CN103788098A - 作为jak抑制剂的氮杂环丁烷和环丁烷衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氮杂环丁烷和环丁烷衍生物以及它们的组合物及使用和制备方法，它们是可用于治疗包括例如炎性疾病和自身免疫疾病以及癌症的JAK相关性疾病的JAK抑制剂。

Description

作为JAK抑制剂的氮杂环丁烷和环丁烷衍生物
本申请是申请号为200980116857.7、申请日2009年3月10日、发明名称“作为JAK抑制剂的氮杂环丁烷和环丁烷衍生物”的中国专利申请的分案申请。
发明技术
本发明涉及氮杂环丁烷和环丁烷衍生物以及它们的组合物及使用和制备方法，它们是可用于治疗包括例如炎性疾病和自身免疫疾病以及癌症的JAK相关性疾病的JAK抑制剂。
发明背景
蛋白激酶(PK)是一组酶，其调节各种各样的、重要的生物过程，尤其包括细胞生长、存活和分化、器官形成和形态发生、新血管形成、组织修复和再生。蛋白激酶在各种生物演化关系中通过催化蛋白(或底物)的磷酸化并从而调节底物的细胞活性来发挥它们的生理功能。除正常组织／器官中的功能之外，许多蛋白激酶也在包括癌症在内的大量人类疾病中起着更特殊的作用。一个亚组的蛋白激酶(也称为致癌性蛋白激酶)，在失调时，能够引起肿瘤形成和生长，并且进一步有助于肿瘤维持和进展。迄今，致癌性蛋白激酶代表了用于癌症干预和药物开发的最大且最有吸引力的蛋白靶组之一。
Janus激酶(JAK)家族在牵涉免疫应答的细胞增殖和功能的细胞因子依赖性调节中起着一定的作用。目前，有四种已知的哺乳动物JAK家族成员：JAK1(亦称Janus激酶-1)，JAK2(亦称Janus激酶-2)，JAK3(亦称Janus激酶，白细胞；JAKL；L-JAK和Janus激酶-3)和TYK2(亦称蛋白质-酪氨酸激酶2)。该JAK蛋白质的尺寸范围为120-140kDa，包括七种保留性JAK同源性(JH)结构域；其中之一是功能催化激酶结构域，另一个是潜在地发挥调节功能和／或用作STAT的停泊位点的假激酶结构域。
在JAK激酶水平下的阻断信号转导为炎性疾病、自身免疫病、骨髓增殖性疾病和人类癌症(仅举几个例子)的治疗方法的开发提供了前景。JAK激酶的抑制也被预见到在患有皮肤免疫疾病如银屑病和皮肤敏化的患者中具有治疗益处。因此，广泛地寻求Janus激酶或相关激酶的抑制剂，且有几篇出版物报告了有效的化合物类型。例如，2006年12月12日提交的美国专利序号11／637,545报告了某些JAK抑制剂，包括吡咯并吡啶和吡咯并嘧啶在内。
因此，持续地需要抑制激酶例如Janus激酶的新型或改进的药剂，以用于开发新的、更有效的的药物来治疗癌症和其它疾病。在这里所述的化合物和方法涉及这些需求和其他目的。
发明概述
本发明尤其提供了式I、II、III和IV的JAK抑制剂：
Figure BDA0000457047210000021
或其药用盐，其中各组成成员在以下定义。
本发明进一步提供了包括式I，II，III或IV的化合物或其药用盐和至少一种药用载体的药物组合物。
本发明进一步提供了通过将治疗有效量的式I、II、III或IV的化合物或其药用盐给药于患者而治疗这里提到的各种JAK相关性疾病和病症的方法。
本发明进一步提供了用于治疗的式I、II、III和IV的化合物或其药用盐。
本发明进一步提供了式I、II、III和IV的化合物或其药用盐在制备治疗用药物中的用途。
本发明进一步提供了制备式I、II、III和IV的化合物的方法。
发明详述
本发明尤其提供了式I的JAK抑制剂：
Figure BDA0000457047210000031
或其药用盐，其中：
L是SO2或CO；
R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、苯基、五员或六员杂芳基、吲哚基、NR2R3或OR4，其中所述烷基、环烷基、苯基或杂芳基任选地被1、2或3个独立地选自F、CN和C1-4烷基中的取代基取代；
R2和R3独立地选自H、C1-4烷基和苯基；以及
R4是C1-6烷基、苯基或苄基。
在一些实施方案中，当L是SO2时，那么R1不是OR4。
在一些实施方案中，当L是SO2时，那么R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、苯基、五员或六员杂芳基或NR2R3，其中所述烷基、环烷基、苯基或杂芳基任选被1、2或3个独立地选自F和C1-4烷基中的取代基取代。
在一些实施方案中，当L是CO时，那么R1是C3-7环烷基、苯基、五员或六员杂芳基、吲哚基、NR2R3或OR4，其中所述环烷基、苯基或杂芳基任选被1、2或3个独立地选自CN和C1-4烷基中的取代基取代。
在一些实施方案中，L是SO2。
在一些实施方案中，L是CO。
在一些实施方案中，R1是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、2-甲基丙-1-基、1-甲基丙-1-基，各自任选被1、2或3个F取代。
在一些实施方案中，R1是C1-4烷基。
在一些实施方案中，R1是乙基。
在一些实施方案中，R1是任选地被C1-4烷基取代的C3-7环烷基。
在一些实施方案中，R1是任选被F、甲基或CN取代的苯基。
在一些实施方案中，R1是选自噻吩基、吡唑基、吡咯基、1，2，4-
Figure BDA0000457047210000042
二唑基和异
Figure BDA0000457047210000043
唑基中的五员杂芳基，各自任选被C1-4烷基取代。
在一些实施方案中，R1是吡啶基。
在一些实施方案中，R1是NR2R3或OR4。
在一些实施方案中，L是SO2，且R1是C1-6烷基。
本发明进一步提供了式II的化合物：
Figure BDA0000457047210000041
或其药用盐，其中：
R5和R6独立地选自H、F、CN、OH、C1-4烷基、苄氧基、C2-8二烷基氨基磺酰基和五员杂芳基，其中所述烷基任选地被1、2或3个选自F、OH、CN和C1-4烷氧基中的取代基取代，且其中所述五员杂芳基任选被C1-4烷基取代。
在一些实施方案中，当R5和R6中的一个是OH时，那么R5和R6的另一个不是CN或F。
在一些实施方案中，R5和R6中的一个是H，且另一个选自H、F、CN、OH、C1-4烷基、苄氧基、C2-8二烷基氨基磺酰基和五员杂芳基，其中所述烷基任选地被1、2或3个选自F、OH、CN和C1-4烷氧基中的取代基取代，且其中所述五员杂芳基任选被C1-4烷基取代。
在一些实施方案中，R5和R6独立地选自H、F、CN、OH和甲基。
在一些实施方案中，R5和R6独立地选自H和CN。
本发明进一步提供了式III或IV的化合物：
Figure BDA0000457047210000051
或其药用盐，其中：
L是SO2或CO；
R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、苯基、五员或六员杂芳基、吲哚基、NR2R3或OR4，其中所述烷基、环烷基、苯基或杂芳基任选地被1、2或3个独立地选自F、CN和C1-4烷基中的取代基取代；
R2和R3独立地选自H、C1-4烷基和苯基；以及
R4是C1-6烷基、苯基或苄基；
其中当L是SO2时，R1不是OR4。
在一些实施方案中，L是SO2。
在一些实施方案中，L是CO。
在一些实施方案中，R1是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、2-甲基丙-1-基、1-甲基丙-1-基，各自任选被1、2或3个F取代。
在一些实施方案中，R1是C1-4烷基。
在一些实施方案中，R1是乙基。
在一些实施方案中，R1是任选被C1-4烷基取代的C3-7环烷基。
在一些实施方案中，R1是任选被F、甲基或CN取代的苯基。
在一些实施方案中，R1是选自噻吩基、吡唑基、吡咯基、1，2，4-
Figure BDA0000457047210000061
二唑基和异
Figure BDA0000457047210000062
唑基中的五员杂芳基，各自任选被C1-4烷基取代。
在一些实施方案中，R1是吡啶基。
在一些实施方案中，R1是NR2R3或OR4。
在一些实施方案中，L是SO2，且R1是C1-6烷基。
在本说明书中的不同地方，本发明的化合物的取代基按组或范围公开。具体地，本发明意图包括这种组和范围的成员的所有的个体子组合。例如，术语C1-6烷基明确表示分别地公开了甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
进一步领会到，本发明的某些特征，为了清楚起见，在不同的实施方案的上下文中进行了描述，但还可以在单个实施方案中组合地提供。相反地，为了简便起见在单个实施方案中描述的本发明的多个特征还可以单独地提供或以任何适当的子组合提供。
在这里使用的术语“烷基”是指直链或支化的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基)、戊基(例如，正戊基，异戊基，仲戊基，新戊基)等。烷基可以含有1到约20个，2到约20个，1到约10个，1到约8个，1到约6个，1到约4个，或1到约3个碳原子。连接烷基在这里是指“亚烷基”。
在这里使用的“环烷基”是指非芳族环烃，包括环化烷基、烯基和炔基。环烷基可以包括单环或多环(例如，具有2、3或4个稠环)基团和螺环。环烷基的成环的碳原子可以任选被氧代或硫基取代。环烷基还包括环烷亚基。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚三烯基、降冰片基、降蒎烷基(norpinyl)、降蒈烷基(norcarnyl)、金刚烷基等。在一些实施方案中，该环烷基是环丙基。在环烷基的定义中还包括的是具有一个或多个稠合于环烷基环(即与环烷基环共有一个键)的芳族环的结构部分，例如环戊烷、环戊烯、环己烷等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳族环的环烷基可以通过任何成环原子(包括稠合芳族环的成环原子)连接。
在这里使用的“杂芳基”是指具有至少一个杂原子环原子如硫、氧或氮的芳族杂环。杂芳基包括单环和多环(例如，具有2、3或4个稠环)体系。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，哒嗪基，三嗪基，呋喃基，喹啉基，异喹啉基，噻吩基，咪唑基，噻唑基，吲哚基，吡咯基，唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，苯并噻唑基，异
Figure BDA0000457047210000072
唑基，吡唑基，***基，四唑基，吲唑基，1，2,4-噻二唑基，异噻唑基，苯并噻吩基，嘌呤基，咔唑基，苯并咪唑基，二氢吲哚基等。在一些实施方案中，该杂芳基是吡啶基。在一些实施方案中，该杂芳基是噻吩基、吡唑基、吡咯基、1，2,4-
Figure BDA0000457047210000073
二唑基或异
Figure BDA0000457047210000074
唑基。在一些实施方案中，该杂芳基是吲哚基。在一些实施方案中，杂芳基结构部分中的任一成环的N可以被氧替代。在一些实施方案中，该杂芳基具有1到约20个碳原子，且在其它实施方案中，具有约3到约20个碳原子。在一些实施方案中，该杂芳基含有3到约14个，4到约14个，3到约7个，或5到6个环原子。在一些实施方案中，该杂芳基具有1到约4个，1到约3个，或1到2个杂原子。
在这里使用的“苄氧基”指-O-苄基。
在这里使用的“二烷基氨基磺酰基”是指-SO2-N(烷基)2。
在这里所述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立构中心)。计划包括所有立体异构体例如对映异构体和非对映异构体，除非另有说明。含有不对称取代的碳原子的本发明的化合物能够以旋光活性形式或外消旋形式分离。关于如何由旋光活性起始原料制备旋光活性形式的方法在本领域中是已知的，例如通过外消旋混合物的拆分或者通过立体选择性合成。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可以存在于在这里描述的化合物中，且所有这种稳定的异构体在本发明中均被考虑。描述了本发明的化合物的顺式和反式几何异构体，这些异构体可以作为异构体的混合物或作为单独的异构体形式被分离。在其结构或名称中没有指定具体R／S或顺式／反式构型的能够具有立体异构或几何异构的化合物的情况下，意在将所有此类异构体考虑在内。
化合物的外消旋混合物的拆分可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来进行。示例性方法包括使用手性拆分酸的分级重结晶，该手性拆分酸是旋光活性的成盐有机酸。用于分级重结晶方法的适合的拆分剂例如是旋光活性酸，例如酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或各种旋光活性樟脑磺酸如β-樟脑磺酸的D和L形式。适合于分级结晶方法的其他的拆分剂包括立体异构纯式的α-甲基-苄胺(例如S和R形式或者非对映异构纯形式)，2-苯甘氨醇，降麻黄碱，麻黄碱，N-甲基麻黄碱，环己基乙胺，1，2-二氨基环己烷等。
外消旋混合物的拆分还可以通过上填充有旋光活性拆分剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱子洗脱来进行。适合的洗脱溶剂组成可以由本领域技术人员来决定。
本发明的化合物也包括互变异构形式。互变异构形式由单键与相邻双键的对换以及伴随的质子迁移而产生。互变异构形式包括质子转移互变异构体，它们是具有相同经验式和总电荷的异构质子化状态。质子转移互变异构体的实例包括酮-烯醇配对、酰胺-亚胺酸配对、内酰胺-内酰亚胺配对、酰胺-亚胺酸配对、烯胺-亚胺配对，以及其中质子能够占据杂环体系的两个或多个位置的环状形式，例如，1H-和3H-咪唑，1H-、2H-和4H-1，2，4-***，1H-和2H-异吲哚，以及1H-和2H-吡唑。互变异构形式可以通过适当的取代而处于平衡或空间上固定于一种形式。
本发明的化合物进一步包括水合物和溶剂化物以及无水和非溶剂化形式。
在这里使用的术语“化合物”意图包括所述结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
所有化合物及其药用盐能够与其他物质例如水和溶剂一起存在(例如水合物和溶剂化物)，或者可以是分离的。
本发明的化合物还可以包括在中间体或最终化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
在一些实施方案中，本发明的化合物及其盐是基本上被分离的。所谓“基本上分离”是指该化合物从其形成或被检测到的环境中至少部分分离或基本上分离。部分分离可以包括例如富集本发明的化合物的组合物。基本上分离可以包括含有至少约50重量％，至少约60重量％，至少约70重量％，至少约80重量％，至少约90重量％，至少约95重量％，至少约97重量％，或至少约99重量％本发明化合物或其盐的组合物。分离化合物及其盐的方法在本领域中是常规的。
短语“药用”在这里用于指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触，而没有过大的毒性、刺激、***反应或其他问题或并发症，与适当的利益／风险比率相称的那些化合物、原料、组合物和／或剂型。
在这里使用的表述“环境温度”和“室温”在本领域中是被充分理解的，并且通常是指约为进行反应的室内的温度的温度，例如反应温度，例如从约20℃到约30℃的温度。
本发明还包括在这里描述的化合物的药用盐。在这里使用的“药用盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中对母体化合物通过将现有的酸或碱结构部分转换为其盐形式来改性。药用盐的实例包括，但不限于，碱性残基如胺类的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。本发明的药用盐包括例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规的无毒性盐。本发明的药用盐能够通过常规化学方法由含有碱性或酸性结构部分的母体化合物合成。通常，这种盐可以通过让这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当的碱或酸在水中或有机溶剂中或在这二者的混合物中反应来制备；通常，非水介质如***、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈(ACN)是优选的。适合的盐的名单可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，1985，第1418页和Journal of PharmaceuticalScience，66，2(1977)中找到，这两篇文献在此处通过引用全文并入。
合成
本发明的化合物，包括它们的盐，可以使用已知的有机合成技术来制备，并且可以根据许多可能的合成路线中的任一种来合成。
用于制备本发明的化合物的反应可以在适合的溶剂中进行，所述溶剂可以容易地由有机合成领域中的技术人员来选择。适合的溶剂能够基本上不与起始原料(反应剂)、中间体或产物在进行反应的温度，例如从溶剂的冰点到溶剂的沸点的范围内的温度下反应。既定的反应可以在一种溶剂或者一种以上的溶剂的混合物中进行。取决于特定的反应步骤，用于特定反应步骤的适合溶剂可以由技术人员来选择。
本发明的化合物的制备可以包括各种化学基团的保护和脱保护。保护和脱保护的需要以及适当的保护基的选择可以容易地由本领域技术人员来确定。保护基的化学性质例如可以在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第三版，Wiley&Sons，Inc.，New York(1999)中找到，该文献在此处通过引用全文并入。
反应可以根据本领域中已知的任何适合方法来监测。例如，产物形成可以通过波谱方式如核磁共振谱法(例如，1H或13C)、红外光谱学，分光光度测定法(例如，紫外线-可见)、质谱分析法或者通过通过色层法如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法(TLC)来监测。
本发明提供了如反应路线1、2和3中所示的形成式I的化合物的方法。因此，在反应路线1的步骤(i)中，式I的化合物通过包括处理式Ia的化合物以除去R7结构部分的方法来制备：
Figure BDA0000457047210000101
其中：
L是SO2或CO；
R1是C1-6烷基、C3-7环烷基、苯基、5员或6员杂芳基、吲哚基、NR2R3或OR4，其中所述烷基、环烷基、苯基或杂芳基任选地被1、2或3个独立地选自F、CN和C1-4烷基中的取代基取代；
R2和R3独立地选自H、C1-4烷基和苯基；
R4是C1-6烷基、苯基或苄基；以及
R7是保护基；
其中当L是SO2时，R1不是OR4。
适当的R7保护基包括但不限于在Wuts和Greene，Protective Groupsin Organic Synthesis，第4版，John Wiley&Sons：New Jersey，第696-887页(尤其第872-887页)(2007)中所述的胺类的保护基，该文献通过引用全文并入到此处。在一些实施方案中，R7基团的保护基是对于在反应路线2的步骤(vi)中用于除去R10保护基的条件稳定的基团。在一些实施方案中，R7基团的保护基是对于在反应路线1的步骤(iv)中用于除去R9保护基的条件稳定的基团。在一些实施方案中，R7是耐受室温酸性条件的基团。在一些实施方案中，R7是在室温下、在约10℃到约40℃的温度下、在约15℃到约40℃的温度下或者在约15℃到约30℃的温度下在1-5N盐酸中不被除去的基团。在一些实施方案中，R7是苄氧基羰基(Cbz)，2,2，2-三氯乙氧基羰基(Troc)，2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基(Teoc)，2-(4-三氟甲基苯基磺酰基)乙氧基羰基(Tsc)，叔丁氧基羰基(BOC)，1-金刚烷基氧基羰基(Adoc)，2-金刚烷基羰基(2-Adoc)，2，4-二甲基戊-3-基氧基羰基(Doc)，环己基氧基羰基(Hoc)，1，1-二甲基-2,2,2-三氯乙氧基羰基(TcBOC)，乙烯基，2-氯乙基，2-苯基磺酰基乙基，烯丙基，苄基，2-硝基苄基，4-硝基苄基，二苯基-4-吡啶基甲基，N’，N’-二甲基肼基，甲氧基甲基，叔丁氧基甲基(Bum)，苄氧基甲基(BOM)，或2-四氢吡喃基(THP)。在一些实施方案中，R7是2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEM)。在一些实施方案中，R7是N-戊酰氧基甲基(POM)。
处理式Ia的化合物以除去R7基团能够通过本领域已知的用于除去胺的特定保护基的方法来完成，例如在Wuts和Greene，Protective Groupsin Organic Synthesis，第4版，John Wiley&Sons：New Jersey，第696-887页(尤其第872-887页)(2007)中所述的方法，该文献通过引用全文并入到此处。例如，在一些实施方案中，R7基团通过用氟离子(例如用四丁基氟化铵处理)、盐酸、对甲苯磺酸吡啶
Figure BDA0000457047210000111
盐(PPTS)或者路易斯酸(例如，四氟硼酸锂))处理来除去。在一些实施方案中，该处理包括用四氟硼酸锂处理，随后用氢氧化铵(例如，当R7是2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基时)处理。在一些实施方案中，该处理包括用碱(例如，R7是N-戊酰氧基甲基)处理。在一些实施方案中，该碱是碱金属氢氧化物。在一些实施方案中，该碱是氢氧化钠。在一些实施方案中，该处理包括用氢氧化钠或氨在溶剂如甲醇或水中处理。
在一些实施方案中，为了将SEM保护基脱保护，使用温和的两阶段操作规程。式Ia的SEM保护的底物用四氟硼酸锂(LiBF4)或***合三氟化硼在乙腈水溶液中在环境温度或高温(在一些实施方案中大约80℃)下处理10-20小时。所获得的相应羟甲基中间体然后用氢氧化铵水溶液(NH4OH)在室温下处理，以提供式I的化合物。
在一些实施方案中，为了进行POM脱保护，使用氢氧化钠(NaOH)或氢氧化锂(LiOH)水溶液。因此，式Ia的POM保护的化合物的悬浮液用1N氢氧化钠水溶液在室温下处理2-3小时。在典型的酸-碱后处理之后可以获得所需的式I的产物。
反应路线1
Figure BDA0000457047210000121
在步骤(ii)中，式Ia的化合物通过包括使式Ib的化合物与式Ic的化合物反应从而形成式Ia的化合物的方法来形成：
Figure BDA0000457047210000131
反应路线1的步骤(ii)是在式Ib的化合物与式Ic的化合物之间的迈克尔加成反应。迈克尔加成可以通过迈克尔加成催化剂如碱来促进。在一些实施方案中，该迈克尔加成催化剂是四烷基卤化铵、氢氧化四烷基铵、胍、脒、氢氧化物、醇盐、硅酸盐、碱金属磷酸盐、氧化物、叔胺、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱金属磷酸氢盐、膦或羧酸的碱金属盐。在一些实施方案中，该迈克尔加成催化剂是四甲基胍、1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯、1，5-二氮杂双环(4.3.0)壬-5-烯、1，4-二氮杂双环(2.2.2)辛烷、叔丁基氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、乙醇钠、磷酸三钾、硅酸钠、氧化钙、三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、磷酸氢钾、三苯膦、三乙基磷、乙酸钾或丙烯酸钾。在一些实施方案中，该迈克尔加成催化剂是1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯(DBU)。在一些实施方案中，化学计量或催化量的碱用来促进该迈克尔加成反应。
在一些实施方案中，该反应在有机溶剂如乙腈或二甲基乙酰胺中在室温下进行2-6小时。在优化的反应条件下，所需的迈克尔加合物，即式Ia的化合物，可以以高收率和纯度来获得。
或者，式Ia的化合物可以通过反应路线1的步骤(iii)中所示的方法来形成。因此，式Ia的化合物通过包括使式Id的化合物与式R8-L-R1的化合物反应，从而形成式Ia的化合物的方法来形成：
其中R8是离去基团。
在一些实施方案中，R8是本领域中已知的任一良好离去基团。在一些实施方案中，R8是卤素或C1-4烷氧基。在一些实施方案中，R8是氯。
在一些实施方案中，式Id的化合物与式R8-L-R1的化合物的反应在碱的存在下进行。在一些实施方案中，该碱是叔胺例如三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉等。在一些实施方案中，该碱是二异丙基乙基胺。
在反应路线1的步骤(iv)中，式Id的化合物通过包括处理式Ie的化合物以除去R9基团，从而形成式Id的化合物的方法来形成：
Figure BDA0000457047210000142
其中R9是保护基。
适当的R9保护基包括、但不限于在Wuts和Greene，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第四版，John Wiley&Sons：New Jersey，第696-887页(尤其第872-887页)(2007)中所述的胺的保护基，该文献通过引用全文并入到此处。R9是在不置换R7保护基的条件下能够选择性去除的保护基。在一些实施方案中，该R9是能够在酸性条件下在室温下、在约15℃到约40℃的温度下、或在约15℃到约30℃的温度下除去的保护基。在一些实施方案中，R9是C1-6烷氧基羰基。在一些实施方案中，R9是叔丁氧基羰基。在这里使用的“烷氧基羰基”指式-C(=O)O-烷基的基团。
处理式Ie的化合物以除去R9基团可以通过本领域中已知的用于除去胺的特定保护基的方法来完成，例如在Wuts和Greene，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第四版，John Wiley&Sons：New Jersey，第696-887页(尤其第872-887页)(2007)中所述的方法，该文献通过引用全文并入到此处。适当的处理条件不置换R7保护基。在一些实施方案中，所述处理包括让式Ie的化合物在室温下、在约15℃到约40℃的温度下或在约15℃到约30℃的温度下接触酸性条件。在一些实施方案中，式Ie的化合物的处理包括在1，4-二烷中用盐酸处理。
在反应路线1的步骤(v)中，式Ia的化合物通过包括使式Ib的化合物与式If的化合物反应，从而形成式Ie的化合物的方法来形成：
Figure BDA0000457047210000151
反应路线1的步骤(v)是在式Ib的化合物与式If的化合物之间的迈克尔加成反应。迈克尔加成可以通过迈克尔加成催化剂如碱来促进。在一些实施方案中，该迈克尔加成催化剂是四烷基卤化铵、氢氧化四烷基铵、胍、脒、氢氧化物、醇盐、硅酸盐、碱金属磷酸盐、氧化物、叔胺、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱金属磷酸氢盐、膦或羧酸的碱金属盐。在一些实施方案中，该迈克尔加成催化剂是四甲基胍、1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯、1，5-二氮杂双环(4.3.0)壬-5-烯、1，4-二氮杂双环(2.2.2)辛烷、叔丁基氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、乙醇钠、磷酸三钾、硅酸钠、氧化钙、三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、磷酸氢钾、三苯膦、三乙基磷、乙酸钾或丙烯酸钾。在一些实施方案中，该迈克尔加成催化剂是1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯(DBU)。在一些实施方案中，化学计量或催化量的碱用来促进该迈克尔加成反应。
在一些实施方案中，该反应在有机溶剂如乙腈或二甲基乙酰胺中在室温下进行2-6小时。在优化的反应条件下，所需的迈克尔加合物，即式Ia的化合物，可以以高收率和纯度来获得。
在反应路线2的步骤(vi)中，式Ig的化合物通过包括处理式Ig的化合物以除去R10基团，从而形成式Ib的化合物的方法来形成：
其中R10是保护基。
适当的R10保护基包括、但不限于在Wuts和Greene，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第四版，John Wiley&Sons：New Jersey，第696-887页(尤其第872-887页)(2007)中所述的胺的保护基，该文献通过引用全文并入到此处。R10是在不置换R7保护基的条件下能够选择性去除的保护基。在一些实施方案中，R10是能够在酸性条件下在室温下、在约15℃到约40℃的温度下或者在约15℃到约30℃的温度下除去的保护基。在一些实施方案中，R10是在室温酸性条件下脱保护的基团。在一些实施方案中，R10是1-(乙氧基)乙基、三(C1-6烷基)甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基或三异丙基甲硅烷基)、对甲氧基苄基(PMB)、三苯基甲基(Tr)、二苯基甲基、羟甲基、甲氧基甲基(MOM)、二乙氧基甲基或叔丁基二甲基甲硅烷基甲基。在一些实施方案中，R10是1-(乙氧基)乙基。
处理式Ig的化合物以除去R10基团可以通过本领域已知用于除去胺的特定保护基的方法来完成，例如在Wuts和Greene，Protective Groupsin Organic Synthesis，第四版，John Wiley&Sons：New Jersey，第696-887页(尤其第872-887页)(2007)中所述的方法，该文献通过引用全文并入到此处。在一些实施方案中，该处理包括在酸性条件下(例如盐酸或三氟乙酸)在室温下、在约15℃到约40℃的温度下或者在约15℃到约30℃的温度下处理式Ig的化合物。在一些实施方案中，该处理包括用约1N到约5N盐酸的水溶液在约10℃到约30℃的温度下处理式Ig的化合物。
在反应路线2的步骤(vii)中，式Ig的化合物通过包括在钯催化剂和碱的存在下让式Ih的化合物与式Il的化合物反应，从而形成式Ig的化合物的方法来形成：
Figure BDA0000457047210000171
其中：
X是甲苯磺酸根基团、三氟甲磺酸根基团、碘、氯或溴；以及
Ra和Rb各自独立地是H或C1-6烷基；或者
Ra和Rb与它们所连接的氧原子以及硼原子一起形成任选被1、2、3或4个C1-4烷基取代的5员到6员杂环。
步骤(vii)是苏楚基偶联反应，其能够使用许多钯(0)和钯(II)催化剂来引发，在本领域已知的条件下进行(例如参见Miyaura和Suzuki，Chem. Rev.1995，95，2457-2483，该文献全文并入到此处)。在一些实施方案中，钯催化剂是Pd(PPh3)4和Pd(dppf)2Cl2。在一些实施方案中，钯催化剂是四(三苯基膦)合钯(0)或四(三(邻甲苯基)膦)合钯(0)。在一些实施方案中，钯催化剂是四(三苯基膦)合钯(0)。
在一些实施方案中，钯催化剂加量是约1×10-4到约0.1当量。在一些实施方案中，钯催化剂加量是约0.0010到约0.0015当量。在一些实施方案中，式Ih的化合物与式Il的化合物的化学计量比是约1到约1.05，或者约1到约1.35。在一些实施方案中，用于步骤(vii)的溶剂包括水和有机溶剂。在一些实施方案中，该有机溶剂是1，4-二
Figure BDA0000457047210000183
烷、1-丁醇、1，2-二甲氧基乙烷(DME)、2-丙醇、甲苯或乙醇或它们的组合。在一些实施方案中，该有机溶剂包括1-丁醇和DME的组合。
在一些实施方案中，所述碱是无机碱。在一些实施方案中，该碱是有机碱。在一些实施方案中，该碱是碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐。在一些实施方案中，该碱是碳酸钾(K2CO3)。在一些实施方案中，使用2-5当量的碱(例如K2CO3)。在一些实施方案中，使用2-5当量的碱(例如NaHCO3)。
在一些实施方案中，该苏楚基偶联反应是在约80℃到约100℃的温度下进行。在一些实施方案中，该反应进行2-12小时。
在一些实施方案中，Ra和Rb与它们所连接的氧原子和硼原子一起形成以下结构部分：
Figure BDA0000457047210000181
在一些实施方案中，X是氯、溴或碘。在一些实施方案中，X是氯。
在反应路线2的步骤(viii)中，式Ih的化合物通过用R7基团保护式It的化合物来形成：
Figure BDA0000457047210000182
该R7基团如上所述选择。在一些实施方案中，R7是2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基。在一些实施方案中，R7是N-新戊酰氧基甲基。
R7保护基的添加可以通过本领域已知用于连接胺的保护基的方法来添加(例如参见以上提到的Wuts和Green)。例如，吲哚氮可以用碱(例如用氢化钠(NaH))在有机溶剂(例如THF、1,4-二
Figure BDA0000457047210000192
烷、1,2-二甲氧基乙烷(DME)或N，N-二甲基乙酰胺(DMAC))中在低温下(例如约0℃到约5℃)处理，然后用亲电体例如三甲基甲硅烷基乙氧基甲基氯(SEM-Cl)或新戊酰氧基甲基氯(POM-Cl)处理来去质子化。SEM-或POM-保护的4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶然后能够作为后续的苏楚基反应的起始原料进行分离或者就地产生，用或不用进一步提纯。
式Ic的化合物能够通过以下反应路线3中所示的方法来形成。
因此，在反应路线3的步骤(ix)中，式Ic的化合物通过包括让式Ik的化合物或其盐与式R8-L-R1的化合物在碱的存在下反应，从而形成式Ic的化合物的方法来形成：
Figure BDA0000457047210000191
其中R8是离去基团。
该R8基团可以是本领域已知用于添加含磺酰基或羰基的结构部分的任何适当的离去基团。在一些实施方案中，R8是卤素或C1-4烷氧基。在一些实施方案中，R8是氯、溴或碘。在一些实施方案中，R8是氯。
在一些实施方案中，所述碱是叔胺，例如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉等。在一些实施方案中，该碱是二异丙基乙胺。在一些实施方案中，式Ik的化合物的盐是盐酸盐。
式If的化合物可以按照本领域已知的方法(例如参见以上Wuts和Green)用适当的R9基团保护式Ik的化合物的氨基来形成。或者，式Im的化合物可以用于替代式If的化合物。
在反应路线3的步骤(x)中，式Ik的化合物通过包括处理式Im的化合物以除去-C(=O)OR11结构部分，从而形成式Ik的化合物的方法来形成：
其中R11是C1-6烷氧基羰基。
在一些实施方案中，R11是叔丁氧羰基(BOC)。在一些实施方案中，式Im的化合物的处理包括本领域已知用于从胺上除去烷氧基羰基(例如BOC基团)的任何方法(例如参见Wuts和Greene，Protective Groups inOrganic Synthesis，第四版，John Wiley&Sons：New Jersey，第696-887页(特别是第872-887页)(2007)，该文献通过引用全文并入到此处)。在一些实施方案中，式Im的化合物的处理包括用盐酸水溶液处理。
反应路线3
Figure BDA0000457047210000202
在反应路线3的步骤(xi)中，式Im的化合物通过包括让式In的化合物与含有氰基甲基或氰甲基内
Figure BDA0000457047210000204
盐基团的维蒂希类试剂反应，从而形成式Im的化合物的方法来形成：
Figure BDA0000457047210000203
在这里使用的术语“维蒂希类试剂”是指如在现有技术中所述的维蒂希反应、Wadsworth-Emmons反应和Horner-Wittig反应中使用的试剂(例如参见，Carey和Sundberg，Advanced Organic Chemistry，Part B：Reactions and Synthesis，第四版，Kluwer Academic／PlenumPublishers：New York，第111-119页(2001)；以及March，AdvancedOrganic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，第三版，JohnWiley&Sons：New York，第845-855页(1985)，这些文献通过引用全文并入到此处)。含氰甲基或氰甲基内
Figure BDA0000457047210000211
盐基团的示例性维蒂希类试剂包括、但不限于通式(R’O)2P(=O)-L-R1、R”3P(+)-L(-)-R1，R”2P(＝O)-L-R1和(R’N)2P(=O)-L-R1的化合物，其中R’是C1-6烷氧基或任选取代的苯基；R”是任选取代的苯基；L是-CH2-或-CH-；以及R1是氰基。在一些实施方案中，维蒂希类试剂是磷酸二乙基氰基甲酯。在一些实施方案中，式In的化合物与维蒂希类试剂在碱的存在下反应。在一些实施方案中，该碱是强碱。在一些实施方案中，该碱是叔丁醇钾，叔丁醇钠，氢化钠，乙醇钠，氢氧化钠，碳酸钾或碳酸钠。在一些实施方案中，该碱是碱金属醇盐。在一些实施方案中，该碱是碱金属叔丁醇盐。在一些实施方案中，该碱是叔丁醇钾。在一些实施方案中，式In的氮杂环丁烷酮用维蒂希试剂的烯化在有机溶剂如THF中在碱例如叔丁醇钾的影响下在约0℃到约5℃的温度下进行。
式In的氮杂环丁酮可以通过Gaertner所报告的改良工序来制备(J.Org.Chem.，1967，32，2972)(例如参见步骤(xii)到(xiv))。在一个实施方案中，在亲电体如二碳酸二叔丁酯的存在下在催化氢解条件下由式Ip的化合物“单组分”形成相应的式Io的氨基甲酸酯保护的氮杂环丁醇(azetidinols)与其他改良工序(Zhengming，Chen等人，WO00／63168)相比简化了制备受保护的氮杂环丁醇的方法。式Io的受保护的氮杂环丁醇至式In的相应的酮的TEMPO催化的氧化在温和的反应条件下提供了几乎定量收率。作为二官能化合物，式Io的N保护的氮杂环丁酮是制备络合有机分子的非常有用的合成中间体。
因此，在反应路线3的步骤(xii)中，式In的化合物通过包括用氧化剂组分处理式Io的化合物，从而形成式In的化合物的方法来形成：
在这里使用的术语“氧化剂组分”是指本领域已知用于将仲醇氧化为酮的一种或多种氧化剂(例如参见Carey和Sundberg，AdvancedOrganic Chemistry，Part B：Reactions and Synthesis，第四版，KluwerAcademic／Plenum Publishers：New York，第747-757页)，该文献通过引用全文并入到此处)。在一些实施方案中，该氧化剂组分包括过渡金属氧化剂，包括但不限于铬(VI)试剂(例如，柯林斯试剂，重铬酸吡啶
Figure BDA0000457047210000223
盐(PDC)，或氯铬酸吡啶盐(PCC))，高锰酸钾，二氧化锰(IV)，钌(II)试剂(例如，RuCl2(对异丙基苯甲烷)2)，四氧化钌，或者二氧化锰(IV)、钌(II)试剂和苯醌的组合；DMSO和亲电试剂例如碳二亚胺试剂(例如，二环己基碳二亚胺)、乙酸酐、三氟醋酐、草酰氯或三氧化硫；二甲硫醚和N-氯琥珀酰亚胺；DMSO和氯；或戴斯-马丁试剂。在一些实施方案中，该氧化剂组分包括2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)和化学计量氧化剂(例如，次氯酸钠或N-氯琥珀酰亚胺(NCS))。在一些实施方案中，该氧化剂组分包括TEMPO和次氯酸钠。
在反应路线3的步骤(xiii)中，式Io的化合物通过包括在催化氢化条件下让式Ip的化合物与式Iq的化合物反应，从而形成式Io的化合物的方法来形成：
Figure BDA0000457047210000222
在一些实施方案中，该催化氢化条件包括氢气和钯碳催化剂。
在反应路线3的步骤(xiv)中，式Ip的化合物通过包括下列步骤的方法来制备：
(a)让式Ir的化合物与式Is的化合物反应，从而形成式Ip的化合物的卤化物盐：
以及
(b)用碱处理式Ip的化合物的盐，从而形成式Ip的化合物；
其中X1是卤素。
在一些实施方案中，X1是氯。
本发明进一步提供了形成式I的化合物的方法，包括：
(a)在四(三苯基膦)合钯(0)和碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐碱的存在下，让式Ih的化合物：
Figure BDA0000457047210000232
与下式的化合物反应，
从而形成式Ig的化合物：
(b)处理式Ig的化合物以除去R10基团，从而形成式Ib的化合物：
Figure BDA0000457047210000242
(c)在催化量或化学计量的1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯的存在下，使式Ib的化合物与式Ic的化合物反应：
Figure BDA0000457047210000243
从而形成式Ia的化合物：
Figure BDA0000457047210000244
(d)处理式Ia的化合物以除去R7结构部分，从而形成式I的化合物：
其中：
L是SO2；
R1是C1-6烷基；
R7是2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基乙基或2-新戊酰氧基甲基；
R10是1-(乙氧基)乙基；以及
X是氯。
本发明进一步提供了形成式I的化合物的方法，包括：
(a)在四(三苯基膦)合钯(0)和碱金属碳酸盐碱的存在下，让式Ih的化合物：
Figure BDA0000457047210000252
与下式的化合物反应，
Figure BDA0000457047210000253
从而形成式Ig的化合物：
Figure BDA0000457047210000261
(b)处理式Ig的化合物以除去R10基团，从而形成式Ib的化合物：
Figure BDA0000457047210000262
(c)在催化量或化学计量的1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯的存在下，让式Ib的化合物：
Figure BDA0000457047210000263
与式If的化合物反应，
Figure BDA0000457047210000264
从而形成式Ie的化合物：
Figure BDA0000457047210000271
(d)处理式Ie的化合物以除去R9基团，从而形成式Id化合物：
Figure BDA0000457047210000272
(e)让式Id化合物与式R8-L-R1的化合物反应，从而形成式Ia的化合物：
Figure BDA0000457047210000273
(f)处理式Ia的化合物以除去R7结构部分，从而形成式I的化合物：
Figure BDA0000457047210000281
其中：
L是SO2；
R1是C1-6烷基；
R7是2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基乙基或2-新戊酰氧基甲基；
R8是氯；
R9是叔丁氧羰基；
R10是1-(乙氧基)乙基；以及
X是氯。
所述方法可以用于制备这里的实施方案中所述的任何化合物，或它们的组合，或任何的实施例的化合物。本发明提供了用于形成式I的化合物、式Ia的化合物等的各种方法的任何组合。本发明进一步提供了任何以上中间体或它们的盐。
在一些实施方案中，由所述方法或其组合制备的式I的化合物是{1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈。本发明进一步提供了用于制备{1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈的式Ia、Ib、Ic等的每一种相应的中间体。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使式I的化合物与磷酸反应，以形成磷酸盐。式I的化合物的磷酸盐可以通过用磷酸在有机溶剂如乙醇中的溶液在室温下或在高温下(例如约60℃到约70℃)处理相应的游离碱在有机溶剂如乙醇(EtOH)中的溶液来制备。所生成的粗磷酸盐然后可以进一步通过在有机溶剂或混合有机溶剂体系中重结晶或再制浆来提纯。
在一些实施方案中，由所述方法制备的化合物是{1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈磷酸盐。
在一些实施方案中，式I、II、III和IV的化合物可以根据以下在实施例部分中所述的合成工序来制备。
方法
本发明的化合物可以调节一种或多种Janus激酶(JAK)的活性。术语“调节”是指增高或减低该JAK激酶家族的一个或多个成员的活性的能力。因此，本发明的化合物能够用于通过使JAK与在这里所述的任何一种或多种化合物或组合物接触来调节JAK的方法。在一些实施方案中，本发明的化合物可以用作一种或多种JAK的抑制剂。在其他实施方案中，本发明的化合物能够通过给药调节量的式I、II、III或IV的化合物而用于调节需要调节受体的个体中的JAK的活性。
本发明化合物所要结合和／或调节的JAK包括JAK家族的任何成员。在一些实施方案中，JAK是JAK1、JAK2、JAK3或TYK2。在一些实施方案中，JAK是JAK1或JAK2。在一些实施方案中，JAK是JAK2。在一些实施方案中，JAK是JAK3。
本发明的另一个方面涉及治疗个体(例如患者)的JAK相关性疾病或病症的方法，其通过将治疗有效量或治疗有效剂量的本发明的化合物或其药物组合物给药于需要这种治疗的个体而进行。JAK相关性疾病可以包括与JAK的表达或活性、包括过表达和／或异常活性水平直接或间接关联的任何疾病、障碍或病症。JAK相关性疾病还可以包括能够通过调节JAK活性来预防、改善或治愈的任何疾病、障碍或病症。
JAK相关性疾病的实例包括牵涉免疫***的疾病，例如器官移植排斥反应(例如，同种异体移植排斥和移植物抗宿主疾病)。
JAK相关性疾病的其他实例包括自身免疫病如多发性硬化，类风湿性关节炎，少年关节炎，牛皮癣关节炎，I型糖尿病，狼疮，银屑病，炎症性肠病，溃疡性结肠炎，克罗恩氏病，重症肌无力，免疫球蛋白肾病，自身免疫甲状腺疾病等。在一些实施方案中，该自身免疫病是自身免疫大疱性皮肤病如寻常型天疱疮(PV)或大疱性类天疱疮(BP)。
JAK相关性疾病的其他实例包括***反应性病症如哮喘、食物过敏、特应性皮炎和鼻炎。JAK相关性疾病的其他实例包括病毒病例如EB病毒(EBV)，乙型肝炎，丙型肝炎，HIV，HTLV1，水痘-带状疱疹病毒(VZV)和人***状瘤病毒(HPV)。
JAK相关性疾病或病症包括皮肤病例如银屑病(例如寻常型银屑病)，特应性皮炎，皮疹，皮肤刺激性，皮肤敏化(例如，接触性皮炎或变应性接触性皮炎)。例如，当局部施用时，包括某些药物的某些物质能够引起皮肤敏化。在一些实施方案中，将本发明的至少一种JAK抑制剂与引起不希望有的敏化的药剂共同给药或顺序给药能够有助于治疗这种不希望有的敏化或皮炎。在一些实施方案中，该皮肤疾病通过局部给药本发明的至少一种JAK抑制剂来进行治疗。
在其他实施方案中，该JAK相关性疾病是癌症，包括以实性肿瘤为特征的癌症(例如***癌，肾癌，肝癌，胰腺癌，胃癌，乳腺癌，肺癌，头颈部癌，甲状腺癌，恶性胶质瘤，卡波济氏肉瘤，巨大***增生症(Castleman’s disease)，黑色素瘤等)，血液***癌症(例如，淋巴瘤，白血病如急性淋巴母细胞性白血病，急性髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤)，以及皮肤癌如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和皮肤B细胞淋巴瘤。皮肤T细胞淋巴瘤的实例包括塞扎里综合征和蕈样肉芽肿病。
JAK相关性疾病可以进一步包括以突变JAK2例如在假激酶结构域(例如JAK2V617F)中具有至少一个突变的JAK2的表达为特征的疾病。
JAK相关性疾病可以进一步包括骨髓增生病(MPD)如真性红细胞增多症(PV)，原发性血小板增多症(ET)，具有髓样化生的骨髓纤维化症(MMM)，慢性粒性白血病(CML)，慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)，嗜酸性白细胞增多综合征(HES)，***性肥大细胞病(SMCD)等。在一些实施方案中，该骨髓增生病是原发性骨髓纤维化症(PMF)或后真性红细胞增多症／原发性血小板增多症骨髓纤维化症(Post-PV／ET MF)。
其他JAK相关性疾病包括炎症和炎性疾病。示例性炎性疾病包括眼睛的炎性疾病(例如，虹膜炎，眼色素层炎，巩膜炎，结膜炎或相关疾病)，呼吸道的炎性疾病(例如包括鼻子和鼻窦的上呼吸道，如鼻炎或鼻窦炎，或下呼吸道，包括支气管炎、慢性阻塞性肺病等)，炎症性肌病如心肌炎，和其他炎性疾病。
本文所述的JSK抑制剂可以进一步用于治疗局部缺血再灌注损伤或者与炎症性缺血事件有关的疾病或病症如中风或心跳停止。本文所述的JAK抑制剂可以进一步用来治疗厌食、恶病质或疲劳，例如由癌症导致的或与癌症有关的厌食、恶病质或疲劳。本文所述的JAK抑制剂可以进一步用来治疗再狭窄、硬化性皮炎或纤维化。本文所述的JAK抑制剂可以进一步用来治疗与缺氧或胶质细胞增生有关的病症，例如糖尿病性视网膜病、癌症或神经变性。例如参见Dudley，A.C.等人，Biochem.J.2005，390(Pt2)：427-36和Sriram，K.等人，J.Biol.Chem.2004，279(19)：19936-47.Epub2004年3月2日。本文所述的JAK抑制剂可用于治疗阿尔茨海默氏病。
本文所述的JAK抑制剂可以进一步用来治疗其它炎性疾病如全身炎症反应综合症(SIRS)和脓毒性休克。
本文所述的JAK抑制剂可以进一步用来治疗痛风和由于例如良性***肥大或良性***增生导致的增加的***尺寸。
本文所述的JAK抑制剂以及其它能够影响IL-6／STAT3信号传导的JAK抑制剂可以进一步用来治疗炎症相关性增殖疾病。已经表明炎症与某些类型的癌症的发生有关联。例如，已经表明，患有炎症性肠病例如溃疡性结肠炎的患者具有更高的发生结肠直肠癌症的风险。这些类型的炎症有关的癌症已经称作结肠炎相关性癌症(CAC)。若干研究已经表明，IL-6／STAT3信号传导与促进CAC有关。例如，在CAC动物模型中，缺乏STAT3肠上皮细胞的小鼠具有减小的肿瘤尺寸和发生率。Bromberg等人，“Inflammation and cancer：IL-6and STAT3complete the link(炎症和癌症：IL-6和STAT3完成该联系)”，Cancer Cell，15：79-80(2009)。用IL-6缺乏小鼠获得了类似结果，其与野生型小鼠相比，所发生的腺瘤较少且较小。Grivennikov等人，“IL-6and STAT3are required for survival ofintestinal epithelial cells and the development of colitis-associated cancer(肠上皮细胞的存活和结肠炎相关性癌症的发生需要IL-6和STAT3)”，Cancer Cell，15：103-111(2009)。还参见Bollrath等人，“gp130-MediatedSTAT3activation in enterocytes regulatres cell survival and cell-cycleprogression during colitis-associated tumorigenesis(肠上皮细胞中的gp130介导的STAT3活化在结肠炎相关性肿瘤生成过程中调节细胞存活和细胞周期进展)”，Cancer Cell，15：91-102(2009)；以及Kortylewski等人，“Regulation of the IL-23and IL-12balance by Stat3signaling in the tumormicroenvironment(肿瘤微环境中的IL-23和IL-12平衡通过Stat3信号传导的调节)”，Cancer Cell，15：114-123(2009)。
因此，在一些实施方案中，本发明的JAK抑制剂以及影响IL-6／STAT3信号传导的物质可用于治疗炎症相关性癌症。在一些实施方案中，该癌症与炎症性肠病有关。在一些实施方案中，该炎症性肠病是溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，该炎症性肠病是克罗恩氏病。在一些实施方案中，该炎症相关性癌症是与结肠炎相关的癌症。在一些实施方案中，该炎症相关性癌症是结肠癌或结肠直肠癌。在一些实施方案中，该癌症是胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、腺癌、小肠癌或直肠癌。除在这里提供的化合物以外，可用于治疗炎症相关性癌症的JAK抑制剂的实例包括US2006／0106020；US2006／0183906；US2007／0149506；US2007／0135461；US2008／0188500；US2008／0312258；US2008／0312259；和美国专利申请序号12／270，135中所述的化合物。
JAK抑制剂能够在动物模型中测试在炎症相关性癌症的治疗中的潜在功效。例如，通过在Grivennikov等人，“IL-6and STAT3are requiredfor survival of intestinal epithelial cells and the development ofcolitis-associated cancer(肠上皮细胞的存活和结肠炎相关性癌症的发生需要IL-6和STAT3)”，Cancer Cell，15：103-111(2009)中总结的方法，在治疗(例如用JAK抑制剂)或未治疗小鼠中可以诱发CAC。该疾病的进展可以通过测定体重以及监测直肠出血和腹泻的体征来跟踪。在处死动物之后，取下远端结肠部分用于分析。
在一些实施方案中，本文所述的JAK抑制剂可以进一步用来治疗干眼病。在这里使用的“干眼病”意图是包括在最近的国际干眼病工作组(DEWS)的官方报告中总结的疾病状态，其将干眼定义为“眼泪和眼表的多因子疾病，其导致不舒适感、视力障碍和泪膜不稳定性的症状，具有对眼表的潜在损害。它伴有增高的泪膜的摩尔渗透压浓度以及眼表的炎症。”Lemp，“The Definition and Classification of Dry Eye Disease：Report of the Definition and Classification Subcommittee of theInternational Dry Eye WorkShop(干眼病的定义和分类：国际干眼病工作组的定义和分类小组委员会的报告)”，The Ocular Surface，5(2)，75-92，2007年4月，该文献通过引用全文并入到此处。干眼有时也称为干燥性角膜结膜炎。在一些实施方案中，干眼病的治疗包括改善干眼病的特定症状，例如眼睛不舒适感、视力障碍、泪膜不稳定性、眼泪高渗透压性、眼表的炎症。
如在DEWS报告中所总结的，干眼可以分为两种不同的种类：水液性泪液不足型干眼(aqueous tear-deficient dry eye)和蒸发过强型干眼，其进而包括各种亚类。因此，在一些实施方案中，干眼病是水液性泪液不足型干眼(ADDE)。在其他实施方案中，干眼病是蒸发过强型干眼。在其他实施方案中，干眼病选自ADDE或蒸发过强型干眼病的任何亚类，或它们的适当的组合。然而，如由DEWS报导的作者所述，各种类型和亚类不互相排斥。因此，干眼能够在不同亚类中经由不同的机制发生，或者源于一种亚类的干眼病状态能够导致通过在另一亚类中的机制引起干眼的事件。
第一类干眼，水液性泪液不足型干眼(ADDE)，亦称泪腺分泌不足型干眼和泪液不足。在ADDE中，干眼被认为是由于泪液分泌故障造成的。虽然不希望受任何理论制约，据信干燥是由减少的泪液分泌和体积所造成，引起了泪液高渗透压性。泪膜高渗透压性能够引起眼表上皮细胞的高渗透压性，刺激牵涉各种激酶和信号传导途径的炎症性事件。
ADDE的两个亚类是干燥综合症干眼(SSDE)，其中泪腺成为自身免疫过程的靶的，以及非干燥综合症干眼(NSSDE)。相应地，在一些实施方案中，该眼病是SSDE。在其它实施方案中，干眼病是非干燥综合症干眼。在SSDE中，据认为，活化的T细胞可以渗入泪腺，引起腺泡细胞和导管细胞的死亡和泪液的分泌不足。局部释放的细胞因子或循环抗体的效应可以放大分泌不足的效应。SSDE的两种主要的形式是原发形式和继发形式。原发性SS可以与口干燥(口腔干燥)联合发生。继发性SSDE与原发性SSDE的症状以及自身免疫***疾病如类风湿性关节炎(RA)、***性红斑狼疮、结节性动脉周围炎、Wegener肉芽肿病、***性硬化、原发性胆汁性硬化或混合***病一起发生。用于这些***疾病的每一种的诊断标准在本领域中是已知的。此外，原发性SSDE可以与可能牵涉肺、肾、肝、血管和关节的疾病的全身临床表现有关。
在NSSDE中，干燥综合症干眼的***性自身免疫特征被排除。NSSDE的形式包括原发性泪腺缺陷(包括年龄相关性干眼，先天性无泪以及家族性自主神经异常)，继发性泪腺缺陷(包括泪腺被肉瘤样肉芽肿、淋巴瘤细胞和AIDS相关性T细胞炎性浸润；与移植物抗宿主疾病有关的泪腺缺陷；以及由泪腺切除术或泪腺神经切除术导致的泪腺缺陷)，泪腺导管的阻塞(包括由瘢痕化结膜炎(包括沙眼)、瘢痕性类天疱疮和粘膜类天疱疮、多形性红斑以及化学品或热灼伤导致的泪腺导管的阻塞)，以及反射性分泌不足(包括反射感觉阻断，例如与隐形眼镜磨损、糖尿病和神经营养性角膜炎有关的反射感觉阻断，以及反射运动阻断，包括与VII脑神经破坏、多发性神经瘤病以及接触全身药物如抗组胺剂、β阻断剂、镇痉药、利尿药、三环抗忧郁药、选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂和其他精神性药物有关的反射运动阻断)。
第二大类的干眼病是蒸发过强型干眼，它是在正常泪腺分泌功能的情况下由暴露眼表的过量水损失引起的。蒸发过强型干眼的内在原因包括睑板腺功能紊乱(MGD)(包括由先天性缺陷获得的MGD导致的腺体数目减少所引起的MGD；与双行睫、双行睫-淋巴水肿综合症和组织变形相关的MGD；与睑板腺皮脂溢有关的分泌过多性MGD，与维生素A类药物疗法有关的分泌过多性MGD，原发和继发阻塞性MGD、集中或扩散阻塞性MGD，简单或瘢痕阻塞性MGD，萎缩或炎症阻塞性MGD；前睑炎、红斑痤疮、脂溢性皮炎、先天性缺指(趾)畸形综合症(ectrodactylysyndrome)、特纳综合症、13-顺式视黄酸、多氯联苯和肾上腺素的全身毒性原发或继发的简单MGD；以及化学灼伤、类天疱疮、红斑痤疮、多形性红斑、VKC和AKC原发或继发的瘢痕性MGD)，眼睑孔和眼睑／眼球协调或活力的障碍(例如在颅狭小、内分泌和其他形式的前垂、近视以及在眼睑整形手术之后发生的障碍)，以及低眨眼率(包括由锥体外系疾病如帕金森氏病引起的低眨眼率)。蒸发过强型干眼的外在原因包括眼表病症(包括由维生素A缺乏症引起的眼干燥；以及与局部药物和防腐剂例如表面麻醉和苯扎氯铵相关的眼表病症)，隐形眼镜磨损，眼表疾病(包括***反应性眼病)，变应性结膜炎(包括季节变应性结膜炎，春季角膜结膜炎和特应性角膜结膜炎)，以及抗组胺药的使用。
需要治疗干眼病的患者可以通过本领域已知的各种诊断方法来确定，包括在Bron等人，“Methodologies to Diagnose and Monitor Dry EyeDisease：Report of the Diagnostic Methodology Subcommittee of theInternational Dry Eye Workshop(诊断和监测干眼病的方法：国际干眼病工作组的诊断方法学小组委员会的报告)(2007)”，The Ocular Surface，5(2)，108-152(2007年4月)中总结的诊断方法，该文献通过引用全文并入到此处。这些诊断方法包括、但不限于：(1)症状调查表(例如，Begley等人，“Use of the dry eye questionnaire to measure symptoms of ocularirritation in patients with aqueous tear deficient dry eye(使用用于测定具有水液性泪液不足型干眼的患者的眼睛刺激的症状的干眼调查表)”，Cornea，2002：21：664-70)；(2)检查表面损伤的眼表的染色(例如，玫瑰红或荧光素染色或其他染色方法，例如在Barr等人，“Corneal scarring inthe Collaborative Longitudinal Evaluation of Keratoconus(CLEK)Study：baseline prevalence and repeatability of detection(圆锥角膜联合纵向研究(CLEK)中的角膜瘢痕形成：基线流行和检测的再现性)”，Cornea1999；18(1)：34-46；Lemp，“Report of the National Eye Institute／IndustryWorkshop on clinical trials in dry eyes(国立眼科研究所工作组关于干眼临床试验的报告)”，CLAO J1995；21(4)：221-31；Nichols等人，“Therepeatability of clinical measurements of dry eye(干眼的临床测量的再现性)”，Cornea2004；23：272-85；Bron等人，“Grading of corneal andconjunctival staining in the context of other dry eye tests(其他干眼试验中的角膜和结膜染色的分级)”，Cornea2003；22(7)：640-50)中总结的技术；(3)用于测试泪膜稳定性的泪膜破裂时间的测量(例如，Abelson等人，“Alternate reference values for tear film break-up time in normal and dryeye populations(正常和干眼人群的泪膜破裂时间的备用参考值)”，AdvExp Med Biol2002；506,Part B：1121-1125；Bron AJ等人，“Grading ofcorneal and conjunctival staining in the context of other dry eye tests(其他干眼试验中的角膜和结膜染色的分级)”，Cornea2003；22：640-50；Cho等人，“Review of the tear break-up time and a closer look at the tearbreak-up time of Hong Kong Chinese(泪膜破裂时间的综述以及中国香港的泪膜破裂时间的细看)”，Optom Vis Sci1993；70(1)：30-8；Craig等人，“Tear lipid layer structure and stability following expression of themeibomian glands(睑板腺表达之后的泪膜脂质层结构和稳定性)”.Ophthalmic Physiol Opt1995，15(6)：569-74；Eliason等人，“Staining of theconjunctiva and conjunctival tear film(结膜和结膜泪膜的染色)”，Br JOphthalmol1990；74：519-22；Farrell等人，“A classification for dry eyesfollowing comparison of tear thinning time with Schirmer tear test(根据用希默氏泪水试验比较泪液稀释时间的干眼分类)”，Acta Ophthalmol(Copenh)1992；70(3)：357-60；Johnson等人，“The effect of instilledfluorescein solution volume on the values and repeatability of TBUTmeasurements(灌输的荧光素溶液体积对TBUT测量的值和再现性的效果)”，Cornea2005；24：811-7；Lemp等人，“Corneal desiccation despitenormal tear volume(眼泪量正常的角膜干燥)”，Ann Ophthalmol1970；284：258-261；Lemp“Report of National Eye Institute／IndustryWorkshop on clinical trials in dry eyes(国立眼科研究所工作组关于干眼临床试验的报告)”，CLAO J1995；21：221-232；Madden等人，Comparativestudy of two non-invasive tear film stability techniques(两种非侵入性泪膜稳定性技术的比较研究).Curr Eye Res1994；13(4)：263-9；Marquardt等人，“Modification of tear film break-up time test for increased reliability(用于获得增加的可靠性的泪膜破裂时间试验的改良)”Holly ed.ThePreocular Tear Film in Health，Disease and Contact Lens Wear.Lubbock，Texas：Dry Eye Institute，1986：57-63；Mengher等人，“Non-invasive tearfilm break-up time：sensitivity and specificity(非侵入性泪膜破裂时间：灵敏的和特异性)”，Acta Ophthalmol(Copenh)1986；64(4)：441-4；Nichols等人，“The repeatability of clinical measurements of dry eye(干眼的临床测量的再现性)”Cornea2004；23：272-85；Pflugfelder等人，“Evaluationof subjective assessments and objective diagnostic tests for diagnosingtear-film disorders known to cause ocular irritation(用于诊断已知引起眼睛刺激的泪膜疾病的主观判断和客观诊断试验的评价).”Cornea1998；17(1)：38-56；Vitali等人，“The European Community Study Group ondiagnostic criteria for sjogren’s syndrome.Sensitivity and specificity oftests for ocular and oral involvement in Sjogren’s syndrome.(欧洲共同体研究组关于干燥综合症的诊断标准。干燥综合症的眼和口腔受累的试验的灵敏度和特异性)”1992；Ann Rheum Dis53(10)：637-47；Welch等人，“An approach to a more standardized method of evaluating tear filmbreak-up time(评价泪膜破裂时间的更标准化方法的入门)”InvestOphthalmol Vis Sci2003；2485／B324.)；(4)希默氏试验(通过将滤纸***到结膜囊而反射性刺激的泪流的评价)(例如，van Bijsterveld，“Diagnostictests in the sicca syndrome(干燥综合症的诊断试验)”Arch Ophthalmol1969；82：10-14；Holly等人，“Lacrimation kinetics as determined by a noveltechnique(通过新型技术测定的流泪动力学)”，Holly FJ(ed).Thepreocular tear film.Lubbock TX，Lubbock Dry Eye Institute，1986，第76-88页)；(5)泪液摩尔渗透压浓度的测量(例如，Farris，“Tearosmolarity--a new gold standard?(泪液摩尔渗透压浓度-一种新型黄金标准?)”Adv Exp Med Biol350：495-503，1994；Nelson等人，“Tear filmosmolality determination：an evaluation of potential errors in measurement(泪膜摩尔渗透压浓度)”Curr Eye Res Sep；5(9)：677-81，1986；Sullivan等人，“4th International Conference on the Lacrimal Gland，Tear Film&Ocular Surface and Dry Eye Syndromes(泪腺、泪膜和眼表和干眼综合症的第四届国际会议)，11／20／04”；White等人，“Human basic tear fluidosmolality.I.Importance of sample collection strategy(人基础泪液摩尔渗透压浓度。I.I样本采集策略的重要性)”，Acta Ophthalmol(Copenh)Aug；71(4)：524-9，1993；(6)用于诊断水液性泪液缺乏的泪液弯月面半径、高度和横截面积的测量(例如，Cermak等人，“Is complete androgeninsensitivity syndrome associated with alterations in the meibomium glandand ocular surface(完全雄激素不敏感综合症与睑板腺和眼表的改变有关吗)”，Cornea2003；22：516-521；Farrell等人，“A clinical procedure topredict the value of temporary occlusion therapy in keratoconjunctivitissicca(用于预测干燥性角膜结膜炎的暂时性堵塞治疗的值的临床操作程序)”Ophthal Physiol Opt2003；23：1-8；Glasson等人，“Differences inclinical parameters and tear film of tolerant and intolerant contact lenswearers(耐受和不耐受隐形眼镜佩戴者的临床参数和泪膜的差别)”，Invest Ophthalmol Vis Sci2003；44：5116-5124；Mainstone等人，“Tearmeniscus measurement in the diagnosis ofdry eye(干眼诊断中的泪液弯月面测量)”，Curr Eye Res1996；15：653-661；Nichols等人，“Therepeatability of clinical measurements ofdry eye(干眼的临床测量的再现性)”，Cornea2004a；23：272-285；Nichols等人，“The lack of associationbetween signs and symptoms in patients with dry eye disease(患有干眼病的患者中的体征与症状之间的相关性的缺乏)”，Cornea2004b；23：762-770；Oguz等人，“The height and radius of the tear meniscus andmethods for examining these parameters(泪液弯月面的高度和半径以及检验这些参数的方法)”，Cornea2000；19：497-500；Yokoi等人，“Non-invasive methods of assessing the tear film(评价泪膜的非侵入方法)”，Exp Eye Res2004；78：399-407)；(7)诊断水液性泪液不足型干眼(ATD)或角膜前脂质性泪液不足的泪膜脂质层干涉测量法(Danjo等人，“Observation of precorneal tear film in patients with Sjogren’ssyndrome(患有干燥综合征的患者的角膜前泪膜的观察)”，ActaOphthalmol Scand1995；73：501-5；Doane，“An instrument for in vivo tearfilm interferometry(体内泪膜干涉测量法用仪器)”，Optom Vis Sci1989；66：383-8；Goto等人，“Computer-synthesis of an interference color chart ofhuman tear lipid layer by a colorimetric approach(通过比色法计算机合成人泪液脂质层的干涉色图谱)”，Invest Ophthalmol Vis Sci2003；44：4693-7；Goto等人，“Differentiation of lipid tear deficiency dry eyeby kinetic analysis of tear interference images(通过泪液干涉图像的动力学分析区分脂质泪液不足型干眼)”，Arch Ophthalmol2003；121：173-80；Goto E等人，“Kinetic analysis of tear interference images in aqueous teardeficiency dry eye before and after punctal occlusion(泪点阻塞之前和之后的水液性泪液不足型干眼的泪液干涉图像的动力学分析)”.InvestOphthalmol Vis Sci2003；44：1897-905；Goto等人，“Color mapping of tearlipid layer thickness distribution from the image analysis in DR-1tear lipidlayer interference images(由DR-1泪液脂质层干涉图像的图像分析颜色映射泪液脂质层厚度分布)(ARVO abstract)”.ARVO2004；Guillon，“Tear film photography and contact lens wear(泪膜摄影和隐形眼镜磨损)”，J Br Contact Lens Assoc1982；5：84-7；King-Smith等人，“Threeinterferometric methods for measuring the thickness of layers of the tearfilm(测定泪膜层的厚度的三种干涉测量法)”，Optom Vis Sci1999；76：19-32；Korb等人，“Increase in tear film lipid layer thicknessfollowing treatment of meibomian gland dysfunction(在睑板腺功能障碍的治疗之后的泪膜脂质层厚度的增加)”，Adv Exp Med Biol1994；350：293-8；Korb等人，“The effect of two novel lubricant eye drops ontear film lipid layer thickness in subjects with dry eye symptoms(两种新型润滑剂滴眼剂对具有干眼症状的患者的泪膜脂质层厚度的效果)”，Optom Vis Sci2005；82：594-601；Mathers等人，“Assessment ofthe tearfilm with tandem scanmng confocal microscopy(用串列扫描共聚焦显微镜检查来评价泪膜)”，Cornea1997；16：162-8；Maruyama等人，“Effect ofenvironmental conditions on tear dynamics in soft contact lens wearers(软隐形眼镜佩戴者的泪液动力学环境条件的效果)”，Invest Ophthalmol VisSci2004；45(8)：2563-8；Tiffany，“Refractive index of meibomian and otherlipids(睑板腺脂质以及其他脂质的折射指数)”，Curr Eye Res1986；5：887-9；Tiffany等人，“Meniscometry using the Tearscope-plus(使用Tearscope-plus的弯月面测量法)(ARVO abstract)”.Invest OphthalmolVis Sci2001；42，s37；Yokoi等人，“Correlation of tear lipid layerinterference patterns with the diagnosis and severity of dry eye(泪液脂质层干涉图案与干眼的诊断和严重性的相关性)”，Am J Ophthalmol1996；122：818-24；Yokoi等人，“Assessment of meibomian gland function indry eye using meibometry(使用睑板腺功能测量法评价干眼的睑板腺功能)”，Arch Ophthalmol1999；117：723-9)；(8)用于诊断泪液不稳定性的泪液稳定性分析***(TSAS)(例如，Goto等人，“Tear Film StabilityAnalysis System：Introducing a new application for videokeratography(泪膜稳定性分析***：角膜地形图的新应用的介绍)”，Cornea2004a；Nov；23(8)：S65-S70；Goto等人，“Evaluation of the tear film stability afterlaser in situ keratomileusis using the tear film stability analysis system(使用泪膜稳定性分析***在激光就地角膜磨削术之后来评价泪膜稳定性)”，Am J Ophthalmol2004b Jan；137(1)：116-20；Kojima等人，“A newnoninvasive tear stability analysis system for the assessment of dry eyes(用于评价干眼的新型非侵入式泪液稳定性分析***)”Invest OphthalmolVis Sci2004；May；45(5)：1369-74)；(9)用于评价睑板腺功能障碍的睑板腺功能测量法(例如，Chew等人，“An instrument for quantifying meibomianlipid on the lid margin：the Meibometer(用于定量眼睑边缘上的睑板腺脂质的仪器：睑板腺功能测量仪)”，Curr Eye Res1993a；12：247-254；Chew等人，“The casual level of meibomian lipids in humans(人的睑板腺脂质的随机水平)”，Current Eye Research1993b；12：255-259；Komuro等人，“Assessment of meibomian gland function by a newly developed lasermeibometer(通过新开发的激光睑板腺功能测量仪评价睑板腺功能)”，Adv Exp Med Biol2002；506：517-520；Yokoi等人，“Assessment ofmeibomian gland function in dry eye using meibometry(使用睑板腺功能测量法评价干眼的睑板腺功能)”Arch Ophthalmol1999；117：723-729)；(10)用于测定睑板腺功能障碍的睑板腺成像或睑板腺显微镜检查(meiboscopy)(例如，Kaercher，“Ocular symptoms and signs in patientswith ectodermal dysplasia symdromes(具有外胚层发育不良综合症的患者的眼部症状和体征)”，Grafes Arch Clin Exp Ophthalmol2004；495-500；Jester等人，“In vivo biomcroscopy and photography of meibomian glandsin a rabbit model of meibomian gland dysfunction(睑板腺功能障碍的兔模型中的睑板腺的体内活组织镜检和摄影)”，Invest Ophthalmol Vis Sci1982；22：660-7；Mathers等人，“Video imaging of the meibomian gland(睑板腺的视频图像)”，Arch Ophthalmol1994；112：448-9；Pflugfelder等人，“Evaluation of subjective assessments and objective diagnostic tests fordiagnosing tear-film disorders known to cause ocular irritation(用于诊断已知引起眼部刺激的泪膜疾病的主观判断和客观诊断试验的评价)”，Cornea1998；17(1)：38-56；Robin等人，“In vivo transilluminationbiomicroscopy and photography of meibomian gland dysfunction(睑板腺功能障碍的体内穿透照射活组织镜检和摄影)”.Ophthalmology1985；92：1423-6；Shimazaki等人，“Meibomian gland dysfunction in patientswith Sjogren syndrome(患有干燥综合症的患者的睑板腺功能障碍)”，Ophthalmology1998；105(8)：1485-8；Yokoi等人，“A newly developedvideo-meibography system featuring a newly designed probe(以新设计的探针为特征的新开发的视频睑板腺成像***)”，Jpn J Ophthalmol2007；51：53-6)；(11)刷拭细胞学技术(例如Fukagawa等人，“Histologicalevaluation of brush cytology of rabbit conjunctiva(兔结膜的刷拭细胞学的组织学评价)”，Nippon Ganka Gakkai Zasshi1993；97：1173-8；Fujihara等人，“Evaluation of human conjunctival epithelium by a combination ofbrush cytology and flow cytometry：an approach to the quantitativetechnique(通过刷拭细胞学和流式细胞计的组合评价人结膜上皮：定量技术的方法)”，Diagn Cytopathol1997；17：456-60；Miyoshi等人，“Interleukin-8concentrations in conjunctival epithelium brush cytologysamples correlate with neutrophil，eosinophil infiltration，and cornealdamage(结膜上皮刷拭细胞学样本中的白细胞介素-8与中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润和角膜损伤相关)”，Cornea2001；20：743-7；Takano等人，“Inflammatory cells in brush cytology samples correlate with the severity ofcorneal lesions in atopic keratoconjunctivitis(刷拭细胞学样本中的炎性细胞与特应性角膜结膜炎中的角膜病变的严重度相关)”，Br J Ophthalmol2004；88：1504-5；Tsubota等人，“Brush cytology for the evaluation ofdry-eye(用于评价干眼的刷拭细胞学)”，Nippon Ganka Gakkai Zasshi1990a；94：224-30；Tsubota等人，“Conjunctivalbrush cytology(结膜刷拭细胞学)”，Acta Cytol1990b；34：233-5；Tsubota等人，“Detection by brushcytology of mast cells and eosinophils in allergic and vernal conjunctivitis(在***反应性结膜炎和春季结膜炎中的肥大细胞和嗜酸性粒细胞的刷拭细胞学检测)”；Cornea1991；10：525-31)；(12)用于检测结膜炎症的印迹细胞学中的流式细胞术(例如，Baudouin等人，“Flow cytometry inimpression cytology specimens.A new method for evaluation ofconjunctival Inflammation(印迹细胞学样本的流式细胞术。评价结膜炎症的新方法)”，Invest Ophthalmol Vis Sci1997a；38：1458-1464；Bourcier等人，“Expression of CD40and CD40ligand in the human conjunctivalepithelium(人结膜上皮中的CD40和CD40配体的表达)”，InvestOphthalmol Vis Sci2000；41：120-126；Brignole等人，“Expression of Fasantigen(CD95)in the human conjunctival epithelium.Positive correlationwith class II HLA DR expression in inflammatory conditions(Fas抗原(CD95)在人结膜上皮中的表达。与在炎症病症中的II型HLA DR表达正相关)”，Exp Eye Res1998；67：687-697；Brignole等人，“Flow cytometricanalysis of inflammatory markers in conjunctival epithelial cells of patientswith dry eyes(干眼病患者的结膜上皮细胞中的炎症标记物的流式细胞分析)”Invest Ophthalmol Vis Sci2000；41：1356-1363；Brignole等人，“Flowcytometric analysis of inflammatory markers in KCS：6-month treatmentwith topical cyclosporin A(KCS的炎症标记物的流式细胞分析：用局部环孢菌素A治疗6个月)”，Invest Ophthalmol Vis Sci2001；42：90-95；Brignole等人，“Flow cytometry in conjunctival impression cytology：a newtool for exploring ocular surface pathologies(结膜印迹细胞学的流式细胞术：探测眼表病变的新工具)”，Exp Eye Res2004；78：473-481；Fujihara等人，“Evaluation of human conjunctival epithelium by a combination ofbrush cytology and flow cytometry：an approach to the quantitativetechnique(通过刷拭细胞学和流式细胞术的组合评价人结膜上皮：定量技术的方法)”Diagn Cytopathol1997；17：456-460；Pisella等人，“Flowcytometric analysis of conjunctival epithelium in ocular rosacea andkeratoconjunctivitis sicca(眼红斑痤疮和干燥性角膜结膜炎中的结膜上皮的流式细胞分析)”.Ophthalmology2000；107：1841-1849；Pisella等人，“Conjunctival proinflammatory and proapoptotic effects of latanoprost，preserved timolol and unpreserved timolol：an ex vivo and in vitro study(拉坦前列素、保留噻吗洛尔和未保留噻吗洛尔的结膜促炎症和促凋亡效应：体外和体内研究)”.Invest Ophthalmol Vis Sci2004；45：1360-1368)；(13)用于诊断泪液的质量(电解质浓度)、KCS和高渗透压性的羊齿状结晶试验(例如，Albach等人，“Diagnosis ofkeratoconjunctivitis sicca inrheumatoid arthritis.The value of various tests(类风湿关节炎中的干燥性角膜结膜炎的诊断。各种试验的值)”，Ophthalmologe1994Apr；91(2)：229-34；Golding等人，“X-ray and scanning electron microscopicanalysis of the structural composition of tear ferns(泪液羊齿状结晶的结构组成的X射线和扫描电子显微镜分析)”，Cornea1994Jan；13(1)：58-66；Norn，“Quantitative tear ferning.Clmical investigations(定量泪液羊齿状结晶形成。临床调查)”，Acta Ophthalmol(Copenh)1994Jun；72(3)：369-72；Pearce等人，“Spatial location studies on the chemicalcomposition of human tear ferns(人泪液羊齿状结晶的化学组成的空间位置研究)”，Ophthalmic Physiol Opt2000；Jul；20(4)：306-13；Pensyl等人，“The repeatability of tear mucus ferning grading(泪粘液羊齿状结晶形成分级的再现性)”，Optom Vis Sci1998Aug；75(8)：600-4；Rolando，“Tearmucus ferning test in normal and keratoconjunctivitis sicca eyes(正常和干燥性角膜结膜炎眼睛的泪粘液羊齿状结晶形成试验)”.Chibret Int JOphthalmol1984；2(4)：32-41；Rolando等人，“Tear mucus ferning test inkeratoconjunctivitis sicca(干燥性角膜结膜炎的泪粘液羊齿状结晶形成试验)”，Holly FJ，Lamberts DW，MacKeen DL(eds.)：The preocular tear filmin health，disease，and contact lens wear,.1st Intern Tear Film Symposium.Lubbok(Texas，USA)，Dry Eye Institute，1986，203-210；Rolando等人，“The effect ofhyperosmolarity on tear mucus ferning(高渗透压性对泪粘液羊齿状结晶形成的效果)”，Fortschr Ophthalmol1986；83：644-646；Rolando等人，“Tear mucus crystallization in children with cystic fibrosis(患有囊性纤维化的儿童的泪粘液结晶)”，Ophthalmologica1988；197(4)：202-6)；(14)用于评价眼表保护和眼表破坏的危险的眼保护指数(OPI)(例如Ousler等人，“Factors that influence the inter-blinkinterval(IBI)as measured by the ocular protection index(通过眼保护指数测定的影响眨眼间间隔(IBI)的因素)(OPI)”，(Poster presentation)ARVO2002；Nally等人，“Ocular discomfort and tear film break-up time indry eye patients：A correlation(干眼病患者的眼部不舒适感和泪膜破裂时间：相关性)”，Invest Ophthalmol Vis Sci2000；41：4：1436；Abelson等人，“Alternate reference values for tear film break-up time in normal and dryeye populations(正常和干眼人群的泪膜破裂时间的备用参考值)”，Lacrimal Gland，Tear Film，and Dry Eye Syndromes3Part B(泪腺、泪膜和干眼综合症3部分B)”，Adv Exp Med Biol2002；506：1121-1125；Abelson等人，“Dry eye syndrome：diagnosis，clinical trials，andpharmaceutical treatment-‘improving clinical trials’.Lacrimal Gland，Tear Film，and Dry Eye Syndromes3Part B(干眼综合症：诊断、临床试验和药物治疗-‘改进临床试验’。泪腺、泪膜和干眼综合症3部分B)”，Adv Exp Med Biol2002；506：1079-86)；(15)评价水液性泪液不足(ATD)的流泪改变的流泪荧光光度法(荧光测定法)(例如，Gobbels等人，“Tearsecretion in dry eyes as assessed by objective fluorophotometry(用客观荧光光度法评价的干眼的泪液分泌)”.Ger J Ophthalmol1992；1：350-353；Kuppens等人，“Basal tear turnover and topical timolol in glaucoma patientsand healthy controls by Fluorophotometry(青光眼患者的基础泪液转换和局部噻吗洛尔以及根据荧光光度法的健康控制)”，Invest OphthalmolVis Sci1992；33：3442-3448；Mishima，“Some physiological aspects of theprecorneal tear film(角膜前泪膜的一些生理方面)”，Arch Ophthalmol1965；73：233-241；Mishima S，“Determination of tear volume and tear flow(泪液体积和流泪的测定)”，Invest Ophthalmol1966；5：264-275；Mathers等人，“Tear film and evaporation in patients with and without dry eye(有和没有干眼的患者的泪膜和蒸发)”，Ophthalmology1996；103：664-669；Mathers等人，“Tear film changes associated with normal aging(与正常衰老有关的泪膜变化)”，Cornea1996；15：229-334；Mathers，“Evaporationfrom the ocular surface(来自眼表的蒸发)”，Exp Eye Res2004；78：389-394；Van Best等人，“Measurement of basal tear turnover using astandardized protocol(使用标准化程序的基础泪膜转变的测量)”，Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol1995；233：1-7；McNamara等人，“Fluorometry in contact lens research：The next step(隐形眼镜研究中的荧光测定法：下一步)”，Optom Vis Sci1998；75：316-322；Pearce，“Animproved fluorophotometric method for tear turnover assessment(用于泪液转变评价的改进荧光光度法)”，Optom Vis Sci2001；78：30-36)，以及这些诊断实验的组合，每一篇参考文献的公开内容通过引用全文并入到此处。这些方法还可以用来评价本文所述的化合物在干眼病治疗中的临床功效。
在又一个方面，本发明提供了在需要的患者中治疗结膜炎、眼色素层炎(包括慢性眼色素层炎)、视网膜脉络膜炎、视网膜炎、睫状体炎、巩膜炎、浅层巩膜炎或虹膜炎；治疗与角膜移植、LASIK(激光辅助原位角膜磨削术)、准分子激光屈光性角膜切削术或LASEK(激光辅助上皮下角膜磨削术)有关的炎症或疼痛；抑制与角膜移植、LASIK、准分子激光屈光性角膜切削术或LASEK有关的视力损失；或抑制移植排斥反应的方法，包括将治疗有效量的式I的化合物或其药用盐或其N-氧化物给药于该患者。在一些实施方案中，化合物或其药用盐或N-氧化物在术前给药于将要进行选自角膜移植、LASIK、准分子激光屈光性角膜切削术和LASEK中的手术的患者。在一些实施方案中，化合物或其药用盐或N-氧化物抑制或减轻了手术期间和之后的炎症或疼痛。在一些实施方案中，化合物或其药用盐或N-氧化物在手术之前给药约1天到约2天。在一些实施方案中，化合物或其药用盐或N-氧化物在术后给药于已经进行了选自角膜移植、LASIK、准分子激光屈光性角膜切削术和LASEK中的手术的患者。在一些实施方案中，抑制视力损失表示减轻视力的损失。在一些实施方案中，该术后或术前的治疗减轻了在手术之后的伤疤和纤维沉积物的量。在一些实施方案中，抑制视力损失表示患者保持视力。在一些实施方案中，抑制移植排斥反应是指化合物或其药用盐或N-氧化物是免疫抑制性的，因此防止角膜移植的总排斥反应。
在这里使用的术语“接触”是指在体外***或体内***中将指定的部分组合到一起。例如，让JAK与本发明的化合物接触包括将本发明的化合物给药于具有JAK的个体或患者如人以及例如将本发明的化合物引入到包括含JAK的细胞或提纯制剂的样本中。
本文所使用的术语“个体”或“患者”可互换地使用，是指任何动物，包括哺乳动物，优选小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马或灵长目，最优选是人。
本文所使用的短语“治疗有效量”是指引起由研究人员、兽医、医生或其他临床医师在组织、***、动物、个体或人中所要寻求的生物反应或药物反应的活性化合物或药剂的量。
本文所使用的术语“治疗”是指下列中的一种或多种：(1)预防疾病；例如在可能倾向于罹患疾病、病症或障碍、但还没有遭受或显示该疾病的病变或症状的个体中预防该疾病、病症或障碍；(2)抑制该疾病；例如在正遭受或显示该疾病、病症或障碍的病变或症状的个体中抑制该疾病、病症或障碍；以及(3)改善该疾病；例如，在遭受或显示该疾病、病症或障碍的病变或症状的个体中改善该疾病、病症或障碍(即逆转病变和／或症状)，例如减低疾病的严重度。
联合治疗
一种或多种其他药剂如化疗剂、抗炎剂、甾体、免疫抑制剂以及Bcr-Abl、Flt-3、RAF和FAK激酶抑制剂例如在WO2006／056399中所述的激酶抑制剂或其他药剂能够与本发明的化合物联合用于治疗JAK相关性疾病、障碍或病症。该一种或多种其他药剂可以同时或顺序地给药于患者。
化疗剂的实例包括蛋白体抑制剂(例如，硼替佐米)、沙利度胺、来那度胺和DNA损伤剂如苯丙氨酸氮芥、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、依托泊苷、亚硝脲氮芥等。
甾体的实例包括皮质甾类如***或强的松。
Bcr-Abl抑制剂的实例包括在美国专利No.5,521,184、WO04／005281和美国系列No.60／578,491中所公开的种类的化合物及其药用盐类。
适合的Flt-3抑制剂的实例包括在WO03／037347、WO03／099771和WO04／046120中所公开的化合物及其药用盐。
适合的RAF抑制剂的实例包括在WO00／09495和WO05／028444中所公开的化合物及其药用盐。
适合的FAK抑制剂的实例包括在WO04／080980、WO04／056786、WO03／024967、WO01／064655、WO00／053595和WO01／014402中公开的化合物及其药用盐。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种化合物能够与一种或多种其它包括伊马替尼的激酶抑制剂联合用于治疗尤其耐伊马替尼或其它激酶抑制剂的患者。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种JAK抑制剂能够与化疗剂联合用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤，并且可以与对单独的化疗剂的反应相比改进治疗反应，没有加剧的它的毒性效应。用于治疗多发性骨髓瘤的其他药剂的实例例如可以包括，但不限于，苯丙氨酸氮芥，苯丙氨酸氮芥加强的松[MP]，阿霉素，***和Velcade(硼替佐米)。用于治疗多发性骨髓瘤的其他药剂包括Bcr-Abl、Flt-3、RAF和FAK激酶抑制剂。相加或协同效应是将本发明的JAK抑制剂与其他药剂联合的所希望的结果。此外，多发性骨髓瘤细胞对药剂如***的耐受性可以在用本发明的JAK抑制剂治疗时逆转。所述药剂可以与本发明化合物在单一剂型或连续剂型中结合，或者所述药剂可以作为独立的剂型同时或顺序给药。
在一些实施方案中，皮质甾类如***与至少一种JAK抑制剂联合给药于患者，其中***间歇地给药，而不是连续给药。
在一些其他实施方案中，本发明的一种或多种JAK抑制剂与其它治疗剂的组合可以在骨髓移植或干细胞移植之前、期间和／或之后给药于患者。
在一些实施方案中，至少一种其他治疗剂可用于治疗干眼病和其它眼病。在一些实施方案中，该其他治疗剂是肤轻松(
Figure BDA0000457047210000461
)或双甲丙酰龙(Al-2178，Vexol，Alcon)。在一些实施方案中，该其他治疗剂是环孢菌素(
Figure BDA0000457047210000462
)。在一些实施方案中，该其他治疗剂是皮质甾类。在一些实施方案中，该皮质甾类是氟羟***龙(triaminolone)、***、肤轻松、可的松、***龙或氟甲龙(flumetholone)。
在一些实施方案中，所述其他治疗剂选自DehydrexTM(Holles Labs)、Civamide(辣椒素异构体)(Opko)、透明质酸钠(Vismed，Lantibio／TRBChemedia)、环孢菌素(ST-603，Sirion Therapeutics)、ARG101(T)(睾酮，Argentis)、AGR1012(P)(Argentis)、依卡倍特钠(Senju-Ista)、吉法酯(Santen)、15-(s)-羟基二十碳四烯酸(15(S)-HETE)、西维美林(cevilemine)、强力霉素(ALTY-0501，Alacrity)、二甲胺四环素、iDestrinTM(NP50301，Nascent Pharmaceuticals)、环孢菌素A(Nova22007，Novagali)、土霉素(Duramycin，MOLI1901，Lantibio)、CF101(2S,3S，4R,5R)-3，4-二羟基-5-[6-[(3-碘代苯基)甲基氨基]嘌呤-9-基]-N-甲基-氧杂环戊烷-2-氨基甲酰，Can-Fite Biopharma)、voclosporin(LX212orLX214，Lux Biosciences)、ARG103(Agentis)、RX-10045(合成resolvin类似物，Resolvyx)，DYN15(Dyanmis Therapeutics)、来格列酮(DE011，Daiichi Sanko)、TB4(RegeneRx)、OPH-01(Ophtalmis Monaco)、PCS101(Pericor Science)、REV1-31(Evolutec)、Lacritin(Senju)、雷巴米特(Otsuka-Novartis)、OT-551(Othera)、PAI-2(University of Pennsylvania andTemple University)、毛果芸香碱、他克莫司、吡美莫司(AMS981，Novartis)、氯替泼诺碳酸乙酯、利妥昔单抗、二尿嘧啶核苷四聚磷酸酯四钠盐(INS365，Inspire)、KLS-0611(Kissei Pharmaceuticals)、脱氢异雄甾酮、阿那白滞素、依法利珠单抗、霉酚酸钠、依那西普(
Figure BDA0000457047210000471
)、羟氯奎、NGX267(TorreyPines Therapeutics)或沙利度胺。
在一些实施方案中，该其他治疗剂是抗血管生成剂、胆碱能激动剂、TRP-1受体调节剂、钙通道阻断剂、粘蛋白促泌素、MUC1刺激剂、钙调磷酸酶抑制剂、皮质甾类、P2Y2受体激动剂、毒蕈碱受体激动剂、另一种JAK抑制剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、Flt-3激酶抑制剂、RAF激酶抑制剂以及FAK激酶抑制剂例如在WO2006／056399中所述的抑制剂。在一些实施方案中，该其他治疗剂是四环素衍生物(例如，二甲胺四环素或强力霉素)。
在一些实施方案中，该其他治疗剂是缓和剂滴眼剂(亦称人工泪)，它包括但不限于含有聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、甘油、聚乙二醇(例如PEG400)或羧甲基纤维素的组合物。人工泪能够通过补偿减低的泪膜润湿和润滑能力而有助于治疗干眼。在一些实施方案中，该其他治疗剂是粘液溶解药物，如N-乙酰基-半胱氨酸，它可以与粘蛋白相互作用，因此降低泪膜的粘度。
在一些实施方案中，该其他治疗剂包括抗生素，抗病毒药，抗真菌药，***，包括甾族的和非甾族的抗炎剂在内的抗炎剂以及抗***反应药。适合的药物的实例包括氨基糖苷类如氨丁卡霉素，庆大霉素，托普霉素，链霉素，奈替米星和卡那霉素；氟代喹诺酮如环丙沙星，诺氟沙星，氧氟沙星，曲伐沙星，洛美沙星，左氧氟沙星和依诺沙星；二氮杂萘；磺酰胺类；多粘菌素；氯霉素；新霉素；巴龙霉素(paramomomycin)；甲磺酸粘菌素；杆菌肽；万古霉素；四环素类；利福平及其衍生物(利福平类)；环丝氨酸；β-内酰胺；头孢菌素类；两性霉素；氟康唑；5-氟胞嘧啶；多马霉素(natamycin)；咪康唑；酮康唑；皮质甾类；双氯芬酸；氟比洛芬；酮咯酸；舒洛芬；克乐敏(comolyn)；洛多酰胺；左卡巴斯汀；萘甲唑林(naphazoling)；安塔唑啉；非尼拉敏；或氮杂内酯抗生素。
药物制剂和剂型
当用作药物时，本发明的化合物能够以药物组合物的形式给药。这些组合物能够以制药领域中公知的方式来制备，并且能够通过各种途径来给药，取决于需要局部还是全身给药以及所要治疗的区域。给药可以是局部的(包括透皮、表皮、眼科和粘膜，包括鼻内、***和直肠输送)，肺部(例如，通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内或鼻内)，口服或胃肠外。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内肌内或注射或输液；或颅内如鞘内或心室内给药。肠胃外给药可以是单一大剂量的形式，或者例如可以通过连续输液泵。局部给药用药物组合物和制剂可以包括透皮贴片，软膏，洗液，霜剂，凝胶剂，滴剂，栓剂，喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或令人想望的。涂布的避孕套、手套等也可能是有用的。
本发明也包括含有作为活性成分的以上本发明的一种或多种化合物以及一种或多种药用载体(赋型剂)的药物组合物。在本发明的组合物的制备中，该活性成分通常与赋型剂混合，用赋型剂稀释或例如以胶囊、小袋、纸或其他容器的形式包封在这种载体内。当赋型剂作为稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料，其用作该活性成分的辅料、载体或介质。因此，该组合物可以是片剂，药丸，粉末，糖锭，小袋，扁囊剂，酏剂，悬浮液，乳液，溶液，糖浆剂，气溶胶(作为固体或在液体介质中)，含有例如至多10重量％活性化合物的软膏，软明胶胶囊和硬明胶胶囊，栓剂，无菌可注射溶液和无菌的包装粉末的形式。
在制剂的制备中，该活性化合物在与其它成分结合之前可以研磨，以提供适当的粒度。如果该活性化合物是基本上不溶的，可以将它研磨至小于200目的粒度。如果该活性化合物是基本上溶于水的，可以通过研磨来调节粒度，以便在制剂中提供基本上均匀的分布，例如大约40目。
本发明的化合物可以使用已知的研磨工序如湿磨法来研磨，以获得适于形成片剂和其他制剂类型的粒度。本发明的化合物的细分散(纳米颗粒)制剂可以通过本领域已知的方法来制备，例如参见国际专利申请No.WO2002／000196。
一些适合的赋型剂的实例包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，***树胶，磷酸钙，海藻酸盐，黄芪胶，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水，糖浆和甲基纤维素。该制剂可以另外包括：润滑剂如滑石，硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化和悬浮剂；防腐剂如甲基-和丙基羟基-苯甲酸酯；甜味剂；以及调味剂。能够通过使用本领域已知的工序来配制本发明的组合物，以便在给药于患者之后提供活性成分的快速释放、持续释放或延迟释放。
所述组合物能够配制为单位剂型，各剂量含有约5到约1000mg(1g)，更通常约100到约500mg的活性成分。术语“单位剂型”是指适合作为人患者和其他哺乳动物的单一剂量的物理上分立的单位，每一个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性材料以及适合的药物赋型剂。
该活性化合物能够在宽剂量范围内是有效的，并且通常以药学有效量给药。然而，应该理解的是，实际上给药的化合物的量通常由医生根据相关情况来决定，包括所要治疗的病症、选择的给药途径、给药的实际化合物、个体患者的年龄、体重以及反应、患者的症状的严重程度等等。
为了制备固体组合物例如片剂，主要的活性成分与药物赋型剂混合，形成含有本发明的化合物的均匀混合物的固体预配制组合物。当提到这些预制备组合物为均匀的时，该活性成分通常均匀地分散在整个组合物中，使得该组合物能够容易地细分为同样有效的单位剂型如片剂、药丸和胶囊。该固体预配制剂然后被细分为含有例如约0.1到约1000mg的本发明活性成分的上述类型的单位剂型。
本发明的片剂或药丸可以进行包衣或以其他方式复合，以形成提供了延长作用的优点的剂型。例如，片剂或药丸可以包括内剂量和外剂量组分，外剂量组分是在内剂量组分上的包层的形式。该两种组分可以通过肠衣层来分隔，该肠衣层用于抵抗在胃中的分解，允许内部组分完整地进入到十二指肠或者延迟释放。许多材料能够用于这种肠衣层或包衣，这种材料包括许多聚合物酸和聚合物酸与诸如虫胶、十六烷醇和乙酸纤维素之类的材料的混合物。
能够引入本发明的化合物和组合物用于口服给药或者注射给药的液体形式包括水溶液，适当调味的糖浆剂，水悬浮液或油悬浮液，以及含有食用油例如棉子油、芝麻油、椰子油或花生油以及酏剂和类似的药物辅料的调味乳液。
吸入或吹入用组合物包括在药用水性或有机溶剂或它们的混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。该液体或固体组合物可以含有如上所述的适合的药用赋型剂。在一些实施方案中，所述组合物通过口腔或鼻呼吸道途径来给药，用于获得局部或全身效应。组合物可以通过使用惰性气体来雾化。雾化的溶液可以直接从雾化装置中呼吸，或者雾化装置可以连接于面具罩或间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物能够经口或经鼻由以适当方式输送制剂的设备给药。
给药于患者的化合物或组合物的量将根据所要给药的药物、给药的目的如预防或治疗、患者的状态、给药方式等而改变。在治疗应用中，组合物能够以足以治愈或至少部分控制疾病及其并发症的症状的量给药于已经患有疾病的患者。有效剂量将取决于所要治疗的疾病病症以及主治临床医生根据诸如疾病的严重度、患者的年龄、体重和一般条件等之类的因素的判断。
给药于患者的组合物能够为如上所述的药物组合物的形式。这些组合物能够通过常规灭菌技术来灭菌，或者可以进行无菌过滤。水溶液可以原样包装使用，或者进行冻干，冻干制剂在给药之前与无菌水性载体结合。化合物制剂的pH通常为3-11，更优选5-9，最优选7-8。应该理解的是，某些上述赋型剂、载体或稳定剂的使用将导致药物盐的形成。
本发明的化合物的治疗剂量能够根据例如进行治疗的特定用途、化合物的给药方式、患者的健康和状况以及处方医生的判断而改变。药物组合物中的本发明的化合物的比例或浓度可以根据包括剂量、化学特性(例如，疏水性)和给药途径在内的许多因素而改变。例如，本发明的化合物能够在含有约0.1到约10％w／v的化合物的生理缓冲水溶液中提供，用于肠胃外给药。一些典型剂量范围是约1μg/kg到约1g/kg体重／天。在一些实施方案中，剂量范围是约0.01mg／kg到约100mg／kg体重／天。该剂量很可能取决于诸如疾病或病症的类型以及进展程度、特定患者的总体健康状态、所选择的化合物的相对生物效力、赋型剂的配方及其给药途径之类的变量。有效剂量可以由体外或动物模型试验***得出的剂量反应曲线来外推。
在一些实施方案中，本发明的化合物或其药用盐作为眼科组合物给药。因此，在一些实施方案中，该方法包括所述化合物或其药用盐与眼用载体的给药。在一些实施方案中，该眼科组合物是液体组合物、半固体组合物、***剂、薄膜、微粒或纳米颗粒。
在一些实施方案中，该眼科组合物是液体组合物。在一些实施方案中，该眼科组合物是半固体组合物。在一些实施方案中，该眼科组合物是局部用组合物。该局部用组合物包括但不限于液体和半固体组合物。在一些实施方案中，该眼科组合物是局部用组合物。在一些实施方案中，该局部用组合物包括水溶液、水性悬浮液、软膏或凝胶。在一些实施方案中，该眼科组合物局部施用于眼睛的前面、上眼睑下，下眼睑上和盲管(cul-de-sac)内。在一些实施方案中，该眼科组合物是已灭菌的。该灭菌能够通过已知技术如溶液的灭菌过滤或者通过备用安瓿内的溶液的加热来完成。本发明的眼科组合物可以进一步含有适于制备眼科制剂的药物赋型剂。这种赋型剂的实例是防腐剂、缓冲剂、螯合剂、抗氧剂和调节渗透压的盐。
在这里使用的术语“眼用载体”是指能够含有和释放所述化合物或其药用盐或N-氧化物且与眼睛相适应的任何材料。在一些实施方案中，该眼用载体是水或水溶液或水性悬浮液，但也包括油类如用于制造软膏的油类和聚合物基质如在眼用***剂中使用的聚合物基质。在一些实施方案中，该组合物可以是包括所述化合物或其药用盐或N-氧化物的水性悬浮液。液体眼科组合物，包括软膏和悬浮液，可以具有适于所选择的给药途径的粘度。在一些实施方案中，该眼科组合物具有约1000到约30000厘泊的粘度。
在一些实施方案中，该液体组合物进一步包括聚合物。这些聚合物可用来改进生物利用率、提升粘度或对于液体制剂减少来自眼睛的排液。在一些实施方案中，所述聚合物包括但不限于Wagh等人，“Polymersused in ocular dosage form and drug delivery systems(用于眼用剂型和药物输送***的聚合物)”，Asian J.Pharm.，第12-17页(2008年1月)中所述的聚合物，该文献通过引用全文并入到此处。在一些实施方案中，该聚合物是透明质酸钠、脱乙酰壳多糖、环糊精(例如，羟丙基β-环糊精)、聚半乳糖醛酸、木糖葡聚糖、黄原胶、结冷胶、巯基化壳聚糖、聚(原酸酯)(如在Einmahl，Adv.Drug.Deliv.Rev.53：45-73(2001)中所述的，该文献通过引用全文并入到此处)，或者罗望子多糖(如在Ghelardi等人，Antimicrob.Agents Chemother.48：3396-3401(2004)中所述的，该文献通过引用全文并入到此处)。
在一些实施方案中，该眼科组合物可以进一步包括以下的一种或多种：表面活性剂，助剂，缓冲剂，抗氧化剂，张力调节剂，防腐剂(例如，EDTA，BAK(苯扎氯铵)，亚氯酸钠，过硼酸钠，polyquaterium-1)，增稠剂或粘度调节剂(例如，羧甲基纤维素，羟甲基纤维素，聚乙烯醇，聚乙二醇，二醇400，丙二醇羟甲基纤维素，羟丙基-瓜尔胶，透明质酸和羟基丙基纤维素)等等。制剂中的添加剂可包括但不限于氯化钠，碳酸氢钠，山梨酸，对羟基苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸丙酯，洗必太，蓖麻油和过硼酸钠。
水性眼科组合物(溶液或悬浮液)通常不含生理或对眼有害的组分。在一些实施方案中，在组合物中使用纯净水或去离子水。pH可通过添加任何生理可接受的眼用pH调节酸、碱或缓冲剂而调节到约5.0到8.5的范围内。眼用酸的实例包括乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、盐酸等，碱的实例包括氢氧化钠，磷酸钠，四硼酸钠，柠檬酸钠，乙酸钠，乳酸钠，三羟甲基氨基甲烷，三羟甲基氨基甲烷等。盐和缓冲剂包括柠檬酸盐／右旋糖，碳酸氢钠，氯化铵以及上述酸和碱的混合物。
在一些实施方案中，眼科组合物的渗透压力可以是约10mOsM(毫渗摩尔)到约400mOsM，或260mOsM到约340mOsM。在一些实施方案中，该渗透压可以通过使用适量的生理可接受的眼用盐或赋型剂来调节。在其他实施方案中，氯化钠可用来近似于生理流体。在其它实施方案中，以组合物的总重量为基准计，组合物包括约0.01重量％到约1重量％，或者约0.05重量％到约0.45重量％的氯化钠。除了氯化钠以外或代替氯化钠，还可以使用由阳离子如钾、铵等和阴离子如氯根、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氢根、硫酸氢钠、硫酸铵等组成的一种或多种当量盐，以便获得在上述范围内的渗透压。类似地，糖如甘露糖醇、右旋糖、山梨糖醇、葡萄糖等也可以用来调节渗透压。
在一些实施方案中，所述方法包括形成或供给与眼睛的外表面接触的治疗剂的贮库。贮库是指不被眼泪或其他眼睛清除机制快速除去的治疗剂的供给源。这允许通过简单施用使持续高浓度的治疗剂存在于眼睛外表面上的流体中。不希望受任何理论的制约，据信吸收和渗透可能取决于溶解的药物浓度和外部组织与含药物的流体的接触时间这二者。当该药物通过眼内液清除和／或吸收到眼睛组织中而被除去时，更多的药物从贮库提供(例如溶解)到补充的眼内液中。因此，贮库的使用可更容易促进更难溶的治疗剂施加到眼组织中。在一些实施方案中，该贮库可以保持多达8小时或更久。在一些实施方案中，该眼用贮库的形式包括但不限于水性聚合物悬浮液、软膏和固体***剂。
在一些实施方案中，半固体组合物是在施加于眼睛上时粘度增高的液体制剂，通常是由于该液体制剂中的聚合物。该粘度增高可以通过温度、pH、电解质浓度的变化来触发。在一些实施方案中，所述聚合物包括、但不限于在Wagh等人，“Polymers used in ocular dosage form and drugdelivery systems(用于眼科剂型和药物输送***的聚合物)”，Asian J.Pharm.，第12-17页(2008年1月)中所述的用于半固体剂型的聚合物，该文献通过引用全文并入到此处。在一些实施方案中，聚合物是纤维醋法酯，聚丙烯酸，结冷胶，透明质酸(hyaluronase)，脱乙酰壳多糖，海藻酸盐(例如，海藻酸钠)，或环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物(例如，
Figure BDA0000457047210000531
BASF；泊洛沙姆)。在一些实施方案中，该聚丙烯酸是交联的丙烯酸(例如，)。在一些实施方案中，该半固体组合物包括carbopol和环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物的混合物；甲基纤维素和羟乙基纤维素的混合物；或聚乙二醇和环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物的混合物。
在一些实施方案中，该眼科组合物是软膏或凝胶。在一些实施方案中，该眼科组合物是油型输送载体。在一些实施方案中，组合物包括其中添加了活性成分(通常为0.1-2％)和赋型剂的石油或羊毛脂基质。常用基质可以包括但不限于矿物油、矿脂以及它们的组合。在一些实施方案中，该软膏作为条带施用于下眼睑上。
在一些实施方案中，该眼科组合物是眼用***剂。在一些实施方案中，该眼用***剂是生物学惰性的，柔软的，可生物蚀解的，粘弹性的，在接触治疗剂之后对于灭菌是稳定的，抗来自空气传播的细菌的感染，具有生物蚀解性、生物相容性和／或粘弹性。在一些实施方案中，该***剂包括眼用基质，例如聚合物基质。该基质典型地是聚合物，且该治疗剂通常分散于其中或粘结到聚合物基质上。在一些实施方案中，该治疗剂可以通过溶解或共价键的水解而慢慢地从基质中释放出来。在一些实施方案中，聚合物是可生物蚀解的(可溶的)，且其溶解速率可以控制分散于其中的治疗剂的释放速度。在另一形式中，聚合物基质是可生物降解的聚合物，其例如通过水解而分解，从而释放出粘结于其上或分散于其中的治疗剂。在其他实施方案中，该基质和治疗剂可以用附加的聚合物涂层包围，以进一步控制释放。在一些实施方案中，该***剂包括可生物降解的聚合物，例如聚己内酯(PCL)，乙烯／乙酸乙烯酯共聚物(EVA)，聚氰基丙烯酸烷基酯，聚氨酯，尼龙，或共聚(dl-丙交酯-乙交酯)(PLGA)，或它们的任意共聚物。在一些实施方案中，该治疗剂分散到基质材料中或分散在聚合之前的用于制造该基质材料的单体组合物中。在一些实施方案中，治疗剂的量为约0.1到约50％，或约2到约20％。在其他实施方案中，使用可生物降解的或可生物蚀解的聚合物基质，使得不必除去用过的***剂。当该可生物降解的或可生物蚀解的聚合物降解或溶解时，该治疗剂被释放。
在其他实施方案中，眼用***剂含有聚合物，所述聚合物包括、但不限于在Wagh等人，“Polymers used in ocular dosage form and drugdelivery systems(用于眼科剂型和药物输送***的聚合物)”，Asian J.Pharm.，第12-17页(2008年1月)中所述的那些聚合物，该文献通过引用全文并入到此处。在一些实施方案中，该***剂包括选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物(例如，出自Rohm或Degussa的聚合物家族)，羟甲基纤维素，聚丙烯酸，聚(酰胺基胺)树枝形聚合物，聚(二甲基硅氧烷)，聚氧化乙烯，共聚(丙交酯-乙交酯)，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(乙烯醇)或聚(富马酸丙二醇酯)中的聚合物。在一些实施方案中，该***剂包括
Figure BDA0000457047210000542
R。在一些实施方案中，该***剂是450kDa聚丙烯酸-半胱氨酸缀合物。
在一些实施方案中，该眼科组合物是眼用膜。适合于此类膜的聚合物包括、但不限于在Wagh等人，“Polymers used in ocular dosage form anddrug delivery systems(用于眼科剂型和药物输送***的聚合物)”，AsianJ.Pharm.，第12-17页(2008年1月)中所述的聚合物，在一些实施方案中，该膜是软质隐形眼镜，例如由用与二甲基丙烯酸乙二醇酯交联的N,N-二乙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸的共聚物制造的软质隐形眼镜。
在一些实施方案中，该***剂包括含有治疗剂的芯和外套管(例如参见美国专利公开No.20040009222，其全部内容通过引用并入到此处)。在一些实施方案中，该外套管可透过、半透过或不透过该药物。在一些实施方案中，该药物芯可包括不显著影响药物的释放速度的聚合物基质。在一些实施方案中，该外套管、药物芯的聚合物基质或二者可以是可生物蚀解的。在一些实施方案中，共挤出产品可以分割为药物输送装置。在一些实施方案中，该装置可以无涂层，使得它们各自的端部是开放的，或者该装置例如涂有治疗剂可透过、治疗剂半透过或可生物蚀解的层。在某些实施方案中，该治疗剂和至少一种聚合物以粉末形式混合。在一些实施方案中，该***剂通过将聚合物材料输送到第一挤出装置，将治疗剂输送到第二挤出装置，将包括聚合物材料和治疗剂的物质共挤出，以及将该物质成形为至少一种共挤出药物输送装置来形成，该共挤出药物输送装置包括含有治疗剂的芯和含有聚合物材料的外层。在某些实施方案中，输送到第二挤出装置的治疗剂与至少一种聚合物混合。在某些实施方案中，该治疗剂和至少一种聚合物以粉末形式混合。在某些实施方案中，该操作包括将一种以上的药物输送到第二挤出装置。在某些实施方案中，该聚合物材料是对治疗剂不透过、半透过或可透过的材料。该聚合物材料可以是可生物蚀解的和／或辐射固化性的。在后一种情况下，该***剂可以进行照射。
在某些实施方案中，该***剂是管状形式，并且可以分割为多个更短的产品。在某些实施方案中，该***剂进一步包括具有一个或多个层的多个更短的产品的涂层，所述层包括可透过治疗剂的层、半透过治疗剂的层和可生物蚀解的层中的至少一个。该聚合物材料可以包括任何生物相容性聚合物，例如聚己内酯(PCL)，乙烯／乙酸乙烯酯共聚物(EVA)，聚氰基丙烯酸烷基酯，聚氨酯，尼龙，或共聚(dl-丙交酯-乙交酯)(PLGA)，或这些的任意共聚物。
在一些实施方案中，该***剂包括用聚合物基质涂布或者分散在聚合物基质中的治疗有效量的至少一种治疗剂，其中该治疗剂为颗粒或细粒状。在一些实施方案中，当药物从颗粒中溶解到基质内，通过基质扩散并且释放到周围的生理性液体中时，该治疗剂从制剂中释放出来。在一些实施方案中，释放速率主要地受治疗剂从颗粒／细粒溶解到基质中的速率限制；通过基质扩散并分散到周围流体中的步骤基本上不限制释放速率。在某些实施方案中，聚合物基质是非生物蚀解的，而在其它实施方案中，它是可生物蚀解的。非生物蚀解的聚合物基质的实例能够由聚氨酯、聚硅酮、共聚(乙烯-乙酸乙烯酯)(EVA)、聚乙烯醇及其衍生物和共聚物形成。可生物蚀解的聚合物基质的实例能够由聚酐、聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯及其衍生物和共聚物形成。
在一些实施方案中，该***剂包括胶原材料。在一些实施方案中，该***剂可以是可溶性眼科药物***剂(SODI，例如用于输送药物的、能够在上结膜囊中引入的聚合物卵圆形膜；椭圆形***剂，例如由乙烯-乙酸乙烯酯制成的
Figure BDA0000457047210000561
(毛果芸香碱眼科治疗***，由AlzaCorporation开发)；
Figure BDA0000457047210000562
(由Escalon Ophthalmics Inc.，Skillman，NS开发)，其为杆状硅酮弹性体；
Figure BDA0000457047210000563
由纤维素制成的杆状***剂；新型眼科药物输送***(NODS)，由聚(乙烯醇)制成；以及在Fabrizio，Advanced Drug Delivery Reviews16：95-106，1998中所述的***剂，该文献通过引用全文并入到此处。在另外的实施方案中，取决于用于固定***剂的位置和机制，该***剂可以由患者或医生来放置。在另外的实施方案中，该***剂包括胶原、明胶或聚合物，其中该聚合物选自聚己内酯(PCL)、乙烯／乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、尼龙、共聚(dl-丙交酯-乙交酯)(PLGA)或上述聚合物的任意共聚物。在一些实施方案中，该***剂植入在上眼皮下。在一些实施方案中，该***剂植入到眼睛的后段、脉络膜间隙或巩膜中。在一些实施方案中，该***剂植入到玻璃体内或视网膜下。在一些实施方案中，该***剂注入到视网膜下。给药方法及其制备技术在Remington’s PharmaceuticalSciences中进行了阐述，该文献通过引用全文并入到此处。
在其它实施方案中，该***剂提供了治疗剂在眼睛的玻璃体中的持续释放。在这里使用的“持续释放”是指该组合物以可控方式在延长的时间内释放该治疗剂。在一些实施方案中，该***剂以使得在释放过程中水性治疗剂浓度低于玻璃体治疗剂浓度的速度释放该治疗剂。在一些实施方案中，水性治疗剂浓度是约0.002μg／mL到约0.01μg／mL，或者约0.01μg／mL到约0.05μg／mL，或者低于约0.05μg／mL。在一些实施方案中，治疗剂以约1μg/天到约50μg／天，或者约1μg/天到约10μg／天的速率释放。在一些实施方案中，该***剂进一步包括如以上详细描述的其他治疗剂，例如，肤轻松(例如存在于眼用***剂
Figure BDA0000457047210000571
中的治疗剂)。
在一些实施方案中，该眼科组合物包括微球粒或纳米粒子。在一些实施方案中，该微球粒包括明胶。在一些实施方案中，该微球粒注入到眼睛的后段、脉络膜间隙中、巩膜中、玻璃体内或视网膜下。在一些实施方案中，微球粒或纳米粒子含有聚合物，所述聚合物包括、但不限于在Wagh等人，“Polymers used in ocular dosage form and drug deliverysystems(用于眼科剂型和药物输送***的聚合物)”，Asian J.Pharm.，第12-17页(2008年1月)中所述的聚合物，该文献通过引用全文并入到此处。在一些实施方案中，该聚合物是脱乙酰壳多糖，聚羧酸如聚丙烯酸，白蛋白颗粒，透明质酸酯类，聚衣康酸，聚氰基丙烯酸丁酯，聚己内酯，聚(异丁基)己内酯，共聚(乳酸-乙醇酸)或聚乳酸。在一些实施方案中，该微球粒或纳米粒子包括固体脂质颗粒。
在一些实施方案中，该眼科组合物包括离子交换树脂。在一些实施方案中，该离子交换树脂是无机沸石或合成有机树脂。在一些实施方案中，离子结合树脂包括、但不限于在Wagh等人，“Polymers used in oculardosage form and drug delivery systems(用于眼科剂型和药物输送***的聚合物)”，Asian J.Pharm.，第12-17页(2008年1月)中所述的树脂，该文献通过引用全文并入到此处。在一些实施方案中，离子交换树脂是部分中和的聚丙烯酸。
在一些实施方案中，该眼科组合物是水性聚合物悬浮液。在一些实施方案中，该治疗剂或聚合物悬浮剂悬浮于水性介质(例如，具有如上所述的性质)中。在一些实施方案中，该治疗剂被悬浮。在一些实施方案中，该治疗剂是在溶液中。在其他实施方案中，该悬浮剂用于为悬浮液提供稳定性，增加该剂型在眼睛上的停留时间，或者就更长的释放时间和更均匀的释放曲线而言增强药物的持续释放。聚合物悬浮剂的实例包括，但不限于，右旋糖苷，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，多糖凝胶剂，
Figure BDA0000457047210000581
纤维素聚合物如羟丙基甲基纤维素及含羧基的聚合物例如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其他的聚合物缓和剂。在一些实施方案中，该聚合物悬浮剂是水可溶胀的、水不溶性聚合物，尤其交联的含羧基的聚合物。在一些实施方案中，以所存在的单体的总重量为基准计，该聚合物悬浮剂包括至少约90重量％到约99.9重量％，或约95重量％到约99.9重量％的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体。在一些实施方案中，该含羧基的单烯属不饱和单体包括丙烯酸，甲基丙烯酸，乙基丙烯酸，甲基丙烯酸(巴豆酸)，顺式-α-甲基巴豆酸(当归酸)，反式-α-甲基巴豆酸(α-甲基巴豆酸)，α-丁基巴豆酸，α-苯基丙烯酸，α-苄基丙烯酸，α-环己基丙烯酸，苯基丙烯酸(肉桂酸)，香豆酸(邻羟基肉桂酸)以及伞形酸(对羟基香豆酸)。在一些实施方案中，该聚合物可通过多官能团的交联剂(例如，双官能的交联剂)来交联。在另外的实施方案中，交联量应该足以形成不溶性聚合物颗粒，但不应太大以致于过度干涉治疗剂的持续释放。在一些实施方案中，该聚合物仅仅轻度交联。在一些实施方案中，以所存在的单体的总重量为基准计，该交联剂的含量为约0.01％到约5％，或约0.1％到约5.0％，或约0.2％到约1％。在一些实施方案中，该交联剂是非聚烯基聚醚双官能交联用单体例如二乙烯基乙二醇，2，3-二羟基己-1，5二烯，2，5-二甲基-1，5-己二烯，二乙烯基苯，N,N-二烯丙基丙烯酰胺，N,N-二烯丙基甲基丙烯酰胺；每一分子含有两个或更多个烯基醚基团的聚烯基聚醚交联剂，例如，含有末端H2C=C<基团的烯基醚基团，通过用卤代烯烃如烯丙基溴等将含有至少四个碳原子和至少三个羟基的多元醇醚化来制备，例如，聚烯丙基蔗糖，聚烯丙基季戊四醇等；分子量约400到约8000的二烯属非亲水性大分子交联剂，例如二醇和多元醇的不溶性二丙烯酸酯和多丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，由聚酯二醇、聚醚二醇或聚硅氧烷二醇与甲基丙烯酸羟烷基酯衍生的异氰酸酯终端的预聚物的二异氰酸酯丙烯酸或甲基丙烯酸羟烷基酯反应产物等。
在一些实施方案中，该交联聚合物可由作为唯一存在的单烯属不饱和单体的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体与一种或多种交联剂制备。在一些实施方案中，该聚合物是其中至多约40重量％，优选约0重量％到约20重量％的一种或多种含羧基的单烯属不饱和单体被一种或多种不含羧基、仅含生理上和眼科学无害的取代基的单烯属不饱和单体替代的聚合物，所述单体包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯，丙烯酸3-羟丙酯等，乙酸乙烯酯，N-乙烯基吡咯烷酮等(关于这种其他单烯属不饱和单体的更广泛的名单，参见Mueller等人，美国专利No.4,548,990，其全部内容通过引用并入到此处)。在一些实施方案中，聚合物包括聚卡波非(Noveon AA-1)、和
Figure BDA0000457047210000592
在一些实施方案中，该交联聚合物通过使用常规自由基聚合催化剂将单体悬浮或乳液聚合至当量球径不超过约50μm的干燥粒度来制备。在一些实施方案中，该平均干燥粒度为当量球径约1到约30μm，或约3约20μm。在一些实施方案中，聚合物颗粒通过将较大的聚合物颗粒机械研磨来获得。在其他实施方案中，此类聚合物具有约250000到约4000000，以及3000000000到4000000000的分子量。在其它实施方案中，交联聚合物的颗粒是单分散的，是指它们所具有的粒度分布应使得至少约80％、约90％或约95％的颗粒落入主粒度分布的μm带内。在其他实施方案中，单分散粒度是指不超过约20％，约10％，或约5％颗粒的粒度在1μm以下。在一些实施方案中，聚合物水性悬浮液包括约0.05到约1％、约0.1到约0.5％、或约0.1到约0.5％的治疗剂和约0.1到约10％、约0.5到约6.5％、约0.5到约2.0％、约0.5％到约1.2％、约0.6到约0.9％、或约0.6到约0.8％的聚合物悬浮剂。虽然提到的是单种，但应该理解，在总量处于规定范围的情况下，可以使用一种或多种聚合物悬浮剂。在一个实施方案中，不溶性的轻度交联的聚合物颗粒的量、pH和渗透压能够彼此相关，并且与交联度相关，以提供具有约500到约100000厘泊，优选约1000到约30000厘泊或约1000到约10000厘泊的粘度的组合物，所述粘度使用装有25号芯轴和13R小样品接头的Brookfield数字LVT粘度计在12rpm和室温(约25℃)下测定。在一些实施方案中，该粘度为约10到约400厘泊，约10到约200厘泊或约10到约25厘泊。
在一些实施方案中，可以配制聚合物水性悬浮液，使得它们在眼中保持与给药于眼睛之前的粘度相同或基本上相同的粘度。在一些实施方案中，可以配制它们，使得其在与泪液接触时凝胶化增强。例如，当pH低于约6.7的含有
Figure BDA0000457047210000593
或其他类似聚丙烯酸类聚合物的制剂给药于眼睛时，该聚合物在与泪液接触时可能溶胀，因为它具有较高pH(大约7)。该凝胶化或凝胶化的增强可能导致悬浮颗粒的夹带，从而延长了组合物在眼睛中的停留时间。在一些实施方案中，随着悬浮颗粒经时溶解，该治疗剂慢慢地释放。在一些实施方案中，该输送途径增加了患者舒适感，增加了治疗剂与眼组织的接触时间，从而增加了药物吸收的程度和制剂在眼睛中的作用持续时间。在这些药物输送***中含有的治疗剂可以取决于诸如药物本身及其外形、药物加载的程度和***的pH以及还可能存在的任何药物输送助剂如与眼表相容的离子交换树脂之类的因素的速率从凝胶中释放。
本发明的组合物可以进一步包括一种或多种其他药剂，如化疗剂、甾类、抗炎化合物或免疫抑制剂，它们的实例在上文被列举。
以下通过具体实施例来更详细地说明本发明。以下实施例为了说明的目的而提供，绝不意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易认识到，可以改变或改良各种非关键参数以获得基本上相同的结果。
实施例
实施例1.{1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈三氟乙酸盐
步骤1.3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，在氮气氛围中，向氢化钠(60％矿物油分散体，0.257g，6.42mmol)在四氢呋喃(32mL)中的悬浮液中添加氰甲基膦酸二乙酯(1.19g，6.72mmol)(从Aldrich购买)。然后将反应在室温下搅拌45分钟。滴加3-氮杂环丁酮-1-甲酸叔丁酯(1.00g，5.84mmol)(从Alfa Aesar购买)在四氢呋喃(8.8mL)中的溶液，并将该混合物搅拌16小时。添加盐水和乙酸乙酯，并分离各层。水层用三份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用硫酸钠干燥，过滤，再浓缩，获得产物，不用进一步提纯在步骤2中使用(1.12g，99％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.38(p，1H)，4.73-4.68(m，2H)，4.64-4.59(m，2H)，1.46(s，9H)。
步骤2.3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
Figure BDA0000457047210000612
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(4.61g，14.6mmol)(根据WO2007／070514的实施例65的步骤2的方法制备)和3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.84g，14.6mmol)在乙腈(100mL)中的溶液中添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(2.19mL，14.6mmol)。将反应在室温下搅拌16小时。真空脱除乙腈，残留物溶干乙酸乙酯。该溶液用1N HCl和盐水依次洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，再浓缩。残留物通过快速柱色谱法提纯，用80％乙酸乙酯／己烷洗脱，获得所需产物(5.36g，72％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.86(s，1H)，8.44(s，1H)，8.34(s，1H)，7.42(d，1H)，6.80(d，1H)，5.68(s，2H)，4.54(d，2H)，4.29(d，2H)，3.59-3.51(m，2H)，3.33(s，2H)，1.47(s，9H)，0.96-0.89(m，2H)，-0.06(s，9H)；LCMS(M+H)+：510.2。
步骤3.3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈
Figure BDA0000457047210000621
向3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(5.36g，10.5mmol)在1，4-二烷(100mL)中的溶液中添加氯化氢在1，4-二
Figure BDA0000457047210000623
烷(40mL，160mmol)中的4.00M溶液，并将该混合物在室温下搅拌16小时。将反应物倒入足以中和的饱和碳酸氢钠溶液中。该产物用三份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，再浓缩，获得产物，该产物不用进一步提纯而直接使用(3.0g，69％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.85(s，1H)，8.42(s，1H)，8.32(s，1H)，7.41(d，1H)，6.80(d，1H)，5.68(s，2H)，4.30(d，2H)，3.88(d，2H)，3.58-3.51(m，2H)，3.42(s，2H)，0.96-0.89(m，2H)，-0.06(s，9H)；LCMS(M+H)+：410.2。
步骤4.1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈
向3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈(0.100g，0.244mmol)在含有N,N-二异丙基乙胺(0.085mL，0.49mmol)的四氢呋喃(2mL)中的溶液中添加乙烷磺酰氯(0.023mL，0.24mmol)。在搅拌1.5小时以后，将反应混合物倒入稀HCl中，并用三份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得产物，该产物不用进一步提纯而直接在步骤5中使用(111mg，91％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.86(s，1H)，8.63(s，1H)，8.35(s，1H)，7.45(d，1H)，6.83(d，1H)，5.68(s，2H)，4.63(d，2H)，4.26(d，2H)，3.54(t，2H)，3.42(s，2H)，3.09(q，2H)，1.41(t，3H)，0.92(t，2H)，-0.06(s，9H)；LCMS(M+H)+：502.1。
步骤5.1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈三氟乙酸盐
向1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈(0.111g，0.22mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中添加三氟乙酸(2mL)，并将该溶液搅拌1.5小时。真空脱除溶剂，将残留物溶于甲醇(3mL)中，并添加乙二胺(0.1mL)。在搅拌3小时以后，在真空中减小体积，产物通过制备型HPLC／MS(SunFire C18柱，用含有0.1％TFA的MeCN／H2O的梯度洗脱)提纯，从而获得作为三氟乙酸盐的产物(50mg，47％)。
1H NMR(400MHz，d6-dmso)：δ12.55(br d，1H)，9.03(s，1H)，8.83(s，1H)，8.56(s，1H)，7.79-7.75(m，1H)，7.24-7.19(m，1H)，4.59(d，2H)，4.26(d，2H)，3.71(s，2H)，3.25(q，2H)，1.24(t，3H)；LCMS(M+H)+：372.1。
或者，脱保护和磺酰化步骤能够如实施例2所示以相反顺序进行。
实施例2.1-(环丙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈三氟乙酸盐
步骤1.3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈三氟乙酸盐
Figure BDA0000457047210000642
将如实施例1的步骤2中所制备的3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(0.60g，1.2mmol)在三氟乙酸(10mL)和二氯甲烷(40mL)中的溶液搅拌5小时。真空脱除溶剂，将残留物在甲醇(40mL)和14.50M的氢氧化铵在水(10mL)中的溶液中搅拌过夜。蒸发掉溶剂，残留物在甲醇中重构，通过制备型HPLC／MS(SunFire C18柱，用含有0.1％TFA的MeCN／H2O的梯度洗脱)提纯，从而获得作为三氟乙酸盐的产物(526mg，88％)。
1H NMR(400MHz，d6-dmso)：δ12.36(br s，1H)，9.37(br s，1H)，9.15(br s，1H)，9.05(s，1H)，8.77(s，1H)，8.56(s，1H)，7.71(dd，1H)，7.14(dd，1H)，4.75-4.65(m，2H)，4.48-4.39(m，2H)，3.74(s，2H)；LCMS(M+H)+：280.1。
步骤2.1-(环丙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈三氟乙酸盐
向四氢呋喃(38mL)和三乙胺(0.55mL，3.9mmol)中的3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈双(三氟乙酸盐)(0.400g，0.788mmol)中添加环丙烷磺酰氯(0.084mL，0.83mmol)。将反应在室温下搅拌几小时，定期添加环丙烷磺酰氯，直到通过LCMS确认起始胺被消耗为止。为了溶解不溶物质，添加甲醇(0.16mL)。真空脱除THF，使用MeOH来重构样品，用于通过制备型HPLC／MS(SunFire C18柱，用含有0.1％TFA的MeCN／H2O的梯度洗脱)提纯，从而获得作为三氟乙酸盐的产物(193mg，49％)。
1H NMR(300MHz，d6-dmso)：δ12.53(br s，1H)，9.05(s，1H)，8.82(s，1H)，8.55(s，1H)，7.76(dd，1H)，7.21(dd，1H)，4.65(d，2H)，4.31(d，2H)，3.70(s，2H)，2.90-2.80(m，1H)，1.07-0.97(m，4H)；LCMS(M+H)+：384.1。
实施例3.1-[(1-甲基环丙基)羰基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈三氟乙酸盐
Figure BDA0000457047210000651
向1-甲基环丙烷甲酸(4.3mg，0.043mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.018g，0.14mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中的溶液添加六氟磷酸N，N，N′，N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并***-1-基)脲
Figure BDA0000457047210000663
(0.016g，0.043mmol)(购自Aldrich)。将反应搅拌15分钟，随后添加实施例2的步骤1获得的3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈双(三氟乙酸)盐(0.014g，0.029mmol)。将反应搅拌16小时。产物通过制备型HPLC／MS(SunFire C18柱，用含有0.1％TFA的MeCN／H2O的梯度洗脱)提纯，从而获得作为三氟乙酸盐的产物(6mg，45％)。
1H NMR(300MHz，d6-dmso)：δ12.82(br s，1H)，9.10(s，1H)，8.91(s，1H)，8.59(s，1H)，7.86(s，1H)，7.31(s，1H)，5.07-4.07(br，4H)，3.72(s，2H)，1.28(s，3H)，0.98(s，2H)，0.54(s，2H)；LCMS(M+H)+：362.2。
在一些情况下，使用实施例3的变型，其中用THF替代DMF作为溶剂。在表1中，这用变型A来表示。
实施例4.1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈三氟乙酸盐
Figure BDA0000457047210000661
步骤1.1-(环丙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-醇
Figure BDA0000457047210000662
在0℃下，向氮杂环丁烷-3-醇盐酸盐(1.00g，9.13mmol)(购自Matrix)和N，N-二异丙基乙胺(4.77mL，27.4mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液中添加环丙烷磺酰氯(0.930mL，9.13mmol)，并将该反应搅拌16小时。添加水，产物用乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用1N HCl、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得黄色油，不用进一步提纯而直接使用(1.04g，64％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ4.61(p，1H)，4.14-4.07(m，2H)，3.93-3.86(m，2H)，2.69(br s，1H)，2.42-2.32(m，1H)，1.20-1.11(m，2H)，1.06-0.98(m，2H)。
步骤2.1-(环丙基磺酰基)-3-[(三乙基甲硅烷基)氧基]氮杂环丁烷
向1-(环丙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-醇(1.04g，5.87mmol)和三乙胺(3.11mL，22.3mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液中先后添加4-二甲基氨基吡啶(0.090g，0.73mmol)和氯三乙基甲硅烷(1.00M THF溶液，8.0mL，8.0mmol)。将反应在室温下搅拌16小时。向该反应添加饱和碳酸氢钠溶液，产物用乙酸乙酯：己烷的1：1混合物萃取三次。合并的有机萃取物用稀HCl和盐水洗涤，然后用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。进行快速柱色谱法，用0-50％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，从而获得所需产物(1.0g，58％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ4.56(p，1H)，4.05-3.98(m，2H)，3.90-3.83(m，2H)，2.41-2.32(m，1H)，1.20-1.12(m，2H)，1.05-0.96(m，2H)，0.93(t，9H)，0.57(q，6H)。
步骤3.1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]-3-[(三乙基甲硅烷基)氧基]氮杂环丁烷
Figure BDA0000457047210000681
在-78℃下，向1-(环丙基磺酰基)-3-[(三乙基甲硅烷基)氧基]氮杂环丁烷(1.0g，3.4mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液滴加正丁基锂在己烷(1.37mL，3.43mmol)中的2.50M溶液。在该温度下搅拌1小时以后，添加甲基碘(0.224mL，3.60mmol)。在30分钟以后，将反应温度升高至0℃，并搅拌50分钟。反应通过先后添加饱和碳酸氢钠和盐水来猝灭，产物用乙酸乙酯萃取。萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。进行快速柱色谱法，用0-30％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，从而获得所需产物(890mg，85％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ4.57(p，1H)，4.00-3.94(m，2H)，3.92-3.86(m，2H)，1.49(s，3H)，1.35-1.29(m，2H)，0.93(t，9H)，0.73(dt，2H)，0.57(q，6H)。
步骤4.1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]氮杂环丁烷-3-醇
Figure BDA0000457047210000682
在室温下，将1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]-3-[(三乙基甲硅烷基)氧基]氮杂环丁烷(0.125g，0.41mmol)在四氢呋喃(3mL)、水(1mL)和乙酸(1mL)中的溶液搅拌四小时。该混合物通过倒入到碳酸氢钠的溶液中而被中和。产物用乙酸乙酯萃取，萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得产物，该产物不用进一步提纯而直接使用(64mg，82％)。
1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ4.56-4.47(m，1H)，4.02-3.95(m，2H)，3.83-3.75(m，2H)，1.47(s，3H)，1.26-1.19(m，2H)，0.84-0.77(m，2H)。
步骤5.1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]氮杂环丁烷-3-酮
Figure BDA0000457047210000691
在-78℃下，向草酰氯(59μL，0.69mmol)在二氯甲烷(1.5mL)中的溶液缓慢滴加二甲亚砜(0.10mL，1.5mmol)。在添加完之后，将反应搅拌15分钟。滴加1-[(1-甲基环丙基)-磺酰基]氮杂环丁烷-3-醇(64mg，0.33mmol)在二氯甲烷(1.0mL)中的溶液，并将该反应混合物在-60℃下搅拌45分钟。滴加三乙胺(0.28mL，2.0mmol)，将反应搅拌15分钟，移走该浴，使溶液升温至环境温度。真空脱除溶剂，并添加乙酸乙酯。该溶液用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水顺序洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。该粗产物不用进一步提纯而直接在步骤6中使用。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ4.07(d，2H)，3.93(d，2H)，1.58(s，3H)，1.44-1.38(m，2H)，0.87(dt，2H)。
步骤6.1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]氮杂环丁烷-3-亚基乙腈
Figure BDA0000457047210000692
在0℃下，向氢化钠(矿物油中的60％分散体，17mg，0.42mmol)在四氢呋喃(2mL)中的混合物滴加氰甲基膦酸二乙酯(70μL，0.43mmol)。然后使该混合物到达室温，并搅拌另外45分钟。添加1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]氮杂环丁烷-3-酮(在步骤5中制备)在四氢呋喃(1.0mL)中的溶液，将该混合物在环境温度下搅拌16小时。向反应物中添加水和固体NaCl，产物再用三份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得产物(71mg，100％)，不用进一步提纯而在步骤7中直接使用。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.44-5.39(m，1H)，4.76-4.71(m，2H)，4.69-4.64(m，2H)，1.49(s，3H)，1.36-1.30(m，2H)，0.80(dt，2H)。
步骤7.1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.108g，0.344mmol)和1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]氮杂环丁烷-3-亚基乙腈(71mg，0.33mmol)在乙腈(3mL)中的溶液中添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(51μL，0.34mmol)。在15小时的反应时间以后，真空脱除乙腈，残留物在乙酸乙酯和1NHCl之间分配。分离各层，有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，再浓缩。进行快速柱色谱法，用0-80％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得产物(135mg，77％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.86(s，1H)，8.46(s，1H)，8.35(s，1H)，7.42(d，1H)，6.80(d，1H)，5.68(s，2H)，4.62(d，2H)，4.22(d，2H)，3.59-3.50(m，2H)，3.42(s，2H)，1.55(s，3H)，1.42-1.36(m，2H)，0.96-0.89(m，2H)，0.85(dt，2H)，-0.06(s，9H)；LCMS(M十H)+：528.1。
步骤8.1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈三氟乙酸盐
将1-[(1-甲基环丙基)磺酰基]-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈(44mg，0.083mmol)在二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(5mL)中的溶液搅拌2小时。真空脱除溶剂。该残留物与14.50M的氢氧化铵溶液(3mL)在甲醇(10mL)中搅拌16小时。真空脱除溶剂，残留物通过制备型HPLC-MS(SunFireC18柱，用含有0.1％TFA的H2O和MeCN的梯度洗脱)，获得作为三氟乙酸盐的产物(0.02g，50％)。
1H NMR(300MHz，d6-dmso)：δ12.56(br s，1H)，9.03(s，1H)，8.83(s，1H)，8.55(s，1H)，7.77(dd，1H)，7.21(dd，1H)，4.58(d，2H)，4.23(d，2H)，3.71(s，2H)，1.46(s，3H)，1.22-1.16(m，2H)，0.93-0.87(m，2H)；LCMS(M+H)+：398.1。
在实施例1或实施例2的方法中，使用酰氯、异氰酸酯或氯甲酸酯代替磺酰氯，以分别获得酰胺(表1中的实施例号22、24、26-30和33)，脲类(表1中的实施例号38)或者氨基甲酸酯(表1中的实施例号35-37)作为产品。另外，三乙胺和二异丙基乙胺可互换地使用。表1中的一些酰胺按照实施例3中所述的备选方法，通过将实施例2步骤1的胺与羧酸偶联来制备。
表1
Figure BDA0000457047210000711
Figure BDA0000457047210000721
Figure BDA0000457047210000741
Figure BDA0000457047210000751
Figure BDA0000457047210000761
Figure BDA0000457047210000781
Figure BDA0000457047210000791
Figure BDA0000457047210000801
Figure BDA0000457047210000821
Figure BDA0000457047210000831
在表1中的产品被称为游离碱时，它们使用制备型HPLC／MS提纯(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH而不是含有0.1％TFA的MeCN／H2O的梯度洗脱)。
实施例39.顺式3-(氰基甲基)-N，N-二甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷磺酰胺和反式3-(氰基甲基)-N，N-二甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷磺酰胺
Figure BDA0000457047210000841
步骤1.顺式和反式3-(苄氧基)-N,N-二甲基环丁烷磺酰胺
Figure BDA0000457047210000842
在-78℃下，向N，N-二甲基-甲烷磺酰胺(7.45g，60.5mmol)在四氢呋喃(190mL)中的溶液添加250M的正丁基锂在己烷(31mL，77.5mmol)中的溶液。将反应在-78℃下搅拌45分钟，然后加温到0℃，并搅拌15分钟，然后再冷却到-78℃。快速滴加2-(苄氧基)-丙烷-1，3-二基双(4-甲基苯磺酸酯)(如在Chemical Communications v.30，第3190-3192页(2006)中所述那样制备；29.1g，59.3mmol)在四氢呋喃(120mL)中的溶液。在添加完之后，将反应在-78℃下搅拌15分钟，然后移走浴，经1.5小时让反应升温至环境温度。将该溶液再冷却到-78℃，再添加2.50M的正丁基锂在己烷(31mL，77.5mmol)中的溶液。在15分钟之后，移走该浴，再次让反应达到环境温度，并搅拌16小时。当通过TLC判断反应不完全时，将它再次冷却至-78℃，添加又一部分的正丁基锂在己烷(10mL，25mmol)中的2.5M溶液。在加热到室温之后，反应通过添加水来猝灭，该混合物用三份乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物先后用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，再浓缩。进行快速色谱法，用20-50％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得所需产物。该异构体独立地表征，但在后续转换中作为顺反异构体混合物再结合(7.06g，44％)。
异构体1：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.38-7.27(m，5H)，4.42(s，2H)，4.41-4.33(m，1H)，3.83-3.74(m，1H)，2.87(s，6H)，2.79-2.71(m，2H)，2.47-2.38(m，2H)。
异构体2：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.37-7.26(m，5H)，4.44(s，2H)，4.02-3.93(m，1H)，3.34-3.24(m，1H)，2.85(s，6H)，2.61-2.46(m，4H)。
步骤2.顺式和反式3-羟基-N,N-二甲基环丁烷磺酰胺
Figure BDA0000457047210000851
向顺式和反式3-(苄氧基)-N，N-二甲基环丁烷磺酰胺(7.06g，26.2mmol)在乙醇(100mL)中的混合物中添加钯(2.8g，2.6mmol)(10％Pd／C，湿Degussa型)。将该混合物脱气，在50psi氢气下振荡16小时。将反应混合物过滤，钯碳用乙醇冲洗。将滤液进行浓缩，获得白色固体，不用进一步提纯而直接使用(4.60g，98％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.71-4.63(m，1H，次要异构体)，4.22(p，1H，主要异构体)，3.83-3.74(m，1H，次要异构体)，3.37-3.27(m，1H，主要异构体)，2.87(s，6H，次要异构体)，2.86(s，6H，主要异构体)，2.85-2.77(m，2H，次要异构体)，2.76-2.68(m，2H，主要异构体)，2.48-2.40(m，2H，主要异构体)，2.40-2.32(m，2H，次要异构体)。
步骤3.N，N-二甲基-3-氧代环丁烷磺酰胺
Figure BDA0000457047210000852
向戴斯-马丁氧化剂(14.3g，33.7mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液添加二氯甲烷(200mL)中的顺式和反式3-羟基-N,N-二甲基环丁烷磺酰胺(5.75g，32.1mol)。将反应在环境温度下搅拌16小时。将DCM的体积在真空中减少至100mL。该溶液通过碱性氧化铝的填塞物过滤，用另外的DCM冲洗。将滤液蒸发。所得黄色粘性固体通过接连用几份***强力搅拌来萃取。萃取物用固体碳酸钠填料来过滤，再次通过另一碱性氧化铝的填塞物过滤，最后用另外的小部分的乙酸乙酯冲洗，以获得清洁产物(4g，70％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.89-3.80(m，1H)，3.68-3.59(m，2H)，3.44-3.34(m，2H)，2.93(s，6H).
步骤4.顺式3-(氰基甲基)-N，N-二甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷磺酰胺和反式3-(氰基甲基)-N,N-二甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷磺酰胺
将N，N-二甲基-3-氧代环丁烷磺酰胺(4.0g，22mmol)和(三苯基磷亚基)乙腈(6.80g，22.6mmol)在甲苯(150mL)中的混合物加热至回流，保持1小时。从不溶物质滗析掉反应溶液，真空脱除溶剂，获得了粗产物，其在共轭加成中不用进一步提纯而直接使用。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.31-5.25(m，1H)，3.91-3.78(m，1H)，3.50-3.10(m，4H)，2.89(s，6H).
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(7.09g，22.5mmol)和粗3-(氰基亚甲基)-N,N-二甲基环丁烷磺酰胺(以上制备)在乙腈(200mL)中的溶液添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(3.36mL，22.5mmol)。将反应搅拌16小时。粗产物通过快速柱色谱法提纯，用0-10％甲醇／DCM(二氯甲烷)的梯度洗脱。进一步使用制备型HPLC／MS(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的MeCN／H2O的梯度洗脱)提纯由该预提纯收集的产物，从而获得异构体混合物。使用一部分的该混合物通过下列方法分离顺式和反式异构体：ChiralTechnologies Chiralcel OJ柱，30×250mm，5μ填充材料，用60％乙醇／己烷在14.5ml／min的流速和65mg／注射的柱负载下洗脱。这样获得的峰1通过用20％TFA／DCM搅拌2小时，随后蒸发，将残留物溶解在4mL MeOH中，然后添加0.25mL乙二胺来去保护。在搅拌1小时后，真空脱除溶剂，将粗产物重构，用制备型HPLC／MS(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的MeCN／H2O的梯度洗脱)提纯，从而获得顺式3-(氰基甲基)-N,N-二甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷磺酰胺。
1H NMR(500MHz，d6-dmso)：δ12.10(br s，1H)，8.78(s，1H)，8.69(s，1H)，8.42(s，1H)，7.60(d，1H)，7.06(d，1H)，4.25(p，1H)，3.59(s，2H)，3.14-3.07(m，2H)，2.85-2.79(m，2H)，3.80(s，6H)；LCMS：386.1。
通过与用于峰1的相同方法，去保护和提纯由异构体分离获得的峰2，获得反式3-(氰基甲基)-N，N-二甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷磺酰胺。
1H NMR(500MHz，d6-dmso)：δ12.10(br s，1H)，8.90(s，1H)，8.70(s，1H)，8.45(s，1H)，7.60(d，1H)，7.09(d，1H)，4.18(p，1H)，3.46(s，2H)，3.35-3.28(m，2H)，2.89-2.82(m，2H)，2.79(s，6H)；LCMS：386.0。
实施例40.顺式3-异
Figure BDA0000457047210000873
唑-3-基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈和反式3-异
Figure BDA0000457047210000874
唑-3-基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
步骤1.3-(苄氧基)环丁烷-1，1-二甲酸二乙酯
Figure BDA0000457047210000872
向氢化钠(60％矿物油分散体，4.67g，0.117mol)在1，4-二烷(69mL)中的悬浮液滴加丙二酸二乙酯(17.7mL，0.117mol)。添加完后，将该混合物在环境温度下搅拌1.5小时。向该混合物中滴加[2-溴-1-(氯甲基)乙氧基]甲苯(根据Organic Letters(2004)，6(11)，第1853-1856页中所述的工序制备；32.0g，0.121mol)，将所得混合物在环境温度下搅拌1小时，然后在回流下加热16小时。将该混合物在冰浴中短暂冷却，分批添加氢化钠(60％矿物油分散体，4.67g，0.117mol)。将该混合物加热至回流，保持另外24小时。在冷却到室温之后，将该混合物倒入pH7缓冲剂和盐水中，并且该产物用三份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。进行快速柱色谱法，用5-60％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得产物(26.9g，75％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.37-7.25(m，5H)，4.42(s，2H)，4.24-4.10(m，5H)，2.83-2.75(m，2H)，2.58-2.50(m，2H)，1.31-1.24(m，6H)。
步骤2.顺式和反式3-(苄氧基)环丁烷甲酸
Figure BDA0000457047210000881
将3-(苄氧基)环丁烷-1，1-二甲酸二乙酯(20.0g，0.0653mol)和氢氧化钾(18g，0.32mol)在乙醇(110mL)和水(10mL)中的溶液加热至回流，保持2小时。该碱性混合物用***洗涤一次。醚洗液用两份1N NaOH反萃取。合并的水层通过添加浓HCl酸化，然后用***萃取三次。合并的萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得作为粘性黄色固体的中间体，随后与甲苯共沸蒸馏。该二酸在海瓦克真空(hyvac)(<5mmHg)下在190℃加热1.5小时，以进行脱羧，获得顺式和反式一元酸的混合物，不用进一步提纯而直接使用(13.5g，92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.38-7.26(m，10H)，4.44(s，2H)，443(s，2H)，4.31(p，1H)，4.02-3.93(m，1H)，3.12-3.04(m，1H)，2.72-2.62(m，1H)，2.59-2.48(m，4H)，2.38-2.24(m，4H)。
步骤3.顺式和反式3-(苄氧基)-N-甲氧基-N-甲基环丁烷甲酰胺
Figure BDA0000457047210000891
将3-(苄氧基)环丁烷甲酸(2.50g，12.1mmol)、N，O-二甲基羟胺盐酸盐(1.18g，12.1mmol)、六氟磷酸苯并***-1-基氧基三(二甲基氨基)
Figure BDA0000457047210000893
(5.9g，13mmol)(Advanced ChemTech)和三乙胺(3.7mL，27mmol)在二氯甲烷(80mL)中的混合物在室温下搅拌16小时。该溶液然后用水洗涤两次，用盐水洗涤一次，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。进行快速柱色谱法，用20-50％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得作为顺式和反式异构体的混合物的产物(1.7g，56％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.35-7.24(m，10H)，4.43(s，2H)，4.42(s，2H)，4.31-4.24(m，1H)，4.03-3.95(m，1H)，3.64(s，3H)，3.63(s，3H)，3.47(br s，1H)，3.19(s，3H)，3.18(s，3H)，2.95(br s，1H)，2.57-2.48(m，2H)，2.47-2.38(m，2H)，2.34-2.23(m，4H)。
步骤4.顺式和反式1-[3-(苄氧基)环丁基]丙-2-炔-1-酮
Figure BDA0000457047210000892
在-78℃下，向3-(苄氧基)-N-甲氧基-N-甲基环丁烷甲酰胺(1.7g，6.8mmol)在四氢呋喃(40mL)中的溶液中添加溴化乙炔基镁在四氢呋喃(14.3mL，7.15mmol)中的0.5M溶液，经1小时将反应加热至环境温度。该反应通过添加饱和NH4Cl溶液来猝灭，产物用乙酸乙酯萃取。萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得产物，其不用进一步提纯在步骤5中直接使用。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.39-7.21(m，10H)，4.43(s，2H)，4.41(s，2H)，4.19-4.09(m，1H)，4.06-3.95(m，1H)，3.36-3.24(m，1H)，3.29(s，1H)，3.26(s，1H)，2.90-2.79(m，1H)，2.67-2.59(m，2H)，2.56-2.47(m，2H)，2.36-2.26(m，4H)。
步骤5.顺式3-[3-(苄氧基)环丁基]异
Figure BDA0000457047210000903
唑和反式3-[3-(苄氧基)环丁基]异
Figure BDA0000457047210000904
唑
Figure BDA0000457047210000901
向1-[3-(苄氧基)环丁基]丙-2-炔-1-酮(在步骤4中制备)在乙醇(40mL)中的溶液中先后添加盐酸羟胺(0.54g，7.7mmol)和碳酸钠(1.48g，14.0mmol)。将反应搅拌16小时。然后将反应加热至回流，并保持4小时，再冷却。向反应混合物中添加水和乙酸乙酯。将各层分离，水层用另外两份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。进行快速柱色谱法，用15-50％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得作为顺式和反式异构体的混合物的产物(520mg，33％，经两步)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.32(dd，1H)，8.31(dd，1H)，7.36-7.26(m，10H)，6.30(d，1H)，6.21(d，1H)，4.47(s，2H)，4.45(s，2H)，4.38-4.30(m，1H)，4.12-4.04(m，1H)，3.62-3.53(m，1H)，3.23-3.13(m，1H)，2.75-2.14(m，8H)。
步骤6.顺式和反式3-异
Figure BDA0000457047210000905
唑-3-基环丁醇
将顺式和反式3-[3-(苄氧基)环丁基]异唑(0.520g，2.27mmol)和20％氢氧化钯／碳(0.14g，0.20mmol)在四氢呋喃(30mL)和乙酸(8mL)中的混合物进行脱气，并在氢气氛下(由气球提供)搅拌3小时。将混合物过滤，通过添加NaOH进行中和，用三份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得作为顺式和反式异构体的混合物的产物(320mg，100％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.55(dd，1H)，8.54(dd，1H)，6.44(d，1H)，6.42(d，1H)，4.50-4.41(m，1H)，4.26-4.17(m，1H)，3.55-3.46(m，1H)，3.14-3.03(m，1H)，2.73-2.64(m，2H)，2.54-2.46(m，2H)，2.44-2.35(m，2H)，2.13-2.03(m，2H)。
步骤7.3-异
Figure BDA0000457047210000913
唑-3-基环丁酮
Figure BDA0000457047210000911
将作为顺式和反式异构体混合物的3-异
Figure BDA0000457047210000914
唑-3-基环丁醇(0.316g，2.27mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，并添加戴斯-马丁氧化剂(0.96g，2.3mmol)。在搅拌2小时后，添加饱和的NaHCO3溶液和盐水，该混合物用三份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。进行快速柱色谱法，用20-50％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得产物(258mg，83％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.40(dd，1H)，6.31(d，1H)，3.81-3.72(m，1H)，3.59-3.48(m，2H)，3.46-3.37(m，2H)。
步骤8.(3-异
Figure BDA0000457047210000915
唑-3-基环丁亚基)乙腈
Figure BDA0000457047210000912
将氢化钠(60％矿物油分散体，75mg，1.88mmol)立即添加到氰甲基膦酸二乙酯(0.33mL，2.1mmol)在四氢呋喃(8mL)中的溶液中。在搅拌5分钟后，添加3-异唑-3-基环丁酮(258mg，1.88mmol)在四氢呋喃(20mL)中的溶液。在2小时反应时间以后，将反应混合物在乙酸乙酯和盐水之间分配，并分离各层。水层用另外两份乙酸乙酯萃取，合并的萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。残留物然后与甲苯共沸蒸馏，产物不用进一步提纯而在步骤9中直接使用。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.38(dd，1H)，6.28(d，1H)，5.27(p，1H)，3.81-3.72(m，1H)，3.50-3.15(m，4H)。
步骤9.顺式3-异
Figure BDA0000457047210000922
唑-3-基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈和反式3-异唑-3-基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
向(3-异
Figure BDA0000457047210000924
唑-3-基环丁亚基)乙腈(在步骤8中制备)在乙腈(8mL)中的溶液先后添加4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.59g，1.9mmol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(280mL，1.9mmol)。将反应搅拌72小时。真空脱除乙腈。进行快速柱色谱法，用50-100％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得顺式和反式异构体的混合物。该混合物用20％TFA／DCM(8mL／32mL)搅拌3小时，并真空脱除过量溶剂。该残留物与乙二胺(2mL)在甲醇(40mL)中搅拌16小时。再次真空脱除溶剂。混合物通过制备型HpLC／MS提纯(XBridge C18柱，流动相：含有0.1％NH4OH的20.5-25.5％的MeCN／H2O)。峰1，顺式3-异
Figure BDA0000457047210000925
唑-3-基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(185mg，28％)，峰2，反式3-异
Figure BDA0000457047210000926
唑-3-基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(85mg，13％)。
峰1，(顺式-)：1H NMR(400MHz，d6-dmso)：δ12.13(br s，1H)，8.85(d，1H)，8.76(s，1H)，8.69(s，1H)，8.42(s，1H)，7.60(d，1H)，7.07(d，1H)，6.67(d，1H)，3.85(p，1H)，3.67(s，2H)，3.04-2.95(m，2H)，2.89-2.81(m，2H)；LCMS(M+H)+：346.1。
峰2，(反式-)：1H NMR(400MHz，d6-dmso)：δ12.14(br s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，1H)，8.71(s，1H)，8.47(s，1H)，7.62(dd，1H)，7.11(dd，1H)，6.73(d，1H)，3.71(p，1H)，3.46(s，2H)，3.34-3.27(m，2H)，2.80-2.71(m，2H)；LCMS(M+H)+：346.1。
实施例41.{顺式3-(3-甲基-1，2，4-
Figure BDA0000457047210000933
二唑-5-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基}乙腈三氟乙酸盐和{反式3-(3-甲基-1，2，4-二唑-5-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基}乙腈三氟乙酸盐
步骤1.顺式和反式3-(苄氧基)环丁烷甲酸乙酯
Figure BDA0000457047210000932
向3-(苄氧基)环丁烷甲酸(5.00g，24.2mmol)(如实施例6的步骤2那样制备)在乙醇(60mL)中的溶液添加0.08mL浓H2SO4。将该混合物在温和回流下加热48小时。在冷却到室温之后，真空蒸发溶剂。进行快速柱色谱法，用0-20％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得作为顺式和反式异构体混合物的所需产物(3.91g，69％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.37-7.26(m，10H)，4.43(s，2H)，4.41(s，2H)，4.29(p，1H)，4.14(q，2H)，4.13(q，2H)，3.99-3.91(m，1H)，3.07-2.98(m，1H)，2.66-2.55(m，1H)，2.54-2.44(m，4H)，2.34-2.20(m，4H)，1.26(t，3H)，1.25(t，3H)。
步骤2.顺式和反式3-羟基环丁烷甲酸乙酯
Figure BDA0000457047210000941
向顺式和反式3-(苄氧基)环丁烷甲酸乙酯(3.91g，16.7mmol)在乙醇(40mL)中的溶液中添加钯(10％碳载钯，湿Degussa型)(270mg，0.25mmol)。将该混合物脱气，在50psi氢气下振荡16小时。将该反应混合物过滤，真空脱除溶剂，获得作为顺式和反式异构体的混合物的产物，该产物不用进一步提纯而直接使用(2.40g，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.60-4.52(m，1H)，4.22-4.12(m，1H)，4.14(q，2H)，4.13(q，2H)，3.04-2.96(m，1H)，2.64-2.51(m，5H)，2.25-2.11(m，4H)，2.02(br s，2H)，1.25(t，3H)1.25(t，3H)。
步骤3.氧代环丁烷甲酸乙酯
Figure BDA0000457047210000942
在-78℃下，向二氯甲烷(100mL)中添加草酰氯(1.79mL，21.2mmol)，随后添加二甲亚砜(2.51mL，35.3mmol)。在30分钟以后，添加溶于二氯甲烷(46mL)中的顺式和反式3-羟基环丁烷甲酸乙酯(2.68g，17.6mol)。将该混合物在-78℃下搅拌30分钟。添加三乙胺(9.84mL，70.6mmol)。然后经2小时将该混合物加热至室温。将水加入到反应混合物中，并分离各层。有机相依次用1N HCl、水、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。该产物(2.36g，94％)不用进一步提纯而直接使用。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.21(q，2H)，3.45-3.37(m，2H)，3.33-3.17(m，3H)，1.29(t，3H)。
步骤4.3-(氰基亚甲基)环丁烷甲酸乙酯
Figure BDA0000457047210000951
在0℃下，向氢化钠(60％矿物油分散体，0.730g，18.3mmol)在四氢呋喃(100mL)中的悬浮液滴加的氰甲基膦酸二乙酯(3.22mL，19.9mmol)。移走冷却浴，使反应到达室温，在该温度下搅拌45分钟。将该溶液再冷却到0℃，滴加3-氧代环丁烷甲酸乙酯(2.36g，16.6mmol)在四氢呋喃(50mL)中的溶液。在搅拌2小时以后，将水和***添加到该反应中。将各层分离，含水部分用另外两份***萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。该残留物与甲苯共沸蒸馏一次，获得产物，该产物不用进一步提纯而在步骤5中直接使用。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.23-5.20(m，1H)，4.18(q，2H)，3.25-3.02(m，5H)，1.28(t，3H)。
步骤5.3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷甲酸乙酯
Figure BDA0000457047210000952
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(5.23g，16.6mmol)和3-(氰基亚甲基)环丁烷甲酸乙酯(在步骤4中制备)在乙腈(40mL)中的溶液添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(2.48mL，16.6mmol)。将该混合物在室温下搅拌136小时。真空脱除溶剂。进行快速柱色谱法，用50-90％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得作为顺式和反式异构体混合物的产物(4.53g，52％，经两步)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.85(s，1H)，8.84(s，1H)，8.45(s，1H)，8.41(s，1H)，8.33(s，1H)，8.31(s，1H)，7.41(d，1H)，7.40(d，1H)，6.81(d，1H)，6.80(d，1H)，5.68(s，4H)，4.17(q，2H)，4.12(q，2H)，3.54(t，4H)，3.27(s，2H)，3.28-2.80(m，10H)，3.19(s，2H)，1.26(t，3H)，1.25(t，3H)，0.92(t，4H)，-0.06(s，18H)；LCMS(M+H)+：481.1。
步骤6.{顺式3-(3-甲基-1，2，4-
Figure BDA0000457047210000961
二唑-5-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基}乙腈三氟乙酸盐和{反式3-(3-甲基-1,2，4-
Figure BDA0000457047210000962
二唑-5-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基}乙腈三氟乙酸盐
向顺式和反式3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷甲酸乙酯(2.25g，3.98mmol)在四氢呋喃(55mL)和水(18mL)中的溶液添加氢氧化锂(0.48g，20mmol)在少量水中的溶液。将反应在室温下搅拌4小时。将该反应混合物在冰浴中冷却，并添加浓HCl，以获得pH为5。该产物用三份乙酸乙酯萃取。萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩，获得作为顺式和反式异构体的混合物的产物，其不用进一步提纯而直接使用。LCMS(M+H)+：453.1。
向以上制备的3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷甲酸(50.0mg，0.11mmol)、1-羟基苯并***(3.0mg，0.022mmol)和N-羟基乙脒(根据J.Org.Chem.，2003，68(19)，第7316-7321页中所述的工序制备)(8.2mg，0.11mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(0.5mL)和N，N-二异丙基乙胺(96μL，0.55mmol)中的混合物中添加O-(苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲
Figure BDA0000457047210000963
六氟磷酸盐(42mg，0.110mmol)(Advanced ChemTech)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。添加附加亚化学计量的O-(苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N-羟基乙脒，反应继续另外24小时。然后将反应加热到110℃，保持1小时，以完成环化。向该反应添加饱和碳酸氢钠溶液，产物用四份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。该粗产物混合物在含有20％TFA的DCM中搅拌2小时，再真空脱除溶剂。该残留物溶于1.5mL的甲醇和0.3mL乙二胺中，再搅拌2小时。该反应混合物通过制备型HPLC／MS(SunFire C18柱，用含有0.1％TFA的H2O／MeCN的梯度洗脱)提纯，拆分顺式(6mg，10％)和反式(5mg，8％)异构体，获得作为三氟乙酸盐的每一种产物。
顺式-异构体：1H NMR(300MHz，d6-dmso)：δ12.39(br s，1H)，8.86(s，1H)，8.77(s，1H)，8.48(s，1H)，7.86(br s，1H)，7.73-7.68(m，1H)，7.19-7.14(m，1H)，4.12-3.96(m，1H)，3.70(s，2H)，3.22-3.08(m，2H)，2.99-2.85(m，2H)，2.31(s，3H)；LCMS(M+H)+：361.1。
反式-异构体：1H NMR(300MHz，d6-dmso)：δ12.36(br s，1H)，8.99(s，1H)，8.77(s，1H)，8.52(s，1H)，7.90(br s，1H)，7.72-7.67(m，1H)，7.21-7.17(m，1H)，4.03-3.88(m，1H)，3.52(s，2H)，3.47-3.31(m，2H)，2.93-2.84(m，2H)，2.36(s，3H)；LCMS(M+H)+：361.0。
其他
Figure BDA0000457047210000972
二唑根据实施例41在步骤6中使用不同的偕胺肟(根据J.Org.Chem.2003，68(19)，第7316-7321页中所述的工序来制备)来制备，见表2。
表2
Figure BDA0000457047210000971
Figure BDA0000457047210000981
实施例43.1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈三氟乙酸盐
Figure BDA0000457047210000982
步骤1.环丁亚基乙腈.
在0℃下，向1.0000M的叔丁醇钾在四氢呋喃(19.2mL)中的溶液滴加氰甲基膦酸二乙酯(3.26mL，0.0202mol)在四氢呋喃(24.52mL，0.3023mol)中的溶液。将该反应升温至室温，然后再次冷却到0℃。向该反应混合物中添加环丁酮(1.37mL，0.0183mol)在四氢呋喃(4.90mL，0.0605mol)中的溶液。将该反应加热至室温，并在室温下搅拌过夜。用水猝灭之后，该混合物用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥，再蒸干。该粗混合物在下一步中直接使用(1.30g，76.25％)。
步骤2.1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.030g，0.000095mol)在乙腈(0.60mL，0.011mol)中的溶液中添加环丁亚基乙腈(0.0177g，0.000190mol)，随后添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.0142mL，0.0000951mol)。将所得混合物搅拌过夜。在蒸干以后，残留物上硅胶进行提纯，获得所需迈克尔加成产物。LCMS(M+H)409.1。
以上制备的粗残留物溶于0.2mL二氯甲烷中，用0.4mL TFA在室温下处理30分钟。在蒸干以后，该残留物用50μL的乙二胺在1mL的甲醇中在室温下处理30分钟。所得混合物通过RP-HPLC提纯(XBridge C18柱，用含有0.1％TFA的乙腈／水的梯度洗脱)，从而获得作为TFA盐的标题产物，LCMS C15H15N6(M+H)+计算值：279.1；实测值：279.0。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.68(1H，br s)，8.88(1H，s)，8.84(1H，s)，8.51(1H，s)，7.78(1H，m)，7.25(1H，m)，3.49(2H，s)，2.78(2H，m)，2.39(2H，m)，2.06(1H，m)，1.93(1H，m)ppm。
实施例44.顺式和反式3-(羟甲基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
Figure BDA0000457047210001001
步骤1.3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯
在氮气下，以使得温度维持在70℃以下的速率将丙二酸二异丙酯(72g，0.38mol)滴加到氢化钠(17g，0.42mol)在干燥N,N-二甲基甲酰胺(140mL，1.8mol)中的搅拌悬浮液中。在氢放出停止时，一次性添加1，3-二溴-2，2-二甲氧基丙烷(50g，0.2mol)，将该混合物在140℃下加热48小时。将冷却的混合物倒入氯化铵饱和溶液(300mL)中，用己烷萃取。有机层用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸干。对残留物进行真空蒸馏(油泵)，以获得所需环丁烷化合物(31g，56.32％)。沸点为92-94℃／0.01mm)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.02(2H，sept.，J=6.4Hz)，3.12(6H，s)，2.66(4H，s)，1.11(12H，d，J=6.4Hz)ppm。
步骤2.3-氧代环丁烷甲酸。
将3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯(31g，0.11mol)与78mL的20％HCl在回流下加热60小时。在冷却之后，该溶液用***连续萃取18小时。在减压下除去***，留下了黄色油，其在静置时结晶，获得了标题酸(10.4g，84.78％)。
步骤3.3-氧代环丁烷甲酸甲酯。
将N，N′-二环己基碳二亚胺(7.17g，0.0347mol)在二氯甲烷(8mL，0.1mol)中的溶液滴加到3-氧代环丁烷甲酸(3.6g，0.032mol)、甲醇(2.6mL，0.063mol)和4-二甲基氨基吡啶(308g，0.0252mol)在二氯甲烷(20mL，0.2mol)中的搅拌混合物中。将该混合物在室温下搅拌24小时，然后用赛力特硅藻土过滤。该滤液用0.5M HCl和饱和碳酸氢钠洗涤，进行干燥，再浓缩至干燥。该残留物用硅胶提纯，用0-40％EtOAc／己烷洗脱，获得所需酯(3.26g，80.64％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ3.78(s，3H)，3.43～3.20(5H，m)ppm。
步骤4.3-(氰基亚甲基)环丁烷甲酸甲酯。
在0℃下，向1.0000M的叔丁醇钾在四氢呋喃(26.7mL)中的溶液滴加氰甲基膦酸二乙酯(4.53mL，0.0280mol)在四氢呋喃(50mL，0.6mol)中的溶液。将该反应升温至室温，然后再次冷却到0℃。向该反应混合物中添加3-氧代环丁烷甲酸甲酯(3.26g，0.0254mol)在四氢呋喃(20mL，0.3mol)中的溶液。将该反应加热至室温，并在室温下搅拌过夜。用水猝灭之后，该混合物用***萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥，再蒸干。该粗混合物用硅胶提纯，用0-40％EtOAc／己烷洗脱，得到该所需产物(3.12g，81.12％)。LCMS C8H10NO2(M+H)+计算值：152.1；实测值：152.3。
步骤5.3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷甲酸甲酯。
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(2.01g，0.00637mol)在乙腈(4.0E1mL，0.77mol)中的溶液中先后添加3-(氰基亚甲基)环丁烷甲酸甲酯(1.93g，0.0127mol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.953mL，0.00637mol)。将所得混合物在50℃下搅拌过夜。在蒸干以后，该残留物用硅胶提纯，用0-100％EtOAc／己烷洗脱，得到作为顺式和反式异构体混合物的所需迈克尔加成产物(2.12g，71.3％)。LCMS C23H31N6O3Si(M+H)+计算值：467.2；实测值：467.4。
步骤6.3-(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
在0℃下，向3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷甲酸甲酯(7.0g，0.015mol)在四氢呋喃(100mL，1mol)中的混合物中添加四氢硼酸锂(0.327g，0.0150mol)。然后将反应在50℃下加热3小时。向该反应添加60mL的甲醇。将所得混合物在50℃下加热另外15分钟，然后蒸干。该残留物用1N HCl处理，然后用固体碳酸氢钠中和，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，再蒸干。该残留物用硅胶提纯，用0-100％EtOAc提纯，得到作为顺式和反式混合物的所需产物(5.85g，88.91％)。LCMS C22H31N6O2Si(M+H)+计算值：439.2；实测值：439.4。
步骤7.3-(羟甲基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
向3-(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.030g，0.000068mol)中添加1.5mL的TFA。将该反应在室温下搅拌30分钟，然后蒸干。将该粗混合物溶于1mL的甲醇，用60μL的乙二胺在室温下处理5小时。所得混合物通过RP-HPLC提纯(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到作为游离碱的所需产品。第一峰保留时间0.766分钟，LCMS C16H17N6O(M+H)+计算值：309.1；实测值：309.3。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.11(1H，br s)，8.67(1H，s)，8.65(1H，s)，8.37(1H，s)，7.58(1H，d，J=3.6)，7.02(1H，d，J=3.6Hz)，4.69(1H，br s)，3.47(2H，s)，3.41(2H，br s)，2.53(2H，m)，2.37(2H，m)ppm。第二峰保留时间0.805分钟，LCMS C16H17N6O(M+H)+计算值：309.1；实测值：309.3。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.11(1H，br s)，8.80(1H，s)，8.68(1H，s)，8.40(1H，s)，7.58(1H，d，J=3.6Hz)，7.07(1H，d，J=3.6Hz)，4.78(1H，br t，J=5.2Hz)，3.47(2H，br t，J=5.2Hz)，3.36(2H，s)，2.85(2H，m)，2.29(2H，m)ppm。
实施例45.顺式和反式3-(氟甲基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
Figure BDA0000457047210001021
向塑料瓶内的3-(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.050g，0.00011mol)在二氯甲烷(3.10mL，0.0483mol)中的混合物中先后添加2-甲氧基-N-(2-甲氧基乙基)-N-(三氟-λ(4)-硫基)乙胺(63.0μL，0.000342mol)和乙醇(1μL，0.00002mol)。将反应在室温下搅拌过夜，然后蒸干，从而获得氟化产物。LCMS(M+H)441.1。
向以上获得的残留物中添加3mL的TFA。将该反应在室温下搅拌30分钟，然后蒸干。将该粗混合物溶于1mL的甲醇中，用60μL的乙二胺在室温下处理5小时。所得混合物通过RP-HPLC提纯(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到作为游离碱的所需产品。根据分析LCMS，第一峰保留时间0.973分钟[Waters SunFire HPLC柱(C18，2.1x50mm，5μM)，注射体积2μL，流速3mL／min，3分钟内的梯度从2％到80％B(A=含有0.025％TFA的水；B＝乙腈)]，LCMSC16H16FN6(M+H)+计算值：311.1；实测值：311.3。根据分析LCMS，第二峰保留时间1.006分钟，LCMS C16H16FN6(M+H)+计算值：311.1；实测值：311.3。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.09(1H，br s)，8.84(1H，s)，8.70(1H，s)，8.43(1H，s)，7.59(1H，d，J=4.0Hz)，7.08(1H，d，J=4.0Hz)，4.53(2H，dd，J=5.5and47.5Hz)，3.38(2H，s)，2.97(2H，m)，2.68(1H，m)，2.39(2H，m)ppm.19F NMR(500MHz，DMSO-d6)δ-221.84(td，J=47.5和21.0Hz)ppm。
实施例46.顺式和反式3-(二氟甲基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
Figure BDA0000457047210001031
步骤1.3-甲酰基1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
在-78℃下，将二甲亚砜(0.194mL，0.00274mol)加入到草酰氯(0.145mL，0.00171mol)在二氯甲烷(6.384mL，0.09959mol)中的溶液中。在10分钟后，添加溶于二氯甲烷(12.77mL，0.1992mol)的3-(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.500g，0.00114mol)，并将所形成的混合物在-78℃下搅拌30分钟。然后添加三乙胺(0.794mL，0.00570mol)，并将该混合物搅拌5小时，使温度逐渐升高至室温。用水猝灭之后，该混合物用二氯甲烷萃取。将有机层合并，用盐水洗涤，干燥，再蒸干。该残留物用硅胶提纯，用0-100％EtOAc／己烷洗脱，得到所需的醛(430mg，86％)。LCMS C22H29N6O2Si(M+H)+计算值：437.2；实测值：437.4。
步骤2.3-(二氟甲基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
向塑料瓶内的3-甲酰基-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.285g，0.000653mol)在二氯甲烷(6mL，0.09mol)中的混合物先后添加2-甲氧基-N-(2-甲氧基乙基)-N-(三氟-λ(4)-硫基)乙胺(0.481mL，0.00261mol)和乙醇(8μL，0.0001mol)。将反应在室温下搅拌过夜，然后蒸干。LCMS(M+H)459.4。
向以上制备的残留物中添加3mL的TFA。将该反应在室温下搅拌30分钟，然后蒸干。将该粗混合物溶于3mL的甲醇中，用乙二胺(0.22mL，0.0033mol)在室温下处理5小时。所得混合物通过RP-HPLC提纯(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到作为游离碱的所需产品。第一峰保留时间0.935分钟，LCMSC16H15F2N6(M+H)+计算值：329.1；实测值：329.1。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，br s)，8.74(1H，s)，8.69(1H，s)，8.40(1H，s)，7.59(1H，d，J=3.5Hz)，7.06(1H，d，J＝3.5Hz)，6.20(1H，td，J=57.0and4.0Hz)，3.57(2H，s)，2.98(1H，m)，2.81(2H，m)，2.52(2H，m)ppm。第二峰保留时间0.974分钟，LCMS C16H15F2N6(M+H)+计算值：329.1；实测值：329.1。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，br s)，8.78(1H，s)，8.70(1H，s)，8.44(1H，s)，7.60(1H，d，J=3.5Hz)，7.09(1H，d，J=3.5Hz)，6.25(1H，td，J=57.0and4.5Hz)，3.41(2H，s)，3.01(2H，m)，2.90(1H，m)，2.56(2H，m)ppm。
实施例47.顺式和反式2，2′-[1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，3-二基]二乙腈。
Figure BDA0000457047210001051
步骤1.3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基甲基甲磺酸酯。
在0℃下，向3-(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.122g，0.000278mol)在二氯甲烷(2mL，0.04mol)中的混合物先后添加三乙胺(0.0775mL，0.000556mol)和甲烷磺酰氯(0.0478g，0.000417mol)。反应在室温下搅拌过夜，用水猝灭，用二氯甲烷萃取。该有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，然后蒸干。该粗混合物直接在下一步中使用(138mg，96.02％)。LCMS C23H33N6O4SSi(M+H)+计算值：517.2；实测值：517.4。
步骤2.2，2′-[1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，3-二基]二乙腈。
在65℃下，将3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基甲基甲磺酸酯(0.138g，0.000267mol)和***(0.0870g，0.00134mol)在N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL，0.013mol)中的混合物加热过夜。在冷却到室温后，混合物用EtOAc萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，然后蒸干。LCMS(M+H)448.4。
以上制备的粗产物用1mL的TFA在室温下处理30分钟，然后蒸干。所获得的残留物用0.1mL的乙二胺在1mL的甲醇中在室温下处理过夜。将该混合物施加于RP-HPLC上(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，从而获得比率3∶2的两种异构体。第一峰保留时间0.869分钟，LCMS C17H16N7(M+H)+计算值：318.1；实测值318.3。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ1209(1H，br s)，8.72(1H，s)，8.69(1H，s)，8.39(1H，s)，7.60(1H，d，J=3.5Hz)，7.05(1H，d，J=3.5Hz)，3.52(2H，s)，2.79(2H，br s)，2.68(1H，m)，2.61(2H，br s)，2.60(2H，br s)ppm。第二峰保留时间0.919分钟，LCMS C17H16N7(M+H)+计算值：318.1；实测值：318.3。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.09(1H，br s)，8.85(1H，s)，8.70(1H，s)，8.43(1H，s)，7.59(1H，d，J=3.5Hz)，7.08(1H，d，J=3.5Hz)，3.40(2H，s)，3.07(2H，m)，2.80(2H，d，J=7.0Hz)，2.70(1H，m)，2.34(2H，m)ppm。
实施例48.顺式和反式3-(氰基甲基)-1-甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈。
Figure BDA0000457047210001061
步骤1.1-甲基-3-亚甲基环丁腈
在-78℃下，向3-亚甲基环丁腈(5.00g，0.0537mol)(购自中国Bepharm Ltd.)在四氢呋喃(200mL，2mol)中的混合物中添加二异丙基氨基锂在四氢呋喃(32.2mL)中的2.00M溶液。在-78℃下搅拌30分钟后，添加甲基碘(4.18mL，0.0671mol)。将反应在-78℃下搅拌30分钟，然后加热到室温，用氯化铵猝灭，然后用***萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥，再蒸干。该粗残留物在下一步中直接使用。
步骤2.1-甲基-3-氧代环丁腈。
将水(60mL，3mol)与1，4-二
Figure BDA0000457047210001062
烷(200mL，2mol)、1-甲基-3-亚甲基环丁腈(5.75g，0.0537mol)和0.2M的四氧化锇水溶液(1mL)的混合物搅拌5分钟，在此期间，该混合物变成棕色。在将温度维持在室温的同时，经30分钟分批添加高碘酸钠(24.1g，0.113mol)。将该混合物搅拌过夜。该混合物用二氯甲烷萃取，合并的有机层用MgSO4干燥。在除去溶剂后，该粗产物在下一步中直接使用(5.50g，93.92％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ3.74(2H，m)，3.16(2H，m)，1.75(3H，s)ppm。
步骤3.3-(氰基亚甲基)-1-甲基环丁腈。
在0℃下，向1.0M的叔丁醇钾在四氢呋喃(52.9mL)中的溶液中滴加氰甲基膦酸二乙酯(8.98mL，0.0555mol)在四氢呋喃(90mL，1mol)中的溶液。将该反应升温至室温，然后再次冷却到0℃。向该反应混合物添加1-甲基-3-氧代环丁腈(5.50g，0.0504mol)在四氢呋喃(40mL，0.6mol)中的溶液。将该反应加热至室温，并在室温下搅拌过夜。用水猝灭之后，该混合物用***萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥，再蒸干。该粗混合物用硅胶提纯，用0-60％EtOAc／己烷洗脱，得到所需产物(3.12g，46.84％)。LCMS C8H9N2(M+H)+计算值：133.1；实测值：133.1。
步骤4.3-(氰基甲基)-1-甲基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈。
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.030g，0.000095mol)在乙腈(0.5mL，0.01mol)中的溶液先后添加3-(氰基亚甲基)-1-甲基环丁腈(0.0126g，0.0000951mol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.0142mL，0.0000951mol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后蒸干。LCMS(M+H)448.4。
该粗混合物用1mL的TFA(三氟乙酸)在室温下处理1小时，再蒸干。该残留物与0.050mL的乙二胺在1mL的甲醇中在室温下搅拌过夜。反应混合物施加于RP-HPLC上(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到作为游离碱的所需产品。第一峰保留时间0.916分钟，LCMS C17H16N7(M+H)+计算值：318.1；实测值：318.4。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，br s)，8.93(1H，s)，8.71(1H，s)，8.46(1H，s)，7.61(1H，d，J=3.5Hz)，7.08(1H，d，J=3.5Hz)，3.48(2H，dd，J=2.0and12.5Hz)，3.45(2H，s)，2.74(2H，dd，J=2.0and12.5Hz)，1.62(3H，s)ppm。第二峰保留时间0.988分钟，LCMS C17H16N7(M+H)+计算值：318.1；实测值：318.4。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，br s)，8.84(1H，s)，8.70(1H，s)，8.43(1H，s)，7.61(1H，d，J＝3.5Hz)，7.06(1H，d，J=3.5Hz)，3.52(2H，s)，3.12(4H，m)，1.45(3H，s)ppm。
实施例49.顺式和反式3-(氰基甲基)-1-(甲氧基甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈。
Figure BDA0000457047210001081
步骤1.1-(甲氧基甲基)-3-亚甲基环丁腈
在-78℃下，向3-亚甲基环丁腈(1.00g，0.0107mol)在四氢呋喃(40mL，0.5mol)中的混合物中添加二异丙基氨基锂在四氢呋喃(6.44mL)中的2.00M溶液。在-78℃下搅拌30分钟之后，向所得混合物中添加氯甲基甲醚(1.02mL，0.0134mol)。将反应在-78℃下搅拌30分钟，然后加热到室温，用氯化铵猝灭，然后用***萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥，再蒸干。该粗残留物在下一步中直接使用。
步骤2.1-(甲氧基甲基)-3-氧代环丁腈。
将水(2mL，0.1mol)与1，4-二
Figure BDA0000457047210001082
烷(7mL，0.08mol)、1-(甲氧基甲基)-3-亚甲基环丁腈(0.294g，0.00214mol)和0.2M四氧化锇水溶液(0.04mL)的混合物搅拌5分钟，在此期间，该混合物变成棕色。在将温度维持在室温的同时，经30分钟分批添加高碘酸钠(0.963g，0.00450mol)。将该混合物搅拌过夜。该混合物用EtOAc萃取，合并的有机层用MgSO4干燥。在除去溶剂后，该粗产物在下一步中直接使用(298mg，99.92％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.70(2H，s)，3.68(3H，s)，3.58(2H，m)，3.38(2H，m)ppm。
步骤3.3-(氰基亚甲基)-1-(甲氧基甲基)环丁腈
在0℃下，向1.0000M的叔丁醇钾在四氢呋喃(2.25mL)中的溶液中滴加氰甲基膦酸二乙酯(0.381mL，0.00236mol)在四氢呋喃(4mL，0.05mol)中的溶液。将该反应升温至室温，然后再次冷却到0℃。向该反应混合物中添加1-(甲氧基甲基)-3-氧代环丁腈(0.298g，0.00214mol)在四氢呋喃(2mL，0.02mol)中的溶液。将该反应加热至室温，并在室温下搅拌过夜。用水猝灭之后，该混合物用***萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥，再蒸干。该粗混合物在下一步中直接使用。LCMSC9H11N2O(M+H)+计算值：163.1；实测值：163.1。
步骤4.3-(氰基甲基)-1-(甲氧基甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈。
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.256g，0.000812mol)在乙腈(5mL，0.1mol)中的溶液先后添加3-(氰基亚甲基)-1-(甲氧基甲基)环丁腈(0.166g，0.00102mol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.153mL，0.00102mol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，再蒸干。LCMS(M+H)478.4。
以上获得的粗混合物用1mL的TFA在室温下处理1小时，然后蒸干。该残留物与0.050mL的乙二胺在1mL的甲醇中在室温下搅拌过夜。反应混合物施加于RP-HPLC上(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到作为游离碱的所需产品。第一峰保留时间0.969分钟，LCMS C18H18N7O(M+H)+计算值：m／z=348.2；实测值：348.4。第二峰保留时间0.986分钟，LCMS C18H18N7O(M+H)+计算值：348.2；实测值：348.4。
实施例50.顺式和反式3-(氰基甲基)-1-(氟甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈
Figure BDA0000457047210001091
步骤1.1-(羟甲基)-3-亚甲基环丁腈。
在-78℃下，向1-(甲氧基甲基)-3-亚甲基环丁腈(1.40g，0.0102mol)在二氯甲烷(30mL，0.4mol)中的混合物添加三溴化硼在二氯甲烷(12.8mL)中的1.0M溶液。将该反应在室温下搅拌2小时，用碳酸氢钠水溶液猝灭，再用二氯甲烷萃取。合并的有机层用硫酸镁干燥，再蒸干，获得所需产物(1.26g，100％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.81(2H，m)，3.66(2H，s)，3.10(2H，m)，2.59(2H，m)ppm。
步骤2.1-(氟甲基)-3-亚甲基环丁腈
向塑料瓶内的1-(羟甲基)-3-亚甲基环丁腈(0.252g，0.00205mol)在二氯甲烷(20mL，0.3mol)中的混合物中先后添加2-甲氧基-N-(2-甲氧基乙基)-N-(三氟-λ(4)-硫基)乙胺(1.13mL，0.00614mol)和乙醇(20μL，0.0004mol)。将该反应在室温下搅拌过夜，然后用碳酸氢钠水溶液猝灭，再用二氯甲烷萃取。将萃取物合并，用水、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，再蒸干。该残留物在下一步中直接使用。
步骤3.1-(氟甲基)-3-氧代环丁腈。
将水(2mL，0.1mol)与1，4-二
Figure BDA0000457047210001101
烷(6mL，0.08mol)、1-(氟甲基)-3-亚甲基环丁腈(0.256g，0.00204mol)和0.2M四氧化锇水溶液(0.04mL)的混合物搅拌5分钟，在此期间，该混合物变成棕色。在将温度维持在室温的同时，经30分钟分批添加高碘酸钠(0.919g，0.00430mol)。将该混合物搅拌过夜。该混合物用EtOAc萃取，合并的有机层用MgSO4干燥。在脱除溶剂后，该粗产物在下一步中直接使用。
步骤4.3-(氰基亚甲基)-1-(氟甲基)环丁腈
在0℃下，向1.0M的叔丁醇钾在四氢呋喃(2.15mL)中的溶液中滴加氰甲基膦酸二乙酯(0.364mL，0.00225mol)在四氢呋喃(4mL，0.04mol)中的溶液。将该反应升温至室温，然后再次冷却到0℃。向该反应混合物中添加1-(氟甲基)-3-氧代环丁腈(0.260g，0.00204mol)在四氢呋喃(2mL，0.02mol)中的溶液。将该反应加热至室温，并在室温下搅拌过夜。用水猝灭之后，该混合物用***萃取。合并的有机层先后用水、盐水洗涤，干燥，再蒸干。该粗混合物在下一步中直接使用。
步骤5.3-(氰基甲基)-1-(氟甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.256g，0.000812mol)在乙腈(5mL，0.1mol)中的溶液先后添加3-(氰基亚甲基)-1-(氟甲基)环丁腈(0.153g，0.00102mol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.153mL，0.00102mol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，再蒸干。LCMS(M+H)465.4。
该粗混合物用1mL的TFA在室温下处理1小时，再蒸干。该残留物与0.050mL的乙二胺在1mL的甲醇中在室温下搅拌过夜。反应混合物施加于RP-HPLC上(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到作为游离碱的所需产品。第一峰保留时间0.939分钟，LCMSC17H15FN7(M+H)+计算值：336.1；实测值：336.3。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.08(1H，br s)，8.97(1H，s)，8.70(1H，s)，8.49(1H，s)，7.61(1H，d，J=3.6Hz)，7.09(1H，d，J=3.6Hz)，4.81(2H，d，J=46.4Hz)，3.48(2H，s)，3.44(2H，m)，2.90(2H，m)ppm。第二峰保留时间0.978分钟，LCMS C17H15FN7(M+H)+计算值：336.1；实测值：336.3。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.08(1H，br s)，8.85(1H，s)，8.68(1H，s)，8.43(1H，s)，7.61(1H，d，J=4.4Hz)，7.06(1H，d，J=4.4Hz)，4.58(2H，d，J=46.4Hz)，3.58(2H，s)，3.26(2H，m)，3.09(2H，m)ppm。
实施例51.顺式和反式1，3-双(氰基甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈
Figure BDA0000457047210001111
步骤1.甲磺酸(1-氰基-3-亚甲基环丁基)甲酯。
在0℃下，向1-(羟甲基)-3-亚甲基环丁腈(0.756g，0.00614mol)在二氯甲烷(20mL，0.3mol)中的混合物中先后添加三乙胺(1.28mL，0.00921mol)和甲烷磺酰氯(0.594mL，0.00767mol)。将该反应在室温下搅拌1小时，用水猝灭，再用二氯甲烷萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，然后用硫酸镁干燥，再蒸干。该残留物在下一步中直接使用。
步骤2.1-(氰基甲基)-3-亚甲基环丁腈。
将甲磺酸(1-氰基-3-亚甲基环丁基)甲酯(0.41g，0.0020mol)和***(0.66g，0.010mol)在N,N-二甲基甲酰胺(5mL，0.06mol)中的混合物在65℃下加热过夜。在用水稀释以后，所得混合物用EtOAc萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥，再蒸干。该残留物在下一步中直接使用。
步骤3.1-(氰基甲基)-3-氧代环丁腈。
将水(2mL，0.1mol)与1,4-二烷(6mL，0.08mol)、1-(氰基甲基)-3-亚甲基环丁腈(0.270g，0.00204mol)和0.2M四氧化锇水溶液(0.04mL)的混合物搅拌5分钟，在此期间，该混合物变成棕色。在将温度维持在室温的同时，经30分钟分批添加高碘酸钠(0.919g，0.00430mol)。将该混合物搅拌过夜。该混合物用EtOAc萃取，合并的有机层用MgSO4干燥。在脱除溶剂后，该粗产物在下一步中直接使用。
步骤4.1-(氰基甲基)-3-(氰基亚甲基)环丁腈。
在0℃下，向10M的叔丁醇钾在四氢呋喃(2.15mL)中的溶液中滴加氰甲基膦酸二乙酯(0.364mL，000225mol)在四氢呋喃(4mL，0.04mol)中的溶液。将该反应升温至室温，然后再次冷却到0℃。向该反应混合物中添加1-(氰基甲基)-3-氧代环丁腈(0.274g，0.00204mol)在四氢呋喃(2mL，0.02mol)中的溶液。将该反应加热至室温，并在室温下搅拌过夜。用水猝灭之后，该混合物用***萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，然后干燥，再蒸干。该粗混合物在下一步中直接使用。
步骤5.1，3-双(氰基甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈
向4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.256g，0.000812mol)在乙腈(5mL，0.1mol)中的溶液先后添加1-(氰基甲基)-3-(氰基亚甲基)环丁腈(0.161g，0.00102mol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.153mL，0.00102mol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，再蒸干。LCMS(M+H)473.4。
该粗混合物用1mL的TFA在室温下处理1小时，然后蒸干。该残留物与0.050mL的乙二胺在1mL的甲醇中在室温下搅拌过夜。反应混合物施加于RP-HPLC上(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到作为游离碱的所需产品。第一峰保留时间0.883分钟，LCMSC18H15N8(M+H)+计算值：343.1；实测值：343.4。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.12(1H，br s)，8.98(1H，s)，8.70(1H，s)，8.48(1H，s)，7.61(1H，d，J=4.0Hz)，7.10(1H，d，J=4.0Hz)，3.56(2H，d，J＝13.2)，3.46(2H，s)，3.42(2H，m)，2.92(2H，d，J=13.2Hz)ppm。第二峰保留时间0.897分钟，LCMS C18H15N8(M+H)+计算值：343.1；实测值：343.4。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.08(1H，br s)，8.85(1H，s)，8.69(1H，s)，8.43(1H，s)，7.61(1H，m)，7.07(1H，m)，3.38(2H，s)，3.27(2H，m)，3.14(2H，m)，2.88(2H，m)ppm。
实施例52.顺式和反式3-(氰基甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈
Figure BDA0000457047210001131
步骤1.3-氧代环丁腈。
将水(40mL，2mol)与1，4-二烷(100mL，1mol)、3-亚甲基环丁腈(3.30g，0.0354mol)(可从中国Bepharma Ltd.购买到)和四氧化锇的0.2M水溶液(0.7mL)的混合物搅拌5分钟，在此期间，该混合物变成棕色。在将温度维持在室温的同时，经30分钟分批添加高碘酸钠(15.9g，0.0744mol)。将该混合物搅拌另外1.5小时，然后用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥，再浓缩，获得固体(2.04g，60.54％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ3.58(4H，m)，3.25(1H，m)ppm。
步骤23-(氰基亚甲基)环丁腈
在0℃下，向1M的叔丁醇钾在THF(67.4mL)中的溶液中滴加氰甲基膦酸二乙酯(11.4mL，0.0706mol)在四氢呋喃(100mL，1mol)中的溶液。将该反应混合物升温到室温，并再次冷却到0℃。向所得混合物中添加3-氧代环丁腈(6.10g，0.0641mol)在四氢呋喃(20mL，0.2mol)中的溶液。将该反应混合物加热至室温，并搅拌2小时。用水猝灭之后，该混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥，再浓缩。该残留物通过快速硅胶柱提纯，用0-10％甲醇／二氯甲烷洗脱，得到标题产物(5.40g，71.26％)。LCMS(M+Na)141.3。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.30(1H，m)，3.40(2H，m)，3.14(3H，m)ppm。
步骤3.3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈
在氮气下，将3-(氰基亚甲基)环丁腈(120mg，0.0010mol)与4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.1g，0.0003mol)在乙腈(2mL，0.04mol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(6μL，0.00004mol)中合并。将该混合物在室温下搅拌整个周末。在蒸干后，该粗混合物通过快速柱提纯，用0-10％甲醇／二氯甲烷洗脱，得到所需产物。LCMS(M+H)434.4。
步骤4.3-(氰基甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈。
在装有搅拌棒、冷凝器和氮气导入管的500mL圆底烧瓶内添加乙腈(16.3mL，0.311mol)、水(1.4mL，0.078mol)和3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈(1.00g，0.00231mol)。溶液是均匀的。在添加四氟硼酸锂(2.21g，0.0231mol)后，将所得混合物加热至回流过夜，然后在室温下经5分钟分批添加7.2M氢氧化铵水溶液(1.2mL)，以便将pH调节至9-10。将该反应在室温下搅拌2小时。固体通过过滤除去，滤液用乙腈、水和MeOH稀释。所得混合物上Waters XBridge HPLC柱(C18，30×100mm，5μM)提纯，其中注射体积为5mL(～50mg／注射)，流速60mL／min，梯度为12分钟10-28％B(A=含有0.15％NH4OH的水；B=含有0.15％NH4OH的乙腈)，从而获得作为游离碱的所需产物。Waters SunFire HPLC柱的第一峰保留时间0.826分钟(C18，2.1×50mm，5μM)，注射体积2μL，流速3mL／min，梯度为3分钟2-80％B(A=含有0.025％TFA的水；B=乙腈)。LCMS C16H14N7(M+H)+计算值：304.1；实测值304.3。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，br s)，8.82(1H，s)，8.70(1H，s)，8.44(1H，s)，7.61(1H，d，J=4.0Hz)，7.08(1H，d，J=4.0Hz)，3.59(1H，m)，3.57(2H，s)，3.19(2H，m)，2.86(2H，m)ppm。相同SunFire柱HPLC条件下的第二峰保留时间为0.864分钟，LCMS C16H14N7(M+H)+计算值：304.1；实测值：304.3。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.67(1H，s)，8.66(1H，s)，8.40(1H，s)，7.51(1H，d，J=3.6Hz)，6.99(1H，d，J=3.6Hz)，3.50(1H，m)，3.42(2H，s)，3.24(2H，m)，3.00(2H，m)ppm。
实施例53.3，3-双(羟甲基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
Figure BDA0000457047210001151
步骤1.3-氧代环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯。
将3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯(3g，0.01mol)在20mL的三氟乙酸-水(95∶5)中的混合物在0℃下搅拌4小时。该反应用EtOAc稀释，用水、饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤，用MgSO4干燥，再蒸发，得到黄色油状的粗产物(2.4g)，其在下一步中直接使用。H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.07(2H，h，J=6.8Hz)，3.54(4H，s)，1.23(12H，d，J=6.8Hz)ppm。
步骤2.3-(氰基亚甲基)环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯
在0℃下，向1.0000M的叔丁醇钾在四氢呋喃(17mL)中的溶液和THF(10mL)的混合物中添加氰甲基膦酸二乙酯(2.7mL，0.017mol)。将该反应加热至室温，30分钟之后再次冷却至0℃。向该反应混合物中添加3-氧代环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯(2.7g，0.011mol)在THF(10mL)中的溶液。将该反应逐渐加热至室温，并在室温下搅拌2小时。该反应用饱和NH4Cl水溶液猝灭，并减缩有机溶剂。该混合物用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，浓缩，用Combiflash(硅胶，0-35％EtOAc／Hex)提纯，得到浅黄色油状的所需产物(2.65g)。
步骤3.3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯
将3-(氰基亚甲基)环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯(2.65g，0.00999mol)与4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(1g，0.003mol)在乙腈(10mL)中合并，在氮气下，添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.5mL，0.003mol)。将该混合物在50℃下加热过夜。将反应浓缩，用Combiflash(硅胶，0-50％EtOAc／Hex)提纯，获得无色油状的所需产物(0.3g)。LCMS C29H41N6O5Si(M+H)+计算值：581.3；实测值：581.4。
步骤4.3，3-双(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
将3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯(0.3g，0.5mmol)溶于四氢呋喃(15mL，180mmol)，在0℃下添加四氢硼酸锂(0.017g，0.77mmol)。然后，将反应加热至50℃，保持30分钟。向该反应添加MeOH(10mL)。将该反应在50℃下保持15分钟，然后汽提至接近干燥。该残留物用1N HCl处理，然后用固体NaHCO3中和。该混合物在水和EtOAc之间分配。将各相分离，水相用EtOAc洗涤。合并的有机相先后用水、盐水洗涤，用MgSO4干燥，浓缩，用Combiflash(硅胶，0-100％EtOAc／Hex)提纯，得到无色油状的所需产物(0.145g，60％)。LCMSC23H33N6O3Si(M+H)+计算值：469.2；实测值：469.4。
步骤5.3，3-双(羟甲基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
3，3-双(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.022g，0.000046mol)用三氟乙酸(0.5mL，0.006mol)在室温下处理30分钟，再蒸干。然后将该残留物与乙二胺(0.2mL，0.003mol)在MeOH(1mL)中混合2小时。将反应物浓缩，用制备型LCMS提纯(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，获得作为游离碱的所需产物。LCMSC17H19N6O2(M+H)+计算值：339.2；实测值：339.3。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ8.72(1H，s)，8.67(1H，s)，8.39(1H，s)，7.51(1H，d，J=3.3Hz)，6.97(1H，d，J=3.3Hz)，3.62(2H，s)，3.46(2H，s)，3.36(2H，s)，2.80(2H，d，J=13.8Hz)，2.54(2H，d，J=13.8Hz)ppm。
实施例54.3，3-双(氟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
Figure BDA0000457047210001171
将在装有氮气导入管和搅拌棒的特氟隆瓶内的3，3-双(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.03g，0.00006mol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液，用2-甲氧基-N-(2-甲氧基乙基)-N-(三氟-λ(4)-硫基)乙胺(0.06mL，0.0004mol)在室温下处理。添加乙醇(0.003mL，0.00006mol)，并将该混合物在室温下搅拌过夜。将所得混合物浓缩，用制备型LCMS提纯(XBridgeC18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到相应氟化产物，该氟化产物用三氟乙酸(0.5mL，0.006mol)在室温下处理30分钟。在蒸干后，所形成的残留物与乙二胺(0.2mL，0.003mol)在MeOH(1mL)中在室温下混合2小时。将反应物蒸干，残留物通过制备型LCMS(pH=10)提纯，获得所需产物。LCMS C17H17F2N2(M+H)+计算值：343.1；实测值：343.4。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ9.55(1H，br s)，8.86(1H，s)，8.49(1H，s)，8.35(1H，s)，7.40(1H，m)，6.82(1H，m)，4.54(2H，d，J=47.7Hz)，4.38(2H，d，J=47.4Hz)，3.14(2H，s)，2.96(2H，d，J=13.8Hz)，2.72(2H，d，J=13.8Hz)ppm。
实施例55.2，2′，2″-[1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1,3，3-三基]三乙腈
Figure BDA0000457047210001181
步骤1.(3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二基)二甲醇
在0℃下，向3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二甲酸二异丙酯(3.0g，0.010mol)在THF(20mL)中的溶液中在搅拌下缓慢添加2.0M的四氢铝酸锂在四氢呋喃(16mL)中的溶液。将该混合物搅拌2小时，使其升温至室温。在0℃下，向该反应连续地滴加水(1.2mL)、15％NaOH溶液(1.2mL)和水(3.6mL)，并将所形成的混合物在室温下搅拌2小时。将该混合物过滤，将滤液浓缩，获得无色油状的所需产物(1.64g，89％)，其不用提纯而直接在下一步中使用。
步骤2.(3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二基)双(亚甲基)二甲烷磺酸酯
在0℃下，向(3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二基)二甲醇(1.64g，0.00931mol)和三乙胺(7.8mL，0.056mol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物中滴加甲烷磺酰氯(2.2mL，0.028mol)。将所形成的混合物在室温下搅拌1小时。该反应物用二氯甲烷稀释，用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩，获得棕色油状的粗甲磺酸酯产物(2.95g，95.4％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.38(4H，s)，3.14(6H，s)，3.02(6H，s)，2.10(4H，s)ppm。
步骤3.2,2′-(3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二基)二乙腈
向(3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二基)双(亚甲基)二甲烷磺酸酯(2.9g，0.0087mol)在二甲亚砜(10mL)中的溶液中添加***(1.7g，0.026m0l)和1,4，7，10，13，16-六氧杂环十八烷(6.9g，0.026mol)。将该反应在60℃下搅拌过夜。该反应用水猝灭，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩，获得棕色油状的粗产物(2g)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.14(6H，s)，2.78(4H，s)，2.11(4H，s)ppm。
步骤4.2，2′-(3-氧代环丁烷-1，1-二基)二乙腈
向2，2′-(3，3-二甲氧基环丁烷-1，1-二基)二乙腈(2g，0.01mol)在丙酮(5mL)中的混合物添加对甲苯磺酸(1g，0.006mol)。将该混合物在室温下搅拌整个周末。该反应用饱和NaHCO3溶液中和，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，再蒸发，获得棕色油状的粗产物。
步骤5.2，2′，2″-环丁烷-1，1-二基-3-亚基三乙腈
在0℃下，向1.0M的叔丁醇钾在四氢呋喃(5.1mL)中的溶液滴加氰甲基膦酸二乙酯(0.82mL，0.0051mol)。将该反应加热至室温，30分钟之后再次冷却至0℃。向该反应混合物中添加2，2′-(3-氧代环丁烷-1，1-二基)二乙腈(0.5g，0.003mol)在THF(5mL)中的溶液。将该反应逐渐加热至室温，并在室温下搅拌2小时。该反应用饱和NH4Cl水溶液猝灭，然后用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩，获得棕色油状粗产物，其在下一步中直接使用。
步骤6.2，2′，2″-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，3，3-三基三乙腈
将粗产物2，2′，2″-环丁烷-1，1-二基-3-亚基三乙腈(1g，0.006mol)与4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.2g，0.0006mol)在乙腈(10mL)中合并，在氮气下添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.1mL，0.001mol)。将该混合物在50℃下加热过夜。将反应浓缩，用Combiflash(硅胶，0-100％EtOAc／Hex)提纯，得到浅棕色油状的所需产物。LCMS C25H31N8OSi(M+H)+计算值：487.2；实测值：487.4。
步骤7.2，2′，2″-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，3，3-三基三乙腈
将2，2′，2”-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，3，3-三基三乙腈(0.03g，0.00006mol)用三氟乙酸(0.5mL，0.006mol)在室温下处理30分钟，然后蒸干。该残留物与乙二胺(0.2mL，0.003mol)在MeOH(1mL)中在室温下混合1小时。将反应物蒸干，残留物通过制备型LCMS(pH=10)提纯，得到所需产物。LCMS C19H17N8(M+H)+计算值：m／z=357.1；实测值：357.4。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.06(1H，br s)，8.79(1H，s)，8.63(1H，s)，8.38(1H，s)，7.55(1H，d，J=3.6Hz)，7.01(1H，d，J=3.6Hz)，3.46(2H，s)，3.03(2H，s)，2.97(2H，d，J=15.2Hz)，2.76(2H，s)，2.57(2H，d，J=15.2Hz)ppm。
实施例56.顺式和反式3-羟基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
Figure BDA0000457047210001201
步骤1.N-甲氧基-N-甲基-3-氧杂环丁烷甲酰胺
在0℃下，向N,O-二甲基羟胺盐酸盐(5.2g，0.054mol)和3-氧代环丁烷甲酸(4.0g，0.035mol)在二氯甲烷(30mL)中的混合物中先后添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(10.0g，0.052mol)、1-羟基苯并***(7.1g，0.052mol)和三乙胺(34mL，0.24mol)。将该混合物在室温下搅拌过夜，然后用水猝灭。该混合物用EtOAc萃取。有机层用MgSO4干燥，浓缩，用Combiflash提纯(硅胶，0-5％30分钟，随后5-20％EtOAc／Hex)，得到作为浅黄色油的所需产物(4.3g，78％)。LCMSC7H12NO3(M+H)+计算值：158.1；实测值：158.3。
步骤2.3-羟基-N-甲氧基-N-甲基环丁烷甲酰胺
将N-甲氧基-N-甲基-3-氧代环丁烷甲酰胺(1g，0.006mol)溶于甲醇(8mL，0.2mol)。向该混合物添加硼氢化钠(0.2g，0.006mol)。将反应在室温下搅拌1小时。向该反应混合物添加1N HCl水溶液，以将pH调节至2。将该混合物浓缩，然后用EtOAc萃取。合并的有机层用MgSO4干燥，再浓缩，获得浅黄色油状的粗产物(1.4g)。LCMS C7H14NO3(M+H)+计算值：160.0；实测值：160.3。
步骤3.3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-N-甲氧基-N-甲基环丁烷甲酰胺
向3-羟基-N-甲氧基-N-甲基环丁烷甲酰胺(0.6g，0.004mol在DMF(10mL)中的溶液中先后添加叔丁基氯二苯基甲硅烷(3mL，0.01mol)和1H-咪唑(1g，0.02mol)。将该混合物在室温下搅拌过夜。该反应用二氯甲烷稀释，用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。该有机层用MgSO4干燥，浓缩和用Combiflash(硅胶，0-30％EtOAc／Hex)提纯，得到作为顺式和反式异构体混合物的所需产物(0.7g，50％)。LCMS C23H32NO3Si(M+H)+计算值：398.2；实测值：398.1。
步骤4.1-(3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁基)乙酮
在氮气下，缓慢地将3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基-N-甲氧基-N-甲基环丁烷甲酰胺(0.7g，0.002mol)在***(10mL)中的溶液添加到甲基碘化镁在***(3mL)中的3.0M溶液中。将反应进行搅拌，并加热到回流，保持2小时。该混合物用冰猝灭，分离醚层。水层用1N HCl酸化，并用***萃取几次。将有机层合并，用MgSO4干燥，浓缩，用Combiflash提纯(硅胶，0-30％EtOAc／Hex)，得到无色油状的所需产物(0.6g)。LCMSC22H29O2Si(M+H)+计算值：353.2；实测值：353.3。
步骤5.3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁基乙酸酯
在搅拌下，在0℃下，向1-(3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁基)乙酮(0.65g，0.0018mol)在二氯甲烷(10mL)中的搅拌溶液中添加碳酸氢钠(0.39g，0.0046mol)和间氯过苯甲酸(1.0g，0.0046mol)。将该反应在室温下搅拌过夜。LCMS显示不完全反应，添加另外2.5当量的间氯过苯甲酸和NaHCO3，并将该反应搅拌另外一天。反应用20％Na2S2O3水溶液(50mL)猝灭，并在室温下搅拌另外30分钟，然后用二氯甲烷萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，浓缩，用Combiflash(硅胶，0-10％EtOAc／Hex)提纯，得到无色油状的所需产物(0.3g，40％)。LCMSC22H29O3Si(M+H)+计算值：369.2；实测值：369.4。
步骤6.3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁醇
向3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁基乙酸酯(0.27g，0.00073mol)在THF(5mL)和MeOH(3mL)中的溶液中添加1.0M的氢氧化锂水溶液(10mL)。将反应在室温下搅拌1小时。该混合物用水猝灭，再用EtOAc萃取。合并的有机层用MgSO4干燥，再浓缩，获得无色油状的粗醇产物(0.3g)，其不用进一步提纯在下一步中直接使用。LCMSC20H26O2NaSi(M+Na)+计算值：349.2；实测值：349.3。
步骤7.3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁酮
在氮气下，将草酰氯(0.1mL，0.001mol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液冷却到-78℃。滴加二甲亚砜(0.2mL，0.002mol)。在添加完之后，将反应搅拌15分钟。滴加粗3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁醇(0.2g，0.0006mol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液，并在-78℃下将该反应混合物搅拌45分钟。滴加三乙胺(0.5mL，0.004mol)，并将反应搅拌15分钟。然后使反应升温至室温，用水猝灭，用二氯甲烷萃取。将有机层合并，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，再蒸发，获得黄色油状的粗酮(0.27g)，其不用进一步提纯在下一步中直接使用。LCMS C20H25O2Si(M+H)+计算值：325.12；实测值：325.3。
步骤8.(3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁亚基)乙腈
在0℃下，向1.0M的叔丁醇钾在四氢呋喃(1.2mL)中的溶液滴加氰甲基膦酸二乙酯(0.19mL，0.0012mol)。将该反应加热至室温，30分钟之后再次冷却至0℃。向该反应混合物中添加3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环丁酮(0.25g，0.00077mol)在THF(5mL)中的溶液。将该反应逐渐加热至室温，并在室温下搅拌2小时。该反应用饱和NH4Cl水溶液猝灭，然后用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩。所形成的残留物用Combiflash(硅胶，0-20％EtOAc／Hex)提纯，获得无色油状的所需产物(0.2g)。LCMS C22H26NOSi(M+H)+计算值：348.1实测值：348.3。
步骤9.{3-羟基-1-[4-(1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基}乙腈
将(3-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基丁亚基)乙腈(0.15g，0.00043mol)与4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.14g，0.00043mol)在乙腈(5mL)中合并，并在氮气下添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.064mL，0.00043mol)。将该混合物加热至50℃过夜。LCMS显示了具有m／z为425.4的峰，表明在迈克尔加成过程中同时发生了脱甲硅烷基反应。将反应浓缩，用combiflash(硅胶，0-100％EtOAc／Hex)提纯，获得所需产物。LCMS(M+H)425.4。
步骤10.3-羟基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
将3-羟基-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.020g，0.000046mol)用三氟乙酸(0.5mL，0.006mol)在室温下处理30分钟，再蒸干。所形成的残留物与乙二胺(0.2mL，0.003mol)在MeOH(1mL)中混合2小时。将反应浓缩，用制备型LCMS(pH＝10)提纯，获得所需产物的两种异构体。第一峰保留时间0.714分钟，LCMS C15H15N6O(M+H)+计算值：295.1；实测值：295.3。第二峰保留时间0.750分钟，LCMS C15H15N6O(M+H)+计算值：295.1；实测值：295.3。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.67(1H，s)，8.66(1H，s)，8.38(1H，s)，7.51(1H，d，J=3.6Hz)，6.98(1H，d，J=3.6Hz)，4.37(1H，s)，3.34(2H，s)，3.22(2H，m)，2.48(2H，m)ppm。
实施例57.3-氟-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
Figure BDA0000457047210001241
装有氮气导入管和搅拌棒的特氟隆瓶内含有的3-羟基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.01g，0.00003mol)(顺式／反式异构体的混合物)在二氯甲烷(3mL)中的溶液用2-甲氧基-N-(2-甲氧基乙基)-N-(三氟-λ(4)-硫基)乙胺(0.03mL，0.0002mol)在室温下处理。添加乙醇(0.002mL，0.00003mol)，并将该混合物在室温下搅拌整个周末。将该反应蒸干，残留物用制备型HPLC(pH=10)提纯，获得两种异构体的混合物。LCMS C15H14FN6(M+H)+计算值：297.1；实测值：297.3。
实施例58.3-甲基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
Figure BDA0000457047210001242
步骤1.3-(溴甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
向3-(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(1.0g，0.0023mol)和四溴化碳(1.1g，0.0034mol)在DMF(7mL)中的冰冷却的混合物中添加三苯基膦(0.90g，0.0034mol)，并将该混合物在该温度下搅拌30分钟。向所得暗褐色溶液中先后添加饱和NaHCO3水溶液(5mL)和水(5mL)，该混合物用二氯甲烷萃取。将有机层合并，用水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，用combiflash(硅胶，0-40％EtOAc／Hex)提纯，得到作为浅黄色固体的所需产物(1.0g，87％)。LCMS C22H30BrN6OSi(M+H)+计算值：501.1：实测值：501.3。
步骤2.3-甲基-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
让3-(溴甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.65g，0.0013mol)与四氢硼酸钠(0.096g，0.0026mol)在DMF(5.2mL)(～0.5M)中在室温和氮气下反应3小时。用水猝灭该反应，用二氯甲烷萃取。有机层用水、盐水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩，获得黄色油，即作为顺式和反式异构体混合物的所需产物。LCMS C22H31N6OSi(M+H)+计算值：423.2；实测值：423.4。
步骤3.3-甲基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
向3-甲基-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.5g，0.001mol)在乙腈(8.07mL，0.154mol)和水(0.70mL，0.039mol)中的混合物中添加四氟硼酸锂(1.10g，0.0114mol)。将该溶液加热，在100℃下回流5天。在室温下经5分钟分批添加7.2M的氢氧化铵水溶液(0.59mL)，将pH调节到9-10。将该混合物在室温下搅拌2小时。将反应过滤，用乙腈、水和MeOH稀释，用制备型HPLC提纯(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)，得到保留时间为1.057分钟的第一种异构体，LCMSC16H17N6(M+H)+计算值：293.2；实测值：293.3。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ10.07(1H，br s)，8.88(1H，s)，8.45(1H，s)，8.34(1H，s)，7.43(1H，d，J=3.5Hz)，6.85(1H，d，J=3.5Hz)，3.16(2H，s)，2.77(2H，m)，2.55(1H，m)，2.43(2H，m)，1.24(3H，d，J=6.5Hz)ppm；然后是保留时间为1.107分钟的第二异构体；LCMS C16H17N6(M+H)+计算值：293.2；实测值：293.3。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ10.21(1H，br s)，8.89(1H，s)，8.61(1H，s)，8.37(1H，s)，7.44(1H，d，J=3.5Hz)，6.86(1H，d，J=3.5Hz)，3.07(2H，s)，3.05(2H，m)，2.61(1H，m)，2.26(2H，m)，1.25(3H，d，J=7.0Hz)ppm。
实施例59.3，3-二甲基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
Figure BDA0000457047210001261
步骤1.3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，1-二基双(亚甲基)二甲烷磺酸酯。
向3，3-双(羟甲基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.06g，0.0001mol)和三乙胺(0.1mL，0.0008mol)在二氯甲烷(3mL)中的混合物中缓慢地添加甲烷磺酰氯(0.03mL，0.0004mol)。将所形成的混合物在室温下搅拌30分钟。该反应用二氯甲烷稀释，用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩。该残留物上Combiflash(硅胶，0-100％EtOAc／Hex)提纯，得到白色固体状的所需产物(60mg，75％)。LCMS C25H37N6O7S2Si(M+H)+计算值：625.2；实测值：625.3。
步骤2.3，3-二甲基-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈
让3-(氰基甲基)-3-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁烷-1，1-二基双(亚甲基)二甲烷磺酸酯(0.06g，0.0001mol)与四氢硼酸钠(0.02g，0.0004mol)在DMF(0.8mL)(～0.5M)中在65℃和氮气下反应2小时。用水猝灭该反应，再用二氯甲烷萃取。有机层用水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩。残留物用Combiflash(硅胶，0-60％EtOAc／Hex)提纯，得到该所需产物。LCMSC23H33N6OSi(M+H)+计算值：437.2；实测值：437.4。
步骤3.3，3-二甲基-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
3，3-二甲基-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.020g，0.000046mol)用三氟乙酸(0.5mL，0.006mol)在室温下处理30分钟，然后蒸干。该残留物然后与乙二胺(0.2mL，0.003mol)在MeOH(1mL)中振荡2小时。将该反应浓缩，用制备型HPLC(XBridge C18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)提纯，获得所需产物。LCMS C17H19N6(M+H)+计算值：307.2；实测值：307.3。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，br s)，8.76(1H，s)，8.67(1H，s)，8.40(1H，s)，7.58(1H，d，J=3.6Hz)，7.05(1H，d，J=3.6Hz)，3.35(2H，s)，2.75(2H，d，J=14Hz)，2.33(2H，d，J=14.0Hz)，1.22(3H，s)，1.02(3H，s)ppm。
实施例60.顺式和反式3-(苄氧基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
Figure BDA0000457047210001271
步骤1.[2-溴-1-(溴甲基)乙氧基]甲苯
将1-溴-2，3-环氧丙烷(28mL，0.33mol)和苄基溴(39mL，0.33mol)与氯化汞(II)(0.04g，0.0002mol)混合。将该混合物缓慢加热至155-160℃，并搅拌过夜。然后将该反应混合物冷却到室温，用Combiflash(硅胶，100％己烷)提纯，得到透明油状的所需产物(63g，62％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.40(5H，m)，4.71(2H，s)，3.82(1H，t，J=4.8Hz)，3.60(4H，d，J=4.8Hz)ppm。
步骤2.([3-(甲基亚磺酰基)-3-(甲硫基)环丁基]氧基甲基)苯。
在-10℃下，将2.5M的正丁基锂在己烷(19mL)中的溶液滴加到(甲基亚磺酰基)(甲硫基)甲烷(5.0g，0.040mol)在THF(10mL)中的溶液中，并将该混合物搅拌3小时。在-70℃下，经30分钟向所得溶液中滴加[2-溴-1-(溴甲基)乙氧基]甲苯(4.9g，0.016mol)。将该混合物在该温度下搅拌3小时，然后在室温下搅拌过夜。该反应用二氯甲烷稀释，再用水洗涤。该水相用二氯甲烷萃取。将有机层合并，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，用Combiflash(硅胶，0-55％EtOAc／Hex)提纯，得到棕色油状的所需产物(2.4g，56％)。LCMS(M+Na)293.3。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.30(5H，m)，4.45(2H，s)，4.33(1H，m)，2.75(2H，m)，2.65(2H，m)，2.41(3H，s)，2.12(3H，s)ppm。
步骤3.3-(苄氧基)环丁酮。
将([3-(甲基亚磺酰基)-3-(甲硫基)环丁基]氧基甲基)苯(2.4g，0.0089mol)溶于Et2O(40mL)，再添加35％高氯酸(1.8mL)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。向该反应混合物中添加固体NaHCO3和MgSO4，并搅拌片刻。滤出该不溶性固体。将该滤液浓缩，再用combiflash(硅胶，100％二氯甲烷)提纯，得到作为浅黄色油的所需产物(0.7g)。LCMSC11H13O2(M+H)+计算值：177.1，实测值：177.3。
步骤4.[3-(苄氧基)环丁亚基]乙腈。
在0℃下，向1.0000M的叔丁醇钾在四氢呋喃(0.68mL)中的溶液和THF(5mL)的混合物中滴加氰甲基膦酸二乙酯(0.11mL，0.00068mol)。将该反应加热至室温，30分钟之后再次冷却至0℃。向该反应混合物中添加3-(苄氧基)环丁酮(0.1g，0.0006mol)在THF(5mL)中的溶液。将该反应搅拌过夜，使其升温至室温。该反应用饱和NH4Cl水溶液猝灭，再用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥，再浓缩至干燥。该粗产物在下一步中直接使用，不用进一步提纯。
步骤5.3-(苄氧基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
在氮气下，向[3-(苄氧基)环丁亚基]乙腈(0.1g，0.0005mol)和4-(1H-吡唑-4-基)-7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.1g，0.0003mol)在乙腈(5mL)中的混合物中添加1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.05mL，0.0003mol)。将该混合物在50℃下加热过夜，然后在减压下浓缩。该残留物用combiflash(硅胶，0-55％EtOAc／Hex)提纯，获得作为顺式和反式异构体混合物的所需产物。LCMSC28H35N6O2Si(M+H)+计算值：515.3；实测值：515.4。
步骤6.3-(苄氧基)-1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈。
3-(苄氧基)-1-[4-(7-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁基乙腈(0.024g，0.000046mol)用三氟乙酸(0.5mL，0.006mol)在室温下处理30分钟，然后蒸干。将该残留物溶于MeOH(1mL)中，并用乙二胺(0.2mL，0.003mol)在室温下处理2小时。该反应混合物进行真空浓缩，所得残留物用制备型HPLC(XBridgeC18柱，用含有0.15％NH4OH的乙腈／水的梯度洗脱)提纯，获得所需产物的两种异构体。第一峰保留时间1.406分钟；LCMS C22H21N6O(M+H)+计算值：385.2；实测值：385.3。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，brs)，8.71(1H，s)，8.67(1H，s)，8.38(1H，s)，7.58(1H，d，J=3.6Hz)，7.33(4H，m)，7.29(1H，m)，7.05(1H，d，J＝3.6Hz)，4.43(2H，s)，4.23(1H，m)，3.43(2H，s)，2.78(2H，m)，2.74(2H，m)ppm。第二峰保留时间1.474分钟，LCMS C22H21N6O(M+H)+计算值：385.2；实测值：3853。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.10(1H，br s)，8.79(1H，s)，8.67(1H，s)，8.39(1H，s)，7.59(1H，d，J＝3.6Hz)，7.34(4H，m)，7.29(1H，m)，7.06(1H，d，J=3.6Hz)，4.44(2H，s)，4.14(1H，m)，3.44(2H，s)，3.16(2H，m)，2.44(2H，m)ppm。
实施例61.1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈磷酸盐的大规模制备
Figure BDA0000457047210001301
步骤1.3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2)。
将氰甲基膦酸二乙酯(745g，4.20mol，1.20当量)和无水THF(9L)加入到装有热电偶套管、加料漏斗和氮气保护管的四颈烧瓶内。该溶液用冰-甲醇浴冷却到-14℃，并经20分钟添加t-BuOK在THF(3.85L，3.85mol，1.1当量)中的1.0M溶液，保持温度<-5℃。将该混合物在-10℃下搅拌3小时，在保持反应温度<-5℃的同时，经2小时添加1-叔丁氧基羰基-3-氮杂环丁酮(1，600g，3.50mol)在THF(2L)中的溶液。将该反应混合物在-5℃到-10℃下搅拌1小时，然后缓慢地升温至室温，并在室温下搅拌过夜。该反应混合物然后用水(4.5L)和饱和盐水(4.5L)稀释，再用乙酸乙酯(2×9L)萃取。将有机层合并，用盐水(6L)洗涤，再用无水Na2SO4干燥。将该有机溶剂在减压下除去，用二氯甲烷(4L)稀释，再吸附到硅胶(1.5kg)上。该产物通过快速柱色谱法提纯(SiO2，3.5kg×2)，各柱用(8L的庚烷，8L的5％AcOEt／庚烷，12L的10％AcOEt／庚烷，40L的25％AcOEt／庚烷)洗脱，得到白色固体状的纯3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2，414.7g，679.8g理论，61％收率)。2：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.46(s，9H)，4.62(m，2H)，4.72(m，2H)，5.41(m，1H)。
步骤2.2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(4)。
3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2，1000g，5.2mol)用乙腈(7L)和3N HCl水溶液(7L)稀释。将该所得反应混合物在室温下搅拌18小时。当TLC显示反应被认为完全时，将该反应混合物在减压下浓缩。然后将残留固体悬浮于乙腈(12L)中，并冷却至5℃。在保持温度<15℃的同时，将二异丙基乙基胺(2.7L，14.6mol，3当量)缓慢加入到该悬浮液中。将该均匀溶液冷却至5℃，经1小时添加乙烷磺酰氯(730mL，7.73mol，1.5当量)，同时保持反应温度<15℃。将所得溶液缓慢升温至室温，并在室温下搅拌过夜。添加附加量的乙烷磺酰氯(100mL，1.05mol，0.2当量)，并将该反应混合物在室温下搅拌另外2小时。在认为反应完成后，将反应混合物在减压下浓缩至大约4L的体积。然后将该溶液投入到50L分液漏斗中，用二氯甲烷(10L)稀释，再用半饱和的盐水(10L)洗涤。水相用二氯甲烷(5L)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，再在减压下吸附到硅胶(1Kg)上。然后将该材料装载到硅胶柱(2.5Kg)上，用20％乙酸乙酯／庚烷(40L)、40％乙酸乙酯／庚烷(80L)和最后60％乙酸乙酯／庚烷(40L)洗脱，获得灰白色固体状的纯2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(4，567g，968.4g理论，58.6％收率)。4：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.38(t，3H)，3.05(q，2H)，4.72(m，2H)，4.79(m，2H)，5.41(m，1H)；MS：m／z计算值：187.05；实测值：187.1。
步骤3.2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(4)和2-(3-氯-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(4B)。
将3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2，82g，0.42mol)加入到THF(850mL)中，将所得溶液冷却至0℃，然后在保持温度<5℃的同时，经1小时添加在1，4-二烷(850mL，3.38mol，8.0当量)中的4MHCl溶液。将所得反应混合物缓慢地升温至室温，并在室温下搅拌18小时。当反应被认为完全时，将该反应混合物在减压下浓缩，并将该残留物置于高真空下另外3小时，然后用THF(900mL)和二异丙基乙胺(183mL，1.06mol，2.5当量)在室温下处理。然后将所得溶液冷却至0℃，在保持反应温度<5℃的同时，添加乙烷磺酰氯(56mL，0.59mol，1.4当量)。移走冰浴，将反应在室温下搅拌18小时。当TLC指示反应完全时，反应混合物用乙酸乙酯(1L)稀释，再用饱和盐水(1L)洗涤。水层用乙酸乙酯(2×500mL)萃取。用硫酸钠将合并的有机层干燥，并在减压下浓缩。该残留物用二氯甲烷稀释，再吸收到硅胶(150g)上。该混合物通过柱色谱法(1.5Kg硅胶)提纯，用庚烷(4L)、10％EtOAc／庚烷(4L)、20％EtOAc／庚烷(8L)、30％EtOAc／庚烷(12L)和最后40％EtOAc／庚烷(12L)洗脱，获得灰白色固体状的2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(4)和2-(3-氯-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(4B)(58.1g，68％收率)，其被发现是化合物4和4B的大约1比1的混合物。4：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.38(t，3H)，3.05(q，2H)，4.72(m，2H)，4.79(m，2H)，5.41(m，1H)；MS：m/z计算值：187.05；实测值：187.1。4B：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.38(t，3H)，3.05(q，2H)，3.1(s，2H)，4.15(d，2H)，4.37(d，2H)；MS：m/z计算值：222.9；实测值：222.9。
步骤4.2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(6)。
在室温下，经30分钟向作为大约1比1混合物的由前述反应获得的2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(4)和2-(3-氯-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(4B)(4和4B，184g，919mmol，1.2当量)和4-(1H-吡唑-4-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(5，241g，766mmol)在乙腈(6L)中的溶液中滴加DBU(137mL，919mmol，1.2当量)。将所得反应混合物在室温下搅拌过夜。当反应被认为完全时，在减压下除去溶剂。在40℃下将所得固体溶于6L的乙酸乙酯和2L的乙腈中，该溶液用盐水(3L)和水(1L)的混合物洗涤。水层用乙酸乙酯(3×1.6L)萃取。合并的有机层用盐水(1.6L)洗涤，并在减压下除去溶剂。将甲苯(2L)加入到该残留物中，在减压下重复共沸蒸馏。该残留物与MTBE(1.5L，甲基叔丁基醚)一起研磨，通过过滤收集固体。在50℃下将该棕色固体完全溶解在乙酸乙酯(3L)中，然后用活性炭(30g)和硅胶(30g)处理该溶液。将所得混合物在45℃下搅拌1小时，然后通过赛力特硅藻土趁热过滤。在减压下除去溶剂，该残留物与MTBE(3L)一起研磨。通过过滤收集固体，再用MTBE(1L)洗涤。然后在70℃下将固体完全地溶于异丙醇(8.8L)中，并且在搅拌下将该所得溶液逐渐地冷却到室温过夜。通过过滤收集固体，用异丙醇(1.3L)和庚烷(2×490mL)洗涤，并且在烘箱中干燥过夜，获得灰白色固体状的2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(6，327g，384.3g理论，85％收率)。6：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.00(s，9H)，0.99(m，2H)，1.49(t，3H)，3.15(q，2H)，3.49(s，2H)，3.60(m，2H)，4.30(d，2H)，4.70(d，2H)，5.76(s，2H)，6.83(s，1H)，7.50(s，1H)，8.40(s，1H)，8.50(s，1H)，8.90(s，1H)；MS：m/z计算值：502.20；实测值：502.3。
步骤5.2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(7)。
向2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(6，327g，655mmol)在乙腈(3L)和水(300mL)中的溶液添加LiBF4(614g，6.55mol，10.0当量)。将所得反应混合物在75℃下搅拌过夜。将该反应混合物冷却至0℃，然后缓慢添加氢氧化铵(NH4OH，570mL)在水(2.2L)中的溶液，以保持温度在10℃以下(pH9-10)。将该混合物在室温下搅拌过夜。当反应被认为完全时，添加水(10L)，并将所得混合物在室温下强力搅拌3小时。通过过滤收集固体，用水(6.7L)和庚烷(6.7L)洗涤，在45℃下在真空烘箱中干燥整个周末。然后将该干燥的固体溶于MeOH的20％二氯甲烷溶液(12L)中，通过柱色谱法上1.3Kg的硅胶提纯，用20％MeOH在二氯甲烷中的溶液(18L)洗脱，获得灰白色固体状的2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(7，204g，243.3g理论，83.8％收率)。7：1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ1.25(t，3H)，3.25(q，2H)，3.75(s，2H)，4.25(d，2H)，4.65(d，2H)，7.10(d，1H)，7.65(dd，1H)，8.50(s，1H)，8.70(s，1H)，8.95(s，1H)，12.2(bs，1H)；MS：m/z计算值：372.12；实测值：372.0。
步骤6.2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈磷酸盐。
在70℃下，经30分钟向2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(7，204g，550mmol)在乙腈(5.1L)和乙醇(1.6L)中的溶液中缓慢地添加磷酸(67.4g，688mmol，1.25当量)在乙醇(800mL)中的溶液。将所得反应混合物在70℃下搅拌2小时，然后在搅拌下逐渐冷却至室温过夜。通过过滤来收集固体，用乙腈(160mL)洗涤，在真空烘箱中在45℃下干燥，获得白色固体状的2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈磷酸盐(240g，258.2g理论，93％收率)。最终产物：1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ1.25(t，3H)，3.25(q，2H)，3.75(s，2H)，4.20(d，2H)，4.61(d，2H)，7.10(d，1H)，7.60(dd，1H)，8.50(s，1H)，8.70(s，1H)，8.95(s，1H)，12.2(bs，1H)；MS：m/z计算值：372.12；实测值：372.0。
实施例62.4-氯-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(3)。
在室温下，向装有氮气导入管、加料漏斗、热电偶套管和机械搅拌器的烧瓶内添加4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(1，600g，3.91mol)和N,N-二甲基乙酰胺(DMAC，9.6L)。将该混合物在冰／盐水浴中冷却至0-5℃，之后在0-5℃分批添加固体氢化钠(NaH，60wt％，174g，4.35mol，1.1当量)。该反应混合物在15分钟的过程中变成深色溶液。然后以内部反应温度不超过5℃的速率，经由加料漏斗缓慢添加三甲基甲硅烷基乙氧基甲基氯(2，SEM-Cl，763mL，4.31mol，1.1当量)。然后将该反应混合物在0-5℃下搅拌30分钟。当通过TLC和HPLC确定反应完全时，用水(1L)将该反应混合物猝灭。该混合物然后用水(12L)和MTBE(8L)稀释。将两层分离，水层用MTBE(8L)萃取。合并的有机层用水(2×4L)和盐水(4L)洗涤，再用硫酸钠(Na2SO4)干燥。在减压下除去溶剂。然后将该残留物溶于庚烷(2L)中，过滤，加载到硅胶(SiO2，3.5Kg)柱中，先后用庚烷(6L)、95％庚烷／乙酸乙酯(12L)，90％庚烷／乙酸乙酯(10L)和80％庚烷／乙酸乙酯(10L)洗脱。将含有纯的所需产物的级分合并，在减压下浓缩，获得浅黄色油状的4-氯-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(3，987g，1109.8g理论，88.9％收率)，其在室温下静置时部分固化成油状固体。3：1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ8.67(s，1H)，7.87(d，1H，J=3.8Hz)，6.71(d，1H，J=3.6Hz)，5.63(s，2H)，3.50(t，2H，J=7.9Hz)，0.80(t，2H，J=8.1Hz)，1.24(s，9H)ppm；13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ151.3，150.8，150.7，131.5，116.9，99.3，72.9，65.8，17.1，-1.48ppm；C12H18ClN3OSi(MW283.83)，LCMS(EI)m／e284／286(M++H).
实施例63.4-(1H-吡唑-4-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(5)。
在室温下，向装有架顶搅拌器、冷凝器、热电偶套管和氮气导入管的反应器中添加水(H2O，9.0L)、固体碳酸钾(K2CO3，4461g，32.28mol，2.42当量)、4-氯-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(3，3597g，12.67mol)、1-(1-乙氧基乙基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(4，3550g，13.34mol，1.05当量)和1-丁醇(27L)。将所得反应混合物脱气三次，每次用氮气回填充，然后用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4，46g，0.040mol，0.003当量)在室温下处理。将所得反应混合物加热至温和回流(约90℃)，保持1-4小时。当通过HPLC确定反应完全时，将该反应混合物逐渐地冷却至室温，然后用赛力特硅藻土床过滤。用乙酸乙酯(2×2L)洗涤赛力特硅藻土床，然后将滤液和洗涤液合并。将两层分离，水层用乙酸乙酯(12L)萃取。将合并的有机层在减压下浓缩，以除去溶剂，且粗4-(1-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(6)不用进一步提纯而与四氢呋喃(THF，4.2L)一起重新直接加回到反应器中，用于后续的酸促进的脱保护反应。
在室温下，向反应器内的如上所述制备的粗4-(1-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(6)在四氢呋喃(THF，4.2L)中的悬浮液中添加水(H2O，20.8L)以及10％HCl水溶液(16.2L，45.89mol，3.44当量)。将所得反应混合物在16-30℃下搅拌2-5小时。当通过HPLC分析认为反应完全时，该反应混合物在室温下用30％氢氧化钠(NaOH)水溶液(4L，50.42mol，3.78当量)处理。将所得反应混合物在室温下搅拌1-2小时。通过过滤收集固体，并用水(2×5L)洗涤。将湿滤饼与乙腈(21.6L)重新加入到反应器中，再将所得悬浮液加热至缓和回流，保持1-2小时。然后在搅拌下将该透明溶液逐渐冷却至室温，在冷却下从溶液中沉淀出固体。将该混合物在室温下搅拌另外1-2小时。通过过滤收集固体，用乙腈(2×3.5L)洗涤，并且在烘箱内在45-55℃和减压下干燥至恒重，获得白色结晶固体状的4-(1H-吡唑-4-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(5，3281.7g，3996.8g理论，82.1％收率)(99.5面积％，根据HPLC)。5：1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.41(br.s，1H)，8.74(s，1H)，8.67(br.s，1H)，8.35(br.s，1H)，7.72(d，1H，J=3.7Hz)，7.10(d，1H，J=3.7Hz)，5.61(s，2H)，3.51(t，2H，J=8.2Hz)，0.81(t，2H，J=8.2Hz)，0.13(s，9H)ppm；C15H21N5OSi(MW，315.45)，LCMS(EI)m／e316(M++H)。
实施例64.1-二苯甲基氮杂环丁烷-3-醇盐酸盐(23)。
在室温下，将二苯甲胺(21，2737g，15.0mol，1.04当量)在甲醇(MeOH，6L)中的溶液用来自加料漏斗的2-(氯甲基)环氧乙烷(22，1330g，14.5mol)处理。在初始添加过程中，注意到轻微的吸热。将所得反应混合物在室温下搅拌3天，然后加热至回流，保持另外3天。当TLC显示该反应被认为完全时，首先将该反应混合物冷却至室温，然后在冰浴中冷却至0-5℃。通过过滤收集固体，用丙酮(4L)洗涤，获得第一次收获的所需粗产物(23，1516g)。将该滤液在减压下浓缩，所得半固体用丙酮(1L)稀释。该固体然后通过过滤来收集，获得第二次收获的所需粗产物(23，221g)。发现该粗产物1-二苯甲基氮杂环丁烷-3-醇盐酸盐(23，1737g，3998.7g理论，43.4％收率)是足够纯的，不用进一步提纯在后续反应中直接使用。23：1HNMR(DMSO-d6，300MHz)，δ12.28(br.d，1H)，7.7(m，5H)，7.49(m，5H)，6.38(d，1H)，4.72(br.s，1H)，4.46(m，1H)，4.12(m，2H)，3.85(m，2H)ppm；C16H18ClNO(23的游离碱，C16H17NO MW，239.31)，LCMS(EI)m／e240(M++H)。
实施例65.3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(24)。
将1-二苯甲基氮杂环丁烷-3-醇盐酸盐(23，625g，2.27mol)在10％碳酸钠水溶液(Na2CO3，5L)和二氯甲烷(CH2Cl2，5L)中的悬浮液在室温下搅拌，直至所有固体溶解为止。将两层分离，水层用二氯甲烷(CH2Cl2，2L)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠(Na2SO4)干燥，并在减压下浓缩。然后将该所形成的23的粗游离碱溶于THF(6L)中，再将该溶液投入到大型Parr高压釜中。将二碳酸二叔丁酯(BOC2O，545g，2.5mol，1.1当量)和20％钯(Pd)／碳(125g，50％湿)加入到Parr高压釜中。用氢气(H2)将该容器加压至30psi，并在稳定的氢气氛下(容器再填充三次以保持压力在30psi)在室温下搅拌18小时。当HPLC显示反应完全(当不再有氢被吸收时)时，通过赛力特硅藻土垫将该反应混合物过滤，再用THF(4L)洗涤赛力特硅藻土垫。将该滤液在减压下浓缩，以除去溶剂，将残留物加载到具有最低量二氯甲烷(CH2Cl2)的Biotage150柱上。该柱用20-50％乙酸乙酯／庚烷洗脱，将含有纯的所需产物(24)的级分收集和合并。在减压下除去溶剂，获得无色油状的3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(24，357g，393.2g理论，90.8％收率)，其在室温下在真空中静置时固化。24：1HNMR(CDCl3，300MHz)，δ4.56(m1H)，4.13(m，2H)，3.81(m，2H)，1.43(s，9H)ppm。
实施例66.3-氮杂环丁酮-1-甲酸叔丁酯(7)。
将3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(24，50g，289mmol)在乙酸乙酯(400mL)中的溶液冷却到0℃。然后将所得溶液用固体TEMPO(0.5g，3.2mmol，0.011当量)和溴化钾(KBr，3.9g，33.2mmol，0.115当量)的水溶液(60mL)在0-5℃下处理。在将反应温度保持在0-5℃之间的同时，添加饱和碳酸氢钠水溶液(NaHCO3，450mL)和次氯酸钠水溶液(NaClO，10-13％有效氯，450mL)。一旦添加次氯酸钠溶液，反应混合物的颜色立即变化。当添加附加量的次氯酸钠溶液时，反应混合物的颜色逐渐褪去。当TLC显示所有起始原料被消耗时，反应混合物的颜色不再变化。该反应混合物然后用乙酸乙酯(EtOAc，500mL)稀释，分离为两层。有机层用水(500mL)和饱和氯化钠水溶液(500mL)洗涤，用硫酸钠(Na2SO4)干燥。然后，将溶剂在减压下除去，得到粗产物3-氮杂环丁酮-1-甲酸叔丁酯(7，48g，49.47g理论，97％收率)，发现其是足够纯的，不用进一步提纯而在后续反应中直接使用。粗产物7：1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ4.65(s，4H)，1.42(s，9H)ppm。
实施例67.3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(9)。
在室温下，将氰甲基膦酸二乙酯(8，745g，4.20mol，1.20当量)和无水四氢呋喃(THF，9L)加入到装有热电偶套管、加料漏斗和氮气保护管的四颈烧瓶中。该溶液用冰-甲醇浴冷却至到-14℃，在将反应温度保持在-5℃以下的同时，经20分钟添加叔丁醇钾(t-BuOK)在无水四氢呋喃(THF，3.85L，3.85mol，1.1当量)中的1.0M溶液。将所得反应混合物在-10℃下搅拌3小时，并且在将内部温度保持在-5℃以下的同时，经2小时添加1-叔丁氧基羰基-3-氮杂环丁酮(7，600g，3.50mol)在无水四氢呋喃(THF，2L)中的溶液。将该反应混合物在-5℃到-10℃下搅拌1小时，然后缓慢地升温至室温，并在室温下搅拌过夜。然后将该反应混合物用水(4.5L)和饱和氯化钠水溶液(NaCl，4.5L)稀释，再用乙酸乙酯(EtOAc，2×9L)萃取。合并的有机层用盐水(6L)洗涤，再用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥。在减压下除去有机溶剂，残留物用二氯甲烷(CH2Cl2，4L)稀释，然后吸收到硅胶(SiO2，1.5Kg)上。吸收到硅胶上的该粗产物通过快速柱色谱法提纯(SiO2，3.5Kg，0-25％EtOAc／己烷梯度洗脱)，获得白色固体状的3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(9，414.7g，679.8g理论，61％收率)。9：1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ5.40(m，1H)，4.70(m，2H)，4.61(m，2H)，1.46(s，9H)ppm；C10H14N2O2(MW，194.23)，LCMS(EI)m／e217(M++Na)。
Figure BDA0000457047210001391
实施例68.2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(11)。
将3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(9，1000g，5.2mol)在乙腈(7L)和3N HCl水溶液(7L)中的溶液在室温下搅拌18小时。当HPLC显示所有起始原料(9)被消耗时，将该反应混合物在减压下浓缩至干燥。然后，将含有粗的所需脱保护产物(10)的残留物悬浮在乙腈(12L)中，再将所得悬浮液冷却到0-5℃。然后，在将内部温度保持在5℃以下的同时，缓慢添加二异丙基乙胺(DIEA，3.14L，18.03mol，3.5当量)。将所得均匀的溶液冷却至0℃，并在保持内部温度在5℃以下的同时，经1小时添加乙烷磺酰氯(EtSO2Cl，730mL，7.73mol，1.5当量)。将所得反应混合物逐渐升温至室温，并在室温下搅拌过夜。当HPLC显示反应完全时，将该反应混合物在减压下浓缩至大约2L的体积。设定旋转蒸发器的浴温度不超过45℃。然后将该浓缩残留物用二氯甲烷(CH2Cl2，10L)稀释，所得二氯甲烷溶液用氯化钠水溶液(10L)洗涤。水相用二氯甲烷(CH2Cl2，5L)反萃取。合并的有机层用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，残留物在减压下吸收到硅胶(SiO2，1Kg)上。设定旋转蒸发器的浴温度不超过45℃。然后将该材料加载到硅胶柱(SiO2，2.5kg)上，用20-60％乙酸乙酯／庚烷洗脱，获得灰白色固体状的2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(11，882g，968.4g理论，91％收率)。11：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ5.46(m，1H)，4.77(m，2H)，4.70(m，2H)，3.05(q，2H)，1.39(t，3H)ppm；C7H10N2O2S(MW，186.23)，LCMS(EI)m／e187(M++H)。
实施例69.2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(12)。
方法A.向4-(1H-吡唑-4-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(5，440g，1.395mol)和2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(11，312.4g，1.68mol，1.2当量)在乙腈(4.4L)中的悬浮液中滴加DBU(249.8mL，1.67mol，1.2当量)，以保持反应温度在15-25℃之间。在添加DBU后，反应混合物变得均匀，但在30分钟后出现沉淀。将反应混合物在室温下搅拌3小时。当HPLC显示反应被认为完全时，该反应混合物用水(11L)猝灭。将所得混合物在室温下搅拌另外30分钟，然后过滤。固体滤饼用水(4L)、MTBE(2L)洗涤，在真空烘箱中在35℃下干燥24小时，获得白色固体状的粗2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(12，681g，699.8g理论，97.3％收率)，发现其对于后续反应来说是足够纯的，无需进一步提纯。12：1HNMR(CDCl3，300MHz)，δ8.86(s，1H)，8.45(s，1H)，8.35(s，1H)，7.43(d，1H)，6.80(d，1H)，5.68(s，2H)，4.65(d，2H)，4.27(d，2H)，3.55(s，2H)，3.4(t，2H)，3.07(m，2H)，1.42(m，3H)，0.92(m，2H)，-0.05(s，9H)ppm；C22H31N7O3SSi(MW，501.68)，LCMS(EI)m／e502(M++H)。
Figure BDA0000457047210001411
实施例70.2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(14)。
方法A.在室温下，向2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(12，400g，797mmol)在乙腈(3.6L)和水(360mL)中的溶液添加固体四氟硼酸锂(LiBF4，747.5g，7.97mol，10.0当量)。将该所得反应混合物加热至80℃，并在80℃下搅拌过夜。当HPLC显示脱保护的第一阶段完全(其获得了相应的羟甲基中间体13)时，将该反应混合物逐渐冷却至室温，随后冷却至0℃。将氢氧化铵(28-30％NH4OH水溶液，680mL)在水(2.7L)中的溶液缓慢添加到该反应混合物中，以便将pH调节至9-10，同时保持内部温度在10℃以下。将所得混合物在室温下搅拌过夜。当HPLC显示脱保护的第二阶段完全时，将该反应混合物加入到水(10L)中，并且将所得混合物在室温下强力地搅拌3小时。通过过滤来收集固体，用水(8L)和庚烷(8L)洗涤，并且在对流烘箱内在35℃下干燥整个周末。将该干燥的固体溶于MeOH在二氯甲烷(16L)中的20％溶液中，然后通过柱色谱法上1.6Kg的硅胶(SiO2)提纯。该柱用20％MeOH在二氯甲烷中的溶液(CH2Cl2，18L)洗脱，获得灰白色固体状的2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(14，239.5g，296.1g理论，80.9％收率)。14：1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.15(s，1H)，8.94(s，1H)，8.72(s，1H)，8.49(s，1H)，7.63(d，1H)，7.09(d，1H)，4.62(d，2H)，4.25(d，2H)，3.71(s，2H)，3.24(q，2H)，1.26(t，3H)ppm；C16H17N7O2S(MW，371.42)，LCMS(EI)m／e372(M++H)。
实施例71.2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈磷酸盐。
在70℃下，经50分钟，向2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(14，471.2g，1268.6mmol)在乙腈(10.86L)和乙醇(3.75L)中的溶液缓慢地添加磷酸(H3PO4，191.6g，1661.7mmol，1.31当量)在乙醇(EtOH，1.68L)中的85％水溶液。将所得反应混合物缓慢地冷却至室温，并在室温下搅拌过夜。通过过滤收集固体，再用乙腈(500mL)洗涤。然后，在室温下将所得湿滤饼悬浮在乙醇(EtOH，7.0L)中，之后用磷酸(H3PO4，95.1g，824.6mmol，0.65当量)在乙醇(EtOH，1.23L)中的85％水溶液处理。然后，将所得混合物加热至回流，并在回流下搅拌1小时，之后缓慢地冷却至室温，在室温下搅拌过夜。通过过滤收集固体，用乙醇(2L)和庚烷／乙醇(v／v2／1，2.1L)洗涤，在真空烘箱中在40℃下干燥过夜，获得白色结晶固体状的2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈磷酸盐(534.8g，595.5g理论，89.8％收率)。磷酸盐：mp：187℃；C16H20N7O6PS的元素分析，计算值：C，40.94；H，4.29；N，20.89；P，6.60；S，6.83；实测值：C，40.65；H，4.22；N，20.71；P，6.53；S，6.95；FTIR(γmax，cm-1)：3123(-CH-)，2254(CN)，1627和1441(杂芳族C=N)，1600和1559(杂芳族C=C)，1312(-SO2-)；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.19(s，1H)，8.94(s，1H)，8.71(s，1H)，8.48(s，1H)，7.62(dd，1H，J=3.5，2.3Hz)，7.08(dd，1H，J=3.6，1.5Hz)，4.60(d，2H，J=9.3，9.2Hz)，4.23(d，2H，J=9.3，9.2Hz)，3.69(s，2H)，3.23(q，2H，J=7.2Hz)，1.23(t，3H，J＝7.3Hz)ppm；13C NMR(DMSO-d6，75MHz)δ152.3，150.9，149.4，140.0，129.7，127.1，122.2，116.8，113.1，100.1，58.6，56.1，43.3，26.9，7.5ppm；C16H17N7O2S(游离碱，MW，371.42)，LCMS(EI)m／e372(M++H)。
实施例72.3-(氰基甲基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(15)。
在室温下，向3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(9，417.2g，2.15mol，1.05当量)和4-(1H-吡唑-4-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(5，645g，2.04mol)在乙腈(4.9L)中的悬浮液中滴加DBU(30.5mL，0.204mol，0.1当量)。然后，将所得反应混合物在室温下搅拌3小时。在约1小时后，获得了透明的棕色溶液。当LCMS显示无起始原料余留时，添加硅胶(SiO2，1kg)，并将该混合物在减压下浓缩至干燥。将含有所需粗产物(15)的该材料加载到预装硅石柱(SiO2，2.5Kg)上，该柱用60-80％的乙酸乙酯／庚烷洗脱。将含有纯的所需产物(15)的级分合并，在减压下浓缩，获得稠油状的所需产物，然后在庚烷中在室温下搅拌，直到发生结晶为止。通过过滤收集固体，用庚烷洗涤，获得白色固体状的3-(氰基甲基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(15，1014.9g，1039.7g理论，97.6％收率)。15：1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ8.93(s，1H)，8.77(s，1H)，8.47(s，1H)，7.80(d，1H，J=3.8Hz)，7.20(d，1H，J=3.7Hz)，5.63(s，2H)，4.50(d，2H，J=9.3Hz)，4.21(d，2H，J=9.3Hz)，3.66(s，2H)，3.52(t，2H，J＝7.8Hz)，1.40(s，9H)，0.82(t，2H，J=8.1Hz)，-0.12(s，9H)ppm；C25H35N7O3Si(MW，509.68)，LCMS(EI)m／e510(M++H)和532(M++Na)。
实施例73.2-(3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(16)。
在室温下，向3-(氰基甲基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(15，389.6g，0.765mol)在二氯甲烷(CH2Cl2，7L)中的溶液中添加氯化氢(HCl)在二
Figure BDA0000457047210001442
烷(4M，1.15L，4.6mol，6.0当量)中的溶液。将所得反应混合物在室温下搅拌48小时。当LCMS显示所有起始原料已经被消耗时，将该反应混合物分批转移到含有氢氧化铵水溶液(NH4OH，约4％v／v，2.5L)的22L分液漏斗中。气体放出，而漏斗保持手触不烫。作为预防措施定期添加冰块。一旦添加了所有反应混合物，继续搅拌约15分钟。发现水层的pH接近11。将两层分离，有机层用盐水(2L)洗涤，用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，在减压下浓缩至最小体积。将庚烷(约3L)添加到该残留物中，将所得悬浮液在减压下浓缩到干燥，得到橙色油状的粗2-(3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(16，268.2g，313.3g理论，85.6％收率)，其直接用于后续反应，不用进一步提纯。粗产物16：1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.92(s，1H)，8.45(s，1H)，8.39(s，1H)，7.47(d，1H)，6.87(d，1H)，5.74(s，2H)，4.36(d，2H)，3.95(d，2H)，3.77(s，2H)，3.62(t，2H)，1.9(br.s，1H)，0.99(t，2H)，0.01(s，9H)ppm；C20H27N7OSi(MW，409.56)，LCMS(EI)m／e410(M++H)。
实施例75.2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(12)。
方法B.在0-5℃下，向粗2-(3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(16，423.7g，1.03mol)在乙酸乙酯(EtOAc，6.5L)中的溶液中滴加乙烷磺酰氯(EtSO2Cl，117mL，1.23mol，1.2当量)在乙酸乙酯(110mL)中的溶液。将所得反应混合物逐渐升温至室温，并在室温下搅拌过夜。当LCMS分析显示无起始原料余留时，将反应混合物转移到22L分液漏斗中，并用水(4L)、盐水(2L)和饱和碳酸氢钠水溶液(NaHCO3，2L)洗涤。合并的水层用乙酸乙酯(EtOAc，2L)反萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，并在减压下浓缩。该粗材料上硅胶提纯，用二氯甲烷／乙酸乙酯(100／0到0／100)洗脱。将含有纯的所需产物(12)的级分合并，在减压下浓缩至最小体积，然后用庚烷在室温下处理。通过过滤收集固体，用庚烷洗涤，获得白色固体状的2-(1-(乙基磺酰基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(12，397g，516.7g理论，76.8％收率)，发现其在每一个可比的方面均与通过方法A制备的材料相同。12：1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ8.86(s，1H)，8.45(s，1H)，8.35(s，1H)，7.43(d，1H)，6.80(d，1H)，5.68(s，2H)，465(d，2H)，4.27(d，2H)，3.55(s，2H)，3.4(t，2H)，3.07(m，2H)，1.42(m，3H)，092(m，2H)，-0.05(s，9H)ppm；C22H31N7O3SSi(MW，501.68)，LCMS(EI)m／e502(M++H)。
Figure BDA0000457047210001461
实施例76.新戊酸[4-(1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]甲酯(19)。
向烘干的装有搅拌棒、隔膜、热电偶、500mL加料漏斗和氮气导入管的3L四颈圆底烧瓶内添加固体氢化钠(NaH，60wt％，在矿物油中，32.82g，0.82mol，1.20当量)和无水1，2-二甲氧基乙烷(DME，500mL，4.8mol)，并将所得混合物冷却到0-3℃。向烘干的1L圆底烧瓶内添加4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(1，105.0g，0.684mol)和1，2-二甲氧基乙烷(DME，750mL，72mol)，然后在5-12℃下经30分钟经由大孔套管将所得淤浆分批加入到氢化钠在DME中的悬浮液中。所得反应混合物是不均匀的。在添加之后，移走冷浴，将该混合物逐渐升至室温，在室温下搅拌1小时，然后冷却至0-5℃。然后，在0-5℃下在搅拌的同时经30分钟将新戊酸氯甲酯(新戊酰氧基甲基氯，POM-Cl，112mL，0.752mol，1.1当量)滴加到反应混合物中。新戊酸氯甲酯的添加是温和放热的，反应温度上升至高达14℃。在添加新戊酸氯甲酯以后，移走冷却水浴，使反应混合物返回到室温，并在室温下搅拌90分钟。当通过HPLC确认之后认为反应完全时，该反应混合物用水(100mL)小心地猝灭，含有粗POM保护的氯脱氮嘌呤(17)的该猝灭的反应混合物在后续苏楚基偶联反应中直接使用，不用进一步后处理和提纯。
在室温下，向如上所述制备的含有粗POM保护的氯脱氮嘌呤(17)的猝灭反应混合物中添加1-(1-乙氧基乙基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(4，200g，0.75mol，1.10当量)和固体碳酸钾(K2CO3，189g，1.37mol，2.0当量)。让氮气流通过该溶液达15分钟，从而将所得混合物脱气，之后用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4，7.9g，0.68mmol，0.01当量)处理，所得反应混合物在回流(约82℃)下加热10小时。当通过TLC(1∶1己烷／乙酸乙酯)和LCMS认为反应完全时，将反应混合物冷却到室温，用乙酸乙酯(2L)和水(1L)稀释。将两层分离，水层用乙酸乙酯(500mL)萃取。合并的有机层用水(2X1L)和盐水(1L)洗涤，之后在减压下浓缩，获得浅黄色油状的粗新戊酸(4-[1-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]甲酯(18)，它直接用于后续脱保护反应，不用进一步提纯。
将粗产物18在THF(1L，12.3mol)中的溶液用4N HCl水溶液(500mL)在室温下处理。随后将所得反应混合物在室温下搅拌5小时。当反应被认为完全时，将反应混合物冷却到0-5℃，之后用1M氢氧化钠(NaOH)水溶液(2L)将pH调节至9-10。然后将该混合物在减压下浓缩，以除去大部分的THF，将所得悬浮液在室温下搅拌2小时。通过过滤收集固体，用水(3×500mL)洗涤，在真空烘箱中干燥，获得灰白色固体状的新戊酸[4-(1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]甲酯(19，157.5g，204.43g理论，三个步骤收率77％)，发现其对于后续反应而言是足够纯的(＞98面积％，根据HPLC)，无需进一步提纯。19：1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.42(br s，1H)，8.76(s，1H)，8.67(s，1H)，8.33(s，1H)，7.68(d，1H，J=3.8Hz)，7.11(d，1H，J=3.8Hz)，6.21(s，2H)，1.06(s，9H)ppm；13CNMR(DMSO-d6，100MHz)δ177.74，152.31，152.09，151.91，139.52，130.39，120.51，113.93，101.91，67.26，38.98，27.26ppm；C15H17N5O2(MW，299.33)，LCMS(EI)m／e300(M++H)。
实施例77.新戊酸(4-(1-(3-(氰基甲基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)甲酯(20)。
向新戊酸[4-(1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]甲酯(19，10.0g，33.4mmol)和2-(1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基)乙腈(11，6.22g，33.4mmol，1.0当量)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF，20mL)中的悬浮液中滴加DBU(254mg，1.67mmol，0.05当量)，以便保持反应温度在15-25℃之间。在添加DBU以后，该反应混合物在90分钟内变得均匀。将反应混合物在室温下搅拌3小时。当HPLC显示反应被认为完全时，反应混合物用水(120mL)和乙腈(80mL)猝灭。将所得混合物在室温下搅拌另外30分钟。通过过滤收集固体，用乙腈和水的混合物(2／3(按体积)，2×20mL)洗涤，在真空烘箱中在40-45℃下干燥24小时，获得白色固体状的粗新戊酸(4-(1-(3-(氰基甲基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)甲酯(20，14.5g，16.2g理论，89.5％收率)，发现它对于后续反应而言是足够纯的(>98.0％，根据HPLC)，无需进一步提纯。20：1HNMR(CDCl3，300MHz)，δ8.87(s，1H)，8.43(s，1H)，8.37(s，1H)，7.51(d，1H，J=3.6Hz)，6.76(d，1H，J=3.6Hz)，6.26(s，2H)，4.64(d，2H，J=9.6Hz)，4.25(d，2H，J=9.6Hz)，3.41(s，2H)，3.09(q，2H，J=7.6Hz)，1.42(t，3H，J=7.6Hz)，1.17(s，9H)ppm；C22H27N7O4S(MW，485.56)，LCMS(EI)m／e486(M++H)。
Figure BDA0000457047210001481
实施例78.2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(14)。
方法B.将新戊酸(4-(1-(3-(氰基甲基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)甲酯(20，1.0g，2.06mmol)在甲醇(MeOH，5mL)和四氢呋喃(THF，20mL)中的悬浮液用1M氢氧化钠水溶液(NaOH，2.3mL，2.3mmol，1.12当量)在室温下处理，并将所得反应混合物在室温下搅拌2-3小时。当HPLC显示反应被认为完全时，反应混合物用水(10mL)和1N HCl水溶液(0.2mL)在室温下猝灭，以便将pH调节至7-7.5。将所得混合物在室温下搅拌30分钟，之后通过过滤收集固体。固体用乙腈和水的混合物(2／3(按体积)，2×4mL)洗涤，在真空中在40-45℃下干燥24小时，获得灰白色固体状的粗2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(14，658mg，765mg理论，86％收率)，发现它与通过方法A制备的材料相同。粗产物14：1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.15(s，1H)，8.94(s，1H)，8.72(s，1H)，8.49(s，1H)，7.63(d，1H)，7.09(d，1H)，4.62(d，2H)，4.25(d，2H)，3.71(s，2H)，3.24(q，2H)，1.26(t，3H)ppm；C16H17N7O2S(MW，371.42)，LCMS(EI)m／e372(M++H).
方法C.或者，将新戊酸(4-(1-(3-(氰基甲基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)甲酯(20，10.0g，20.6mmol)和氢氧化锂一水合物(259g，61.8mmol)在乙腈(CH3CN40mL)和异丙醇(10mL)中的悬浮液在45-50℃下加热6小时。当HPLC显示反应被认为完全时，将该反应混合物冷却到室温，添加1M盐酸水溶液(41mL)，以便在25℃以下的温度下将pH调节至6-7。在添加酸之后，将该混合物在室温下搅拌1小时，通过过滤分离出沉淀。该湿滤饼用水(50mL)洗涤，在真空烘箱中在50℃下干燥，获得灰白色固体状的粗2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(14，6.0g，7.65g理论，78％收率)，发现它与通过方法A制备的材料相同。
实施例79.{1-(环丙基磺酰基)-3-[4-(7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈(25)。
在室温下，向烘干的装有架顶搅拌器、氮气导入管、隔膜和热电偶的2L圆底烧瓶内添加无水四氢呋喃(THF，800mL)，(3-[4-(7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈(16，38.6g，94.2mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，22.0mL，126mmol，1.34当量)。然后，将所得溶液冷却到0-5℃，之后在0-5℃下，经8分钟用注射器分批添加环丙烷磺酰氯(14.3mL，134mmol，1.42当量)。在10分钟以后，移走冰浴，使反应混合物逐渐升至室温。当在22小时后HPLC显示反应完全时，将反应混合物在减压下浓缩，以除去约400mL的溶剂。该残留物用乙酸乙酯(EtOAc，500mL)处理，所得溶液用20％氯化钠水溶液(NaCl，300mL)洗涤。该水层用乙酸乙酯(EtOAc，150mL)反萃取。合并的有机级分用硫酸镁(MgSO4)干燥，在减压下浓缩，以获得琥珀油状的粗产物(25)。该粗产物然后通过快速柱色谱法提纯(SiO2，50％到70％乙酸乙酯／己烷梯度洗脱)，以获得浅黄色油状的(1-(环丙基磺酰基)-3-[4-(7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈(25，39.4g，48.4g理论，81.4％收率)，其在室温下真空中静置时固化。25：1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ8.98(s，1H)，8.78(s，1H)，8.50(s，1H)，7.81(d，1H，J=3.8Hz)，7.20(d，1H，J=3.6Hz)，5.63(s，2H)，4.66(d，2H，J=9.5Hz)，4.28(d，2H，J=9.3Hz)，3.69(s，2H)，3.52(t，2H，J=7.8Hz)，2.84(m，1H)，1.01(m，4H)，0.82(t，2H，J=8.4Hz)，-0.12(s，9H)ppm；C23H31N7O3SSi(MW，513.69)，LCMS(EI)m/e514(M++H)和536(M++Na)。
Figure BDA0000457047210001511
实施例80.2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(环丙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(27)。
在室温下，向装有搅拌棒、冷凝器、热电偶和氮气导入管的500mL圆底烧瓶内添加{1-(环丙基磺酰基)-3-[4-(7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈(25，17.5g，34.1mmol)、乙腈(254mL)和水(23.9mL)。在室温下，在所得反应混合物中一次性添加固体四氟硼酸锂(LiBF4，32.6g，341mmol，10.0当量)。将所得反应混合物加热至回流，并在回流下搅拌21小时。当HPLC显示第一阶段的脱保护反应完全(这产生相应羟甲基中间体26)时，将该反应混合物逐渐地冷却到室温，之后在室温下用20％NH4OH水溶液(45mL)将溶液pH调至9-10。然后将所得反应混合物在室温下搅拌一夜。当HPLC显示第二阶段的脱保护反应完成时，反应混合物用赛力特硅藻土垫过滤，该赛力特硅藻土垫再用乙酸乙酯(EtOAc，50mL)洗涤。该滤液然后用20％氯化钠水溶液(NaCl，200mL)和乙酸乙酯(EtOAc，200mL)稀释。将该两层分离，并且水层用乙酸乙酯(EtOAc，200mL)萃取。合并的有机级分用1M碳酸氢钠水溶液(NaHCO3，200mL)和水(200mL)洗涤。合并的水溶液用乙酸乙酯(EtOAc，100mL)反萃取。该合并的有机级分然后用硫酸镁(MgSO4)干燥，在减压下浓缩，得到浅黄色固体状的粗产物(27)。该粗固体然后用乙腈(200mL)处理，将所得悬浮液在60℃下加热15分钟，然后冷却至室温，并在室温下搅拌60分钟。通过过滤收集固体，用少量的乙腈洗涤，得到第一次收获的所需产物(27，6.9g)。然后将合并的滤液浓缩，获得黄色固体，该固体用乙腈(100mL)处理，在60℃下加热30分钟。将该悬浮液冷却至室温，并在室温下搅拌60分钟。固体通过过滤收集，用少量的乙腈洗涤，得到第二次收获的所需产物(27，3.0g)。然后将该滤液浓缩，该残留物通过快速柱色谱法提纯(SiO2，50％乙酸乙酯／乙腈洗脱)，得到第三次收获的所需产物(27，1.4g)。该反应获得了灰白色固体状的2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(环丙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(27，11.3g，13.07g理论，86.5％总收率)。27：1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ12.16(br.s，1H)，8.95(s，1H)，8.70(s，1H)，8.48(s，1H)，7.62(dd，1H，J=3.6，2.3Hz)，7.08(dd，1H，J=3.5，1.4Hz)，4.66(d，2H，J=9.4Hz)，4.28(d，2H，J=9.4Hz)，3.69(s，2H)，2.84(m，1H)，1.01(m，4H)ppm；C17H17N7O2S(MW，383.43)，LCMS(EI)m/e384(M++H)。
实施例81.2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(环丙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈磷酸盐。
在室温下，向装有搅拌棒、加料漏斗、氮气导入管和冷凝器的1L圆底烧瓶内添加2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(环丙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(27，11.3g，29.5mmol)和乙腈(275mL)。将所得混合物加热至70℃，之后在70℃下分三批添加乙醇(EtOH，150mL)。所得均匀的溶液过滤到装有架顶搅拌器、加料漏斗、氮气导入管和冷凝器的清洁1L圆底烧瓶内。然后，将该混合物再次加热到67℃，再次形成均匀的溶液。然后在67℃下，经10分钟将磷酸(H3PO4，3.03g，30.9mmol，1.05当量)在乙醇(EtOH，30mL)中的溶液滴加到该溶液中。在磷酸乙醇溶液添加结束之后，该溶液仍然是均匀的。将所得反应混合物在67℃下搅拌10分钟，之后逐渐冷却至室温，在室温下搅拌19小时。固体通过过滤收集，用乙腈(2×40mL)洗涤。将该湿滤饼在高真空下部分地干燥，然后转移到75℃真空烘箱中，干燥至恒重，获得白色固体状的2-(3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(环丙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈磷酸盐(12.0g，14.2g理论，84.5％收率)。磷酸盐：1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ12.13(br.s，1H)，9.20(br.s，3H)，8.94(s，1H)，8.70(s，1H)，8.47(s，1H)，7.61(dd，1H，J=3.4，2.3Hz)，7.07(dd，1H，J=3.6，1.6Hz)，4.65(d，2H，J=9.1Hz)，4.28(d，2H，J=9.7Hz)，3.68(s，2H)，2.82(m，1H)，1.01(m，4H)ppm；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)δ152.9，151.6，150.0，140.6，130.3，127.7，122.9，117.3，113.8，100.7，59.7，57.1，27.6，25.4，4.9ppm；C17H20N7O6PS(MW，481.42；游离碱C17H17N7O2S，MW，383.43)，LCMS(EI)m／e384(M++H).
实施例82：{1-(乙基磺酰基)-3-[3-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈
Figure BDA0000457047210001531
步骤1.4-(1H-吡咯-3-基)-7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
将4-氯-7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(12.9g，45.4mmol)(如WO2007／070514的实施例65那样制备)、[1-(三异丙基甲硅烷基)-1H-吡咯-3-基]硼酸(Frontier Scientific)(10.4g，38.9mmol)和碳酸钠(4.36g，41.2mmol)在1，2-二甲氧基乙烷(100mL)和水(35mL)中的混合物通过用氮气流吹扫20分钟进行脱气。然后添加四(三苯基膦)钯(0)(2.25g，1.94mmol)，再将反应加热至回流，保持9小时。随着偶联反应进行，TIPS保护基团也慢慢地被除去。通过旋转蒸发来除去溶剂，产物通过快速柱色谱法提纯，用10-50％乙酸乙酯／己烷的梯度洗脱，获得所需产物(7g，57％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.93(br s，1H)，8.84(s，1H)，7.73-7.69(m，1H)，7.33(d，1H)，7.04-7.00(m，1H)，6.94(dd，1H)，6.85(d，1H)，5.66(s，2H)，3.55(m，2H)，0.92(m，2H)，-0.06(s，9H)。LCMS(M+H)+：315.2.
步骤2.
将4-(1H-吡咯-3-基)-7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.100g，0.318mmol)和[1-(乙基磺酰基)氮杂环丁烷-3-亚基]乙腈(0.118g，0.636mmol，如实施例68那样制备)在乙腈(1mL)中的溶液用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(24μL，0.16mmol)处理。将该混合物搅拌4小时。蒸发溶剂。将残留物在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液之间分配，然后用另外两份乙酸乙酯萃取。合并的萃取物用硫酸钠干燥，滗析，再浓缩。该粗产物与25％TFA／DCM(8mL)搅拌过夜。蒸发溶剂。该产物然后与乙二胺(0.3mL)一起在甲醇(5mL)中搅拌。使用制备型HPLC-MS(用含有0.15％NH4OH的甲醇和水的梯度进行洗脱)来提纯该产物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.59(s，1H)，7.54(dd，1H)，7.27(d，1H)，6.95(dd，1H)，6.82(dd，1H)，6.74(d，1H)，4.49(d，2H)，4.15(d，2H)，3.24(s，2H)，3.02(q，2H)，1.33(t，3H)；LCMS(M+H)+：371.1。
实施例83：4-{1-[1-(乙基磺酰基)-3-(氟甲基)氮杂环丁烷-3-基]-1H-吡唑-4-基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶三氟乙酸盐
Figure BDA0000457047210001541
步骤1.3-[氟(苯磺酰基)亚甲基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在-78℃下，向氟甲基苯基砜(0.50g，2.9mmol)和氯磷酸二乙酯(0.415mL，2.87mmol)在四氢呋喃(6mL，70mmol)中的混合物滴加1.000M的双三甲基硅基氨基锂在四氢呋喃(6.2mL，6.2mmol)中的溶液。在将该混合物在-78℃下搅拌1小时之后，添加3-氮杂环丁酮-1-甲酸叔丁酯(0.378g，2.21mmol)在四氢呋喃(1.3mL，16mmol)中的溶液。将该反应加热至环境温度，并在室温下搅拌2小时。将该反应物倒入EtOAc和饱和氯化铵的冰冷的混合物中。将有机层分离，水层用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，再用硫酸钠干燥。将溶剂在减压下除去，所得残留物上硅胶提纯，用0-50％EtOAc／己烷洗脱，得到所需产物(560mg，77.5％)。LCMS C15H18FNO4SNa(M+Na)+计算值：m／z=350.1；实测值(M+Na)350.3。
步骤2.3-[氟(苯磺酰基)甲基]-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将4-(1H-吡唑-4-基)-7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.40g，1.3mmol)、3-[氟(苯磺酰基)亚甲基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(0.56g，1.7mmol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.182mL，1.22mmol)在乙腈(6mL，100mmol)中的混合物在室温下搅拌3小时。在蒸干以后，将残留物上硅胶提纯，用0-100％EtOAc／己烷洗脱，得到所需产物(820mg，100％)。LCMS C30H40FN6O5SSi(M+H)+计算值：m／z＝643.3；实测值：643.4。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.92(1H，s)，8.55(1H，s)，8.32(1H，s)，7.87(2H，m)，7.68(1H，m)，7.55(2H，m)，7.47(1H，d，J=3.6Hz)，6.84(1H，d，J=3，6Hz)，5.77(1H，d，J=45.6Hz)，5.74(2H，s)，4.93(1H，d，J＝10.2Hz)，4.73～4.58(3H，m)，3.60(2H，t，J＝8.1Hz)，1.51(9H，s)，0.98(3H，t，J=8.1Hz)，0.07(9H，s)ppm。19F NMR(CDCl3，300MHz)δ-181.84(1F，d，J＝48.6Hz)ppm。
步骤3.3-(氟甲基)-3-[4-(7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在-20℃下，在氮气中，向3-[氟(苯磺酰基)甲基]-3-[4-(7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(0.312g，0.485mmol)和磷酸氢二钠(1.38g，9.71mmol)在甲醇(7.5mL，180mmol)中的混合物中添加钠汞齐(2.17g，9.71mmol)。将该反应在-20℃到0℃下搅拌1小时，用EtOAc稀释，然后用饱和氯化铵猝灭。该混合物用赛力特硅藻土过滤，所收集的固体用单质硫粉末处理，以破坏汞残留物。将滤液层分离，有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，再蒸发。该残留物用硅胶提纯，用0-80％EtOAc／己烷洗脱，得到所需的产物(120mg，49.2％)。LCMS C24H36FN6O3Si(M+H)+计算值：m／z=503.3；实测值：503.2。
步骤4.4-{1-[1-(乙基磺酰基)-3-(氟甲基)氮杂环丁烷-3-基]-1H-吡唑-4-基}-7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
将3-(氟甲基)-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(0.120g，0.239mmol)用4.00M的氯化氢在1，4-二
Figure BDA0000457047210001561
烷(1.0mL，4.0mmol)中的溶液在室温下处理1小时，然后在减压下蒸干。LCMS(M+H)403.4。向所形成的乙腈中的粗HCl盐(4mL，80mmol)中先后添加三乙胺(0.0998mL，0.716mmol)和乙烷磺酰氯(0.0317mL，0.334mmol)。将该混合物在室温下搅拌30分钟。用碳酸氢钠水溶液猝灭以后，该混合物用二氯甲烷萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，再用硫酸钠干燥，蒸干。该残留物在下一步中直接使用。LCMS C21H32FN6O3SSi(M+H)+计算值：m／z=495.2；实测值：495.4。
步骤5.4-{1-[1-(乙基磺酰基)-3-(氟甲基)氮杂环丁烷-3-基]-1H-吡唑-4-基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
将4-{1-[1-(乙基磺酰基)-3-(氟甲基)氮杂环丁烷-3-基]-1H-吡唑-4-基}-7-([2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(O.060g，0.12mmol)用2mL的TFA在室温下处理30分钟。将反应混合物蒸干。LCMS(M+H)395.3。将所得残留物溶于3mL的甲醇，并用乙二胺(0.0811mL，1.21mmol)在室温下处理30分钟。该混合物上RP-HPLC(XBridge C18柱，用含有0.2％TFA的丙酮／水的梯度洗脱)，得到作为TFA盐的所需产物。LCMS C15H18FN602S(M+H)+(游离碱)计算值：m／z=365.1；实测值：365.3。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ12.57(1H，br s)，8.94(1H，s)，8.81(1H，s)，8.53(1H，s)，7.75(1H，br s)，7.21(1H，br s)，5.03(2H，d，J＝46.8Hz)，4.53(1H，dd，J=9.0和2.7Hz)，4.24(1H，d，J=9.0Hz)，3.25(2H，q，J=7.2Hz)，1.23(3H，t，J=7.2Hz)ppm。19F NMR(DMSO-d6，300MHz)δ-74.98(3F，s)，-225.56(1F，t，J=48.3Hz)ppm。
实施例A：体外JAK激酶试验
按照Park等人，Analytical Biochemistry1999，269，94-104中所述的以下体外试验，测试这里的化合物的JAK靶的抑制活性。使用昆虫细胞中的杆状病毒，表达具有N端His标签的人JAK1(a.a.837-1142)、JAK2(a.a.828-1132)和JAK3(a.a.781-1124)的催化结构域，并提纯。JAK1、JAK2或JAK3的催化活性通过测定生物素化的肽的磷酸化来分析。磷酸化肽通过均相时间分辨荧光(HTRF)来检测。在包括100mM NaCl、5mM DTT和0.1mg／mL(0.01％)BSA的50mM Tris(pH7.8)缓冲液中含有酶、ATP和500nM肽的反应中，测定化合物对于每一种激酶的IC50。反应中的ATP浓度对于Jak1是90μM，对于Jak2是30μM以及对于Jak3是3μM。反应在室温下进行1小时，然后用试验缓冲液(PerkinElmer，马萨诸塞州波士顿)中的20μL45mM EDTA、300nM SA-APC、6nM Eu-Py20停止。与铕标记的抗体的结合发生40分钟，HTRF信号用融合酶标仪(Perkin Elmer，马萨诸塞州波士顿)测定。发现实施例1-60、82和83的化合物的IC50值对于JAK1、JAK2和JAK3中的至少一种低于60nM。
实施例B：细胞试验
根据下列至少一种细胞试验，测试这里的一种或多种化合物的JAK靶的抑制活性。
将依赖细胞因子并因此生长需要JAK／STAT信号转导的癌细胞系以6000细胞／孔(96孔板形式)的密度在RPMI1640、10％FBS和1nG／mL的适当细胞因子中平板接种。将化合物加入到DMSO／培养基(终浓度0.2％DMSO)中的细胞中，并在37℃、5％CO2下孵育72小时。化合物对细胞活力的效应使用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测分析(Promega)，随后进行TopCount(Perkin Elmer，马萨诸塞州波士顿)定量来评价。使用非JAK驱动的细胞系用相同的试验读数平行地测定化合物潜在的脱靶效应。所有实验一式两份进行。
以上细胞系还可以用来检验化合物对JAK激酶或潜在的下游底物如STAT蛋白、Akt、Shp2或Erk的磷酸化的效应。这些实验可以在过夜细胞因子饥饿之后进行，随后是用化合物简短预孵育(2小时或更短)和大约1小时或更短的细胞因子刺激。然后从细胞中提取蛋白，通过包括Western印迹或ELISA在内的本领域技术人员熟悉的技术使用能够在磷酸化蛋白和总蛋白之间进行区分的抗体来分析。这些实验可以利用正常细胞或癌细胞来调查化合物对肿瘤细胞存活生物学或炎性疾病的介体的活性。例如，对于后者，细胞因子如IL-6、IL-12、IL-23或IFN能够用于刺激JAK活化，导致STAT蛋白的磷酸化，并潜在地导致转录谱(通过阵列或qPCR技术评价)或蛋白如IL-17的产生和／或分泌。化合物抑制这些细胞因子介导的效应的能力可以使用本领域技术人员所常用的技术来测定。
本发明的化合物还可以在设计来评价其抗突变JAK如存在于骨髓增殖性疾病中的JAK2V617F突变的效力和活性的细胞模型中测试。这些实验常常利用其中异位表达野生型或突变JAK激酶的细胞因子依赖的血液系细胞(例如BaF／3)(James，C.等人，Nature434：1144-1148；Staerk，J.等人，JBC280：41893-41899)。终点包括化合物对细胞存活、增殖和磷酸化JAK、STAT、Akt或Erk蛋白的效应。
对本发明的某些化合物已经评价了或能够评价它们的抑制T细胞增殖的活性。这种试验可以被认为是第二细胞因子(即JAK)驱动的增殖试验以及免疫抑制或免疫活化抑制的简化试验。以下是这种实验如何能够进行的提要。使用Ficoll Hypaque分离方法从人全血样本制备周围血液单核细胞(PBMC)，T细胞(级分2000)能够通过淘洗从PBMC中获得。新鲜分离的人T细胞能够在培养基(补充有10％胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素的RPMI1640)中以2×106细胞／ml的密度在37℃下保持高达2天。对于IL-2刺激的细胞增殖分析，T细胞首先用最终浓度10μg／mL的植物血球凝集素(PHA)处理72小时。在用PBS洗涤一次后，以6000细胞／孔在96孔板中平板接种，在100U／mL人IL-2(ProSpec-Tany TechnoGene；Rehovot，以色列)的存在下在培养基中用不同浓度的化合物处理。将平板在37℃下孵育72小时，增殖指数使用CellTiter-Glo发光试剂按照制造厂建议的操作程序(Promega；Madison，WI)进行评价。
实施例C：体内抗肿瘤效力
本发明的化合物能够在免疫受损小鼠的人肿瘤异种移植模型中进行评价。例如，能够使用INA-6浆细胞瘤细胞系的致瘤变体来皮下接种SCID小鼠(Burger，R.等人，Hematol J.2：42-53，2001)。荷瘤动物然后能够随机分为药物治疗组或载体治疗组，不同剂量的化合物能够通过包括口服、腹膜内或使用可移植的泵的连续输液在内的许多常规途径给药。肿瘤生长使用卡尺经时跟踪。进一步，肿瘤样本能够在开始治疗之后的任何时间采集，用于如上所述的分析(实施例B)，以评价化合物对JAK活性和下游信号传导途径的效应。另外，化合物的选择性可以使用由其他已知激酶(例如Bcr-Abl)驱动的异种移植肿瘤模型如K562肿瘤模型来评价。
实施例D：鼠皮肤接触迟发型过敏性反应试验
对本发明的化合物还能够测试其在T细胞驱动的鼠迟发型过敏性反应试验模型中(抑制JAK靶)的功效。鼠皮肤接触迟发型过敏以(DTH)反应被认为是临床接触性皮炎以及其他的皮肤T淋巴细胞介导的免疫疾病如银屑病的有效模型(Immunol Today.1998年1月；19(1)：37-44)。鼠DTH与银屑病共有多个特征，包括免疫浸润、伴随的炎性细胞因子的增加以及角化细胞过度增殖。此外，在临床中治疗银屑病有效的许多种类的药剂也是小鼠DTH反应的有效抑制剂(Agents Actions.1993年1月；38(1-2)：116-21)。
在第0天和第一天，Balb／c小鼠通过用抗原2，4-二硝基-氟代苯(DNFB)局部施用于它们的剃毛腹部来致敏。在第5天，使用工程测微计测定耳朵的厚度。记录该测量值，并用作基线。动物的两只耳朵然后通过局部施用浓度0.2％的总计20μL(10μL施用于内耳廓和10μL施用于外耳廓)的DNFB来攻击。在攻击之后二十四到七十二小时后，再次测定耳朵。在整个致敏和攻击期(第1天到第7天)或者在攻击期之前和整个攻击期中(通常第4天到第7天的下午)用试验化合物治疗。试验化合物的治疗(不同浓度)为全身或局部给药(治疗局部施加于耳朵)。试验化合物的效力通过与没有治疗的情况相比耳朵肿胀的减轻来表示。导致减轻20％或更多的化合物被认为是有效的。在一些实验中，小鼠被攻击，但不致敏(阴性对照)。
试验化合物的抑制效应(抑制JAK-STAT途径的活化)化合物可以通过免疫组化分析来确认。JAK-STAT途径的激活导致功能性转录因子的形成和移位。此外，免疫细胞的汇集和角化细胞增殖增加也应提供了在能够调查和定量的耳朵中的独特表达谱变化。***固定和石蜡包埋的耳朵切片(在DTH模型中的攻击期之后采集)使用与磷酸化STAT3(克隆58E12，Cell Signaling Technologies)特异性相互作用的抗体进行免疫组化分析。小鼠耳朵用试验化合物、载体或***(临床上有效的银屑病治疗剂)处理，或没有任何处理，在DTH模型中用于对比。试验化合物和***可以定性和定量地产生类似的转录变化，且试验化合物和***可以减少浸润细胞的数目。试验化合物的全身和局部给药均可以产生抑制效应，即，浸润细胞的数目减少和转录变化的抑制。
实施例E：体内抗炎活性
本发明的化合物能够在设计来再现单一或复杂炎症反应的啮齿动物或非啮齿动物模型中进行评价。例如，关节炎的啮齿动物模型能够用于评价预防或治疗性给药的化合物的治疗潜力。这些模型包括但不限于小鼠或大鼠胶原诱导性关节炎、大鼠佐剂诱导性关节炎以及胶原抗体诱导性关节炎。自身免疫病，包括但不限于多发性硬化，I型糖尿病，葡萄膜视网膜炎，甲状腺炎，重症肌无力，免疫球蛋白肾病，心肌炎，气道敏化(哮喘)，狼疮，或结肠炎，也可用来评价本发明的化合物的治疗潜力。这些模型在研究团体中沿用已久，并且是本领域技术人员所熟悉的(Current Protocols in Immunology，第3卷，Coligan，J.E.等人，WileyPress.；Methods inMolecular Biology：第225卷，Inflammation Protocols.，Winyard，P.G.和Willoughby，D.A.，Humana Press，2003.)。
实施例F：用于治疗干眼、眼色素层炎和结膜炎的动物模型
可以在本领域技术人员已知的一个或多个干眼临床前模型中评价化合物，这些模型包括但不限于兔伴刀豆球蛋白A(ConA)泪腺模型、东莨菪碱小鼠模型(皮下或透皮)、肉毒杆菌(Botulinumn)小鼠泪腺模型或者许多导致眼睛腺体功能紊乱的自发型啮齿动物自身免疫模型(例如NOD-SCID，MRL／lpr，或NZB／NZW)(Barabino等人，Experimental EyeResearch2004，79，613-621以及Schrader等人，DevelopmentalOpthalmology，Karger2008，41，298-312，以上文献通过引用全文并入到此处)。这些模型的终点可以包括眼腺体和眼睛(角膜等)的组织病理学以及可能的测定泪液产生的传统Schirmer试验或其改进型(Barabino等人)。可通过经由多个给药途径(例如全身或局部)定量给药来评价活性，该给药可以在可测量的疾病存在之前或之后开始。
可以在本领域技术人员已知的一个或多个眼色素层炎的临床前模型中评价化合物。这些包括但不限于实验性自身免疫眼色素层炎(EAU)和内毒素诱导型眼色素层炎(EIU)的模型。EAU实验可以在兔、大鼠或小鼠中进行，且可以包括被动或主动免疫。例如，许多视网膜抗原可以用来使动物对相关免疫原致敏，此后可以用相同抗原对动物进行眼部攻击。EIU模型是更急性的，包括局部或全身给药亚致死剂量的脂多糖。EIU和EAU模型二者的终点尤其可以包括眼底检查、组织病理学。这些模型由史密斯等人进行了综述。(Immunology and Cell Biology1998，76，497-512，该文献通过引用并入到此处)。通过经由多个给药途径(例如全身或局部)定量给药来评价活性，该给药可以在可测量的疾病存在之前或之后开始。以上列举的一些模型也可以发展为巩膜炎／浅层巩膜炎，视网膜脉络膜炎，睫状体炎，或者虹膜炎，因此可用于调查化合物治疗这些疾病的潜在活性。
还可以在本领域技术人员已知的一个或多个结膜炎的临床前模型中评价化合物。这些包括但不限于利用豚鼠、大鼠或小鼠的啮齿动物模型。豚鼠模型包括利用主动或被动免疫接种和／或免疫攻击程序与抗原如卵清蛋白或豚草的那些模型(在Groneberg，D.A.等人，Allergy2003，58，1101-1113中进行了综述，该文献通过引用全文并入到此处)。大鼠和小鼠模型在一般设计上类似于豚鼠(也由Groneberg进行了综述)。可通过经由多个给药途径(例如全身或局部)定量给药来评价活性，该给药可以在可测量的疾病存在之前或之后开始。这种研究的终点可以包括例如眼组织如结膜的组织学、免疫学、生物化学或分子分析。
实施例G：对比数据
以下表3提供了实施例1化合物与在美国专利申请公开No.2007／0135461中所述的其他JAK抑制剂相比的效力数据。
表3
Figure BDA0000457047210001621
表3中的JAK1和JAK2数据使用以上实施例A中所述的体外分析程序来获得。表3中的INA-6数据使用以上实施例B的细胞分析程序来获得，其中所使用的癌细胞是INA-6细胞(Burger等人，The HematologyJournal(2001)，2，42-53)。对比例1对应于化合物{1-[4-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环戊基}乙腈；对比例2对应于化合物(1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环戊基}乙腈；对比例3对应于化合物3-(1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环戊基}丙腈；对比例4对应于化合物(1-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环己基}乙腈；而对比例5对应于化合物N′-氰基-4-(氰基甲基)-4-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]哌啶-1-甲脒。
根据以上说明，除了上述描述的内容以外，本发明的各种变型对于本领域技术人员来说是明显的本申请中引用的每一篇参考文献全部内容引入这里供参考。

Claims (9)

1.1-(环丙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基乙腈，或其药用盐。
2.{1-(丙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈，或其药用盐。
3.3-(氰基甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]环丁腈，或其药用盐。
4.{1-(乙基磺酰基)-3-[3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈，或其药用盐。
5.组合物，包含根据权利要求1-4的任一项所述的化合物或其药用盐和至少一种药用载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物适合于口服给药。
7.权利要求1-4任一项的化合物或其药用盐用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗自身免疫病。
8.权利要求1-4任一项的化合物或其药用盐用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗炎性疾病。
9.根据权利要求6-8任一项的用途，其中所述药物适合于口服给药。
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