ES2537203T3

ES2537203T3 - Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activación linfocitaria (LAG-3) y usos de los mismos

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Publication number: ES2537203T3
Application number: ES09807162.4T
Authority: ES
Inventors: Kent B. Thudium; Alan J. Korman; Heidi Leblanc; Mark Yamanaka; Mark Selby; Kyra D. Zens
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2009-08-11
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2029-08-11
Also published as: WO2010019570A3; US20220204612A1; ZA201101009B; HK1212911A1; EP3597216A1; EP3597216B1; CA2734335C; SMT201500125B; NZ590991A; HRP20200070T8; US11236163B2; KR102121141B1; KR20200068749A; US20190276539A1; US20220195040A1; SG10201706497QA; US20190276538A1; TW201019958A; US20200385467A1; MX2019000094A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une al gen 3 de activación de linfocitos humanos (LAG-3), en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 43.

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activación linfocitaria (LAG-3) y usos de los mismos

5 Antecedentes de la invención

El gen 3 de activación linfocitaria o LAG-3 (también conocido como CD223), es un miembro de la familia supergénica de las inmunoglobulinas y está estructural y genéticamente relacionado con CD4. El LAG-3 no se expresa en linfocitos de la sangre periférica en reposo, pero se expresa en linfocitos T y en linfocitos citolíticos espontáneos. La

10 LAG-3 es una proteína de membrana codificada por un gen localizado en la parte distal del brazo corto del cromosoma 12, cerca del gen CD4, lo que sugiere que el gen LAG-3 puede haber evolucionado mediante duplicación genética (Triebel et al. (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405).

Al igual que el CD4, se ha demostrado que la LAG-3 interacciona con moléculas del MHC de clase II pero, a

15 diferencia del CD4, la LAG-3 no interacciona con la proteína gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana (Baixeras et al. (1992) J. Exp. Med. 176:327-337). Los estudios con una proteína de fusión LAG-3 inmunoglobulínica (sLAG-3Ig) demostraron una unión directa y específica de la LAG-3 al MHC de clase II sobre la superficie celular (Huard et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:1180-1186).

20 En los estudios in vitro de las respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno, la adición de anticuerpos anti-LAG-3 produjo un aumento en la proliferación de linfocitos T, una mayor expresión de antígenos de activación, tales como CD25, y mayores concentraciones de citocinas, tales como interferón gamma e interleucina 4, lo que respalda la teoría de que la interacción entre LAG-/MHC de clase II desempeña una función en la estimulación reductora dependiente del antígeno de linfocitos T CD4+ (Huard et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:3216-3221). Se ha

25 demostrado que la región intracitoplásmica de la LAG-3 interacciona con una proteína llamada LAP, que se cree es una molécula de transducción de señales involucrada en la reducción de la vía de activación de CD3/TCR (Iouzalen et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31:2885-2891). Además, se ha detectado que los linfocitos T CD4+CD25+ reguladores (Treg) expresan la LAG-3 al activarse y los anticuerpos contra la LAG-3 inhiben la supresión por parte de los linfocitos Treg tanto en in vitro como en in vivo, lo cual sugiere que la LAG-3 contribuye a la actividad supresora de los linfocitos

30 Treg (Huang, C. et al. (2004) Immunity 21:503-513). Es más, se ha detectado que la LAG-3 regula de forma negativa la homeostasis de linfocitos T por parte de los linfocitos T reguladores tanto en mecanismos dependientes como independientes del linfocito T (Workman, C.J. and Vignali, D.A. (2005) J. Immunol. 174:688-695).

En ciertas circunstancias, se ha detectado que la LAG-3 también posee efectos inmunoestimuladores. Por ejemplo,

35 las células tumorales transfectadas con LAG-3 trasplantadas en ratones singénicos mostraron una reducción acusada del crecimiento o regresión total en comparación con células tumorales que no habían sido transfectadas, lo que sugiere que la expresión de la LAG-3 en las células tumorales estimuló una respuesta antitumoral mediante la estimulación de las células presentadoras de antígenos a través de moléculas del MHC de clase II (Prigent et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:3867-3876). Además, se ha detectado que la proteína de fusión LAG-3 Ig soluble

40 estimula tanto respuestas inmunitarias humorales como celulares cuando se administran a ratones junto con un antígeno, lo que indica que la LAG-3 Ig soluble puede desempeñar las funciones de un adyuvante de una vacuna (El Mir and Triebel (2000) J. Immunol. 164:5583-5589). Además, se ha detectado que la LAG-3 Ig soluble humana amplifica la generación in vitro de inmunidad específica para un tumor de tipo I (Casati et al. (2006) Cancer Res. 66:4450-4460). La actividad funcional de la LAG-3 se examina con más detalle en Triebel (2003) Trends Immunol.

45 24:619-622. En vista de lo anterior, agentes adicionales para modular la actividad de la LAG-3 resultan interesantes.

Resumen

La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales aislados (en particular anticuerpos monoclonales

50 humanos) y porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la LAG-3 humana y comprenden: (a) una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 43.

55 Los anticuerpos, y porciones de unión a antígeno de los mismos, de la invención presentan propiedades funcionales deseables. Estas propiedades incluyen una gran afinidad de unión a la LAG-3 humana, unión a la LAG-3 humana y de mono (p. ej., LAG-3 de mono Cynomolgus y/o Rhesus) pero no a la LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de la LAG-3 a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II y/o la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno. Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar,

60 por ejemplo, para detectar la proteína LAG-3 o para estimular las respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno, como por ejemplo, en un sujeto que padece un tumor o un sujeto portador de un virus.

En un aspecto, el anticuerpo de la invención, o la porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno de éste, donde el anticuerpo se une a la LAG-3

65 humana y presenta al menos una de las siguientes propiedades:

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(a): se une a LAG-3 de mono;

(b): no se une a LAG-3 de ratón;

(c): inhibe la unión de la LAG-3 a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II; y

(d): estimula una respuesta inmunitaria.

Preferentemente, el anticuerpo presenta al menos dos de las propiedades (a), (b), (c) y (d). Más preferentemente, el anticuerpo presenta al menos tres de las propiedades (a), (b), (c) y (d). Incluso más preferentemente, el anticuerpo presenta las cuatro propiedades (a), (b), (c) y (d).

En una realización preferida, el anticuerpo estimula una respuesta de linfocitos T específica para un antígeno, tal como la producción de interleucina 2 (IL-2) en una respuesta de linfocitos T específica de un antígeno. En otras realizaciones, el anticuerpo estimula una respuesta inmune tal como una respuesta antitumoral (p. ej., inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de injerto tumoral in vivo) o una respuesta autoinmunitaria (p. ej., estimula el desarrollo de la diabetes en ratones NOD). En otra realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo de la LAG-3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos PGHPLAPG (SEC ID Nº: 76). En otra realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo de la LAG-3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos HPAPPSSW (SEC ID Nº: 77) o PAAPSSWG (SEC ID Nº: 78). En otras realizaciones, el anticuerpo se une a la LAG

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3 humana con una KD de 1 x 10M o menor, se une a la LAG-3 humana con una KD de 1 x 10M o menor, se une a

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la LAG-3 humana con una KD of 5 x 10M o menor, o se une a la LAG-3 humana con una KD de 1 x 10M o menor. En una realización, el anticuerpo tiñe tejido pituitario por inmunohistoquímica, mientras que en otra realización, el anticuerpo no tiñe tejido pituitario por inmunohistoquímica.

En otro aspecto, el anticuerpo de la invención, o porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno de este, donde el anticuerpo presenta competencia cruzada por la unión a la LAG-3 humana con un anticuerpo de referencia, donde el anticuerpo de referencia comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 37 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 43

En otro aspecto, el anticuerpo de la invención o porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal aislado, o a una porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 3-20 humano, un gen VH 4-34 humano, un gen VH 3-33 humano o un gen VH 1-24 humano, donde el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana. En otro aspecto, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención es un anticuerpo monoclonal aislado, o a una porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de la cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen VK L18 humano, un gen VK L6 humano o un gen VK A27 humano, donde el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana. En una realización preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno de este, que comprende: una región variable de cadena pesada que el producto de o se deriva de un gen VH 4-34 humano y una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VK L6 humano; donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humana.

En otro aspecto, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno de este, que comprende:

(a): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 37; y

(b): una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 43.

Los anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, de un isotipo IgG1, IgG2 o IgG4. En una realización preferida, el anticuerpo es un isotipo IgG4. En otra realización preferida, el anticuerpo es un isotipo IgG4 que posee una mutación de serina a prolina en la región constante de la región bisagra de la cadena pesada (en una posición que se corresponde con la posición 241 conforme a lo que se describe en Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108), de forma que se reduce o suprime la heterogeneidad de los puentes disulfuro entre las cadenas pesadas. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fab’ o Fab’2, o anticuerpos de cadena sencilla.

Esta divulgación también proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención, o una porción de unión a antígeno de este, enlazado a un agente terapéutico, p. ej., una citotoxina o un isotopo radioactivo. Esta divulgación también proporciona una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de este, de la invención enlazado a un segundo grupo funcional con una especificidad de unión distinta a dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno de este.

Se proporcionan también composiciones que comprenden un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de este,

: o un inmunoconjugado o una molécula biespecífica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También quedan contempladas en esta divulgación las moléculas de ácido nucleico que codifiquen los anticuerpos,

: o las porciones de unión a antígeno de estos, de la invención, así como también los vectores de expresión que comprenden tales ácidos nucleicos y las células huésped que comprenden tales vectores de expresión. También se

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proporcionan los métodos de preparación de anticuerpos anti-LAG-3 que utilizan las células huésped que comprenden tales vectores de expresión y que pueden incluir los pasos de (i) expresión del anticuerpo en la célula huésped y (ii) aislamiento del anticuerpo de la célula huésped.

5 En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos anti-LAG-3 de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, para su uso en métodos de estimulación de respuestas inmunitarias. Por ejemplo, se describe en la presente un método de estimulación de una respuesta de un linfocito T específica para un antígeno que comprende poner dicho linfocito T en contacto con un anticuerpo de la invención de forma que se estimule una respuesta del linfocito T específica para el antígeno. Preferentemente, se estimula la producción de interleucina 2 por parte del linfocito T específico para el antígeno. Además, se describe en la presente un método de estimulación de una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta de linfocito T específica para un antígeno) en un sujeto que comprende administrar un anticuerpo de la invención al sujeto de forma que se estimule una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta de linfocito T específica para el antígeno) en el sujeto. En un método preferido, el sujeto es un sujeto que padece un tumor y se estimula una respuesta inmunitaria contra el tumor. En otro método preferido, el sujeto es un

15 sujeto portador de un virus y se estimula una respuesta inmunitaria contra el virus.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antígeno del mismo, de forma que se inhiba el crecimiento del tumor en el sujeto. En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, o porciones de unión a antígeno del mismo, para su uso en un método para tratar una infección vírica en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antígeno del mismo, de forma que se trate la infección vírica en el sujeto.

25 En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, o porciones de unión a antígeno del mismo, para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3, o porciones de unión a antígeno del mismo, y al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, tal como un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, de forma que se estimule una respuesta inmunitaria en el sujeto, por ejemplo para inhibir el crecimiento tumoral o estimular una respuesta antivírica. En una realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-1. En otra realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización más, se administra al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-CTLA-4. En una realización, el anticuepro anti-LAG-3 es un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo de la divulgación. Como alternativa, el anticuerpo anti-LAG-3 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o

35 humanizado. En otra realización, el anticuerpo inmunoestimulador adicional (p. ej., el anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o el anticuerpo anti-CTLA-4) es un anticuerpo humano. Como alternativa, el anticuerpo inmunoestimulador adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 49) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 37) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 25F7. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 1), CDR2 (SEC ID Nº: 7) y CDR3 (SEC ID Nº: 13) están delineadas y las derivaciones V, D y J de la línea germinal están indicadas.

45 La Figura 1B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 55) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 43) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 25F7. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 19), CDR2 (SEC ID Nº: 25) y CDR3 (SEC ID Nº: 31) están delineadas y las derivaciones V y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 50) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 38) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 26H10. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 2), CDR2 (SEC ID Nº: 8) y CDR3 (SEC ID Nº: 14) están delineadas y las derivaciones V, D y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 56) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 44) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 26H10. Las regiones

55 CDR1 (SEC ID Nº: 20), CDR2 (SEC ID Nº: 26) y CDR3 (SEC ID Nº: 32) están delineadas y las derivaciones V y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 51) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 39) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 25E3. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 3), CDR2 (SEC ID Nº: 9) y CDR3 están delineadas y las derivaciones V, D y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 57) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 45) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 25E3. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 21), CDR2 (SEC ID Nº: 27) y CDR3 (SEC ID Nº: 33) están delineadas y las derivaciones V y J de la línea germinal están indicadas.

65 La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 52) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 40) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 8B7. Las regiones CDR1 (SEC

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ID Nº: 4), CDR2 (SEC ID Nº: 10) y CDR3 (SEC ID Nº: 16) están delineadas y las derivaciones V, D y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 58) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 46) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 8B7. Las regiones CDR1

5 (SEC ID Nº: 22), CDR2 (SEC ID Nº: 28) y CDR3 (SEC ID Nº: 34) están delineadas y las derivaciones V y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 53) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 41) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 11F2. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 5), CDR2 (SEC ID Nº: 11) y CDR3 (SEC ID Nº: 17) están delineadas y las derivaciones V, D y J de

10 la línea germinal están indicadas. La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 59) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 47) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 11F2. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 23), CDR2 (SEC ID Nº: 29) y CDR3 (SEC ID Nº: 35) están delineadas y las derivaciones V y J de la línea germinal están indicadas.

15 La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 54) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 42) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 17E5. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 6), CDR2 (SEC ID Nº: 12) y CDR3 (SEC ID Nº: 18) están delineadas y las derivaciones V, D y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 60) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:

20 48) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 17E5. Las regiones CDR1 (SEC ID Nº: 24), CDR2 (SEC ID Nº: 30) y CDR3 (SEC ID Nº: 36) están delineadas y las derivaciones V y J de la línea germinal están indicadas. La Figura 7 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 25F7 (SEC ID Nº: 37) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana VH 4-34 y JH5b (SEC

25 ID Nº: 61 y 62, respectivamente). La Figura 8 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 25F7 (SEC ID Nº: 43) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 y JK2 (SEC ID Nº: 63 y 64, respectivamente). La Figura 9 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada

30 de 26H10 (SEC ID Nº: 38) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana VH 3-33 y JH6B (SEC ID Nº: 65 y 66, respectivamente). La Figura 10 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 26H10 (SEC ID Nº: 44) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk A27 y JK3 (SEC ID Nº: 67 y 68, respectivamente).

35 La Figura 11 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 25E3 (SEC ID Nº: 39) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana VH 3-20 y JH4b (SEC ID Nº: 69 y 70, respectivamente). La Figura 12 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 25E3 (SEC ID Nº: 45) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L18 y JK2 (SEC ID Nº:

40 71 y 64, respectivamente). La Figura 13 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 8B7 (SEC ID Nº: 40) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana VH 4-34 y JH5b (SEC ID Nº: 61 y 62, respectivamente). La Figura 14 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de

45 8B7 (SEC ID Nº: 46) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 y JK4 (SEC ID Nº: 63 y 72, respectivamente). La Figura 15 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 11F2 (SEC ID Nº: 41) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana VH 1-24 y JH4b (SEC ID Nº: 73 y 70, respectivamente).

50 La Figura 16 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 11F2 (SEC ID Nº: 47) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 y JK1 (SEC ID Nº: 63 y 74, respectivamente). La Figura 17 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 17E5 (SEC ID Nº: 42) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana VH 3-33 y 2-2

55 (SEC ID Nº: 65 y 70, respectivamente). La Figura 18 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 17E5 (SEC ID Nº: 48) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 (SEC ID Nº: 63 y 75, respectivamente). La Figura 19 muestra la alineación de la secuencia proteica codificada por el clon pa23-5 de ADNc de la LAG-3

60 de mono (SEC ID Nº: 93) con la secuencia de la proteína LAG-3 de mono rhesus depositada en Genbank (SEC ID Nº: 94) (N.o de acceso en Genbank XM_001108923). La región peptídica del bucle extra y el dominio transmembrana están subrayados. El aminoácido diferente entre las dos secuencias (posición de aminoácido 419) está resaltado en negrita.

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Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a la LAG-3 humana y que presentan propiedades funcionales deseables. Esta divulgación 5 proporciona anticuerpos aislados, métodos de fabricación de tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos, y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Además, se describen en la presente métodos de utilización de los anticuerpos, tales como para detectar una proteína LAG-3, así como también a los métodos de utilización de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención para estimular respuestas inmunes, solos o combinados con

10 otros anticuerpos inmunoestimuladores. Por consiguiente, esta divulgación también proporciona métodos de utilización de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención para, por ejemplo, inhibir el crecimiento tumoral o tratar una infección vírica.

Para que la presente divulgación pueda comprenderse más fácilmente, se definen, en primer lugar, ciertos términos. 15 Se presentan otras definiciones adicionales en la descripción detallada.

El término "LAG-3" se refiere al gen 3 de activación linfocitaria. El término "LAG-3" incluye variantes, isoformas, homólogos, ortólogos y parálogos. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para una proteína LAG-3 humana pueden, en ciertos casos, presentar reactividad cruzada con una proteína LAG-3 de una especie no humana. En 20 otras realizaciones, los anticuerpos específicos para una proteína LAG-3 humana pueden ser completamente específicos para la proteína LAG-3 humana y puede que no presenten reactividad cruzada con otras especies u otros tipos de reactividad cruzada, o puede que presenten reactividad cruzada con la LAG-3 de otras especies determinadas pero no de todas las demás especies (p. ej., que presente reactividad cruzada con la LAG-3 de mono pero no con la LAG-3 de ratón). El término “LAG-3 humana” se refiere a la secuencia de la LAG-3 humana, tal como 25 la secuencia de aminoácidos completa de la LAG-3 humana con el N.o de acceso en Genbank NP_002277. El término "LAG-3 de ratón" se refiere a la secuencia de la LAG-3 de ratón, tal como la secuencia de aminoácidos completa de la LAG-3 de ratón con N.o de acceso en Genbank NP_032505. La LAG-3 se conoce también en la materia como, por ejemplo, CD223. La secuencia de la LAG-3 humana puede diferenciarse de la LAG-3 humana con

N.o de acceso en Genbank NP_002277 al poseer, p. ej., mutaciones conservadas o mutaciones en regiones no

30 conservadas y la LAG-3 posee sustancialmente la misma función biológica que la LAG-3 humana con N.o de acceso en Genbank NP_002277. Por ejemplo, una función biológica de la LAG-3 humana es poseer un epítopo en el dominio extracelular de la LAG-3 que se une específicamente a un anticuerpo de la presente divulgación, o una función bilógica de la LAG-3 humana es la unión a moléculas del MHC de clase II.

35 Se pretende que el término "LAG-3 de mono" englobe las proteínas LAG-3 expresadas por monos del nuevo mundo y del viejo mundo, incluidas, pero sin limitarse a, LAG-3 de monos cynomolgus y LAG-3 de monos rhesus. Una secuencia de aminoácidos representativa para la LAG-3 de mono es la secuencia de aminoácidos de la LAG-3 de mono rhesus que se muestra en la Figura 19 y la SEC ID Nº: 85, la cual está también depositada con el N.o de acceso en Genbank XM_001108923. Otra secuencia de aminoácidos representativa para la LAG-3 de mono es la

40 secuencia alternativa del clon pa23-5 de mono rhesus que se muestra en la Figura 19 y la SEC ID Nº: 84, aislada como se describe en el Ejemplo 3A, subsección 3. Esta secuencia alternativa de rhesus presenta un único aminoácido diferente en la posición 419 en comparación con la secuencia depositada en Genbank.

Una secuencia particular de la LAG-3 humana será, generalmente, al menos un 90 % idéntica en la secuencia de

45 aminoácidos de la LAG-3 humana con el N.o de acceso en Genbank NP_002277 y contiene residuos aminoacídicos que identifican la secuencia de aminoácidos como humana por comparación con secuencias de aminoácidos de la LAG-3 de otras especies (p. ej., Múridos). En ciertos casos, una LAG-3 humana puede ser al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica en la secuencia de aminoácidos de la LAG-3 con el N.o de acceso en Genbank NP_002277. En ciertas realizaciones, una secuencia de la LAG-3 humana no puede presentar

50 más de 10 aminoácidos diferentes respecto a la secuencia de la LAG-3 con el N.o de acceso en Genbank NP_002277. En ciertas realizaciones, la LAG-3 humana no puede presentar más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 ó 1 aminoácidos diferentes respecto a la secuencia de la LAG-3 con el N.° de acceso en Genbank NP_002277.El porcentaje de identidad se puede determinar como se describe en la presente.

55 El término "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células mencionadas anteriormente o el hígado (incluidos anticuerpos, citocinas y el complemento) que produce un daño selectivo a, destrucción de o eliminación de patógenos invasores del cuerpo humano, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos normales humanos.

60 Una "respuesta de linfocito T específica para un antígeno" se refiere a las respuestas por parte de un linfocito T que se deben a la estimulación del linfocito T con el antígeno para el cual el linfocito T es específico. Los ejemplos no limitantes de respuestas de linfocitos T debidas a la estimulación específica de antígenos incluyen la proliferación y la producción de citocinas (p. ej., la producción de IL-2).

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Tal como se hace referencia en la presente al término “anticuerpo”, este incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, “porción de unión a antígeno”) o cadenas simples de estos. Los anticuerpos completos son glucoproteínas que comprenden al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena 5 pesada (abreviado en la presente como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviado en la presente como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio: CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de la complementaridad (CDR), entremezcladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones de entramado (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestos del amino terminal al carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, incluidos varias células del sistema inmunitario (p. ej.,

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se utiliza en la presente, hace referencia a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (p. ej., una proteína LAG-3). Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden realizar la función de unión a antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, FUNDAMENTAL 25 IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.ª edición, 1993); (iv) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH1; (v) un fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de una única rama de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que está constituido por un dominio VH; (vii) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (viii) un nanocuerpo, una región variable de la cadena pesada que contiene un dominio variable simple y dos dominios constantes. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estén codificados por genes separados, estos se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permite convertirlos en una cadena proteica simple en la cual las regiones VL y VH se parean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv (scFv); véase, p. ej., Bird et al.. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Se pretende también que tales anticuerpos de cadena simple queden englobados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un

35 anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales con los que estarán familiarizados los expertos en la materia y los fragmentos se someten a estudios de utilidad del mismo modo que ocurre con los anticuerpos intactos.

Se pretende que un "anticuerpo aislado", como se utiliza en la presente, haga referencia a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a una proteína LAG-3 está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de las proteínas LAG-3). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína LAG-3 humana puede, sin embargo, presentar reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las proteínas LAG-3 de otras especies. Es más, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro

45 material celular y/o productos químicos.

El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un preparado de moléculas de anticuerpo de composición molecular simple. Una composición de anticuerpos monoclonales exhibe una única especificidad y afinidad de unión a un epítopo particular.

Se pretende que el término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, incluya anticuerpos que poseen regiones variables en las cuales tanto las regiones de entramado como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos

55 humanos de la invención pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o dirigida in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, no se pretende que el término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, incluya anticuerpos en los cuales se han insertado secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias de entramado humanas.

El término "anticuerpo monoclonal humano" hace referencia a anticuerpos que presentan una única especificidad de unión que tienen regiones variables en las cuales tanto las regiones de entramado como las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal

65 transgénico no humano, p. ej., un ratón transgénico, que posee un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada y un transgén de la cadena ligera humanos fusionados a una célula inmortalizada.

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La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humanos o un hibridoma preparado a partir de estos (descrito con mayor detalle más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, p. ej., a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una genoteca recombinante combinatoria de anticuerpos humanos y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualesquiera otros medios que impliquen el corte y empalme de las secuencias génicas humanas de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes poseen regiones variables en las cuales las regiones de entramado y las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciones dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o mutagénesis somática in vivo si se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humana) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son las secuencias que, aunque se deriven de las secuencias VH y VL de la línea germinal humana y se relacionen con estas, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo.

El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) que es codificado por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de forma intercambiable en la presente con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

La expresión "derivados de anticuerpos humanos" hace referencia a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, p. ej., un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

Se pretende que la expresión "anticuerpo humanizado" haga referencia a anticuerpos en los cuales se han injertado secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias de entramado humanas. Se pueden realizar modificaciones adicionales de la región de entramado en las secuencias del entramado humano.

Se pretende que la expresión "anticuerpo quimérico" haga referencia a anticuerpos en los cuales las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el cual las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.

Se pretende que un anticuerpo que "se une específicamente a la LAG-3 humana”, como se utiliza en la presente, haga referencia a un anticuerpo que se une a la proteína LAG-3 humana (y posiblemente a una proteína LAG-3 de una o más especies no humanas) pero no se une sustancialmente a proteínas que no sean LAG-3. Preferentemente, el anticuerpo se une a la proteína LAG-3 humana con "alta afinidad", es decir, con una KD de 1 x 10-7 M o menor,

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más preferentemente de 5 x 10M o menor, más preferentemente de 3 x 10M o menor, más preferentemente de 1

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x 10M o menor, más preferentemente de 5 x 10M o menor o incluso más preferentemente de 1 x 10M o menor.

La expresión “no se une sustancialmente” a una proteína o células, como se utiliza en la presente, significa que no se une o no se une con una alta afinidad a la proteína o células, es decir, se une a la proteína o células con una KD

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de 1 x 10M o mayor, más preferentemente de 1 x 10M o mayor, más preferentemente de 1 x 10M o mayor,

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más preferentemente de 1 x 10M o mayor, aún más preferentemente de 1 x 10M o mayor.

Se pretende que el término "K" o “Ka”, como se utiliza en la presente, haga referencia a la velocidad de

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asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que se pretende que el término "Kdis" o “Kd”, como se utiliza en la presente, haga referencia a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Se pretende que el término “KD”, como se utiliza en la presente, haga referencia a la constante de disociación, que se obtiene de la proporción de Kd respecto a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para los anticuerpos pueden ser determinados usando los métodos debidamente establecidos en el arte. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es utilizando la resonancia de plasmones superficiales, preferentemente usando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore® .

El término “alta afinidad” para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que posee una KD de 1 x 10-7 M o menor,

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más preferentemente de 5 x 10M o menor, incluso más preferentemente de 1 x 10M o menor, incluso más

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preferentemente de 5 x 10M o menor e incluso más preferentemente de 1 x 10M o menor para un antígeno de interés. Sin embargo, la unión de “alta afinidad” puede variar para otros isotipos del anticuerpo. Por ejemplo, la unión de “alta afinidad” para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-6 M o menor, más

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preferentemente de 10M o menor, incluso más preferentemente de 10M o menor.

El término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas,

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caballos, gallinas, anfibios y reptiles, aunque se prefieren los mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos.

En las siguientes subsecciones se describen varios aspectos de la invención con más detalle.

Anticuerpos anti-LAG-3 que poseen propiedades funcionales particulares

Los anticuerpos de la invención se caracterizan por características o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a la LAG-3 humana y se pueden unir a la LAG-3 de otras especies determinadas, p. ej., LAG-3 de mono (p. ej., mono cynomolgus, mono rhesus), pero no se unen sustancialmente a la LAG-3 de otras especies determinadas, p. ej., LAG-3 de ratón. Preferentemente, un anticuerpo de la invención se une a la LAG-3 humana con alta afinidad.

La capacidad del anticuerpo de estimular una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta de linfocito T específica para un antígeno, puede venir indicada por, por ejemplo, la capacidad del anticuerpo de estimular la producción de interleucina 2 (IL-2) en una respuesta de linfocito T específica para un antígeno. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención se une a la LAG-3 humana pero no presenta una capacidad para estimular una respuesta de linfocito T específica para un antígeno. En otras realizaciones, un anticuerpo de la invención se une a la LAG-3 humana pero no presenta una capacidad para estimular una respuesta de linfocito T específica para un antígeno. Otros medios mediante los cuales se puede evaluar la capacidad del anticuerpo de estimular una respuesta inmunitaria incluyen la capacidad del anticuerpo de inhibir el crecimiento tumoral, tal como en un modelo de injerto tumoral in vivo (véase, p. ej., el Ejemplo 6) o la capacidad del anticuerpo de estimular una respuesta autoinmunitaria, tal como la capacidad de inducir el desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria en un modelo autoinmunitario, tal como la capacidad de inducir el desarrollo de la diabetes en el modelo de ratones NOD (véase, p. ej., el Ejemplo 7).

La unión de un anticuerpo de la invención a la LAG-3 se puede evaluar utilizando una o más de las técnicas debidamente establecidas en la materia. Por ejemplo, en una realización preferida, un anticuerpo se puede estudiar mediante un ensayo de citometría de flujo en el que el anticuerpo se hace reaccionar con una línea celular que expresa la LAG-3 humana, tal como las células CHO que han sido transfectadas para expresar la LAG-3 (p. ej, la LAG-3 humana o la LAG-3 de mono (p. ej., mono rhesus o cynomolgus) o la LAG-3 de ratón) en su superficie celular (véase, p. ej., el Ejemplo 3A para más información sobre un ensayo adecuado). Otras células adecuadas para utilizar en los ensayos de citometría de flujo incluyen linfocitos T CD4+ activados estimulados con anti-CD3, que expresan la LAG-3 natural. Además o como alternativa, la unión del anticuerpo, incluida la cinética de la unión (p. ej., el valor de KD) se puede estudiar en ensayos de unión BIAcore (véase, p. ej., el Ejemplo 3B para más información sobre ensayos adecuados). Otros ensayos de unión adecuados incluyen ensayos ELISA, por ejemplo, utilizando una proteína LAG-3 recombinante (véase, p. ej., el Ejemplo 1 para más información sobre un ensayo adecuado).

Preferentemente, un anticuerpo de la invención se une a una proteína LAG-3 con una KD de 5 x 10-8 M o menor, se

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une a una proteína LAG-3 con una KD de 2 x 10M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una KD de 5 x 10M

o menor, se une a una proteína LAG-3 con una KD de 4 x 10-9 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una KD

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de 3 x 10M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una KD de 2 x 10M o menor, se une a una proteína LAG-3

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conunaKDde1x10Momenor,seuneaunaproteínaLAG-3conunaKDde5x10Momenor,oseuneauna proteína LAG-3 con una KD de 1 x 10-10 M o menor.

Normalmente, un anticuerpo de la invención se une a la LAG-3 en tejidos linfoides, tales como amígdala, bazo o timo, lo cual se puede detectar por inmunohistoquímica. Además, como se describe con más detalle en el Ejemplo 8, ciertos anticuerpos anti-LAG-3 de la invención tiñen el tejido pituitario (p. ej., se retienen en la pituitaria) según se midió por inmunohistoquímica, mientras que otros anticuerpos anti-LAG-3 de la invención no tiñen el tejido pituitario

(p. ej., no se retienen en la pituitaria) según se midió por inmunohistoquímica. Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 humano que tiñe el tejido pituitario por inmunohistoquímica, mientras que en otra realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 humano que no tiñe el tejido pituitario por inmunohistoquímica.

Los anticuerpos preferidos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Además o como alternativa, los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados.

Anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5

Un anticuerpo preferido de la invención es el anticuerpo monoclonal humano 25F7. 25F7 y los anticuerpos anti-LAG3 adicionales 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se aislaron y caracterizaron estructuralmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Las secuencias de aminoácidos VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 37-42, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos VK de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 43-48, respectivamente.

Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a la LAG-3 humana, las secuencias VH y VL pueden "mezclarse y emparejarse" para crear otras moléculas de unión anti-LAG-3. Preferentemente, cuando las cadenas

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VH y VL están mezcladas y emparejadas, una secuencia VH de un par VH/VL particular se reemplaza con una secuencia VH estructuralmente similar. De modo análogo, preferentemente una secuencia VL de un par VH/VL particular se reemplaza con una secuencia VL estructuralmente similar.

En un aspecto, esta divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 43.

En otro aspecto, esta divulgación proporciona anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y de la cadena ligera de 25F7. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 37-42, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 43-48, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 13-14, GGY y 16-18, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VK de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 19-24, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VK de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 25-30. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VK de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 31-36, respectivamente. Las regiones CDR se delinean utilizando el sistema de Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, N.o de Publicación NIH 91-3242).

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a la LAG-3 humana y que la especificidad de unión a antígeno viene proporcionada fundamentalmente por las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VL pueden "mezclarse y emparejarse" (es decir, se pueden mezclar y emparejar las CDR de anticuerpos diferentes, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y una CDR1, CDR2 y CDR3 de VL) para crear otras moléculas de unión anti-LAG-3. La unión a LAG-3 de tales anticuerpos "mezclados y emparejados" puede estudiarse utilizando los ensayos de unión descritos anteriormente y en los ejemplos (p. ej., los ELISA y el análisis Biacore®). Preferentemente, cuando se mezclan y emparejan secuencias CDR de VH, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH particular se reemplaza con una o más secuencias CDR estructuralmente similares. De forma análoga, cuando las secuencias CDR de VL se mezclan y emparejan, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VL en particular se reemplaza preferentemente con una o más secuencias CDR estructuralmente similares. Resultará evidente para un experto en la materia que se pueden crear nuevas secuencias de VH y VL sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares a las de las secuencias CDR divulgadas en la presente para los anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5. En una realización preferida, el anticuerpo de la invención o la porción de unión a antígeno del mismo comprende:

(a): una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 1;

(b): una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 7;

(c): una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 13;

(d): una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 19;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 25; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 31.

Se sabe con certeza en el arte que el dominio CDR3, independientemente del (de los) dominio(s) CDR1 y/o CDR2, solo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo para un antígeno cognado, y que previsiblemente se pueden generar múltiples anticuerpos con la misma especificidad de unión basándose en una secuencia CDR3 común. Véanse, por ejemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) y Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000). Véase también las Patentes de EE. UU. N.os 6 951 646; 6 914 128; 6 090 382; 6 818 216; 6 156 313; 6 827 925; 5 833 943; 5 762 905 y 5 760 185.

Anticuerpos que poseen secuencias de la línea germinal particulares

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de la cadena pesada de un gen particular de inmunoglobulina de la cadena pesada de la línea germinal y/o una región variable de la cadena ligera de un gen particular de inmunoglobulina de la cadena ligera de la línea germinal.

Por ejemplo, en una realización preferida, esta divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 3-20 humano, un gen VH 4-34 humano, un gen VH 3-33 humano o un gen VH 1-24 humano, donde el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana. En una realización preferida, esta divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno de este, donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 4-34 humano y comprende una región variable de la cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen VK L6 humano, donde el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana.

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5 Dichos anticuerpos también pueden poseer una o más de las características funcionales descritas anteriormente en detalle, tales como una alta afinidad de unión a la LAG-3 humana, la unión a la LAG-3 de mono, la carencia de unión a la LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de la LAG-3 a las moléculas del MHC de clase II y/o la capacidad de estimular las respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno.

Un ejemplo de un anticuerpo que posee VH y VL de VH 3-20 y VK L18, respectivamente, es el anticuerpo 25E3. Ejemplos de anticuerpos que poseen VH y VL de VH 4-34 y VK L6, respectivamente, son los anticuerpos 25F7 y 8B7. Un ejemplo de un anticuerpo que posee VH y VL de VH 3-33 y VK A27, respectivamente, es el anticuerpo 26H10. Un ejemplo de un anticuerpo que posee VH y VL de VH 1-24 y VK L6, respectivamente, es el anticuerpo 11F2. Un

15 ejemplo de un anticuerpo que posee VH y VL de VH 3-33 y VK L6, respectivamente, es el anticuerpo 17E5.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de la cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia particular de la línea germinal si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Dichos sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico portador de genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o el cribado de una genoteca de inmunoglobulina humana expresada en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede identificarse como tal por comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de la línea germinal humana y por selección de la 25 secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que es la más similar en secuencia (es decir, el % de identidad máximo) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia particular de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede contener aminoácidos diferentes en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas espontáneas o a la introducción intencional de una mutación dirigida. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado es normalmente al menos un 90 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos aminoacídicos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se comparan con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (p. ej., las secuencias de la línea germinal múrida). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %,

35 98 % o 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de la línea germinal humana no presentará más de 10 aminoácidos diferentes respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano no puede presentar más de 5, o incluso más de 4, 3, 2 ó 1, aminoácidos diferentes respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

Anticuerpos homólogos

Los anticuerpos de la invención comprenden regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden

45 secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monoclonal 25F7 descrito en la presente y donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención. Específicamente, esta divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, donde:

(a): la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % homóloga a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 37;

(b): la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %

homóloga a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 43; y 55 (c) el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana.

El anticuerpo puede poseer una o más de las siguientes características funcionales indicadas anteriormente, tales como una alta afinidad de unión a la LAG-3 humana, la unión a la LAG-3 de mono, la carencia de unión a la LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de la LAG-3 a las moléculas del MHC de clase II y/o la capacidad de estimular las respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno.

En varias realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

65 En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser un 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % homólogas a las secuencias expuestas anteriormente. Un anticuerpo que posee regiones VH y VL con una alta homología (es decir, un 95 % o mayor) a las regiones VH y VL de las secuencias expuestas anteriormente se puede obtener por mutagénesis (p. ej., la mutagénesis dirigida o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican las SEC ID Nº: 49 ó 55, seguida del análisis del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones expuestas anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en la presente.

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5 Como se utiliza en la presente, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de lagunas y la longitud de cada laguna, que

10 precisa(n) ser introducida(s) para la alineación óptima de las dos secuencias. Se puede conseguir comparar las secuencias y determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático como el que se describe en los ejemplos no limitantes que aparecen más adelante.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E.

15 Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de peso de residuo PAM120, una penalización por longitud de espacio de 12 y una penalización por espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz

20 Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó6.

Además o como alternativa, las secuencias de proteínas de la presente divulgación pueden utilizarse además como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda de comparación con las bases de datos públicas a fin de, por 25 ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden realizar usando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.

30 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por defecto de los respectivos programas resultan útiles (p. ej., XBLAST y NBLAST). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticuerpos con modificaciones conservadoras

35 En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias específicas de aminoácidos basadas en 25F7, o modificaciones conservadoras de estos, y donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención. Se sobreentiende en la materia que se pueden realizar ciertas modificaciones

40 conservadoras de las secuencias que no suprimen la unión al antígeno. Véanse, p. ej., Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:2686426870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O’Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 y Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43. Por consiguiente, esta divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión al antígeno de este, que

45 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, donde:

(a) la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 13 y modificaciones conservadoras de esta;

50 (b) la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 31 y modificaciones conservadoras de ésta; y

(c) el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana.

Además o como alternativa, el anticuerpo puede poseer una o más de las siguientes características funcionales

55 descritas anteriormente, tales como una alta afinidad de unión a la LAG-3 humana, la unión a la LAG-3 de mono, la carencia de unión a la LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de la LAG-3 a las moléculas del MHC de clase II y/o la capacidad de estimular las respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno.

En una realización preferida, la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia

60 de aminoácidos de SEC ID Nº: 7 y modificaciones conservadoras de ésta; y la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 25 y modificaciones conservadoras de ésta. En otra realización preferida, la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 y modificaciones conservadoras de ésta; y la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 19 y

65 modificaciones conservadoras de ésta.

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En varias realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, anticuerpo humanizado o anticuerpo quimérico.

Se pretende que el término "modificaciones de secuencia conservadoras", como se utiliza en la presente, haga

5 referencia a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención por medio de técnicas estándares de uso común en la materia, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en las que el residuo aminoacídico se sustituye por un residuo aminoacídico que posee una cadena lateral similar. Se han caracterizado en la materia las familias de los residuos aminoacídicos que poseen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina,

15 prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, se puede reemplazar uno o más residuos aminoacídicos en las regiones CDR de un anticuerpo de la invención por otros residuos aminoacídicos de la misma familia de cadena lateral y se puede realizar un análisis del anticuerpo alterado para determinar la función retenida (es decir, las funciones expuestas anteriormente) empleando los ensayos funcionales descritos en la presente.

Anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos Anti-LAG-3

Los anticuerpos de la invención que se unen al mismo epítopo de la LAG-3 que el anticuerpo monoclonal anti-LAG-3

25 25F7 (es decir, tienen la capacidad de presentar competición cruzada por la unión a la LAG-3 humana con el anticuerpo monoclonal 25F7). En realizaciones preferidas, el anticuerpo de referencia para los estudios de la competición cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal 25F7.

Se pueden identificar tales anticuerpos que presentan competición cruzada basándose en su capacidad para competir de forma cruzada con 25F7 en los ensayos estándares de unión a la LAG-3. Por ejemplo, se pueden utilizar los ensayos ELISA estándares en los cuales una proteína LAG-3 recombinante humana se inmoviliza en la placa, se marca uno de los anticuerpos con una marca fluorescente y se evalúa la capacidad de los anticuerpos no marcados de competir por la unión con el anticuerpo marcado. Además o como alternativa, el análisis BIAcore se puede utilizar para determinar la capacidad de los anticuerpos de presentar competición cruzada. La capacidad de un anticuerpo

35 de ensayo de inhibir la unión de, por ejemplo, 25F7 a la LAG-3 humana confirma que el anticuerpo de ensayo puede competir con 25F7 por la unión a la LAG-3 humana y, por lo tanto, se une al mismo epítopo en la LAG-3 humana que el 25F7. En una realización preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en la LAG-3 humana que el 25F7 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en los ejemplos.

Como se indica más detalladamente en el Ejemplo 3C, la unión de 25E3, 25F7 y 8B7 a la LAG-3 humana se ha asignado a una región "bucle extra" en el primer dominio extracelular de la LAG-3 humana. La secuencia de la región de bucle extra se expone en SEC ID Nº: 79. Utilizando un experimento de detección de péptidos, la unión del 25E3 a la región de bucle extra se ha asignado a la siguiente secuencia de aminoácidos: PGHPLAPG (SEC ID Nº:

45 76), mientras que la unión del 25F7 a la región de bucle extra se ha asignado a la siguiente secuencia de aminoácidos: HPAAPSSW (SEC ID Nº: 77), y la unión del 8B7 a la región de bucle extra se ha asignado a la siguiente secuencia de aminoácidos: PAAPSSWG (SEC ID Nº: 78). Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 que se une a un epítopo de la LAG-3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos PGHPLAPG (SEC ID Nº: 76). Específicamente, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 que se une a un epítopo de la LAG-3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos HPAAPSSW (SEC ID Nº: 77).

Anticuerpos sintetizados por ingeniería genética y modificados

Un anticuerpo que posee una o más secuencias VH y/o VL divulgadas en la presente pueden usarse como material

55 de partida para sintetizar por ingeniería genética un anticuerpo modificado. Dicho anticuerpo modificado puede poseer propiedades del anticuerpo de partida alteradas. Un anticuerpo puede sintetizarse por ingeniería genética modificando uno o más residuos en una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de entramado. Además o como alternativa, un anticuerpo se puede sintetizar por ingeniería genética modificando los residuos en la región o regiones constantes para, por ejemplo, alterar la función o las funciones efectoras del anticuerpo.

Por ejemplo, se pueden utilizar injertos de CDR para sintetizar por ingeniería genética regiones variables de anticuerpos. Los anticuerpos interaccionan con los antígenos de interés predominantemente a través de los residuos aminoacídicos que están situados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena 65 pesada y de la cadena ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que en las secuencias que no pertenecen a las CDR. Debido a que las secuencias CDR son

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responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de los anticuerpos específicos espontáneos construyendo vectores de expresión que incluyan las secuencias CDR del anticuerpo específico espontáneo injertadas en las secuencias de entramado de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, p. ej., Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:1002910033; las Patentes de EE. UU. N.os 5 225 539; 5 530 101; 5 585 089; 5 693 762 y 6 180 370).

Por consiguiente, otra realización de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 13, respectivamente, y una región variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 31, respectivamente. Por lo tanto, dichos anticuerpos contienen las secuencias CDR de VH y VL del anticuerpo monoclonal 25F7 y pueden contener secuencias de entramado diferentes de este anticuerpo.

Dichas secuencias de entramado pueden ser obtenidas de bases de datos de ADN públicas o de las referencias publicadas que incluyen secuencias del gen del anticuerpo de la línea germinal. Por ejemplo, se pueden encontrar secuencias de ADN de la línea germinal para genes de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera humanas en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible de Internet en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como también en Kabat et al. (1991), cited supra; Tomlinson et al. (1992) " The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox et al. (1994) " A Directory of Human Germline VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836. A modo de otro ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de las cadenas ligera y pesada humanas se pueden encontrar en la base de datos del Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de la cadena pesada de la línea germinal encontradas en el ratón HCo7 HuMAb están disponibles con los siguientes números de acceso en Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). A modo de otro ejemplo, las siguientes secuencias de la cadena pesada de la línea germinal encontradas en el ratón HCo12 HuMAb están disponibles con los siguientes números de acceso en Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) y 3-23 (AJ406678).

Las secuencias de proteínas del anticuerpo se comparan con una base de datos de secuencias de proteínas compilada usando uno de los métodos de búsqueda de similitud entre secuencias llamado el Gapped BLAST (Altschul et al. (1997), supra), con el que estarán familiarizados los expertos en la materia.

Las secuencias de entramado preferidas para utilizar en los anticuerpos de la invención son aquéllas que son estructuralmente similares a las secuencias de entramado utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invención, es decir, similares a la secuencia de entramado VH 4-34 (SEC ID Nº: 61) y/o la secuencia de entramado VK L6 (SEC ID Nº: 63) utilizadas por el anticuerpo monoclonal preferido de la invención. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VK se pueden injertar en las regiones de entramado que poseen la secuencia idéntica a aquella encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal a partir del cual la secuencia de entramado se deriva, o las secuencias CDR se pueden injertar en las regiones de entramado que contienen una o más mutaciones comparadas con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que en ciertos casos es beneficioso mutar los residuos en las regiones de entramado para mantener o fomentar la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N.os 5 530 101; 5 585 089; 5 693 762 y 6 180 370).

Otro tipo de modificación de la región variable es mutar los residuos aminoacídicos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VL para mejorar de esta forma una o más propiedades de la unión (por ejemplo, la afinidad) al anticuerpo de interés. La mutagénesis dirigida o mutagénesis mediada por PCR puede realizarse para introducir la o las mutaciones, y se puede evaluar el efecto sobre la unión del anticuerpo u otra propiedad funcional de interés en ensayos in vitro o in vivo como los que se describen en la presente y se proporcionan en los ejemplos. Se introducen modificaciones preferiblemente conservadoras (como se indicó anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, pero son preferiblemente sustituciones. Es más, normalmente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos en una región CDR.

Por consiguiente, los anticuerpos anti-LAG-3 monoclonales aislados, o las porciones de unión a antígeno de este, descritas en la presente pueden comprender una región variable de la cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparacion con SEC ID Nº: 1; (b) una región CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID Nº: 7; (c) una región CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 13, o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID Nº: 13; (d) una región CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 19, o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID Nº: 19;

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(e) una región CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 25 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en

5 comparación con SEC ID Nº: 25; y (f) una región CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 31 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID Nº: 31.

Los anticuerpos de la invención sintetizados por ingeniería genética incluyen aquellos en los que se han llevado a

10 cabo modificaciones de los residuos de entramado en VH y/o VL para, por ejemplo, mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones del entramado se llevan a cabo para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más residuos de entramado a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutación somática puede contener residuos de entramado que se diferencian de la secuencia de la línea germinal de la cual se deriva

15 el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar comparando las secuencias de entramado del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las cuales se deriva el anticuerpo.

Por ejemplo, la Tabla A muestra regiones en las que una posición de un aminoácido de la región de entramado (utilizando el sistema de numeración de Kabat) es diferente de la línea germinal y cómo se puede retromutar esta

20 posición a la línea germinal mediante las sustituciones indicadas:

Tabla A – Ejemplos de retromutaciones

Región: Posición del aminoácido del entramado (numeración de Kabat) Retromutación

25E3 VH: 72 G72R

25E3 VH: 95 Y95H

25E3 VH: 97 T97A

25E3 VH: 98 T98R

25F7 VH: 69 L69I

25F7 VH: 71 L71V

25F7 VH: 83 R83S

25F7 VH: 97 F97R

8B7 VH: 76 K76N

8B7 VH: 79 A79S

8B7 VH: 83 N83S

8B7 VH: 112 P112Q

11F2 VH: 3 D3A

17E5 VH: 3 H3Q

8B7 VH: 59 C59Y

8B7 VH: 59 C59S

Otro tipo de modificación del entramado implica mutar uno o más residuos en la región de entramado o incluso en una o más regiones CDR para eliminar los epítopos de los linfocitos T con el fin de reducir de este modo la 25 inmunogenicidad potencial del anticuerpo. También se hace referencia a este enfoque como “desinmunización” y se describe más detalladamente en la Publicación de Patente de EE. UU. N.o 20030153043.

Además o como alternativa a las modificaciones llevadas a cabo en las regiones CDR o de entramado, los anticuerpos de la invención se pueden sintetizar por ingeniería genética para que incluyan modificaciones en la 30 región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la unión al complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (p. ej., se pueden enlazar una o más partes de grupos químicos al anticuerpo) o se puede modificar para alterar su glucosilación, para alterar así una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe más detalladamente a

35 continuación. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice UE de Kabat.

En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo isotópico IgG4 que comprende una mutación de Serina a Prolina en la posición correspondiente con la posición 228 (S228P; índice UE) en la región bisagra de la región constante de la cadena pesada. Se ha detectado que esta mutación suprime la heterogeneidad de los puentes 40 disulfuro entre las cadenas pesadas en la región bisagra (Angal et al. supra; la posición 241 se basa en el sistema de numeración de Kabat). Por ejemplo, en varias realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención puede comprender una región variable de la cadena pesada de 25F7 (SEC ID Nº: 37) enlazada a una región constante de

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IgG4 humana en la que la Serina en una posición correspondiente con la posición 241 como se describe en Angal et al., supra, se ha mutado a Prolina. Por lo tanto, par la región variable de la cadena pesada de 25F7 enlazada a la región constante de IgG4 humana, esta mutación se corresponde con una mutación S228P por el índice UE.

En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de manera tal que se altere el número de residuos de cisteína en la región bisagra, p. ej., aumenta o disminuye. Este enfoque se describe además en la Patente de EE. UU. N.o 5 677 425. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar la unión de las cadenas ligeras y pesadas, o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, se muta la región bisagra Fc de un anticuerpo para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfase entre los dominios CH2-CH3 del fragmento bisagra Fc de forma que el anticuerpo dificulte la unión de la proteína A estafilocócica (SpA) relativa a la unión natural de la SpA con el dominio bisagra Fc. Este enfoque se describe más detalladamente en la Patente de EE. UU. N.o 6 165 745.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Varios enfoques son posibles. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de EE. UU. N.o 6 277 375. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión al receptor de reciclaje tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de EE. UU. N.os 5 869 046 y 6 121 022.

En otras realizaciones más, la región de Fc se altera sustituyendo al menos un residuo aminoacídico por un residuo aminoacídico diferente para alterar la o las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden sustituir uno

o más aminoácidos seleccionados de los residuos aminoacídicos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 por un residuo aminoacídico diferente de manera que el anticuerpo posea una afinidad alterada por un ligando efector pero retenga la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo de partida. El ligando efector cuya afinidad se altera puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este método se describe más detalladamente en las Patentes de EE. UU. N.os 5 624 821 y 5 648 260.

En otro ejemplo, se pueden sustituir uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos aminoacídicos 329, 331 y 322 por un residuo aminoacídico diferente de manera que el anticuerpo altere la unión a C1q y/o reduzca o suprima la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe más detalladamente en la Patente de EE. UU. N.o 6 194 551.

En otro ejemplo, se alteran uno o más residuos aminoacídicos en las posiciones de aminoácidos 231 y 239 para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo de fijar el complemento. Este enfoque se describe además en la Publicación PCT WO 94/29351.

En otro ejemplo más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcγ mediante la modificación de uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439. Este enfoque se describe más detalladamente en la Publicación PCT WO 00/42072. Es más, se han asignado los sitios de unión sobre la IgG1 humana para FcγR1, FcγRII, FcγRIII y FcRn, y se han descrito variantes con una unión mejorada (véase Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Se demostró que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoraban la unión a FcγRIII. Además, se demostró que las siguientes mutaciones combinadas mejoraban la unión a FcγRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En otra realización más, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede sintetizar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones del carbohidrato se pueden llevar a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una o más sustituciones de aminoácidos, lo cual produce la eliminación de uno o más sitios de glucosilación en el entramado de la región variable para eliminar de esta forma la glucosilación en ese sitio. Tal aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N.os. 5 714 350 y 6 350 861.

Además o como alternativa, se puede sintetizar un anticuerpo que posee un tipo de glucosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado con cantidades reducidas de residuos fucosilo o un anticuerpo que posee más estructuras de GlcNac de bisección. Se ha demostrado que tales patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad CCDA de los anticuerpos. Tales modificaciones del carbohidrato se pueden llevar a cabo por, por ejemplo, expresión del anticuerpo en una célula huésped con el mecanismo de glucosilación alterado. Las células con el mecanismo de glucosilación alterado han sido descritas en la materia y se pueden utilizar como células

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huésped en las cuales se expresan anticuerpos recombinantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con la glucosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (α-(1,6)-fucosiltransferasa), de forma que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8-/-se crearon mediante la interrupción intencionada del gen FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazo (véase la Publicación de Patente de EE. UU. N.o 20040110704 y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). A modo de otro ejemplo, la EP 1 176 195 describe una línea celular con un gen FUT8 interrumpido funcionalmente, que codifica una fucosil transferasa, de forma que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presenten hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima α-1,6 relacionada con el enlace. La EP 1 176 195 también describe líneas celulares que poseen una actividad enzimática baja para agregar fucosa a la N-acetilglucosamina la cual se une a la región Fc del anticuerpo o que no posee actividad enzimática, por ejemplo, la línea celular YB2/0 (ATCC CRL 1662) del mieloma de rata. La Publicación PCT WO 03/035835 describe una variante de la línea celular CHO, células Lec13, con capacidad reducida para agregar fucosa a los carbohidratos unidos a Asn(297), lo que también produce la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Los anticuerpos con un perfil de glucosilación modificado también se pueden producir en huevos de gallina, como se describe en la Publicación PCT WO 06/089231. Como alternativa, se pueden producir anticuerpos con un perfil de glucosilación modificado en células vegetales, tales como Lemna. Se divulgan métodos para la producción de anticuerpos en un sistema vegetal en la Solicitud de Patente de EE. UU. correspondiente de Alston & Bird LLP, N.o de expediente 040989/314911, presentada el 11 de agosto de 2006. La publicación PCT WO 99/54342 describe líneas celulares modificadas por ingeniería genética para expresar glicosiltransferasas que modifican glicoproteínas (p. ej., β(1,4)-Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de forma que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas por ingeniería genética presentan estructuras GlcNac de bisección incrementadas, lo que produce un aumento de la actividad de CCDA de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Como alternativa, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden ser escindidos utilizando una enzima fucosidasa; p. ej., la α-L-fucosidasa para eliminar los residuos fucosilo de los anticuerpos (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Otra modificación de los anticuerpos de la presente que está contemplada por esta divulgación es la pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar para, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (p. ej., en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o un fragmento de este, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado aldehídico de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se enlazan al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero reactivo análogo hidrosoluble). Se pretende que el término "polietilenglicol", como se utiliza en la presente, englobe cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivatizar otras proteínas, tales como mono-(C1-C10)alcoxi-o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son de uso común en la materia y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, p. ej., EP 0154316y EP 0 401 384.

Propiedades físicas de los anticuerpos

Los anticuerpos de esta divulgación se pueden caracterizar por sus diferentes propiedades físicas y sirven para detectar y/o diferenciar sus diferentes clases.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener uno o más sitios de glucosilación en la región variable de la cadena ligera o en la región variable de la cadena pesada. Dichos sitios de glucosilación pueden producir una mayor inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración del pK del anticuerpo debido a una unión al antígeno alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se sabe que la glucosilación tiene lugar en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-LAG-3 que no contenga glucosilación en la región variable. Esto se puede conseguir seleccionando los anticuerpos que no contienen el motivo de glucosilación en la región variable o mutando residuos en la región de glucosilación.

En una realización preferida, los anticuerpos de la presente divulgación no contienen sitios de isomerismo de asparragina. La desamidación de la asparragina puede tener lugar en las secuencias N-G o D-G y da origen a la creación de un residuo de ácido isoaspártico que introduce una curvatura en la cadena polipeptídica y disminuye su estabilidad (efecto del ácido isoaspártico).

Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico (pI) único, que generalmente entrará en el intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pI para un anticuerpo IgG1 entra normalmente en el intervalo de pH de 7 y 9,5, y el pI para un anticuerpo IgG4 entra normalmente en el intervalo de pH de 6 y 8. Se sospecha que los anticuerpos con un pI que no pertenece al intervalo normal pueden tener cierto despliegue e inestabilidad en condiciones in vivo. Por tanto, es preferible tener un anticuerpo anti-LAG-3 que contenga un valor de pI que entre en el intervalo normal. Esto se puede conseguir seleccionando los anticuerpos con un valor pI en el intervalo normal o mutando residuos superficiales cargados.

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Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, con una temperatura de fusión más elevada indicando una mayor estabilidad general in vivo (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Generalmente, es preferible que la TM1 (la temperatura inicial de despliegue) sea mayor que 60 ºC, preferiblemente mayor que 65 ºC, aún más preferiblemente mayor que 70 ºC. El punto de fusión de un anticuerpo se

5 puede medir usando calorimetría diferencial de barrido (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) dicroismo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

En una realización preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La degradación de un anticuerpo puede medirse utilizando electroforesis capilar (EC) y MALDI-MS (Alexander AJ and Hughes DE (1995) 10 Anal Chem 67:3626-32).

En otra realización preferida, se seleccionan anticuerpos que presentan efectos de agregación mínimos, lo cual puede conducir a que se desencadene una respuesta inmunitaria no deseada y/o a propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables. Generalmente, los anticuerpos con una agregación del 25 % o menor son aceptables,

15 preferiblemente del 20 % o menor, más preferiblemente del 15 % o menor, aún más preferiblemente del 10 % o menor y aún más preferiblemente del 5 % o menor. La agregación se puede medir mediante varias técnicas, incluyendo columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y dispersión de luz.

20 Métodos de síntesis de anticuerpos por ingeniería genética

Como se indicó anteriormente, los anticuerpos anti-LAG-3 que poseen secuencias de VH y VL divulgadas en la presente se pueden utilizar para crear nuevos anticuerpos anti-LAG-3 modificando las secuencias VH y/o VL, o la o las regiones constantes enlazadas a estas. Por lo tanto, las características estructurales de un anticuerpo anti-LAG-3 25 de la invención, p. ej., 25F7, se utilizan para crear anticuerpos estructuralmente relacionados con los anticuerpos anti-LAG-3 que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión a la LAG-3 humana. Por ejemplo, se pueden combinar una o más regiones CDR de 25F7 o mutaciones de esta, recombinantemente con regiones de entramado conocidas y/u otras CDR para crear otros anticuerpos anti-LAG-3 de la invención sintetizados recombinantemente por ingeniería genética, como se indicó anteriormente. Otros tipos de 30 modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de síntesis por ingeniería genética es una o más de las secuencias de VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones CDR de estas. Para crear el anticuerpo sintetizado por ingeniería genética, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como proteína) un anticuerpo que posea una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones CDR de estas. En vez de esto, se utiliza la información

35 contenida en la o las secuencias como el material de partida para crear una o más secuencias de "segunda generación" derivadas de la o las secuencias originales, y después de esto se prepara la o las secuencias de "segunda generación", y se expresan como una proteína.

Por consiguiente, se describe en la presente un método para preparar un anticuerpo anti-LAG-3 que comprende: 40

(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia CDR1 de SEC ID Nº: 1, la secuencia CDR2 de SEC ID Nº: 7 y/o la secuencia CDR3 de SEC ID Nº: 13; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia CDR1 de SEC ID Nº: 19, la secuencia CDR2 de SEC ID Nº: 25 y/o la secuencia CDR3 de SEC ID Nº: 31;

45 (b) alterar al menos un residuo aminoacídico de la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y

(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

50 Se pueden emplear técnicas de biología molecular estándares para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.

Preferentemente, el anticuerpo codificado por la o las secuencias de anticuerpo alteradas es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-LAG-3 descritos en la presente, dichas 55 propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a:

(i): alta afinidad de unión a la LAG-3 humana;

(ii): unión a la LAG-3 de mono;

(iii) carencia de unión a la LAG-3 de ratón; 60 (iv) una capacidad para inhibir la unión de la LAG-3 a las moléculas del MHC de clase II; y/o

(v) una capacidad para estimular una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta de linfocito T específica para un antígeno).

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar utilizando ensayos estándares de uso 65 común en la materia y/o descritos en la presente, tales como aquellos que se exponen en los ejemplos.

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En ciertas realizaciones de los métodos de síntesis por ingeniería genética de los anticuerpos de la invención, pueden introducirse mutaciones aleatoria o selectivamente a lo largo de la totalidad o en parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-LAG-3, y los anticuerpos anti-LAG-3 modificados resultantes pueden cribarse respecto a su actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en la presente. Existen varios métodos

5 mutacionales descritos en la materia (véanse, p. ej., las Publicaciones PCT WO 02/092780 y WO 03/074679).

Moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención

Otro aspecto de la invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se presenta sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos

o proteínas celulares, por técnicas estándares, incluidos el tratamiento SDS/ alcalino, formación de bandas en CsCl, cromatografía de columna, electroforesis en gel de agarosa y otras de uso común en la materia. Véase, Ausubel, et

15 al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intrónicas. En una realización preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden obtener empleando técnicas de biología molécular estándares. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos portadores de genes de inmunoglobulina humana como se describe a continuación) los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo creado por el hibridoma se pueden obtener por técnicas de amplificación por PCR o clonación de ADNc estándares. Para los anticuerpos obtenidos de una genoteca de genes de inmunoglobulina (p. ej., utilizando técnicas de exposición en fagos), un ácido nucleico que codifica dichos

25 anticuerpos puede obtenerse de la genoteca.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidos de la invención son las que codifican las secuencias VH y VL del anticuerpo monoclonal 25F7. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias V de 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 49-54, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias VL de 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 y 17E5 se muestran en SEC ID Nº: 55-60, respectivamente.

Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse ulteriormente por técnicas estándar de recombinación de ADN, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de las cadenas de anticuerpos de longitud total, en genes de fragmentos Fab o

35 en un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un conector flexible. El término “operativamente unidos”, como se utiliza en este contexto, se pretende que signifique que los dos fragmentos de ADN están unidos de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en fase.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de la cadena pesada de longitud total enlazando operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Se han descrito las secuencias de genes humanos de la región constante de la cadena pesada en la materia (véase, por ejemplo, Kabat et al. (1991), supra) y los fragmentos de ADN que engloban 45 estas regiones se pueden obtener por amplificación estándar por PCR . La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero la más preferible es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede estar operativamente unido a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica región de VL se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de la cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Se han descrito las secuencias de genes humanos de la región constante de la cadena ligera en la materia (véase, por ejemplo, Kabat et al., supra) y los fragmentos de ADN que contienen estas regiones se pueden obtener por medio de amplificación estándar por PCR. En realizaciones

55 preferidas, la región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un conector flexible, p. ej., que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal modo que las secuencias VH y VL pueden expresarse como una proteína de cadena simple contigua, con las regiones VH y VL unidas por el conector flexible (véanse, p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Producción de los anticuerpos monoclonales de la invención

65 Se pueden obtener anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente divulgación utilizando la famosa técnica de hibridación celular somática (hibridoma) de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Otras realizaciones para la

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producción de anticuerpos monoclonales incluyen la transformación oncogénica o vírica de linfocitos B y técnicas de expresión en fagos. Los anticuerpos quiméricos o humanizados están debidamente descritos en la materia. Véanse,

p. ej., las Patentes de EE. UU. No 4 816 567; 5 225 539; 5 530 101; 5 585 089; 5 693 762 y 6 180 370.

En una realización preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra la LAG-3 humana se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos portadores de partes del sistema inmunitario humano en vez del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones a los que se hace referencia en la presente como el ratón HuMAb® y el ratón KM®, respectivamente, y se hace referencia colectivamente a estos en la presente como "ratones portadores de Ig humana".

El ratón HuMAb® (Medarex® Inc.) contiene minilocus de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de las cadenas pesada (µ y γ) y ligera (κ) humanas no transpuestas, junto con mutaciones direccionadas que desactivan los loci endógenos de las cadenas µ y κ (véase, p. ej., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o κ de ratón, y como respuesta a la inmunización, los transgenes de las cadenas pesada y ligera humanas introducidos sufren un cambio de clase y una mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgGκ humanos de alta afinidad (Lonberg et al. (1994), supra; examinado en Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg,

N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding y Lonberg (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536546). La preparación y el uso del ratón HuMAb®, y las modificaciones genómicas portadas por dichos ratones, se describen más detalladamente en Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, cuyo contenido se incorpora a la presente específicamente en su totalidad por referencia. Véanse además las Patentes de EE. UU. N.os 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; 5 789 650; 5 877 397; 5 661 016; 5 814 318; 5 874 299; 5 770 429; y 5 545 807; las Publicaciones PCT N.os WO 92/03918; WO 93/12227; WO 94/25585; WO 97/13852; WO 98/24884; WO 99/45962 y WO 01/14424.

Se pueden generar anticuerpos humanos utilizando un ratón portador de secuencias de inmunoglobulina humanas en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón portador de un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Se hace referencia a este ratón en la presente como a un "ratón KM®" y se describe detalladamente en la Publicación PCT WO 02/43478. También se describe una forma modificada de este ratón, que comprende además un trastorno homocigótico de los genes endógenos del receptor FcRIIB, en la Publicación PCT WO 02/43478 y se hace referencia a este como a un "ratón KM/FCGR2D®". Se pueden utilizar también ratones con transgenes de la cadena pesada de HCo7 o HCo12, o de ambos.

Otras realizaciones con animales transgénicos incluyen el Xenomouse (Abgenix, Inc., Patentes de EE. UU. N.os 5 939 598; 6 075 181; 6 114 598; 6 150 584 y 6 162 963). Otras realizaciones incluyen "ratones TC" (Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727) y vacas portadoras de transcromosomas de las cadenas pesada y ligera humanos (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894; Publicación PCT WO 02/092812).

Como alternativa, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención se preparan utilizando métodos de expresión en fagos para cribar genotecas de genes de inmunoglobulina humanos. Véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. Nº 5 223 409; 5 403 484; 5 571 698; 5 427 908; 5 580 717; 5 969 108; 6 172 197; 5 885 793; 6 521 404; 6 544 731; 6 555 313; 6 582 915 y 6 593 081.

Los anticuerpos monoclonales humanos anti-LAG-3 también se pueden preparar utilizando ratones SCID en los cuales se han reconstituido células inmunitarias humanas de manera tal que se puede generar una respuesta del anticuerpo humano tras la inmunización. Véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N.os. 5 476 996 y 5 698 767.

Además, los anticuerpos anti-LAG-3 humanos pueden prepararse utilizando la exposición en fagos en la que los fagos comprenden ácidos nucleicos que codifican anticuerpos generados en animales transgénicos previamente inmunizados con LAG-3. Preferiblemente, el animal transgénico es un ratón HuMab, KM o Kirin. Véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N.o 6 794 132.

Inmunización de ratones portadores de Ig humana

Pueden inmunizarse ratones portadores de Ig humana con un prepado purificado o enriquecido de un antígeno LAG3, una proteína LAG-3 recombinante o células que expresan una proteína LAG-3. Véanse, p. ej., Lonberg et al. (1994), supra; Fishwild et al. (1996), supra; las Publicaciones PCT WO 98/24884 o WO 01/14424. Preferentemente, se inmunizan ratones de 6-16 semanas con 5-50 µg de proteína LAG-3. Como alternativa, se utiliza una porción de LAG-3 fusionada a un polipéptido que no sea del tipo LAG-3.

Pueden inmunizarse los ratones transgénicos por vía intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV) con antígeno LAG-3 en el adyuvante completo de Freund, seguido de las subsecuentes inmunizaciones IP o IV con antígeno en el adyuvante

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incompleto de Freund. Como alternativa, se utilizan adyuvantes que no sean los de Freund o células completas en ausencia de adyuvante. El plasma puede ser cribado por medio de ELISA y las células de los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina anti-LAG-3 humana se pueden utilizar para las fusiones.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos anti-LAG-3, se pueden aislar y fusionar esplenocitos y/o células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados a una línea celular inmortalizada apropriada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden cribar según su producción de anticuerpos específicos para el antígeno. La generación de hibridomas es de uso común en la materia. Véase, p. ej., Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York.

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales de la invención

Los anticuerpos de la invención pueden obtenerse en un transfectoma de células húesped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de recombinación de ADN y métodos de transfección de genes como es de uso común en la materia (p. ej., Morrison, S. (1985) Science 229:1202). En una realización, se inserta ADN que codifica cadenas pesadas y ligeras de longitud parcial o completa obtenido por técnicas estándares de biología molecular en uno o más vectores de expresión de forma que los genes estén operativamente unidos a las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción. En este contexto, el término "operativamente unido" se pretende que signifique que un gen del anticuerpo está ligado en un vector de manera que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector cumplan con la función deseada de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo.

Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de las cadenas de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células huésped de mamíferos incluyen elementos víricos que controlan los niveles de expresión elevados de proteínas en células de mamíferos, tales como promoteres y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, (p. ej., el promotor principal tardío de adenovirus (AdMLP) y polioma. Como alternativa, se pueden utilizar secuencias reguladoras que no sean víricas, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de β-globina. Además, elementos reguladores compuestos por secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRα, que contiene secuencias del promotor temprano del SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos humanos T tipo 1 (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan de modo que sean compatibles con la célula huésped de expresión utilizada.

Los genes de la cadena ligera del anticuerpo y los genes de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en el mismo o en diferentes vectores de expresión. En realizaciones preferidas, las regiones variables se utilizan para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en los vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera del isotipo deseado de forma que el segmento VH esté operativamente unido al o a los segmentos CH en el vector y el segmento VL esté operativamente unido al segmento CL en el vector. Además o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señalización que facilite la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula huésped. Los genes de la cadena del anticuerpo se pueden clonar en el vector de forma que el péptido de señalización se una en fase al amino terminal de los genes de la cadena del anticuerpo. El péptido de señalización puede ser un péptido de señalización inmunoglobulínico o un péptido de señalización heterólogo (es decir, un péptido de señalización de una proteína no inmunoglobulínica).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar otras secuencias, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (p. ej, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las cuales el vector ha sido introducido (véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N.os 4 399 216, 4 634 665 y 5 179 017). Por ejemplo, el gen marcador seleccionable normalmente confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, o una célula huésped en la cual el vector ha sido introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para utilizar en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexata) y el neo gen (para la selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, se transfecta el o los vectores de expresión que codifican las cadenas ligera y pesada en una célula huésped por técnicas estándares. Se pretende que las diferentes formas del término "transfección" engloben una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huesped procariota o eucariota, p. ej., electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrano y análogos. Aunque en teoría es posible expresar los anticuerpos de la invención en

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células huésped procariotas o eucariotas, se prefiere la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferentemente células huésped de mamíferos, porque dichas células eucariotas y, en particular, las células de mamíferos son más propensas a ensamblar y secretar un anticuerpo debidamente plegado e inmunológicamente activo que las células procariotas .

Las células huésped de mamífero preferidas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células ováricas de hámster chino (CHO) (incluidas las células dhfr -CHO, descritas en Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador de DHFR seleccionable, p. ej., como el que se describe en R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621); células NSO de mieloma; células COS y células SP2. En particular, para utilizar con células NSO de mieloma, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión de genes GS divulgado en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841. Cuando se introducen vectores de expresión que codifican genes de anticuerpos en células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen por cultivo de las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos estándares de purificación de proteínas.

Caracterización de la unión del anticuerpo al antígeno

Se pueden analizar los anticuerpos de la invención para determinar su unión a la LAG-3 humana, por ejemplo, por ELISA estándar. Las IgG anti-LAG-3 humanas se pueden analizar además para determinar su reactividad con un antígeno LAG-3 por inmunotransferencia de tipo Western. La especificidad de unión de un anticuerpo de la invención también se puede determinar monitorizando la unión del anticuerpo a las células que expresan una proteína LAG-3, por ejemplo, por citometría de flujo. Estos métodos son de uso común en la materia. Véase, p. ej., Harlow and Lane (1988), citado supra.

Inmunoconjugados

Los anticuerpos de esta invención se pueden conjugar con un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado tal como un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). Los agentes terapéuticos adecuados incluyen antimetabolitos, agentes alquilantes, ligandos de unión al surco menor de ADN, intercaladores de ADN, entrecruzadores de ADN, inhibidores de la histona deacetilasa, inhibidores de exportación nuclear, inhibidores de proteasomas, inhibidores de la topoisomerasa I o II, inhibidores de proteínas de choque térmico, inhibidores de la tirosina cinasa, antibióticos y agentes antimitóticos. En el ADC, el anticuerpo y el agente terapéutico están preferentemente conjugados a través de un conector escindible tal como un conector peptidilo, disulfuro o hidrazona. Más preferentemente, el conector es un conector peptidilo tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEC ID Nº:15), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser o Glu. Los ADC se pueden preparar como se describe en las Patentes de EE. UU. N.os 7 087 600; 6 989 452 y 7 129 261; las Publicaciones PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312 y WO 08/103693; las Publicaciones de Patentes de EE. UU. 20060024317; 20060004081 y 20060247295.

Moléculas biespecíficas

En otro aspecto, la presente divulgación presenta moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-LAG3 unido a al menos una molécula funcional diferente, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une al menos a dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. Por lo tanto, como se utiliza en la presente, "molécula biespecífica" incluye moléculas que poseen tres o más especificidades. En una realización preferida, la molécula biespecífica comprende una primera especificidad de unión para la LAG-3 y una segunda especificidad de unión para una molécula inductora que recopila células efectoras citotóxicas que pueden matar una célula diana que expresa la LAG-3. Son ejemplos de moléculas inductoras adecuadas CD64, CD89, CD16 y CD3. Véase, p. ej., Kufer et al., TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004).

En una realización, una molécula biespecífica posee, además de una especificidad de unión para anti-Fc y una especificidad de unión para anti-LAG-3, una tercera especificidad. La tercera especificidad puede ser para un antifactor potenciador (EF, por sus siglas en inglés), por ejemplo, una molécula que se une a una proteína superficial involucrada en la actividad citotóxica y, por lo tanto, aumenta la respuesta inmunitaria contra la célula diana. Por ejemplo, el anti-factor potenciador puede unirse a un linfocito T citotóxico (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40 ó ICAM-1) u otra célula inmunitaria, lo que da lugar a una mayor respuesta inmunitaria contra la célula diana.

Las moléculas biespecíficas pueden presentarse en diferentes formatos y tamaños. En un extremo del espectro de tamaños, una molécula biespecífica retiene el formato tradicional del anticuerpo, a no ser porque en vez de poseer dos ramas de unión de idéntica especificidad, posee dos ramas de unión cada una con una especificidad diferente. En el otro extremo, las moléculas biespecíficas que consisten en dos fragmentos de anticuerpo monocatenarios (scFv’s) unidos por una cadena peptídica, llamada constructo Bs(scFv)2. Las moléculas biespecíficas de tamaño

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intermedio incluyen dos fragmentos F(ab) diferentes unidos por un conector peptidilo. Las moléculas biespecíficas en estos u otros formatos se pueden preparar por ingeniería genética, hibridación somática o métodos químicos. Véase,

p. ej., Kufer et al, citado supra; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998) y van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000), y las referencias citadas en estos.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente divulgación formulado junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Puede contener opcionalmente uno o más principios farmacéuticamente activos, tales como otro anticuerpo o un fármaco. Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en una terapia combinada con, por ejemplo, otro agente inmunoestimulador, un agente anticanceroso, un agente antivírico o una vacuna, de forma que el anticuerpo anti-LAG-3 aumente la respuesta inmunitaria contra la vacuna.

La composición farmacéutica puede comprender múltiples excipientes. Los excipientes que se pueden utilizar incluyen portadores, agentes activos superficiales, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinanetes sólidos, agentes de suspensión o dispersión, solubilizadores, colorantes, saborizantes, recubrimientos, disgregantes, lubricantes, edulcorantes, conservantes, agentes isotónicos y combinaciones de estos. La selección y el uso de excipientes adecuados se explica en Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003).

Preferiblemente, una composición farmacéutica es adecuada para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., por inyección o infusión). Según la vía de administración, el compuesto activo puede estar recubierto con un material para proteger el compuesto contra la acción de ácidos y de otras condiciones naturales que pueden desactivarlo. La expresión "administración parenteral", tal como se utiliza en la presente, hace referencia a los diferentes modos de administración aparte de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluye, sin limitar, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e intraesternal. Como alternativa, un anticuerpo de la invención se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” hace referencia a una sal que retiene la actividad biológica del compuesto de partida deseada y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos atóxicos, tales como hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosfórico y análogos, así como también ácidos orgánicos atóxicos, tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos aromáticos y alifáticos, y análogos. Las sales de adición de bases incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y análogos, así como también de aminas orgánicas atóxicas, tales como N, N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína y análogas.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles. También se pueden formular en forma de una microemulsión, liposoma u otras estructuras ordenadas adecuadas para una alta concentración de fármaco.

La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material portador para obtener una forma farmacéutica simple variará dependiendo del sujeto que se está tratando y el modo particular de administración y será generalmente la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. Generalmente, de un 100 %, esta cantidad variará de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 99 % de principio activo, preferentemente de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 70 %, más preferentemente de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 % de principio activo combinado con un portador farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el transcurso de un tiempo determinado o se puede reducir o aumentar la dosis proporcionalmente según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosis para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. Como se utiliza en la presente, forma farmaceútica unitaria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el portador farmacéutico requerido. Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar como formulación de liberación prolongada, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente.

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Para la administración del anticuerpo, la dosis varía desde aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg y más frecuentemente de 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso 5 corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen ejemplar de tratamiento implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez de cada 3 a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención incluyen 1 mg/kg peso corporal o 3 mg/kg peso corporal mediante administración intravenosa, siendo el anticuerpo administrado mediante uno de los siguientes programas de

10 dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguidos de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, la dosis se ajusta para alcanzar una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 µg/ml y en algunos métodos de aproximadamente 25-300 µg/ml.

15 Una "dosis terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención produce preferentemente una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los periodos exentos de síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o la incapacidad debidos a la aflicción causada por la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de sujetos que sufren tumores, una "dosis terapéuticamente eficaz" inhibe preferiblemente el crecimiento del tumor al menos aproximadamente en un 20 %,

20 más preferentemente al menos aproximadamente en un 40 %, aún más preferentemente al menos aproximadamente en un 60 % y aún más preferentemente al menos aproximadamente en un 80 % con relación a los sujetos sin tratar. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño de un tumor o si no aliviar los síntomas en un sujeto, que suele ser un ser humano o puede ser otro mamífero.

25 La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación regulada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se suelen emplear polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como un copolímero de acetato de vinilo y etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,

J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

30 Las composiciones terapéuticas se pueden administrar mediante dispositivos médicos tales como (1) dispositivos para inyecciones hipodérmicas sin agujas (p. ej., US 5 399 163; 5 383 851; 5 312 335; 5 064 413; 4 941 880; 4 790 824 y 4 596 556); (2) bombas para microinfusión (US 4 487 603); (3) dispositivos transdérmicos (US 4 486,194); (4) equipos para infusión (US 4 447 233 y 4 447 224); y (5) dispositivos osmóticos (US 4 439 196 y 4 475 196).

35 En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención se pueden formular para garantizar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención traspasen la barrera hematoencefálica, se pueden formular en forma de liposomas, que pueden comprender además grupos de direccionamiento para potenciar un transporte selectivo a células u órganos específicos. Véase, p. ej., US

40 4 522 811; 5 374 548; 5 416 016 y 5 399 331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994)

J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123 y Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

45 Usos y métodos de la invención

Los anticuerpos, las composiciones de los anticuerpos y los métodos de la presente invención poseen múltiples usos in vitro e in vivo relacionados con, por ejemplo, la detección de la LAG-3 o la potenciación de una respuesta

50 inmunitaria por bloqueo de la LAG-3. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos. Por ejemplo, se pueden administrar estas moléculas a células en cultivos, in vitro o ex vivo,o a sujetos humanos, p. ej., in vivo, para potenciar la inmunidad en varias situaciones. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de este, de la invención para su uso en un método para modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o

55 una porción de unión a antígeno de este, de la invención de forma que se modifique la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta se intensifica, estimula o regula en sentido creciente.

Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que requieran potenciar una respuesta inmunitaria. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que sufran un trastorno que puede ser tratado

60 mediante el incremento de una respuesta inmunitaria (p. ej., la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T). En una realización particular, los métodos son particularmente adecuados para tratar el cáncer in vivo. Para conseguir potenciar la inmunidad específica para un antígeno, se pueden administrar los anticuerpos anti-LAG-3 junto con un antígeno de interés o el antígeno puede que ya esté presente en el sujeto a tratar (p. ej., un sujeto que padece un tumor o portador de un virus). Cuando los anticuerpos contra la LAG-3 se administran junto con otro agente, se

65 pueden administrar los dos en cualquier orden o simultáneamente.

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La invención proporciona además métodos para detectar la presencia del antígeno de LAG-3 humana en una muestra o medir la cantidad del antígeno de LAG-3 humana, que comprenden poner en contacto la muestra y una muestra de control con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno de este, que se une específicamente a la LAG-3 humana, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo,

5 o una porción de este, y la LAG-3 humana. Poteriormente se detecta la formación de un complejo. Cuando, al comparar, exista una diferencia en la formación de complejo entre la muestra y la muestra de control esto indica la presencia de antígeno LAG-3 humano en la muestra. Es más, los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención se pueden utilizar para purificar LAG-3 humana mediante purificación según su inmunoafinidad.

Debido a la capacidad de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención de inhibir la unión de la LAG-3 a moléculas del MHC de clase II y estimular respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno, los anticuerpos de la invención también pueden usarse en métodos in vitro e in vivo para estimular, intensificar o aumentar respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede usarse en un método de estimulación de una respuesta de un linfocito T específica para un antígeno que comprende poner dicho linfocito T

15 en contacto con el anticuerpo de la invención de forma que se estimule una respuesta del linfocito T específica para el antígeno. Cualquier indicador adecuado de una respuesta de linfocito T específica para un antígeno se puede utilizar para medir la respuesta de linfocito T específica del antígeno. Los ejemplos no limitantes de tales indicadores adecuados incluyen una mayor proliferación de linfocitos T en presencia del anticuerpo y/o una mayor producción de citocinas en presencia del anticuerpo. En una realización preferida, se estimula la producción de interleucina 2 por parte del linfocito T específico para el antígeno.

La invención también proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta de linfocito T específica para un antígeno) en un sujeto que comprende administrar el anticuerpo de la invención al sujeto de forma que se estimule una respuesta inmunitaria (p. ej., una

25 respuesta de linfocito T específica para el antígeno) en el sujeto. En una realización preferida, el sujeto es un sujeto que padece un tumor y se estimula una respuesta inmunitaria contra el tumor. En otra realización preferida, el sujeto es un sujeto portador de un virus y se estimula una respuesta inmunitaria contra el virus.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo de la invención de forma que se inhiba el crecimiento del tumor en el sujeto. En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para tratar una infección vírica en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo de la invención de forma que se trate la infección vírica en el sujeto.

35 Este y otros usos de la invención se explican con más detalle a continuación.

Cáncer

El bloqueo de la LAG-3 por parte de los anticuerpos puede potenciar la respuesta inmunitaria a células cancerosas en el paciente. En un aspecto, la presente invención hace referencia a un anticuerpo de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto in vivo de modo que se inhiba el crecimiento de tumores cancerosos. Puede utilizarse un anticuerpo anti-LAG-3 exclusivamente para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, se puede utilizar un anticuerpo anti-LAG-3 junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos estándares del cáncer u otros anticuerpos, como se describe a continuación.

45 Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo de la invención, o una porción de unión a antígeno de este, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-LAG-3 o una porción de unión a antígeno de este. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-LAG-3 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos humanos anti-LAG-3 humana descritos en la presente). Además o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-LAG-3 quimérico o humanizado.

Los cánceres preferidos cuyo crecimiento puede inhibirse utilizando los anticuerpos de la invención incluyen los cánceres normalmente sensibles a inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para el

55 tratamiento incluyen melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), cáncer renal (p. ej., carcinoma de células claras), cáncer prostático (p. ej., adenocarcinoma prostático refractario a hormonas), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón (p. ej., cáncer no microcítico de pulmón). Además, la invención incluye neoplasias refractarias o recurrentes cuyo crecimiento se puede inhibir utilizando los anticuepos de la invención.

Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse utilizando los métodos de la invención incluyen cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cáncer de esófago, cáncer del 65 intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias

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crónicas o agudas incluidos la leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis de tumores, tumor del eje raquídeo, glioma del tallo cerebral, adenoma de la hipófisis, sarcoma de

5 Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos por el medio ambiente incluidos los inducidos por asbesto y combinaciones de dichos cánceres. La presente invención también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos, especialmente de cánceres metastásicos que expresan la PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144).

Opcionalmente, los anticuerpos contra la LAG-3 se pueden combinar con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluidos proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidrato), células y células transfectadas con genes codificantes de citocinas inmunoestimulantes (He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos no limitantes de vacunas contra tumores que se pueden utilizar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o

15 tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (se explica más detalladamente a continuación).

En los seres humanos, se ha detectado que algunos tumores son inmunogénicos, como por ejemplo los melanomas. Al aumentar el umbral de activación de linfocitos T mediante el bloqueo de la LAG-3, se pueden activar las respuestas tumorales en el huésped.

El bloqueo de la LAG-3 es posible que alcance su máxima eficacia cuando se combina con un protocolo de vacunación. Se han desarrollado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S. (2000) Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C.,

25 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, cap. 61, págs. 3023-3043 en DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, quinta edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna utilizando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares alcanzan su máxima efectividad cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un activador potente de la presentación de antígeno para la vacunación contra tumores (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43).

El estudio de la expresión génica y de los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 35 281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumores son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que surgió el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Cabe destacar que se puede demostrar que muchos de estos antígenos que son las dianas de linfocitos T específicos para el tumor localizados en el huésped. El bloqueo de la LAG-3 se puede utilizar junto con un conjunto de proteínas y/o péptidos recombinantes expresados en un tumor a fin de generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente consideradas como autoantígenos por el sistema inmunitario y son por lo tanto tolerantes a ellas. El antígeno tumoral puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y solamente en un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). (Estos tejidos somáticos pueden estar protegidos contra el ataque inmunitario por diversos medios). Los antígenos tumorales también pueden ser 45 "neoantígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de las proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no afines (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelphia)

o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas contra tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como el virus del papiloma humano (VPH), el virus de la hepatitis (VHB y VHC) y el virus herpético del sarcoma de kaposi (VSHK). Otra forma de antígeno específico de un tumor que se puede utilizar junto con el bloqueo de la LAG-3 es la de las proteínas de choque térmico (PCT) purificadas aisladas del propio tejido del tumor. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas PCT son muy eficaces en el suministro a las células presentadoras de antígeno para estimular la inmunidad contra el tumor (Suot & Srivastava (1995) Science

55 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).

Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígeno potentes que se pueden utilizar para cebar respuestas específicas para un antígeno. Las CD se pueden producir ex vivo y cargarse con varios antígenos proteínicos y peptídicos así como también extractos de células tumorales (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD pueden transducirse por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las CD también se han fusionado directamente a células tumorales a efectos de inmunización (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunación, la inmunización con CD se puede combinar eficazmente con el bloqueo de la LAG-3 para activar respuestas antitumorales más potentes.

65 El bloqueo de la LAG-3 también se puede combinar con tratamientos contra el cáncer estándares. El bloqueo de la LAG-3 se puede combinar eficazmente con regímenes quimioterapeúticos. En estos casos, puede ser posible

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reducir la dosis de agente quimioterapéutico administrada (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de dicha combinación es un anticuerpo anti-LAG-3 combinado con decarbazina para el tratamiento de un melanoma. Otro ejemplo de dicha combinación es un anticuerpo anti-LAG-3 combinado con interleucina 2 (IL-2) para el tratamiento de un melanoma. La base científica racional que respalda el uso combinado del bloqueo de la LAG-3 y quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar como resultado niveles incrementados de antígeno tumoral en el sistema de presentación del antígeno. Otras terapias combinatorias que pueden dar como resultado sinergia con el bloqueo de la LAG-3 por muerte celular son radiación, cirugía y supresión hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. También se pueden combinar inhibidores de la angiogénesis con el bloqueo de la LAG-3. La inhibición de la angiogénesis produce la muerte de las células tumorales que pueden alimentar el antígeno tumoral en los sistemas de presentación de antígeno del húesped.

Los anticuerpos bloqueantes de la LAG-3 se pueden utilizar también combinados con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor Fcα o Fcγ a las células tumorales (véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N.os 5 922 845 y 5 837 243). Pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos para hacer frente a dos antígenos separados. Por ejemplo, se han utilizado anticuerpos biespecíficos anti-receptor Fc/antiantígeno tumoral

(p. ej., Her-2/neu) para dirigir macrófagos a los sitios de un tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas específicas contra tumores. La rama de linfocitos T de estas respuestas podría incrementarse mediante el uso del bloqueo de la LAG-3. Como alternativa, puede suministrarse directamente el antígeno a las CD mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y a un marcador de la superficie celular específico para células dendríticas.

Los tumores eluden la vigilancia inmunitaria del huésped mediante una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser contrarrestados mediante la desactivación de las proteínas que son expresadas por los tumores y que son imunosupresoras. Estas incluyen entre otras el TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200) y el ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Pueden utilizarse anticuerpos para cada una de estas entidades combinados con anti-LAG-3 para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias a los tumores por parte del huésped.

Otros anticuerpos que activan la capacidad de respuesta inmunitaria del huésped se pueden utilizar combinados con anti-LAG-3. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendítricas que activan la función de las CD y la presentación de antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad auxiliar de los linfocitos T (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) y se pueden utilizar junto con anticuerpos de la LAG-3 (Ito et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). Los anticuerpos activantes de moléculas coestimuladoras de linfocitos T tales como CTLA-4 (p. ej., la Patente de EE. UU. N.o 5 811 097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266) también pueden proporcionar niveles incrementados de activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se está utilizando actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Si bien la enfermedad de injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, puede obtenerse beneficio terapéutico de las respuestas del injerto contra el tumor. Puede utilizarse el bloqueo de la LAG-3 para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos para el tumor injertados en el donante.

Existen también varios protocolos de tratamiento experimentales que implican la activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos para el antígeno y la transferencia adoptiva de estos linfocitos a los destinatarios para estimular linfocitos T contra el tumor específicos para el antígeno (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos pueden utilizarse también para activar las respuestas de linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. La activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-LAG-3 puede aumentar la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

Enfermedades infecciosas

La invención también es útil para tratar pacientes que han estado expuestos a toxinas o patógenos particulares. Por consiguiente, se describe en la presente un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3, o una porción de unión a antígeno de este, de forma que se trate la enfermedad infecciosa del sujeto. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-LAG-3 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-LAG-3 humanos descritos en la presente). Además o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado.

De forma análoga a su aplicación en tumores como se indicó anteriormente, el bloqueo de la LAG-3 mediado por anticuerpos puede utilizarse solo o como adyuvante, combinado con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los cuales puede ser particularmente útil este enfoque terapéutico, incluyen patógenos para los cuales no existe actualmente ninguna vacuna eficaz o patógenos para los cuales las vacunas convencionales no son completamente eficaces. Estos incluyen, pero no se limitan a, VIH, hepatitis (A, B y C), gripe, herpes, giardia, malaria, leishmania, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. El bloqueo de la LAG-3 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como el VIH que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración de anti-LAG-3 humanos, provocando de este modo una respuesta fuerte de los linfocitos T que no es amortiguada por señales negativas procedentes de la

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5 LAG-3.

Algunos ejemplos de virus patógenos causantes de infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), virus herpéticos (p. ej., VZV, VHS-I, VHA-6, VHS-II y CMV, virus de Epstein-Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus Coxsackie, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus de la vacuna, virus VLTH, virus del dengue, papilomavirus, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus de JC y virus arboviral de la encefalitis.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas causantes de infecciones tratables por los métodos de la invención

15 incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, pneumococos, meningococos y gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y la bacteria de la enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patógenos causantes de infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen Candida (albicans, kruzei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), el género Mucorales (mucor, absidia, rizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos causantes de infecciones tratables por los métodos de la invención

25 incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, Nippostrongylus brasiliensis.

En todos los métodos anteriores, el bloqueo de la LAG-3 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia tales como el tratamiento con citocinas (p. ej., interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia con anticuerpos biespecíficos, lo cual proporciona una mejor presentación de antígenos tumorales (véase, p. ej., Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).

Reacciones autoinmunitarias

35 Los anticuerpos anti-LAG-3 pueden provocar y amplificar respuestas autoinmunitarias. De hecho, la inducción de respuestas antitumorales utilizando células tumorales y vacunas peptídicas pone de manifiesto que muchas respuestas antitumorales implican anti-autoreactividades (van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996)

J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4). Por lo tanto, es posible considerar la utilización del bloqueo de la anti-LAG-3 junto con diversas autoproteínas para elaborar protocolos de vacunación para generar eficazmente respuestas inmunitarias contra estas autoproteínas para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer da lugar a la acumulación inadecuada del péptido Aβ en depósitos de amiloide en el cerebro; las respuestas de anticuerpos contra el amiloide son capaces de eliminar estos depósitos de amiloide

45 (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177).

También se pueden utilizar otras autoproteínas como dianas tales como IgE para el tratamiento de alergias y de asma así como el TNFα para la artritis reumatoide. Por último, se pueden inducir respuestas de anticuerpos a varias hormonas mediante el uso del anticuerpo anti-LAG-3. Las respuestas de anticuerpos neutralizantes a hormonas reproductoras se pueden utilizar para la anticoncepción. La respuesta de anticuerpos neutralizantes a hormonas y otros factores solubles que se requieren para el crecimiento de tumores particulares también pueden considerarse como posibles dianas de vacunación.

Se pueden utilizar métodos análogos a los descritos anteriormente para el uso del anticuerpo anti-LAG-3 con el fin

55 de inducir respuestas terapéuticas autoinmunitarias para tratar pacientes que sufran una acumulación inadecuada de otros autoantígenos, tales como depósitos de amiloide, incluidos de Aβ en la enfermedad de Alzheimer, de citocinas tales como del TNFα, y de IgE.

Vacunas

Se pueden utilizar anticuerpos anti-LAG-3 para estimular respuestas inmunitarias específicas para un antígeno mediante la administración de un anticuerpo anti-LAG-3 junto con un antígeno de interés (p. ej., una vacuna). Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, o porción de unión a antígeno de este, para su uso en un método para potenciar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto, 65 que comprende administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) el anticuerpo anti-LAG-3, o una porción de unión a antígeno de este, de forma que se potencia una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. Preferentemente, el

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anticuerpo es un anticuerpo anti-LAG-3 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-LAG-3 humanos descritos en la presente). Además o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno vírico, un antígeno bacteriano o un antígeno procedente de un patógeno. Los ejemplos no limitantes de tales antígenos incluyen los indicados en las

5 secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas contra tumores) indicados anteriormente o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Se conocen perfectamente en la materia las vías adecuadas de administración in vivo in vitro de las composiciones de anticuerpo (p. ej., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención y pueden ser elegidas por un experto en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos se pueden administrar por inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo.

15 Como se ha descrito previamente, los anticuerpos anti-LAG-3 humanos de la invención se pueden administrar junto con uno o más agentes terapéuticos diferentes, p. ej., un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede estar unido al agente (como un inmunocomplejo) o se puede aministrar separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después o a la vez que el agente o se puede administrar junto con otras terapias de uso habitual, por ejemplo, una terapia contra el cáncer, por ejemplo, radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos, tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino-sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil, dacarbazina y ciclofosfamida-hidroxiurea que, por sí solos, son eficaces solamente a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa en una dosis de 100 mg/ml una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa en una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21

25 días. La administración conjunta de anticuerpos anti-LAG-3 humanos, o fragmentos de unión a antígeno de estos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerosos que operan mediante diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico sobre las células tumorales humanas. Dicha administración conjunta puede solucionar los problemas ocasionados por el desarrollo de resistencia a los fármacos

o por un cambio en la antigenicidad de las células tumorales lo que las harían no reactivas al anticuerpo.

Asimismo, dentro del alcance de la presente invención se encuentran kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la invención (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) y las instrucciones para su empleo. El kit puede contener además como mínimo un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (p. ej., un anticuerpo humano que posea

35 una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno LAG-3 distinto del primer anticuerpo humano). Los kits normalmente incluyen una etiqueta que indica el uso indicado del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o registrado suministrado en o con el kit, o comoquiera que acompañe el kit.

Terapia combinada

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en métodos de terapia combinada en los que se administra el anticuerpo anti-LAG-3 junto con uno o más anticuerpos adicionales que son eficaces en la estimulación de respuestas inmunitarias para de este modo potenciar, estimular o aumentar las respuestas inmunitarias en un sujeto. Por ejemplo, la invención proporciona un método para estimular una 45 respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y uno o más anticuerpos inmunoestimuladores adicionales, tales como un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, de forma que se estimule una respuesta inmunitaria en el sujeto, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o estimular una respuesta antivírica. En una realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-1. En otra realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización más, se administra al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-CTLA-4. En una realización, el anticuepro anti-LAG-3 es un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo de la divulgación. Como alternativa, el anticuerpo anti-LAG-3 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (p. ej., preparado de un mAb anti-LAG-3 de ratón). En otra realización, dicho anticuerpo inmunoestimulador adicional (p. ej., el anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o anti-CTLA-4) es un aticuerpo humano.

55 Como alternativa, dicho anticuerpo inmunoestimulador adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (p. ej., preparado a partir de un anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o anti-CTLA-4).

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (p. ej., el cáncer), que comprende administrar el anticuerpo LAG-3 y un anticuerpo CTLA-4 a un sujeto. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra en una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-CTLA-4 se administra en una dosis subterapéutica o se administran ambos en una dosis subterapéutica. En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en un método para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti65 LAG-3 y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-CTLA-4 a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 es el anticuerpo monoclonal 10D1 de secuencia

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humana (descrito en la Publicación PCT WO 01/14424) y el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 25F7 descrito en la presente. Otros anticuerpos anti-CTLA-4 englobados por los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, los divulgados en: WO 98/42752; WO 00/37504; la Patente de EE. UU. N.o 6 207 156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Resumen N.o 2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 se une a la CTLA-4 humana con una KD de 5 x 10 8 M o menor, se une a la CTLA-4 humana con una KD de 1 x 10-8 M o menor, se une a la CTLA-4 humana con una

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KDde5x10Momenor,oseunealaCTLA-4humanaconunaKDdeentre1x10My1x10Momenor.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (p. ej., el cáncer), que comprende administrar el anticuerpo LAG-3 y un anticuerpo PD-1 a un sujeto. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra en una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-1 se administra en una dosis subterapéutica o se administran ambos en una dosis subterapéutica. En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en un método para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti-LAG-3 y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-PD-1 a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 25F7 descrito en la presente. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 de secuencia humana incluyen 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 4A11, que se describen en la Publicación PCT WO 06/121168. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se une a la PD-1 humana con una

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KDde5x10Momenor,seunealaPD-1humanaconunaKDde1x10Momenor,seunealaPD-1humana

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conunaKDde5x10Momenor,oseunealaPD-1humanaconunaKDdeentre1x10My1x10Momenor.

En una realización, la presente invención proporciona anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (p. ej., el cáncer), que comprende administrar el anticuerpo LAG-3 y un anticuerpo PD-L1 a un sujeto. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra en una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-L1 se administra en una dosis subterapéutica o se administran ambos en una dosis subterapéutica. En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en un método para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti-LAG3 y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-PD-L1 a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 25F7 descrito en la presente. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 de secuencia humana incluyen 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4, que se describen en la Publicación PCT WO 07/005874. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 se une a la PD-L1 humana con una KD de 5 x 10-8 M o menor, se une a la PD-L1 humana con una KD de

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1 x 10M o menor, se une a la PD-L1 humana con una KD de 5 x 10M o menor, o se une a la PD-L1 humana con

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unaKDdeentre1x10My1x10Momenor.

El bloqueo de la LAG-3 y uno o más antígenos segunda diana tales como CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 por parte de anticuerpos pueden aumentar la respuesta inmunitaria a células cancerosas en el paciente. Se incluyen entre los cánceres cuyo crecimiento puede ser inhibido utilizando los anticuerpos de la presente divulgación incluyen cánceres normalmente sensibles a inmunoterapia. Los ejemplos representativos de cánceres a tratar con la terapia combinada de la presente divulgación inlcuyen los cánceres específicamente enumerados anteriormente en la explicación de la monoterapia con anticuerpos anti-LAG-3.

En ciertas realizaciones, se puede administrar la combinación de anticuerpos terapéuticos indicada en la presente a la vez que una sola composición en un portador farmacéuticamente aceptable, o a la vez que composiciones separadas con cada anticuerpo en un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la combinación de anticuerpos terapéuticos se puede administrar secuencialmente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-LAG-3 se pueden administrar secuencialmente, tal como la administración del anticuerpo anti-CTLA4 en primer lugar y la del anticuerpo anti-LAG-3 en segundo lugar, o la administración del anticuerpo anti-LAG-3 en primer lugar y la del anticuerpo anti-CTLA-4 en segundo lugar. Además o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-LAG-3 se pueden administrar secuencialmente, tal como la administración del anticuerpo anti-PD1 en primer lugar y la del anticuerpo anti-LAG-3 en segundo lugar, o la administración del anticuerpo anti-LAG-3 en primer lugar y la del anticuerpo anti-PD-1 en segundo lugar. Además o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-L1 y un anticuerpo anti-LAG-3 se pueden administrar secuencialmente, tal como la administración del anticuerpo anti-PD-L1 en primer lugar y la del anticuerpo anti-LAG-3 en segundo lugar, o la administración del anticuerpo anti-LAG-3 en primer lugar y la del anticuerpo anti-PD-L1 en segundo lugar.

Además, si se administra secuencialmente más de una dosis de terapia combinada, el orden de la administración secuencial puede invertirse o mantenerse en el mismo orden en cada momento de la administración, pueden combinarse administraciones secuenciales con administraciones simultáneas o cualquier combinación de estas. Por ejemplo, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-LAG-3 puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con anti-CTLA-4 en primer lugar y anti-LAG-3 en

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segundo lugar, y la tercera administración puede ser secuencial con anti-LAG-3 en primer lugar y anti-CTLA-4 en segundo lugar, etc. Además o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo antiPD-1 y anticuerpo anti-LAG-3 puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con anti-PD-1 en primer lugar y anti-LAG-3 en segundo lugar, y la tercera administración puede ser secuencial con anti-LAG-3 en primer lugar y anti-PD-1 en segundo lugar, etc. Además o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-L1 y anticuerpo anti-LAG-3 puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con anti-PD-L1 en primer lugar y anti-LAG-3 en segundo lugar, y la tercera administración puede ser secuencial con anti-LAG-3 en primer lugar y anti-PD-L1 en segundo lugar, etc. Otro regimen de dosificación representativo puede suponer una primera administración que es secuencial con anti-LAG-3 en primer lugar y anti-CTLA-4 (y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1) en segundo lugar, y las administraciones posteriores pueden ser simultáneas.

Opcionalmente, la combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y uno o más anticuerpos adicionales (p. ej., anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1) puede combinarse posteriormente con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluidos proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidrato), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimuladoras (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos no limitantes de vacunas contra tumores que se pueden utilizar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (se explica más detalladamente a continuación). Un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 se puede combinar además con un protocolo de vacunación, tal como cualquiera de los protocolos de vacunación indicados en detalle anteriormente con respecto a la monoterapia con anticuerpos anti-LAG-3.

Un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 también se puede combinar con tratamientos estándares contra el cáncer. Por ejemplo, un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 se puede combinar eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, es posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente divulgación (Mokyr et al. (1998) Cancer Research

58: 5301-5304). Un ejemplo de dicha combinación es una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 combinados a su vez con decarbazina para el tratamiento de un melanoma. Otro ejemplo es una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 combinados a su vez con interleucina 2 (IL-2) para el tratamiento de un melanoma. La base científica racional que respalda el uso combinado del bloqueo de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar como resultado niveles incrementados de antígeno tumoral en el sistema de presentación del antígeno. Otras terapias combinatorias que pueden dar como resultado sinergia con un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 por muerte celular incluyen radiación, cirugía o supresión hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD1 y/o PD-L1. La inhibición de la angiogénesis produce la muerte de las células tumorales, lo cual puede ser una fuente de antígeno tumoral alimentado en los sistemas de presentación de antígeno del huésped.

También se puede utilizar una combinación de anticuerpos bloqueantes de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 combinados con anticuerpos biespecíficos que dirigen células efectoras que expresan el receptor Fcα o Fcγ a las células tumorales (véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N.os 5 922 845 y 5 837 243). Pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos para hacer frente a dos antígenos separados. La rama de linfocitos T de estas respuestas podría incrementarse mediante el uso de un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1.

En otro ejemplo, se puede utilizar una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti

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PD-L1 junto con anticuerpos antineoplásicos, tales como Rituxan(rituximab), Herceptin(trastuzumab), Bexxar

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(tositumomab), Zevalin(ibritumomab), Campath(alemtuzumab), Lymphocide(eprtuzumab), Avastin(bevacizumab), y Tarceva® (erlotinib), y análogos. A modo de ejemplo y sin pretender quedar limitados por la teoría, el tratamiento con un anticuerpo anticanceroso o un anticuerpo anticanceroso conjugado a una toxina puede producir la muerte de las células cancerosas (p. ej., las células tumorales) lo que podría potenciar una respuesta inmunitaria mediada por CTLA-4, PD-1, PD-L1 o LAG-3. En un ejemplo de una realización, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (p. ej., un tumor canceroso) puede incluir un anticuerpo anticanceroso combinado con anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1, simultánea o secuencialmente o cualquier combinación de estos, lo cual puede potenciar respuestas inmunitarias antitumorales por parte del huésped.

Los tumores eluden la vigilancia inmunitaria del huésped mediante una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser contrarrestados por la desactivación de proteínas, que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen entre otras el TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200) y el ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). En otro ejemplo, se pueden combinar además anticuerpos para cada una de estas entidades con una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 para contrarrestar los efectos de los agentes inmunosupresores y favorecer las respuestas inmunitarias antitumorales por parte del huésped.

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Otros anticuerpos que se pueden utilizar para activar la capacidad de respuesta inmunitaria del huésped se pueden utilizar además combinados con una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1. Estos incluyen moléculas en la superficie de células dendríticas que activan la función de CD y la presentación de antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 (Ridge et al., supra) se pueden utililzar junto con una combinación de anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 (Ito et al., supra). Otros anticuerpos activadores de moléculas coestimuladoras de linfocitos T (Weinberg et al., supra, Melero et al. supra et al., supra) pueden proporcionar además niveles incrementados de activación de linfocitos T.

Como se indicó anteriormente, el trasplante de médula ósea se está utilizando actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Puede utilizarse un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos para tumores injertados en el donante.

Varios protocolos de tratamiento experimentales que implican la activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos para el antígeno y la transferencia adoptiva de estos linfocitos a los destinatarios para identificar linfocitos T contra el tumor específicos para el antígeno (Greenberg & Riddell, supra). Estos métodos pueden utilizarse también para activar las respuestas de linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. Cabe esperar que la activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 aumente la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención para su uso en un método para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa

(p. ej., el cáncer) con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti-LAG-3 y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 a un sujeto. Por ejemplo puede reducirse la frecuencia de la colitis o diarrea inducida por anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Debido a que cualquier paciente que recibe un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador corre el riesgo de desarrollar colitis o diarrea inducida por dicho anticuerpo, esta población entera de pacientes es adecuada para terapia de acuerdo con los métodos de la presente invención. Aunque se han administrado esteroides para tratar la enfermedad intestinal inflamatoria (EII) y prevenir las exacerbaciones de la EII, estos no se han utilizado para prevenir (reducir la aparición de) la EII en pacientes que no han sido diagnosticados de EII. Los efectos secundarios significativos asociados con esteroides, incluso esteroides no absorbibles, han hecho que se desaconseje su uso profiláctico.

En otras realizaciones, un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 blockade (es decir, anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 terapéuticos inmunoestimuladores) se pueden combinar además con el uso de un esteroide no absorbible cualquiera. Como se utiliza en la presente, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que exhibe un metabolismo extenso de primer paso de tal manera que, después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, menor de aproximadamente el 20 %. En una realización de la invención, el esteroide no absorbible es budesónida. La budesónida es un glucocorticosteroide de acción local, que se metaboliza extensamente, fundamentalmente en el hígado, tras su administración oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesónida dependiente del pH y del tiempo desarrollada para optimizar el suministro de fármacos al íleon y a lo largo del colon. ENTOCORT EC® está autorizado en los Estados Unidos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn leve a moderada relacionada con el íleon y/o el colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORT EC® para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT EC® se libera en los intestinos antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa intestinal, ENTOCORT EC® es metabolizado extensamente por el sistema del citocromo P450 en el hígado para dar metabolitos con una actividad glucocorticoide insignificante. Así pues, la biodisponibilidad es baja (aproximadamente del 10 %). La baja biodisponibilidad de la budesónida da como resultado una proporción terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides con metabolismo de primer paso menos extenso. La budesónida da lugar a menos efectos adversos, incluida una menor supresión hipotalámico-hipofisaria, que los corticosteroides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT EC® puede dar lugar a efectos glucocorticoides sistémicos tales como hipercorticismo y supresión adrenal. Véase PDR 58.a ed. 2004; 608-610.

En otras realizaciones más, un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 (es decir, anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 terapéuticos inmunoestimuladores) junto con un esteroide no absorbible se pueden combinar además con un salicitalo. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA tales como, por ejemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire EE. UU.; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

De acuerdo con los usos médicos de la presente invención, un salicilato administrado combinado con anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y un esteroide no absorbible puede incluir cualquier administración superpuesta o secuencial del salicilato y el esteroide no absorbible con el objetivo de reducir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimulantes. Así pues, por ejemplo, los métodos para reducir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores de acuerdo con la presente invención engloban la administración de un salicilato y un esteroide no absorbible simultánea o secuencialmente (p.

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ej., se administra un salicilato 6 horas después de un esteroide no absorbible), o cualquier combinación de estos. Además, de acuerdo con la presente invención, se pueden administrar un salicilato y un esteroide no absorbible por la misma vía (p. ej., se administran ambos por vía oral) o por vías diferentes (p. ej., se administra un salicilato por vía oral y se administra un esteroide no absorbible por vía rectal), que pueden diferir de la o las vías utilizadas para administrar los anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1.

La presente divulgación se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, los cuales no se deben interpretar como limitantes.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra la LAG-3

Los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 humanos se generaron utilizando ratones transgénicos que expresan genes de anticuerpos humanos, como se indica a continuación.

Antígenos

Las proteínas de fusión LAG-3 recombinantes humanas se utilizaron como inmunógeno para generar anticuerpos anti-LAG-3 humanos. En ciertas inmunizaciones, se utilizó como inmunógeno una proteína de fusión que comprendía la región extracelular completa (dominios 1-4) de la LAG-3 humana fusionada a un dominio Fc de inmunoglobulina humana (R&D Systems, # de catálogo 2319-L3) (D1-D4 hFc) o a un dominio Fc de inmunoglobulina de ratón (D1-D4 mFc). Para otras inmunizaciones, se utilizó como inmunógeno una proteína de fusión que comprendía solo los dos primeros dominios extracelulares de la LAG-3 humana fusionada con un dominio Fc de inmunoglobulina de ratón (D1-D2 mFc). Las proteínas de fusión LAG-3 se prepararon utilizando técnicas estándares de recombinación de ADN.

Razas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™ de ratones transcromosómicos transgénicos

Se preparon anticuerpos monoclonales completamente humanos contra la LAG-3 humana utilizando las razas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™ de ratones transcromosómicos transgénicos, que expresan genes de anticuerpos humanos.

En la raza KM Mouse™, se ha alterado homocigóticamente el gen de la cadena ligera kappa endógena de ratón como se describe en Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 y se ha alterado homocigóticamente el gen de la cadena pesada de ratón endógeno como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01/09187. Además, esta raza de ratón porta un transgen de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild ., supra. La raza también contiene el transcromosoma SC20, que porta el locus de la cadena pesada de la Ig humana, como se describe en la Publicación PCT WO 02/43478. La raza KM/FCGR2D Mouse™ es la misma que la raza KM Mouse™ salvo que su genoma también comprende una alteración homocigótica del gen FcRIIB endógeno. Las razas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™ también se describen detalladamente en la Publicación de la Solicitud de EE. UU. N.o 20020199213.

Inmunizaciones de KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™:

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos de la LAG-3, se inmunizaron ratones de las razas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™ con una de las tres proteínas de fusión LAG-3 recombinantes diferentes descritas anteriormente (D1-D4 hFc, D1-D4 mFc, D1-D2, mFc). Los esquemas de inmunización general se describen en Lonberg et al. (1994) supra; Fishwild et al., supra y la Publicación PCT WO 98/24884. Los ratones tenían una edad de 6-16 semanas en el momento de la primera infusión de antígeno. Los ratones se inmunizaron por vía intraperitoneal (IP) y/o subcutánea (SC). Los ratones se inmunizaron cuatro veces cada dos semanas con 10 µg de la proteína de fusión LAG-3 recombinante, seguida de dos inmunizaciones con 20 µg del mismo inmunógeno en Ribi como adyuvante. La respuesta inmunitaria se monitorizó mediante extracciones de sangre retroorbitales. El plasma se cribó por ELISA (como se describe más adelante) y se utilizaron para las fusiones ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-LAG-3. Antes de sacrificar los ratones y extirpar sus bazos, se estimularon por vía intravenosa e intraperitoneal con 20 µg de antígeno, seguidos de una estimulación intravenosa posterior con 20 µg de antígeno.

Selección de ratones KM y KM/FCGR2D que producen anticuerpos anti-LAG-3

Para seleccionar ratones que producían anticuerpos que se unían a la proteína LAG-3, se analizaron sueros de ratones inmunizados con la proteína de fusión D1-D4 hFc por un ELISA modificado como se describe originariamente en Fishwild et al. (1996). Resumiendo, se cubrieron placas de microtítulos con proteína de fusión LAG-3 recombinante purificada con densidad de 1 µg/ml en PBS, 50 µl/pocillos incubados a 4°C durante la noche, posteriormente se bloquearon con 200 µl/pocillo de BSA al 5 % en PBS. Se añadieron diluciones de plasma procedente de ratones inmunizados con LAG-3 a cada pocillo y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y se incubaron posteriormente con un anticuerpo policlonal de cabra anti-cadena ligera kappa humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante una hora a

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temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se revelaron con sustrato ABTS y se analizaron por espectrofotometría con DO 405.

Para ratones inmunizados con proteínas de fusión D1-D4 mFc o D1-D2 mFc, se analizaron sueros de estos ratones por ELISA indirecto utilizando anti-Ig de ratón de cabra para cubrir las placas durante una hora antes de cubirlas con el antígeno para eliminar la unión no específica a la parte Fc de ratón. Posteriormente se llevaron a cabo los mismos pasos de ELISA que se describieron anteriormente.

Los ratones que desarrollaron los títulos más elevados de anticuerpos anti-LAG-3 se utilizaron para las fusiones. Las fusiones se realizaron como se describe a continuación y los sobrenadantes de hibridoma se analizaron para determinar la actividad anti-LAG-3 por ELISA.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos contra proteínas LAG-3

Los esplenocitos de ratón, aislados de ratones KM o KM/FCGR2D, se fusionaron por electrofusión basada en un campo eléctrico utilizando un electroporador de fusión con eliminación selectiva Cyto Pulse de cámara grande (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD) de una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se cribaron posteriormente según su producción de anticuerpos específicos para el antígeno. Se fusionaron suspensiones celulares simples de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados con un cuarto del número de células P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580) de células de mieloma de ratón no secretoras. Las células se colocaron con una densidad de aproximadamente 1 x 105/pocillo en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido de aproximadamente dos semanas de incubación en un medio selectivo que contenía suero fetal bovino al 10 % complementado con origen (IGEN) en RPMI, L-glutamina, piruvato sódico, HEPES, penicilina, estreptamicina, gentamicina, lx HAT y β-mercaptoetanol. Después de 1-2 semanas, se cultivaron las células en un medio en el cual se había reemplazado el HAT por HT. Posteriormente, se cribaron los pocillos individuales por ELISA (descrito anteriormente) según su contenido en anticuerpos anti-LAG-3 IgG monoclonales humanos. Una vez que se produjo un crecimiento extenso del hibridoma, se monitorizó el medio normalmente al cabo de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se colocaron de nuevo en las placas, se cribaron de nuevo y, en caso de ser todavía positivos para la IgG humana, se subclonaron los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 al menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables se cultivaron posteriormente in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo tisular para su posterior caracterización.

Se seleccionaron clones de hibridomas de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 para análisis y secuenciación posteriores.

Ejemplo 2: Caracterización estructural de los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 humanos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5

Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de mAb expresadas por los clones de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 descritos en el Ejemplo 1, se secuenciaron utilizando el siguiente protocolo. El ARN total se preparó a partir de 5 x 106 células de hibridoma utilizando el Mini Kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). El ADNc se preparó mediante el protocolo 5’-RACE con el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) y transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las regiones V de cada anticuerpo se amplificaron utilizando un cebador de la región constante específico para 3’ humano, apareado con la mezcla de cebador universal 5’ RACE. Los productos de PCR que contenían las regiones V se clonaron en el vector pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en cepas de E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se preparon las muestras de ADN miniprep o Templiphi (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, EE. UU.) y se sometieron a secuenciación de ADN (Sequetech, Mountain View, CA). Las secuencias de ADN resultantes se analizaron para determinar sus redisposiciones en fase y otras caracteríticas de los anticuerpos. Las proteínas expresadas se caracterizaron por análisis químicos de proteínas estándar. Se detectó que los clones de 125E3, 25F7 y 26H10 expresaban un anticuerpo que comprendía una cadena pesada y una cadena ligera kappa de IgG1, mientras que se detectó que los clones de 8B7 y 17E5 expresaban un anticuerpo que comprendía una cadena pesada y una cadena ligera kappa de IgG4 y se detectó que el clon de 11F2 expresaba un anticuerpo que comprendía una cadena pesada y una cadena ligera kappa de IgG2.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 25F7 se muestran en la Figura 1A y en SEC ID Nº: 49 y 37, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera kappa de 25F7 se muestran en la Figura 1B y en SEC ID Nº: 55 y 43, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 25F7 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 7) demostró que la cadena pesada de 25F7 utiliza un segmento V de la línea germinal humana VH 4-34 (SEC ID Nº:61) y un segmento JH de la línea germinal humana JH5b (SEC ID Nº:62). Mediante el análisis posterior de la secuencia VH de 25F7 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 1A y en SEC ID Nº: 1, 7 y 13, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 25F7 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 8) demostró que la cadena ligera kappa de 25F7 utiliza un segmento VK de la línea germinal humana VK L6 (SEC ID Nº:63) y un segmento JK de la línea germinal humana JK 2 (SEC ID Nº:64). Mediante el análisis posterior de la secuencia VK de 25F7 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 1B y en SEC ID Nº: 19, 25 y 31, respectivamente.

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H de la línea germinal humana VH 3-33 (SEC ID Nº:65) y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6B (SEC ID Nº:66). Mediante el análisis posterior de la secuencia VH de 26H10 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 2A y en SEC ID Nº: 2, 8 y 14, respectivamente. La

15 comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 26H10 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 10) demostró que la cadena ligera kappa de 26H10 utiliza un segmento VK de la línea germinal humana VK A27 (SEC ID Nº:67) y un segmento JK de la línea germinal humana JK 3 (SEC ID Nº:68). Mediante el análisis posterior de la secuencia VK de 26H10 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 2B y en SEC ID Nº: 20, 26 y 32, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 25E3 se muestran en la Figura 3A y en SEC ID Nº: 51 y 39, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 25E3 se muestran en la Figura 3B y en SEC ID Nº: 57 y 45, respectivamente. La 25 comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 25E3 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 11) demostró que la cadena pesada de 25E3 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 3-20 (SEC ID Nº:69) y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b (SEC ID Nº:70). Mediante el análisis posterior de la secuencia VH de 25E3 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 3A y en SEC ID Nº: 3, 9 y GGY, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 25E3 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 12) demostró que la cadena ligera kappa de 25E3 utiliza un segmento VK de la línea germinal humana VK L18 (SEC ID Nº:71) y un segmento JK de la línea germinal humana JK 2 (SEC ID Nº:64). Mediante el análisis posterior de la secuencia VK de 25E3 utilizando el

35 sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 3B y en SEC ID Nº: 21, 27 y 33, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 8B7 se muestran en la Figura 4A y en SEC ID Nº: 52 y 40, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 8B7 se muestran en la Figura 4B y en SEC ID Nº: 58 y 46, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 8B7 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 13) demostró que la cadena pesada de 8B7 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 4-34 (SEC ID Nº:61) y un segmento JH de la línea germinal humana JH 5B (SEC ID Nº:62). Mediante el análisis posterior de la secuencia VH de 8B7 utilizando el

45 sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 4A y en SEC ID Nº: 4, 10 y 16, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 8B7 (Figura 14) con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera kappa de 8B7 utiliza un segmento VK de la línea germinal humana VK L6 (SEC ID Nº:63) y un segmento JK de la línea germinal humana JK 4 (SEC ID Nº:72). Mediante el análisis posterior de la secuencia VK de 26H10 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 4B y en SEC ID Nº: 22, 28 y 34, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 11F2 se muestran en la

55 Figura 5A y en SEC ID Nº: 53 y 41, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 11F2 se muestran en la Figura 5B y en SEC ID Nº: 59 y 47, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 11F2 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 15) demostró que la cadena pesada de 11F2 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 1-24 (SEC ID Nº:73), un segmento D de la línea germinal humana 2-15 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4B (SEC ID Nº:70). Mediante el análisis posterior de la secuencia VH de 11F2 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 13A y en SEC ID Nº: 5, 11 y 17, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 11F2 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas

65 (Figura 16) demostró que la cadena ligera kappa de 11F2 utiliza un segmento VK de la línea germinal humana VK L6 (SEC ID Nº:63) y un segmento JK de la línea germinal humana JK 1 (SEC ID Nº:74). Mediante el análisis posterior de

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la secuencia VK de 11F2 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 5B y en SEC ID Nº: 23, 29 y 35, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 17E5 se muestran en la Figura 6A y en SEC ID Nº: 54 y 42, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 17E5 se muestran en la Figura 6B y en SEC ID Nº: 60 y 48, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 17E5 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 17) demostró que la cadena pesada de 17E5 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 3-33 (SEC ID Nº:65), un segmento D de la línea germinal humana 2-2 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4B (SEC ID Nº:70). Mediante el análisis posterior de la secuencia VH de 17E5 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 6A y en SEC ID Nº: 6, 12 y 18, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 17E5 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas (Figura 18) demostró que la cadena ligera kappa de 17E5 utiliza un segmento VK de la línea germinal humana VK L6 (SEC ID Nº:63) y un segmento JK de la línea germinal humana JK 5 (SEC ID Nº:75). Mediante el análisis posterior de la secuencia VK de 17E5 utilizando el sistema de Kabat para la determinación de las regiones CDR se obtuvo la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 6B y en SEC ID Nº: 24, 30 y 36, respectivamente.

Las regiones variables de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se pueden convertir en anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo deseado utilizando técnicas de recombinación de ADN estándares. Por ejemplo, las regiones VH y VL que codifican ADN se pueden clonar en un vector de expresión que porta las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de forma que las regiones variables estén operativamente enlazadas a las regiones constantes. Como alternativa, se pueden utilizar vectores separados para la expresión de la cadena pesada de longitud completa y de la cadena ligera de longitud completa. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión adecuados para usar en la creación de anticuerpos de longitud completa incluyen los vectores pIE descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. N.º 20050153394.

Ejemplo 3: Caracterización de las propiedades de unión de los anticuerpos monoclonales LAG-3

En este ejemplo, se examinó la unión de anticuerpos anti-LAG-3 humanos a la LAG-3 de la superficie celular (LAG-3 humana, de mono y de ratón) por citometría de flujo. Además, se analizó la cinética de la unión a la LAG-3 mediante un análisis BIACORE. Es más, el mapeo de los epítopos se llevó a cabo utilizando un experimento de escaneo peptídico.

A. Estudios por citometría de flujo

1. Unión de células CHO-LAG-3 humana

Para analizar la capacidad de los anticuerpos de unirse a la proteína LAG-3 de la superficie celular, se incubaron los anticuerpos con una línea celular CHO que había sido transfectada para expresar la LAG-3 humana en la superficie celular. Los anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se diluyeron en serie con 1x tampón PFAE frío (1x PBS + 2 % de FBS, 0,02 % de azida de sodio, Na EDTA 2mM). Para la reacción de unión, se añadieron 50 µl de solución de anticuerpo diluido a 50 µl de suspensión celular que contenía 2 x 105 células y la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con 1x tampón PFAE. Se añadió una dilución 1:100 de anticuerpo de cabra anti-cadena ligera kappa humana marcado con FITC (Bethyl Laboratories, Inc., # de Cat. A80-115F) y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 4oC, seguido de dos lavados con 1x tampón PFAE frío. Tras el último lavado, se añadieron 150 µl de 1x PFAE frío que contenía 10 µg/ml de yoduro de propidio (Roche Applied Science, # de Cat. 1_348_639) a cada solución y se realizó un análisis de la unión de anticuerpo por citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (BD Bioscience).

Los resultados del análisis por citometría de flujo se resumen a continuación en la Tabla 1, que muestra los valores de CE50 para la unión CHO-LAG-3 humana, lo que demuestra que 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se unen eficazmente a la LAG-3 de la superficie celular humana, donde 25F7 posee una CE50 aproximadamente 20 veces menor que 25E3 pero una CE50 aproximadamente equivalente a la de 8B7 y 26H10. Los resultados de CE50 para 11F2 y 17E5 estaban en el mismo intervalo que para 25E3.

Tabla 1: Unión de anticuerpos anti-LAG-3 a células CHO que expresaban LAG-3 humana

Anticuerpo: CE50 (nM)

25F7: 0,45 – 2,52

8B7: 1,93 – 4,44

26H10: 1,81 – 3,64

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11F2: 15,12

25E3: 14,9 – 25,39

17E5: 12,3

2. Unión de linfocitos T CD4+ activados humanos

Para analizar la capacidad de los anticuerpos de unirse a la LAG-3 humana natural en la superficie de linfocitos T

5 activados humanos, se aislaron linfocitos T CD4+ en reposo de células sanguíneas mononucleares periféricas purificadas y se sometieron a tres días de estimulación con una combinación de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 fijados a microesferas de poliestireno. Los anticuerpos monoclonales 25F7, 8B7 y 26H10 se diluyeron en serie con 1x tampón PFAE frío (1x PBS + 2 % de FBS, 0,02 % de azida de sodio, Na EDTA 2mM). Para la reacción de unión, se mezclaron 50 µl de la solución de anticuerpo diluido con 50 µl de anti-CD4 humano marcado con PE (BD

10 Bioscience, # de Cat. 555347). Se procesaron los linfocitos T activados mediante el mismo protocolo descrito anteriormente. El análisis de la unión de anticuerpo se llevó a cabo como se describió anteriormente.

Los resultados del análisis por citometría de flujo se resumen a continuación en la Tabla 2, que muestra las CE50 para la unión a los linfocitos T CD4+ T humanos activados, lo que demuestra que los tres anticuerpos se unen de 15 forma similar a la LAG-3 de la superficie celular humana.

Tabla 2: Unión de anticuerpos anti-LAG-3 a linfocitos T CD4+ humanos activados

Anticuerpo: CE50 (nM)

25F7: 0,27 – 0,45

26H10: 0,41 – 0,84

8B7: 0,69 – 1,80

3. Unión de antígeno LAG-3 de mono

20 Para determinar si los anticuerpos anti-LAG-3 presentan reactividad cruzada con la LAG-3 de mono, se clonó una secuencia de ADNc por RT-PCR a partir de un preparado de ADNc combinado preparado por transcripción inversa de ARN de una serie de muestras de tejido de monos cynomolgus y rhesus. La secuencia se amplificó primero a partir del ADNc combinado utilizando cebadores (cebador directo 5’: 5Mcyn1408; 5’-atgtgggaggctcagttcctg-3’ (SEC

25 ID Nº: 91) y cebador inverso 3’: 3Mcyn1408a; 5’-gtcagagctgctccggctc-3’ (SEC ID Nº: 92)) utilizando un sistema de amplificación por PCR GC-rich (Roche) y se clonó en un vector de clonación TOPO receptor (Invitrogen) para el análisis de secuencias. Posteriormente, se reamplificaron clones concordantes con la secuencia de referencia de la LAG-3 de mono rhesus de Genbank (N.o de acceso en Genbank XM_001108923) a partir del vector de clonación de ADN TOPO utilizando un segundo grupo de cebadores que incorporaban los sitios de restricción enzimática para la

30 clonación direccional en un vector de expresión de células de mamífero.

El clon pa23-5 de la LAG-3 de mono se aisló y se secuenció. La secuencia de mono aislada presentaba un 99,6 % de identidad con la secuencia de referencia de la LAG-3 de mono rhesus de Genbank. Se muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos del clon pa23-3 de ADNc (SEC ID Nº: 93) con la LAG-3 de mono rhesus (SEC ID

35 Nº: 94) de Genbank (con N.o de acceso XM_001108923) en la Figura 19. Las dos secuencias son idénticas salvo por un aminoácido diferente en la posición 419 (arginina en el clon pa23-5 frente a treonina en la secuencia de rhesus de Genbank) y a partir de esto se concluye que el clon pa23-5 de ADNc representa la secuencia genética de la LAG-3 de rhesus.

40 El clon pa23-5 de ADNc se insertó en un constructo de expresión, que se transfirió en células en suspensión CHO-S por nucleofección (Amaxa). La expresión de la LAG-3 de rhesus por parte de clones resistentes a fármacos seleccionados y clasificados se confirmó mediante un análisis FACS. Esta línea celular CHO clonal que sobreexpresa la LAG_3 de rhesus se utilizó en ensayos FACS similares a los que se describieron anteriormente para medir la reactividad cruzada que presentan los anticuerpos a la proteína de mono. En resumen, los anticuerpos

45 monoclonales 25F7, 8B7 y 26H10 se diluyeron en serie con 1x tampón PFAE frío (1x PBS + 2 % de FBS, 0,02 % de azida de sodio, Na EDTA 2mM). Para la reacción de unión, se añadieron 50 µl de solución de anticuerpo diluido a 50 µl de suspensión celular que contenía 2 x 105 células y la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos. Se procesaron las células mediante el mismo protocolo descrito anteriormente. El análisis de la unión de anticuerpo se llevó a cabo como se describió anteriormente.

50 En un experimento separado, se analizaron los anticuerpos para determinar la unión a la LAG-3 de mono cynomolgus utilizando linfocitos T de mono cynomolgus activados. La activación in vitro de estos linfocitos T de mono se consiguió mediante tratamiento con anti-CD3/anti-CD28 de linfocitos T mediante esencialmente el mismo protocolo descrito anteriormente para la activación in vitro de linfocitos T humanos, seguido de un análisis por

55 citometría de flujo realizado como se describió anteriormente para teñir linfocitos T CD4+ humanos activados in vitro.

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Los resultados de los análisis por citometría de flujo utilizando las células CHO-LAG-3 de rhesus y los linfocitos T de cynomolgus activados se resumen a continuación en la Tabla 3, que muestra las CE50 para la unión a los dos tipos diferentes de células que expresan la LAG-3 de mono. Estos resultados demostraron que todos los anticuerpos se unen eficazmente tanto a la LAG-3 en los linfocitos T de cynomolgus activados como a la LAG-3 de rhesus (SEC ID

5 Nº: 93) transfectada en células CHO. Sin embargo, existe una jerarquía de afinidades de unión, donde el clon de 26H10 muestra la afinidad más alta, que es aproximadamente 2,5 y 6 veces mejor que la de los clones de 8B7 y 25F7, respectivamente. La diferencia en la jerarquía de unión entre los dos tipos de células puede reflejar diferencias en las secuencias de aminoácidos entre las proteínas LAG-3 de rhesus y de cynomolgus.

10 Tabla 3: Unión de anticuerpos anti-LAG-3 a la LAG-3 de mono

Anticuerpo: CE50 de linfocitos T CD4+ de cyno activados (nM) CE50 de CHO-LAG-3 de rhesus (nM)

26H10: 5,19 4,684

25F7: 14,18 22,72

8B7: 30,45 10,01

4. Unión de antígeno LAG-3 de ratón

Para determinar si los anticuerpos presentaban reactividad cruzada con la LAG-3 de ratón, se realizaron estudios

15 por citometría de flujo similares a los descritos anteriormente utilizando como célula diana una línea celular de hibridoma de linfocito T de ratón (3A9) que había sido transfectada para expresar la LAG-3 de ratón en su superficie celular, seguidos de un análisis FACS para detectar la unión de anticuerpo. Los resultados indicaron que, a diferencia de un anticuerpo de control anti-LAG-3 de ratón de control que presentaba una fuerte tinción, ninguno de los anticuerpos 25E3, 25F7, 8B7 ó 26H10 humanos presentó una unión por encima de los niveles de fondo a la

20 LAG-3 de ratón de la superficie celular, lo que desmostró que ninguno de estos anticuerpos presentaba reactividad cruzada con la LAG-3 de ratón.

B. Análisis BIACORE

25 La unión de los anticuerpos 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 y 17E5 a la proteína LAG-3 recombinante se examinó por BIAcore™ utilizando un método de captura. Cada uno de los anticuerpos 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 y 17E5 se capturaron utilizando anti-CH1, un anticuerpo reactivo que es específico para la región constante 1 de la cadena pesada de anticuerpo humano (Zymed, Clon HP6045, conc. patrón 1,0 mg/ml). El anti-CH1 se cubrió con un chip CM5 (BR-1000-14, grado de investigación) con una densidad alta (9700-11500RUs). El recubrimiento se llevó a

30 cabo según el procedimiento de inmovilización estándar recomendado por el fabricante. El anticuerpo 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 ó 17E5 purificado, con concentraciones en el intervalo de 0,5-3 µg/ml, se capturó posteriormente en la superficie recubierta anti-CH1 con una velocidad de flujo de 10uL/min durante 1 minuto. Se inyectó una única concentración de la proteína de fusión LAG-3 humana (20 nM) sobre el anticuerpo capturado durante 3 minutos con una velocidad de flujo 25 µg/ml. Se dejó que el antígeno se disociara durante 7,5 minutos. La superficie del chip se

35 regeneró depués de cada ciclo con 25 µL de NaOH 25 mM, seguido de 30 µL de lavado con HBS-EP. Los controles isotípicos se analizaron en el chip y los datos se emplearon para restar la unión no específica. Todos los experimentos se llevaron a cabo en un equipo de resonancia de plasmones superficiales Biacore 3000, utilizando un software BIAcore Control v 3.2. Se llevó a cabo un análisis de datos utilizando un software BiaEvaluation v3.2. Los resultados se muestran en la Tabla 4 siguiente. Los resultados de BIAcore para 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 y 17E5

40 confirman los resultados de citometría de flujo de los cinco anticuerpos, todos ellos son capaces de unirse con alta afinidad a la LAG-3 humana.

Tabla 4: Cinética de unión de anticuerpos anti-LAG-3 a la LAG-3 humana recombinante

Anticuerpo: KD x 10 -9 (M)

25E3: 0,09

8B7: 0,09

26H10: 0,10

25F7: 0,47

17E5: 4,53

45 C. Mapeo de epítopos

En la proteína LAG-3, el primer domino similar a inmunoglobulina de la región extracelular contiene un "bucle extra" expuesto que posee la secuencia de aminoácidos: GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEC ID Nº: 79). Para examinar la unión de 25E3, 25F7, 8B7 y 26H10 a esta región de la LAG-3, y mapear el epítopo al que se une 50 cada anticuerpo, se realizó un experimento de escaneo peptídico a lo largo de esta región. Se preparó una serie de 10 péptidos solapados que se escaneaban a lo largo de la longitud completa de la secuencia del bucle extra y se conjugó con biotina. Para el análisis ELISA, se utilizaron placas de microtitulación recubiertas previamente con

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estreptavidina (Sigma-Aldrich, # de Cat. M5432) para capturar los conjugados de péptidos del bucle biotinilados

aplicados en un volumen de 100 µl con una concentración de 2 µg/ml y se incubaron 18 horas a 4oC, después de lo

cual las placas se lavaron 3 veces y se bloquearon a temperatura ambiente durante una hora con tampón de

bloqueo (1x PBS + FBS al 10 %). A continuación, se aplicaron anticuerpos anti-LAG-3 humanos diluidos en serie 3

5 veces en tampón de bloqueo de 10 µg/ml y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y

posteriormente se lavaron tres veces. Para detectar el anticuerpo humano unido, se diluyó un anticuerpo de cabra

anti-cadena ligera kappa humana conjugado con HRP (Bethyl Laboratories, # de Cat. A80-115P) hasta 1 µg/ml en

tampón de bloqueo y se aplicó a los pocillos de ensayo durante una hora, seguido de tres lavados y la aplicación del

sustrato TMB (eBioscience, # de Cat. 00-4201-56). Se realizaron lecturas de densidad óptica con una longitud de 10 onda de 650 nm en un espectrofotómetro Spectramax 340PC (Molecular Dynamics, Inc.). Los resultados del

experimento de escaneo peptídico se resumen a continuación en la Tabla 5.

Tabla 5: Unión de anticuerpos anti-LAG al escaner peptídico del bucle extra de la LAG-3

Escaner peptídicos del bucle extra de la LAG-3: SEQ

GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY: 79 25E3 8B7 25F7 26H10

GPPAAAPGHPLA: 80 - - - -

PAAAPGHPLAPG: 81 ++ - - -

AAPGHPLAPGPH: 82 ++ - - -

PGHPLAPGPHPA: 83 + - - -

HPLAPGPHPAAP: 84 ± - - -

LAPGPHPAAPSS: 85 - - - -

PGPHPAAPSSWG: 86 - ++ ++ -

PHPAAPSSWGPR: 87 - ++ ++ -

PAAPSSWGPRPR: 88 - ++ + -

APSSWGPRPRRY: 89 - - - -

15 Según estos resultados, se determinó que el anticuerpo 25E3 reconocía una región dentro del bucle extracelular que comprendía la secuencia de aminoácidos PGHPLAPG (SEC ID Nº: 76), mientras que el anticuerpo 25F7 reconocía una región dentro del bucle extra que comprendía la secuencia de aminoácidos HPAAPSSW (SEC ID Nº: 77) y 8B7 parecía reconocer una región dentro del bucle extracelular que comprendía la secuencia de aminoácidos PAAPSSWG (SEC ID Nº: 78). En cambio, no se pudo detectar ninguna unión del péptido bucle extra de longitud

20 completa o de cualquiera de los péptidos escaneados más cortos por parte del anticuerpo 26H10.

Las regiones identificadas en este studio se subrayan en la secuencia del bucle extra de longitud completa:

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25 Por lo tanto, los resultados del escáner peptídico indican que los anticuerpos 25E3, 25F7 y 8B7 se unen a epítopos diferentes, aunque próximos, en la LAG-3 humana.

Para examinar más detalladamente la unión de estos anticuerpos a la región del péptido bucle extra, se realizaron

30 ensayos ELISA adicionales. En un ensayo ELISA utilizando el péptido bucle extra de longitud completa humano (SEC ID Nº: 79), se determinaron los valores de CE50 para la unión de 25E3, 25F7 y 8B7. Además, se realizó un ensayo peptídico ELISA similar utilizando la secuencia del péptido bucle extra de longitud completa de la LAG-3 de mono rhesus, que poseía la secuencia GPPAPAPGHPPAPGHRPAAP YSWGPRPRRY (SEC ID Nº: 90), y se determinaron los valores de CE50 para la unión de 25F7 y 8B7. Los resultados se resumen a continuación en la

35 Tabla 6. Los resultados confirman que los anticuerpos 25E3, 25F7 y 8B7 son capaces de reconocer la región del péptido bucle extra de la LAG-3 humana. Es más, los anticuerpos 25F7 y 8B7 también se unen a la región del péptido bucle extra de la LAG-3 de rhesus, aunque su unión es peor si se compara con la secuencia humana, lo cual puede deberse a la divergencia de secuencias de especie en este polipéptido. Los resultados también confirman que el anticuerpo 26H10 no es capaz de reconocer el péptido bucle extra de la LAG-3.

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Tabla 6: Unión de anticuerpos anti-LAG-3 al péptido bucle extra de la LAG-3 humana y de rhesus

Anticuerpo: CE50 del bucle extra humano (nM) CE50 del bucle extra de rhesus (nM)

25E3: 0,55 No ensayado

25F7: 0,29-0,95 13,09

8B7: 0,28-1,35 0,60

26H10: No existe unión No existe unión

Ejemplo 4: Inhibición de la unión de la LAG-3 al MHC de clase II por mAb anti-LAG-3

5 Para comprobar la capacidad de los anticuerpos anti-LAG-3 de inhibir la unión de la LAG-3 a moléculas del MHC de clase II, se realizó un ensayo de unión in vitro en el cual una proteína de fusión LAG-3, que comprendía un dominio extracelular de la LAG-3 humana fusionado a Fc de ratón (hLAG-3-mIg), se hizo reaccionar con células Daudi, las cuales expresan moléculas del MHC de clase II humano.

10 Para comprobar la inhibición por parte de los anticuerpos de la unión de la LAG-3 al MHC de clase II, 25E3, 25F7, 8B7 y 26H10 se diluyeron en serie a partir de 20 µg/ml en tampón PFAE y a estas diluciones en serie se añadió 1 µg/ml de proteína de fusión hLAG-3-mIg. Esta mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de añadirla a 2x105 células Daudi lavadas con 1x PFAE. La mezcla se aplicó a células Daudi y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las células se sedimentaron (3 minutos, 400 xg), se lavaron una vez con 1x tampón PFAE y se

15 volvieron a sedimentar, y se detectó la unión de hLAG-3-mIg a las células Daudi utilizando un reactivo secundario anti-mIgG Fc marcado con PE recombinante. El análsis de la unión LAG-3-mIg se llevó a cabo con el citométro de flujo FACScalibur (BD Bioscience). Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 7, que muestra los valores de CI50 en nM.

20 Tabla 7: Inhibición de la unión de la LAG-3 al MHC de clase II por parte de anticuerpos anti-LAG-3

Anticuerpo: CI50 (nM)

25E3: 0,8 -6,78

25F7: 0,12 -0,92

8B7: 0,19 – 0,95

26H10: 0,10

Los resultados demuestran que los cuatro anticuerpos son eficaces en la inhibición de la unión de la LAG-3 a anticuerpos del MHC de clase II, donde 25F7, 8B7 y 26H10 presentan valores de CI50 aproximadamente de 7 a 13 veces menores que los de 25E3.

25 Ejemplo 5: Estimulación de respuesta de linfocito T específica para un antígeno por parte de mAb anti-LAG-3

Para comprobar la capacidad de los anticuerpos anti-LAG-3 para estimular una respuesta de linfocito T específica

30 para un antígeno, se empleó un ensayo de estimulación peptídica de linfocitos T 3A9 (véanse, por ejemplo, Workman et al. (2003) J. Immunol. 169:5392-5395; Workman et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:2255-2263).

En este ensayo, se utilizó como linfocito T respondedor un hibridoma de linfocito T de ratón, 3A9, específico para el péptido HEL48-62. El linfocito 3A9 T respondedor se transdujo retroviralmente para expresar la LAG-3 humana o la 35 LAG-3 de ratón en su superficie celular. La célula presentadora de antígeno (APC) usada para presentar el péptido antigénico HEL48-62 a las células 3A9 fue la línea celular LK35.2 positiva del MHC de clase II . Otros estudios indicaron que una proteína de fusión LAG-3 humana era capaz de unirse a moléclulas del MHC de clase II de ratón, validando de este modo el uso de APC LK35.2 de ratón en este ensayo. La estimulación específica para un antígeno de las células 3A9 fue indicada por la producción de interleucina 2 (IL-2), cuya secreción se midió por ELISA (kit

40 OptEIA de IL-2 de ratón, BD Bioscience, # de Cat. 555148 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante).

La expresión ectópica de la LAG-3 humana o de ratón en los linfocitos T 3A9, en ausencia de anticuerpos, produjo un efecto inhibitorio sobre las respuestas específicas para un antígeno cuando se incubaron los linfocitos T transfectados con las APC LK35.2 presentadoras del péptido antigénico HEL48-62, como se indica por un aumento en

45 la cantidad de péptido antigénico necesaria para estimular la producción de la IL-2 por parte de las células 3A9 en comparación con el perfil de respuesta-dosis de péptido de los linfocitos T 3A9 de control.

Para comprobar la estimulación de una respuesta de linfocitos T específica de un antígeno por parte de anticuerpos, las APC (2,5x104 células) se incubaron previamente con el péptido antigénico (200 nM) durante 30 minutos a 37°C y 50 los linfocitos T 3A9 (5,0x104 células que expresan mLAG-3, hLAG-3 o células de control) se incubaron previamente con un anticuerpo anti-hLAG-3 (25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2, 17E5), se diluyeron con una dilución de tres veces en serie a partir de 25 µg/ml) durante 15 minutos a 37°C. Los linfocitos T 3A9 se añadieron posteriormente a las

imagen40

APC impulsadas por antígeno y el cultivo se incubó durante 24 horas a 37°C. El sobrenadante se recogió y se midió la producción de IL-2 de ratón. Los resultados para los linfocitos T 3A9 que expresaban la LAG-3 humana se presentan en la Tabla 8, que muestra los valores de CI50 en nM.

Tabla 8: Estimulación de respuestas de linfocito T específicas para un antígeno por parte de anticuerpos anti-LAG-3

Anticuerpo: CI50 del ensayo peptídico 3A9-hLAG-3 (nM)

25F7: 0,14 – 1,94

26H10: 1,45 – 6,49

8B7: 3,25 – 13,90

25E3: 3,88 – 70,78

11F2: 81,50 – 240

17E5: No existe inhibición

Los resultados muestran que los anticuerpos 25F7, 8B7 y 26H10, y 25E3 en un grado menor, fueron capaces de estimular la producción de IL-2 en un ensayo de respuestas de linfocito T específicas para un antígeno, mientras que el anticuerpo 11F2 presentaba una capacidad mínima de inhibición y el anticuerpo 17E5 no fue funcional en este

10 ensayo. Ninguno de los anticuerpos alteró la producción de IL-2 medida por parte de los linfocitos T 3A9 de control o de células T 3A9 transfectadas con la proteína LAG-3 de ratón, lo que demostró la especificidad del efecto estimulatorio.

Ejemplo 6: Inhibición del crecimiento tumoral por parte de mAb anti-LAG-3 mAb, solo o combinado

15 Para comprobar la capacidad del anticuerpo anti-LAG-3, solo o combinado con otro anticuerpo inmunoestimulador, de inhibir el crecimiento de células tumorales in vivo, se utilizaron dos modelos diferentes de injerto tumoral de ratón singénico. El primer modelo utilizó células de fibrosarcoma Sa1N múrido. El segundo modelo utilizó la línea celular MC38 de cáncer de colon múrido.

20 En un primer experimento, se implantó cada ratón (raza A/J) con 2 x 106 células de fibrosarcoma Sa1N el día 0 y las células tumorales se dejaron crecer siete días. Los días 7, 10 y 12 posimplantación, se trataron los ratones con 10 mg/kg de mAb anti-LAG-3 solo (el mAb C9B7W de rata anti-LAG-3 de ratón; eBioscience, N.o de Cat. 14-2231), un anticuerpo anti-PD-L1 solo (un mAb 14D8 anti-PD-L1 de ratón), los anticuerpos anti-LAG-3 y anti-PD-L1 combinados

25 o un anticuerpo isotípico IgG1 de control. El mAb 14D8 es un anticuerpo de rata anti-PD-L1 de ratón que ha sido quimerizado para contener la IgG1de ratón y las regiones constantes kappa de ratón.

Se midieron los volumenes tumorales en los ratones durante los 50 días posteriores a la implantación, y se determinaron la mediana y la media de los volumenes tumorales. La media de la inhibición del crecimiento tumoral 30 se calculó (sobre la base de un 0 % de inhibición para el tratamiento con el anticuerpo isotópico IgG1 de control). Los resultados para el día 24 posimplantación se resumen a continuación en la Tabla 9:

Tabla 9: Media de la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de tumor Sa1N

Día: IgG1 LAG-3 PD-L1 Combinación

24: - 68 74,9 95,8

35 Por lo tanto, el tratamiento con anticuerpo anti-LAG3 solo o con el anticuerpo anti-PD-L1 solo, produjo la inhibición del crecimiento tumoral, mientras que la combinación de ambos anticuerpos produjo una inhibición incluso mayor del crecimiento tumoral. Respecto a los grupos de tratamiento, al final del experimento los resultados fueron una remisión total del tumor en 4 de los 10 ratones tratados con anti-LAG3 solo, mientras que únicamente se observó una remisión total del tumor en 1 de los 10 ratones tratados con el anticuerpo IgG1 de control. De forma análoga, se

40 observó una remisión total del tumor en 4 de los 11 ratones tratados con anti-PD-L1 solo. El tratamiento de los ratones con la combinación de anti-LAG3 y anti-PD-L1 produjo una remisión total del tumor en 9 de 10 ratones; el resto de los ratones que seguían presentado el tumor tenían un tumor indolente que permaneció pequeño durante el estudio.

45 Dos estudios adicionales utilizaron ratones implantados con células de la línea celular MC38 de cáncer de colon múrido. En el primer experimento, se implantó cada ratón C57Bl/6 con 2 x 106 células MC38 el día 0, y se trataron el día 7, 10 y 12 posimplantación con 200 µg/dosis de anti-LAG-3 solo ( mAb C9B7W), anti-PD-1 solo (el mAb 4H2) o anti-LAG-3 y anti-PD-1 combinados. Se utilizó un anticuerpo isotípico IgG1 apareado,400 µg/dosis, como control. El mAb 4H2 es un anticuerpo de rata anti-PD-1 de ratón que ha sido quimerizado para contener la IgG1de ratón y las

50 regiones constantes kappa de ratón.

La media del volumen tumoral, la mediana del volumen tumoral y el % de supervivencia se determinaron 80 días después de la implantación. Los resultados mostraron que la monoterapia con LAG-3 en este modelo tumoral (MC38) mostró una actividad mínima o ninguna actividad en la inhibición del crecimiento tumoral y ninguno de los ratones tratados sobrevivió el experimento. En cambio, la monoterapia con anti-PD-1 mostró una actividad significativa, con una remisión total del tumor en 4 de 10 ratones al final del experimento. Es más, de forma análoga a los resultados para el modelo Sa1N, la terapia combinada de anti-LAG-3 junto con anti-PD-1 fue más eficaz que cualquiera de los tratamientos solos, con una remisión total del tumor en 7 de 8 ratones al final del experimento.

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5 En un segundo experimento con el modelo MC38, se implantó cada ratón C57Bl/6 con 2 x 106 células MC38 el día 0, y se trataron los días 5, 8 y 11 posimplantación con 200 µg/dosis de anticuerpo de ensayo y/o 400 µg/dosis de anticuerpo IgG de control, como sigue: (i) un anticuerpo anti-IgG1 de control; (ii) un mAb anti-LAG-3 (mAb C9B7W) junto con la IgG1 de control; (iii) un anticuerpo anti-PD-1 (4H2) con la IgG1 de control; (iv) un anticuerpo anti-CTLA-4

10 (el mAb 9D9 de ratón anti-CTLA-4 de ratón) junto con la IgG1 de control; (v) el mAb anti-LAG-3 junto con el mAb anti-PD-1; o (vi) el mAb anti-LAG-3 junto con el mAb anti-CTLA-4. El mAb 9D9 es un anticuerpo de ratón anti-CTLA4 de ratón que se generó en un ratón en el cual el CTLA-4 endógeno de ratón había sido desactivado.

La media del volumen tumoral, la mediana del volumen tumoral y el % de supervivencia se determinaron durante

15 100 días después de la implantación. Los resultados fueron similares al primer experimento en que la monoterapia con LAG-3 mostró una actividad mínima o ninguna actividad en la inhibición del crecimiento tumoral MC38 y ninguno de los ratones tratados sobrevivió el experimento. La monoterapia con CTLA-4 también mostró una actividad mínima

o ninguna actividad en la inhibición del crecimiento tumoral MC38 y ninguno de los ratones tratados sobrevivió el experimento. En cambio, la monoterapia con anti-PD-1 mostró de nuevo una actividad significativa, con una remisión

20 total del tumor en 4 de 10 ratones al final del experimento. Es más, la terapia combinada fue más eficaz que la monoterapia. Para los ratones tratados con la combinación de anti-LAG-3 y anti-CTLA-4, se observó una remisión total del tumor en 3 de 10 ratones al final del experimento y, para los ratones tratados con la combinación de anti-LAG-3 y anti-PD-1, se observó una remisión total del tumor en 8 de 10 ratones al final del experimento.

25 Por lo tanto, los estudios de injertos de tumores in vivo descritos anteriormente mostraron que, para al menos algunos modelos tumorales, el tratamiento con anticuerpo anti-LAG solo producía una inhibición significativa del crecimiento tumoral in vivo. Es más, para modelos tumorales múltiples, la terapia combinada del anticuerpo anti-LAG-3 junto con el anticuerpo anti-PD-1, el anticuerpo anti-PD-L1 o el anticuerpo anti-CTLA-4 producía una actividad antitumoral incluso mayor que únicamente la monoterapia.

30

Ejemplo 7: Promoción de la autoinmunidad en ratones NOD por inhibición por parte de mAb anti-LAG-3

Para comprobar la capacidad del anticuerpo anti-LAG-3 de estimular una respuesta inmunitaria, como se indica mediante el desarrollo de autoinmunidad, se utilizó el modelo de diabetes de ratón NOD. Se sabe que los ratones

35 NOD son propensos a desarrollar la diabetes autoinmunitaria. La progresión de la diabetes se puede monitorizar en ratones NOD hembra midiendo la glucosa en suero. Así pues, se examinó el efecto del tratamiento con anti-LAG-3, solo o combinado con cualquiera de los anticuerpos inmunoestimuladores, sobre el desarrollo de la diabetes en ratones NOD hembra.

40 Se trataron ratones NOD hembra el día 0, 2 y 5 con 250 µg/dosis de bien sea: (i) un anticuerpo isotípico IgG1 de control; (ii) mAb anti-LAG-3 solo (mAb C9B7W); (iii) mAb anti-PD-1 solo (mAb 4H2); (iv) mAb anti-CTLA-4 solo (mAb 9D9); (v) mAb anti-LAG-3 junto con mAb anti-PD-1; o (vi) mAb anti-LAG-3 junto con anti-CTLA-4. Los resultados obtenidos con el tratamiento con anti-LAG-3 solo o el tratamiento con anti-PD-1 solo (pero no el tratamiento con anti-CTLA-4 solo) aumentaron el número de ratones que se convertían en el fenotipo diabético. Es más, el tratamiento

45 combinado de anti-LAG-3 junto con anti-PD-1, o anti-LAG-3 junto con anti-CTLA-4, era incluso más eficaz en la conversión de ratones en el fenotipo diabético.

Por lo tanto, estos resultados demuestran que el bloqueo de la interacción de la LAG-3 con su receptor interfería con una señal inmunorreguladora negativa que permitía una actividad inmunológica mayor en los ratones NOD, y esta

50 mayor actividad inmunológica en los ratones tratados con LAG-3 se podía potenciar por tratamiento combinado bien sea con el anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4.

Ejemplo 8: Inmunohistoquímica utilizando mAb anti-LAG-3

55 En este experimento, se utilizaron anticuerpos anti-LAG-3 marcados fluorescentemente en los experimentos de inmunohistoquímica. Se utilizaron los siguientes anticuerpos anti-LAG-3 humanos marcados con FITC: 25F7-FITC

(F:P = 2,9; versión IgG1); 25F7-G4-FITC (F:P = 2,7; versión IgG4); 8B7-FITC (F:P = 2,6) y 26H10-FITC (F:P = 3,4). Se examinó un panel de tejidos linfoides, específicamente de amígdala (dos muestras), de bazo (dos muestras) y del timo (dos muestras), junto con tejido pituitario (cuatro muestras). También se utilizaron las células CHO

60 transfectadas con LAG-3 como control. Se utilizaron secciones criostato fijadas con acetona. Las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-LAG-3 marcado con FITC (0,2-5 µg/ml), seguido de la tinción con anticuerpo de conejo anti-FITC como anticuerpo puente y posteriormente se visulizaron utilizando el EnVision™+ System Kit de conejo (Dako EE. UU., Carpinteria, CA). Los resultados se resumen en la Tabla 10 siguiente:

65 Como cabía esperar, la expresión LAG-3 se detectó en el panel del tejido linfoide. Además, dos de los tres anticuerpos anti-LAG-3 examinados, 25F7 (versiones IgG1 y IgG4) y 26H10, exhibieron retención en el tejido

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Tejido: 25F7-FITC 25F7-G4-FITC 8B7-FITC 26H10-FITC

Células CHO/LAG-3: +(fuerte) +(fuerte) +(fuerte) +(fuerte)

Amígdala(n=2): +(fuerte; rara en LC dispersos, 2/2) +(fuerte; rara en LC dispersos, 2/2) +(fuerte; rara en LC dispersos, 2/2) +(fuerte; rara en LC dispersos, 2/2)

Bazo(n=2): +(muy débil, principalmente en la pulpa roja, 2/2) +(muy débil, principalmente en la pulpa roja, 2/2) +(débil, principalmente en la pulpa roja, 2/2) +(muy débil, principalmente en la pulpa roja, 2/2)

Timo(n=2): +(fuerte; muy rara en LC dispersos, 1/2) +(fuerte; muy rara en LC dispersos, 1/2) +(fuerte; muy rara en LC dispersos, 1/2) +(fuerte; muy rara en LC dispersos, 1/2)

Pituitaria(n=4): +(fuerte; ocasional en la adenohipófisis, 3/4) +(fuerte; ocasional en la adenohipófisis, 3/4) ¯ +(fuerte; ocasional en la adenohipófisis, 3/4; moderada débil, rara 1/4)

LC = linfocito; + = tinción positiva; -= tinción negativa

5 pituitario, mientras que un anticuerpo examinado, 8B7, no mostró esta retención en el tejido pituitario. Por lo tanto, el experimento de inmunohistoquímica identificó dos subgrupos de anticuerpos anti-LAG-3, donde se retiene un subgrupo en el tejido pituitario y el otro subgrupo no se retiene en el tejido pituitario.

RESUMEN del LISTADO de SECUENCIAS 10

SEC ID Nº:: SECUENCIA SEC ID Nº: SECUENCIA

1: VH CDR1 a.a. 25F7 49 VH n.t. 25F7

2: VH CDR1 a.a. 26H10 50 VH n.t. 26H10

3: VH CDR1 a.a. 25E3 51 VH n.t. 25E3

4: VH CDR1 a.a. 8B7 52 VH n.t. 8B7

5: VH CDR1 a.a. 11F2 53 VH n.t. 11F2

6: VH CDR1 a.a. 17E5 54 VH n.t. 17E5

7: VH CDR2 a.a. 25F7 55 VK n.t. 25F7

8: VH CDR2 a.a. 26H10 56 VK n.t. 26H10

9: VH CDR2 a.a. 25E3 57 VK n.t. 25E3

10: VH CDR2 a.a. 8B7 58 VK n.t. 8B7

11: VH CDR2 a.a. 11F2 59 VK n.t. 11F2

12: VH CDR2 a.a. 17E5 60 VK n.t. 17E5

13: VH CDR3 a.a. 25F7 61 VH 4-34 línea germinal a.a.

14: VH CDR3 a.a. 26H10 62 VH JH5b línea germinal a.a.

15: PVGVV 63 VK L6 línea germinal a.a.

16: VH CDR3 a.a. 8B7 64 VK JK2 línea germinal a.a.

17: VH CDR3 a.a. 11F2 65 VH 3-33 línea germinal a.a.

18: VH CDR3 a.a. 17E5 66 VH JH5b línea germinal a.a.

67: Vk A 27 línea germinal a.a.

19: VH CDR1 a.a. 25F7 68 VK JK3 línea germinal a.a.

20: VK CDR1 a.a. 26H10 69 VH 3-20 línea germinal a.a.

21: VK CDR1 a.a. 25E3

22: VK CDR1 a.a. 8B7 70 VH JH5b línea germinal a.a.

23: VK CDR1 a.a. 11F2 71 VK L-18 línea germinal a.a.

24: VK CDR1 a.a. 17E5 72 VK JK4 línea germinal a.a.

73: VH 1-24 línea germinal a.a.

Claims

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REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une al gen 3 de activación de linfocitos humanos (LAG-3), en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 43.
2.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEC ID Nº: 43.
3.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que comprende secuencias de región variable de cadenas ligera y pesada tal como se exponen en SEC ID Nº: 37 y SEC ID Nº: 43, respectivamente.
4.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que inhibe la unión de LAG-3 a moléculas de la clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
5.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que estimula una respuesta de linfocito T específica para un antígeno.
6.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo estimula la producción de interleucina-2 por parte del linfocito T específico para un antígeno.
7.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se une a la proteína LAG-3 humana con una KD de 1 x 10-9 o menos.
8.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se une a la proteína LAG-3 humana con una KD de 5 x 10-10 o menos.
9.

Una composición que comprende el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10.

La composición de la reivindicación 9, que además comprende al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional.
11.

La composición de la reivindicación 10, en la que el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4.
12.

La composición de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1.
13.

Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, unido a un agente terapéutico.
14.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
15.

Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 14.
16.

Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15.
17.

Un método para preparar un anticuerpo anti-LAG-3 que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de la reivindicación 16 y aislar el anticuerpo de la célula huésped.
18.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en terapia.
19.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, para su uso en terapia.
20.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, de la reivindicación 19 para el uso de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4.
21.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, de la reivindicación 19, para el uso de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1.
22.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y al menos un anticuerpo inmunoestimulador adiciona, de una cualquiera de las reivindicaciones 19-21 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en donde el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional se administran de manera concurrente, por separado o secuencialmente.
23.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la estimulación de una respuesta de linfocito T específica para un antígeno.
24.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto.
25.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto.
26.

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en el tratamiento de una infección viral en un sujeto.

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