MXPA06001508A

MXPA06001508A - 3-ciclopentiliden-1,3-dihidroindol-2-onas geometricamente restringidas como potentes inhibidores de proteina cinasa

Info

Publication number: MXPA06001508A
Application number: MXPA/A/2006/001508A
Authority: MX
Inventors: Cho Tang Peng; Chen Wei Chung; Zhang Fangjie; Cui Jingrong
Original assignee: Sugen Inc
Priority date: 2003-08-06
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2006-12-13

Abstract

La presente invención se refiere a ciertas indolinonas geométricamente restringidas sustituidas con sulfonamido de la fórmula (ver fórmula):en la que R1 - R12 y X son variables definidas en la presente memoria. Las indolinonas geométricamente restringidas sustituidas con sulfonamido de las realizaciones preferidas de la presente invención modulan la actividad de proteína cinasas ("PKs"). Los compuestos de la invención son por lo tantoútiles para tratar trastornos relacionados con la actividad PK anormal. También se descrien las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, los métodos de tratar enfermedades utilizando las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos y los métodos de prepararlos.

Description

3-CICLOPENTIL1DEN-1.3-DIHIDROINDOL-2-ONAS GEOMÉTRICAMENTE RESTRINGIDAS COMO POTENTES INHIBIDORES DE PROTEÍNA CINASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a ciertas indolinonas geométricamente restringidas sustituidas con sulfonamido que modulan la actividad de proteína cinasas ("PKs"). Los compuestos de esta ¡nvención son, por lo tanto, útiles para tratar de trastornos relacionados con la actividad PK anormal. También se describen las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, los métodos de tratar enfermedades utilizando las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos y los métodos para prepararlos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Lo que sigue se ofrece solamente como información de antecedentes y no se admite que sea técnica anterior a la presente invención. Las proteína cinasas ("PKs") son enzimas que catalizan la fosforilación de grupos hídroxi sobre los residuos de tirosina, serina y treonina de proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente simple son asombrosas; crecimiento, diferenciación y proliferación celular, es decir, virtualmente todos los aspectos de la vida de la célula en una forma u otra depende de al actividad PK. Además, la actividad PK anormal se ha relacionado con un sinfín de trastornos, que se extienden desde enfermedades relativamente no amenazadoras para la vida tales como la psoriasis a enfermedades extremadamente virulentas tales como el glioblastoma (cáncer cerebral). Las PKs se pueden desglosar convenientemente en dos clases, las proteína tirosina cinasas (PTKs) y las serina-treonina cinasas (STKs). Uno de los aspectos principales de la actividad PTK es su implicación con los receptores del factor de crecimiento. Los receptores del factor de crecimienlo son proteínas de la superficie celular. Cuando se unen a un ligando de factor de crecimiento, los receptores del factor de crecimiento se convierten en una forma activa que interactúa con proteínas sobre la superficie interior de una membrana celular. Esto conduce a la fosforilación sobre residuos de tirosina del receptor y otras proteínas y a la formación dentro de la célula de complejos con una variedad de moléculas citoplasmáticas señalizadoras que, por turnos, efectúan numerosas respuestas celulares tales como división (proliferación) celular, diferenciación celular, crecimiento celular, expresión de efectos metabólicos al microenfomo extracelular, etc. Para una discusión más completa, véase Schlessinger y Ullrich, Neuron 9: 303-391 (1992), que se incorpora como referencia, incluyendo cualquier dibujo, como si se expusiera completamente en la presente memoria. Los receptores del factor de crecimiento con actividad PTK son conocidos como receptores tirosina cinasas ("RTKs"). Comprenden una gran familia de receptores transmembrana con actividad biológica diversa. Actualmente, se han identificado por lo menos diecinueve (19) subfamilias distintas de RTKs. Un ejemplo de estas es la subfamilia denominada las RTKs "HER", que ¡ncluye EGFR (receptor del factor de crecimiento epitelial), HER2, HER3 y HER . Estas RTKs consisten en un dominio glicosilado extracelular de unión al ligando, un dominio de transmembrana y un dominio citoplasmático intracelular catalítico que puede fosforilar residuos de tirosina sobre las proteínas. Otra subfamilia de RTK consiste en el receptor de insulina (IR), receptor del factor de crecimiento semejante a la insulina I (IGF-1R) y receptor relacionado con el receptor de insulina (IRR). IR e IGF-1R interactúan con la insulina, IGF-I e IGF-II para formar un heterotetrámero de dos subunidades a glicosiladas totalmente extracelulares y dos subunidades ß que cruzan la membrana celular y que contienen el dominio de tirosina cinasa. Otra subfamilia de RTK se denomina como el grupo del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGFR"), que incluye PDGFRa, PDGFRß, CSFIR, c-kit y flt-3. Estos receptores consisten en dominios extracelulares glicosilados compuestos de 5 bucles similares a inmunoglobulina y un dominio intracelular en el que el dominio de tirosina cinasa está interrumpido por un dominio inerte de cinasa. Otro grupo que, debido a su similitud con la subfamilia PDGFR, a veces se incluye en el último grupo es la subfamilia del receptor de cinasa de hígado fetal ("flk"). Este grupo, que contiene bucles de inmunoglobulina extracelular compuestos de receptor con dominio inserto-cinasa cinasa-1 de hígado fetal (KDR/FLK-1), y tirosina cinasa 1 de tipo fms (flt-1 y flt-4). Un miembro adicional de la familia del receptor del factor de crecimiento de tirosina cinasa es el subgrupo del factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF"). Este grupo consiste en cuatro receptores, FGFR1-4, y muchos ligandos. Aunque hay considerable corte y empalme alternativo, generalmente los receptores consisten en un dominio exfracelular glicosilado que contiene 3 bucles de tipo inmunoglobulina y un dominio intracelular en el que la secuencia de tirosina cinasa está interrumpida por regiones de un dominio inserto-cinasa. Aún otro miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento de tirosina cinasa es MET, a menudo denominado como c-Met también conocido como receptor tirosina cinasa del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (hHGFR). Se piensa que c-Met juega un papel en el crecimiento del tumor primario y la metástasis. Un listado más completo de las subfamilias de RTK conocidas se describe en Plowman ef al., DN & P, 7(6): 334-339 (1994), que se incorpora como referencia, incluyendo cualquier dibujo, como si se expusiera completameníe en la présenle memoria. Además de las RTKs, lambién existe una familia de PTKs completamente intracelular llamada "no-receptores tirosina cinasas" o "tirosina cinasas citoplasmáticas". En la preseníe memoria se utilizará ésta última designación, abreviada "CTK". Las CTKs no contienen dominios extracelulares y transmembrana. En la actualidad, se han identificado más de 24 CTKs en 11 subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fak, Jak, LIMK y Ack). Hasta ahora la subfamilia Src parece ser el grupo más grande de CTKs e ¡ncluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr, y Yrk. Para una discusión más detallada de CTKs, véase Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), que se incorpora como referencia, incluyendo cualquier dibujo, como si se expusiera completamente en la presente memoria. Las serina/treonina cinasas, STKs, como las CTKs, son predominantemente intracelulares aunque hay unas pocas receptores cinasas del tipo STK. Las STKs son las más comunes de las cinasas citosólicas; es decir, cinasas que llevan a cabo su función en esa parte del citoplasma distinta de los orgánulos citoplasmáticos y el citoesqueleío. El ciíosol es la región deníro de la célula en la que ocurre gran parte la actividad biosintética y metabólica intermediaria de la célula; por ejemplo, es en el citosol que las proteínas se sintetizan sobre los ribosomas. Las STKs incluyen CDk2, Raf, la familia ZC de cinasas, la familia NEK de cinasas y BUB1. Todas las RTKs, CTKs y STKs han estado implicadas en un sinfín de enfermedades patógenas que incluyen, significativameníe, el cáncer. Oirás enfermedades patógenas que se han asociado con PTKs incluyen, sin limiíación, psoriasis, cirrosis hepática, diabetes, angiogénesis, fibrosis, reestenosis, enfermedades oculares, artritis reumatoide y otros trastornos inflamatorios, trastornos inmunológicos tales como enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular tal como ateroesclerosis y una variedad de írastornos renales. Con respecto al cáncer, dos de las hipótesis principales avanzadas para explicar la proliferación celular excesiva que conduce al desarrollo del tumor se relacionan con funciones que se sabe que están reguladas por PK. Es decir, se ha sugerido que el crecimiento celular maligno resulía de un fallo en los mecanismos que conírolan la división y/o diferenciación celular. Se ha demostrado que los productos de proteína de varios proto-oncogenes están implicados en los caminos de transducción de señal que regulan el crecimiento y diferenciación celular. Estos productos de proteína de los proto-oncogenes incluyen los factores de crecimiento extracelulares, los receptores de PTK transmembrana del factor de crecimiento (RTKs), las PTKs citoplasmáficas (CTKs) y las STKs cilosólicas, discutidas más arriba. En vista de la aparente unión entre las actividades celulares relacionadas con PK y la amplia variedad de trastornos humanos, no es ninguna sorpresa que se esté gastando una gran cantidad de esfuerzo en un intento por identificar formas de modular la actividad PK. Algunas de estas han implicado aproximaciones biomiméticas utilizando moléculas grandes modeladas sobre las implicadas en los procesos celulares reales (por ejemplo, ligandos mutantes (Solicitud de patente de EE.UU. N° de Serie 4.966.849); receptores solubles y anticuerpos (Solicitud de patente internacional N° WO 94/10202, Kendall y Tomas, Proc.Nat'l Acad. Sci., 90:10705-10709 (1994), Kim, et al., Nature, 362:841-844 (1993)); ligandos de ARN (Jelinek, et al., Biochemistrí, 33:10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell, 4:358A (1993); Kinsella, ef al., Exp. Cell Res., 199:56-62 (1992); Wright, ef al., J. Cellular Fis., 152:448-57) e inhibidores de tirosina cinasa (documentos WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente de EE.UU. N° 5.330.992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. , 35:2268 (1994)). Además de lo anteriormeníe mencionado, se han hecho intentos para identificar moléculas pequeñas que actúan como inhibidores de PK. Por ejemplo, se han descrito compuestos arílicos bis-monocíclicos, bicíclicos y heterocíclicos (documento PCT WO 92/20642), derivados de vinilen-azaindol (documento PCT WO 94/14808) y 1-ciclopropil-4-piridilqu¡nolonas (Patente de EE.UU. N° 5.330.992) como inhibidores de tirosina cinasa. Se han descrito compuestos de estirilo (Patente de EE.UU. N° 5.217.999), compuestos de piridilo sustituidos con estirilo (Patente de EE.UU. N° 5.302.606), derivados de quinazolina (Solicitud de patente EP N° 0 566 266 A1), selenoindoles y selenuros (documento PCT WO 94/03427), compuestos polihidroxílicos tricíclicos (documento PCT WO 92/21660) y compuestos de ácido bencilfosfónico (documento PCT WO 91/15495) como inhibidores de PTK útiles en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan inhibidores de PTK más eficaces.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula en la que A, B, D y E se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en carbono y nitrógeno de forma tal que cuando A es nitrógeno, B y E son carbono y cuando E es nitrógeno y A es carbono, entonces B es carbono o nitrógeno; en la que cuando A, B, D, o E es nitrógeno, R2, R3, R4 o R5 no existen respectivamente; a condición de que el anillo que contiene A, B, D y E no contenga más de dos nitrógenos; Ri y R6 son cada uno H; R2, R3, R4, R5, R7 y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, trihaloalquilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, -SOR-?3, -SO2R13, -SO2NR13R14, R?4SO2N(R13)-, N-trihalometanosulfonamido, -C(O)R?5, -C(O)OR-?5, R?5C(O)O-, ciano, nitro, halo, cianato, isocianato, isocianato, íiocianaío, isotiocianato, -OC(O)NR13R14, R14OC(O)NR?s-, -OC(S)NR 3R?4, R14OC(S)NR?3-, -C(O)NR13Ri4, R C(O)NRi3- y -NR13R14; R2 y R3 o R3 y R4 o R4 y R5 o R y R8 juntos con los átomos a los que están unidos pueden asociarse para formar un grupo metilendioxi, un grupo eíilendioxi, un anillo alicíclico o un anillo heteroalicíclico; R13 y R14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroalicíclico, -C(O)R?5, acetilo, -SO2Ri5 y -(CH2)nNRi3Ri4; o R13 y R14 junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros; R15 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heteroalicíclico; R9, R10, R11 y R12 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, írihaloalquilo, halo, ciano, hidroxi, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, -SO2R15, -S(O)Ri5, -(CH2)nC(O)ORi5, cianato, isocianato, fiocianaío, isotiocianato, -C(O)NR13R , Ri4C(O)NR?3- y -NR13R?4; n es un número entero desde 0 a 20; X se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno, y azufre; y en la que cuando X es oxígeno o azufre, entonces Re no existe; o un profármaco o sal farmacéuíicameníe aceptable del mismo.

En las realizaciones preferidas, la invención se refiere a compuestos de Fórmula I, en la que A, B, D y E son carbono. En otras realizaciones preferidas, la invención ser refiere a compuestos de Fórmula I, en la que A, B, D y E son carbono y X es nitrógeno. En aún otras realizaciones preferidas, la invención se refiere a compuestos de Fórmula I, en la que R2, R3, R4, R5, R7 y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consisíe en H, alquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, -SOR-|3, -SO2R13, -SO2NR13R-i4, -C(O)OR?5, halo y -C(O)NR?3R14. En otras realizaciones preferidas, la invención se refiere a compuesto de Fórmula I, en la que R2, R3, R4, R5, R7 y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, -SOR?3, -SO2R13, -SO2NRI3RH, -C(O)OR?5, halo y -C(O)NR?3R?4 y A, B, D y E son carbono. En aún otras realizaciones preferidas, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula I, en la que R , R3, R4, R5, R7 y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, -SOR13, -SO2R13, -SO2NR?3R?4, -C(O)OR?5, halo y -C(O)NR-i3R? ; A, B, D y E son carbono; y X es nitrógeno. En todavía otras realizaciones preferidas, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula I que es: éster etílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíIico; éster etílico del ácido 6-[5-(2,6-dicloro-fenilmetanosuIfonil)-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3- carboxílico; ésíer efílico del ácido 2-meíil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iIiden]-1 ,4,5,6-teírahidro-c¡clopenfa[b]pirrol-3-carboxílico; mefil amida del ácido 3-[2-meíi!-4,5-dihidro-1 H-ciclopenía[b]pirroI(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico; ácido 2-mefil-6-[5-met¡lsulfamoiI-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]p¡rrol-3-carboxílico; ésíer etílico del ácido 6-[5-metanosulfonil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indoI-(3Z)-iliden]-2-met¡l-1,4,5,6-tetrah¡dro-c¡clopenta[b]pirrol-3-carboxílico; ésíer eíílico del ácido 6-[5-dimetilsulfamoiI-2-oxo-1,2-dihidro-indol(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíl¡co; éster etílico del ácido 6-[5-isopropilsuIfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-meíil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxíl¡co; ésíer elílico del ácido 6-[5-etanosulfonil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; (2-hidroxi-3-pirrolidin-1-¡l-propil)-am¡da del ácido 2-meíil-6-[5-meíilsuIfamo¡l-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-íetrahidro-cicIopen-ía[b]pirrol-3-carboxílico; (3-ciclopropilamino-2-hidroxi-propil)-amida del ácido 2-meíil-6-[5-meíilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iIiden]-1 ,4,5,6-íetrahidro-ciclopen-ía[b]pirrol-3-carboxílico; (2-dimetilamino-etil)-amida del ácido 2-metil-6-[5-metiIsulfamoil-2-oxo-1, 2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-íetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3- carboxílico; metil amida del ácido 3-[2-mefil-3-((R)-2-pirrolidin-1-¡lmetil-pirrolidin-1-carbon¡l)-4,5-d¡h¡dro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-il¡den]-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfónico; éster etílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-5-sulfamo¡I-1 ,2-dihidro-indoI-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-teírahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíI¡co; metil-amida del ácido 3-[3-metanosulfoniI-2-metil-4,5-dihidro-1 H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico; ácido {6-metoxi-3-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-indan-1-il}-acéíico; 5-fluoro-3-[2-meíil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmeí¡I-p¡rrolid¡n-1-carboniI)-4,5-dihidro-1H-ciclopenía[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1,3-dihidro-¡ndol-2-ona; 6-mefoxi-3-[2-mef¡l-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmeíil-pirrol¡din-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenfa[b]pirrol-(6Z)-iIiden]-1,3-dih¡dro-¡ndol-2-ona; 4-metoxi-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolid¡n-1 -ilmetil-pirrolidin-1 -carbonil)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iIiden]-1,3-dihidro-indol-2-ona; 7-cloro-3-[2-metil-3-((S)-2-p¡rrolid¡n-1-ilmetil-pirrolidin-1-carboniI)-4,5-dihidro-1H-ciclopenía[b]p¡rrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-indoI-2-ona; 3-[2-metiI-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmetil-pirrolid¡n-1-carbonil)-4,5-dih¡-dro-1 H-cicIopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-2-ona; y 6-(4-metoxi-fen¡l)-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmefil-p¡rroIidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenía[b]pirrol-(6Z)-il¡den]-1,3-dihidro-indol-2-ona; o un profármaco o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula II: R2, R3, R4, R5, R7 y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, trihaloalquilo, heteroalicíclíco, hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, -SOR13, -SO2R13, -SO2NR?3Rw, R14SO2N(R13)-, N-trihalometanosulfonamido, -C(O)R15, -C(O)OR15, R?5C(O)O-, ciano, nitro, halo, cianato, isocianato, isocianato, tiocianato, isoíiocianaío, -OC(O)NR13Ri4, R OC(O)NR13-, -OC(S)NR13R? , R14OC(S)NR13-, -C(O)NR13R?4> R? C(O)NR13- y -NRi3R?4; R2 y R3 o R3 y R4 o R4 y R5 o R y R8 juntos con los átomos a los que están unidos pueden asociarse para formar un grupo metilendioxi, un grupo etilendioxi, un anillo alicíclico o un anillo heteroalicíclico; R13 y R se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroalicíclico, -C(O)R?s, acetilo, -SO2R15 y -(CH2)nNR-i3R?4; o R13 y R junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros; en la que R15 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heteroalicíclico; Rg, R10, R11 y R12 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, trihaloalquilo, halo, ciano, hidroxi, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, - SO2R15, -S(O)R-i5, -(CH2)nC(O)ORi5, cianato, ¡socianafo, íiocianato, isotiocianaío, -C(O)NR13Ru, RHC(O)NR13- y -NR?3R?4; y n es un número entero desde 0 a 20; o un profármaco o sal farmacéuticameníe acepíable del mismo. En una realización preferida, la invención se refiere a compuestos de Fórmula II, en la que R2, R3, R4, R5, R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, -SOR13, -SO2R13, -SO2NR?3R14, -C(O)OR?5, halo y -C(O)NR13R14. En otra realización preferida, el compuesto de Fórmula II es: éster eíílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-íetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; ésíer efílico del ácido 6-[5-(2,6-dicloro-fenilmefanosulfonil)-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 2-metil-6-[5-met¡Isulfamoil-2-oxo-1,2-d¡hidro-¡ndol-(3Z)-iI¡den]-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíIico; metilamida del ácido 3-[2-metil-4,5-dihidro-1H-cicIopen-ta[b]pirrol(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico; ácido 2-metil-6-[5-meti?sulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indoI-(3Z)-¡Iiden]-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíIico; éster etílico del ácido 6-[5-metanosulfonil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol- (3Z)-iliden]-2-metil-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-dimetilsulfamoiI-2-oxo-1,2-dihidro-indol(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíIico; éster etílico del ácido 6-[5-isopropilsuIfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíIico; ésíer eíílico del ácido 6-[5-eíanosulfonil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iI¡den]-2-metil-1,4,5,6-tetrah¡dro-ciclopenta[b]pirroI-3-carboxíl¡co; (2-hidroxi-3-pirrolidin-1-il-propil)-amida del ácido 2-metil-6-[5-metilsuIfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indoI-(3Z)-il¡den]-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; (3-cicIopropilamino-2-hidrox¡-propiI)-amida del ácido 2-metiI-6-[5-met¡IsuIfamoiI-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopen-ta[b]pirrol-3-carboxílico; (2-dimetilamino-etil)-amida del ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iIiden]-1 ,4,5,6-telrahidro-ciclopenía[b]pirroI-3-carboxílico; metilamida del ácido 3-[2-metil-3-((R)-2-pirrolidin-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3- díhidro-1 H-indol-5-sulfónico; ésfer etílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-5-sulfamoil-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-feírahidro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxílico; metilamida del ácido 3-[3-metanosulfonil-2-metil-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]p¡rrol-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfón¡co; ácido {6-metoxi-3-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-¡ndol-(3Z)-iliden]-indan-1 -iI}-acético; 5-fluoro-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmefil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1,3-dihidro-indoI-2-ona; 6-meíoxi-3-[2-meíil-3-((S)-2-?irrolidin-1 -ilmeíil-pirrolidin-1 -carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenfa[b]pirrol-(6Z)-¡liden]-1,3-dihidro-indol-2-ona; 4-metoxi-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolid¡n-1-ilmeíil-p¡rrolidin-1-carbonil)-4,5-dih¡dro-1H-ciclopenía[b]pirrol-(6Z)-il¡den]-1,3-dihidro-¡ndol-2-ona; 7-cloro-3-[2-metil-3-((S)-2-p¡rrolidin-1-ilmetil-pirrolídin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-indoI-2-ona; 3-[2-metil-3-((S)-2-p¡rrolidin-1-ilmetil-pirroI¡din-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-cicIopenía[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1,3-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-2-ona; y 6-(4-meíoxi-fen¡l)-3-[2-met¡l-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmet¡l-pirrolidin-1 -carbonil)-4,5-dihidro-1 H-cicIopenía[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-indol-2-ona; o un profármaco o sal farmacéuíicameníe acepíable del mismo. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéuíica que comprende un compuesto de Fórmula l o II, o un profármaco o una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula I o II y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En todavía otro aspecto, la invención se refiere a un método para la modulación de la actividad catalítica de una proteína cinasa que comprende poner en contacto dicha proteína cinasa con un compuesto de Fórmula I o II o un profármaco o sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula I o II. En una realización preferida, la proteína cinasa se selecciona del grupo que consiste en una receptor tirosina cinasa, una no-receptor tirosina cinasa y una serina-íreonina cinasa. En aún otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar o prevenir un trastorno relacionado con proteína cinasas en un organismo que comprende administrar al organismo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéuíica que comprende un compuesto de Fórmula I o ll o un profármaco o una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula I o II y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, el trastorno relacionado con proíeína cinasas se selecciona del grupo que consisíe en un trastorno relacionado con receptores tirosina cinasas, un trastorno relacionado con no-receptores tirosina cinasas y un trastorno relacionado con serina-freonina cinasas. En ofra realización preferida, el trastorno relacionado con proteína cinasas se selecciona del grupo que consiste en un trastorno relacionado con PDGFR y un trastorno relacionado con flk. En una realización preferida, el trastorno relacionado con proteína cinasas es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en carcinoma espinocelular, astrociíoma, sarcoma de Kaposi, glioblasíoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de prósfata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, glioma, cáncer colorectal, cáncer genitourinario y cáncer gasírointestinal. En otra realización preferida, el trastorno relacionado con proteína cinasas se selecciona del grupo que consiste en diabetes, un trastorno autoinmunitario, un trastorno de hiperproliferación, reestenosis, fibrosis, psoriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau, artrosis, artritis reumatoide, angiogénesis, un trastorno inflamatorio, un trastorno inmunológico y un trastorno cardiovascular. En una realización preferida, el organismo es un ser humano.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS Se ha descubierto una familia de nuevas indolinonas geométricamente restringidas sustituidas con sulfonamido que manifiestan capacidad moduladora de PK y tienen un efecto de mejora contra trastornos relacionados con la actividad PK anormal. Los compuestos presentados en la presente memoria son solamente ejemplos y no se deben interpreíar como limitantes del alcance de esta invención de ninguna manera. En otro aspecto, la invención está dirigida a una composición farmacéuíica que comprende uno o más compuestos de la Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un excipiente farmacéuticameníe aceptable. También es un aspecto de esta invención que un compuesío descriío en la preseníe memoria, o su sal, se pueda combinar con oíros ageníes quimioterápicos para el tratamiento de las enfermedades y trastornos discutidos más arriba. Por ejemplo, un compuesto o sal de esta invención se podría combinar con agentes alquilantes tales como el fluorouracilo (5-FU) solo o en combinación adicional con leucovorina; u otros agentes alquilantes tales como, sin limitación, otros análogos de pirimidina tales como UFT, capecitabina, gemciíabina y citarabina, los alquil sulfonatos, por ejemplo, busulfano (utilizado en el tratamienío de la leucemia granulocííica crónica), improsulfano, y piposulfano; aziridinas, por ejemplo, benzodepa, carbocuona, meíuredepa y uredepa; efileniminas y metilmelaminas, por ejemplo, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; y las mostazas nitrogenadas, por ejemplo, clorambucilo (utilizado en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica, macroglobulinemia primaria y linfoma no Hodgkin), ciclofosfamida (utilizada en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, tumor de Wilm y rabdomiosarcoma), estramusíina, ifosfamida, novembricina, predimusíina y mostaza de uracilo (utilizada en el tralamiento de trombocitosis primaria, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin y cáncer de ovario); y íriazinas, por ejemplo, dacarbazina (utilizada en el fraíamienío del sarcoma de tejidos blandos). Asimismo se puede esperar que un compuesío o sal de esía invención tenga un efecto beneficioso en combinación con otros agentes quimioíerápicos antimetabolitos tales como, sin limitación, análogos del ácido fólico, por ejemplo meíoírexato (utilizado en el traíamiento de la leucemia linfocítica aguda, coriocarcinoma, cáncer de mama micosis fungiodes, cáncer cabeza y cuello y sarcoma osteogénico) y pferopferina; y los análogos de purina tales como mercaptopurina y tioguanina que encueníran uso en el íratamiento de las leucemias granulocítica aguda, linfocítica aguda y granulocííica crónica. También se puede esperar que un compuesío o sal de esfa invención resulte eficaz en combinación con agentes quimioterápicos basados en producios naturales tales como, sin limiíación, los alcaloides de la vinca, por ejemplo, vinblaslina (utilizada en el tratamiento de cáncer de mama y testicular), vincristina y vindesina; las epipodofiloíoxinas, por ejemplo, etopósido y tenipósido, los cuales son útiles en el tratamiento del cáncer testicular y el sarcoma de Kaposi; los agentes quimioterápicos antibióticos, por ejemplo, daunorubicina, doxorrubicina, epirrubicina, mitomicina (utilizada para tratar cáncer de estómago, cerviz, colon, mama, vejiga y páncreas), dactinomicina, temozolomida, plicamicina, bleomicina (utilizada en el trafamienío de cáncer de piel, esófago y íracío genitourinario); y los agentes quimioíerápicos enzimáticos tales como la L-asparaginasa.

Además de lo aníeriormeníe mencionado, se puede esperar que un compuesío o sal de esía invención tenga un efecto beneficioso en combinación con complejos de coordinación de platino (cisplatino, etc.), ureas susíifuidas tales como la hidroxiurea; derivados de metilhidracina, por ejemplo, procarbazina; supresores adrenocorticales, por ejemplo, mitotano, aminoglutetimida; y hormonas y antagonistas de hormonas tales como los adrenocorticoesteroides (por ejemplo prednisona), progesíágenos (por ejemplo caproaío de hidroxiprogesíerona); esírógenos (por ejemplo dieíilestilbesterol); antiestrógenos íales como el tamoxifeno; andrógenos, por ejemplo el propionato de tesfosíerona; e inhibidores de aromatasa (tales como el anastrozol). Finalmente, se puede esperar que la combinación de un compuesto de esta invención sea particularmente eficaz en combinación con mitoxanírona o pacliíaxel para el fralamiento de cánceres de tumor sólido o leucemias tales como, sin limitación, leucemia mielógena (no linfocítica) aguda. El método anteriormente mencionado se puede llevar a cabo en combinación con un agente quimioterápico seleccionado del grupo que consiste en inhibidores mitóíicos, agentes alquilantes, anlimeíabolifos, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de íopoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, agentes aníiangiógenos tales como los inhibidores de MMP-2, MMP-9 y COX-2, y antiandrógenos.

Los ejemplos de inhibidores COX-II útiles incluyen Vioxx®, CELEBREX® (alecoxib), valdecoxib, paracoxib, rofecoxib y Cox 189. Los ejemplos de inhibidores de la metaloproíeinasa de matriz se describen en los documentos WO 96/33172 (publicado el 24 de octubre de 1996), WO 96/27583 (publicado el 7 de marzo de 1996), la Solicitud de Patente Europea N° 97304971.1 (presentada el 29 de octubre de 1999), los documentos WO 98/07697 (publicado el 26 de febrero de 1998), WO 98/03516 (publicado el 29 de enero de 1998), WO 98/34918 (publicado el 13 de agosto de 1998), WO 98/34915 (publicado el 13 de agosto de 1998), WO 98/33768 (publicado el 6 de agosto de 1998), WO 98/30566 (publicado el 16 julio de 1998), la Publicación de Patente Europea 606.046 (publicada el 13 de julio de 1994), la Publicación de Patente Europea 931.788 (publicada el 28 de julio de 1999), los documentos WO 90/05719 (publicado el 31 de mayo de 1990), WO 99/52910 (publicado el 21 de octubre de 1999), WO 99/52889 (publicado el 21 de octubre de 1999), WO 99/29667 (publicado el 17 Junio de 1999), la Soliciíud Internacional PCT N° PCT/IB98/01113 (presentada el 21 de julio de1998), la Solicitud de Pateníe Europea N° 99302232.1 (presentada el 25 de marzo de 1999), la solicitud de patente de Gran Brefaña número 9912961.1 (preseníada el 3 de junio de 1999), la Solicifud Provisional de EE.UU. N° 60/148.464 (presentada el 12 de agosto de 1999), la Patente de EE.UU. N° 5.863.949 (hecha pública el 26 de enero de 1999), la Patente de EE.UU. N° 5.861.510 (hecha pública el 19 de enero de 1999), y la Publicación de Pateníe Europea 780.386 (publicada el 25 junio de 1997), todas las cuales se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia. Los inhibidores de MMP-2 y MMP-9 preferidos son los que tienen poca o ninguna actividad inhibiendo MMP-1. Más preferidos, son los que inhiben selectivamente MMP-2 y/o MMP-9 relativo a las otras meíaloproteinasas de matriz (es decir MMP-1 , MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y MMP-13). Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP útiles en la presente invención son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, y los compuestos enumerados en la siguiente lista: ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamo¡l-ciclopeníil)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-bic¡clo[3.2.1]ocfan-3-carboxíIico; hidroxiamida del ácido (2R, 3R) 1-[4-(2-cIoro-4-fluoro-bencilox¡)-bencenosulfonil]-3-hidrox¡-3-metil-p¡peridin-2-carboxílico; hidroxiamida del ácido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-p¡ran-4-carboxí-lico; ácido 3-[[4-(4-fíuoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxícarbamoiI-ciclo-butil)-amino]-prop¡ónico; hidroxiamida del ácido 4-[4-(4-cIoro-fenoxi)-benceno-sulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; hidroxiamida del ácido (R) 3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-íefrahidro-piran-3-carboxílico; hidroxia-mida del ácido (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metil-benciIoxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico; ácido 3-[[(4-(4-fluoro-fenoxi)-bence-nosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-1-metil-etil)-am¡no]-propiónico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(4-hidrox¡carbamoil-tetrah¡dro-piran-4-iI)- aminoj-propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenox¡)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilam¡no]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; e hidroxiamida del ácido (R) 3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosuIfonilamino]-teírahidro-furan-3-carboxílico; y sales y solvaíos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. También se pueden utilizar en la presente invención otros agentes anti-angiogénesis, que incluyen oíros inhibidores COX-II y otros inhibidores de MMP. Los compuestos de la Fórmula (I) también se pueden utilizar con inhibidores de transducción de señal, tales como agentes que pueden inhibir las respuestas del EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), tales como anticuerpos del EGFR, anticuerpos del EGF, y moléculas que son inhibidores del EGFR; inhibidores del VEGF (factor de crecimiento endoíelial vascular); e inhibidores del receptor erbB2, íales como moléculas orgánicas o anticuerpos que se unen al receptor erbB2, por ejemplo, HERCPTIN® (Genentech, Inc. de San Francisco Sur, Calif., EE.UU.), los inhibidores del EGFR se describen, por ejemplo, en los documentos WO 95/19970 (publicado el 27 de Julio de 1995), WO 98/14451 (publicado el 9 de Abril de 1998), WO 98/02434 (publicado el 22 de Enero de 1998), y la Pateníe de EE.UU. N° 5.747.498 (hecha pública el 5 de Mayo de 1998), y íales susíancias se pueden uíilizar en la presente invención como se describe en el presente memoria. Los agentes inhibidores del EGFR ¡ncluyen, pero no están limitados a, los anticuerpos monoclonales C225 y anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated de New York, N. Y., EE.UU.), los compuesíos ZD-1839 (AsfraZeneca), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), MDX-447 (Medarex Inc. de Annandale, N. J. , EE.UU.), y OLX-103 (Merck & Co. de Whiíehouse Station, N. J. , EE.UU.), VRCTC-310 (Ventech Research) y la toxina de fusión de EGF (Seragen Inc. de Hopkinton, Mass.). Estos y otros agentes inhibidores del EGFR se pueden utilizar en la presente invención. Los inhibidores del VEGF, por ejemplo SU-5416, SU11248, SU-6668 (Sugen Inc. de San Francisco Sur, Calif., EE.UU.), también se pueden combinar con un compuesto de la Fórmula (I). Los inhibidores del VEGF se describen, por ejemplo, en los documentos WO 99/24440 (publicado el 20 de mayo de 1999), Solicitud internacional PCT PCT/IB99/00797 (presentado el 3 de mayo de 1999), en WO 95/21613 (publicado el 17 de agosto de 1995), WO 99/61422 (publicado el 2 de diciembre de 1999), Patente de EE.UU. N° 5.834.504 (hecho público el 10 de noviembre de 1998), WO 01/60814, WO 98/50356 (publicado el 12 de noviembre de 1998), Patente de EE.UU. N° 5.883.113 (hecho público el 16 de marzo de 1999), Patente de EE.UU. N° 5.886.020 (hecho público el 23 de marzo de 1999), Pateníe de EE.UU. N° 5.792.783 (hecho público el 11 de agosto de 1998), WO 99/10349 (publicado el 4 de marzo de 1999), WO 97/32856 (publicado el 12 de septiembre de 1997), WO 97/22596 (publicado el 26 de junio de 1997), WO 98/54093 (publicado el 3 de diciembre de 1998), WO 98/02438 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 99/16755 (publicado el 8 de abril de 1999), y WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), los cuales se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia. Otros ejemplos de algunos inhibidores específicos del VEGF útiles en la presente ¡nvención son IM862 (Cytran Inc. de Kirkiand, Wash., EE.UU.); anticuerpo monoclonal anti-VEGF de Genentech, Inc. de San Francisco Sur, Calif.; y angiozima, una ribozima sintética de Ribozyme (Boulder, Coló.) y Chiron (Emeryville, Calif.). Estos y otros inhibidores del VEGF se pueden utilizar en la presente invención como se describe en la presente memoria. Los inhibidores del receptor erbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Welcome pie), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. de The Woodlands, Tex. , EE.UU.) y 2B-1 (Chiron), se pueden además combinar con un compuesto de la Fórmula (l) por ejemplo los indicados en los documentos WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 99/35146 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 99/35132 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 97/13760 (publicado el 17 de abril de 1997), WO 95/19970 (publicado el 27 de julio de 1995), Patente de EE.UU. N° 5.587.458 (hecho público el 24 de diciembre de 1996), y Patente de EE.UU. N° 5.877.305 (hecho público el 2 de marzo de 1999), que se incorporan por este medio en la presente memoria en su totalidad como referencia. Inhibidores del receptor erbB2 útiles en la presente invención se describen también en la Solicitud Provisional de EE.UU. N° 60/117.341 , presentada el 27 de enero de 1999, y en la Soliciíud Provisional de EE.UU. N° 60/117.346, preseníada el 27 de enero de 1999, las cuales se incorporan en su foíalidad en la presente memoria como referencia. Las sustancias y compuestos inhibidores del receptor erbB2 descritos en las mencionadas solicitudes PCT, patentes de EE.UU., y solicitudes provisionales de EE.UU., así como oíros compuestos y sustancias que inhiben el receptor erbB2, se pueden utilizar con los compuestos de la Fórmula (I), de acuerdo con la presente invención. Los compuestos de Fórmula (I) también se pueden utilizar con otros agentes útiles para traíar el cáncer, que incluyen, pero no se limifan a, ageníes capaces de mejorar las respuesfas inmuniíarias antitumorales, tales como los anticuerpos CTLA4 (antígeno 4 de linfocito citotóxico), y otros agentes capaces de bloquear CTLA4; y agentes aníi-proliferaíivos tales como otros inhibidores de famesil proíeína íransferasa, por ejemplo los inhibidores de famesil proteína transferasa descritos en las referencias diadas en la sección de "Antecedentes", de la Patente de EE.UU. N° 6.258.824 B1. Los anticuerpos CTLA4 específicos que se pueden utilizar en la presente invención incluyen los descritos en la Solicitud Provisional de EE.UU. 60/113.647 (presentada el 23 de diciembre de 1998) que se incorpora como referencia en su totalidad, sin embargo se pueden utilizar otros anticuerpos CTLA4 en la presente invención. El méíodo anteriormente mencionado también se puede llevar a cabo en combinación con radioterapia, en el que la cantidad de un compuesto de la Fórmula (I) en combinación con la radioterapia, es eficaz para tratar las enfermedades anteriormente mencionadas. El nivel de radioterapia administrada se puede reducir a una dosis sub-eficaz cuando se administra en combinación con los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente invención. Las técnicas para administrar radioterapia son conocidas en la materia, y estas técnicas se pueden utilizar en el tratamiento conjunto descriío en la presente memoria. La administración del compuesto de la invención en este traíamiento conjunto se puede determinar como se describe en la presente memoria. Otro aspecto de la ¡nvención está dirigido al uso de compuestos de la Fórmula I o II en la preparación de un medicamento, que es útil para el tratamiento de una enfermedad mediada por la actividad anormal de proteína cinasa. En un aspecto, una realización preferida de la presente ¡nvención se refiere al uso de compuestos de Fórmula I o II en la preparación de un medicamento, que es útil para el tratamiento de una enfermedad medida por la actividad anormal de proteína cinasa. "Sal farmacéuticamente aceptable" o "sal farmacéuticamente aceptable del mismo" se refiere a las sales que conservan las propiedades y eficacia biológica de las bases libres y que se obtienen por reacción con ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico, ácido acético, ácido bencenosulfónico (besilato), ácido benzoico, ácido camforsulfónico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido isetiónico, ácido láctico, ácido maleico, ácido málico, ácido mandélico, ácido múcico, ácido pamoico, ácido pantoténico, ácido succínico, ácido tartarito, y similares. Una "composición farmacéuíica" se refiere a una mezcla de uno o más de los compuestos descritos en la presente invención, o de sales fisiológicamente aceptables de los mismos, con otros componentes químicos, fales como vehículos y excipientes fisiológicamente aceptables. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. Como se utiliza en la presente memoria, un "vehículo fisiológicamente aceptable" se refiere a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula las propiedades y actividad biológica del compuesto administrado. Un "excipiente" se refiere a una susíancia inerte añadida a una composición farmacéuíica para facilifar más la adminisíración de un compuesto. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato calcico, fosfato calcico, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa (que ¡ncluyen la celulosa microcrisíalina), gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglomerantes, agentes disgregantes, y similares. "Alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado que incluye grupos de cadena lineal, cadena ramificada o cíclicos.

Preferentemente, el grupo alquilo tiene 1 a 20 átomos de carbono (siempre que en la presente memoria se indica un intervalo numérico, por ejemplo "1-20", significa que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. hasta e incluyendo 20 átomos de carbono). Más preferentemente, es un alquilo de tamaño medio que tiene 1 a 10 átomos de carbono. Lo más preferentemente, es un alquilo inferior que tiene 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando está sustiíuido, cada grupo sustituyente es preferentemente uno o más individualmente seleccionado de halógeno, -hidroxi, -COR", -COOR', OCOR', CONRR', -RNCOR', -NRR\ -CN, -NO2, -CZ3, -SR', -SOR', -SO2R', -SO2OR', -SO2NRR", tiocarbonilo, -RNSO2R", perfluoroalquilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-íiocarbamilo, sililo, amonio, alquilo inferior, alquinilo inferior, alquinilo inferior, cicloalquilo, heíeroalicido, heteroarilo, y arilo. R y R' son independientemente H, alquilo, o arilo, en los que el alquilo o arilo puede estar adicionalmente sustiíuido con halógeno, (CH2)nN(R")2, (CH2)nCO2R, (CH2)nOR", (CH2)nOC(O)R", alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aminocarbonilo, un anillo heíeroalicíclico, arilo, alcoxi, -OCZ3, ariloxí, C(O)NH2, o heíeroarilo. R" es H, alquilo o arilo. N es 0 - 3. "Alquenilo" se refiere a un hidrocarburo alifáfico que íiene por lo menos un doble enlace carbono-carbono, que ¡ncluye grupos de cadena lineal, cadena ramificada o cíclicos que íienen por lo menos un doble enlace carbono-carbono. Preferentemeníe, el grupo alquenilo íiene 2 a 20 átomos de carbono (siempre que en la presente memoria se indica un iníervalo numérico, por ejemplo "2-20", significa que el grupo, en este caso el grupo alquenilo, puede contener 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. hasía e incluyendo 20 átomos de carbono). Más preferentemente, es un alquenilo de tamaño medio que tiene 2 a 10 átomos de carbono. Lo más prefereníemeníe, es un alquenilo inferior que tiene 2 a 6 átomos de carbono. El grupo alquenilo puede estar sustiíuido o no sustituido. Cuando está sustiíuido, cada grupo sustituyente es preferentemente uno o más individualmente seleccionado de halógeno, -hidroxi, -COR', -COOR", OCOR', CONRR', -RNCOR', -NRR', -CN, -NO2, -CZ3, -SR', -SOR", -SO2R', -SO2OR', -SO2NRR\ tiocarbonilo, -RNSO2R', perfluoroalquilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, sililo, amonio, alquilo inferior, alquinilo inferior, alquinilo inferior, cicloalquilo, heteroaliciclo, heteroarilo, y arilo. En los que R y R' se definen en la presente memoria. "Alquinilo" se refiere a un hidrocarburo alifático que íiene por lo menos un friple enlace carbono-carbono, que incluye grupos de cadena lineal, cadena ramificada o cíclicos que tienen por lo menos un íriple enlace carbono-carbono. Preferentemente, el grupo alquinilo tiene 2 a 20 átomos de carbono (siempre que en la presente memoria se indica un intervalo numérico, por ejemplo "2-20", significa que el grupo, en este caso el grupo alquinilo, puede contener 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. hasta e incluyendo 20 átomos de carbono). Más preferentemente, es un alquinilo de íamaño medio que íiene 2 a 10 átomos de carbono. Lo más preferentemeníe, es un alquinilo inferior que tiene 2 a 6 átomos de carbono. El grupo alquinilo puede estar sustiíuido o no sustituido. Cuando está sustifuido, cada grupo susíiíuyeníe es preferentemente uno o más individualmenfe seleccionado de halógeno, -hidroxi, -COR', -COOR', OCOR', CONRR', -RNCOR', -NRR\ -CN, -NO2, -CZ3, -SR", -SOR', -SO2R\ -SO2OR', -SO2NRR', íiocarbonilo, -RNSO2R', perfluoroalquilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-íiocarbamilo, N-íiocarbamilo, sililo, amonio, alquilo inferior, alquinilo inferior, alquinilo inferior, cicloalquilo, heteroaliciclo, heteroarilo, y arilo. En los que R y R' se definen en la presente memoria. Un "cicloalquilo" o un grupo "alicíclico" se refiere a un grupo monocíclico o anillo fusionado (es decir, anillos que comparten un par adyacente de átomos de carbono) con iodos los átomos de carbono en el que uno o más de los anillos no tienen un sistema de elecírones pi complefamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo son ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciciohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptaírieno. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido o no sustiíuido. Cuando esíá sustiíuido, cada grupo sustituyente es preferentemente uno o más individualmente seleccionado de halógeno, -hidroxi, -COR', -COOR', OCOR', CONRR', -RNCOR*, -NRR', -CN, -NO2, -CZ3, -SR\ -SOR', -SO2R', -SO2OR', -SO2NRR', tiocarbonilo, -RNSO2R', perfluoroalquilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, sililo, amonio, alquilo inferior, alquinilo inferior, alquinilo inferior, cicloalquilo, heteroaliciclo, heteroarilo, y arilo. En los que R y R' se definen en la presente memoria. Un grupo "arilo" se refiere a un grupo monocíclico o anillo fusionado policíclico (es decir, anillos que comparten un par adyaceníe de átomos de carbono) con todos los átomos de carbono que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos arilo son fenilo, naftalenilo y aníracenilo. El grupo arilo puede esíar susíiíuido o no sustituido. Cuando está sustiíuido, cada grupo susíiíuyeníe es preferentemente uno o más seleccionado de halógeno, -hidroxi, alcoxi, ariloxi, -COR', -COOR', OCOR', CONRR', -RNCOR', -NRR", -CN, -NO2, -CZ3, -SR\ -SOR', -SO2R', -SO2OR', -SO2NRR\ tiocarbonilo, -RNSO2R', perfluoroalquilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, sililo, amonio, alquilo inferior, alquínilo inferior, alquinilo inferior, cicloalquilo, heteroaliciclo, heteroarilo, y arilo. En los que R y R' se definen en la presente memoria. Como se utiliza en la presente memoria, un grupo "heteroarilo" se refiere a un grupo monocíclico o anillo fusionado (es decir, anillos que comparten un par adyacentes de átomos) que tienen en el anillo(s) uno o más átomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, que tienen un sistema de electrones pí completameníe conjugado. Los ejemplos, sin limiíación, de grupos heteroarilo son pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol. El grupo heteroarilo puede estar sustiluido o no sustituido. Cuando está sustituido, cada grupo sustituyente es preferentemente uno o más seleccionado de halógeno, -hidroxi, -COR', -COOR', OCOR', CONRR', -RNCOR', -NRR', -CN, -NO2, -CZ3, -SR', -SOR', -SO2R', -SO2OR', -SO2NRR\ tiocarbonilo, -RNSO2R', perfluoroalquilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-íiocarbamilo, sililo, amonio, alquilo inferior, alquinilo inferior, alquinilo inferior, cicloalquilo, heteroaliciclo, heteroarilo, y arilo, en los que Z es halógeno. En los que R y R' se definen en la presente memoria. Un "anillo heteroalicíclico" o grupo "heteroaliciclo" se refiere a un grupo monocíclíco o anillo fusionado que tiene en el anillo(s) uno o más átomos seleccionados del grupo que consisíe en nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no pueden tener un sistema de elecírones pi compleíameníe conjugado. El anillo heteroalicíclico puede esíar susíiíuido o no sustituido. El anillo heteroalicíclico puede contener uno o más grupos oxo. Cuando está sustituido, el grupo(s) sustifuyeníe es preferentemente uno o más seleccionado de halógeno, -hidroxi, -COR', -COOR', OCOR', CONRR', -RNCOR', -NRR', -CN, -NO2, -CZ3, -SR', -SOR', -SO2R', -SO2OR', -SO2NRR', tiocarbonílo, -RNSO2R', perfluoroalquilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, sililo, amonio, alquilo inferior, alquinilo inferior, alquinilo inferior, cicloalquilo, heteroaliciclo, heíeroarilo, y arilo. En los que R y R' se definen en la preseníe memoria. Z se refiere a un grupo halógeno seleccionado del grupo que consisíe en flúor, cloro, bromo y yodo. Un grupo "hidroxi" se refiere a un grupo -OH. Un grupo "alcoxi" se refiere tanto a un grupo -O-alquil como a un grupo -O-cidoalquil, como se definen en la presente memoria. Un "alcoxicarbonilo" se refiere a un -C(O)-O. Un "aminocarbonilo" se refiere a un -C(O)-NRR'. Un "ariloxicarbonilo" se refiere a -C(O)-Oaril. Un grupo "ariloxi" se refiere tanto a un grupo -O-aril como a un grupo -O-heteroaril, como se definen en la presente memoria. Un grupo "arilalquilo" se refiere a -alquil-aril, en el que alquil y aril se definen en la presente memoria. Un grupo "alquilarilo" se refiere a -aril-alquil, en el que alquil y aril se definen en la presente memoria. Un grupo "arilsulfonilo" se refiere a un -SO2-aril. Un grupo "alquilsulfonilo" se refiere a un -SO2-aIquil. Un grupo "heteroariloxilo" se refiere a un grupo heteroaril-O- con el heteroaril como se define en la presente memoria. Un grupo "heíeroalicicloxi" se refiere a un grupo heteroalicíclico- O- con el heteroalicíclico como se define en la presente memoria. Un grupo "carbonilo" se refiere a un -C(=O)-R. Un grupo "aldehido" se refiere a un grupo carbonilo en el que R es hidrógeno. Un grupo "tiocarbonilo" se refiere a un grupo -C (=S) -R. Un grupo "trihalomeíanocarbonilo" se refiere a un grupo Z3C- C(0> Un grupo "C-carboxilo" se refiere a un grupo -C(O)O-R.

Un grupo "O-carboxilo" se refiere a un grupo R-C(O)O-. Un grupo "ácido carboxílico" se refiere a un grupo C-carboxilo en el que R es hidrógeno. Un "halo" o grupo "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo. Un grupo "trihalomeíilo" se refiere a un grupo -CZ3. Un grupo "írihalometanosulfonilo" se refiere a un grupo Z3CS(O)2 Un grupo "trihalometanosulfonamido" se refiere a un grupo Z3CS(O)2NR-. Un grupo "sulfinilo" se refiere a un grupo -S(O)-R. Un grupo "sulfonilo" se refiere a un grupo -S(O)2R. Un grupo "S-sulfonamido" se refiere a un grupo -S(O)NRR'. Un grupo "N-sulfonamido" se refiere a un grupo -NR-S(O)2R. Un grupo "O-carbamilo" se refiere a un grupo -OC(O)NRR'. Un grupo "N-carbamilo" se refiere a un grupo ROC(O)NR-. Un grupo "O-tiocarbamilo" se refiere a un grupo -OC(S)NRR'. Un grupo "N-íiocarbamilo" se refiere a un grupo ROC(S)NR'-. Un grupo "amino" se refiere a un grupo -NHS o un grupo -NRR'. Un grupo "C-amido" se refiere a un grupo -C(O)NRR'. Un grupo "N-amido" se refiere a un grupo R'C(O)NR-. Un grupo "niíro" se refiere a un grupo -NO2. Un grupo "ciano" se refiere a un grupo -CN.

Un grupo "sililo" se refiere a un grupo -Si(R)3. Un grupo "fosfonilo" se refiere a un grupo -P(=O)(O)2. Un grupo "aminoalquilo" se refiere a un grupo -alquilNRR'. Un grupo "alquilaminoalquilo" se refiere a un grupo -alquil-NR-alquil. Un grupo "dialquilaminoalquilo" se refiere a un grupo -alquil-N- (alquil)2 Un grupo "perfluoroalquilo" se refiere a un grupo alquilo en el que iodos los átomos de hidrógeno se han remplazado con átomos de flúor. Las definiciones de R-i - R12, X, R, R' y R" se definen en la presente memoria. Los compuestos que tienen la misma fórmula molecular pero difieren en la naturaleza o secuencia del enlace de sus átomos o la disposición de sus átomos en el espacio son denominados "isómeros". Los isómeros que difieren en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes especulares uno de otro se denominan "diastereómeros" y los que son imágenes especulares no superponibles se denominan "enantiómeros". Cuando un compuesto tiene un centro asimétrico, por ejemplo, está unido a cuatro grupos diferentes, es posible un par de enantiómeros. Un enantiómero se puede caracterizar por la configuración absoluta de su centro asimétrico y se describe por las reglas de secuencia R- y S- de Cahn y Prelog, o por la manera en que la molécula rota el plano de la luz polarizada y se designa como dextrógiro o levógiro (es decir, como isómeros (+) o (-) respectivamente). Un compuesto quiral puede existir o como enantiómero individual o como una mezcla de ellos. Una mezcla que contiene proporciones iguales de los enantiómeros se llama una "mezcla racémica". Los compuesíos de esía invención pueden tener uno o más centros asimétricos; tales compuestos se pueden preparar por lo tanto como estereoisómeros individuales (R)- o (S)- o como sus mezclas. A menos que se indique lo contrario, la descripción y denominación de un compuesto particular en la memoria y reivindicaciones tiene la finalidad de incluir tanto los enantiómeros individuales como sus mezclas, racémica o de otro clase. Los métodos para la determinación de la estereoquímica y la separación de estereoisómeros son bien conocidos en la técnica (véase la discusión en el Capítulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4a edición J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992). Los compuestos de Fórmula I o II pueden preseníar los fenómenos de tautomería e isomería estructural. Por ejemplo, los compuestos descritos en la presente memoria pueden adoptar una configuración E o Z alrededor de cualquier doble enlace en la molécula. Esta ¡nvención abarca cualquier forma tautómera o isómera esírucíural y sus mezclas que tengan la capacidad de modular la actividad de RTK, CTK y/o STK y no está limitada a ninguna forma íaulómera o isómera esíructural. Una "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de un o más de los compuestos descritos en la presente memoria, o sus sales o profármacos fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables, con oíros componentes químicos, fales como vehículos y excipientes fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. El compuesto de Fórmula I o II también puede actuar como profármaco. Un "profármaco" se refiere a un agente que se convierte en el fármaco precursor jn vivo. A menudo los profármacos son úíiles porque, en algunas sifuaciones, pueden ser más fáciles de administrar que el fármaco precursor. Por ejemplo, pueden ser biodisponibles mediante administración oral mientras que el fármaco precursor no lo es. El profármaco también puede tener mejor solubilidad en composiciones farmacéuticas que el fármaco precursor. Un ejemplo, sin limitación, de un profármaco sería un compuesto de la presente ¡nvención que se administra como un éster (el "profármaco") para facilitar el transporte a través de membrana celular en la que la solubilidad acuosa es perjudicial para la movilidad pero después se hidroliza metabólicamente ai ácido carboxílico, la entidad activa, una vez dentro de la célula donde la solubilidad acuosa es beneficiosa. Un ejemplo adicional de un profármaco puede ser un polipéptido corto, por ejemplo, sin limiíación, un polipéptido de 2 - 10 aminoácidos, unido por un grupo amíno terminal a un grupo carboxi de un compuesto de esta invención en el que el polipéptido se hidroliza o metaboliza jn vivo para liberar la molécula activa. Los profármacos de un compuesío de Fórmula I o II están dentro del alcance de esta invención. Adicionalmente, se contempla que un compuesto de Fórmula I o II se metabolizaría mediante enzimas en el cuerpo del organismo tal como un ser humano para generar un metaboliío que puede modular la acíividad de las proíeína cinasas. Tales meíaboliíos esíán deníro del alcance de la preseníe invención. Como se utiliza en la présenle invención, un "vehículo fisiológicamente/farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula las propiedades y actividad biológica del compuesto administrado. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancie inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar más la administración de un compuesto. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato calcico, fosfato calcico, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles. Como se utiliza en la presente memoria, la terminología "sal farmacéuticameníe acepfable" se refiere a las sales que conservan la eficacia y propiedades biológicas del compuesfo precursor. Tales sales incluyen: (1) sal de adición de ácido que se obtiene por reacción de la base libre del compuesto precursor. con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, y ácido perclórico y similares, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido (D) o (L) málico, ácido maleico, ácido mefanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-íoluensulfónico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico y similares, preferentemente ácido clorhídrico o (L)-málico; o (2) sales formadas cuando un protón ácido preseníe en el compuesío precursor o se remplaza por un ion metálico, por ejemplo un ¡on de meíal alcalino, un ¡on alcalinoíérreo, o un ion aluminio; o se coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dieíanolamina, írieíanolamina, íromeíamina, N-meíilglucamina, y similares. "PK" se refiere a recepíor proteína tirosina cinasa (RTKs), no-receptor tirosina cinasa o tirosina cinasa celular (CTKs) y serina-íreonina cinasas (STKs). "Méíodo" se refiere a maneras, medios, íécnícas y procedimientos para llevar a cabo una íarea dada que incluye, pero no se limiía a, las maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por, o fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos por, los profesionales de la química, farmacia, biología bioquímica y medicina. "Modulación" o "modular" se refieren a la alteración de la actividad catalítica de las RTKs, CTKs y STKs. En particular, modular se refiere a la activación de la actividad catalítica de las RTKs, CTKs y STKs, preferentemente la activación o inhibición de la actividad catalífica de las RTKs, CTKs y STKs, dependiendo de la concentración del compuesto o sal a la que se expone la RTK, CTK o STK o, más preferentemente, la inhibición de la actividad catalííica de las RTKs, CTKs y STKs. "Acíividad caíalítica" se refiere a la velocidad de fosforilación de tirosina bajo la influencia, directa o indirecta, de RTKs y/o CTKs o la fosforilación de serina y treonina bajo la influencia, directa o indirecta, de STKs. "Poner en coníaclo" se refiere a poner juntos un compuesto de esta invención y una PK objetivo de tal manera que el compuesto pueda afectar la actividad catalííica de la PK, o direcíameníe, es decir, por interacción con la cinasa sola, o indirectamente, es decir, por interacción con otra molécula de la que sea dependiente la actividad caíalííica de la cinasa. Tal "puesta en contacto" se puede llevar a cabo "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo, una placa peíri o similar. En un tubo de ensayo, poner en contacto puede implicar solamente un compuesto y una PK de interés o puede implicar células enteras. Las células también se pueden mantener o cultivar en placas de cultivo celular y poner en contacío con un compuesío en esíe entorno. En este contexto, la capacidad de un compuesto particular para afectar un trastorno relacionado con PK, es decir, la IC50 del compuesto, definida más abajo, se puede determinar aníes de que se intente el uso de los compuestos in vivo con organismos vivos más complejos. Para las células fuera del organismo, existen múltiples métodos, y son bien conocidos por los expertos en la técnica, para poner en contacto las PKs con los compuestos que incluyen, pero no se limitan a, microinyección celular directa y numerosas técnicas de transporte transmembrana. n w'fro" se refiere a los procedimientos llevados a cabo en un entorno artificial tales como, por ejemplo, sin limitación, en un tubo de ensayo o medio de cultivo. '77 Vo" se refiere a los procedimientos llevados a cabo dentro de un organismo vivo tales como, sin limifación, un ratón, raía o conejo. "Trasíorno relacionado con PK", "írasíorno conducido por PK", y "actividad PK anormal" se refieren a una enfermedad caracterizada por la inadecuada, es decir, sub- o, más comúnmente, sobre-, acíividad caíalííica de PK, en la que la PK particular puede ser una RTK, una CTK o una STK. La actividad caíalítica inadecuada puede surgir como resulíado de: (1) la expresión de PK en células que normalmente no expresan PKs, (2) el aumento de expresión de PK que conduce a proliferación, diferenciación y/o crecimiento celulares no deseados, o, (3) disminución de expresión de PK que conduce a reducciones no deseadas en la proliferación, diferenciación y/o crecimiento celulares. La sobre-acíividad de una PK se refiere a la amplificación del gen que codifica una PK particular o a la producción de un nivel de actividad de PK que puede correlacionarse con un írasíorno de proliferación, diferenciación y/o crecimiento celulares (es decir, cuando el nivel de la PK aumenta, la gravedad de uno o más síntomas del trasíorno celular aumenía). La sub-acíivídad es, por supuesto, la inversa, en la que la gravedad de uno o más síntomas de un trasíorno celular aumente cuando el nivel de la actividad de PK disminuye. "Tratar", "traíando" y "tratamiento" se refieren a un método de aliviar o anular un trastorno celular mediado por PK y/o sus síntomas correspondientes. Con respecto particularmente al cáncer, estos íérminos simplemente significan que la esperanza de vida de un individuo afectado con un cáncer aumentará o que uno o más de los síntomas de la enfermedad se reducirán. "Organismo" se refiere a cualquier ente vivo formado por al menos una célula. Un organismo vivo puede ser ían simple como, por ejemplo, una única célula eucarioía o fan complejo como un mamífero, que incluye un ser humano. "Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a esa cantidad del compuesto que se administra, que alivia hasta cierto punto uno o más de los síntomas del trastorno que se traía. En referencia al íraíamienío del cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad que tiene el efecto de: (1) reducir el tamaño del tumor; (2) inhibir (es decir, relrasar hasta cierto punto, preferentemente parar) la metástasis del tumor; (3) inhibir hasta cierto punto (es decir, refrasar hasta cierto punto, preferentemente parar) el crecimiento tumoral, y/o, (4) aliviar hasta cierto punto (o, preferentemente, eliminar) uno o más síntomas asociados con el cáncer. "Supervisar" significa observar o detecíar el efecto de poner en contacto un compuesto con una célula que expresa una PK particular. El efecto observado o detecíado puede ser un cambio en el fenotipo celular, en la actividad catalítica de una PK o un cambio en la interacción de una PK con un copartícipe de unión naíural. Las técnicas para observar o detectar tales efectos son bien conocidas en la materia. Los efectos referenciados más arriba se seleccionan de un cambio o una ausencia de cambio en un fenotipo celular, un cambio o ausencia de cambio en la actividad cafalítica de una proteína cinasa o un cambio o ausencia de cambio en la interacción de la proteína cinasa con un copartícipe de unión naíural en un aspecío final de esía invención. "Fenotipo celular" se refiere a la apariencia externa de una célula o tejido o a la función biológica de la célula o tejido. Los ejemplos, sin limitación, de un fenotipo celular son tamaño celular, crecimiento celular, proliferación celular, diferenciación celular, supervivencia celular, apoptosis, y absorción y uso de nutrientes. Tales características fenotípicas son mensurables por técnicas bien conocidas en la materia. "Copartícipe de unión natural" se refiere a un polipéptido que se une a una PK particular en una célula. Los socios de unión naturales pueden jugar un papel en propagar una señal en un proceso de transducción de señal mediado por PK. Un cambio en la interacción del copartícipe de unión nafural con la PK puede manifesíarse por sí mismo como un aumenío o disminución de la concentración del complejo PK/copartícipe de unión natural y, como resultado, en un cambio observable en la capacidad de la PK para mediar la transducción de señal.

Indicaciones Las PKs cuya actividad caíalítica esíá modulada por los compuesíos de esía invención incluyen proteína tirosina cinasas de las cuales hay dos íipos, receptores tirosina cinasas (RTKs) y íirosina cinasas celulares (CTKs), y serina-treonina cinasas (STKs). La transducción de señal mediada por RTK se inicia mediante la interacción extracelular con un factor de crecimiento (ligando) específico, seguido por la dimerización del receptor, estimulación transitoria de la actividad intrínseca de proteína tirosina cinasa y fosforilación. Se crean así sitios de unión para moléculas infracelulares de transducción de señal y se conduce a la formación de complejos con un espectro de moléculas ciíoplasmáíicas de señalización que facilite la respuesta celular apropiada (por ejemplo, división celular, efectos metabólicos sobre el microentorno extracelular, etc.). Véase, Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9: 303-391. Se ha demostrado que los sitios de fosforilación de tirosina en los receptores del factor de crecimiento funcionan como sitios de unión de alta afinidad para los dominios SH2 (homología src) de moléculas de señalización. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785, Songyang et al., 1993, CeJI 72:767-778, y Koch et al., 1991 , Science 252:668-678. Se han identificado varias proteínas de sustrato intracelulares que se asocian con RTKs. Se pueden dividir en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico, y (2) sustratos que carecen de tal dominio pero que sirven como adaptadores y se asocian con moléculas caíalíticamenfe acíivas. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. La especificidad de las interacciones entre receptores y dominios SH2 de sus sustratos se determina por los residuos de aminoácido inmediaíameníe alrededor del residuo de tirosina fosforilado. Las diferencias en las afinidades de unión entre los dominios SH2 y las secuencias de aminoácidos alrededor de los residuos de fosfotirosina en receptores particulares son consistentes con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación de sustrato. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Estas observaciones sugieren que la función de cada RTK está determinada no solo por su paírón de expresión y capacidad de unión sino también por la serie de caminos de transducción de señal corriente abajo que se activan mediante un receptor particular. Así, la fosforilación proporciona una etapa reguladora importante que determina la selectividad de los caminos de señalización adquirida por receptores específicos del factor de crecimiento, así como receptores del factor de diferenciación. Las STKs, que son principalmente citosólicas, afectan la bioquímica interna de la célula, a menudo como una respuesía automática a un evento PTK. Las STKs han estado implicadas en el proceso de señalización que inicia la síntesis del ADN y la subsiguieníe miíosís que conduce a la proliferación celular. Así, la transducción de señal de PK da como resultado, entre otras respuestas, la proliferación, diferenciación, crecimiento y metabolismo celulares. La proliferación celular anormal puede dar como resultado una amplia serie de frasíornos y enfermedades, que incluyen el desarrollo de neoplasia íal como carcinoma, sarcoma, glioblasíoma y hemangioma, trastornos tales como leucemia, psoriasis, arteriosclerosis, artritis y retinopatía diabética y oíros trastornos relacionados con la angiogénesis y/o vasculogénesis incontroladas. No se requiere un entendimiento preciso del mecanismo por el cual los compuestos de esta invención inhiben las PKs para poner in práctica la presente invención. Sin embargo, aunque no estando unido por la presente a ningún mecanismo o teoría particular, se cree que los compuestos interacíúan con los aminoácidos en la región caíalífica de las PKs. Los compuestos descritos en la presente memoria pueden así tener utilidad como ensayos in vitro para PKs así como mostrar efectos terapéuticos in vivo mediante la interacción con PKs. Adicionalmeníe, los compuestos de la presente invención proporcionan una aproximación terapéutica al frafamienío de muchas clases de lumores sólidos, que incluyen pero no se limiían a carcinomas, sarcomas incluyendo el sarcoma de Kaposi, erilroblasíoma, glioblastoma, meningioma, asírocifoma, melanoma y mioblastoma. También se contempla por esía ¡nvención el tratamiento o prevención de cánceres de íumor no sólido fales como leucemia. Las indicaciones pueden incluir, pero no se limiían a cánceres de cerebro, cánceres de sangre, cánceres de pulmón y cánceres de hueso. Los ejemplos adicionales, sin limifación, de los tipos de trastornos relacionados con la actividad de PK inadecuada que los compuesíos descritos en la presente memoria pueden ser útiles para prevenir, tratar y estudiar, son trastornos proliferativos celulares, trastornos fibróticos y írasfornos mefabólicos. Los írastornos proliferativos celulares, que se pueden prevenir, traíar o adicionalmeníe estudiar mediante la presente invención ¡ncluyen cáncer, írasíomos proliferativos de vasos sanguíneos y. trastornos proliferativos de células mesangiales. Los trastornos proliferativos de vasos sanguíneos se refieren a trastornos relacionados con la vasculogénesis (formación de vasos sanguíneos) anormal y la angiogénesis (extensión de los vasos sanguíneos) anormal. Aunque la vasculogénesis y angiogénesis juegan un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos normales tales como desarrollo embrionario, formación del cuerpo lúteo, cicatrización de heridas y regeneración de órganos, también juegan un papel fundamental en el desarrollo del cáncer en el que dan como resultado la formación de nuevos capilares necesarios para mantener un tumor vivo. Oíros ejemplos de trastornos de proliferación de vasos sanguíneos ¡ncluyen artritis, en la que nuevos vasos sanguíneos capilares invaden la articulación y desíruyen el cartílago, y enfermedades oculares, como la retinopafía diabética, en la que nuevos capilares en la retina invaden el vitreo, sangran y causan ceguera. Se han identificado dos RTKs estructuralmente relacionadas que se unen al VEGF con alta afinidad: el receptor 1 tirosina de tipo fms (flt-l) (Shibuya et al., 1990, Oncoqene. 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science. 255:989-991) y el receptor KDR/FLK-1, también conocido como VEGF-R2. Se ha informado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un miíógeno específico de células endoteliales con actividad promotora del crecimiento celular endoíelial viíro. Ferrara y Henzel, 1989, Biochein. Biophvs. Res. Comm.. 161:851-858; Vaisman el al., 1990, J. Biol. Chem.. 265:19461-19566. La información expuesía en las Solicitudes de EE.UU. números 08/193.829, 08/038.596 y 07/975.750, sugiere firmemente que el VEGF no es solamente responsable de la proliferación celular endotelial, sino que también es regulador principal de la angiogénesis normal y patológica. Véase en general, Klagsburn y Soker, 1993, Current Biology. 3 (10) 699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037. La vasculogénesis y angiogénesis normales juegan papeles importantes en una variedad de procesos fisiológicos tales como desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, regeneración de órganos y procesos reproductivos femeninos fales como el desarrollo del folículo en el cuerpo lúteo durante la ovulación y el crecimiento de la placenta después de la gestación. Folkman y Shing, 1992, J. Bioloaical Chem.. 267(16): 10931-34. La vasculogénesis y/o angiogénesis inconíroladas se han asociado con enfermedades tales como la diabetes así como con íumores sólidos malignos que dependen de la vascularización para crecer. Klagsburn y Soker, 1993, Curreni Bioloav. 3(10):699-702; Folkham, 1991, J. Naíl. Cáncer Inst. 82:4-6; Weidner, et al., 1991. New Enal. J. Med.. 324:1- 5. El supuesto papel del VEGF en la proliferación y migración de células endoteliales duraníe la angiogénesis y vasculogénesis indica un papel importante del receptor KDR/FLK-1 en estos procesos. Las enfermedades tales como la diabetes meliitus (Folkman, 198, en Xlth Congress of Thrombosis and Haemosíasis (Versíraeía, eí al., eds.), pp. 583-596, Leuven Universiíy Press, Leuven) y la artritis, así como el crecimiento de tumores malignos pueden resultar de la angiogénesis incontrolada. Véase por ejemplo, Folkman, 1971, N. Engl. J. Med.. 285:1182-1186. Los receptores a los que el VEGF se une específicamente son una diana terapéutica importante y poderosa para la regulación y modulación de la vasculogénesis y/o angiogénesis y una variedad de enfermedades graves que implican crecimiento celular anormal causado por tales procesos. Plowman, et al., 1994, DN & P. 7(6):334-339. Más particularmente, el papel altamente específico del receptor KDR/FLK-1 en la neovascularización le hace un blanco de elección para las aproximaciones terapéuíicas al tratamiento del cáncer y otras enfermedades que implican la formación incontrolada de vasos sanguíneos. Así, la presente invención proporciona compuestos que regulan, modulan y/o inhiben la vasculogénesis y/o angiogénesis afectando la actividad enzimática del receptor KDR/FLK-1 e interfiriendo con la señal transducida por el KDR/FLK-1. Así la preseníe ¡nvención proporciona una aproximación terapéutica al traíamiento de muchas clases de tumores sólidos que ¡ncluyen, pero no se limitan a, glioblastoma, melanoma y sarcoma de Kaposi, y carcinoma de ovario, pulmón, mama, próstata, páncreas, colon y epidermoide. Además, los datos sugieren que la administración de compuestos que inhiben el camino de transducción de señal mediado por KDR/FIk-1 también se puede utilizar en el tratamienío de hemangioma, reestenosis y retinopaíía diabética. Además, esta invención se refiere a la inhibición de la vasculogénesis y angiogénesis por otros caminos mediados por receptor, incluyendo el camino que comprende el receptor flk-l. La transducción de señal mediada por receptor tirosina cinasa se inicia por la interacción exíracelular con un factor de crecimienlo (ligando) específico, seguido por la dimerización del recepíor, estimulación transitoria de la actividad intrínseca de proteína tirosina cinasa y auíofosforilación. Se crean así sitios de unión para moléculas iníracelulares de íransducción de señal que conducen a la formación de complejos con un especíro de moléculas citoplasmáticas de señalización que facilita la respuesta celular apropiada, por ejemplo, división celular, efectos mefabólicos en el mícroentomo extracelular. Véase, Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9:1-20. La estrecha homología de las regiones intracelulares del KDR/FLK-1 con la del recepíor PDGF-ß (homología del 50,3%) y/o el receptor flt-l relacionado indica la inducción de caminos de transducción de señal superpuestos. Por ejemplo, se ha demostrado que para el receptor PDGF-ß, los miembros de la familia src (Twamley et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90:7696-7700), fosfatidi[inositol-3'-cinasa (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipasa c? (Kashishian y Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol.. 4:49-51), proteína de activación de ras-GTPasa (Kashishian et al., 1992, EMBO J.. 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993. Proc. Nati.

Acad. Sci. USA. 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726), y las moléculas adaptadoras Shc y Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 6889-6896), se unen a regiones que implican diferentes sitios de autofosforilación. Véase en general, Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Así, es probable que los caminos de transducción de señal activados por KDR/FLK-1 incluyan el camino ras (Rozakis et al., 1992, Nature. 360:689-692), el camino PI-3'-cinasa, los caminos mediados por src y los caminos mediados por plc?. Cada uno de esíos caminos puede jugar un papel crítico en el efecto angiógeno y/o vasculógeno de KDR/FLK-1 en las células endoteliales. Consecuentemente, un aspecto aún adicional de esta ¡nvención se refiere al uso de los compuestos orgánicos descritos en la presente memoria para modular la angiogénesis y vasculogénesis que como tales procesos se controlan por estos caminos. A la inversa, los trastornos relacionados con la retracción, contracción o cerramiento de los vasos sanguíneos, tales como la reestenosis, también están implicados y se pueden trafar o prevenir por los métodos de esta invención. Los trastornos fibróticos se refieren a la formación anormal de matrices extracelulares. Los ejemplos de trastornos fibróticos incluyen cirrosis hepática, trastornos proliferativos de células mesangiales y fibrosis pulmonar. La cirrosis hepática se caracteriza por el aumento en constituyentes de matriz extracelular que da como resultado la formación de una cicatriz hepática. Un aumento de la matriz extracelular que da como resultado una cicaíriz hepática también se puede causar por una infección viral tal como la hepatitis. Los lipocitos parecen jugar un papel muy importante en la cirrosis hepática. Oíros trastornos fibróticos implicados ¡ncluyen la aterosclerosis. La fibrosis pulmonar puede resultar del trafamienío con radiación o del íratamienío con fármacos quimioterápicos. Los trastornos proliferativos de células mesangiales se refieren a trastornos provocados por la proliferación anormal de células mesangiales. Los trastornos proliferativos mesangiales incluyen diversas enfermedades renales humanas tales como glomerulonefritis, nefropaíía diabética y nefroesclerosis maligna así como trastornos tales como síndromes de microangiopatía trombótica, rechazo de transplantes, y glomerulopafías. Se ha implicado al RTK PDGFR en el mantenimiento de la proliferación de células mesangiales. Floege et al., 1993, Kidnev International 43:47S-54S. Muchos cánceres son trastornos proliferativos celulares y, como se ha destacado previamente, las PKs se han asociado con trastornos proliferativos celulares. Así, no es sorprendente que PKs íales como, por ejemplo, miembros de la familia RTK se han asociado con el desarrollo del cáncer. Algunos de estos receptores, como EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cáncer 63:227-233, Torp ef al., 1992, APMIS 100:713-719), HER2/neu (Slamon eí al., 1989, Science 244:707-712) y PDGR-R (Kumabe ei al., 1992, Oncogene. 7:627-633) se sobre-expresan en muchos tumores y/o se activan persistentemente por bucles autocrinos. De hecho, se han demostrado las sobre-expresiones de receptor (Akbasak y Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci.. 111:119-133, Dickson eí al., 1992. Cáncer Treatment Res. 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) y los bucles autocrinos (Lee y Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.. 118:1057-1070, Korc et al., supra. Akbasak y Suner-Akbasak et al., supra) en los cánceres más comunes y graves. Por ejemplo, se ha asociado al EGFR con carcinoma espinocelular, astrocitoma, glioblasíoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón y cáncer de vejiga. Se ha asociado al HER2 con cáncer de mama, ovario, gásfrico, pulmón, páncreas y vejiga. Se ha asociado al PDGFR con glíoblasfoma y melanoma así como con cáncer de pulmón, ovario y próstata. Se ha asociado a la RTK c-met con la formación de tumores malignos. Por ejemplo, se ha asociado la c-met con, entre otros cánceres, carcinomas y linfomas colorectal, tiroideo, pancreático, gástrico y hepatocelular. Adicionalmeníe se ha vinculado la c-meí a la leucemia. También se ha detectado la sobre-expresión del gen de c-met en pacientes con la enfermedad de Hodgkin la enfermedad de Burkift. El IGF-IR, además de estar implicado en el soporte nutricional y en la diabetes de tipo II, íambién se ha asociado con varios tipos de cánceres. Por ejemplo, se ha implicado al IGF-l como un estimulador del crecimiento autocrino para varios tipos de tumores, por ejemplo células de carcinoma de cáncer de mama humano (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invesí. 84:1418-1423) y células pequeñas de tumor de pulmón (Macauley et al., 1990, Cáncer Res., 50:2511-2517). Además, el IGF-I, aunque implicado íntegramente en el crecimienío y diferenciación normales del sistema nervioso, también parece ser un estimulador autocrino de gliomas humanos. Sandberg-Nordqvisf et al., 1993, Cáncer Res. 53:2475-2478. La importancia del IGF-IR y sus ligandos en la proliferación celular está soportada adicionalmente por el hecho de que muchos tipos de células en cultivos (fibroblastos, células epiteliales, células de músculo liso, linfocitos T, células mieloides, condrocítos y osteoblastos (las células madre de la médula ósea)) son estimulados a crecer por el IGF-I. Goldring y Goldring, 1991 , Eukaryotic Gene Expression. 1:301-326. Baserga y Coppola sugieren que el IGF-IR juega un papel central en el mecanismo de transformación y, como tal, puede ser una diana preferida para intervenciones terapéuticas para un amplio espectro de cánceres humanos. Baserga, 1995, Cáncer Res.. 55:249-252, Baserga, 1994, CeN 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol.. 14:4588-4595. Se ha implicado a las STKs en muchos tipos de cáncer que incluyen, en particular, el cáncer de mama (Canee, et al., Int. J. Cáncer, 54: 71-77 (1993)). La asociación entre la actividad anormal de PK y la enfermedad no se limiía al cáncer. Por ejemplo, las RTKs se han asociado con enfermedades tales como psoriasis, diabetes mellitus, endometriosis, angiogénesis, desarrollo de placa de ateroma, enfermedad de Alzheimer, reestenosis, enfermedad de von Hippel-Lindau, hiperproliferación epidérmica, enfermedades neurodegenerativas, degeneración macular relacionada con la edad y hemangiomas. Por ejemplo, el EGFR se ha señalado en la cicaírización de heridas de córnea y dermis. Se han señalado defectos en el recepíor de insulina (Insulina-R) y el IGF-R en la diabetes mellifus de tipo II. Una correlación más compleía eníre las RTKs específicas y sus indicaciones terapéuticas se expone en Plowman et al., 1994, DN & P 7:334-339. Según se ha indicado previamente, no solo las RTKs sino las CTKs que incluyen, pero no se limiían a, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, Ick, blk, hck, fgr y yrk (revisadas por Bolen eí al., 1992, FASEB J.. 6:3403-3409) esíán implicadas en el camino de íransducción de señal proliferaíivo y mefabólico y así se podía esperar, y se ha demosírado, que están implicadas en muchos trastornos mediados por PTK a los que esíá dirigida la preseníe invención. Por ejemplo, se ha demosírado que la src mutada (v-src) es una oncoproteína (pp60v"src) en pollo. Además, su homólogo celular, el proto-oncogen pp60c"src transmite señales oncogénicas de muchos receptores. La sobre-expresión del EGFR o el HER2/neu en tumores conduce a la activación constiíufiva del pp60c"src, que es caracíerísíica de células malignas pero ausente en células normales. Por oíra parte, los ratones deficientes en la expresión de c-src exhiben un fenotipo osteopetrótico, que indica una participación clave del c-src en la función del osfeociaslo y una posible implicación en los trastornos relacionados. Igualmente, se ha implicado al Zap70 en la señalización de células T que puede relacionarse con trastornos autoinmunitarios. Las STKs se han asociado con la inflamación, enfermedad autoinmunitaria, inmunorespuestas, y írasíomos de hiperproliferación íales como reesíenosis, fibrosis, psoriasis, artrosis y artritis reumatoide. También se han implicado las PKs en la implantación embrionaria. Así, los compuestos de esta ¡nvención pueden proporcionar un método eficaz de prevenir tal implantación embrionaria y por lo tanío ser útiles como agentes de control de natalidad. Trastornos adicionales que se pueden frafar o prevenir utilizando los compuestos de esta invención son trasfornos inmunitarios tales como enfermedad autoinmunitaria, SIDA y trastornos cardiovasculares tales como ateroesclerosis. Finalmente, en la actualidad se sospecha que tanío las RTKs como las CTKs esíán implicadas trastornos hiperinmunitarios. Los compuesíos y datos presenfados no deben ser interpretados como limitantes del alcance de esía ¡nvención de ninguna manera cualesquiera.

Composiciones Farmacéuticas v su Uso Un compuesto de la presente invención o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, se puede administrar como tal a un paciente humano o se puede administrar en composiciones farmacéuticas en las que los productos anteriores se mezclan con vehículos o excipiente(s) adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en la última edición de "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA.

Ruías de Adminisíración Las rutas de administración adecuadas pueden incluir, sin limiíación, la administración oral, intraoral, rectal, transmucosa o intestinal o las inyecciones intramuscular, epicutánea, parenteral, subcutánea, transdérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, ¡ntravítrea, iníraperiíoneal, iníranasal, iníramuscular, iníradural, inírarrespiraíoria, de inhalación nasal o infraocular. Las rufas de administración preferidas son la oral y la parenteral. Alternativamente, se puede administrar el compuesto de una manera local en lugar de sisfémica, por ejemplo, vía inyección del compuesto directamente en un tumor sólido, a menudo en una formulación depot o de liberación sostenida. Además, se puede administrar el fármaco en un sistema de administración de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con anticuerpo específico del tumor. Los liposomas se dirigirán a y se absorberán selectivamente por el lumor.

Composición/Formulación Las composiciones farmacéuíicas de la presente invención se pueden fabricar mediante procedimienfos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulado, inmovilización, liofilización o secado por atomización.

Las composiciones farmacéuticas para el uso en los métodos de la presente ¡nvención se pueden preparar por cualquiera de los métodos de farmacia, pero todos los métodos ¡ncluyen la etapa de hacer entrar en asociación el ingrediente activo con el vehículo que constiíuye uno o más ingredientes necesarios. En particular, las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente ¡nvención se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la rufa de administración elegida. Las formas farmacéuticas incluyen comprimidos, trociscos, dispersiones, suspensiones, disoluciones, cápsulas, parches, jarabes, elixires, geles, polvos, magmas, pastillas, pomadas, cremas, pastas, emplastos, lociones, discos, supositorios, nebulizadores nasales u prales, aerosoles y similares. Para inyección, los compuestos de la invención se pueden formular en disoluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales tampones con o sin una concentración baja de íensioactivo o cosolvente, o tampón fisiológico salino. Para administración transmucosa, se utilizan en la formulación sustancias penetrantes apropiadas para la barrera que se va a permear. Tales sustancias penetrantes son en general conocidas en la técnica.

Para adminisfración oral, los compuestos se pueden formular combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos posibilitan que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, pildoras, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares, para la ingestión oral por el paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden hacer utilizando un excipiente sólido, opcionalmeníe moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, después de añadir otras sustancias auxiliares si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes útiles son, en particular, materiales de carga tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manifol, o sorbiíol, preparaciones de celulosa íales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de írigo, almidón de arroz, y almidón de pataía y otros materiales íales como gelatina, goma arábiga, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximeíilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinil-pirrolidona enlrecruzada, agar, o ácido algínico. También se puede uíilizar una sal tal como el alginaío sódico. Los núcleos de grageas se suministran con los recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden uíilizar disoluciones conceníradas de azúcar que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, disoluciones de barniz, y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente incluyen cápsulas de cierre a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de cierre a presión pueden contener los ingredientes activos en mezcla con un material de carga tal como lactosa, un aglomerante tal como almidón, y/o un lubricante tal como talco o estearato magnésico y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, polietilenglicoles líquidos, cremophor, capmul, mono- di- o íriglicéridos de cadena media o larga. También se pueden añadir esíabilizadores es esías formulaciones. Para administración por inhalación, los compuestos para el uso según la presente invención se administran conv nientemente en forma de un pulverizador aerosol utilizando un envase presurizado o un nebulizador y un propelente adecuado, por ejemplo, sin limitación, diclorodifluorometano, friclorofluorometano, dicloroíeírafluoroeíano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede controlar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para el uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Los compuestos también se pueden formular para administración parenteral, por ejemplo, por inyección de embolada única o por infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener materiales de formulación tales como agentes de suspensión, esíabilizaníes y/o dispersantes. Las composiciones farmacéuticas para adminisíración pareníeral incluyen disoluciones acuosas de una forma soluble en agua, tal como, sin limitación, una sal, del compuesto activo. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos acíivos en un vehículo lipófilo. Los vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, ésíeres siníéíicos de ácidos grasos íales como oleaío de etilo y triglicéridos, o materiales tales como liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, íales como, carboximeíil-celulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes y/o ageníes que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones alíamente conceníradas. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para la preparación con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes del uso. Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases convencionales de supositorios tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones previamente descritas, los compuestos también se pueden formular como preparaciones depot. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección iníramuscular. Un compuesto de esta invención se puede formular para esta ruta de administración con materiales poliméricos o hidróbofos adecuados (por ejemplo, en una emulsión con un aceite farmacológicamente aceptable), con resinas de intercambio ¡ónico, o como un derivado moderadamente soluble tal como, sin limitación, una sal moderadamente soluble. Un ejemplo no limitante de un vehículo farmacéutico para los compuesto hidrófobos de la invención es un sistema cosolvente que comprende alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible con agua y una fase acuosa tal como el sistema co-solvente VPD. VPD es una disolución de 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del tensioacíivo no polar Polisorbato 80, y 65% p/v de polietilenglicol 300, preparado a volumen en etanol absoluto. El sistema de co-solvente VPD (VPD:D5W) consiste en VPD diluido 1:1 con disolución de dextrosa al 5% en agua. Este sistema co-solvente disuelve bien compuestos hidrófobos, y por si mismo produce baja toxicidad tras la administración sistémíca. Naíuralmente, las proporciones de tal sistema co-solvente se pueden variar considerablemente sin desíruir sus caracterísíicas de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes del co-solvente se puede variar: por ejemplo, se pueden uíilizar otros tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar del Polisorbato 80, se puede variar el tamaño de la fracción del polietilenglicol, oíros polímeros biocompatibles pueden remplazar al polietilenglicol, por ejemplo polivinil-pirrolidona, y otros azúcares o polisacáridos pueden sustifuir a la dextrosa. Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de administración para compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos y portadores de adminislración para fármacos hidrófobos. Además, también se pueden emplear ciertos disolventes orgánicos tales como el dimetilsulfóxido, aunque a menudo al coste de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos se pueden adminisírar utilizando un sisíema de liberación sostenida, tal como las matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrófobos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naíuraleza química, liberar los compuesíos duraníe unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden uíilizar estrategias adicionales para la estabilización de la proíeína. Las composiciones farmacéuticas en la presente memoria también pueden comprender vehículos o excipientes de fase sólida o gel adecuados. Los ejemplos de íales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limiían a, carbonato calcico, fosfato calcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles. Muchos de los compuestos moduladores de PK de la invención se pueden proporcionar como sales fisiológicamente aceptables en las que el compuesto reivindicado puede formar las especies cargadas negativamente o las cargadas positivamente. Los ejemplos de sales en las que el compuesto forma el resto cargado positivamente incluye, sin limitación, sales de amonio cuaternario (definidas en otro lugar en la presente memoria), íales como el hidrocloruro, sulfato, carbonato, lactato, tartrato, maleato, succinato, malato, acetato y metilsulfonato (CH3SO3), en las que el átomo de nitrógeno del grupo amonio cuaternario es un nitrógeno del compuesto seleccionado de esta invención que ha reaccionado con el ácido apropiado. Las sales en las que un compuesto de esta invención forma las especies cargadas negativamente incluyen, sin limitación, las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio formadas por la reacción de un grupo ácido carboxílico en el compuesto con una base apropiada (por ejemplo hidróxido sódico (NaOH), hidróxido potásico (KOH), hidróxido de calcio (Ca(OH)2), etc.). Dosificación Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en la preseníe invención incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad suficiente para alcanzar el propósito pretendido, es decir, la modulación de la actividad PK o el íraíamienío o prevención de un trastorno relacionado con PK. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de compuesto eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se va a trafar. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está en conformidad con la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente memoria. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la ¡nvención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Después, se puede formular la dosificación para el uso en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración en circulación que incluya la IC5o según se determinó en el cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición mitad de la máxima de la actividad c-Met). A continuación tal información se puede utilizar para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos descriíos en la presente memoria se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, determinando la IC5o y la LD50 (las cuales se discuten en otro lugar en la presente memoria) para un compuesío sujeto. Los datos obtenidos a partir de esíos ensayos de cultivos celulares y esfudios con animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosificación para el uso en seres humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, mía de adminisfración y dosificación se pueden elegir por el médico individual a la vista del estado del paciente. (Véase por ejemplo, Fingí, ef al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1 p. 1). La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de las especies activas que sean suficientes para mantener los efectos moduladores de la cinasa. Estos niveles plasmáticos se denominan como concentraciones eficaces mínimas (MECs). La MEC variará para cada compuesto pero se puede estimar a partir de los datos in vitro, por ejemplo, la concentración necesaria para alcanzar la inhibición del 50-90% de una cinasa se puede averiguar utilizando los ensayos descritos en la presente memoria. Las dosificaciones necesarias para alcanzar la MEC dependerán de las características individuales y de la ruta de administración. Se pueden uíilizar análisis de HPLC y bioanálisis para determinar las concentraciones plasmáticas. Los intervalos de dosificación también se pueden determinar utilizando el valor de la MEC. Los compuestos se deben administrar utilizando un régimen que mantenga los niveles plasmáticos por encima de la MEC durante el 10-90% del tiempo, preferentemente entre el 30-90% y más preferentemente entre el 50-90%. Actualmente, las cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos de Fórmula (I) pueden extenderse desde aproximadamente 10 mg/m2 a 1000 mg/m2 por día. Incluso más preferentemente 25 mg/m2 a 500 mg/m2. En los casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local del fármaco puede no estar relacionada con la concentración plasmática y se pueden emplear otros procedimientos conocidos en la técnica para determinar la cantidad e intervalo de dosificación correcta. La cantidad de una composición administrada será, por supuesto, dependiente del sujeto que se va a tratar, la gravedad de la afección, la manera de administración, el juicio del médico que prescribe, etc. Envasado Las composiciones se pueden presentar, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas farmacéuticas que contienen el principio activo. El envase puede por ejemplo comprender una hoja de mefal o de plásíico, tal como un blíster. El envase o el dispositivo dispensador pueden estar acompañados por ¡nstrucciones para la administración. El envase o el dispensador también pueden estar acompañados de un aviso asociado al envase en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de sustancias farmacéuticas, aviso que es reflexivo de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o de la adminisíración humana o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede esfar en el eliqueíado aprobado por la Food and Drug Administraíion de EE.UU. para la prescripción de fármacos o en un prospecto aprobado del producto. Las composiciones que comprenden un produelo de la ¡nvención formulado en un vehículo farmacéutico compatible también se pueden preparar, poner en un envase apropiado, y etiquetar para el tratamiento de una enfermedad indicada. Las Enfermedades adecuadas indicadas en la etiquete pueden incluir el tratamiento de un tumor, inhibición de angiogénesis, íratamienío de fibrosis, diabetes, y similares. Los ejemplos siguientes se dan para ilustrar la presente invención. Se debe entender, sin embargo, que la invención no se debe limitar a las condiciones específicas o deíalles específicos descritos en estos ejemplos. A través de la memoria, cualesquiera y todas las referencias a documentos públicamente disponibles se incorporan específicamente en esta solicitud de patente como referencia.

EJEMPLOS Esquema Sintético General Esquema General Intermedios Eiemplo A Éster eíílico del ácido 2-meíil-6-oxo-1, 4,5,6-tetrahidro-c¡clopenta[b]p¡rrol-3-carboxílico Método 1 Se mezclaron juntos ácido polifosfórico (20 g) y P2O5 (1,0 g) y se calentaron a 70°C durante 20 min. A la mezcla se añadió ácido 3-(4- etox¡carbonil-5-meíil-3-pirrolil)propiónico (1 ,0 g, 4,44 mmol) y se continuó calentando durante 20 horas. La reacción se vertió en hielo-agua, se extrajo con EíOAc. La capa orgánica se lavó con salmuera y NaHCO3 sat., y se secó (MgSO ). Después de eliminar el disolvente, el producío bruío se recrisíalizó de CH2CI2-hexano para dar (0,78 g, 85%) del ésíer eíílico del ácido 2-metii-6-oxo-1 ,4,5,6-teírahídro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxílico como un sólido blanco. Método 2 Una mezcla de ácido metanosulfónico (170,0 g) y P2O5 (17,0 g) se agitó de temperatura ambiente a 100°C durante 1 hora hasta que se convirtió en una disolución íransparenfe. La disolución se enfrió a 30°C y a continuación se añadió el ácido 3-(4-etoxicarbonil-5-metiI-3-pirroIil)propiónico (10,0 g, 44,4 mmol) en porciones con agitación. La mezcla se agitó a 30-40°C durante 4 horas y después se dejó estar en reposo a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se vertió lentamente en hielo-NaHCO3 (60,0 g). El precipitado se recogió por filíración, se lavó con agua, NaHCO3 sat. y agua por turnos para dar 8,59 g (97%) del compuesto del título como un sólido blanco grisáceo. 1HNMR (400 MHz, CDCl3) d 10,8 (s ancho, 1H, NH), 4,29 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,03 (m, 2H), 2,88 (m, 2H), 2,68 (s, 3H, CH3), 1,36 (t, J = 7 Hz, 3H). MS m/z 206 [M-1]. Eiemplo B Ácido 2-metil-6-oxo-1,4,5,6-fetrahidro-cíclopen-fa[b]pirrol-3-carboxílico Una suspensión del éster etílico del ácido 2-metil-6-oxo-1, 4,5,6-teírahidro-ciclopenfa[b]pirrol-3-carboxílico (Eiemplo A, 8,28 g, 40 mmol) en LiOH acuoso 1 N (150 mL) se agitó a 50-60°C durante 48 horas. Se obtuvo una disolución amarillenta transparente. La reacción se enfrió, se vertió sobre hielo y se aciduló con HCl 6 N a pH 3,0. El sólido se recogió por filíración, se lavó con agua y se secó para dar 6,55 g (91%) del compuesto del tííulo como un sólido blanco. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 12,12 (s ancho, 1H, NH), 12,0 (s ancho, 1H, COOH), 2,83 (m, 2H), 2,66 (m, 2H), 2,44 (s, 3H, CH3). MS m/z 178 [M-1]. Eiemplo C Bencilamida del ácido 2-metil-6-oxo-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxíIico Una mezcla de ácido 2-metil-6-oxo-1,4,5,6-fetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico (Ejemplo B. 268,5 mg, 1,5 mmol), HOBt (202,5 mg, 1 ,5 mmol) y EDC (573,5 mg, 3 mmol) en DMF (5 mL) seca se agitó a temperaíura ambiente durante 20 min. A continuación se añadió anilina (3,0 mmol) a la mezcla y se continuó agitando durante 24 horas. La reacción se diluyó con Na2CO3 sai. y agua, el sólido se recogió por filtración a vacío, se lavó con Na2CO3 sat. y agua por turnos, y se secó para dar 315 mg del compuesto del tííulo como un sólido blanco. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,96 (s, 1H, NH), 7,63 (t, 1 H), 7,27-7,33 (m, 4H), 7,18-7,23 (m, 1H), 4,4 (d, J = 6 Hz, 2H, NCH3), 2,96 (m, 2H), 2,69 (m, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3). MS m/z 267 [M-1]. Ejemplo D 4-CIoro-benciIamida del ácido 2-meíil-6-oxo-1 ,4,5,6-teírah¡dro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico Procedimiento como el del Ejemplo C, pero se utilizó 4-cloroanilina para dar 403 mg del compuesto del título como un sólido blanco. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,98 (s, 1 H, NH), 7,65 (t, 1 H), 7,29-7,37 (m, 4H), 4,38 (d, J = 6 Hz, 2H, NCH2), 2,96 (m, 2H), 2,69 (m, 2H), 2,42 (s, 3H, CH3). MS miz 301 [M-1]. Eiemplo E 2,6-Difluoro-benciIamida del ácido 2-metil-6-oxo-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico Procedimiento como el del Ejemplo C, pero se utilizó 2,6-dífluoroanilina para dar 401 mg del compuesto del título como un sólido blanco. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,93 (s, 1 H, NH), 7,52 (t, 1 H), 7,37 (m, 1H), 7,05 (m, 2H), 4,45 (d, J = 6 Hz, 2H, NCH2), 2,87 (m, 2H), 2,66 (m, 2H), 2,38 (s, 3H, CH3). MS miz 303 [M-1]. Eiemplo F 2-Metil-3-((S)-2-pirrolidin-1 -ilmeíil-pirrolidin-1 -carbonil)-4,5-dihidro-1 H-c¡clopenta[b]pirrol-6-ona Una mezcla de ácido 2-metil-6-oxo-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico (Ejemplo B, 3,58 g, 20 mmol), HOBt (2,7 g, 20 mmol) y EDC (5,74 g, 30 mmol) en DMF seca (50 mL) se agitó de 0°C a temperafura ambiente durante 20 min. Después se añadió (S)-(+)-1-(2-pirroIidinilmetil)pirrolidina (24 mmol) y se continuó agitando durante 48 horas.

Se eliminó el disolvente a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con Na2CO3 sat., se secó, se concentró y se purificó en una columna de gel de sílice para dar 5,1 g (81%) del compuesto del título como una espuma amarillenta. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,85 (s, 1 H, NH), 4,2 (m ancho, 1H), 3,38 (m, 2H), 2,75 (m, 1H), 2,66 (m, 2H), 2,65 (m, 1 H), 2,4 (m, 6H), 2,24 (s, 3H, CH3), 1,96 (m, 1 H), 1 ,81 (m, 3H), 1 ,6 (m, 4H). MS /77/z 314 [M-1]. Ejemplo 1 Éster etílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-1 ,2-dihidro-¡ndol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-tetrah¡dro-c¡clopenta[b]pirro -3-carboxílico Una mezcla de oxindol (44 mg, 0,33 mmol) y éster etílico del ácido 2-metil-6-oxo-1 ,4,5,6-tetrah¡dro-ciciopenta[b]p¡rrol-3-carboxíl¡co (Eiemplo A, 62 mg, 0,3 mmol) en DMF (5 mL)-piperidina (0,5 mL) se calentó a 110°C con agitación durante 72 horas. Se eliminó la mayoría del disolvente a presión reducida y el residuo se diluyó con etanol. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con etanol y se secó para dar 56 mg (58%) del compuesto del tííulo como un sólido amarillo. 1HNMR (400MHz, CDCI3) d 11 ,61 (s ancho, 1 H, NH), 7,6 (s, 1 H, NH), 7,44 (d, 1 H), 7,15 (t, 1 H), 7,07 (i, 1H), 6,91 (d, 1H), 4,3 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,17 (m, 2H), 2,66 (s, 3H, CH3), 1,37 (t, J = 7 Hz, 3H). MS miz 321 [M-1]. Eiemplo 2 Ésíer eíílico del ácido 6-[5-(2,6-dicloro-fenilmetanosulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-íeírahidro-cicIopenla[b]pirrol-3-carboxílico Procedimiento similar al del Eiemplo 1 para dar 48% del compuesto del tííulo como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,67 (s, 1H, NH), 1,14 (s, 1H, NH), 7,49 (m, 4H), 7,39 (dd, 1 H), 7,03 (d, 1H), 4,85 (s, 2H), 4,2 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,34 (m, 2H), 3,04 (m, 2H), 2,63 (s, 3H, CH3), 1,28 (t, J = 7 Hz, 3H). MS m/z 543 [M-1]. Eiemplo 3 Éster etílico del ácido 2-metil-6-[5-meíiIsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-il¡den]-1, 4,5, 6- íeírahidro-ciclopenta[b] pirrol-3-carboxílico Procedimiento similar al del Eiemplo 1 para dar 63% del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,69 (s, 1H, NH), 11 ,01 (s, 1H, NH), 7,75 (d, 1H), 7,53 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1H), 7,3 (c, 1H, NH), 7,0 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,18 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,56 (m, 2H), 3,07 (m, 2H), 2,61 (s, 3H, CH3), 2,37 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3), 1 ,27 (t, J = 7 Hz, 3H). MS /77/z 414 [M-1]. Ejemplo 4 Metilamida del ácido 3-[2-Metil-4,5-dihidro-1H-cicIopenía[b]pirrol-(6Z)-¡liden]-2-oxo-2,3-d¡hidro-1H-indoI-5-sulfónico Véase el Ejemplo 5. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,36 (s,1H, NH), 10,91 (s, 1 H, NH), 7,74 (d, 1H), 7,48 (dd, 1 H), 7,25 (c, 1H, NH), 6,99 (d, 1H), 6,02 (s,1 H), 3,56 (m, 2H), 2,93 (m, 2H), 2,39 (s, 3H, CH3), 2,37 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3). MS miz 342 [M-1]. Eiemplo 5 Ácido 2-metil-6-[5-mefilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-telrahidro-ciclopenía[b]p¡rrol-3-carboxílico Una mezcla de metilamida del ácido 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-suIfón¡co (905 mg, 4 mmol) y ácido 2-metil-6-oxo-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenía[b]p¡rrol-3-carboxílico (Ejemplo B, 716 mg, 4 mmol) en DMF (50 mL) y piperidina (5 mL) se calentó a 110°C con agitación durante 48 horas. Se eliminó el disolvente y el residuo se suspendió en metanol-hielo-agua y se aciduló con HCl 2N. El sólido se recogió por filtración y a continuación se suspendió en DCM. La suspensión se lavó con NaOH acuosa 2N por tres veces. La capa acuosa combinada se lavó con DCM. La capa acuosa se aciduló con HCl 2N y se filtró para dar un sólido marrón, que se trituró con MeOH para proporcionar 380 mg del compuesto del título como un sólido amarillo marrón. La capa orgánica combinada se secó (Na2SO ) y se evaporó para dar 130 mg de la metilamida del ácido 3-[2-metil-4,5-d¡hidro-1H-ciclopenta[b]pirroI-(6Z)-iI¡den]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico (Ejemplo 4) como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 12,16 (s ancho, 1H, COOH), 11 ,64 (s, 1 H, NH), 11 ,0 (s, 1 H, NH), 7,75 (d, 1 H), 7,52 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1 H), 7,3 (c, 1 H, NH), 7,0 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,56 (m, 2H), 3,07 (m, 2H), 2,61 (s, 3H, CH3), 2,36 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3). MS miz 386 [M-1]. Eiemplo 6 Ester etílico del ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 65% del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,69 (s, 1H, NH), 11 ,09 (s,1H, NH), 7,82 (s, 1H), 7,66 (d, 1H), 7,05 (d,1H), 4,19 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,18 (s, 3H, CH3), 3,08 (m, 2H), 2,62 (s, 3H, CH3), 1,27 (t, J = 7 Hz, 3H). MS miz 399 [M-1]. Eiemplo 7 Éster etílico del ácido 6-[5-dimetilsulfamoi!-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4, 5,6-tetrahidro-c¡clopenta[b]pirrol-3-carboxílíco Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 59% del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,68 (s, 1H, NH), 11 ,07 (s, 1H, NH), 7,62 (d, 1H), 7,49 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1 H), 7,06 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,18 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 2,61 (s, 3H, CH3), 2,59 (s, 6H, N (CH3) 2), 1 ,26 (t, J = 7 Hz, 3H). MS /77/z 428 [M-1]. Eiemplo 8 Éster etílico del ácido 6-[5-¡sopropilsulfamoil-2-oxo- 1,2-dih¡dro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1,4,5,6-teírahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico Procedimiento similar al del Eiemplo 1 para dar 65% del compuesto del tííulo como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,68 (s, 1 H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,79 (d, 1H), 7,55 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 7 Hz, 1H, NH), 6,98 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,18 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,55 (m, 2H), 3,18 (m, 1 H), 3,07 (m, 2H), 2,61 (s, 3H, CH3), 1,26 (s, 3H, CH3), 0,93 (d, J = 6 Hz, 6H, 2xCH3). MS /77/z 442 [M-1]. Ejemplo 9 Éster efílico del ácido 6-[5-eíanosulfonil-2-oxo-1,2-dihidro-indoI-3-(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenfa[b]pirroI-3-carboxílico Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 40% del compuesto del tííulo como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,68 (s, 1H, NH), 11,1 (s, 1H, NH), 7,76 (d, 1 H), 7,6 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1 H), 7,05 (d, J = 8 Hz, 1 H), 4,18 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,76 (m, 2H), 3,25 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,06 (m, 2H), 2,61 (s, 3H, CH3), 1,27 (t, J = 7 Hz, 3H), 1 ,10 (t, J = 7 Hz, 3H). MS /?7/z 413 [M-1]. Eiemplo 10 (2-Hidroxi-3-pirrolidin-1-il-propil)-amida del ácido 2-metiI-6-[5-meíilsulfamo¡l-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iIiden]-1,4,5,6-íeírahidro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxílico Una mezcla de ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico (Ejemplo 5. 78 mg, 0,2 mmol), HOBt (27 mg, 0,2mmol) y EDC (77 mg, 0,4 mmol) in DMF seca (2 mL) se agitó a temperaíura ambiente durante 30 min. A continuación se añadió 1-amino-3-pirrolidin-1-il-propan-2-ol (0,4 mmol) y se continuó agitando durante 48 horas. Se eliminó el disolvente a presión reducida y el residuo se cristalizó y se purificó en una columna de gel de sílice para dar 54 mg del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,6 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1 H, NH), 7,76 (d, 1H), 7,52 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1 H), 7,28 (c, 1H, NH), 7,11 (t, 1H, NH), 7,01 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,85 (m, 1H, OH), 3,71 (m, 1H), 3,61 (m, 2H), 3,18 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 3,3-3,4 (m, 2H), 2,59 (s, 3H, CH3), 2,5 (m, 4H), 2,37 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3), 1 ,66 (m, 4H). MS m z 512 [M-1]. Eiemplo 11 (3-Ciclopropilamino-2-hidroxi-propil)-amida del ácido 2-metil-6-[5-mefilsuIfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-íeírahidro-c¡clopenfa[b]pirrol-3-carboxíl¡co Procedimiento como el del Eiemplo 10. pero se utilizó 1-amino-3-ciclopropilamino-propan-2-ol para dar 53 mg del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,61 (s, 1 H, NH), 11,01 (s, 1H, NH), 7,77 (d, 1 H), 7,53 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1 H), 7,29 (c, 1 H, NH), 7,14 (t, 1 H, NH), 7,02 (9d, J = 8 Hz, 1H), 4,86 (d, 1H, OH), 3,67 (m, 1H), 3,62 (m, 2H), 3,3 (m, 2H), 3,22 (m, 1H), 3,17 (m, 2H), 2,6 (m, 2H), 2,59 (s, 3H, CH3), 2,38 (d, J = Hz, 3H, NCH3), 2,09 (m, 1 H), 0,35 (m, 2H), 0,22 (m, 2H). MS m/z 500 [M+1]. Ejemplo 12 (2-Dimet¡Iamino-etil)-amida del ácido 2-meíil-6-[5-metilsulfamoiI-2-oxo-1 ,2-dih¡dro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico Procedimiento como el del Ejemplo 10, pero se utilizó NN-dimetiletilendiamina para dar 55 mg del compuesto del título como un sólido naranja. 1H?MR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,58 (s, 1 H, ?H), 11,0 (s, 1 H, ?H), 7,76 (d, 1H), 7,52 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1 H), 7,28 (c, 1H, ?H), 7,06 (t, 1H, ?H), 7,0 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,6 (m, 2H), 3,29 (m, 2H), 3. 14 (m, 2H), 2,58 (s, 3H, CH3), 2,38 (f, 2H), 2,37 (d, J = 5 Hz, 3H, ?CH3), 2,18 (s, 3H, ?(CH3)2).

MS /77/z 456 [M-1]. Eiemplo 13 Metilamida del ácido 3-[2-metil-3-((R)-2-p¡rrolidin-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbon¡l)-4,5-dihidro-1 H-cicIopenta[b]pirroI-(6Z)-¡liden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico Procedimiento como el del Eiemplo 10. pero se utilizó (S)-(+)-1-(2-pirroIidiniImetil)pirrolidina para dar 54 mg del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,56 (s ancho, 1H, NH), 10,98 (s, 1H, NH), 7,75 (d, 1 H), 7,51 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1H), 7,28 (c, 1H, NH), 7,01 (d, J = 8 Hz, 1 H), 4,22 (m ancho, 1H), 3,59 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 2,96 (m, 2H), 2,46 (m, 6H), 2,4 (s, 3H, CH3), 2,37 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3), 2,0 (m, 1 H), 1,84 (m, 3H), 1,62 (m, 4H). Eiemplo 14 Éster etílico del ácido 2-meti!-6-[2-oxo-5-suIfamoil-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 75% del compuesto del titulo como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,70 (s, 1 H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 7,85 (s, 1H), 7,58 (d, 1H), 7,2 (s, 2H,NH2), 6,97 (d,1H), 4,2 (c, J = 7 Hz, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,09 (m, 2H), 2,62 (s,3H, CH3), 1,27 (t, J = 7 Hz, 3H). MS miz 400 [M-1]. Ejemplo 15 Metilamida del ácido 3-ciclopentiliden-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfónico Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 73% del compuesto del título como un sólido gris. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 10,84 (s, 1H, NH), 7,73 (d, 1H), 7,59 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1H), 7,31 (c, 1H, NH), 6,98 (d, J = 8 Hz, 1H), 2,99 (t, 2H), 2,86 (t, 2H), 2,35 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3), 1 ,83 (m, 2H), 1,75 (m, 2H). MS m z 291 [M-1]. Eiemplo 16 Metilamida del ácido 3-[3-metanosulfonil-2-metil-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 73% del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,82 (s, 1 H, NH), 11 ,06 (s, 1 H, NH), 7,76 (d,1H), 7,55 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1H), 7,32 (c, 1 H, NH), 7,02 (d, J = 8 Hz, 1 H), 3,59 (m, 2H), 3,13 (s, 3H, CH3), 3,10 (m, 2H), 2,6 (s, 3H,CH3), 2,37 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3). MS m/z420 [M-1]. Ejemplo 17 Ácido {6-metoxi-3-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-indan-1-iI}-acético Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 28% del compuesto del título como un sólido amarillo verdoso. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 12,35 (s,1H, COOH), 10,96 (s, 1H, NH), 9,47 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,86 (s,1H), 7,6 (d, 1H), 7,29 (c, 1H, NH), 7,12 (d, 1H), 6,99 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,95 (dd, 1H), 3,84 (s, 3H,OCH3), 3,64-3,76 (m, 2H), 3,3 (d, 1H), 2,92 (dd, 1 H), 2,55 (m, 1H), 2,4 (d, J = 5 Hz, 3H, NCH3). MS miz 427 [M-1]. Eiemplo 18 5-Fluoro-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1 -ilmeíil-pirrolidin-1 -carboniI)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-¡ndol-2-ona Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 62% del compuesto del título como un sólido amarillo verdoso. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,62 (s, 1H, NH), 10,57 (s, 1H, NH), 7,2 (dd, 1 H), 6,9 (m, 1H), 6,83 (dd, 1 H), 4,22 (m ancho, 1 H), 3,56 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,48 (m, 6H), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,0 (m, 1H), 1 ,85 (m, 3H), 1,64 (m, 4H). MS m/z 449 [M+1]. Eiemplo 19 6-Metoxi-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1 -ilmetil-pirrolidin-1 -carbonil)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenía[b]pirroI-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-indoI-2-ona Quiral Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 70% del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11 ,42 (s ancho, 1 H, NH), 10,5 (s, 1H, NH), 7,28 (d, J = 8 Hz, 1 H), 6,53 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1H), 6,44 (d, J = 2 Hz, 1H), 4,2 (m ancho, 1H), 3. 73 (s, 3H, OCH3), 3,46 (m, 2H), 3,41 (m, 2H), 2,9 (m, 2H), 2,48 (m, 6H), 2,36 (s, 3H, CH3), 1,99 (m, 1 H), 1,83 (m, 3H), 1,61 (m, 4H). MS miz 461 [M-1]. Eiemplo 20 4-Metoxi-3-[2-metiI-3-((S)-2-pirrolidin-1 -ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirroK6Z)-iliden]-1,3-dihidro-indol-2-ona Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 63% del compuesto del título como un sólido amarillo. HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,58 (s ancho, 1H, NH), 10,55 (s, 1H, NH), 7,41 (d, 1H), 7,29 (m, 2H), 7,0-7,1 (m, 3H), 6,99 (d, 1H), 4,2 (m ancho, 1H), 3,75 (s, 3H, OCH3), 3,55 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,45 (m, 6H), 2,39 (s, 3H, CH3), 2,0 (m, 1 H), 1 ,84 (m, 3H), 1,62 (m, 4H). MS m/z 535 [M-1]. Eiemplo 21 7-cloro-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmeíil-pirroIidin-1-carbonil)-4,5-dih¡dro-1H-ciclopenía[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1,3-dih¡dro-indol-2-ona Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 57% del compuesío del título como un sólido amarillo verdoso. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,58 (s ancho, 1 H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,36 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,12 (dd, 1H), 6,97 (t, 1H), 4,22 (m ancho, 1 H), 3,55 (m, 2H), 3,41 (m, 2H), 2,91 (m, 2H), 2,46 (rri, 6H), 2,4 (s, 3H, CH3), 1 ,98 (m, 1 H), 1 ,84 (m, 3H), 1,62 (m, 4H). MS miz 463 [M-1]. Eiemplo 22 3-[2-Metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-cicIopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-2-ona Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 21% del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,46 (s ancho, 1H, NH), 11 ,08 (s, 1H, NH), 7,95 (dd, 1H), 7,66 (d, 1H), 6,95 (dd, 1H), 4,2 (m ancho, 1H), 3,54 (m, 2H), 3,41 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,45 (m, 6H), 2,4 (s, 3H, CH3), 1,98 (m, 1 H), 1 ,84 (m, 3H), 1,61 (m, 4H). MS miz 430 [M-1]. Eiemplo 23 6-(4-Meíoxi-fenil)-3-r2-meíil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmefil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenía[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1,3-dihidro-indol-2-ona Procedimiento similar al del Ejemplo 1 para dar 63% del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11,55 (s ancho, 1H, NH), 10,61 (s, 1H, NH), 7,55 (m, 2H), 7,43 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,21 (dd, J = 2 y 8 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,01 (m, 2H), 4,2 (m ancho, 1H), 3,78 (s, 3H,OCH3), 3,55 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,5 (m, 6H), 2,39 (s, 3H,CH3), 2,0 (m, 1 H), 1,84 (m, 3H), 1,62 (m, 4H). MS /77/z 535 [M-1].

Se apreciará que, en cualquier serie dada de compuestos, se observará un intervalo de actividades biológicas. En sus aspectos actualmente preferidos, esta invención se refiere a nuevas indolinonas sustituidas, geométricamente restringidas, capaces de modular, regular y/o inhibir la actividad de proteína cinasa. Los análisis siguientes se pueden emplear para seleccionar los compuestos que demuestran el grado óptimo de la actividad deseada. Procedimientos de Ensayo Los ensayos in vitro siguientes se pueden utilizar para determinar el nivel de actividad y efecto de los diferentes compuestos de la presente ¡nvención sobre una o más de la PKs. Se pueden diseñar siguiendo las mismas líneas análisis similares para cualquier PK usando técnicas bien conocidas en la materia. Varios de los ensayos descritos en la presente memoria se realizan en un formato ELISA (Ensayo tipo Sandwich de Sustancias Inmunoabsorbentes Unidas a Enzimas) (Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Manual de Clinical Immunology, 2a ed., Rose 5 Friedman, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D. C, pp. 359-371). El procedimiento general es como sigue: se introduce un compuesto en células que expresan la cinasa de prueba, o de forma natural o de forma recombinante, durante un periodo de tiempo seleccionado después del cual, si la cinasa de prueba es un receptor, se añade un ligando que se sabe que activa el receptor. Las células se lisan y el lisado se transfiere a los pocilios de una placa ELISA previamente recubiertos con un anticuerpo específico que reconoce el sustrato de la reacción de fosforilación enzimática. Los componentes no sustratos del lisado celular se lavan y se detecta la cantidad de fosforilación sobre el sustrato con un anticuerpo que específicamente reconoce fosfotirosina comparado con células de control que no se pusieron en contacto con el compuesto de prueba. Más abajo se proporcionan los protocolos actualmente preferidos para llevar a cabo los experimentos ELISA para PKs específicas. Sin embargo, la adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de los compuestos contra otras RTKs, así como para CTKs y STKs, está muy dentro del alcance del conocimiento de los expertos en la técnica. Otros ensayos descritos en la presente memoria miden la cantidad de ADN producida en respuesta a la activación de una cinasa de prueba, que es una medida general de una respuesía proliferativa. El procedimiento general para este análisis es como sigue: se introduce un compuesto en células que expresan la cinasa de prueba, o de forma natural o de forma recombinante, durante un periodo de tiempo seleccionado después del cual, si la cinasa de prueba es un receptor, se añade un ligando que se sabe que activa el receptor. Después de la incubación por lo menos durante toda la noche, se añade un reactivo marcador de ADN tal como la 5-bromodesoxiuridina (BrdU) o la H3-timidina. La canfidad de DNA marcado se delecta o con un anticuerpo anti-BrdU o midiendo la radioactividad y se compara con células de control no puestas en contacto con un compuesto de prueba. BIOENSAYO DE GST-FLK-1 Este ensayo analiza la actividad de tirosina cinasa de GST-Flk1 sobre pépíidos poli(glu-tyr). Materiales v Reactivos: 1. Placas de ELISA de 96 pocilios de Corning (Catálogo de Corning, N° 25805-96). 2. poli(glu-tyr) 4:1 , liofilizado (Catálogo de Sigma, N° P0275), 1 mg/ml en PBS estéril. 3. Tampón PBS: para 1 L, mezclar 0,2 g de KH2PO4, 1,15 g de Na2HPO4, 0,2 g de KCl y 8 g de NaCI en aprox. 900 mi de dH2O. Cuando todos los reactivos se han disuelto, ajustar el pH a 7,2 con HCl. Llevar el volumen total a 1 L con dH2O. 4. Tampón PBST: a 1 L de Tampón PBS, añadir 1,0 ml de Tween-20. 5. Tampón de Bloqueo con TBB: para 1 L, mezclar 1,21 g de TRIS, 8,77 g de NaCI, 1 ml de TWEEN-20 en aproximadamente 900 ml de dH2O. Ajustar el pH a 7,2 con HCl. Añadir 10 g de BSA, agiíar para disolver. Llevar el volumen foíal a 1 L con dH2O. Filírar para eliminar material formado de partículas. 6. BSA al 1% en PBS: añadir 10 g de BSA a aprox. 990 ml de fampón PBS, agitar para disolver. Ajustar el volumen total a 1 L con tampón PBS, filtrar para eliminar material formado de partículas. 7. Hepes 50 mM pH 7,5. 8. GST-Flk1cd purificado a partir de la transformación sf9 de baculovirus recombinante (SUGEN, Inc.). 9. DMSO al 4% en dH2O. 10. ATP 10 mM en dH2O. 11. MnCI240 mM 12. Tampón de Dilución de Cinasa (KDB): mezclar 10 ml de Hepes (pH 7,5), 1 mi de NaCI 5M, 40 µL de ortovanadato de sodio 100 mM y 0,4 ml de BSA al 5% en dH2O con 88,56 mi de dH2O. 13. Placas NUNC de polipropileno de 96 pocilios de fondo en V, Catálogo de Applied Scientific, N° AS-72092 14. EDTA: mezclar 14,12 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) con aprox. 70 ml de dH2O. Añadir NaOH 10 N hasta que el EDTA se disuelve. Ajustar el pH a 8,0. Ajustar el volumen total a 100 ml con dH2O. 15. 1° y 2o Tampón de Dilución de Anticuerpo: mezclar 10 ml de BSA al 5% en fampón PBS con 89,5 mi de TBST. 16. Antisueros anti-fosfotirosina policlonales de conejo (SUGEN, Inc.) 17. Conjugado anfi-conejo HRP preparado en cabra. 18. Disolución de ABST: A aprox. 900 ml de dH2O añadir 19,21 g de ácido cíírico y 35,49 g de Na2HPO4. Ajustar el pH a 4,0 con ácido fosfórico. Añadir ácido 2,2,-Azinobis(3-et¡l-benzot¡azolin-6-sulfónico) (ABTS, Sigma, N° de Cat. A-1888), mantener durante aprox. 1/2 hora, filtrar. 19. Peróxido de Hidrógeno al 30%. 20. ABST/H2O2: añadir 3 µl de H2O2 a 15 ml de disolución de ABST. 21. HCl 0,2 M. Procedimiento: 1. Recubrir placas de ELISA de 96 pocilios de Corning con 2 µg de poliEY en 100 µl de PBS/pocillo, mantener a temperaíura ambieníe durante 2 horas o a 4°C durante toda la noche. Cubrir las placas para evitar evaporación. 2. Eliminar el líquido no enlazado de los pocilios invirtiendo la placa. Lavar una vez con TBST. Dar una palmadiía a la placa sobre una foallita de papel para eliminar el exceso de líquido. 3. Añadir 100 µl de BSA al 1% en PBS a cada pocilio. Incubar, con agitación, durante 1 hr. a temperatura ambiente. 4. Repetir la etapa 2. 5. Empapar los pocilios con Hepes 50 mM (pH 7,5, 150 µl/pocillo). 6. Diluir el compuesto de prueba con dH2O/DMSO al 4% a 4 veces la concentración de ensayo final deseada en placas de polipropileno de 96 pocilios. 7. Añadir 25 µl del compuesto de prueba diluido a cada pocilio de la placa de ELISA. En los pocilios de control, poner 25 µl de dH O/DMSO al 4%. 8. Diluir GST-Flk1 0,005 µg (5 ngVpocillo en KDB. 9. Añadir 50 µl de enzima diluida a cada pocilio. 10. Añadir 25 µl EDTA 0,5 M a los pocilios de control negativos. 11. Añadir 25 µl de MnCI2 40 mM con 4X ATP (2 µM) a todos los pocilios (volumen final 100 µl, concentración final de ATP 0,5 µM en cada pocilio). 12. Incubar, con agitación, durante 15 minutos a femperaíura ambieníe. 13. Parar la reacción añadiendo 25 µl de EDTA 500 mM a cada pocilio. 14. Lavar 3X con TBST y dar una palmadiía a la placa sobre una toallifa de papel para eliminar el exceso de líquido. 15. Añadir 100 µl por pocilio de antisueros anti-fosfotirosina, dilución 1:10.000 en tampón de dilución de anticuerpo. Incubar, con agitación, durante 90 min. a temperatura ambiente. 16. Lavar como en la etapa 14. 17. Añadir 100 µl/pocillo de conjugado anti-conejo HRP preparado en cabra (1:6.000 en tampón de dilución de anticuerpo). Incubar, con agitación, durante 90 minutos a temperatura ambiente. 18. Lavar como en la efapa 14. 19. Añadir 100 µl de disolución ABST/H2O2 a temperatura ambiente a cada pocilio. 20. Incubar, con agitación durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 21. Si es necesario, parar la reacción añadiendo 100 µl de HCl 0,2 M a cada pocilio. 22. Leer los resultados en el lector de ELISA Dynafech MR7000 con filtro de prueba a 410 nm y con filtro de referencia a 630 nm. BIOENSAYO DE PYK2 Este ensayo se utiliza para medir la actividad de cinasa in vifro de la pyk2 de longiíud completa marcada con epitopo HA (FL. pyk2-HA) en un ensayo ELISA. Materiales y Reactivos: 1. Placas de ELISA de 96 pocilios de Corning. 2. anticuerpo aníi-HA monoclonal 12CA5 (SUGEN, Inc.) 3. PBS (Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (Catálogo de Gibco, N° 450-1300EB) 4. Tampón TBST: para 1 L, mezclar 8,766 g de NaCI, 6,057 g de TRIS y 1 ml de Tritón X-100 al 0,1 % en aprox. 900 ml dH2O. Ajustar el pH a 7,2, llevar el volumen a 1 L. 5. Tampón de Bloqueo: para 1 L, mezclar 100 g de BSA al 10%, 12,1 g de TRIS 100 mM, 58,44 g de NaCI 1 M y 10 ml de TWEEN-20 al 1%. 6. FL. pyk2-HA de lisados de células sf9 (SUGEN, Inc.). 7. DMSO al 4% en H2O MilliQue. 8. ATP 10 mM en dH2O. 9. MnCI2 1 M. 10. MgCI2 1M. 11. D¡tiotreiíol 1M (DTT). 12. 10X Tampón de fosforilación de cinasa: mezclar 5,0 ml de Hepes 1 M (pH 7,5), 0,2 ml de MnCI2 1 M, 1 ,0 ml de MgCI2 1M, 1,0 ml de Tritón X-100 al 10% en 2,8 ml de dH2O. Justo antes de usarlo, añadir 0,1 ml de DTT 1M. 13. Placas NUNC de polipropileno de 96 pocilios de fondo en V. 14. EDTA 500 mM en dH2O. 15. Tampón de dilución de anticuerpo: para 100 mL, 1 mL de BSA al %/PBS y 1 mL de Tween-20 al 10% en 88 ml de TBS. 16. Anti-Ptyr conjugado con HRP (PY99, Santa Cruz Biotech, N° de Caí. SC-7020). 17. ABTS, Moss, N° de Caí. ABST-2000. 18. SDS al 10%. Procedimienío: 1. Recubrir Placas de ELISA de 96 pocilios de Corning con 0,5 µg por pocilio de anticuerpo anti-HA 12CA5 en 100 µl de PBS. Almacenar duraníe íoda la noche a 4°C. 2. Eliminar el anticuerpo HA no unido de los pocilios invirtíendo la placa. Lavar la placa con dH2O. Dar una palmadita a la placa sobre una toallita de papel para eliminar el exceso de líquido. 3. Añadir 150 µl de Tampón de Bloqueo a cada pocilio. Incubar, con agitación, durante 30 min a temperatura ambiente. 4. Lavar la placa 4x con TBS-T. 5. Diluir ei lisado en PBS (1 ,5 µg de lisado/100 µl de PBS). 6. Añadir 100 µl de lisado diluido a cada pocilio. Agifar a temperatura ambiente durante 1 hr. 7. Lavar como en la etapa 4. 8. Añadir 50 µl de 2X Tampón de cinasa a la placa de ELISA que contiene pyk2-HA capturado. 9. Añadir 25 µL de compuesto de prueba 400 µM en DMSO al 4% a cada pocilio. Para los pocilios de control usar DMSO al 4% solo. 10. Añadir 25 µL de EDTA 0,5 M a los pocilios de control negativos. 11. Añadir 25 µl de ATP 20 µM a todos los pocilios. Incubar, con agitación, durante 10 minutos. 12. Parar la reacción añadiendo 25 µl de EDTA 500 mM (pH 8,0) a todos los pocilios. 13. Lavar como en la etapa 4. 14. Añadir 100 µL Anti-Ptyr conjugado con HRP diluido 1:6000 en Tampón de Dilución de Anticuerpo a cada pocilio. Incubar, con agitación, durante 1 hr. a temperaíura ambiente. 15. Lavar la placa 3X con TBST y 1X con PBS. 16. Añadir 100 µL de disolución de ABST a cada pocilio. 17. Si es necesario, parar la evolución de la reacción añadiendo 20 µL de SDS al 10% a cada pocilio. 18. Leer la placa en el lector de ELISA con filtro de prueba a 410 nm y filtro de referencia a 630 nm. BIOENSAYO DE FGFRT Este ensayo se utiliza para medir la actividad de cinasa in viíro del FGF1-R en un ensayo de ELISA.

Materiales v Reactivos: 1. Placas de ELISA de 96 pocilios de Costar (Catálogo de Corning, N° 3369). 2. PoIi(GIu-Tyr) (Catálogo de Sigma, N° P0275). 3. PBS (Catálogo de Gibco, N° 450-1300EB) 4. Disolución de Tampón de Hepes 50 mM. 5. Tampón de Bloqueo (BSA al 5%/PBS). 6. GST-FGFRT purificado (SUGEN, Inc.) 7. Tampón de Dilución de Cinasa. Mezclar 500 µl de Hepes 1M (GIBCO), 20 µl de BSA al 5%/PBS, 10 µl de ortovanadato sódico 100 mM y 50 µl de NaCI 5M. 8. ATP IO mM 9. Mezcla de fosforilación ATP/MnCI2: mezclar 20 µL de ATP, 400 µL de MnCI2 1M y 9,56 ml de dH2O. 10. Placas NUNC de polipropileno de 96 pocilios de fondo en V (Catálogo de Applied Scientific, N° AS-72092). 11. EDTA 0,5M. 12. TBST 0,05% Añadir 500 µL de TWEEN a 1 litro de TBS. 13. Suero anti-fosfotirosina policlonal de conejo (SUGEN, Inc.). 14. Conjugado peroxidasa IgG anti-conejo preparado en cabra (Biosource, N° de Catálogo ALI0404). 15. Disolución de ABTS. - 16. Disolución de ABTS/H2O2. Procedimiento: 1. Recubrir placas de ELISA de 96 pocilios de Costar con 1 µg por pocilio de Poli (Glu-Tyr) en 100 µl de PBS. Almacenar duraníe toda la noche a 4°C. 2. Lavar las placas recubíertas una vez con PBS. 3. Añadir 150 µL de Tampón de Bloqueo BSA al 5%/PBS a cada pocilio. Incubar, con agitación, durante 1 hr a temperatura ambiente. 4. Lavar la placa 2x con PBS, después una vez con Hepes 50 mM. Dar una palmadita a la placa sobre una toalliía de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas. 5. Añadir 25 µL de compuesío de prueba 0,4 mM en DMSO al 4% o DMSO al 4% solo (coníroles) a la placa. 6. Diluir el GST-FGFR-i purificado en Tampón de Dilución de Cinasa (5 ng de cinasa/50 µl de KDB/pocillo). 7. Añadir 50 µL de cinasa diluida a cada pocilio. 8. Comenzar la reacción de la cinasa añadiendo 25 µl/pocillo de ATP recientemente preparado/Mn++ (0,4 ml de MnCI2 1M, 40 µL de ATP 10 mM, 9,56 ml de dH2?), recientemente preparado. 9. Parar la reacción con 25 µL de EDTA 0,5M. 10. Lavar la placa 4x con TBST reciente. 11. Prepara Tampón de Dilución de Anticuerpo: Para 50 ml, mezclar 5 ml de BSA al 5%, 250 µl de leche al 5% y 50 µl de vanadato sódico 100 mM, llevar a volumen final con TBST al 0,05%. 12. Añadir 100 µl por pocilio de anti-fosfotirosina (dilución 1:10000 en ADB). Incubar, con agiíación durante 1 hr. a temperaíura ambiente. 13. Lavar como en la etapa 10. 14. Añadir 100 µl por pocilio de conjugado peroxidasa IgG anticonejo preparado en cabra de Biosource (dilución 1:6000 en ADB). Incubar, con agitación durante 1 hr. a temperatura ambiente. 15. Lavar como en la etapa 10 y después con PBS para eliminar burbujas y exceso de TWEEN. 16. Añadir 100 µl de disolución de ABTS/H2O2 a cada pocilio. 17. Incubar, con agitación, durante 10 a 20 minutos. Eliminar cualquier burbuja. 18. Leer el ensayo en el lector de ELISA Dynatech MR7000: filtro de prueba a 410 nm, filtro de referencia a 630 nm. BIOENSAYO DE PDGFR Este ensayo se utiliza para la actividad de cinasa in vitro del PDGFR en un ensayo de ELISA. Materiales y Reactivos: 1. Placas de ELISA de 96 pocilios de Corning 2. anticuerpo anti-PDGFR monoclonal 28D4C10 (SUGEN, Inc.). 3. PBS. 4. Tampón TBST. 5. Tampón de bloqueo (el mismo que para el bioensayo de EGFR). 6. Lisado de células NIH 3T3 que expresan PDGFR-ß (SUGEN, Inc.). 7. Tampón TBS. 8. TBS + DMSO al 10%. 9. ATP. 10. MnCI2 11. Mezcla de fosforilación tampón de cinasa: para 10 mí, mezclar 250 µl de TRIS 1 M, 200 µl de NaCI 5M, 100 µl de MnCI2 1 M y 50 µl de Tritón X-100 100 mM en suficiente dH2O para hacer 10 ml. 12. Placas NUNC de polipropileno de 96 pocilios de fondo en V. 13. EDTA. 14. Suero anti-fosfotirosina policlonal de conejo (SUGEN, Inc.). 15. Conjugado peroxidasa IgG anti-conejo preparado en cabra (Biosource, N° de Cat. ALI0404). 16. ABTS. 17. Peróxido de hidrógeno, disolución al 30%. 18. ABTS/H2O2. 19. HCl 0,2 M. Procedimiento: 1. Recubrir placas de ELISA de 96 pocilios de Corning con 0,5 µg de 28D4C10 en 100 µl de PBS por pocilio, mantener durante toda la noche a 4°C. 2. Eliminar 28D4C10 no enlazado de los pocilios invirtiendo la placa para eliminar el líquido. Lavar 1x con dH2O. Dar una palmadita a la placa sobre una toallita de papel para eliminar el exceso de líquido. 3. Añadir 150 µl de Tampón de Bloqueo a cada pocilio. Incubar durante 30 min. a temperatura ambiente con agitación. 4. Lavar la placa 3x con agua desionizada, después una vez con TBST. Dar una palmadita a la placa sobre una toallita de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas. 5. Diluir el lisado en HNTG (10 µg de Iisado/100 µl de HNTG). 6. Añadir 100 µl de lisado diluido a cada pocilio. Agitar a temperafura ambiente durante 60 min. 7. Lavar las placas como se describe en la Etapa 4. 8. Añadir 80 µl de mezcla de tampón de cinasa de trabajo a la placa de ELISA que contiene el PDGFR capturado. 9. Diluir el compuesto de prueba 1:10 en TBS en placas de polipropileno de 96 pocilios. 10. Añadir 10 µl del compuesto de prueba diluido a la placa de ELISA. A los pocilios de control, añadir 10 µl de TBS + DMSO al 10%. Incubar con agitación durante 30 minutos a temperafura ambiente. 11. Añadir 10 µl de ATP directamente a iodos los pocilios excepto al pocilio de control negativo (el volumen final del pocilio debe ser aproximadamente100 µl con ATP 20 µM en cada pocilio.) Incubar 30 minutos con agitación. 12. Parar la reacción añadiendo 10 µl de disolución de EDTA a cada pocillo. 13. Lavar 4x con agua desionizada, dos veces con TBST. 14. Añadir 100 µl anti-fosfotirosina (dilución 1:3000 en TBST) por pocilio. Incubar con agitación durante 30-45 min. a temperafura ambiente. 15. Lavar como en la etapa 4. 16. Añadir 100 µl de Conjugado peroxidasa IgG anti-conejo preparado en cabra de Biosource (dilución 1:2000 en TBST) a cada pocilio. Incubar con agitación durante 30 min. a íemperalura ambieníe. 17. Lavar como en la etapa 4. 18. Añadir 100 µl de Disolución de ABTS/H2O2 a cada pocilio. 19. Incubar 10 a 30 minutos con agitación. Eliminar cualquier burbuja. 20. Si es necesario parar ia reacción con la adición de 100 µl de HCl 0,2 M por pocilio. 21. Leer el ensayo en el lector de ELISA Dynatech MR7000 con filtro de prueba a 410 nm y filtro de referencia a 630 nm. ENSAYO DE CDK2/CICLINA A Este ensayo se utiliza para medir la actividad de serina/treonina cinasa in viíro de cdk2/cidina A humana en un Ensayo de Centelleo por Proximidad (SPA). Materiales v Reactivos. 1. Placas (flexibles) de poli(tereftalato de etileno) de 96 pocilios de Wallac (Catálogo de Wallac, N° 1450-401). 2. Redivue [?33P] ATP de Amersham (catálogo de Amersham, N° AH 9968). 3. Perlas de SPA de poliviniltolueno recubiertas de estreptavidina de Amersham (caíálogo de Amersham, N° RPNQ0007). Las perlas se deben reconstiluir en PBS sin magnesio o calcio, a 20 mg/ml. 4. Complejo enzimálico cdk2/ciclina A activado purificado a partir de células Sf9 (SUGEN, Inc.). 5. Sustrato peptídico biotinilado (Debtide). El péplido biotina-X-PKTPKKAKKL se disuelve en dH2O a una concentración de 5 mg/ml. 6. DMSO al 20% en dH2O. 7. Tampón de cinasa: para 10 ml, mezclar 9,1 ml de dH2O, 0,5 mi de TRIS (pH 7,4), 0,2 ml de MgCI2 1 M, 0,2 ml de NP40 al 10% y 0,02 ml de DTT 1M, añadido reciente justo antes de usarlo. 8. ATP 10 mM en dH2O. 9. Tris 1M, pH ajustado a 7,4 con HCl. 10. MgCI2 1M. 11. DTT 1M. 12. PBS (Catálogo de Gibco, N° 14190-144). 13. EDTA 0.5M. 14. Disolución de parada: Para 10 ml, mezclar 9,25 ml de PBS, 0,05 ml ATP 10 mM, 0,1 ml EDTA 0,5 M, 0,1 ml de Tritón X-100 al 10% y 1,5 ml de perlas de SPA de 50 mg/ml. Procedimiento: 1. Preparar disoluciones de los compuestos de prueba a 4x la concentración final deseada en DMSO al 5%. Añadir 10 µL a cada pocilio. Para controles positivos y negativos, usar 10 µL de DMSO al 20% solo en los pocilios. 2. Diluir el sustrato peptídico (deb-tide) 1 :250 con dH2O para dar una concentración final de 0,02 mg/ml. 3. Mezclar 24 µL de ATP 0,1 mM con 24 µCi de ?33P ATP y suficiente dH2O para hacer 600 µL 4. Mezclar 1:1 las disoluciones de ATP y péptido diluidas (600 µL + 600 µL por placa). Añadir 10 µL de esta disolución a cada pocilio. 5. Diluir 5 µL de disolución de cdk2/ciclina A en 2,1 mi 2x de tampón de cinasa (por placa). Añadir 200 µL de enzima por pocilio. Para los controles negativos, añadir 20 µL 2x de fampón de cinasa sin enzima. 6. Mezclar brevemente en un agitador de placa; incubar durante 60 minutos. 7. Añadir 200 µL de disolución de parada por pocilio. 8. Dejar esíar en reposo por lo menos 10 min. 9. Cenírifugar la placa a aprox. 2300 rpm durante 10-15 min. 10. Contar la placa en un lector Trilux. ENSAYO DE TRANSFOSFORILACIÓN DE MET Este ensayo se utiliza para medir los niveles de fosfotirosina en un sustrato poli(ácido glutámico.-firosina, 4:1) como un medio para identificar agonistas/antagonistas de transfosforilación de met del sustrato.

Materíales v Reactivos: 1. Placas de ELISA de 96 pocilios de Corning, Catálogo de Corning, N° 25805-96. 2. Poli(glu-tyr), 4:1 , Sigma, N° de Cat. P 0275. 3. PBS, Catálogo de Gibco, N° 450-1300EB 4. Hepes 50 mM 5. Tampón de Bloqueo: Disolver 25 g Seroalbúmina Bovina, Sigma, N° de Cat. A- 7888, en 500 ml de PBS, filtrar a través de un filtro de 4 µm. 6. Proteína de fusión GST purificada que contiene el dominio cinasa de Met, SUGEN, Inc. 7. Tampón TBST. 8. DMSO acuoso al 10% (H2O MilliQue). 9. Adenosina-d'-trifosfato acuosa (dH2O) 10 mM, Sigma, N° de Cat. A-5394. 10. 2X Tampón de Dilución de Cinasa: Para 100 ml, mezclar 10 mL de HEPES 1M a pH 7,5 con 0,4 mL de BSA al 5%/PBS, 0,2 mL de ortovanadato sódico 0,1 M y 1 mL de cloruro sódico 5M en 88,4 L dH2O. 11. 4X Mezcla de Reacción de ATP: para 10 mL, mezclar 0,4 mL de cloruro de manganeso 1 M y 0,02 mL de ATP 0,1 M en 9,56 ml de dH2O. 12. 4X Mezcla de Controles Negativos: para 10 mL, mezclar 0,4 mL de cloruro de manganeso 1 M en 9,6 ml de dH2O. 13. Placas NUNC de polipropileno de 96 pocilios de fondo en V, Catálogo de Applied Scientific, N° S-72092 14. EDTA 500 mM. 15. Tampón de Dilución de Anticuerpo: para 100 mL, mezclar 10 mL de BSA al 5%/PBS, 0,5 mL de Leche Instantánea Camatione® al 5% en PBS y 0,1 mL de ortovanadato sódico 0,1 M en 88,4 ml de TBST. 16. Anticuerpo aníifosfotirosina policlonal de conejo, SUGEN, Inc. 17. Anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante aníi-conejo preparado en Cabra, Biosource, Inc. 18. Disolución de ABTS: para 1 L, mezclar 19,21 g de ácido cítrico, 35,49 g de Na2HPO4 y 500 mg de ABTS con suficiente dH2O para hacer 1 L. 19. ABTS/H2O2: mezclar 15 mL de disolución de ABST con 2 µL H2O2 cinco minutos antes de usarlo. 20. HCl 0,2 M Procedimiento: 1. Recubrir placas de ELISA con 2 µg Poli(Glu-Tyr) en 100 µL de PBS, mantener durante íoda la noche a 4°C. 2. Bloquear la placa con 150 µL de BSA al 5%/PBS durante 60 min. 3. Lavar la placa dos veces con PBS después una vez con íampón Hepes 50 mM pH 7,4. 4. Añadir 50 µl de la cinasa diluida a todos los pocilios. (La cinasa purificada se diluye con Tampón de Dilución de Cinasa. La concentración final debe ser 10 ng/pocillo.) 5. Añadir 25 µL del compuesto de prueba (en DMSO al 4%) o DMSO solo (4% en dH2Ü) para los controles a la placa. 6. Incubar la mezcla cinasa/compuesto durante 15 minutos. 7. Añadir 25 µL de MnCI240 mM a los pocilios de control negativo. 8. Añadir 25 µL de mezcla ATP/MnCI2 a iodos los otros pocilios (excepto a los controles negativos). Incubar durante 5 min. 9. Añadir 25 µL EDTA 500 mM para parar la reacción. 10. Lavar la placa 3x con TBST. 11. Añadir 100 µL de anti-Ptyr policlonal de conejo diluida 1 :10.000 en Tampón de Dilución de Anticuerpo a cada pocilio. Incubar, con agitación, a temperatura ambiente durante una hora. 12. Lavar la placa 3x con TBST. 13. Diluir el anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP de Biosource 1 :6.000 en Tampón de Dilución de Anticuerpo. Añadir 100 µL por pocilio e incubar a temperatura ambiente, con agitación, durante una hora. 14. Lavar la placa 1X con PBS. 15. Añadir 100 µl de disolución de ABTS/H2O2 a cada pocilio. 16. Si es necesario, parar la evolución de la reacción con la adición de 100 µl de HCl 0,2M por pocilio. 17. Leer la placa en el lector de ELISA Dynatech MR7000 con el filtro de prueba a 410 nm y el filtro de referencia a 630 nm. Ensayo de Transfosforilación de IGF-1 Este ensayo se utiliza para medir el nivel de fosfotirosina en poli(ácido glutámico:tirosina, 4:1) para la identificación de agonistas/antagonistas de la transfosforilación de gst-IGF-1 de un sustraío.

Materiales y Reactivos: 1. Placas de ELISA de 96 pocilios de Corning. 2. Poli(GIu-Tyr), 4:1 , Sigma, N° de Cat. P 0275. 3. PBS, Catálogo de Gibco, N° 450-1300EB. 4. Hepes 50 mM 5. Tampón de Bloqueo de TBB: para 1 L, mezclar 100 g de BSA, 12,1 g de TRIS (pH 7,5), 58,44 g de cloruro sódico y 10 mL de TWEEN-20 al 1%. 6. Proteína de fusión GST purificada que contiene el dominio cinasa de IGF-1 (SUGEN, Inc.) 7. Tampón TBST: para 1 L, mezclar 6,057 g de Tris, 8,766 g de cloruro sódico y 0,5 ml de TWEEN-20 con suficiente dH2O para hacer 1 litro. 8. DMSO al 4% en H2O Milli-Q. 9. ATP 10 mM en dH2O. 10. 2X Tampón de Dilución de Cinasa: para 100 mL, mezclar 10 mL de HEPES 1 M (pH 7,5), 0,4 mL de BSA al 5% en dH2O, 0,2 mL de ortovanadato sódico 0,1 M y 1 mL de cloruro sódico 5 M con suficiente dH2O para hacer 100 mL. 11. 4X Mezcla de Reacción de ATP: para 10 mL, mezclar 0,4 mL de MnCI2 1 M y 0,008 mL de ATP 0,01 M y 9,56 mL de dH2O. 12. 4X Mezcla de Controles Negativos: mezclar 0,4 mL de MnCI2 1 M en 9,60 mL de dH2O. 13. Placas NUNC de polipropileno de 96 pocilios de fondo en V. 14. EDTA 500 mM en dH2O. 15. Tampón de Dilución de Anticuerpo: para 100 mL, mezclar 10 mL de BSA al 5% en PBS, 0,5 mL de Leche desnatada Instantánea Carnation al 5% en PBS y 0,1 mL de ortovanadato sódico 0,1 M en 88,4 ml de TBST. 16. Anticuerpo antifosfotirosina políclonal de conejo, SUGEN, Inc. 17. Anticuerpo conjugado anti-conejo HRP preparado en cabra, Biosource. 18. Disolución de ABTS. 20. ABTS/H2O2: mezclar 15 mL ABTS con 2 µL de H2O2 5 minutos antes de usarlo. 21. HCl 0,2 M en dH2O. Procedimiento: 1. Recubrir la placa de ELISA con 2,0 µg/pocillo de Poli(Glu, Tyr), 4:1 (Sigma P0275) en 100 µl de PBS. Almacenar la placa durante toda la noche a 4°C. 2. Lavar la placa una vez con PBS. 3. Añadir 100 µl de Tampón de Bloqueo de TBB a cada pocilio. Incubar la placa durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. 4. Lavar la placa una vez con PBS, después dos veces con íampón Hepes 50 mM pH 7,5. 5. Añadir 25 µL de compuesío de prueba en DMSO al 4% (obtenido diluyendo una disolución de almacenamiento del compuesto de prueba 10 mM en DMSO al 100% con dH2O) a la placa. 6. Añadir 10,0 ng de cinasa gsí-IGF-1 en 50 µl de Tampón de Dilución de Cinasa a todos los pocilios. 7. Comenzar la reacción de la cinasa añadiendo 25 µl 4X de Mezcla de Reacción de ATP a todos los pocilios de prueba y a los pocilios de control positivo. Añadir 25 µ 4X de Mezcla de Controles Negativos a todos los pocilios de control negativo. Incubar durante 10 minutos, con agitación, a temperatura ambiente. 8. Añadir 25 µl de EDTA 0,5M (pH 8,0) a todos los pocilios. 9. Lavar la placa 4x con Tampón TBST. 10. Añadir antisueros anti-fosfotirosina policlonales de conejo a una dilución de 1 :10.000 en 100 µl de Tampón de Dilución de Anticuerpo a todos los pocilios. Incubar, con agitación, a temperafura ambieníe durante 1 hora. 11. Lavar la placa como en la etapa 9. 12. Añadir 100 µL de anti-conejo HRP de Biosource a una dilución de 1:10.000 en Tampón de Dilución de Anticuerpo a iodos los pocilios.

Incubar, con agifacíón, a temperatura ambiente durante 1 hora. 13. Lavar la placa como en la etapa 9, seguir con un lavado con PBS para eliminar burbujas y exceso de Tween-20. 14. Desarrollar añadiendo 100 µl/pocillo de ABTS/H2O2 a cada pocilio. 15. Después de aproximadamente 5 minutos, leer en el lector de ELISA con filtro de prueba a 410 nm y filtro de referencia a 630 nm. ENSAYOS DE INCORPORACIÓN DE BrdU Los ensayos siguientes utilizan células diseñadas para expresar un receptor seleccionado y después evaluar el efecto de un compuesto de interés sobre la actividad de la síntesis de ADN inducida por el ligando determinando la incorporación de BrdU en el ADN. Los materiales, reacíivos y procedimienío siguieníes son generales para cada uno de los ensayos de incorporación de BrdU siguieníes. Se indican las variaciones en ensayos específicos. Materiales v Reactivos Generales: 1. El ligando apropiado. 2. Las células diseñadas apropiadas. 3. Reactivo Marcador de BrdU: 10 mM, en PBS, pH 7,4 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, EN). 4. FixDenat: disolución de fijación (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, EN). 5. Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa (Chemicon, Temecula, CA). 6. Disolución de Sustrato de TMB: tetrametilbenzidina (TMB, lista para usar, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, EN). 7. Disolución de Lavado de PBS: 1X PBS, pH 7,4. 8. Albúmina, Bovina (BSA), fracción V en polvo (Sigma Chemical Co., EE.UU.). Procedimiento General: 1. Las células se siembran a 8000 células/pocilio en CS al 10%, Gln 2mM en DMEM, en una placa de 96 pocilios. Las células se incuban durante toda la noche a 37°C en CO2 al 5%. 2. Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y después se privan de suero en un medio sin suero (CS al 0% DMEM con BSA al 0,1%) durante 24 horas. 3. En el día 3, se añaden simultáneamente el ligando apropiado y el compuesto de prueba a las células. Los pocilios de conírol negativo reciben DMEM sin suero con BSA al 0,1% solamente; las células de conírol positivo reciben el ligando pero no compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM sin suero con ligando en una placa de 96 pocilios, y se diluyen de manera seriada para 7 concentraciones de prueba. 4. Después de 18 horas de la activación del ligando, se añade el reactivo marcador de BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA al 0,1%) y las células se incuban con BrdU (la concentración final es 10 µM) durante 1,5 horas. 5. Después de la incubación con reactivo marcador, se elimina el medio decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toallita de papel. Se añade la disolución FixDenat (50 µl/poc¡IIo) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agilador de placa. 6. Se elimina la disolución FixDenat decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toallita de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 µl/pocillo) como una disolución de bloqueo y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. 7. Se elimina la disolución de bloqueo decantando y los pocilios se lavan una vez con PBS. Se añade disolución anti-BrdU-POD (dilución 1 :200 en PBS, BSA al 1%, 50 µl/pocillo) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. 8. El conjugado de anticuerpo se elimina decaníando y se enjuagan los pocilios 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiendo y dando golpeciíos sobre una toallita de papel. 9. Se añade disolución de sustrato de TMB (100 µl/pocillo) y se incuba durante 20 minutos a temperaíura ambiente en un agitador de placa hasta que el desarrollo del color es suficiente para la detección fotométrica. 10. Se mide la absorbancia de las muestras a 410 nm (en modo de "longitud de onda dual" con un filtro que lee a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector de placas de ELISA Dynatech. Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida con EGF Materiales v Reactivos: 1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Lid., Japan). 2. 3T3/EGFRC7. El resto de los Materiales y Reactivos y el Procedimiento, según lo arriba mencionado. Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida con PDGF Materiales v Reactivos: 1. PDGF B/B humano (Boehringer Mannheim, Germany). 2. 3T3/EGFRc7. El resto de los Materiales y Reactivos y el Procedimiento, según lo arriba mencionado. Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida con FGF Materiales v Reactivos: 1. FGF2/bFGF humano (Gibco BRL, EE.UU.). 2. 3T3c7/EGFr El resto de los Materiales y Reactivos y el Procedimiento, según lo arriba mencionado. Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida con IGF-1 Materiales y Reactivos: 1. Humano, recombinante (G511 , Promega Corp., EE.UU.) 2. 3T3/IGF1 r. El resto de los Materiales y Reactivos y el Procedimiento, según lo arriba mencionado. Ensayo de Transfosforilación de Src Este ensayo se utiliza para detectar sistemáticamente inhibidores de la tirosina cinasa Src. Materiales y Reactivos: 1. Tampón de recubrimiento: PBS que contiene azida sódica (0,2mg/ml). 2. BSA aM% p/v en PBS. 3. Tampón de lavado: PBS que contiene Tween 20 al 0,05% v/v (PBS-TWEEN) 4. HEPES 500mM pH 7,4. 5. ATP (40 µM) + MgCI2 (80 mM) en agua destilada. 6. MgCI2 (80 mM) en agua destilada (para blancos no ATP). 7. Compuestos de prueba, 10 mM en DMSO. 8. Tampón de Ensayo: HEPES 100 mM, pH 7,4, que contiene DTT 2 mM, ortovanadato sódico 0,2 mM y 0,2 mgs/ml de BSA. 9. Src humana recombinante parcialmente purificada (UBI (14-117) . Anti-fosfotirosina (anti-PY policlonal de conejo SUGEN). 11. Ig anti-conejo preparado en cabra unido con HRP (Biosource International, N° 6430) 12. ABTS sustrato de HRP o sustrato de Peroxidasa de Pierce. 13. Placas de ELISA de Corning. Procedimienío: 1. Recubrir placas con 100 µl de poli(Glu-Tyr) de 20 µg/ml (Sigma, N° de Cal. P0275) que contiene azida sódica al 0,01%. Mantener durante toda la noche a 4°C. 2. Bloquear con BSA al 1% a 100 µl/pocillo durante una hora a temperatura ambiente. 3. Preparar la placa con los compuestos de prueba (10 mM en DMSO) a 2 µl/pocillo en una placa Costar lista para la dilución con dH2? y preparando las placas de reacción. 4. Diluir la cinasa Src 1:10.000 en tampón de Reacción, para 5 placas preparar 25 ml como sigue: 2,5 ml de HEPES 1M pH 7,4 (almacenado estéril a 4°C), 21 ,85 ml de agua destilada, 0,1 ml de BSA al 5%, 0,5 ml de ortovanadato sódico 10 mM (almacenado estéril a 4°C), 50 µl de DTT 1 ,0M (almacenado congelado a -20°C), y 2,5 µl de cinasa Src (almacenada congelada a -80°C). 5. Añadir 48 µl de agua destilada a los 2 µl de cada compuesto en la placa de dilución después añadir 25 µl/pocillo de esto a la placa de reacción. 6. Añadir 50 µl de HRP a cada pocilio de tampón de reacción y después 25 µl de ATP-MgCI2/poc¡Ilo (MgCI2 solamente a los blancos no ATP).

Incubar a temperaíura ambiente durante 15 minutos en el agitador de placa. Parar la reacción añadiendo 25 µl de EDTA 0,5M a cada pocilio. 7. Lavar 4X con PBS-TWEEN. 8. Añadir 100 µl de anti-fosfotirosina (1 :10.000 de suero anti-pTyr o 1:3.000 de anticuerpo purificado por afinidad con PA diluido con glicerol al %) en PBS-TWEEN que contiene BSA al 0,5%, leche desnatada en polvo al 0,025% y ortovanadato sódico 100 µM. Incubar con agitación continua a temperatura ambiente durante una hora. 9. Lavar las placas 4X con PBS-TWEEN. 10. Añadir 100 µl de Ig unida con HRP (1:5.000) en PBS-TWEEN que contiene BSA al 0,5%, leche desnatada en polvo al 0,025% y ortovanadato sódico 100 µM. Incubar con agitación a temperatura ambiente durante una hora. 11. Lavar las placas 4X con PBS-TWEEN y después una vez con PBS. 12. Desarrollar la placa utilizando ABTS u otro sustrato de peroxidasa. Análisis del ciclo celular: Se exponen células A431 en medio de cultivo estándar a una concentración deseada de un compuesío de prueba durante 20-24 horas a 37°C. A continuación las células se recogen, se suspenden en PBS, se fijan con hielo-metanol frío al 70% y se tiñen con yoduro de propidio. Después se mide el coníenido de ADN utilizando un citómeíro de flujo FACScan. A continuación se puede estimar la distribución de fases del ciclo celular utilizando el programa informático CelIFit (Becfon-Dickinson). Ensayo de HUV-EC-C Este ensayo se utiliza para medir la acíividad de un compuesto contra RDF-R, FGF-R, VEGF, aFGF o Flk-1/KDR, todos los cuales se expresan de manera natural por células HUV-EC. DÍA O 1. Lavar y tripsínizar las células HUV-EC-C (células endoteliales de la vena umbilical humana), (Colección Americana de Cultivos Tipo, n° de catálogo 1730 CRL). Lavar con solución salina íamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS, obtenida de Gibco BRL, n° de catálogo 14190-029) 2 veces a aproximadamente 1 ml/10 cm2 de frasco de cultivo tisular. Tripsinizar con tripsina al 0,05% - EDTA en disolución de disociación celular no enzimática (Sigma Chemical Company, n° de catálogo C-1544). La tripsina al 0,05% se hace diluyendo tripsina al 0.25%/EDTA 1 mM (Gibco, n° de catálogo 25200-049) en la disolución de disociación celular. Tripsinizar con aproximadamente 1 ml/25-30 cm2 de frasco de cultivo tisular durante aproximadamente 5 minutos a 37°C. Después de que las células se hayan separado del frasco, añadir un volumen igual de medio de ensayo y transferir a un tubo estéril de centrífuga de 50 ml (Fisher Scientific, n° de catálogo 05-539-6). 2. Lavar las células con aproximadamente 35 ml de medio de ensayo en el tubo estéril de centrífuga de 50 ml añadiendo el medio de ensayo, centrifugar durante 10 minutos a aproximadamente 200x g, aspirar el sobrenadante, y resuspender con 35 ml de D-PBS. Repetir el lavado dos veces más con D-PBS, resuspender las células en 1 ml de medio de ensayo/15 cm2 de frasco de cultivo fisular. El medio de ensayo consiste en medio F12K (Gibco BRL, n° de catálogo 21127-014) y 0,5% de suero bovino fetal inactivado por calor. Conlar las células con un contador Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) y añadir medio de ensayo a las células para obtener una concentración de 0,8-1,0 x 104 células/pocilio, incubar ~24 h a 37°C, 5% de CO2. DÍA 1 1. Preparar valoraciones del compuesto de prueba por dilución al doble en placas de 96 pocilios separadas, generalmente 50 µM hasía 0 µM. Usar el mismo medio de ensayo que el mencionado en la eíapa 2 del día 0 más arriba. Las valoraciones se hacen añadiendo 90 µl/pocillo del compuesío de prueba a 200 µM (4X la concentración final del pocilio) al pocilio superior de una columna particular de la placa. Puesto que el compuesto de prueba almacenado es normalmente 20 mM en DMSO, los 200 µM de concentración de fármaco contienen 2% de DMSO. Se utiliza un diluyente preparado al 2% de DMSO en medio de ensayo (F12K + 0,5% de suero bovino fetal) como diluyente para las valoraciones del compuesto de prueba para diluir el compuesto de prueba pero manteniendo constante la concentración de DMSO. Añadir este diluyente a los restantes pocilios en la columna a 60 µl/pocillo. Tomar 60 µl de los 120 µl de la dilución del compuesto de prueba 200 µM en el pocilio superior de la columna y mezclar con 60 µl en el segundo pocilio de la columna. Tomar 60 µl de este pocilio y mezclar con los 60 µl en el tercer pocilio de la columna, y así sucesivamente hasta que se completen las valoraciones por dilución al doble. Cuando se mezcla el penúltimo pocilio, tomar 60 µl de los 120 µl en este pocilio y descartarlo. Dejar el último pocilio con 60 µl de DMSO/diluyente de medios como un control que no contiene compuesto de prueba. Hacer 9 columnas de compuesto de prueba valorados, suficiente para pocilios triplicados cada uno para: (1) VEGF (obtenido de Pepro Techlnc, n° de catálogo 100-200), (2) factor de crecimiento de células endoteliales (ECGF) (también conocido como factor de crecimiento del fibroblasto ácido o aFGF) (obtenido de Boehringer Mannheim Biochemica, n° de catálogo 1439 600), (3) PDGF B/B humano (1276-956, Boehringer Mannheim, Germany) y control de medios de ensayo. El ECGF viene como una preparación con heparina sódica. 2. Transferir 50 µl/pocillo de las diluciones del compuesto de prueba a las placas de ensayo de 96 pocilios que contienen las 0,8-1, 0x104 células/100 µl/pocillo de las células HUV-EC-C del día 0 e incubar ~2 h a 37°C, CO2 a 5%. 3. Por triplicado, añadir 50 µl/pocillo de VEGF a 80 µg/ml, ECGF a 20 ng/ml, o control de medios a cada condición de compuesto de prueba. Como con los compuestos de prueba, las concentraciones del factor de crecimiento son 4X la concentración final deseada. Utilizar los medios de ensayo de la etapa 2 del día 0 para hacer las concentraciones de los factores de crecimiento, incubar aproximadamente 24 horas a 37°C, CO2 al 5%. Cada pocilio tendrá 50 µl de dilución del compuesto de prueba, 50 µl de factor de crecimiento o medio, y 100 µl de células, que da un total de 200 µl/pocillo. Así las 4X concentraciones del compuesío de prueba y los factores de crecimiento se transforman en 1X una vez que se ha añadido todo a los pocilios. DÍA 2 1. Añadir 3H-timidina (Amersham, n° de catálogo TRK-686) a 1 µCi/pocillo (10 µl/pocillo de disolución de 100 µCi/ml preparada en medio RPMl + suero bovino fetal inactivado por calor al 10%) e incubar -24 h a 37°C, CO2 al 5%. El RPMl se obtiene de Gibco BRL, n° de catálogo 11875-051. DÍA 3 1. Congelar las placas durante toda la noche a -20°C. DÍA 4 Descongelar las placas y recolector con un recolector de placas de 96 pocilios (Tomtec Harvester 96®) sobre esterillas de filtro (Wallac, n° de catálogo 1205-401), leer las cuentes en un coníador de centelleo de líquidos Wallac Beiaplaíe®. Modelos Animales In Vivo MODELOS ANIMALES DE XENOINJERTO La capacidad de los fumores humanos de crecer como xenoinjertos en ratones atímicos (por ejemplo Balb/c, un/un) proporciona un modelo in vivo útil para estudiar la respuesta biológica a traíamientos para tumores humanos. Desde el primer xenotransplante con éxito de tumores humanos en ratones atímicos (Rygaard y Povisen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), se han transplantado muchas diferentes líneas celulares de tumor humano (por ejemplo, de mama, pulmón, genitourinario, gasíro-intestinal, de cabeza y cuello, glioblastoma, de huesos, y melanomas malignos) y han crecido con éxito en ratones desnudos. Los ensayos siguientes se pueden utilizar para determinar el nivel de actividad, especificidad y efecto de los diferentes compuestos de la presente ¡nvención. Tres tipos generales de ensayos son útiles para evaluar los compuestos: celular/catalítico, celular/biológico e in vivo. El objeto de los ensayos celulares/catalííicos es determinar el efecto de un compuesto sobre la capacidad de una TK para fosforilar tirosinas en un sustrato conocido en una célula. El objeto de los ensayos celulares/biológicos es determinar el efecto de un compuesto sobre la respuesta biológica estimulada por una TK en una célula. El objeto de los ensayos in vivo es determinar el efecto de un compuesto en un modelo animal de un trasíorno particular tal como el cáncer. Las líneas celulares adecuadas para experimentos de xenoinjertos subcutáneos incluyen células C6 (glioma, ATCC # CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), células A431 (carcinoma epidermoide, ATCC # CRL 1555), células Calu 6 (pulmón, ATCC # HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC # CRL 1435), células SKOV3TP5, S114 (NIH3T3 línea celular de fibroblasto genéticamente diseñada para expresiones de cMet y HGF de NCI), U-87MG (glioma maligno humano, ATCC HTB 14) y fibroblastos NIH 3T3 genéticamente diseñados para sobre-expresar EGFR, PDGFR, IGF-1R o cualquier oíra cinasa de prueba. El protocolo siguiente se puede utilizar para llevar a cabo experimentos de xenoinjerto: Los ratones atímicos hembra (BALB/c, un/un) se obtienen de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Todos los animales se mantienen bajo condiciones de sala limpia en cajas Micro-isolator con lecho Alpha-dri. Reciben comida estéril para roedores y agua ad libitum. Las líneas celulares se cultivan en el medio apropiado (por ejemplo, MEM, DMEM, F10 de Ham, o F12 de Ham más suero bovino fetal (FBS) al 5% - 10% y glutamina (GLN) 2 mM. Todos los medios de cultivo celular, glutamina, y suero bovino fetal se adquieren de Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) a menos que se especifique otra cosa. Todas ias células se cultivan en una atmósfera húmeda de aire al 90-95% y CO2 al 5-10% a 37°C. Todas las líneas celulares se subcultivan rufinariameníe dos veces por semana y son negativas a micoplasma según se determina por el méíodo Mycoíecl (Gibco). Las células se cosechan en o cerca de la confluencia con Tripsina-EDTA y se granulan a 450 x g durante 10 mín. Los granulos se resuspenden en PBS estéril o medios (sin FBS) estériles a una conceníración particular y las células se implantan en el costado trasero de los ratones (8 -10 ratones por grupo, 2-10x106 células/animal). El crecimiento del tumor se mide sobre 3 a 6 semanas utilizando el calibrador vernier (nonio). Los volúmenes del tumor se calculan como producto de longitud x anchura x altura a menos que se indique otra cosa. Los valores P se calculan utilizando el test t de Student. Los compuesfos de prueba en 50 - 100 µL de excipiente (DMSO, o VPD:D5W) se pueden administrar por inyección IP a diferentes concentraciones empezando generalmente en el día uno después de la implantación. MODELO DE INVASIÓN TUMORAL Se ha desarrollado el modelo de invasión tumoral siguiente y se puede utilizar para la evaluación del valor y eficacia terapéuticas de los compuestos identificados para inhibir selectivamente el receptor KDR/FLK-1. Procedimiento Se utilizan ratones (hembra) desnudos de 8 semanas de edad (Simonsen Inc.) como animales de experimentación. La implantación de células tumorales se puede llevar a cabo en una cabina de flujo laminar. Para la anestesia, se administra intraperitonealmente el Cóctel Xilazina/Ketamina (100 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de Xilazina). Se hace una incisión en la línea media para exponer la cavidad abdominal (aproximadameníe de 1,5 cm de longiíud) para inyector 107 células tumorales en un volumen de 100 µl de medio. Las células se inyectan o en el lóbulo duodenal del páncreas o bajo la serosa del colón. Se cierran el peritoneo y los músculos con una sutura continua de seda 6-0 y la piel se cierra uíilizando grapas. Se observa a los animales diariamente. Análisis Después de 2-6 semanas, dependiendo de las observaciones evidentes de los animales, los raíones se sacrifican, y las metásíasis del íumor local a diversos órganos (pulmón, hígado, cerebro, estómago, bazo, corazón y músculos) se escinden y analizan (medida del tamaño del tumor, grado de invasión, inmunoquímica, determinación de la hibridación in siíu, etc.). Ensayo Celular - Fosforilación de Met Materiales v Reactivos: 1. Placas de cultivo de 10 cm de Falcon. 2. Células A549 de carcinoma de pulmón. 3. Medio de cultivo F12K (con FBS al 2% + glutamina 2mM). 4. Medio de ensayo F12K (con BSA al 0, 1 %). 5. Rascadores celulares de Fisher. 6. Tampón de lisis (HNTG, ortovanadato sódico 1 mM, PMSF 1 mM y fluoruro sódico 2mM). 7. Tubos Eppendorf de 1 ,5 ml. 8. Microcentrífuga Eppendorf. 9. Reactivos de ensayo BCA A y B (N° 23223 y 23224, Pierce). 10. Agitador rotativo de tubos de ensayo. 11. Agitador rotativo de recipientes de gel de electrotransferencia. 12. 5X tampón de muestras. 13. Geles preparados de Novex de acrilamida al 8% y tris-glicina. 14. Cámara de electroforesis de Bio-Rad. 15. Tampón de SDS-PAGE. 16. TBS (pH 7,6) + Tritón X-100 al 0,1% (TBST), con o sin leche al 5%. 17. Tampón de inmunoelectrotransferencia. 18. Papel de nitrocelulosa de Osmonics. 19. Papel de transferencia de Bio-Rad. 20. Aparato de transferencia de geles. 21. Anti-fosfotirosina (monoclonal de ratón). 22. Patrones Preíeñidos de Kaleidoscopio de Bio-Rad (161-0324). 23. Anti-h-met (C-28) policlonal de conejo, conjugado y no conjugado con agarosa (N° sc-161 AC y sc-161 , Santa Cruz Biotechnology, Inc.). 24. Ig de burro y anti-conejo conjugada con HRP (NA 934, Amersham). 25. Ig de oveja anti-rafón conjugada con HRP (NA 931 , Amersham). 26. Sustrato quimioluminiscente denominado SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (N° 34080, Pierce). 27. Film transparente Sarán Wrap. 28. Chasis de exposición Kodak BioMax. 29. Película de rayos X de Fuji. 30. Revelador de película de Kodak. Procedimiento: 1. Sembrar células en placas de 10 cm con medio de cultivo con FBS al 2% + glutamina 2mM. Cultivar hasía cerca de la confluencia. 2. Privar a las células de suero durante toda la noche en el medio de ensayo con BSA al 0,1%. 3. Añadir el fármaco a las placas, una dosis por placa, normalmente en una valoración de doble dilución. Añadir el medio de ensayo (con la misma concenlración de DMSO que los fármacos) para el blanco sin fármaco. 4. Incubar las placas 4-5 horas con el fármaco, después añadir HG 50 ng/ml duraníe 10 minutes. 5. Lavar las placas una vez con PBS, añadir 400 µl de tampón de lisis, y rascar las células. Recoger en tubos Eppendorf de 1 ,5 ml. 6. Después de aproximadamente 10-20 minutos en el tampón de lisis, centrifugar los lisados en una microcenírífuga a velocidad máxima (14.000g) y recoger los sobrenadantes en un tubo Eppendorf separado. 7. Determinar la concentración de proteína con los reactivos del ensayo BCA. 8. Ajustar la concentración de la muestra a 0,5 mg de proteína en 0,4 ml utilizando el tampón de lisis. 9. Añadir 15 µl de anti-h-met AC para la inmunoprecipitación, roíar las muestras durante 2 horas a 4°C. 10. Lavar las muesíras 3 veces con íampón de lisis y resuspender en 35 µl 5X de íampón de muesíras. 11. Hervir la muestra a 100°C durante 10 minutos y microcentrifugar en el ajuste más alto durante 30 minutos para granular las perlas de agarosa. 12. Cargar 15 µl de cada uno a 2 geles, uno para anti-fosforilación y el otro para anti-h-met. También cargar 10 µl de patrones preteñidos, un carril por gel. 13. Desarrollar el gel a alrededor de 100-125 V, después transferir el gel a la nitrocelulosa o durante toda la noche a 70 mAmps o 1 una hora a 500 mAmps. 14. Bloquear las membranas en el agitador rotativo durante 1 hora en TBS + Tritón X-100 al 0,1% (TBST) + PBS al 5%. Todas las etapas a partir de este punto son a temperatura ambiente a menos que se indique otra cosa. 15. Añadir 0,8 µg/ml de antifosfotirosina y 0,25 µg/ml de anti-h-met en el agitador rotativo o durante 2 horas o durante toda la noche. 16. Lavar las membranas 3 veces 5 minutos cada una en TBST en el agitador roíativo. 17. Añadir los anticuerpos conjugados con HRP (oveja aníi-ratón para la antifosfotirosina; burro anti-conejo para la anti-h-met) a 1:5000 durante aproximadamente 45 minutos en el agitador rotativo. 18. Lavar las membranas 3 veces durante 5 minutos cada una en TBST en el agitador rotativo. 19. Añadir los 2 reactivos del kit SuperSignal juntos en volúmenes iguales (3 ml + 3 ml para cada transferencia), rotar durante 1-2 minutes. 20. Envolver las transferencias en film transparenten Sarán Wrap y cerrarlo de manera segura dentro del chasis de exposición. 21. En el cuarto oscuro con solo la luz de seguridad encendida, poner una lámina de película denfro del chasis. Después del tiempo previsto, quitar la película y ponerla en la máquina de revelado para el procesamiento automáfico. Experimentar con el tiempo de exposición para conseguir la exposición apropiada. Ensayo de Centelleo por Proximidad de ZC1 El Ensayo de Centelleo por Proximidad (SPA) se utiliza para analizar la acíividad de proteína serina/treonina cinasa de ZC1 in vitro para la búsqueda sistemática de inhibidores de ZC1 en un ensayo homogéneo. El ensayo descrito más abajo es favorable para la búsqueda sistemática de alto rendimiento de inhibidores de ZC1. Materiales v Disoluciones: 1. Placas (flexibles) de poli(tereftalato de etileno) de 96 pocilios de Wallac (Catálogo de Wallac, N° 1450-401). 2. Easy-Tide [?33P] ATP de NEN (Católogo de NEN, N° NEG602H). 3. Perlas de SPA de poliviniltolueno recubiertas de estreptavidina de Amersham (catálogo de Amersham, N° NIF 107). Reconstituir las perlas en PBS sin magnesio o calcio, a 50 mg/mL. Almacenar las perlas reconstiíuidas a 4°C. (Para alcanzar las cuentas óptimas, es importante que deba estar preseníe exceso de perla de SPA de estreptavidina para enlazar todas las moléculas biotiniladas en el ensayo). Enzima ZC1 activada purificada a partir de células Sf9 - Concentración final de 300 ng/pocillo. 4. Sustrato peptídico N° 902B (biotina-KRTLRRKRTLRRKRTLRR) - Concenfración final de 0,5 µM/pocillo (2XKm). Procedimiento: 1. Preparar las disoluciones de inhibidores a 5x la concentración final deseada en DMSO al 5%. Añadir 10 µL a cada pocilio de la placa flexible. Para los controles positivos y negativos, añadir 10 µL de DMSO al 5%. 2. Preparar la mezcla de ATP como se ha mostrado más arriba (2,1 ml de mezcla de ATP es suficiente para una placa de ensayo). Añadir 20 µL a todos los pocilios. 3. Añadir 20 µL de EDTA 5M a los pocilios de control negativo. 4. Preparar la disolución de enzima en 2,5X tampón de cinasa (HEPES 50 mM pH 7,4, MnCI2 12,5 mM, NaCI 500 mM, y DTT 1 mM). La concentración final de enzima será de 0,30 µg/pocillo (por ejemplo, dada una disolución de almacenamiento de 0,5 mg/mL, añadir 302 µL de enzima ZC1 a 10 mL de Tampón de Cinasa). Añadir 20 µL por pocilio para empezar la reacción. 5. Permitir que la reacción de cinasa avance a temperaíura ambiente durante 60 minutos. 6. A cada pocilio, añadir 200 µL de una disolución de parada que coníiene ATP 0,05 mM, EDTA 5 mM, Triíon X-100 al 0,1%, y 5 mg por ml de perlas de SPA de poliviniltolueno recubiertas de estreptavidina de Amersham (N° de Cat NIF 1077) en PBS. Incubar durante 15 minutos. 7. Centrifugar la placa a 2300 rpm durante 15 min. 8. Contar la placa en el lector Trilux utilizando el protocolo de placa flexible de SPA (que incluye la curva de extinción). Ensayo de Centelleo por Proximidad de Aurora2 El ensayo de Centelleo por Proximidad (SPA) se utiliza para analizar la acíividad de proíeína serina/íreonina cinasa de Aurora2 in viíro para buscar sistemáticamente inhibidores de Aurora2 en un ensayo homogéneo. El ensayo descrito más abajo es favorable para la búsqueda sistemática de alto rendimiento de inhibidores de Aurora2. Materiales v Disoluciones: 1. Placas (flexibles) de poli(tereftalafo de etileno) de 96 pocilios de Wallac (Catálogo de Wallac, N° 1450-401). 2. Easy-Tide [?33P] ATP de NEN (Católogo de NEN, N° NEG602H). 3. Perlas de SPA de polivinillolueno recubiertas de estreptavidina de Amersham (catálogo de Amersham, N° NIF 107). Reconstituir las perlas en PBS sin magnesio o calcio, a 50 mg/mL. Almacenar las perlas reconstiíuidas a 4°C. (Para alcanzar las cuenfas ópíimas, es importaníe que deba esíar presente exceso de perlas de SPA de estrepíavidina para enlazar todas las moléculas biotiniladas en el ensayo). 4. Enzima: enzima GST-Aurora2 purificada a partir de células BL21. 1 ,0 mg/ml; alícuotas de 500 µl. Utilizar 0,125 mg/pocillo de ensayo.

. Susíraío peptídico biotinilado: péptido SUGEN N° 800A. Bioíina-LC-LC- LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG disuelto en DMSO a una concentración de 10 mg/ml. Almacenado a -20°C en alícuotas de 500 µl -Concentración final de 0,012 mlg/pocillo (2 X Km). Procedimiento: 1. Preparar las disoluciones de inhibidores a 5x la concentración final deseada en DMSO al 5%. Añadir 10 µL a cada pocilio de la placa flexible. Para los controles positivos y negativos, añadir 10 µL de DMSO al 5%. 2. Preparar la mezcla de ATP como se ha mostrado más arriba (2,1 ml de mezcla de ATP es suficiente para una placa de ensayo). Añadir 20 µL a todos los pocilios. 3. Añadir 20 µL de EDTA 5M a los pocilios de control negativo. 4. Preparar la disolución de enzima en 2,5X íampón de cinasa (HEPES 50 mM pH 7,4, MnCI2 12,5 mM, NaCI 500 mM, y DTT 1 mM). La concenfración final de enzima será de 0,125 µg/pocillo. Añadir 20 µL por pocilio para empezar la reacción. 5. Permitir que la reacción de cinasa avance a temperaíura ambieníe durante 60 minutos. 6. A cada pocilio, añadir 200 µL de una disolución de parada que contiene ATP 0,05 mM, EDTA 5 mM, Triíon X-100 al 0,1%, y 5 mg por ml de perlas de SPA de polivinillolueno recubiertas de estrepíavidina de Amersham (N° de Caí. NIF 1077) en PBS. Incubar durante 15 minuíos. 7. Centrifugar la placa a 2300 rpm durante 15 min. 8. Contar la placa en el lector Trilux utilizando el protocolo de placa flexible de SPA Ensayos adicionales Los ensayos adicionales que se pueden utilizar para evaluar los compuestos de esta invención ¡ncluyen, sin limitación, un ensayo bio-flk-1, un ensayo de receptor quimérico HER2 - receptor EGF en células completas, un ensayo bio-src, un ensayo bio-lck y un ensayo que mide la función de fosforilación de raf. Los protocolos para cada uno de estos ensayos se pueden encontrar en la Solicitud de EE.UU. N° de Serie 09/099.842, que se incorpora como referencia, incluyendo cualquier dibujo, en la presente memoria. Adicionalmente, la Patente de EE.UU. N° 5.792.783, presentada el 5 de junio de 1996 y la Solicitud de EE.UU. N° de Serie 09/322.297, presentada el 28 de mayo de 1999 se incorporan como referencia como si se expusieran en su totalidad en la presente memoria. La Tabla 1 , de más abajo, muestra los valores de IC50 obtenidos para varios compuesíos de las realizaciones preferidas de la invención.

Un experto en la técnica íambién apreciaría fácilmente que la presente ¡nvención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obíener los fines y veníajas mencionadas, así como los inherentes en la presente memoria. Los complejos moleculares y los métodos, procedimientos, fratamieníos, moléculas, compuesfos específicos descritos en la presente memoria son en este momento representativos de las realizaciones preferidas, son ejemplares, y no están pensados como limitaciones en el alcance de la ¡nvención. Los cambios en estos y otros usos que se les ocurrirán a los expertos en la técnica que se abarcan dentro del espíritu de la invención están definidos por el alcance de las reivindicaciones. Será fácilmente evidente para un experto en la técnica que se pueden hacer diversas sustituciones y modificaciones a la invención descrita en la presente memoria sin salir del alcance y espíritu de la invención. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a los que la invención pertenece. Todas las patentes y publicaciones se incorporan en la presente memoria como referencia en la misma extensión que si cada publicación individual se indicara específica e individualmente para ser incorporada como referencia. La invención descrita de manera ilustrativa en la presente memoria se puede practicar en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describan específicamente en la presente memoria. Así, por ejemplo, en cada caso en la presente memoria cualquiera de las terminologías "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" se puede remplazar con cualquiera de las otras dos terminologías. Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que en el uso de tales términos y expresiones excluir cualquiera de las equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino que se reconoce que son posible diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Así, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante las realizaciones y características opcionales preferidas, se puede recurrir a la modificación y variación de los conceptos descritos en la presente invención por los expertos en la técnica, y que fales modificaciones y variaciones se considera que están dentro del alcance de esta invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Además, mientras que las características y aspectos de la invención se describen en términos de los grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe así en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Por ejemplo, si X se describe como seleccionado del grupo que consiste en bromo, cloro, y yodo, están completamente descritas las reivindicaciones para X que es bromo y las reivindicaciones para X que es bromo y cloro. Otras realizaciones están dentro de las reivindicaciones siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES Un compuesto de la Formula: en la que A, B, D y E se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en carbono y nitrógeno de forma tal que cuando A es nitrógeno, B y E son carbono y cuando E es nitrógeno y A es carbono, entonces B es carbono o nitrógeno; en la que cuando A, B, D, o E es nitrógeno, R2, R3, R4 o R5 no existen respectivamente; a condición de que el anillo que contiene A, B, D y E no contenga más de dos nilrógenos; R2, R3, R4, R5, R7 y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, frihaloalquilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, -SOR13, -SO2R?3, -SO2NR13R14, R14SO2N(R13)-, N-trihalomefanosulfonamido, -C(O)R?5, -C(O)OR?5, R?5C(O)O-, ciano, niíro, halo, cianato, isocianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, -OC(O)NR?3R14, R14OC(O)NR13-, -OC(S)NR?3Ri4, R? OC(S)NR13-, -C(O)NR?3R14> R14C(O)NR13- y -NR13R ; R2 y R3 o R3 y R4 o R4 y R5 o R7 y R8 juntos con los átomos a los que están unidos pueden asociarse para formar un grupo metilendioxi, un grupo etilendioxi, un anillo alicíclico o un anillo heferoalicíclíco; R13 y R14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroalicíclico, -C(O)R?5, acetilo, -SO2R15 y -(CH2)nNR?3Ri4; o R13 y R14 junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros; R15 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, heíeroarilo y heteroalicíclico; R9, R10, R11 y R12 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, trihaloalquilo, halo, ciano, hidroxi, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, - SO2R15, -S(O)Ri5, -(CH2)nC(O)ORi5, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, -C(O)NR?3R , RMC(O)NR?3- y -NR?3R14; n es un número entero desde 0 a 20; X se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno, y azufre; y en la que cuando X es oxígeno o azufre, entonces R6 no existe; o un profármaco o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2.- El compuesto de la reivindicación 1, en el que A, B, D y E son carbono. 3.- El compuesto de la reivindicación 2, en el que X es nitrógeno. 4.- El compuesto de la reivindicación 1, en el que R2, R3, R4, R5, R7 y Rs se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, -SOR?3, -SO2R-|3, -SO2NR?3R , -C(O)OR15, halo y -C(O)NR?3Ri4. 5.- El compuesto de la reivindicación 4, en el que A, B, D y E son carbono. 6.- El compuesto de la reivindicación 5, en el que X es nitrógeno. 7.- El compuesto de la reivindicación 1 , que es: éster etílico del ácido 2-meíil-6-[2-oxo-1,2-d¡hidro-indol-(3Z)-il¡den]-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-(2,6-dicloro-fenilmetanosulfoniI)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-meíil-1 ,4,5,6-íetrahidro-ciclopenta[b]pirroi-3-carboxílico; éster etílico del ácido 2-metiI-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iI¡den]-1 ,4,5,6-tetrahidro-cicIopenta[b]p¡rrol-3-carboxílico; metil amida del ácido 3-[2-metil-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfónico; ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-¡ndoI-(3Z)-iliden]- 1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílíco; éster etílico del ácido 6-[5-metanosulfonil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-íetrahidro-cíclopenfa[b]pirrol-3-carboxíl¡co; éster etílico del ácido 6-[5-dimetiIsuIfamoil-2-oxo-1 ,2-dih¡dro-¡ndol(3Z)-iliden]-2-metiI-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenfa[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-isoprop¡Isulfamoii-2-oxo-1,2-dihidro-¡ndol-(3Z)-iIiden]-2-metiI-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-etanosulfoníl-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1,4,5,6-tetrahidro-cicIopenta[b]pirrol-3-carboxílico; (2-hidroxi-3-pirrolidin-1-il-propil)-amida del ácido 2-metil-6-[5-met¡Isulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-¡ndol-(3Z)-¡Iiden]-1 ,4,5,6-teírahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíIico; (3-ciclopropilamino-2-hidroxi-propil)-amida del ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-fefrahidro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxílico; (2-dimeíílamino-eííl)-amida del ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-¡ndol-(3Z)-iI¡den]-1,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; metil amida del ácido 3-[2-metil-3-((R)-2-pirrolidin-1-iImet¡l-pirrolid¡n-1-carbon¡I)-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-d¡hidro-1H-indol-5-sulfónico; éster etílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-5-sulfamoil-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-feírahidro-cicIopenía[b]pirrol-3-carboxílico; meííl-amida del ácido 3-[3-metanosulfoniI-2-metíl-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dih¡dro-1H-ÍndoI-5-sulfón¡co; ácido {6-metoxi-3-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indoI-(3Z)-iliden]-indan-1-il}-acético; 5-fluoro-3-[2-met¡l-3-((S)-2-pirrol¡d¡n-1-ilmeíil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenía[b]pirrol-(6Z)-¡l¡den]-1,3-d¡h¡dro-indol-2-ona; 6-meíox¡-3-[2-metil-3-((S)-2-pirroIidin-1-¡lmeí¡I-pirroIidin-1-carboniI)-4,5-dihidro-1H-cíclopenfa[b]pirrol-(6Z)-ilíden]-1,3-dihidro-indol-2-ona; 4-metox¡-3-[2-met¡l-3-((S)-2-pirrolidin-1 -ilmetil-pirrolidin-1 -carbonil)-4,5-dih¡dro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-¡liden]-1,3-dihidro-indol-2-ona; 7-c!oro-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]p¡rrol-(6Z)-¡l¡den]-1 ,3-d¡h¡dro-¡ndol-2-ona; 3-[2-metil-3-((S)-2-p¡rrol¡din-1-ilmetiI-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-2-ona; y 6-(4-metoxi-fen¡l)-3-[2-met¡l-3-((S)-2-p¡rrol¡din-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-cicIopenía[b]pirrol-(6Z)-¡I¡den]-1 ,3-d¡h¡dro-indol-2-ona; o un profármaco o sal farmacéuíicameníe acepíable del mismo. 8.- Un compuesío de Fórmula: R2, R3, R4, R5, R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, trihaloalquilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, mercapto, alquiltio, ariltio, -SOR?3, -SO2R?3, -SO2NR13Ri4, R? SO2N(Ri3)-, N-írihalometanosulfonamido, -C(O)R-?5, -C(O)OR-?5, R15C(O)O-, ciano, nitro, halo, cianato, isocianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, -OC(O)NR?3R-?4, R?4OC(O)NR?3-, -OC(S)NR13Ri4, R14OC(S)NR13-, -C(O)NR13R?4, R14C(O)NR13- y -NR13R14; R2 y R3 o R3 y R4 o R4 y R5 o R7 y R8 juntos con los átomos a los que esfán unidos pueden asociarse para formar un grupo metilendioxi, un grupo eíilendioxi, un anillo alicíclico o un anillo heteroalicíclico; R13 y Ru se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroalicíclico, -C(O)R?5, acetilo, -SO2R15 y -(CH2)nNR?3Ri4; o R-13 y R14 junto con los átomos a los que esíán unidos pueden formar un anillo heteroalicíclico de cinco o seis miembros; en la que R15 se selecciona del grupo que consisfe en H, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heteroalicíclico; R9, R10, R11 y R12 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, trihaloalquilo, halo, ciano, hidroxi, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, -SO2R15, -S(O)R-i5, -(CH2)pC(O)ORi5, cianato, isocianato, íiocianato, ¡sotiocianato, -C(O)NR?3Ri4, Ri4C(O)NR?3- y -NR13R ; y n es un número entero desde 0 a 20; o un profármaco o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 9.- El compuesto de la reivindicación 8, en el que R2, R3, R4, R5, R7 y Rd se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, -SOR13, -S?2R-?3, -SO2NR-?3Ri4, - C(O)OR15, halo y -C(O)NR13R14. 10.- El compuesto de la reivindicación 8, que es: éster etílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-il¡den]-1,4,5,6-teírahidro-cicIopenfa[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-(2,6-dicloro-fenilmetanosulfonil)-2-oxo-1,2-d¡hidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1,4,5,6-íetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 2-metil-6-[5-met¡Isulfamoil-2-oxo-1,2-d¡hidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-íefrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíIico; metilamida del ácido 3-[2-metil-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5-sulfónico; ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-¡ndoI-(3Z)-iIiden]-1 ,4,5,6-teírah¡dro-ciclopenía[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-metanosulfonil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-metil-1,4,5,6-íetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-dimetilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indol(3Z)-iliden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-isopropilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-¡liden]-2-metil-1 ,4,5,6-tetrahidro-cicIopenía[b]pirrol-3-carboxílico; éster etílico del ácido 6-[5-etanosulfonil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-2-mefil-1 ,4,5,6-teírahidro-ciclopenfa[b]p¡rrol-3-carboxílico; (2-hidroxi-3-pirrolidin-1-il-propil)-amida del ácido 2-meíil-6-[5-metilsulfamo¡l-2-oxo-1,2-d¡h¡dro-¡ndol-(3Z)-iIiden]-1,4,5,6-tetrahidro- ciclopenfa[b]pirrol-3-carboxílico; (3-ciclopropilamino-2-h¡droxi-propil)-amida del ácido 2-meíil-6-[5-metilsulfamo¡l-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1,4,5,6-tetrahidro-cicIopenta[b]pirrol-3-carboxíl¡co; (2-dimefilamino-et¡l)-amida del ácido 2-metil-6-[5-metilsulfamoiI-2-oxo- 1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-tetrahidro-ciclopenía[b]pirroI-3-carboxíIico; metilamida del ácido 3-[2-metil-3-((R)-2-pirrolidin-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfónico; éster etílico del ácido 2-metil-6-[2-oxo-5-sulfamoil-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-1 ,4,5,6-tetrah¡dro-ciclopenta[b]pirrol-3-carboxíl¡co; metilamida del ácido 3-[3-metanosulfonil-2-metil-4,5-dihidro-1 H-cicIopenta[b]pirroI-(6Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-¡ndol-5-sulfónico; ácido {6-metox¡-3-[5-metilsulfamoil-2-oxo-1,2-dihidro-indoI-(3Z)-¡liden]-indan-1-il}-acético; 5-fluoro-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1,3-dihidro-indol-2-ona; 6-metoxi-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmetil-pirrolidin-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenía[b]pirrol-(6Z)-il¡den]-1,3-dihidro-indol-2-ona; 4-meíoxi-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1 -ilmeíil-pirrolidin-1 -carboniI)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-¡liden]-1,3-d¡hidro-indol-2-ona; 7-cloro-3-[2-met¡l-3-((S)-2-pirroIidin-1-¡lmetil-pirrolidin-

1-carbonil)-4,5-dihidro-1H-ciclopenfa[b]pírrol-(6Z)-iliden]-1,3-dihidro-indoI-

2-ona;

3-[2-meíil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmeíil-pirroI¡din-1-carbonil)-4,5-dihidro-1 H-ciclopenfa[b]pirrol-(6Z)-iliden]-1 ,3-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-2-ona; y 6-(

4-metoxi-fenil)-3-[2-metil-3-((S)-2-pirrolidin-1-ilmeíil-pirrolidin-1-carbonil)-4,

5-dihidro-1H-ciclopenta[b]pirrol-(6Z)-il¡den]-1,3-dihidro-indol-2-ona; o un profármaco o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 11.- Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto, profármaco o sal farmacéuticamente aceptable de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 7, 8, o 10 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables. 12.- Un método para la modulación de la actividad caíalítica de una proteína cinasa que comprende poner en contacto dicha proteína cinasa con un compuesto, profármaco o sal farmacéuticamente aceptable de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 7, 8, o 10. 13.- El método de la reivindicación 12, en el que dicha proteína cinasa se selecciona del grupo que consiste en una receptor tirosina cinasa, una no receptor tirosina cinasa y una serina-treonina cinasa. 14.- Un método para tratar o prevenir un trastorno relacionado con proteína cinasas en un organismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un compuesto, profármaco o sal farmacéuticamente aceptable de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 7, 8, o 10 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables a dicho organismo. 15.- El método de la reivindicación 14, en el que dicho trastomo relacionado con proteína cinasas se selecciona del grupo que consiste en un trastorno relacionado con receptor tirosina cinasas, un trastorno relacionado con no receptor tirosina cinasas y un trastorno relacionado con serina-treonina cinasas. 16.- El método de la reivindicación 14, en el que dicho trastorno relacionado con proteína cinasas se selecciona del grupo que consiste en un trastorno relacionado con PDGFR y un trastorno relacionado con flk. 17.- El método de la reivindicación 14, en el que dicho trastorno relacionado con proteína cinasas es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en carcinoma espinocelular, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de próstafa, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, glioma, cáncer colorecfal, cáncer genitourinario y cáncer gastrointestinal. 18.- El método de la reivindicación 14, en el que dicho trastorno relacionado con proteína cinasas se selecciona del grupo que consiste en diabetes, un trastorno autoinmunitario, un trastorno de hiperproliferacíón, reestenosis, fíbrosís, psoriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau, artrosis, artritis reumatoide, angiogénesis, un trastorno inflamatorio, un trastorno ¡nmunológico y un trastorno cardiovascular. 19.- El método de la reivindicación 14, en el que dicho organismo es un ser humano.