CZ304320B6 - Farmaceutický prostředek obsahující bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem a předmět výroby - Google Patents

Abstract

Farmaceutický prostředek obsahující bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem. Použití farmaceutického prostředku pro ovlivnění vaskulární permeability (VP) v tkáních. Zahrnuty jsou rovněž související prostředky a výrobek.

Description

Oblast techniky

Navrhovaný vynález obecně spadá do oblasti medicíny a konkrétně popisuje způsoby a prostředky pro ovlivňování a inhibici vaskulámí permeability (VP).

Dosavadní stav techniky

Angiogeneze je proces vaskularizace tkáně, který zahrnuje růst nově se vyvíjejících krevních cév v tkáni a bývá také označován jako neovaskularizace. Proces je ovlivňován infiltrací endotheliálních buněk a buněk hladkého svalstva. Věří se, že tento proces probíhá jedním ze tří způsobů: céva se může oddělit zjiž dříve existující cévy, vývoj cévy de novo může probíhat z prekurzorových buněk (vaskulogeneze) nebo existující malá céva může zvětšovat svůj průměr. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990). Aby angiogeneze mohla probíhat, endotheliální buňky musí nejprve degradovat a prostoupit bazální membránu krevní cévy podobným způsobem, jaký používají nádorové buňky během invaze a tvorby metastáz. Antiogeneze obvykle neprobíhá v dospělých nebo zralých tkáních, ačkoliv může probíhat při hojení zranění a během růstového cyklu žlutého tělíska (corpus luteum). Viz např. Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990). Zatímco angiogeneze je důležitý proces během neonatálního růstu, je rovněž nesmírně důležitá při hojení zranění a je důležitým faktorem při patogenezi celé řady klinických poruch zahrnujících záněty tkání, artritidu, nádorový růst, diabetickou retinopatii a pigmentózní degenerace sítnice a podobně. Tyto klinické projevy spojené s angiogenezí jsou označovány jako angiogenní choroby. Folkman et al., Science, 235:442^147 (1987).

Bylo zjištěno, že potlačení angiogeneze může být užitečnou terapií pro omezování růstu nádoru. K inhibici angiogeneze může docházet (1) potlačením uvolňování „angiogenních molekul“, jako jsou bFGF (basic fibroblast growth factor), (2) neutralizací angiogenních molekul například pomocí anti-pbFGF protilátek, (3) použitím inhibitorů receptorů vitronektinu α_νβ.3 a (4) potlačením reakce endotheliálních buněk na angiogenní stimuly. Nejnadějnější je tato poslední strategie, kdy Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96 (1992) popisuje některé inhibitory reakce endotheliálních buněk zahrnující inhibitor kolagenázy, inhibitory převrácení bazální membrány, angostatické steroidy, inhibitory angiogeneze pocházející zhub, faktor destiček 4, thrombospondin, léky užívané pro léčbu artritidy, jako je např. D-penicillamin athiomalát zlatý, analogy vitamínu D₃, interferon alfa apod., kdy všechny tyto látky jsou rovněž použitelné pro inhibici angiogeneze. Další použitelné inhibitory angiogeneze je možno nalézt v Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988) a patenty US 5 092 885, 5 112 964, 5 192 744, 5 202 352, 5 753 230, 5 766 591. Přesto v žádné z výše uvedených referencí nejsou mezi inhibitory angiogeneze zahrnuty proteiny Src.

Již dříve bylo zjištěno, že angiogeneze závisí na interakci mezi vaskulámími integriny a proteiny mezibuněčné hmoty. Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994). Dále bylo zjištěno, že programovaná buněčná smrt (apoptóza) angiogenních vaskulámích buněk je spuštěna interakcí, která může být potlačena některými konkrétními antagonisty vaskulámích integrinů α_νβ₃. Brooks et al., Cell, 79:1157-1164 (1994). Nejnovější zjištění ukazují, že vazba metaloproteázy-2 mezibuněčné hmoty (MMP-2) na receptor vitronektinu (α_νβ₃) může být potlačena pomocí α_νβ5 antagonistů a tímto způsobem je možné potlačit enzymatickou funkci této proteázy. Brooks et al., Cell, 85:683-893 (1996). Bylo zjištěno, že integriny a_v představují důležitou složku nezbytnou pro přežívání endotheliálních buněk během angiogeneze cév. Specifický antagonista integrinů ot_v blokuje diskrétní angiogenetické dráhy indukované růstovými faktory. Např. angiogeneze indukovaná pomocí vaskulámího endotheliálního růstového faktoru (VEGF) je blokována

- 1 CZ 304320 B6 pomocí antagonistů integrinu a_vp5, zatímco angiogeneze indukovaná bazickým fibroblastovým růstovým faktorem (bFGF) je blokována pomocí antagonistů integrinu α_νβ3·

Mozkové cévy jsou charakteristické vysoce specifickou krevně mozkovou bariérou, která zabraňuje malým molekulám prostupovat do přilehlé mozkové tkáně. Povaha krevně mozkové bariéry u savců je středem zájmů celé řady farmakologických studií, neboť celá řada léčiv právě díky této vysoce specifické krevně mozkové bariéře nemůže prostupovat z krevního řečiště do mozku. Navrhovaný vynález zahrnuje rovněž nepředpokládané zjištění, že vaskulární permeabilita, měřená pomocí propustnosti krve, může být ovlivněna pomocí proteinu Src nebo Yes. Dále bylo zjištěno, že vaskulární permeabilita je spojena s angiogenezi a celou řadou patologických stavů. Zánětem vyvolaná zvýšená vaskulární permeabilita je spojena s otokem tkáně a jejím svraštěním.

Nezbytnost tyrozin kinázové aktivity proteinu Src pro angiogenezi indukovanou v EGF, ale ne bFGF, ukazuje, že v regulaci a aktivaci těchto signálů existují podstatné rozdíly, jak v kuřecím embryu, tak myších modelech. Eliceiri et al., Molecular Cell, 4:915-924 (1999).

Změny ve vaskulární permeabilitě dané angiogenními signály z nádorových buněk představují model pro sledování signalizačních drah spojených s rakovinou, přestože vaskulární permeabilita způsobená zraněním, nemocí nebo jiným traumatem krevních cév je ve většině případů zvýšená propustnost cév a otok spojený s poškozením tkáně. Například, cerebrovaskulámí choroba spojená s mozkovou příhodou nebo jiným vaskulárním poškozením mozku nebo míšní tkáně je nejběžnější neurologická porucha a v mnoha případech důvod invalidity. Obvykle poškození mozku nebo tkáně míchy v oblasti mozkové příhody vyvolává propustnost cév a/nebo edém. Mozková příhoda může zahrnovat zranění způsobené mozkovou ischémií, přerušením normálního průtoku krve do mozku, mozkovou nedostatečností způsobenou přechodnými poruchami krevního toku, infarktem způsobeným embolií nebo trombózou buď intrakraniálních, nebo extrakraniálních cév, krvácením, arteriovenózními malformacemi. Ischemická mrtvice a mozkové krvácení může vzniknout náhle a důsledek těchto příhod je obvykle závislý na poškozené oblasti mozku (viz. The Merck Manual, 16. vydání, kapitola 123, 1992).

Kromě mozkových příhod rovněž infekce nebo choroby centrálního nervového systému (CNS) mohou ovlivnit krevní cévy v mozku a míše a mohou způsobit zánět nebo edém tak, jak například způsobuje bakteriální meningitida, virová encefalitida a formování mozkových abscesů (viz. The Merck Manual, 16. vydání, kapitola 125, 1992). Systémové choroby mohou rovněž oslabit stěnu krevních cév a tím způsobit zvýšenou propustnost cév a otoky tak, jako v případě diabetů, nemocí ledvin, arterosklerózy apod. Vaskulární propustnost a vznik otoků jsou tedy kritické patologie, odlišné a nezávislé na rakovině, v případě kterých je třeba efektivního specifického terapeutického zásahu, a to zejména v případě celého spektra poranění, traumat nebo chorob.

Bylo zjištěno, že selektivní inhibici tyrozin kináz rodiny Src snížíme poškození nebo trauma spojené se zvýšením vaskulární permeability v tkáních, což vede k potlačení patologických stavů spojených se zvýšenou propustností krevních cév a/nebo vznikem otoků.

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález je zaměřen na ovlivnění vaskulární permeability tyrozin kinázou Src, zde bude označována jako Src, nebo tyrozin kinázou Yes, rovněž označovanou pouze jako Yes, nebo selektivní inhibici aktivity tyrozin kináz rodiny Src.

Vynález se týká farmaceutického prostředku obsahujícího bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

-2CZ 304320 B6

Tedy, jedním aspektem navrhovaného vynálezu je farmaceutický prostředek určený k ovlivnění vaskulámí permeability v cílové tkáni savců. V prostředcích podle navrhovaného vynálezu je obsaženo terapeuticky efektivní množství směsi tyrozin kináz Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Předpokládaný účinek prostředku, který obsahuje aktivní Src a Yes kinázy, je posílení nebo zvýšení vaskulámí permeability krevních cév v cílové tkáni. V případě, že požadovaný Src protein je aktivní kináza, nej vhodnější Src je Src-A. Dalším vhodným aktivním Src proteinem je ten, kde aminokyselinový zbytek na pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu. 'Nejvhodnější aktivní Yes protein by měl mít kinázovou aktivitu divokého typu lidského Yes, jako je například Yes-1 protein. Dalším vhodným aktivním Yes proteinem je takový, kde kinázové inaktivační fosforylační místo proteinu Yes je mutováno, aby zabránilo nebo minimalizovalo inaktivační fosforylaci, podobně jako mutace aminokyselinového zbytku 527 proteinu Src na jakoukoliv aminokyselinu kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu.

Předpokládaný účinek prostředku, který obsahuje Src a Yes protein, které jsou ve formě neaktivních kináz, je snížení nebo potlačení vaskulámí permeability krevních cév v cílové tkáni. V případě, že požadovaný Src protein je neaktivní protein, nejvhodnějším Src je Src 251. Dalším vhodným neaktivním Src je Src K295M. Vhodný neaktivní Yes proteine bude postrádat kinázovou aktivitu na rozdíl od proteinu divokého typu.

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující therapeuticky účinné množství nukleových kyselin umožňující expresi tyrozin kináz Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu, po transfekci do cílových buněk ve vhodném farmaceutickém nosiči. Exprimovatelné nukleové kyseliny kódující Src a Yes kinázy mohou obsahovat sekvence nukleových kyselin kódující celé proteiny nebo jejich části kináz Src nebo Yes. Po transfekci do cílových buněk dochází v těchto buňkách k přepisu a transkripci a translaci nukleových kyselin, což vede k expresi požadovaných proteinů.

Pokud cílem ovlivnění je posílení nebo zvýšení vaskulámí permeability krevní cév v cílové tkáni, nukleové kyseliny kódující Src budou kódovat aktivní formy Src a nukleové kyseliny kódující Yes budou kódovat aktivní formu Yes kinázy. Jakmile jsou přeneseny do cílové hostitelské buňky, jsou tyto nukleové kyseliny hostitelskou buňkou exprimovány. Nejvhodnější nukleové kyseliny kódující Src jsou ty, které kódují aktivní Src-A protein. Další vhodnou nukleovou kyselinou kódující Src je nukleová kyselina kódující mutované Src, kde aminokyselinový zbytek na pozici 527 exprimovaného Src proteinu je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu. Nejvhodnější nukleová kyselina kódující Yes protein kóduje protein divokého typu, nebo protein u modifikovaného tak, aby postrádal nebo potlačoval inaktivační fosforylační místo Yes proteinu podobným způsobem mutace aminokyselinového zbytku 527 proteinu Src, jak bylo popsáno výše.

Pokud je požadovaný účinek prostředku snížení nebo potlačení vaskulámí permeability krevních cév v cílové tkáni, nejvhodnější nukleovou kyselinou kódující neaktivní Src protein je nukleová kyselina kódující Src 251 protein. Další vhodnou nukleovou kyselinu kódující Src je nukleová kyselina kódující neaktivní Src K.295M. Nejvhodnější neaktivní nukleová kyselina kódující protein Yes bude kódovat protein, který postrádá proteinovou aktivitu.

Je zřejmé, že prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs nukleových kyselin, kde každá nukleová kyselina může obsahovat exprimovatelný gen pro Src nebo Yes. Navíc je také zřejmé, že jedna molekula nukleové kyseliny může obsahovat oba geny kódující jak Src protein, tak Yes protein. Pro požadované ovlivnění angiogeneze a vaskulámí permeability v cílové tkáni, farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs aktivních nebo neaktivních tyrozin kináz Src nebo tyrozin kináz Yes. Podobně farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs nukleových kyselin umožňujících expresi aktivní nebo neaktivní formy tyrozin kináz Src nebo tyrozin kináz Yes.

-3 CZ 304320 B6

Použitím různých množství první tyrozin kinázy podané současně s druhým vyšším množstvím druhé tyrozin kinázy, podle navrhovaného vynálezu, umožní citlivější modulaci. Podle této konkrétní varianty použitím promotorů s různou intenzitou exprese nebo jiných regulačních elementů, první tyrozin kináza, jejíž gen je exprimován v nižší míře, může být podávána zároveň s vysoce exprimovaným genem pro druhou tyrozin kinázu, podle navrhovaného vynálezu. V této konkrétní variantě může být dosaženo nárůstu angiogeneze nebo jejího udržení, minimalizací nebo potlačením vaskulámí permeability pomocí prvního genu s nízkou expresní aktivitou pro Src v kombinaci s druhým vysoce expresně aktivním Yes genem. Tato současná aplikace může být uskutečněna při použití oddělených expresních vektorů nebo pomocí jednoho kombinovaného expresního vektorového konstruktu. Podobně, snížení angiogeneze může být dosaženo nebo udrženo posílením nebo zvýšením vaskulámí permeability, za použití prvního genu s nízkou expresní aktivitou pro Src vkombinaci s druhým vysoce expresně aktivním Yes genem. Další stupně modulace mohou být dosaženy pomocí různých permutací vysokých/nízkých a Src/Yes v kombinaci s volbou aktivity promotorových elementů a indukovatelných promotorů.

Je zřejmé, že jednotlivé geny pro Src a Yes mohou být pod regulační kontrolou stejné nebo různých regulačních sekvencí nukleové kyseliny, kterými mohou být například posilovače, represory a promotory. V případě, že jeden nebo více proteinů je exprimováno ze stejného vektoru, je zřejmé, že regulace a kontrola transkripce nezávislých genů pro jednotlivé proteiny může být pod kontrolou stejných regulačních jednotek. Je také zřejmé, že regulace a kontrola transkripce může probíhat pomocí dvou nebo více nezávisle operujících regulačních jednotek. Regulační elementy známé v současném stavu techniky mohou být konstitutivně aktivní, nebo indukovatelné, posilovače, promotory, supresory nebo podobné nukleotidové sekvence.

Je zřejmé, že prostředek obsahující nukleové kyseliny podle navrhovaného vynálezu může obsahovat virové a/nebo nevirové vektory pro přenos genů obsahující nukleotidové sekvence kódující proteiny Src a/nebo Yes. Retrovirové a nevirové vektory zajišťující přenos a expresi genu jsou známé v současném stavu techniky a zkráceně popsány dále.

Nejvhodnější nukleová kyselina bude kódovat Src-A protein. Další vhodný aktivní Src protein je takový, ve kterém aminokyselina na pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina, kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu.

Je zřejmé, že směs Src a Yes proteinů a/nebo nukleových kyselin kódující tyto kyseliny může kombinovat aktivní a neaktivní formy těchto proteinů v závislosti na požadované míře ovlivnění a společném požadovaném účinku na angiogenezi a vaskulámí permeabilitu, jak je uvedeno v navrhovaném vynálezu.

Prostředek obsahující proteiny Src nebo Yes může obsahovat přečištěný protein, biologicky aktivní fragmenty přirozených proteinů, rekombinantně produkované Src nebo Yes proteiny nebo proteinové fragmenty fúzních proteinů, nebo geny/nukleotidové expresní vektory pro expresi Src nebo Yes proteinů, nebo jejich směsi. V případě, že Src nebo Yes proteiny jsou inaktivované nebo inhibované, ovlivněním je potlačení vaskulámí permeability. V případě, že proteiny Src nebo Yes jsou aktivní nebo aktivované, ovlivněním je posílení vaskulámí permeability.

Navrhovaný vynález zahrnuje způsoby léčby savčí tkáně pomocí prostředku obsahujícího therapeuticky účinné množství Src nebo Yes, nebo jejich kombinací, které bude ovlivňovat vaskulámí permeabilitu. Podle způsobů navrhovaného vynálezu jsou tyrozin kinázy Src a Yes, nebo nukleové kyseliny ve formě expresních vektorů zajišťující expresi těchto proteinů aplikované do tkáně trpící poruchou, která může být ovlivněna modulací vaskulámí permeability. V případě, že jako terapeutický zásah při ovlivnění vaskulámí permeability je požadováno zvýšení nebo posílení vaskulámí permeability, je třeba aplikovat aktivní formy Src proteinu a/nebo Yes proteinu. Podobně, je popsán způsob aplikace exprimovatelných nukleových kyselin, které kódují aktivní nebo neaktivní formy Src a/nebo Yes proteinu.

-4CZ 304320 B6

Tkáň, kteráje léčena může být jakákoliv tkáň, ve které je třeba ovlivnit vaskulámí permeabilitu. Terapeutická léčba probíhá aplikací efektivního množství prostředku s požadovaným účinkem do cílové tkáně a dostatečně dlouhým působením proteinu nebo nukleových kyselin obsažených v léčebném prostředku v cílové tkáni. Pro potlačení vaskulámí permeability je užitečné ošetřit porušenou tkáň v místě, kde je propustnost cév narušena. Příkladem takové tkáně je tkáň, ve které probíhá zánět, tkáň zasažená mrtvicí, infarkt myokardu nebo jiného zablokování normálního průtoku apod.

Pro posílení je vhodné léčit pacienty trpící ischemickými chorobami končetin, ve kterých je oslabený krevní oběh v případě diabetů, nebo jiných poruch, nebo pro posílení prostupu léčiv určených pro léčbu mozku přes krevně mozkovou bariéru. Pacienti s chronickými zraněními, která se nehojí, mohou být rovně léčeni díky nárůstu proliferace vaskulámích buněk a neovaskularizaci, kteráje ovlivněna vaskulámí permeabilitou.

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je předmět výroby, která zahrnuje balicí materiál a farmaceutický prostředek obsažený uvnitř uvedeného balicího materiálu, kde tento farmaceutický prostředek je schopen ovlivnit vaskulámí permeabilitu v tkáni trpící chorobou, přičemž uvedený balicí materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že popisovaný farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu chorob pomocí ovlivnění vaskulámí permeability a kde tento farmaceutický prostředek obsahuje therapeuticky účinné množství tyrozin kináz Yes ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Tato varianta popisuje protein Yes v aktivní nebo neaktivní formě a také nukleovou kyselinu kódující nebo neaktivní protein Yes. Jak retrovirové, tak nevirové přenosové/expresní vektory pro přenos genů mohou obsahovat nukleotidovou sekvenci kódující protein Yes buď v aktivní nebo neaktivní formě, nebo oboje. Pokud jsou přítomny obě, aktivní i neaktivní, formy protein kinázy, je třeba, aby geny byly pod kontrolou oddělených indukovatelných promotorů umožňujících alternativní expresi podle požadavků léčby.

Dalším aspektem navrhovaného vynálezuje předmět výroby popisující farmaceutický prostředek obsahující therapeuticky účinné množství tyrozin kináz Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu, ve farmaceuticky přijatelném nosiči. V případě, že příslušné balení je určeno pro ovlivnění ve smyslu posílení vaskulámí permeability, Src a Yes jsou v aktivní formě. Vhodná aktivní forma proteinu Src je Src-A protein. Další vhodný aktivní Src protein je takový, kde aminokyselina v pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu.

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu popisuje předmět výroby, která zahrnuje farmaceutické prostředky, přičemž tento farmaceutický prostředek zahrnuje therapeuticky účinné množství neaktivní tyrozin kinázy Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu, ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž smyslem požadovaného ovlivnění je potlačení nebo snížení vaskulámí permeability. Vhodný neaktivní protein Src je protein Src 251. Neaktivním proteinem Src je protein Src K295M.

Podobně dalším aspektem navrhovaného vynálezu jsou oblasti výroby, kde farmaceutický prostředek obsahuje nukleovou kyselinu umožňující expresi tyrozin kináz Src a Yes ve vhodném farmaceutickém nosiči. Nejvhodnější nukleové kyseliny tvořící část tohoto farmaceutického prostředku, podle této oblasti výroby, kódují aktivní protein Src, přičemž smyslem ovlivnění je posílení nebo aktivace vaskulámí permeability. Další možností jsou nukleové kyseliny kódující aktivní Yes protein. Vhodná aktivní forma proteinu Src je Src-A protein. Další vhodný aktivní Src protein je takový, kde aminokyselina v pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu. Je také zřejmé, že je možné připravit jednu nukleovou kyselinu, kteráje schopna exprimovat oba geny Yes i Src buď nezávisle regulované, nebo pod transkripční kontrolou stejného promotoru, posilovače, supresoru, represoru, nebo jiných vhodných regulačních sekvencí nukleové kyseliny.

-5CZ 304320 B6

Poškození tkáně spojené se zvýšenou propustností cév a/nebo otokem spojeným se změnami vaskulární permeability je možné léčit pomocí inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src. Za tímto účelem je do narušené tkáně, která má být léčena aplikováno efektivní množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src schopných ovlivnit vaskulární permeabilitu. Poškození tkáně způsobené zvýšenou propustností cév nebo otokem je tímto způsobem možno podstatně snížit.

Navrhovaný vynález popisuje konkrétně způsob inhibice zvýšení vaskulární permeability v tkáni trpící poruchou spojenou se zvýšenou propustností cév a/nebo otokem aplikováno efektivní množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src schopných ovlivnit vaskulární permeabilitu zároveň s farmaceuticky aktivním nosičem. V nej vhodnější variantě je specifický inhibitor tyrozin kinázy Src aplikován do tkáně.

Jakýkoliv patologický stav zahrnující zhoubné zvýšení vaskulární permeability vyvolané zraněním a poškození tkáně způsobené propustností cév nebo otokem může být touto metodou léčen. Tyto patologické stavy mohou zahrnovat trauma krevních cév, jako je fyzické napojení, zablokování, oddělení, uzavření, trauma apod. Další systémové patologické stavy, jako je arterioskleróza, diabetózní retinopatie, zánětlivé choroby způsobené mikrobiálními infekcemi, artritida apod. mohou být rovněž léčeny pomocí způsobů podle navrhovaného vynálezu.

Způsoby navrhovaného vynálezu jsou použitelné pro léčbu cerebrovaskulámích chorob nebo traumat potlačením poškození tkáně, které je způsobeno zvýšenou vaskulární propustností a/nebo otokem, kterýje s touto poruchou spojen. Konkrétně, způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou použitelné pro ochranu tkáně před poškozením spojeným s nárůstem vaskulární permeability indukovaným VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) a mediovaným Src. Přesto způsoby podle navrhovaného vynálezu nejsou omezeny pouze pro VEGF indukovaný nárůst vaskulární permeability, ale jsou také vhodné pro ovlivnění nárůstu vaskulární permeability vyvolaném tyrozin kinázami rodiny Src v odpovědi na další regulační signály.

Konkrétně, inhibici tyrozin kináz Src (také zde zkráceně označovanou jako Src) a blízkou příbuznou tyrozin kinázou Yes (také zde zkráceně označovanou jako Yes) léčená tkán může být specificky ovlivněna tak, aby v ní došlo ke snížení vaskulární permeability spojené se zraněním nebo chorobou.

Vhodný inhibitor tyrozin kináz rodiny Src pro účely navrhovaného vynálezu může být chemický inhibitor patřící do skupiny zahrnující PPI, PP2, PD173955, AGF1872, PD162531, Radiciol R2146 a Geldanamycin. Pro použití podle navrhovaného vynálezu je možno použít i jiné chemické inhibitory tyrozin kináz rodiny Src.

Vaskulární permeabilita může být také ovlivněna aplikací inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src, kterým je proteinový inhibitor do tkáně, jako je neaktivní Src protein, jako Src K295M, nebo Src 215, nebo neaktivní Yes protein, nebo aktivní c-terminální Src kinázový protein (CSK).

Pro ovlivnění vaskulární permeability v tkáni jsou také důležité nukleové kyseliny kódující inhibiční protein tyrozin kináz rodiny Src, jako je neaktivní Src, neaktivní Yes anebo aktivní CSK protein. Tyto inhibitory tyrozin kinázové aktivity rodiny Src na bázi nukleových kyselin mohou zahrnovat jeden nebo více retrovirových expresních vektorů, nevirové expresní vektory, apod. Tyto inhibitory tvořené nukleovou kyselinou by měly obsahovat vhodné regulační signály, jako jsou promotory nebo posilovače jednoho nebo více exprimovatelných segment nukleových kyselin na libovolné molekule nukleové kyseliny.

Další aspekt navrhovaného vynálezu se týká oblasti výroby zahrnující balicí materiál a farmaceutický prostředek obsažený uvnitř tohoto balicího materiálu, přičemž tento farmaceutický prostředek je schopen ovlivnit vaskulární permeabilitu vtkáni trpící příslušnou chorobou. Balicí materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že příslušný farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu vaskulární propustnosti nebo otoků spojených s poruchou a farmaceutický

-6CZ 304320 B6 prostředek obsahuje terapeuticky účinné množství inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Vzhledem k výrobě, navrhovaný vynález může obsahovat jako součást farmaceutického prostředku inhibitor tyrozin kináz rodin Src chemické povahy. Konkrétně, nej vhodnější inhibitor tyrozin kináz rodin Src chemické povahy by měl patřit do skupiny zahrnující PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin, nebo látky s podobnou schopností inhibovat aktivitu Src. Nej vhodnějším inhibitorem je PPI.

V oblasti výroby podle navrhovaného vynálezu je rovněž zahrnut farmaceutický prostředek obsahující proteinový inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, kterým je neaktivní protein Src, jako je např. Src K295M nebo Src 251, neaktivní protein Yes nebo aktivní CSK protein.

Dále je možné, aby farmaceutický prostředek obsahoval nukleovou kyselinu kódující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelném nosiči. V tomto farmaceutickém prostředku může být inhibitorem kódovaným nukleovou kyselinou neaktivní protein Src, jako je např. Src K295M nebo Src 251, neaktivní protein Yes nebo aktivní CSK protein.

Předmět výroby může zahrnovat jeden nebo více farmaceutických prostředků, které obsahují terapeutické inhibitory tyrozin kináz rodiny Src nebo sub-terapeutické množství jednoho nebo více inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs jednoho nebo více inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src v sub-terapeutickém množství ovlivňujícím vaskulámí permeabilitu, které při společném působení zajistí požadované snížení vaskulámí permeability v ošetřené tkáni. Farmaceutický prostředek popisovaný v článku výroby podle navrhovaného vynálezu se může odlišovat podle požadovaného modulačního účinku a etiketa na obalu by měla odpovídat těmto změnám.

Farmaceutický prostředek popisovaný v článku výroby podle navrhovaného vynálezu se může odlišovat podle požadovaného modulačního nebo inhibičního účinku a etiketa na obalu by měla odpovídat těmto změnám.

Detailní popis vynálezu

A. Definice

Aminokyselinový zbytek: aminokyselina vzniklá chemickým štěpením (hydrolýzou) polypeptidu v peptidových vazbách. Aminokyselinové zbytky zde popisované jsou nejčastěji v „L“ izomemí formě. Přesto, zbytky v „D“ izomemí formě mohou nahradit jakýkoliv L-aminokyselinový zbytek, dokud si polypeptid zachová svoje funkční vlastnosti. NH₂ označuje volný konec aminokyseliny nacházející se na amino-konci polypeptidu. COOH označuje volný konec aminokyseliny nacházející se na karboxy-konci polypeptidu. V souladu se standardní nomenklaturou polypeptidů (viz J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) a uznáno jako 37 CFR §1.822 (b) (2)).

Je třeba uvést, že všechny sekvence aminokyselinových zbytků jsou zde uváděny ve vzorcích, u kterých je pravo-levá orientace v konvenčním směru od amino-konce ke karboxy-konci. Dále je třeba uvést, že uvozovky na začátku, a nebo konci sekvence aminokyselinových zbytků označují peptidovou vazbu k další sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků.

Polypeptid: popisuje lineární sérii aminokyselinových zbytků napojených navzájem peptidovou vazbou mezi α-amino skupinou a karboxy koncem následující aminokyseliny.

-7CZ 304320 B6

Peptid: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín lineární sérii ne více než 50 aminokyselinových zbytků napojených navzájem stejně jako v případě polypeptidu.

Cyklický peptid: tak, jak je zde používán, popisuj tento termín sloučeninu s kruhovou strukturou heteroatomu, která zahrnuje několik amidových vazeb jako v typickém peptidů. Cyklický peptid může být homodetický „začátek ke konci“ zacyklený lineární peptid, kde n-konec lineárního peptidů tvoří amidovou vazbu s c-terminálním karboxylem lineárního peptidů, nebo může obsahovat kruhovou strukturu kde polymer je heterodetický a obsahuje amidové vazby a/nebo jiné vazby které uzavírají cyklus, jako jsou disulfidické vazby, thioestery, thioamidy, guanidino a podobné vazby.

Protein: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín lineární sérii více než 50 aminokyselinových zbytků napojených navzájem stejně jako v případě polypeptidu.

Fúzní protein: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín polypeptid obsahující alespoň dvě odlišné polypeptidové domény operativně spojené typickou peptidovou vazbou (fúzované), kde dvě domény odpovídají peptidům, které se v přirozeném prostředí fúzované nenacházejí.

Syntetický peptid: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín chemicky připravený řetězec aminokyselinových zbytků spojených dohromady peptidovou vazbou, který neobsahuje přirozeně se vyskytující proteiny ajejich fragmenty.

B. Obecné předpoklady

Navrhovaný vynález popisuje obecně: (1) zjištění, že vaskulámí permeabilita vyvolaná pomocí VEGF je specificky vyvolána tyrozin kinázami rodiny Src a Yes a že vaskulární permeabilita může být ovlivněna aplikací buď aktivní, nebo neaktivní formy proteinů Src a Yes pro potlačení, nebo posílení angiogeneze, respektive, (2) další zjištění, že vaskulámí propustnost a/nebo otok spojené s traumatem, poruchou nebo zraněním vyvolávajícím nárůst vaskulámí permeability mohou být specificky ovlivněny a potlačeny inhibici aktivity tyrozin kináz rodiny Src, a (3) zjištění, že aplikace inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src in vivo zmenší poškození tkáně způsobené nárůstem vaskulámí permeability vyvolané chorobou nebo zraněním, v případě že se nejedná o rakovinu nebo angiogenezí.

Toto zjištění je důležité, díky úloze, kterou vaskulámí permeabilita hraje v celé řadě chorob, procesů a ve spojení s angiogenezí, tvorbou nových krevních cév. V případě, že je tkáň postižena chorobou vyžadující angiogenezí pro růst tkáně, je žádoucí potlačit angiogenezí a tím potlačit chorobný růst tkáně. Angiogeneze může být účinněji potlačena za současného snížení vaskulámí permeability. V případě, že poškozená tkáň vyžaduje pro růst a uzdravení angiogenezí, je žádoucí posílit nebo vyvolat vaskulární permeabilitu a tím angiogenezí a tak zajistit růst tkáně a uzdravení.

V případě, že vznik nových krevních cév je příčinou, nebo průvodním jevem, patologie spojené s nemocnou tkání, potlačení vaskulámí permeability a tím angiogeneze sníží zhoubný účinek choroby. Potlačením vaskulámí permeability spojené s angiogenezí je možné ovlivnit průběh choroby, potlačit její příznaky a v některých případech dokonce chorobu vyléčit.

V některých případech je zvýšení vaskulámí permeability žádoucí pro zvýšení účinnosti přenosu léčiv po systémovém podání. Krevně mozková bariéra je termín popisující přesnou regulaci vaskulámí permeabilita způsob minimalizace prostupu dokonce i malých molekul do mozku z krevního oběhu. Schopnost selektivně a specificky ovlivnit permeabilitu krevně mozkové bariéry pomocí ovlivnění vaskulámí permeability v příslušných krevních cévách umožní aplikaci léčiv, které by jinak nebyly schopny projít z krevního oběhu do mozkové tkáně.

-8CZ 304320 B6

Podobně, řada patologií a poškození vyvolaných mrtvicí je vyvoláno následným nárůstem vaskulámí permeability a tedy možnost specificky ovlivňovat vaskulámí permeabilitu umožní nové a účinné léčebné postupy pro potlačení nežádoucích účinků mrtvice.

Způsoby podle navrhovaného vynález jsou velmi účinné neboť taková terapie je vysoce selektivní pro vaskulámí permeabilitu a ne pro další biologické procesy.

Navrhovaný vynález popisuje v jedné části zjištění, že angiogeneze je vyvolána proteinem tyrozin kinázou Src a tedy že antiogenezi je možno ovlivňovat aplikací buď aktivní, nebo neaktivní formy proteinu Src pro posílení nebo potlačení angiogeneze.

Toto zjištění je důležité díky úloze kterou angiogeneze, tedy tvorba nových krevních cév, hraje v celé řadě chorob. V případě, že tkáň postižená chorobou vyžaduje angiogenezi pro růst tkáně, je žádoucí angiogenezi potlačit a tím potlačit růst nemocné tkáně. V případě, že zraněná tkáň vyžaduje angiogenezi pro růst tkáně a hojení, je žádoucí posílit nebo vyvolat angiogenezi a tím dosáhnout růstu a hojení tkáně.

V případě, že růst nových krevních cév je příčinou, nebo průvodním jevem, patologie spojené s nemocnou tkání, potlačení angiogeneze sníží zhoubný účinek choroby. Potlačením angiogeneze je možné ovlivnit průběh choroby, potlačit její příznaky a v některých případech dokonce chorobu vyléčit.

Příkladem tkáně spojené s chorobou a neovaskularizací, kde je přínosem potlačit angiogenezi jsou např. revmatoidní artritida, diabetická retinopatie, zánětlivé choroby, restenosis a podobně.

V případě, že růst nových cév je nezbytný pro podporu růstu zhoubné tkáně, potlačení angiogeneze sníží krevní zásobení tkáně a tím přispěje ke snížení množství tkáně díky nezbytnosti krevního zásobení. Příkladem může být růst nádorů, kde neovaskularizace je neustálým požadavkem pro to aby nádor výrost na více než několik milimetrů a pro vznik metastazujícího pevného nádoru.

V případě že růst nových krevních cév přispívá k uzdravování tkáně, posílení angiogeneze napomáhá hojení. Příkladem může být léčení pacienta s ischemickými končetinami, kdy v končetinách je slabý krevní oběh způsobený diabetem nebo jinou poruchou. Také je tuto léčbu možno použít u pacientů s chronickými zraněními, která se nehojí a tím přispět ke zvýšení proliferace vaskulámích buněk a neovaskularizací.

Způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou velmi účinné neboť taková terapie je vysoce selektivní pro angiogenezi a ne pro další biologické procesy.

Jak je uvedeno výše, angiogeneze zahrnuje celou řadu procesů zahrnujících neovaskularizací tkání včetně dorůstání tkáně, vaskulogenezi nebo zvětšování cév, přičemž ve všech těchto procesech je klíčový Src protein. Kromě hojení traumatických poranění, tvorby žlutého tělíska a embryogeneze, věří se, že většina procesů angiogeneze je spojena s chorobami a tedy použití popisovaných terapeutických postupů je selektivní pro nemoci a nemá nežádoucí vedlejší účinky.

Navrhovaný vynález také popisuje, v jedné části, objev, že vaskulámí propustnost a/nebo otok spojené s traumatem, nemocí nebo zraněním vyvolávajícím nárůst vaskulámí permeability může být specificky ovlivněno a potlačeno inhibicí aktivity tyrozin kináz rodiny Src. Konkrétně, navrhovaný vynález popisuje zjištění, že podání inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src in vivo, zmenší poškození tkáně vyvolané nemocí nebo zraněním způsobeným nárůstem vaskulámí permeability, která není spojena s rakovinou nebo angiogenezi.

Zatímco podání inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src ovlivní nárůst vaskulámí permeability vyvolaný VEGF, specifická inhibice aktivity tyrozin kináz rodiny Src minimalizuje poškození

-9CZ 304320 B6 okolní tkáně vyvolané propustnosti cév nebo otokem, přesto je signál rodiny tyrozin kináz Src aktivovaný.

Vaskulámí permeabilita je zapojena do řady chorobných stavů, které nemusí přímo souviset s angiogenezí. Např. celá řada patologií a poškození vyvolaných mrtvicí je vyvoláno následným nárůstem vaskulámí permeability díky traumatu v krevních cévách a tedy možnost specificky ovlivnit vaskulámí permeabilitu umožňuje nové účinné léčebné postupy pro potlačení nežádoucích projevů při mrtvici.

Příkladem tkáně spojené s chorobou a nebo zraněním, kdy dochází ke zvýšené propustnosti cév a/nebo otoku, je přínosem specifická inhibice aktivity tyrozin kináz rodiny Src jsou např. revmatoidní artritida, diabetická retinopatie, zánětlivé choroby, restenosis a podobně.

Traumatické poranění mozku nebo míchy a další cerebrovaskulámí příhody obvykle vyvolané ischemií nebo krvácením jsou hlavní příčinou neurologických poruch a spojených zranění. Mozkové otoky a propustnost cév vyvolané těmito příhodami jsou životu nebezpečné patologie, které spouštějí systémové a rozptýlené poškození mozku a míchy (centrální nervový systém, CNS) a možnost specificky ovlivnit propustnost cév a otok které poškozují okolní tkáně je v takových případech velmi důležitá.

Infekce CNS, jako je meningitida, cerebritida, encefalitida mohou vést k různým mozkovým patologiím, včetně mozkového otoku. Léčba takové infekce může být podpořena specifickou terapií pro snížení vaskulámí propustnosti nebo otoku.

Bylo uvedeno, že systémová neutralizace proteinu VEGF pomocí fúzního proteinu VEGF receptor IgG, sníží velikost infarktu následujícího po cerebrální ischemií, a tento efekt je pravděpodobně způsoben snížením vaskulámí permeability vyvolávané VEGF. N. van Bruggen et al., J. Clin. Inves. 104:1613-1620 (1999). Přesto VEGF není ten klíčový mediátor nárůstu vaskulámí permebility, kterým, jak bylo zjištěno, je Src.

Další poruchy nebo nemoci, kde je zapojeno zvýšení vaskulámí permeability pomocí Src ajsou tedy vhodným cílem pro léčení pomocí způsobů a prostředků podle navrhovaného vynálezu mohou být např. mozkové krvácení, mozkové a míšní trauma, hypoxií vyvolané poškození mozku a míchy, zánětlivé poruchu CNS: virové nebo bakteriální infekce (např. meningitida, HIV encefalopatie), autoimunitní poruchy (např. mnohoěetná skleróza), poruchy vedoucí k chronickému zvýšení propustnosti krevně mozkové bariéry (např. Morbus Alzheimer), chirurgické zákroky, kde může být dočasně přerušeno prokrvení a zásobování kyslíkem může sloužit jako ochranné agens, revmatoidní artritida a diabetická retinopatie.

C. Tyrozin kinázy rodiny Src

Proteiny typu tyrozin kináz použitelné v navrhovaném vynálezu se mohou odlišovat v závislosti na zamýšleném použití. Termíny „protein Src“ a „Src“ jsou společně používány pro různé formy tyrozin kináz Src zde popisovaných, buď aktivní, nebo neaktivní formy. Termíny „protein Yes“ a„Yes“ jsou společně používány pro různé formy tyrozin kináz Yes zde popisovaných, buď aktivní, nebo neaktivní formy. Dále jsou v kontextu popisu, uváděny odkazy na genové sekvence nukleových kyselin a geny kódující Src a Yes. Termín „rodina Src“ popisuje skupiny tyrozin kináz, které jsou podobné funkcí a aminokyselinovou sekvencí se Src.

Termín „aktivní protein Src“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Src která posiluje angiogenezí nebo vaskulámí permeabilitu. Termín „aktivní protein Yes“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Yes která posiluje vaskulámí permeabilitu. Způsoby stanovování posílení angiogeneze nebo vaskulámí permeability jsou popisovány dále a nemohou být brány jako limitace. Protein je brán jako aktivní když míra angiogeneze nebo vaskulámí permeability je alespoň o 10 % vyšší, lépe

- 10CZ 304320 B6 pak o 25 % vyšší a nejlépe o 50 % vyšší než kontrolní hladina, kde nebyl do systému přidán žádný protein.

Nejvhodnější technika pro stanovování míry posílení angiogeneze je CAM technika využívající virový vektor RCAS jak je popisováno v příkladech, kde angiogenní index je vypočítán jako množství rozvětvení.

Nejvhodnější techniky stanovování posílení vaskulámí permeability je Milesova technika za použití Evansovy modře u myší jak je popisováno v příkladech, kde je vaskulámí permeabilita měřena jako množství Evansovy modře která prostoupí z cév.

Nej vhodnější aktivní proteiny Src a Yes vykazují tyrozin kinázovou aktivitu. Příklady aktivních proteinů Src a Yes jsou popsány v příkladech a zahrnují Src-A a Yes-1.

Termín „neaktivní protein Src“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Src která potlačuje angiogenezi nebo vaskulámí permeabilitu. Termín „neaktivní protein Yes“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Yes která potlačuje vaskulámí permeabilitu. Způsoby stanovování potlačení nárůstu vaskulámí permeability jsou popisovány dále a nemohou být brány jako limitace. Protein Src je brán jako neaktivní když míra angiogeneze je alespoň o 10 % nižší, lépe pak o 25 % nižší a nejlépe o 50 % nižší než kontrolní hladina, kde nebyl do systému přidán žádný protein.

Protein Src nebo Yes je brán jako neaktivní když míra vaskulámí permeability je alespoň o 10 % nižší, lépe pak o 25 % nižší a nejlépe o 50 % nižší než kontrolní hladina, kde nebyl do systému přidán žádný protein Src nebo Yes.

Nejvhodnější technika pro stanovování míry posílení angiogeneze je CAM technika využívající virový vektor RCAS jak je popisováno v příkladech, kde angiogenní index je vypočítán jako množství rozvětvení.

Nejvhodnější techniky stanovování posílení vaskulámí permeability je Milesova technika za použití Evansovy modře u myší jak je popisováno v příkladech, kde je vaskulámí permeabilita měřena jako množství Evansovy modře která prostoupí z cév.

Nejvhodnější aktivní proteiny Src a Yes vykazují sníženou tyrozin kinázovou aktivitu. Příklady neaktivních proteinů Src a Yes jsou popsány v příkladech a zahrnují Src-251 a Src K295M.

Protein Src použitelný v navrhovaném vynálezu může být připraven libovolným způsobem známým v současném stavu techniky, včetně izolace z přirozených zdrojů, jako např. z tkáně, přípravou rekombinantní DNA, její expresí a přečištěním a podobně. Src a/nebo Yes mohou být rovněž připraveny in sítu zavedením terapeutického genu do tkáně která je postižena, a kdy tento gen zajistí expresi příslušného proteinu v tkáni.

Gen kódující Src nebo Yes proteiny může být připraven celou řadou způsobů známých v současném stavu techniky a vynález nemůže být výčtem těchto technik nijak limitován. Např. vývoj genu pro Src je dobře znám a zahrnuje celou řadu homologů ze savčích, ptačích, virových a podobných druhů, a gen může být správně klonován za použití klonovací techniky cDNA z jakékoliv tkáně exprimující tento protein. Nejvhodnější Src pro použití v navrhovaném vynálezu je buněčný protein, jako jsou savčí nebo ptačí homology označované jako c-src. Nejvhodnější je lidský c-src. Nejvhodnější Yes pro použití v navrhovaném vynálezu je lidský buněčný protein cyes. Nej vhodnější je lidský c-yes-1 kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 11. Protein Yes-1 na obr. 11 je kódován úsekem nukleové kyseliny uvedené na obr. 12 a označen jako kódující doménový segment.

- 11 CZ 304320 B6

D. Rekombinantní molekuly DNA a expresní systémy pro expresi proteinů Src a Yes.

Navrhovaný vynález popisuje některé nukleotidové sekvence použitelné v navrhovaném vynálezu. Tyto sekvence zahrnují sekvence kódující Src protein použitelný v navrhovaném vynálezu a různé části DNA, rekombinantní DNA (rDNA) molekuly a vektory navržené pro expresi proteinu Src. Tyto sekvence také zahrnují sekvence kódující Yes protein použitelný v navrhovaném vynálezu a řadu DNA segmentů, rekombinantní DNA (rDNA) molekuly a vektory navržené pro expresi proteinu Yes.Molekuly DNA (segmenty) podle navrhovaného vynálezu mohou tedy zahrnovat sekvence kódující celé strukturní geny, fragmenty strukturních genů nebo kombinace těchto genů a transkripční jednotky jak je zde uvedeno dále.

Nejvhodnější oblast DNA je nukleotidová sekvence kódující protein Src nebo Yes nebo oba, jak jsou zde definovány, nebo jejich biologicky aktivní fragmenty.

Sekvence aminokyselinových zbytků a nukleotidová sekvence nej vhodnějších Src a Yes je uvedena v příkladech.

Vhodná sekvence DNA kóduje sekvenci aminokyselinových zbytků v podstatě stejnou, a skládající se zejména ze sekvence aminokyselinových zbytků nebo jejich částí odpovídající proteinům Src a Yes, tak jak jsou zde popisovány. Reprezentativní a vhodné DNA sekvence jsou dále popsány v příkladech.

Aminokyselinová sekvence proteinu nebo polypeptidu přímo odpovídá genetickému kódu sekvence deoxyribonukleové kyseliny (DNA) strukturních genů které kódují protein. Tedy, strukturní gen nebo segment DNA může být definován vzhledem k aminokyselinové sekvenci, tzn. proteinu nebo polypeptidu, který kóduje.

Důležitým a dobře známým rysem genetického kódu je jeho degenerovanost. To znamená, že většina aminokyselin použitých pro tvorbu proteinů je kódována více než jedním kódujícím nukleotidovým tripletem (kodónem) který pak kóduje stejný aminokyselinový zbytek. Je tedy možné, že jednu konkrétní aminokyselinovou sekvenci kóduje několik různých sekvencí nukleotidů. Tyto nukleotidové sekvence jsou funkčně stejné, neboť jejich výsledkem je produkce stejného aminokyselinového zbytku ve všech organismech. Někdy je možné do sekvence zabudovat methylované purinové nebo pyrimidinové varianty nukleotidů. Přesto tato methylace neovlivňuje žádným způsobem kódování.

Nukleová kyselina je jakýkoliv polynukleotid nebo fragment nukleové kyseliny, buď polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, tzn. RNA nebo DNA, nebo jejich analogy. V nejvhodnějších případech je nukleová kyselina ve formě segmentů dvoj šroubovice DNA, tzn. jako DNA sekvence, ačkoliv v některých molekulárně—biologických technikách je výhodnější jednořetězcová DNA nebo RNA.

Sekvence DNA jsou připravované celou řadou způsobů včetně chemické syntézy a pomocí rekombinantních postupů, zejména pak pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Sekvence DNA kódující části proteinu Src mohou být snadno syntetizovány pomocí chemických postupů, např. fosfotriesterovou technikou podle Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981), nebo pomocí automatického syntetizátoru. Dále je možné delší sekvence DNA připravit pomocí technik známých v současném stavu techniky, jako je syntéza skupin oligonukleotidů, která definuje DNA sekvenci, následovaná hybridizací a Iigací oligonukleotidů tak, aby vznikla celá sekvence. Alternativní technikou je izolace požadované DNA sekvence pomocí PCR za použití dvojice primerů z cDNA knihovny o které je známo že obsahuje sekvence kódující protein Src.

Je zřejmé, že během chemické syntézy je možné provádět libovolné modifikace jednoduchou záměnou příslušné báze za takovou, která kóduje přirozenou sekvenci aminokyselinových

- 12CZ 304320 B6 zbytků. Tento způsob je dobře známý v současném stavu techniky a je možné ho aplikovat na přípravu různých modifikovaných proteinů Src jak jsou zde popisovány.

Dále DNA sekvence skládající se zejména ze strukturních genů kódujících proteiny Src a Yes mohou být následně pozměněny tak, aby bylo dosaženo požadované náhrady.

1. Klonování genů Src a Yes

Geny Src a Yes podle navrhovaného vynálezu mohou být klonovány z vhodného zdroje genomové DNA nebo mediátorové RNA (mRNA) celou řadou biochemických technik. Klonování těchto genů může probíhat podle obecných technik popisovaných v příkladech a známých v současném stavu techniky.

Zdroje nukleových kyselin pro klonování genů Src a Yes pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu mohou zahrnovat genomovou DNA nebo mediátorovou RNA (mRNA) ve formě cDNA knihovny z tkáně o které je známo, že exprimuje tyto proteiny, nej vhodnější tkání, je lidská plicní tkáň, ačkoliv je samozřejmě možné použít i jiné tkáně.

Nejvhodnější klonovací technikou je příprava sDNA knihovny za použití standardních technik a izolace nukleotidové sekvence kódující SRC nebo Yes pomocí PCR amplifikace za použití dvojice oligonukleotidových primerů založených na zde popsané nukleotidové sekvenci.

Další možností je, že požadované klony cDNA mohou být identifikovány a izolovány z cDNA nebo genové knihovny pomocí konvenčních hybridizačních technik nukleových kyselin pomocí hybridizačních sond založených na nukleotidových sekvencích zde popisovaných. Další techniky izolace a klonování, použitelné pro nukleové kyseliny kódující Src a Yes jsou dobře známé každému odborníkovi v současném stavu techniky.

2. Přenos genu a/nebo expresního vektoru

Navrhovaný vynález popisuje rekombinantní molekuly DNA (rDNA) obsahující DNA sekvenci kódující Src nebo Yes protein, nebo oba, jak je zde popsáno. Exprimovatelná rDNA může být připravena operativním (v exprimovatelném čtecím rámci) napojením vektoru na sekvenci DNA kódující Src nebo Yes podle navrhovaného vynálezu. Tedy rekombinantní molekula je hybridní molekula obsahující alespoň dvě nukleotidové sekvence, které dají vzniknout takové nukleotidové sekvenci, která se normálně v přírodě nevyskytuje.

Volba vektoru, do něhož je sekvence DNA podle navrhovaného vynálezu operativně zapojena závisí, podle pravidel známých v současném stavu techniky na požadovaných funkčních vlastnostech, tzn. expresi proteinu a hostitelské buňce, která má být transformována. Je třeba zvážit všechny možnosti známé v současném stavu techniky při konstrukci rekombinantních molekul DNA. Vektor použitelný v navrhovaném vynálezu by měl být schopný řízené replikace a lépe pak také exprese strukturních genů zapojených do sekvence DNA, ke které je připojen.

V případě, že vektor obsahuje exprimovatelné sekvence src i yes, oba geny mohou být regulované stejnými regulačními jednotkami proti směru prvního genu, nebo mohou být regulovány nezávislými regulačními jednotkami.

Odborníkům v současném stavu techniky jsou známé, jak prokaryotické, tak eukaryotické expresní vektory, a dále jsou popsány v Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) a v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Tyto publikace také popisují řadu dalších technik rekombinantní DNA zde uvedených.

- 13 CZ 304320 B6

V jedné variantě, vektor použitelný v navrhovaném vynálezu by mohl být prokaryotický replicon, tzn. sekvence DNA se schopností autonomní replikace a udržování rekombinantní DNA mimo chromozóm prokaryotických hostitelských buněk, jako jsou bakteriální buňky tímto vektorem transformované. Tyto replikony jsou známé v současném stavu techniky. Navíc, tato varianta používající prokaryotický replikon také obsahuje gen, jehož exprese zajišťuje rezistenci k některému léčivu po transformaci do bakteriálních buněk. Typickým genem lékové rezistence jsou geny přinášející rezistenci k ampicilinu nebo tetracyklinu.

Takové vektory které zahrnují prokaryotické replikony mohou také obsahovat prokaryotický promotor schopný přímé exprese (transkripce a translace) strukturních genů u bakteriálních hostitelských buněk, jako je např. transformovaná E. coli. Promotor je kontrolní jednotka exprese tvořený DNA sekvencí, která umožňuje vazbu RNA polymerázy a počátek transkripce. Promotorové sekvence kompatibilní s bakteriálními hostiteli jsou obvykle umístěné v plazmidových vektorech obsahujících vhodná restrikční místa pro vložení sekvencí DNA podle navrhovaného vynálezu. Typickým příkladem těchto plazmidových vektorů jsou pUC8, pUC9, pBR322 a pBR329 dostupné od BioRad Laboratories (Richmond CA), pRSET dostupný od Invitrogen (San Diego, CA) a pPL a pKK223 dostupné od Pharmacia, Piscataway, NJ.

Expresní vektory kompatibilní s eukaryotickými buňkami, zejména ty kompatibilní se savčími buňkami, mohou být také použity pro přípravu rekombinantních molekul DNA podle navrhovaného vynálezu. Eukaryotické expresní vektory jsou dobře známé v současném stavu techniky a jsou dostupné z celé řady komerčních zdrojů. Obvykle jsou tyto vektory navrženy tak, aby obsahovaly vhodné restrikční místo pro vložení požadované sekvence DNA. Typickým příkladem těchto vektorů pak jsou pSVL a pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (Intemational Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC, # 31 255), pRc/CMV (Invitrogen Inc.), nejvhodnější vektor popsaný v příkladech a podobné eukaryotické expresní vektory.

Nejvhodnější systém pro expresi genů podle navrhovaného vynálezu zahrnuje transportní složku, to znamená schopnost nasměrovat gen do tkáně kde je třeba. Vhodné vektory jsou infekční vektory, jako jsou rekombinantní DNA viry, adenoviry nebo retrovirové vektory, které jsou upravené pomcí genového inženýrství, tak aby exprimovaly požadovaný protein a měly takové vlastnosti, které umožní infekci předem zvolené cílové tkáně. Nejvhodnějším vektorem je replikačně kompetentní ptačí sarkomový virus (RCAS), kterýje zde popsaný.

Je možno rovněž připravit savčí buněčný systém, které využívají rekombinantní viry nebo virové částice pro přímou expresi. Například při použití adenovirového expresního vektoru, kódující sekvence polypeptidu může být napojena na adenovirový transkripční/translační kontrolní komplex, tzn. pozdní promotor, a trojdílnou počáteční sekvenci. Takový chimemí gen může být poté vložen do adenovirového genomu pomocí in vitro nebo in vivo rekombinace. Vložením do neesenciální oblasti virového genomu (tzn. oblast El nebo E3) povede ke vzniku rekombinantního viru, který je živý a schopný exprimovat polypeptid v infikovaném hostiteli (např. viz. Logan et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81:3655-3659 (1984)). Další možností je použít promotor 7.5K. z viru vakcinie (např. viz. Mackett et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79: 7415-7419 (1982), Mackett et al., J. Virol., 49:857-864 (1984), Panicali et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79:4927^4931 (1982)). Obzvláště zajímavé jsou vektory založené na hovězí papilomaviru, který má schopnost replikovat se jako extrachromozomální jednotka (Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981)). Obecně po vstupu této DNA do cílové buňky se plazmid namnoží na 100 až 200 na buňku. Transkripce vložené cDNA nevyžaduje integraci plazmidu do hostitelova chromozomu a tím je zajištěna vysoká hladina exprese. Takové vektory mohou být použity pro zajištění stabilní exprese, pokud je v plazmidu použit selektovatelný znak, jako např. gen neo. Další možností je zpravit retrovirový genom tak, aby byl použitelný jako vektor umožňující zavedení a přímou expresi nukleotidové sekvence kódující polypeptid v hostitelské buňce (Cone et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81:6349-6353 (1984)). Vysokou hladinu exprese je možné zajistit také za použití indukovatelných promotorů včetně např. promotoru pro metallothionin IIA a promotoru teplotního šoku.

- 14 CZ 304320 B6

V poslední době bylo rovněž studováno dlouhodobé přežívání cytomegalovirového (CMV) promotoru vzhledem k promotoru Rousova sarkomaviru (RSV) řízené thymidin kinázové (TK) genové terapie u holých myší trpících lidským ovariálním karcinomem. Účinnost buněčného zabíjení adenovirem vyvolané CMV promotorem řízené herpes simplex TK genové terapie prokázalo, že je dvakrát až desetkrát účinnější než případě terapie řízené RSV (Tong et al., 1999, Hybridoma 18 (1):93-97). Design chimemích promotorů pro aplikaci v genové terapii, kde je žádoucí nízká hladina exprese následovaná indukovatelnou vysokou úrovní exprese, již byl rovněž dříve popsán (Suzuki et al., 1996, Human Gene Therapy, 7:1883-1893).

Pro dlouhodobou produkci s vysokým výtěžkem rekombinantních proteinů je vhodnější stabilní exprese. Raději, než používat expresní vektory obsahující virové počátky replikace, je transformovat hostitelské buňky pomocí cDNA kontrolované příslušnou kontrolní jednotkou (tzn. sekvencemi promotorů a enhancerů, konců transkripce, polyadenylačních míst, atd.), a selektovatelných znaků. Jak je uvedeno výše, selekční znak v rekombinantním plazmidu zajišťuje rezistenci proti zvolenému léčivu a umožní buňce stabilně integrovat plazmid do jejího chromozomu a nárůst formy kolonie, ze které je možné buňky klonovat a rozdělit do buněčných linií.

Například, po zavedení cizorodé DNA mohou být transformované buňky ponechány jeden až dva dny v obohaceném médiu a poté přeneseny do selektivního média. Je možné použít celou řadu selekčních systémů, včetně např. herpes simplex virus thymidin kinázy (Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)), hypoxantin, guanin, fosforibosyl transferázy (Szybalska et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 48:2026 (1962)), a adeninfosforibosyl transferázy (Lowy et al., Cell, 22:817 (1980)) genů, které mohou být použité pro tk~, hgprf nebo aprt buněk. Je také možné použít geny zajišťující rezistenci proti antimetabolitům pro vlastní selekci, např. gen pro dhfř, který zajišťuje rezistenci k methotrexátu (Wigler et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 77:3567 (1980)), O'Hare et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78:1527 (1981), gpt, který zajišťuje rezistenci ke kyselině mykofenolové, (Mulligan et al., proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78:2072 (1981)), neo, který zajišťuje rezistenci k aminoglykosilu G418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)) a hygro, který zajišťuje rezistenci k hygromycinu (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). V poslední době byly popsány další selektovatelné geny, zejména trpB, který umožňuje buňkám využívat indol namísto tryptofanu, hisD, který umožňuje buňkám využívat histinol namísto histidinu (Hartman et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85:804 (1988)) a ODC (omithin dekarboxyláza), který zajišťuje rezistenci k inhibitoru omithin dekarboxylázy, 2-(difluormethyl)-DL-omithin, DFMO (McConlogue L., Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)).

Vhodné vektory použitelné pro lidskou genovou terapii jsou odvozené z retrovirového původu (Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol., 107 (Sub. 1):31-32, Bank et al., 1996, Bioassays, 18 (12):999-1007, Robbins et al., 1998, Pharmacol. Ther., 80( 1 ):35-47). Terapeutický potenciál genového přenosu a antisense therapie je podpořen vývojem celé řady vektorových systémů určených pro léčbu různých chorob. (Vaskulatura, Stephan et al., 1997, Fundan. Clin. Pharmacol., 11(2):97-110, Feldman et al., 1997, Cardiovasc. Res., 35(3):391-404, Vassalli et al., 1997, Cardiovasc. Res., 35(3):459^169, Baek et al., 1998, Circ. Res., 82(3):295-305, Fedviny, Fien et al., 1997, Kidney Int. Suppl., 61:585-8, Játra, Ferry et al., 1998, Hum. Gene Ther., (14):1975-81, Svaly, Marshall et al., 1998, Curr. Opn. Genet. Def., 8(3):360-5) kromě těchto tkání kritickým cílem pro genovou terapii u lidí je rakovina, a to bud’ nádor sám o sobě, anebo asociované tkáně (Runnebaum, 1997, Anticancer Res., 17(4B):2887-90, Spear et al., 1998, J. Neurovirol., 4(2):133^17).

Specifickými příklady virových vektorů pro genovou terapii, který jsou přizpůsobené pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu jsou zkráceně popsány dále. Transport genu pomocí retrovirů byl naposledy popsán v Federspiel and Gughes (1998), Methods in Cell Biol., 52:179-214), kde je popisována zejména rodina retrovirů viru ptačí leukózie (AFV) (Federspiel et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 93:4931 (1996), Federspiel et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA,

- 15 CZ 304320 B6

91:11241 (1994)). Retrovirové vektory včetně ALV a myšího leukemického viru (MLV) byly dále popsány v Svoboda (1998), Gene, 206:153-163.

Modifikované retrovirové/adenovirové expresní systémy by měly být správně přizpůsobené pro praxi ve způsobech podle navrhovaného vynálezu. Například virus myší leukémie (MLV) byl popsán v Karavanas et al., 1998, Cric. Ref. in Oncology / Hematology, 28:7-30. Adenovirové expresní systémy byly popsány ve Von Segger and Nemerow, Gene Expressions Systems (ed. Femandes and Hoeffler, Academie Press, San Diego, CA, 1999, kapitola 5, str. 112-157).

Proteinové expresní systémy byly prokázány jako účinné jak in vivo, tak in vitro. Například, pro účinný přenos genů do buněk lidského dlaždicovitého karcinomu pomocí herpes simplex viru (HSV) typu 1 byl popsán amplikonový vektor. (Carew et al., 1998, Am. J. Surg., 176:404—408). Herpes simplex virus byl použit pro přenos do buněk nervového systému (Goins et al., 1997, J. Neurovirol. 3, (Sub. l):S80-8). Cílené sebevražedné vektory využívající HSV-TK byly testovány pro použití u pevných nádorů. (Smiley et al., 1997, Hum. Gene, Ther. 8(8):965-77). Herpes simplex virus typu 1 byl použit pro protinádorovou terapii v případě rakoviny tlustého střeva. (Yoon et al., 1998, Ann. Surg., 228(3):366-374. Hybridní vektory byly vyvinuty pro prodloužení doby transfekce, včetně HSV/AV (adeno-asociovaných virů) hybridů pro léčbu lepatocytů (Fraefel et al., 1997, Mol. Med., 3(12):813-825).

Virus vakcínie byl vyvinut pro lidskou genovou terapii díky jeho rozsáhlému genomu (Peplinski et al., 1998, Surg. Oncol., Clin. N. Am. 7(3):575-88). Virus vakcínie s deletovaným genem pro thymidin kinázu exprimující purinnukleosid pyrofosforylázu byl popsán pro použití jako nádorově směřující vektor pro genovou terapii (Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapy 10:649-657).

Adeno-asociovaný virus 2 (AAV) byl popsán jako použitelný pro genovou terapii u lidí přesto, že AAV vyžaduje pomocný virus (jako adenovirus nebo herpes viru) pro optimální replikaci a sbalování v savčích buňkách. (Snoeck et al., 1997, Exp. Nephrol. 5(6):514-20, Rabinowitz et al., 1998, Curr. Opn. Biotechnol. 9(5):470-5). Přesto in vitro sbalování infekčních rekombinantních AAV bylo popsáno, což činí tento systém také slibným. (Ding et al., 1997, gene Therapy 4:1167-1172). Bylo zjištěno, že pomocí AAV vyvolaný přenos ekotropní virové receptorové cDNA umožňuje ekotropní retrovirovou transfekci zralých a primárních lidských buněk. (Qing et al., 1997, J. Virology 71 (7):5663-5667). Protinádorová terapie využívající vektor AAV exprimující lidský protein p53 divokého typu byla rovněž popsána. (Qazilbash et al., 1997, Gene Therapy 4:675-682). Rovněž byl prokázán přenos genu do vaskulámích buněk pomocí AAV vektorů (Maeda et al., 1997, Cardiovascular Res. 35:514-521). AAV se ukázalo býti vhodným vektorem i pro genovou terapii směrovanou proti játrům (Xiao et al., 1998, J. Virol. 72(12):10222-6). AAV vektory byly uznány jako použitelné i pro genovou terapii mozkové tkáně a centrálního nervového systému (Chamberlin et al., 1998, Brain Res. 793 (1-2):169-75, During et al., 1998, Gene Therapy, 5(6), 820-7). Vektory AAV byly také porovnávány s adenovirovými vektory (AdV) v případě genové terapie směrované do plic a přenosu lidské cystické fibrózy epitheliálních buněk (Teramoto et al., 1998, J. Virol., 72(11):8904-12).

Chimemí AdV/retrovirové vektorové systémy pro genovou terapii, které spojují nejvhodnější vlastnosti jednotlivých virů tak, aby vznikly neintegrativní AdV, které by byly funkčně integrativní prostřednictvím přechodné generace buněk produkujících retrovirus (Feng et al., 1997, Nat. Biotechnology 15(9):866-70, Bilbao et al., 1997, FASEB J. 11(8)624-34). Tato slibná nová generace vektorů pro genovou byla přizpůsobena tak, aby se stala směrovanou protinádorovou terapií (Bilbao et al., 1998, Adv. Exp. Med. Biol. 451:365-74). Jednou injekcí AdV exprimujících p53 byl potlačen růst podkožního nádoru buněk lidského karcinomu prostaty (Asgari et al., 1997, Int. J. Cancer 71(3):377-82). Dále byl popsán přenos divokého typu genu p53 pomocí AdV vektorů u pacientů s pokročilým nemalobuněčným karcinomem plic. (Schuler et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2075-2082). Stejný druh rakoviny byl cílem terapie nahrazující gen p53 pomocí AdV vektoru. (Roth et al., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suppl. 8):33-7). Přenos genu p53

- 16CZ 304320 B6 pomocí AdV zpomalí diferenciaci endotheliálních buněk a angiogenezi in vivo. (Riccioni et al.,

1998, Gene Ther. 5(6):74754). Adenovirem vyvolaná exprese melanomového antigenu gp75 jako imunoterapie metastatického melanomu se rovněž jeví jako slibná. (Hirschowitz et al., 1998, Gene Therapy 5:975-983). AdV zajišťuje infekci lidských buněk ekotropním retrovirem a zvyšuje účinnost retrovirové infekce. (Scott-Taylor et al., 1998, GeneTher. 5(5):621-9). AdV vektory byly použity pro přenos genu do buněk vaskulárního hladkého svalstva (Li et al., 1997, Chin. Med. J. (Engl) 110( 12):950-4), buněk dlaždicovitého karcinomu (Geobel et al., 1998, Otolarynol Head Neck Surg 119(4):331-6), buněk rakoviny hltanu (Senmaru et al., 1998, Int J. Cancer 78(3):366-71), mezengiálních buněk (Nahman et al., 1998, J. Investig. Med. 46(5):2049), gliových buněk (Chen et al., 1998, Cancer Res. 58(16):3504-7), a do kloubů zvířat (Ikeda et al., 1998, J. Rheumatol. 25(9):1666-73). V poslední době byl prokázán katétrem aplikovaný perikardiální přenos genu pomocí AcV vektorů. (March et al., 1999, Clin. Cardiol. 22(1 Suppl. 1):123-9). Manipulace s kontrolními genetickými jednotkami AdV systému umožní ovlivňovat AdV přenášený gen a jeho expresi in vivo. (Burcin et al., 1999, PNAS (USA) 96(2):3 55—60).

Alfavirové vektory byly vyvinuty pro aplikaci v lidské genové terapii s buněčnými liniemi vhodnými pro transfekci pomocí expresních kazet použitelných v Sindbis viry a Semliki Forest viry a odvozenými vektory (Polo et al., 1999, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 96:4598^4603). Byly rovněž vyvinuty necytopatické flavivirové replikonové systémy založené na RNA (Vamavski et al.,

1999, Virology, 255(2):366-75). Sebevražedný EISV-TK gen obsažený v Sindbis virovém vektoru byl použit pro buněčné specifické směrování do nádorových buněk (Iijima et al., 1998, Int. J. Cancer 80(1):110-8).

Retrovirové vektory založené na lidských spumavirech (EIFV-Human Foamy Virus) mají také slibné vlastnosti pro použití jako vektory genové terapie (Trobridge et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2517-2525). Spumavirové vektory byly vybrány pro sebevražednou genovou terapii (Nestler et al., 1997, Gene Ther. 4(11):1270-7). Rekombinantní myší cytomegaloviry a promotorové systémy jsou rovněž používány jako vektory díky vysoké hladině exprese. (Manning et al., 1998, J. Virol. Meth. 73(1):31-9, Tong etal., 1998, Hybridoma 18(1):93-7).

Přenos genu do nedělících se buněk může být uskutečněn díky přípravě vektorů odvozených od Sendai virů. (Nakanishi et al., 1998, J. Controlled Release 54(1):61-8).

V dalším úsilí umožnit transformaci nedělících se somatických buněk byly testovány lentiviry. Genová terapie cystické fibrózy pomocí replikačně defektivního lidského viru získaného selhání imunity (HIV) byla rovněž popsána. (Goldman et al., 1997, Human Gene Therapy 8:2261-2268). Byla rovněž prokázána stabilní exprese genů doručených do jater a svalů pomocí lentivirových vektorů. (Kafri et al., 1997, Nat. Genet. 17(3):314-7). Přesto bezpečnost je nejdůležitějším parametrem a vývoj nových virových vektorů jde velmi rychle kupředu. (Kim et al., 1998, J. Virol. 72(2):994-1004). Studiem HIV LTR a Tat přináší důležité informace o organizaci genomu pro rozvoj dalších vektorů. (Sadaie et al., 1998, J. Med. Virol. (54(2):118-28). Tedy, genetické požadavky pro účinný vývoj vektorů založených na HIV je v současné době daleko jasnější. (Gasmi et al., 1999, J. Virol. 73(3):1828-34). Byly popsány vektory, kteréjsou schopny samy se inaktivovat nebo dočasné buněčné linie (například Zuffery et al., 1998, J. Virol., 72(12):9873-80, Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72(10):8150-7, Duli et al., 1997, J. Virol. 72(11):8463-71 a Kaul et al., 1998. Virology 249(1):167-74). Účinná transformace lidských lymfocytů a CD34+ buněk pomocí HIV vektorů již byla rovněž popsána. (Douglas et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10(6):93545, Miyoshi et al., 1999, Science 283(5402):682-6). Dále byla popsána účinná transformace nedělících se lidských buněk pomocí lentivirového vektoru odvozeného z kočičího viru získaného selhání imunity (FIV), což minimalizuje bezpečnostní problémy spojené s používáním virových vektorů založených na HIV. (Poeschla et al., 1998, Nátuře Medicine 4(3):354-57). Byla prokázána produktivní infekce lidských krevních mononukleámích buněk pomocí FIV vektorů. (Johnston et al., 1997, J. Virol. 73(3):2491-8).

- 17CZ 304320 B6

S řadou virových vektorů se špatně pracuje a jejich kapacita pro množství vložené DNA je omezená, což jsou jejich největší nevýhody. Například kromě zjednodušených buněčných linií sloužících pro sbalování virů, minivirových vektorů odvozených z lidských herpes virů, herpes simplex viru typu 1 (HSV-1), a Epstein-Barrova viru, byly vyvinuty pro zjednodušení manipulace s genetickým materiálem a přípravu virových vektorů. (Wang et al., 1996, J. Virology 70(12):8422-8430). Adaptorové plazmidy, jak bylo dříve zjištěno, zajišťují vstup cizorodé DNA do retrovirových vektorů nezávislých na pomocných složkách. (1987, J. Virology 61(10):30043012).

Virové vektory nejsou jediným způsobem pro účinnou virovou terapii, neboť byla popsána celá řada nevirových vektorů. Směrovaný nevirový vektor pro transport genu založený na použití epidermální růstový faktor/DNA polyplex (EGF/DNA) se ukázal jako účinný a efektivní pro specifický transport genů. (Cristiano et al., 1998, Anticancer Res. 17:3241-3246). Genová terapie vaskulámích tkání a centrálního systému se ukázala jako možná pomocí kationických lipozómů. (Yang et al., 1997, J. Neurotrauma 14(5):281-97). Přechodné genové terapie pankreatitidy bylo dosaženo rovněž pomocí kationických lipozómů. (Denham et al., 1998, Ann. Surg. 227(6): 812-20). Jako účinné pro transport genů se ukázaly rovněž komplexy vektor/DNA odvozené od chitosanu. (Erbacher et al., 1998, Pharm. Res. 15(9):1332-9). Dále byl popsán nevirový DNA vektor založený na terplex systému. (Kim et al., 1998, 53(1-3):175-82). Virové částice potažené komplexy lipozómů jsou rovněž dobře použitelné pro přenos genů. (Hirai et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241(1):112-8).

Byla popsána genová terapie přímou injekcí nevirového vektoru T7 kódujícího thymidin kinázový gen do nádoru. (Chen et al., 1998, Human Gene Therapy 9:729-736). Pro přímý přenos genu injekcí je důležitá příprava plazmidové DNA. (Hom et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6(5):656-73). Modifikované plazmidové vektory jsou přizpůsobené pro přímou injekční aplikaci. (Hartikka et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7(10):1205-17).

V současném stavu techniky je tedy známa celá řada vektorů a konstruktů použitelných pro přenos genu nebo genovou terapii. Tyto vektory jsou většinou přizpůsobeny pro použití ve způsobbech podle navrhovaného vynálezu. Příslušnou manipulací za použití rekombinantních technik DNA a molekulární biologie je možné vložit správně orientované geny pro Src nebo Yes, nebo oba (buď aktivní, nebo neaktivní) do zvoleného expresního/transportního vektoru, přičemž je možné použít celou řadu ekvivalentních vektorů pro použití v navrhovaném vynálezu.

E. Způsoby ovlivnění vaskulámí permeability

Navrhovaný vynález popisuje způsob ovlivnění vaskulámí permeability v krevních cévách a tkáních postižených chorobou nebo poruchou a tím ovlivnit dopad projevů, které souvisí s vaskulámí permeabilitou, na tkáň. Obecně, tyto způsoby zahrnují aplikaci prostředku obsahujícího protein Src nebo Yes v množství ovlivňujícím vaskulámí permeabilitu, nebo jejich směsi, nebo nukleotidových vektorů exprimujících aktivní nebo neaktivní formy Src nebo Yes, nebo obou, nebo inhibitoru rodiny tyrozin kináz Src, jako je chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src, nebo nukleotidový inhibitor Src, do tkáně postižené nemocí nebo poruchou, podle způsobů navrhovaného vynálezu.

Jak je zde popisováno, jakákoliv tkáň nebo orgán představující organizovanou strukturu může být cílem choroby nebo poruchy ovlivňující vaskulámí permeabilitu, včetně mozku, pokožky, svalů, střev, pojivové tkáně, kloubů, kostí, apod., tedy tkáním, ve kterých se vyskytují krevní cévy.

Pacient léčený podle navrhovaného vynálezu je ve většině variant člověk, ačkoliv je zřejmé, že z principu navrhovaného vynálezu je navrhovaný vynález účinný u všech savců, a tedy všichni mohou být zahrnuty v termínu „pacient“. V tomto kontextu se savcem rozumí jakýkoliv savčí druh, u kterého léčba tkáně postižené poruchou postihují angiogenezi je nezbytná, konkrétně pak chovný dobytek a zdomácnělé savčí druhy.

- 18CZ 304320 B6

Způsob podle navrhovaného vynálezu zahrnuje aplikaci terapeuticky účinného množství fyziologicky tolerovatelného prostředku obsahujícího proteiny Src nebo Yes nebo jejich směsi, nebo nukleotidových vektorů exprimujících aktivní nebo neaktivní formy Src nebo Yes, nebo obou, nebo inhibitoru rodiny tyrozin kináz Src, jako je chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src, nebo nukleotidový inhibitor Src pacientovi.

Rozmezí dávky proteinu Src nebo Yes určeného k podání závisí na formě proteinu, jeho účinnosti, jak je popisováno dále, a toto množství by mělo být dostatečné, aby vyvolalo požadovaný efekt ve vaskulámí permeabilitě a tím mohli být příznaky choroby, které jsou vyvolány vaskulární permeabilitou, potlačeny. Dávky by neměly být příliš vysoké, neboť by mohli způsobovat nežádoucí vedlejší eťekty, jako jsou syndromy hyperviskozity, plicní otoky, dočasná selhání srdce, apod. Obecně, dávka bude záviset na věku, kondici, pohlaví a rozsahu choroby u pacienta a měl by ji stanovit odborník v současném stavu techniky. Dávka by také mohla být upravena lékařem pro případ komplikací.

Terapeuticky účinné množství ovlivňující vaskulámí permeabilitu, je takové množství proteinů Src nebo Yes nebo jejich směsi, nebo nukleových kyselin kódujících proteiny Src nebo Yes, dostatečné pro vyvolání měřitelného ovlivnění vaskulámí permeability, tzn. množství ovlivňující vaskulámí permeabilitu. Ovlivnění vaskulámí permeability může být měřeno pomocí technik zde popisovaných, nebo pomocí technik známých odborníkovi v oboru.

Ovlivnění vaskulámí permeability je možno měřit Millerovou technikou, která je zde popsána, nebo jakoukoliv jinou technikou známou odborníkům v současném stavu techniky.

Proteiny Src nebo Yes, nebo nukleotidové vektory by mohly být aplikovány parenterálně pomocí injekce nebo postupnou inťúzí během dne. Protože tkáň, která má být léčena, je obvykle dosažitelná i pomocí systémové aplikace, a tedy v nej obvyklejším případě je léčena pomocí intravenózní aplikace terapeutického prostředku, další tkáně a způsoby transportu musí být také testovány, neboť existuje jistá pravděpodobnost, že cílová tkáň obsahuje cílovou molekulu. Prostředek podle navrhovaného vynálezu tedy může být podáván intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulárně, subkutánně, intrakavitálně, transdermálně a může být doručován pomocí peristaltických technik.

Terapeutické prostředky obsahující proteiny Src nebo Yes nebo nukleotidové vektory exprimující proteiny Src nebo Yes je možné obvykle podávat intravenózně jako např. pomocí injekce v jednotkové dávce. Termín Jednotková dávka“, pokud je použit jako odkaz vzhledem k terapeutickému prostředku podle navrhovaného vynálezu, popisuje fyzicky diskrétní jednotku vhodnou jako jednu dávku pro subjekt, kdy každá dávka obsahuje předem stanovené množství předem stanovené složky, vypočítané tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku po požadovaném naředění, např. nosičem nebo vehikulem.

V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu jsou látky podávány v jedné dávce intravenózně. Lokalizovaná aplikace může proběhnout přímou injekcí nebo zvolením anatomicky izolovaných kompartmentů, izolací mikrocirkulace cílového orgánového systému, reperfúzí v cirkulačním systému nebo katétru dočasně zavedeného do cílového orgánu a vaskulatury spojené s porušenou tkání.

Prostředky jsou podávány způsobem kompatibilním s lékovou formou a v terapeuticky účinném množství. Množství, které má být podáno, a časování aplikací závisí na léčeném subjektu, schopnosti pacientova organizmu reagovat na aktivní složku a stupni požadovaného terapeutického účinku. Přesná množství aktivní složky nezbytná pro aplikaci závisí na úsudku odborníka aje rozdílná pro každý jednotlivý případ. Ačkoliv jsou zde popisována vhodná rozmezí dávek pro systémovou aplikaci, závisí rovněž na způsobu aplikace. Vhodné protokoly aplikace jsou také variabilní, ale obvykle se sjednocují po úvodní dávce následované opakovanými dávkami v jedno- nebo více hodinovém intervalu a následnou injekcí při další aplikaci. Další možností je

- 19CZ 304320 B6 kontinuální intravenózní infuze schopná udržet koncentraci v krvi v rozmezí hodnot specifických pro zamýšlenou in vivo terapii. Existuje celá řada chorob, u kterých se zdá potlačení angiogeneze jako klíčové, jsou pak označované jako angiogenní choroby, kterými mohou být např. zánětlivé poruchy, jako jsou imunitní a neimunitní záněty, chronický artikulámí revmatismus, lupénka, poruchy spojené s nežádoucím nebo nevhodným zablokováním cév, jako je diabetická retinopatie, neovaskulámí glaukom, restinóza, kapilární proliferace v arteriosklerotických plácích a osteoporóza a poruchy spojené s rakovinou, jako jsou pevné nádory, metastázy pevných nádorů, angofibromy, retrolentální fibroplázie, hemangiomy, Kaposiho sarkom a podobná nádorová onemocnění, která pro růst nádoru vyžadují neovaskularizaci.

Vaskulámí permeabilita je důležitou složkou angiogeneze aje spojena s celou řadou škodlivých patologií. Například poškození způsobené zvýšenou vaskulámí permeabilitou vyvolanou mrtvicí může způsobit poškození i díky vyvolání zánětu.

Tedy způsoby potlačení vaskulární permeability v tkáni postižené nemocí nebo poruchou potlačí příznaky této choroby a v závislosti na jejím typu mohou přispět k léčbě choroby. V jedné variantě navrhovaný vynález zahrnuje potlačení vaskulámí permeability na místě postiženém poruchou. Míra vaskulámí permeability v tkáni a tedy míra její inhibice dosažená popisovanými způsoby může být stanovená celou řadou způsobů.

V jedné konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je léčenou tkání tkáň postižená zánětem a vaskulámí permeabilita je zvýšena díky stimulaci VEGF. Do této oblasti spadá způsob potlačení vaskulámí permeability v artritické tkáni, jako v případě pacientů s chronickým artikulámím revmatismem, v případě tkání postižených zánětem, v tkáni postižené lupénkou, apod.

V další variantě je léčenou tkání rohovka pacienta s nemocnou rohovkou, jako v případě diabetické retinopatie, makulámí degenerace, nebo neovaskulámího glaukomu a vaskulámí permeabilitu je třeba potlačit v tkáni rohovky v místech, kde došlo k neovaskularizaci. Způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou také účinné při zabraňování tvorby metastáz, neboť (1) jejich vznik vyžaduje vaskularizaci primárního nádoru tak, aby mohly metastatické nádorové buňky opustit přimámí nádor a (2) jejich usazení a růst v cílovém místě vyžaduje neovaskularizaci.

V další variantě popisuje navrhovaný vynález spojení způsobu podle navrhovaného vynálezu s dalšími terapeutickými postupy, jako je konvenční chemoterapie namířená proti pevným nádorům a pro kontrolu tvorby metastáz. Aplikaci inhibitoru vaskulámí permeability obvykle probíhá během nebo po chemoterapii, ačkoliv je vhodnější vaskulámí permeabilitu potlačit po chemoterapeutickém zásahu ve chvíli, kdy nádorová tkáň po toxickém zásahu zvýší vaskulámí permeabilitu tak, aby obnovila zásobování nádorové tkáně a živinami. Kromě toho je možné použít způsob inhibice vaskulámí permeability po chirurgickém zásahu, když je pevný nádor odstraněn, jako prevenci tvorby metastáz.

V případě, že popisovaný způsob je použit pro potlačení vaskulámí permeability v případě metastáz, je tento způsob také použitelný pro potlačení vzniku metastáz a potlačení růstu již vzniklých nádorů.

Restenosis je proces migrace buněk hladkého svalstva (SMC) ajejich proliferace v tkáních a na místech, kde perkutánní transluminální koronární angioplastiky, který snižuje pravděpodobnost úspěchu tohoto zákroku. Migrace a proliferace buněk hladkého svalstva během restenózy je možné označit jako proces, který je možné ovlivnit potlačení vaskulámí permeability pomocí způsobů podle navrhovaného vynálezu. Tedy, navrhovaný vynález také zahrnuje potlačení restenosis pomocí snížení vaskulární permeability podle navrhovaného vynálezu u pacientů, kteří podstoupili angioplastiku. V případě potlačování restenosis je inaktivovaná tyrozin kináza podávána obvykle po angioplastice, neboť stěna koronárních cév je rizikovou oblastí pro vznik restenózy, a to obvykle od 2 do asi 28 dní, spíše však během prvních 14 dnů po zákroku. Způsob podle navrhovaného vynálezu pro potlačení vaskulámí permeability v tkáni postižené chorobou, a tedy . ?n CZ 304320 B6 rovněž postup způsobu léčby chorob spojených se změnami vaskulární permeability, zahrnuje kontakt tkání, ve kterých dochází ke zvýšení vaskulární permeability, nebo kde je zvýšené riziko zvýšení vaskulární permeability s prostředkem obsahujícím terapeuticky účinné množství inaktivovaných proteinů Src a/nebo Yes, nebo vektorů zajišťujících expresi těchto proteinů.

V případě, že je třeba zvýšit nebo posílit vaskulární permeabilitu, je vhodnější použít aplikaci aktivních forem proteinů Src a/nebo Yes do tkáně. Způsob a načasování aplikace je podobné jako v případě způsobů popsaných výše týkajících se potlačení vaskulární permeability.

Například, ovlivnění propustnosti krevně mozkové bariéry pro umožnění vstupu léčiv do tkáně mozku je rovněž předmětem navrhovaného vynálezu. Zvýšení vaskulární permeability krevně mozkové bariéry umožní léčivům, která normálně nejsou schopná tuto bariéru překročit, vstoupit do tkáně mozku.

Může být nezbytné ovlivňovat angiogenezi pomocí vaskulární permeability velmi citlivě a v tom případě může být žádoucí použít směs aktivních a neaktivních forem proteinů Src nebo Yes nebo nukleových kyselin kódujících a zajišťujících expresi proteinů Src nebo Yes.

Potlačení nebo posílení angiogeneze obvykle nastává 5 až 7 dní po prvním kontaktu s terapeutickým prostředkem podle navrhovaného vynálezu. Podobně ovlivnění vaskulární permeability by mělo probíhat v podobném časovém rámci. První účinky se mohou dostavit v poměrně krátkém časovém úseku po aplikaci terapeutického prostředku. Limitujícím faktorem je míra absorpce tkání, buněčná intemalizace, translokace proteinu nebo translace nukleové kyseliny (závisí na terapeutickém prostředku) a směrování proteinu. Je tedy možné, že první projevy ovlivnění vaskulární permeability nastanou již za méně než hodinu po podání. Je možné následné nebo prodloužené podávání neaktivního Src a/nebo Yes proteinu za použití správných podmínek. Modifikací těchto parametrů tedy získáme celou řadu možných terapeutických časových úseků, které mohou být navrženy.

Způsob podle navrhovaného vynálezu také zahrnuje aplikaci prostředku obsahujícího inhibitor tyrozin kináz rodiny Src do tkáně postižené chorobou, zraněním krevních cév nebo traumatem. Inhibitor tyrozin kináz rodiny Src může být chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src nebo nukleotidový inhibitor Src.

Příklady vhodných chemických inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src jsou např. PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamycin apod.

PPI (od Biomol, licence od Pfizer) je syntetický inhibitor Src používaný v této studii. PPI je členem rodiny pyrazol pyrimidinu - inhibitorů Src. Další syntetické inhibitory Src zahrnují PP2 (Calbiochem, licence od Pfizer), který je strukturně podobný PPI a ukázal se také účinným blokátorem aktivity tyrozin kináz rodiny Src. (Hanke et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(2): 695-701). Další specifický inhibitor tyrozin kinázy Src je PD173955 (Moasser et al., 1999, Cancer Res. 59:6145-6152), jehož struktura byla publikována. PD162531 (Owens et al., 2000, Mol. Biol. Cell 11:51-64) je také specifickým inhibitorem kináz Src od Parke Davise, ale struktura není z literatury dostupná. Geldanamycin je další inhibitor kinázy Src dostupný od Life Technologies. Radiciol je komerčně dostupný od různých firem (např. Calbiochem, RBI, Sigma), je antifungální makrocyklické laktonové antibiotikum, které rovněž působí jako nespecifický inhibitor tyrozin kináz a byla prokázána jeho schopnost potlačit jeho aktivitu tyrozin kinázy Src. Nejvhodnější chemické inhibitory jsou PPI a PP2 nebo podobně, nejvhodnější chemický inhibitor je pak PPI.

Další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src je možné identifikovat a charakterizovat pomocí technik známých v současném stavu techniky. Například je možné testování chemických látek jako potenciálních a selektivních inhibitorů Src nebo jiných tyrozin kináz a výsledkem může být pak identifikace chemické skupiny použitelné jako účinný inhibitor tyrozin kináz rodiny Src.

-21 CZ 304320 B6

Například, katecholy byly identifikovány jako důležité vazebné elementy pro celou řadu inhibitorů tyrozin kináz pocházejících z přirozených zdrojů a rovněž byly nalezeny v látkách vybraných pomocí kombinační cílené selekce pro selektivní inhibici c-Src. (Mály, D. J. et al., 2000, Combinatorial Target - Guided Ligand Assembly: Identification of Potent Subtypes - Selective c-Src Inhibitors, PNAS (USA) 97(6):2419-2424). Vyhledávání založené na kombinační chemii možných látek s inhibičními vlastnostmi využívá skupiny, o kterých je známé, že jsou důležité pro inhibici Src, jako výchozí bod, a je důležitým a účinným způsobem pro izolaci a charakterizaci dalších chemických inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src.

Ještě opatrnější výběr potenciálních vazebných elementů založených na možnosti napodobení je v případě širokého spektra funkčních skupin nacházejících se na polypeptidech a nukleových kyselinách, které mohou být použité pro provádění kombinačního vyhledávání aktivních inhibitorů. Například knihovny popisující O-methyloxim jsou pro tento účel obzvláště vhodné, neboť tyto knihovny jsou snadno připravené pomocí kondenzace O-methylhydroxylaminu s velkým množství komerčně dostupných aldehydů. Vznik O-alkyloximu je slučitelný s celou řadou funkčních skupin, které jsou stabilní při fyziologické pH. (Malay et al., viz. výše).

Jak bylo popsáno, vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src rovněž zahrnují množství neaktivních proteinů Src nebo Yes, nebo jejich směsí, nebo nukleotidových vektorů exprimujících neaktivní Src nebo Yes, nebo obojí, schopných potlačit vaskulámí permeabilitu, podle navrhovaného vynálezu.

Další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src mohou být CSK - nebo nukleotidové vektory umožňující expresi CSK v množství zajišťující inaktivaci, podle navrhovaného vynálezu.

Jak bylo popsáno výše, jakákoliv tkáň, nebo orgán, skládající se z organizovaných tkání, může být místem poruchy vaskulámí permeability, a to včetně mozku, pokožky, svalů, střeva, pojivové tkáně, kloubů, kostí a dalších tkání, ve kterých se nacházejí krevní cévy.

Pacient, který může být léčen pomocí způsobů uvedených v navrhovaném vynálezu, by měl být zejména lidský pacient, ačkoliv je zřejmé z principu navrhovaného vynálezu, že uvedené principy by byly účinné u všech savců. Z toho vyplývá i definice termínu „pacient“, jak je zde používán. V tomto kontextu je jako savec rozuměn jakýkoliv savčí druh, u kterého je třeba léčit jakékoliv poškození tkáně spojené s propustností cév nebo otoky, zejména pak savčí druhy důležité pro zemědělství nebo domácí zvířata.

Způsob podle navrhovaného vynálezu zahrnuje aplikaci terapeuticky účinného množství chemického inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src, neaktivních proteinů Src nebo Yes, aktivního proteinu CSK, nukleové kyseliny kódující tyto proteiny, nebo jejich směsi, ve fyziologicky tolerovatelném prostředku savčímu pacientovi v souladu se způsoby podle navrhovaného vynálezu. Rozmezí dávek pro aplikaci chemických inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src, jako je např. PPI, může být rozmezí od 0,01 mg/kg tělesné hmotnosti od asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo může být limitováno rozpustností aktivní složky ve farmaceutickém nosiči. Je vhodné, aby terapeutické dávky byly v rozmezí od 1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 9 mg/kg tělesné hmotnosti. Nižší dávky, jako např. od 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 1 mg/kg tělesné hmotnosti mohou být přizpůsobeny opakované aplikaci pro léčbu chronických poruch. Typické dávky pro léčbu akutních poruch, které jsou méně závažné, snadno dostupné a kde způsob aplikace je jednodušší mohou být od asi 1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 3 mg/kg tělesné hmotnosti. V závislosti na závažnosti poranění, lokalizaci nebo způsobu aplikace mohou být použity vyšší dávky od asi 3 mg/kg tělesné hmotnosti od asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti (nebo podle rozpustnosti látky ve farmaceutickém nosiči), a to zejména v případě závažných poranění, lokalizací, které jsou těžko přístupné, nebo aplikací, které mohou probíhat pouze prostřednictvím nepřímé systémové aplikace.

-22CZ 304320 B6

V případě akutního poranění nebo traumatu je nejvhodnější zahájit léčbu co nejdříve po poranění. Přesto časový limit pro účinnou aplikaci inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src může být v rozmezí asi 48 hodin po poranění nebo traumatu, v případě akutních případů. Je vhodnější, aby k aplikaci došlo během prvních 24 hodin, přičemž lépe 12 hodin a nejvhodnější případ je, když aplikace proběhne během prvních 6 hodin. Aplikace 48 hodin po poranění může být účinná pro odstranění dalšího poškození tkáně způsobeného následnou vaskulární propustností nebo otokem a dokonce i účinek původního poškození tkáně může být takovouto aplikací snížen.

V případě preventivní aplikace určené pro preventivní ochranu tkáně před vaskulární propustností nebo otokem v případě chirurgického zákroku nebo v případě diagnostického předpokladu, by k aplikaci mělo dojít před vlastním nárůstem vaskulární permeability, nebo během nástupu nárůstu vaskulární permeability. Pro léčbu chronických poruch vedoucích k nárůstu vaskulární permeability a s tím spojené vaskulární propustnosti a otoku aplikace aktivních inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src by měla probíhat v kontinuálním dávkovacím protokolu.

Rozmezí dávek pro aplikaci neaktivních proteinů Src nebo Yes, nebo aktivního proteinu CSK závisí na formě proteinu, jeho účinnosti, jak je popsáno dále, a použité množství by mělo být dostatečné, aby bylo dosaženo požadovaného efektu, kdy vaskulární permeabilita a příznaky chorob spojené s vaskulární permeabilitou, jsou potlačeny. Dávka by neměla být natolik vysoká, aby způsobila nežádoucí vedlejší účinky, jakými může být syndrom hyperviskozity, plicní otok, selhání srdce způsobené překrvením apod.

Terapeuticky účinné množství ovlivňující vaskulární permeabilitu je takové množství aktivního SCK nebo neaktivní proteinů Src nebo Yes, nebo jejich směsí, nebo nukleových kyselin kódujících tyto proteiny, které je dostatečně pro to, aby bylo dosaženo měřitelné změny vaskulární permeability v léčené tkáni, tzn. množství ovlivňující vaskulární permeabilitu. Ovlivnění vaskulámí permeability může být stanoveno pomocí technik popsaných výše, nebo pomocí způsobů známých odborníkům v současném stavu techniky. Ovlivnění vaskulární permeability může být stanoveno pomocí Millerovy techniky, jak je zde popsáno, nebo pomocí jiných technik známých v současném stavu techniky.

Obecně, dávka může záviset na věku, podmínkách, pohlaví a rozsahu choroby u pacienta a měla by být určena odborníkem v současném stavu techniky. V případě jakýchkoliv komplikací by tato dávky měla být upravena příslušným lékařem.

Farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu by mohl být aplikován parenterálně pomocí injekce nebo postupnou infúzi během dne. Protože tkáň, která má být léčena, je obvykle dosažitelná i pomocí systémové aplikace, a tedy v nejobvyklejším případě je léčena pomocí intravenózní aplikace terapeutického prostředku, další tkáně a způsoby transportu musí být také testovány, neboť existuje jistá pravděpodobnost, že cílová tkáň obsahuje cílovou molekulu. Prostředek podle navrhovaného vynálezu tedy může být podáván intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulámě, subkutánně, intrakavitálně, transdermálně a může být doručován pomocí peristaltických technik.

Intravenózní aplikace probíhá např. pomocí injekce v jednotkové dávce. Termín Jednotková dávka“, pokud je použit jako odkaz vzhledem k terapeutickému prostředku podle navrhovaného vynálezu, popisuje fyzicky diskrétní jednotku vhodnou jako jednu dávku pro subjekt, kdy každá dávka obsahuje předem stanovené množství předem stanovené složky, vypočítané tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku po požadovaném naředění, např. nosičem nebo vehikulem.

V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu jsou látky podávány v jedné dávce intravenózně. Fokalizovaná aplikace může proběhnout přímou injekcí nebo zvolením anatomicky izolovaných kompartmentů, izolací mikrocirkulace cílového orgánového systému, reperfúzí v cir-23 CZ 304320 B6 kulačním systému nebo katétru dočasně zavedeného do cílového orgánu a vaskulatury spojené s porušenou tkání.

Prostředky jsou podávány způsobem kompatibilním s lékovou formou a v terapeuticky účinném množství. Množství, které má být podáno, a časování aplikací závisí na léčeném subjektu, schopnosti pacientova organizmu reagovat na aktivní složku a stupni požadovaného terapeutického účinku. Přesná množství aktivní složky nezbytná pro aplikaci závisí na úsudku odborníka aje rozdílná pro každý jednotlivý případ. Ačkoliv jsou zde popisována vhodná rozmezí dávek pro systémovou aplikaci, závisí rovněž na způsobu aplikace. Vhodné protokoly aplikace jsou také variabilní, ale obvykle se sjednocují po úvodní dávce následované opakovanými dávkami v jedno- nebo více hodinovém intervalu a následnou injekcí při další aplikaci. Další možností je kontinuální intravenózní infúze schopná udržet koncentraci v krvi v rozmezí hodnot specifických pro zamýšlenou in vivo terapii.

Tedy způsoby podle navrhovaného vynálezu potlačující poškození tkáně díky vaskulámí propustnosti nebo otoku spojeném s nemocí nebo poruchou potlačí příznaky této choroby a v závislosti na jejím typu mohou přispět k léčbě choroby. Zvýšení vaskulámí permeability v tkáni, a tedy účinnost inhibice dosažené pomocí navrhovaného vynálezu, může být stanoveno celou řadou technik. Konkrétně se jedná o způsoby vhodné pro potlačení mrtvice nebo další mozkových příhod spojených s poškozením centrálního nervového systému, který je dáno vyvolaným zvýšení vaskulámí permeability následnou zvýšenou propustností cév a/nebo vzniklým otokem, který poškodí přilehlou tkáň.

V jedné konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je léčenou tkání tkáň postižená zánětem a vaskulámí permeabilita je zvýšena díky stimulaci VEGF. Do této oblasti spadá způsob potlačení vaskulámí permeability v artritické tkáni, jako v případě pacientů s chronickým artikulámím revmatismem, v případě tkání postižených zánětem, v tkáni postižené lupénkou, apod.

V další variantě je léčenou tkání rohovka pacienta s nemocnou rohovkou, jako v případě diabetické retinopatie, makulámí degenerace, nebo neovaskulámího glaukomu a vaskulámí permeabilitu je třeba potlačit v tkáni rohovky v místech, kde došlo k neovaskularizaci. Popisovaný způsob podle navrhovaného vynálezu pro nížení vaskulámí permeability v tkáni postižené zraněním nebo chorobou rovněž použitelný jako způsob léčby chorob spojených s porušením vaskulámí permeability, zahrnuje kontakt tkáně, ve které došlo k nárůstu vaskulámí permeability, nebo tkáně, kde je zvýšené riziko nárůstu vaskulámí permeability s prostředkem obsahujícím terapeuticky účinné množství inhibitoru tyrozin kináz Src.

Ovlivnění vaskulámí permeability a zabránění poškození tkáně způsobeném propustností cév a otokem by mělo nastat během krátkého časového úseku po aplikaci terapeutického prostředku. Většina terapeutických účinků je patrná během 3 dní po podání, v případě akutního zranění nebo traumatu. Účinky chronické aplikace nejsou obvykle tak patrné.

Limitujícím faktorem je míra absorpce tkání, buněčná intemalizace, translokace proteinu nebo translace nukleové kyseliny (závisí na terapeutickém prostředku) a směrování proteinu. Účinky ovlivňující poškození tkáně pak mohou nastat již za méně než hodinu po podání. Je možné následné nebo prodloužené podávání inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src za použití správných podmínek. Modifikací těchto parametrů tedy získáme celou řadu možných terapeutických časových úseků, které mohou být navrženy.

F. Terapeutický prostředek (obecná pravidla)

Navrhovaný vynález popisuje terapeutické prostředky použitelné pro použití v léčebných postupech zde popisovaných. Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s proteiny Src a Yes, nebo vektory schopné expresi proteinů Src a Yes zajistit, jak je zde popsáno, nebo inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, který je zde popsa-24CZ 304320 B6 ný, kterým může být chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src nebo nukleotidový inhibitor Src, rozpuštěný nebo rozptýlený v nosiči jako aktivní složka. V nejvhodnější variantě není terapeutický prostředek imunogenní po aplikaci savcům nebo lidským pacientům za terapeutickým účelem.

Proteiny Src a Yes mohou být aktivní, neaktivní, nebo se může jednat o jejich směsi, v závislosti na požadovaném účinku. Nejvhodnější formy Src a Yes jsou popsány výše. Protein CSK by měl být přítomný v aktivní formě.

Jak jsou používány zde termíny „farmaceuticky přijatelný“ a nebo „fyziologicky tolerovatelný“ a jejich gramatické varianty, popisující prostředky, nosiče, rozpouštědla a složky, mohou být zaměněny a představují takové materiály, které je možno podat savcům, aniž by vyvolaly nežádoucí fyziologické efekty, jako je nevolnost, závrať, podráždění žaludku a podobně.

Příprava farmaceutického prostředku, který obsahuje rozpuštěné nebo rozptýlené aktivní složky je dobře známá v současném stavu techniky a nemůže být limitována zvolenou formou. Tyto prostředky jsou obvykle připraveny v injekční formě, a to jak v kapalné formě nebo suspenzi, přesto že pevná forma vhodná pro přípravu roztoku nebo suspenze v kapalině před použitím, je rovněž použitelná. Prostředek může být také ve formě emulze nebo jako lipozómový prostředek. Aktivní složka může být smíchána s nosičem, který je farmaceuticky přijatelný a kombinovatelný s aktivní složkou v množství dostatečném pro použití v terapeutických technikách zde popsaných. Vhodnými nosiči mohou být například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol a podobně, nebo jejich kombinace. Dále pokus je třeba prostředek může obsahovat menší množství dalších složek, jako jsou zvlhčovadla nebo emulzifikátory, pufry a podobně, které zvyšují účinnost aktivní složky.

Terapeutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat farmaceuticky přijatelné soli použitých látek. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli vzniklé přidáním kyseliny (tvořené aminoskupinami polypeptidu) tvořené neorganickými solemi, jako jsou např. kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, organickými kyselinami, jako je kyselina octová, tartarová, mandelová atd. Soli tvořené volnými karboxylovými skupinami mohou být také odvozené od anorganických zásad, jako je např. sodík, draslík, amoniak, vápník nebo hydroxidy železa a organickými zásadami jako je izopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain a podobně.

Fyziologicky přijatelné nosiče jsou dobře známé v současném stavu techniky. Příkladem kapalných nosičů jsou sterilní vodné roztoky, které neobsahují žádné další přísady, kromě aktivních složek a vody, nebo mohou obsahovat pufr jako fosforečnan sodný s fyziologickým pH, fyziologický roztok nebo oboje, jako je fosfátový fyziologický roztok. Dále vodné nosiče mohou obsahovat více než jednu pufrovací sůl, jako jsou sodné nebo draselné chloridy, dextróza, polyethylenglykol a další roztoky.

Kapalný prostředek může také obsahovat kapalnou fázi kromě té, ve které je voda. Příkladem těchto dalších kapalných fází je glycerin, rostlinné oleje, jako je bavlníkový olej a emulze voda-olej.

F(i) Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu pro ovlivnění vaskulámí permeabilify

V jedné variantě navrhovaného vynálezu terapeutické prostředky obsahují takové množství proteinů Src a/nebo Yes, které je dostatečné pro ovlivnění vaskulámí permeability, nebo účinný rekombinantní DNA expresní vektor schopný zajistit expresi účinného množství proteinů Src a Yes, obvykle ve formě obsahující alespoň hmotnostních 0,1 % proteinů Src nebo Yes z celkové hmotnosti terapeutického prostředku. Hmotnostní procenta jsou určena jako poměr hmotnosti proteinů Src nebo Yes k celkovému množství prostředku. Tedy např. 0,1 % hmotnosti předsta-25 CZ 304320 B6 vuje 0,1 g proteinů Src nebo Yes z lOOg celkové hmotnosti prostředku. Pro DNA expresní vektory je aplikované množství závislé na vlastnostech expresního vektoru, léčené tkáni a dalších podmínkách.

F(ii) Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src

Chemické terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s inhibitorem tyrozin kináz rodiny Src rozpuštěným nebo rozptýleným v nosiči jako aktivní složka.

Proteinové terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s neaktivním Src, neaktivním Yes nebo aktivním proteinem CSK rozpuštěným nebo rozptýleným v nosiči jako inhibitor tyrozin kináz rodiny Src.

Nukleotidové terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s nukleovou kyselinou kódující neaktivním Src, neaktivním Yes nebo aktivním proteinem CSK rozpuštěnou nebo rozptýlenou v nosiči jako inhibitor tyrozin kináz rodiny Src.

Vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src by měly specificky inhibovat biologickou aktivitu tyrozin kináz rodiny Src. Nejvhodnější inhibitory tyrozin kináz rodiny Src by měly být zejména specifické pro inhibici aktivity ^pp60Src proteinu a sekundárně inhibovat nejbližší příbuzné členy rodiny tyrozin kináz Src, jako je Yes. Vhodný inhibitor tyrozin kináz rodiny Src může být inhibitor patřící do skupiny zahrnující PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radiciol R2146 a Geldanamycin. Další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src mohou být identifikovány a charakterizovány pomocí standardních technik známých v současném stavu techniky. Mutanty Src vykazující inhibiční účinek na vaskulární permeabilitu namísto aktivace, jsou označovány jako neaktivní mutanty Src. Proteiny obsahující mutace, které jim dávají inhibiční aktivitu, jsou také označovány jako dominantně negativní proteiny Src, které potlačují vaskulámí permeabilitu, a to i v případě, že je výsledkem endogenní aktivity Src, stejně jako posílené aktivity Src způsobené stimulací růstovým faktorem. Některé mutace divokého typu c-Src podle navrhovaného vynálezu mohou rovněž sloužit jako dominantně negativní vzhledem kjejich schopnosti blokovat růst krevních cév a vaskulámí permeabilitu, např. snížením vaskulámí permeability in vivo. Tedy další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src, včetně neaktivních forem proteinů Src a Yes které mohou sloužit jako antagonisté aktivity proteinů Src nebo Yes což vede k inhibici nebo snížení vaskulární permeability krevních cév v cílové tkáni. Nejvhodnější neaktivní protein Src je protein označovaný jako Src 251. Dalším vhodným proteinem je protein Src K295M. Vhodný neaktivní protein Yes b měl mít potlačenou kinázovou aktivitu vzhledem k divokému typu proteinu. Další inhibitory tyrozin kináz rodiny Src mohou být antisens nukleové kyseliny, analogy nukleových kyselin, nebo nukleové kyseliny kódující protein které potlačují expresi genů Src a Yes v cílových buňkách. Antisens molekuly mohou být terapeuticky účinné látky ovlivňující vaskulámí permeabilitu v případě, že tyto antisens nukleové kyseliny schopné hybridizovat s mRNA kódující protein Src nebo Yes, mohou hybridizovat s mRNA, což vede k inhibici buněčné exprese tyrozin kináz Src nebo Yes po transfekci do cílové buňky ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Jak bylo uvedeno výše, vhodným inhibičním proteinem c-Src je protein Src251, kde je exprimováno pouze 251 počátečních aminokyselin. Tento konstrukt postrádá celou kinázovou doménu a je tedy označován jako „mrtvá kináza“ Src. Další konstrukt je Src K295M mutant, kde aminokyselina lysin v pozici 295 je zaměřena za aminokyselinu methionin. Tato bodová mutace v kinázové doméně brání vazbě ATP a rovněž blokuje na kináze závislou funkci Src nezbytnou pro signalizaci vaskulámích a nádorových buněk a proliferaci.

-26CZ 304320 B6

Kromě bodových mutací, jakákoliv mutace vedoucí k dosažení požadované inhibiční aktivity je použitelná pro použití v navrhovaném vynálezu. Konstrukty fúzních proteinů kombinující požadovaný protein Src (mutantu nebo jeho fragment) s exprimovaným aminokyselinovým tágem, antigenním epitopem, fluorescenčním proteinem nebo jinými proteiny či peptidy jsou rovněž použitelné, tak dlouho dokud požadovaný modulační účinek proteinu Src zůstává nezměněný.

Podobně, přidáním exogenního inhibitoru aktivity proteinu Src nebo stimulací exprese těchto inhibitorů v cílové tkáni, jak je to proveditelné pomocí CSK (c-terminální Src kináza), je rovněž způsobem inhibice aktivity Src. Fosforylace tyrozinu inaktivujícího Src, je způsobem negativní regulace c-terminální kinázy je účinkem popsaným u CSK (Nada et al., 1991, Nátuře 351:69-72, Okada et al., 1991, J. Biol. Chem. 266 (36):24249-24252). Když CSK fosforyluje aminokyselinu 527 v divokém typu proteinu Src, protein Src inaktivuje, tedy CSK je rovněž použitelné jako silný inhibitor aktivity Src. Sekvence aminokyselin lidského CSK obsahuje 450 aminokyselin a je označena přístupovým číslem P41240 a nachází se v proteinové databázi Swiss. sekvence mRNA nukleové kyseliny kódující lidský protein CSK je označen přístupovým číslem NM 004383 v databázi GenBank.

V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu farmaceutický prostředek obsahující takové množství proteinů Src nebo Yes a/nebo CSK schopné ovlivnit vaskulámí permeabilitu, nebo účinný expresní vektor zajišťující expresi účinného množství neaktivních proteinů Src, Yes nebo aktivního proteiny CSK, obvykle ve formě obsahující alespoň hmotnostních 0,1 % proteinů Src nebo Yes z celkové hmotnosti terapeutického prostředku. Hmotnostní procenta jsou určena jako poměr hmotnosti proteinů Src nebo Yes k celkovému množství prostředku. Tedy např. 0,1 % hmotnosti představuje 0,1 g proteinů Src nebo Yes z 100 g celkové hmotnosti prostředku. Pro expresní vektory je aplikované množství závislé na vlastnostech expresního vektoru, léčené tkáni a dalších podmínkách. Tedy účinné množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceutickém prostředku je takové množství, které vede k terapeuticky účinnému ovlivnění vaskulámí permeability regulované proteinem Src. Terapeutické množství jakéhokoliv farmaceutického prostředku je takové, které samo o sobě vede k potlačení vaskulámí propustnosti nebo otoku způsobující poškození tkáně.

G(i) Obecné předpoklady, předmět výroby jak je použit zde, termín balicí materiál popisuje jakýkoliv materiál, jako je sklo, plast, papír, fólie a podobně, schopný udržet farmaceutický prostředek nezměněný. Tedy např. balicí materiál může být plastová nebo skleněná lahvička, laminovaná obálka a podobné nádoby, které obsahují farmaceutický prostředek.

V nejvhodnější variantě balicí materiál obsahuje etiketu na které je zřetelně popsán obsah, způsob výroby a použití farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř.

G(ii) Terapeutické prostředky ovlivňující vaskulámí permeabilitu, předmět výroby

Navrhovaný vynález zahrnuje i předmět výroby popisující označenou nádobu obsahující terapeuticky účinné množství směsi proteinů Src a Yes. Předmět výroby popisuje i balicí materiál a farmaceuticky aktivní složku obsaženou uvnitř balicího materiálu.

Farmaceutická složka v oblasti výroby je jakýkoliv prostředek podle navrhovaného vynálezu obsahující proteiny Src nebo Yes v farmaceuticky přijatelné lékové formě tak, jak je popsána v přiloženém popisu. Tedy, prostředek může obsahovat protein Src nebo Yes nebo molekulu DNA umožňující expresi proteinu Src, molekulu DNA umožňující expresi proteinu Yes nebo molekulu DNA umožňující expresi obou proteinů. Předmět výroby popisuje takové množství farmaceutického agens dostatečného pro léčbu poruch popsaných výše, a to buď v jednotce, nebo v několika dávkách.

-27CZ 304320 B6

Proteiny Src mohou být aktivní nebo neaktivní, nebo to může být jejich směs v závislosti na požadované úrovni ovlivnění. Nejvhodnější formy aktivních nebo neaktivních proteinů Src nebo Yes jsou popsány výše.

Obalový materiál by měl obsahovat etiketu, na které je zřetelně označeno použití obsaženého farmakologického prostředku, tzn. pro léčbu poruch spojených s oslabením nebo posílením vaskulámí permeability a spojených poruch zde popisovaných. Etiketa může dále obsahovat instrukce pro použití a související informace, které mohou být důležité pro obchod. Balicí materiál může obsahovat nádobu nebo nádoby pro skladování farmaceutického prostředku.

G(iii) Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, předmět výroby.

Navrhovaný vynález zahrnuje i předmět výroby popisující označenou nádobu obsahující terapeuticky účinné množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src. Inhibitorem může být balený chemický, proteinový nebo nukleotidový inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, kombinace několika nebo jejich směs. Předmět výroby popisuje i balicí materiál a farmaceuticky aktivní složku obsaženou uvnitř balicího materiálu. Předmět výroby může také obsahovat dvě nebo více subterapeutických dávek farmaceutického prostředku, jejichž účinek se sčítá, což vede k potlačení poškození tkáně vyvolanému propustností cév nebo otokem.

Farmaceutická složka v oblasti výroby je jakýkoliv prostředek podle navrhovaného vynálezu obsahující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelné lékové formě tak, jakje popsána v přiloženém popisu. Tedy, prostředek může obsahovat chemické inhibitory jako PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin, proteinové inhibitory jako je neaktivní Src nebo Yes, aktivní protein CSK nebo molekulu nukleové kyseliny schopnou zajistit expresi těchto proteinů nebo jejich kombinací. Předmět výroby popisuje takové množství farmaceutického agens dostatečného pro léčbu poruch popsaných výše, a to buď v jednotce, nebo v několika dávkách.

Obalový materiál by měl obsahovat etiketu, na které je zřetelně označeno použití obsaženého farmakologického prostředku, tzn. pro léčbu poruch spojených s potlačením nárůstu vaskulámí permeability a spojených poruch zde popisovaných. Etiketa může dále obsahovat instrukce pro použití a související informace, které mohou být důležité pro obchod. Balicí materiál může obsahovat nádobu nebo nádoby pro skladování farmaceutického prostředku.

Přehled obrázků na výkresech

K obrazům tvořícím část tohoto spisu:

Obr. 1 je cDNA sekvence kuřecího c-Src kterou je kompletní sekvence s introny které byly deletovány jak bylo popsáno v Takeya et al., Cell, 32:881-890 (1983). Tato sekvence je dostupná v GenBank pod přístupovým číslem J00844. Sekvence obsahuje 1759 nukleotidů s částí kódující protein začínající a končící na příslušných kódujících sekvencích 112 a 1713 (sekvence č. 2).

Obr. 2 je kódovaná aminokyselinová sekvence kuřecího c-Src kódující sekvence z obr. 1 (sekvence č. 3).

Obr. 3 je cDNA sekvence lidského c-Src kterou poprvé popsal Braeuninger et al., proč. Nati. Acad. Sci., USA., 88:10411-10415 (1991). Tato sekvence je dostupná v GenBank pod přístupovým číslem X59932. Sekvence obsahuje 1759 nukleotidů s částí kódující protein začínající a končící na příslušných kódujících sekvencích 134 a 1486 (sekvence č. 4).

-28CZ 304320 B6

Obr. 4 je kódovaná aminokyselinová sekvence lidského c-Src kódující sekvence z obr. 3 (sekvence č. 5).

Obr. 5 ukazuje aktivaci endogenního Src pomocí bFGF nebo VEGF jak popisuje příklad 4. Vrchní část obrázku ukazuje výsledky in vitro kinázového testu s mírou aktivace endogenního c-Src buď pomocí bFGF, a nebo VEGF. Spodní část obrázku je blot kinázové techniky značený anti-Src protilátkou jako kontrola ekvivalentu Src a obsahu IgG.

Obr. 6 popisuje účinek retrovirem zajištěné exprese genu c-Src A na angiogenezi kuřecího CAM jak je popisováno v příkladu 4. Devítidenní kuřecí CAMy byly vystaveny RCAS-Src A aktivní mutant c-Src) nebo kontrolního RCAS-GFP (Green Fluorescent Protein = zeleně fluoreskující protein sloužící jako expresní sonda) retrovirům nebo pufru po dobu 72 h. Míra angiogeneze byla kvantifikována tak, jak je uvedeno v obr. 6A s reprezentativními mikrofotografiemi (4x) na obr. 6B odpovídajícími každém léčbě snímanými pomocí stereomikroskopu.

Obr. 7 ukazuje retrovirovou expresi c-Src A při aktivaci fosforylace vaskulámí MAP kinázy. Obr. 7A ukazuje tkáňové extrakty 10-ti denních kuřecích CAM které byly vystaveny VEGG nebo PMA po dobu 30 minut nebo po infekci c-src a retroviru po dobu 48 hodin. NT zkratka znamená kontrola bez léčby. Src bylo imunoprecipitováno z ekvivalentního množství celkového proteinového extraktu a vystaveno in vitro imunokomplexové kinázové technice za použití FAK-GST fuzního proteinu jako substrátu, rozděleno na elektroforéze a přeneseno na nitrocelulózu. V alikvotech výše popsaného lyzátu z celé tkáně byla rovněž stanovována fosforylace endogenního ERK pomocí anti-fosfo-ERK protilátky. Obr. 7B ukazuje 10 dní staré CAM, které byly infikovány buď „prázdným“ RCAS nebo RCAS obsahujícím Src A. Po dvou dnech byly CAM rozpitvány, zamraženy v OCT a nařezány na 4 gm řezy. Tyto řezy byly značeny pomocí antifosfo-ERK protilátky (New Englang Biolabs), promyty a detekce proběhla pomocí kozí antikráličí sekundární protilátky značené FITC. Fluorescenční obrazy byly zachyceny pomocí chlazené CCD kamery (Princeton Inst.).

Obr. 8 ukazuje selektivní požadavky pro Src aktivitu během VEGF, ale ne bFGF indukované angiogeneze. Devět dní staré kuřecí CAM byly vystaveny RCAS-Src 251 nebo kontrolní RCAS-GFP retroviru nebo pufru po dobu 20 hodin a poté inkubovány dalších 72 hodin v přítomnosti nebo v absenci bFGF nebo VEGF. Míra angiogeneze byla kvantifikována na obr. 8A jak je popisováno výše a reprezentativní mikrofotografíe (6x) byly snímány stereomikroskopem, jak ukazuje obr. 8B. Obr. 8C ukazuje blot značený pomocí anti-Src protilátky pro potvrzení exprese Src251 v transfekovaných buňkách a jako kontrola slouží slepé transfektanty.

Obr. 9 ukazuje výsledky retrovirového zavádění RCAS-Src 251 u lidských nádorů. Obr. 9A je mikrofotografíe, která ukazuje fragment lidského medulloblastomového nádoru infikovaného RCAS-GFP (RCAS-Green Fluorescent Protein) exprimujícímu GFP exkluzivně v nádorové vaskulatuře (označeno šipkou), jak bylo zjištěno na optických sekcích získaných pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu BioRad (značka = 500 gm). Obr. 9B ukazuje data z nádorů ošetřených povrchovou aplikací retroviru, které byly ponechány růst 3 až 6 dní, poté vyoperovány a byla stanovena jejich váha. Vynesená data představují průměrnou změnu v hmotnosti nádoru (od 50 mg výchozí hmotnosti nádoru) +/- SEM dvou opakování. Obr. 9C ukazuje reprezentativní mikrofotografíe meduloblastomů chirurgicky vyjmutých z embryí (značka = 350 gm). Spodní část obrázku představují velká zvětšení jednotlivých nádorů ukazující vaskulaturu každého nádoru v detailu (značka = 350 gm). Šipka označuje porušení krevních cév u nádorů ošetřených RCAS-Src251.

Obr. 10 je diagram ukazující restrikční mapu RCASBP (RCAS) vektorového konstruktu (sekvence č. 1).

Obr. 11 ukazuje kódovanou aminokyselinovou sekvenci lidského proteiny c-Yes v jednopísmenném kódu (sekvence č. 8).

-29CZ 304320 B6

Obr. 12 ukazuje nukleotidovou sekvenci cDNA kódující lidský protein c-Yes. Tato sekvence je dostupná v GenBank pod přístupovým číslem MI5990. Sekvence obsahuje 4517 nukleotidů s částí kódující protein začínající a končící na příslušných kódujících sekvencích 208 a 1839 a přepsaná do aminokyselinové sekvence zobrazené na obr. 11 (sekvence č. 7),

Obr. 13 ukazuje výsledky retrovirového přenosu Src251 a CSK u myšího modelu angiogeneze po podkožní aplikaci. Obr. 13A ukazuje výsledky imunoblotu pro detekci exprese flk. Obr. 13B ukazuje výsledky imunoblotu z techniky sledující flk po stimulaci VEGF a bFGF. Obr. 13C je graf, který zobrazuje počet CD34 pozitivních krevních cév (průměr trojic náhodných polí při zvětšení 20x) po ošetření VEGF a bFGF v přítomnosti GFP, Src 251 nebo CSR retrovirů.

Obr, 14 popisuje výsledky z modifikované Milesovy techniky pro stanovení vaskulámí permeability v pokožce myší deficitních v expresi Src, fyn a Yes. Obr. 14A je fotografie ošetřených uší, obr. 14B je graf experimentálních výsledků pro stimulaci různých deficitních myší. Obr. 14C ukazuje množství vymytého barviva Evansova modř po léčbě.

Obr. 15 je graf zobrazující relativní velikost infarktů u Src +/-, Src divokého tyu (wt) a divokého typu myší ošetřených PPI. Při léčbě PPI byla použita koncentrace 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti.

Obr. 16 ukazuje sekvenční MRI skenování mozků kontrolních myší a myší ošetřených PPI, ukazující méně mozkových infarktů u myší ošetřených PPI (vpravo) než u kontrolních zvířat (vlevo).

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady vztahující se k navrhovanému vynálezu jsou pouze ilustrací a nemohou být brány jako limitující faktory. Navíc varianty navrhovaného vynálezu, již nyní známé nebo v budoucnu vyvinuté odborníkem v současném stavu techniky mohou rovněž spadat do rámce navrhovaného vynálezu, tak, jak je uvedeno v nárocích.

Příklad 1. Příprava expresního konstruktu c-src a c-yes

Pro přípravu expresního konstruktu použitelného pro ovlivnění vaskulámí permeability a angiogeneze pomocí způsobů podle navrhovaného vynálezu, je cDNA kódující c-src upravena a vložena do vhodného expresního vektoru/konstruktu.

Sekvence cDNA kódující divoký typ (tzn. endogenní) kuřecí c-src je zobrazen na obr. 1 (sekvence č. 2) s kódovanou aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (sekvence č. 3). Kódovaná proteinová sekvence je překládána z cDNA od nukleotidu na pozici 112 do pozice 1713. Nukleotidová sekvence odpovídající nukleotidové sekvenci lidské cDNA kódující c-src (sekvence č. 4) a sekvence kódovaných aminokyselin (sekvence č. 5) jsou uvedeny na obr. 3 a 4. Pro lidskou proteinovou sekvenci, kódující pozice začíná na nukleotidu 134 a končí na 1486 cDNA.

Byl připraven divoký typ, stejně jako celá řada mutovaných variant cDNA kódující c-src. Mutované c-Src konstrukty byly připraveny cílenou mutagenezí, jak popisuje Kaplan et al., EMBO J., 13:4745^1756 (1994). Mutovaný c-Src konstrukt kódující mutované proteiny Src pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu, je popsán v Kaplan et al., EMBO J., 13:4745-4756 (1994). Kaplan et al., popisuje různé mutované varianty c-Src konstruktu kódující proteiny pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu. Např. Kaplan et al., ukazuje různé produkty kuřecích c-src alel na obr. 1, zahrnuje SrcA a Src251.

-30CZ 304320 B6

Navrhovaný vynález popisuje dvě kategorie funkcí c-Src při ovlivnění vaskulámí permeability. Jak bylo uvedeno dříve, do jedné kategorie spadají molekuly Src, které zvyšují vaskulámí permeabilitu ajsou tedy označené jako aktivní proteiny. Divoký typ Src a celá řada dalších mutant je v navrhovaném vynálezu označena proteiny indukující vaskulámí permeabilitu. Jedna mutace divokého typu c-src, která je schopna indukovat růst krevních cév a vaskulámí permeability je mutant SrcA s bodovou mutací v aminokyselině na pozici 527, kdy došlo k záměně tyroziny 257 na fenylaíanin. Toto místo je za normální situace místem negativní regulace c-Src kinázy pomocí kinázy označované jako CSK. V případě, že dojde k fosforylaci tyrozinu 527 v divokém typu proteinu Src pomocí CSK, je tento protein deaktivován. V mutantě označené jako SrcA je regulační tyrozin změněn na fenylaíanin a tím se stává tento protein trvale aktivním a nelze deaktivovat pomocí fosforylace.

Další mutace Src, u kterých byl prokázán opačný modulační účinek na vaskulání permeabilitu, to znamená, že vaskulámí permeabilitu potlačuje, namísto, aby ji zvyšoval. Tyto mutace jsou označovány jako neaktivní mutanty Src. Proteiny obsahující mutace, které zajišťují jejich inhibiční účinek, jsou také označovány jako dominantně negativní proteiny Src, neboť snižují vaskulámí permeabilitu, včetně vaskulámí permeability vyvolané endogenní aktivitou Src, stejně tak, jako zvýšenou aktivitu Src vyvolanou stimulací růstovými faktory. Některé mutace c-src divokého typu podle navrhovaného vynálezu může rovněž fungovat jako dominantně negativní, díky jejich schopnosti blokovat růst krevních cév a vaskulámí permeability a tedy snížení vaskulámí permeability in vivo.

Vhodným inhibičním proteinem c-Src je např. Src 251 kde je exprimováno pouze prvních 521 aminokyselin. Tento konstrukt neobsahuje celou kinázovou doménu aje proto označován jako „mrtvá kináza“ Src. Další konstrukt je Src K295M mutant, kde aminokyselina lysin v pozici 295 je zaměřena za aminokyselinu methionin. Tato bodová mutace v kinázové doméně brání vazbě ATP a rovněž blokuje na kináze závislou funkci Src nezbytnou pro signalizaci vaskulárních a nádorových buněk a proliferaci.

Kromě bodových mutací, jakákoliv mutace vedoucí k dosažení požadované inhibiční aktivity je použitelná pro použití v navrhovaném vynálezu. Konstrukty fúzních proteinů kombinující požadovaný protein Src (mutantu nebo jeho fragment) s exprimovaným aminokyselinovým tágem, antigenním epitopem, fluorescenčním proteinem nebo jinými proteiny Či peptidy jsou rovněž použitelné, tak dlouho dokud požadovaný modulační účinek proteinu Src zůstává nezměněný.

Např. aktivní mutace Src v pozici 527, dokud není výslednou aminokyselinou v této pozici tyrozin, serin nebo threonin, navrhovaný vynález uvádí, že přítomnost jakékoliv jiné aminokyseliny v této pozici dá vzniknout proteinu, kterýje aktivní a má požadovanou aktivitu posilující vaskulámí permeabilitu.

Kináza Ye z rodiny Src již byla popsána dříve, ale o jejích funkcích v buňce je dosud známo jen velmi málo. (Burek et al., 1988, The Oncogenes, Springer - Verlag, New York, str. 133-155, Marth et al., 1985, Cell, 43:393, Semba et al., 1986, PNAS (USA) 83:5459, Shibuya et al., 1982, J. Virol. 42:143, Yoshida et al., 1985, Jpn. J. Cancer Res. 76:559). Nejvhodnější aktivní lidský protein Yes je kódovaný nukleovou kyselinou popsanou v Sukegawa et al., (1987, Mol. Cell Biol. 7:41-47). Inaktivované modifikace lidského proteinu Yes a nukleové kyseliny kódující Yes mohou být připraveny stejně jako v případě Src.

- 31 CZ 304320 B6

Tabulka 1

Mutace Src_funkce Src_vliv na vaskulámí permeabilitu a angiogenezi

c-Src	Ί-	aktivní	stimuluje
SrcA (T527F)	Α	aktivní	stimuluje
Src527 (bodová)	+	aktivní	stimuluje
Src251	-	neaktivní	inhibuj e
Src (zkrácená)	-	neaktivní	inhibuj e
Src (K295M)	-	neaktivní	inhibuj e
Src (bodová)	-	neaktivní	inhibuj e

Vhodným expresním konstruktem použitelným v navrhovaném vynálezu je konstrukt RCASBP (A) (sekvence č. 1). Tento expresní vektor je odvozen od skupiny replikačně kompetentních ptačích sarkomových virů s posílenou Bryanovou polymerázou (BP) pro zvýšení titru a je specifický pro obalový glykoprotein typu A exprimovaný v normálních ptačích buňkách (přehled je v Methods in Cell Biology, 52:179-214 (1997), viz také Hughes et al., 1987, J. Virol. 61:3004-3012, Fekete & Čepko, 1993, Mol. Cellular Biol. 13(4):2604-2613, Itoh et al., 1996, Development 122:291-300, Scott et al., 1998, BioTechniques 24:660-666). Kompletní sekvence RCASBP (A) (sekvence č. 1) je uvedena ve výpisu sekvencí a restrikční mapa konstruktu je zobrazena na obr. 10 a označena jako RCAS.

Původní konstrukt Src 251 byl subklonován Dr. Pam Schwartzbergem v NIH z laboratoře Dr Harolda Varmuse. Klonování sekvence cDNA kódující src zajišťující expresi byl připraven vložením spojky obsahující restrikční místa Not I-BstBl-Not I do jedinečného restrikčního místa Not I na 5' konci Src 251. Src obsahuje jedinečné Cla I místo na 3' konci. Štěpením Src 251 pomocí BstBl a Cla I vznikne BstBl-Cla I fragment, který je poté vklonován do Cla I místa na RCASBP (A). Přesahy BstBl umožňují spojení s přesahy Cla 1 a tato napojená místa pak již nejsou enzymem Cla I štěpitelná. Src konstrukt použitelný v navrhovaném vynálezu je možné připravit zvýše popsaného vektoru nejprve štěpením RCAS vektoru obsahujícího Src 251 pomocí Not I a Cla I (v DAM+ pozadí) tak, aby bylo možné vložit podobně naštěpenou cDNA pro Src. Tedy konstrukt RCASBP (A) původně obsahující Src 251 může být dále použit pro klonování dalších Src konstruktů jak je popisováno v Kaplan et al., (1994, EMBO J. 13(20):4745-4756) do RCASBP (A) pomocí fragmentů připravených pomocí Not I - Cla I z Src 251 konstruktu. Tak, aby bylo možno připravit požadované mutace c—src v c—DNA, byly použity standardní postupy cílené mutageneze, které jsou známé každému odborníkovi v současném stavu techniky. PCR primery určené pro přípravu příslušné mutace byly rovněž navrženy s restrikčními místy tak, aby bylo možno dosáhnout následných klonovacích kroků. Celé segmenty sekvence nukleové kyseliny kódující Src jsou odstraněny z nukleotidového konstruktu pomocí PCR amplifikačních technik založených na známé sekvenci cDNA kuřecího, lidského a dalších homologů Src a následné přípravě nového konstruktu.

V jedné konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je 3' PCR primer použit pro oba amplifíkaci nukleové kyseliny kódující src ve správném čtecím rámci. Použití tohoto primeru přidá tag obsahující 9E10-myc epitop na karboxy konec vzniklého Src konstruktu. Následující aminokyseliny byly přidány za aminokyselinu 251 Src tak, aby byl připraven vektorový konstrukt obsahující tag s 9E10-myc epitopem:VDMEQKLIAEEDLN (sekvence č. 6). Proběhly dvě oddělené PCR reakce pro každý konstrukt a byly získány podobné výsledky. Všechny mutantní konstrukty připravené pomocí PCR byly rovněž sekvenovány pomocí PCR tak, aby byla potvrzena předpokládaná sekvence DNA klonů. Divoký typ a mutované Src cDNA pro

-32CZ 304320 B6 použití v expresních systémech podle navrhovaného vynálezu jsou také dostupné od Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY, odkud je možné koupit ptačí i lidský src a některé mrtvé kinázy a aktivované mutované formy.

Další možnosti použitelných expresních vektorů pro použití při expresi proteinů Src nebo Yes, jsou adenovirové vektory popisované v patentech US 797 368, US 5 173 414, US 5 436 146, LIS 5 589 377 a US 5 670 488. Dalšími způsoby pro transport modulačních proteinů Src a Yes zahrnují transport Src a Yes cDNA pomocí nevirových vektorových systémů jak je popsáno v patentu US 5 675 954 a transport cDNA samotné ve formě „nahé“ DNA je popsán v patentu US 5 589 466. Transport konstruktů podle navrhovaného vynálezu není rovněž omezeno na povrchovou aplikaci virových vektorů, jak je popsáno v CAM technice uvedené výše. Např. prostředek obsahující virový vektor je pomocí injekce aplikován intravenózně pro systémové podání do krevního řečiště. Tyto vektory je také možno směrovat do míst zvýšené neovaskularizace pomocí např. lokalizované injekce do nádoru.

Proteiny exprimované in vitro jsou rovněž použitelné pro jejich aplikaci následované po expresi a přečištění zvolených proteinů Src pomocí technik použitelných pro aplikaci proteinů a polypeptidů. Jednou z těchto technik je použití lipozómů, jak je popsáno v patentu US 4 356 167, US 5 580 575, US 5 542 935 a US 5 643 599. Každému odborníkovi v současném stavu techniky jsou dobře známé další vektoiy a transportní systémy proteinů, které jsou použitelné pro expresi s transport proteinů Src a Yes podle navrhovaného vynálezu.

Příklad 2. Charakteristika neošetřené kuřecí membrány kryjící chorioallantois (CAM)

A. Příprava CAM

Angiogenezi je možné vyvolat v membráně kuřecího chorioallantoisu (CAM), kdy během normální embryonální angiogeneze dochází k tvorbě zralých krevních cév. Bylo prokázáno, že angiogeneze je vyvolána reakcí na specifické cytokiny nebo nádorové fragmenty jak popisuje Leibovich et al., Nátuře, 329:360 (1987) anebo Asprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597 (1975). CAM byly připraveny z kuřecích embryí pro následnou indukci angiogeneze a její inhibici. Desetidenní kuřecí embrya byla získána z Mclntyre Polutry (Lake Side, CA) a inkubovány při 37 °C v 60% vlhkosti. Na konci vejce přímo nad vzduchovým vakem byla vyrobena malá dírka skrz skořápku pomocí malého vrtáčku (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine WI). Druhá dírka byla vyvrtána na široké straně vejce v oblasti postrádající embryonální krevní cévy, což bylo nejprve zjištěno prosvícením vejce. Na první dírku byl vyvinut negativní tlak, což vede k tomu, že membrána kryjící chorioalantois se odchlípla od membrány skořápky a vytvořila falešný vzduchový tlak nad CAM. Otvor o velikosti 1 x 1 cm byl vyříznut do membrány v místech, kde se nacházela CAM za použití modelářského řezacího kolečka (Dremel). Tento malý otvor umožnil přímý přístup do CAM. Takto upravené CAM byly buď použity v šestém dni embryogeneze, stádiu typickém aktivní neovaskularizací, bez další léčby CAM, které pak sloužily jako kontrolní model pro stanovení vlivu na embryonální vaskularizaci, nebo byly použity až desátý den embryogeneze, kdy míra angiogeneze značně poklesne. Takto připravené CAM byly tedy použity v navrhovaném vynálezu pro indukci obnovení angiogeneze v reakci na léčbu cytokiny anebo po kontaktu s nádorem, jak je popsáno níže.

Příklad 3. Stanovení CAM angiogeneze

A. Angiogeneze indukovaná růstovými faktory

Angiogeneze, jak bylo prokázáno, může být vyvolána cytokiny nebo růstovými faktory. Angiogeneze byla vyvolána umístněním 5x5 mm Whatmanova filtračního papírku (Whatmanův filtrační papír č. 1) napuštěném Hanksovým roztokem (HBSS, Gibco, Grand Island, New York)

-33CZ 304320 B6 nebo HBSS obsahujícím 2 pg/ml rekombinantního bazického fibroblastového růstového faktoru (bFGF) nebo vaskulámího endotheliálního buněčného růstového faktoru (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA) na CAM buď devátý, nebo desátý den vývoje kuřecího embrya v oblasti postrádající krevní cévy a otvor ve skořápce byl uzavřen lepící páskou. Jiné koncentrace růstových faktorů byly pro vyvolání růstu krevní cév také účinné. Pro techniky, ve kterých je hodnocena inhibice angiogeneze pomocí intravenózní injekce antagonistů byla angiogeneze nejprve vyvolána 1 až 2 pg/ml bFGF nebo VEGF ve fibroblastovém růstovém médiu. Míra angiogeneze byla poté stanovena pomocí mikrofotografie po 72 hodinách.

B. Embryonální angiogeneze

Příprava CAM nezbytných pro stanovení účinků inhibitorů angiogeneze na přirozenou tvorbu embryonální vaskulatury v šestidenních kuřecích embiyích byla popsána výše. V tomto stádiu vývoje rostou krevní cévy de novo a tím představují použitelný systém pro stanovení míry ovlivnění angiogeneze pomocí proteinů Src podle navrhovaného vynálezu. CAM jsou připraveny stejně, jak bylo popsáno výše s tou výjimkou, že tato technika probíhá šestý den embryonálního vývoje spíše než devátý či desátý den.

Příklad 4. Ovlivnění angiogeneze stanovené pomocí CAM techniky

Pro stanovení vlivu proteinu Src na angiogenezí byly následující techniky provedeny na desetidenních kuřecích CAM. 54 μg konstruktu RCAS připraveného podle popisu v příkladu 1 bylo pomocí transfekce zavedeno do kuřecích imortalizovaných fibroblastů linie DF-1 (dar od Douga Fostera Univ. of Min.). Tato buněčná linie stejně jako primární kuřecí embryonální fibroblasty byla schopna produkovat virus, nicméně buňky DF-1 produkovaly vyšší titr. Virové supematanty byly odebrány z narostlých DF-1 buněk produkujících virus v bezsérovém CLM médiu (složení: základ média F—10 doplněný DMSO, kyselinou listovou, kyselinou glutamovou a roztokem vitamínů MEM). 35 ml supematantu obsahujícího viry bylo zahuštěno pomocí ultracentrifugace při 4 °C po dobu dvou hodin při 22000 rpm. Takto zahuštěné virové pelety byly zahuštěny v 1/100 původního objemu v bezsérovém CLM médiu, rozdělené na alikvoty a zamražené při -80 °C. Koncentrace byla stanovena sériovým ředěním kontrolních virových vektorů obsahujících nukleotidovou sekvenci kódující zeleně fluoreskující protein (GFP), označované jako RCAS-GFP, infikovaných primárních kuřecích embryonálních fibroblastů, které byly inkubovány 48 až 72 hodin. Koncentrace těchto virových alikvotů obvykle přesahovala 10⁸ I.U./ml. Pro CAM techniku využívající tyto virové alikvoty byly připraveny kortison acetátem nasáklé v Hartmanovy filtrační disky, 6 mm v průměru, které byly připraveny 30 minutovou lázní v 3 mg/ml kortison acetátu v 95 % ethanolu. Disky byly vysušeny v lamináru a poté na ně bylo naneseno 20 μΐ suspenze viru. Poté byly disky přitisknuty na CAM devíti nebo desetidenních kuřecích embryí, zalepeny celofánovou páskou a inkubovány 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. Poté bylo k CAM přidáno buď samotné PBS, nebo růstové faktory v koncentraci 5 pg/ml ve 20 μΐ objemu k příslušné virové dávce jako další posilovač účinku viru v tkáni CAM. Po 72 hodinách byly CAM sebrány a změny v angiogenním indexu byly stanoveny pomocí dvou slepých odčítání počtu rozvětvení cév v CAM ležícím pod diskem. Pro kinázovou techniku byla tkáň ležící pod diskem odebrána do RIPA homogenizována pomocí motorizovaného mixéru a Src byla pomocí imunoprecipitace vybrána z příslušného množství celkového proteinu a použita v in vitro kinázové technice využívající FAK-GST tužní protein jako substrát. Pro imunofluorescenční studii byla tkáň CAM ležící pod diskem zamražena v OCT, nařezána na 4 pm řezy, fixována v acetonu po dobu 1 minuty, inkubována ve 3 % normálního kozího séra po dobu 1 hodina následně inkubována s primární králičí protilátkou anti-fosforylované ERK, jak je popsáno v Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140:1255-1263 (1998), promyta v PBS a označena fluorescenčně značenou sekundární protilátkou.

-34CZ 304320 B6

A. Aktivace endogenního Src pomocí bFGF nebo VEGF

Pro stanovení účinku růstových faktorů na aktivitu Src při ovlivnění angiogeneze byla použita následující technika. Tkáňové extrakty z desetidenních kuřecích CAM, které byly vystaveny účinkům bFGF nebo VEGF (2 pg/ml po dobu 2 hodin) byly lyžovány. Endogenní Src bylo pomocí imunoprecipitace vybráno z příslušného množství celkového proteinu a použita v in vitro kinázové technice využívající FAK-GST fuzní protein jako substrát, rozděleno pomocí elektroforézy a převedeno na nitrocelulózu. Výsledky této techniky jsou zobrazeny na obr. č. 5, kde je patrný nárůst aktivity Src v dráze ovlivněné buď bFGF, nebo VEGF ve srovnání s kontrolními vzorky, které ukazují běžnou aktivitu Src v normální CSM tkáni. Jak bFGF, tak VEGF způsobují asi dvojnásobný nárůst aktivity endogenní Src nacházející se v CAM. Výše popisovaný kinázový blot byl také značen pomocí anti-Src protilátky pro kontrolu nanesení ekvivalentu Src a obsahuje IgG.

B. Účinek retrovirem vyvolané genové exprese SrcA na angiogenezi v kuřecích CAM

Následující techniky testovala vliv mutovaných Src proteinů na angiogenezi kuřecích CAM. V této technice byly devítidenní kuřecí CAM vystaveny účinkům RCAS-SrcA nebo RCAS-GFP expresním retrovirům nebo pufru po dobu 72 hodin a detekce probíhala tak, jak je popsáno výše. Výsledky této techniky jsou zobrazeny na obr. č. 6a, kdy angiogeneze je kvantifikována pomocí výše popsaných postupů. Reprezentativní mikrofotografie (4x) byly získány pomocí stereomikroskopu, jak ukazuje obr. č. 6b. Základní aktivita normální endogenní Src má angiogenní index přibližně 50. Naopak, CAM vystavené vlivu retrovirového vektoru zajišťujícího expresi RCAS-SrcA s bodovou mutací v aminokyselině na pozici 527, kde je tyrosin zaměněn za fenylalanin, vede ke zvýšení (indukci) angiogeneze a angiogenní index je přibližně 90. Zvýšení angiogeneze vyvolané pomocí SrcA je rovněž zřejmé z fotografií uveřejněných na obr. č. 6b.

C. Retrovirová exprese SrcA aktivuje fosforylaci vaskulámí MAP kinázy

Byl sledován vliv SrcA a srovnán s vlivem růstových faktorů VEGF a PMA na fosforylaci vaskulámí MAP kinázy pomocí následujících technik a technik popsaných výše. Tkáňové extrakty desetidenních kuřecích CAM vystavených působením VEGF nebo PMA (jiný mitogen ve srovnatelné koncentraci) po dobu 30 minut byly srovnávány s CAM infikovanými pomocí retroviru zajišťujícího expresi SRCA po 48 hodinách. Endogenní Src bylo pomocí imunoprecipitace vybráno z příslušného množství celkového proteinu a použita v in vitro kinázové technice využívající FAK-GST fúzní protein jako substrát, rozděleno pomocí elektroforézy a převedeno na nitrocelulózu.

Výsledky této techniky jsou uvedeny na obr. č. 7a, kde neovlivněné CAM (NT) vykazují obvyklou míru fosforylace vaskulámí MAP kinázy vyvolané endogenním Src. Jak VEGF, tak PMA vedou k zhruba dvojnásobnému nárůstu nad normál. Oproti tomu SrcA zvyšuje aktivitu asi na pěti až desetinásobek neovlivněného vzorku. Alikvoty výše popsaného tkáňového lyzátu byly rovněž použity pro stanovení fosforylace endogenní ERK pomocí imunoblotu s anti-fosfo-ERK protilátkou, jak je uvedeno na obr. č. 7b. Pro tento experiment byly desetidenní CAM infikovány buď prázdným RCAS, nebo RCAS zajišťujícím expresi SrcA. Po dvou dnech byla tkáň CAM zamražena v OCT, nařezána na 4pm řezy. Řezy byly inkubovány s protilátkou anti-fosforylované ERK (Nwe England Biolabs), promyta v PBS a označena pomocí kozí anti—králičí fluorescenčně značené sekundární protilátky. Fluorescenční obrázky byly získány chlazenou CCD kamerou (Princeton Inst.). Mikrofotografie ukazují zvýšenou imunofluorescenci ve vzorcích ošetřených SrcA po srovnání s kontrolními vzorky.

D. Selektivní požadavky pro aktivitu Src během angiogeneze vyvolané VEGF, ale ne bFGF

Pro stanovení vlivu modulační aktivity Src na angiogenezi vyvolanou růstovými faktory byla použita následující technika. Devítidenní kuřecí CAM byly vystaveny preparátu retrovirového

-35 CZ 304320 B6 vektoru, který zajišťoval expresi dominantně negativní mutace Src označované jako Src251 nebo Src K295M, jak bylo popsáno výše. CAM byly inkubovány s RCAS-Src251 nebo kontrolními RCAS-GFP retroviry po dobu 20 hodin a poté inkubovány dalších 72 hodin v přítomnosti nebo absenci bFGF nebo VEGF.

Míra angiogeneze kvantifikovaná tak, jak bylo popsáno výše, je uvedena na obr. č. 8a. Reprezentativní mikrofotografie (6 x uvedené na obr. č, 8b) byly získány pomocí stereomikroskopu. Obr. č. 8c ukazuje blot označený pomocí anti-Src protilátky potvrzující expresi Src251 vtransfekovaných buňkách ve srovnání s negativní kontrolou. Výsledky těchto technik popsaných výše, že jak bFGF, tak VEGF ošetřené CAM v přítomnosti RACS-GFP kontrolují indukci angiogeneze přes míru angiogeneze vyvolané Src, která byla pozorovatelná u negativních kontrol nebo neinkubovaných CAM preparátů. Exprimovaný dominantně negativní mutant Src251 byl účinný při inhibici VEGF indukované angiogeneze zpátky na základní hladinu, ale nebyl účinný pro potlačení angiogeneze vyvolané bFGF. Mikrofotografie uvedené na obr. č. 8b potvrzují údaje obr. č. 8a. Tedy, díky retrovirům exprimovaných Src251 je účinný inhibitor angiogeneze v případě, že angiogeneze je vyvolána VEGF.

Aplikace proteinu Src podle navrhovaného vynálezu i v jiných modelech angiogeneze, jak je popsáno v následujících příkladech, spadá rovněž do rámce navrhovaného vynálezu.

Příklad 5. Potlačení růstu nádorové tkáně pomocí modulátorů Src, jak bylo stanoveno pomocí modelové techniky v oku králíka in vivo

Vliv modulačních proteinů Src na angiogenezí vyvolanou růstovými faktory může být pozorován v přirozeně průhledných strukturách jako například na rohovce oka. Nové krevní cévy rostou od okraje rohovky, která je bohatě krevně zásobena, směrem k jejímu centru, které obvykle nemá dostatečné krevní zásobení. Stimulátory angiogeneze, jako je bFGF po aplikaci na rohovku vyvolají růst nových krevních cév z okraje. Antagonisté angiogeneze po aplikaci na rohovku potlačí růst nových krevních cév vyrůstajíccích z okraje rohovky. Tedy, v rohovce probíhá angiogeneze jako invaze indotheliálních buněk z okraje rohovky směrem do tuhé kolagenem naplněné tkáně rohovky, což je velmi dobře viditelné. Na modelu králičího oka je tedy v in vivo systému velmi dobře pozorovatelná stimulace nebo inhibice angiogeneze následující po implantaci látek podle navrhovaného vynálezu na rohovku v oku.

A. Model králičího oka in vivo představuje vhodný model pro sledování angiogeneze indukované růstovými faktory

Angiogeneze je indukována in vivo v oku králíka pomocí růstových faktorů bFGF nebo VEGF, jak je popsáno v následujících odstavcích.

Podle popisu v D'Amato et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085, 1994, byly připraveny pelety polymeru obsahujícího růstové faktory. Každá peleta obsahovala 650 ng růstových faktorů navázaných na sukralfát (Carafed, Marion Merrel Dow Corp.) tak, aby byl růstový faktor stabilizován a bylo zjištěno jeho pomalé uvolňování do přilehlé tkáně. Kromě toho byly připraveny pelety polymerů obsahující požadovaný retrovirus zajišťující expresi Src, jak bylo popsáno výše. Pelety jsou použity ve speciálně připravených v teflonových kapslích, které obsahují 2,5mm jádro. Asi 12 μΐ materiálu je umístěno do každé kapsle a polymerizace probíhá přes noc ve sterilním prostředí. Pelety jsou poté vy sterilizovány pomocí ultrafialového záření. Účinky proteinů Src jsou potom stanoveny pomocí výše popsaných technik.

-36CZ 304320 B6

Příklad 6. Potlačení růstu nádorové tkáně in vivo pomocí proteinů Src u chimér myš:člověk

In vivo chimemí model myšičlověk je připraven nahrazením části pokožky myší kmene SCID lidskou neonatální pokožkou. Tento in vivo chimemí model myš člověk je připraven podle popisu Yan et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). Přibližně 2 cm² pokožky je chirurgicky odstraněno z myši kmene SCID ve věku 6 až 8 týdnů a nahrazeno lidskou neonatální pokožkou. Myš je uspána a oholena v ploše asi 5 cm² z každé strany v laterálně abdominální oblasti. Dva kruhové štěpy o ploše asi 2 cm² jsou připraveny odstraněním pokožky o plné tloušťce až na úroveň facie. Lidské kožní štěpy o plné tloušťce a stejné velikosti odvozené z lidské neonatální pokožky jsou umístěny a na místo jsou přišity. Štěp je překryt pomocí obvazu, který je připevněn k pokožce. Pro překrytí zranění je také použita mikropórová krycí páska. Lidská melanomová buněčná linie M21-L nebo linie karcinomu prsu MDA 23.1 (ATCC HTB 26, α_νβ3 negativní pomocí imunoreaktivity v tkáňové sekci mAb LM 609), jsou testované formy solidních lidských nádorů, které byly aplikovány na lidské štěpy na SCID myších. Buněčná suspenze 5 χ 10⁶ buněk M21-L nebo MDA 23.1 byla injikována interdermálně do lidského kožního štěpu. Myši byly poté pozorovány 2 až 4 týdny, aby byl umožněn růst měřitelných lidských nádorů. Jakmile je zřetelný a měřitelný nádor patrný, je myši do ocasní žíly injekcí aplikován prostředek obsahující retrovirus podle navrhovaného vynálezu nebo PBS. Po 2 až 3 týdnech je nádor vyjmut a zvážen a je provedena histologická analýza. Nakonec je stanoven vyli exprimovaného proteinu Src na příslušný nádor.

Příklad 7. In vitro potlačení růstu lidského nádoru pomocí proteinu Src, stanovením pomocí CAM techniky

Růst nádoru je závislý na angiogenezi (Lolkman, 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-10934, Weidner et al., 1991, Ν. E. J. Med. 324:1-8, Brooks et al., 1994, Cell 79:1157-1164). Nejnovější publikace ukazují, že růst nádoru je možné ovlivnit pomocí antagonistů VEGF receptorů, které mají protiangiogenní účinky (Kim et al., 1993, Nátuře 362:8451-844). Ujišťovali jsme, zda potlačení angiogeneze aplikací deletované kinázy Src251 ovlivní růst lidského meduloblastomu (DAOY), vysoce angiogenního nádoru, o kterém je známé, že produkuje VEGF a velmi malé množství bFGF. Na kuřecích CAM byla třetí a šestý den prováděna technika růstu meduloblastomu DAOY stejně, jak bylo popsáno dříve (Brooks et al., 1994, viz výše). Buňky DAOY v množství 5 χ 10⁶ inkubované v RPMI 1640 obsahujícím 10% fetálního telecího séra bylo promyto a přeneseno na CAM desetidenního embrya tak, aby vznikly DAOY nádorové fragmenty. Po sedmi dnech 50 mg nádorových fragmentů bylo vyoperováno a přeneseno na další embryo a inkubováno další tri až šest dní zároveň s povrchovou aplikací (25 μΐ) buď kontrolního RCAS-GFP retroviru RCAS-Src251, nebo bez léčby. Pomocí konfokálního zobrazení celé tkáně příslušného nádoru jsme byli schopni stanovit, zda dochází k dostatečné expresi RCAS konstruktu v okolí a uvnitř nádorových fragmentů po této povrchové aplikaci. Nádor byl odstraněn a zvážen ve dvou slepých pokusech, a to tak, že byla vyjmuta pouze jednoznačně definovatelná nádorová hmota (Brooks et al., 1194, viz. výše). Hmotnost syrového nádoru po třech nebo šesti dnech byla srovnána s původní hmotností a procentuální hmotnosti byly stanoveny pro každou jednotlivou skupinu. Tyto nádory rostoucí na CAM a vyvolávající aktivní angiogenezi (obr. č. 9) nám umožňují selektivně směrovat ptačí specifický RCAS retrovirus do ptačího nádoru pocházejícího z vaskulární tkáně.

Obr. č. 9 ukazuje výsledky prokazující, že doručení retroviru RCAS-Src251 do lidského nádoru rostoucího na kuřecím CAM je schopno zvrátit růst nádoru. Obr. č. 9a ukazuje lidský meduloblastom, který narostl na kuřecích embryích tak, jak bylo popsáno výše. Retroviry obsahující RCA-GFP nebo RCAS-Src251 byli povrchově aplikována na nádory narostlé do velikosti více než 50 mg. Reprezentativní fotografie fragmentu meduloblastomu infikovaného RCAS-GFP exprimujícího dokazuje exklusivní expresi v nádorových cévách (označeno šipkou), jak bylo zjištěno pomocí optických sekcí na BioRad konfokálním skenovacím mikroskopu (značka = 500 pm). Obr. č. 9b ukazuje výsledky nádorů ošetřených, jak bylo uvedeno výše, které rostly tři až

-37CZ 304320 B6 šest dní, načež byly vyoperovány a byla stanovena jejich surová hmotnost. Data jsou vynesena jako průměrná změna hmotnosti nádoru (odlišující se od 50 mg - výchozí hmotnosti nádoru) +/směrodatná odchylka dvou opakování. RCAS-Src251 měl podstatný vliv na růst po třech dnech (*, P<0,002) a po šesti dnech (**, P<0,005). Obr. č. 9c ukazuje reprezentativní mikrofotografie meduloblastomu chirurgicky odstraněného z embryí, které byly získány pomocí stereomikroskopu Olympus (značka = 350 pm). (spodní panel) Mikrofotografie jednotlivých nádorů s velkým zvětšením ukazuje vaskulaturu příslušných nádorů v detailu (značka = 350 pm). Šipka ukazuje porušení krevních cév v nádorech ošetřených RCAS-Src251. Výsledky ukazují, že aplikace RCAS obsahujícího Src251 do narostlých meduloblastomů vede k selektivně virové expresi v krevních cévách uvnitř nádoru (obr. č. 9a), a to podstatně vede ke zpomalení růstu těchto nádorů během šesti dnů (obr. č. 9b). Je důležité, že krevní cévy uvnitř nádoru u zvířat léčených pomocí viru obsahujícího Src251 byly poškozené a podstatně méně rozvinuté co do počtu vzhledem k nádorové vakulatuře kontrolních zvířat (obr. č. 9c). Fakt, že nádory infikované RCASGFP vykazují lokalizaci GFP pouze v nádorové vaskulatuře ukazuje, že protinádorový účinek pozorovaný u retrovirem přenášené sekvence Src251 je dán jeho účinky zabraňující angiogenezi.

Příklad 8. Nezbytnost Src pro přežití endotheliálních buněk během angiogeneze vyvolané VGEF, ale ne bFGF

Nejnovější důkazy ukazují, že receptory růstových faktorů (Choi and Ballermann, 1995, J. Biol. Chem., 270:21144-21150, Satake et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm., 244:642-646) a integriny (Meredith et al., 1993, Mol. Biol. Cell., 4:953-961., Brooks et al., 1994 a, Science, 264:569-571) posilují přežívání angiogenních endotheliálních buněk. Fakt, že jak růstové faktory, tak adhezivní receptory rovněž ovlivňují aktivitu Src, ukazuje na možnou úlohu Src v přežívání endotheliálních buněk během angiogeneze. CAM stimulované pomocí bFGF nebo VEGF byly infikovány retrovirem obsahujícím Src251 a zmrazené řezy těchto tkání byly testovány na přítomných apoptotických buněk.

Obecně kryořezy CAM ošetřené RCAS-GFP nebo RCAS-Src251 inkubované s bFGF nebo VEGF byly porovnávány na přítomnost apoptotických buněk pomocí sady Apoptotag (Oncor Gaitherzburg, MD). Tyto řezy byly rovněž značené pomocí králičí polyklonální anti-vWf (biogenix, San Ramon, CA) a označeny pomocí jednoho pg/ml DAPI. Fluorescenční obrázky byly získány pomocí chlazené CCD kamery (Roper, Trenton, NJ) a poté byly upraveny a srovnány výsledky z různých experimentálních zásahů, jak bylo popsáno dříve (Ellcelri et al., 1998, viz výše).

Pro stanovení apoptotického indexu v retrovirem infikované tkáni CAM byl annexin V konjugovaný s FITC (Clontech, Palo Alto, CA) použit pro značení buněčné suspenze a promyté buňky byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Buněčné suspenze CAM buněk byly připraveny z negativních kontrol i virem infikovaných CAM po naštěpení nadrobno rozstříhané tkáně CAM 0,1 % kolagenázou typu IV (Worthington Biochemicals, Fakewood, NJ), v RPMI 1640 po dobu 1 hodiny při 37 °C, jak bylo popsáno výše (Brooks et al., 1994, b) a přefiltrovány přes 100 pM nylonový filtr (Becton Dickinson, Fountain Fakes, NJ). Fluorescence byla měřena pomocí průtokového cytometru (Becton Dickinson) při počtu 10 000) buněk.

Měření vWf značení pomocí faxu probíhalo souběžně s kolagenázou naštěpenou CAM tkání, která byla fixována 1,8 % paraformaldehydem, permeabilizována v 70 % methanolu, inkubována s anti-vWf protilátkou a detekována pomocí sekundární protilátky s připojeným FITC.

Aplikace Src251 způsobí výrazné značení technikou TUNEF v krevních cévách pozitivních pro antigeny příbuzné faktoru VIII (von Willebrandův faktor = vWf) u CAM stimulovaných VEGF, ale ne bFGF. Fakticky minimální míra apoptózy byla pozorována u dalších buněčných typů v CAM, což ukazuje, že Src kinázová aktivita zajišťující přežívání buněk v krevních cévách aktivovaných VEGF má vysokou specifitu pro endotheliální buňky. V další sérii experimentů

-38CZ 304320 B6 retrovirem infikované CAM stimulované pomocí VEGF nebo bFGF byly nejprve natráveny kolagenázou tak, aby bylo možno připravit buněčnou suspenzi. Takto získaná suspenze buněk pocházející z CAM obsahuje přibližně 20 až 50 % endotheliálních buněk v Wf pozitivních a byla analyzována na přítomnost apoptotických buněk pomocí průtokové cytometrie značením annexinem V, který značí časně apoptotické buňky. Buňky získané z CAM infikovaných Src251 a stimulovaných VEGF vykázaly podstatný nárůst značení annexinem V v porovnání s buňkami infikovanými RCAS-GFP pocházejícími z ACM stimulovaných VEGF. Naopak buňky za slepě infikovaných CAM nebo buňky infikované RCAS-Src251 a stimulované pomocí bFGF vykázaly minimální nebo žádné značení annexinem V. Žádné značení annexinem nebylo rovněž prokazatelné u buněk připravených z nestimulovaných nebo bFGF stimulovaných CAM. Tato data prokazují, že kinázová aktivita Src je selektivně nezbytná pro přežívání endotheliálních buněk v CAM během angiogeneze vyvolané VEGF, ale ne bFGF.

Příklad 9. Selektivní požadavky na aktivitu Src kinázy v podkožním myším modelu angiogeneze

Pro další analýzu úlohy Src v angiogenezí byl použit myší model. V tomto případě byla angiogeneze indukována podkožní injekcí Matrigelu zbaveného růstových faktorů a doplněného buď bFGF (100 ng/ml), nebo VEGF (400 ng/ml) u athymických myší wehl (nu/nu) a analyzována po pěti dnech (Passaniti et al., 1992). Angiogeneze byla kvantifikována odstraněním a homogenizací tkáně, izolací proteinů a imunoblotem s protilátkami proti VEGF receptorů (flk—1) (obr. č. 13a), které jsou specifické pro endotheliální buňky. Stejně, jako bylo zjištěno u kuřat, exprese cDNA kódující deletovanou kinázu Src251 blokuje u tohoto myšího modelu angiogenezí vyvolanou VEGF, ale nemá žádný vliv na angiogenezí vyvolanou bFGF (obr. č. 13b). Pro stanovení úlohy endogenního Src v tomto modelu byly tkáně infikovány retrovirem zajišťujícím expresi Cak, který inhibuje aktivitu endogenního Src pomocí fosforylace c-koncového regulačního místa (Nada et al., 1991, Nátuře, 361:68-72). Exprese Cak blokuje angiogenezí vyvolanou VEGF, ale ne bFGF (obr. č. 13), což potvrzuje úlohu aktivity endogenního Src při angiogenezí vyvolané VEGF.

Neovaskularizace těchto tkání stimulovaných VEGF a infikovaných virem byla potvrzena přímou imunofluorescenční pomocí FITC značené anti-DC34 (obr. č. 13) nebo pomocí anti-flk-1-protilátky a kvantifikována podle počtu pozitivně značených CD34 krevních buněk v jednotlivých zmražených řezech (obr. č. 13c).

Obecně, angiogeneze byla indukována pomocí podkožní injekce Matrigelu zbaveného růstových faktorů obsahujícího solný roztok nebo VEGF (400 ng/ml) zároveň 2 χ 10⁶ podpůrných buněk exprimujících GFP retrovirus do boku athymických wahl (nu/nu) myší a analyzována po pěti dnech inkubace. Angiogeneze byla kvantifikována pomocí imunoblotu s protilátkou proti receptoru VEGF (flk—1), která je specifická pro endotheliální buňky. Na obr. č. 15a jsou uvedeny výsledky imunoblotu. Vliv deletované kinázy Src251, Csk, nebo GFP retrovirů na angiogenezí vyvolanou VEGF (400 ng/ml) nebo bFGF (400 ng/ml) byl analyzován pomocí imunoblotu tkáňového lyzátu pomocí anti-fik-1 protilátky. Příklady těchto výsledků jsou zobrazeny na obr. č. 15b. Vliv retrovirů zajišťujících expresi Src251 anebo Csk na neovaskularizaci vyvolanou VEGF byl kvantifikován pomocí počtu CD34 pozitivních buněk v tkáňových řezech, které byly značeny pomocí nepřímé imunofluorescence a počítány ve třech opakováních v náhodném poli při zvětšení dvacetkrát. Řezy byly rovněž použity pro imunofluorescenční značení anti-CD34 protilátkou nebo anti-flk-1 protilátkou, vyfotografovány a kvantifikovány stejně, jak bylo popsáno výše v případě CAM technik.

Kompletní detekce přímé fluorescence nádorového fragmentu infikovaného RCAS-GFP byla získána vyjmutím nádorového fragmentu a zobrazením nefixované tkáně přímo pomocí laserové konfokální mikroskopie (MRC 1024, BioRad, Hercules, CA).

-39CZ 304320 B6

Příklad 10. Vliv intradermální exprese VEGF v uších Src-/- nebo Src+/- myší

V návaznosti na výsledky získané z kuřecího a myšího modelu angiogeneze, přímé genetické postupy byly použity pro sledování intradermální angiogeneze indukované VEGF u Src-/- myší. Rovněž testován byl vliv na vaskulámí permeabilitu, neboť o VEGF je známo, že nejen aktivuje růst cév, ale zároveň zvyšuje vaskulámí permeabilitu (Senger et al., 1983, Science, 218:983-985, Ferreraand Davis-Smith, 1997, Endocr. Ref., 16:4-25).

Intradermální injekce adenovirů zajišťujících expresi lidského VEGF byly aplikovány od uší Src-/- a Src+/- myší, zatímco kontrolní adenovirus zajišťující expresi β-galaktosidázy byl pomocí injekce aplikován do druhého ucha každé myši. Růst nových cév vyvolaný VEGF v uších Src+/- myší byl poprvé detekovatelný po 48 hodinách a neovaskularizace byla analyzována po pěti dnech.

Obecně, byly připraveny deficitní myši (129/8V/Ev x C57B16/J) v pp60^{c Src}. pp60^{c Ycs}, pp60^{c lyn} podle dříve popsaných technik (Soriano et al., 1991, Cell, 64:693-702). Další dávky byly získány z Jackson Labs. Myší uši byly injikovány intradermálně (Eriksson et al., 1980, Microvass. Res., 19:374-378) s 5 μΙ adenoviru zajišťujícího expresi buď VEGF, nebo β-galaktosidázy a uši byly vyfotografovány po pěti dnech pomocí stereomikroskopu. Bylo zjištěno, v X-gal značených uších předem injikovaných adenovirem zajišťujícím expresi β-galaktosidázy, že míra exprese u Src+/- a Src-/- je stejná. V případě uší Src-/- injikovaných VEGF nebyl prokázán žádný měřitelný nárůst angiogeneze pomocí stanovování rozvětvení (p<0,05). Překvapivě nej zřetelnější fenotypový znak těchto zvířat byla naprostá blokáda vaskulámí propustnosti ve srovnání s ušima myší Src+/- po injekci VEGF. Sledování uší injikovaných VEGF potvrdilo nárůst vaskulámí propustnosti Src+/- myší, zatímco v Src-/- myších zcela schází. Vaskulámí propustnost u těchto zvířat naznačuje, že aktivita vaskulámí permeability, kterou je možné in vivo spojovat s angiogenezí (Dvorak et al., 1995, Am. J. Pathol., 148:1029-1039), může být selektivně narušen u pp60^{c Src} deficitních myší.

Přikladli. VEGF není schopné porušit krevně mozkovou bariéru u myších postrádajících pp60^cSrc

Mozková vaskulatura je charakteristická vysoce restriktivní krevně mozkovou bariérou, která brání malým molekulám pronikat z cév do přilehlé mozkové tkáně. Nádory rostoucího mozku mohou porušit tuto bariéru zejména díky produkci angiogenního růstového faktoru, kterým může být VEGF. Proto jsme sledovali povahu krevně mozkové bariéry u Src+/- nebo Src-/- myší. V tomto případě byl VEGF nebo fyziologický roztok stereotakticky aplikován do pravé nebo levé hemisféry mozku. Všechny myši obdržely systémové injekce Evansovy modři pro sledování aktivity vaskulámí permeability.

Obecně, fyziologický roztok nebo VEGF (200 ng ve 2 μΐ) byly aplikovány stereotakticky do levého nebo pravého frontálního laloku 92 mm nalevo nebo napravo od střední osy, 0,5 mm rostrálně od průsečíku švu šípového a věnčitého a 3 mm do hloubky od tvrdé pleny mozkové. Zvířata dostala 30 minut po injekci intravenózně dávku roztoku Evansovy modři, jak bylo popsáno výše. Po dalších 30 minutách byly myši promyty a mozky byly vyjmuty. Fluorescence Evansovy modři byla pozorována pomocí laserového konfokálního mikroskopu na čerstvých nefixováných zamražených řezech z mozků.

Vaskulámí propustnost byla lokalizována v hemisféře, do které bylo injikováno VEGF u Src+/myší, ale v případě Src-/- myší nebyla prokázána žádná vaskulámí propustnost. Byl to rovněž případ, kdy sledování vaskulámí permeability bylo stanovováno pomocí nahromadění Evansovy modři a detekováno epifluorescenční analýzou zamražených řezů těchto mozků. VEGF tedy narušuje krevně mozkovou bariéru způsobem, kterýje závislý na aktivních funkcí pp60^{c Src}.

-40CZ 304320 B6

Příklad 12. Vaskulámí permeabilita vyvolaná VEGF, ale už ne vaskulámí permeabilita spojená se zánětem, je závislá na pp60^{c Src}

Pro další analýzu a kvantifikaci účinku VEGF jako faktoru ovlivňujícího vaskulámí permeabilitu u Src+/- nebo Src-/- myší byla použita Milesova technika (Miles and Miles, 1952) pro kvantitativní stanovení vaskulámí permeability v pokožce těchto zvířat. VEGF bylo aplikováno intradermálně u Src+/- nebo Src-/- myší, kterým byla podána intravenózní systémová injekce Evansovy modři. Během 15 minut po injekci VEGF došlo k trojnásobnému nárůstu vaskulámí permeability u Src+/- myší. Přesto u Src-/- myší nebyl pozorovatelný žádný nárůst vaskulámí permeability. Míra zabarvení injikovaných kožních oblastí byla kvantifikována a srovnána s kontrolními vzorky a bFGF. Kontroly injikované bFGF nebo fyziologickým roztokem na rozdíl od VEGF neprokázaly žádný nárůst ve vaskulámí permeabilitě. Milesova technika (Miles et al., 1962) byla přizpůsobena pro myši injikované 10 μΐ VEGF (400 ng/ml), alylizothiokyanátem (hořčičný olej, 20 % hmotnosti v minerálním oleji) nebo fyziologickým roztokem intradermálně u myší, kterým předem bylo aplikováno intravenózně 100 μΐ 0,5 % Evansovy modři. Po 15 minutách byly vyjmuty kožní vzorky, fotografovány, promyty ve formalínu při 5 8 °C a vzniklý roztok byl kvantifikován pomocí spektrofotometru.

Vaskulámí propustnost/permeabilitu se zvyšuje i během zánětu, což umožňuje akumulaci adhezivních proteinů a prozánětlivých buněk v tkáni. Je pravdou, že prozánětlivé signály samy o sobě zvyšují vaskulámí propustnost. Jedna z látek vyvolávajících záněty, alylizothiokyanát, známý také jako hořčičný olej (Inoue et al., 1997, viz. výše), byla testována u Src+/- nebo Src-/myší vzhledem ke své schopnosti zvyšovat vaskulámí permeabilitu. Na rozdíl od pozorování u Src-/- myší stimulovaných VEGF, nebyl pozorován nárůst vaskulámí permeability po injekci látky vyvolávající zánět alylizothiokyanátu. Z toho vyplývá, že Src hraje klíčovou roli při zvyšování vaskulámí permeability pomocí VEGF, ale není schopné ovlivnit vaskulámí permeabilitu spojenou se zánětlivými procesy.

Příklad 13. Vaskulámí permeabilita vyvolaná VEGF závisí na Src a Yes, ale ne na Fyn

Specifita požadavků Src pro aktivaci vaskulámí permeability byla testována pomocí vaskulámí permeability vyvolané VEGF spojené se SFK, jako jsou Fyn nebo Yes, které, podobně jako Src, jsou exprimovány endotheliálními buňkami (Bull et al., 1994, FEBS Letters, 361:41 -44, Kiefer et al., 1994, Curr. Biol. 4:100-109). Bylo potvrzeno, že tyto tři SFK jsou exprimovány rovnoměrně v aortách myší divokého typu podobně jako Src-/- myši zvířata deficitní na Yes mají defekt při zvyšování vaskulámí permeability pomocí VEGF. Překvapivě myši postrádající Fyn jsou schopny prudce měnit vaskulámí permeabilitu v reakci na VEGF, a to takovou měrou, která se neliší od kontrolních zvířat. Zablokování indukce vaskulámí permeability pomocí VEGF u Src-/- nebo Yes-/-myší prokazuje, že kinázová aktivita specifických SFK je nezbytná pro signalizaci prostřednictvím VEGF a umožňuje ovlivnění vaskulámí permeability, ale ne angiogeneze. Ovlivnění vaskulámí permeability pomocí VEGF v pokožce Src+/- (obr. č. 14a, levý obrázek) nebo Src-/- (obr. č. 14a, pravý obrázek) myší bylo stanovováno intradermální aplikací PBS nebo VEGF (400 ng) do myší, kterým byla intravenózně podána Evansova modř. Po 15 minutách byly kožní vzorky fotografovány (měřítko - 1 mm). Hvězdička označuje místo injekce. Oblast přilehlá k místu aplikace VEGF, bFGF nebo PBS vyjmuta a vaskulámí permeability byla kvantifikována vymytím Evansovy modře ve formamidu (58 °C, 24 hodin) a absorbance byla stanovována při 500 nm (obr. č. 14b, levý graf). Schopnost látky vyvolávající zánět (alylizothiokyanát), o které je známé, že vyvolává zánět a zvyšuje vaskulámí permeabilitu, byla testována u Src+/- nebo Src-/myší (obr. 14b vpravo).

Schopnost VEGF zvyšovat vaskulámí permeabilitu byla porovnávána u Src-/-, Fyn -/- nebo Yes-/- myší pomocí Milesovy techniky (obr. č. 14c). Údaje z jednotlivých měření Milesovou technikou jsou vyneseny jako průměr ± směrodatná odchylka z tří nezávislých opakování.

-41 CZ 304320 B6

Zvířata Src-/- a Yes-/- defektní při vyvolání vaskulární permeability byla srovnávána s kontrolními zvířaty na statistickou odchylku (*p<0,05, dvojvýběrový t-test), přičemž poruchy vaskulární permeability po injekci VEGF ani u Fyn-/-, ani u alylizothiokyanátem ošetření Src+/myší nebyly statisticky významné (**p<0,05).

Příklad 14. Myši po aplikaci inhibitorů tyrosin kináz rodiny Src a Src-/- myši vykazují snížené poškození tkáně během traumatu nebo poranění krevních cév než neošetřené myši divokého typu

Specifická aplikace inhibitorů tyrosin kináz rodiny Src slouží k potlačení patologické propustnosti cév a permeability během poranění cév při poruchách, jakými je například mrtvice. Vaskulární endothelium je dynamický buněčný typ, který reaguje na řadu podnětů různými způsoby, jako je například oddělení nové krevní cévy během angiogeneze v nádoru nebo regulace permeability cévní stěny během mrtvicí vyvolaného otoku a poškození tkáně.

Snížení vaskulární permeability u dvou modelů myší mrtvice pomocí inhibice aktivační dráhy Src pomocí léčiv je dostatečné pro zabránění poškození mozku snížením propustností cév vyvolaným ischemií. Navíc, u myší geneticky deficitních v Src, které mají sníženou vaskulární propustnost, je rovněž snížen objem infarktu. Kombinací údajů získaných se syntetickými Src inhibitory s dalšími genetickými důkazy o snížené vaskulární propustnosti během mrtvice a dalších podobných modelů dokazují fyziologickou relevanci těchto postupů při snižování poškození mozku během mrtvice. Inhibici těchto signalizačních drah pomocí celé řady dostupných inhibitorů tyrosin kináz rodiny Src, které zablokují tuto signalizační kaskádu, má podstatný léčebný přínos při ochraně mozku při poškození způsobeným zvýšenou propustností cév.

Pro indukci fokální mozkové ischemie byly použity dvě různé techniky. Oba zvířecí modely fokální cerebrální ischemie jsou dobře definované a široce používané při výzkumu mrtvice. Oba modely byly již dříve používány pro výzkum patofyziologie mozkové ischemie stejně jako pro testování nových léčiv proti mrtvici.

A) Myši byly uspány pomocí avertinu a tělesná teplota byla udržována udržováním zvířat na vyhřívané podložce. Byl proveden řez mezi pravým uchem a pravým okem. Z lebky byl oddělen spánkový sval a malá dírka byla vyvrtána v oblasti nad střední mozkovou tepnou (MCA). Mozkové pleny byly odstraněny a pravá MCA byla ucpána pomocí koagulace krve zahřívacím vláknem. Zvířata byla probuzena a navrácena do klecí. Po 24 hodinách byly mozky promyty, vyjmuty a nařezány na 1 mm řezy. Řezy byly zality do 2 % 2,3,5-trifenyltetrazolchloridu (TTC) a část mozku postižená infarktem byla identifikována jako neoznačená (bílá) tkáň obklopená živou (červenou) tkání. Objem infarktu byl definován jako suma neoznačených oblastí v řezech násobenou jejich tloušťkou.

Myši deficitní v Src (Src-/-) byly použity pro studii úlohy Src při mozkové ischemii. Src+/myši sloužily jako kontroly. Zjistili jsme, že Src-/- myši mají snížený objem infarktu z 26 ± 10 mm³ na 16 ± 4 mm³ u kontrol 24 hodin po zásahu. Tento účinek byl ještě posílen, když C57B16 myši divokého typu dostaly 1,5 mg/kg PPI ve formě intraperitoneální injekce 30 minut po uzavření cévy. Velikost infarktu byla potom snížena z 31 ± 12 mm³ v případě neošetřených myší na 8 ± 2 mm³ v případě myší, kterým bylo podáno PPI.

Β) V druhém modelu fokální cerebrální ischemie byla MCA ucpána umístěním ucpávky do MCA. Jeden díl na fibrin bohatého 24 hodin starého homologního strupu byl umístěn k počátku MCA pomocí upraveného PE-50 katétru. Vyvolání cerebrální ischemie bylo prokázáno snížením průtoku krve mozkem v ipsilaterální hemisféře ve srovnání s kontrolaterální hemisférou. Po 24 hodinách byly mozky vyjmuty, byly z nich připraveny řezy, které byly obarveny hematoxilineosinem (HE). Objem infarktů byl stanoven součtem infarktových ploch v sériových řezech násobeno vzdáleností mezi jednotlivými řezy.

-42CZ 304320 B6

Dávky PP používané v této studii (1,5 mg/kg i.p.) byly vybrány empiricky. Je známo, že VEGF je prvně exprimováno asi 3 hodiny po cerebrální ischemii v mozku s maximálním účinkem během 12 až 24 hodin. Této studii bylo PPI podáno 30 minut pro rozběhnutí infarktu tak, aby byl zcela zablokován nárůst vaskulámí permeability vyvolaný VEGF. Podle časového průběhu obvyklé exprese VEGF potenciální terapeutické okno vhodné pro aplikaci inhibitorů Src by mělo být do 12 hodin po mrtvici. U chorob spojených se stabilním nárůstem vaskulámí permeability je vhodnější nepřetržité podávání látek potlačující účinky Src.

Obr. č. 15a je graf zobrazujících srovnání výsledků průměrných objemu infarktů (mm³) v myších mozcích po zranění, kdy myši byly heterozygoti (Src+/-), dominantně negativní Src mutanty (Src-/-), divoké typy myší (WT), nebo divoké typy myší, kterým bylo podáno 1,5 mg/kg (PPI).

Obr. č. 16 ukazuje vzorky sekvenčních MRI skenů izolovaných promytých myších mozků po vyvolání poškození CNS, přičemž progrese skenů u myší ošetřených PPI (vpravo) jednoznačně prokazuje menší infarkt než progrese skenů v případě kontrolních neošetřených myší.

Způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou přizpůsobeny konkrétně pro specifické ovlivnění poškození tkáně vyvolané vaskulámí permeabilitu, neboť cílem je inhibice tyrosin kináz rodiny Src vedoucí ke snížení vaskulámí permeability bez dlouhodobého účinku na další reakce vyvolané VEGF, které mohou být důležité pro hojení zranění. Na rozdíl od neutralizačních VEGF proteinů, inhibice Src neinterferuje s kumulativním angiogenním efektem VEGF, který může být přínosný v pozdějších stádiích choroby.

Použití syntetických inhibitorů s nízkou molekulovou hmotností je obecně bezpečnější a snadněji proveditelné než použití velkých proteinů. Použití rekombinantních proteinů, jako je fúzní protein VEGF receptor - myší imunoglobulin, může být potenciálně nebezpečné a není použitelné pro opakovanou reakci díky vyvolání alergické odpovědi u lidí (vznik lidských antimyších protilátek, HAMA).

Nakonec VEGF není jediným aktivátorem signalizační kaskády vedoucí k Src, i jiné cytokiny jsou zapojené do patofyziologie mozkové ischemie, která může ovlivnit vaskulámí permeabilitu, jako je IF-6 a TNF-α. Tedy inhibice VEGF nemusí nutně potlačit poškození tkáně, které je způsobené aktivací Src. Fakticky snížení velikosti infarktu pomocí PPI je vhodnější než použití antagonistů VEGF, což ukazuje, že jiné signalizační dráhy mohou aktivovat Src kinázy a tím zajistit nárůst vaskulámí permeability.

Výše popsaná specifikace je zamýšlena tak, že umožní odborníkovi v současném stavu techniky pochopit vynález. Navrhovaný vynález nemůže být limitován použitím některých buněčných linií, neboť uvedené varianty jsou pouze jako jednoduché ilustrace aspektů podle navrhovaného vynálezu a jakákoliv buněčná linie, která je použitelná v rámci navrhovaného vynálezu spadá do rámce. Přiložený materiál by měl být natolik jasný, aby umožnil jakéhokoliv aspektu navrhovaného vynálezu včetně nejvhodnějších variant navrhovaného vynálezu a nemůže být brán jako limitace rámce nároků vzhledem ke konkrétním příkladům, které popisuje. Navíc, různé modifikace navrhovaného vynálezu, kromě těch, které jsou ukázány a popsány, budou každému odborníkovi v současném stavu techniky zřejmé po přečtení předcházejícího popisu a rovněž bude zřejmé, že spadají do rámce připojených nároků.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   -43 CZ 304320 B6
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že bílkovina Src je Src-A nebo má na aminokyselinovém zbytku v pozici 527 jakýkoliv aminokyselinový zbytek, kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu, nebo bílkovina Src je neaktivní.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že neaktivní bílkovina Src je Src K295M neboje Src 251.
4. 4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že bílkovina Yes je neaktivní bílkovina Yes.
5. 5. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje neaktivní bílkovinu tyrosin kinázy Yes nebo směs neaktivních bílkovin tyrosin kinázy Src a Yes pro použití ve způsobu ovlivnění vaskulámí permeability ve tkáni postižené projevy nemocí a obsahující kontakt tkáně s terapeuticky účinným množstvím farmaceutického prostředku ovlivňujícím vaskulámí permeabilitu, kde projev nemoci je vybrán ze skupiny sestávající ze škod způsobených mrtvicí, růstu tumorů, infarktu myokardu, arteriosklerózy, edému mozku, cerebrovaskulámích onemocnění nebo traumat, revmatické artritidy, diabetické retinopatie, artritidy, zánětlivých onemocnění, chronického kloubního revmatizmu a psoriázy, restenózy, krvácení mozku, traumatu mozku a páteře, hypoxií vyvolaného poranění mozku a páteře, zánětlivých onemocnění centrálního nervového systému, virových nebo bakteriálních infekcí centrálního nervového systému, autoimunitních onemocnění, onemocnění s chronickým zvýšením propustnosti hematoencefalické bariéry a syndromu respirační tísně dospělých (ARDS) a tvorby metastáz.
6. 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje aktivní bílkovinu tyrosin kinázy Yes nebo směs aktivních bílkovin tyrosin kinázy Src a Yes pro použití ve způsobu ovlivnění vaskulámí permeability ve tkáni postižené projevy nemoci a obsahující kontakt tkáně s farmaceutickým prostředkem v množství terapeuticky účinným pro ovlivňování vaskulámí permeability, kde projev nemoci je vybrán ze skupiny sestávající z ischemických končetin a chronického poranění.
7. 7. Výrobek složený z obalového materiálu a farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř tohoto obalového materiálu, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek je schopný ovlivnit vaskulámí permeabilitu v tkáni postižené projevem nemoci a obalový materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že obsažený farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu projevu nemoci ovlivněním vaskulámí permeability, a kde farmaceutický prostředek obsahuje bílkoviny tyrosin kinázy Src a Yes, ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
8. 8. Výrobek složený z obalového materiálu a farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř tohoto obalového materiálu, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek je schopný ovlivnit vaskulámí permeabilitu v tkáni postižené projevem nemoci a obalový materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že obsažený farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu projevu nemoci ovlivněním vaskulámí permeability, a kde farmaceutický prostředek obsahuje bílkovinu tyrosin kinázy Yes, ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
9. 9. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje inhibitor rodiny tyrozin kináz pro použití ve způsobu zlepšení postižené tkáně související svaskulámím prosakováním nebo edémem, obsahující kontakt tkáně s farmaceutickým prostředkem v množství terapeuticky účinným pro ovlivňování vaskulámí permeability, kde inhibitor rodiny tyrozin kinázy Src je vybrán ze skupiny sestávající z neaktivní bílkoviny Yes, směsi neaktivní bílkoviny Src a neaktivní bílkoviny Yes, a směsi neaktivní bílkoviny Yes a/nebo neaktivní bílkoviny Src společně s chemickým inhibitorem vybraným z PPI, PP2, PD173955, AGF1872, PD162531, Radicicolu R2146 a Geldanamycinu.

   -44CZ 304320 B6
10. 10. Výrobek složený z obalového materiálu a farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř tohoto obalového materiálu, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek je schopný ovlivnit zvýšení vaskulámí permeability vtkáni postižené projevem nemoci, a kde obalový materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že obsažený farmaceutický prostředek

    5 může být použit pro léčbu vaskulárního prosakování nebo edému spojeného s projevy onemocnění, a kde farmaceutický prostředek obsahuje inhibitor rodiny tyrozin kinázy Src a farmaceuticky přijatelný nosič, kde inhibitor rodiny tyrozin kinázy Src je vybrán ze skupiny sestávající z neaktivní bílkoviny Yes, směsi inaktivní bílkoviny Src a inaktivní bílkoviny Yes, směsi inaktivní bílkoviny Yes a/nebo inaktivní bílkoviny Src společně s chemickým inhibitorem ío vybraným z PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicolu R2146 a Galdanamycinu.