KR101763499B1 - 항-il-13 수용체 알파 2 항체 및 항체-약물 접합체 - Google Patents

항-il-13 수용체 알파 2 항체 및 항체-약물 접합체 Download PDF

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Abstract

본원은 항-IL-13-Rα2 항체 및 항체 약물 접합체 및 그의 제조 및 사용 방법을 개시한다.

Description

항-IL-13 수용체 알파 2 항체 및 항체-약물 접합체 {ANTI-IL-13 RECEPTOR ALPHA 2 ANTIBODIES AND ANTIBODY-DRUG CONJUGATES}
본 발명은 암의 치료를 위한 항-IL-13 수용체 알파 2 (IL-13-Rα2) 항체 및 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
서열 목록
본원은 EFS를 통해 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
높은 수준의 IL-13-Rα2가 췌장, 유방, 난소 및 악성 신경교종을 비롯한 다수의 암 세포에서 확인되었다. 대조적으로, 단지 소수의 유형의 정상 조직만이 IL-13-Rα2를 발현하며, 단지 낮은 수준으로 발현한다. 암의 치료는 지난 10년에 걸쳐 일차 치료 옵션으로서 수술, 방사선 요법, 및 화학요법에 의해 개선되어 왔다. 이러한 치료는 많은 환자에서 생존을 연장시키고/거나 증상을 완화시킬 수 있지만, 많은 환자를 치유하지 못할 가능성이 있다. 암에 대한 추가의 치료 옵션에 대한 상당한 필요성이 여전히 존재한다.
따라서, 특히 비-IL-13-Rα2 발현 세포에 대해서는 바람직하지 않은 효과를 발휘하지 않으면서 IL-13-Rα2 발현 종양 세포에 대해 임상적으로 유용한 세포독성 효과를 발휘할 수 있는 항-IL-13-Rα2 항체-약물 접합체는 다양한 IL-13-Rα2 발현 종양 세포의 치료에 있어서 충족되지 않은 임상적 필요성을 충족시킨다.
본 발명은 항-IL-13-Rα2 항체-약물 접합체 및 암의 치료를 위한 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 1의 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 5의 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 (a) 서열 2를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 3을 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 4를 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 6을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 7을 포함하는 경쇄 CDR2; 및, (f) 서열 8을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 추가로 제공한다.
본 발명은 서열 1의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 5의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 추가로 제공한다.
본 발명은 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 추가로 제공한다.
본 발명은 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합된 세포독성제를 포함하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 화학식 Ab-(L-D)p를 갖는, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공하며, 상기 식에서 (a) Ab는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고 D는 약물이고; (c) p는 1 내지 약 8의 정수이다.
본 발명은 링커가 말레이미도카프로일 (mc) 및 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA (vc)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 링커-약물 모이어티가 실시예 14에 제시된 바와 같은 vc-0101 또는 mc-3377로 지정된 화학식을 갖는 것인, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 Ab가 (a) 서열 1의 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 5의 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 Ab가 (a) 서열 2를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 3을 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 4를 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 6을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 7을 포함하는 경쇄 CDR2; 및, (f) 서열 8을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 L-D가 vc-0101, mc-3377, mc-0131, MalPeg-6121, MalPeg-0131, mc-6121, vc-3906, vc-6780, mc-8261, mc3906, 및 MalPeg-8261로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 조작된 시스테인 잔기에 대한 부위-특이적 접합을 사용하고, 화학식 Ab-(L-D)p 또는 그의 제약상 허용되는 염을 갖는, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공하며, 상기 식에서 (a) Ab는 서열 1에 제시된 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열 5에 제시된 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열 33 및 서열 34의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 한 쌍의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 Fc 영역; 또는 조작된 Fc 영역, 및 L443C (서열 28), Q347C (서열 29), kK183C (서열 31), L443C/kA111C (서열 28 및 30), L443C/kK183C (서열 28 및 31), Q347C/kA111C (서열 29 및 30), 및 Q347C/kK183C (서열 29 및 31)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조작된 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; (b) L-D는 링커-약물 모이어티이며, 여기서 L은 링커이고 D는 약물이고; (c) p는 1 내지 약 8의 정수이다.
본 발명은 조작된 시스테인 잔기에 대한 부위 특이적 접합을 사용한 상기 기재된 항체-약물 접합체를 추가로 제공하며, 여기서 링커-약물 모이어티는 실시예 14에 제시된 바와 같은 vc-0101 또는 mc-3377로 지정된 화학식 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 형태를 갖고, p는 약 4의 정수이다.
본 발명은 다중기능적 항체 접합체 (MAC) 기술을 사용한 본 발명의 항체-약물 접합체를 추가로 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하고, 항체는 서열 52에 제시된 바와 같은 LC의 위치 185에서 돌연변이 D185A를 갖고, 항체는 서열 49의 LC의 K188의 측쇄에 부착된 링커를 통해 적어도 하나의 약물 모이어티에 공유적으로 접합되며; 여기서 약물 모이어티는 실시예 13에 제시된 바와 같은 0101 또는 3377로 지정된 화학식 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 형태를 갖고, p는 하한치가 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 및 약 2.0으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상한치가 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 범위 내의 정수이다. 일부 측면에서, p는 약 2이다.
본 발명은 본 발명의 항체-약물 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 IL-13-Rα2 발현 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체-약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 IL-13-Rα2 발현 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 악성 신경교종, 자궁내막, 신장, 폐, 식도, 난소, 전립선, 췌장, 흑색종, 위 및 고환의 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 IL-13-Rα2 발현 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 폐암, 결장암, 위암, 췌장암, 난소암, 악성 신경교종 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 IL-13-Rα2 발현 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 요법을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체-약물 접합체의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 IL-13-Rα2 발현 암의 치료를 위한, 본 발명의 항체-약물 접합체의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 IL-13-Rα2 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 상기 언급된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, IL-13-Rα2 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 (a) 말레이미도카프로일 및 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 0101 및 3377로 이루어진 군으로부터 선택된 약물에 연결하여 링커-약물 모이어티를 생성하는 단계; (b) 상기 링커-약물 모이어티를 상기 나타낸 세포 배양물로부터 회수된 항체에 접합시키는 단계; 및 (c) 항체-약물 접합체를 정제하는 단계를 포함하는, IL-13-Rα2 항체-약물 접합체를 생산하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 인간 IL-13-Rα2에의 특이적 결합에 대해 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체를 추가로 제공한다.
본 발명은 인간 IL-13-Rα2에의 특이적 결합을 위한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 암을 가진 대상체로부터의 암의 생물학적 샘플이 hIL-13-Rα2를 발현하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 암을 가진 대상체가 본 발명의 항체-약물 접합체에 대해 반응할 것인지 여부를 예측하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 암을 가진 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을 본 발명의 항체를 사용하는 면역검정에서 시험하는 단계; 상기 샘플 상의 hIL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 결정하는 단계; 및 hIL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 hIL-13-Rα2의 수준을 결정하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 암을 가진 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을 본 발명의 항체를 사용하는 면역검정에서 시험하는 단계; 상기 샘플 상의 hIL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 결정하는 단계; hIL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 hIL-13-Rα2의 수준을 결정하는 단계; 및 본 발명의 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 IL-13-Rα2 발현 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
도 1: hIL-13Rα1이 아닌 hIL-13-Rα2에 대한 키메라 항체 ch07 및 ch08의 결합 특이성.
도 2a 및 도 2b: ch07, ch08 및 항체 MAB614 및 ab27414는 IL-13Rα2에 대해 별개의 결합 에피토프를 갖는다.
도 2c: ch07 및 ch08이 결합에서 경쟁이 없음을 보여주는 비아코어(Biacore) 분석.
도 3: ch07 및 ch08은 비-중화 항체이다.
도 4a - 4g: 서열 1 - 55.
본 발명은 암의 치료를 위한 IL-13-Rα2 항체-약물 접합체를 제공한다. 본 발명이 보다 용이하게 이해되도록, 특정 용어 및 일반적 기술을 먼저 정의한다.
본 개시내용에서 사용된 모든 아미노산 약어는 37 C.F.R. § 1.822 (d)(1)에 기재된 바와 같은 미국 특허상표국에서 허용되는 것이다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 그의 기술은 널리 공지된 것이고 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 방법 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지된 통상의 방법에 따라 및 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바에 따라 일반적으로 수행된다. 예를 들어, [Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조한다.
"항체" 또는 "Ab"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 예를 들어 제한 없이 scFv, 단일 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타류 항체), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv를 포함하는 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배위를 포괄한다 (예를 들어, [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136] 참조). 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하고, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 항체의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
용어 "단리된"은 그의 천연 환경이 실질적으로 존재하지 않는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 단리된 항체는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편"은 주어진 항원 (예를 들어, 표적 IL-13-Rα2)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 무손상 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 Fab; Fab'; F(ab')2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄 (VL)의 가변 영역 또는 항체 중쇄 (VH)의 가변 영역을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 또한 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3)에 의해 연결되어 있는 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어지고, 이는 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 대상 가변 영역의 변이체가 특히 CDR 영역 외부 (즉, 프레임워크 영역 내)에 아미노산 잔기 치환을 갖는 것을 목적으로 하는 경우에, 대상 가변 영역과 동일한 정규 부류 내의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역과 대상 가변 영역을 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987). 대상 CDR에 플랭킹된 FR을 선택하는 경우에, 예를 들어 항체를 인간화하거나 최적화하는 경우에, 동일한 정규 부류 내의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 항체로부터의 FR이 바람직하다.
가변 도메인의 "CDR"은 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 카바트 및 코티아 둘 다의 누적 정의, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태 정의 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인되는 가변 영역 내의 아미노산 잔기이다. 항체 CDR은 카바트 등에 의해 최초로 정의된 초가변 영역으로서 확인될 수 있다. 예를 들어 [Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참조한다. CDR의 위치는 코티아 등에 의해 최초로 기재된 구조적 루프 구조로서 또한 확인될 수 있다. 예를 들어 [Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883]을 참조한다. CDR을 확인하는 다른 접근법은 카바트와 코티아의 절충안인, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재 엑셀리스(Accelrys)®)를 사용하여 유도된 "AbM 정의", 또는 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745]에 기재되어 있는 관찰된 항원 접촉에 기초한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본원에서 CDR의 "입체형태적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 엔탈피에 의해 항원 결합에 기여하는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 이들이 특정한 잔기 또는 잔기의 기 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 더 짧아지거나 더 길어질 수 있을지라도, 적어도 카바트 CDR의 부분과 중첩될 것이다. 본원에 사용된 CDR은 접근법의 조합을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시양태의 경우에, CDR은 카바트, 코티아, 확장형, AbM, 접촉 및/또는 입체형태적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "IgG Fc 영역", "Fc 영역", "Fc 도메인" 및 "Fc"는 IgG 분자의 파파인 소화에 의해 수득되는 결정화가능한 단편과 관련이 있는 IgG 분자의 부분을 지칭한다. Fc 영역은 디술피드 결합에 의해 연결된 IgG 분자의 2개의 중쇄의 C-말단 절반으로 이루어진다. 이는 항원 결합 활성은 없지만 탄수화물 모이어티, 및 보체 및 FcRn 수용체를 비롯한 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 함유한다 (하기 참조). Fc 단편은 전체 제2 불변 도메인 CH2 (인간 IgG1의 잔기 231-340, 카바트 넘버링 시스템에 따름) 및 제3 불변 도메인 CH3 (잔기 341-447)을 함유한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "조작된 Fc 폴리펩티드", "조작된 Fc 영역" 및 "조작된 Fc"는 접합을 위한 부위를 도입하는 적어도 하나의 돌연변이, 예를 들어 아미노산 치환을 포함하는 Fc 폴리펩티드, 또는 그의 부분을 의미한다. 바람직하게는, 돌연변이는 그 위치의 자연 발생 아미노산 잔기 대신 시스테인을 도입하며, 여기서 돌연변이는 Fc에 대한 모이어티의 접합을 위한 반응성 부위 (예를 들어, 반응성 술프히드릴 기)를 생성한다.
용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 그것을 제조하는 방법이 아닌, 예를 들어 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 비롯한 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 동종이거나 또는 실질적으로 동종인 집단으로 존재한다.
"인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다.
"인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"는 인간 항체 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 또는 인간 세포로부터 유래된 항체를 지칭한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 것인 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 것인 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
"치료제"는 암 세포 또는 활성화된 면역 세포에 세포독성, 세포증식억제 및/또는 면역조절 효과를 발휘하는 작용제이다. 치료제의 예는 세포독성제, 화학요법제, 세포증식억제제 및 면역조절제를 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다.
"세포독성 효과"는 표적 세포(들)의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 지칭한다. "세포독성제"는 세포에 대해 세포독성 및/또는 세포증식억제 효과를 갖는 작용제를 지칭한다.
"세포증식억제 효과"는 세포 증식의 억제를 지칭한다. "세포증식억제제"는 세포에 대해 세포증식억제 효과를 갖고, 그로 인해 세포의 특정 하위세트의 성장 및/또는 확대를 억제하는 작용제를 지칭한다.
"항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 IL-13-Rα2에 결합하고 세포독성제, 세포증식억제제 및/또는 치료제에 접합된 항체 유도체를 비롯한 항체 또는 그의 항체 단편을 지칭한다.
"항-IL-13-Rα2 항체-약물 접합체"는 본원에 기재된 바와 같이 링커 (L)를 통해 세포독성 약물 (D)에 연결된 항-IL-13-Rα2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다.
"링커 (L)"는 약물에 대한 항체의 직접 또는 간접 연결을 기재한다. mAb에의 링커의 부착은 다양한 방식으로, 예컨대 표면 리신을 통해, 산화된 탄수화물에 대한 환원적 커플링, 및 쇄간 디술피드 연결을 감소시키는 것에 의해 유리된 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 히드라존-, 디술피드- 및 펩티드-기반 연결을 비롯한 다양한 ADC 연결 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
"약물 (D)"은 생물학적 또는 검출가능한 활성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어, 치료제, 검출가능한 표지, 결합제 등, 및 생체내에서 활성제로 대사되는 전구약물이다. 용어 약물, 약물 모이어티, 페이로드 및 화합물은 상호교환적으로 사용된다.
"L-D"는 링커 (L)에 연결된 세포독성 약물 (D)로부터 생성된 링커-약물 모이어티이다.
용어 "에피토프"는 항체의 항원-결합 영역 중 하나 이상에서 항체에 의해 인식되고, 항체에 의해 결합이 이루어질 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 종종, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 집단으로 이루어지고, 특이적 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 통상의 면역검정에 의해 결정되는 바와 같은, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드의 부분으로서 정의된다. "비선형 에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질 내의 불연속 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다. 항원 상의 목적 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특성화는 바람직한 에피토프에 대한 정보를 밝혀낼 수 있다. 이어서, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 항원에의 결합에 대해 서로 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "결합 친화도 (KD)"는 특정한 항원-항체 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. KD는 회합률 (Ka) 또는 "온-레이트 (kon)"에 대한 "오프-레이트 (koff)"로도 불리는 해리율 (Kd)의 비이다. 따라서, KD는 koff / kon과 동일하고, 몰 농도 (M)로서 표현된다. KD가 작을수록 결합 친화도가 강하게 된다. 따라서, 1 μM의 KD는 1 nM의 KD와 비교하여 약한 결합 친화도를 나타낸다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 하나의 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 전형적으로 비아코어® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것에 의한다.
항체 및 IL-13-Rα2 항원 사이의 결합과 관련하여 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하다"는 항체가 IL-13-Rα2 항원에 25℃에서의 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정 시에 약 30 nM 미만의 KD로 결합한다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 염"은 분자 또는 거대분자의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다.
용어 "효력"은 생물학적 활성의 측정치이고, IC50으로서, 또는 실시예 15에 기재된 바와 같이 IL-13-Rα2 양성 세포주의 성장의 50%를 억제하는데 필요한 항원 IL-13-Rα2에 대한 항체 또는 항체 약물 접합체의 억제 농도로서 지정될 수 있다.
"EC50"은 결합 능력의 측정치이고, 기준선 및 최대치 사이의 중간 반응을 야기하는데 필요한 항체 또는 항체-약물 접합체의 반수 최대 유효 농도로서 정의된다.
본원에 사용된 어구 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 (투여량 및 투여 기간 및 수단에 대한) 양을 지칭한다. 유효량은 대상체에게 치료 이익을 제공하는데 필요한 활성제의 적어도 최소량이지만, 독성량 미만이다.
본 발명의 항체의 생물활성과 관련하여 본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "중화하다"는, 예를 들어 생물학적 활성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 억제되는 대상의 진행 또는 중증도에 대해 실질적으로 길항작용하거나, 이를 금하거나, 방지하거나, 금지하거나, 늦추거나, 교란하거나, 제거하거나, 중지시키거나, 감소시키거나, 또는 역전시키는 항체의 능력을 의미한다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 제2 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합의 결과가 제2 항체의 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 것을 의미한다. 대안적으로 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것이 제1 항체의 존재 하에 또한 검출가능하게 감소되는 경우도 있을 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 즉, 제2 항체는 제1 항체가 그의 각각의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체는 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일한 정도, 더 큰 정도, 또는 더 적은 정도와 상관없이 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우에, 항체는 그의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체가 둘 다 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태 변화 또는 공통적인 에피토프 또는 그의 부분에 대한 결합)과는 관계없이, 통상의 기술자는 본원에 제공되는 교시에 기초하여 본원에 개시된 방법에 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되며 유용할 수 있음을 인식할 것이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함할 수 있다: 오직 변이체에 대한 코딩 서열, 변이체에 대한 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예컨대 기능적 폴리펩티드, 또는 신호 또는 분비 서열 또는 프로-단백질 서열; 항체에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 항체에 대한 코딩 서열의 5' 및/또는 3'의 인트론 또는 비-코딩 서열. 용어 "항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 변이체에 대한 추가의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 특정 숙주 세포/발현 시스템에 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 목적하는 단백질의 아미노산 서열로부터 용이하게 수득될 수 있는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다 (진아트 아게(GENEART AG), 독일 레겐스부르크 참조).
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자인 개개의 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연적, 우연적 또는 고의적 돌연변이로 인해 본래 모 세포와 (형태학상 또는 게놈 DNA 상보성에서) 반드시 완전하게 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이를 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지되어 있는 천연적으로 회합되거나 또는 이종인 프로모터 영역을 비롯하여, 항체 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열을 전형적으로 포함할 것이다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터내 진핵 프로모터 시스템일 것이지만, 원핵 숙주에 대한 제어 서열도 또한 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 세포주 내로 혼입되면, 숙주 세포는 뉴클레오티드 서열을 발현하는데, 그리고 원하는 경우에, 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 증식된다. 바람직한 진핵 세포주는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포, 또는 인간 배아 신장 세포주를 포함한다. 가장 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포주이다.
항체
본 발명의 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술들의 조합 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어 [Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999) 및 Fellouse, F.A., et al., J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)] 참조).
하기 표 1 및 2는 본 발명의 항체에 대한 바람직한 CDR을 나타낸다.
<표 1>
Figure 112015042224767-pct00001
<표 2>
Figure 112015042224767-pct00002
본 발명의 한 실시양태는 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다:
a) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역:
i) 서열 6 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1;
ii) 서열 7 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및
iii) 서열 8 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 및
b) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역:
i) 서열 2 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1;
ii) 서열 3 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및
iii) 서열 4 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1.
본 발명의 바람직한 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 하기를 포함한다:
a) 서열 6의 LCDR1, 서열 7의 LCDR2, 및 서열 8의 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및
b) 서열 2의 HCDR1, 서열 3의 HCDR2, 및 서열 4의 HCDR3을 포함하는 HCVR.
본 발명의 또 다른 바람직한 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 하기를 포함한다:
a) 서열 14의 LCDR1, 서열 15의 LCDR2, 및 서열 16의 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및
b) 서열 10의 HCDR1, 서열 11의 HCDR2, 및 서열 12의 HCDR3을 포함하는 HCVR.
본 발명의 바람직한 모노클로날 항체는 본원에서 hu08 (인간화 항-IL-13-Rα2 IgG1 항체); 및 hu07 (인간화 항-IL-13-Rα2 IgG1 항체)로 지칭된다. mAb hu08 및 hu07을 코딩하는 아미노산 서열의 서열 번호는 하기 표 3에 제공된다:
<표 3>
Figure 112015042224767-pct00003
본 발명의 한 실시양태는 서열 1과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열 및 서열 5와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 IL-13Rα2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 서열 48과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열 및 서열 41과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 IL-13Rα2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 그의 단편은 서열 1과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열 및 서열 5와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 그의 단편은 서열 48과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열 및 서열 41과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
본 발명의 대표적인 물질은 2012년 11월 6일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁되었다. ATCC 수탁 번호 PTA-13304를 갖는 벡터는 hu08-VLv1.0으로 지정된 인간 항-IL-13 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 수탁 번호 PTA-13305를 갖는 벡터는 hu08-VHv1.0으로 지정된 인간 항-IL-13 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 이는 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여 시에 또는 임의의 미국 또는 타국 특허 출원의 공개 시에, 이중 빠른 시점에, 공공에 대한 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 그에 대한 미국 특허청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정한 언급이 있는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라 특허청장에 의해 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용가능성을 보장한다.
항체에 대한 약물 모이어티의 접합
약물 모이어티는 항체에 대한 접합 지점과 반응성인 기를 갖거나 또는 이를 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 (예를 들어 항체의 엡실론-아미노 기 리신 또는 N-말단에서의) 알킬화, 산화된 탄수화물의 환원성 아미노화, 히드록실 기와 카르복실 기 사이의 에스테르교환, 아미노 기 또는 카르복실 기에서의 아미드화, 및 티올에의 접합에 의해 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 분자당 접합되는 약물 모이어티의 개수, p는 평균 1 내지 8; 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 실시양태에서, p는 평균 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 실시양태에서, p는 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 일부 실시양태에서, p는 평균 약 1 내지 약 8; 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1 내지 약 2의 범위이다. 일부 실시양태에서, p는 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4 또는 약 2 내지 약 3의 범위이다. 접합을 위해 사용될 수 있는 화학의 예에 대해, 예를 들어 [Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 15 (Chemical Modifications of Proteins)]을 참조한다.
링커
약물 모이어티는 링커에 의해 항체에 연결될 수 있다. 적합한 링커는, 예를 들어 절단가능한 링커 및 비-절단가능한 링커를 포함한다. 절단가능한 링커는 세포내 조건 하의 절단에 대해 전형적으로 감수성이다. 적합한 절단가능한 링커는 예를 들어 세포내 프로테아제, 예컨대 리소솜 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 링커를 포함한다. 예시적 실시양태에서, 링커는 디펩티드 링커, 예컨대 발린-시트룰린 (val-cit), 페닐알라닌-리신 (phe-lys) 링커, 또는 말레이미도카프로닉-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (vc) 링커일 수 있다. 또 다른 링커는 술포숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트 (smcc)이다. 술포-smcc 접합은 술프히드릴 (티올, -SH)과 반응하지만, 그의 술포-NHS 에스테르는 (리신 및 단백질 또는 펩티드 N-말단에서 발견되는 바와 같은) 1급 아민에 대해 반응성인 말레이미드 기를 통해 일어난다. 또 다른 링커는 말레이미도카프로일 (mc)이다. 다른 적합한 링커는 특정 pH 또는 pH 범위에서 가수분해가능한 링커, 예컨대 히드라존 링커를 포함한다. 추가의 적합한 절단가능한 링커는 디술피드 링커를 포함한다. 링커는 예를 들어 mc 링커 등과 같이, 약물이 방출될 수 있도록 항체가 세포내에서 분해되어야 하는 정도로 항체에 공유적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 링커는 말레이미도카프로닉-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (vc) 및 말레이미도카프로일 (mc)이다.
조작된 Fc 폴리펩티드
항체의 중쇄의 CH2 또는 CH3 도메인의 표면 상, 또는 경쇄의 불변 도메인 상, 또는 달리 접근가능한 곳에 아마도 존재하는 특정 잔기가 자연 발생 야생형 아미노산의, 예를 들어 시스테인에 의한 치환에 적합하고, 따라서 다양한 작용제에 접합될 수 있는 부위로 조작하는데 유용하다는 것이 종전에 보고된 바 있다 (본원에 참고로 포함되는 미국 특허 가출원 USSN 61/580169 참조).
아미노산 변형은 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있고, 이러한 많은 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 통상적이다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 임의의 널리 공지된 PCR-기반 기술을 사용하여 아미노산 치환, 결실 및 삽입이 달성될 수 있다. 아미노산 치환은 부위-지정 돌연변이유발에 의해 일어날 수 있다 (예를 들어 [Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; 및 Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488] 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 Fc 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는데 사용될 수 있고, 이에 의해 항체 또는 그의 단편은 조작된 Fc 영역을 포함하며, 이는 조작된 잔기 (즉, 야생형 비변형된 Fc와 비교하여 치환된 아미노산)에서 매우 다양한 모이어티와의 접합에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 카파 경쇄 불변 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는데 사용될 수 있고, 이에 의해 항체 또는 그의 단편은 아미노산 돌연변이 또는 그의 부분을 포함하는 조작된 CL 영역을 포함하며, 이는 조작된 아미노산 잔기에서 매우 다양한 모이어티와의 접합에 사용될 수 있다.
본 발명의 IL-13-Rα2 항체는 1, 2개, 또는 그 초과의 아미노산이 항체 중쇄의 위치 347, 392, 398, 422 및 443으로부터 선택된 것인 조작된 Fc 폴리펩티드를 포괄할 수 있으며, 여기서 불변 영역의 넘버링 시스템은 또 다른 아미노산 (천연 및 비-천연/합성 아미노산 포함)으로 치환된 모, 천연, 또는 야생형 항체의 카바트 등 (1991, NIH Publication 91- 3242, National Technical Information Service, 버지니아주 스프링필드, 이하 "카바트")에 기재된 바와 같은 EU 인덱스의 그것이다.
Fc 폴리펩티드에서의, 예를 들어 시스테인 잔기의 단일 치환은 IgG 항체 분자의 동종이량체 속성으로 인해 생성되는 IgG 분자 내의 2개의 상응하는 잔기의 디스플레이를 통상적으로 야기하는 것에 주목한다. 따라서, 본 발명의 생성되는 조작된 IgG 항체는 약물 또는 화합물에의 접합을 위한 적어도 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 반응성 기를 디스플레이할 수 있다. 한 실시양태에서, 치환 중 하나 이상은 시스테인 잔기에 의하고, 생성되는 조작된 항체는 약물 또는 화합물에의 접합을 위한 적어도 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 티올 기를 디스플레이할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 Fc 폴리펩티드는 항체의 중쇄의 위치 347, 392, 398, 422 및 443으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하며, 여기서 불변 영역의 넘버링 시스템은 카바트 등 (상기 문헌)에 기재된 바와 같은 EU 인덱스의 그것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 Fc 폴리펩티드는 (a) 서열 33의 아미노산 서열; 및 (b) 서열 34의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 한 쌍의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 Fc 폴리펩티드는 (a) 서열 28의 아미노산 서열; 및 (b) 서열 29의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 치환을 포함한다.
조작된 Cκ 폴리펩티드
본 발명의 IL-13-Rα2 항체는 1, 2, 또는 3개의 아미노산이 항체 경쇄의 위치 111, 183, 또는 188로부터 선택된 것인 조작된 항체 경쇄 불변 영역 (LC), 또는 그의 부분을 포괄할 수 있으며, 여기서 경쇄 불변 영역의 넘버링 시스템은 또 다른 아미노산 (천연 및 비-천연/합성 아미노산 포함)으로 치환된 모, 천연, 또는 야생형 항체의 카바트 등 (1991, NIH Publication 91- 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA, 이하 "카바트")에 기재된 바와 같은 카바트 넘버링 시스템의 그것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 LC 폴리펩티드는 (a) 서열 30의 아미노산 서열; (b) 서열 31의 아미노산 서열; 및 (c) 서열 32의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 많은 항체의 이량체 속성으로 인해 (예를 들어, IgG는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 중쇄는 Fc 폴리펩티드를 포함함), 본 발명의 항체는 적어도 하나의 조작된 Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있고 적어도 하나의 조작된 경쇄 불변 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있으며, 이에 따라 적어도 2개의 - 하나는 Fc 폴리펩티드 내 그리고 다른 하나는 CL 폴리펩티드 내의 부위-특이적 접합 부위를 제공한다. 본 발명의 바람직한 항체는 L443C/kA111C (서열 28 및 30), L443C/kK183C (서열 28 및 31), Q347C/kA111C (서열 29 및 30), 및 Q347C/kK183C (서열 29 및 31)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조작된 Fc 폴리펩티드 및 적어도 하나의 조작된 경쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함한다.
MAC 접합 기술
용어 다중기능적 항체 접합체, 또는 MAC는 표적에 대해 생물학적 효과를 발휘하는 적어도 하나의 약물 모이어티에 불변 카파 영역을 통해 공유적으로 접합된 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 52, 서열 53, 서열 54, 또는 서열 55의 K90 및 H91을 포함하고, 약물 모이어티는 K90에서 접합된다. MAC 기술은 종전의 WO2012/007896 및 USSN 61/584,675에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 포함된다.
약물 모이어티는 표적에 대해 생물학적 효과를 발휘하고, 이는 펩티드, 소분자, 단백질, 핵산 분자, 독소, 압타머 또는 항원 결합 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 약물 모이어티는 표적 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는 약물일 수 있다. 일부 측면에서, 세포독소는 아우리스타틴으로 공지된 화합물 부류 내의 것이다. 대표적인 아우리스타틴은 본원의 실시예 13에 기재된 화합물 0101 및 3377이다.
약물 모이어티의 항체의 불변 경쇄 도메인과의 반응은 Fc 수용체 (예컨대 FcγR 및 FcRn)에 대한 항체의 Fc 부분의 결합 또는 그의 각각의 표적에 대한 항체의 결합의 임의의 간섭을 최소화하거나 방지하기 위해 특히 바람직하다. 대조적으로, 항체의 Fc 부분에 대한 각각의 약물 모이어티의 접합은 생체내 항체 반감기 및/또는 면역계와 상호작용하는 그의 능력 (이펙터 기능)을 감소시킬 수 있다. 항체의 가변 중쇄 (VH) 또는 가변 경쇄 (VL) 영역에서의 약물 모이어티의 접합은 그의 동족체에 대한 항체의 결합을 감소시킬 위험을 갖는다.
MAC 기술의 이점 중 하나는 시약 및 반응 조건 (특히 이탈기 에스테르 및 링커 항체의 몰비)에 따라, 본 발명의 조성물 및 샘플이 규정된 수의 항체에 대한 규정된 수의 약물 모이어티로 생성될 수 있다는 것이다. 이는 약물 모이어티 및 항체의 상대적인 반응성 및 치료 윈도우의 균형을 맞출 때 특히 유용할 수 있다. 또한, 일부 상황에서, 항체당 약물 모이어티의 수를 특정 역치를 초과하여 증가시키는 것은 증가된 표적 결합 또는 치료 효과를 야기하지 않을 수 있다. 따라서, 항체당 접합되는 약물 모이어티의 수를 제어하고 이때 Fc 또는 결합 부위 간섭을 최소화하도록 접합 위치를 지시할 수 있는 것이 유용하다. 따라서, 일부 상황에서 단일 리신 잔기, 예컨대 hu08 LC 불변 영역, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 또는 서열 55의 K90만을 우선적으로 장식하는 감소된 접합을 가능하게 하는 본 발명의 측면이 유리할 수 있다. 또한, K90에 대한 접합은 신뢰할 만하고 강건한 반면에, 각각 반응성 및 pI가 약간 상이한 다른 항체 표면 리신에 대한 접합은 시기적절하지 않거나 비정상적인 시점에, 예컨대 순환 동안 및 항체 인식에 의한 표적에의 약물 모이어티의 전달 전에 접합된 분자를 방출할 수 있는 접합된 항체의 이종 샘플을 생성할 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 야생형 불변 카파 쇄 (서열 55)의 D77의 특정 돌연변이가 약물 접합을 위한 K90 부위의 접근성 및/또는 반응성을 개선한다는 발견이다. 또한, 본 발명은 위치 45에서의 V/A 및 위치 83에서의 A/L의, 카파 쇄의 공지된 다형성을 제공한다 (3종의 확인된 인간 불변 카파 다형성 Km(1):V45/L83, Km(1,2): A45/L83, 및 Km(3) A45/V83을 제공함). 따라서, 본 발명은 서열 53을 포함하는 MAC를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 카파 불변 도메인이 서열 52, 서열 54 및 서열 55로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 Km(3) 다형성의 MAC를 제공한다.
본 발명은 서열 52에 제시된 바와 같은 LC 불변 영역을 갖고, 상기 LC 불변 영역이 위치 80에서 리신 잔기 (K80) 및 위치 77에서 아스파르트산 잔기가 알라닌 잔기로 대체된 것 (D77A)을 갖는 것인, 인간 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 제공한다.
본 발명은 서열 53에 제시된 바와 같은 LC 불변 영역을 갖고, 여기서 위치 45는 V 또는 A이고, 위치 83은 A 또는 L이고, 위치 77은 A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 인간 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 제공한다. 일부 측면에서, 위치 45가 V이고, 위치 83이 L이다. 서열 53의 일부 측면에서, 위치 77은 A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다. 서열 53의 위치 45 및 83에서의 잔기의 가변성은 단지 Km(1), Km(1,2), 및 Km(3) 다형성 중 어느 1, 2개 또는 모든 3개가 제공되도록 선택될 수 있다.
본 발명은 서열 54에 제시된 바와 같은 LC 불변 영역을 갖고, 여기서 위치 77은 A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 인간 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 제공한다.
본 발명은 서열 55에 제시된 바와 같은 LC 불변 영역을 갖는, 인간 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 제공한다.
암에 대한 요법
종양, 전이 또는 탈제어된 세포 성장을 특징으로 하는 다른 질환 또는 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는 암은 본 발명의 항체-약물 접합체의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있다.
예시적인 항-IL-13-Rα2 ADC는 IL-13-Rα2가 정상 (예를 들어, 비-암성 조직)에 비해 발현되거나 과다발현되는 암을 치료하는데 유용하다. 본원에 기재된 방법에 따른 IL-13-Rα2-발현 암의 치료 또는 예방은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-IL-13-Rα2 ADC를 투여하는 것에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포독성제에 접합된 항-IL-13-Rα2 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 유도체가 투여될 것이다. 일부 예시적 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 (i) IL-13-Rα2 발현 암 세포에 결합하고, (ii) 예를 들어 IL-13-Rα2 발현 암 세포의 증식을 억제하거나 또는 IL-13-Rα2 발현 암 세포를 사멸하기 위한 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 발휘할 것이다.
다른 실시양태에서, 항-IL-13-Rα2 ADC는 또 다른 치료제와 함께 공-투여되거나, 또는 또 다른 치료제와 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-IL-13-Rα2 ADC는 치료 기준 화학요법제를 비롯한 화학요법제와 함께 공-투여되거나, 또는 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 다른 치료제는 치료할 특정 질환에 대한 치료 기준인 작용제일 것이거나, 또는 치료할 특정 질환에 대한 샐비지 요법의 일부이다. 항암제 및 화학치료 요법은, 예를 들어, 예를 들어 항-CD52 항체 (예를 들어, 알렘투주맙), 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙), 및 항-CD40 항체 (예를 들어, SGN40)를 비롯한 항암 항체; 예를 들어 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손); CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손); RCVP (리툭시맙+CVP); RCHOP (리툭시맙+CHOP); RICE (리툭시맙+이포사미드, 카르보플라틴, 에토포시드); RDHAP, (리툭시맙+덱사메타손, 시타라빈, 시스플라틴); RESHAP (리툭시맙+에토포시드, 메틸프레드니솔론, 시타라빈, 시스플라틴); 겜시타빈; 아스파라기나제의 존재 또는 부재 하의 빈크리스틴, 프레드니손 및 안트라시클린과의 조합 치료; 다우노루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 아스파라기나제와의 조합 치료; 테니포시드 및 Ara-C (시타라빈)와의 조합 치료; 메토트렉세이트 및 류코보린과의 조합 치료; 블레오마이신, 독소루비신, 에토포시드, 메클로레타민, 프레드니손, 빈블라스틴 및 빈크리스틴과의 조합 치료; 소분자 억제제; 및 예를 들어 보르테조밉을 비롯한 프로테오솜 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의 항-IL-13-Rα2 ADC를 방사선 치료와 조합하여, 임의로 또 다른 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-13-Rα2 ADC는 항암제 (예를 들어, 화학요법제)와 및/또는 방사선 요법과 공동으로 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 화학요법제 또는 방사선 요법은 본 발명의 화합물의 투여의 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 1일, 1주, 1개월, 수개월 (예를 들어 3개월 만큼) 전 또는 후에 투여된다.
본 발명의 ADC는 선택된 투여 방식, 및 제약상 허용되는 희석제 또는 부형제, 예컨대 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 담체 등에 적절하게 제제화된 투여용 제약 조성물 형태일 수 있다. [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18th ed., 1995]는 진료의에게 일반적으로 공지되어 있는 제제화 기술의 개요를 제공한다.
이들 제약 조성물은 암을 치료하기 위한 일반적으로 의도되는 목적을 달성하는, 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 비경구로, 본원에서 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 및 관절내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 투여 방식을 지칭하는 것으로서 정의된다. 투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재할 경우에 공동 치료의 종류, 치료 빈도, 및 목적하는 효과의 속성에 의존할 것이다.
본 발명의 범위 내의 조성물은, ADC가 암 치료를 위해 목적하는 의학적 효과를 달성하는데 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물을 포함한다. 환자별로 개별 필요량은 달라질 수 있지만, 모든 성분의 유효량에 대해 최적인 범위를 결정하는 것은 통상의 기술을 갖는 임상의의 능력 내에 있다.
진단
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 시험관내 또는 생체내 생물학적 샘플에서 hIL-13-Rα2를 검출하는데 또한 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항- hIL-13-Rα2 항체는 조직 또는 조직으로부터 유래된 세포에서 hIL-13-Rα2의 수준을 결정하는데 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 조직은 질환 조직이다. 방법의 바람직한 실시양태에서, 조직은 종양 또는 그의 생검이다. 방법의 바람직한 실시양태에서, 조직 또는 그의 생검이 먼저 환자로부터 절제된 다음, 조직 또는 생검 내의 hIL-13-Rα2의 수준이 본 발명의 항체 또는 항체 단편에 의한 면역검정에서 결정될 수 있다. 조직 또는 그의 생검은 동결되거나 고정될 수 있다. 동일한 방법을 사용하여 hIL-13-Rα2 단백질의 다른 특성, 예컨대 그의 세포 표면 수준 또는 세포 국재화를 결정할 수 있다.
상기 기재된 방법을 사용하여 암에 걸린 것으로 공지되었거나 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에서 암을 진단할 수 있으며, 여기서 상기 환자에서 측정된 hIL-13-Rα2의 수준은 정상 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교된다. 이어서 상기 방법을 사용하여 종양이 hIL-13-Rα2를 발현하는지 여부를 결정할 수 있고, 이는 종양이 본 발명의 항체-약물 접합체에 의한 치료에 양호하게 응답할 것임을 시사할 수 있다. 바람직하게는, 종양은 폐암, 결장암, 위암, 췌장암, 난소암, 악성 신경교종 및 흑색종, 또는 hIL-13-Rα2이 발현되는 다른 암종, 및 hIL-13-Rα2이 주로 발현되는 것으로 아직 결정되지 않은 다른 암이다.
본 발명의 한 실시양태는 암을 가진 것으로 의심되는 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계; 본 발명의 항체를 사용하는 면역검정에서 상기 샘플을 시험하는 단계; 상기 샘플 상의 hIL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 결정하는 단계; hIL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 정상 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 hIL-13-Rα2의 수준을 결정하는 단계; 및 본 발명의 항체-약물 접합체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 IL-13-Rα2 발현 암을 치료하는 방법이다.
본 발명은 연구 또는 진단 용도에서의 사용을 위해 추가로 표지된 모노클로날 항체, 인간화 항체 및 그의 에피토프-결합 단편을 추가로 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 표지는 방사성표지, 형광단, 발색단, 영상화제 또는 금속 이온이다.
상기 표지된 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편을 암을 가진 것으로 의심되는 대상체에게 투여하고, 대상체의 신체 내에서의 표지의 분포를 측정 또는 모니터링하는 진단 방법이 또한 제공된다.
키트
본 발명은 예를 들어 기재된 세포독성 접합체 및 특정한 세포 유형의 사멸을 위한 세포독성 접합체의 사용에 대한 설명서를 포함하는 키트를 또한 포함한다. 설명서는 세포독성 접합체를 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 사용하는 것에 대한 지침을 포함할 수 있다. 전형적으로, 키트는 세포독성 접합체를 함유하는 구획을 가질 것이다. 세포독성 접합체는 동결건조된 형태, 액체 형태, 또는 키트 내에 포함되도록 개조될 수 있는 기타 형태일 수 있다. 키트는 키트 내의 설명서에 기재된 방법을 실행하는데 필요한 추가적인 요소, 예컨대 동결건조 분말을 재구성하기 위한 멸균 용액, 환자에게 투여하기 전에 세포독성 접합체와 조합하기 위한 추가의 작용제, 및 접합체를 환자에게 투여하는 것을 보조하는 도구를 또한 함유할 수 있다.
상기에 또는 하기 실시예에서 인용되는 모든 공개 및 특허 문헌은 각각이 개별적으로 나타내는 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 하기 실시예와 관련하여 추가로 기재될 것이지만; 본 발명이 이러한 실시예로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적 측면의 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공되는 것이고, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
뮤린 항-IL-13Rα2 항체 mu07 및 mu08의 생성 및 평가
마우스에서 인간 IL-13Rα2 항원 및 표준 면역화 방법을 사용하여 항-hIL-13Rα2 항체를 제조하였다. (Zhang, C., Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 901, DOI 10.1007/978-1-61779-931-0_7, ⓒ Springer Science+Business Media, LLC 2012). 2종의 뮤린 항체, mu07 및 mu08는 세포 표면에서 높은 수준의 IL-13Rα2를 내생적으로 발현하는 흑색종 세포주인 A375 세포에 결합함을 확인하였다.
ADC에서 항체의 중요한 특징은 그의 수용체에의 결합 후의 신속한 내재화이다. 항체 mu07 및 mu08은 37℃에서 A375 세포와의 1시간 인큐베이션 후 각각 38% 및 31% 내재화되는 것으로 평가 및 발견되었다.
실시예 2
뮤린 항-IL-13Rα2 항체 mu07 및 mu08의 가변 영역
스마터(SMARTer)® cDNA 합성 시스템 (클론테크 래보러토리즈 인크.(Clontech Laboratories Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰)에 이어 PCR 증폭을 사용하여 mu07 및 mu08 항-IL-13Rα2 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝하였다. 표준 기술에 의해 cDNA를 합성하고, PCR 슈퍼믹스 하이 피델리티(PCR SuperMix High Fidelity) (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)와 함께 스마터® IIA 올리고 서열에 어닐링하는 프라이머 및 마우스 불변 영역 특이적 프라이머 (경쇄의 경우에 마우스 카파 및 중쇄의 경우에 마우스 IgG1)를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 PCR 산물을 pCR4-TOPO 벡터 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)에 서브클로닝하고, 핵산 서열을 결정하였다.
mu07 및 mu08 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열 25의 아미노산 잔기 및 서열 23의 아미노산 잔기로 기재하였다. mu07 및 mu08 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열 26 및 서열 24에 기재하였다.
실시예 3
키메라 항체 ch07 및 ch08의 결합 특이성 및 결합 동역학
관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 영역과 함께 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 키메라 항체 07 및 08 (ch07 및 ch08)을 구축하였다. ch07 및 ch08의 결합 활성 및 특이성을 평가하기 위해, IL-13 시토카인에 대한 수용체인 재조합 hIL-13-Rα2 및 hIL-13Rα1을 사용하여 표준 직접 ELISA 프로토콜을 수행하였다. 결합은 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 염소 항-인간 IgG카파에 의해 검출되었다. 도 1에서의 결과는 키메라 항체가 둘 다 hIL-13Rα2에는 특이적으로 결합할 수 있지만 hIL-13Rα1에는 그렇지 않음을 입증하였다. ED50은 ch07 및 ch08의 경우에 각각 0.15nM 및 0.076nM이었다.
ch07 및 ch08 항체의 결합 동역학을 평가하기 위해, 비아코어® 인간 Fab 포획 키트 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 비아코어® T100 또는 T200 기기 상에서 SPR (표면 플라즈몬 공명) 실험을 수행하였다. 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하는 비아코어® T100 평가 소프트웨어 버전 2.0을 사용하여 모든 데이터를 분석하였다.
Ka, Kd 및 KD를 표 5에 제시한다. pH7.4에서, hIL-13-Rα2에 대한 ch07 및 ch08 둘 다의 결합 친화도는 pM 범위가 각각 648pM 및 964pM이었다. hIL-13-Rα2로부터의 ch07 해리는 ch08보다 약 2배 더 느리다. pH6.0에서, hIL-13-Rα2에 대한 ch07 및 ch08 결합 친화도는 낮은 nM 범위 내였다. ch08 및 ch07의 해리율은 매우 유사하였다. pH7.4보다 pH6.0에서 더 높은 KD는 더 낮은 회합률로 인한 것이다.
<표 5> 키메라 항체 ch07 및 ch08의 동역학적 분석
Figure 112015042224767-pct00004
실시예 4
항체 ch07 및 ch08의 결합 에피토프
ch07 및 ch08이 별개의 결합 에피토프를 갖는지 여부를 조사하기 위해 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 ELISA 실험 전에, ch07 및 ch08을 비오티닐화하였다. 비오티닐화 ch07 (비오틴-ch07) 및 ch08 (비오틴-ch08)의 EC50은 직접 표준 ELISA에 의해 결정하였다. 경쟁 ELISA를 위해, 재조합 hIL-13-Rα2를 96-웰 플레이트 상에 PBS 중 2μg/mL의 50ul로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 이어서 플레이트를 표준 ELISA 프로토콜에 따라 차단하고 세척하였다. 3-배 연속 희석된 ch07 및 ch08 (2x 최종 농도)을 각각 일정량의 비오틴-ch07 (도 2a) 또는 비오틴-ch08 (도 2b)과 혼합하고, 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합된 비오티닐화 키메라 항체의 양을 HRP 접합된 스트렙타비딘에 의해 1:5000에서 1시간 동안 검출하였다. 결과를 도 2에 제시한다. 비표지된 키메라 ch07은 hIL-13-Rα2에 대한 결합에서 비오틴-ch07과 경쟁하는 반면에, 비표지된 ch08은 어떠한 경쟁 징후도 보이지 않았다 (도 2a). 비오틴-ch08과 경쟁시키기 위해 동일한 세트의 항체를 사용한 경우에 유사한 결과가 수득되었다 (도 2b). 이는 항체 ch07 및 ch08이 hIL-13Rα2에 대해 별개의 결합 에피토프를 갖는다는 것을 분명하게 입증하였다.
2종의 상업적으로 입수가능한 항체, 모노클로날 마우스 IgG1, MAB614 (R&D 시스템즈(R&D Systems)) 및 모노클로날 마우스 IgG1, ab27414 (압캠(Abcam))를 사용하여 경쟁 ELISA를 또한 수행하였다. 도 2a 및 도 2b는 상업용 항체가 둘 다 비오틴-ch07 또는 비오틴-ch08과 IL-13Rα2에 대한 결합에서 경쟁하지 않음을 보여주며, 이는 항체 ch07 및 ch08이 2종의 상업용 항체와 상이한 결합 에피토프를 가짐을 나타낸다.
이러한 결과는 비아코어 실험에 의해 확인되었다. 약 100RU의 hIL-13-Rα2를 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 칩 상에 고정시켰다. ch07 (100nM 및 200nM) 및 ch08 (100nM 및 200nM)을 hIL-13-Rα2 실험 채널 및 대조 채널 상에 10ul/분의 유량으로 150초 동안 순차적으로 주입하였다. 100nM ch07을 고정된 hIL-13Rα2에 주입한 경우에 50RU에 도달하였다. ch07 농도를 200nM로 증가시킨 경우에 어떠한 추가의 RU 증가도 없었고, 이는 ch07에 대한 hIL-13-Rα2 상의 결합 부위가 포화되었음을 나타낸다. 100nM ch08의 주입으로, 100RU가 첨가되었다. 이러한 양성 결합 신호는 2종의 항체는 경쟁이 없음을 나타낸다. 결과는 항체 ch07 및 ch08이 상이한 결합 에피토프를 가짐을 추가로 확인시켜 주었다 (도 2c).
실시예 5
ch07 및 ch08 중화 연구
ch07 및 ch08이 IL-13 기능을 중화시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 경쟁 ELISA를 수행하였다. 항-Flag Ab를 96-웰 플레이트 상에 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 표준 ELISA 프로토콜에 따라 차단하고 세척하였다. 마우스 항체, 키메라 항체, 양성 대조군 네이키드 IL-13Rα2, 및 음성 대조군 hIL-21R의 3-배 연속 희석액을 일정량의 비오티닐화 IL-13Rα2-Fc (4x ED50) 및 일정량의 IL-13 (4x ED50)과 함께 RT에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 100ul의 복합체를 ELISA 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합된 비오틴-IL-13-Rα2의 양을 HRP 접합된 스트렙타비딘에 의해 1:5000에서 1시간 동안 검출하였다. 결과를 도 3에 제시한다. 항체 07 및 08 (뮤린 및 키메라 형태)은 둘 다 IL-13-Rα2 결합 부위에 대해 IL-13과 경쟁하지 않는 반면에, 네이키드 IL-13-Rα2는 비오티닐화 IL-13Rα2와 경쟁하였다. 이는 항체 07 및 08 (뮤린 및 키메라 형태)이 비-중화 항체임을 나타낸다.
실시예 6
mu08의 인간화
모노클로날 뮤린 항체 mu08 (서열 23 및 24)을 인간 수용자 프레임워크로서 DP-54 및 DPK9를 사용하여 인간화하였다. 복귀 돌연변이의 존재 또는 부재 하에 CDR 그라프팅에 의해 인간화 08 항체 (hu08)를 제조하였다. 뮤린 mu08 항체의 CDR을 카바트 체계를 사용하여 확인하였다.
hu08 중쇄 가변 영역 (VH 버전 1.0)은 mu08의 CDR을 인간 DP-54 프레임워크 영역에 직접적으로 그라프팅시킴으로써 구축하였다. 버전 1.1은 위치 A40T, G42D, G44R 및 N83S에서의 프레임워크 DP-54의 복귀 돌연변이에 의해 제조하였다. v1.0 및 v1.1을 둘 다 hIgG1 불변 영역을 함유하는 pSMED2 벡터에 클로닝시켰다. 인간화 hu08 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 v1.0의 경우에 서열 17이고 v1.1의 경우에 서열 20이다. hu08 중쇄 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열은 v1.0의 경우에 서열 1이고 v1.1의 경우에 서열 19이다.
hu08 경쇄 가변 영역 (VK 버전 1.0)은 뮤린 mu08의 CDR을 인간 DPK9 프레임워크 영역에 직접적으로 그라프팅시킴으로써 구축하였다. 버전 1.1은 위치 K39I, S60D, T72S, T73F 및 T74I에서 프레임워크 DPK9의 복귀 돌연변이에 의해 제조하였다. 버전 v1.0 및 v1.1을 둘 다 hIg카파 불변 영역을 함유하는 pSMEN3 벡터에 클로닝 시켰다. hu08 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 v1.0의 경우에 서열 18이고 v1.1의 경우에 서열 22이다. hu08 경쇄 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열은 v1.0의 경우에 서열 5이고 v1.1의 경우에 서열 21이다.
실시예 7
인간화 hu08의 특성화
표준 직접 ELISA에 의해 재조합 hIL-13-Rα2에 대한 인간화 hu08 결합을 평가하였다. 재조합 hIL-13-Rα2를 96-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 연속 희석된 키메라 항체 또는 인간화 항체를 버전 1.0 및 1.1의 중쇄 및 경쇄의 조합으로, 예를 들어 hu08 v1.0 HC/1.0 LC, hu08 v1.0 HC/v1.1 LC, hu08 v1.1 HC/v1.0 LC, 및 hu08 v1.1 HC/v1.1 LC로 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 결합은 HRP 접합된 염소 항-인간 Ig 카파에 의해 검출하였다. 결과를 하기 표 6에 제시하였고, 이는 모든 4종의 인간화 항체의 조합이 재조합 hIL-13-Rα2에 결합할 수 있고 ED50이 ch08과 유사함을 입증하였다.
표준 FACS (형광 활성화 세포 분류) 분석을 수행하여 세포 표면 IL-13Rα2에 대한 항체의 결합 활성을 평가하였다. A375 세포를 1% 소 혈청 알부민 및 0.001% 아지드화나트륨을 함유하는 빙냉 PBS로 세척하였다. 세포를 항체 hu08 v1.0 및 hu08 v1.1, 예를 들어 hu08 v1.0 HC/1.0 LC, hu08 v1.0 HC/v1.1 LC, hu08 v1.1 HC/v1.0 LC, 및 hu08 v1.1 HC/v1.1 LC의 연속 희석액과 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한 다음 포스파티딜에탄올아민-표지된 염소 항-인간 IgG로 염색하고, 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 중에서 고정시키고, FACS캔(FACScan)® (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 상에서 분석하였다. 데이터는 재조합 수용체에 대한 결합과 일치하였고, 모든 4종의 조합의 세포 표면 항원에 대한 결합이 ch08과 유사함을 보여주었다 (표 6).
경쟁 ELISA를 수행하여 hu08 1.0 및 hu08 v1.1이 IL-13-Rα2 결합에 대해 ch08과 경쟁하는지 여부를 평가하였다. 재조합 hIL-13-Rα2를 96-웰 플레이트 상에 PBS 중 2μg/mL의 50ul로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 이어서 플레이트를 표준 ELISA 프로토콜에 따라 차단하고 세척하였다. 3-배 연속 희석된 ch08, hu08 1.0 및 hu08 v1.1, 및 음성 대조군 ch07 (2x 최종 농도)을 비오티닐화 ch08 (2x EC50)과 혼합하였다. 50μl의 항체 및 비오틴-ch08 혼합물을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하엿다. 비오틴-ch08 결합된 양을 HRP 접합된 스트렙타비딘에 의해 검출하였다. 결과를 표 6에 제시한다. 인간화 항체의 모든 4종의 조합은 비오티닐화 ch08과의 경쟁에 있어서 키메라 항체 ch08과 유사하였고, 이는 hu08 1.0 및 hu08 v1.1이 ch08과 동일한 결합 에피토프를 보유하고, 가용성 및 세포 표면 IL-13-Rα2에 대해 유사한 친화도를 가짐을 나타낸다.
<표 6>
Figure 112015042224767-pct00005
hu08 v1.0 HC/v1.0 LC 및 hu08 v1.1HC /v1.1LC를 규모 확대하여 정제된 단백질을 생성하였다. 항체는 둘 다 HEK293F 현탁 세포에서 일시적으로 발현되었다. 놀랍게도, 08의 인간화는 ch08의 수율과 비교하여 항체 제조 수율을 5-6배만큼 개선하였다 (표 7).
<표 7>
Figure 112015042224767-pct00006
단백질 또는 단백질 도메인의 열 안정성과 단백질 또는 단백질 도메인의 전반적인 안정성 사이에 직접적인 상관관계가 존재하였다. 단백질 또는 단백질 도메인의 보다 높은 융점은 개선된 제조성 및 보다 긴 보관 수명/안정성을 종종 제공한다. 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 ch08 및 hu08 (v 1.0 및 v1.1)의 열 안정성을 조사하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 마이크로칼(MicroCal) VP-DSC 기기 상에서 DSC에 의한 키메라 및 인간화 항체의 열적 풀림을 수행하였다. 인간화 항체, hu08 v1.0/1.0 및 hu08 v1.1/1.1은 둘 다 키메라 버전 ch08보다 더 높은 Tm2 (Fab)를 나타내었다 (표 8). 이는 ch08의 인간화가 이 항체의 열 안정성을 개선함을 입증한다.
<표 8>
Figure 112015042224767-pct00007
hu08 항체의 결합 동역학을 상기 기재된 바와 같이 비아코어® T100 상에서 수행하였고, 결과를 표 9에 제시한다.
<표 9>
Figure 112015042224767-pct00008
실시예 8
mu07의 인간화
모노클로날 뮤린 항체 mu07를 인간화하는 일반적인 전략은 실시예 6에서 mu08에 대해 기재된 바와 동일하다. 인간화 hu07 중쇄 가변 영역 (VH 버전 1.0)은 mu07의 CDR을 인간 DP-54 프레임워크 영역에 직접적으로 그라프팅시킴으로써 구축하였다. 버전 1.1-1.5는 다양한 위치에서의 프레임워크 DP-54의 복귀 돌연변이에 의해 제조하였다 (표 10). 모든 버전을 hIgG1 불변 영역을 함유하는 pSMED2 벡터에 클로닝시켰다.
hu07 경쇄 가변 영역 (VK 버전 1.0)은 mu07의 CDR을 인간 DPK9 프레임워크 영역에 직접적으로 그라프팅시킴으로써 구축하였다. 버전 1.1-1.7은 다양한 위치에서의 프레임워크 DPK9의 복귀 돌연변이에 의해 제조하였다 (표 10). 모든 버전을 hIg 카파 불변 영역을 함유하는 pSMEN3 벡터에 클로닝시켰다. hu07 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열의 서열 번호를 표 10에 열거한다.
<표 10>
Figure 112015042224767-pct00009
실시예 9
인간화 hu07의 특성화
hu07의 다양한 버전의 결합/경쟁 특성을 평가하기 위해, COS-1 M6 세포에서 hu07 중쇄 및 경쇄의 19종의 조합에 의한 일시적 형질감염을 수행하였다. 6종의 중쇄 및 3종의 경쇄를 포함시켰다: 키메라 중쇄, 인간화 v1.0-1.5 중쇄, 키메라 경쇄 및 인간화 v1.0-1.1 경쇄. 형질감염 후 2일째에 조건화 배지 (CM)를 수거하고, 관련 기술분야에 공지된 프로토콜을 사용하여 표준 ELISA에 의한 재조합 IL-13-Rα2에 대한 직접 결합, A375 세포를 사용한 세포-기반 ELISA에 의한 세포 표면 수용체 결합, 및 비오티닐화 ch07과의 경쟁 ELISA를 수행하였다.
CM으로부터의 초기 스크리닝 데이터에 기초하여, 중쇄 v1.5를 추가의 연구를 위해 선택하였다. 중쇄 v1.5를 키메라, 인간화 v1.0 및 v1.1 경쇄와 쌍 형성시켰다. 표 11은 hu07 항체의 결합 활성, 경쟁 특성 및 세포독성을 요약한다. 키메라 경쇄 Kc와 쌍을 형성한 hu07 v1.5는 키메라 항체와 유사한 ED50 및 IC50을 입증하였다. A375 세포 및 재조합 단백질에 대한 경쟁 활성은 이러한 중쇄 v1.5가 경쇄 v1.0 및 v1.1과 쌍을 형성한 경우에 감소되었다.
<표 11>
Figure 112015042224767-pct00010
hu07 중쇄 v1.5를 경쇄 최적화를 위해 사용하였다. COS-1 M6 세포에서 hu07 중쇄 및 경쇄의 10종의 조합에 의한 일시적 형질감염을 수행하였다. 중쇄 v1.5를 키메라 경쇄 및 인간화 버전 v1.0-1.7과 쌍 형성시켰다. CM을 수거하고, ELISA에 의한 재조합 hIL-13α2 (rhIL-13α2)에 대한 결합 친화도 및 경쟁 ELISA에 의한 비오티닐화 ch07에 대한 경쟁 활성을 결정하기 위한 실험에 사용하였다. 데이터는 중쇄 v1.5 및 경쇄 v1.7의 조합이 최적임을 나타낸다. 이러한 결과는 정제된 단백질에 의해 확인되었다 (표 12).
<표 12>
Figure 112015042224767-pct00011
실시예 10
ch07, hu07, ch08 및 hu08의 종 교차 반응성
시노몰구스 (시노) 원숭이 IL-13-Rα2 (세포외 도메인 (ECD)) 및 막횡단 도메인 (TM)을 RT-PCR에 의해 시노 원숭이 고환 및 지방 조직으로부터 단리해내었다. 시노 IL-13-Rα2의 아미노산 서열을 서열 27에 제시한다. 동일성은 인간과 시노 IL-13Rα2 사이에 94%였다.
C-말단에서 Flag 태그와 융합된 시노 IL-13-Rα2의 ECD/TM 도메인을 pSMED2 발현 벡터에 클로닝시켰다. HEK293 현탁 세포를 플라스미드 및 pSMED2 벡터를 함유하는 시노-IL-13-Rα2로 (모의 형질감염으로서) 일시적으로 형질감염시켰다. 72시간 후 세포를 수거하고, FACS 분석하였다. ch07, ch08, hu08v1.0/1.0 및 hu08v1.1/1.1을 비롯한 4종의 항체를 시험하였다. R-피코에리트린-표지된 염소 항-인간 또는 마우스 IgG에 의해 세포 표면 시노-IL-13-Rα2 상에의 결합을 검출하였다. 데이터는 ch07, ch08, hu08v1.0/1.0 및 hu08v1.1/1.1이 세포 표면 시노-IL-13-Rα2에 결합할 수 있고, 유사한 결합 친화도 (ED50)를 가짐을 입증한다 (표 13).
<표 13>
Figure 112015042224767-pct00012
직접 ELISA에 의해 마우스 IL-13-Rα2에 대한 hu07 및 hu08의 결합을 평가하였다. 아미노산 수준에서의 인간과 마우스 IL-13-Rα2 사이의 동일성은 대략 64%였다. 재조합 mIL-13-Rα2 또는 hIL-13-Rα2 (양성 대조군으로서)를 96-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 정제된 키메라 ch07 및 ch08을 연속 희석하고, 항원 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 결합된 항체를 HRP 접합된 염소 항-인간 IgGFc 특이적 이차 항체에 의해 검출하였다. mIL-13-Rα2 결합에 대해 어떠한 검출가능한 신호도 존재하지 않은 반면에, 양성 대조군 hIL-13-Rα2에 대한 결합은 강력하였고, 이는 hu07 및 hu08이 뮤린 mIL-13Rα2와 교차 반응하지 않음을 나타낸다.
실시예 11
IL13R-α2를 발현하는 인간 세포주에 대한 결합
IL-13-Rα2 항원을 발현하는 세포주 및 음성 대조군 세포를 96 깊은 웰 플레이트의 웰당 200,000개의 세포 밀도로 플레이팅하고, 빙상에 유지시켰다. 둘베코(Dulbecco)의 포스페이트 완충 염수 (DPBS) 중의 3% 소 혈청 알부민 BSA 중에서 제조된 마우스 모노클로날 항체 mu07 또는 mu08을 플레이트에 10 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 이어서 플레이트를 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 2회 세척하였다. 이차 항체, PE (피코에리트린) 접합된 염소 항-마우스 IgG Fc를 웰에 첨가하였다. 4℃에서의 30분 인큐베이션 후, 이어서 FACS캔™ (BD 바이오사이언시스) 상에서 FACS에 의해 평균 형광 강도를 분석하였다.
표 14의 데이터는 mu07 및 mu08 항체가 다양한 질환 적응증으로부터의 IL-13R-α2 양성 세포주의 다양한 패널에 결합함을 보여준다.
<표 14>
Figure 112015042224767-pct00013
실시예 12
내재화
항체 내재화는 IL-13-Rα2 발현 세포에 세포독성을 위해 ADC를 전달하기 위한 중요한 특징이다. IL-13-Rα2에의 결합 후 항체의 내재화는 mu07 및 mu08 항체 및 양성 대조군 마우스 모노클로날 항체 (ab27414)를 사용하여 4종의 세포주 (PC3MM2, A375, Hs766T, 및 H460R)에 대해 조사하였다. 항체 (10 μg/mL)를 다양한 세포와 함께 1시간 동안 빙상에서 인큐베이션하고, 결합되지 않은 항체를 냉 배지로 2회 세척함으로써 제거하였다. 세포 배양 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포의 샘플을 15분째 및 4시간째에 고정시켰다. 상이한 시점에서의 퍼센트 내재화를 표 15에 제시한다. 데이터는 mu07 및 mu08이 IL-13-Rα2 발현 세포에 용이하게 내재화됨을 보여준다.
<표 15>
Figure 112015042224767-pct00014
실시예 13
화합물 0101 및 3377의 합성
화합물 0101 및 3377을 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 번호 13/670,612에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
화합물 0101 (반응식에서 #54)에 대한 실험
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#54)의 제조
Figure 112015042224767-pct00015
단계 1. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#53)의 합성. 일반적 절차 D에 따라, 디클로로메탄 (20 mL, 0.1 M) 및 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 중의 #32 (2.05 g, 2.83 mmol, 1 eq.), 아민 #19 (2.5 g, 3.4 mmol, 1.2 eq.), HATU (1.29 g, 3.38 mmol, 1.2 eq.) 및 트리에틸아민 (1.57 mL, 11.3 mmol, 4 eq.)으로부터 조 목적 물질을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 헵탄 중 0%에서 55% 아세톤)에 의해 정제하여 #53 (2.42 g, 74%)을 고체로서 생성하였다. LC-MS: m/z 965.7 [M+H+], 987.6 [M+Na+], 체류 시간 = 1.04분; HPLC (프로토콜 A): m/z 965.4 [M+H+], 체류 시간 = 11.344분 (순도 > 97%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 회전이성질체의 혼합물인 것으로 추정됨, 특징적 신호:
Figure 112015042224767-pct00016
단계 2. 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#54)의 합성
일반적 절차 A에 따라, 디클로로메탄 (10 mL, 0.07 M) 중 #53 (701 mg, 0.726 mmol)으로부터 조 목적 물질을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 디클로로메탄 중 0%에서 10% 메탄올)에 의해 정제하였다. 잔류물을 디에틸 에테르 및 헵탄으로 희석하고, 진공 하에 농축시켜 #54 (406 mg, 75%)를 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS: m/z 743.6 [M+H+], 체류 시간 = 0.70분; HPLC (프로토콜 A): m/z 743.4 [M+H+], 체류 시간 = 6.903분, (순도 > 97%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 회전이성질체의 혼합물인 것으로 추정됨, 특징적 신호:
Figure 112015042224767-pct00017
화합물 3377 (반응식에서 #115)에 대한 실험
N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염 (#115)의 제조.
Figure 112015042224767-pct00018
단계 1. 메틸 N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴}(메틸)아미노]-3-메톡시-5-메틸헵타노일}피롤리딘-2-일]-3-메톡시-2-메틸프로파노일}-L-페닐알라니네이트 (#113)의 합성. 질소 하의 디클로로메탄 75 mL 중의 이량체 산#5 (12. 1g, 23.0 mM) 및 #67 (11.5 g, 23.0 mM)의 교반 혼합물에, HATU (10.8 g, 27.6 mM)에 이어 휘니그 염기 (12.1 mL, 69.0 mM)를 첨가하였다. 반응물이 실온에서 15시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 보다 작은 부피로 농축시키고, 에틸 아세테이트로 녹이고, 1 N HCl로 2회 세척하였다. 이어서 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 헵탄 중 0%에서 70% 아세톤)에 의해 정제하여, #113 (12.3 g, 62%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS (프로토콜 Q): m/z 855.3 [M+H+], 877.2 [M+Na+], 체류 시간 = 2.32분; HPLC (프로토콜 R): m/z 855.5 [M+H+], 체류 시간 = 9.596분 (순도 > 97%).
단계 2. 메틸 N-{(2R,3R)-3-메톡시-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-메톡시-5-메틸-4-[메틸(L-발릴)아미노]헵타노일}피롤리딘-2-일]-2-메틸프로파노일}-L-페닐알라니네이트 (#114)의 합성. 일반적 절차 A에 따라, #113 (12 g, 14 mmol, 1 eq.), 디클로로메탄 (60 mL, 0.24 M) 및 디에틸아민 (40 mL, 390 mM)으로부터 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 디클로로메탄 중 0%에서 25% 메탄올)에 의한 정제 후 #114 (5.9 g, 67%)를 백색/연황색 고체로서 합성하였다. LC-MS (프로토콜 Q): m/z 633.0 [M+H+], 체류 시간 = 1.19분. HPLC (프로토콜 A): m/z 633.5 [M+H+], 체류 시간 = 7.142분 (순도 > 98%).
단계 3. N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드-트리플루오로아세트산 염 (#115)의 합성. 디클로로메탄 10 mL 중의 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N,2-디메틸알라닌 (167 mg, 0.493 mM), #114 (260 mg, 0.411 mM), 및 HATU (188 mg, 0.493 mM)의 교반 혼합물에 휘니그 염기 (0.14 mL, 0.82 mM)를 첨가하였다. 반응물이 실온에서 1시간 20분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 감축시켰다. THF (9 mL)를 조 물질에 첨가하고, 이 교반 혼합물에 물 3 mL 중에 용해된 수산화리튬 (49.2 mg, 2.06 mM)을 첨가하였다. 반응물이 실온에서 4시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 농축시킨 후, 중압 역상 C18 크로마토그래피 (구배: 각각의 상에 0.02% TFA를 함유하는 아세토니트릴 중 5%에서 45% 물)에 의해 #115 (218 mg, 64%)를 백색 고체로서 정제하였다. LC-MS (프로토콜 Q): m/z 718.7 [M+H+], 740.6 [M+Na+], 체류 시간 = 1.21분. HPLC (프로토콜 A, 45℃): m /z 718.4 [M+H+], 체류 시간 = 6.903분.
실시예 14
항-IL-13-Rα2 ADC의 제조
화학적 화합물에 결합하는 반응성 부위를 갖는 링커의 섹션을 사용하고 항체에 대해 반응성 부위를 갖는 링커의 또 다른 섹션을 도입하여 본 발명의 ADC를 제조할 수 있다. 한 측면에서, 링커는 항체 단위, 예컨대 항체 상에 존재하는 친핵성 기와 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체 상의 유용한 친핵성 기는 술프히드릴, 히드록실 및 아미노 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체의 친핵성 기의 헤테로원자는 링커 상의 친전자성 기에 대해 반응성이고, 링커에 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
링커는 항체 단위 상에 존재하는 친전자성 기와 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체 상의 친전자성 기는 링커와의 부착에 편리한 부위를 제공한다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 링커의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하고 항체에 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "mc-"는 하기를 지칭한다:
Figure 112015042224767-pct00019
본원에 사용된 "vc-"는 하기를 지칭한다:
Figure 112015042224767-pct00020
항-IL-13-Rα2 ADC는 mAb의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)에 의한 부분적 환원에 이어 환원된 시스테인 잔기와 목적하는 말레이미드 말단 링커-페이로드의 반응을 통해 제조하였다. 특히, hu08은 2.2 몰 과량의 100 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충제) 중의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), pH 7.0 및 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)을 2 h 동안 37℃에서 첨가하는 것을 통해 부분적으로 환원시켰다. 이어서 목적하는 링커-페이로드를 7.0 말레이미도카프로닉 - 발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-아우리스타틴-0101 [vc-0101, 하기 참조]), 또는 7.0 말레이미도카프로닉-아우리스타틴-3377 [mc-3377, 하기 참조]의 링커-페이로드/mAb 몰비로 반응 혼합물에 첨가하고, 추가로 1 h 동안 25℃에서 15% v/v 디메틸아세트아미드 (DMA)의 존재 하에 반응시켰다. 1 h 인큐베이션 기간 후, N-에틸말레이미드 (vc-0101 및 mc-3377에 대해 3배 과량)를 첨가하여 미반응된 티올을 캡핑하고, 15분 동안 반응되게 한 후, 6배 과량의 L-Cys를 첨가하여 임의의 미반응된 링커-페이로드를 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 밤새 4℃에서 포스페이트 완충 염수 (PBS), pH 7.4 중에서 투석시키고, SEC (AKTA 익스플로러, 슈퍼덱스(Superdex) 200 10/30 GL 칼럼)를 통해 정제하였다. 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 및 약물-항체 비 (로딩)를 계산하기 위한 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 ADC를 추가로 특성화하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
mc-3377 (시스테인 잔기를 통해 항체 X에 접합)
Figure 112015042224767-pct00021
vc-0101 (시스테인 잔기를 통해 항체 X에 접합)
Figure 112015042224767-pct00022
실시예 15
시험관내 세포독성 검정
IL-13-Rα2 항원을 발현하는 세포주 및 음성 대조군 세포주를 증가하는 농도의 항-IL-13-Rα2 ADC와 함께 배양하였다. 4일 후, 각각의 배양물의 생존율을 평가하였다. IC50 값을 로지스틱 비-선형 회귀에 의해 계산하고, ng Ab/mL로서 나타내었다. 바람직한 링커 페이로드는 vc-0101 및 mc-3377이었다.
인간화 항-IL-13Rα2 항체 hu08을 표 16에 제공된 바와 같이 다양한 링커-페이로드 조합에 접합시켰다. 항체 약물 접합체를 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 번호 13/670,612에 기재된 방법에 따라 제조하였고, 상응하는 명명법 및 실험상 화학적 합성 도식 번호를 표 16에 제시한다.
<표 16>
Figure 112015042224767-pct00023
또한, hu08의 돌연변이체 버전 (hu08MAC)을 실시예 21에 기재된 바와 같이 그리고 표준 프로토콜에 따라 생성하였다. 화합물 0101을 절단가능한 링커에 접합시켜 하기 구조를 형성하고,
Figure 112015042224767-pct00024
이어서 본원에 기재된 기술에 따라 hu08MAC에 접합시켜 hu08MAC-0101을 형성하였다.
데이터는 6종의 상이한 아우리스타틴 페이로드에 접합된 항-IL-13-Rα2 항체 hu08v1.0/1.0이 시험된 IL-13-Rα2 양성 세포주 둘 다 (PC3MM2 및 A375)에 대해 효과적이며, 1.1 내지 4.9 ng Ab/mL 또는 7.3-32.7 pM 범위의 IC50을 가짐을 입증하였다 (표 17). 또한, hu08MAC-0101은 시험된 IL-13Rα2 양성 세포주 둘 다 (PC3MM2 및 A375)에 대해 효과적이며, 7.9 ng Ab/mL의 IC50을 가졌다. 모든 ADC는 IL-13-Rα2 음성 세포주, H460에 대해서는 활성이 없었고, 비- IL-13-Rα2 결합 대조군 ADC, hIgG8.8-vc-0101 및 hIgG8.8-mc-3377는 시험된 어떠한 세포주에 대해서도 활성이 없었다.
<표 17>
Figure 112015042224767-pct00025
실시예 16
피하 이종이식편 모델
암컷, 무흉선 (누드) 마우스에 PC3MM2 또는 A375 종양 세포를 s.c. 주사하였다. 대략 0.2 내지 0.8 g의 단계적 종양을 가진 마우스 (n = 8 내지 10 마우스/치료군)에 생리 염수 (비히클), 링커-페이로드 vc-0101, vc-6780, vc-3906, mc-8261, mc-0131, mc-6121, mc-3377, MalPeg-8261, MalPeg-0131, MalPeg-6121, 및 MalPeg-3906을 갖는 hu08v1.0/1.0 ADC, 및 vc-0101 또는 mc-3377과 접합된 비-결합 Ab (hIgG8.8)를 2 또는 3 mg Ab/kg의 용량으로 q4d x 4로 정맥내 투여하였다. ADC는 Ab 함량에 기초하여 투여하였다. 종양을 적어도 1주 1회 측정하고, 그의 크기를 mm3 = 0.5 x (종양 너비2) x (종양 길이)로 계산하였다.
표 18에 열거된 생체내 효능 결과는 시험된 다양한 ADC에 의한 항-종양 활성의 범위를 보여준다. 효력의 상대적 순서는 hu08-vc-0101 > hu08-vc-6780 ≥ hu08-mc-0131 > hu08-mc-6121 > hu08-mc-3906 > hu08-MalPeg-0131 >hu08-MalPeg-6121 > hu08-MalPeg-3906 > hu08-mc-8261이었다.
표 19의 데이터는 ADC hu08-vc-0101 및 hu08-mc-3377이 PC3MM2에서 종양 성장을 감소시키는데 3mg/kg에서 효과가 있음을 보여준다. 대형 크기의 종양 (일부 동물에서 >2500 mm3)으로 인해 제15일에 종료된 비히클 대조군과 비교하여, hu08-vc-0101 및 hu07-mc-3377은 제76일에 측정가능한 종양이 없는 동물이 각각 8마리 중 5마리 또는 8마리 중 3마리였다. 비히클 대조군과 유사하게, 비관련 ADC 대조군 3 mg/kg의 hIgG8.8-vc-0101 및 10 mg/kg의 hIgG8.4-mc-3377은 군 내 대형 크기의 종양으로 인해 각각 제15일 및 제19일에 종료시켰다. 이들 결과는 hu08-vc-0101 및 hu07-mc-3377로부터의 유의한 치료 효능 (일부 동물은 질환이 치유됨)이 IL-13-Rα2 표적-매개됨을 입증한다.
<표 18>
Figure 112015042224767-pct00026
<표 19>
Figure 112015042224767-pct00027
표 20a의 데이터는 hu08-vc-0101 및 hu08-mc-3377의 ADC가 A375 세포를 사용한 제2 생체내 이종이식편 모델에서 3 mg/kg에서 효과가 있음을 나타낸다. 비히클 대조군, 및 hIgG8.8-vc-0101 및 hIgG8.8-mc-3377의 비관련 ADC 대조군은 대형 종양 크기로 인해 각각 제19일, 제22일, 제27일에 종료시켰다. 3 mg/kg의 hu08-vc-0101 및 hu08-mc-3377에 의한 치료는 모든 동물에서 종양 퇴행을 유발하였고, 유의한 생존 이점을 제공하였다. hu08-mc-3377로 시험된 모든 동물에서 제19일 -제22일에 어떠한 측정가능한 종양도 관찰되지 않았다. 일부 종양은 재발하기는 하였지만, 제71일에 측정가능한 종양이 없는 동물이 10마리 중 5마리 존재하였다. hu08-vc-0101로 치료된 군을 100일 넘게 모니터링하였고, 8마리의 동물이 제19일-제100일에 어떠한 측정가능한 종양도 갖지 않았다. 이들 결과는 IL-13-Rα2 양성 종양에 대한 hu08-vc-0101 및 hu08-mc-3377의 강력한 항종양 활성을 입증한다.
<표 20a>
Figure 112015042224767-pct00028
표 20b 및 20c의 데이터는 ADC hu08-vc-0101 및 hu08-mc3377이 HEY-C2 난소암 세포주를 사용한 제3 생체내 이종이식편 모델에서 효과가 있음을 나타낸다. 비히클 대조군 및 음성 ADC 대조군 hIgG8.8-vc0101 (3 mg/kg 및 10 mg/kg) 및 hIgG8.8-mc-3377 (10 mg/kg)은 GT 지정으로 표시된 바와 같이 대형 종양 크기로 인해 종료시켰다. hu08-vc-0101 및 hu08-mc-3377에 의한 1, 3 및 10 mg/kg 용량 수준에서의 치료는 용량-의존적 반응을 제공하였다. 3 mg/kg의 hu08-vc-0101로 치료된 9마리의 동물 중 5마리 및 10 mg/kg의 hu08-vc-0101로 치료된 9마리의 동물 중 7마리가 연구 종료일 (제103일)까지 생존하였다. 유사하게, 3 mg/kg의 hu08-mc-3377로 치료된 9마리의 동물 중 5마리 및 10 mg/kg의 hu08-mc-3377로 치료된 9마리의 동물 중 9마리가 연구 종료일 (제103일)까지 생존하였다.
<표 20b>
Figure 112015042224767-pct00029
<표 20c>
Figure 112015042224767-pct00030
실시예 17
부위-특이적 접합을 위한 시스테인 돌연변이체 생성
균질한 약물 로딩을 개선하고 통상의 접합 방법에 의해 종종 관찰되는 변경된 항원-결합 또는 변경된 약동학을 갖는 ADC 하위집단을 회피하기 위해 항체에 대한 링커-페이로드의 부위 특이적 접합을 수행하였다. 하나의 이러한 부위-특이적 접합 방법은 표적 항체의 아미노산 서열 내의 특정 부위에 시스테인 잔기를 도입하는 것이다. 불변 중쇄 및 불변 경쇄 내의 수많은 아미노산 위치가 이전에 확인되었고 (특허 출원 USSN 61/580,169 참조), hu08v1.0/1.0 항체 내의 특정 아미노산 위치에서 시스테인 잔기로 치환되었다. 모든 시스테인 돌연변이는 부위-지정 돌연변이유발 또는 pSMED-hu08v1.0 및 pSEMN3-hu08v1.0에 기초한 중첩 PCR에 의해 구축하였다. 하기는 hu08v1.0/1.0으로부터 유래된 시스테인 돌연변이체 및 각각의 서열 번호의 목록이다 (표 21).
<표 21>
Figure 112015042224767-pct00031
실시예 18
시스테인 돌연변이체의 특성화
hu08v1.0/1.0의 시스테인 돌연변이체를 프리스타일 293 발현 배지 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 내의 일시적으로 형질감염된 HEK293 현탁 세포 배양물 또는 CHO 세포 배양물 안정 풀에서 발현시켰다. 항체를 단백질 A (ProA) 크로마토그래피에 의해 표준 조건 하에 세포 배양 배지로부터 단리하였다. 칼럼 분획을 풀링하고, 30,000 MWCO 막이 장착된 밀리포어(Millipore) 스핀 튜브를 사용하여 농축시켰다. 이어서 단백질을 PBS-CMF, pH 7.2로 평형화된 크기 배제 칼럼 (슈퍼덱스 200) 상에 로딩하였다. 피크 분획을 풀링하고, 30,000 MWCO 막이 장착된 밀리포어 스핀 튜브를 사용하여 농축시키고, 마지막으로 0.22um 필터를 통해 여과하였다. 일시적 발현으로부터의 데이터는 표 22에 제시하고, CHO 세포 안정 풀로부터의 데이터는 표 23에 제시한다. 야생형 hu08v1.0/1.0 및 그의 시스테인 유도체는 ProA 포획 후에 비슷한 최종 수율 및 순도를 가졌고, SEC 후에 최대 99% 순도에 달하였고, 동결 및 해동의 2-3 사이클 후 안정하였다. 이러한 데이터는 시스테인 돌연변이체가 hu08v1.0/1.0과 비교하여 그의 발현 프로파일 및 정제 특성을 유지함을 입증한다.
<표 22>
Figure 112015042224767-pct00032
<표 23>
Figure 112015042224767-pct00033
hu08v1.0/1.0 시스테인 돌연변이체의 결합 특성.
hIL-13-Rα2에 대한 시스테인 돌연변이체의 결합 특성을 표준 ELISA 및 경쟁 ELISA에 의해 평가하였다. 결과는 모든 Cys 돌연변이체가 야생형 hu08v1.0/1.0과 비교하여 유사한 ED50을 가짐을 제시한다 (표 23). 이러한 결론은 비오티닐화 ch08과의 경쟁 ELISA에 의해 확인되었다. 표 24는 모든 Cys 돌연변이체가 야생형 hu08과 유사한 IC50을 가짐을 입증하며, 이는 결합 친화도가 야생형 hu08과 동일함을 나타낸다. ch07은 음성 대조군으로서 사용되었다.
<표 24>
Figure 112015042224767-pct00034
hu08v1.0/1.0 시스테인 돌연변이체의 열 안정성.
항-IL-13-Rα2 시스테인 돌연변이체 mAb의 열 안정성은 오토샘플러가 장착된 마이크로칼의 모세관-DSC 시스템 (매사추세츠주 노샘프턴)을 사용하는 모세관 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 분석하였다. 표준 프로토콜을 사용하였다. 샘플 세포와 참조 세포 사이의 열 용량 차이를 기록하고, 오리진7.0(Origin7.0) 소프트웨어 (오리진랩(OriginLab), 매사추세츠주 노샘프턴)의 3개의 열 전이에 대한 비-2 상태 모델 적합을 사용하여 분석하였다. PBS 완충제를 사용하여 샘플 및 참조 세포 둘 다에서 기준선 온도기록도를 또한 생성하고, 단백질 변성과 연관되지 않은 임의의 시스템 열을 차감하는데 사용하였다. 표 25의 결과는 2종의 단일 및 3종의 이중 시스테인 돌연변이체 항체가 모 hu08v1.0/1.0과 비슷한 Tm을 가짐을 제시한다.
<표 25>
Figure 112015042224767-pct00035
hu08v1.0/1.0 시스테인 돌연변이체 ADC의 열 안정성
야생형 hu08v1.0/1.0 및 5종의 시스테인 돌연변이체를 미국 특허 가출원 61/580,169에 기재된 바와 같이 vc-0101과 접합시켰다. 모든 ADC의 열 안정성을 모세관 시차 주사 열량측정법 (DSC, 상세한 내용은 상기 참조)에 의해 측정하였다. 하기 표 26에 제시된 바와 같이, 야생형 hu08v1.0/1.0 vc-0101 접합체의 Tm1은 그의 네이키드 항체 (표 8 참조)보다 유의하게 더 낮았다 (≥ 5℃). ADC의 Tm2는 네이키드 항체보다 약 1-2℃ 더 낮은 반면에 Tm3은 비슷하였다. hu08v1.0/1.0 시스테인 돌연변이체와 관련하여, vc-0101 접합체의 Tm1, Tm2 및 Tm3은 그의 상응하는 네이키드 항체와 유사하거나 약간 더 낮았다 (≤ 1-2℃) (표 25 참조). 이는 시스테인 돌연변이체가 접합 후 야생형 항체보다 열적으로 더 안정함을 나타낸다.
<표 26>
Figure 112015042224767-pct00036
vc-0101과 접합된 hu08v1.0/1.0 시스테인 돌연변이체의 혈장 및 글루타티온 안정성.
GSH 안정성을 위한 샘플 제조: PBS 중 30μg의 hu08-vc-0101 ADC 또는 hu08-cys 돌연변이체-vc-0101 ADC를 글루타티온 (GSH) 용액과 혼합하여 최종 농도 0.5mM GSH를 생성하였다. 0.5mM GSH 중 ADC 및 대조군 ADC (0mM GSH)를 37℃에서 인큐베이션하고, 0, 3, 및 6일째에 샘플링하였다. 환원을 위해 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)를 사용하였다.
마우스 혈장 안정성을 위한 샘플 제조: PBS 중 90μg ADC 샘플을 20% MPER (포유동물 단백질 추출 시약)로 1:1로 희석시킨 마우스 혈장과 혼합하였다. ADC/혈장 샘플을 37℃에서 인큐베이션하고, 분취액을 0, 1, 및 2일째에 채취하고, 비오티닐화 재조합 hIL-13-Rα2 단백질로 면역-침전시켰다. ADC를 0.15% 포름산 용액으로 용리시키고, 진한 트리스 HCl 완충제로 pH 7.8로 중화시켰다. PNGaseF (펩티드: N-글리코시다제 F)를 첨가하여 샘플을 탈글리코실화하고, TCEP로 환원시켰다.
LC/MS 분석 절차: ADC/혈장 및 ADC/GSH 안정성 샘플의 분취액을 10% 아세토니트릴을 함유하는 0.1% 포름산 용액을 첨가하여 산성화한 다음, 워터 제보(Water Xevo) G2 Q-TOF 질량 분광계와 커플링된 애질런트(Agilent) 1100 모세관 HPLC 상에서 LC/MS 분석하였다. 분석물을 0.1% 포름산을 함유하는 조르박스 포로쉘(Zorbax Poroshell) 300SB C8 칼럼 (0.5 mm X 75 mm, 80℃에서 유지됨) 상에 로딩하고, 20-40% 완충제 B (80% 아세토니트릴, 18% 1-프로판올, 0.1% 포름산을 함유하는 2% 물)의 구배를 사용하여 20μl/분의 유량으로 5.5분에 걸쳐 용리시켰다. 질량 분광측정 검출을 3.3 kV로 설정된 모세관 전압으로 양성, 감수성 모드에서 수행하였다. 매스링스(MassLynx)에서 MaxEnt 1 함수를 사용하여 데이터 분석을 수행하고, 하기 식에 기초한 로딩 계산을 위해 강도를 사용하였다:
로딩 =2*[LC1/(LC0+LC1)]+2*HC1/(HC0+HC1+HC2)]+4*HC2/(HC0+HC1+HC2)].
vc-0101과 접합된 hu08 및 그의 cys 돌연변이체의 ADC (표 26으로부터)에 대해 혈장 및 GSH 안정성을 검정하였다. 결과는 시스테인 돌연변이체로부터 유래된 ADC가 통상의 접합 기술로부터 유래된 ADC보다 더 안정함을 입증한다 (표 27).
<표 27>
Figure 112015042224767-pct00037
실시예 19
Cys 돌연변이체 ADC의 시험관내 세포독성 검정
IL-13-Rα2 항원을 발현하는 세포주 또는 IL-13-Rα2 음성 세포주, H460을 vc-0101 또는 mc-3377과 접합된 증가하는 농도의 hu08v1.0/1.0 시스테인 돌연변이체와 함께 배양하였다. 4일 후, 각각의 배양물의 생존율을 평가하였다. IC50 값을 로지스틱 비-선형 회귀에 의해 계산하고, ng/mL로 나타내었다 (표 28a 및 28b).
<표 28a>
Figure 112015042224767-pct00038
<표 28b>
Figure 112015042224767-pct00039
실시예 20
Cys 돌연변이체 ADC의 피하 이종이식편 모델
암컷, 무흉선 (누드) 마우스에 PC3MM2 종양 세포를 s.c. 주사하였다. 대략 0.2 내지 0.5 g의 단계적 종양을 가진 마우스 (n = 8 내지 10 마우스/치료군)에 1.5 또는 4.5 mg/kg 생리 염수 (비히클) 시스테인 돌연변이체 L443C-vc-0101, K392C/L443C-vc-0101, L443C/K183C-vc-0101, Q347C-vc-0101, 또는 hAB-vc-0101, 또는 3, 6, 및 12 mg/kg L443C-mc-3377, K392C/L443C-mc-3377, L443C/K183C-mc-3377을 단일 용량으로 정맥내 투여하였다. 모든 ADC는 Ab 함량에 기초하여 투여하였다. 종양을 적어도 1주 1회 측정하고, 그의 크기 (mm3 ± SEM)를 mm3 = 0.5 x (종양 너비2) x (종양 길이)로 계산하였다.
표 29의 데이터는 L443C-vc-0101, K392C/L443C-vc-0101, L443C/K183C-vc-0101, 및 hu08-vc-0101이 1.5 mg/kg 및 4.5 mg/kg 둘 다에서 비히클 대조군과 비교하여 모두 PC3MM2 이종이식편의 성장을 억제함을 나타낸다. L443C/K183-vc-0101은 4.5 mg/kg의 용량 수준에서 군의 종료 전 제70일에 가장 긴 모니터링 시간을 갖는 것으로 나타난, 실험에서 시험된 가장 강력한 화합물이었다.
<표 29>
Figure 112015042224767-pct00040
표 30의 데이터는 Q347C-vc-0101 및 Q347C/K183C-vc-0101이 모두 비히클 대조군과 비교하여 1.5 mg/kg 및 4.5 mg/kg 둘 다에서 PC3MM2 이종이식편의 성장을 억제함을 나타낸다. 또한, 데이터는 hu08MAC-0101이 비히클 대조군과 비교하여 1.5 mg/kg에서 PC3MM2 이종이식편의 성장을 억제함을 입증한다. 가장 강력한 화합물은 4.5 mg/kg의 용량 수준에서 제77일의 가장 긴 모니터링 시간을 갖는 것으로 나타난 Q347C/K183C-vc-0101이었다. 이들 결과는 부위-특이적 vc-0101 접합체가 야생형 hu08-vc-0101 접합체와 효능에 있어서 비슷하거나 더 우수함을 제시한다.
<표 30>
Figure 112015042224767-pct00041
표 31 a 및 b의 데이터는 L443C-mc-3377, K392C/L443C-mc-3377, L443C/K183C-mc-3377, 및 hu08-mc-3377이 비히클 대조군과 비교하여 용량-의존적 방식으로 종양 퇴행을 유발함을 나타낸다. L443C/K183C-mc-3377은 다른 화합물과 비교하여 12 mg/kg 용량 수준에서 작은 평균 종양 크기를 나타낸, 실험에서 시험된 가장 강력한 화합물이었다. 또한, L443C/K183C-mc3377로 12 mg/kg으로 치료된 군으로부터 제60일에 측정가능한 종양이 없는 동물이 8마리 중 6마리 존재하였다.
<표 31a>
Figure 112015042224767-pct00042
<표 31b>
Figure 112015042224767-pct00043
실시예 21
MAC 기술에 의한 부위-특이적 접합
항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 다중기능적 항체 접합체 (MAC)를 제조하는 방법은 앞서 기재되어 있다 (WO2012/007896 및 USSN 61/584,675.). 본 발명의 측면은 인간 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 MAC을 제조하는 방법으로서, 여기서 항체는 서열 52에 제시된 바와 같이 LC의 위치 185에서 돌연변이 D185A를 갖고, 서열 49의 LC의 K188의 측쇄에 부착된 링커를 통해 적어도 하나의 약물 모이어티에 공유적으로 접합되고; 상기 방법은 PFP (펜타플루오로페닐) 에스테르를 사용하여 약물 모이어티를 공유적으로 부착시키는 단계 및 이렇게 형성된 이펙터 모이어티-링커-이탈기 복합체를 항체와 약물 모이어티:항체의 약 3.5:1 내지 약 4.5:1의 몰비로 반응시키는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 몰비는 약 3.7:1 내지 약 4.3:1이다. 본원에 기재된 MAC는 hu08MAC-0101로 지정되고, 서열 52의 LC의 돌연변이 D185A; 및 서열 52의 LC의 위치 188의 리신 잔기 (K188)의 측쇄에 접합된 약물 모이어티 0101 (실시예 13)을 포함한다. hu08MAC-0101의 시험관내 활성을 표 17 (실시예 15)에 제시한다. PC3MM2 이종이식편 모델에서의 생체내 활성은 표 30 (실시예 20)에 제시한다.
ATCC PTA-13302 20121106 ATCC PTA-13303 20121106 ATCC PTA-13304 20121106 ATCC PTA-13305 20121106
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. Ma, Dangshe <120> Anti-IL13-Receptor Alpha 2 Antibodies and Antibody-Drug Conjugates <130> PC71968PRV4 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide Sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Thr Thr Ala Leu Ala Thr Arg Phe Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 2 Ser Arg Asn Gly Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ser Ala Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Ala Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 52 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant version of human constant kappa domain <400> 52 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Ala Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 53 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant version of human constant kappa domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is Ala or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa at position 77 is Ala, Gly, Ile, Val, Leu, Arg, Ser, Thr, Gln, Pro, Asn, Met, His or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> Xaa at position 83 is Leu or Val <400> 53 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 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Claims (28)

  1. 서열 2를 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열 3을 포함하는 중쇄 CDR2;
    서열 4를 포함하는 중쇄 CDR3;
    서열 6을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열 7을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열 8을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 IL-13-Rα2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 서열 1의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열 서열 5의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합된 세포독성제를 포함하는 항체-약물 접합체.
  7. 하기 화학식의 항체-약물 접합체.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서:
    (a) Ab는 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    (b) L-D는 링커-약물 모이어티이며, 여기서 L은 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA(vc), 말레이미도카프로일(mc) 및 말레이미드-프로필렌 글리콜(MalPeg)로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고, D는 0101, 3377, 0131, 6121, 3906, 6780 및 8261로 이루어진 군으로부터 선택된 약물이며;
    (c) p는 1 내지 8의 정수이다.
  8. 제7항에 있어서, L-D가 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA(vc)-0101 및 말레이미도카프로일(mc)-3377로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체.
  9. 하기 화학식의 항체-약물 접합체.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서:
    (a) Ab는 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    (b) L-D는 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA(vc)-0101인 링커-약물 모이어티이며;
    (c) p는 1 내지 8의 정수이다.
  10. 하기 화학식의 항체-약물 접합체.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서:
    (a) Ab는 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    (b) L-D는 말레이미도카프로일(mc)-3377인 링커-약물 모이어티이며;
    (c) p는 1 내지 8의 정수이다.
  11. 제6항의 항체-약물 접합체를 포함하는, 환자에서 IL-13-Rα2 발현 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암이 폐암, 결장암, 위암, 췌장암, 난소암, 악성 신경교종 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  13. 제6항에 있어서, IL-13-Rα2 발현 암의 치료에 사용하기 위한 항체-약물 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암이 폐암, 결장암, 위암, 췌장암, 난소암, 악성 신경교종 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체.
  15. 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산.
  16. 제15항의 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 제16항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  19. (a) 말레이미도카프로일-Val-Cit-PABA(vc), 말레이미도카프로일(mc) 및 말레이미드-프로필렌 글리콜(MalPeg)로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 약물에 연결하는 단계;
    (b) 상기 링커-약물 모이어티를, 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포의 세포 배양물로부터 회수된 항체에 접합시키는 단계; 및
    (c) 항체-약물 접합체를 정제하는 단계
    를 포함하는, 하기 화학식의 항-IL-13-Rα2 항체-약물 접합체를 생산하는 방법.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서:
    (a) Ab는 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    (b) L-D는 링커-약물 모이어티이며, 여기서 L은 링커이고 D는 약물이며;
    (c) p는 1 내지 8의 정수이다.
  20. 인간 IL-13-Rα2로의 특이적 결합에 대해 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체.
  21. 암을 가진 대상체로부터의 상기 암의 생물학적 샘플이 인간 IL-13-Rα2를 발현하는지 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 인간 IL-13-Rα2의 발현은 대상체가 반응할 것임을 나타내는 것인, 암을 가진 대상체가 제6항의 항체-약물 접합체에 대해 반응할 것인지 여부를 예측하는 방법.
  22. (a) 암을 가진 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을 제1항 또는 제2항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 인간 IL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 결정하는 단계; 및
    (c) 인간 IL-13-Rα2의 세포 표면 수준을 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서 인간 IL-13-Rα2의 수준을 결정하는 방법.
  23. 삭제
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