JP7332691B2 - 抗体の開発可能性が最大化された抗体ライブラリー - Google Patents

抗体の開発可能性が最大化された抗体ライブラリー Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６９５，０６５号及び２０１９年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８２２，９７１号の出願日の利益を主張し、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
現在、（１）マウスモノクローナル抗体の「ヒト化」、（２）ヒト抗体遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの免疫化、及び（３）巨大なヒト抗体ライブラリーからのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択という、ヒト治療的使用のヒト抗体を生成するために使用される３つの組み換え抗体プラットフォームがある。免疫化アプローチは、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答の適切な発生に依存し、所望の特徴を有する抗体を生じない場合がある。対照的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択は、特定の特性を有する抗体を直接選択することができ、且つ一度選択すると、親和性または特異性に関して容易に改善することができるという利点がある。
一般に、合成抗体ライブラリー及び天然抗体ライブラリーという２種類の抗体ライブラリーがある。合成抗体ライブラリーは、抗体フレームワークに、ランダム化された相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を導入することにより構築することができる。そのような抗体ライブラリーは、良好に作用するフレームワークを選択することにより、幅広い潜在的な遺伝的多様性及び改善された発現を有し得る。しかし、合成抗体ライブラリーは、多数の非機能的抗体メンバーも含み、限定されたセットのフレームワーク足場内に多様性を生じさせるために使用される定型的方法で多くの天然の多様性を除外する。天然抗体ライブラリーとして既知の天然源から作成された抗体ライブラリーは、再編成Ｖ遺伝子がＢ細胞で品質管理を受けるという利点を有し、その結果、潜在的な多様性が低くても、はるかに高い割合のＶ遺伝子が生物学的に機能する。短所は、多様性を増加させるために多数のＢ細胞を取得するという課題、ならびにＥ．ｃｏｌｉ、酵母、または哺乳動物細胞で組み換え発現される一部の抗体の発現不良及び不良な生物物理学的特性を含む。
多様化重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体ライブラリーが本明細書で提供され、これは、天然に存在する抗体（例えば、天然に存在するヒト抗体または天然に存在するラクダ科動物抗体）から得られた相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。任意に、ＶＨ ＣＤＲ、及び／またはＶＬ ＣＤＲのうちのいずれかは、それを有する抗体の１つ以上の特徴に影響を与える１つ以上のライアビリティを有するメンバーを少なくとも除外する。ヒト抗体などの天然抗体由来のＣＤＲを含むそのような抗体ライブラリーは、多数の機能的メンバーを有し、ヒト抗体の天然の多様性を反映するであろう。本明細書に記載のように１つ以上のライアビリティを有するメンバーを除外すると、所望の特性、例えば、組み換え技術により産生された場合の高収率、高い安定性、凝集能力の低減、以下に記載のライアビリティの低減などを有するメンバーの割合が高まるであろう。従って、本明細書に記載の抗体ライブラリーは、抗体の開発可能性を最大化するであろう。
従って、本開示の一態様は、複数の核酸、または核酸を含む複数の遺伝子パッケージを含む抗体重鎖ライブラリーを特徴とする。複数の核酸は、抗体重鎖可変ドメインの集団をコードし、これは、共通の抗体重鎖可変ドメイン遺伝子のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域に、重鎖ＣＤＲ１の集団、重鎖ＣＤＲ２の集団、及び／または重鎖ＣＤＲ３の集団を一括して（組み合わせて）含む。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３は、哺乳動物種、例えば、ヒトまたはラクダ科動物の天然に存在する抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、複数の核酸は、抗体重鎖可変ドメインの集団（例えば、ヒト抗体重鎖可変ドメイン）をコードし、これは、重鎖ＣＤＲ１の集団、重鎖ＣＤＲ２の集団、及び重鎖ＣＤＲ３の集団を一括して（組み合わせて）含む。
一部の実施形態では、共通の抗体重鎖可変ドメイン遺伝子は、ヒト抗体重鎖可変ドメイン遺伝子であってよい。例としては、ＶＨ１－２４、ＶＨ２－７０、ＶＨ３－７、ＶＨ４－３０－４、ＶＨ５－５１、ＶＨ１－１８、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－２３、ＶＨ５－１０－１、ＶＨ３－９、またはＶＨ３－１１が挙げられる。一部の場合では、ヒト抗体重鎖可変領域遺伝子は、治療用抗体、例えば、アブリルマブ、メポリズマブ、クレネズマブ、ネシツムマブ、アニフロルマブ、エボクルマブ（ｅｖｏｃｕｌｕｍａｂ）、アビツズマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、バピネウズマブ、ベンラリズマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セツリズマブ、クラザキズマブ、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エロツズマブ、エプラツズマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、フィクラツズマブ、フレチクマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、ゲボキズマブ、イバリズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、モガムリズマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オテリキシズマブ、オトレツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ（ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、ペルツズマブ、ピナツズマブ、ポラツズマブ、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラムシルマブ、レスリズマブ、ロモソズマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シファリムマブ、タバルマブ、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、チルドラキズマブ、トシリズマブ、トベツマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブ、またはザノリムマブに由来してもよい。
一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１の集団、重鎖ＣＤＲ２の集団、及び／または重鎖ＣＤＲ３の集団は、以下のライアビリティのうちの１つ以上を含むメンバーを含まない（例えば、実質的に含まない）ことができる：
（ｉ）グリコシル化部位（例えば、モチーフＮＸＳ、ＮＸＴ、もしくはＮＸＣ（式中、Ｘはプロリンを除く任意の天然に存在するアミノ酸残基を表す）を含む）、
（ｉｉ）脱アミド化部位（例えば、ＮＧ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＮ、ＮＡ、ＮＨ、ＮＤ、ＧＮＦ、ＧＮＹ、ＧＮＴ、もしくはＧＮＧのモチーフを含む）、
（ｉｉｉ）異性化部位（例えば、ＤＴ、ＤＨ、ＤＳ、ＤＧ、もしくはＤＤのモチーフを含む）、
（ｉｖ）ペアになっていないシステイン、
（ｖ）１を超える正味電荷（例えば、ＬＣＤＲ１－２及び／もしくはＨＣＤＲ１－２におけるもの）、
（ｖｉ）粘度に影響を与え得る少なくとも２つの芳香族残基（例えば、ＨＹＦもしくはＨＷＨ）を含有するトリペプチドモチーフ、
（ｖｉｉ）凝集を促進するモチーフ（例えば、ＦＨＷのモチーフを含む）、
（ｖｉｉｉ）多重特異性部位（例えば、ＧＧ、ＧＧＧ、ＲＲ、ＶＧ、Ｗ、ＷＶ、ＷＷ、ＷＷＷ、ＹＹ、もしくはＷＸＷ（Ｘは任意のアミノ酸残基を指す））、
（ｉｘ）プロテアーゼ感受性部位（例えば、モチーフＤＸ（式中、ＸはＰ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｋ、Ｌ、もしくはＤであり得る）を含む）、
（ｘ）インテグリン結合部位（例えば、モチーフＲＧＤ、ＬＤＶ、もしくはＫＧＤを含む）、
（ｘｉ）リジン糖化部位などのリジン糖化部位（例えば、ＫＥ、ＥＫ、もしくはＥＤ）、
（ｘｉｉ）金属触媒フラグメント化部位（例えば、ＨＳ、ＳＨ、ＫＴ、ＨＸＳ、もしくはＳＸＨ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）のモチーフを含む）、
（ｘｉｉｉ）多重特異性凝集部位（例えば、Ｘ1Ｘ2Ｘ3（式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のそれぞれが独立して、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹである）のモチーフ）、ならびに／または
（ｘｉｖ）ストレプトアビジン結合モチーフ（例えば、モチーフＨＰＱ、ＥＰＤＷ（配列番号１１７）、ＰＷＸＷＬ（配列番号１１８）（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）、ＧＤＷＶＦＩ（配列番号１１９）、もしくはＰＷＰＷＬＧ（配列番号１２０）を含む）。
代わりにまたは加えて、本明細書に記載の抗体ライブラリー内の重鎖ＣＤＲ１の集団、重鎖ＣＤＲ２の集団、及び／または重鎖ＣＤＲ３の集団が、非機能的メンバーを含まない。
一部の実施形態では、抗体重鎖ＣＤＲ１フラグメントの集団、抗体重鎖ＣＤＲ２フラグメントの集団、及び／または抗体重鎖ＣＤＲ３フラグメントの集団は、（ｉ）～（ｘｉｖ）のうちの少なくとも２つを含むメンバーを含まない。一部の例では、少なくとも抗体重鎖ＣＤＲ１フラグメントの集団、抗体重鎖ＣＤＲ２フラグメントの集団、及び／または抗体重鎖ＣＤＲ３フラグメントの集団は、（ｉ）～（ｉｘ）を含むメンバーを含まず、任意に、（ｘ）～（ｘｉｖ）のうちの１つ以上を含むメンバーを含まない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体ライブラリーは、（ｉ）～（ｘｉｖ）のうちの１つ以上を含むメンバーを含まない重鎖ＣＤＲ１の集団及び／または重鎖ＣＤＲ２の集団を含み、重鎖ＣＤＲ３の集団は、（本明細書に開示の１つ以上のライアビリティ（ｉ）～（ｘｉｖ）を除去することなく）天然に存在するヒト抗体に由来し、例えば、ヒトＢリンパ球またはその前駆細胞に由来する。
一部の場合では、本明細書に記載の抗体ライブラリーのメンバーは、同じ天然に存在する抗体に由来しない重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び／または重鎖ＣＤＲ３を含む。例えば、抗体ライブラリーのメンバーの少なくとも５０％は、同じ天然に存在する抗体に由来する重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び／または重鎖ＣＤＲ３を含まない。
別の態様では、本開示は、複数の核酸、または核酸を含む複数の遺伝子パッケージを含む抗体軽鎖ライブラリーを提供する。複数の核酸は、抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、ヒト抗体軽鎖可変ドメイン）の集団をコードし、これらは、共通の抗体軽鎖可変ドメイン遺伝子（例えば、ヒト抗体軽鎖可変ドメイン遺伝子）のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域に位置する軽鎖ＣＤＲ１の集団、軽鎖ＣＤＲ２の集団、及び／または軽鎖ＣＤＲ３の集団を一括して（組み合わせて）含む。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに任意に共通の軽鎖可変ドメイン遺伝子は、同じ哺乳動物種、例えば、ヒト、の天然に存在する抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、ヒト抗体軽鎖可変ドメインの集団は、軽鎖ＣＤＲ１の集団、軽鎖ＣＤＲ２の集団、及び軽鎖ＣＤＲ３の集団を一括して含む。一部の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１の集団、軽鎖ＣＤＲ２の集団、及び／または軽鎖ＣＤＲ３の集団は、本明細書に記載のライアビリティ（例えば、本明細書に記載の（ｉ）～（ｘｉｖ））のうちの１つ以上を含むメンバーを含まない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体軽鎖ライブラリーは、同じ天然に存在する抗体に由来しない軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び／または軽鎖ＣＤＲ３を有するメンバーを含んでもよい。例えば、抗体軽鎖ライブラリーのメンバーの少なくとも５０％は、同じ天然に存在する抗体に由来する軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び／または軽鎖ＣＤＲ３を含まない。
一部の実施形態では、抗体軽鎖ライブラリーで使用される共通の抗体軽鎖可変ドメイン遺伝子は、ヒト抗体軽鎖可変ドメイン遺伝子であってよい。例としては、Ｋ１－１２、Ｋ４－１、Ｋ２Ｄ－２９、Ｋ３－１１、Ｋ３－２０、またはＬ２－１４が挙げられる。一部の場合では、ヒト抗体重鎖可変領域遺伝子は、本明細書に記載されるような治療用抗体に由来する。
（ｉ）本明細書に記載の抗体重鎖ライブラリーの抗体重鎖可変ドメインの集団をコードする第１の複数の核酸、及び、（ｉｉ）本明細書に記載の抗体軽鎖ライブラリーの抗体軽鎖可変ドメインの集団をコードする第２の複数の核酸、を含む抗体ライブラリーも本明細書で提供される。あるいは、本明細書で提供される抗体ライブラリーは、（ｉ）本明細書に記載の抗体重鎖ライブラリーの抗体重鎖可変ドメインの集団をコードする第１の複数の核酸、及び、（ｉｉ）ＶＫ３－２０であり得る共通の軽鎖可変ドメイン、を含んでもよい。
本明細書に開示の抗体ライブラリーのうちのいずれも、好適な形式、例えば、全長抗体のライブラリー、Ｆａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントのライブラリー、一本鎖抗体のライブラリー、または一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）のライブラリーのものであってよい。一部の例では、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、ヒト抗体ライブラリーであってよい。他の例では、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、ラクダ科動物ＶＨＨ抗体ライブラリーであってよい。
別の態様では、本開示は、以下を含む抗体ライブラリーを作製するための方法を特徴とする：
（ａ）天然に存在する抗体重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）フラグメントの集団をコードする第１の複数の核酸、及び／または、（ｂ）天然に存在する抗体重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）フラグメントの集団をコードする第２の複数の核酸、を提供すること、ならびに
抗体重鎖可変ドメイン遺伝子（例えば、本明細書に記載のもの）のＣＤＲ１領域及び／またはＣＤＲ２領域に、それぞれ、第１の複数の核酸及び／または第２の複数の核酸を挿入し、それにより、抗体ライブラリーを作製すること。
方法はさらに、以下を含んでもよい：
天然に存在する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）フラグメントの集団をコードする第３の複数の核酸を提供すること、及び
重鎖可変領域遺伝子のＣＤＲ３領域に第３の複数の核酸を挿入すること。
重鎖ＣＤＲ１フラグメント、重鎖ＣＤＲ２フラグメント、及び重鎖ＣＤＲ３フラグメントは、本明細書に開示の哺乳動物種の天然に存在する抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３フラグメントは、同じ哺乳動物種に由来し得る。任意に、共通の重鎖可変領域遺伝子もまた、同じ哺乳動物種に由来してもよい。
一部の実施形態では、抗体ライブラリーは、メンバーを含み、これらのそれぞれにおいて、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び／または重鎖ＣＤＲ３が同じ天然に存在する抗体に由来しない。例えば、抗体ライブラリーのメンバーの少なくとも５０％は、同じ天然に存在する抗体由来の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び／または重鎖ＣＤＲ３を含有しない。
一部の実施形態では、抗体重鎖ＣＤＲ１フラグメントの集団、抗体重鎖ＣＤＲ２フラグメントの集団、及び／または抗体重鎖ＣＤＲ３フラグメントの集団は、本明細書に記載のライアビリティ、例えば、本明細書に開示の（ｉ）～（ｘｉｖ）、のうちの１つ以上を含むメンバーを含まず、例えば、抗体重鎖ＣＤＲ１フラグメントの集団、抗体重鎖ＣＤＲ２フラグメントの集団、及び／または抗体重鎖ＣＤＲ３フラグメントの集団は、（ｉ）～（ｘｉｖ）のうちの少なくとも２つを含むメンバーを含まなくてもよい。一部の場合では、抗体重鎖ＣＤＲ１フラグメントの集団、抗体重鎖ＣＤＲ２フラグメントの集団、及び／または抗体重鎖ＣＤＲ３フラグメントの集団は、（ｉ）～（ｉｘ）のうちのいずれかを含むメンバーを含まず、任意に、さらに（ｘ）～（ｘｉｖ）のうちの１つ以上を含まない。
他の実施形態では、抗体重鎖ＣＤＲ１フラグメントの集団及び／または抗体重鎖ＣＤＲ２フラグメントの集団は、本明細書に記載のライアビリティのうちの１つ以上（例えば、（ｉ）～（ｘｉｖ）のうちの少なくとも２つまたは（ｉ）～（ｘｉｖ）の全て）を含むメンバーを含まず、ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３フラグメントの集団は、天然に存在するヒト抗体に由来し（例えば、Ｂ細胞に由来し）、１つ以上のライアビリティが除外されなくてもよい。
一部の実施形態では、第１の複数の核酸、第２の複数の核酸、及び／または第３の複数の核酸は、以下を含むプロセスで生成される：
（ａ）天然に存在する抗体（例えば、天然に存在するヒト抗体）の集団の重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、及び／または重鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を得ること、
（ｂ）ライアビリティのない重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、及び／または重鎖ＣＤＲ３配列を得るために、（ａ）から、ライアビリティ（ｉ）～（ｘｉｖ）のうちの１つ以上を含む重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び／または重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を除外すること、ならびに
（ｃ）ライアビリティのない重鎖ＣＤＲ１領域をコードする第１の複数の核酸、ライアビリティのない重鎖ＣＤＲ２領域をコードする第２の複数の核酸、及び／またはライアビリティのない重鎖ＣＤＲ３領域をコードする第３の複数の核酸を合成すること。
一部の場合では、上記のプロセスはさらに、（ｄ）ライアビリティのない重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域由来の機能的メンバーを単離すること、を含んでもよい。例えば、ライアビリティのない重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３の機能的メンバーは、抗体が宿主細胞の表面に提示される方法で、宿主細胞にライアビリティのない重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域を含む抗体を発現させること、宿主細胞上に提示され、折りたたみの改善を示し、及び／または多重特異性試薬への結合の低減を示す抗体を単離すること、ならびに、提示された抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域を同定することにより単離することができ、これらは、ライアビリティのない重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域の機能的メンバーである。
本明細書に記載の抗体ライブラリーを作製するための方法はさらに、以下を含んでもよい：
（ｉ）天然に存在する抗体軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）フラグメントの集団をコードする第４の複数の核酸、天然に存在する抗体軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）フラグメントの集団をコードする第５の複数の核酸、及び／または天然に存在するヒト抗体軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）フラグメントの集団をコードする第６の複数の核酸を提供すること、ならびに
（ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域に、それぞれ、第４の複数の核酸、第５の複数の核酸、及び／または第６の複数の核酸を挿入すること。
軽鎖ＣＤＲ１フラグメント、軽鎖ＣＤＲ２フラグメント、及び軽鎖ＣＤＲ３フラグメントは、本明細書に開示の哺乳動物種の天然に存在する抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３フラグメントは、同じ哺乳動物種に由来し得る。任意に、共通の軽鎖可変領域遺伝子もまた、同じ哺乳動物種に由来してもよい。
天然に存在する抗体軽鎖ＣＤＲ１フラグメントの集団、抗体軽鎖ＣＤＲ２フラグメントの集団、及び／または抗体軽鎖ＣＤＲ３フラグメントの集団は、本明細書に記載のライアビリティのうちの１つ以上（例えば、本明細書に記載の（ｉ）～（ｘｉｖ）のうちの少なくとも２つまたは全て）を含むメンバーを含まなくてもよい。抗体ライブラリーは、メンバーを含んでもよく、これらのそれぞれは、同じ天然に存在する抗体にはみられない軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び／または軽鎖ＣＤＲ３を含む。例えば、抗体ライブラリーのメンバーの少なくとも５０％は、同じ天然に存在する抗体にはみられない軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び／または軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態では、第４の複数の核酸、第５の複数の核酸、及び／または第６の複数の核酸は、以下を含むプロセスで生成される：
（ａ）天然に存在する抗体（例えば、天然に存在するヒト抗体）の集団の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を得ること、
（ｂ）ライアビリティのない軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列を得るために、（ａ）から、（ｉ）～（ｘ）のうちの１つ以上を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３アミノ酸配列を除外すること、ならびに
（ｃ）ライアビリティのない軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域をコードする第４の複数の核酸、第５の複数の核酸、及び／または第６の複数の核酸を合成すること。
上記のプロセスはさらに、（ｄ）ライアビリティのない軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域から機能的メンバーを単離すること、を含んでもよい。例えば、ライアビリティのない軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３の機能的メンバーは、抗体が宿主細胞の表面に提示される方法で、宿主細胞にライアビリティのない軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域を含む抗体を発現させること、宿主細胞上に提示され、折りたたみの改善を示し、及び／または多重特異性試薬への結合の低減を示す抗体を単離すること、ならびに、提示された抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域を同定することにより単離され、これらは、ライアビリティのない軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３領域の機能的メンバーである。
さらに、本開示は、抗体軽鎖ライブラリーを作製するための方法を特徴とし、本方法は、以下を含む：
（ｉ）天然に存在する抗体軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）フラグメントの集団をコードする第１の複数の核酸、天然に存在する抗体軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）フラグメントの集団をコードする第２の複数の核酸、及び／または天然に存在する抗体軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）フラグメントの集団をコードする第３の複数の核酸を提供すること、ならびに
（ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域に、それぞれ、第１の複数の核酸、第２の複数の核酸、及び／または第３の複数の核酸を挿入すること。
軽鎖ＣＤＲ１フラグメント、軽鎖ＣＤＲ２フラグメント、及び軽鎖ＣＤＲ３フラグメントは、本明細書に開示の哺乳動物種の天然に存在する抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３フラグメントは、同じ哺乳動物種に由来し得る。任意に、共通の軽鎖可変領域遺伝子もまた、同じ哺乳動物種に由来してもよい。
また、本開示の範囲内に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかで作製される抗体ライブラリー（例えば、抗体重鎖ライブラリー、抗体軽鎖ライブラリー、またはそれらの組み合わせ）がある。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、以下の明細書に記載される。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳述される説明、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。
本出願は、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含有する。
第２相もしくは第３相臨床試験の治療用抗体、または抗体ライブラリー構築のための足場として使用するのに好適もしくは不適な承認済みの治療用抗体のパーセンテージを示す図である。第２相、第３相、及び承認済みのそれぞれに適する足場：０～１つのフラグ（左のバー）。第２相、第３相、及び承認済みのそれぞれに不適な足場：２つを超えるフラグ（右のバー）。 選択された治療用抗体のＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子から開発された７つの足場を示す概略図である。ＬＣＤＲ２を除いて、全てのＣＤＲは、ＩＭＧＴで記載されるとおりである。ＬＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔの記載を使用する。 選択された軽鎖足場に（一例として）ＬＤＣＲ１をクローニングする例示的な設計を示す概略図である。例示的なベクター核酸及び対応するアミノ酸が示される。核酸配列は、配列番号１（上）及び配列番号２（下）に対応する。アミノ酸配列は、配列番号３に対応する。 固有のＣＤＲを同定し且つライアビリティ、発生率、及び／または異常な長さに基づいてＣＤＲを情報的に除去する例示的なプロセスを記載するフローチャートである。 脱アミド化部位、異性化部位、グリコシル化部位、またはペアになっていないシステインなどのライアビリティ（強調表示されている）を含む例示的なＨＣＤＲ２配列を示す。各列の最初の配列は、コンセンサス配列のグラフ表示を示し、その後に、例示的なバリアント配列が続く。「脱アミド化列」に示される配列は、配列番号４～２４に対応する（上から下）。「異性化列」に示される配列は、配列番号２５～４５に対応する（上から下）。「グリコシル化列」に示される配列は、配列番号４６～６６に対応する（上から下）。「ペアになっていないシステイン列」に示される配列は、配列番号６７～８７に対応する（上から下）。 重鎖ＣＤＲ３のシステイン残基の存在を示す図である。 重鎖ＣＤＲ３のシステイン残基の存在を示す。配列は、配列番号８８～１０２に対応する（上から下）。 ＣＤＲのペアになっているシステイン残基を示す図である。 バイオインフォマティクス濾過前後の、重鎖ＣＤＲ１（左パネル）及びＣＤＲ２（右パネル）領域におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、重鎖ＣＤＲ１（左パネル）及びＣＤＲ２（右パネル）領域におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、ＶＫ ＣＤＲ１（左パネル）及びＣＤＲ２（右パネル）領域におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、ＶＫ ＣＤＲ１（左パネル）及びＣＤＲ２（右パネル）領域におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、Ｖλ ＣＤＲ１（左パネル）及びＣＤＲ２（右パネル）におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、Ｖλ ＣＤＲ１（左パネル）及びＣＤＲ２（右パネル）におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、ＶＫ ＣＤＲ３（左パネル）及びＶλＣＤＲ３（右パネル）におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、ＶＫ ＣＤＲ３（左パネル）及びＶλＣＤＲ３（右パネル）におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 バイオインフォマティクス濾過前後の、ＨＣ ＣＤＲ３におけるライアビリティの存在を示すグラフを含む。 様々な存在量のしきい値で除外された各ライブラリーのＣＤＲのパーセンテージを示すグラフを含む。シーケンシングエラーで生じるＣＤＲを除外するために、４回の読み取りのシングルスレッドが、様々なライブラリー間で使用される。 様々な存在量のしきい値で除外された各ライブラリーのＣＤＲのパーセンテージを示すグラフを含む。シーケンシングエラーで生じるＣＤＲを除外するために、４回の読み取りのシングルスレッドが、様々なライブラリー間で使用される。 様々な存在量のしきい値で除外された各ライブラリーのＣＤＲのパーセンテージを示すグラフを含む。シーケンシングエラーで生じるＣＤＲを除外するために、４回の読み取りのシングルスレッドが、様々なライブラリー間で使用される。 様々なしきい値読み取りで除外した後に、重鎖ＣＤＲ３を除く全てのプールされたＣＤＲに対して残存するＣＤＲの数を示すチャートを含む。 ライブラリー１のＣＤＲの長さ分布を示すグラフを含む（アブリルマブ由来の足場を使用する）。各ＣＤＲの生殖細胞系列の長さは、各グラフの下に示され、強調された領域の外側のＣＤＲは、長さが異常なために除外される。 ライブラリー２のＣＤＲの長さ分布を示すグラフを含む（メポリズマブ由来の足場を使用する）。各ＣＤＲの生殖細胞系列の長さは、各グラフの下に示され、強調された領域の外側のＣＤＲは、長さが異常なために除外される。 ライブラリー３のＣＤＲの長さ分布を示すグラフを含む（クレネズマブ由来の足場を使用する）。各ＣＤＲの生殖細胞系列の長さは、各グラフの下に示され、強調された領域の外側のＣＤＲは、長さが異常なために除外される。 ライブラリー４のＣＤＲの長さ分布を示すグラフを含む（ネシツムマブに由来する足場を使用する）。各ＣＤＲの生殖細胞系列の長さは、各グラフの下に示され、強調された領域の外側のＣＤＲは、長さが異常なために除外される。 ライブラリー５のＣＤＲの長さ分布を示すグラフを含む（アニフロルマブに由来する足場を使用する）。各ＣＤＲの生殖細胞系列の長さは、各グラフの下に示され、強調された領域の外側のＣＤＲは、長さが異常なために除外される。 ライブラリー６のＣＤＲの長さ分布を示すグラフを含む（エボクルマブに由来する足場を使用する）。各ＣＤＲの生殖細胞系列の長さは、各グラフの下に示され、強調された領域の外側のＣＤＲは、長さが異常なために除外される。 良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングした前（赤）及び後（緑）のフィルタリング後（緑）の天然の分布（青）及び複製された天然の設計分布を示すグラフを含む。ＬＣＤＲ１－３及びＨＣＤＲ１－２のそれぞれにおける６つの異なる足場／生殖細胞系列のデータが示される。結果は、図２５Ｂ～Ｇに示されるライブラリーのシーケンシングに基づく。 良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングした前（赤）及び後（緑）のフィルタリング後（緑）の天然の分布（青）及び複製された天然の設計分布を示すグラフを含む。ＬＣＤＲ１－３及びＨＣＤＲ１－２のそれぞれにおける６つの異なる足場／生殖細胞系列のデータが示される。結果は、図２５Ｂ～Ｇに示されるライブラリーのシーケンシングに基づく。 良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングした前（赤）及び後（緑）のフィルタリング後（緑）の天然の分布（青）及び複製された天然の設計分布を示すグラフを含む。ＬＣＤＲ１－３及びＨＣＤＲ１－２のそれぞれにおける６つの異なる足場／生殖細胞系列のデータが示される。結果は、図２５Ｂ～Ｇに示されるライブラリーのシーケンシングに基づく。 良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングした前（赤）及び後（緑）のフィルタリング後（緑）の天然の分布（青）及び複製された天然の設計分布を示すグラフを含む。ＬＣＤＲ１－３及びＨＣＤＲ１－２のそれぞれにおける６つの異なる足場／生殖細胞系列のデータが示される。結果は、図２５Ｂ～Ｇに示されるライブラリーのシーケンシングに基づく。 良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングした前（赤）及び後（緑）のフィルタリング後（緑）の天然の分布（青）及び複製された天然の設計分布を示すグラフを含む。ＬＣＤＲ１－３及びＨＣＤＲ１－２のそれぞれにおける６つの異なる足場／生殖細胞系列のデータが示される。結果は、図２５Ｂ～Ｇに示されるライブラリーのシーケンシングに基づく。 良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングした前（赤）及び後（緑）のフィルタリング後（緑）の天然の分布（青）及び複製された天然の設計分布を示すグラフを含む。ＬＣＤＲ１－３及びＨＣＤＲ１－２のそれぞれにおける６つの異なる足場／生殖細胞系列のデータが示される。結果は、図２５Ｂ～Ｇに示されるライブラリーのシーケンシングに基づく。 天然の分布（天然ライブラリー－青）、ならびに良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングする前（赤）及び後（緑色）の複製された天然の設計分布について評価された各ＣＤＲ位置での多様性の累積プロットを含む。結果は、図２５Ｂ～２５Ｇに示されているライブラリーのシーケンシングに基づく。 天然の分布（天然ライブラリー－青）、ならびに良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングする前（赤）及び後（緑色）の複製された天然の設計分布について評価された各ＣＤＲ位置での多様性の累積プロットを含む。結果は、図２５Ｂ～２５Ｇに示されているライブラリーのシーケンシングに基づく。 天然の分布（天然ライブラリー－青）、ならびに良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングする前（赤）及び後（緑色）の複製された天然の設計分布について評価された各ＣＤＲ位置での多様性の累積プロットを含む。結果は、図２５Ｂ～２５Ｇに示されているライブラリーのシーケンシングに基づく。 天然の分布（天然ライブラリー－青）、ならびに良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングする前（赤）及び後（緑色）の複製された天然の設計分布について評価された各ＣＤＲ位置での多様性の累積プロットを含む。結果は、図２５Ｂ～２５Ｇに示されているライブラリーのシーケンシングに基づく。 天然の分布（天然ライブラリー－青）、ならびに良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングする前（赤）及び後（緑色）の複製された天然の設計分布について評価された各ＣＤＲ位置での多様性の累積プロットを含む。結果は、図２５Ｂ～２５Ｇに示されているライブラリーのシーケンシングに基づく。 天然の分布（天然ライブラリー－青）、ならびに良好に折りたたまれた配列についてフィルタリングする前（赤）及び後（緑色）の複製された天然の設計分布について評価された各ＣＤＲ位置での多様性の累積プロットを含む。結果は、図２５Ｂ～２５Ｇに示されているライブラリーのシーケンシングに基づく。 機能的ＣＤＲ、例えば、良好に折りたたまれたＬＣ ＣＤＲ３について選択するための例示的なプロセスを示す図である。 酵母ディスプレイベクターに、ＬＣ ＣＤＲ１をコードするオリゴヌクレオチドを挿入する例示的なプロセスを示す図である。ＢｓａＩ及びＳｆｉｌで切断されるべき酵母ディスプレイベクターの一部を表す核酸配列は、配列番号１０３～１０４に対応する（上から下へ）。切断型ベクターの配列（中央）は、配列番号１０５～１０８に対応する（上から下、次に、左から右に標識付けされる）。増幅ＬＣＤＲ１オリゴ（中央）の配列は、配列番号１０９～１１２に対応する（上から下、次に、左から右に標識付けされる）。相同組み換えにより、酵母ディスプレイベクター（下）に挿入された増幅ＬＣＤＲ１が生成され、これは、配列番号１１３～１１６に対応する（上から下、次に、左から右に標識された）。 一例として機能的ＫＣＤＲ１を含むＶＫ鎖を使用して、クローニング後に単一のＣＤＲループライブラリーを提示する酵母を選別することにより、良好に発現された抗体ＣＤＲを単離する例示的なプロセスを示す図である。 酵母に提示されたＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－１、ＬＣＤＲ１－３）ライブラリーのそれぞれについて、提示された単一のＣＤＲループライブラリーを単離する例示的なプロセスを適用した結果を示す。Ｘ軸は、抗体提示のレベルを示し、Ｙ軸は、各特定の提示レベルでのクローンの数を示す。全てのヒストグラムでは、臨床候補の提示レベルは、青点線で示される。ＬＣＤＲ１－２及びＨＣＤＲ１－２では、蛍光活性化細胞選別を使用して、酵母の最も蛍光性の高い２％を選別し、これは、最も高度に発現する抗体を提示する酵母に対応する。選別されたＳＶ５（青プロット）及び最も蛍光性の高い２％（赤プロット）の提示レベルが示される。ＬＣＤＲ３では、磁気活性化細胞選別を使用して、最も高度に発現された抗体を提示する酵母を選別した。形質転換された酵母クローン（青プロット）は、磁気活性化細胞で選別された酵母クローン（赤）と比較される。 酵母に提示されたＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－１、ＬＣＤＲ１－３）ライブラリーのそれぞれについて、提示された単一のＣＤＲループライブラリーを単離する例示的なプロセスを適用した結果を示す。Ｘ軸は、抗体提示のレベルを示し、Ｙ軸は、各特定の提示レベルでのクローンの数を示す。全てのヒストグラムでは、臨床候補の提示レベルは、青点線で示される。ＬＣＤＲ１－２及びＨＣＤＲ１－２では、蛍光活性化細胞選別を使用して、酵母の最も蛍光性の高い２％を選別し、これは、最も高度に発現する抗体を提示する酵母に対応する。選別されたＳＶ５（青プロット）及び最も蛍光性の高い２％（赤プロット）の提示レベルが示される。ＬＣＤＲ３では、磁気活性化細胞選別を使用して、最も高度に発現された抗体を提示する酵母を選別した。形質転換された酵母クローン（青プロット）は、磁気活性化細胞で選別された酵母クローン（赤）と比較される。 酵母に提示されたＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－１、ＬＣＤＲ１－３）ライブラリーのそれぞれについて、提示された単一のＣＤＲループライブラリーを単離する例示的なプロセスを適用した結果を示す。Ｘ軸は、抗体提示のレベルを示し、Ｙ軸は、各特定の提示レベルでのクローンの数を示す。全てのヒストグラムでは、臨床候補の提示レベルは、青点線で示される。ＬＣＤＲ１－２及びＨＣＤＲ１－２では、蛍光活性化細胞選別を使用して、酵母の最も蛍光性の高い２％を選別し、これは、最も高度に発現する抗体を提示する酵母に対応する。選別されたＳＶ５（青プロット）及び最も蛍光性の高い２％（赤プロット）の提示レベルが示される。ＬＣＤＲ３では、磁気活性化細胞選別を使用して、最も高度に発現された抗体を提示する酵母を選別した。形質転換された酵母クローン（青プロット）は、磁気活性化細胞で選別された酵母クローン（赤）と比較される。 酵母に提示されたＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－１、ＬＣＤＲ１－３）ライブラリーのそれぞれについて、提示された単一のＣＤＲループライブラリーを単離する例示的なプロセスを適用した結果を示す。Ｘ軸は、抗体提示のレベルを示し、Ｙ軸は、各特定の提示レベルでのクローンの数を示す。全てのヒストグラムでは、臨床候補の提示レベルは、青点線で示される。ＬＣＤＲ１－２及びＨＣＤＲ１－２では、蛍光活性化細胞選別を使用して、酵母の最も蛍光性の高い２％を選別し、これは、最も高度に発現する抗体を提示する酵母に対応する。選別されたＳＶ５（青プロット）及び最も蛍光性の高い２％（赤プロット）の提示レベルが示される。ＬＣＤＲ３では、磁気活性化細胞選別を使用して、最も高度に発現された抗体を提示する酵母を選別した。形質転換された酵母クローン（青プロット）は、磁気活性化細胞で選別された酵母クローン（赤）と比較される。 酵母に提示されたＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－１、ＬＣＤＲ１－３）ライブラリーのそれぞれについて、提示された単一のＣＤＲループライブラリーを単離する例示的なプロセスを適用した結果を示す。Ｘ軸は、抗体提示のレベルを示し、Ｙ軸は、各特定の提示レベルでのクローンの数を示す。全てのヒストグラムでは、臨床候補の提示レベルは、青点線で示される。ＬＣＤＲ１－２及びＨＣＤＲ１－２では、蛍光活性化細胞選別を使用して、酵母の最も蛍光性の高い２％を選別し、これは、最も高度に発現する抗体を提示する酵母に対応する。選別されたＳＶ５（青プロット）及び最も蛍光性の高い２％（赤プロット）の提示レベルが示される。ＬＣＤＲ３では、磁気活性化細胞選別を使用して、最も高度に発現された抗体を提示する酵母を選別した。形質転換された酵母クローン（青プロット）は、磁気活性化細胞で選別された酵母クローン（赤）と比較される。 酵母に提示されたＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－１、ＬＣＤＲ１－３）ライブラリーのそれぞれについて、提示された単一のＣＤＲループライブラリーを単離する例示的なプロセスを適用した結果を示す。Ｘ軸は、抗体提示のレベルを示し、Ｙ軸は、各特定の提示レベルでのクローンの数を示す。全てのヒストグラムでは、臨床候補の提示レベルは、青点線で示される。ＬＣＤＲ１－２及びＨＣＤＲ１－２では、蛍光活性化細胞選別を使用して、酵母の最も蛍光性の高い２％を選別し、これは、最も高度に発現する抗体を提示する酵母に対応する。選別されたＳＶ５（青プロット）及び最も蛍光性の高い２％（赤プロット）の提示レベルが示される。ＬＣＤＲ３では、磁気活性化細胞選別を使用して、最も高度に発現された抗体を提示する酵母を選別した。形質転換された酵母クローン（青プロット）は、磁気活性化細胞で選別された酵母クローン（赤）と比較される。 一定のＶＨ鎖及び機能的抗体を選択するＬＣ ＣＤＲに多様性を有するＶＬ鎖間のペアリングを示す図である。 一定のＶＨ鎖及び機能的抗体の選択するためのＶＨ ＣＤＲに多様性を有するＶＨ鎖間のペアリングを示す図である。 酵母ディスプレイ及び未修飾ＶＨドメインを介して選択された良好に折りたたまれたＬＣ ＣＤＲを有するＶＬ鎖を含む例示的な抗体ライブラリーの構築を示す図である。 予め選択されたＶＨまたはＶＬ足場に、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲを増幅して組み立てる例示的なプロセスを示す図である。 ＶＨドメインのライブラリー及びＶＬドメインのライブラリーを組み合わせることによる例示的なＦａｂ抗体ライブラリーの構築を示す図である。 ＶＨドメインのライブラリー及びＶＬドメインのライブラリーを組み合わせることによる例示的なｓｃＦｖ抗体ライブラリーの構築を示す図である。 対応するライブラリーと比較した、足場として使用される臨床候補に対応するｓｃＦｖのフロープロットである。ライブラリー５の二重ピークは、最終的なファージディスプレイライブラリーで除外された、より小さな切断型産物の存在によるものと考えられる。 ｐＩＩＩ及びｓｃＦｖ－ｐＩＩＩバンドが示されたライブラリー１～３のウェスタンブロットを示す。 様々な濃度で選択された、標的に結合する酵母上に提示された抗体の結合を示す。酵母上の提示後に、ファージディスプレイによる２ラウンドの選択、及び２ラウンドの酵母ディスプレイが続いた。ライブラリー１及びライブラリー２は、同じＬＣＤＲ１－３及びＨＣＤＲ１－２の多様性、ならびに異なるドナーからのＨＣＤＲ３の多様性を使用して作成された２つの異なるライブラリーを表す。 ＶＬシャッフリングを介した例示的な親和性成熟アプローチを示す図である。 図３２に示されたＶＬシャッフリングの後の、さらなるＨＣ ＣＤＲ１及びＨＣ ＣＤＲ２シャッフリングを示す図である。 ライブラリーＡまたはライブラリーＢから単離された種々の濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎｍ、または０ｎＭ）で示された抗原に結合するクローンを示す図を含む。 本明細書に開示のライブラリーからの高親和性抗体（ナノモル以下のレベルでの結合親和性を有する）の単離を示す図を含む。 本明細書に開示のライブラリーからの高親和性抗体（ナノモル以下のレベルでの結合親和性を有する）の単離を示す図を含む。 本明細書に開示のライブラリーからの高親和性抗体（ナノモル以下のレベルでの結合親和性を有する）の単離を示す図を含む。 本明細書に開示のライブラリーからの、追加の抗原、ＰＤＧＦ、ＴＧＦＢＲ２、及びＴＧＦＢＲ３に対して高い結合親和性を有する抗体の単離を示す図である。
抗体ライブラリーが、様々な抗体の数に関して測定して、より大きくまたはより多様であるほど、それから選択することができる抗体がより優れていることが一般に認められている。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ １３（１４）：３２４５－３２６０，１９９４及びＰｅｒｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ．，８１（４）：６４５－７０，１９７９。ほとんどの抗体ライブラリーの多様性は、各コロニーが異なる抗体を表すと仮定して、形質転換体の数を数えることにより推定されている。
ＶＨ遺伝子多様性が、得られたコロニーの数、例えば、Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８（１）：７５－８０，２０００に記載のライブラリーの場合、約１０8、と同じであると一般に仮定された。しかし、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、ＶＨクローン多様性（固有のＨＣＤＲ３アミノ酸配列）が実際には約３０分の１（３ｘ１０6）であったことを示した。Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．，６（１）：１６０－７２，２０１４。この明らかな低い多様性にも関わらず、多くの抗体が、このライブラリーから選択されている。例えば、以下を参照のこと、Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８（１）：７５－８０，２０００、Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，３３：１４６－６０，２０１５、Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ；２５３（１－２）：２３３－４２，２００１、Ｋｅｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５（１２）：２３５０－６３，２００６、Ａｙｒｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．６（３）：１０７２－８２，２００７、Ｖｅｌａｐｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，３２１（１－２）：６０－９，２００７、Ｌｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６（１２）：ｅ２７７５６，２０１１、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７（１１）：ｅ４９５３５，２０１２、Ｃｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：２７０，２０１３、及びＦｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，７（１）：３２－４１，２０１５。
別の天然の抗体ライブラリーのＮＧＳシーケンシングは、使用されたドナーの数が非常に高かった（６５４）にも関わらず、測定されたより低いＶＨ多様性（２×１０5）を示し、コロニーの推定数は、３×１０10であった。Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０６（４８）：２０２１６－２１，２００９。さらに、Ｆａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１２（５）：ｅ０１７７５７４，２０１７は、最大の多様性を有する３つのライブラリー（コロニーの数）６～１６ｘ１０6について記載し、３～９ｘ１０6のＮＧＳ多様性を推定していた。
遺伝的多様性は必須であるが、有効な機能的多様性がさらに重要である：コードされた抗体が非機能的であり且つ適切に折りたたむことができない場合、高い遺伝的多様性は、有用性がないものである。実に、抗体の単一アミノ酸の変化が、発現レベル及び安定性の劇的な変化をもたらし得る。一部の刊行物は、合成のものよりも天然の抗体ライブラリーの優位性を示している。Ｈｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１６（５）：３８１－６，２００３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８２（１０）：２６２０－３０，２０１４、及びＣｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，３７３（１－２）：７９－８８，２０１１。天然の多様性は、免疫系により機能が事前にスクリーニングされているという利点を有する。しかし、一部の抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイシステムで良好に発現されず、折りたたまれ、且つ、多様性が少数のクローンにより支配される可能性があるという欠点がある。
本開示は、少なくとも部分的に、天然の多様性を含む抗体ライブラリーの構築を目的とし、その結果、ライブラリーのメンバーが機能性について免疫系により事前にスクリーニングされるであろうが、潜在的なライアビリティを含有するメンバーを除外すると、一般的なスクリーニングシステムにおいては良好に発現されず、凝集し、及び／または良好に折りたたまれないであろう（例えば、酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、もしくはβ－ラクタマーゼなどのフォールディングレポーター；例えば、以下を参照のこと、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅ Ｂｉｏｌ．，１２：９４－１０１；１９８８、及びＤ’Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２，ｓｕｐｐｌ．１，Ｓ１－Ｓ５；２０１１、または緑色蛍光タンパク質、例えば、以下を参照のこと、Ｗａｌｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：６９１－５；１９９９、Ｃａｂａｎｔｏｕｓ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ．，３：ｅ２３８７；２００８、及びＣａｂａｎｔｏｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６：１１３－９；２００５）。従って、本開示は、一部の実施形態では、抗体ライブラリーのメンバーが十分に発現され及び／または折りたたまれることが予想されるように、抗体足場内でｉｎ ｖｉｖｏで生成された体細胞変異を含有する天然に存在するＣＤＲを含む天然に存在するＣＤＲを組み合わせること、ならびに、ライアビリティを欠くことにより、非常に多様で高度に機能的な抗体ライブラリーを作製する方法を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「ライアビリティ」という用語は、抗体の１つ以上の所望の特徴（例えば、安定性、発現もしくはディスプレイシステムにおける良好な発現、適切な折りたたみ、凝集がないかもしくは低減する、溶解性、インテグリン結合がないかもしくは低減する、グリコシル化がないかもしくは低減する、脱アミド化がないかもしくは低減する、異性化がないかもしくは低減する、ペアになっていないシステインがない、またはプロテアーゼ感受性がないかもしくは低減するなど）に悪影響を与える抗体内のモチーフ（例えば、重鎖または軽鎖ＣＤＲ領域に位置する）を指す。高度に機能的なメンバーで構成されているので、そのような抗体ライブラリーは、これらのライアビリティのうちのいずれかを含有する抗体が存在する同様の遺伝子サイズのライブラリーよりも機能的にはるかに大きいと予想されるであろう。換言すれば、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、はるかに大きな有効な多様性を有するであろう。
Ｉ．抗体ライブラリー及び構築の方法
本明細書に記載の重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ集団を含む抗体ライブラリー（重鎖ＣＤＲ及び／または軽鎖ＣＤＲは、本明細書にも記載される事前に選択された重鎖可変ドメイン遺伝子及び／または事前に選択された軽鎖可変ドメイン遺伝子に挿入される）、ならびにそのような抗体ライブラリーを作製する方法が本明細書で提供される。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３、ならびに事前に選択された重可変ドメインは、哺乳動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、またはラクダ科動物、例えば、ラクダもしくはラマのものであってよい。一部の場合では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、同じ哺乳動物種（例えば、ヒトまたはラクダ科動物）の抗体に由来してもよい。任意に、事前に選択された重鎖可変ドメイン遺伝子は、同じ哺乳動物種に由来してもよい。あるいは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３、ならびに、任意に、事前に選択された重鎖可変ドメイン遺伝子は、様々な哺乳動物種の天然に存在する抗体に由来してもよい。
同様に、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに事前に選択された軽鎖可変ドメイン遺伝子は、本明細書に記載されるような哺乳動物種のものであってよい。一部の場合では、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、同じ哺乳動物種（例えば、ヒトまたはラクダ科動物）の抗体に由来してもよい。任意に、事前に選択された軽鎖可変ドメイン遺伝子は、同じ哺乳動物種に由来してもよい。あるいは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３、ならびに、任意に、事前に選択された軽鎖可変ドメイン遺伝子は、様々な哺乳動物種の天然に存在する抗体に由来してもよい。
一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ及び事前に選択された可変ドメイン遺伝子、ならびに軽鎖ＣＤＲ及び事前に選択された可変ドメイン遺伝子は、全て同じ哺乳動物種、例えば、ヒト、である。
抗体（複数の形態で交換可能に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクト（例えば、全長）抗体だけでなく、その抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗体部分を含む融合タンパク質、ダイアボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ナノボディとしても知られる、例えば、ラクダ科動物にみられるＶｈＨ抗体などのＶHのみ抗体）、または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）も包含する。
代表的な抗体分子は、重鎖可変領域（ＶH）及び軽鎖可変領域（ＶL）を含み、これらは通常、抗原結合に関与する。ＶH及びＶＬ領域はさらに、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても知られる超可変性の領域に細分化することができ、それらの間に「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られる、より保存された領域が点在する。各ＶH及びＶLは通常、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／またはｃｏｎｔａｃｔ定義（これらの全てが当該技術分野で周知である）で、当該技術分野で周知の方法を使用して正確に識別することができる。例えば、以下を参照のこと、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）。ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓも参照のこと。
ナノボディとしても知られる単一ドメイン抗体もまた、本開示の範囲内にある。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、重鎖（ＶＨＨ）のみを含有する。重鎖のみ抗体（ＨｃＡｂ）は、ラクダ科動物及びサメにより天然で産生される。ＨｃＡｂの抗原結合部分は、ＶＨＨフラグメントで構成される。Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．９１１：１５－２６（２０１２）。
本明細書に開示の抗体ライブラリーは、任意の好適な形式の抗体の集団を含有してもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、任意の好適なファミリー（例えば、ＩｇＧ、またはＩｇＡ）のものであり得る全長抗体の集団を含む。他の実施形態では、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、の集団を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、一本鎖抗体の集団を含む。あるいは、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、ＶＨＨフラグメントなどの単一ドメイン抗体の集団を含んでもよい。
本明細書に記載の抗体ライブラリーを構築するための例示的なステップは、以下を含んでもよい：
（１）可変遺伝子足場として使用するのに適するＶＨ／ＶＬペアを同定すること、
（２）各ＣＤＲに単一の挿入部位を含有する足場に基づいてベクターを生成すること（残存するＣＤＲが、不変のままであってよい）、
（３）天然に存在する抗体配列（これは、天然抗体ライブラリーのシーケンシングメンバーから得られ得る）のデータベースの分析により天然に存在するＣＤＲを同定すること、
（４）天然に存在するＣＤＲ配列のデータベースから、ライアビリティをコードする可能性のあるそれらの配列を除外すること、
（５）オリゴヌクレオチドとして、ＣＤＲの残りのセットを合成すること、
（６）前に改変された足場内の適切な部位にＣＤＲを挿入すること（各足場が、唯一の部位にＣＤＲを含有し、例えば、ＨＣＤＲ１の同定された集合が、改変足場のＨＣＤＲ１部位に挿入される）。
一部の実施形態では、本明細書に記載の同定されたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせ）は、良好な折りたたみ及び／または発現について実験的にスクリーニングまたは選択されてもよく、且つ、良好でない折りたたみ、良好でない発現、他反応性、または凝集などのライアビリティに対してスクリーニングまたは選択されてもよい。選択されたＣＤＲは、足場の構成内の完全なＶドメインに挿入されてもよい。得られた完全なＶドメインはさらに、良好な折りたたみ及び／または発現についてスクリーニング及び選択することができ、及び／あるいは良好でない折りたたみもしくは発現、多反応性、または凝集などのライアビリティに対してスクリーニング及び選択することができる。選択されたＶＨ／ＶＬの完全な足場ペアは、所望の結合特異性を有する抗体のスクリーニングのために組み立て、適切なディスプレイベクター（例えば、ファージまたは酵母）にクローニングすることができる。
Ａ．重鎖及び軽鎖可変ドメインフレームワーク足場の選択
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体ライブラリーを構築するのに使用される重鎖及び／または軽鎖フレームワーク足場は、市販の治療用抗体（例えば、販売承認が米国食品医薬品局もしくは／もしくは欧州医薬品庁により承認されているもの）または現在臨床試験中、例えば、第ＩＩ相もしくは第ＩＩＩ相治験中である治療用抗体に由来してもよい。本明細書で使用される場合、治療用抗体は、（例えば、ＵＳ、ＥＰ、またはＣＡもしくはＪＰなどの他の司法管轄の）承認済みの薬物製品の抗体分子、あるいは、例えば、ＵＳまたは欧州での好適な司法管轄において臨床試験中であったかまたは現在臨床試験中である抗体分子を指す。
そのような治療用抗体で使用される生殖細胞系列重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン遺伝子は、凝集、疎水性相互作用、多重特異性、単量体性、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞）における発現レベル、そのＦａｂ形態のＴｍ、及び精製特性などの特徴について試験することができる。表１を参照のこと。望ましい特徴、例えば、哺乳動物細胞において高い発現レベル（例えば、ＨＥＫ細胞において５０ｍｇ／Ｌ以上）、高いＦａｂのＴｍ（例えば、６４℃を超える）、加速された安定性の低い勾配（例えば、０．０９未満）などを有するものを、ライブラリー構築のフレームワーク足場として選択することができる。追加の特徴及び選択基準が表１に提供され、これは、例示的な例として、最良の特性を有するそれらの治療用抗体、及び良好でない治療特性を有する３つの追加の抗体を示す。このデータは、ＪＪａｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１４，９４４－９４９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１６４０８１１４（２０１７）から導出される。
評価される各特徴は、評価された治療用抗体の最悪１０％にフラグを割り当てることができる。図１を参照のこと。一部の場合では、２つ未満のフラグを有する（例えば、１つのフラグを有するかまたはフラグを全く有さない）それらの治療用抗体は、重鎖及び／または軽鎖フレームワーク足場として使用するために選択されてもよい。
一部の実施形態では、重鎖フレームワーク足場として使用するための重鎖可変ドメイン遺伝子は、ＶＨ１－２４、ＶＨ２－７０、ＶＨ３－７、ＶＨ４－３０－４、ＶＨ５－５１、ＶＨ１－１８、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－２３、ＶＨ５－１０－１、ＶＨ３－９、またはＶＨ３－１１であり得る。代わりにまたは加えて、軽鎖フレームワーク足場として使用される軽鎖可変ドメイン遺伝子は、Ｋ１－１２、Ｋ４－１、Ｋ２Ｄ－２９、Ｋ３－１１、Ｋ３－２０、またはＬ２－１４とすることができる。そのような重鎖及び／または軽鎖フレームワーク足場は、生殖細胞系列ＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子であってよい。あるいは、重鎖及び／または軽鎖フレームワーク足場は、生殖系列遺伝子対応物と比較して、１つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４）に１つ以上の変異を含有してもよい。そのような変異は、治療用抗体内に存在し得るか、または特定のライアビリティ、例えば、メチオニン酸化、凝集、インテグリン結合、グリコシル化、脱アミド化、異性化、ペアになっていないシステイン、またはプロテアーゼ感受性、を回避するために導入されてもよい。特定の例では、本明細書に記載の抗体ライブラリーは、以下のＶＨ及びＶＬフレームワーク足場ペアを使用する：ＶＨ１－２４／ＶＫ１－１２、ＶＨ２－７０／ＶＫ４－１、ＶＨ３－７／ＶＫ２Ｄ－２９、ＶＨ４－３０－４／ＶＫ３－１１、ＶＨ５－５１／ＶＫ３－２０、またはＶＨ１－１８／ＶＬ２－１４。
一部の特定の例では、本明細書に記載の抗体ライブラリーに使用されるＶＨ及び／またはＶＬフレームワーク足場は、アブリルマブ、メポリズマブ、クレネズマブ、ネシツムマブ、アニフロルマブ、またはエボクルマブに由来し、これらのそれぞれの特徴が表２に提供される。本明細書で使用される場合、「に由来する」は、改変がないか、またはフレームワーク領域のうちの１つ以上に１つ以上の変異が導入される、例えば、ＶＨ遺伝子に（例えば、フレームワーク領域のうちの１つ以上に）及び／またはＶＬ遺伝子に（例えば、フレームワーク領域のうちの１つ以上に）最大５つのアミノ酸置換（例えば、最大４、３、２、または１つのアミノ酸置換）が導入される、これらの治療用抗体のうちのいずれかのＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子の使用を指す。
一部の例では、生殖細胞系列ＶＨ及び／もしくはＶＬ遺伝子に導入された、または参照治療用抗体（例えば、表２に記載のもの）のＶＨ及び／もしくはＶＬ遺伝子に導入された変異は、保存的置換であってよい。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷またはサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、そのような方法を編集する参考文献にみられるような当業者に既知のポリペプチド配列を変更するための方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。
例示的なＶＨ及びＶＬフレームワーク足場のアミノ酸配列（太字で示される改変されるＣＤＲ及び下線が引かれた表２に記載の親治療用抗体と比較した変異を有する）が、以下に提供される：
アブリルマブに由来する足場：
●ＣＤＲは、太字で下線が引かれる
●元の抗体由来の変異は、イタリック体にされる（全Ｊκは、Ｊκ４に置換されている）。
Figure 0007332691000001
メポリズマブに由来する足場：
Figure 0007332691000002
クレネズマブに由来する足場：
Figure 0007332691000003
ネシツムマブに由来する足場：
Figure 0007332691000004
アニフロルマブに由来する足場：
Figure 0007332691000005
エボロクマブに由来する足場：
Figure 0007332691000006
本明細書に記載のＶＨ及び／またはＶＬフレームワーク足場のうちのいずれも、対応するフレームワーク足場に、対応するＣＤＲ位置で重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲの多様な集団をそれぞれコードする複数の核酸のうちの１つ以上のクローニングを可能にするカセットを構築するために使用することができる。
一部の場合では、制限部位を、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、または重鎖ＣＤＲ３の多様な集団をコードする複数の核酸をクローニングするためにＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、またはＣＤＲ３領域に隣接する重鎖足場に導入することができる。一部の場合では、制限部位を、フレームワーク足場に対応するＣＤＲ領域の組み合わせをクローニングするために、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のうちの少なくとも２つ（例えば、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ２、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ３、またはＣＤＲ２＋ＣＤＲ３）に隣接する重鎖フレームワーク足場に導入することができる。一例では、制限部位を、対応する位置の多様な重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をクローニングするために、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の全てに隣接する重鎖フレームワーク足場に導入することができる。
一部の場合では、制限部位を、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、または重鎖ＣＤＲ３の多様な集団をコードする複数の核酸をクローニングするためにＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、またはＣＤＲ３領域に隣接する軽鎖足場に導入することができる。一部の場合では、制限部位を、フレームワーク足場に対応するＣＤＲ領域の組み合わせをクローニングするために、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のうちの少なくとも２つ（例えば、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ２、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ３、またはＣＤＲ２＋ＣＤＲ３）に隣接する軽鎖フレームワーク足場に導入することができる。一例では、制限部位を、対応する位置の多様な軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をクローニングするために、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の全てに隣接する軽鎖フレームワーク足場に導入することができる。
図２及び３は、重鎖足場に重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の多様性を導入するためのカセット、及び／または軽鎖足場に軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３の多様性を導入するためのカセットを構築するための例示的なスキームを示す。
得られたカセットは、好適な発現、ディスプレイ、または折りたたみレポーターシステムでコードされた抗体を産生するために好適な発現ベクターに配置することができる。
Ｂ．重鎖及び軽鎖ＣＤＲ集団
抗体ライブラリーの重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３集団は、天然に存在するヒト抗体に由来し得る。そのようなＣＤＲ配列は、既存の天然抗体ライブラリーで、天然に存在する抗体（例えば、ヒト抗体）をシーケンシングすること、ならびに重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ配列を同定する従来の方法でこうして得られた重鎖及び軽鎖配列を分析することにより得ることができる。代わりにまたは加えて、天然に存在する抗体ＣＤＲ配列は、天然に存在する抗体配列（例えば、ヒト抗体配列またはラクダ科動物ＶＨＨ抗体配列）の公的に利用可能なデータベース、例えば、ＮＣＢＩデータベース、ＩＭＧＴデータベース、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２４：２６，２００７の配列、及び／またはＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５７：９１７，２００６の配列、Ｋｏｖａｌｔｓｕｋ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｏｂｓｅｒｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｐａｃｅ：Ａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１８００７０８（２０１８）に記載のＴｈｅ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｐａｃｅ（ａｎｔｉｂｏｄｙｍａｐ．ｏｒｇ）、及び／またはＣｏｒｒｉｅ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ｉＲｅｃｅｐｔｏｒ：Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｑｕｅｒｙｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｂ－ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｄａｔａ ａｃｒｏｓｓ ｆｅｄｅｒａｔｅｄ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２８４，２４－４１，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２６６６（２０１８）に記載のｉＲｅｃｅｐｔｏｒデータベース（ｉｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｉｒｍａｃｓ．ｓｆｕ．ｃａ）、及び／またはＢｒｉｎｅｙ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｏｎａｌｉｔｙ ｄｅｓｐｉｔｅ ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓｅｌｉｎｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０８７９－ｙ（２０１９）に記載の配列データベース、におけるそのような抗体の配列を分析することにより得ることができる。
フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、ＩＭＧＴ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／またはｃｏｎｔａｃｔ定義（これらの全てが当該技術分野で周知である）で、当該技術分野で周知の方法を使用して正確に識別することができる。例えば、以下を参照のこと、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７，５５－７７（２００３）及び Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）。ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ，ＩＭＧＴ．ｏｒｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓも参照のこと。
こうして得られた重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列はさらに、ライアビリティを含むもの、例えば、表４に記載のもの、を除去するために分析されてもよい。一部の場合では、表４（例えば、グリコシル化部位、脱アミド化部位、異性化部位、ペアになっていないシステイン、１を超える正味の電荷（例えば、ＬＣＤＲ１－２及び／またはＨＣ ＣＤＲ１－２における）、（粘度に影響を与え得る）少なくとも２つの芳香族残基を含有するトリペプチドモチーフ、凝集を促進するモチーフ、（ｖｉｉｉ）ＧＧ、ＧＧＧ、ＲＲ、ＶＧ、Ｗ、ＷＶ、ＷＷ、ＷＷＷ、ＹＹ、またはＷＸＷ（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）のモチーフを含有するような多重特異性部位；プロテアーゼ感受性部位（フラグメント化感受性部位）、またはインテグリン結合部位）ならびに／または図５（例としてＨＣ ＣＤＲ２を使用する）に記載のライアビリティのうちの１つを含む重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列は、得られた抗体ライブラリーが除外されたライアビリティを含むメンバーを含まない（実質的に含まないまたは完全に含まない）ように除去することができる。
代わりにまたは加えて、リジン糖化部位などの潜在的な糖化部位が除去されてもよい。糖化部位とは、非酵素的プロセスを介して糖分子に結合することができるタンパク質分子内の部位を指す。例示的な糖化部位としては、ＫＥ、ＥＫ、及びＥＤが挙げられるが、これらに限定されない。追加のライアビリティは、金属触媒フラグメント化部位（例えば、ＨＳ、ＳＨ、ＫＴ、ＨＸＳ、またはＳＸＨ（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、多重特異性凝集部位（例えば、Ｘ1Ｘ2Ｘ3のモチーフを有する（式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のそれぞれが独立して、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、またはＹである）、ならびにストレプトアビジン結合モチーフ（例えば、ＨＰＱ、ＥＰＤＷ（配列番号１１７）、ＰＷＸＷＬ（配列番号１１８）（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、ＧＤＷＶＦＩ（配列番号１１９）、及びＰＷＰＷＬＧ（配列番号１２０））を含む。
実質的に含まないとは、ライアビリティを含む重鎖または軽鎖ＣＤＲの数が、ライブラリー中で２０％未満、例えば、１５％未満または１０％未満、であることを意味する。
一部の例では、上記のライアビリティのうちの２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、またはそれ以上）を含む重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列は、得られるライブラリーが除外されたライアビリティを含むメンバーが含まれない（実質的に含まれないか、または完全に含まれない）ように除去することができる。一例では、表４に記載のライアビリティの全てを含む重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列は、得られるライブラリーがライアビリティのうちのいずれかを含むメンバーを含まない（実質的に含まないか、または完全に含まない）ように除去することができる。代わりにまたは加えて、結果として得られるライブラリーが、ライアビリティのうちのいずれかを含むメンバーを含まない（実質的に含まない、または完全に含まない）ように図５に記載のライアビリティの全てを含む重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列を除去することができる。一具体例では、本明細書に開示のライアビリティの全てを含む重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列は、得られるライブラリーがライアビリティのうちのいずれかを含むメンバーを含まない（実質的に含まないか、または完全に含まない）ように除去することができる。
一部の例では、ライアビリティ、例えば、表４及び／または図５に記載のものなど、のうちの１つ以上を含む重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を除去することができるが、重鎖ＣＤＲ３配列は、ライアビリティを有するメンバーを除去することなく、天然に存在するヒト抗体に由来し得る。あるいは、１つ以上のライアビリティを含む重鎖ＣＤＲ３配列を除去することもできる。あるいはまたは加えて、ライアビリティ、例えば、表４に記載の及び図５に例として示されるもの、のうちの１つ以上を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を除去することができる。
一部の例では、異常な長さを有する重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列を除外することもできる。例えば、生殖細胞系列の長さ±２－ａａの範囲を超える長さを有する軽鎖ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２を除外することができる。図１６～２１を参照のこと。
一部の例では、脱アミド化部位（例えば、ＮＧ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＮ、ＧＮＦ、ＧＮＹ、ＧＮＴ、ＧＮＧ）、異性化部位（例えば、ＤＧ、ＤＳ、ＤＤ）、凝集部位（ＦＨＷ）；粘度に影響を与えるモチーフ（例えば、ＨＹＦ及びＨＷＨ）、良好でない開発可能性を示すモチーフ（例えば、ＬＣＤＲ１－２及び／またはＨＣＤＲ１－２の正味電荷≧＋１）、ペアになっていないシステリン、多重特異性部位（例えば、ＧＧＧ、ＲＲ、ＶＧ、ＶＶ、ＶＶＶ、ＷＷ、ＷＷＷ、ＹＹ、ＷＸＷ（Ｘが、任意のアミノ酸残基を指す）、及びＧＧ）、ならびにグリコシル化部位（例えば、ＮＸＳまたはＮＸＴ（式中、Ｘが、プロリンを除く任意のアミノ酸残基である）を含有する重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２メンバーを除外することができる。一部の例では、重鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ２メンバーにおける以下のライアビリティのうちの１つ以上を除外することもできる：追加のグリコシル化部位（例えば、ＮＸＣ、Ｘが、プロリン以外の任意のアミノ酸残基である）、追加の脱アミノ化部位（例えば、ＮＡ、ＮＨ、及び／もしくはＮＤ）、追加の異性化部位（例えば、ＤＴ及び／もしくはＤＨ）、リジン糖化部位（例えば、ＫＥ、ＥＫ、及びＥＤ）、インテグリン結合部位（例えば、ＲＧＤ、ＲＹＤ、ＬＤＶ、及びＫＧＤ）、プロテアーゼ感受性部位（フラグメント化部位）（例えば、ＤＰ、ＤＧ、ＤＳ、ＤＶ、ＤＹ、ＤＦ、ＤＱ、ＤＫ、ＤＬ、及びＤＤ）、金属触媒フラグメント化部位（例えば、ＨＳ、ＳＨ、ＫＴ、ＨＸＳ、及びＳＸＨ（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、多重特異性凝集部位（例えば、Ｘ1Ｘ2Ｘ3（式中、各Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のそれぞれが独立して、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹである）のモチーフを有する）、ならびに／またはストレプトアビジン結合部位（例えば、ＨＰＱ、ＥＰＤＷ（配列番号１１７）、ＰＷＸＷＬ（配列番号１１８）（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、ＧＤＷＶＦＩ（配列番号１１９）、及びＰＷＰＷＬＧ（配列番号１２０））。
一部の例では、本明細書に記載の１つ以上のライアビリティを有する重鎖ＣＤＲ３メンバーを除外することもできる。あるいは、重鎖ＣＤＲ３メンバーは、本明細書に記載の１つ以上のライアビリティを除去することなく、直接、天然に存在する抗体に由来するものを含んでもよい。
代わりにまたは加えて、脱アミド化部位（例えば、ＮＧ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＮ、ＧＮＦ、ＧＮＹ、ＧＮＴ、ＧＮＧ）、異性化部位（例えば、ＤＧ、ＤＳ、ＤＤ）、凝集部位（ＦＨＷ）；粘度に影響を与えるモチーフ（例えば、ＨＹＦ及びＨＷＨ）、良好でない開発可能性を示すモチーフ（例えば、ＬＣＤＲ１－２、ＨＣＤＲ１－２の正味電荷≧＋１）、ペアになっていないシステリン、多重特異性部位（例えば、ＧＧＧ、ＲＲ、ＶＧ、ＶＶ、ＶＶＶ、ＷＷ、ＷＷＷ、ＹＹ、ＷＸＷ（Ｘが、任意のアミノ酸残基を指す）、及びＧＧ）、ならびにグリコシル化部位（例えば、ＮＸＳまたはＮＸＴ（式中、Ｘが、プロリンを除く任意のアミノ酸残基である）を含有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３メンバーを除外することができる。一部の例では、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３メンバーにおける以下のライアビリティのうちの１つ以上を除外することもできる：追加のグリコシル化部位（例えば、ＮＸＣ、Ｘが、プロリン以外の任意のアミノ酸残基である）、追加の脱アミド化部位（例えば、ＮＡ、ＮＨ、及び／またはＮＤ）、追加の異性化部位（例えば、ＤＴ及び／またはＤＨ）、リジン糖化部位（例えば、ＫＥ、ＥＫ、及びＥＤ）、インテグリン結合部位（例えば、ＲＧＤ、ＲＹＤ、ＬＤＶ、及びＫＧＤ）、プロテアーゼ感受性部位（フラグメント化部位）（例えば、ＤＰ、ＤＧ、ＤＳ、ＤＶ、ＤＹ、ＤＦ、ＤＱ、ＤＫ、ＤＬ、及びＤＤ）、金属触媒フラグメント化部位（例えば、ＨＳ、ＳＨ、ＫＴ、ＨＸＳ、及びＳＸＨ（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、多重特異性凝集部位（例えば、Ｘ1Ｘ2Ｘ3のモチーフを有する（式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のそれぞれが独立して、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、またはＹである）、ならびに／またはストレプトアビジン結合部位（例えば、ＨＰＱ、ＥＰＤＷ（配列番号１１７）、ＰＷＸＷＬ（配列番号１１８）（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、ＧＤＷＶＦＩ（配列番号１１９）、及びＰＷＰＷＬＧ（配列番号１２０））。
一部の例では、本明細書に記載の１つ以上のライアビリティは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３メンバーの全てから除外されてもよい。
１つ以上のライアビリティを含む配列を除外するか、または全ての配列を維持する、天然に存在する抗体から得られた、得られた重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列は、ＣＤＲ配列をコードし且つ複製する核酸を合成するために、テンプレートとして使用することができる。そのような核酸は、本明細書に開示のＶＨ及び／またはＶＬ足場の対応するＣＤＲの位置に挿入することができ、「複製された天然ＣＤＲ」と呼ばれる。
必要に応じて、１つ以上の重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲが挿入されたＶＨ及び／またはＶＬ足場を有する発現ベクターは、機能的メンバーを単離するのに適する発現／ディスプレイシステムに導入することができる。機能的メンバーは、１つ以上の優れた特徴、例えば、好適なディスプレイシステムにおける良好な発現及びディスプレイ、折りたたみの改善、凝集の低減、もしくは多反応性、及び／またはより大きいＴｍ、を有するものを含む。そのような機能メンバーは、発現ベクターから産生された抗体を提示する宿主細胞を収集すること、ならびに、収集された宿主細胞における発現ベクターにコードされる対応する重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ配列をシーケンシングすることにより同定することができる。
例えば、最初の抗体ライブラリーはまた、適切な抗体折りたたみを検出するコンフォメーションプローブで染色されている抗体を提示する酵母について選別されてもよい。Ｔｒａｘｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６（２）：１７４－８０，２０１２。そのようなコンフォメーションプローブの例としては、それぞれＶＨ３及びＶＫドメインに結合することが可能なプロテインＡ（Ｈｉｌｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１７８（１）：３３１－６，１９９３、Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｊ．Ｉｍｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７７（１－２）：１５１－６３，１９９４、及びＲｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５４（１２）：６４３７－４５，１９９５）またはプロテインＬ（Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７０（１）：１８１－９，１９８８、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，９（８）：６７９－８７，２００１、及びＥｎｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，３４７（１）：１０７－２０，２００５）、ならびに全ての抗体にみられる「ヌクレオチド結合部位」に結合するインドール３－酪酸の誘導体（Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２８（２５）：９６４０－８，２０１２、Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，８４（１８）：７７２１－８，２０１２、Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．，２５（７）：１１９８－２０２，２０１４、及びＭｕｓｔａｆａｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，１１２（７）：１３２７－３４，２０１５）が挙げられる（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９３（１２）：６０１９－２４，１９９３）。
コンフォメーションプローブの以前の使用は、酵母ディスプレイにおける高い発現及び熱安定性を予測することが示されている（Ｔｒａｘｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｓｈｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９２（５）：９４９－５６，１９９９、Ｔｒａｘｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，１８２４（４）：５４２－９，２０１２、Ｔｒａｘｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２６（４）：２５５－６５，２０１３、及びＨａｓｅｎｈｉｎｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２６（１０）：６７５－８２，２０１３）。このアプローチは、十分に発現され且つ良好に折りたたまれている抗体フラグメントについて選択する。良好な提示のための積極的な選択の代わりに、個々の各ＣＤＲライブラリーは、ライアビリティを含むＣＤＲを枯渇させることができる。例えば、抗体スクリーニングに使用されるスクリーニング（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．，５（５）：７８７－９４，２０１３、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，７（４）：７７０－７，２０１５、Ｋｏｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．７（４）：７５２－８，２０１５、Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．，７（２）：３５２－６３，２０１５、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２８（１０）：４０３－１４，２０１５、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．，９（４）：６４６－５３，２０１７、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２６（１０）：６６３－７０，２０１３、及びＫｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．，９（７）：１０３６－４０，２０１７）を、酵母ディスプレイの選別に適合させること、及びより「開発可能な」表現型に対応する酵母ディスプレイ抗体を単離することにより、高機能ライブラリーを作成するために組み合わせることができる好適なＣＤＲが選択される。
そのような選択の例としては、多重特異性試薬、ヘパリン、またはシャペロンが挙げられ、そのような物質に結合しない抗体のみを保持する。熱ショックステップを適用することにより、さらなる安定性の増加を生じさせることができる（Ｔｒａｘｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｓｈｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９２（５）：９４９－５６，１９９９、Ｔｒａｘｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，１８２４（４）：５４２－９，２０１２、Ｔｒａｘｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２６（４）：２５５－６５，２０１３、及びＨａｓｅｎｈｉｎｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２６（１０）：６７５－８２，２０１３）。図２３も参照のこと。
重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３の機能的メンバーをコードする配列は、そのような機能的メンバーをコードする核酸を合成するためのテンプレートとして使用することができ、または直接使用することができる。次に、得られた核酸は、本明細書に記載のＶＨ及び／またはＶＬ足場に挿入し、また本明細書に記載されるととおり抗体ライブラリーを作製することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示の抗体ライブラリーは、非機能的メンバーを実質的に含まず、例えば、１０％未満（例えば、８％未満、５％未満、３％未満、１％未満、またはそれ以下）の非機能的メンバーを有する。
Ｃ．抗体ライブラリー
本明細書に記載の抗体ライブラリーは、複数の抗体重鎖及び／または抗体軽鎖可変ドメインをコードする複数の核酸を含んでもよく、これは一括して、対応するＣＤＲ位置に挿入された重鎖または軽鎖ＣＤＲ１の多様な集団、重鎖または軽鎖ＣＤＲ２の多様な集団、及び／または重鎖または軽鎖ＣＤＲの多様な集団を有する共通のＶＨ及び／またはＶＬフレームワーク足場（例えば、それらは、本明細書に記載のもの）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体ライブラリーは、複数の抗体重鎖可変ドメインをコードする複数の核酸を含む重鎖ライブラリーである。一部の例では、重鎖ライブラリーは、（少なくとも１０2の固有の重鎖ＣＤＲ１配列を有する）重鎖ＣＤＲ１の少なくとも１０2の多様性、例えば、少なくとも１０3、１０4、１０5の多様性、または少なくとも１０6の多様性、を含んでもよい。代わりにまたは加えて、重鎖ライブラリーは、（少なくとも１０2の固有の重鎖ＣＤＲ２配列を有する）重鎖ＣＤＲ２の少なくとも１０2の多様性、例えば、少なくとも１０3、１０4、１０5の多様性、または少なくとも１０6の多様性、を含んでもよい。他の例では、重鎖ライブラリーは、（少なくとも１０2の固有の重鎖ＣＤＲ３配列を有する）重鎖ＣＤＲ３の少なくとも１０2の多様性、例えば、少なくとも１０3、１０4、１０5の多様性、少なくとも１０6の多様性、少なくとも１０7の多様性、または少なくとも１０8多様性、を含んでもよい。
一部の例では、重鎖ライブラリーは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、または重鎖ＣＤＲ３にのみ多様性を含んでもよい。他の例では、重鎖ライブラリーは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のうちの少なくとも２つ（例えば、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ２、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ３、またはＣＤＲ２＋ＣＤＲ３）に多様性を含んでもよい。一具体例では、重鎖ライブラリーは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の全てに多様性を含む。
一部の実施形態では、重鎖ライブラリーは、標的抗原への結合活性を有する事前に選択された抗体（親抗体）の親和性成熟のために生成された２次ライブラリーである。そのような２次ライブラリーは、親抗体の他のＣＤＲ配列（複数可）を維持しながら、重鎖ＣＤＲ領域の１つまたは２つに多様性を含んでもよい。例えば、２次ライブラリーは、親抗体と同じ重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、ならびに重鎖ＣＤＲ３配列の多様な集団を含んでもよい。あるいは、２次ライブラリーは、親抗体と同じ重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに重鎖ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２配列の多様な集団を含んでもよい。
本明細書に開示の重鎖ライブラリーのうちのいずれも、共通の軽鎖可変領域とペアになっていてもよい。あるいは、本明細書にも記載される軽鎖抗体ライブラリーのうちのいずれかとペアになっていてもよい。
複数の抗体軽鎖可変ドメインをコードする複数の核酸を含む抗体軽鎖ライブラリーも本明細書で提供される。一部の例では、軽鎖ライブラリーは、（少なくとも１０2の固有の軽鎖ＣＤＲ１配列を有する）軽鎖ＣＤＲ１の少なくとも１０2の多様性、例えば、少なくとも１０3、１０4、１０5の多様性、または少なくとも１０6の多様性、を含んでもよい。代わりにまたは加えて、軽鎖ライブラリーは、（少なくとも１０2の固有の軽鎖ＣＤＲ２配列を有する）軽鎖ＣＤＲ２の少なくとも１０2の多様性、例えば、少なくとも１０3、１０4、１０5の多様性、または少なくとも１０6の多様性、を含んでもよい。他の例では、軽鎖ライブラリーは、（少なくとも１０2の固有の軽鎖ＣＤＲ３配列を有する）軽鎖ＣＤＲ３の少なくとも１０2の多様性、例えば、少なくとも１０3、１０4、１０5の多様性、少なくとも１０6の多様性、少なくとも１０7の多様性、または少なくとも１０8多様性、を含んでもよい。
一部の例では、軽鎖ライブラリーは、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、または軽鎖ＣＤＲ３にのみ多様性を含んでもよい。他の例では、軽鎖ライブラリーは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のうちの少なくとも２つ（例えば、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ２、ＣＤＲ１＋ＣＤＲ３、またはＣＤＲ２＋ＣＤＲ３）に多様性を含んでもよい。一具体例では、軽鎖ライブラリーは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の全てに多様性を含む。
一部の実施形態では、軽鎖ライブラリーは、標的抗原への結合活性を有する事前に選択された抗体（親抗体）の親和性成熟のために生成された２次ライブラリーである。そのような２次ライブラリーは、親抗体の他のＣＤＲ配列（複数可）を維持しながら、軽鎖ＣＤＲ領域のうちの１つまたは２つに多様性を含んでもよい。例えば、２次ライブラリーは、親抗体と同じ軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、ならびに軽鎖ＣＤＲ３配列の多様な集団を含んでもよい。あるいは、２次ライブラリーは、親抗体と同じ軽鎖ＣＤＲ３配列、ならびに軽鎖ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２配列の多様な集団を含んでもよい。
図３５及び図３６に示されるように、２次ライブラリーは、ＶＬシャッフリング及び／またはＶＨ ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２シャッフリングを介して生成されてもよい。
本明細書に開示の軽鎖ライブラリーのうちのいずれも、共通の重鎖可変領域とペアになっていてもよい。例えば、図２６を参照のこと。あるいは、本明細書にも記載される重鎖抗体ライブラリーのうちのいずれかとペアになっていてもよい。例えば、図２７を参照のこと。
ＩＩ．抗体ライブラリースクリーニング
本明細書に記載の抗体ライブラリーのうちのいずれも、目的の抗原に結合特異性を有する抗体をスクリーニングするために使用されてもよい。ライブラリーの核酸でコードされる抗体は、好適な発現／ディスプレイシステム、例えば、無細胞ディスプレイシステム（例えば、リボソームディスプレイ）、ファージディスプレイシステム、原核細胞ベースのディスプレイシステム（例えば、細菌ディスプレイ）、または原核細胞ベースのディスプレイシステム（例えば、酵母ディスプレイまたは哺乳動物細胞ディスプレイ）を使用して発現及び提示させることができる。ある特定の実施形態では、抗体ライブラリーは、酵母細胞上で発現及び提示される。他の実施形態では、抗体ライブラリーは、ファージ粒子上で発現及び提示される（ファージディスプレイ）。他の実施形態では、２つ以上のディスプレイシステム、例えば、ファージディスプレイとそれに続く酵母ディスプレイが使用される。
抗体のライブラリーは、任意の形式の、好適なシステム、例えば、本明細書に記載のもので発現／提示されてもよい。例としては、インタクト抗体（全長抗体）、その抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ）、または一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
ファージディスプレイは、バクテリオファージ（例えば、ファージｆ１、ｆｄ、及びＭ１３）を使用するタンパク質ディスプレイ形式である。このシステムでは、少なくとも１つの抗体鎖（例えば、重鎖及び／または軽鎖）が通常、バクテリオファージコートタンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質、または主要コートタンパク質、に共有結合している（例えば、ＷＯ００／７１６９４を参照のこと）。ファージディスプレイは、例えば、Ｕ．Ｓ．５，２２３，４０９、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０、ＷＯ９０／０２８０９、ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：１８２１８－３０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１－２０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２：３７１－８、Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０－１３７２、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５－７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９－８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６－３５８０、Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３－１３７７、及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３－４１３７に記載される。
タンパク質構成要素を提示するバクテリオファージは、標準的なファージ調製法、例えば、成長培地のＰＥＧ沈殿、を使用して成長させて、採取することができる。個々のディスプレイファージを選択した後、選択されたタンパク質構成要素をコードする核酸は、増幅後に、選択されたファージに感染された細胞またはファージ自体から単離することができる。個々のコロニーまたはプラークを選択することができ、核酸を単離してシーケンシングすることができる。
他の実施形態では、真核生物の発現／ディスプレイシステム、例えば、酵母細胞または哺乳動物細胞を、本明細書に記載の抗体のライブラリーを発現及び提示するために使用することができる。酵母ディスプレイは、タンパク質構成要素（例えば、抗体構成要素）が酵母細胞壁タンパク質（例えば、Ａｇａ１ｐまたはＡｇａ２ｐ）に直接的または間接的に結合しているタンパク質ディスプレイ形式である。一部の場合では、抗体の１つの鎖を、直接提示するために酵母細胞壁タンパク質に共有結合的に融合させることができる。他の例では、抗体構成要素及び酵母細胞壁構成要素間の会合は、仲介物質により媒介することができる。酵母ディスプレイは、例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２０（１－２）：１７９－１８８，１９９８、Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９２（２）：２４３－２４８，２０００、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５４６（２－３）：２８８－２９４，２００３、及びＢｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ５２６（２）：９９－１０６，２０１２に記載される。
標的抗原に結合することが可能な抗体を単離するために本明細書に記載の抗体ライブラリーをスクリーニングするために、抗体のライブラリーは、抗体－抗原結合を可能にする好適な条件下で標的抗原と接触させることができる。標的抗原に結合する抗体を提示するファージ粒子または宿主細胞は、例えば、保持または標的抗原が固定化され、必要に応じて増幅されるサポートメンバーにより単離することができ、提示された抗体をコードする核酸を決定することができる。スクリーニングプロセスを複数回繰り返すことができ、ディスプレイシステムを組み合わせて使用することができる。必要とされる場合、様々な抗原を、所望の結合特異性を有する抗体メンバーを選択するために、または非標的抗原への結合活性を有する抗体メンバーを除外する負の選択のために使用することができる。
本明細書に記載のライブラリーに由来する抗体のスクリーニングは、任意の適切な手段により実施することができる。例えば、結合活性は、標準的なイムノアッセイ及び／またはアフィニティークロマトグラフィーで評価することができる。治療標的に結合する候補抗体の能力を決定することは、例えば、表面プラズモン共鳴に基づいて所与の標的抗原への抗体の結合速度を測定するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）機器を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイすることができる。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、多数の動物モデルのうちのいずれかを使用して実施し、その後、続いて、必要に応じてヒトにおいて試験することができる。細胞ベースの生物学的アッセイも企図される。
抗体ライブラリースクリーニングから同定されたリード抗体は、本明細書に記載の親和性成熟を受け得る。親和性成熟から生じる２次ライブラリーは、本明細書で提供される日常的な実施及び／または開示に従って、所望の特徴、例えば、高い結合親和性及び／または結合特異性を有する結合体についてスクリーニングされてもよい。
一般的手法
本開示の実施は、別途指示のない限り、当業者の技能範囲内の分子生物学（組み換え手法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の手法を用いるであろう。そのような手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５））、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））、及び Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献で十分に説明される。
さらなる詳説なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられている。それ故、以下の具体的な実施形態は、単なる例示であり、いかなる方法であれ、本開示の残部を限定するものではないと解釈すべきである。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
実施例１：足場としての使用に適するＶＨ ＶＬペアを同定する
ＣＤＲ挿入の足場として好適なＶＨ／ＶＬペアは、非常に多様で機能性の高い抗体ライブラリーを作成するために非常に重要である。足場を選択するための通常の理由は、以下のとおりである：（ｉ）足場は、自然で通常使用される（例えば、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－２３）、（ｉｉ）足場は、既知の抗体から選択される、（ｉｉｉ）足場は、他のものより広く使用されている、（ｉｖ）足場は、コンセンサス生殖細胞系列配列を含有する、及び（ｖ）足場のＶＨ及びＶＬペアは、安定し、十分に発現され、及び非凝集であると考えられる。
抗体ライブラリー構築のための足場として使用される好適なＶＨ／ＶＬペアを同定するための代替アプローチが本明細書で提供される。ある特定の承認済み抗体及び現在承認された、または第２相もしくは第３相の臨床試験中の抗体について記載する近年の刊行物を分析した（Ｊａｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１４，９４４－９４９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１６４０８１１４（２０１７））。これらの抗体のＶＨ及びＶＬ生殖細胞系列遺伝子を決定した。論文の各臨床抗体について提供された開発可能性データ（例えば、凝集、疎水性相互作用、多重特異性、単量体性、ＨＥＫ細胞における発現レベル、及びＦａｂ Ｔｍ）に基づいて、臨床抗体におけるこれらの生殖細胞系列遺伝子の頻度及び開発可能性を評価した。試験された標準のそれぞれに対して最悪の１０％の値を示す抗体にフラグを付け（表１で太字及び斜体で強調される）、１つ以下のフラグを有する抗体のみを開発可能とみなした。表１では、１つ以下のフラグを含有する全ての臨床抗体が、２～６９行に示される。７０～７２行では、２つ以上のフラグを有する抗体の例が、示される（表１）。例示的な例として選択された抗体が、太字で強調される。抗体の臨床開発期及びこれらの抗体のフラグのパーセンテージの相関関係が図１に示される。
６つの治療用抗体（アブリルマブ、メポリズマブ、クレネズマブ、ネシツムマブ、アニフロルマブ、及びエボクルマブ）が本発明者らの最終的な足場の選択肢として選択される（表１で太字及びイタリック体で強調され、さらに表２に記載される）。それらは十分に発現され、ライアビリティを全く示さないか、または最小限のライアビリティを示し、ごく少ないフレームワーク変異を含有し、これらの抗体に好適な抗体足場の存在を示す低免疫原性を有する。
表２に記載の治療用抗体のそれぞれのために、実施例２に記載されるように、７つのベクターを設計及び合成した。表２に記載の６つの元の足場に由来する元の足場、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３足場をコードするベクターの概略図が、図２に示される。足場は、５つのＶＨ遺伝子ファミリー（ＶＨ１－５）及び５つのＶＬファミリー（ＶＫ１－４；Ｖλ２）を表す。表２。天然に存在する複製ＣＤＲを、さらなる試験のために、十分に発現され、折りたたまれ、ライアビリティがないことが確認されたこれらの選択された例示的な抗体足場に挿入することができる。
Figure 0007332691000007
Figure 0007332691000008
Figure 0007332691000009
Figure 0007332691000010
Figure 0007332691000011
Figure 0007332691000012
Figure 0007332691000013
 ＊これらの同定されたＣＤＲは、同一であるが、様々なＶＨ１遺伝子（ＶＨ１－１８及びＶＨ１－２４）に対応する様々な隣接領域と共に合成される。
＾これらの同定されたＣＤＲは、同一であるが、様々なＶＫ３遺伝子（ＶＫ３－２０及びＶＫ３－１１）に対応する様々な隣接領域と共に合成される。
実施例２：実験的ＣＤＲスクリーニング用のベクターの作成
表２に示される６つの足場を使用して作成された６つのライブラリーのそれぞれに対して、足場のそれぞれに対応する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする７つのポリヌクレオチドを合成した。７つの合成されたポリヌクレオチドのうちの１つが、未改変ｓｃＦｖをコードし、他の６つのポリヌクレオチドを、元のＣＤＲのうちの１つが、２つの逆のＢｓａＩ部位（認識配列の外部で切断するＩＩｓ型酵素）、ベクターの切断を確実にし、且つＢｓａＩ部位間のスペーサーとして機能する追加のＳｆｉＩ部位、フレームシフト、及びバックグラウンド配列の発現を防止するオーカー終止コドンを含む制限部位の組み合わせで置換されるように改変した（図２～３）。足場をコードするこれらの改変ヌクレオチドのそれぞれを酵母ディスプレイベクターにクローニングし、この配列中の終止コドンの存在により、改変ＣＤＲが機能的ＣＤＲと置換されるまで、酵母表面上の足場の発現が防止された。
実施例３：ＣＤＲ配列のデータベースの生成及び潜在的なライアビリティを示すＣＤＲの情報科学的除外
本明細書で例示されるライブラリーの使用に適するＣＤＲを同定するために採用されたプロセスが図４に示される。天然に存在するＣＤＲ（ヒト抗体などの天然に存在する抗体にみられるＣＤＲ）のデータベースを生成するために、合計１億４千万超の読み取りを含む、合計４０人のドナーに由来する可変遺伝子の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を実施した。ＮｏｖａＳｅｑ分析をＬＣＤＲ３シーケンシングデータに適用し、ＭｉＳｅｑ分析を重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２シーケンシングデータに適用した。可変遺伝子配列の分析により、表３に示されるＣＤＲの数を特定することが可能になった。
全体として、以下の重鎖及び軽鎖ＣＤＲに対応する固有のＣＤＲを同定し、固有のＣＤＲ及び潜在的な隣接足場オリゴを含むＣＤＲの両方が示された（括弧内）。様々な足場に対応する様々な隣接配列を有する一部のＣＤＲを合成する必要があるので、オリゴの数は、ＣＤＲの数よりも多い：
●約５２，６７５（６６，０２０）のＬＣＤＲ１、
●約１９，５５０（２３，８５４）のＬＣＤＲ２、
●約２，１８０，９２２（２，６１７，０５１）のＬＣＤＲ３、
●約１４７，７４１（１６７，３７６）のＨＣＤＲ１、
●約１７０，７５８（２０２，１７０）のＨＣＤＲ２、及び
●約１３，５８８，７５４のＨＣＤＲ３。
短い配列に低減させたライアビリティを使用して、それらを含有するＣＤＲを同定した。例えば、脱アミド化、異性化、グリコシル化、またはペアになっていないシステインなどのライアビリティを含有するＨＣＤＲ２配列は、ピンク色で強調される（図５）。ライアビリティを同定し、ライブラリーのライアビリティを含有するＣＤＲを除外する重要性を強調するために、ＨＣＤＲ３におけるペアになっていないシステインを一例として図６～８に示した。システインは、最大４％のＨＣＤＲ３アミノ酸を成し、それらは、ペアになって、構造的に配置される必要があり、そうでなければ、ペアになっていないシステインまたは配置が良好でないなシステインが存在することにより、ＣＤＲに望ましくない構造的または化学的反応性が導入され、それにより、ＣＤＲが非機能的また開発不能になるであろう。同定された例示的なライアビリティの一覧が表４に記載され、追加の配列ベースのライアビリティが同様にスクリーニングすることができることが明らかである。記載されたライアビリティの出現について、先に表３で同定された固有のＣＤＲの一覧を試験し、ライアビリティを含有する全てのＣＤＲを固有のＣＤＲの一覧から計算的に除外した。図９～１３は、様々なＣＤＲ集団からのライアビリティの除外の程度を反映する。
Figure 0007332691000014
Figure 0007332691000015
Figure 0007332691000016
実施例４：シーケンシングエラー除外
上記の実施例３に開示の潜在的なライアビリティを含有するＣＤＲの除去後に、シーケンシングエラーの結果として生じている可能のあるＣＤＲもまた計算的に除外した。シーケンシングされたＣＤＲがオーバーサンプリングされる場合、シーケンシングエラーの可能性が高い。一般に、特定のＣＤＲのコピーが多いほど、それが真正であり、シーケンシングエラーの結果ではない可能性が高い。
データセットの各固有のＣＤＲの存在量を、ライアビリティを含有するものが除去された後に評価した。様々なライブラリー及び個々のＣＤＲのそれぞれに対し、様々な存在量（読み取り数）で保持された配列のパーセンテージを評価した。保持される情報が多いほど、ＣＤＲがシーケンシングエラーの結果であることはまれで、天然に存在するＣＤＲではない可能性が高い。各ライブラリーに様々なしきい値を適用した時の、ＨＣＤＲ３を除く様々なＣＤＲに対し除外された配列のパーセンテージが図１４に示される。固有のＣＤＲの数と保持された配列情報の良好なバランスを表すために、それぞれの固有のＣＤＲに対し、４回以上の読み取りのしきい値を評価した。読み取りの総数、及び同定された固有のＣＤＲの総数に応じて、様々なしきい値を選択することができることは明らかである。各ライブラリーに対し、個々のＣＤＲそれぞれに対して異なるしきい値を使用することができるが、４回の読み取りの単一のしきい値を一貫性があるように選択した。４回未満の読み取りを有するＣＤＲをライブラリーから除去した。
図１５に示されるように、様々なしきい値を使用すると、様々な配列を有する様々な数のＣＤＲを得ることが予想されるであろう。
実施例５：長さの異常に基づくＣＤＲの除外
生殖細胞系列ＣＤＲの長さが保存されるが、親和性成熟中に変動し得る。長さが異常なＣＤＲは、それらを含有する抗体の折りたたみ及び発現を低減させることが予想される。長さが異常なＣＤＲも図４に記載の規則の下で計算的に除外し、図１６～２１に示されるように、ピンクの網掛け領域の外側の長さを有するＣＤＲを除外した。保持されるＣＤＲの数への影響が表５及び表６に示される。代替規則が、ライアビリティを欠く天然に存在するＣＤＲの同定に適用され得ること、及び新しいライアビリティが同定されると、それらを同様に除外することができることは明らかである。さらに、多反応性または凝集挙動などのライアビリティの存在について実験的に選択されたＣＤＲで次世代シーケンシングを実施することにより、追加の配列ライアビリティを同定することができ、このアプローチを使用して作成された他のライブラリーで除外することができる。シーケンシングされたＣＤＲの数が増加するにつれて、固有のＣＤＲの数、及びライアビリティを欠く固有のＣＤＲの数の両方が増加することが予想され、潜在的なライブラリーの多様性が増加する。
これらの様々な情報操作の完了後、ライアビリティを全く含有しないと確認された固有のＣＤＲの最終の数は、この例示的なライブラリーの各足場について、固有のＣＤＲ及び隣接足場オリゴを含むＣＤＲの両方を示す表３（括弧内）に示される：
●約３，５６６（５，４７６）のＬＣＤＲ１、
●約２，９７２（３，９４４）のＬＣＤＲ２、
●約２１８，４７１（２９７，５０９）のＬＣＤＲ３、
●約１４，３４０（１７，２００）のＨＣＤＲ１、
●約１１，３９７（１３，５６８）のＨＣＤＲ２、及び
●約１，７９１，８０１のＨＣＤＲ３。
Figure 0007332691000017
Figure 0007332691000018
実施例６：最終のＣＤＲに対応するオリゴヌクレオチドの合成及び増幅
上記の実施例に記載の除外ステップ後にＨＣＤＲ１－２及びＬＣＤＲ１－３について同定されたものに対応するオリゴヌクレオチドを合成し（Ｔｗｉｓｔ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンフランシスコ）、選択されたＣＤＲをコードする合計３３７，６９７のオリゴヌクレオチドが得られた。これらのオリゴヌクレオチドのＣＤＲコード配列を、フレームワークベクターに相同の５’及び３’配列に隣接させて、ＣＤＲコード配列をフレームワークベクターにクローン化した。増幅と酵母ディスプレイベクターへのオリゴヌクレオチドの挿入の両方のために、相同配列を使用した。
各ライブラリー足場及びＣＤＲ位置に特異的なプライマーペアを使用して、複製された天然ＣＤＲの組み合わせたプールを増幅し、相同組み換えにより実施例２に記載の酵母ディスプレイベクターにクローン化し、３０の異なる単一ＣＤＲループライブラリー（６つのライブラリー、ＬＣＤＲ１－３、ＨＣＤＲ１－２）が得られた。蛍光活性化細胞選別により、ＳＶ５タグを認識するモノクローナル抗体を使用して、提示のためにこれらを選別した。これらのライブラリーのそれぞれに対し、これは、任意のレベルの提示を可能にする使用される特定のプライマーペア（以下を参照のこと）を使用して増幅される複製天然ＣＤＲの多様性を表し、図２２では、「フィルタリング前の複製天然のもの」として示される。
図２２Ａ～Ｆは、ＨＣＤＲ１－２及びＬＣＤＲ１－３の複製された天然の多様性をコードするために、合成オリゴヌクレオチドを使用する例示的な利点を示す。特に、ＣＤＲ１－２の場合、存在量が最も多いＣＤＲ及び存在量が最も少ないＣＤＲの存在量の差は、３００，０００倍を超え得、生殖細胞系列ＣＤＲ１－２配列の存在量が圧倒的に最も多い。天然ＣＤＲを合成する場合、図２２Ａ～Ｆに示されるように、分布は常に、はるかにより均一になり、存在量が最も多いＣＤＲ及び存在量が最も少ないＣＤＲの存在量の差は、ＣＤＲ及びライブラリーに応じて１０～２００倍の範囲である。本明細書に記載のアプローチを使用した各ＣＤＲでの多様性の改善はさらに、図２２Ｇ～Ｌに示され、そこでは累積分布が、ライブラリー及びＣＤＲ位置毎に示される。各プロットに対する数値は、存在量が最も多い５０％のクローンを成すクローンの数であるＤ５０を示し、全てのライブラリーの全てのＣＤＲについて、複製された天然の多様性が、天然の多様性よりも大幅に高い。ＨＣＤＲ３の場合、ＶＤＪ再構成プロセス（ＶＤ及びＤＪ接合部でのヌクレオチドの除去の追加を含む）により、様々なＨＣＤＲ３間の存在量の変動性が少なくなる。
以下のプライマーを使用して、オリゴヌクレオチドのプールを増幅に供した：
ＬＣＤＲ１の場合：Ｆ－Ｌ１－ＬＣＤＲ１～Ｆ－Ｌ６－ＬＣＤＲ１及びＲ－Ｌ１－ＬＣＤＲ１～Ｒ－Ｌ６－ＬＣＤＲ１
ＬＣＤＲ２の場合：Ｆ－Ｌ１－ＬＣＤＲ２～Ｆ－Ｌ６－ＬＣＤＲ２及びＲ－Ｌ１－ＬＣＤＲ２～Ｒ－Ｌ６－ＬＣＤＲ２
ＬＣＤＲ３の場合：Ｆ－Ｌ１－ＬＣＤＲ３～Ｆ－Ｌ６－ＬＣＤＲ３及びＲ－Ｌ１－ＬＣＤＲ３～Ｒ－Ｌ６－ＬＣＤＲ３
ＨＣＤＲ１の場合：Ｆ－Ｌ１－ＨＣＤＲ１～Ｆ－Ｌ１－ＨＣＤＲ１及びＲ－Ｌ１－ＨＣＤＲ１～Ｒ－Ｌ１－ＨＣＤＲ１
ＨＣＤＲ２の場合：Ｆ－Ｌ１－ＨＣＤＲ２～Ｆ－Ｌ１－ＨＣＤＲ２及びＲ－Ｌ１－ＨＣＤＲ２～Ｒ－Ｌ１－ＨＣＤＲ２。
例示的な増幅プライマー配列及びアセンブリプライマー配列が、それぞれ表７及び表８に提供される。
Figure 0007332691000019
Figure 0007332691000020
Figure 0007332691000021
Figure 0007332691000022
Figure 0007332691000023
ＨＣＤＲ１－２及びＬＣＤＲ１－３にみられる多様性は、アレイベースのオリゴヌクレオチド合成で比較的容易に網羅することができるが、一部の場合では、ＨＣＤＲ３ではそうではない可能性があり、元の多様性は、１０8の異なるＨＣＤＲ３を容易に超え得る。ライアビリティ及び４回未満みられたＣＤＲを除外し得る後でも、異なるＨＣＤＲ３の数は、ＮｏｖａＳｅｑ（３ｘ１０9の読み取り）が多様性を評価されるために使用される場合、１０7を超え得る。これは、合成ＨＣＤＲ３の多様性を、アレイベースの合成で扱いやすい１０6未満の配列に制限することにより、または、合成ＨＣＤＲ１－２及びＬＣＤＲ１－３の多様性を、ドナーリンパ球から増幅させた天然に多様なＨＣＤＲ３と組み合わせることにより対処することができる。
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ ＬｅｕｋｏＰａｋ ＣＤ１９キットを使用して、合計１０9を超えるＢ細胞を含む１０人のドナーに由来するＬｅｕｋｏ ＰａｋのＢリンパ球のＲＮＡを単離した。ＩｇＭ定常領域でのプライマーアニーリングを使用して、ｃＤＮＡを調製した。表７及び表８に記載の６つのフォワードプライマー（Ｆ－Ｌ１－ＨＣＤＲ３～Ｆ１－Ｌ６－ＨＣＤＲ３）及び２つのリバースプライマー（Ｒ－ＪＨ４及びＲＪＨ６）の全ての可能な組み合わせを使用して、ＨＣＤＲ３をｃＤＮＡから増幅した。この増幅は、フレームワークベクターに相同の５’及び３’末端に配列を付加して、ＨＣＤＲ３がクローン化されることになる。
実施例７：単一部位ＣＤＲベクターへのＣＤＲのクローニング及び機能的ＣＤＲの選択
天然の複製ＣＤＲは、機能を保証するはずである基準（例えば、ライアビリティの除去）に基づいて合成され、オリゴヌクレオチド合成は、１００％正確ではないことがある。不正確な配列の問題に加えて、良好でない発現または多反応性を引き起こす他の未同定のライアビリティが、合成されたオリゴヌクレオチドでコードされ得る。機能的なＣＤＲの選択は、この問題に対処するための選択肢であり得る。
上記の除外ステップで残存するＣＤＲのそれぞれを、適切な酵母ディスプレイ足場ベクターにクローン化した。例示的な足場のコード配列が以下に提供される：
＞１－アブリルマブ
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１３９）
＞１ａ－アブリルマブｄＬＣＤＲ１
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４０）
＞１ｂ－アブリルマブｄＬＣＤＲ２
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４１）
＞１ｃ－アブリルマブｄＬＣＤＲ３
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４２）
＞１ｄ－アブリルマブｄＨＣＤＲ１
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４３）
＞１ｅ－アブリルマブｄＨＣＤＲ２
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＡＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４４）
＞１ｆ－アブリルマブｄＨＣＤＲ３
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧ
ＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４５）
＞２－メポリズマブ
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４６）
＞２ａ－メポリズマブｄＬＣＤＲ１
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＞２ｂ－メポリズマブｄＬＣＤＲ２
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＞２ｃ－メポリズマブｄＬＣＤＲ３
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１４９）
＞２ｄ－メポリズマブｄＨＣＤＲ１
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＞２ｅ－メポリズマブｄＨＣＤＲ２
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＡＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１５１）
＞２ｆ－メポリズマブｄＨＣＤＲ３
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＞３－クレネズマブ
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＣＴＣＴＡＡＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１５３）
＞３ａ－クレネズマブｄＬＣＤＲ１ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＡＴＡＡＣＧＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１５４）
＞３ｂ－クレネズマブｄＬＣＤＲ２
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＞３ｃ－クレネズマブｄＬＣＤＲ３
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＞３ｄ－クレネズマブｄＨＣＤＲ１
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＞３ｅ－クレネズマブｄＨＣＤＲ２
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＞３ｆ－クレネズマブｄＨＣＤＲ３
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＞４－ネシツムマブ
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＞４ａ－ネシツムマブｄＬＣＤＲ１
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＞４ｂ－ネシツムマブｄＬＣＤＲ２
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＞４ｃ－ネシツムマブｄＬＣＤＲ３
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＴＣＧＧＴＧＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１６３）
＞４ｄ－ネシツムマブｄＨＣＤＲ１
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＴＣＧＧＴＧＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１６４）
＞４ｅ－ネシツムマブｄＨＣＤＲ２
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＴＡＣａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＧＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＴＣＧＧＴＧＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１６５）
＞４ｆ－ネシツムマブｄＨＣＤＲ３
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１６６）
＞５－アニフロルマブ
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＧＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＧＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１６７）
＞５ａ－アニフロルマブｄＬＣＤＲ１
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＧＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＧＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１６８）
＞５ｂ－アニフロルマブｄＬＣＤＲ２
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＧＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＧＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１６９）
＞５ｃ－アニフロルマブｄＬＣＤＲ３
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＞５ｄ－アニフロルマブｄＨＣＤＲ１
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＞５ｅ－アニフロルマブｄＨＣＤＲ２
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＞５ｆ－アニフロルマブｄＨＣＤＲ３
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＞６－エボロクマブ
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＞６ａ－エボロクマブｄＬＣＤＲ１
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＞６ｂ－エボロクマブｄＬＣＤＲ２
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＞６ｃ－エボロクマブｄＬＣＤＲ３
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＞６ｄ－エボロクマブｄＨＣＤＲ１
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１７８）
＞６ｅ－エボロクマブｄＨＣＤＲ２
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＡＡＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１７９）
＞６ｆ－エボロクマブｄＨＣＤＲ３
ｃａｇｔｔａｇａｔａａａａｇａｇｇｃｇｃｇｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｃＧＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴａｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｃａｇｔａａｇｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｃｔａｇｃｇｇｃａａａｃｃａａｔｃｃｃａａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｇｇｃ（配列番号１８０）
配列１～６は、示される例示的な足場のコード配列を指し、配列１ａ～１ｆ、２ａ～２ｆ、３ａ～３ｆ、４ａ～４ｆ、５ａ～５ｆ、及び６ａ～６ｆは、示される例示的な足場それぞれの対応するＣＤＲに隣接するクローニング部位が挿入された配列を指す。
図２４に示されるように、一例としてライブラリー１のＬＣＤＲ１を使用して、ＬＣＤＲ１足場ベクターをＢｓａＩ及びＳｆｉｌで消化し、ＬＣＤＲ１の部位にギャップが残った。次に、切断されたベクター及びＬＣＤＲ１オリゴヌクレオチドの集合を酵母に形質転換した。酵母細胞内では、ベクター及びＬＣＤＲ１オリゴヌクレオチド間の相同組み換えにより、ＬＣＤＲ１足場ベクターへのＬＣＤＲ１オリゴヌクレオチドの挿入がもたらされる。上で同定されたＬＣＤＲ１オリゴヌクレオチドのそれぞれを有するＬＣＤＲ１酵母足場ベクターの集団全体は、ＬＣＤＲ１酵母ディスプレイライブラリーを構成する（図２５）。ＬＣＤＲ１足場ベクターの場合、評価されるＬＣＤＲ１を除いて、ＶＨ及びＶＬドメインの全ての部分が一定である。機能的なＬＣＤＲ１の選択を、提示（すなわち、発現）について選別することにより実施した。ｓｃＦｖの提示が誘導された後、酵母細胞は、ｓｃＦｖ提示を検出する蛍光標識抗体で染色される（ＳＶ５タグを認識するｍＡｂを使用する）。ＣＤＲ１－２のライブラリーでは、集団は、フローサイトメトリーで分析され、陽性集団の中で上位２％の最も蛍光細胞をゲーティングすることにより、蛍光活性化細胞選別により選別される。これにより、高レベルの提示を促進するＣＤＲの濃縮が確実になる。図２２Ａ～Ｌでは、この厳密な２％の選別後の集団は、「フィルタリング後に複製された天然のもの」として示される。理論上の多様性と比較して少なくとも１０倍の細胞数が選別され、全ての起こりうるクローンの回収を確実とする。ＬＣＤＲ３の場合、ｓｃＦｖディスプレイの誘導及びｓｃＦｖディスプレイ（ＳＶ５）を検出する蛍光標識抗体を用いる染色の後、陽性集団（ｓｃＦｖディスプレイ）は、使用される１次抗体（ＳＶ５）を認識する磁性ナノ粒子を用いるＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別）を使用して精製される。特に、上記のＣＤＲ１－２についての最も蛍光性の高い２％の蛍光活性化細胞選別と同様に、ナノ粒子の結合能をはるかに超える多数の細胞を有し、これにより、十分に提示された配列を濃縮することによる競合が用いられる場合、ｓｃＦｖディスプレイのレベルが高いほど、細胞がナノ粒子に結合する可能性が高くなる。ＬＣＤＲ３の理論的多様性はＣＤＲ１－２の数倍であるので、ＭＡＣＳ手法は、短時間で多数の細胞を精製する能力があるので、ＬＣＤＲ３の場合に、優先的に用いられる。
ｓｃＦｖが酵母ディスプレイのためにこの例で使用されるが、ＣＤＲ特異的足場ベクターの形式は、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または全長免疫グロブリンであり得、要件は、提示を実施することができることである。良好に折りたたまれた足場にクローン化された単一のＣＤＲのライブラリーを選別することにより、終止コドン、フレームシフトを含有するか、または発現が良好でないもしくは多反応性であるＣＤＲが除外され得る。酵母表面上の効果的な提示は、以前に多様なタンパク質の安定性及び折りたたみの改善と相関関係が見出されている（Ｃｈｅｒｆ、ＧＭ ａｎｄ Ｒ Ｃｏｃｈｒａｎ（２０１５）．“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３１９：１５５－１７５、Ｐａｖｏｏｒ，Ｔ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）．“Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ ＆ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ：ＰＥＤＳ ２５（１０）：６２５－６３０、Ｐｅｐｐｅｒ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（２００８）．“Ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｗｈｅｒｅ ａｒｅ ｗｅ ｎｏｗ？”Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ １１（２）：１２７－１３４、Ｘｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１３）．“Ｒａｐｉｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．”ＭＡｂｓ ５（２）：２３７－２５４．）。各ＣＤＲライブラリーが選別された後、良好に折りたたまれたＣＤＲを発現する酵母細胞からＤＮＡを単離することにより、良好に発現され、非多反応性のＣＤＲの集合が得られる。機能的ＣＤＲライブラリーがクローン化及び選別される方法の図解が図２３～２５に示される。６つの異なる足場のフィルタリングされていないライブラリー及びフィルタリングされたライブラリーが図２５Ｂ～Ｇに示される。集団がフローサイトメトリーにより分析され、発現レベル（ｘ軸）がヒストグラムとして表される。分析は、濃縮後に明らかな改善を示し（ＣＤＲ１－２の場合、蛍光活性化細胞選別による上位２％及びＬＣＤＲ３の場合磁気活性化細胞選別よる上位２％）、ほとんどのライブラリーは、足場が生成された元の臨床候補の提示レベルを超える提示レベルを示す。
本明細書で提供される例では、本発明者らは、改善された発現レベルについて選別している。しかし、望ましい特性（例えば、高発現、低多反応性、良好な開発可能性）を有する酵母ディスプレイ抗体を、望ましくない特性（例えば、低発現、高多反応性、良好でない開発可能性）を有する酵母ディスプレイ抗体と区別する任意の選択的方法を使用して同様のアプローチを採用することができる。例えば、多反応性が低減した抗体を選択するために、多重特異性試薬に結合しない抗体（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＩｇＧ、または他の抗体フラグメント）を提示するクローンが選択されるであろう。そのような多重特異性試薬の例としては、以下に記載されるものが挙げられる：Ｈｏｔｚｅｌ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｒｉｓｋ ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｆａｓｔ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．ＭＡｂｓ ４，７５３－７６０，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２２１８９（２０１２）、Ｘｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｙｅａｓｔ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ，ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｏｏｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６，６６３－６７０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｔ０４７（２０１３）、Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ＭＡｂｓ ９，１０３６－１０４０，ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１７．１３５６５２９（２０１７）。
実施例８：全長ｓｃＦｖライブラリーの組み立て
個々のＣＤＲライブラリーそれぞれを発現及び開発可能性についてスクリーニングした時点で、ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲを全長ＶＨまたはＶＬドメインに組み立てた。表７及び表８に記載のプライマーを使用して隣接配列を用いて、ＶＬ及びＶＨの個々のＣＤＲを増幅した。図２９～３１に示されるように、これを実施し、ＶＨ及びＶＬを最初に、それらの構成要素ＣＤＲフラグメント及び隣接フレームワーク領域から組み立て、次に、完全なｓｃＦｖまたはＦａｂに組み合わせた。代替アプローチは、図２６～２８に示されるように、未改変ＶＬまたはＶＨパートナー鎖の構成内で、各全長ＶＨまたはＶＬを組み立てることであろう。この代替アプローチは、未改変パートナー鎖の構成内で機能するＶＨまたはＶＬライブラリーについて（ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳにより）選別することを可能にするであろう。しかし、図３２に示されるように、フィルタリングされたＣＤＲのライブラリーに直接由来する完全なｓｃＦｖを直接組み立てると、この中間ステップを必要とせずに高機能ｓｃＦｖライブラリーがもたらされ、これは、足場として使用される臨床抗体に由来するｓｃＦｖのピークディスプレイレベルが、ライブラリーディスプレイレベルの分布が足場として使用される臨床候補抗体のものよりも広いことを除いて、対応するライブラリーに対するものと類似することを示し、親臨床足場のｓｃＦｖよりもよく提示される一部のｓｃＦｖを含むことを、本発明者らは見出した。機能的抗体ライブラリーは、ファージ、酵母、または哺乳動物のディスプレイベクターを含む様々なディスプレイベクターの構成内で組み立てることができる。
実施例９：ファージディスプレイベクター（ｐＤＡＮ５）へのクローニング
ｓｃＦｖまたはＦａｂライブラリーを組み立てた時点で、それらをｐＤＡＮ５などのファージディスプレイベクターにライゲーションして、それらの機能を調べた。このベクターは、ＢｓｓＨＩＩ及びＮｈｅＩの制限酵素部位に含まれる、繊維状ファージのｇ３の上流にクローニング部位を含有する。軽鎖の上流のＢｓｓＨＩＩ制限部位及び重鎖の下流のＮｈｅＩを含有する隣接プライマーを用いて、実施例８で作成されたｓｃＦｖ／Ｆａｂを増幅した。次に、ＰＣＲ産物を同じ酵素で消化して、粘着末端を生成した。ｐＤＡＮ５プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ中で培養し、アルカリ溶解で抽出し、塩化セシウム／臭化エチジウム勾配で精製した。プラスミドを同じ酵素で消化し、バックボーンをアガロースゲル電気泳動抽出とそれに続くクロマトグラフィーで精製して、汚染物質を除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、バックボーンをｓｃＦｖ／Ｆａｂライブラリーに１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーションを精製し、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞に電気的形質転換した。形質転換された細胞を、カルベニシリン及びグルコースを含有する寒天プレート上にプレーティングして、プラスミドが導入された細菌を選択した。ＰａｃＢｉｏシーケンシングによるｓｃＦｖライブラリーの分析により、９０％を超えるオープンリーディングフレームが明らかになり（表９）、クローン重複は基本的になかった（表１０）。
Figure 0007332691000024
Figure 0007332691000025
実施例１０：ウェスタンブロットを含むバクテリオファージ粒子の作成
ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで、液体２ｘＹＴ培地＋カルベニシリン＋グルコース（グルコースは、ｓｃＦｖ／Ｆａｂ発現を阻害するためのものである）を含有する振とうフラスコ内で、形質転換された細菌を３７℃で培養した。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（感染の多重度５で）を用いて、振とうせずに、細菌を３７℃で３０分間重複感染させた。細菌を遠心分離し、培地を除去し、２×ＹＴ培地＋カルベニシリン＋カナマイシンと交換し、シェーカーインキュベーター内、２５℃で１６時間培養した。
ファージ粒子を回収するために、培養物を遠心分離して、細菌及びファージが見出される上清を分離した。上清を２０％のＰＥＧ８０００＋２．５ＭのＮａＣｌ溶液と、５：１の比率で混合した。これにより、ファージが沈殿し、遠心分離によりファージを回収することが可能になる。上清を廃棄し、ファージペレットをＰＢＳ溶液に再懸濁した。図３３に示されるように、発現タグ（ＳＶ５）を特異的に認識する抗体を使用して、ファージによるｓｃＦｖ／Ｆａｂの提示を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＋ウェスタンブロットで評価した。
実施例１１：ライブラリーを使用したファージ及び酵母ディスプレイの組み合わせによる抗体選択
構築及びファージ粒子の生成後、目的の標的に対してライブラリーをスクリーニングした。ファージディスプレイのみを使用して、選択を実施することができる（Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ，Ｄ．＆ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｍａｋｅ ｌａｒｇｅ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８，７５－８０（２０００））が、本発明者らは、ファージ及び酵母ディスプレイ技術を組み合わせることを選ぶ（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ８５，ａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７，ｅ４９５３５（２０１２））。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ磁気ビーズシステムを使用して、ｓｃＦｖライブラリーを提示する１０12のファージ粒子を臨床目的のビオチン化組み換えヒト抗原、すなわちインターロイキン６、インターフェロンアルファ、及びＧＭ－ＣＳＦに対する２ラウンドの選択に使用した。ビオチン化タンパク質（１００～４００ｎＭ）でコーティングされた２×１０7のストレプトアビジン結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０）を洗浄し、抗原でコーティングし、ファージ粒子と共にインキュベートし、再度洗浄して非結合物を除去した。次に、ｐＨを低減させること及びＦ’線毛を有する細菌に感染させることにより、ファージ粒子を溶出させた（Ｏｍｉｎｍａｘ－２Ｔ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ファージを増殖させ、選択サイクルを繰り返した。２ラウンドのファージ濃縮後、ｓｃＦｖをＰＣＲ増幅し、相同組み換え（ｐＳｐｅｃ酵母ディスプレイベクター）によりＮ末端酵母ディスプレイシステムに移した。そこではＡｇａ－２のＮ末端に融合されたｓｃＦｖを提示する。次に、培地にガラクトースを添加することにより、形質転換された酵母をｓｃＦｖディスプレイのために誘導した。次に、蛍光活性化細胞選別によるビオチン化組み換えヒト抗原に対するさらに２～３ラウンドの濃縮のために、誘導された酵母ミニライブラリーを使用した。陽性の抗原結合シグナルを有する最大１０，０００の酵母細胞を選別し、各ラウンドで増殖させた。最初の選別ラウンドでの標的濃度は、１００ｎＭであったが、１０ｎＭ、次に、１ｎＭに低減させた。これらのラウンドのファージ及び酵母選別濃縮の後、回収された集団をフローサイトメトリーで分析して、漸減濃度の抗原で、抗原に対する結合を試験し、抗原の不存在下で、２次試薬への非特異的結合をチェックした（図３４）。結果は、ライブラリーが、試験された全ての抗原に対して高親和性結合体を効率よく生じることができることを示す。
実施例１２：選択された抗体の親和性決定
実施例１１に記載のファージ＋酵母ディスプレイプロトコールを使用して、ナイーブライブラリーから選択される抗体の親和性決定を、本明細書に記載のアプローチに従って実施した。Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡマシンを使用して、種々の標的（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ａ ２Ａ、及びＩＬ－６）へのこのようにして得られた抗体バリアントの結合親和性を試験した。要約すると、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ａ ２Ａ、及びＩＬ－６に対する選択からのｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体を発現する酵母の上清を、抗ヒトＦｃを含むＣａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ ＨＣ２００Ｍチップに固定化した。１：１：１の１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）、１００ｍＭのＳ－ＮＨＳ、４００ｍＭのＥＤＣ（ＭＥＳ ５．５で再構成された全て）でチップを活性化し、アッセイを実行する直前に、それぞれ１００μＬをバイアル中で混合した。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧを、５０μｇ／ｍＬで１０分間固定化し、続いて、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で７分間失活させた。
ｓｃＦｖ－Ｆｃの上清を、ＨＢＳＴＥ緩衝液への２または３倍に希釈し、抗Ｆｃ表面に１２分間循環させた。ＩＦＮ－２Ａの場合６ｎＭ及びＩＬ－６／ＧＭ－ＳＣＦの場合１６７ｎＭで開始する３倍希釈系列で、抗原を試験した。最低濃度から最高濃度までの抗原試料を試験した。図３７。
結合サイクル間で完全に解離しなかったＩＦＮ－２Ａ及びＧＭ－ＳＣＦクローンのためにＲｍａｘパラメータを使用して、データを処理し、バルクシフトパラメータを使用して、データの一部も適合させた。
図３８Ａ～３８Ｃに示されるように、実施例１～１０に記載される、構築されたライブラリーから直接選択された抗体の親和性は、非常に強力であることが示され、多くのナノモル以下の抗体が選択された。
このアプローチを使用して、ＰＤＧＦ、ＴＧＦＢＲ２、及びＴＧＦＢＲ３を含む、追加の標的に対する抗体を調査し、同様の結果を観察した。図３９。
実施例１３：抗体の成熟
最適化されたＶＬ及びＶＨペアを選択し、成熟抗体にＣＤＲを組み立てるには、以下のアプローチを使用することができる。最初に、ＶＨが、未改変形態で保持されるが、ＬＣＤＲライブラリーのＶＬが、シャッフリングされる。残存する機能的ＶＬが、未改変ＶＨと共に組み立てられ、形成された抗体は、機能性について試験される（図３５）。同様に、ＶＬが、未改変のままであり、ＶＨライブラリーに合成ＨＣＤＲ１／２及び天然ＨＣＤＲ３を含むＶＨが、シャッフリングされる。残存する機能的ＶＨのそれぞれは、未改変ＶＨをと共に組み立てることができ、新しく形成された抗体の機能を、機能性について試験する（図３６）。
他の実施形態
本明細書に開示の特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書で開示の各特徴が、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替特徴で置き換えられてもよい。従って、別途明記のない限り、開示の各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の例にすぎない。
上の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために、本発明の種々の変更及び修正を行うことができる。従って、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
均等物
いくつかの発明の実施形態が本明細書に記載及び例示されているが、当業者らは、機能を実施するための、ならびに／または結果及び／もしくは本明細書に記載の利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／または構造を容易に想定することになり、そのような変形及び／または修正のそれぞれは、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般に、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示的であることが意図されること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途（複数可）に依存するであろうことは、当業者らは容易に理解するであろう。当業者らは、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の発明の実施形態との多くの均等物を認識することになるか、またはそれを確認することができるであろう。それ故、上述の実施形態が、ほんの一例として、示されること、ならびに添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、具体的に説明及び特許請求されるもの以外の発明の実施形態が実施され得ることが理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法それぞれに関する。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の任意の組み合わせが、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義及び使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書内の定義、及び／または定義された用語の通常の意味に優先すると理解されるべきである。
本明細書に開示の全ての参考文献、特許、及び特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、これは、一部の場合では、文書全体を包含してもよい。
本明細書で、明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明確に反対の指示のない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書で、明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／または」という表現は、そのように結合された要素、すなわち、一部の場合には共同して存在し、他の場合には選言的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／または」と共に記載される複数の要素は、同じ方法で解釈されるべきであり、すなわち、要素の「１つ以上」がそのように結合される。「及び／または」節で具体的に同定される要素以外の他の要素が、具体的に同定されるそれらの要素に関連するまたは関連しないに関わらず、任意に存在してもよい。従って、非限定例として、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの制約のない文言と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意に、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意に、Ａ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意に、他の要素を含む）などを指し得る。
本明細書で、明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上で定義された「及び／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、一覧内の項目を分ける場合、「または」または「及び／または」は、要素の数または一覧、及び、任意に、追加の一覧にない項目を含んでおり、すなわち、これらの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含むと解釈されるべきである。「のうちの１つのみ」または「のうちのちょうど１つ」または特許請求の範囲で使用される場合、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの、明確に反対が指示される用語のみが、要素の数または一覧のうちのちょうど１つの要素を含むことを指すであろう。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は単に、排他性のある用語、例えば、「いずれか」、「のうちの一方」、「のうちの一方のみ」、または「のうちのちょうど一方」、が先行する場合、排他的代替（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を指すと解釈されるものとする。特許請求の範囲で使用される場合、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書で、明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素の一覧に関して「少なくとも１つ」という表現は、要素の一覧の要素のうちの任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素の一覧内に具体的に記載されるありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、要素の一覧の要素の任意の組み合わせを除外しないと理解されるべきである。この定義により、「少なくとも１つ」の表現が指す要素の一覧内に具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に同定されるそれらの要素に関連するまたは関連しないに関わらず、任意に、存在してもよいことも可能になる。従って、非限定例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（または、同等に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、同等に「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない（及び任意にＢ以外の要素を含む）任意に２つ以上を含む少なくとも１つのＡ、別の実施形態では、Ａが存在しない（及び任意にＡ以外の要素を含む）任意に２つ以上を含む少なくとも１つのＢ、さらに別の実施形態では、任意に２つ以上を含む少なくとも１つＡ及び任意に２つ以上を含む少なくとも１つのＢ（及び任意に他の要素を含む）などを指し得る。
明確に反対の指示のない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法では、本方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が参照される順序に限定されないことも理解されるべきである。

Claims (8)

  1. 第１の複数の核酸及び第２の複数の核酸を含む抗体ライブラリーであって、
    前記第１の複数の核酸が、抗体重鎖可変ドメインの集団をコードし、前記抗体重鎖可変ドメインの集団が、前記抗体重鎖可変ドメイン遺伝子のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域に位置する、重鎖ＣＤＲ１の集団、重鎖ＣＤＲ２の集団及び重鎖ＣＤＲ３の集団を一括して含み、前記重鎖ＣＤＲ１、前記重鎖ＣＤＲ２、及び前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が天然に存在するヒト抗体に由来し、
    前記第２の複数の核酸が、抗体軽鎖可変ドメインの集団をコードし、前記抗体軽鎖可変ドメインの集団が、前記抗体軽鎖可変ドメイン遺伝子のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域に位置する、軽鎖ＣＤＲ１の集団、軽鎖ＣＤＲ２の集団及び軽鎖ＣＤＲ３の集団を一括して含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、前記軽鎖ＣＤＲ２、及び前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が天然ヒト抗体に由来し、
    重鎖ＣＤＲ１の集団、重鎖ＣＤＲ２の集団、軽鎖ＣＤＲ１の集団、軽鎖ＣＤＲ２の集団、及び軽鎖ＣＤＲ３の集団の少なくとも９０％が、以下：
    （ｉ）グリコシル化部位、
    （ｉｉ）脱アミド化部位、
    （ｉｉｉ）異性化部位、
    （ｉｖ）ペアになっていないシステイン、
    （ｖ）１を超える正味電荷、
    （ｖｉ）少なくとも２つの芳香族残基を含有するトリペプチドモチーフ、
    （ｖｉｉ）凝集を促進するモチーフ、
    （ｖｉｉｉ）多重特異性部位、
    （ｉｘ）プロテアーゼ感受性部位、
    （ｘ）インテグリン結合部位、
    （ｘｉ）リジン糖化部位、
    （ｘｉｉ）金属触媒フラグメント化部位、
    （ｘｉｉｉ）多重特異性凝集部位、及び
    （ｘｉｖ）ストレプトアビジン結合モチーフ
    のうちの１つ以上を含むメンバーを完全に含まず、
    （ｉ）のグリコシル化部位が、モチーフＮＸＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＣを含み、Ｘが、プロリン以外の任意の天然に存在するアミノ酸残基を表す；（ｉｉ）の脱アミド化部位が、ＮＧ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＮ、ＮＡ、ＮＨ、ＮＤ、ＧＮＦ、ＧＮＹ、ＧＮＴ、またはＧＮＧのモチーフを含む；（ｉｉｉ）の異性化部位が、ＤＴ、ＤＨ、ＤＳ、ＤＧ、またはＤＤのモチーフを含む；（ｖｉ）のトリペプチドが、ＨＹＦまたはＨＷＨである；（ｖｉｉ）の凝集を促進するモチーフが、ＦＨＷのモチーフを含む；（ｖｉｉｉ）の多重特異性部位が、モチーフＧＧ、ＧＧＧ、ＲＲ、ＶＧ、Ｗ、ＷＶ、ＷＷ、ＷＷＷ、ＹＹ、またはＷＸＷを含み、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す；（ｉｘ）のプロテアーゼ切断部位が、ＤＸのモチーフを含み、Ｘが、Ｐ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｋ、Ｌ、またはＤである；（ｘ）のインテグリン結合部位が、ＲＧＤ、ＲＹＤ、ＬＤＶ、またはＫＧＤを含む；（ｘｉ）のリジン糖化部位が、ＫＥ、ＥＫ、またはＥＤを含む；（ｘｉｉ）の金属触媒フラグメント化部位が、ＨＳ、ＳＨ、ＫＴ、ＨＸＳ、またはＳＸＨのモチーフを含み、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す；（ｘｉｉｉ）の多重特異性凝集部位が、Ｘ１Ｘ２Ｘ３のモチーフを含み、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のそれぞれが独立して、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より選択される；（ｘｉｖ）のストレプトアビジン結合モチーフが、モチーフＨＰＱ、ＥＰＤＷ（配列番号１１７）、ＰＷＸＷＬ（配列番号１１８）（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、ＧＤＷＶＦＩ（配列番号１１９）、またはＰＷＰＷＬＧ（配列番号１２０）を含む；
    前記重鎖ＣＤＲ１の集団、前記重鎖ＣＤＲ２の集団、前記重鎖ＣＤＲ３の集団、前記軽鎖ＣＤＲ１の集団、前記軽鎖ＣＤＲ２の集団、及び前記軽鎖ＣＤＲ３の集団の少なくとも９５％が、非機能的メンバーを完全に含まず、
    前記重鎖可変ドメインのフレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４の遺伝子の全て、及び前記軽鎖可変ドメインのフレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４の遺伝子の全てが、単一の治療用抗体由来であり、
    各フレームワーク領域が、最大５つのアミノ酸置換を含み、
    前記重鎖及び軽鎖のライブラリーが、同一の単一の治療用抗体に由来するか、または、前記重鎖のライブラリーが、前記単一の治療用抗体のうちの１つに由来し、前記軽鎖のライブラリーが、異なった単一の治療用抗体に由来し、
    前記単一の治療用抗体が、アビツズマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、バピネウズマブ、ベンラリズマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セツリズマブ、クラザキズマブ、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エロツズマブ、エプラツズマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、フィクラツズマブ、フレチクマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、ゲボキズマブ、イバリズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、モガムリズマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オテリキシズマブ、オトレツズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、ペルツズマブ、ピナツズマブ、ポラツズマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、レスリズマブ、ロモソズマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シファリムマブ、タバルマブ、チガツズマブ、チルドラキズマブ、トシリズマブ、トベツマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブ、及びザノリムマブからなる群より選択される、抗体ライブラリー。
  2. 前記単一の治療用抗体が、アブリルマブ、メポリズマブ、クレネズマブ、ネシツムマブ、アニフロルマブ、及びエボクルマブからなる群より選択される、請求項１に記載の抗体ライブラリー。
  3. 前記抗体ライブラリーが、全長抗体ライブラリー、Ｆａｂ抗体ライブラリー、または一本鎖抗体ライブラリーである、請求項１に記載の抗体ライブラリー。
  4. 前記重鎖ＣＤＲ３の前記核酸配列がドナーリンパ球から得られる、請求項１に記載の抗体ライブラリー。
  5. 抗体ライブラリーの製造方法であって、以下：
    （１）（ａ）天然に存在するヒト抗体重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）フラグメントの集団をコードする第１の複数の核酸、
    （ｂ）天然に存在するヒト抗体重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）フラグメントの集団をコードする第２の複数の核酸、
    （ｃ）天然に存在するヒト抗体重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）フラグメントの集団をコードする第３の複数の核酸、
    （ｄ）共通の抗体重鎖可変ドメインをコードする核酸遺伝子、
    （ｅ）天然に存在するヒト抗体軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）フラグメントの集団をコードする第４の複数の核酸、
    （ｆ）天然に存在するヒト抗体軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）フラグメントの集団をコードする第５の複数の核酸、
    （ｇ）天然に存在するヒト抗体軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）フラグメントの集団をコードする第６の複数の核酸、
    （ｈ）抗体軽鎖可変ドメインをコードする核酸遺伝子、
    を提供すること；
    （２）前記第１の複数の核酸、前記第２の複数の核酸及び前記第３の複数の核酸を、それぞれ、前記抗体重鎖可変ドメインをコードする遺伝子の、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域にそれぞれ挿入すること、それによって抗体重鎖可変ドメインライブラリーをコードする核酸の集団を製造すること；
    （３）前記第４の複数の核酸、前記第５の複数の核酸及び前記第６の複数の核酸を、それぞれ、前記抗体軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子の、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域にそれぞれ挿入すること、それによって抗体軽鎖可変ドメインライブラリーをコードする核酸の集団を製造すること；
    （４）前記抗体重鎖可変ドメインライブラリーをコードする核酸の集団を、抗体軽鎖可変ドメインライブラリーをコードする核酸の集団と組み合わせること、それによって抗体ライブラリーを製造すること、
    を含み、
    重鎖ＣＤＲ１の集団、重鎖ＣＤＲ２の集団、軽鎖ＣＤＲ１の集団、軽鎖ＣＤＲ２の集団、及び軽鎖ＣＤＲ３の集団の少なくとも９０％が、以下：
    （ｉ）グリコシル化部位、
    （ｉｉ）脱アミド化部位、
    （ｉｉｉ）異性化部位、
    （ｉｖ）ペアになっていないシステイン、
    （ｖ）１を超える正味電荷、
    （ｖｉ）少なくとも２つの芳香族残基を含有するトリペプチドモチーフ、
    （ｖｉｉ）凝集を促進するモチーフ、
    （ｖｉｉｉ）多重特異性部位、
    （ｉｘ）プロテアーゼ感受性部位、
    （ｘ）インテグリン結合部位、
    （ｘｉ）リジン糖化部位、
    （ｘｉｉ）金属触媒フラグメント化部位、
    （ｘｉｉｉ）多重特異性凝集部位、及び
    （ｘｉｖ）ストレプトアビジン結合モチーフ
    のうちの１つ以上を含むメンバーを完全に含まず、
    （ｉ）のグリコシル化部位が、モチーフＮＸＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＣを含み、Ｘが、プロリン以外の任意の天然に存在するアミノ酸残基を表す；（ｉｉ）の脱アミド化部位が、ＮＧ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＮ、ＮＡ、ＮＨ、ＮＤ、ＧＮＦ、ＧＮＹ、ＧＮＴ、またはＧＮＧのモチーフを含む；（ｉｉｉ）の異性化部位が、ＤＴ、ＤＨ、ＤＳ、ＤＧ、またはＤＤのモチーフを含む；（ｖｉ）のトリペプチドが、ＨＹＦまたはＨＷＨである；（ｖｉｉ）の凝集を促進するモチーフが、ＦＨＷのモチーフを含む；（ｖｉｉｉ）の多重特異性部位が、モチーフＧＧ、ＧＧＧ、ＲＲ、ＶＧ、Ｗ、ＷＶ、ＷＷ、ＷＷＷ、ＹＹ、またはＷＸＷを含み、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す；（ｉｘ）のプロテアーゼ切断部位が、ＤＸのモチーフを含み、Ｘが、Ｐ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、Ｋ、Ｌ、またはＤである；（ｘ）のインテグリン結合部位が、ＲＧＤ、ＲＹＤ、ＬＤＶ、またはＫＧＤを含む；（ｘｉ）のリジン糖化部位が、ＫＥ、ＥＫ、またはＥＤを含む；（ｘｉｉ）の金属触媒フラグメント化部位が、ＨＳ、ＳＨ、ＫＴ、ＨＸＳ、またはＳＸＨのモチーフを含み、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す；（ｘｉｉｉ）の多重特異性凝集部位が、Ｘ１Ｘ２Ｘ３のモチーフを含み、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のそれぞれが独立して、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より選択される；（ｘｉｖ）のストレプトアビジン結合モチーフが、モチーフＨＰＱ、ＥＰＤＷ（配列番号１１７）、ＰＷＸＷＬ（配列番号１１８）（式中、Ｘが、任意のアミノ酸残基を表す）、ＧＤＷＶＦＩ（配列番号１１９）、またはＰＷＰＷＬＧ（配列番号１２０）を含む；
    前記重鎖ＣＤＲ１の集団、前記重鎖ＣＤＲ２の集団、前記重鎖ＣＤＲ３の集団、前記軽鎖ＣＤＲ１の集団、前記軽鎖ＣＤＲ２の集団、及び前記軽鎖ＣＤＲ３の集団の少なくとも９５％が、非機能的メンバーを完全に含まず、
    前記重鎖可変ドメインのフレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４の領域の全て、及び前記共通の抗体軽鎖可変ドメインのフレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４の領域の全てが、単一の治療用抗体由来であり、
    各フレームワーク領域が、最大５つのアミノ酸置換を含み、
    前記重鎖及び軽鎖のライブラリーが、同一の単一の治療用抗体に由来するか、または、前記重鎖のライブラリーが、前記単一の治療用抗体のうちの１つに由来し、前記軽鎖のライブラリーが、異なった単一の治療用抗体に由来し、
    前記単一の治療用抗体が、アビツズマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、バピネウズマブ、ベンラリズマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セツリズマブ、クラザキズマブ、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エロツズマブ、エプラツズマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、フィクラツズマブ、フレチクマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、ゲボキズマブ、イバリズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、モガムリズマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オテリキシズマブ、オトレツズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、ペルツズマブ、ピナツズマブ、ポラツズマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、レスリズマブ、ロモソズマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シファリムマブ、タバルマブ、チガツズマブ、チルドラキズマブ、トシリズマブ、トベツマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブ、及びザノリムマブからなる群より選択される、方法。
  6. 前記第１の複数の核酸、前記第２の複数の核酸、前記第３の複数の核酸、前記第４の複数の核酸、前記第５の複数の核酸及び前記第６の複数の核酸が、以下：
    （ａ）天然に存在する抗体の集団の、前記重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域及び軽鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を取得すること；
    （ｂ）（ｉ）～（ｘｉｖ）の全てを含む前記重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、前記重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、前記軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、前記軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び前記軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を、（ａ）から除去して、ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ１配列、ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ２配列、ライアビリティを含まない軽鎖ＣＤＲ１配列、ライアビリティを含まない軽鎖ＣＤＲ２配列、及びライアビリティを含まない軽鎖ＣＤＲ３配列を取得すること；
    （ｃ）ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ１領域をコードする第１の複数の核酸、ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ２領域をコードする第２の複数の核酸、ライアビリティを含まない軽鎖ＣＤＲ１領域をコードする第４の複数の核酸、及びライアビリティを含まない軽鎖ＣＤＲ３領域をコードする第６の複数の核酸を合成すること、
    を含む工程によって製造される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第３の複数の核酸が、
    （ａ）Ｂ細胞の集団由来の前記重鎖ＣＤＲ３領域を増幅すること；及び
    （ｂ）（ａ）で得られた前記重鎖ＣＤＲ３領域をコードする前記第３の複数の核酸を、残りのＣＤＲと組み合わせること
    を含む工程によって製造される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第１の複数の核酸、前記第２の複数の核酸及び前記第３の複数の核酸を製造する工程が、ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域、及び／または前記ＣＤＲ３領域から機能的メンバーを単離することを更に含み、
    （ｉ）ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域の機能的メンバー、またはＣＤＲ３領域の機能的メンバーが、ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域、及び／またはＣＤＲ３領域を含む抗体を、前記抗体が宿主細胞の表面に提示される方法で、前記宿主細胞で発現させること、及び、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／ＣＤＲ３領域の機能的メンバーである、前記提示された抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／ＣＤＲ３領域を同定すること、によって単離されるか；または、
    （ｉｉ）ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域の機能的メンバー、及び／またはＣＤＲ３領域の機能的メンバーが、場合によりβラクタマーゼまたは緑色蛍光タンパク質であるフォールディングレポーターと融合して、ライアビリティを含まない重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域、及び／またはＣＤＲ３領域、またはそのフラグメントを含む抗体を発現させることによって単離されて、改善されたフォールディングを有するメンバーを取得する、請求項７に記載の方法。
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