ES2746805T3

ES2746805T3 - Anticuerpo de PD-1, fragmento de unión a antígeno del mismo y aplicación médica del mismo

Info

Publication number: ES2746805T3
Application number: ES14868918T
Authority: ES
Inventors: Jijun Yuan; Xiangdong Qu; Jufang Lin; Xin Ye; Guoqing Cao; Weikang Tao; Lianshan Zhang; Lei Zhang; Li Yang
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: CN105026428B; NZ721624A; JP6502959B2; IL246137B; WO2015085847A1; JP2017500889A; AU2014361473A1; EP3081576A4; PH12016501120A1; HRP20191678T1; CN105026428A; SI3081576T1; EA035037B1; US20190309069A1; PE20160953A1; LT3081576T; CA2932966A1; SG11201604738TA; DK3081576T3; AU2014361473B2

Abstract

Un anticuerpo de PD-1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente; y una región variable de cadena pesada que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo de PD-1, fragmento de unión a antígeno del mismo y aplicación médica del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo de PD-1, un fragmento de unión a antígeno de PD-1, un anticuerpo quimérico y anticuerpos humanizados que comprenden la CDR del anticuerpo de PD-1, así como una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de PD-1 y el fragmento de unión a antígeno del mismo, así como su uso como fármaco contra el cáncer.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia tumoral es un punto caliente en el área terapéutica del tumor desde hace mucho tiempo, la inmunoterapia del cáncer asociada a los linfocitos T está en la posición central. La inmunoterapia tumoral afecta a los tumores al utilizar y movilizar completamente los linfocitos T citotóxicos en pacientes con tumores; puede ser la forma más eficaz y segura para el tratamiento del cáncer. Al mismo tiempo, el escape tumoral es un gran obstáculo que enfrenta la inmunoterapia tumoral, en la cual las células cancerosas promueven el rápido crecimiento del tumor a través de su efecto inhibitorio sobre el sistema inmunitario.

Existe una relación extremadamente compleja entre el mecanismo de escape inmunitario del tumor y la respuesta inmunitaria del cuerpo a los tumores. En la etapa temprana de la inmunoterapia tumoral, los linfocitos citolíticos específicos de tumor tienen actividad biológica, pero pierden la función citolítica en la etapa tardía del crecimiento tumoral. Por lo tanto, la inmunoterapia tumoral es potenciar al máximo la respuesta del propio sistema inmunitario del paciente al tumor. La clave de la inmunoterapia tumoral no es solo activar la respuesta del sistema inmunitario existente, sino también mantener la duración e intensidad de la respuesta del sistema inmunitario.

La activación de linfocitos T humanos in vivo se implementa mediante un sistema de dos vías de señalización que no solo necesita enviar un péptido de antígeno MHC a través de células presentadoras de antígeno a los linfocitos T para proporcionar una primera señal, sino que también requiere una serie de moléculas coestimuladoras para proporcionar una segunda señal, y después los linfocitos T muestran una respuesta inmunitaria normal. Este sistema de doble señalización desempeña un papel vital en el equilibrio del sistema inmunitario y regula estrictamente las diferentes respuestas inmunitarias estimuladas por antígenos endógenos y exógenos. La ausencia de una segunda señal proporcionada por las moléculas coestimuladoras dará como resultado una falta de respuesta o una respuesta inmunitaria de linfocitos T específica sostenida, lo que conducirá a la tolerancia. Por lo tanto, la segunda vía de señal desempeña un papel regulador clave en todo el proceso de la respuesta inmunitaria.

La proteína de muerte celular programada-1 (PD-1), encontrada en 1992, es un receptor de proteína expresado en la superficie de los linfocitos T y está involucrada en la apoptosis celular. PD-1 pertenece a la familia CD28, muestra una homología del 23% en la secuencia de aminoácidos con el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), pero se expresa principalmente en linfocitos T activados, linfocitos B y células mieloides, que es diferente de CTLA. PD-1 tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2 respectivamente. El PD-L1 se expresa predominantemente en linfocitos T, linfocitos B, macrófagos y células dendríticas (CD) y la expresión está regulada positivamente en las células activadas. La expresión de PD-L2 se limita principalmente a las células presentadoras de antígeno, tal como los macrófagos activados y las células dendríticas.

Nuevos estudios han detectado una alta expresión de la proteína PD-L1 en tejidos tumorales humanos tal como el cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer renal, melanoma y otros, y los niveles de expresión de PD-L1 están estrechamente relacionados con la afección clínica y el pronóstico de los pacientes. Debido a que PD-L1 inhibe la proliferación de linfocitos T a través de la segunda vía de señalización, el bloqueo de la unión de PD-L1/PD-1 se convierte en un objetivo muy prometedor en el campo de la inmunoterapia tumoral.

El documento WO 2011/110621 divulga un anticuerpo agonista humanizado que se une a PD-1 humana, usos terapéuticos del mismo, composiciones y métodos para producir dicho anticuerpo. El documento WO 2008/156712 divulga anticuerpos que bloquean la unión del Receptor de Muerte Programada Humano (hPD-1) a sus ligandos (hPD-1-L1 o hPD-1-L2) y sus secuencias de región variable, así como un método para aumentar la actividad (o reducir la modulación negativa) de una respuesta inmunitaria a través de la vía de PD-1. Melero et al. (2013) Clin Cancer Res 19(5): 997-1008 indican ensayos clínicos con diferentes mAb anti-PD-1 para tratar tumores.

Actualmente, hay varias compañías farmacéuticas multinacionales dedicadas a los anticuerpos monoclonales contra PD-1, que maximizan la respuesta autoinmunitaria de los pacientes contra el tumor al bloquear la unión de PD-Ll/PD-1 y lograr secuencialmente el propósito de destruir las células tumorales, tal como el documento WO2009114335. En los resultados clínicos de los anticuerpos monoclonales contra PD-1 de BMS y Merck, se ha observado cierta tasa de respuesta en cáncer de pulmón no microcítico, melanoma y carcinoma renal, y la tasa de respuesta mostró una relevancia notablemente alta con la expresión de PD-L1 en tumores, que sugirió que el anticuerpo de PD-1 ejerce un efecto positivo sobre los tumores.

La presente invención proporciona un anticuerpo de PD-1 con alta afinidad, alta selectividad y alta actividad biológica. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

una región variable de cadena ligera que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y Se Q ID NO: 8, respectivamente; y

una región variable de cadena pesada que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID n O: 5, respectivamente.

También se proporciona una molécula de ADN que codifica el anticuerpo, un vector de expresión que comprende la molécula de ADN, una célula hospedadora transformada con el vector de expresión, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno y usos médicos del anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno y de la composición farmacéutica.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

una región variable de cadena ligera que comprende al menos una LCDR seleccionada de esas secuencias como se muestra en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; y

una región variable de cadena pesada que comprende al menos una HCDR seleccionada de esas secuencias como se muestra en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena ligera comprende una LCDR1 como se muestra en la SEQ ID NO: 6.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena ligera comprende una LCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 7.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena ligera comprende una LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 8.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena pesada comprende una HCDR1 como se muestra en la SEQ ID NO: 3.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena pesada comprende una HCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 4.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena pesada comprende una HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 5.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena ligera comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente.

En el presente documento se describe un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena pesada comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y s Eq ID NO: 5, respectivamente.

Se proporciona un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la región variable de cadena ligera comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente; y en donde la región variable de cadena pesada comprende una HCDR1, una h Cd R2 y una HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo murino o un fragmento del mismo.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo murino o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la región variable de cadena ligera comprende además la FR de cadena ligera de la cadena murina k, A o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo murino o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento comprende además una región constante de cadena ligera de cadena k, A murina o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo murino o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la región variable de cadena pesada comprende además la FR de cadena pesada de las IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 murinas o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo murino o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento comprende además una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 murinas o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 o fragmento de unión a antígeno proporcionado en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 quimérico o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la secuencia de la región variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico es la SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico es la SEQ ID NO: 9.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo de PD-1 quimérico o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento comprende además una región constante de cadena ligera de cadena k, A humana o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo de PD-1 quimérico o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento comprende además una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana o una variante de la misma, preferentemente comprende una región constante de cadena pesada de IgG2 o IgG4 humana, o la de IgG1 que no tiene ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) después de la mutación de aminoácidos.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno proporcionado en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende además la FR de cadena ligera de la cadena k, A humana o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la secuencia de la FR de cadena ligera de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado deriva de una secuencia combinada de las cadenas ligeras de la línea germinal humana IGKV1-39 y JK4 como se muestra en la SEQ ID NO: 14, que comprenden FR1, FR2 y FR3 de IGKV 1-39 y FR4 de JK4.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo humanizado se muestra en la SEQ ID NO: 12 o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la variante de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende una mutación de 0-10 aminoácidos en la región variable de cadena ligera, preferentemente A43S.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento comprende además una región constante de cadena ligera de cadena k, A humana o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la región variable de cadena pesada comprende además la FR de cadena pesada de las IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas o una variante de la misma.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 humanizado o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la secuencia de la FR de cadena pesada de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado deriva de una secuencia combinada de las cadenas pesadas de la línea germinal humana IgHV3-7 y JH6 como se muestra en la SEQ ID NO: 13, que comprenden FR1, f R2 y FR3 de IgHV3-7 y FR4 de JH6.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo humanizado se muestra en la SEQ ID NO: 11 o una variante de la misma; en donde la variante comprende preferentemente una mutación de 0-10 aminoácidos en la región variable de cadena pesada, más preferentemente G44R.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo de PD-1 humanizado o el fragmento del mismo proporcionado en el presente documento comprende además una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas o una variante de la misma, y preferentemente comprende una región constante de cadena pesada de IgG2 humana o IgG4 humana que no tiene ADCC, o la de IgG1 humana que no tiene ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) después de la mutación de aminoácidos. La variante es preferentemente una mutación de región constante de cadena pesada que causa atenuación o deficiencia de ADCC, y más preferentemente N297A, L234A, L235A de IgG 1, quimera IgG2/4 y F235E o L234A/E235A de IgG4.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con el anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno proporcionado en el presente documento, el fragmento de unión a antígeno es Fab, Fv, sFv o F(ab')².

La presente invención proporciona además una molécula de ADN que codifica el anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno descrito anteriormente.

La presente invención proporciona además un vector de expresión que comprende la molécula de ADN como se describe anteriormente.

La presente invención proporciona además una célula hospedadora transformada con el vector de expresión como se describe anteriormente.

En una realización preferida de la presente invención, de acuerdo con la célula hospedadora proporcionada en el presente documento, la célula hospedadora es bacteria, preferentemente E. coli.

En una realización preferida de la presente invención, La célula huésped proporcionada en el presente documento es levadura, preferentemente Pichia pastoris.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento y un excipiente, diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además el uso del anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno descrito anteriormente, o la composición farmacéutica que contiene el mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer, más preferentemente cáncer que expresa PD-L1; y el cáncer es preferentemente cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer renal, melanoma y más preferentemente cáncer de pulmón no microcítico, melanoma y cáncer renal.

La presente divulgación proporciona además un anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno, o la composición farmacéutica que contiene el mismo para su uso en el tratamiento y prevención de la enfermedad o trastorno mediados por PD-1, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, o la composición farmacéutica que lo comprende; en donde la enfermedad es preferentemente cáncer, más preferentemente cáncer que expresa PD-L1; el cáncer es, preferentemente, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer renal, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico y más preferentemente cáncer de pulmón no microcítico, melanoma y cáncer renal.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica humana. El resultado muestra que el anticuerpo de PDb-1 mAb005 de prueba puede estimular de manera eficaz la proliferación de células mononucleares de sangre periférica humana, con una CE50 de 83 ng/ml.

Figura 2: Prueba de secreción de citocina IFN-y de células mononucleares de sangre periférica humana. El resultado muestra que el anticuerpo de PD-1 mAb005 de prueba puede estimular la proliferación de PBMC y al mismo tiempo estimular de manera eficaz la secreción de citocina IFN-y, con una CE50 de 13 ng/ml.

Figura 3: efecto inhibitorio del anticuerpo de PD-1 H005-1 sobre el crecimiento de células de glioma.

Figura 4: diagrama que muestra el cambio en el volumen tumoral después del tratamiento.

Figura 5: diagrama que muestra el cambio de peso de los ratones después del tratamiento.

Descripción detallada de la invención

1. Definiciones

Para entender más fácilmente la invención, se definen, de manera específica, determinados términos técnicos y científicos a continuación. A menos que se defina específicamente en otra parte del presente documento, todos los demás términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el código de una letra y el código de tres letras para aminoácidos son como se describen en J. biol. chem, 243, (1968) p3558.

Tal como se usa en el presente documento, "Anticuerpo" se refiere a inmunoglobulina, una estructura de cadena de cuatro péptidos conectados entre sí por enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Las diferentes regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina muestran diferentes composiciones de aminoácidos y órdenes de clasificación, presentando así diferentes tipos de antigenicidad. En consecuencia, las inmunoglobulinas se pueden dividir en cinco categorías, o denominar isotipos de inmunoglobulinas, a saber, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, sus cadenas pesadas son cadena p, cadena 8, cadena y, cadena a y cadena £, respectivamente. De acuerdo con su composición de aminoácidos de la región bisagra y el número y ubicación de los enlaces disulfuro de la cadena pesada, el mismo tipo de Ig puede dividirse en diferentes subcategorías, por ejemplo, IgG puede dividirse en IgG 1, IgG2, IgG3, y IgG4. La cadena ligera se puede dividir en una cadena k o A considerando diferentes regiones constantes. Cada una de las cinco Ig puede tener una cadena k o A.

En la presente invención, la región variable de cadena ligera del anticuerpo mencionada en el presente documento comprende además una región constante de cadena ligera, que comprende una cadena k, A humana o murina o una variante de la misma.

En la presente invención, la región variable de cadena pesada del anticuerpo mencionada en el presente documento comprende además una región constante de cadena pesada, que comprende IgG1, 2, 3, 4 humana o murina o una variante de la misma.

Cerca de la secuencia N-terminal de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, la secuencia de aproximadamente 110 aminoácidos varía en gran medida, conocida como la región variable (región V); el resto de la secuencia de aminoácidos cerca del extremo C es relativamente estable, conocida como la región constante (región C). La región variable comprende tres regiones hipervariables (HVR) y cuatro regiones marco de secuencias relativamente conservadas (FR). Las tres regiones hipervariables determinan la especificidad del anticuerpo, también conocidas como regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Cada región variable de cadena ligera (LCVR) y cada región variable de cadena pesada (HCVR) se compone de tres CDR y cuatro FR, con un orden secuencial desde el amino terminal al carboxilo terminal: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Tres CDR de cadena ligera se refieren a LCDR1, LCDR2 y LCDR3; tres CDR de cadena pesada se refieren a HCDR1, HCDR2 y HCDR3. Los números y localizaciones de los restos de aminoácidos de CDR en LCVR y HCVR del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno en el presente documento corresponden a los criterios de numeración de Kabat conocidos (LCDR1-3, HCDE2-3), o corresponden a los criterios de numeración de Kabat y Chothia (HCDR1).

La expresión "anticuerpo murino" en la presente invención se refiere al anticuerpo monoclonal anti-PD-1 humana preparado de acuerdo con el conocimiento y las habilidades en la técnica. Durante la preparación, se inyectó un objeto de prueba con antígeno PD-1 y después se separó el anticuerpo que expresa hibridoma que posee la secuencia o las características funcionales deseadas. En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo de PD-1 murino o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además una región constante de cadena ligera de cadena k, A murina o una variante de la misma o comprende además una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 murina o una variante de la misma.

La expresión "anticuerpo quimérico", es un anticuerpo que se forma al fusionar la región variable de un anticuerpo murino con la región constante de un anticuerpo humano, el anticuerpo quimérico puede aliviar la respuesta inmunitaria inducida por el anticuerpo murino. Para establecer un anticuerpo quimérico, primero se establece el hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal murino específico, se clona un gen de región variable a partir de células de hibridoma de ratón, después se clona un gen de región constante de un anticuerpo humano según se desee, el gen de región variable de ratón se une con el gen de región constante humana para formar un gen quimérico que puede insertarse en un vector humano, y finalmente la molécula de anticuerpo quimérico se expresa en el sistema industrial eucariota o procariota. En una realización preferida de la presente invención, la región variable de cadena ligera del anticuerpo de PD-1 quimérico comprende además la FR de cadena ligera de la cadena k, A murinas o una variante de la misma y la secuencia de la región variable de cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 10. La región variable de cadena pesada del anticuerpo de PD-1 quimérico comprende además la FR de la cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 murinas o una variante de la misma, y la secuencia de la región variable de cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 9. La región constante de un anticuerpo humano se selecciona de la región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana o una variante de la misma, preferentemente comprende una región constante de cadena pesada de IgG2 o IgG4 humana, o la de IgG1 humana que no tiene ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) después de la mutación de aminoácidos.

La expresión "anticuerpo humanizado", también conocido como anticuerpo injertado con CDR, se refiere a un anticuerpo generado por injerto de secuencias de CDR murinas en una región marco de región variable de un anticuerpo humano, a saber, una secuencia de marco de anticuerpo de línea germinal humana de diferente tipo. El anticuerpo humanizado supera la respuesta de anticuerpo desventajosamente fuerte inducida por el anticuerpo quimérico que porta una gran cantidad de componentes de proteína murina. Dichas secuencias marco pueden obtenerse de una base de datos de ADN pública que cubre secuencias de genes de anticuerpos de línea germinal o referencias publicadas. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal de los genes de la región variable de la cadena ligera y pesada humana se pueden encontrar en la base de datos de la secuencia de la línea germinal humana "VBase" (disponible en la webwww. mrccpe. com. ac. uk/vbase), así como se puede encontrar en Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. En una realización preferida de la invención, las secuencias de CDR murinas del anticuerpo de PD-1 humanizado se seleccionan de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Las regiones marco de la región variable del anticuerpo humano se diseñaron y seleccionaron de tal manera que la secuencia de la FR de la cadena ligera de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo deriva de la secuencia de combinación de las cadenas ligeras de la línea germinal humana IGKV1-39 y JK4: SEQ ID NO: 14, que comprenden FR1, FR2 y FR3 de IGKV 1-39 y FR4 de JK4; la secuencia de la FR de la cadena pesada de la región variable de cadena pesada del anticuerpo deriva de la secuencia de combinación de las cadenas pesadas de la línea germinal humana IgHV3-7 y JH6: SEQ ID NO: 13, que comprenden FR1, FR2 y FR3 de IgHV3-7 y FR4 de JH6. Para evitar la disminución de la actividad durante la reducción de la inmunogenicidad, la región variable del anticuerpo humano se somete a una mutación inversa mínima para mantener la actividad.

Tal como se usa en el presente documento, "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F (ab') 2 con actividad de unión a antígeno, así como a un fragmento Fv, fragmento sFv, que se une con PD-1 humana; que comprende una o más regiones CDR de anticuerpos descritas en la presente invención seleccionadas del grupo consiste en la SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 8. El fragmento Fv es un fragmento de anticuerpo mínimo que comprende una región variable de cadena pesada, una región variable de cadena ligera y todos los sitios de unión a antígeno sin una región constante. En general, el anticuerpo Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL, y es capaz de formar una estructura requerida para la unión al antígeno. Asimismo, se pueden usar diferentes enlazadores para conectar las regiones variables de dos anticuerpos para formar un polipéptido, denominado anticuerpo de cadena sencilla o Fv de cadena sencilla (sFv). Tal como se usa en el presente documento, la expresión "que se une con PD-1", significa que interacciona con PD-1 humana. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "determinante antigénico" de la presente invención, se refiere a sitios tridimensionales discontinuos sobre el antígeno, reconocidos por el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término "ADCC", a saber, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, se refiere a las células que expresan receptores de Fc que destruyen directamente a las células diana recubiertas por un anticuerpo mediante el reconocimiento del segmento Fc del anticuerpo. La función efectora de ADCC del anticuerpo puede reducirse o eliminarse mediante la modificación del segmento Fc en IgG. La modificación se refiere a mutaciones de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, tales como mutaciones seleccionadas de N297A, L234A, L235A en IgG 1; quimera IgG2/4; mutaciones F235E o L234A/E235A en IgG4.

Tal como se usa en el presente documento, la proteína de fusión descrita en la presente divulgación es un producto proteico obtenido por expresión conjunta de dos genes mediante tecnología de a Dn recombinante. Proteína de fusión de Fc con dominio extracelular de PD-1 recombinante obtenida expresando de manera conjunta un dominio extracelular de PD-1 y un fragmento Fc de anticuerpo humano mediante tecnología de ADN recombinante. El dominio extracelular de PD-1 se refiere al resto de PD-1 fuera de la citomembrana, cuya secuencia es la región de trazado de la SEQ ID NO: 1 a continuación.

Los métodos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Capítulos 5 8 and 15. Por ejemplo, los ratones se pueden inmunizar con PD-1 humana, o fragmentos de la misma, y los anticuerpos resultantes se pueden renaturalizar, purificar y secuenciar usando métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Los fragmentos de unión a antígeno también se pueden preparar por métodos convencionales. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la presente invención está modificado genéticamente para introducir una o más regiones marco humanas (FR) en una CDR derivada no humana. Las secuencias de línea germinal de FR humanas se pueden obtener de ImMunoGeneTics (IMGT) a través de su sitio webhttp: //imgt. cines. fr o de The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351. De manera específica, la línea germinal de FR de cadena ligera para su uso en el anticuerpo o en el fragmento de unión a antígeno de la presente invención incluye A3 y O2. La línea germinal de FR de cadena pesada particular para su uso en el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la presente invención incluye VH3-21 y VH3-23.

El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno modificado genéticamente de la presente invención puede prepararse y purificarse usando métodos convencionales. Por ejemplo, Las secuencias de ADNc que codifican una cadena pesada (SEQ ID NO: 11) y una cadena ligera (SEQ ID NO: 12) pueden clonarse y recombinarse en un vector de expresión de GS. El vector de expresión de inmunoglobulina recombinada puede después transfectar establemente células CHO. Como un método más recomendado bien conocido en la técnica, la expresión de anticuerpos en mamíferos dará como resultado la glucosilación, típicamente en el extremo N altamente conservado en la región FC. Los clones estables se pueden obtener mediante la expresión de un anticuerpo que se une específicamente a PCSK9 humano. Los clones positivos pueden expandirse en un medio de cultivo sin suero para la producción de anticuerpos en biorreactores. El medio de cultivo, en el que se ha secretado un anticuerpo, puede purificarse mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, el medio se puede aplicar convenientemente a una columna de proteína A o G Sepharose FF que se ha equilibrado con un tampón compatible. La columna se lava para eliminar componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido se eluye por gradiente de PH y SDS-PAGe detecta los fragmentos de anticuerpo y después se agrupan. El anticuerpo puede filtrarse y concentrarse usando técnicas habituales. El agregado soluble y los multímeros pueden eliminarse de manera eficaz mediante técnicas habituales, incluyendo la exclusión de tamaño o el intercambio iónico. El producto obtenido puede congelarse inmediatamente, por ejemplo a -70 ° C, o puede liofilizarse.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal o mAb, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que deriva de un solo clon que incluye, pero sin limitación, cualquier clon eucariota, procariota o de fago. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno monoclonales pueden recombinarse, por ejemplo, mediante tecnologías de hibridoma, tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas (por ejemplo, injerto de CDR) u otras tecnologías conocidas en la técnica.

"Administración" y "tratamiento", tal como se aplica a un animal, ser humano, sujeto experimental, célula, tejido, órgano o fluido biológico, se refiere a poner en contacto un agente o composición farmacéuticos, terapéuticos o de diagnóstico exógenos con el animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. "Administración" y "tratamiento" pueden referirse, por ejemplo, a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula abarca poner en contacto un reactivo con la célula, así como poner en contacto un reactivo con un fluido, donde el fluido está en contacto con la célula. "Administración" y "tratamiento" también significa tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, por un reactivo, compuesto de diagnóstico de unión o por otra célula. "Tratamiento", como se aplica a un ser humano, veterinario, o a un sujeto de investigación, se refiere al tratamiento terapéutico, medidas profilácticas o preventivas, a aplicaciones de investigación y diagnóstico.

"Tratar " significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que comprende cualquiera de los compuestos de unión de la presente invención, interna o externamente a un paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad para los cuales el agente tiene actividad terapéutica conocida. Generalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntomas de la enfermedad en el paciente o la población tratada, ya sea induciendo la regresión de o inhibiendo la progresión de tales síntomas en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad en particular (también denominada "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad y el peso del paciente, y la capacidad del fármaco para desencadenar una respuesta deseada en el paciente. Se puede evaluar si se ha aliviado un síntoma de la enfermedad mediante cualquier medición clínica que generalmente usan los médicos u otros proveedores de atención médica cualificados para evaluar la gravedad o el estado de progresión de ese síntoma. Si bien una realización de la presente invención (por ejemplo, un anticuerpo de PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer) puede no ser eficaz para aliviar los síntomas de la enfermedad de interés en cada paciente, debería aliviar los síntomas de la enfermedad objetivo de interés en un número estadísticamente significativo de pacientes según lo determinado por cualquier prueba estadística conocida en la técnica, como la prueba t de Student, la prueba de chicuadrado, la prueba U de acuerdo con Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

"Modificaciones conservativas" o "reemplazo o sustitución conservativa" se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína con otros aminoácidos que tienen características similares (p. ej. Carga, tamaño de cadena lateral, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.), de modo que los cambios se pueden realizar con frecuencia sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Ed.)). Además, las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de interrumpir la actividad biológica.

"Que consiste esencialmente en", o su variación, tal como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, indica la inclusión de cualquier elemento o grupo de elementos enumerados, y la inclusión opcional de otros elementos de naturaleza similar o diferente a los elementos enumerados, que no cambian materialmente las propiedades básicas o novedosas del régimen de dosificación, método o composición especificados. A modo de ejemplo no limitante, un compuesto de unión que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos enumerada también puede incluir uno o más aminoácidos que no afectan materialmente a las propiedades del compuesto de unión.

La "cantidad eficaz" abarca una cantidad suficiente para mejorar o prevenir un síntoma o signo de una afección médica. La cantidad eficaz también significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnóstico. Una cantidad eficaz para un paciente o un sujeto veterinario particular puede variar dependiendo de factores tales como la afección a tratar, la salud general del paciente, la vía y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios. Una cantidad eficaz puede ser la dosis máxima o el protocolo de dosificación que evita efectos secundarios o efectos tóxicos significativos.

"Exógeno " se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, célula o cuerpo humano, dependiendo del contexto. "Endógeno" se refiere a sustancias que se producen dentro de una célula, organismo o cuerpo humano, dependiendo del contexto.

"Homología" se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos polipéptidos. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácidos, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x100. Por ejemplo, si 6 de 10 posiciones en dos secuencias son coincidentes u homólogas cuando las secuencias están alineadas óptimamente, entonces las dos secuencias son 60% homólogas. En general, se hace la comparación cuando dos secuencias se alinean para proporcionar el máximo porcentaje de homología.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas esas designaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas", incluyen la célula primaria sujeto y los cultivos derivados de los anteriores sin considerar el número de transferencias. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada para la célula originalmente transformada. Cuando se propongan designaciones distintas, esto será evidente según el contexto.

Tal como se usa en el presente documento, "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en el que se amplifican pequeñas cantidades de un resto específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN, como se describe en, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 4.683.195. En general, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá debe estar disponible, de modo que se puedan diseñar cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas correspondientes del molde a amplificar. Los nucleótidos 5 ' terminales de los dos cebadores pueden ser idénticos a los extremos del material a amplificar. La PCR se puede utilizar para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas a partir de ADN genómico total y ADNc transcrito a partir de secuencias de ARN celular total, bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase generalmente Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51: 263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N. Y. ). Tal como se usa en el presente documento, la PCR se considera como uno, pero no el único, ejemplo de un método de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico, que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un resto específico del ácido nucleico.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que puede producirse el evento o situación que sigue, pero no necesariamente, y la descripción incluye los casos en que se produce o no se produce el evento o circunstancia. Por ejemplo, "opcionalmente comprende 1-3 regiones variables de cadena pesada de anticuerpo" significa que la región variable de cadena pesada de anticuerpo con secuencia específica puede, pero no necesariamente estar presente.

"Composición farmacéutica" se refiere a una que contiene una mezcla de uno o más compuestos de acuerdo con la presente invención o una sal o profármaco de los mismos fisiológicamente/farmacéuticamente aceptable con otros componentes químicos, así como componentes adicionales tales como transportadores y excipientes fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica tiene como objetivo promover la administración a un organismo, facilitando la absorción del principio activo y ejerciendo así un efecto biológico.

Descripción detallada de la invención

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describe adicionalmente con referencia a los ejemplos. En los ejemplos de la presente invención, cuando no se describen condiciones específicas, los experimentos se realizan generalmente en condiciones convencionales como se describe en el Manual de Laboratorio de Tecnología de Anticuerpos y el Manual de Clonación Molecular de Cold Spring Harbor, o en condiciones propuestas por los fabricantes del material o producto. Cuando la fuente de los reactivos no se proporciona específicamente, los reactivos son reactivos convencionales disponibles comercialmente.

Ejemplo 1 Preparación de Anticuerpo

Se generaron anticuerpos monoclonales murinos contra PD-1 humana. La proteína de fusión dominio extracelular de PD-1 recombinante purificada-Fc (PD-1 Fc) (SEQID NO: 1); o células Ch O transfectadas con PD-1 (SEQ ID NO: 2) se usaron como antígeno para inmunizar ratones Balb/C y ratones SJL. el antígeno PD-1 humano se adquirió de ORIGENE, n.° de cat. SC117011, Secuencia de referencia NCBI: NM_005018.1.

PD-1 Fc, proteína de fusión dominio extracelular de PD-1 recombinante-Fc (SEQ ID NO: 1):

MDMKVPAOI.LGLL1.I .VVKPOSRCPGWFI.DSPDRPWNPPTFSPAI.EWTEGDN ATE

KSFSNTSESFVENVYYRM SPSNOTDKEAAFPEDRSOPGOrX’RFRVTOl-PNGRDF H yiSVVRARRN DSGTYLCGAISI.APKAOlKESLRAELRVTERRAKVPTAHPSPSPR

PAGOFOTLVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV

SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKE

YKCKVSNKA1PAP1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGF

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCS

v m h e a l h n h y t q k s l s l s p g k .

PD-1, células transfectantes de antígeno PD-1 (SEQ ID NO: 2):

MQ1PQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFT

c s f s n t s e s f v l n w y r m s p s n q t d k l a a f p e d r s o p g q d c r f r v t o l p n g r d f h

M SVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAOtKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRP a g o f q t l v v g w g g l l g s l v l l v w v l a v i c s r a a r g t i g a r r t g q p l k e d p s a v

PVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGP

RSAQPLRPEDGHCSWPL .

La inmunización con la proteína de fusión de dominio extracelular de PD-1-Fc se divide en dosis alta (50ug) y dosis baja (10ug) del antígeno purificado, la inmunización con las células CHO transfectadas con PD-1 usa 0,5-1 x107 células. La inmunización se realizó los días 0, 14 y 35 respectivamente con el adyuvante Completo de Freund; se tomaron muestras de sangre en el sitio retroorbital para controlar la respuesta inmunitaria. Los ratones con título de inmunoglobulina humana anti-PD-1 se obtuvieron mediante ELISA para la detección en plasma. El día 56, los ratones con el mayor título de inmunoglobulina humana anti-PD-1 se sometieron a inmunización reforzada. 3 días más tarde, se sacrificaron los ratones y se retiró el bazo para la fusión. Las fusiones de hibridoma se exploraron y se obtuvo un anticuerpo monoclonal murino mAb005. La secuencia de la región variable de la cadena pesada y la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino mAb005 son las siguientes:

mAb005 HCVR

EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYMMSWVRQTPEKRLEWVAT1SG GGANTYYPDSVKGRFT1SRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARQLYYFDYW GQGTTLTVSS SEQID NO: 9

mAb005 LCVR

D1QMTQSPASQSASLGEGVTITCLASQTIGTWLTVVYQQKPGKSPQLEIYTATSLA

DG VPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQ.AEDFVTYYCQQVYS1PWTFGGG TICLEIK

SEQID NO: 10

Las secuencias de CDR son las siguientes:

Ejemplo 2: Exploración de anticuerpos

Ensayo de unión a ELISA de anticuerpo de PD-1 in vitro:

El anticuerpo de PD-1 bloquea la ruta de señalización de PD-1 y su ligando mediante la unión al dominio extracelular de PD-1. El ensayo ELISA in vitro se usa para detectar la propiedad de unión del anticuerpo de PD-1. La proteína de fusión de dominio extracelular de PD-1 biotinilada FC (PD-1 FC) se recubre sobre placas de 96 pocillos mediante la unión a la avidina de neutralización. La intensidad de la señal después de la adición del anticuerpo se usa para determinar la propiedad de unión del anticuerpo y PD-1.

La avidina de neutralización (unión a biotina) se diluyó a 1 pl/ml con tampón PBS, se pipeteó en una placa de 96 pocillos a 100 pl/pocillo y se mantuvo durante 16 h-20 h a 4 °C. La placa de 96 pocillos se lavó una vez con PBST (PH7,4 PBS, que contenía tweeen20 al 0,05%) después se retiró el tampón PBS, después la placa se incubó y se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con la adición de 120 pl/pocillo de PBST/Leche al 1 %. Después de retirar la solución de bloqueo, la placa se lavó con tampón PBST, seguido de la adición de 1 pg/ml de PD1-FC marcado con biotina que se diluyó con PBST/leche al 1%, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de retirar la solución de bloqueo, la placa se lavó con tampón PBST 3 veces, seguido de la adición del anticuerpo de PD-1 de prueba que se diluyó a una concentración adecuada con PBST/leche al 1%, y se incubó durante 1,5 h a temperatura ambiente. Después de retirar del sistema de reacción, la placa se lavó 3 veces con tampón PBST, seguido de la adición de 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario anti-murino marcado con HRP (The Jackson Laboratory) que se diluyó con PBST/leche al 1%, y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavarse tres veces con PBST, se añadió la placa con 100 pl/pocillo de TMB y se incubó durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Después se terminó la reacción con la adición de 100 pl/pocillo de H²SO⁴1M. El valor de absorbancia a 450 nm se leyó en el lector de microplacas NOVOStar; se calculó el valor de CE⁵⁰de unión a ELISA.

Los resultados demostraron que el anticuerpo mAb005 mostró una excelente actividad de unión al PD-1 Fc humana (PD-1 humana) y al PD-1Fc de cinomolgus (PD-1 cyno).

Ensayo de bloqueo in vitro de la unión del anticuerpo de PD-1 y el ligando PD-1:

PD-L1 sobre la superficie de una célula tumoral muestra un efecto supresor sobre la proliferación de linfocitos T al unirse a PD-1 sobre la superficie de un linfocito T. El anticuerpo de PD-1 bloquea la ruta de señalización PD-L1/PD-1 al unirse a PD-1 para estimular la proliferación de linfocitos T. El ensayo de bloqueo de unión PD-1/PD-L1 se usa para detectar la actividad de bloqueo del anticuerpo de PD-1 sobre la ruta de señalización.

En este experimento, se recubrió una placa de 96 pocillos con una proteína PD-1 con el dominio extracelular fusionado con FC (PD-1-FC), y se incubó con el anticuerpo de prueba de PD-1; más tarde se añadió PD-L1 marcado con biotina para incubación. Después de lavar la placa, se detectó la cantidad de unión de PD-L1 marcada con biotina; se calculó el valor de CI⁵⁰de bloqueo del anticuerpo de PD-1 para la unión del ligando PD-L1.

PD-1-FC se diluyó a 1 pg/ml con tampón CB PH 9,6 (1,59 g de Na2CO3 y 2,93 g de NaHCO3 se disolvieron en 1 l de agua destilada), se pipeteó en una placa de 96 pocillos 100 pl/pocillo y se mantuvo durante 16 h-20 h a 4 °C. La placa de 96 pocillos se lavó una vez con PBST (PH7,4 PBS, que contenía tweeen20 al 0,05%) después se retiró el tampón PBS, después la placa se incubó y se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con 120 pl/pocillo de PBST/leche al 1 %. Después de retirar la solución de bloqueo, la placa se lavó con tampón PBST una vez, seguido de la adición de 90 pl de anticuerpo de PD-1 de prueba que se diluyó a una concentración adecuada con diluyentes de muestra (PH 7,4, PBS que contiene BSA al 5%, Tween20 al 0,05%), y se incubó durante 1 hora a 4 °C. Después, se añadieron a la placa 10 X concentraciones de PD-L1 marcado con biotina (Beijing Sino Biological Inc.) (10 pg/ml) a la placa a 10 pl/pocillo, se hizo oscilar y mezclar con un oscilador, y se incubó a 37 °C durante 1 h. Después de retirar del sistema de reacción, la placa se lavó 6 veces con tampón PBST, seguido de la adición de 100 pl/pocillo de estreptavidina -polímero de peroxidasa que se diluyó con PBST en una proporción de 1:400, y se incubó en oscilación durante 50 minutos a temperatura ambiente. Después de lavarse 6 veces con PBST, se añadió la placa con 100 pl/pocillo de TMB y se incubó durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Después se terminó la reacción con la adición de 100 pl/pocillo de H²SO⁴1M. El valor de absorbancia a 450 nm se leyó en el lector de microplacas NOVOStar; se calculó el valor de CI⁵⁰de bloqueo de PD-1 para la unión del ligando PD-L1.

El resultado mostró que el anticuerpo mAb005 fue muy eficaz para bloquear la unión de PD-L1 con PD-1.

Ejemplo 3: Ensayo de selectividad de unión del anticuerpo de PD-1 in vitro

Para detectar la actividad de unión específica del anticuerpo de PD-1 a otras proteínas de la familia PD-1, se usaron CTLA4 humano y CD28 humano para los ensayos de unión. Entre tanto, la PD-1 de ratones también se usó para ensayos de unión con el fin de determinar la diversidad del anticuerpo de PD-1 para diferentes especies distintas de humanos/monos.

Proteínas de unión selectiva: PD-1 humana, ICOS humana, CTLA4 humana, CD28 humana PD-1 de ratón, (Beijing Sino Biological Inc.), se diluyeron respectivamente a 1 pg/ml con tampón PBS, se pipetearon en una placa de 96 pocillos 100 pl/pocillo y se mantuvieron durante 16 h-20 h a 4 °C. La placa de 96 pocillos se lavó una vez con PBST (PH7,4 PBS, que contenía tweeen20 al 0,05%) después se retiró el tampón PBS, después la placa se incubó y se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con 120 pl/pocillo de PBST/leche al 1 %. Después de retirar la solución de bloqueo, la placa se lavó con tampón PBST 3 veces, seguido de la adición del anticuerpo de PD-1 de prueba, y se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Después de retirar del sistema de reacción, la placa se lavó 3 veces con PBST, seguido de la adición de 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario anti-murino marcado con HRP (The Jackson Laboratory) que se diluyó con PBST/leche al 1%, y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con PBST, seguido de adición de 100 pl/pocillo de TMB y se incubó durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Después se terminó la reacción con la adición de 100 pl/pocillo de H²SO⁴1M. El valor de absorbancia a 450 nm se leyó en el lector de microplacas NOVOStar.

El resultado demostró que el anticuerpo mAb005 no muestra actividad de unión específica a otras proteínas de la familia PD-1. Entre tanto, el mAb no tiene reactividad cruzada de especies contra la PD-1 murina.

Ejemplo 4: Ensayo de unión celular in vitro del anticuerpo de PD-1

FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) es un método de prueba para detectar la interacción de proteínas y células. La prueba se usa para detectar la actividad de unión del anticuerpo de PD-1 al PD-1 natural expresada en la superficie celular. Las células utilizadas en la prueba son células CHO que expresan altamente PD-1 (véase Ejemplo 1, células CHO transfectadas con PD-1 (SEQID NO: 2)).

Las células CHO que expresan altamente PD-1 se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos, y el sedimento se recogió y se suspendió con 10-15 ml de tampón de flujo enfriado previamente para el recuento celular. Las células se centrifugaron a 1000 rpm en tubos de centrífuga de 50 ml durante 5 minutos y se recogieron. Después de la retirada del sobrenadante, el sedimento se resuspendió con tampón de bloqueo enfriado previamente con una densidad de 0,5-1,0X107 células/ml. Después de la incubación a 4 °C durante 30 minutos, la resuspensión se pipeteó a la placa de 96 pocillos a 100 pl/pocillo. La placa de 96 pocillos se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se descartó. Se añadieron 100 pl de anticuerpo primario a cada pocillo; las células se resuspendieron y se incubaron en la oscuridad durante 60 minutos a 4 °C. Después de la centrifugación y descarte del sobrenadante, se añadieron 100 pl de anticuerpo secundario marcado con FITC (BD Biosciences) diluido a 1:400. Las células se resuspendieron y se incubaron en la oscuridad durante 60 minutos a 4 °C. Se lavaron las células dos veces con tampón de flujo, se resuspendieron y se fijaron con formaldehido al 1% para un ensayo de citometría de flujo.

Los resultados muestran que el anticuerpo mAb005 también puede unirse a PD-1 en la superficie celular.

Ejemplo 5: Afinidad de unión in vitro y ensayo cinético

El método Biacore es un ensayo reconocido que detecta objetivamente la afinidad de interacción y la cinética de las proteínas. Se analizó la afinidad caracterizada y la cinética de unión del anticuerpo de PD-1 de prueba de la presente invención por Biacore (GE).

De acuerdo con las instrucciones de un kit proporcionado por Biacore, el anticuerpo de PD-1 de prueba de la presente invención se unió covalentemente al chip CM5 (GE) usando un método de acoplamiento de aminoácidos convencional. Después, una serie de concentraciones gradientes de la proteína PD-1 His (Beijing Sino Biological Inc.), que se diluyeron en el mismo tampón, se cargaron sucesivamente en cada ciclo. Después de eso, las muestras se regeneraron con reactivo regenerado en el kit. La cinética de unión antígeno-anticuerpo se rastreó durante 3 minutos y la cinética de disociación se rastreó durante 10 minutos. Se analizaron los datos obtenidos mediante el software de evaluación BIA de GE utilizando el modelo de unión 1:1 (Langmuir). Los valores de Ka (kon), kd (koff) y KD determinados por el ensayo se muestran en la siguiente tabla.

Los resultados mostraron que el valor de Kd de unión del anticuerpo mAb005 a PD-1 alcanzó 3,57 nM.

Ejemplo 6 Prueba de citología in vitro

El ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica humanas nuevas (PBMC) afectado por el anticuerpo se usa para detectar la actividad celular del anticuerpo mAb005.

La densidad de PBMC humanas nuevas se ajustó a 2x106/ml, se sembraron en una placa de 6 pocillos a 2 ml/pocillo, y se incubaron durante 6 horas a 37 °C, CO²al 5 %. Después de descartar las células en suspensión, cada pocillo de células adherentes se mezcló con 2 ml de medio RPMI1640 que contenía 100 ng/ml de GM-CSF (factor biológico estimulante de colonias de granulocitos) y 100 ng/ml de IL-4, y otro 1 ml de medio RPMI1640 que contiene 100 ng/ml de GM-CSF y 100 ng/ml de IL-4 después de la incubación durante 2 días, después las células se cultivaron continuamente durante 2 días, seguido de la adición de 100 ng/ml de TNF-a (factor de necrosis tumoral-a) en cada pocillo y se cultivaron durante otros 2 días para obtener células dendríticas maduras. Las células dendríticas y los linfocitos T alogénicos se centrifugaron y resuspendieron respectivamente a una concentración de 1x106/ml y 1x105/ml, y se pipetearon en una placa de 96 pocillos a 100 pl/ pocillo, seguido de la adición de 20 pl/ pocillo de anticuerpo que se diluyó a diferentes gradientes de concentración con PBS, y las células se cultivaron en 37 °C, incubadora de CO²al 5% durante 5 días. A continuación, se tomaron muestras de 100 pl de cultivo celular para detectar la proliferación celular con el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo®. El resultado se muestra en la Figura 1, indicando que el anticuerpo de PDb-1 mAb005 de prueba puede estimular de manera eficaz la proliferación de células mononucleares de sangre periférica humana, con una CE50 de 83 ng/ml. La muestra restante se detectó para la secreción de citocina IFN-y. El resultado se muestra en la Figura 2, que demuestra que el anticuerpo de PD-1 mAb005 de prueba podría estimular la proliferación de PBMC y al mismo tiempo estimular de manera eficaz la secreción de citocina IFN-y, con una CE50 de 13 ng/ml.

Ejemplo 7: Humanización de anticuerpos murinos

Con referencia a las secuencias de la región variable de la cadena ligera (LCVR de mAb005, SEQ ID NO: 10) y la región variable de la cadena pesada (HCVR de mAb005, SEQ ID NO: 9) del anticuerpo mAb005, los moldes humanizados mejor coincidían con su no-CDR en la base de datos de Germline. El molde de la cadena pesada del anticuerpo es IgHV3-7/JH6, seleccionando FR1, FR2, FR3 de la cadena ligera de la línea germinal humana IGKV1-39 y FR4 de JK4, con la secuencia de la SEQ ID NO: 13; el molde de la cadena ligera es IGKV1-39/JK4, seleccionando FR1, FR2, FR3 de la cadena ligera de la línea germinal humana IGKV1-39 y FR4 de JK4, con la secuencia de SEQ ID NO: 14.

Molde de cadena pesada de línea germinal humana (SEQ ID NO: 13):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQ

DGSEKYYVDSVKGRFT1SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTTV

TVSS-,

Molde de cadena ligera de línea germinal humana (SEQ ID NO: 14):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS

SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFGGGTKVEIK .

La CDR del anticuerpo murino se injertó en el molde de humanización seleccionado, reemplazando la CDR del molde humano, y después se recombinó con la región constante de IgG4 para obtener un anticuerpo humanizado H005-1. A continuación, basándose en la estructura tridimensional del anticuerpo murino, los restos integrados, los restos que interactuaron directamente con la CDR y los restos que influyen significativamente en la conformación de VL y VH se retromutaron para obtener anticuerpos humanizados H005-2, H005-3 y H005-4, las secuencias son las siguientes.

Expresión de anticuerpos

H005-1 HC

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISG GGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKR VESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK SEQIDNO: II

H005-1 LC

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLA DGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVA APSVF1FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQIDNO: 12

La secuencia HC del anticuerpo humanizado H005-1 con CDR murina injertada es (SEQID NO: 11), la secuencia LC del anticuerpo humanizado es (SEQ ID NO: 12). Los sitios que pueden afectar la actividad del anticuerpo se sometieron a mutaciones puntuales, las secuencias son las siguientes:

Los ADNc se sintetizaron de acuerdo con las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y la cadena pesada de cada anticuerpo humanizado (SEQ NO 11, SEQ NO 12 y sus variantes). Después de que los ADNc se digirieron con XhoI y BamHI, los fragmentos de ADNc obtenidos se insertaron en vectores de expresión pcDNA3.1 (Life Technologies N.° de Cat.V790-20) en los sitios de restricción BamHI/XhoI. Se usaron los vectores de expresión y un reactivo de transfección PEI (Polysciences, Inc. N^ de Cat. 23966) para transfectar células HEK293 (Life Technologies N^ de Cat.

11625019) a 1:2, y las células transfectadas se incubaron en una incubadora de CO²durante 4-5 días. Los anticuerpos expresados se recuperaron por centrifugación y se purificaron de acuerdo con un método convencional para obtener los anticuerpos humanizados de la presente invención.

Ejemplo 8: Datos de actividad de anticuerpos humanizados

Los anticuerpos humanizados se sometieron a un ensayo de unión ELISA (el método es el mismo que el del Ejemplo 2), un ensayo de bloqueo de unión al ligando (el método es el mismo que el del Ejemplo 2) y un experimento de cinética de afinidad (el método es el mismo que el del Ejemplo 5) in vitro. Los resultados se muestran en la siguiente tabla:

El resultado mostró que los anticuerpos humanizados H005-1, H 005-2, H005-3 y H 005-4 mantuvieron la actividad de unión a PD-1, con una cinética de afinidad KD de 2,79, 2,98, 2,45 y 3,89 nM respectivamente. De forma simultánea, todos los anticuerpos humanizados mostraron de manera eficaz actividad de bloqueo contra la ruta PD-L1/PD-1. Ejemplo 9: Inhibición del crecimiento de células tumorales por el anticuerpo de PD-1

1. Materiales experimentales:

Células U87MG (células de glioma): adquiridas en el Banco de Células de la Academia China de Ciencias, Cat. TCHu138;

PBMC (células mononucleares de sangre periférica) adquiridas en el Centro de Sangre de Shanghai;

CD3: adquiridas de Miltenyi Biotec Número de Cat. 130-093-387;

CD28: adquiridas de Miltenyi Biotec Número de Cat. 130-093-375;

Kit-8 de recuento de células: disponible en DOJINDO LABORATORIES, n.° de cat. CK04;

mIgG (control negativo): adquiridos de SANTA CRUZ Número de Cat. sc-2025; usando dosis de 1660ng/ml. 2. Métodos experimentales:

1) Se cultivaron células U87MG en medio EMEM que contenía FBS al 10% y P/S al 1%, se incubaron en una placa de 96 pocillos, 1x104* células por pocillo.

2) El anticuerpo H005-1 se diluyó a diferentes gradientes de concentración (mostrados en el eje de abscisas de la Fig. 3) con p Bs , se añadió a la placa de 96 pocillos a 10 pl/pocillo y se incubó en una incubadora de CO²al 5% a 37 °C durante 4 horas.

3) Después de la adhesión celular, se añadieron 80 ul de suspensión de células PBMC a cada pocillo con una densidad celular de 2x104 células/pocillo, y se añadieron 10 pl de anticuerpo de CD3 y anticuerpo de CD28 en cada pocillo, las concentraciones finales de anticuerpos de CD3 y de CD28 fueron ambas 500ng/ml.

4) Después de 72 horas de incubación en la incubadora de CO²al 5% a 37 °C, se añadieron 10 pl de CCK8 a cada pocillo para su desarrollo. 2 horas después, se determinó la DO450.

3. Resultado:

El resultado se mostró en la figura 3, en comparación con mIgG (control negativo), las diferentes concentraciones de anticuerpo de PD-1 (H005-1) tuvieron un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento de células U87MG, y la tasa de inhibición a la mayor concentración fue de aproximadamente el 30%.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de PD-1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID n O: 5, respectivamente

2. El anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo quimérico.

3. El anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9.

4. El anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo humanizado.

5. El anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde: la región variable de cadena pesada comprende regiones marco de cadena pesada (FR) correspondientes a FR1, FR2 y FR3 de IgHV3-7 y FR4 de JH6, cada una de las cuales deriva de la secuencia de combinación de cadenas pesadas de la línea germinal humana representada en la SEQ ID NO: 13; y

la región variable de cadena ligera comprende regiones FR de cadena ligera correspondientes a FR1, FR2 y FR3 de IGKV 1-39 y FR4 de JK4, cada una de las cuales deriva de la secuencia de combinación de cadenas ligeras de la línea germinal humana representada en la SEQ ID NO: 14.

6. El anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende:

una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11; y

una cadena ligera que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 12.

7. Una molécula de ADN que codifica el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora transformada con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8.

10. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la célula hospedadora es una bacteria.

11. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la célula hospedadora es una levadura.

12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un excipiente, diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.

13. El anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento del cáncer.

14. El anticuerpo de PD-1 o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer renal, melanoma o cáncer de pulmón no microcítico.