JP2024514277A - 単一ドメインｐｄ－ｌ１抗体 - Google Patents
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Abstract
様々な単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびこれらの単一ドメイン抗体を含むポリペプチド（例えば、二重特異性抗体およびキメラ抗原受容体）が提供される。これらの抗体は、それらのヒト化対応物を含めて、優れた活性を示したことにより、様々な二重特異性抗体形式における使用のために好適である。様々な疾患、例えば、がんおよび感染性疾患などを処置するために、および診断するために本発明の抗体またはポリペプチドを使用する方法もまた提供される。
Description
本発明は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９００５８（２０２１年４月２６日出願）の優先権を主張しており、その内容がその全体によって本明細書中に組み込まれる。
本発明は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９００４６（２０２１年４月２６日出願）の優先権を主張しており、その内容がその全体によって本明細書中に組み込まれる。
本発明は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９００４９（２０２１年４月２６日出願）の優先権を主張しており、その内容がその全体によって本明細書中に組み込まれる。
背景
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、ナノボディとしてもまた知られているものであり、ただ１つの単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。完全な抗体と同様に、単一ドメイン抗体は、特異的な抗原に対して選択的に結合することができる。１２～１５ｋＤａにすぎない分子量を有することにより、単一ドメイン抗体は、一般的な抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さい。単一ドメイン抗体は、その小さいサイズおよび一本鎖性質を考慮すると、フラグメントとして他のタンパク質（例えば、二重特異性抗体など）に含めるために特に好適であり得る。
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、ナノボディとしてもまた知られているものであり、ただ１つの単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。完全な抗体と同様に、単一ドメイン抗体は、特異的な抗原に対して選択的に結合することができる。１２～１５ｋＤａにすぎない分子量を有することにより、単一ドメイン抗体は、一般的な抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さい。単一ドメイン抗体は、その小さいサイズおよび一本鎖性質を考慮すると、フラグメントとして他のタンパク質（例えば、二重特異性抗体など）に含めるために特に好適であり得る。
プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）（これは、分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としてもまた知られているものである）に対して特異的な様々な抗体が、がん処置のために、また、他の臨床用途において使用されている。ＰＤ－Ｌ１は、免疫系を特定の事象の期間中に、例えば、妊娠、組織の同種移植、自己免疫疾患および他の疾患状態（例えば、肝炎）の期間中に抑制することにおいて主要な役割を果たしていると考えられる４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１またはＢ７．１に結合すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をリンパ節において低下させる阻害シグナルが伝達され、そして、それを補って、ＰＤ－１はまた、リンパ節における外来抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を、遺伝子Ｂｃｌ－２の低下した調節によってさらに媒介されるアポトーシスを介して制御することができる。
がんの処置に加えて、ＰＤ－Ｌ１阻害はまた、感染性疾患を処置することにおいて有望であることが示されている。細胞内感染のマウスモデルにおいて、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現をＴ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージにおいて誘導した。ＰＤ－Ｌ１遮断（例えば、遮断抗体を使用する）は感染マウスについての死亡率の増加をもたらした。遮断はマクロファージによるＴＮＦαおよび一酸化窒素の産生を低下させ、ＮＫ細胞によるグランザイムＢ産生を低下させ、そしてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４ Ｔ細胞ではない）の増殖を低下させた。この証拠は、ＰＤ－Ｌ１が細胞内感染における積極的な共刺激分子として作用することを示唆している。
発明の概要
本開示は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とする様々な新規な単一ドメイン抗体を提供する。これらの単一ドメイン抗体は、それらの小さいサイズにもかかわらず、優れた結合親和性および生物学的機能を示した。様々な異なる形式の二重特異性抗体に含められたとき、得られた二重特異性抗体のいくつかが優れた性質を示した。
本開示は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とする様々な新規な単一ドメイン抗体を提供する。これらの単一ドメイン抗体は、それらの小さいサイズにもかかわらず、優れた結合親和性および生物学的機能を示した。様々な異なる形式の二重特異性抗体に含められたとき、得られた二重特異性抗体のいくつかが優れた性質を示した。
１つの局面において、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有し、かつ、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体、または前記単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有し、かつ、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＫａｂａｔナンバリングスキームに従う。
抗体またはポリペプチドのいくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、（１）配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列をそれぞれ含み、または（２）配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列をそれぞれ含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａからなる群から選択される１またはそれを超える復帰変異を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａの復帰変異を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１１４～配列番号１２２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１は配列番号１１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖからなる群から選択される１またはそれを超える復帰変異を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖの復帰変異を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１２７または配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１とは異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体である。
別の局面において、本明細書中には、本願の抗体と、ＰＤ－Ｌ１でない標的抗原に対する結合特異性を有する第２の抗体または抗原結合フラグメントとを含む二重特異性抗体が提供される。
別の局面において、本明細書中には、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有する抗ＰＤ－Ｌ１部分と、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合特異性を有する抗ＴＩＧＩＴ部分とを含む二重特異性抗体であって、抗ＴＩＧＩＴ部分が、配列番号１７１のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１７２のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、二重特異性抗体が提供される。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＴＩＧＩＴ部分は、配列番号１７１のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１７２のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３はＫａｂａｔナンバリングスキームに従う。いくつかの実施形態において、抗ＴＩＧＩＴ部分は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７３～配列番号１７８のアミノ酸配列をそれぞれ含む。いくつかの実施形態において、抗ＴＩＧＩＴ部分は、配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＫａｂａｔナンバリングスキームに従う。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、（１）配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列をそれぞれ含み、または（２）配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列をそれぞれ含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分はヒト化される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は１１９または１３０のアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＴＩＧＩＴ部分の重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＴＩＧＩＴ部分の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＴＩＧＩＴ部分の軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＴＩＧＩＴ部分の軽鎖のＮ末端に融合される。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体はホモ二量体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体には、２つの抗ＰＤ－Ｌ１部分が含まれる。いくつかの実施形態において、２つの抗ＰＤ－Ｌ１部分のそれぞれが抗ＴＩＧＩＴ部分の重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体には、４つの抗ＰＤ－Ｌ１部分が含まれる。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、（１）配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８２および配列番号１８４からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖成分と、（２）配列番号１８０および配列番号１８３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖成分とを含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む重鎖成分と、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む軽鎖成分とを含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む重鎖成分と、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む軽鎖成分とを含む。
別の局面において、本明細書中には、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有する抗ＰＤ－Ｌ１部分と、ヒトＣＤ４７タンパク質に対する結合特異性を有する抗ＣＤ４７部分とを含む二重特異性抗体であって、抗ＣＤ４７部分が、配列番号１３１または配列番号１３３のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３２または配列番号１３４のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、二重特異性抗体が提供される。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７部分は、配列番号１３１または配列番号１３３のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３２または配列番号１３４のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３はＫａｂａｔナンバリングスキームに従う。
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７部分は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１３５～配列番号１４０のアミノ酸配列をそれぞれ含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７部分は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７部分は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１４１～配列番号１４６のアミノ酸配列をそれぞれ含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７部分は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＫａｂａｔナンバリングスキームに従う。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、（１）配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列をそれぞれ含み、または（２）配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列をそれぞれ含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分はヒト化される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は１１９または１３０のアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＣＤ４７部分の重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＣＤ４７部分の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＣＤ４７部分の軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１部分は抗ＣＤ４７部分の軽鎖のＮ末端に融合される。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体はホモ二量体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体には、２つの抗ＰＤ－Ｌ１部分が含まれる。いくつかの実施形態において、２つの抗ＰＤ－Ｌ１部分のそれぞれが抗ＣＤ４７部分の重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体には、４つの抗ＰＤ－Ｌ１部分が含まれる。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、（１）配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６９および配列番号１７０からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖成分と、（２）配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６５および配列番号１６８からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖成分とを含む。
別の局面において、本明細書中には、本願の抗体またはポリペプチドあるいは本願の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
別の局面において、本明細書中には、本願のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
別の局面において、本明細書中には、本願のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞が提供される。
別の局面において、本明細書中には、（１）本願の抗体またはポリペプチド、二重特異性抗体、あるいはポリヌクレオチドと、（２）医薬的に許容され得るキャリアとを含む組成物が提供される。
別の局面において、本明細書中には、がんを処置することを必要とする患者においてがんを処置する方法であって、有効量の本願の抗体またはポリペプチド、二重特異性抗体、あるいはポリヌクレオチドを患者に投与することを含む方法が提供される。別の局面において、本明細書中には、がんを処置するための医薬品を調製するための、本願の抗体またはポリペプチド、二重特異性抗体、あるいはポリヌクレオチドの使用が提供される。いくつかの実施形態において、がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、がんは、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される。
詳細な説明
定義
用語「ａ」または用語「ａｎ」の実体は１またはそれを超える当該実体を示すことに留意しなければならない。例えば、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」は１またはそれを超える抗体を表すことが理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（または「ａｎ」）、用語「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ（１またはそれを超える）」および用語「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ（少なくとも１つ）」は本明細書中では交換可能に使用され得る。
定義
用語「ａ」または用語「ａｎ」の実体は１またはそれを超える当該実体を示すことに留意しなければならない。例えば、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」は１またはそれを超える抗体を表すことが理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（または「ａｎ」）、用語「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ（１またはそれを超える）」および用語「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ（少なくとも１つ）」は本明細書中では交換可能に使用され得る。
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対するある特定の割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有する；このことは、アライメントされたとき、その割合の塩基（またはアミノ酸）が、これら２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性またはパーセント配列同一性は、この技術分野において知られているソフトウェアプログラムを使用して、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他編（２００７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されるソフトウェアプログラムを使用して求めることができる。好ましくは、デフォルトパラメーターがアライメントのために使用される。１つのアライメントプログラムが、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムとして、下記のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが挙げられる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；並び替え順＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に等価なポリヌクレオチドは、上記の指定されたパーセント相同性を有し、かつ同じ生物学的活性または類似した生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
用語「等価な核酸またはポリヌクレオチド」は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とのある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を示す。二本鎖核酸のホモログには、それとの、またはその相補体とのある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸が含まれることが意図される。１つの局面において、核酸のホモログはその核酸またはその相補体に対してハイブリダイズすることができる。同様に、「等価なポリペプチド」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とのある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを示す。いくつかの局面において、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である。いくつかの局面において、等価なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドと比較した場合、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの付加、欠失、置換およびそれらの組み合わせを有する。いくつかの局面において、等価な配列は参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。
本明細書中で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識し、かつ当該抗原に特異的に結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を示す。抗体として、完全な抗体、およびそのいずれかの抗原結合フラグメントまたはその一本鎖を挙げることができる。したがって、用語「抗体」には、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含むタンパク質分子またはペプチド含有分子がどのようなものであれ含まれる。そのようなものの例には、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖可変領域または軽鎖可変領域、重鎖定常領域または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、あるいは任意のそれらの一部、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部が含まれるが、これらに限定されない。
用語「抗体フラグメント」または用語「抗原結合フラグメント」は、本明細書中で使用される場合、抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、無傷な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。用語「抗体フラグメント」には、アプタマー、スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）が含まれる。用語「抗体フラグメント」にはまた、特異的な抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する合成タンパク質または遺伝子操作タンパク質がどのようなものであれ含まれる。
「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」は免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を示す。いくつかの局面において、これらの領域は、アミノ酸が１０個～約２５個の短いリンカーペプチドによりつながれる。リンカーは柔軟性のためにグリシンに富むことができ、同様にまた、溶解性のためにセリンまたはトレオニンに富むことができ、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端とつなぐことができ、また逆も同様である。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。様々なｓｃＦｖ分子がこの技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。
抗体という用語は、生化学的に区別することができる様々な幅広いクラスのポリペプチドを包含する。当業者であれば、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にはいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４）があることを理解する。抗体の「クラス」を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥとしてそれぞれ決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などが、十分に特徴づけられており、機能的特殊化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの様々な改変型が、本開示を考慮して当業者には容易に識別可能であり、したがって本開示の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが明らかに本開示の範囲内であり、下記の議論は一般には、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００～７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。これら４つの鎖は典型的には、軽鎖が腕木となって、「Ｙ」の開口部から始まり、かつ可変領域を通って続く重鎖を支える「Ｙ」字型立体配置でジスルフィド結合によって連結される。
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、それらのバリアントまたは誘導体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫドメインまたはＶＨドメインのどちらかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（これには、例えば、本明細書中に開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリン分子または抗体分子は、免疫グロブリン分子のいずれかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
「特異的に結合する」または「に対する特異性を有する」によって、一般には、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および当該結合が何らかの相補性を抗原結合ドメインとエピトープとの間で伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、当該抗体が無作為の無関係なエピトープに結合するであろうよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するときには当該エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を限定するために本明細書中では使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対してより高い特異性を有すると見なされる場合があり、または抗体「Ａ」は、関連のあるエピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われる場合がある。
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」または用語「処置」は、治療的処置と、予防的または防止的な措置との両方を示し、その目的は、望まれていない生理学的変化または障害、例えば、がんの進行などを防止すること、または遅らせる（和らげる）ことである。有益な臨床結果または所望の臨床結果には、検出可能であろうと、または検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の広がりの減少、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態（state）、疾患進行の遅延または減速化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的であろうと、または完全であろうと）が含まれるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていないならば、予想された生存と比較して、生存を延ばすことを意味することができる。処置を必要としている者には、病状（condition）または障害を既に有する者、同様にまた、状態または障害を有する傾向がある者、あるいは状態または障害が防止されることになる者が含まれる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によって、診断、予後または治療が望まれる対象がどのような対象であれ、特に哺乳動物対象が意味される。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、農場動物、および動物園動物、競技用動物またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれる。
本明細書中で使用される場合、「処置を必要としている患者に」または「処置を必要としている対象」などの語句には、例えば、検出のために、診断手順のために、および／または処置のためにであるが、使用される本開示の抗体または組成物の投与から利益を得るであろう対象、例えば、哺乳動物対象が含まれる。
単一ドメインＰＤ－Ｌ１抗体
本開示は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する高い親和性を有する単鎖抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。本抗体は、強力な結合活性および阻害活性を示したことから、治療用途および診断用途のために有用である。また重要なことに、様々な異なる形式の二重特異性抗体における標的化ユニットの１つとして組み込まれたとき、ある特定の得られた二重特異性抗体が、これらの単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体のさらなる有用性を確立する顕著な性質を示した。
本開示は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する高い親和性を有する単鎖抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。本抗体は、強力な結合活性および阻害活性を示したことから、治療用途および診断用途のために有用である。また重要なことに、様々な異なる形式の二重特異性抗体における標的化ユニットの１つとして組み込まれたとき、ある特定の得られた二重特異性抗体が、これらの単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体のさらなる有用性を確立する顕著な性質を示した。
したがって、本開示の１つの実施形態において、単一ドメイン抗体、およびそのような単一ドメイン抗体が含まれるポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、表１において提供される抗体（例えば、配列番号１～配列番号３６）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１には配列番号５５のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ２には配列番号５６のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ３には配列番号５７のアミノ酸配列が含まれる。配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７は、抗体ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびそのヒト化対応物である９３＿ＶＨ－１～９３＿ＶＨ－９のＣＤＲである。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、１個、２個または３個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を伴うことを除いて、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、グラフト化抗体の性質を改善するために試験される１またはそれを超える復帰変異が含まれる。いくつかの実施形態において、復帰変異は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａの復帰変異のすべてが含まれる。
例示的なヒト化抗体には、９３＿ＶＨ－１、９３＿ＶＨ－２、９３＿ＶＨ－３、９３＿ＶＨ－４、９３＿ＶＨ－５、９３＿ＶＨ－６、９３＿ＶＨ－７、９３＿ＶＨ－８および９３＿ＶＨ－９が含まれる。例示的な配列が配列番号１１４～配列番号１２２である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は配列番号１１９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１には配列番号１１３のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ２には配列番号４９のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ３には配列番号５０のアミノ酸配列が含まれる。配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０は、ヒト化抗体である１１２－ＶＨＨ１－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ２－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ３－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ４－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ５－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ６－ＰＴＭまたは１１２－ＶＨＨ７－ＰＴＭのＣＤＲである。元の抗体ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２と比較して、これらのヒト化抗体には、ＣＤＲ１（配列番号４８）におけるＮ３４Ｑ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）が、翻訳後修飾を妨げるために含まれた。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、１個、２個または３個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を伴うことを除いて、配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖからなる群から選択される１またはそれを超える復帰変異が含まれる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖの復帰変異のすべてが含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、表１において提供される抗体（例えば、配列番号１～配列番号３６）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号５１および配列番号５２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５３および配列番号５４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号５８のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５３および配列番号３９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５９および配列番号６０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７３および配列番号７４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７５および配列番号７６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号７７および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７８および配列番号７９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８０、配列番号８１および配列番号８２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号８３および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号８７および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８８および配列番号８９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号９０および配列番号９１のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号９２、配列番号９３および配列番号９４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号９８および配列番号９９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１００、配列番号１０１および配列番号１０２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１０３、配列番号１０４および配列番号１０５のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８５および配列番号１０６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１０７、配列番号１０８および配列番号１０９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
いくつかの実施形態において、抗体には、配列番号１～配列番号３６から選択されるアミノ酸配列が含まれる。
いくつかの実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合することにおいて本明細書中に開示される抗体のいずれかと競合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が含まれた抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。
抗体またはポリペプチドと、医薬的に許容され得るキャリアとが含まれる組成物もまた提供される。
本明細書中に開示されるような抗体は改変されることがあり、その結果、当該抗体は、当該抗体が由来した天然に存在する結合ポリペプチドからアミノ酸配列において異なるようにされることもまた、当業者によって理解される。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は出発配列に類似している場合があり、例えば、出発配列に対するある特定のパーセント同一性を有する場合があり、例えば、出発配列に対する同一性が、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である場合がある。いくつかの実施形態において、改変された抗体またはフラグメントは、指定されたＣＤＲ配列を保持する。
本明細書中に開示されるような単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１つ、２つ、３つまたは４つのユニットと、１またはそれを超える他の特異性（ＰＤ－Ｌ１以外）とが含まれる二重特異性抗体および多重特異性抗体もまた提供される。
本開示は、少なくともヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質およびヒトＣＤ４７タンパク質に対する結合特異性を有する二重特異性抗体および多重特異性抗体を提供する。ＰＤ－Ｌ１は、適応免疫系に対する非常に重要な「ｄｏｎ’ｔ ｆｉｎｄ ｍｅ」（「自分を見つけないで」）シグナルであり、これに対して、ＣＤ４７は、抗貪食性の「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」（「自分を食べないで」）シグナルを自然免疫系に伝達する。それらはしばしばヒト腫瘍の表面に過剰発現される。したがって、自然免疫チェックポイントおよび適応免疫チェックポイントの両方を二重に標的とすることはおそらくは、抗腫瘍治療効果を最大化し、より長続きする応答を誘発するであろう。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体および多重特異性抗体には、少なくとも単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれる抗ＰＤ－Ｌ１部分が含まれる。明らかにされるように、単鎖抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する高い親和性を有する。本抗体は、強力な結合活性および阻害活性を示したことから、治療用途および診断用途のために有用である。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、表１において提供される抗体（例えば、配列番号１～配列番号３６）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１には配列番号５５のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ２には配列番号５６のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ３には配列番号５７のアミノ酸配列が含まれる。配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７は、抗体ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびそのヒト化対応物である９３＿ＶＨ－１～９３＿ＶＨ－９のＣＤＲである。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、１個、２個または３個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を伴うことを除いて、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、グラフト化抗体の性質を改善するために試験される１またはそれを超える復帰変異が含まれる。いくつかの実施形態において、復帰変異は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａの復帰変異のすべてが含まれる。
例示的なヒト化抗体には、９３＿ＶＨ－１、９３＿ＶＨ－２、９３＿ＶＨ－３、９３＿ＶＨ－４、９３＿ＶＨ－５、９３＿ＶＨ－６、９３＿ＶＨ－７、９３＿ＶＨ－８および９３＿ＶＨ－９が含まれる。例示的な配列が配列番号１１４～配列番号１２２である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は配列番号１１９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１には配列番号１１３のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ２には配列番号４９のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ３には配列番号５０のアミノ酸配列が含まれる。配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０は、ヒト化抗体である１１２－ＶＨＨ１－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ２－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ３－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ４－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ５－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ６－ＰＴＭまたは１１２－ＶＨＨ７－ＰＴＭのＣＤＲである。元の抗体ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２と比較して、これらのヒト化抗体には、ＣＤＲ１（配列番号４８）におけるＮ３４Ｑ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）が、翻訳後修飾を妨げるために含まれた。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、１個、２個または３個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を伴うことを除いて、配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖからなる群から選択される１またはそれを超える復帰変異が含まれる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖの復帰変異のすべてが含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、表１において提供される抗体（例えば、配列番号１～配列番号３６）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号５１および配列番号５２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５３および配列番号５４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号５８のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５３および配列番号３９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５９および配列番号６０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７３および配列番号７４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７５および配列番号７６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号７７および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７８および配列番号７９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８０、配列番号８１および配列番号８２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号８３および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号８７および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８８および配列番号８９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号９０および配列番号９１のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号９２、配列番号９３および配列番号９４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号９８および配列番号９９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１００、配列番号１０１および配列番号１０２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１０３、配列番号１０４および配列番号１０５のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８５および配列番号１０６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１０７、配列番号１０８および配列番号１０９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
いくつかの実施形態において、抗体には、配列番号１～配列番号３６から選択されるアミノ酸配列が含まれる。
いくつかの実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合することにおいて本明細書中に開示される抗体のいずれかと競合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が含まれた抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体または多重特異性抗体の抗ＣＤ４７部分は１対（またはいくつかの実施形態においては２対）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。ＶＨには、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ、およびＶＨ ＣＤＲ３が含まれることが可能である。ＶＬには、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が含まれることが可能である。
いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３には、配列番号１４１～配列番号１４６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。これらのＣＤＲは、親の抗ＣＤ４７抗体３４Ｃ５からのものである。いくつかの実施形態において、ＶＨには配列番号１３３のアミノ酸配列が含まれ、ＶＬには配列番号１３４のアミノ酸配列が含まれる（表５）。
いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３には、配列番号１３５～配列番号１４０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。これらのＣＤＲは、親の抗ＣＤ４７抗体１３Ｈ３からのものである。いくつかの実施形態において、ＶＨには配列番号１３１のアミノ酸配列が含まれ、ＶＬには配列番号１３２のアミノ酸配列が含まれる（表５）。
二重特異性抗体は、図３において例示される形式を含めてどのような形式であっても取ることができる。１つの実施形態において、二重特異性抗体は対称的である。一例が図３Ａにおいて提供され、この場合、２つの単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、必要に応じてリンカーを介して、抗ＣＤ４７抗体の重鎖のそれぞれのＮ末端に融合される。図３Ｂの例では、単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、必要に応じてリンカーを介して、抗ＣＤ４７抗体の軽鎖のそれぞれのＮ末端に融合される。
図３Ｃの例では、単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、必要に応じてリンカーを介して、抗ＣＤ４７抗体の軽鎖（定常領域）のそれぞれのＣ末端に融合される。図３Ｄの例では、単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、必要に応じてリンカーを介して、抗ＣＤ４７抗体の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に融合される。
二重特異性抗体はまた、非対称であること、例えば、図３Ｅ～図３Ｆにおいて例示されるものなどであることが可能である。図３Ｅにおいて、２つの単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＦｃ鎖の一方のＮ末端に直列につながれる。他方のＦｃ鎖に関しては、抗ＣＤ４７ ＦａｂユニットがＮ末端に融合される。わずかに異なるが、図３Ｆでは、抗ＣＤ４７部分には単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）が含まれる。
二重特異性抗体には、いずれかのＩｇＧタイプ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４）からの定常領域が含まれる場合がある。
抗体またはポリペプチドと、医薬的に許容され得るキャリアとが含まれる組成物もまた提供される。
本明細書中に開示されるような抗体は改変されることがあり、その結果、当該抗体は、当該抗体が由来した天然に存在する結合ポリペプチドからアミノ酸配列において異なるようにされることもまた、当業者によって理解される。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は出発配列に類似している場合があり、例えば、出発配列に対するある特定のパーセント同一性を有する場合があり、例えば、出発配列に対する同一性が、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である場合がある。いくつかの実施形態において、改変された抗体またはフラグメントは、指定されたＣＤＲ配列を保持する。
本開示は、少なくともヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質およびヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合特異性を有する二重特異性抗体および多重特異性抗体を提供する。ＰＤ－Ｌ１は、適応免疫系に対する非常に重要な「ｄｏｎ’ｔ ｆｉｎｄ ｍｅ」（「自分を見つけないで」）シグナルであり、これに対して、ＴＩＧＩＴは、腫瘍および感染細胞が免疫応答から逃れるのを助ける。それらはしばしばヒト腫瘍の表面に過剰発現される。したがって、自然免疫チェックポイントおよび適応免疫チェックポイントの両方を二重に標的とすることはおそらくは、抗腫瘍治療効果を最大化し、より長続きする応答を誘発するであろう。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体および多重特異性抗体には、少なくとも単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれる抗ＰＤ－Ｌ１部分が含まれる。明らかにされるように、単鎖抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する高い親和性を有する。本抗体は、強力な結合活性および阻害活性を示したことから、治療用途および診断用途のために有用である。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、表１において提供される抗体（例えば、配列番号１～配列番号３６）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１には配列番号５５のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ２には配列番号５６のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ３には配列番号５７のアミノ酸配列が含まれる。配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７は、抗体ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびそのヒト化対応物である９３＿ＶＨ－１～９３＿ＶＨ－９のＣＤＲである。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、１個、２個または３個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を伴うことを除いて、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、グラフト化抗体の性質を改善するために試験される１またはそれを超える復帰変異が含まれる。いくつかの実施形態において、復帰変異は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａの復帰変異のすべてが含まれる。
例示的なヒト化抗体には、９３＿ＶＨ－１、９３＿ＶＨ－２、９３＿ＶＨ－３、９３＿ＶＨ－４、９３＿ＶＨ－５、９３＿ＶＨ－６、９３＿ＶＨ－７、９３＿ＶＨ－８および９３＿ＶＨ－９が含まれる。例示的な配列が配列番号１１４～配列番号１２２である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は配列番号１１９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１には配列番号１１３のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ２には配列番号４９のアミノ酸配列が含まれ、ＣＤＲ３には配列番号５０のアミノ酸配列が含まれる。配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０は、ヒト化抗体である１１２－ＶＨＨ１－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ２－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ３－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ４－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ５－ＰＴＭ、１１２－ＶＨＨ６－ＰＴＭまたは１１２－ＶＨＨ７－ＰＴＭのＣＤＲである。元の抗体ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２と比較して、これらのヒト化抗体には、ＣＤＲ１（配列番号４８）におけるＮ３４Ｑ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）が、翻訳後修飾を妨げるために含まれた。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、１個、２個または３個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を伴うことを除いて、配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖからなる群から選択される１またはそれを超える復帰変異が含まれる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体には、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖの復帰変異のすべてが含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、表１において提供される抗体（例えば、配列番号１～配列番号３６）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号５１および配列番号５２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５３および配列番号５４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号４１および配列番号５８のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５３および配列番号３９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号５９および配列番号６０のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７３および配列番号７４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７５および配列番号７６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号７７および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号３７、配列番号７８および配列番号７９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８０、配列番号８１および配列番号８２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号４０、配列番号８３および配列番号４７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号６４、配列番号８７および配列番号６６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８８および配列番号８９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号９０および配列番号９１のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号９２、配列番号９３および配列番号９４のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号９８および配列番号９９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１００、配列番号１０１および配列番号１０２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１０３、配列番号１０４および配列番号１０５のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号８４、配列番号８５および配列番号１０６のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１０７、配列番号１０８および配列番号１０９のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。１つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３には、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。
いくつかの実施形態において、抗体には、配列番号１～配列番号３６から選択されるアミノ酸配列が含まれる。
いくつかの実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合することにおいて本明細書中に開示される抗体のいずれかと競合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が含まれた抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合フラグメントもまた提供される。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体または多重特異性抗体の抗ＴＩＧＩＴ部分は１対（またはいくつかの実施形態においては２対）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。ＶＨには、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ、およびＶＨ ＣＤＲ３が含まれることが可能である。ＶＬには、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が含まれることが可能である。
いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３には、配列番号１７３～配列番号１７８のアミノ酸配列がそれぞれ含まれる。いくつかの実施形態において、ＶＨには配列番号１７１のアミノ酸配列が含まれ、ＶＬには配列番号１７２のアミノ酸配列が含まれる（表７）。
二重特異性抗体は、図９において例示される形式を含めてどのような形式であっても取ることができる。１つの実施形態において、二重特異性抗体は好ましくは対称的である。１つの実施形態において、単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体は抗ＴＩＧＩＴ部分のＣ末端側に位置する。
一例となる形式が図９Ａにおいて提供され、この場合、２つの単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、必要に応じてリンカーを介して、抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖定常領域のそれぞれのＣ末端に融合される。図９Ｂの例において、それぞれの重鎖には、２コピーの単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれる。
図９Ｃの例では、単一ドメイン抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、必要に応じてリンカーを介して、抗ＴＩＧＩＴ抗体の軽鎖（定常領域）のそれぞれのＣ末端に融合される。
二重特異性抗体には、いずれかのＩｇＧタイプ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４）からの定常領域が含まれる場合がある。
抗体またはポリペプチドと、医薬的に許容され得るキャリアとが含まれる組成物もまた提供される。
本明細書中に開示されるような抗体は改変されることがあり、その結果、当該抗体は、当該抗体が由来した天然に存在する結合ポリペプチドからアミノ酸配列において異なるようにされることもまた、当業者によって理解される。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は出発配列に類似している場合があり、例えば、出発配列に対するある特定のパーセント同一性を有する場合があり、例えば、出発配列に対する同一性が、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である場合がある。いくつかの実施形態において、改変された抗体またはフラグメントは、指定されたＣＤＲ配列を保持する。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
本開示はまた、本開示の抗体、そのバリアントまたは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子の表面における、または別個のポリヌクレオチド分子の表面における抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全体をコードする場合がある。加えて、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子の表面における、または別個のポリヌクレオチド分子の表面における抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一部をコードする場合がある。
本開示はまた、本開示の抗体、そのバリアントまたは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子の表面における、または別個のポリヌクレオチド分子の表面における抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全体をコードする場合がある。加えて、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子の表面における、または別個のポリヌクレオチド分子の表面における抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一部をコードする場合がある。
抗体を作製する様々な方法がこの技術分野では広く知られており、本明細書中に記載される。ある特定の実施形態において、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方が完全にヒト型である。完全にヒト型の抗体を、この技術分野において記載される技術を使用して、また、本明細書中に記載されるように作製することができる。例えば、特異的な抗原に対しての完全にヒト型の抗体を、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、内因性の遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物に当該抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作製するために使用することができる例示的な技術が、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号（これらはその全体が参照によって組み込まれる）に記載される。
がん処置
本明細書中に記載されるように、本開示の抗体、二重特異性抗体、ポリペプチド、バリアントまたは誘導体は、ある特定の処置方法および診断方法において使用される場合がある。
本明細書中に記載されるように、本開示の抗体、二重特異性抗体、ポリペプチド、バリアントまたは誘導体は、ある特定の処置方法および診断方法において使用される場合がある。
本開示はさらに、本開示の抗体を、本明細書中に記載される障害または状態の１またはそれを超えるものを処置するために患者に、例えば、動物、哺乳動物およびヒトなどに投与することを伴う、抗体に基づく治療に関する。本開示の治療用化合物には、本開示の抗体（これには、本明細書中に記載されるようなそのバリアントおよび誘導体が含まれる）、および本開示の抗体（これには、本明細書中に記載されるようなそのバリアントおよび誘導体が含まれる）をコードする核酸またはポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の抗体はまた、がんを処置するために、または阻害するために使用することができる。ＰＤ－Ｌ１が腫瘍細胞において過剰発現され得る。腫瘍由来ＰＤ－Ｌ１は免疫細胞表面のＰＤ－１に結合し、それによって抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限することができる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする小分子阻害剤またはモノクローナル抗体をマウス腫瘍モデルにおいて用いた結果は、標的化されたＰＤ－Ｌ１療法が、腫瘍成長の効果的な制御に対する重要な代替的かつ現実的なアプローチであることを示している。実験による実施例において明らかにされるように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、がん患者における改善された生存を引き起こし得る適応免疫応答機構を活性化した。
したがって、いくつかの実施形態において、がんを処置することを必要とする患者においてがんを処置するための方法が提供される。本方法は、１つの実施形態においては、有効量の本開示の抗体を患者に投与することを伴う。いくつかの実施形態において、患者におけるがん細胞（例えば、間質細胞）の少なくとも１つがＰＤ－Ｌ１を発現し、またはＰＤ－Ｌ１を過剰発現し、またはＰＤ－Ｌ１を発現するように誘導される。ＰＤ－Ｌ１発現の誘導を、例えば、腫瘍ワクチンの投与または放射線療法によって行うことができる。
ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する腫瘍には、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、乳がん、尿道がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、メルケル細胞癌、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がんおよび小細胞肺がんの腫瘍が含まれる。したがって、現時点で開示された抗体は、いずれか１またはそれを超えるそのようながんを処置するために使用することができる。
組成物
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗体と、許容され得るキャリアとを含む。いくつかの実施形態において、組成物にはさらに、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）が含まれる。
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗体と、許容され得るキャリアとを含む。いくつかの実施形態において、組成物にはさらに、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）が含まれる。
具体的な実施形態において、用語「医薬的に許容され得る」は、連邦政府または州政府の規制官庁によって承認されたこと、あるいは動物における使用、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方または他の一般に認識された薬局方に収載されたことを意味する。さらに、「医薬的に許容され得るキャリア」は、一般には、非毒性の固体状、半固体状または液状の充填剤、希釈剤、封入材料またはあらゆる種類の配合補助剤である。
用語「キャリア」は、治療剤が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを示す。そのような医薬用キャリアは、無菌の液体、例えば、水、およびオイル（これには、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のオイルが含まれる）、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水が、医薬組成物が静脈内投与されるときには好ましいキャリアである。食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液状キャリアとして、特に注射用液剤のために用いることができる。好適な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望されるならば、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝化剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）もまた含有することができる。抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；および張度を調整するための剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースもまた想定される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤・散剤（powder）、持続放出製剤などの形態を取ることができる。組成物は、従来の結合剤（binder）およびキャリア（例えば、トリグリセリド）とともに坐剤として製剤化することができる。経口製剤には、標準的なキャリア、例えば、医薬用等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｉｎｅ）、セルロース、炭酸マグネシウムなどが含まれ得る。好適な医薬用キャリアの例が、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態をもたらすような適量のキャリアと一緒に、治療有効量の抗原結合ポリペプチドを好ましくは精製形態で含有する。製剤は投与様式に適するべきである。非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルに封入することができる。
一実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適合される医薬組成物として日常的手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液における液剤である。必要な場合、組成物にはまた、可溶化剤と、注射部位における痛みを和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカインなど）とが含まれることがある。一般には、成分は、別々に、または単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性薬剤の量を表示する気密封止容器（例えば、アンプルまたはサシェなど）における乾燥凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物として一緒に混合されて、そのどちらでも供給される。組成物が注入によって投与されることになる場合、組成物は、無菌の医薬用等級の水または生理食塩水を含有する注入ボトルで投薬できる。組成物が注射によって投与される場合には、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルが、成分が投与前に混合されてもよいように提供され得る。
実施例１．ヒトＰＤ－Ｌ１に対するアルパカ単一ドメイン抗体の生成
本実施例は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を、アルパカの免疫、続いてファージライブラリーの構築および選択を使用してどのように生成させたかを示す。
本実施例は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を、アルパカの免疫、続いてファージライブラリーの構築および選択を使用してどのように生成させたかを示す。
抗原：組換えヒトＰＤ－Ｌ１／ｈＦｃ融合タンパク質を、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を産生するための免疫原として使用した。ヒト免疫グロブリンＦｃドメインに融合されるヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外領域全体を含む融合タンパク質を免疫原として使用した。
免疫
アルパカを最初、０日目に６００μｇのマウスＰＤ－Ｌ１と完全フロイトアジュバントとの１：１の混合物により皮下（ＳＣ）免疫し、２１日目に不完全フロイトアジュバントとともに２５０μｇのマウスＰＤ－Ｌ１により免疫し、４２日目に不完全フロイトアジュバントとともに２５０μｇのヒトＰＤ－Ｌ１により免疫した。免疫応答を、抗ＰＤ－Ｌ１結合についての力価を測定することによってモニターした。
アルパカを最初、０日目に６００μｇのマウスＰＤ－Ｌ１と完全フロイトアジュバントとの１：１の混合物により皮下（ＳＣ）免疫し、２１日目に不完全フロイトアジュバントとともに２５０μｇのマウスＰＤ－Ｌ１により免疫し、４２日目に不完全フロイトアジュバントとともに２５０μｇのヒトＰＤ－Ｌ１により免疫した。免疫応答を、抗ＰＤ－Ｌ１結合についての力価を測定することによってモニターした。
ライブラリーの構築およびスクリーニング
アルパカのＰＢＭＣを集め、抗体ファージディスプレイライブラリーを、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ逆転写、ＰＣＲ増幅、およびファージディスプレイベクターへのクローニングによって生成させた。その後、ライブラリーを１回の液相パンニングおよび１回の固相パンニングに供した。一般には、ライブラリーをビオチン化ＰＤ－Ｌ１により被覆されたイムノチューブまたはビーズにおいてインキュベートした。非結合ファージをＰＢＳＴによる５回～２０回にわたる洗浄によって除いた。それぞれの選択について、合計で３回のパンニングを行った。
アルパカのＰＢＭＣを集め、抗体ファージディスプレイライブラリーを、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ逆転写、ＰＣＲ増幅、およびファージディスプレイベクターへのクローニングによって生成させた。その後、ライブラリーを１回の液相パンニングおよび１回の固相パンニングに供した。一般には、ライブラリーをビオチン化ＰＤ－Ｌ１により被覆されたイムノチューブまたはビーズにおいてインキュベートした。非結合ファージをＰＢＳＴによる５回～２０回にわたる洗浄によって除いた。それぞれの選択について、合計で３回のパンニングを行った。
結合剤の配列をＰＣＲによって抗原結合陽性ファージから増幅し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。特有の抗体およびそれらのＣＤＲ領域の配列が下記の表において提供される。
実施例２．ヒトＰＤ－Ｌ１に対するアルパカモノクローナル抗体の結合活性および遮断活性
本発明の抗体のいくつかの結合特性および遮断特性がＧａｔｏｒによって特徴づけられた。抗ｈｉｓプローブが最初にチップに負荷され、続いてヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓが、抗原を捕捉するために負荷された。その後、抗体を注入して、結合曲線を記録した。最後に、ヒトＰＤ１／ｈＦｃを注入して、抗体がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し得るかどうかを求めた。図１に示されるように、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびＡＳＰ－３０－４６のすべてが、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を効果的に遮断した。親和性がさらに、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００によって確認された。
実施例３．抗ＰＤ－Ｌ１アルパカモノクローナル抗体のヒト化。
ｍＡｂ ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２の可変領域遺伝子を用いて、ヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの最初の工程において、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２のアミノ酸配列を、全体的に最もよく一致するヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を見出すためにヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースに対して比較した。ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３について、ヒトに最も近い一致物がＩＧＨＶ３－２３＊０４遺伝子であった。その後、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をＩＧＨＶ３－２３＊０４遺伝子のフレームワーク配列に移植したヒト化可変ドメイン配列を設計した。ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２について、ヒトに最も近い一致物がＩＧＨＶ３－４８＊０３遺伝子であった。その後、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をＩＧＨＶ３－４８＊０３遺伝子のフレームワーク配列に移植したヒト化可変ドメイン配列を設計した。一方で、一残基変異（Ｎ３４Ｑ、Ｋａｂａｔナンバリング）を、翻訳後修飾の危険性を低下させるためにＣＤＲ１内に導入した。その後、３Ｄモデルを生成して、アルパカアミノ酸のヒトアミノ酸への置き換えが結合および／またはＣＤＲ立体配座に影響を及ぼし得る任意のフレームワーク位置が存在するかどうかを明らかにした。
本発明の抗体のいくつかの結合特性および遮断特性がＧａｔｏｒによって特徴づけられた。抗ｈｉｓプローブが最初にチップに負荷され、続いてヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓが、抗原を捕捉するために負荷された。その後、抗体を注入して、結合曲線を記録した。最後に、ヒトＰＤ１／ｈＦｃを注入して、抗体がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し得るかどうかを求めた。図１に示されるように、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびＡＳＰ－３０－４６のすべてが、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を効果的に遮断した。親和性がさらに、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００によって確認された。
ｍＡｂ ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２の可変領域遺伝子を用いて、ヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの最初の工程において、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３およびＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２のアミノ酸配列を、全体的に最もよく一致するヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を見出すためにヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースに対して比較した。ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３について、ヒトに最も近い一致物がＩＧＨＶ３－２３＊０４遺伝子であった。その後、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をＩＧＨＶ３－２３＊０４遺伝子のフレームワーク配列に移植したヒト化可変ドメイン配列を設計した。ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２について、ヒトに最も近い一致物がＩＧＨＶ３－４８＊０３遺伝子であった。その後、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をＩＧＨＶ３－４８＊０３遺伝子のフレームワーク配列に移植したヒト化可変ドメイン配列を設計した。一方で、一残基変異（Ｎ３４Ｑ、Ｋａｂａｔナンバリング）を、翻訳後修飾の危険性を低下させるためにＣＤＲ１内に導入した。その後、３Ｄモデルを生成して、アルパカアミノ酸のヒトアミノ酸への置き換えが結合および／またはＣＤＲ立体配座に影響を及ぼし得る任意のフレームワーク位置が存在するかどうかを明らかにした。
実施例４．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の詳細な動態。
ヒト化抗体の結合動態を探るために、本実施例ではさらに、完全動態親和性試験を、種々のモノクローナル抗体に対しての様々な用量の抗原（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．１５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ）の会合および解離をＢｉａｃｏｒｅによってモニターすることによって行った。表４に示されるように、１１２－ＶＨＨ５－ＰＴＭの親和性はＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２キメラ抗体と同程度であった。９３ＶＨ－４、９３ＶＨ－６および９３ＶＨ－８の親和性は、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３キメラ抗体と同程度であった。
ヒト化抗体の結合動態を探るために、本実施例ではさらに、完全動態親和性試験を、種々のモノクローナル抗体に対しての様々な用量の抗原（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．１５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ）の会合および解離をＢｉａｃｏｒｅによってモニターすることによって行った。表４に示されるように、１１２－ＶＨＨ５－ＰＴＭの親和性はＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－１１２キメラ抗体と同程度であった。９３ＶＨ－４、９３ＶＨ－６および９３ＶＨ－８の親和性は、ＡＬＰ－Ｔａｎ－３ｐ－９３キメラ抗体と同程度であった。
実施例５．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合特性
本願のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合特性を最初にＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。簡単に記載すると、図１Ｂに示されるような異なる濃度での１００μｌの抗ＰＤ－Ｌ１抗体（９３－ＶＨ６または１１２－ＶＨ４７）をヒトＨｉｓ－ＰＤ－Ｌ１により事前に被覆された９６ウエルプレートのそれぞれのウエルにおいてインキュベートし、その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰを加え、ＨＲＰのその基質との発色反応によって分析した。図１Ｂに示されるように、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体である９３－ＶＨ６および１１２－ＶＨ４７はともに、ヒトＰＤ－Ｌ１との特異的結合を用量依存的様式で呈した。
本願のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合特性を最初にＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。簡単に記載すると、図１Ｂに示されるような異なる濃度での１００μｌの抗ＰＤ－Ｌ１抗体（９３－ＶＨ６または１１２－ＶＨ４７）をヒトＨｉｓ－ＰＤ－Ｌ１により事前に被覆された９６ウエルプレートのそれぞれのウエルにおいてインキュベートし、その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰを加え、ＨＲＰのその基質との発色反応によって分析した。図１Ｂに示されるように、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体である９３－ＶＨ６および１１２－ＶＨ４７はともに、ヒトＰＤ－Ｌ１との特異的結合を用量依存的様式で呈した。
本願の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合能をさらに、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＲａｊｉ細胞を使用することによって評価した。簡単に記載すると、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現する５０μｌのＲａｊｉ細胞を２＊１０５細胞／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに播種した。図１Ｃに示されるような異なる濃度での５０μｌの抗ＰＤ－Ｌ１抗体（９３－ＶＨ６または１１２－ＶＨ４７）をそれぞれのウエルに加え、氷上で１時間にわたって細胞とともにインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液によって２回洗浄し、１００μｌのＰＥ－抗ｈｕ ＩｇＧを補充し、続いてインキュベーションを氷上で１時間にわたって行った。インキュベーション後、それぞれのウエルにおける細胞をフローサイトメトリーによる分析のために集め、６５μｌのＦＡＣＳ緩衝液により再懸濁した。図１Ｃに示されるように、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体である９３－ＶＨ６および１１２－ＶＨ４７はともに、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＲａｊｉ細胞との特異的結合を用量依存的様式で呈した。
実施例６．Ｔ細胞活性化バイオアッセイ（ＮＦＡＴ）
抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＴ細胞応答を刺激する能力を試験するために、ｈＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した。Ｊｕｒｋａｔは、ＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼ発現をＴＣＲ刺激の際に活性化することができるヒトＴ細胞白血病細胞株である。このアッセイにおいて、ヒトＰＤ－１遺伝子がレンチウイルスによってトランスフェクトされるＪｕｒｋａｔ細胞をレスポンダー細胞として使用した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）が、ＴＣＲシグナルを刺激するために使用される。このシステムでは、異所的発現されたｈｕＰＤ－Ｌ１は、ＳＥＥ刺激されたＮＦ－ＡＴ－ルシフェラーゼ活性をＪｕｒｋａｔ細胞において抑制することができ、一方で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性を逆転することができる。手短に言えば、ＡＰＣ（２．５×１０４個）をＳＥＥ刺激の存在下、ＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１×１０５個）と共培養した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を培養開始時に加えた。６時間後、得られた細胞をそのルシフェラーゼ活性について評価した。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＴ細胞応答を刺激する能力を試験するために、ｈＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した。Ｊｕｒｋａｔは、ＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼ発現をＴＣＲ刺激の際に活性化することができるヒトＴ細胞白血病細胞株である。このアッセイにおいて、ヒトＰＤ－１遺伝子がレンチウイルスによってトランスフェクトされるＪｕｒｋａｔ細胞をレスポンダー細胞として使用した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）が、ＴＣＲシグナルを刺激するために使用される。このシステムでは、異所的発現されたｈｕＰＤ－Ｌ１は、ＳＥＥ刺激されたＮＦ－ＡＴ－ルシフェラーゼ活性をＪｕｒｋａｔ細胞において抑制することができ、一方で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性を逆転することができる。手短に言えば、ＡＰＣ（２．５×１０４個）をＳＥＥ刺激の存在下、ＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１×１０５個）と共培養した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を培養開始時に加えた。６時間後、得られた細胞をそのルシフェラーゼ活性について評価した。
図２Ａ～図２Ｃに示されるように、試験されたすべての抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断し、したがって、ＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼ活性を増強した。
実施例７．ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の生成
２つの以前に特定された抗ＣＤ４７抗体の１３Ｈ３および３４Ｃ５と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の９３－ＶＨ－６とを選択して、抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を「２対２」形式および「１対２」形式（図３において例示される構造）で生成させた。
２つの以前に特定された抗ＣＤ４７抗体の１３Ｈ３および３４Ｃ５と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の９３－ＶＨ－６とを選択して、抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を「２対２」形式および「１対２」形式（図３において例示される構造）で生成させた。
図３Ａは「２対２」の対称的形式の二重特異性抗体分子を例示する。そのような二重特異性抗体には、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃにつながれる抗ＣＤ４７ Ｆａｂの重鎖にＧＳリンカーを介してそれぞれがつながれる２つの抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が含まれることが可能である。
図３Ｂは別の「２対２」の対称的形式の二重特異性抗体分子を例示する。そのような二重特異性抗体には、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃにつながれる抗ＣＤ４７ Ｆａｂの軽鎖にＧＳリンカーを介してそれぞれがつながれる２つの抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が含まれることが可能である。
図３Ｃは別の「２対２」の対称的形式の二重特異性抗体分子を例示する。そのような二重特異性抗体には、抗ＣＤ４７ ＦａｂにつながれるＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃのＣＬにＧＳリンカーを介してそれぞれがつながれる２つの抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が含まれることが可能である。
図３Ｄは別の「２対２」の対称的形式の二重特異性抗体分子を例示する。この二重特異性抗体には、抗ＣＤ４７ Ｆａｂと、１つのＩｇＧ１ Ｆｃまたは１つのＩｇＧ４ Ｆｃと、ＧＳリンカーを介してＣＨ３に連結される抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体とが含まれる。
図３Ｅは「２対１」の非対称的形式の二重特異性抗体分子を示す。この二重特異性抗体には、抗ＣＤ４７ ＦａｂもまたつながれるＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃに１つのＧＳリンカーによって連結される２つのタンデム状の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が含まれる。Ｆｃ部分には、ＣＨ３におけるノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ）変異が、誤った対形成を減少させるために含まれる。
図３Ｆは別の「２対１」の非対称的形式の二重特異性抗体分子を示す。この二重特異性抗体には、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖもまたつながれるＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃに１つのＧＳリンカーによって連結される２つのタンデム状の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が含まれる。Ｆｃ部分には、ＣＨ３におけるノブ・イン・ホール変異が、誤った対形成を減少させるために含まれる。
これらの二重特異性抗体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞の１００ｍＬの一過性トランスフェクトされた上清からプロテインＡ親和性カラムによって精製した。二重特異性抗体のそれぞれの純度をＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより試験した。
実施例８．ＣＤ４７がＳＩＲＰαに結合することを遮断する抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体
アッセイをＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）の記載に従って行った。簡単に記載すると、連続希釈した抗体、すなわち、Ｔａｇ１－ＣＤ４７とＴａｇ２－ＳＩＲＰａとを事前に混合し、室温で１５分間にわたってインキュベートし、その後、事前に混合された抗Ｔａｇ１－Ｔｂ３および抗Ｔａｇ２－ＸＬ６６５を加え、ＲＴで１時間にわたってインキュベートした。蛍光データを、レーザーを光源として使用するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った。抗ＣＤ４７抗体（１３Ｈ３または３４Ｃ５）をこの試験において陽性コントロールとして使用した。
アッセイをＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）の記載に従って行った。簡単に記載すると、連続希釈した抗体、すなわち、Ｔａｇ１－ＣＤ４７とＴａｇ２－ＳＩＲＰａとを事前に混合し、室温で１５分間にわたってインキュベートし、その後、事前に混合された抗Ｔａｇ１－Ｔｂ３および抗Ｔａｇ２－ＸＬ６６５を加え、ＲＴで１時間にわたってインキュベートした。蛍光データを、レーザーを光源として使用するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った。抗ＣＤ４７抗体（１３Ｈ３または３４Ｃ５）をこの試験において陽性コントロールとして使用した。
結果が、３４Ｃ５が１３Ｈ３よりも強い遮断活性を有したことを示す図４Ａおよび図４Ｂに示される。そのうえ、３４Ｃ５－ＩｇＧ１－９３ＶＨ－６、９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｈ－ＩｇＧ１および９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｌ－ＩｇＧ１は、親の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体と比較して、いくらかの活性喪失を有した。しかしながら、残りのＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、それらの親の抗ＣＤ４７抗体に対して同程度のＳＩＲＰα遮断活性または一層より強いＳＩＲＰα遮断活性を有した。
実施例９．Ｔ細胞活性化バイオアッセイ（ＮＦＡＴ）
抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＴ細胞応答を刺激する能力を試験するために、ｈＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した。Ｊｕｒｋａｔは、ＮＦ－ＡＴ活性化ルシフェラーゼ発現をＴＣＲ刺激の際に活性化することができるヒトＴ細胞白血病細胞株である。このアッセイにおいて、ヒトＰＤ－１遺伝子がレンチウイルスによってトランスフェクトされるＪｕｒｋａｔ細胞をレスポンダー細胞として使用した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）が、ＴＣＲシグナルを刺激するために使用される。このシステムでは、異所的発現されたｈｕＰＤ－Ｌ１は、ＳＥＥ刺激されたＮＦ－ＡＴ－ルシフェラーゼ活性をＪｕｒｋａｔ細胞において抑制することができ、一方で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＮＦ－ＡＴ－ルシフェラーゼ活性を逆転することができる。手短に言えば、ＡＰＣ（２．５×１０４個）をＳＥＥ刺激の存在下、ＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１×１０５個）と共培養した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を培養開始時に加えた。６時間後、得られた細胞をそのルシフェラーゼ活性について評価した。
抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＴ細胞応答を刺激する能力を試験するために、ｈＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した。Ｊｕｒｋａｔは、ＮＦ－ＡＴ活性化ルシフェラーゼ発現をＴＣＲ刺激の際に活性化することができるヒトＴ細胞白血病細胞株である。このアッセイにおいて、ヒトＰＤ－１遺伝子がレンチウイルスによってトランスフェクトされるＪｕｒｋａｔ細胞をレスポンダー細胞として使用した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）が、ＴＣＲシグナルを刺激するために使用される。このシステムでは、異所的発現されたｈｕＰＤ－Ｌ１は、ＳＥＥ刺激されたＮＦ－ＡＴ－ルシフェラーゼ活性をＪｕｒｋａｔ細胞において抑制することができ、一方で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＮＦ－ＡＴ－ルシフェラーゼ活性を逆転することができる。手短に言えば、ＡＰＣ（２．５×１０４個）をＳＥＥ刺激の存在下、ＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１×１０５個）と共培養した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を培養開始時に加えた。６時間後、得られた細胞をそのルシフェラーゼ活性について評価した。
図５に示されるように、２対２の形式にあるすべての二重特異性抗体が、親のＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体９３－ＶＨ－６と比較して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１媒介ＮＦ－ＡＴ－ルシフェラーゼ活性を遮断することにおいて同程度の効力またはより強い効力を有した。
実施例１０．抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体はヒトマクロファージ（ＭΦ）による腫瘍細胞の食作用の増加を示した
単球をヒト血液から単離し、当該単球を６日間にわたってｈＧＣＳＦの存在下でマクロファージに分化させた。単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を掻き取り、２４ウエルディッシュに再プレーティングし、２４時間にわたって接着させた。ヒト腫瘍細胞株ＲＫＯを標的細胞として選び、１ｍＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ－Ｆａｒレッドにより２０分間にわたって標識し、ＭＤＭを１ｍＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ－Ｖｉｏｌｅｔにより２０分間にわたって標識し、その後、食細胞あたり腫瘍細胞の比率３：１で混合し、抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体および対応するコントロールｍＡｂならびに組み合わせを様々な用量で加えた。３時間にわたるインキュベーションの後、標的細胞の食作用をフローサイトメトリーによって分析した。食作用を、マクロファージに対してゲーティングし、その後、二重陽性細胞の割合を評価することによって測定した。
単球をヒト血液から単離し、当該単球を６日間にわたってｈＧＣＳＦの存在下でマクロファージに分化させた。単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を掻き取り、２４ウエルディッシュに再プレーティングし、２４時間にわたって接着させた。ヒト腫瘍細胞株ＲＫＯを標的細胞として選び、１ｍＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ－Ｆａｒレッドにより２０分間にわたって標識し、ＭＤＭを１ｍＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ－Ｖｉｏｌｅｔにより２０分間にわたって標識し、その後、食細胞あたり腫瘍細胞の比率３：１で混合し、抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体および対応するコントロールｍＡｂならびに組み合わせを様々な用量で加えた。３時間にわたるインキュベーションの後、標的細胞の食作用をフローサイトメトリーによって分析した。食作用を、マクロファージに対してゲーティングし、その後、二重陽性細胞の割合を評価することによって測定した。
図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、親のモノクローナル抗体と臨床ベンチマーク抗体との併用処置よりも高いＡＤＣＰ効力を示した。
別の研究を、アイソタイプがＡＤＣＰ効力をもたらすかどうかをさらに試験するために行った。この研究では、ｈＩｇＧ１ ＦｃおよびｈＩｇＧ４ Ｆｃをそれぞれ有する二重特異性抗体の間での、ＡＤＣＰアッセイにおける差を比較した。結果が図６Ｃに示される。抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のＡＤＣＰ効力が、アイソタイプがｈＩｇＧ１からｈＩｇＧ４に変化したときには全体的に同程度であった。
実施例１１．抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の、ＲＫＯ細胞に基づく結合
ＲＫＯ細胞は、内因性レベルのヒトＣＤ４７およびヒトＰＤ－Ｌ１を表面に発現するヒト結腸癌細胞株である。ＲＫＯ細胞を、連続希釈した抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、親のＣＤ４７単一特異性抗体またはＰＤ－Ｌ１単一特異性抗体とともに４℃で３０分間にわたってインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄し、続いて、ＡＰＣ標識二次抗体とのインキュベーションを４℃で３０分間にわたって行った。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液により３回にわたって洗浄した。結合をフローサイトメトリーによって測定した。
ＲＫＯ細胞は、内因性レベルのヒトＣＤ４７およびヒトＰＤ－Ｌ１を表面に発現するヒト結腸癌細胞株である。ＲＫＯ細胞を、連続希釈した抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、親のＣＤ４７単一特異性抗体またはＰＤ－Ｌ１単一特異性抗体とともに４℃で３０分間にわたってインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄し、続いて、ＡＰＣ標識二次抗体とのインキュベーションを４℃で３０分間にわたって行った。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液により３回にわたって洗浄した。結合をフローサイトメトリーによって測定した。
図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、対称的形式での抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、親のＰＤ－Ｌ１単一特異性抗体よりも強い結合能または同程度の結合能のどちらかを示した。
実施例１２．抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のＲＢＣ結合試験およびＲＢＣ凝集試験
１０．１ ＲＢＣ結合アッセイ
ヒトＲＢＣをＰＢＳで１％に希釈し、抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（抗体の用量設定は、２００ｎＭから開始して３倍ずつ低減）とともに４℃で１時間にわたってインキュベートし、続いて、ＰＥコンジュゲート化二次抗体を４℃で３０分間にわたって加えた。ヒトＲＢＣに対する抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１抗体の結合をフローサイトメトリーによって調べた。
１０．１ ＲＢＣ結合アッセイ
ヒトＲＢＣをＰＢＳで１％に希釈し、抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（抗体の用量設定は、２００ｎＭから開始して３倍ずつ低減）とともに４℃で１時間にわたってインキュベートし、続いて、ＰＥコンジュゲート化二次抗体を４℃で３０分間にわたって加えた。ヒトＲＢＣに対する抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１抗体の結合をフローサイトメトリーによって調べた。
図８Ａに示されるように、９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｈ－ＩｇＧ１、９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｌ－ＩｇＧ１および１３Ｈ３－Ｌ－９３ＶＨ６－ＩｇＧ１は、最小限のＲＢＣ結合、またはＲＢＣ結合がないことを示し、１３Ｈ３抗体と同程度であった。試験されたすべての抗体の中で、親のＣＤ４７抗体３４Ｃ５が最も強いＲＢＣ結合を示した。
１０．２ ＲＢＣ凝集アッセイ
ヒトＲＢＣをＰＢＳで１％に希釈し、丸底９６ウエルプレートにおいて用量設定した抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１抗体（抗体の用量設定は、２００ｎＭから開始して３～４倍ずつ低減）とともに室温で２時間にわたってインキュベートした。赤血球凝集の証拠が、血球凝集していないＲＢＣの点状（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）赤色ドットと比較して曇りとして現れる非沈降ＲＢＣの存在によって明らかにされる。
ヒトＲＢＣをＰＢＳで１％に希釈し、丸底９６ウエルプレートにおいて用量設定した抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１抗体（抗体の用量設定は、２００ｎＭから開始して３～４倍ずつ低減）とともに室温で２時間にわたってインキュベートした。赤血球凝集の証拠が、血球凝集していないＲＢＣの点状（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）赤色ドットと比較して曇りとして現れる非沈降ＲＢＣの存在によって明らかにされる。
図８Ｂに示されるように、９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｈ－ＩｇＧ１および９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｌ－ＩｇＧ１は、親のＣＤ４７抗体１３Ｈ３と類似しているが、評価できるほどにＲＢＣ凝集がないことを示した。参照抗体５Ｆ９はＲＢＣ凝集を４つの試験された濃度で示した。
実施例１３．抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のインビボ抗腫瘍効力
実施例１３．抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のインビボ抗腫瘍効力
１２匹のＮＯＧマウスに、０．２ｍＬのＤＰＢＳ中ヒトＰＢＭＣを個別に注射した（ｉ．ｖ．、５×１０６個／マウス）。８日後、１×１０６個のＲＫＯ細胞をマウスの右脇腹に皮下接種した。平均腫瘍サイズが５７ｍｍ３に達したとき、腫瘍を有するマウスを無作為に３つの群（群あたり４匹のマウス）に分け、これらに、ＰＢＳ、９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｌ－ＩｇＧ１（１２ｍｇ／ｋｇ）、９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｌ－ＩｇＧ４（１２ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ腹腔内投与した。腫瘍体積および体重を週に２回、測定し、記録した。１９日目に、動物を安楽死させた。図８Ｃに示されるように、９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｌ－ＩｇＧ１処置および９３ＶＨ６－１３Ｈ３－Ｌ－ＩｇＧ４処置は、ＰＢＳと比較した場合、有意に阻害された腫瘍成長を示し、このことから、本願の抗ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１ ｂｓＡｂの強力な抗腫瘍効力が示唆された。
実施例１４．ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の生成
例示的な抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である９３－ＶＨ６および１１２－ＶＨ４７を選択して、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を種々の形式（図９において例示される構造）で生成させた。
例示的な抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である９３－ＶＨ６および１１２－ＶＨ４７を選択して、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を種々の形式（図９において例示される構造）で生成させた。
１つの形式において、２つのＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを、Ｇ４Ｓリンカーを介して抗ＴＩＧＩＴ部分の重鎖のＣ末端に融合し（これはＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－ＰＤ－Ｌ１として示される）、または抗ＴＩＧＩＴ部分の軽鎖のＣ末端に融合した（これはＴＩＧＩＴ－ＣＬ－ＰＤ－Ｌ１として示される）。あるいは、４つのＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂを、すなわち、それぞれのタンデム群での２つを、Ｇ４Ｓリンカーを介してＴＩＧＩＴ部分の重鎖のＣ末端に連結した（これはＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－ＰＤ－Ｌ１＊２として示される）。
これらの二重特異性抗体を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞培養物の１００ｍＬの上清からプロテインＡ親和性カラムによって精製した。二重特異性抗体のそれぞれの純度をＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。
実施例１５．ＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの結合特性
組換えヒトｈｉｓタグ化ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって試験した。ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ分子または親の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂをプロテインＡチップによって捕捉した。ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質の一連の希釈物（６．２５ｎＭ～１００ｎＭ）を、捕捉された抗体の上に１０μＬ／分の流速で注入した。抗原を１８０秒間にわたって会合させ、１２００秒間にわたって解離させた。すべての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。
組換えヒトｈｉｓタグ化ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって試験した。ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ分子または親の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂをプロテインＡチップによって捕捉した。ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質の一連の希釈物（６．２５ｎＭ～１００ｎＭ）を、捕捉された抗体の上に１０μＬ／分の流速で注入した。抗原を１８０秒間にわたって会合させ、１２００秒間にわたって解離させた。すべての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。
データは、ＰＤ－Ｌ１結合親和性が、ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ分子においては、その親の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較したとき、損なわれなかったことを示す（表９）。
抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ分子のヒトＰＤ－Ｌ１との結合をＥＬＩＳＡによってさらに分析した。簡単に記載すると、図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるような異なる濃度の１００μｌの抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂである、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６＊２、ＴＩＧＩＴ－ＣＬ－９３－ＶＨ６およびＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－１１２－ＶＨ４７を、ヒトＨｉｓ－ＰＤ－Ｌ１により事前に被覆された９６ウエルプレートのそれぞれのウエルにおいてインキュベートし、その後、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂとヒトＨｉｓ－ＰＤ－Ｌ１との間での結合を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰを介して分析した。図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６＊２、ＴＩＧＩＴ－ＣＬ－９３－ＶＨ６およびＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－１１２－ＶＨ４７を含めて試験されたＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂはすべてが、ヒトＰＤ－Ｌ１との特異的結合を用量依存的様式で呈した。
さらに、本願の抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂｓの、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞との結合能を、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を使用することによって分析した。簡単に記載すると、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現する５０μｌのＲａｊｉ細胞を２＊１０５細胞／ウエルで９６ウエルプレートに播種した。図１０Ｃに示されるような異なる濃度の５０μｌの抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、１１２－ＶＨ４７またはＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－１１２－ＶＨ４７をそれぞれのウエルに加え、氷上で１時間にわたって細胞とともにインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液によって２回洗浄し、１００μｌのＰＥ－抗ｈｕ ＩｇＧを補充し、続いてインキュベーションを氷上で１時間にわたって行った。インキュベーション後、それぞれのウエルにおける細胞をフローサイトメトリーによる分析のために集め、６５μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。図１０Ｃに示されるように、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－１１２－ＶＨ４７は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＲａｊｉ細胞との特異的結合を用量依存的様式で呈した。
実施例１６．ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ分子のＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト活性
ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ分子のＰＤ－Ｌ１拮抗活性を評価するために、ＰＤ－Ｌ１細胞に基づく機能的アッセイを実施例６に記載されるように行った。
ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ分子のＰＤ－Ｌ１拮抗活性を評価するために、ＰＤ－Ｌ１細胞に基づく機能的アッセイを実施例６に記載されるように行った。
図１１に示されるように、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６＊２ ｂｓＡｂ分子は、親の９３－ＶＨ６ ｓｄＡｂと同程度の拮抗活性を示した。ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６は、抗９３－ＶＨ６ ｓｄＡｂと比較したとき、増強された最大効果を示し、しかし、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト活性におけるＥＣ５０の低下を示した。ＴＩＧＩＴ－ＣＬ－９３－ＶＨ６ ｂｓＡｂは、９３－ＶＨ６ ｓｄＡｂと比較したとき、同程度の最大効果を示し、しかし、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト活性におけるＥＣ５０の低下を示した。
実施例１７．ＴＩＧＩＴに対するＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの結合特性
ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂおよびその親のＴＩＧＩＴ抗体の組換えＨｉｓタグ化ヒトＴＩＧＩＴ－ＥＣＤタンパク質への結合をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００によって調べた。抗体をプロテインＡチップによって捕捉した。一連の濃度のＨｉｓタグ化ヒトＴＩＧＩＴ－ＥＣＤタンパク質（０．７８ｎＭ～１２．５ｎＭ）を、捕捉抗体の上に１０μｌ／分の流速で注入した。会合相は１８０秒であり、解離相は１２００秒であった。
ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂおよびその親のＴＩＧＩＴ抗体の組換えＨｉｓタグ化ヒトＴＩＧＩＴ－ＥＣＤタンパク質への結合をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００によって調べた。抗体をプロテインＡチップによって捕捉した。一連の濃度のＨｉｓタグ化ヒトＴＩＧＩＴ－ＥＣＤタンパク質（０．７８ｎＭ～１２．５ｎＭ）を、捕捉抗体の上に１０μｌ／分の流速で注入した。会合相は１８０秒であり、解離相は１２００秒であった。
結果が下記において表１０に示される。ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ抗体についてのＢｉａｃｏｒｅ結果は、これらの二重特異性抗体がヒトＴＩＧＩＴに対する高親和性の結合剤であることを示している。表に示されるように、これらのＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ抗体は、それらの親のＴＩＧＩＴ抗体に対する同程度の親和性を有した。
ＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合能を評価するために、ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂをＨｉｓタグ化ヒトＴＩＧＩＴについてのＥＬＩＳＡ結合試験に供した。図１２に示されるように、試験されたＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂのすべてがＴＩＧＩＴとの特異的結合を用量依存的様式で呈した。
実施例１８．ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂのＴＩＧＩＴアンタゴニスト活性
ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ抗体のＴＩＧＩＴ遮断機能を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞に基づくインビトロ機能的アッセイを使用した。簡単に記載すると、ヒトＴＩＧＩＴとその対抗受容体ＣＤ２２６とを同時に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の表面に過剰発現させ、一方で、それらのコリガンドであるヒトＣＤ１５５をＲａｊｉ細胞の表面に過剰発現させた。これらの２つの細胞タイプをスーパー抗原の存在下で共培養したとき、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５ライゲーションによってＪｕｒｋａｔ細胞表面に送達される負のシグナル伝達により、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化が阻害される。ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイと同様のルシフェラーゼレポートシステムを使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化状態を評価した。連続希釈したＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂまたは抗ＴＩＧＩＴ抗体を培養系に加えたとき、抗体はＪｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ－ＣＤ２２６細胞のルシフェラーゼ発現を用量依存的に増強することができる。
ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ抗体のＴＩＧＩＴ遮断機能を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞に基づくインビトロ機能的アッセイを使用した。簡単に記載すると、ヒトＴＩＧＩＴとその対抗受容体ＣＤ２２６とを同時に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の表面に過剰発現させ、一方で、それらのコリガンドであるヒトＣＤ１５５をＲａｊｉ細胞の表面に過剰発現させた。これらの２つの細胞タイプをスーパー抗原の存在下で共培養したとき、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５ライゲーションによってＪｕｒｋａｔ細胞表面に送達される負のシグナル伝達により、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化が阻害される。ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイと同様のルシフェラーゼレポートシステムを使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化状態を評価した。連続希釈したＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂまたは抗ＴＩＧＩＴ抗体を培養系に加えたとき、抗体はＪｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ－ＣＤ２２６細胞のルシフェラーゼ発現を用量依存的に増強することができる。
このアッセイにより、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６ ｂｓＡｂ分子を、それらの親のＴＩＧＩＴ抗体と比較したとき、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５シグナル伝達を遮断してＪｕｒｋａｔ細胞活性化を増強することにおいて、優れた効力を示した（図１３）。それ以外の２つの形式、すなわち、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６＊２ ｂｓＡｂ、およびＴＩＧＩＴ－ＣＬ－９３－ＶＨ６ ｂｓＡｂは、親のＴＩＧＩＴ抗体と同程度のＴＩＧＩＴ遮断活性を示した。
実施例１９．インビトロにおけるＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの相乗効果
Ｔ細胞活性化を増進させることにおけるＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの相乗効果を評価するために、本発明者らは、細胞に基づくロバストなインビトロ二機能性アッセイを確立した。簡単に記載すると、ヒトＴＩＧＩＴと、ＣＤ２２６およびＰＤ１とを同時に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の表面に過剰発現させ、一方で、それらの個々のリガンドであるＣＤ１５５およびＰＤ－Ｌ１をＲａｊｉ細胞の表面に過剰発現させた。これらの２つの細胞タイプをスーパー抗原の存在下で共培養したとき、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用およびＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用の両方によってＪｕｒｋａｔ細胞表面に送達される負のシグナル伝達により、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現によって示されるＪｕｒｋａｔ細胞活性化が相乗的に阻害された。
Ｔ細胞活性化を増進させることにおけるＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの相乗効果を評価するために、本発明者らは、細胞に基づくロバストなインビトロ二機能性アッセイを確立した。簡単に記載すると、ヒトＴＩＧＩＴと、ＣＤ２２６およびＰＤ１とを同時に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の表面に過剰発現させ、一方で、それらの個々のリガンドであるＣＤ１５５およびＰＤ－Ｌ１をＲａｊｉ細胞の表面に過剰発現させた。これらの２つの細胞タイプをスーパー抗原の存在下で共培養したとき、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用およびＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用の両方によってＪｕｒｋａｔ細胞表面に送達される負のシグナル伝達により、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現によって示されるＪｕｒｋａｔ細胞活性化が相乗的に阻害された。
図１４に示されるように、連続希釈したＴＩＧＩＴ抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体を培養系に加えたとき、抗体はＪｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ－ＣＤ２２６－ＰＤ－１細胞のルシフェラーゼ発現を用量依存的に増強することができた。しかしながら、抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせはルシフェラーゼ産生を有意に増強し、このことから、これらの２つの抗体の強力な相乗効果が示された。留意すべきことに、ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ形式であるＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６およびＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－ＰＤ－９３－ＶＨ６＊２は、コンボ処理（combo treatment）よりも一層有意に増強されたＴ細胞活性化を示し、これに対して、ＴＩＧＩＴ－ＣＬ－９３－ＶＨ６ ｂｓＡｂはコンボ処理と同程度のＴ細胞活性化を示した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞株に基づく二機能性アッセイにおける観察をさらに確認するために、ヒトＰＢＭＣ由来の初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に対するＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂの相乗効果をさらに調べた。簡単に記載すると、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化因子のヒトＣＤ１５５と、ＰＤ－Ｌ１とを構成的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－ＴＣＲ－ＣＤ１５５－ＰＤ－Ｌ１細胞）を、ウエルあたり３５，０００細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。２名の健常者ドナーから単離した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞をウエルあたり５０，０００細胞の密度でＣＨＯ－ＴＣＲ－ＣＤ１５５－ＰＤ－Ｌ１細胞とともにインキュベートした。その後、連続希釈したＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤ－Ｌ１、またはこれら２つの抗体の組み合わせを３日間にわたって共培養系に加え、培養培地を、標準的なＥＬＩＳＡキットを使用するＩＦＮ－γ測定のために集めた。
図１５に示されるように、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生をかろうじて刺激することができたが、これらの２つの抗体の組み合わせはＩＦＮ－γ産生を濃度依存的様式で有意に増強した。最も重要なことに、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ－９３－ＶＨ６ ｂｓＡｂは、Ｔ細胞活性化によって誘導されたＩＦＮ－γ産生においてコンボ処理よりも有意に優れた効力を示した：このことから、インビトロにおける初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に対するこのＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ ｂｓＡｂ形式の強い相乗効果が明らかにされた。
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本開示は、本開示の個々の局面の単一の例示として意図される記載された具体的な実施形態によって範囲が限定されず、機能的に等価である組成物または方法はどれもが本開示の範囲内にある。様々な改変および変形形態が、本開示の精神または範囲から逸脱することなく本開示の方法および組成物においてなされることが可能であることが、当業者には明らかである。したがって、本開示は、本開示のそのような改変および変形形態が、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある限り、そのような改変および変形形態を包含することが意図される。
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願があたかも、参照によって組み込まれることが具体的に、かつ個々に示されているのと同じ程度に、参照によって本明細書中に組み込まれる。
Claims (25)
- ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有し、かつ、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体、または前記単一ドメイン抗体を含むポリペプチド。
- 前記単一ドメイン抗体がヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特異性を有し、かつ、配列番号１～配列番号３６、配列番号１１４～配列番号１２２および配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つの相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつ、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がＫａｂａｔナンバリングスキームに従う、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、
（１）配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列をそれぞれ、または
（２）配列番号１１３、配列番号４９および配列番号５０のアミノ酸配列をそれぞれ
含む、請求項１または２に記載の抗体またはポリペプチド。 - 前記ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が配列番号５６のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記抗体がヒト化される、請求項４に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記ヒト化抗体が、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａからなる群から選択される１またはそれを超える復帰変異を含む、請求項５に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記ヒト化抗体が、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｆ、４７Ｆ、４９Ａ、７８Ｖおよび９４Ａの復帰変異を含む、請求項５に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記抗体が、配列番号１１４～配列番号１２２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記抗体が配列番号１１９のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記ＣＤＲ１が配列番号１１３のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記抗体がヒト化される、請求項１０に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記ヒト化抗体が、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖからなる群から選択される１またはそれを超える復帰変異を含む、請求項１１に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記ヒト化抗体が、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、６８Ａ、９３Ｒおよび９４Ｖの復帰変異を含む、請求項１１に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記抗体が、配列番号１２３～配列番号１３０からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記抗体が配列番号１２７または配列番号１３０のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体またはポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、ＰＤ－Ｌ１とは異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド。
- 請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体と、ＰＤ－Ｌ１でない標的抗原に対する結合特異性を有する第２の抗体または抗原結合フラグメントとを含む二重特異性抗体。
- 請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチドあるいは請求項１７に記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９に記載のベクターを含む細胞。
- （１）請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド、請求項１７に記載の二重特異性抗体、あるいは請求項１８に記載のポリヌクレオチド、および
（２）医薬的に許容され得るキャリア
を含む組成物。 - がんを処置することを必要とする患者においてがんを処置する方法であって、有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド、請求項１７に記載の二重特異性抗体、あるいは請求項１８に記載のポリヌクレオチドを前記患者に投与することを含む方法。
- がんを処置するための医薬品を調製するための、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド、請求項１７に記載の二重特異性抗体、あるいは請求項１８に記載のポリヌクレオチドの使用。
- 前記がんが固形腫瘍である、請求項２２に記載の方法または請求項２３に記載の使用。
- 前記がんが、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法または請求項２３に記載の使用。
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