CN110272491B - 一种抗pd-1抗体的纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗PD‑1抗体的纯化工艺。具体而言，该纯化工艺包括使用亲和层析、病毒灭活、阴离子膜层析和阳离子交换层析等方法来去除污染物。该工艺可降低生产成本并提高抗体收率。

Description

一种抗PD-1抗体的纯化工艺

技术领域

本发明涉及抗体纯化领域，具体涉及一种抗PD-1抗体的纯化工艺，包括使用亲和层析、病毒灭活、阴离子膜层析和阳离子交换层析等方法来去除污染物。

背景技术

随着生物医药的不断发展，抗体药物显示出越来越重要的地位。对含有目标抗体培养物进行分离纯化是其生产过程中必不可少的步骤，如何通过优化抗体的纯化条件，进一步增加去除污染物的效率，提高抗体的纯度和收率等是目前工业化生产中重要的问题。

抗体纯化的工艺包含多个步骤，目前常用的是亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析等色谱分离方法，每种分离方法中具体参数不同、填料选择的不同都会对纯化效果产生影响。

亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子转移性可逆结合的特性而建立的分离纯化技术。适用于从成分复杂且杂质含量大的混合物中提纯目标物，还可以根据其生物功能将有活性与无活性的目标物分开，具有专一、高效等特性。一般经过亲和层析后的产品可以达到大于80％的纯度，同时还能保证较高的回收率。但是抗体药物不仅需要保证单体纯度，还需要尽可能的减少宿主蛋白和DNA的残留，因此还需要后续的纯化步骤。

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是目前生物化学领域中常用的一种纯化方法。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子通过可逆交换从而达到分离目的的一种层析方法。所谓离子交换，是指溶液中的某一种离子与另一种合在载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。若载体上结合着带正电荷的活性基团，则可交换阴离子，为阴离子交换剂；若载体上结合着带负电荷的活性基团，则可交换阳离子，为阳离子交换剂。离子交换层析目前广泛的应用于各种抗体如利妥昔抗体、曲妥珠单抗和阿达木单抗等的分离纯化。

抗PD-1抗体是当前备受瞩目的一类抗体，全球有多家跨国药企正在开发，施贵宝制药公司的nivolumab和默沙东公司的pembrolizumab已于2014年上市，上市后销售额均突破十亿美元。WO2017054646A公开了一种抗PD-1抗体的序列，该抗PD-1抗体已处于临床Ⅲ期，安全性良好，已报到的临床研究结果已经显示出其具有一定的抗肿瘤作用([J].Journal of Clinical Oncology 35(2017):e15572-e15572)。

由于抗体分子量大、结构复杂，不同抗体之间的差异性也较大，不同抗体与离子交换剂的结合力不仅与其携带的电荷的数目有关，还与抗体分子量的大小及电荷排列等也有一定关系。因此，针对不同的抗体，优化出合适的离子层析纯化工艺，尽可能降低生产成本并提高抗体收率，是目前需要迫切解决的技术问题。

发明内容

本发明提供了一种利用阳离子层析纯化包含抗体和污染物的组合物的方法，包括以下步骤：

1)上样：将所述组合物加载到阳离子交换材料上；

2)清洗：用平衡缓冲液清洗阳离子交换材料；

3)洗脱：用洗脱缓冲液从阳离子交换材料上洗脱下目的抗体；

4)稀释：收集洗脱液，稀释。

在本发明一个实施方案中，其中上样组合物pH为4.5-5.5，优选pH为4.8-5.2，最优选pH为5.0。

在本发明一个实施方案中，其中上样组合物的电导率＜5mS。

在本发明一个实施方案中，其中平衡缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐或磷酸盐，优选柠檬酸。

在本发明一个实施方案中，其中平衡缓冲液的浓度为10-30mM，优选20mM；平衡缓冲液的pH为4.5-5.5，优选4.8-5.2。

在本发明一个实施方案中，其中洗脱缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐或磷酸盐中一种或多种的混合物，浓度为10-30mM，优选20mM；洗脱缓冲液中还含有氯化钾、氯化钠、碳酸钾、乙酸钠、硫酸钾、硫酸钠、柠檬酸盐、磷酸盐中一种或多种盐类，浓度为100-250mM，优选150-200mM，最优选180mM。

在本发明一个实施方案中，其中洗脱缓冲液的电导率为10-25mS，优选18-22mS。

在本发明一个实施方案中，其中洗脱缓冲液的pH为4.5-5.5，优选pH为4.8-5.2，最优选pH为5.0。

在本发明一个实施方案中，其中稀释时在洗脱收集液中加入水或者缓冲液进行稀释，稀释后溶液电导率＜10mS。

本发明所述的纯化方法，其在阳离子交换层析前还包括以下步骤：

a)亲和层析；

b)病毒灭活；

c)阴离子膜层析。

在本发明一个实施方案中，其中步骤a)亲和层析在上样前先用平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液和氯化钠的混合溶液，pH值为7.0-8.0。

在本发明一个实施方案中，其中步骤a)亲和层析的洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液，浓度为40-60nM，pH值为2.0-4.0，优选pH值为2.8-3.2。

在本发明一个实施方案中，其中步骤b)调节亲和层析洗脱液的pH值为3.2-4.0，优选3.6-3.8，进行病毒灭活。

在本发明一个实施方案中，其中步骤c)阴离子膜层析在上样前先用清洗缓冲液清洗，清洗缓冲液为磷酸盐缓冲液和氯化钠的混合溶液，pH值为7.0-8.0。

在本发明一个实施方案中，其中步骤c)阴离子膜层析的平衡缓冲液为柠檬酸缓冲液，浓度为10-30nM，pH值为4.0-6.0。

在本发明一个实施方案中，其中在阳离子交换层析后还包括除病毒过滤和超滤的步骤。

在本发明一个实施方案中，其中抗体选自抗CD20抗体、抗VEGFR抗体和抗PD-1抗体，优选抗PD-1抗体。

在本发明一个实施方案中，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

其中，前面所述的各CDR序列如下表所示：

名称	序列	编号
			HCDR1	SYMMS	SEQID NO：1
HCDR2	TISGGGANTYYPDSVKG	SEQID NO：2
			HCDR3	QLYYFDY	SEQID NO：3
LCDR1	LASQTIGTWLT	SEQID NO：4
			LCDR2	TATSLAD	SEQID NO：5
LCDR3	QQVYSIPWT	SEQID NO：6

优选的，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段为抗PD-1人源化抗体。

优选的，人源化抗体轻链可变区序列为如SEQ ID NO:10所示的序列或其变体；所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为A43S的氨基酸变化。所述人源化抗体重链可变区序列为如SEQ ID NO:9所示的序列或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为G44R的氨基酸变化。

前述的人源化抗体重、轻链的可变区序列如下所示：

重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQID NO：9

轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

SEQID NO：10

优选的，人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列或其变体；所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为A43S的氨基酸变化。所述人源化抗体重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为G44R的氨基酸变化。

在本发明一个实施方案中，人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列，重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列。

前述的人源化抗体重、轻链的序列如下所示：

重链

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQID NO：7

轻链

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQID NO：8

本发明还提供一种组合物，其包含以上任一项方法获得的抗体以及缓冲液。

附图说明：

图1：阳离子Millipore Fractogel EMD SO₃(M)梯度层析图谱

图2：阳离子Millipore Fractogel EMD SO₃(M)梯度层析组分SEC分析

图3：阳离子Millipore Fractogel EMD SO₃(M)阶段层析组分SEC分析

发明详述

一、术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

术语“污染物”是指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)；浸出的蛋白A；核酸；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分。

术语“缓冲液”是指通过其酸-碱成对成分的作用来抵抗pH变化的溶液。Buffers.AGuide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems，Gueffroy，D.，Ed.Calbiochem Corporation(1975)中记载了取决于例如期望的缓冲液pH而可采用的多种缓冲液。

术语“平衡缓冲液”在本发明中是指用于在将包含感兴趣抗体和一种或多种污染物的组合物加载到离子交换材料上之前平衡离子交换材料的缓冲液。

术语“清洗缓冲液”在本发明中是指在加载组合物之后且在洗脱感兴趣蛋白质之前流过离子交换材料的缓冲液。清洗缓冲液可用于自离子交换材料清除一种或多种污染物，基本上不洗脱期望抗体产物。

术语“电导率”是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子运输来流动，随着水溶液中存在的离子的量越来越多，溶液会具有更高的电导率。电导率的度量的基本单位是西门子(或欧姆)、欧姆(mS/cm)，而且可以使用电导率计来测量，诸如各种型号的Orion电导率计。因为电解电导率是溶液中的离子携带电流的能力，所以溶液的电导率可以通过改变其中的离子浓度来改变。例如可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氧化纳、乙酸钠、或氧化钾)的浓度来实现期望的电导率。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的结合特异性。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本发明一个实施方案中，所述的PD-1人源化抗体的CDR序列选自SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6。

术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人PD-1结合的Fv片段sFv片段；包含本发明所述抗体的选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:6中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与PD-1结合”，指能与人PD-1相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。

实施例1、抗PD-1抗体细胞培养深层过滤液经亲和层析捕获并初步提纯

本实施例中抗PD-1抗体重、轻链的序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，亲和层析步骤如下：

步骤一、将亲和层析填料Prosep Ultra Plus(Millipore)装填入柱。用消毒液(150mM磷酸)冲洗，静置。再用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液+1M氯化纳pH7.4±0.1)冲洗，收集取过柱液测内毒素，限度小于0.25EU/mL，检测合格方可上样，若不合格需重新消毒及平衡。

步骤二、分3个循环上样，确保载量≤40g/L。

步骤三、用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液+1M氯化纳pH7.4±0.1)冲洗。

步骤四、用洗杂缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液pH7.4±0.1)冲洗。

步骤五、用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸缓冲液pH3.0±0.1)洗脱目的蛋白。

步骤六、亲和层析收集液取样检测蛋白浓度，计算本步回收率并送样QC检测SEC-HPLC纯度。结果如下表：

表1

上样量(mg)	回收量(mg)	回收率(％)	SEC-HPLC纯度(％)
				1800	1710	95	91.6

结论：细胞培养液按照40mg/ml的载量进行Millipore PUP亲和层析，回收率为95％，SEC-HPLC纯度91.6％。

实施例2、低pH病毒灭活

收集洗脱液，为了确定病毒灭活的pH，将收集液分为三组，第二、三组经过1.5小时低pH孵育后用1.0M Tris调pH至5.0，第一组未进行低pH孵育直接调节pH至5.0的样品进行SEC检测，结果如下表：

表2

由表中结果可以看出抗PD-1抗体在较低pH条件下SEC不稳定，综合考虑pH及处理时间对病毒灭活的效果，最终用1M Tris或1M柠檬酸调节亲和层析收集液pH 3.6-3.8，18-26℃条件下静置90-95min进行病毒灭活。灭活结束后，加入1M Tris调节样品pH至5.0±0.1，除病毒结果如下表：

表3

结论：实验结果表明，两种病毒降低量(log10)均大于4logs，表示该步骤灭活病毒有效。

实施例3、阴离子膜层析

亲和层析收集液经低pH病毒灭活、吸附深层过滤后，进行阴离子膜层析，步骤如下：

步骤一、阴离子层析膜为Sartobind Q(赛多利斯)层析膜，消毒液(1M NaOH)冲洗。

步骤二、用清洗缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液+1M氯化纳，pH7.4±0.1)冲洗。

步骤三、用平衡缓冲液(20mM柠檬酸缓冲液，pH5.0±0.1)冲洗，然后取过膜液测内毒素，限度小于0.25EU/mL，检测合格方可上样，若不合格需重新消毒及平衡。

步骤四、确认上样液pH5.0±0.1，电导＜5mS/cm，进行上样，根据UV280收集流穿液。

步骤五、上样结束后，用平衡缓冲液顶洗，根据UV280继续收集流穿液，送样QC检测HCP去除效果。结果如下表：

表4

	浓度(mg/ml)	SEC(％)	HCP(ppm)	HCP去除(％)
					上样前	12.2	90.3	1247	N/A
流穿液	12.1	90.3	664	46.7

结论：亲和层析样品经阴离子膜流穿模式层析后纯度无明显变化，HCP去除率达到46.7％。

实施例4、阳离子层析

吸附深层过滤收集液经阴离子膜层析后，需进行阳离子层析进一步提纯，步骤如下：

步骤一、将阳离子层析填料Fractogel EMD SO₃ ^-(M)(Millipore)装填入柱。用消毒液(1M NaOH)冲洗，静置。再用平衡缓冲液(20mM柠檬酸缓冲液，pH5.0±0.1)冲洗，收集取过柱液测内毒素，限度小于0.25EU/mL，检测合格方可上样，若不合格需重新消毒及平衡。

步骤二、确认上样液pH5.0±0.1，电导＜5mS，进行上样。

步骤三、用平衡缓冲液(20mM柠檬酸缓冲液，pH5.0±0.1)冲洗。

步骤四、用洗脱缓冲液20mM柠檬酸缓冲液，pH 5.0和20mM柠檬酸缓冲液+200mMNaCl，pH5.0梯度洗脱目的蛋白，分管收集样品进行SEC检测，层析图谱如图1，收集样品各组分SEC结果如图2。

由图中可以看出在20mM柠檬酸缓冲液，pH5.0的体系下，盐浓度达到180mM NaCl时抗PD-1抗体的SEC达到最高97.5％，同时在出峰UV280上升至1000mAU前含有杂质，工艺上采取舍弃该部分。固定洗脱缓冲液为20mM柠檬酸缓冲液+180mMNaCl，pH5.0的。收集样品各组分SEC结果如图3。

实施例5、抗PD-1抗体的稳定性

通过阳离子层析填料Fractogel EMD SO₃ ^-(M)(Millipore)层析后的抗PD-1抗体，纯度得到显著提升。纯化后样品处于pH5.0，电导20ms/cm左右体系内，在短时间内目测形成纤维状沉淀，经0.22μm过滤后仍有沉淀析出的现象。

由于阳离子层析后得到的PD-1抗体会产生纤维状沉淀，设计实验检测抗PD-1抗体的盐稳定性，进行如下操作：将亲和洗脱样品，pH5.0，用2M NaCl滴定，用电导率仪检测电导并记录，灯检样品澄清度，结果见下表：

表5

样品	电导(ms/cm)	澄清度
			初始样品	3.81	澄清
1	7.05	少量纤维状沉淀
			2	9.62	纤维状沉淀
3	12.35	纤维状沉淀
			4	15.23	纤维状沉淀
5	19.50	纤维状沉淀
			6	24.6	纤维状沉淀
7	28.8	纤维状沉淀

由表5可以看出，抗PD-1抗体在pH5.0，初始样品低盐(电导3.81ms/cm)条件下稳定性较好，随着盐浓度的增加，电导升高，逐渐出现纤维状沉淀，并随着盐浓度的增高并未表现出纤维状沉淀复溶的现象，证明抗PD-1抗体的盐稳定性较弱。采取了将阳离子层析过程中洗脱样品直接接入预先准备的注射用水中进行稀释，降低体系内盐浓度进而达到控制纤维状沉淀产生的作用，注射用水按不同比例稀释样品的数据如表6，由表中可以看出，电导率≤10ms/cm时，样品基本不产生沉淀。

表6

样品编号	注射用水(ml)	样品(ml)	电导(ms/cm)	澄清度
					A1	1	1	9.65	少量纤维状沉淀
A2	2	1	6.48	少量纤维状沉淀
					A3	3	1	4.77	澄清
A4	4	1	4.08	澄清
					A5	5	1	3.23	澄清

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

上海恒瑞医药有限公司

苏州盛迪亚生物医药有限公司

<120> 一种抗PD-1抗体的纯化工艺

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 1

Ser Tyr Met Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 2

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 3

Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 4

Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 5

Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 6

Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(443)

<223> 重链序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(214)

<223> 轻链序列

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(116)

<223> 重链可变区

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 轻链可变区

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims (24)

1.一种利用阳离子层析纯化包含抗体和污染物的组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）上样：将所述组合物加载到阳离子交换材料上；

2）清洗：用平衡缓冲液清洗阳离子交换材料；

3）洗脱：用洗脱缓冲液从阳离子交换材料上洗脱下目的抗体，其中洗脱缓冲液的电导率为18-22mS/cm；

4）稀释：收集洗脱液，使用注射用水稀释，稀释后溶液电导率＜10mS/cm；

其中所述抗体是抗PD-1人源化抗体，并且其轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列，其重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中上样组合物pH为4.5-5.5。

3.根据权利要求2所述的方法，其中上样组合物pH为4.8-5.2。

4.根据权利要求2所述的方法，其中上样组合物pH为5.0。

5.根据权利要求1所述的方法，其中上样组合物的电导率＜5mS/cm。

6.根据权利要求1所述的方法，其中平衡缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐或磷酸盐。

7.根据权利要求6所述的方法，其中平衡缓冲液中的缓冲物质为柠檬酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中平衡缓冲液的浓度为10-30mM，平衡缓冲液的pH为4.5-5.5。

9.根据权利要求8所述的方法，其中平衡缓冲液的浓度为20mM；平衡缓冲液的pH为4.8-5.2。

10.根据权利要求1所述的方法，其中洗脱缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐或磷酸盐中一种或多种的混合物，浓度为10-30mM；洗脱缓冲液中还含有氯化钾、氯化钠、碳酸钾、乙酸钠、硫酸钾、硫酸钠中一种或多种盐类，浓度为100-250mM。

11.根据权利要求10所述的方法，其中洗脱缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐或磷酸盐中一种或多种的混合物，浓度为20mM；洗脱缓冲液中还含有氯化钾、氯化钠、碳酸钾、乙酸钠、硫酸钾、硫酸钠中一种或多种盐类，浓度为150-200mM。

12.根据权利要求10所述的方法，其中洗脱缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐或磷酸盐中一种或多种的混合物，浓度为20mM；洗脱缓冲液中还含有氯化钾、氯化钠、碳酸钾、乙酸钠、硫酸钾、硫酸钠中一种或多种盐类，浓度为180 mM。

13.根据权利要求10-12任一项所述的方法，其中洗脱缓冲液的pH为4.5-5.5。

14.根据权利要求13所述的方法，其中洗脱缓冲液的pH为4.8-5.2。

15.根据权利要求13所述的方法，其中洗脱缓冲液的pH为5.0。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阳离子交换层析前还包括以下步骤：

a）亲和层析；

b）病毒灭活；

c）阴离子膜层析。

17.根据权利要求16所述方法，其中步骤a）亲和层析在上样前先用平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液和氯化钠的混合溶液，pH值为7.0-8.0。

18.根据权利要求16所述的方法，其中步骤a）亲和层析的洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液，浓度为40-60nM，pH值为2.0-4.0。

19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤a）亲和层析的洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液，浓度为40-60nM，pH值为2.8-3.2。

20.根据权利要求16所述的方法，其中步骤b）调节亲和层析洗脱液的pH值为3.2-4.0，进行病毒灭活。

21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤b）调节亲和层析洗脱液的pH值为3.6-3.8，进行病毒灭活。

22.根据权利要求16所述的方法，其中步骤c）阴离子膜层析在上样前先用清洗缓冲液清洗，清洗缓冲液为磷酸盐缓冲液和氯化钠的混合溶液，pH值为7.0-8.0。

23.根据权利要求16所述的方法，其中步骤c）阴离子膜层析的平衡缓冲液为柠檬酸缓冲液，浓度为10-30nM，pH值为4.0-6.0。

24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阳离子交换层析后还包括除病毒过滤和超滤的步骤。

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