ES2902670T3 - Anticuerpo monoclonal contra PD-1 y aplicaciones del mismo - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal contra el factor de muerte programada 1 (PD-1) o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un sitio de unión al receptor de Fc neonatal (FcRn) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpo monoclonal contra PD-1 y aplicaciones del mismo
Campo
La presente divulgación se refiere al campo de la inmunología y la modificación por ingeniería de anticuerpos, en particular a un anticuerpo monoclonal contra el factor de muerte programada 1 (PD-1) y la aplicación del mismo. Antecedentes
Actualmente, todavía existe la necesidad de un método para prolongar la semivida sérica del anticuerpo similar a la inmunoglobulina G (IgG) (especialmente el anticuerpo similar a IgG que se produce de manera natural) y aumentar la afinidad de unión del anticuerpo similar a IgG al receptor de Fc neonatal (FcRn).
El factor de muerte programada 1 (PD-1) (también conocido como CD279, ID de gen: PDCD1, número de registro Genebank: NP_005009), como miembro inhibidor de la superfamilia de inmunoglobulinas homóloga a CD28, es un receptor de superficie celular crítico en la regulación del equilibrio entre señales estimulantes e inhibidoras en el sistema inmunitario, así como el mantenimiento de la tolerancia periférica. PD-1 es una proteína transmembrana de tipo I monomérica, que consiste en un dominio extracelular similar a una región variable de inmunoglobulina y un dominio citoplasmático con un motivo de inhibición inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) y un motivo conmutador inmunorreceptor basado en tirosina (ITSM). La expresión de PD-1 es inducible en células T, células B, linfocitos citolíticos naturales (células NK) y monocitos, por ejemplo, después de la activación de linfocitos mediante la transducción de señales del receptor de células T (RCT) o del receptor de células B (RCB). PD-1 tiene dos ligandos conocidos, es decir, PD-L1 (tal como, B7-H1, c D274) y PD-L2 (tal como, B7-DC, CD273), que son miembros de la familia de B7 expresados en la superficie celular. Cuando se liga un ligando, PD-1 recluta fosfatasas (tales como SHP-1 y SHP-2) a su motivo de tirosina intracelular, que desfosforila posteriormente moléculas efectoras activadas mediante la transducción de señales de RCT o RCB. Por tanto, PD-1 es capaz de transducir señales inhibidoras en células T y células B sólo cuando se unen con RCT o RCB al mismo tiempo.
Un anticuerpo que reconoce específicamente PD-1 (es decir, un anticuerpo monoclonal contra PD-1) tal como un anticuerpo similar a IgG se usa generalmente en terapia, sin embargo, todavía debe mejorarse porque el anticuerpo similar a IgG natural muestra una grave deficiencia de baja persistencia y corta semivida sérica en la circulación sanguínea que afecta directamente a la eficacia del tratamiento, lo que da como resultado un efecto secundario en un paciente y aumenta la frecuencia y dosificación de la administración del fármaco, lo que aumenta adicionalmente el coste del tratamiento. Por tanto, para prolongar la semivida sérica del anticuerpo similar a IgG (especialmente el anticuerpo similar a IgG natural) y aumentar la afinidad de unión del anticuerpo similar a IgG a FcRn, es de gran importancia desarrollar un nuevo anticuerpo similar a IgG capaz de aumentar la afinidad de unión a FcRn así como de prolongar la semivida sérica.
El documento WO/2009/086320 A1 se refiere a una región Fc variante que comprende al menos una modificación relativa a una región Fc humana silvestre, en la que la modificación se seleccionó del grupo que consiste en 434S, 252Y/428L, 252Y/434S y 428L/434S, y la numeración es según el índice de la UE.
Sumario de la invención
La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal contra el factor de muerte programada 1 (PD-1) o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un sitio de unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Divulgación detallada
La información técnica que se expone a continuación puede ir en algunos aspectos más allá de la divulgación de la invención, que está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención.
Los aspectos de la presente divulgación tienen como objetivo resolver al menos uno de los problemas existentes en la técnica relacionada al menos en cierta medida. Con este propósito, un objeto de la presente divulgación es proporcionar un nuevo anticuerpo monoclonal contra el factor de muerte programada 1 (PD-1) que presenta una mayor afinidad de unión a FcRn y una semivida sérica prolongada. Cabe señalar que la presente divulgación se lleva a cabo por los presentes inventores según los siguientes descubrimientos y trabajos.
El anticuerpo IgG puede hidrolizarse con papaína escindiendo el enlace disulfuro en el extremo N-terminal de una región bisagra del anticuerpo IgG, obteniendo así tres fragmentos, es decir, dos fragmentos idénticos de unión al antígeno (es decir, Fab) y un fragmento cristalizable (es decir, Fc). El fragmento cristalizable Fc del anticuerpo interacciona con una variedad de receptores y ligandos de Fc, lo que le confiere de ese modo importantes funciones
efectoras al anticuerpo, incluyendo la iniciación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la fagocitosis y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA), y transporte de anticuerpos a través de la barrera celular mediante transcitosis. Además, el fragmento Fc es importante para mantener la semivida sérica del anticuerpo similar a IgG.
El receptor de Fc neonatal (FcRn) es un receptor responsable del transporte activo de inmunoglobulina G (IgG) por células epiteliales, que es un heterodímero que consiste en una subunidad de cadena alfa y una subunidad de cadena beta que están unidas por un enlace no covalente. El fragmento Fc del anticuerpo IgG incluye dos cadenas polipeptídicas idénticas, cada una de las cuales se une a una única molécula de FcRn a través de su sitio de unión a FcRn individual. Para un mamífero adulto, el anticuerpo IgG se une a FcRn a través del fragmento Fc protegiendo de ese modo al anticuerpo IgG frente a la degradación, por lo que el fragmento Fc es de importancia crítica para mantener el nivel de anticuerpos en suero. El anticuerpo IgG que se une a FcRn después de endocitosarse por células endoteliales circulará en la circulación sanguínea, mientras que el anticuerpo IgG que no se une a FcRn se degradará por lisosomas. Por tanto, el fragmento Fc es fundamental para determinar la intensidad con la que el anticuerpo IgG se une a FcRn.
Basándose en lo anterior, los presentes inventores han intentado prolongar la semivida sérica de un anticuerpo similar a IgG y aumentar la afinidad de unión del anticuerpo similar a IgG a FcRn cambiando la secuencia de una región constante de cadena pesada de anticuerpo similar a IgG (es decir, la secuencia del fragmento Fc), con el anticuerpo similar a IgG H2L2 que reconoce específicamente a PD-1 como objeto. Es decir, los presentes inventores tienen como objetivo mejorar la semivida sérica y la afinidad de unión a FcRn mediante la mutación de los aminoácidos en el fragmento Fc del anticuerpo similar a IgG H2L2. Después de una serie de diseños experimentales e investigaciones, los presentes inventores encuentran con sorpresa que la afinidad de unión del anticuerpo similar a IgG H2L2 a FcRn puede mejorarse mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en el fragmento Fc del anticuerpo H2L2, aumentando así la semivida sérica del anticuerpo similar a IgG H2L2. En concreto, el fragmento Fc del anticuerpo similar a IgG H2L2 está mutado en las posiciones de aminoácido 254, 308 y 434 con aminoácidos que son diferentes de los de un anticuerpo similar a IgG silvestre (que no contiene ninguna mutación de aminoácidos), obteniéndose así un anticuerpo optimizado que presenta una semivida sérica prolongada en comparación con el anticuerpo similar a IgG silvestre mientras se mantiene la afinidad de unión y la especificidad de reconocimiento por el antígeno PD-1.
Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal contra PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el anticuerpo monoclonal incluye un sitio de unión al receptor de Fc neonatal (FcRn) que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV
f l f p p k p k d t l m t [t}r t p e v t c v v v d v s q e d p e v q f n w y v d g v e v h n a k t k p r e e q f n s t
YRVVSVLT@LHQDWLNGKEYKCKYSNKGLPSSTEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT
KNQVSLTCLVKGFYPSDTAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE
GNVFSCSVM HEALH@ HYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 5),
en la que los aminoácidos recuadrados representan respectivamente los aminoácidos en las posiciones 254, 308 y 434 en el sitio de unión a FcRn de una región constante de cadena pesada del anticuerpo monoclonal contra PD-1. Es decir, según la realización, el anticuerpo monoclonal contra PD-1 de la presente divulgación (es decir, un anticuerpo similar a IgG) tiene el aminoácido treonina en la posición 254, el aminoácido prolina en la posición 308 y el aminoácido alanina en la posición 434. en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada. Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que el anticuerpo monoclonal contra PD-1 presenta una fuerte afinidad de unión a FcRn y una semivida sérica prolongada, así como una fuerte afinidad de unión y una buena especificidad de reconocimiento por el antígeno PD-1.
En algunos aspectos, el anticuerpo monoclonal contra PD-1 incluye una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En el presente documento, el anticuerpo monoclonal contra PD-1 denominado H8L2, tiene una mutación de aminoácido a treonina en la posición 254, una mutación de aminoácido a prolina en la posición 308 y una mutación de aminoácido a alanina en la posición 434 en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada en comparación con un anticuerpo H2L2 silvestre. Por tanto, el anticuerpo monoclonal contra PD-1 de la presente divulgación (es decir, H8L2) presenta una fuerte afinidad de unión a FcRn y una semivida sérica prolongada en comparación con el anticuerpo H2L2 silvestre, mientras que se mantienen la afinidad de unión y la especificidad de reconocimiento para el antígeno PD-1.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado. En algunas realizaciones, el
polinucleótido codifica para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito anteriormente. En algunas realizaciones, el anticuerpo codificado por el polinucleótido aislado presenta una fuerte afinidad de unión a FcRn y una semivida sérica prolongada, así como una fuerte afinidad de unión y una buena especificidad de reconocimiento por el antígeno PD-1.
En algunos aspectos, el polinucleótido incluye una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 o una secuencia complementaria de la misma, en la que la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 codifica para el sitio de unión a FcRn que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
AAGGGCGAAGC AT GGTTT GCCTATT GGGGCC AGGGAACCCTGGT C ACCGT CTCCT CAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTC CGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCCAGCAGCTTGG GCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCT GGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCACC CGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTC C AGTT C AACT GGTACGT GG AT GGCGT GG AGGT GC ATAAT GCC AAG AC AAAGC CGC GG GAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCCCCCTGCACCAG GACT GGCTGAACGGC AAGGAGTAC AAGTGC AAGGT CTCC AACAAAGGCCTCCCGTCC TCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT AC AGC AGGCTAACC GT GGAC AAG AGC AGGT GGC AGG AGGGGAAT GT CTTCT C AT GCT CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACGCCCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCT GGGTAAA (SEQ ID NO: 6)
Por tanto, el anticuerpo codificado por el polinucleótido aislado tiene treonina, prolina y alanina, respectivamente, en las posiciones de aminoácido 254, 308 y 434 en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada. Además, el anticuerpo presenta una fuerte afinidad de unión a FcRn y una semivida sérica prolongada, así como una fuerte afinidad de unión y una buena especificidad de reconocimiento por el antígeno PD-1.
En algunos aspectos, el polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Por tanto, el anticuerpo codificado por el polinucleótido aislado tiene una mutación de aminoácido a treonina en la posición 254, una mutación de aminoácido a prolina en la posición 308 y una mutación de aminoácido a alanina en la posición 434 en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada en comparación con el anticuerpo H2L2 silvestre. Además, el anticuerpo monoclonal contra PD-1 de la presente divulgación presenta una fuerte afinidad de unión a FcRn y una semivida sérica prolongada en comparación con el anticuerpo H2L2 silvestre, mientras que se mantienen la afinidad de unión y la especificidad de reconocimiento por el antígeno PD-1.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión. En algunas realizaciones, el vector de expresión incluye el polinucleótido descrito anteriormente.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona una célula recombinante. En algunas realizaciones, la célula recombinante incluye el vector de expresión descrito anteriormente.
Los presentes inventores han descubierto que el anticuerpo que reconoce específicamente PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mimo según algunos aspectos puede sintetizarse de manera eficiente cultivando la célula recombinante descrita anteriormente. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para preparar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito anteriormente. En algunos aspectos, el método incluye cultivar la célula recombinante descrita anteriormente. Con respecto al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce específicamente PD-1, las características y ventajas descritas anteriormente son igualmente aplicables al método y no se describirán en el presente documento.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación también proporciona el uso del polinucleótido, del vector de expresión o de la célula recombinante descrita anteriormente en la preparación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente a PD-1. Por tanto, los presentes
inventores han descubierto que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de unirse específicamente a PD-1 puede producirse de manera eficiente usando el polinucleótido, el vector de expresión o la célula recombinante descritos anteriormente, con una semivida sérica prolongada, una fuerte afinidad de unión a FcRn, así como una fuerte afinidad de unión y una buena especificidad de reconocimiento por el antígeno PD-1. Además, la unión de PD-1 a su receptor puede bloquearse eficazmente mediante el anticuerpo preparado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que bloqueará adicionalmente la ruta de señalización relacionada con el receptor de PD-1 (tal como SHP1/2), inhibiendo de ese modo eficazmente el crecimiento tumoral.
En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, del polinucleótido, del vector de expresión o de la célula recombinante descritos anteriormente en la preparación de un medicamento para fomentar la activación y proliferación de células T, regulando la expresión y secreción de citocinas o estimulando células antitumorales para generar una respuesta inmunitaria más fuerte. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el polinucleótido, el vector de expresión o la célula recombinante descritos anteriormente. Por tanto, la composición farmacéutica puede ser útil para fomentar eficazmente la activación y proliferación de las células T, regular la expresión y secreción de citocinas o estimular células antitumorales para generar una respuesta inmunitaria más fuerte.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para identificar un medicamento capaz de unirse a PD-1. En algunas realizaciones, el método incluye poner en contacto el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito anteriormente con un antígeno en presencia de un candidato, y determinar una primera cantidad de unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, en el que el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo; y poner en contacto el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito anteriormente con un antígeno en ausencia del candidato, y determinar una segunda cantidad de unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, en el que el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo, en el que la segunda cantidad de unión mayor que la primera cantidad de unión es una indicación de que el candidato tiene la capacidad de unirse a PD-1. Por tanto, puede examinarse un candidato que se une a PD-1 usando este método.
Cabe señalar que el bloqueo tanto de PD-1 como de CTLA-4 se aplica normalmente en combinación con la terapia tumoral convencional (por ejemplo, quimioterapia). Por ejemplo, tanto un agente de bloqueo de PD-1 como un agente de bloqueo de CTLA-4 se unirán eficazmente al tejido con quimioterapia. Algunos ensayos clínicos demuestran que puede lograrse la misma eficacia con un fármaco quimioterápico con una dosificación reducida cuando se usa en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-CTLA-4. Se notifica en la bibliografía que la descarbazina (docetaxel, un fármaco anticancerígeno) o la interleucina-2 (IL-2) en combinación tanto con el anticuerpo anti-PD-1 como con el anticuerpo anti-CTLA-4 es útil en el tratamiento del melanoma. Por un lado, el fármaco quimioterápico induce la muerte celular, lo que aumenta a su vez el nivel de antígenos expresados por las células tumorales. Por otro lado, el bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 potencia el efecto sinérgico con radioterapia, cirugía, terapia hormonal y similares, cada una de las cuales amplía las fuentes de antígenos en el cuerpo. Además, también pueden usarse inhibidores de la angiogénesis en combinación tanto con el anticuerpo anti-PD-1 como con el anticuerpo anti-CTLA-4 para inhibir la proliferación vascular, inhibiendo de ese modo adicionalmente el crecimiento de células tumorales, que también puede resultar del aumento de la expresión del antígeno en el cuerpo.
En un aún todavía un aspecto, la presente divulgación proporciona una combinación de fármacos. En algunas realizaciones, la combinación de fármacos incluye:
a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el polinucleótido, el vector de expresión o la célula recombinante descritos anteriormente; y
b) un agente potenciador del sistema inmunitario diferente de a).
Por tanto, la combinación de fármacos consigue un mejor efecto terapéutico para el tumor.
En algunos aspectos, el agente potenciador del sistema inmunitario diferente de a) incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4), un anticuerpo anti-CD40, budesonida y un salicilato; opcionalmente, el salicilato incluye al menos una de sulfasalazina, olsalazina, balsalazida y mesalamina.
Además, debe tenerse en cuenta que el término “aminoácido”, tal como se usa en este documento, significa uno cualquiera de los 20 aminoácidos naturales o análogos no naturales de los mismos que pueden estar presentes en una posición específica y definida. Los 20 aminoácidos naturales pueden abreviarse a un código de tres letras o un código de una letra:
La expresión “posición de aminoácido n”, tales como las posiciones de aminoácido 254, 308 y 434, se refiere a la posición de aminoácido específica en la secuencia de aminoácidos de una proteína. Para el fragmento Fc de la presente divulgación, la posición del aminoácido puede numerarse según el índice EU en Kabat.
Los aspectos y ventajas adicionales de la presente divulgación se expondrán parcialmente en la siguiente descripción, parte de la cual resultará evidente a partir de la descripción o se entenderá a partir de la práctica de la presente divulgación.
Breve descripción de los dibujos
Los aspectos y ventajas anteriores y/o adicionales de la presente divulgación resultarán evidentes y se entenderán fácilmente a partir de la descripción de los ejemplos en combinación con las siguientes figuras, en las que:
la figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de ELISA de los anticuerpos H8L2 y H2L2 que se unen a PD-1 según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 2 es un gráfico que muestra resultados de ELISA competitivo de anticuerpos H8L2 y H2L2 que compiten con PdL1 en la unión de Pd-1 según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 3 es un gráfico que muestra resultados de ELISA competitivo de anticuerpos H8L2 y H2L2 que compiten con PdL2 en la unión de Pd-1 según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 4 es un gráfico que muestra los parámetros característicos cinéticos de los anticuerpos H8L2 y H2L2 según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 5 es un gráfico que muestra el contenido de IL-2 secretado por células T con estimulación de anticuerpos H8L2 y H2L2 mediante el bloqueo de la activación de la proteína PD-1 según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 6 es un gráfico que muestra el contenido de IFN gamma secretado por células T con estimulación de anticuerpos H8L2 y H2L2 mediante el bloqueo de la activación de la proteína PD-1 según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 7 es un gráfico que muestra las curvas de concentración-tiempo de los anticuerpos H8L2 y H2L2 medidos por ELISA en un estudio de concentración sérica de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 8 es un gráfico que muestra la concentración plasmática individual después de la administración de anticuerpo H8L2 en 1 mg/kg en un estudio farmacocinético de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 9 es un gráfico que muestra la concentración plasmática individual después de la administración de anticuerpo H8L2 en 3 mg/kg en un estudio farmacocinético de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) según
algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 10 es un gráfico que muestra la concentración plasmática individual después de la administración de anticuerpo H8L2 en 10mg/kg en un estudio farmacocinético de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 11 es un gráfico que muestra la concentración plasmática individual después de la administración de anticuerpo H2L2 silvestre en 10 mg/kg en un estudio farmacocinético de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 12 es un gráfico que muestra la semivida promedio efectiva de los anticuerpos H2L2 y H8L2 silvestres en un estudio farmacocinético de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) según algunas realizaciones de la presente divulgación;
la figura 13 es un gráfico que muestra el resultado de SDS-PAGE del anticuerpo H8L2 según una realización de la presente divulgación;
la figura 14 es un gráfico que muestra el resultado de SEC-HPLC del anticuerpo H8L2 según una realización de la presente divulgación;
la figura 15 es un gráfico que muestra la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD-1 detectada con el método de FACS según una realización de la presente divulgación;
la figura 16 es un gráfico que muestra la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD-1 en presencia de PD-L1 detectado con el método de FACS según una realización de la presente divulgación;
la figura 17 es un gráfico que muestra el resultado de detección de la constante de afinidad del anticuerpo H8L2 con FcyRIMa en estudios de efectos de CCDA y CDC según una realización de la presente divulgación;
la figura 18 es un gráfico que muestra el resultado de detección de la constante de afinidad del anticuerpo H8L2 con C1q en estudios de efectos de CCDA y CDC según una realización de la presente divulgación.
Ejemplos
Se hará referencia con detalle a ejemplos de la presente divulgación. Los expertos en la técnica apreciarán que los siguientes ejemplos son explicativos y no puede interpretarse que limiten el alcance de la presente divulgación. Si no se especifican en los ejemplos tecnología o condiciones específicas, se realizará una etapa según las técnicas o condiciones descritas en la bibliografía en la técnica (por ejemplo, haciendo referencia a J. Sambrook et al. (traducido por Huang PT), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Science Press) o según las instrucciones del producto. Si no se especifican los fabricantes de reactivos o instrumentos, los reactivos o instrumentos pueden estar disponibles comercialmente, por ejemplo, de Illumina Company.
Ejemplo 1 Expresión de proteínas del anticuerpo H8L2
Para el anticuerpo H2L2 humanizado (anticuerpo similar a IgG contra PD-1), se mutaron los aminoácidos en las posiciones 254, 308 y 434 en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada, respectivamente a treonina, prolina y alanina, dando un variante denominada anticuerpo similar a IgG H8L2 contra PD-1 (es decir, anticuerpo H8L2).
Es decir, el anticuerpo H8L2 de interés tiene una mutación de treonina en la posición de aminoácido 254, una mutación de prolina en la posición de aminoácido 308 y una mutación de alanina en la posición de aminoácido 434 en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada, con el resto aminoácidos sin cambios, en comparación con el anticuerpo H2L2 humanizado.
En la práctica, se construyó la secuencia de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo H8L2 humanizado que se forma mediante síntesis génica en un vector de expresión, que se transfectó en una célula 293 de células de mamífero. Después de la transfección, se expresó el anticuerpo H8L2 y se secretó por la célula 293 de células de mamífero. Posteriormente, se purificó tal anticuerpo H8L2 humanizado obtenido con una columna de afinidad de proteína A, obteniéndose así el anticuerpo H8L2 humanizado purificado, que se usará para el estudio de farmacología después de la identificación de calidad mediante métodos de SDS-PAGE y SEC-HPLC convencionales.
Entre ellos, se muestran los resultados del anticuerpo H8L2 humanizado identificado por los métodos de SDS-PAGE y SEC-HPLC, respectivamente en la figura 13 y la figura 14.
La figura 13 muestra el resultado de SDS-PAGE del anticuerpo H8L2, en el que el carril 1 se refiere a un H8L2 no reducido, el carril 2 se refiere a un H8L2 reducido, el carril 3 se refiere a albúmina de suero bovino (BSA) y el carril M se refiere a un patrón de ADN (que incluye 14,4 KDa, 18,4 KDa, 25 KDa, 35 KDa, 45 KDa, 66,2 KDa y 116 KDa). Puede observarse que el anticuerpo candidato 18A10 H8L2 tiene una alta pureza global.
La figura 14 muestra el resultado de SEC-HPLC del anticuerpo H8L2, a partir del cual puede observarse que el anticuerpo candidato 18A10 H8L2 tiene una pureza del 98,19 % después de confirmarse mediante cuantificación integral.
Tal como se describió anteriormente, la diferencia entre los anticuerpos humanizados H2L2 y H8L2 sólo radica en los aminoácidos en las posiciones 254, 308 y 434 en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada, por tanto, proporcionándose sólo la secuencia de aminoácidos del anticuerpo H8L2 para referencia.
La cadena pesada del anticuerpo H8L2 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos:
EVOLVOSGGGLVOPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVROAPGKGLDWVATISGGGR DTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLOMNSLRAEDTALYYCAROKGEAWFAYWGOGTEVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMI@RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST
YRV V S VLT^LHQD WLN GKE YKCKV SNKGLP S SIEKTISKAKGQPREPQ V YTLPP S QEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALH0HYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 1),
en la que la región variable de cadena pesada del anticuerpo H8L2 está subrayada; y los sitios de mutación del anticuerpo H8L2 (en relación con el anticuerpo H2L2) están recuadrados, siendo respectivamente mutaciones de aminoácidos en las posiciones 254, 308 y 434 en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada. Específicamente, para las mutaciones de aminoácidos en el sitio de unión a FcRn de la región constante de cadena pesada del anticuerpo H8L2, el aminoácido en la posición 254 se muta a treonina a partir de serina, el aminoácido en la posición 308 se muta a prolina a partir de valina, y el aminoácido en la posición 434 se muta a alanina a partir de asparagina, en comparación con el anticuerpo H2L2 humanizado.
La secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada del anticuerpo H8L2 humanizado se encuentra a continuación:
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGCGCACTC CGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGAA GCTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACCTTTAGCTCCTACGGAATGTCCTGGGTGCGA CAGGCACCCGGGAAGGGGCTGGACTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGAGAC ACCTACTATCCTGATAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATTAGCCGGGACAACAGCAAGA ACAATCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGATACTGCACTGTACTATTG TGCCCGCCAGAAGGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
CGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGG AGCACCTCCGAGAGCACAGCCGGCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACC TGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTC ATGATCACCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGAC CCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA AAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCCCC CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGG CCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT G ACC T GC CT GGT C AAAGGCTT C TAC CC C AGC G AC AT C GCC GT GG AGT GGG AG AGC AA TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGT CTTCTC ATGCT C CGT GAT GC AT GAGGCTCT GC ACGCCC ACTAC AC AC AG AAG AGCCTC TCCCTGTCTCTGGGTAAA (SEQ ID NO: 2),
en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región variable de cadena pesada está subrayada. La cadena ligera del anticuerpo H8L2 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos:
DlVLTOSPASLAVSPGORATlTCRASESVDNYGISFMNWFOOKPGOPPtCLLlYAASNKG TGVPARFSGSGSGTDFTLN1NPMEENDTAMYFCOOSKEVPW TFGGGTKEEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 3),
en la que la región variable de cadena ligera del anticuerpo H8L2 está subrayada.
El ácido nucleico que codifica para la cadena ligera del anticuerpo H8L2 humanizado tiene una secuencia de nucleótidos:
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTC CGATATTGTGCTGACTCAGAGCCCTGCTTCCCTGGCCGTGTCTCCAGGACAGCGAGCT ACCATCACATGCAGAGCATCTGAGAGTGTGGACAACTACGGAATTAGTTTCATGAATT GGTTTCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCAACAA GGGCACCGGGGTGCCTGCTCGATTCTCAGGAAGCGGCTCCGGGACAGACTTTACTCTG
AACATTAACCCAAT GGAGGAAAATGATAC AGC AATGTACTTCTGCCAGC AGAGC AAGG AGGTGCCCTGGACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTG CACCAT CT GTCTT CATCTT CCCGCCAT CTGAT GAGCAGTTGAAAT CT GGAAC'T GCCT CT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGG ATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGG ACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 4),
en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región variable de cadena ligera está subrayada. Ejemplo 2 Experimento ELISA de anticuerpo H8L2 humanizado recombinante
Se sometieron el anticuerpo H2L2 humanizado y el anticuerpo H8L2 humanizado preparados en el ejemplo 1 a un experimento de unión ELISA y un experimento ELISA competitivo para realizar una comparación, tal como se describe con detalle a continuación.
2.1 Experimentos de unión ELISA de los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2
Específicamente, se realizó el experimento de unión de ELISA tal como sigue.
Etapa a): recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa de ELISA con antígeno PD-1-his en una concentración de 0,25 |ig/ml (100 |il por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche.
Etapa b): bloqueo
La placa de ELISA recubierta con el antígeno PD-1-his se bloqueó con BSA al 1 % en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas y se lavó con tampón PBST 1x que contenía Tween-20 al 1 % tres veces, con golpecitos suaves hasta sequedad.
Etapa c): incubación con anticuerpo primario
Se diluyeron los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2, respectivamente a partir de 2 |ig/ml en serie a 1:3, obteniéndose 7 disoluciones de anticuerpo en gradiente. Se añadieron las 7 disoluciones de anticuerpo en gradiente de cada uno de los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2, respectivamente a la placa de ELISA bloqueada para su incubación a 37 °C durante 1 hora, con la disolución de PBS como control de blanco.
Etapa d): incubación con anticuerpo secundario
Después de lavar la placa de ELISA con el tampón PBST tres veces y darle golpecitos suaves hasta sequedad, se añadió para la incubación anticuerpo de cabra anti-IgG humana-HRP (H+L) como anticuerpo secundario en una dilución 1:10000 (100 |il por pocillo)a 37 °C durante 1 hora.
Etapa e): revelado
Después de que se lavó la placa de ELISA con el tampón PBST tres veces y se le dieron golpecitos suaves hasta sequedad de nuevo, se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) como revelador en 100 |il por pocillo para incubación a temperatura ambiente durante de 5 a 10 minutos.
Etapa f): Terminación del revelado
Se añadió una disolución de H2SO42 M en 50 |il por pocillo para terminar el revelado.
Etapa g): lectura
Se midió la absorbancia de la disolución en cada pocillo con el lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm.
La figura 1 muestra los resultados, a partir de los cuales se calcula que los valores de CE50 de la unión de H8L2 y H2L2 a PD-1 son, respectivamente, de 0,04 nM y 0,05 nM. Tal como puede observarse en la figura 1, la mutación en
el sitio de unión a FcRN no tiene ningún efecto sobre la unión del anticuerpo a PD-1.
2.2 Experimentos ELISA competitivos de los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2 con PDL1 Específicamente, se realizó el experimento ELISA competitivo tal como sigue.
Etapa a): recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa de ELISA de 96 pocillos con antígeno PD-1-hIgGFc en una concentración de 0,5 p,g/ml (50 pj por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche.
Etapa b): bloqueo
Después de lavar con el tampón PBST tres veces y darle golpecitos suaves hasta sequedad, la placa de ELISA de 96 pocillos se bloqueó con BSA al 1 % en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas y se lavó con el tampón PBST 1x que contenía Tween-20 al 1 % tres veces.
Etapa c): incubación con anticuerpo primario
Se diluyeron los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2, respectivamente a partir de 6 p,g/ml en serie a 1:3, obteniéndose 7 disoluciones de anticuerpo en gradiente. Se añadieron las 7 disoluciones de anticuerpo en gradiente de cada uno de los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2 (50 pj por pocillo), respectivamente a la placa de ELISA de 96 pocillos bloqueada para su incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, con la disolución de PBS como control de blanco.
Etapa d): incubación con ligando
Se añadieron 0,6 p,g/ml de disolución de PDL1-mIgG2aFc en 50 pj por pocillo para su incubación a 37 °C durante 1 hora.
Etapa e): incubación con anticuerpo secundario
Después de lavar la placa de ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST tres veces y darle golpecitos suaves hasta sequedad, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP (H+L) como anticuerpo secundario en una dilución 1:5000 (50 pj por pocillo) para su incubación a 37 °C durante 1 hora.
Etapaf): revelado
Después de lavar la placa de ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST tres veces y darle golpecitos suaves hasta sequedad de nuevo, se añadió TMB como revelador en 50 pj por pocillo para su incubación a temperatura ambiente durante de 5 a 10 minutos.
Etapa g): Terminación del revelado
Se añadió una disolución de H2SO42 M en 50 pj por pocillo para terminar el revelado.
Etapa h): lectura
Se midió la absorbancia de la disolución en cada pocillo con el lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm.
La figura 2 muestra los resultados, a partir de los cuales los valores de CE50 de los anticuerpos H8L2 y H2L2 que se unen de manera competitiva a PD-1 en presencia de PD-L1 son, respectivamente, de 0,474 nM y 0,783 nM, lo que demuestra que la mutación en el sitio de unión a FcRN no tiene ningún efecto sobre la unión de manera competitiva a PD-1 en el presencia de PD-L1.
2.3 Experimentos ELISA competitivos de los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2 con PDL2
Específicamente, se realizó el experimento ELISA competitivo tal como sigue.
Etapa a): recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa de ELISA de 96 pocillos con antígeno PD-1-hIgGFc en una concentración de 1,0 pg/ml (100 pl por pocillo) mediante incubación a 4°C durante la noche.
Etapa b): bloqueo
Después de lavar con el tampón PBST tres veces y darle golpecitos suaves hasta sequedad, la placa de ELISA de 96 pocillos se bloqueó con BSA al 1 % en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas y se lavó con el tampón PBST 1x que contenía Tween-20 al 1 % cuatro veces.
Etapa c): incubación con anticuerpo primario
Se diluyeron los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2, respectivamente a partir de 20 pg/ml en serie a 1:3, obteniéndose 7 disoluciones de anticuerpo en gradiente. Se añadieron las 7 disoluciones de anticuerpo en gradiente de cada uno de los anticuerpos 18A10 H8L2 y 18A10 H2L2 (50 pl por pocillo), respectivamente a la placa de ELISA de 96 pocillos bloqueada para su incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, con la disolución de PBS como control de blanco.
Etapa d): incubación con ligando
Se añadieron 1,0 pg/ml de disolución de PDL2-etiqueta de his en 50 pl por pocillo para su incubación a 37 °C durante 1 hora.
Etapa e): incubación con anticuerpo secundario
Después de que la placa de ELISA de 96 pocillos se lavó con el tampón PBST cinco veces y se le dieron golpecitos suaves hasta sequedad, se añadió anticuerpo anti-etiqueta de his de ratón monoclonal conjugado con HRP como anticuerpo secundario en una dilución 1:750 (50 pl por pocillo) para su incubación a 37 °C durante 1 hora.
Etapa f): revelado
Después de lavar la placa de ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST seis veces y darle golpecitos suaves hasta sequedad de nuevo, se añadió TMB como revelador en 100 pl por pocillo para su incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Etapa g): Terminación del revelado
Se añadió una disolución de H2SO42 Men 50 pl por pocillo para terminar el revelado.
Etapa h): lectura
Se midió la absorbancia de la disolución en cada pocillo con el lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm.
La figura 3 muestra los resultados, a partir de los cuales los valores de CE50 de los anticuerpos H8L2 y H2L2 que se unen de manera competitiva a PD-1 en presencia de PDL2 son, respectivamente, de 1,83nM y 1,58nM, lo que demuestra que la mutación en el sitio de unión a FcRN no tiene ningún efecto sobre la unión de manera competitiva a PD-1 en presencia de PDL2.
2.4 Actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1-hFc de macaco cangrejero (Macaca fascicularis)
En este experimento, se detectó la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a un antígeno no humano (tal como PD1 de macaco cangrejero) mediante el método de ELISA para reflejar la reactividad cruzada del anticuerpo H8L2 con el antígeno no humano.
Se recubrió una placa de ELISA con PD1-hFc de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) en una concentración de 0,125 ^g/ml (50 pj por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche. Después de lavar con el tampón PBST una vez y darle golpecitos suaves hasta sequedad, se bloqueó la placa de ELISA con BSA al 1 % en el tampón PBS (300 pj por pocillo) a 37 °C durante 2 horas. Se lavó la placa de ELISA bloqueada una vez con el tampón PBST y se le dieron golpecitos suaves hasta sequedad. El anticuerpo H8L2 diluido hasta 7 nM como concentración inicial se diluyó adicionalmente en serie a 1:3 en una placa, seguido de la adición a la placa de ELISA bloqueada en 100 pj por pocillo para su incubación a 37 °C durante 30 minutos por duplicado, con la disolución de PBS como control de blanco. Después de lavar la placa de ELISA con el tampón PBST tres veces, se añadió anticuerpo de cabra anti-F(ab’)2 de IgG humana-HRP como anticuerpo secundario en 50 p,l por pocillo para su incubación a 37 °C durante 30 minutos. Se lavó la placa de ELISA cuatro veces con tampón PBST y se añadió TMB como revelador en 50 pj por pocillo para incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. Después de añadirse disolución de H2SO42 M en 50 pj por pocillo para terminar el revelado, se midió la placa de ELISA con el lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm para obtener la absorbancia de la disolución en cada pocillo, con análisis y procesamiento de datos mediante el software SoftMax Pro 6.2.1.
Se muestran los resultados de detección de la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1-hFc de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) a una longitud de onda de 450 nm en la siguiente tabla.
Los resultados a una longitud de onda de 450nm en la tabla muestran que el valor de CE50 de la unión del anticuerpo H8L2 a PD1-hFc de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) es de 0,219 nM.
2.5 Actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 de rata (método de ELISA)
En este experimento, se detectó la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a un antígeno no humano (tal como PD1 de rata) mediante el método de ELISA para reflejar la reactividad cruzada del anticuerpo H8L2 con antígeno no humano.
Se recubrió una placa de ELISA con PD1 de rata en una concentración de 1 ^g/ml (50 pj por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche. Después de lavar con el tampón PBST una vez y darle golpecitos suaves hasta sequedad, se bloqueó la placa de ELISA con BSA al 1 % en el tampón PBS (300 pj por pocillo) a 37 °C durante 2 horas. Se lavó la placa de ELISA bloqueada con el tampón PBST tres veces y se le dieron golpecitos suaves hasta sequedad. El anticuerpo H8L2 diluido a 7nM como concentración inicial se diluyó adicionalmente en serie a 1:3 en una placa, seguido de la adición a la placa de ELISA bloqueada en 100 pj por pocillo para su incubación a 37 °C durante 30 minutos por duplicado, con la disolución de PBS como control de blanco. Después de lavar la placa de
ELISA con el tampón PBST tres veces, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG humana-HRP como anticuerpo secundario en 50 pl por pocillo para su incubación a 37 °C durante 30 minutos. Se lavó la placa de ELISA cuatro veces con tampón PBST y se añadió TMB como revelador en 50 pl por pocillo para incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. Después de añadir disolución de H2SO42 M en 50 pl por pocillo para terminar el revelado, se midió la placa de ELISA con el lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm para obtener la absorbancia de la disolución en cada pocillo, con análisis y procesamiento de datos mediante el software SoftMax Pro 6.2.1.
Se muestran los resultados de detección de la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 de rata a una longitud de onda de 450 nm en la siguiente tabla.
Los resultados a una longitud de onda de 450 nm en la tabla muestran que casi no hay actividad de unión entre el anticuerpo H8L2 y PD1 de rata.
Ejemplo 3 Determinación de los parámetros característicos cinéticos de los anticuerpos H8L2 y H2L2 con el instrumento de interacción molecular Fortebio
Se determinaron los parámetros cinéticos característicos del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1 y del anticuerpo H2L2 usando el instrumento de interacción molecular Fortebio para realizar una comparación, que se describen con detalle a continuación.
Se inmovilizó el antígeno PD-1 marcado con biotina en la superficie del sensor SA. Después del equilibrado con el tampón PBST, se aplicó el anticuerpo H8L2, diluido en serie a 1:3 con PBST (200 nM, 66,67 nM, 22,22 nM, 7,41 nM, 2,47 nM, 0,82 nM, 0,27 nM y 0 nM, respectivamente), al sensor SA para determinar la unión al antígeno PD-1 marcado con biotina, después de lo cual se aplicó PBST al sensor SA para la disociación. El ensayo del anticuerpo H2L2 es el mismo que el del anticuerpo H8L2. Los resultados de los parámetros característicos cinéticos de los anticuerpos H8L2 y H2L2 se muestran en la figura 4, a partir de la cual puede observarse que la mutación en el sitio de unión a FcRN no tiene ningún efecto sobre los parámetros característicos cinéticos del anticuerpo.
Ejemplo 4 Detección de la actividad de unión directa y competitiva del anticuerpo H8L2 con el método de FACS Se detectó la actividad de unión directa y competitiva del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1 usando el método de FACS, que se describe con detalle a continuación.
4.1 Detección de la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 con el método de FACS
En este experimento, se detectó la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 en la superficie de la membrana celular mediante el método de FACS, con una línea celular 293T transfectada de manera estable con PD1 como célula de experimentación.
Específicamente, se realizó el experimento de unión tal como sigue.
Etapa a) Se digirió la línea celular 293T transfectada de manera estable con PD1 y se contó para obtener una suspensión celular en una concentración final de 106 células/ml.
Etapa b) Se añadieron 100 pl de la suspensión celular en un tubo EP de 1,5 ml para cada grupo, con 105 células por grupo.
Etapa c) Se añadió el anticuerpo H8L2 (en concentraciones de 0,01 nM, 0,10 nM, 1,00 nM, 2,50 nM, 5,00 nM, 10,00 nM, 20,00 nM y 50,00 nM), respectivamente en grupos individuales y se incubó en hielo durante 1 hora.
Etapa d) Se centrifugó cada grupo, seguido de un lavado con el tampón PBS una vez.
Etapa e) Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG humana-FITC como anticuerpo secundario a cada grupo y se incubó en hielo en la oscuridad durante 1 hora.
Etapa f) Se centrifugó cada grupo a 4000 r/min a baja temperatura durante 5 minutos, seguido de lavado con el tampón PBS una vez y adición de 200 pl de PBS para suspensión, obteniéndose así una suspensión para detección en línea.
La figura 15 y la siguiente tabla muestran los resultados de la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 en la superficie de la membrana celular detectada con el método de FACS.
H8L2 3,50 7,57 36,59 82,64 147,23 219,65 235,05 197,69 3,40
La figura 15 y la tabla muestran que el valor de CE50 de la unión del anticuerpo H8L2 a PD-1 es de 3,40 nM.
4.2 Detección de la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 en presencia de PDL1 con el método de FACS En este experimento, se detectó la actividad de unión de PDL1 (es decir, una proteína competitiva) a PD1 en la superficie de la membrana celular con el método de FACS para reflejar la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 en presencia de PDL1, con una línea celular 293T transfectada de manera estable con PD1 como célula de experimentación.
Específicamente, se realizó el experimento de unión tal como sigue.
Etapa a) Se digirió la línea celular 293T transfectada de manera estable con PD1 y se contó para obtener una suspensión celular en una concentración final de 106 células/ml.
Etapa b) Se añadieron 100 pl de la suspensión celular en un tubo EP de 1,5 ml para cada grupo, con 105 células por grupo.
Etapa c) Se añadió el anticuerpo H8L2 (en concentraciones de 0,10 nM, 1,00 nM, 2,50 nM, 5,00 nM, 10,00 nM, 20,00 nM, 50,00 nM y 100,00 nM), respectivamente a grupos individuales y se incubó en hielo durante 0,5 horas. Etapa d) Se añadió el ligando PDL1-mFc a cada grupo con una concentración final de 20 nM, seguido de incubación durante otras 0,5 horas.
Etapa e) Se centrifugó cada grupo y se lavó con el tampón PBS una vez.
Etapa f) Se añadió a cada grupo anticuerpo de cabra anti-IgG/IgM humana-FITC como anticuerpo secundario y se incubó en hielo en la oscuridad durante 1 hora.
Etapa g) Se centrifugó cada grupo a 4000 r/min a baja temperatura durante 5 minutos, seguido de lavado con el tampón PBS una vez y adición de 200 pl de PBS para suspensión, obteniéndose así una suspensión para detección en línea.
La figura 16 y la siguiente tabla muestran los resultados de la actividad de unión del anticuerpo H8L2 a PD1 en la superficie de la membrana celular en presencia de PDL1 detectada con el método de FACS.
Concentración/nM Intensidad de fluorescencia promedio CE50 (nM)0,10 1,00 2,50 5,00 10,00 20,00 50,00 100,00
H8L2 50,26 54,90 53,77 48,00 42,85 27,70 4,56 4,14 19,65 La figura 16 y la tabla muestran que el valor de CE50 de la unión del anticuerpo 18A10 H8L2 a PD-1 en presencia de PDL1 es de 19,65 nM.
Ejemplo 5 Ensayo de actividad biológica del anticuerpo contra PD1 con reacción mixta de linfocitos
Se sometieron a ensayo linfocitos T para la secreción de IL-2 e IFN gamma con estimulación del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1 y el anticuerpo H2L2 mediante la reacción mixta de linfocitos (RML) para realizar una comparación, que se describe con detalle a continuación.
Para RML, se mezclaron células T (CT) y células dendríticas (CD) de diferentes fuentes humanas, de modo que las células T secretan IL-2 e IFN gamma con la función de presentación de antígeno de las células CD. Específicamente, los monocitos en la sangre se diferencian en células CD inmaduras con la inducción de citocinas GM-CSF e IL-4, después de lo cual se indujeron las células CD inmaduras a la maduración mediante la estimulación del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Posteriormente, se mezclaron las células CD maduras y las células CT alogénicas y se cultivaron durante 5 días, después de eso se determinaron la IL-2 y el IFN gamma secretados en el sobrenadante celular. En este ejemplo, se mezclaron las células CT (1 * 105 por pocillo) y las células CD maduras (1 x 104 por pocillo) en una placa de 96 pocillos y luego se cultivaron en presencia de anticuerpos individuales en ocho
concentraciones en gradiente (es decir, desde 10 ^M hasta 0,09765625 nM) durante 5 días, después de lo cual se detectó la cantidad de IL-2 en el sobrenadante celular con un kit de ensayo de IL-2. De manera similar, se mezclaron las células CT (1 * 105 por pocillo) y las células CD maduras (1 * 104 por pocillo) en una placa de 96 pocillos y luego se cultivaron en presencia de anticuerpos individuales en cinco concentraciones en gradiente (es decir, desde 300 nM hasta 0,1 nM) durante 5 días, después de lo cual se detectó la cantidad de IFN gamma en el sobrenadante celular con un kit de ensayo de IFN gamma.
La figura 5 muestra el contenido de IL-2 secretado por células T con la estimulación de los anticuerpos H8L2 y H2L2, respectivamente, a partir de lo que puede observarse que los anticuerpos H8L2 y H2L2 son capaces de estimular células T para que secreten IL-2 de manera eficaz, lo que demuestra que la mutación en el sitio de unión a FcRN no tiene ningún efecto sobre la secreción de IL-2 por células T con la estimulación del anticuerpo.
La figura 6 muestra el contenido de IFN gamma secretado por células T con la estimulación de los anticuerpos H8L2 y H2L2, respectivamente, a partir de lo que puede observarse que los anticuerpos H8L2 y H2L2 son capaces de estimular células T para que secreten IFN gamma de manera efectiva, lo que demuestra que la mutación en el sitio de unión a FcRN no tiene ningún efecto sobre la secreción de IFN gamma por células T con la estimulación del anticuerpo. La “IgG” en la figura 6 es un anticuerpo de isotipo como control.
Ejemplo 6 Estudio de la concentración sérica de macaco cangrejero (Macaca fascicularis)
Se detectaron las concentraciones séricas del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1 y el anticuerpo H2L2 en macaco cangrejero (Macaca fascicularis), respectivamente, para realizar una comparación, que se describe con detalle a continuación.
Se dividieron aleatoriamente cuatro macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) en 2 grupos según sus pesos corporales, denominados respectivamente grupo de H8L2 y grupo de H2L2, con 2 animales por grupo. A cada grupo se le administró su anticuerpo individual en una dosificación de 1 mg/kg mediante inyección intravenosa, extrayéndose muestras de sangre completa antes de la administración y después de la administración 5 minutos, 5 horas, 24 horas, 72 horas, 168 horas y 240 horas, respectivamente. Se separó el suero sanguíneo de la sangre completa y se midió el contenido de los anticuerpos H8L2 y H2L2, respectivamente, mediante el método de ELISA, que puede observarse en la figura 7 y la tabla siguiente.
Ejemplo 7 Estudio farmacocinético de macaco cangrejero (Macaca fascicularis)
Se estudió la farmacocinética del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1 y el anticuerpo H2L2 en macaco cangrejero (Macaca fascicularis) para realizar una comparación, que se describe con detalle a continuación.
Se dividieron aleatoriamente 24 macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) en 4 grupos según sus pesos corporales, denominados respectivamente grupo de H2L2 (10mg/kg) y tres grupos de H8L2 en diferentes dosificaciones (es decir, baja: 1 mg/kg, media: 3 mg/kg y alta: 10 mg/kg), con 6 animales por grupo (mitad macho y mitad hembra para cada grupo). A cada grupo se le administró su anticuerpo individual mediante inyección intravenosa, extrayéndose muestras de sangre completa antes de la administración y después de la administración 5 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas, 144 horas y 216 horas, respectivamente. Se separó el suero sanguíneo de la sangre completa y se midió el contenido de los anticuerpos H8L2 y H2L2, respectivamente, mediante el método de ELISA, con los parámetros farmacocinéticos relevantes calculados mediante PhoenixWinNonlin (Pharsight) 6.4.
Antes de la administración única, la concentración sérica de los anticuerpos H2L2 y H8L2 en todos los individuos de los macacos cangrejeros está por debajo del límite de cuantificación inferior. Después de la administración, aumenta la concentración sérica de anticuerpo H8L2 en los macacos cangrejeros de los tres grupos de H8L2 a medida que aumenta la dosificación de administración, en la que la semivida promedio efectiva del grupo de dosificación baja (es decir, 1 mg/kg), el grupo de dosificación media (es decir, 3 mg/kg) y el grupo de dosificación alta (es decir, 10 mg/kg) es respectivamente de 215,72 horas (remítase a la figura 8), 288,78 horas (remítase a la figura 9) y 268,92 horas (remítase a la figura 10). Además, la semivida promedio efectiva del grupo de H2L2 silvestre (en una dosificación de 10 mg/kg) es de 224 horas (remítase a la figura 11). Puede observarse que el grupo de H8L2 presenta una semivida promedio efectiva más prolongada que el grupo de H2L2 silvestre con la misma dosificación de 10 mg/kg (remítase a la figura 12).
Ejemplo 8 Efecto antitumoral del anticuerpo H8L2 en el modelo de tumor MiXeno implantado por vía subcutánea de la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico humano HCC827
Se investigó el efecto antitumoral del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1 usando un modelo de tumor MiXeno implantado por vía subcutánea establecido con la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico HCC827 en ratones NSG, que se describe con detalle a continuación.
Los ratones NSG, caracterizados por diabetes no obesa (NOD), la deleción o mutación Prkdcscid y IL2rgnull, tienen la mayor inmunodeficiencia y, por tanto, se convierten en la herramienta más adecuada para el trasplante de células de origen humano, sin rechazo a células y tejidos de origen humano. Basándose en lo anterior, los presentes inventores evaluaron el efecto farmacéutico del anticuerpo H8L2 in vivo por medio de un modelo de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) establecido mediante trasplante adoptivo de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas en el ratón NSG. Además, los presentes inventores han establecido el modelo de tumor implantado por vía subcutánea (es decir, el modelo MiXeno) usando el ratón NSG, y han descubierto además el efecto antitumoral del anticuerpo H8L2 en el modelo de tumor MiXeno implantado por vía subcutánea de la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico HCC827.
Específicamente, se inocularon células HCC827 en el lado derecho de la parte posterior de cada uno de los 40 ratones NCG (32 ratones de experimentación más 8 ratones de repuesto) en una dosificación de 5 * 106 células por ratón mediante inyección subcutánea el día 0 (día 0). El día 6 tras la inoculación (día 6), se dividieron 32 ratones NCG con un tamaño tumoral de hasta 66 mm3 , en 4 grupos con 8 ratones por grupo, y cada ratón se sometió a un trasplante intravenoso en la cola de 0,1 ml de CMSP (suspendidas en el tampón PBS). Para los cuatro grupos (es decir, 32 ratones), se les administró al grupo de tratamiento con 5 mg/kg de H8L2 (grupo 1), el grupo de tratamiento con 10 mg/kg de H8L2 (grupo 2), el grupo de tratamiento con 5 mg/kg de Opdivo (grupo 3) como control positivo, y el grupo de 5 mg/kg de anticuerpo de isotipo (IgG4 humana) (grupo 4) como control, por vía intravenosa a través de la vena de la cola el día 6, el día 9, el día 13, el día 16, el día 19 y el día 22 tras la inoculación, respectivamente, un total de 6 administraciones tal como se muestra en la tabla 1. Se evaluó la eficacia según el valor relativo de inhibición del crecimiento tumoral (ICTr t v ), y se evaluó la seguridad según el cambio de peso corporal y la muerte de los ratones.
Tabla 1 Diseño experimental para el efecto antitumoral del anticuerpo H8L2 en el modelo MiXeno de la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico humano HCC827
Nota: el volumen de dosificación es de 10 pl/g; n representa el número de ratones; el día 0 representa el día en que se inoculan las células tumorales; i.v. representa administración intravenosa a través de la vena de la cola
Con respecto al grupo de 5 mg/kg de anticuerpo de isotipo (IgG4 humana) como control, el grupo de tratamiento con 10 mg/kg de H8L2 presenta una inhibición significativa del crecimiento tumoral en los días 9 y 13 tras la inoculación de la célula tumoral, con el valor relativo de inhibición del crecimiento tumoral valor (ICTr t v ) del 30 % (p = 0,007) y el 30 % (p = 0,039) respectivamente; el grupo de tratamiento con 5 mg/kg de H8L2 también muestra una inhibición significativa del crecimiento tumoral en los días 9 y 13 tras la inoculación de la célula tumoral, con el valor relativo de inhibición del crecimiento tumoral (ICTr t v ) del 18 % (p = 0,049) y el 25 % (p = 0,041), respectivamente; mientras que el grupo de tratamiento con 5 mg/kg de Opdivo no muestra una inhibición más significativa del crecimiento tumoral en los días 9 y 13 tras la inoculación de la célula tumoral, con el valor relativo de inhibición del crecimiento tumoral (ICTr t v ) del 17 % (p = 0,084) y el 23 % (p = 0,073), respectivamente, remítase a la tabla 2. Los resultados demuestran que el anticuerpo H8L2 es capaz de inhibir significativamente el crecimiento tumoral del modelo de
tumor MiXeno de la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico humano HCC827, incluso con mejor eficacia que el grupo de Opdivo que se usa como control positivo. Además, el grupo de tratamiento con 5 mg/kg de H8L2 y el grupo de tratamiento con 10 mg/kg de H8L2 no desarrollan toxicidad relacionada con el fármaco (tal como pérdida de peso grave o muerte) similar al grupo de tratamiento con 5 mg/kg de Opdivo en el plazo de los 16 días desde la primera administración (es decir, del día 6 al día 22 tras la inoculación), lo que indica una buena tolerancia al tratamiento del anticuerpo H8L2.
Tabla 2 Ensayo de efecto farmacéutico en el modelo de tumor MiXeno de la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico humano HCC827
Nota: se obtiene el valor de P1 comparando con el grupo de 5 mg/kg de anticuerpo de isotipo (IgG4 humana) El anticuerpo H8L2 (es decir, el anticuerpo monoclonal contra PD-1) muestra una inhibición significativa del crecimiento tumoral en el modelo de tumor MiXeno de la línea celular humana de cáncer de pulmón no microcítico HCC827 cuando se inyecta en la dosificación de administración de 10 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente, donde el anticuerpo H8L2 en la dosificación de administración de 10 mg/kg presenta una inhibición incluso más significativa del crecimiento tumoral y muestra una mejor eficacia con respecto al grupo de tratamiento con 5 mg/kg de Opdivo como control positivo, con buena tolerancia para los ratones portadores de tumores con la dosificación tanto de 10 mg/kg como de 5 mg/kg.
Ejemplo 9 Efecto antitumoral del anticuerpo H8L2 en el modelo HuGEMM de la línea celular de cáncer colorrectal murino MC38
Se validó de manera preclínica la eficacia del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1 para el tratamiento del cáncer colorrectal en el ratón portador de PD-1 HuGEMM MC38, que se describe con detalle a continuación.
La línea celular MC38 es una línea celular de cáncer colorrectal murino derivada de ratón C57BL/6. El modelo PD-1 HuGEMM es un ratón modelado que se modifica genéticamente reemplazando algunos fragmentos de la proteína PD-1 murina que interacciona con la molécula de proteína PD-L1 en el ratón C57BL/6 por la proteína derivada humana correspondiente.
Se inocularon células MC38 en el lado derecho de cada uno de los ratones sujeto en una dosificación de 1 * 106 células por ratón mediante inyección subcutánea. Se dividieron los ratones con un tamaño tumoral de hasta 134 mm3 aleatoriamente en 4 grupos según el tamaño tumoral, con 8 ratones por grupo y 4 ratones por jaula, nombrados como grupo 1 a grupo 4, es decir, grupo de tratamiento con 5 mg/kg de H8L2, grupo de tratamiento con 10 mg/kg de H8L2, grupo de tratamiento con 10 mg/kg de Keytruda como control positivo, y grupo de 5 mg/kg de anticuerpo isotipo (IgG4 humana) como control, respectivamente. El anticuerpo correspondiente para cada grupo se administró por vía intravenosa a través de la vena de la cola de los ratones, con un total de 6 administraciones, remítase a la tabla 3.
Tabla 3 Diseño experimental para el ensayo de efecto farmacéutico
El día 13 tras la agrupación, los ratones del grupo 1 tienen un tamaño tumoral promedio de hasta 1933,67 mm3, y el grupo 2 (grupo de tratamiento con 10 mg/kg de Keytruda, en una dosificación alta), el grupo 3 (grupo de tratamiento
con 5 mg/kg de H8L2, en una dosificación baja) y el grupo 4 (grupo de tratamiento con 10 mg/kg de H8L2, en una dosificación alta) tienen, cada uno, una inhibición del crecimiento tumoral (ICT) (%) del 85 %, el 93 % y el 90 % respectivamente, remítase a la tabla 4; y los cuatro grupos tienen, respectivamente, un cambio de peso porcentual del 8,72 %, el 0,94 %, el -2,07 % y el 1,68 %. Ninguno de los ratones tiene una pérdida de peso inesperada significativa o muerte. Los grupos 2 a 4 muestran una diferencia estadísticamente significativa en el efecto de inhibición en comparación con el grupo 1, cada uno con P <0,05.
Tabla 4 Efecto antitumoral del anticuerpo H8L2 en ratones portadores de PD-1 HuGEMM MC38
Nota: a. los datos se representan en “media error estándar”;
b. se analiza la diferencia significativa entre los grupos para el tamaño tumoral usando ANOVA de un actor, donde los grupos 2 a 4 muestran una diferencia estadísticamente significativa en el tamaño tumoral en comparación con el grupo 1, con P <0,05.
Para los grupos 2 a 4, los valores de T-C (cuando el tamaño tumoral del ratón alcanzó hasta 1000 mm3) fueron de 10 días, 14 días y más de 14 días, respectivamente. Además, para los grupos 2 a 4, quedaron respectivamente 3 ratones, 5 ratones y 5 ratones en los que el tumor había remitido completamente incluso durante más de un mes cuando el experimento se completó el día 55, remítase a la tabla 5.
Tabla 5 Datos sin procesar para el tamaño tumoral de célula MC38
El anticuerpo H8L2 (en dosificaciones respectivas de 5 mg/kg y 10 mg/kg) muestra un efecto antitumoral estadísticamente significativo en el ratón portador de PD-1 HuGEMM MC38, que es más eficaz en la regresión completa del tumor en comparación con el grupo de tratamiento con 10 mg/kg de Keytruda.
Ejemplo 10 Efectos de CCDA y CDC del anticuerpo H8L2
Se estudiaron los efectos de CCDA y CDC del anticuerpo H8L2 preparado en el ejemplo 1, que se describe con detalle a continuación.
10.1 Determinación de la constante de afinidad del anticuerpo H8L2 con FcyRIIIa
El receptor de Fc FcyRNIa (también denominado CD16a) puede unirse al fragmento Fc del anticuerpo IgG, lo que
Claims (14)
- REIVINDICACIONESi. Un anticuerpo monoclonal contra el factor de muerte programada 1 (PD-1) o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un sitio de unión al receptor de Fc neonatal (FcRn) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
- 2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que comprende:una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, yuna cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
- 3. Un polinucleótido aislado que codifica para el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2.
- 4. El polinucleótido según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 o una secuencia complementaria de la misma, en el que la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 codifica para el sitio de unión a FcRn que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
- 5. El polinucleótido según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido es de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
- 6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
- 7. Una célula recombinante que comprende el vector de expresión según la reivindicación 6.
- 8. Un método para preparar el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, que comprende cultivar la célula recombinante según la reivindicación 7.
- 9. El polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, el vector de expresión según la reivindicación 6 o la célula recombinante según la reivindicación 7 para su uso en la preparación de un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, en los queel anticuerpo monoclonal se une específicamente al factor de muerte programada 1 (PD-1).
- 10. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, el vector de expresión según la reivindicación 6 o la célula recombinante según la reivindicación 7 para su uso en la preparación de un medicamento para fomentar la activación y proliferación de las células T, regular la expresión y secreción de citocinas o estimular células antitumorales para generar una respuesta inmunitaria más fuerte.
- 11. Una composición farmacéutica, que comprende:el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, el vector de expresión según la reivindicación 6 o la célula recombinante según la reivindicación 7.
- 12. Un método para identificar un medicamento capaz de unirse al factor de muerte programada 1 (PD-1), que comprende:poner en contacto el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2 con un antígeno en presencia de un candidato, y determinar una primera cantidad de unión del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, en el que el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo; yponer en contacto el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2 con un antígeno en ausencia del candidato, y determinar una segunda cantidad de unión del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, en el que el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo,en el que la segunda cantidad de unión mayor que la primera cantidad de unión es una indicación de que el candidato tiene la capacidad de unirse a PD-1.
- 13. Una combinación de fármacos, que comprende:a) el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1o 2, el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, el vector de expresión según la reivindicación 6 o la célula recombinante según la reivindicación 7; yb) un agente potenciador del sistema inmunitario diferente de a).
- 14. La combinación de fármacos según la reivindicación 13, en la que el agente potenciador del sistema inmunitario diferente de a) comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en:un anticuerpo anti-antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4), un anticuerpo anti-CD40, budesonida y un salicilato,opcionalmente, el salicilato comprende al menos una de sulfasalazina, olsalazina, balsalazida y mesalamina.
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