CN104974253A - 抗ctla-4/pd-1双特异性抗体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体、其制备方法及应用。本发明的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体既能与CTLA-4结合，还能与PD-1相结合，其通过阻断CTLA-4和/或PD-1信号传导途径，有效地增强免疫反应，从而可能具有良好的增强抗肿瘤免疫反应的效果。

Description

抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类双特异性抗体和其制备方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

Ｔ细胞的活化启动和效应发挥的过程中至少需要两种信号存在，第一种信号是抗原特异性的，由主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）以及与其结合的抗原肽被T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别并结合后，由TCR复合物向T细胞内传导激活信号；第二种激活信号是抗原非特异性的，是由抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）和T细胞上多种辅助分子之间的配对和相互作用而提供的，能够提供第二种激活信号的一类T细胞膜蛋白又被称为共刺激分子，其中CD28是一种表达在T细胞表面的重要共刺激分子，在T细胞活化中发挥重要作用。当TCR与MHC-抗原肽复合物结合后，如果共刺激分子缺乏，将导致T细胞对特异的抗原表现为无能状态，不仅不能被激活，而且对抗原特异性的活化信号均不应答；如果共刺激分子如CD28与B7分子结合并激活后，可在多个水平上介导Ｔ细胞的活化。活化的Ｔ细胞可以自分泌和旁分泌的形式产生白细胞介素2（interleukin2；IL-2），作用于细胞表面的受体IL2R，进一步刺激Ｔ细胞的增殖，从而为发挥效应功能做好准备。

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）又名CD152，属于白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体（B7-1/CD80，B7-2/CD86），而CTLA-4与B7分子结合后能负下调T细胞的反应活性，参与免疫反应的负向调节，因此是一种免疫共抑制分子。APC上的B7家族分子和T细胞上的配基CTLA4的结合对T细胞的活动起着重要的负向调节作用，阻断此信号通路，可以促进Ｔ细胞的活化。CTLA-4与B7的亲和力显著高于CD28，可以和CD28竞争结合APC表面的B7分子，阻断CD28与B7的共刺激信号传导，抑制T细胞抗原识别第二信号的产生，从而发挥免疫抑制效应。通常情况下，CTLA-4合成后储存于T细胞胞质中的囊泡里，激活信号能够诱导CTLA-4转位到细胞膜上，膜表面的CTLA-4从而与CD28竞争结合相应配体并发挥抑制作用，这是指一种正常的负反馈机制。

大量研究表明，肿瘤在形成过程中，可通过多重机制，逃避免疫***的监视，我们将这一过程称之为肿瘤组织的免疫逃逸或免疫编辑。肿瘤细胞可通过以下途径逃逃脱免疫***的攻击：①肿瘤抗原的抗原调变导致免疫原性降低；②肿瘤细胞表面MHC分子表达缺陷或表达量降低，如提呈抗原肽处理与递呈相关基因（如LMP/TAP基因）的缺陷；③肿瘤细胞通过非经典的人类白细胞抗原（humanleukocyte antigen，HLA）等分子（如HLA-G和HLA-E）抑制NK细胞和部分细胞毒性T细胞的杀伤作用；④肿瘤细胞可自分泌或旁分泌一些免疫抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β等，这些因子可以削弱免疫***对肿瘤的杀伤作用，也可激活调节性T细胞的免疫抑制作用；⑤肿瘤细胞共刺激分子配体及黏附分子表达下降，或肿瘤细胞高表达共抑制分子的配体；⑥肿瘤细胞释放出肿瘤抗原分子，与抗体结合成复合物，通过抗体的Fc段与淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞的Fc受体结合，从而封闭ADCC效应；⑦肿瘤细胞分泌可溶性活化受体的配体，如NK细胞活化受体的配体，下调免疫细胞表面活化受体的表达，使免疫效应细胞功能下调；⑧肿瘤死亡受体的脱落；⑨T细胞肿瘤特异性抗原的耐受（由宿主抗原提呈细胞、髓样细胞或调节性T细胞造成）。T细胞在肿瘤免疫的过程中处于核心地位，如果能调动体内的杀伤武器，将是非常有效且安全的治疗策略。肿瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗的过程中早期肿瘤特异性的CD8阳性T细胞是激活的，随着肿瘤生长到后期失去了杀伤的功能，肿瘤产生抵抗力。总而言之，既要在体内激活原有自身的免疫***反应，还要让已经调动的反应持续增强才是免疫***的最好策略。

T细胞的活化除了需要通过APC递呈MHC-抗原肽给抗原特异性T细胞提供第一信号外，还需要一系列协同刺激分子提供第二信号，进而才能使T细胞达到生理活化阈值产生正常的免疫应答，这在理论上更好地解释了免疫***对自身和非自身抗原产生免疫学应答时精确而微妙的调节机制。如果缺少共刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无反应性或特异性免疫耐受甚至进入凋亡，因此，正性和负性协同刺激信号的调节及两者之间的平衡在极体免疫应答的整个过程中起着重要的调节作用。

PD-1（programmed death-1）最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体。目前，PD-1的配体被证实有两个，分别是PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。PD-L1（B7-H1）属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用；该分子具有宽广的组织表达谱，广泛表达于抗原提呈细胞（APCs）、活化T/B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上皮细胞。PD-L1在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，且许多癌组织较正常组织中的PD-L1表达水平明显上调。应用免疫组织化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、***、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤等人类肿瘤组织中检测到PD-L1蛋白的表达，且PD-L1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关。许多研究均表明PD-L1与肿瘤的免疫逃逸机制相关。研究表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的APC表达的PD-L1均可经PD-1/PD-L1信号通路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应答。大量实验证明，阻断PD-1/PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增值，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，有效抑制肿瘤生长。因此，干预PD-1/PD-L1信号有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。

在抗肿瘤免疫中，CD8阳性的细胞毒性T细胞的免疫应答发挥核心作用，其基本过程可分为抗原识别、细胞活化/增殖/分化和效应杀伤阶段。其中共抑制分子CTLA-4和PD-1分别在T细胞活化/增殖/分化阶段和效应杀伤阶段发挥重要的负向免疫调节作用。正常情况下，这两种分子在自体免疫耐受的维持中起重要作用，能防止自身免疫病的发生；然而在肿瘤患者体内，这两种分子可能起着抑制抗肿瘤免疫的作用。临床研究发现，抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合应用比任一抗体单独使用具有更好的抗肿瘤活性。因此，研究出能同时阻断CTLA-4和PD-1免疫抑制功能的双特异性抗体，从而更加有效地增强抗肿瘤免疫，这类高效抗肿瘤药物一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个既能与CTLA-4结合，还能与PD-1相结合的双特异性抗体,即本发明所述的“抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体”，从而完成了本发明。

本发明公开了：

1.一种抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其既能与CTLA-4结合，还能与PD-1相结合。

2.上述1所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其包含抗CTLA-4单克隆抗体可变区和抗PD-1单克隆抗体可变区。

3.上述1或2所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其轻链氨基酸序列如SEQID NO:4所示，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

4.一种分离的核酸分子，其编码上述1-3任一所述的双特异性抗体，优选地，所述核酸分子其轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示，重链核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

5.一种表达载体，含有上述4或5任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，优选地，所述载体可以为pCHO1.0、pBudCE4.1或pCGS3载体，最优选为pCHO1.0载体。

6.一种宿主细胞，其含有上述5所述的载体。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选地，所述宿主细胞为COS、CHO、NS0；最优选地，所述宿主细胞为或GS^-/-细胞。

7.一种制备上述1～3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的方法，该方法包括：

a)在表达条件下，培养上述6所述的宿主细胞，表达抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体；

b)分离或纯化a)所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体。

优选地，所述制备方法包括以下步骤：

a)构建抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的重链融合基因和轻链融合基因；

b)将上述a)融合基因克隆到表达载体pCHO1.0，构建表达载体pCHO1.0（DVD-CTLA-4/PD-1）；

c）将上述b)表达载体pCHO1.0（DVD-CTLA-4/PD-1）转染CHO细胞，筛选，进行亚克隆，将筛选得到的高表达克隆进行扩大培养；

d）分离或纯化c)所获得的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体。

8.一种组合物，含有上述1～3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体和药学上可接受的载体。

9.上述1～3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体或上述8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.上述9所述的用途，其还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

任何编码抗CTLA-4抗体可变区和抗PD-1抗体可变区的合适的DNA都适合于本发明。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pCHO1.0、pBudCE4.1或pCGS3之一，优选pCHO1.0，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养***可用于本发明的融合蛋白的表达，COS、CHO、NS0、sf9及sf21等动物细胞均可适用于本发明，如可以是或GS^-/-细胞。

可用的宿主细胞也可为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5α、BL21（DE3）和TG1之一。

本发明中公开的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的制备方法为，在表达条件下培养上述宿主细胞，从而表达双特异性抗体，进而分离或纯化所述的双特异性抗体。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上显示为单一条带。

本发明公开的上述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体是通过以下方法得到的：全人源抗CTLA-4单抗的全长基因（轻链和重链）序列（参见专利US8318916B2所公布的氨基酸序列，轻链可变区SEQ ID NO7，重链可变区SEQ ID NO17，轻链恒定区SEQ ID NO39，重链恒定区SEQ ID NO40）由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成，全人源抗PD-1单抗的全长基因（轻链和重链）序列（参见专利US20130133091A1中公开的氨基酸序列，轻链可变区SEQ ID NO8，重链可变区SEQ ID NO3，轻链和重链恒定区上述US8318916B2所述SEQ IDNO39-40相同）也由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成。抗CTLA-4单抗的重链和轻链可变区分别与抗PD-1单抗的重链和轻链基因以重叠PCR法重组后克隆到pCHO1.0载体中构建成真核表达载体pCHO1.0（DVD-CTLA-4/PD-1），上述质粒用脂质体法转染CHO-S细胞，并用含适当浓度的甲氨蝶呤（MTX）和嘌呤霉素的选择培养基筛选稳定表达抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的细胞克隆。利用Protein A柱亲和层析法从细胞培养物上清中纯化抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体。所得抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体可变区包括上述抗CTLA-4单抗可变区和上述抗PD-1单抗可变区，其恒定区为上述抗PD-1单抗恒定区，抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

本发明的申请人对上述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体进行亲和力检测、混合淋巴细胞增殖实验、蛋白药物代谢动力学实验，实验结果表明，本发明公开的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体既可以与CTLA-4或PD-1之一结合，也可以同时与CTLA-4和PD-1结合，阻断其信号传导功能。此外，此抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体具有优良的药代动力学性质。实验表明，在相等剂量下，抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体具有比单独应用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体更好的抗肿瘤效果，达到了本发明的目的。本发明公开上述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的融合受体氨基酸核心序列的构象完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。一般情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下稳定保存至少一年；对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。对于本发明公开的上述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）、poloxamer（如poloxamer188）、Triton、十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂硫酸钠、十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸、Pluronics、MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的颗粒化趋势最小；溶液稳定剂可以为糖类、氨基酸类或醇类，其中糖类可以是还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态；等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括但不限于：腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、***、***、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经***的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌***肿瘤、胃肠道胰腺内分泌***肿瘤，生殖***肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或***的药物，可以延迟伴随肿瘤生长相关症状的发展和/或降低这些症状的严重程度，它还能进一步减轻已存在的与肿瘤生长相伴随的症状并防止其他症状的出现，还减少或防止转移。

本发明中抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。

本发明公开的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药以达到更加有效***的目的，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物：如（1）作用于核酸化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝脲类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂（Cisplatin）、卡铂（Carboplatin）和草酸铂（Oxaliplatin）等；抗生素类如阿霉素（Adriamycin/Doxorubicin）、放线菌素D（Dactinomycin D）、柔红霉素（Daunorubicin）、表阿霉素（Epirubicin）、阿克拉霉素（Aclarubicin）、光辉霉素（Mithramycin）等；（2）影响核酸代谢的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和培美曲塞（Pemetrexed）等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5氟尿嘧啶、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（Hydroxycarbamide）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Cytosine arabinoside）和吉西他滨（Gemcitabine）等；（3）作用于微管蛋白的药物：多西他赛（Docetaxel）、长春花碱（Vincristine）、长春瑞滨（Vinorelbine）、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱等；2、激素类药物：抗***如他莫昔芬（Tamoxifen）、屈洛昔芬（Droloxifene）、依西美坦（Exemestane）等；芳香化酶抑制剂如氨鲁米特（Aminoglutethimide）、福美司坦（Formestane）、来曲唑（Letrozle）、阿那曲唑（Anastrozole）等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂类药物：此类药物主要通过调节机体免疫功能以到抗肿瘤的效果，如干扰素类（Interferon）；白细胞介素-2（Interleukin-2）；胸腺肽类（Thymosins）等；4、单克隆抗体类药物：曲妥昔单抗（Trastuzumab）、利妥昔单抗（Rituximab）、西妥昔单抗（Cetuximab）、贝伐单抗（Bevacizumab）等；5、其他类抗肿瘤药物：包括一些目前机制尚不明确、有待进一步研究的药物等。本发明公开的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

附图说明

图1.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体与PD-1结合力实验；

图2.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体与CTLA-4结合力实验；

图3.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的混合淋巴细胞增殖实验

图4.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体血药浓度时间曲线

具体实施方式

以下实施例、实验例是对本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对常规方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.（1989）MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。

实施例1.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体表达载体的构建

全人源抗CTLA-4单抗的全长基因（轻链和重链）序列（参见专利US8318916B2所公开的氨基酸序列，轻链可变区SEQ ID NO7，重链可变区SEQ ID NO17，轻链恒定区SEQ ID NO39，重链恒定区SEQ ID NO40）由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成，全人源抗PD-1单抗的全长基因（轻链和重链）序列（参见专利US20130133091A1中公开的氨基酸序列，轻链可变区SEQ ID NO8，重链可变区SEQ ID NO3，轻链和重链恒定区和上述US8318916B2所述SEQ IDNO39-40相同）也由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成。根据DNA序列分别设计引物用聚合酶链式反应扩增抗CTLA-4单抗的轻链和重连可变区，以及抗PD-1单抗的轻链和重连；设计引物时引入一定长度的互补重叠区，以便用重组PCR法将抗CTLA-4单抗的可变区基因连接到抗PD-1单抗的轻链和重链基因片段上；互补重叠区编码外源的链接区（氨基酸序列为：GGGGSGGGGS），用以使相邻的两个可变区结构域有一定的空间活动自由度。

PCR均采用高保真DNA聚合酶（购自Takara公司的HS DNAPolymerase）。扩增抗PD-1单抗轻重链全长基因以及抗CTLA-4轻重链可变区片段的反应条件按照DNA聚合酶生产商说明书合理设置：95℃20秒；55℃10秒，72℃1分/kb；30个循环。以上PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后用于重组PCR的模板，重组PCR反应条件为：95℃20秒；55℃10秒，72℃2分；6个循环后再加入相应的引物；95℃20秒；55℃10秒，72℃1分/kb。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pCHO1.0载体（购自Life Technologies公司）中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别显示了抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体重链的核苷酸和氨基酸序列；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体轻链的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pCHO1.0（DVD-CTLA-4/PD-1）。

实施例2. 抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中的表达

于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度5×105的CHO-S细胞，第二天细胞密度增至1×106且细胞活率高于95%时进行转染：将50μl浓度为1μg/μl的编码抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体轻重链的质粒pCHO1.0（DVD-CTLA-4/PD-1）稀释到1.45mlOptiPRO^TMSFM（购自Life Technologies公司，以下同）中，轻轻混匀；将50μl转染试剂FreeStyle^TMMAX（购自Life Technologies公司，以下同）稀释到1.45mlOptiPRO^TMSFM中，轻轻混匀；立即将稀释后的FreeStyle^TMMAX溶液慢慢加入到稀释后的DNA溶液中，加入时枪头浸于液面之下并慢慢排出液体；立即上下颠倒数次使溶液混匀，室温下孵育10分钟左右以使DNA-脂质体复合物形成；将3mlDNA-FreeStyle^TMMAX复合物逐滴加入到上述培养细胞的摇瓶中，边加边轻摇培养瓶；转染后的细胞培养物置于37℃、8% CO2、转速130rpm的细胞培养摇床上培养。转染48小时后，离心收集细胞，将培养液换成含有20μg/ml嘌呤霉素（Puromycin）和200nM甲氨喋呤（MTX）的选择培养基筛选稳定转染的抗性克隆；大约两周之后，待细胞活率和密度恢复时，离心收集细胞，将培养液换成含有50μg/ml嘌呤霉素（Puromycin）和1000nM甲氨喋呤（MTX）的选择培养基；大约一周之后，待细胞活率和密度恢复时，离心收集细胞，将培养液换成不含抗生素的培养基，置于37℃、8%CO2、转速130rpm的摇床上悬浮培养10天，期间在第3、5、7、9天以4g/L的终浓度补加葡萄糖；10天后，细胞培养物经低速离心（300g）5分钟去除大部分细胞以及细胞残片后，再经高速离心（10000g）10分钟除去仍然悬浮的固形物，然后抽滤（滤膜孔径0。45μm），最后用Protein A亲和层析柱（购自GE公司）从获得的澄清液体中分离纯化抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体。纯化产物经测序，和SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4序列一致，将纯化融合受体用PBS进行透析，最后以人免疫球蛋白为标准品用BCA（Bicinchoninic acid）法进行定量。

实施例3.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体亲和力检测实验-ELISA法

实验步骤：重组蛋白CTLA-4（购自R&D公司，以下同）和PD-1（购自R&D公司，以下同）用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释成2μg/ml，96孔酶标板每孔添加100μl上述稀释后的蛋白溶液，4℃于湿盒内过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟；将不同稀释度的抗CTLA-4抗体（根据实施例1中所述抗CTLA-4抗体序列并按照实施例1和实施例2方法制备得到，以下同）、抗PD-1抗体（根据实施例1中所述抗PD-1抗体序列并按照实施例1和实施例2方法制备得到，以下同）以及抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体100μl加于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤，加辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG1抗体（Fc特异，购自Sigma公司）于各反应孔中，37℃孵育1小时，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml显色，37℃放置10～30分钟；于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05ml终止反应；置酶标仪上（SpectraMax i3Multi-Mode Platform，美国BIO-TEK公司）测定450nm波长处测定吸光值。

实验结果如图1和图2所示。结果表明：抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体既可结合CTLA-4，也可结合PD-1，且与抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体相比，抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体对两种靶点的结合力并没有因结构的改造而减弱。

实施例4.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体刺激混合淋巴细胞反应的实验

混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLC）是将二个同种无关个体的淋巴细胞混合在一起培养，由于二者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同，可互相刺激，导致对方的淋巴细胞***、增殖和分化，最终产生的淋巴母细胞表现为细胞体积增大，核内DNA和胞浆内RNA增加等。可通过形态学方法计数分化的淋巴细胞百分数，也可通过测定激活的淋巴细胞摄取DNA合成的前体³H标记的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）掺入量的多少来判定。同位素标记法较为客观，重复性好且结果较准确。淋巴细胞增殖反应强度与双方组织相容性抗原的差异程度成正比。两者相容性愈差，反应愈强烈。本法有双向和单向MLR之分，在双向MLR中，双方的淋巴细胞互相刺激而增生、分化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞又是反应细胞；在单向MLC中，将一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理，使其丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应，此时的MLR只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解不同个体淋巴细胞刺激强度与增殖反应强度。人外周血单核/淋巴细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）用密度梯度离心法制备：取两个不同个体A和B的肝素抗凝外周血，用人外周血淋巴细胞分离液（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）分离出单核细胞，洗涤后用RPMI-1640培养液（内含经56℃、30min灭活的小牛血清10%，适宜浓度的青霉素、链霉素，用饱和NaHCO₃溶液调pH至7.2～7.4）调整细胞密度为1×10⁶/ml。

MLC按如下实验步骤实施：1、将A、B二个体的淋巴细胞悬液分别做记号，以个体A的作为MLR的反应细胞，个体B的作为MLR的刺激细胞；2、刺激细胞处理：取个体B的淋巴细胞悬液0.9ml，加人400μg/mL的丝裂霉素C（mitomycin C）0.1ml，使其终浓度为40μg/m，细胞悬液置37℃水浴30min，离心弃上清，沉淀细胞用培养液洗一次，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，丝裂霉素C处理过的个体B的淋巴细胞记作Bm；3、用微量加样器各取0.1mL反应细胞（A）和刺激细胞（Bm）于一圆底细胞培养板的孔中（A+Bm），置37℃、5%CO2培养箱内培养5d；4、在培养终止前15～16h，用同位素微量加样器于每孔内加入³H-TdR1μL（含0.5μCi），此时空白对照组不加同位素；5、样品处理：用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用生理盐水洗去游离的³H-TdR，将滤片置60℃烘箱中烤干，冷却后将滤片放入含闪烁液的测量杯中，用β闪烁体测量仪检测放射强度，空白对照在样品处理前加入同位素，处理方法同实验组；6、实验结果计算：结果以每分钟脉冲数（counts per minute，cpm）表示，所有样品在数据处理前均应减去空白对照组的cpm值，MLR反应强度通常以样品的cpm净值或刺激指数（stimulation index，SI）表示，cpm净值等于实验组cpm值减去对照组cpm，SI等于实验组cpm除以对照组cpm。

实验结果如图3所示。结果表明：与抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体相比，抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体具有更强的刺激淋巴细胞增殖的作用。

实验例5.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的药代动力学实验

实验步骤：10周龄、无特定病原体（Specific-pathogen free，SPF）的成年雄性Wistar大鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司），体重350-400g，随机分为八组，每组四只，通过静脉注射分别给予药物溶剂、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体以及抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，抗体的剂量设为4mg/kg。所有大鼠于注射后0.5h，1h，2h，6h，12h，24h，48h，5d，10d，15d，20d，25d，30d后取血（内眦静脉取血），每只大鼠取血约100μl，加0。1%的肝素混匀，4000rpm离心20min，取上清，弃沉淀。检测血浆中抗体的浓度采用ELISA法：重组蛋白CTLA-4和PD-1用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释成2μg/ml，96孔酶标板每孔添加100μl上述稀释后的蛋白溶液，4℃于湿盒内过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（含有0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟；将不同稀释度的大鼠血浆加于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤，加辣根过氧化物酶标记的大鼠抗人IgG1抗体（Fc特异，Sigma公司产品）于各反应孔中，37℃孵育1小时，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml显色，37℃放置10～30分钟；于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05ml终止反应；置酶标仪上（SpectraMax i3Multi-Mode Platform，美国BIO-TEK公司）测定450nm波长处测定吸光值。检测结果如图4所示，抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体以及抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的体内半衰期均较长，没有显著差异。

Claims (10)

1.一种抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其特征在于，所述抗体既能与CTLA-4结合，还能与PD-1相结合。

2.根据权利要求1所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含抗CTLA-4单克隆抗体可变区和抗PD-1单克隆抗体可变区。

3.根据权利要求1或2所述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其特征在于，所述抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种核酸分子，其编码权利要求1～3任一所述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，重链核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一种表达载体，含有权利要求4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，所述载体可以为pCHO1.0、pBudCE4.1或pCGS3载体。

6.一种宿主细胞，其含有上述5～6任一所述的载体，所述细胞可以为COS、CHO或NS0细胞。

7.一种制备权利要求1～3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的方法，该方法包括：

a)在表达条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，表达抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体；

b)分离或纯化a)所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体。

8.一种组合物，含有权利要求1～3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体和药学上可接受的载体。

9.权利要求1～3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体或上述权利要求8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.上述权利要求9所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。