JP7358361B2 - Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用 - Google Patents

Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用 Download PDF

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Description

ＥＦＳ－ＷＥＢにより電子的に提出した配列表の引用
本出願と共に電子的に提供したASCIIテキストファイルの配列表(名称：3338_098PC01_SequenceListing.txt；サイズ：９１２,９８１バイト；作成日：２０１９年１月１１日)の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
発明の背景
Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３(ＴＩＭ３)はＡ型肝炎ウイルス細胞受容体２(ＨＡＶＣＲ２)としても知られ、免疫応答の主要制御因子として機能するＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＩＭ３は活性化ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞(例えば、タイプ１ヘルパーＣＤ４＋ Ｔ細胞および細胞毒性ＣＤ８＋ Ｔ細胞)で同定され、ガレクチン－９に結合後、Ｔ細胞死または疲弊を誘導することが示された。最近の研究では、ＴＩＭ３発現が多くの自然免疫細胞(例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、肥満細胞およびナチュラルキラー細胞)の活動の制御に重要であることも同定されている。Han G et al., Front Immunol. 4: 449 (2013)参照。
多くの阻害性受容体(例えば、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４)と同様、ＴＩＭ３発現は、癌を含む多くのタイプの慢性疾患と関係している。ＴＩＭ３＋ Ｔ細胞は、進行性黒色腫、非小細胞肺癌または濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者で検出されている。そして、ＴＩＭ３＋制御性Ｔ細胞の存在は、肺癌進行の有効な指標として記載されている。Anderson AC. Cancer Immunol Res. 2: 393-8 (2014)参照。
ＴＩＭ３に対するいくつかの可能性のあるリガンドが同定されている：ガレクチン－９、ＨＭＧＢ１、セマフォリン－４Ａ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＩＬＴ－４およびホスファチジルセリン(ＰｔｄＳｅｒまたはＰＳ)。ＰＳは、重要な細胞膜成分であり、通常細胞膜内葉に局在化する。しかし、細胞がアポトーシスを受けると、ＰＳは再分布され、外膜に曝される。この再分布は多くの腫瘍細胞株でも観察される。Riedl S et al., Biochim Biophys Acta. 1808: 2638-2645 (2011)参照。ＴＩＭ３のＰＳへの結合は、食作用およびクロスプレゼンテーションに重要である。Nakayama M et al., Blood. 113: 3821-30 (2009)参照。
ＴＩＭ３と阻害性受容体ＰＤ－１の密接な関係を示す研究がある。例えば、多くの腫瘍特異的Ｔ細胞はＰＤ－１およびＴＩＭ３両者を発現し、これらＴ細胞は、ＰＤ－１またはＴＩＭ３のみを発現するＴ細胞と比較して、より機能障害性である。Fourcade J et al., J Exp Med. 207: 2175-2186 (2010)参照。
従って、ＴＩＭ３を標的とする薬剤およびこのような薬剤の使用方法が、新規癌免疫療法設計および伝統的癌免疫療法改善のために高度に望まれる。
発明の概要
ここに提供されるのは、ヒトＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３(ＴＩＭ３)(「抗ＴＩＭ３抗体」)に特異的に結合し、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分、特にヒト(例えば、モノクローナル)抗体などの単離抗体である。ある実施態様において、重鎖ＣＤＲ３は配列番号４１４または配列番号４１６を含む。ある実施態様において、重鎖ＣＤＲ１は配列番号４５を含む。ある実施態様において、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４１３または配列番号４１５を含む。ある実施態様において、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号６４を含む。ある実施態様において、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号６６を含む。ある実施態様において、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号６９、配列番号６８または配列番号４１９を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで
(ａ)重鎖ＣＤＲ１は配列番号４５を含み；
(ｂ)重鎖ＣＤＲ２は配列番号４１３または配列番号４１５を含み；
(ｃ)重鎖ＣＤＲ３は配列番号４１４または配列番号４１６を含み；
(ｄ)軽鎖ＣＤＲ１は配列番号６４を含み；
(ｅ)軽鎖ＣＤＲ２は配列番号６６を含み；そして
(ｆ)軽鎖ＣＤＲ３は配列番号６９、配列番号６８または配列番号４１９を含む。
ある実施態様において、(ａ)重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号４５、４１３および４１４をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号６４、６６および６９をそれぞれ含む；(ｂ)重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号４５、４１５および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号６４、６６および６８をそれぞれ含む；または(ｃ)重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号４５、４１５および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号６４、６６および４１９をそれぞれ含む。
ある実施態様において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号４５、４１３および４１４をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号６４、６６および６９をそれぞれ含む。ある実施態様において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号４５、４１５および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号６４、６６および６８をそれぞれ含む。ある実施態様において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号４５、４１５および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号６４、６６および４１９をそれぞれ含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)を含み、ここで、ＶＨは、配列番号４１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)を含み、ここで、ＶＬは、配列番号４１１に示すアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)を含み、ここで、ＶＬは、配列番号４１２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、
(ａ)配列番号４１０を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号４１７を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)；
(ｂ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)；
(ｃ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号４１８を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)；または
(ｄ)配列番号４１２を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)
を含む対照抗体とＴＩＭ３への結合について交差競合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は
(ａ)配列番号４１０を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号４１７を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｂ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｃ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号４１８を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
(ｄ)配列番号４１２を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、ＨＤＸにより決定して、
(ａ)配列番号４１０を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号４１７を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)；
(ｂ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)；
(ｃ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号４１８を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)または
(ｄ)配列番号４１２を含む重鎖可変領域(ＶＨ)および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)
を含む、対照抗体と同じエピトープに結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は
(ａ)配列番号４１０を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号４１７を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｂ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｃ)配列番号４１１を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号４１８を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
(ｄ)配列番号４１２を含む重鎖可変領域(ＶＨ)の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号６０を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分はＶＨおよびＶＬを含み、ここで、ＶＨは配列番号４１０を含み、ＶＬは配列番号４１７を含む。ある実施態様において、ＶＨは配列番号４１１を含み、ＶＬは配列番号６０を含む。ある実施態様において、ＶＨは配列番号４１１を含み、ＶＬは配列番号４１８を含む。ある実施態様において、ＶＨは配列番号４１２を含み、ＶＬは配列番号６０を含む。
ある実施態様において、ここに開示する抗ＴＩＭ３抗体は重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで、(ａ)重鎖ＣＤＲ１は配列番号４６９を含み；(ｂ)重鎖ＣＤＲ２は配列番号４７０を含み；そして(ｃ)重鎖ＣＤＲ３は配列番号４７１を含む。ある実施態様において、(ａ)軽鎖ＣＤＲ１は配列番号４７２を含み；(ｂ)軽鎖ＣＤＲ２は配列番号４７３を含み；そして(ｃ)軽鎖ＣＤＲ３は配列番号４７４を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)を含み、ここで(ａ)ＶＨは配列番号４４９または配列番号４５６を含み；そして(ｂ)ＶＬは配列番号４５０を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびそのバリアントからなる群から選択される。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ１抗体である。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分はエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、
(ａ１)それぞれ配列番号３８６(または３８７)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２)それぞれ配列番号３８８(または３８９)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ３)それぞれ配列番号３９０(または３９１)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ４)それぞれ配列番号３９２(または３９３)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ１)それぞれ配列番号３９４(または３９５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ２)それぞれ配列番号３９４(または３９５)および４０９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ３)それぞれ配列番号３９６(または３９７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ４)それぞれ配列番号３９８(または３９９)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ５)それぞれ配列番号４００(または４０１)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ６)それぞれ配列番号４０２(または４０３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ７)それぞれ配列番号４０４(または４０５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ８)それぞれ配列番号４０６(または４０７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ１)それぞれ配列番号４５１(または４６１)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ２)それぞれ配列番号４５２(または４６２)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ１)それぞれ配列番号４５７(または４６５)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列；または
(ｄ２)それぞれ配列番号４５８(または４６６)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列
を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は次の性質の１以上を有する。
(１)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～０.０５μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(２)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に結合する；
(３)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ、２×１０－8Ｍ、１０－8Ｍまたは５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；
(４)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(５)実施例２２に記載の方法で測定して、カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(６)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－8Ｍ、５×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(７)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)の増殖増大により証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する；および／または
(８)１４Ｈ７、２３Ｂ３、１３Ａ３、ＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４、ＴＩＭ３.２５、１７Ｃ３、９Ｆ６、ＴＩＭ３.７、３Ｇ４および１７Ｃ８の何れかのＶＨおよびＶＬを含む抗体とヒトＴＩＭ３の結合についていずれかの方向でまたは両方向で競合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は(ｉ)それぞれ配列番号４５、４１５および４１６を含むＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含むＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または(ii)配列番号４１２を含むＶＨおよび配列番号６０を含むＶＬを含み、ここで、該抗体はヒトＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；カニクイザルＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ以下のＫＤで結合する；および／またはカニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－6Ｍ以下のＫＤで結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は(ｉ)それぞれ配列番号４５、４１３および４１４を含むＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含むＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または(ii)配列番号４１０を含むＶＨおよび配列番号４１７を含むＶＬを含み、ここで、該抗体はヒトＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；カニクイザルＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；および／またはカニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する。
ある実施態様において、ここに開示する抗ＴＩＭ３抗体の重鎖はＣ末端リシンを含む。他の実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体の重鎖はＣ末端リシンを含まない。
ここに提供されるのは、第二の結合特異性を有する分子に結合された本明細書の抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子である。
ここに提供されるのは、抗ＴＩＭ３抗体のＶＨおよび／またはＶＬまたはその抗原結合部分をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクターおよび該発現ベクターで形質転換させた細胞である。
ここに提供されるのは、薬剤に結合した、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートである。
ここに提供されるのは、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび担体を含む、組成物である。またここに提供されるのは、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび使用の指示を含む、キットである。
ここに提供されるのは、細胞で抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を発現させ、該細胞から該抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を製造する方法である。
ここに提供されるのは、Ｔ細胞とここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように(例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞に対するＴＩＭ３の負の影響の阻害により)接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法である。
ここに提供されるのは、細胞、例えば、エフェクターＴ細胞とここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよびＣＤ３を接触させることを含む、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞)を活性化または共刺激をする方法であり、ここで、エフェクターＴ細胞は活性化または共刺激される(例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞に対するＴＩＭ３の負の影響の阻害により)。
ここに提供されるのは、Ｔ細胞と有効量のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ産生および／またはそれらの増殖を増加させる方法である。
ここに提供されるのは、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ産生が増加するように、対象に有効量のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象におけるＴ細胞におけるＩＦＮ－γ産生を増加させる方法である。
ここに提供されるのは、ＴＩＬが増殖するかまたはサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γを分泌するように、対象に治療有効量のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象におけるＴＩＬ活性を刺激する方法である。
ここに提供されるのは、対象に有効量のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象におけるＮＫ細胞(例えば、ＮＫ細胞の細胞毒性活性増加により)および／またはマクロファージまたは他の抗原提示細胞を刺激する方法である。例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、該ＴＩＭ３抗体と接触する抗原提示細胞によりＩＬ－１２分泌を増加できる。
ここに提供されるのは、対象における免疫応答が刺激されるように、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、対象に二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法である。ある実施態様において、対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。
ここに提供されるのは、対象における腫瘍増殖が阻害されるように、対象にここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における腫瘍の増殖を阻止するまたは腫瘍サイズを減少させる方法である。
ここに提供されるのは、癌を処置するために、それを必要とする対象に治療有効量のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲート体を投与することを含む、例えば、免疫療法により、癌を処置する方法である。ある実施態様において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、ウイルス関連癌およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、癌は転移癌、難治性癌または再発癌である。ある実施態様において、癌は冷たい腫瘍(cold tumor)である。
ある実施態様において、ここに記載する方法は、１以上のさらなる治療剤、例えば、抗ＰＤ－ｌ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と抗ＴＩＭ３抗体を投与することをさらに含む。
ここに提供されるのは、サンプルと抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその抗原結合部分とＴＩＭ３の間で複合体の形成が可能な条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、サンプルにおけるＴＩＭ３タンパク質の存在を検出する方法である。
実施態様
実施態様１. ヒトＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３(ＴＩＭ３)に結合し、次の
(ａ)可溶性ヒトＴＩＭ３に結合する；
(ｂ)膜結合ヒトＴＩＭ３に結合する；
(ｃ)Ｔ細胞活性化を誘導または増強する；そして所望により：
(ｄ)可溶性カニクイザルＴＩＭ３に結合する；および
(ｅ)膜カニクイザルＴＩＭ３に結合する
の性質を示す、単離抗体(例えば、ヒト抗体)またはその抗原結合部分。
実施態様２. 抗体が抗腫瘍免疫応答を刺激する、実施態様１の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３. 抗体が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、実施態様１または２の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４. 抗体がＴＩＭ３発現Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生を増加させる、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様５. 抗体がＴ細胞増殖を増加させる、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様６. 抗体がＦｃ受容体に結合しないまたは抗体がエフェクター機能を欠く、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様７. 抗体がBiacoreで測定して可溶性ヒトＴＩＭ３に１０nM以下のＫＤで結合する、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様８. 抗体がBiacoreで測定して可溶性カニクイザルＴＩＭ３に１００nM以下のＫＤで結合する、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様９. 抗体がＴＩＭ３による負の細胞(例えば、Ｔ細胞)シグナル伝達を阻害するアンタゴニスト抗体である、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合フラグメント。
実施態様１０. 抗体がフローサイトメトリーで測定して０.１または１μg／mL以下のＥＣ５０で膜結合ヒトＴＩＭ３に結合する、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１１. 抗体がスキャチャード解析により測定して、１nM以下のＫＤで膜結合ヒトＴＩＭ３に結合する、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１２. 抗体がフローサイトメトリーで測定して１μg／mL以下のＥＣ５０で膜結合カニクイザルＴＩＭ３に結合するまたは抗体がスキャチャード解析により測定して１nM以下のＫＤで膜結合カニクイザルＴＩＭ３と結合する、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１３. 抗体またはその抗原結合部分が重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで、重鎖ＣＤＲ３が配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８または配列番号１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１４. 重鎖ＣＤＲ１がＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｙ、Ｘ５およびＸ６を含み、ここでＸ１がＳまたは存在せず、Ｘ２がＲまたは存在せず、Ｘ３がＳ、ＲまたはＤであり、Ｘ４がＹまたはＨであり、Ｘ５がＷまたはＭであり、そしてＸ６がＧ、Ｎ、ＳまたはＨである、実施態様１３の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１５. 重鎖ＣＤＲ１がＸ１、Ｙ、Ｙ、ＭおよびＸ２を含み、ここでＸ１がＳまたはＤであり、そしてＸ２がＨまたはＳである、実施態様１３または１４の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１６. 重鎖ＣＤＲ１がＲ、Ｘ１、Ｙ、ＷおよびＸ２を含み、ここでＸ１がＨまたはＹであり、Ｘ２がＮまたはＳである、実施態様１３または１４の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１７. 重鎖ＣＤＲ２がＸ１、Ｉ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｇ、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｙ、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３およびＸ１４を含み、ここでＸ１がＳ、Ｙ、ＩまたはＦであり、Ｘ２がＹ、Ｈ、ＮまたはＳであり、Ｘ３がＹ、Ｐ、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ４がＳ、Ｔ、ＲまたはＧであり、Ｘ５がＦ、ＳまたはＤであり、Ｘ６がＳ、ＴまたはＩであり、Ｘ７がＩまたは存在せず、Ｘ８がＹ、ＮまたはＩであり、Ｘ９がＮ、Ｑ、ＳまたはＡであり、Ｘ１０がＰ、Ｓ、ＱまたはＤであり、Ｘ１１がＳまたはＫであり、Ｘ１２がＬ、ＦまたはＶであり、Ｘ１３がＫまたはＱであり、Ｘ１４がＳまたはＧである、実施態様１３～１６の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１８. 重鎖ＣＤＲ２がＹ、Ｉ、Ｈ、Ｙ、Ｘ１、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、Ｎ、Ｘ２、Ｓ、Ｌ、ＫおよびＳを含み、ここでＸ１がＳまたはＴであり、Ｘ２がＳまたはＰである、実施態様１３～１７の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様１９. 重鎖ＣＤＲ２がＦ、Ｉ、Ｓ、Ｘ１、Ｘ２、Ｇ、Ｓ、Ｘ３、Ｉ、Ｙ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｓ、Ｖ、ＫおよびＧを含み、ここでＸ１がＧ、ＴまたはＳであり、Ｘ２がＧまたはＳであり、Ｘ３がＴまたはＩである、実施態様１３～１７の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２０. 重鎖ＣＤＲ２がＩ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｉ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｆ、ＱおよびＧを含む、実施態様１３～１７の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２１. 軽鎖ＣＤＲ１が配列番号６４または配列番号６５を含む、実施態様１３～２０の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２２. 軽鎖ＣＤＲ２が配列番号６６または配列番号６７を含む、実施態様１３～２１の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２３. 軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０または配列番号７１を含む、実施態様１３～２２の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２４. 抗体またはその抗原結合部分が重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで
(ａ)重鎖ＣＤＲ１が配列番号４１、配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；および配列番号４５からなる群から選択される；
(ｂ)重鎖ＣＤＲ２が配列番号４６、配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号１２２；配列番号１２３；配列番号１２４および配列番号１２５からなる群から選択される；
(ｃ)重鎖ＣＤＲ３が配列番号５３、配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８；配列番号５９；配列番号１２６；配列番号１２７；配列番号１２８および配列番号１２９からなる群から選択される；
(ｄ)軽鎖ＣＤＲ１が配列番号６４または配列番号６５を含む；
(ｅ)軽鎖ＣＤＲ２が配列番号６６または配列番号６７を含む；および
(ｆ)軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０または配列番号７１を含む、
先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２５. 単離抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトＴＩＭ３に結合し、
(ａ１)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２２、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ３)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２３、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ４)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２４、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ５)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２６を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ６)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２７を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ７)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ８)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２９を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ９)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２２、１２８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ１０)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２２、１２６を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ｂ１)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４２、４７、５４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｂ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４２、１２５、５４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｃ)それぞれ配列番号４３、４８および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ)それぞれ配列番号４４、４９および５６を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ)それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ)それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および７１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ１)それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６５、６７および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、７１を含む；
(ｇ３)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｈ)それぞれ配列番号４５、５１および５８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ)それぞれ配列番号４５、５２および５９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２６. 抗体がそれぞれ配列番号４１、４６および５３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２７. 抗体がそれぞれ配列番号４２、４７および５４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２８. 抗体がそれぞれ配列番号４３、４８および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様２９. 抗体がそれぞれ配列番号４４、４９および５６を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３０. 抗体がそれぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３１. 抗体がそれぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および７１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３２. 抗体がそれぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６５、６７および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３３. 抗体がそれぞれ配列番号４５、５１および５８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３４. 抗体がそれぞれ配列番号４５、５２および５９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様２５の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３５. ヒトＴＩＭ３に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、重鎖可変領域が配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１および３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３６. ヒトＴＩＭ３に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、軽鎖可変領域が配列番号６０、６１、６２および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３７. ヒトＴＩＭ３に結合し、ＶＨおよびＶＬを含む対照抗体とヒトＴＩＭ３への結合について交差競合する単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、ＶＨおよびＶＬが
(ａ)配列番号３４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｂ)配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｃ)配列番号３６に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｄ)配列番号３７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｅ)配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｆ)配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｇ)配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｈ)配列番号３９に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｉ)配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｊ)それぞれ配列番号１２１に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｋ)配列番号１２０に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｌ)それぞれ配列番号１１２に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｍ)それぞれ配列番号１１３に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｎ)それぞれ配列番号１１４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｏ)それぞれ配列番号１１５に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｐ)それぞれ配列番号１１６に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｑ)それぞれ配列番号１１７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｒ)それぞれ配列番号１１８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｓ)それぞれ配列番号１１９に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；および
(ｔ)それぞれ配列番号３６４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３８. 例えば、ここに提供する１以上の方法により決定して、対象抗体と同じエピトープでＴＩＭ３に結合する、実施態様３７の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様３９.
(ａ)配列番号３４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｂ)配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｃ)配列番号３６に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｄ)配列番号３７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｅ)配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｆ)配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｇ)配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｈ)配列番号３９に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｉ)配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｊ)それぞれ配列番号１２１に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｋ)それぞれ配列番号１２０に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｌ)それぞれ配列番号１１２に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｍ)それぞれ配列番号１１３に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｎ)それぞれ配列番号１１４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｏ)それぞれ配列番号１１５に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｐ)それぞれ配列番号１１６に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｑ)それぞれ配列番号１１７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｒ)それぞれ配列番号１１８に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；
(ｓ)それぞれ配列番号１１９に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ；および
(ｔ)それぞれ配列番号３６４に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬ
からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４０. 配列番号３４、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９および配列番号３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４１. 配列番号３５または配列番号１２０に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４２. 配列番号３６に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４３. 配列番号３７に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４４. 配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むＶＨまたは配列番号１２１および配列番号６１、配列番号６３または配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４５. 配列番号３９に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４６. 配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施態様３７または３８の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４７. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４８. 抗体がＩｇＧ１抗体である、実施態様４７の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様４９. 抗体がエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、実施態様４７の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様５０. 抗体またはその抗原結合部分が次の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａそして所望によりＡ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、実施態様４９の抗体またはその抗原結合部分。
実施態様５１. 配列番号２６３～２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、先の実施態様の何れかの抗体またはその抗原結合部分
実施態様５２. 抗体またはその抗原結合部分がヒトまたはヒト化抗体である、実施態様１～５１の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
実施態様５３. 抗体が
(ａ１)それぞれ配列番号３０１(または３０２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２)それぞれ配列番号１(または８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ３)それぞれ配列番号１５(または２２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ４)それぞれ配列番号３０３(または３０４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ５)それぞれ配列番号７２(または８２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ６)それぞれ配列番号９２(または１０２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ７)それぞれ配列番号３０５(または３０６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ８)それぞれ配列番号７３(または８３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ９)それぞれ配列番号９３(または１０３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１０)それぞれ配列番号３０７(または３０８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１１)それぞれ配列番号７４(または８４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１２)それぞれ配列番号９４(または１０４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１３)それぞれ配列番号３０９(または３１０)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１４)それぞれ配列番号７５(または８５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１５)それぞれ配列番号９５(または１０５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１６)それぞれ配列番号３１１(または３１２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１７)それぞれ配列番号７６(または８６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１８)それぞれ配列番号９６(または１０６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１９)それぞれ配列番号３１３(または３１４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２０)それぞれ配列番号７７(または８７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２１)それぞれ配列番号９７(または１０７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２２)それぞれ配列番号３１５(または３１６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２３)それぞれ配列番号７８(または８８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２４)それぞれ配列番号９８(または１０８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２５)それぞれ配列番号３１７(または３１８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２６)それぞれ配列番号７９(または８９)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２７)それぞれ配列番号９９(または１０９)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２８)それぞれ配列番号３１９(または３２０)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２９)それぞれ配列番号３４９(または３５０)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ３０)それぞれ配列番号３５１(または３５２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ３１)それぞれ配列番号３５３(または３５４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ１)それぞれ配列番号３２１(または３２２)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ２)それぞれ配列番号２(または９)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ３)それぞれ配列番号１６(または２３)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ４)それぞれ配列番号３２３(または３２４)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ５)それぞれ配列番号８０(または９０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ６)それぞれ配列番号１００(または１１０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ７)それぞれ配列番号３２５(または３２６)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ１)それぞれ配列番号３２７(または３２８)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ２)それぞれ配列番号３(または１０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ３)それぞれ配列番号１７(または２４)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ４)それぞれ配列番号３２９(または３３０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ１)それぞれ配列番号３３１(または３３２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ２)それぞれ配列番号４(または１１)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ３)それぞれ配列番号１８(または２５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ４)それぞれ配列番号３３３(または３３４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ１.１)それぞれ配列番号３３５(または３３６)および３２を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ１.２)それぞれ配列番号３３５(または３３６)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ１.３)それぞれ配列番号３３５(または３３６)および３１を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ２)それぞれ配列番号５(または１２)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ３)それぞれ配列番号１９(または２６)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ４)それぞれ配列番号３３７(または３３８)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ５)それぞれ配列番号８１(または９１)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ６)それぞれ配列番号１０１(または１１１)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ７)それぞれ配列番号３３９(または３４０)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ１)それぞれ配列番号３４１(または３４２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ２)それぞれ配列番号６(または１３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ３)それぞれ配列番号２０(または２７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ４)それぞれ配列番号３４３(または３４４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｇ１)それぞれ配列番号３４５(または３４６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｇ２)それぞれ配列番号７(または４３)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｇ３)それぞれ配列番号２１(または２８)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；または
(ｇ４)それぞれ配列番号３４７(または３４８)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
を含み、ここで、抗体がヒトＴＩＭ３に特異的に結合する、実施態様１～５２の何れかの抗体。
実施態様５４. 抗体またはその抗原結合部分は次の性質の１以上を有する、実施態様１～５３の何れかの抗体またはその抗原結合部分。
(１)例えば、Biacoreで測定して、可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、Biacoreで測定して、可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下(例えば、０.０１nM～１００nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～１μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、スキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(５)例えば、フローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、２０μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～２０μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(６)例えば、スキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(７)(ｉ)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)のＩＦＮ－γ産生を増加させるおよび／または(ii)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する；
(８)混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を刺激する；
(９)例えば、ＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３への結合を阻害する；
(１０)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(１１)ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域(ａ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ｂ)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(ｃ)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；および(ｄ)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)の一つに結合する；
(１２)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図３０))の１以上が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３に対して結合が減少している；；
(１３)１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８の何れかのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する；
(１４)ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(１５)Ｘ線結晶学(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図３０))により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；および／または
(１６)(ａ)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図３０))の１、２、３、４、５、６、７、８または９が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３への結合が減少している；(ｂ)実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する；および／または(ｃ)１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３への結合と競合するまたは交差遮断する。
実施態様５５. 第二の結合特異性を有する分子に結合した、先の実施態様の何れかの抗体を含む二重特異性分子。
実施態様５６. 実施態様１～５４の何れかの抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
実施態様５７. 実施態様５６の核酸分子を含む、発現ベクター。
実施態様５８. 実施態様５７の発現ベクターで形質転換された、細胞。
実施態様５９. 薬剤と結合した実施態様１～５４の何れかの抗体を含む、イムノコンジュゲート。
実施態様６０. 実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび担体を含む、組成物。
実施態様６１. 実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分または二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび使用の指示を含む、キット。
実施態様６２. 抗体またはその抗原結合部分を実施態様５８の細胞で発現させ、該細胞から該抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を製造する方法。
実施態様６３. 抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞と実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法。
実施態様６４. エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激されるように、エフェクターＴ細胞と実施態様１～５５および５９の何れかの抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよびＣＤ３を接触させることを含む、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法。
実施態様６５. Ｔ細胞と有効量の実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生を増加させる方法。
実施態様６６. 細胞と有効量の実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法。
実施態様６７. Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ産生を増加させるように、対象に有効量の実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象におけるＴ細胞のＩＦＮ－γ産生を増加させる方法。
実施態様６８. 対象に治療有効量の実施態様１～５４の何れかの抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、対象におけるＴＩＬ活性を刺激する方法。
実施態様６９. 対象における免疫応答が刺激されるように対象に実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。
実施態様７０. 対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、実施態様６９の方法。
実施態様７１. 対象における腫瘍増殖が阻害されるように対象に実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における腫瘍の増殖を阻止するまたは腫瘍サイズを減少させる方法。
実施態様７２. 癌を処置するために、それを必要とする対象に治療有効量の実施態様１～５５および５９の何れかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、癌を処置する方法。
実施態様７３. 癌が膀胱癌、乳癌、子宮／頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、実施態様７２の方法。
実施態様７４. 癌が転移癌、難治性癌または再発性癌である、実施態様７２または７３の方法。
実施態様７５. １以上のさらなる治療剤を投与することをさらに含む、実施態様６７～７４の何れか、の方法。
実施態様７６. さらなる治療剤が抗ＰＤ－ｌ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、実施態様７５の方法。
実施態様７７. サンプルと実施態様１～５４の何れかの抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその抗原結合部分とＴＩＭ３の間で複合体の形成が可能な条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、サンプルにおけるＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３(ＴＩＭ３)の存在を検出する方法。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１６７)およびアミノ酸配列(配列番号３４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４１)、ＣＤＲ２(配列番号４６)およびＣＤＲ３(配列番号５３)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６８)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号２７４および２６９)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号１６７)およびアミノ酸配列(配列番号３４)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号２７３および２６８)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(配列番号１９３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１６８)およびアミノ酸配列(配列番号３５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４２)、ＣＤＲ２(配列番号４７)およびＣＤＲ３(配列番号５４)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９４)およびアミノ酸配列(配列番号６１)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６９)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号２７４および２６９)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号１６８)およびアミノ酸配列(配列番号３５)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号２７３および２６８)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(配列番号１９４)およびアミノ酸配列(配列番号６１)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１６９)およびアミノ酸配列(配列番号３６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４３)、ＣＤＲ２(配列番号４８)およびＣＤＲ３(配列番号５５)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９４)およびアミノ酸配列(配列番号６１)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６９)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号２７４および２６９)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号１６９)およびアミノ酸配列(配列番号３６)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号２７３および２６８)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(配列番号１９４)およびアミノ酸配列(配列番号６１)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１７０)およびアミノ酸配列(配列番号３７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４４)、ＣＤＲ２(配列番号４９)およびＣＤＲ３(配列番号５６)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６８)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号２７２および２６７)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号１７０)およびアミノ酸配列(配列番号３７)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号２７３および２６８)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(配列番号１９３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１７１)およびアミノ酸配列(配列番号３８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４５)、ＣＤＲ２(配列番号５０)およびＣＤＲ３(配列番号５７)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ１の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９５)およびアミノ酸配列(配列番号６２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６５)、ＣＤＲ２(配列番号６７)およびＣＤＲ３(配列番号７０)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ２の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９６)およびアミノ酸配列(配列番号６３)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号７１)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ３の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９４)およびアミノ酸配列(配列番号６１)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６９)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号２７５および２７０)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ１、ＶＫ２およびＶＫ３の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号１７１)およびアミノ酸配列(配列番号３８)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号２７６および２７１)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(それぞれ配列番号１９５、１９６および１９４)およびアミノ酸配列(それぞれ配列番号６２、６３および６１)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１７２)およびアミノ酸配列(配列番号３９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４５)、ＣＤＲ２(配列番号５１)およびＣＤＲ３(配列番号５８)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６８)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号２７５および２７０)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号１７２)およびアミノ酸配列(配列番号３９)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号２７３および２６８)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(配列番号１９３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１７３)およびアミノ酸配列(配列番号４０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４５)、ＣＤＲ２(配列番号５２)およびＣＤＲ３(配列番号５９)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号１９４)およびアミノ酸配列(配列番号６１)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６９)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号２７５および２７０)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号１７３)およびアミノ酸配列(配列番号４０)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号２７３および２６８)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(配列番号１９４)およびアミノ酸配列(配列番号６１)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１４Ｈ７の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号４２０)およびアミノ酸配列(配列番号４１０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４５)、ＣＤＲ２(配列番号４１３)およびＣＤＲ３(配列番号４１４)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１４Ｈ７の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域のヌクレオチド配列(配列番号４２７)およびアミノ酸配列(配列番号４１７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６９)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号３６２および３６１)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１４Ｈ７の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号４２０)およびアミノ酸配列(配列番号４１０)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号３６３および３６１)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１４Ｈ７の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(配列番号４２７)およびアミノ酸配列(配列番号４１７)を示す。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体２３Ｂ３の成熟重鎖可変(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列(配列番号４２１)およびアミノ酸配列(配列番号４１１)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４５)、ＣＤＲ２(配列番号４１５)およびＣＤＲ３(配列番号４１６)が線引きされ、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体２３Ｂ３の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域ｏｆ ＶＫ１のヌクレオチド配列(配列番号１９３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６８)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体２３Ｂ３の成熟軽鎖可変(ＶＬ)領域ｏｆ ＶＫ２のヌクレオチド配列(配列番号４２８)およびアミノ酸配列(配列番号４１８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６４)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号４１９)が線引きされ、ＶおよびＪ生殖系列系統が示される。
シグナル配列(それぞれ配列番号３６２および３６１)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体２３Ｂ３の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列(配列番号４２１)およびアミノ酸配列(配列番号４１１)ならびにシグナル配列(それぞれ配列番号３６３および３６１)と共に抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体２３Ｂ３のＶＫ１およびＶＫ２の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列(それぞれ配列番号１９３および４２８)およびアミノ酸配列(それぞれ配列番号６０および４１８)を示す。
モノクローナル抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、２３Ｂ３および１４Ｈ７の重鎖可変(ＶＨ)領域の配列アライメントを示す。相補性決定領域(ＣＤＲ)は四角で囲む。
抗体のＶＨ領域、各ＣＤＲおよびその変異体の配列番号の一覧である。
モノクローナル抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６＿ＶＫ１、９Ｆ６＿ＶＫ２、９Ｆ６＿ＶＫ３、３Ｇ４、１７Ｃ８、２３Ｂ３＿ＶＫ１、２３Ｂ３＿ＶＫ２および１４Ｈ７の軽鎖可変(ＶＬ)領域の配列アライメントを示す。相補性決定領域(ＣＤＲ)は四角で囲む。
抗体のＶＬ領域および各ＣＤＲの配列番号の一覧である。
モノクローナル抗体ＴＩＭ３.５(１３Ａ３)およびその例示的バリアント：ＴＩＭ３.１３(Ｄ１０１Ｅ)、ＴＩＭ３.１４(Ｐ１０２Ｖ)、ＴＩＭ３.１５(Ｐ１０２Ｙ)、ＴＩＭ３.１６(Ｐ１０２Ｌ)、ＴＩＭ３.１７(Ｎ６０Ｑ／Ｐ１０２Ｙ)、ＴＩＭ３.１８(Ｎ６０Ｑ／Ｄ１０１Ｅ)、ＴＩＭ３.１０(Ｎ６０Ｑ)、ＴＩＭ３.１１(Ｎ６０Ｓ)およびＴＩＭ３.１２(Ｎ６０Ａ)の成熟完全長重鎖(ＨＣ)の配列アライメントを示す。重鎖の各々のＶＨ領域は下線が引かれている。
モノクローナル抗体９Ｆ６およびその例示的バリアントＴＩＭ３.７(Ａ１０８Ｔ)の成熟完全長ＨＣの配列アライメントを示す。各重鎖のＶＨ領域は下線が引かれている。
モノクローナル８Ｂ９およびその例示的バリアントＴＩＭ３.８(Ｓ６１Ｐ)の成熟完全長ＨＣの配列アライメントを示す。各重鎖のＶＨ領域は下線が引かれている。
モノクローナル抗体２３Ｂ３および例示的バリアントＴＩＭ３.２５(Ｇ６Ｅ／Ｄ７９Ｙ)の成熟完全長ＨＣの配列アライメントを示す。各重鎖のＶＨ領域は下線が引かれている。
ハイブリドーマ由来抗体(１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３)および組み換え(ＴＩＭ３.２－ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５)抗ヒトＴＩＭ３抗体の完全長重鎖および軽鎖、可変領域およびＣＤＲの配列番号の一覧である。重鎖および軽鎖のアイソタイプも示される。「Ｈ.ｎ.」はハイブリドーマ名である。図１６に示す重鎖および軽鎖は、そこに開示されているその要素、例えば、可変領域および定常領域に由来し得る。配列番号が表の２ページ目または３頁目のカラムにないとき、その前の頁またはそのさらに前のページのカラムに提供される。
数抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３トランスフェクトＣＨＯ細胞(図１７Ａ)および活性化ヒトＴ細胞(図１７Ｂ)への結合曲線およびＥＣ５０値を示す。図１７Ａにおいて、次の抗ＴＩＭ３抗体が示される。１３Ａ３、１７Ｃ３、１７Ｃ８、３Ｇ４、８Ｂ９および９Ｆ６。図１７Ｂにおいて、次の抗ＴＩＭ３抗体が示される。１３Ａ３、１７Ｃ３、１７Ｃ８、３Ｇ４、８Ｂ９、８Ｃ４および９Ｆ６。両図１７Ａおよび１７Ｂにおいて、アイソタイプ対照抗体ヒトＩｇＧ１(ｈＧ１)、ＩｇＧ２(ｈＧ２)およびＩｇＧ４(ｈＧ４)を陰性対照として使用した。
抗ＴＩＭ３抗体１４Ｈ７および２３Ｂ３のヒトＴＩＭ３陽性細胞の抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３結合の結合曲線およびＥＣ５０値の比較を示す。アイソタイプ対照抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ１.１(ｈＧ１.１)、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４を陰性対照として使用した。
カニクイザルＴＩＭ３トランスフェクトＣＨＯ細胞株(図１９Ａ)および活性化カニクイザルＴ細胞(図１９Ｂおよび１９Ｃ)への抗ＴＩＭ３抗体の結合分析を示す。図１９Ａにおいて、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３、１７Ｃ３、１７Ｃ８、３Ｇ４、８Ｂ９および９Ｆ６の結合曲線およびＥＣ５０値が提供される。図１９Ｂにおいて、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３の結合曲線およびＥＣ５０値が提供される。図１９Ｃにおいて、１００μgの関連抗体を、活性化カニクイザルＣＤ８＋ Ｔ細胞への結合について試験した。結合データを平均蛍光指数(ＭＦＩ)として示す。図１９Ａ～１９Ｃにおいて、関連アイソタイプ対照抗体(ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２およびｈＩｇＧ４)または無抗体処置(Ｎｏ Ａｂ)を陰性対照として使用した。
ヒトＴＩＭ３(「１」)またはカニクイザルＴＩＭ３(「２」)でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞への抗ＴＩＭ３抗体１４Ｈ７(左パネル)および２３Ｂ３(右パネル)の結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。アイソタイプ対照抗体でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した(「３」)。
腎臓細胞癌(ＲＣＣ)における腫瘍浸潤白血球(ＴＩＬ)からのＩＦＮ－γ産生促進における抗ＴＩＭ３活性(四角で囲んだ説明文に示すとおり、様々な抗体濃度)を示す。各抗体の８つのバーは、示す抗体の様々な濃度を表す。抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、８Ｂ９および９Ｆ６のデータを示す。アイソタイプ対照抗体を対照として使用した。水平点線は、バックグラウンド閾値レベルを提供する。
肺癌ＴＩＬ(図２２Ａ、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ；図２２Ｂ、細胞内ＩＦＮ－γ染色)からのＩＦＮ－γ産生促進における抗ＴＩＭ３活性(四角で囲んだ説明文に示すとおり、様々な抗体濃度)を示す。図２２Ａにおいて、示す各抗体の個々のバー(１３Ａ３および３Ｇ４)は、示す抗体の様々な濃度を表す。図２２Ｂにおいて、上部パネルはＣＤ４＋ Ｔ細胞を示し、下部パネルはＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＴＩＭ３のレベルは８Ｂ９で測定した(ｘ軸)。図２２Ｂにおいて、非ＴＩＭ３特異的抗体(ＫＬＨ－２Ｆ５－ｇ４ｐ)を対照として使用した。ｘ軸はＴＩＭ３発現を示し、ｙ軸はＩＦＮ－γ発現を示す。
患者の様々な組織(すなわち、腎臓、膵臓、肺および甲状腺)から単離し、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３または３Ｇ４と共にインビトロで培養したＴＩＬからのＩＦＮ－γ分泌促進における抗ＴＩＭ３抗体(すなわち、抗体１３Ａ３および３Ｇ４)の有効性を示す。ＩＦＮ－γ分泌をＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞存在下測定した。データを、抗ＴＩＭ３抗体非存在下でＴＩＬにより産生されたＩＦＮ－γレベルを超える増加倍数として示す。
活性化ヒトＴ細胞に対する抗ＴＩＭ３抗体の交差遮断データを示す。図２４Ａにおいて、次の抗ＴＩＭ３抗体３Ｇ４、８Ｂ９、９Ｆ６、１７Ｃ３、１７Ｃ８および８Ｃ４の一つのプレインキュベートされた活性化ヒトＴ細胞への抗ＴＩＭ３抗体１７Ｃ３(濃灰色)、８Ｂ９(黒色)および１３Ａ３(薄灰色)を示す。図２４Ｂにおいて、活性化ヒトＴ細胞を１４Ｈ７または２３Ｂ３抗体とプレインキュベートし、次いで、１３Ａ３抗体の結合を測定した。両図２４Ａおよび２４Ｂにおいて、抗ＴＩＭ３抗体の活性化ヒトＴ細胞への結合の幾何平均蛍光強度が提供される。
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３および８Ｂ９のヒトＴＩＭ３への結合に必須のアミノ酸残基を示す。シグナル配列および膜貫通ドメインは下線が引かれる。
ある抗ＴＩＭ３抗体がヒトＴＩＭ３とＰＳ－リポソームの相互作用を遮断することを示す。図２６Ａは、ホスファチジルセリン(ＰＳ)－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイの模式図を示す。図２６Ｂは、図２６Ａに示すＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイで測定した、ある抗ＴＩＭ３抗体によるｈＴＩＭ３－ＦｃのＰＳ－リポソームへの結合の遮断を示す。最上列は抗ＴＩＭ３抗体３Ｇ４、１３Ａ３、１７Ｃ３および１７Ｃ８のデータを示す。最下列は抗ＴＩＭ３抗体８Ｂ９、８Ｃ４および９Ｆ６のデータを示す。ＰＳ応答時間およびＰＳ－リポソームにｈＴＩＭ３－Ｆｃが結合するか否かが各グラフの右の表に提供される。
様々な抗ＴＩＭ３抗体(例えば、ＴＩＭ３.５(１３Ａ３)、ＴＩＭ３.４(３Ｇ４)、ＴＩＭ３.２(１７Ｃ３)、ＴＩＭ３.９(１７Ｃ８)、９Ｆ６、ＴＩＭ３.８(ＶＨにＳ６１Ｐ置換を有する８Ｂ９)およびＴＩＭ３.６(８Ｃ４))の機能的活性の概要を示す。結合アッセイ、Ｔ細胞アッセイ、ＴＩＬアッセイおよびＰＳ－ＴＩＭ３遮断アッセイのデータが提供される。
配列番号により表される配列の明細と共に、全配列番号の一覧を記載する。
ＣＴ２６結腸直腸腫瘍マウスモデルにおける抗ＰＤ１と抗ＴＩＭ３抗体の組み合わせ投与の抗腫瘍活性を示す。図２９Ａは、(ｉ)対照ＩｇＧ(上部左パネル)、(ii)ＲＭＴ３－２３抗ＴＩＭ３抗体単独(上部右パネル)、(iii)ＲＭＰ１－１４抗ＰＤ１抗体単独(下部左パネル)および(iv)ＲＭＴ３－２３抗ＴＩＭ３とＲＭＰ１－１４抗ＰＤ１抗体の組み合わせ(下部右パネル)で処置したマウス(ｎ＝１０／群)における腫瘍移植後様々な時点での腫瘍体積を示す。図２９Ｂは、(ｉ)ＲＭＴ３－２３抗ＴＩＭ３抗体単独、(ii)ＡｂＭ抗ＴＩＭ３抗体単独、(iii)ＲＭＰ１－１４抗ＰＤ１抗体単独、(iv)ＲＭＴ３－２３抗ＴＩＭ３とＲＭＰ１－１４抗ＰＤ１抗体の組み合わせ、(ｖ)ＡｂＭ抗ＴＩＭ３とＲＭＰ１－１４抗ＰＤ１抗体の組み合わせおよび(vi)アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの時間の関数(腫瘍移植後日数)としての平均腫瘍体積を示す。
水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ－ＭＳ)を使用して抗ＴＩＭ３抗体(１３Ａ３および３Ｇ４)のエピトープをマッピングするために使用した、ｈＴＩＭ３の共通のペプチドの一覧を示す。各バーは消化性ペプチドを示す。丸をした残基(すなわち、Ｎ９９、Ｔ１４５およびＮ１７２)はグリコシル化部位を示す。
ＨＤＸ－ＭＸを使用して同定した抗ＴＩＭ３抗体(１３Ａ３および３Ｇ４)のヒトＴＩＭ３結合領域を示す。上部パネルは１３Ａ３抗ＴＩＭ３抗体の結合領域を示す。下部パネルは３Ｇ４抗ＴＩＭ３抗体の結合領域を示す。
ヒトまたはカニクイザルＴＩＭ３に異所性に発現するＣＨＯ細胞へのＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の結合のスキャチャード解析結果を示す。図３２Ａは125Ｉ－ＴＩＭ３ Ａｂ標準曲線を示す。図３２Ｂはヒト(左パネル)およびカニクイザル(右パネル)ＴＩＭ３発現ＣＨＯ細胞に結合するＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の量を示す。各グラフの下は、推定親和性値およびＣＨＯ細胞表面に発現されるＴＩＭ３分子数を提供する。これらの値は、実施例４に記載のとおり計算された。
２つの別々のドナー(左および右パネル)からの活性化Ｔｈ１細胞へのＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の結合のスキャチャード解析結果を示す。各グラフの下に推定親和性値およびＣＨＯ細胞表面に発現されるＴＩＭ３分子数を示す。これらの値は、実施例４に記載のとおり計算された。
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３およびＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３ Ｆａｂが、極性化Ｔｈ１／照射ＣＨＯ－ＯＫＴ３共培養アッセイにおけるＴｈ１ Ｔ細胞の増殖を増強したことを示す。図３４Ａは、様々な濃度のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３、１３Ａ３(「１３Ａ３－ｇ４」)、無抗体またはアイソタイプ対照抗体(ｈＩｇＧ１.１またはｈＩｇＧ４)で観察されたＴｈ１細胞増殖を示す。抗体についてのバーの各々は異なる濃度を表す。図３４Ｂは、様々な濃度のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３ Ｆａｂ、無抗体(「ｎｏ ａｂ」)またはアイソタイプ対照抗体ＩｇＧ１.３(「Ｇ１.３」)で観察されたＴｈ１細胞増殖を示す。ＴＩＭ３.１８抗体についてのバーの各々は異なる濃度を表す。
極性化Ｔｈ１／照射ＣＨＯ－ＯＫＴ３共培養アッセイにおけるＴｈ１ Ｔ細胞の増殖のＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５介在増強を示す。ＴＩＭ３.１８抗体を、比較目的で含めた。いずれの抗体でも処置していない(「Ｎｏ Ａｂ」)またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１.３抗体(「ＩｇＧ１.３」)で処置したＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した。水平点線は、陰性対照を超える増殖を示す。
抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３(黒丸)がニボルマブと組み合わせて極性化Ｔｈ１／照射ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１共培養アッセイでＴｈ１ Ｔ細胞増殖を増強したことを示す。いずれの抗体でも処置していない(白四角)またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１.３抗体で処置した(灰色四角)ＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した。
抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が照射ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞で刺激後、腎臓細胞癌腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)のインターフェロン－γ分泌を増強したことを示す。アイソタイプ対照抗体(ｈＩｇＧ４またはｈＩｇＧ１.１ｆ)存在下または完全抗体非存在下でＣＨＯで刺激したＴＩＬを陰性対照として使用した。ＴＩＭ３.１８抗体の各々のバーは、該抗体の異なる濃度を表す。
抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が照射ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞で刺激された乳癌ＴＩＬのインターフェロン－γ分泌を増強したことを示す。無抗体またはアイソタイプ対照抗体でのアッセイを対照として使用した。水平点線は陰性対照を超えるインターフェロン－γ分泌を示す。
ＡｌｌｏＭＬＲ(混合リンパ球反応)アッセイで使用したＭ０マクロファージ上のＣＤ１６３、ＣＤ２０６およびＴＩＭ３発現のヒストグラムを示し、その結果を図４０に示す。ヒストグラムの各々は、(１)ＣＤ１６３、ＣＤ２０６またはＴＩＭ３、(２)アイソタイプ対照抗体(すなわち、陰性対照)および(３)バックグラウンド蛍光(「非染色」)(すなわち、陰性対照)の蛍光強度を示す。
抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３、アイソタイプ対照または存在下または抗体非存在下で実施したＡｌｌｏＭＬＲアッセイにおける細胞増殖を示す。
結晶学により決定した、ＴＩＭ３：ＴＩＭ３.１８ Ｆａｂ複合体の構造のリボンダイヤグラムを示す。Ｆａｂフラグメントを薄灰色で示し、ＴＩＭ３を濃灰色で示す。
結晶学により決定した、ＴＩＭ３：ＴＩＭ３.１８ Ｆａｂ複合体の構造を示す。Ｆａｂフラグメントをリボンダイヤグラムとして示す。ＴＩＭ３を白色曲面表現で示し、Ｆａｂ接触残基を濃灰色で記載する。
抗ＴＩＭ３抗体による可能性のある内在化の測定に使用した、アッセイのダイヤグラムである。左パネルはアッセイの図式的概観を示す。右パネルは、内在化値の計算を述べる。
抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３(下部左パネル)およびそのあるバリアント(Ｄ１０１Ｅ－上部左パネル；Ｎ６０Ｑ－上部右パネル)が受容体(すなわち、ＴＩＭ３)介在内在化を誘発しないことを示す。
抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３(図４５Ａ)および３Ｇ４(図４５Ｂ)のエピトープを述べるリボンダイヤグラムを示す。抗体の各々のエピトープのアミノ酸配列を、リボンダイヤグラムの下に提供する。異なるパターンは、特異的エピトープに対応する抗ＴＩＭ３抗体の特異的領域を同定する。
発明の詳細な記載
本明細書がより容易に理解され得るために、一部用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載を通して示される。
単数表現は、そのものの１以上をいうことは理解される；例えば、「ヌクレオチド配列」は１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、用語「ある」、「１以上」および「少なくとも１つ」は、ここでは、相互交換可能に使用され得る。
さらに、「および／または」は、ここで使用さるとき、他を伴うまたは伴わない２つの特定した性質または成分の各々への具体的な開示と解釈される。よって、ここで「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句で使用される用語「および／または」は、次の態様の何れかを含むことが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
用語「含む」を用いてここで態様が記載されている限り、「からなる」および／または「本質的にからなる」の用語以外類似の態様も提供されると理解される。
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に本明細書で使用される用語の多くの一般的辞書を提供する。
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)が認めた形態で記される。数値範囲は、範囲を規定する数値も包含する。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に５’から３’配向で記載する。アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向で記載する。ここに提供する表題は、本明細書全体を参酌して得られ得る、本開示の様々な態様の限定ではない。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書全体を参酌して、より完全に定義される。
用語「約」は、おおよそ、大まかに、付近またはその範囲内であることを意味するようにここで使用する。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用されるとき、その範囲を示す数値の上および下に境界を広げることにより修飾する。一般に、用語「約」は、数値を記載した値から、例えば、１０パーセント上または下(高いまたは低い)分散により数値を上または下に修飾し得る。
ここに使用する用語「Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３」または「ＴＩＭ３」は、タンパク質のＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン(ＴＩＭ)ファミリーのメンバーである受容体をいう。ＴＩＭ３の一次リガンドはホスファチジルセリン(ＴＩＭ３－Ｌ)を含む。ＴＩＭ３はＡ型肝炎ウイルス細胞受容体２(ＨＡＶＣＲ２)、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン受容体３、ＴＩＭ－３、ＴＩＭＤ３、ＴＩＭＤ－３、腎臓傷害分子－３、ＫＩＭ－３およびＣＤ３６６とも称される。用語「ＴＩＭ３」は、細胞により天然に発現されるＴＩＭ３のあらゆるバリアントまたはアイソフォームを含む。従って、ここに記載する抗体は、ヒト以外の種からのＴＩＭ３(例えば、カニクイザルＴＩＭ３)と交差反応できる。あるいは、抗体はヒトＴＩＭ３特異的であり、他の種と何ら交差反応を示さない。ＴＩＭ３またはその何れかのバリアントおよびアイソフォームは、それを天然に発現する細胞または組織から単離できまたは当分野で周知の技術および／またはここに記載するものを使用して組み換えにより製造され得る。
ヒトＴＩＭ３の２アイソフォームが同定されている。アイソフォーム１(Accession No. NP_116171；配列番号２８６)は３０１アミノ酸からなり、基準配列を表す。アイソフォーム２(Accession No. AAH20843；配列番号２８７)は１４２アミノ酸からなり、可溶性である。ＴＩＭ３の膜貫通ドメイン、細胞質ドメインおよび細胞外ドメインの一部をコードする、アミノ酸残基１４３～３０１を欠く。アミノ酸残基１３２～１４２も、上記基準配列と異なる。
下記は、２つの知られているヒトＴＩＭ３アイソフォームのアミノ酸配列である。
(Ａ) ヒトＴＩＭ３アイソフォーム１(Accession No. NP_116171；配列番号２８６；Accession No. NM_032782.4を有するヌクレオチド配列によりコード；配列番号２８８；図２５)：
(Ｂ) ヒトＴＩＭ３アイソフォーム２(Accession No. AAH20843；配列番号２８７；Accession No. BC020843.1を有するヌクレオチド配列によりコード；配列番号２８９)：
アイソフォーム１および２のシグナル配列はアミノ酸１～２１に対応する(下線)。故に、成熟アイソフォーム１および２は、それぞれアミノ酸２２～３０１または１４２からなる。成熟ヒトＴＩＭ３の細胞外ドメインは配列番号２８６のアミノ酸２２～２０２からなり、次のアミノ酸配列を有する：
(配列番号２９０)。
カニクイザルＴＩＭ３タンパク質は次のアミノ酸配列からなる(シグナル配列を含む)：
(配列番号３６０)
用語「抗体」は、ある実施態様において、ジスルフィド結合により相互接続された、少なくとも二つの重(Ｈ)鎖および二つの軽(Ｌ)鎖を含むタンパク質をいう。各重鎖は重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域(ここではＣＨと略す)からなる。ある抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体で、重鎖定常領域はヒンジおよび３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。ある抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体で、各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１ドメイン(ここではＣＬと略す)からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称される、より保存された領域が散剤する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３ＣＤＲおよび４ＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。重鎖はＣ末端リシンを有しても有さなくてもよい。本明細書で特に断らない限り、可変領域のアミノ酸はＫａｂａｔナンバリングシステムを使用して番号付けし、定常領域のものはＥＵシステムを使用して番号付けする。
ここで使用する「ＩｇＧ抗体」、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体は、ある実施態様において、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有する、すなわち、同じサブクラスの天然に存在するＩｇＧ抗体と同じ数の重鎖および軽鎖およびジスルフィド結合を有する。例えば、抗ＴＩＭ３ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体は２つの重鎖(ＨＣ)および２つの軽鎖(ＬＣ)からなり、ここで、２つのＨＣおよびＬＣは、それぞれ天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体に存在する同じ数および位置のジスルフィド架橋により結合される(抗体がジスルフィド架橋を夕食するように変異されていない限り)。
抗体は、一般に、１０－5～１０－11Ｍ以下の解離定数(ＫＤ)により反映される高親和性で、その同族抗原に特異的に結合する。約１０－4Ｍを超えるあらゆるＫＤは、一般に非特異的結合を表すと一般に考えられる。ここで使用する抗原に「特異的に結合する」抗体は、１０－7Ｍ以下、１０－8Ｍ以下、５×１０－9Ｍ以下または１０－8Ｍ～１０－10Ｍ以下のＫＤを有することを意味する高親和性で該抗原および実質的に同一の抗原に結合するが、無関係の抗原に高親和性で結合しない抗体をいう。抗原は、ある抗原と高度な配列同一性を示したら、例えば、ある抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％配列同一性を示したら、該ある抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＴＩＭ３に特異的に結合する抗体は、ある実施態様において、ある霊長類種(例えば、カニクイザルＴＩＭ３)からのＴＩＭ３抗原と交差反応性を有し得るが、他の種からのＴＩＭ３抗原またはＴＩＭ３以外の抗原と交差反応し得ない、
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に知られるアイソタイプの何れかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、ある種でサブクラスに分割される：ヒトでＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならｂにマウスでＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、多くて数アミノ酸互いに異なる、数アロタイプで存在する。「抗体」は、例として、天然に存在するおよび天然に存在しない抗体両者；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体および完全合成抗体を含む。
ここに使用する用語抗体の「抗原結合部分」は、抗原(例えば、ヒトＴＩＭ３)に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントにより遂行され得ることが示されている。抗体、例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の「抗原結合部分」なる用語内に包含される結合フラグメントの例は、(ｉ)Ｆａｂフラグメント(パパイン開裂からのフラグメント)またはＶＬ、ＶＨ、ＬＣおよびＣＨ１ドメインからなる類似一価フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ’)２フラグメント(ペプシン開裂からのフラグメント)またはヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂフラグメントを含む類似二価フラグメント；(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)および(vii)合成リンカーにより所望により結合され得る２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。さらに、Ｆｖフラグメント、ＶＬおよびＶＨの２ドメインが別々の遺伝子によりコードされ得るが、合成リンカーにより組み換え方法を使用して結合され得て、それは一価分子を形成するように、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成する単一タンパク質鎖として製造されることを可能とする(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる慣用技術を使用し得て、フラグメントをインタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクト免疫グロブリンの酵素もしくは化学開裂により製造され得る。
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する、人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む、多様な方法により製造され得る。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照
ここに使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団からの抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の製造中に生じ得る可能性のあるバリアント(このようなバリアントは一般に微量存在する)以外、実質的に類似し、同じエピトープに結合する(例えば、抗体は単一結合特異性および親和性を示す)。修飾因子「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるとして応対の特徴を示すものであり、何らかの特定の方法による抗体の製造が必要であると解釈されない。用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および必要に応じて定常領域を有する、実質的に均一な抗体の集団からの抗体をいう。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含む、ハイブリドーマにより産生される
ここに使用する用語「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段により製造、発現、作製または単離される全ヒト抗体、例えば、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)から単離した抗体またはそれから製造したハイブリドーマ、(ｂ)抗体を発現するようにトランスフォームした宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何れかの他の手段により製造、発現、作製または単離した抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変領域および定常領域を含むが、例えば、抗体成熟中に生じるその後の再配列および変異を含む。文献(例えば、Lonberg (200５)Nature Biotech. 23(9): 1117-1125参照)から知られるとおり、可変領域は、ある外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配列される様々な遺伝子によりコードされる、抗原結合ドメインを含む。再配列に加えて、可変領域は、該外来抗原への抗体の親和性を宇高めるために、複数の一変化(体性変異または超変異という)によりさらに修飾され得る。定常領域は、抗原へのさらなる応答を変化させる(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それ故に、抗原に対する応答により軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする、再配列され、体性変異された核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を有しないかもしれないが、その代わり、実質的に同一または類似である(すなわち、少なくとも８０％同一性を有する)。
「ヒト」抗体(ＨuMＡｂ)は、フレームワークおよびＣＤＲ領域両者がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロで無作為または部位特異的変異誘発またはインビボで体性変異により導入された変異)。しかしながら、ここに使用する用語「ヒト抗体」は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てが、ヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体をいう。抗体のヒト化形態のある実施態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てはヒト免疫グロブリンからのアミノ酸で置換されおり、一方１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分または全ては変わらない。抗体が特定の抗原に結合する能力を排除しない限り、アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を保持する。
「キメラ抗体」は、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来であるような、可変領域がある種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体をいう。
ここで使用する「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
「アロタイプ」は、特定のアイソタイプ群内の天然に存在するバリアントをいい、該バリアントは数アミノ酸異なる(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、何れかのアロタイプのものであり得る。「ＩｇＧ１ｆ」、「ＩｇＧ１.１ｆ」または「ＩｇＧ１.３ｆ」アイソタイプと称されるここで使用する抗体は、アロタイプ「ｆ」のそれぞれＩｇＧ１、エフェクターレスＩｇＧ１.１およびエフェクターレスＩｇＧ１.３抗体であり、すなわち、例えば、配列番号３に示すＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスにより２１４Ｒ、３５６Ｅおよび３５８Ｍを有する
用語「抗原を認識する抗体」および「抗原特異的抗体」は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と相互交換可能に使用される。
ここで使用する「単離抗体」は、他のタンパク質および細胞物質を実質的に含まない抗体をいう。
ここで使用する「ＴＩＭ３－ＬのＴＩＭ３への結合を阻害する」抗体は、例えば、ヒトＴＩＭ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞またはＴＩＭ３発現活性化Ｔ細胞を使用する結合アッセイで、ＴＩＭ３のそのリガンド、例えば、ホスファチジルセリンへの結合を阻害する抗体をいうことを意図し、当分野で認識される方法、例えば、ここに記載するＦＡＣＳベースの結合アッセイで、約１μg／mL以下、例えば約０.９μg／mL以下、約０.８５μg／mL以下、約０.８μg／mL以下、約０.７５μg／mL以下、約０.７μg／mL以下、約０.６５μg／mL以下、約０.６μg／mL以下、約０.５５μg／mL以下、約０.５μg／mL以下、約０.４５μg／mL以下、約０.４μg／mL以下、約０.３５μg／mL以下、約０.３μg／mL以下、約０.２５μg／mL以下、約０.２μg／mL以下、約０.１５μg／mL以下、約０.１μg／mL以下または約０.０５μg／mL以下のＥＣ５０を示す抗体である。
Ａ 「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドの相互作用、またはそれに由来する生化学的事象をいう。エフェクター機能」の例は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ介在エフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)および細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と結合することを必要とする。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲはアレルバリアントを含むＦｃγＲファミリーの受容体またはこれら受容体のオルタナティブスプライシング型を含む。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化(マウスでＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトでＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１つの阻害性(ＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。ヒトＦｃγＲの様々な性質は当分野で知られる。生来のエフェクター細胞型の大部分は活性化ＦｃγＲの１以上および阻害性ＦｃγＲIIＢを共発現し、一方ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は１活性化Ｆｃ受容体(マウスでＦｃγＲIIIおよびヒトでＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現し、マウスおよびヒトで阻害性ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプについてマウスＩｇＧ２ａと等価と考えられる。
「Ｆｃ領域」(フラグメント結晶化可能領域)または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンの、免疫系(例えば、エフェクター細胞)の様々な細胞に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、宿主組織または因子への結合に介在する抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。故に、Ｆｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)を除く抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、重鎖の第二(ＣＨ２)および第三(ＣＨ３)定常ドメイン由来の２つの同一タンパク質フラグメントを含む；ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２～４)を含む。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３ならびにＣＨ１とＣＨ２ドメインの間にヒンジを含む。ここに定義するとおり、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は多様であるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＩｇＧ１についてアミノ酸残基Ｄ２２１から、ＩｇＧ２についてＶ２２２から、ＩｇＧ３についてＬ２２１から、そしてＩｇＧ４についてＰ２２４からカルボキシ末端までのストレッチを規定し、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインはアミノ酸２３７からアミノ酸３４０まで伸び、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧのアミノ酸３４１～アミノ酸４４７または４４６(Ｃ末端リシン残基がないならば)または４４５(Ｃ末端グリシンおよびリシン残基がないならば)まで伸びる。ここで使用するＦｃ領域は、あらゆるアロタイプバリアントまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含む、天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた単離されたまたは「Ｆｃ融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも称される「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃ含有タンパク質ポリペプチドの状況における、この領域も含む。
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、天然で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびにその天然に存在するバリアントを含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの様々なアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1: 1参照)。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、例えば、同定のために使用する具体的方法により定義して、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する、抗原(例えば、ＴＩＭ３)上の部位をいう。エピトープは、隣接アミノ酸(通常線状エピトープ)またはタンパク質の三次元折り畳みにより並置される非隣接アミノ酸(通常立体的エピトープ)の両者から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、常にではないが、一般に変性溶媒への暴露により保持されるが、三次元折り畳みにより形成されるエピトープは、一般に変性溶媒での処理により失われる。エピトープは、一般に特有の空間的高次構造で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。どのエピトープがある抗体により結合されるかを決定する方法(すなわち、エピトープマッピング)は当分野で周知であり、例えば、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイを含み、ここで(例えば、ＴＩＭ３からの)重複または隣接ペプチドが、ある抗体(例えば、抗ＴＩＭ３抗体)との反応性について試験される。エピトープの空間的高次構造を決定する方法は当分野で知られる技術およびここに記載するもの、例えば、ｘ線結晶学、抗原変異分析、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ－ＭＳを含む(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。
用語「エピトープマッピング」は、抗体－抗原認識のための分子決定基を同定する過程をいう。
２以上の抗体について「同じエピトープに結合する」なる用語は、これら抗体が、ある方法により決定して、アミノ酸残基の同じセグメントに結合することを意味する。ある抗体が、ここに記載する抗体と「ＴＩＭ３の同じエピトープ」に結合するか否かを決定する技術は、例えば、エピトープの原子解析を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線解析などのエピトープマッピング方法および水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ－ＭＳ)を含む。他の方法は、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異バリエーションへの結合のモニターであり、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基修飾による結合の喪失が、しばしばエピトープ成分の指標であると考えられる。さらに、エピトープマッピングのコンピューターによるコンビナトリアル方法も使用され得る。これらの方法は、目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレーペプチドライブラリーから特異的短ペプチドを親和性単離する能力を利用する。同じＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同じエピトープに結合することが予測される。
「他の抗体と標的への結合について競合する」抗体は、該他の抗体の該標的への結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体をいう。２つの抗体が互いに標的への結合について競合するか、すなわち、一方の抗体が他方の抗体の標的への結合を阻害するかおよびその程度は、既知競合実験、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を使用して決定され得る。ある実施態様において、抗体は、他の抗体の標的への結合と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合し、かつ阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「遮断抗体」(すなわち、最初に標的とインキュベートされる冷抗体)であるかにより異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載のとおり実施され得る。２つの抗体は、抗体が両方向で互いに、すなわち、競合実験においていずれか一方または他方の抗体をまず抗原と接触させたかにかかわらず、少なくとも５０％遮断するならば、「交差競合する」。
２つの抗体が結合について競合するかまたは交差競合するかを決定する競合結合アッセイは、実施例に記載のような、例えば、フローサイトメトリーによる、ＴＩＭ３発現Ｔ細胞への結合についての競合を含む。他の方法は、ＳＰＲ(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標))、固相直接的または間接的放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、固相直接的または間接的酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)参照)；固相直接的ビオチン－アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)参照)；固相直接的標識アッセイ、固相直接的標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)参照)；１－１２５標識を使用する固相直接的標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)参照)；固相直接的ビオチン－アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546 (1990))；および直瀬的標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))を含む。
ここで使用する用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、予定された抗原のエピトープに結合する抗体をいう。一般に、抗体は、(ｉ)例えば、予定された抗原、例えば、組み換えヒトＴＩＭ３を検体としておよび抗体をリガンドとして使用するＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００装置での表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)テクノロジーまたは抗体の抗原陽性細胞への結合のスキャチャード解析により決定して、約１０－7Ｍ未満、例えば約１０－8Ｍ、１０－9Ｍまたは１０－10Ｍ未満またはそれより低い平衡解離定数(ＫＤ)で結合するおよび(ii)予定された抗原に、予定された抗原または密接に関連する抗原以外のその非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)への結合の親和性より少なくとも２倍大きな親和性で結合する。従って、「ＴＩＭ３に特異的に結合する」抗体は、可溶性または細胞結合ヒトＴＩＭ３に１０－7Ｍ以下、例えば約１０－8Ｍ、１０－9Ｍまたは１０－10Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体をいう。「カニクイザルＴＩＭ３と交差反応する」抗体は、カニクイザルＴＩＭ３に１０－7Ｍ以下、例えば約１０－8Ｍ、１０－9Ｍまたは１０－10Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体をいう。ある実施態様において、非ヒト種からのＴＩＭ３と交差反応しないこのような抗体は、標準結合アッセイでこれらのタンパク質に本質的に検出可能な結合を示さない。
ここに使用する用語「ｋassoc」または「ｋａ」は、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度をいうことを意図し、一方ここに使用する用語「ｋdis」または「ｋｄ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度をいうことを意図する。ここに使用する用語「ＫＤ」は解離定数をいうことを意図し、これはｋｄ対ｋａ比(すなわち、ｋｄ／ｋａ)から得られ、モル濃度(Ｍ)として表される。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤの決定に利用可能な方法は、表面プラズモン共鳴、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムまたはフローサイトメトリーおよびスキャチャード解析を含む。
ここで使用するＩｇＧ抗体についての用語「高親和性」は、１０－8Ｍ以下、１０－9Ｍ以下または１０－10Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについて変わり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０－10Ｍ以下または１０－8Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロまたはインビボアッセイの状況における用語「ＥＣ５０」は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの半分の応答を誘発する抗体またはその抗原結合部分の濃度をいう。
物についてのここに使用する用語「天然に存在する」は、その物が天然で見られることをいう。例えば、天然源から単離でき、実験室で人間により意図的に操作されていない生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続的に結合したアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖長の上限はない。タンパク質中の１以上アミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成などの、しかしこれらに限定されない修飾を含み得る。「タンパク質」は１以上のポリペプチドを含み得る。
ここに使用する用語「核酸分子」はＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基の類似側鎖を有するアミノ酸残基への置換をいう。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されているこれらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ－分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体中の予測非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換える。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当分野で周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照)。
核酸について、用語「実質的相同性」は、２核酸またはその指定配列が、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、最適にアラインおよび比較されたとき、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、少なくともヌクレオチドの約９０％～９５％または少なくとも約９８％～９９.５％が同一であることを示す。あるいは、実質的相同性は、セグメントが、相補性鎖と選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするとき存在する。
ポリペプチドについて、用語「実質的相同性」は、２ポリペプチドまたはその指定配列が、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、最適にアラインおよび比較されたとき、アミノ酸の少なくとも約８０％、アミノ酸の少なくとも約９０％～９５％または少なくとも約９８％～９９.５％が同一であることを示す。
２配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適アライメントのために導入する必要があったギャップ数および各ギャップ長を考慮に入れて、配列により共有される同一位置の数の関数(すなわち、％相同性＝同一位置数／位置の総数×１００)である。配列比較および２配列間のパーセント同一性の決定は、下記非限定的例に記載のとおり、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(worldwideweb.gcg.comから入手可能)のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して、決定され得る。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列のパーセント同一性はまたＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用しても決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Blossum 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。
ここに記載する核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列同定のために、公開されたデータベースに対するサーチを行うための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ここに記載する核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、単語長＝１２で実施され得るＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ここに記載するタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、単語長＝３で実施され得る。比較目的でのギャップ付きアラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり利用できる。ＢＬＡＳＴおよびGapped BLASTプログラムを利用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータが使用され得る。worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov.参照。
核酸は細胞全体に、細胞溶解物にまたは部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術によりの細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸(例えば、他の染色体部分)またはタンパク質から精製されて離されたとき、「単離された」または「実質的に純粋とされた」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
核酸、例えば、ｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供するための標準技術により変異され得る。コード配列について、これらの変異は所望によりアミノ酸配列に影響し得る。特に、ここに記載する天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび他のこのような配列に実質的に相同なまたはそれに由来するＤＮＡ配列が考慮される(ここで「由来する」は、配列が他の配列と同一であるまたはそれから修飾されていることを示す)。
ここに使用する用語「ベクター」は、それに結合している他の核酸を輸送できる核酸分子をいうことを意図する。ベクターの一つのタイプは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう「プラスミド」である。ベクターの他のタイプはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内にライゲートされ得る。あるベクターは、導入される宿主細胞で自律複製できる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞ゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムと同時に複製され得る。さらに、あるベクターは、操作可能に結合している遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、「組み換え発現ベクター」(または単に、「発現ベクター」)と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用性のある発現ベクターはしばしばプラスミドの形である。本明細書で、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、相互交換可能に使用され得る。しかしながら、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの発現ベクターの他の形態も包含する。
ここに使用する用語「組み換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)は、該細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞をいうことを意図し、組み換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も含むことは理解されるべきである。後代で変異または環境的影響によりある修飾が起こるかもしれず、実際、このような子孫は親細胞と同一ではないかもしれないが、なおここに使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
「免疫応答」は、当分野でおよび一般に外来因子または異常、例えば、癌細胞に対する脊椎動物内の生物学的応答をいうと理解され、この応答はこれらの因子およびそれが原因の疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１以上の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞または肝臓が産生する可溶性巨大分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用が介在し、これは侵入病原体、病原体で感染した細胞または組織、癌または他の異常細胞、または自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織の哺乳動物身体での選択的標的化、結合、損傷、破壊および／または排除をもたらす。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞の活性化または阻害または免疫系の何らかの他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化または阻害を含む。
「免疫調節剤」または「イムノレギュレーター」は、ある薬剤、例えば、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得るシグナル伝達経路の成分を標的とする薬剤をいう。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」は、免疫系細胞またはこのような細胞(例えば、Ｔｈ１細胞などのエフェクターＴ細胞)の活性を何らかの改変をいう。このような調節は、様々な細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少または免疫系内で生じ得る他の何らかの変化により経済化し得る免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両者の免疫調節剤が同定されており、その一部は腫瘍微小環境で機能が増強されている可能性がある。ある実施態様において、免疫調節剤は、Ｔ細胞表面の分子を標的とする。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、薬剤、部分、化合物または分子による結合の標的とされ、結合により活性が変えられる、分子、例えば、細胞表面分子である。免疫調節性標的は、例えば、細胞表面受容体(「免疫調節性受容体」)および受容体リガンド(「免疫調節性リガンド」)を含む。
「免疫療法」は、免疫系または免疫応答の誘発、増強、抑制または他の修飾を含む方法による、疾患を有するまたはその発症もしくは再発のリスクのある対象の処置をいう。
「免疫刺激性治療」または「免疫刺激治療」は、例えば、癌を処置するための、対象の免疫応答の増加(誘発または増強)をもたらす治療をいう。
「内因性免疫応答増強」は、対象に存在する免疫応答の有効性または効力の増加を意味する。この有効性および効力の増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序の克服または内因性宿主免疫応答を増強する機序の刺激により達成され得る。
「Ｔエフェクター」(「Ｔｅｆｆ」)細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞)ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および指示するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞、例えば、Ｔｈ１細胞をいうが、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)を含まない。あるここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞およびＴｈ１細胞を活性化する。
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、Ｔ細胞共刺激受容体のアゴニスト活性増強および／または阻害性受容体のアンタゴニスト活性増強によりもたらされ得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイでのＥＣ５０または活性の最大レベル、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性(標的細胞で直接またはＣＤ１０７ａまたはグランザイム検出により間接的に決定)および増殖の変化を測定するアッセイの増加倍率により反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
ここで使用する用語「結合」は、２以上の分子の結合をいう。結合は共有結合または非共有結合であり得る。結合はまた遺伝的(すなわち、組み換え融合)であり得る。このような結合は、化学的コンジュゲーションおよび組み換えタンパク質産生などの当分野で認識されている広範な技術を使用して達成され得る。
ここで使用する「投与」は、治療剤を含む組成物の、当業者に知られる様々な方法および送達系の何れかを使用する対象への物理的導入をいう。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の様々な投与経路は、例えば、注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊椎または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語「非経腸投与」は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および点滴ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非経腸ではない経路で投与し得る。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１回以上の長期に実施もし得る。
ここで使用する用語「Ｔ細胞介在応答」は、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含むＴ細胞が介在する応答をいうＴ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞の細胞毒性および増殖を含む。
ここで使用する用語「細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答」は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８＋ Ｔ細胞が介在する。
ここで使用する用語「阻害」または「遮断」(例えば、ＴＩＭ３－Ｌの細胞のＴＩＭ３への結合の阻害／遮断)は相互交換可能に使用し、部分的または完全両者の阻害／遮断を包含する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、さらにここに記載するとおり決定して、ＴＩＭ３－ＬのＴＩＭ３への結合を、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％阻害する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、さらにここに記載するとおり決定して、ＴＩＭ３－ＬのＴＩＭ３への結合を、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％、阻害する。
ここで使用する用語「腫瘍増殖阻害」は、腫瘍増殖の何らかの測定可能な減少、例えば、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％または１００％の腫瘍増殖阻害を含む。
ここで使用する「癌」は、体内の異常細胞の制御されない増殖により特徴づけられる広い一群の疾患をいう。制御されない細胞***は、隣接組織に侵襲し、リンパ系または血流を介して体の遠位部分に転移し得る、悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
ここに使用する用語「処置する」および「処置」は、疾患と関連する症状、合併症、状態または生化学的徴候の進行、進展、重症度または再発の反転、軽減、改善、阻止または減速または予防または全生存期間延長を目的として、対象に行うあらゆるタイプの介入または過程または活性剤の投与をいう。処置は、疾患を有する対象または疾患を有していない対象(例えば、予防目的)に対するものあり得る。
「造血器腫瘍」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。リンパ腫の例はＢ細胞リンパ腫(Ｂ細胞血液癌)およびＴ細胞リンパ腫両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫はホジキンリンパ腫および大部分の非ホジキンリンパ腫両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫の非限定的例は、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ性組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫(慢性リンパ球性白血病と重複)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む。Ｔ細胞リンパ腫の非限定的例は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、退形成性大細胞リンパ腫および血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫を含む。血液系腫瘍はまた、二次性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病などの、しかしこれらに限定されない白血病も含む。血液系腫瘍はさらに、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの、しかしこれらに限定さない骨髄腫を含む。他の血液学的および／またはＢ細胞またはＴ細胞関連癌は、造血器腫瘍なる用語に包含される。
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果の達成または少なくとも部分的達成に十分な量として定義される。薬物または治療剤の「治療有効量」または「治療有効投与量」は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したときの、疾患症状重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患罹患による機能障害または能力障害の予防により証明される疾患退縮を促進する、薬物の量である。薬物の治療有効量または投与量は「予防有効量」または「予防有効投与量」を含み、これは、疾患を発症するまたは疾患を再発するリスクのある対象に単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を阻止する、薬物の量である。治療剤が疾患退縮を促進するまたは疾患発症もしくは再発を阻止する能力は、治療治験中ヒト対象で、ヒトでの有効性を予測する動物モデルでまたはインビトロアッセイで薬剤の活性のアッセイによるなど、熟練した技術者に知られる多様な方法を使用して評価され得る。
例として、抗癌剤は対象の癌退縮を促進する薬物である。ある実施態様において、治療有効量薬物は、癌の除去の点まで癌退縮を促進する。「Ｐ癌退縮促進」は、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて、腫瘍増殖またはサイズの低減、腫瘍壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患罹患による機能障害または能力障害の予防または患者における疾患症状の他の改善をもたらす有効量の薬物の投与を意味する。さらに、処置に関連する用語「有効」および「有効性」は、薬理学的有効性および生理学的安全性両者を含む。薬理学的有効性は、患者の癌退縮を促進する薬物の能力をいう。生理学的安全性は、薬物投与に起因する細胞、臓器および／または生物レベルでの毒性または他の有害生理学的効果(有害効果)のレベルをいう。
腫瘍処置の例として、薬物の治療有効量または投与量は、未処置対象に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％または少なくとも約８０％細胞増殖または腫瘍増殖を阻害する。ある実施態様において、薬物の治療有効量または投与量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、下記アッセイを使用して評価され得る。あるいは、組成物のこの性質は、化合物が細胞増殖を阻害する能力の試験により評価でき、このような阻害は熟練した実施者に知られるアッセイによりインビトロで測定され得る。ここに記載するある実施態様において、腫瘍退縮は少なくとも約２０日、少なくとも約４０日または少なくとも約６０日の期間観察および継続し得る。
用語「患者」は、予防または治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
ここで使用する用語「対象」はあらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、ここに記載する方法および組成物は、癌を有する対象の処置に使用され得る。用語「非ヒト動物」は、全脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、牛、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
ここでいう用語「体重に基づく」投与量または投与は、患者に投与する投与量が、患者の体重に基づき計算されることを意味する。例えば、６０kg体重の患者が３mg／kgの抗ＴＩＭ３抗体を必要とするとき、投与のための適切な量の抗ＴＩＭ３抗体(すなわち、１８０mg)を計算し、使用できる。
本発明の方法に関する用語「固定投与量」の使用は、単一組成物に存在する２以上の異なる抗体(例えば、抗ＴＩＭ３抗体および第二抗体、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１抗体)が、組成物に互いに特定の(固定)比率で存在することを意味する。ある実施態様において、固定投与量は、抗体重量(例えば、mg)に基づく。ある実施態様において、固定投与量は、抗体濃度(例えば、mg／ml)に基づく。ある実施態様において、２抗体(例えば、抗ＴＩＭ３および抗ＰＤ１または抗ＰＤ－Ｌ１)の比は、少なくとも約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１２０、約１：１４０、約１：１６０、約１：１８０、約１：２００、約２００：１、約１８０：１、約１６０：１、約１４０：１、約１２０：１、約１００：１、約９０：１、約８０：１、約７０：１、約６０：１、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１または約２：１mg第一抗体(例えば、抗ＴＩＭ３抗体)対mg第二抗体である。例えば、２：１比の抗ＴＩＭ３抗体およびニボルマブなどのＰＤ－１抗体は、バイアルまたは注射剤が約４８０mgの抗ＴＩＭ３抗体および２４０mgの抗ＰＤ－１抗体または約２mg／mlの抗ＴＩＭ３抗体および１mg／mlの抗ＰＤ－１抗体を含み得ることを意味する。
ここに記載する方法および投与量に関する用語「一定投与量」の使用は、患者の体重または体表面積(ＢＳＡ)と無関係に患者に投与される投与量を意味する。一定投与量は、それ故にmg／kg投与量ではなく、薬剤(例えば、抗ＴＩＭ３抗体)の絶対量として提供される。例えば、６０kgの人および１００kgの人は、同じ投与量の抗体(例えば、４８０mgの抗ＴＩＭ３抗体)を受ける。
ここで使用する用語「ug」および「uM」は、それぞれ「μg」および「μM」と相互交換可能に使用される。
ここに記載する様々な態様を、次のサブセクションでさらに詳述する。
Ｉ. 抗ヒトＴＩＭ３抗体
ここに記載されるのは、特定の機能的特性または性質により特徴づけられる抗体、例えば、完全ヒト抗体である。例えば、抗体は、ヒトＴＩＭ３およびより具体的に、ヒトＴＩＭ３の細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体は、ＴＩＭ３－Ｌが結合するＴＩＭ３の部位に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体はアンタゴニスト抗体であり、すなわち、細胞、例えば、Ｔ細胞のＴ細胞阻害性活性を阻害または抑制する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、カニクイザルＴＩＭ３などの１以上の非ヒト霊長類からのＴＩＭ３と交差反応する。ある実施態様において、抗体はヒトＴＩＭ３の細胞外領域およびカニクイザルＴＩＭ３の細胞外領域に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体は高親和性でヒトＴＩＭ３に結合する。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、次の機能的性質の１以上を示す。
(ａ)可溶性および／または膜結合ヒトＴＩＭ３に結合する；
(ｂ)可溶性および／または膜結合カニクイザルＴＩＭ３に結合する；
(ｃ)免疫応答を誘発または刺激する；
(ｄ)Ｔ細胞活性化、例えば、Ｔｈ１細胞活性化を誘発または刺激する(例えば、サイトカイン分泌および／または増殖増強により証明)；
(ｅ)例えば、実施例に記載のような共培養アッセイでＴ細胞増殖(例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)を誘発または刺激する；
(ｆ)例えば、実施例に記載するアッセイで決定して、Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ－γ産生または腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)、例えばヒト腎臓、肺、膵臓または乳癌腫瘍からのＴＩＬを誘発または刺激する；
(ｇ)例えば、実施例に記載するアッセイで決定して、ヒトＴＩＭ３のＰｔｄＳｅｒへの結合を遮断または阻害する；
(ｈ)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(ｉ)ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(ｉ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ii)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(iii)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；または(iv)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)に結合する；
(ｊ)例えば、実施例に記載するアッセイで決定して、ヒトＴＩＭ３への結合のここに記載するＴＩＭ３への抗体結合(例えば、１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２のＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５への何れか)と競合または交差遮断する；
(ｋ)ヒトＴＩＭ３に結合するが、次のアミノ酸残基の１以上のアミノ酸置換を有するヒトＴＩＭ３にしない：Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６(図２５)による番号付け)；および
(ｌ)ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(ｍ)Ｘ線結晶学により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；および／または
(ｎ)例えば、実施例に記載する、１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３への結合と競合するまたは交差遮断する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３に高親和性で、例えば、１０－7Ｍ以下、１０－8Ｍ以下、１０－9Ｍ以下、１０－10Ｍ以下、１０－11Ｍ以下、１０－12Ｍ以下、１０－12Ｍ～１０－7Ｍ、１０－11Ｍ～１０－7Ｍ、１０－10Ｍ～１０－7Ｍまたは１０－9Ｍ～１０－7ＭのＫＤで結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥTM(例えば、実施例に記載)で決定して、１０－7Ｍ以下、１０－8Ｍ以下、１０－9Ｍ(１nM)以下、１０－10Ｍ以下、１０－12Ｍ～１０－7Ｍ、１０－11Ｍ～１０－7Ｍ、１０－10Ｍ～１０－7Ｍ、１０－9Ｍ～１０－7Ｍまたは１０－8Ｍ～１０－7ＭのＫＤで結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、活性化ヒトＴ細胞などの結合(例えば、細胞膜結合)ヒトＴＩＭ３に、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットで決定して、１０－7Ｍ以下、１０－8Ｍ以下、１０－9Ｍ(１nM)以下、５×１０－10Ｍ以下、１０－10Ｍ以下、１０－12Ｍ～１０－7Ｍ、１０－11Ｍ～１０－8Ｍ、１０－10Ｍ～１０－8Ｍ、１０－9Ｍ～１０－8Ｍ、１０－11Ｍ～１０－9Ｍまたは１０－10Ｍ～１０－9ＭのＫＤで結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、活性化ヒトＴ細胞などの結合(例えば、細胞膜結合)ヒトＴＩＭ３に、例えば、フローサイトメトリーで決定して、１０μg／mL以下、５μg／mL以下、１μg／mL以下、０.９μg／mL以下、０.８μg／mL以下、０.７μg／mL以下、０.６μg／mL以下、０.５μg／mL以下、０.４μg／mL以下、０.３μg／mL以下、０.２μg／mL以下、０.１μg／mL以下、０.０５μg／mL以下または０.０１μg／mL以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１０－7Ｍ以下、１０－8Ｍ以下、１０－9Ｍ以下、１０－10Ｍ以下、１０－11Ｍ以下、１０－12Ｍ以下、１０－12Ｍ～１０－7Ｍ、１０－11Ｍ～１０－7Ｍ、１０－10Ｍ～１０－7Ｍまたは１０－9Ｍ～１０－7ＭのＫＤで結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥTM(例えば、実施例に記載)で決定して、１０－7Ｍ以下、１０－8Ｍ以下、１０－9Ｍ(１nM)以下、１０－10Ｍ以下、１０－12Ｍ～１０－7Ｍ、１０－11Ｍ～１０－7Ｍ、１０－10Ｍ～１０－7Ｍ、１０－9Ｍ～１０－7Ｍまたは１０－8Ｍ～１０－7ＭのＫＤで結合する。抗ＴＩＭ３抗体は、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下、１０nM以下、１００nM～０.０１nM、１００nM～０.１nM、１００nM～１nMまたは１０nM～１nM、例えば、フローサイトメトリーで測定して(例えば、実施例に記載)のＥＣ５０で結合できる。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、活性化ヒトＴ細胞上などの結合(例えば、細胞膜結合)カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットで決定して、１０－7Ｍ以下、１０－8Ｍ以下、１０－9Ｍ(１nM)以下、５×１０－10Ｍ以下、１０－10Ｍ以下、１０－12Ｍ～１０－7Ｍ、１０－11Ｍ～１０－8Ｍ、１０－10Ｍ～１０－8Ｍ、１０－9Ｍ～１０－8Ｍ、１０－11Ｍ～１０－9Ｍまたは１０－10Ｍ～１０－9ＭのＫＤで結合する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、腫瘍の、例えば、Ｔ細胞の活性化により、免疫応答を刺激または増強する。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３介在Ｔ細胞阻害性活性阻害に起因し得る、例えば、サイトカイン(例えば、ＩＦＮ－γ)分泌増強および／または増殖増強により証明されるとおり、細胞を活性化または共刺激し得る。ある実施態様において、ＴＩＭ３抗体によるＴ細胞活性化または共刺激は、ＣＤ３刺激存在下で生じる。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞および／またはヒトＴＩＭ３を発現するＴ細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)で測定して、ＩＦＮ－γ分泌を５０％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、４倍、５倍またはそれ以上の倍率で、所望により最大１０倍、３０倍、１００倍まで増加させる。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ホスファチジルセリンの細胞、例えば、ＣＨＯ細胞または活性化ヒトＴＩＭ３を発現するＴ細胞のヒトＴＩＭ３への結合を、例えば、１０μg／ml以下、１μg／ml以下、０.０１μg／ml～１０μg／ml、０.１μg／ml～１０μg／mlまたは０.１μg／ml～１μg／mlのＥＣ５０で阻害する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３の細胞外部分例えば、細胞外領域のＩｇ様ドメインのエピトープ、例えば、立体的エピトープ、すなわち、配列番号２８６(図２５)のアミノ酸２２～２０２に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２８６)のアミノ酸２２～１２０または成熟ヒトＴＩＭ３(配列番号２９０)の１～９９に位置するエピトープに結合する(実施例参照)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３の配列番号２８６に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８～６４からなる領域にまたはその中のエピトープに結合する(CPVFECG、配列番号２９６；図２５参照)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３の配列番号２８６に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１～１２０からなる領域にまたはその中のエピトープに結合する(RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２５参照)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８～６４からなる領域(CPVFECG、配列番号２９６)およびまたはその中のエピトープまたは配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１～１２０からなる領域(RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２５参照)またはその中のエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３の配列番号２８６に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸７８～８９からなる領域にまたはその中のエピトープに結合する(WTSRYWLNGDFR、配列番号２９７；図２５参照)。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３と実質的に同じエピトープ、すなわち、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する(図２５)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、３Ｇ４と実質的に同じエピトープ、すなわち、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する(図２５)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１７Ｃ３と実質的に同じエピトープ、すなわち、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する(図２５)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９と実質的に同じエピトープ、すなわち、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する(図２５)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９と実質的に同じエピトープ、すなわち、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する(図２５)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない(図２５)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない(図２５)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない(図２５)。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体ｃは、ヒトＴＩＭ３のここに記載するＣＤＲまたは可変領域を有する抗ＴＩＭ３抗体、例えば、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３およびＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかへの結合と競合する(または結合を阻害する)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのヒトＴＩＭ３への結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある実施態様において、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３への結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのヒトＴＩＭ３への結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害するおよび１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３への結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する(例えば、両方向で競合する)。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、次の特性の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または全てを有する。
(１)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、実施例に記載Biacoreで測定して、可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下(例えば、０.０１nM～１００nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～１μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(５)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、２０μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～２０μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(６)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(７)例えば、実施例に記載のとおり、(ｉ)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)のＩＦＮ－γ産生を増加させるおよび／または(ii)Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)増殖増強により証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または減少により)を誘導または増強する；
(８)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を刺激する；
(９)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、ＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３への結合を阻害する；
(１０)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(１１)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域(ａ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ｂ)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(ｃ)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；および(ｄ)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)の一つに結合する；
(１２)野生型ヒトＴＩＭ３、例えば、実施例に記載の結合と比較して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図２５))の１以上が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３に対して結合が減少している；
(１３)１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３、ＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８およびＴＩＭ３.２５、例えば、実施例に記載の何れかのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する；
(１４)例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(１５)Ｘ線結晶学(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図２５))により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；および／または
(１６)(ａ)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図２５))の１、２、３、４、５、６、７、８または９が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３への結合が減少している；(ｂ)実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する；および／または(ｃ)例えば、実施例に記載のとおり１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３への結合と競合するまたは交差遮断する；
(１７)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ、２×１０－8Ｍ、１０－8Ｍまたは５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１８)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１９)実施例２２に記載の方法で測定して、カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；および／または
(２０)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－8Ｍ、５×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する。
従って、当分野で知られるおよびここに記載する方法で決定して、これら機能的性質(例えば、生化学的、免疫化学的、細胞性、生理学的または他の生物学的活性など)の１以上を示す抗体は、抗体非存在下(例えばまたは無関係種の対照抗体が存在するとき)で見られるのに比して、特定の活性で統計学的有意差を示すと理解される。ある実施態様において、あるアッセイにおける測定パラメータ(例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)の抗ＴＩＭ３抗体誘発増加は、測定パラメータの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、５倍または１０倍の統計学的有意な増加をもたらし、ある実施態様において、ここに記載する抗体は、抗体非存在下に実施した同じアッセイに比して、測定パラメータを、例えば、９２％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、５倍または１０倍を超えて増加させ得る。逆に、あるアッセイにおける測定パラメータ(例えば、腫瘍体積、ヒトＴＩＭ３へのＴＩＭ３－Ｌ結合)の抗ＴＩＭ３抗体誘発減少は、測定パラメータの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の統計学的有意な減少をもたらし、ある実施態様において、ここに記載する抗体は、抗体非存在下に実施した同じアッセイに比して、測定パラメータを、例えば、９２％、９４％、９５％、９７％、９８％または９９％を超えて減少させ得る。
多くの種のＴＩＭ３に対する抗体の結合能を評価する標準アッセイは当分野で知られ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適当なアッセイは、実施例に詳述される。抗体の結合速度論(例えば、結合親和性)も、Biacore分析などの当分野で知られる標準アッセイにより評価され得る。抗体のＴＩＭ３の機能的性質(例えば、リガンド結合、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)に対する効果を評価するアッセイは、以下に、そして実施例にさらに詳述する
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は天然抗体ではないまたは天然に存在する抗体ではない。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、多い、少ないまたは異なるタイプの翻訳後修飾を有することにより、天然に存在する抗体のものと異なる翻訳後修飾を有する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＣＤ３２：Ｔ細胞共培養実験の抗ＴＩＭ３抗体の交差架橋において、このような抗体が抗ＴＩＭ３単独を超えて活性を増強しないことにより決定されるとおり、アゴニスト活性を有しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、アゴニスト活性を促進することなく、ＴＩＭ３とそのリガンドの相互作用を遮断する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＬＰＳ処理単球または樹状細胞からのＩＬ－１２産生を増強する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、組み合わせ処理によりＰＤ－１およびＴＩＭ３を共発現する腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞を回復させ、そうしてＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇を回避する。
II. 抗ＴＩＭ３抗体の例
特定のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、単離され、ここに記載するとおり構造的に特徴づけされた抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのＣＤＲおよび／または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル、組み換えおよび／またはヒト抗体ならびにその可変領域またはＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一性(例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一性)を有する抗体である。全体を引用により本明細書に包含させるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４１９４６参照。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４～４０、４１０および４１１に示す。１３Ａ３、８Ｂ９、９Ｆ６および２３Ｂ３の突然変異型のＶＨアミノ酸配列は配列番号１１２～１２１、３６４および４１２に示す。ＶＨのＶＴＩＭ３.２０およびＴＩＭ３.２１アミノ酸配列は、配列番号４４９に示す。ＶＨのＶＴＩＭ３.２２およびＴＩＭ３.２３アミノ酸配列は、配列番号４５６に示す。ＶＬのＶ１３Ａ３、１７Ｃ３および３Ｇ４アミノ酸配列は、配列番号６０に示す。ＶＬのＶ８Ｂ９、８Ｃ４および１７Ｃ８アミノ酸配列は、配列番号６１に示す。９Ｆ６のＶＬアミノ酸配列は、配列番号６１、６２および６３に示す。ＶＬのＶ１４Ｈ７アミノ酸配列は、配列番号４１７に示す。ＶＬのＶ２３Ｂ３アミノ酸配列は、配列番号６０および４１８に示す。１３Ａ３、８Ｂ９、９Ｆ６および２３Ｂ３の突然変異型のＶＬアミノ酸配列は、対応する非変異抗体のものに対応する。ＶＬのＶＴＩＭ３.２０およびＴＩＭ３.２２アミノ酸配列は、配列番号４５０に示す。ＶＬのＶＴＩＭ３.２１およびＴＩＭ３.２３アミノ酸配列は、配列番号６３に示す。配列番号の帰属の概要を図１６に提供する。
従って、ここに提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、重鎖可変領域は、配列番号３４～４０、１１２～１２１、３６４、４１０～４１２、４４９および４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
また提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号６０～６３、４１７、４１８および４５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ここに提供されるのは、
(ａ)それぞれ配列番号３４および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｂ)それぞれ配列番号３５および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｃ)それぞれ配列番号３６および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｄ)それぞれ配列番号３７および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｅ)それぞれ配列番号３８および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｆ)それぞれ配列番号３８および６２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｇ)それぞれ配列番号３８および６３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｈ)それぞれ配列番号３９および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｉ)それぞれ配列番号４０および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｊ)それぞれ配列番号１２１および６３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｋ)それぞれ配列番号１２０および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｌ)それぞれ配列番号１１２および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｍ)それぞれ配列番号１１３および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｎ)それぞれ配列番号１１４および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｏ)それぞれ配列番号１１５および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｐ)それぞれ配列番号１１６および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｑ)それぞれ配列番号１１７および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｒ)それぞれ配列番号１１８および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｓ)それぞれ配列番号１１９および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｔ)それぞれ配列番号３６４および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｕ)それぞれ配列番号４１０および４１７を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｖ)それぞれ配列番号４１１および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｗ)それぞれ配列番号４１１および４１８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｘ)それぞれ配列番号４１２および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｙ)それぞれ配列番号４４９および４５０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｚ)それぞれ配列番号４４９および６３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ａａ)それぞれ配列番号４５６および４５０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；または
(ｂｂ)それぞれ配列番号４５６および６３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離抗ヒトＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分である。
抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４またはＴＩＭ３.２５の何れかまたはこれらの組み合わせの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４および１７Ｃ３のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１～４４に示す。９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号４５に示す。変異１３Ａ３抗体(すなわち、ＴＩＭ３.１０－ＴＩＭ３.１８)のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、非変異１３Ａ３抗体、すなわち、配列番号４１と同じである。変異８Ｂ９抗体(すなわち、ＴＩＭ３.８)のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、非変異８Ｂ９抗体、すなわち、配列番号４２と同じである。変異９Ｆ６抗体(すなわち、ＴＩＭ３.７)のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、非変異９Ｆ６抗体、すなわち、配列番号４５と同じである。変異２３Ｂ３抗体(すなわち、ＴＩＭ３.２５)のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、非変異２３Ｂ３抗体、すなわち、配列番号４５と同じである。
１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６～５２、４１３および４１５に示す。変異１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１２２に示す。変異１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１１およびＴＩＭ３.１２のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２３および１２４に示す。変異１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１３およびＴＩＭ３.１６のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、非変異１３Ａ３抗体、すなわち、配列番号４６のものである。変異８Ｂ９抗体(すなわち、ＴＩＭ３.８)のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１２５に示す。変異９Ｆ６抗体(すなわち、ＴＩＭ３.７)のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、非変異９Ｆ６抗体、すなわち、配列番号５０と同じである。変異２３Ｂ３抗体(すなわち、ＴＩＭ３.２５)のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、非変異２３Ｂ３抗体、すなわち、配列番号４１５と同じである。
１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３～５９、４１４および４１６に示す。変異１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１０～ＴＩＭ３.１２のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、非変異１３Ａ３抗体、すなわち、配列番号５３のものである。変異１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１３およびＴＩＭ３.１８のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２６に示す。変異１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１５およびＴＩＭ３.１７のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２８に示す。変異１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１４およびＴＩＭ３.１６のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２７および１２９に示す。変異８Ｂ９抗体(すなわち、ＴＩＭ３.８)のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、非変異８Ｂ９抗体、すなわち、配列番号５４のものである。変異９Ｆ６抗体(すなわち、ＴＩＭ３.７)のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、非変異９Ｆ６抗体、すなわち、配列番号５７と同じである。変異２３Ｂ３抗体(すなわち、ＴＩＭ３.２５)のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、非変異２３Ｂ３抗体、すなわち、配列番号４１６と同じである。
１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６４に示す。９Ｆ６のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６４および６５に示す。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６６に示す。９Ｆ６のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６６および６７に示す。１３Ａ３、１７Ｃ３および３Ｇ４のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６８に示す。８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ８および１４Ｈ７のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６９に示す。９Ｆ６のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６９、７０および７１に示す。２３Ｂ３のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６８および４１９に示す。変異抗体１３Ａ３、８Ｂ９、９Ｆ６および２３Ｂ３のＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列は、対応する非変異抗体のものである。図１６は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体のＣＤＲの配列番号の一覧を提供する。
ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して線引きされる((Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。Ｋａｂａｔは、配列決定された最初のヒトＩｇＧ１(ＥＵ抗体; Edelman et al. 1969)の配列ナンバリングに基づく、ＥＵインデックスまたはＥＵナンバリングシステムと称されるスキームの最も一般的ナンバリングシステムである。ここに開示するＫａｂａｔナンバリングスキームに基づき、抗体ナンバリングは、当分野で知られる他のシステム、例えば、Chotia、ＩＭＧＴ、Martin(拡張Chotia)またはＡＨｏナンバリングスキームに変換され得る。
これら抗体の各々がヒトＴＩＭ３に結合し、抗原結合特異性が主としてＣＤＲ１、２および３領域により提供されることを考えると、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列、例えば、図１６のものを「混合および適合」し(すなわち、異なる抗体からのＣＤＲを混合および適合できるが、各抗体はＶＨ ＣＤＲ１、２および３およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含まなければならない)、他のここに記載する抗ＴＩＭ３結合分子を作製することができる。このような「混合および適合」抗体のＴＩＭ３結合を、上におよび実施例に記載の結合アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ)を使用して、試験し得る。ある実施態様において、ＶＨ ＣＤＲ配列が混合および適合されるとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換えられる。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列が混合および適合されるとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換えられる。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７、２３Ｂ３およびＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかについてここに開示するＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列と置き換えることにより作製することができることは、当業者には容易に明らかである。
ここに提供されるのは、
(ａ)配列番号４１～４５および４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号４６～５２、１２２～１２５、４１３、４１５および４７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号５３～５９、１２６～１２９、４１４、４１６および４７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号６４～６５および４７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号６６～６７および４７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号６８～７１、４１９および４７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含む単離抗ヒトＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合する。
ある実施態様において、抗ヒトＴＩＭ３抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は
(ａ)配列番号４１、４６、５３；
(ｂ)配列番号４２、４７、５４；
(ｃ)配列番号４３、４８、５５；
(ｄ)配列番号４４、４９、５６；
(ｅ)配列番号４５、５０、５７；
(ｆ)配列番号４５、５１、５８；
(ｇ)配列番号４５、５２、５９；
(ｈ)配列番号４１、１２２、５３；
(ｉ)配列番号４１、１２３、５３；
(ｊ)配列番号４１、１２４、５３；
(ｋ)配列番号４１、４６、１２６；
(ｌ)配列番号４１、４６、１２７；
(ｍ)配列番号４１、４６、１２８；
(ｎ)配列番号４１、４６、１２９；
(ｏ)配列番号４１、１２２、１２８；
(ｐ)配列番号４１、１２２、１２６；
(ｑ)配列番号４５、４１３、４１４；
(ｒ)配列番号４５、４１５、４１６；または
(ｓ)配列番号４６９、４７０および４７１、
を含み、ここで、該抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合する。
ある実施態様において、抗ヒトＴＩＭ３抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は
(ａ)配列番号６４、６６、６８；
(ｂ)配列番号６４、６６、６９；
(ｃ)配列番号６５、６７、７０；
(ｄ)配列番号６４、６６、７１；
(ｅ)配列番号６４、６６、４１９；または
(ｆ)配列番号４７２、４７３、４７４、
を含み、ここで、該抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
(ａ１)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２２、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ３)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２３、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ４)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２４、５３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ５)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２６を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ６)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２７を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ７)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ８)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、４６、１２９を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ９)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２２、１２８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ａ１０)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４１、１２２、１２６を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ｂ１)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４２、４７、５４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｂ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４２、１２５、５４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｃ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４３、４８、５５を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｄ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４４、４９、５６を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ｅ１)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｅ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、７１を含む；
(ｅ３)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６５、６７、７０を含む；
(ｆ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、５１、５８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ｇ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、５２、５９を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｈ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、４１３、４１４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む；
(ｉ１)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、４１５、４１６を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む；
(ｉ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４５、４１５、４１６を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６、４１９を含む；
(ｊ１)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４６９、４７０および４７１を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４７２、４７３および４７４を含む；または
(ｊ２)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４６９、４７０および４７１を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６４、６６および７１を含み、
ここで、該抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合する。
ここに記載するＶＨドメインまたはそのＣＤＲの１以上は、重鎖、例えば、完全長重鎖を形成するために定常ドメインと結合され得る。同様に、ここに記載するＶＬドメインまたはそのＣＤＲの１以上は、軽鎖、例えば、完全長軽鎖を形成するために定常ドメインと結合され得る。完全長重鎖(なくてもよいＣ末端リシン(Ｋ)以外またはＣ末端グリシンおよびリシン(ＧＫ)以外)および完全長軽鎖を組み合わせて、完全長抗体を形成する。
ここに記載するＶＨドメインを、例えば、ここにさらに記載するとおり、天然に存在するまたは修飾されたヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインと融合させ得る。例えば、ＶＨドメインは、次の野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインアミノ酸配列
(配列番号２９１)
または配列番号２９１のアロタイプバリアントであり、次のアミノ酸配列：
(配列番号２７７；「ＩｇＧ１ｆ」アロタイプ特異的アミノ酸残基は太字かつ下線)
を有するものなどのヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、定常領域に融合したここに記載するＶＨドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
抗ＴＩＭ３抗体のＶＨドメインは、エフェクターレス定常領域、例えば、次のエフェクターレスヒトＩｇＧ１定常ドメインアミノ酸配列：
(配列番号２９４；下線を引いた置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む「ＩｇＧ１.１ｆ」)
または
(配列番号２９５；下線を引いた置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む「ＩｇＧ１.３ｆ」)
の融合した、ここに記載するＶＨドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
例えば、ＩｇＧ１のアロタイプバリアントはＫ９７Ｒ、Ｄ２３９Ｅおよび／またはＬ２４１Ｍ(上記下線および太字)を含み、配列番号２７７、２９４および２９５によるナンバリングである。完全長重領域、例えば、８Ｃ４(配列番号３)内およびＥＵナンバリングにより、これらアミノ酸置換はＫ２１４Ｒ、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍと番号付けされる。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体の定常領域は、配列番号２７７、２９４および２９５による番号付けでアミノ酸Ｌ１１７、Ａ１１８、Ｇ１２０、Ａ２１３およびＰ２１４(上記下線)またはＥＵナンバリングによりＬ２３４、Ａ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０およびＰ３３１に１以上の変異または置換をさらに含み得る。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体の定常領域は、配列番号２９１のアミノ酸Ｌ１１７Ａ、Ａ１１８Ｅ、Ｇ１２０Ａ、Ａ２１３ＳおよびＰ２１４ＳまたはＥＵナンバリングによりＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓに１以上の変異または置換を含む。抗ＴＩＭ３抗体の定常領域はまた、配列番号２９１のＬ１１７Ａ、Ａ１１８ＥおよびＧ１２０ＡまたはＥＵナンバリングによりＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａにも１以上の変異または置換を含み得る。
あるいは、抗ＴＩＭ３抗体のＶＨドメインは、ヒトＩｇＧ４定常領域、例えば、次のヒトＩｇＧ４アミノ酸配列またはそのバリアント：
(配列番号２９２、Ｓ２２８Ｐを含む)
に融合したここに記載するＶＨドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
ここに記載するＶＬドメインは、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖の定常ドメインと融合し得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体のＶＬドメインは、次のヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖アミノ酸配列：
(配列番号２７８)
に融合したここに記載するＶＬドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る。
ある実施態様において、重鎖定常領域はＣ末端にリシンまたは他のアミノ酸を含み、例えば、重鎖に次の最後のアミノ酸ＬＳＰＧＫ(配列番号２７９)を含む。ある実施態様において、重鎖定常領域は、Ｃ末端に１以上のアミノ酸を欠き、例えば、Ｃ末端配列ＬＳＰＧ(配列番号２８０)またはＬＳＰ(配列番号２８１)を有する。
重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の例は、重鎖について配列番号１～２８、７２～１１１、３０１～３５４および軽鎖について配列番号２９～３０および３２～３３に対応する。
ここに提供されるのは、
(ａ１)それぞれ配列番号３０１(または３０２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２)それぞれ配列番号１(または８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ３)それぞれ配列番号１５(または２２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ４)それぞれ配列番号３０３(または３０４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ５)それぞれ配列番号７２(または８２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ６)それぞれ配列番号９２(または１０２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ７)それぞれ配列番号３０５(または３０６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ８)それぞれ配列番号７３(または８３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ９)それぞれ配列番号９３(または１０３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１０)それぞれ配列番号３０７(または３０８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１１)それぞれ配列番号７４(または８４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１２)それぞれ配列番号９４(または１０４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１３)それぞれ配列番号３０９(または３１０)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１４)それぞれ配列番号７５(または８５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１５)それぞれ配列番号９５(または１０５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１６)それぞれ配列番号３１１(または３１２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１７)それぞれ配列番号７６(または８６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１８)それぞれ配列番号９６(または１０６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ１９)それぞれ配列番号３１３(または３１４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２０)それぞれ配列番号７７(または８７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２１)それぞれ配列番号９７(または１０７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２２)それぞれ配列番号３１５(または３１６)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２３)それぞれ配列番号７８(または８８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２４)それぞれ配列番号９８(または１０８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２５)それぞれ配列番号３１７(または３１８)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２６)それぞれ配列番号７９(または８９)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２７)それぞれ配列番号９９(または１０９)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２８)それぞれ配列番号３１９(または３２０)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ２９)それぞれ配列番号３４９(または３５０)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ３０)それぞれ配列番号３５１(または３５２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ａ３１)それぞれ配列番号３５３(または３５４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ１)それぞれ配列番号３２１(または３２２)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ２)それぞれ配列番号２(または９)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ３)それぞれ配列番号１６(または２３)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ４)それぞれ配列番号３２３(または３２４)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ５)それぞれ配列番号８０(または９０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ６)それぞれ配列番号１００(または１１０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｂ７)それぞれ配列番号３２５(または３２６)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ１)それぞれ配列番号３２７(または３２８)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ２)それぞれ配列番号３(または１０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ３)それぞれ配列番号１７(または２４)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｃ４)それぞれ配列番号３２９(または３３０)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ１)それぞれ配列番号３３１(または３３２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ２)それぞれ配列番号４(または１１)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ３)それぞれ配列番号１８(または２５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｄ４)それぞれ配列番号３３３(または３３４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ１.１)それぞれ配列番号３３５(または３３６)および３２を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ１.２)それぞれ配列番号３３５(または３３６)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ１.３)それぞれ配列番号３３５(または３３６)および３１を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ２)それぞれ配列番号５(または１２)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ３)それぞれ配列番号１９(または２６)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ４)それぞれ配列番号３３７(または３３８)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ５)それぞれ配列番号８１(または９１)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ６)それぞれ配列番号１０１(または１１１)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｅ７)それぞれ配列番号３３９(または３４０)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ１)それぞれ配列番号３４１(または３４２)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ２)それぞれ配列番号６(または１３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ３)それぞれ配列番号２０(または２７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｆ４)それぞれ配列番号３４３(または３４４)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｇ１)それぞれ配列番号３４５(または３４６)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｇ２)それぞれ配列番号７(または１４)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｇ３)それぞれ配列番号２１(または２８)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｇ４)それぞれ配列番号３４７(または３４８)および３０を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｈ１)それぞれ配列番号３８６(または３８７)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｈ２)それぞれ配列番号３８８(または３８９)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｈ３)それぞれ配列番号３９０(または３９１)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｈ４)それぞれ配列番号３９２(または３９３)および４０８を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ１.１)それぞれ配列番号３９４(または３９５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ１.２)それぞれ配列番号３９４(または３９５)および４０９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ２)それぞれ配列番号３９６(または３９７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ３)それぞれ配列番号３９８(または３９９)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ４)それぞれ配列番号４００(または４０１)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ５)それぞれ配列番号４０２(または４０３)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ６)それぞれ配列番号４０４(または４０５)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｉ７)それぞれ配列番号４０６(または４０７)および２９を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｊ１)それぞれ配列番号４５１(または４６１)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｊ２)それぞれ配列番号４５２(または４６２)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｋ１)それぞれ配列番号４５４(または４６３)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｋ２)それぞれ配列番号４５５(または４６４)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｌ１)それぞれ配列番号４５７(または４６５)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｌ２)それぞれ配列番号４５８(または４６６)および４５３を含む重鎖および軽鎖配列；
(ｍ１)それぞれ配列番号４５９(または４６７)および３３を含む重鎖および軽鎖配列；または
(ｍ２)それぞれ配列番号４６０(または４６８)および３３を含む重鎖および軽鎖配列
を含む、単離抗ヒトＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ここに、例えば、上の段落に示す重鎖および軽鎖配列の組み合わせを含み、ここで、抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、２つの重鎖を一緒に結合する少なくとも１つのジスルフィド結合をさらに含み得る。抗体は、軽鎖の各々を重鎖の各々に結合するジスルフィド結合も含み得る。
ここに示す重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)、例えば、配列番号１～３３、７２～１１１、３０１～３５４、３８６～４０９、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５７、４５８、４５９、４６０および４６１～４６８の何れかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を、所望の特徴、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗ヒトＴＩＭ３抗体の形成に使用し得る。バリアントの例は、例えば、定常ドメインにアロタイプ変種および／または可変または定常領域に変異、例えば、ここに開示する変異を含むものであり。ここに示す重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)の何れかから、最大で１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２または１アミノ酸(置換、付加または欠失による)異なるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を、所望の特徴、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗ヒトＴＩＭ３抗体の形成に使用し得る。
ある実施態様において、上記抗体は、次の機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上または全てを示す
(１)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下(例えば、０.０１nM～１００nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～１μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(５)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、２０μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～２０μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(６)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(７)例えば、実施例に記載のとおり、(ｉ)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)のＩＦＮ－γ産生を増加させるおよび／または(ii)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する；
(８)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を刺激する；
(９)例えば、実施例に記載のとおり、ＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３への結合を阻害する；
(１０)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(１１)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域(ａ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ｂ)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(ｃ)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；および(ｄ)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)の一つに結合する；
(１２)実施例に記載したように、野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図２５))の１以上が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３に対する結合が減少している；
(１３) 実施例に記載の１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３、ＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８およびＴＩＭ３.２５の何れかのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する；
(１４)例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(１５)Ｘ線結晶学(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図２５))により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；
(１６)(ａ)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図２５))の１、２、３、４、５、６、７、８または９が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３への結合が減少している；(ｂ)実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する；および／または(ｃ)例えば、実施例に記載のとおり、１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３への結合と競合するまたは交差遮断する；
(１７)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ、２×１０－8Ｍ、１０－8Ｍまたは５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１８)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１９)実施例２２に記載の方法で測定して、カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；および／または
(２０)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－8Ｍ、５×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する。
このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は立体的エピトープに結合する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)のアミノ酸残基１～９９または配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸２２～１２０に対応する、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域
(配列番号２９９)のアミノ酸残基に結合する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)のアミノ酸残基３７～４３に対応する成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域CPVFECG(配列番号２９６)のアミノ酸残基に結合する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)のアミノ酸残基５７～８３に対応する成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)のアミノ酸残基に結合する。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)のアミノ酸残基９０～９９に対応する成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域RIQIPGIMND(配列番号２９８)のアミノ酸残基に結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、野生型および変異ヒトＴＩＭ３への結合について抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３およびＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の１以上と同じパターンを有する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域CPVFECG(配列番号２９６)、WTSRYWLNGDFRKGDVSLＴＩＥＮＶＴＬＡＤ(配列番号２９７)および／またはRIQIPGIMND(配列番号２９８)内のアミノ酸残基に結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、(１)49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)または(２)40YTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６９)、66VVLRTDERDVNY77(配列番号３７０)、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95(配列番号３７１)、110ＣRIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３７２)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ｈＴＩＭ３のアミノ酸残基４０～６２および１１１～１２７の領域と相互作用するが、他の領域、例えば、アミノ酸残基Ｙ４０に対してＮ末端の領域、アミノ酸残基Ｅ６２～Ｒ１１１に位置する領域およびアミノ酸残基Ｌ１２７に対してＣ末端の領域と顕著に相互作用しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図２５))の１以上が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３に対して結合が減少しており、抗体は(１)49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)または(２)40YTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６９)、66VVLRTDERDVNY77(配列番号３７０)、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95(配列番号３７１)、110ＣRIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３７２)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、野生型および変異ヒトＴＩＭ３への結合についてＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３または１３Ａ３と類似するパターンを有し、すなわち、抗体は：
(ｉ)ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、(１)49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合するが、例えば、(ａ)アミノ酸残基４９のＮ末端に位置する配列を有するペプチド；(ｂ)アミノ酸残基６２～１１１に位置する配列を有するペプチド(例えば、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95(配列番号３７１))；および(ｃ)アミノ酸残基１２７のＣ末端に位置する配列を有するペプチドと顕著に結合しない(例えば、実施例に記載)；
(ii)例えば、酵母表面ディスプレイ方法を使用して決定して、次のアミノ酸変異の１以上を有するヒトＴＩＭ３に結合しないまたは次のアミノ酸変異の１以上を有するヒトＴＩＭ３への結合が顕著に減少している(例えば、実施例に記載)：Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図２５))；および／または
(iii)Ｘ線結晶学により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図２５))。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は配列番号７２～１１１、３０５～３２０、３２５～３２６、３３９～３４０、３４９～３５４、４０２～４０７、４５１、４５２、４５４、４５５、４５７、４５８、４５９、４６０および４６１～４６８からなる群から選択されるおよび／または軽鎖は配列番号２９～３３および４５３からなる群から選択される。
ここにさらに記載するとおり、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の重鎖定常領域は何れのアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４またはこれらの組み合わせおよび／またはそれらの修飾体であってもよい。抗ＴＩＭ３抗体はエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が低減されていてもなくてもよい。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体の性質を増強させる修飾重鎖定常領域を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は配列番号７２～１１１、３４９～３５２、４０２～４０５、４５１、４５２、４５４、４５５、４５７、４５８、４５９、４６０および４６１～４６８からなる群から選択されるおよび／または軽鎖は配列番号２９～３３および４５３からなる群から選択される。
III. 特定の生殖系列配列を有する抗体
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
ここに示されるとおり、ヒト生殖系列ＶＨ ４－３９遺伝子、ＶＨ ４－５９遺伝子、ＶＨ １－４６遺伝子、ＶＨ ３－１１、ＶＨ ４－１７遺伝子、ＶＨ ３－１０遺伝子、ＶＨ ６－１９遺伝子、ＶＨ ６－１３遺伝子、ＶＨ ４－２３、ＶＨ ＪＨ４ｂ、ＶＨ ＪＨ５ｂ遺伝子および／またはＶＨ ＪＨ６ｂ遺伝子の生成物であるまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、ＴＩＭ３に特異的なヒト抗体が製造されている。従って、ここに提供されるのは、ＶＨ ４－３９、ＶＨ ４－５９、ＶＨ １－４６、ＶＨ ３－１１、ＶＨ ４－１７、ＶＨ ３－１０、ＶＨ６－１９、ＶＨ ６－１３、ＶＨ ４－２３、ＶＨ ＪＨ４ｂ、ＶＨ ＪＨ５ｂ、ＶＨ ＪＨ６ｂおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるヒトＶＨ生殖系列遺伝子の生成物であるまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
ヒト生殖系列ＶＫ Ａ２７遺伝子、ＶＫ ＪＫ５遺伝子、ＶＫ ＪＫ４遺伝子、ＶＫ ＪＫ３、ＶＫ Ｌ１８遺伝子および／またはＶＫ ＪＫ１遺伝子の生成物であるまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、ＴＩＭ３に特異的なヒト抗体が製造されている。従って、ここに提供されるのは、ＶＫ Ａ２７、ＶＫ ＪＫ５、ＶＫ ＪＫ４、ＶＫ ＪＫ３、ＶＫ Ｌ１８、ＶＫ ＪＫ１およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるヒトＶＫ生殖系列遺伝子の生成物であるまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、図面に示すとおり、上記ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子の一つの生成物であるまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、かつまた上記ヒト生殖系列ＶＫ遺伝子の一つの生成物であるまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含むものを含んでいる。
ここで使用するヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるならば、特定の生殖系列配列の「生成物である」または「由来する」重鎖および軽鎖可変領域を含む。このような系は、目的の抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを免疫化するまたはファージに呈示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的の抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「生成物である」または「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較し、ヒト抗体の配列に配列が最も近い(すなわち、最大％同一性)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「生成物である」または「由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異または部位特異的変異の意図的な導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸の差異を含み得る。しかしながら、選択ヒト抗体は、一般にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較して、ヒト抗体とヒトであると特定するアミノ酸残基を含む。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９５％または少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般に、特定のヒト生殖系列配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０を超えるアミノ酸差異を示さない。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と５を超えるまたは４、３、２または１を超えるアミノ酸差異を示さない。
IV. 相同抗体
ここに包含されるのは、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体であり、ここで、該抗体はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の所望の機能的性質を保持する。
例えば、単離抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでよく、ここで
(ａ)重鎖可変領域は、配列番号３４～４０、１１２～１２１、３６４、４１０～４１２、４４９および４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３４～４０、１１２～１２１、３６４、４１０～４１２、４４９および４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５または１～５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み、ここで、所望により重鎖可変領域はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の一つのＣＤＲ配列を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域は、配列番号６０～６３、４１７および４１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６０～６３、４１７、４１８および４５０からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５または１～５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み、ここで、所望により軽鎖可変領域はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の一つのＣＤＲ配列を含む；
(ｃ)抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合するおよび
(ｄ)抗体は次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９または全てを示す：
(１)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下(例えば、０.０１nM～１００nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～１μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(５)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、２０μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～２０μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(６)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(７)例えば、実施例に記載のとおり、(ｉ)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)のＩＦＮ－γ産生を増加させるおよび／または(ii)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する；
(８)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を刺激する；
(９)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、ＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３への結合を阻害する；
(１０)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(１１)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域(ａ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ｂ)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(ｃ)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；および(ｄ)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)の一つに結合する；
(１２)例えば、実施例に記載のとおり、野生型ヒトＴＩＭ３への結合に比して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図２５))の１以上が他のアミノ酸に置換されているヒトＴＩＭ３への結合が低減している；
(１３)実施例に記載の１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３およびＴＩＭ３.２５の何れかのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する；

(１４)例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(１５)Ｘ線結晶学(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図２５))により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；
(１６)(ａ)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図２５))の１、２、３、４、５、６、７、８または９が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３への結合が減少している；(ｂ)実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する；および／または(ｃ)例えば、実施例に記載のとおり１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３への結合と競合するまたは交差遮断する；
(１７)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ、２×１０－8Ｍ、１０－8Ｍまたは５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１８)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１９)実施例２２に記載の方法で測定して、カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；および／または
(２０)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－8Ｍ、５×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する。
ある実施態様において、抗体は、上記(１)～(２０)に挙げた機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または全てを示し得る。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
単離抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は重鎖および軽鎖を含むことができ、ここで、
(ａ)重鎖配列番号１～２８、７２～１１１および３４９～３５２、３８８～３９１(１４Ｈ７／ＴＩＭ３.２４ ＨＣ ＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、３９６～３９９(２３Ｂ３ ＨＣ ＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４０２～４０５(ＴＩＭ３.２５ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４５１、４５２、４６１、４６２(ＴＩＭ３.２０ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４５４、４５５、４６３、４６４(ＴＩＭ３.２１ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４５７、４５８、４６５、４６６(ＴＩＭ３.２２ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)および４５９、４６０、４６７、４６８(ＴＩＭ３.２３ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むまたは配列番号１～２８、７２～１１１、３４９～３５２、３８８～３９１(１４Ｈ７／ＴＩＭ３.２４ ＨＣ ＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、３９６～３９９(２３Ｂ３ ＨＣ ＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４０２～４０５(ＴＩＭ３.２５ ＨＣ ＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４５１、４５２、４６１、４６２(ＴＩＭ３.２０ ＨＣ ＩｇＧ.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４５４、４５５、４６３、４６４(ＴＩＭ３.２１ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)、４５７、４５８、４６５、４６６(ＴＩＭ３.２２ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)および４５９、４６０、４６７、４６８(ＴＩＭ３.２３ ＨＣ ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ)からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５または１～５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含む、ただし、ある実施態様において、配列がエフェクターレス重鎖であるならば、ＩｇＧ１.１定常領域について重鎖をエフェクターレスとする変異は修飾されない(例えば、Ｒ２１４、Ａ２３４、Ｅ２３５、Ａ２３７、Ｓ３３０およびＳ３３１は修飾されない)およびＩｇＧ１.３定常領域ついてＲ２１４、Ａ２３４およびＥ２３５は修飾されず、ここで、所望により重鎖可変領域はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の一つのＣＤＲ配列を含む；
(ｂ)軽鎖は、配列番号２９～３３、４０８、４０９および４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２９～３３、４０８、４０９および４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５または１～５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み、ここで、所望により軽鎖可変領域はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の一つのＣＤＲ配列を含む；
(ｃ)抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合するおよび
(ｄ)抗体は次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または全てを示す：
(１)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下(例えば、０.０１nM～１００nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～１μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(５)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、２０μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～２０μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(６)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(７)例えば、実施例に記載のとおり、(ｉ)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)のＩＦＮ－γ産生を増加させるおよび／または(ii)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する；
(８)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を刺激する；
(９)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、ＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３への結合を阻害する；
(１０)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(１１)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域(ａ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ｂ)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(ｃ)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；および(ｄ)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)の一つに結合する；
(１２)野生型ヒトＴＩＭ３、例えば、実施例に記載への結合と比較して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図２５))の１以上が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３に対して結合が減少している；
(１３)実施例に記載の１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３、ＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８およびＴＩＭ３.２５の何れかのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する；
(１４)例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(１５)Ｘ線結晶学(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図２５))により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；
(１６)例えば、実施例に記載されるとおり、(ａ)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図２５))の１、２、３、４、５、６、７、８または９が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３への結合が減少している；(ｂ)実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する；および／または(ｃ)１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３への結合と競合するまたは交差遮断する；
(１７)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ、２×１０－8Ｍ、１０－8Ｍまたは５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１８)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１９)実施例２２に記載の方法で測定して、カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；および／または
(２０)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－8Ｍ、５×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する。
また提供されるのは、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかの対応するＣＤＲと１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)により異なるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体である。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかの対応する配列に比して、ＣＤＲの１、２、３、４、５または６の各々に１～５アミノ酸変化を含む。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのＣＤＲに比して、全ＣＤＲにわたり、計１～５アミノ酸変化を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３のものからなるＶＨおよびＶＬ ＣＤＲを含み、ここで、１以上のＣＤＲにおけるアミノ酸の１以上は、他のここに開示する抗ＴＩＭ３抗体の一つのものである。
例えば、ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、SRSYYWG(配列番号４１)に比して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨ ＣＤＲ１を含み、例えば、次の縮重配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＸ５Ｘ６(配列番号２８２)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｓであるかまたはない；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、Ｒであるかまたはない；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＲまたはＤである；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＨである；Ｘ５は任意のアミノ酸、例えば、ＷまたはＭである；そしてＸ６は任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＨである)を含み得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、SIYYSGFTYYNPSLKS(配列番号４６)に比して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、例えば、次の縮重配列：Ｘ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４(配列番号２８３)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、Ｙ、ＩまたはＦである；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＳである；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｐ、Ｇ、Ｔ、ＳまたはＮである；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＧである；Ｘ５は任意のアミノ酸、例えば、Ｆ、ＳまたはＤである；Ｘ６は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＴまたはＩである；Ｘ７は任意のアミノ酸、例えば、Ｉであるかまたはない；Ｘ８は任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、ＮまたはＩである；Ｘ９は任意のアミノ酸、例えば、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＡである；Ｘ１０は任意のアミノ酸、例えば、Ｐ、Ｓ、ＱまたはＤである；Ｘ１１は任意のアミノ酸、例えば、ＳまたはＫである；Ｘ１２は任意のアミノ酸、例えば、Ｌ、ＦまたはＶである；Ｘ１３は任意のアミノ酸、例えば、ＫまたはＱである；そしてＸ１４は任意のアミノ酸、例えば、ＳまたはＧである)を含み得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、GGPYGDYAHWFDP(配列番号５３)に比して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨ ＣＤＲ３を含み、例えば、次の縮重配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０(配列番号２８４)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｇであるかまたはない；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｇ、Ｒであるかまたはない；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｍ、Ｉであるかまたはない；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、Ｓ、Ｖであるかまたはない；Ｘ５は任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ｓであるかまたはない；Ｘ６は任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、Ｓであるかまたはない；Ｘ７は任意のアミノ酸、例えば、Ｍ、Ｎ、Ｗであるかまたはない；Ｘ８は任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｓ、Ｅ、Ｎであるかまたはない；Ｘ９は任意のアミノ酸、例えば、Ｙであるかまたはない；Ｘ１０は任意のアミノ酸、例えば、Ｆ、ＰまたはＹである；Ｘ１１は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＦである；Ｘ１２は任意のアミノ酸、例えば、Ｇであるかまたはない；Ｘ１３は任意のアミノ酸、例えば、Ｄであるかまたはない；Ｘ１４は任意のアミノ酸、例えば、Ｙであるかまたはない；Ｘ１５は任意のアミノ酸、例えば、Ａであるかまたはない；Ｘ１６は任意のアミノ酸、例えば、Ｈであるかまたはない；Ｘ１７は任意のアミノ酸、例えば、Ｗであるかまたはない；Ｘ１８は任意のアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｍであるかまたはない；Ｘ１９は任意のアミノ酸、例えば、ＤまたはＥである；そしてＸ２０は任意のアミノ酸、例えば、Ｐ、Ｉ、Ｖ、ＹまたはＬである)を含み得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号６４または配列番号６５に示すアミノ酸配列を含む、ＶＬ ＣＤＲ１を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号６６または配列番号６７に示すアミノ酸配列を含む、ＶＬ ＣＤＲ２を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＱＱＹＧＳＳＰＩＴ(配列番号６８)に比して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＬ ＣＤＲ３を含み、例えば、次の縮重配列：ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６(配列番号２８５)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＦまたはＹである；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＮまたはＧである；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＳである；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、Ｐであるかまたはない；Ｘ５は任意のアミノ酸、例えば、Ｉ、Ｒ、Ｌであるかまたはない；Ｘ６は任意のアミノ酸、例えば、Ｔであるかまたはない)を含み得る。
１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れか、例えば、それぞれ配列番号３４～４０、１１２～１２１、３６４および４１０～４１２および配列番号６０～６３、４１７および４１８のＶＨおよびＶＬ領域またはそれぞれ配列番号１～２８、７２～１１１、３４９～３５２、３８８～３９１、３９６～３９９または４０２～４０５および配列番号２９～３３、４０８または４０９の重鎖および軽鎖またはＣＤＲと相同性の配列を有する抗体は、配列番号１６７～１７３および／または配列番号１９３～１９６または配列番号１３４～１６１、４３０～４３７および／または配列番号１６２～１６６および４４２～４４４をコードする核酸分子を変異誘発し(例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘発)、続いてここに記載する機能的アッセイを使用して、コードされる改変抗体の機能(すなわち、上記(１)～(１６)に示す機能)の保持について試験することにより得る。
Ｖ. 保存的修飾を有する抗体
抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含むことができ、ここで、これらＣＤＲ配列の１以上は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体(例えば、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れか)に基づき特定されたアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾体を含み、ここで、該抗体はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、単離抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含むことができ、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号５３～５９、１２６～１２９、４１４、４１６および４７１およびそれらの保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、所望により重鎖可変領域はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の一つのＣＤＲ配列を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号６８～７１、４１９および４７４およびそれらの保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、所望により軽鎖可変領域はここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の一つのＣＤＲ配列を含む；
(ｃ)抗体はヒトＴＩＭ３に特異的に結合するおよび
(ｄ)抗体は次の特性の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または全てを示す：
(１)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下(例えば、０.０１nM～１００nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～１μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(５)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、２０μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～２０μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(６)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(７)例えば、実施例に記載のとおり、(ｉ)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)のＩＦＮ－γ産生を増加させるおよび／または(ii)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する；
(８)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を刺激する；
(９)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、ＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３への結合を阻害する；
(１０)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(１１)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域(ａ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ｂ)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(ｃ)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；および(ｄ)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)の一つに結合する；
(１２)野生型ヒトＴＩＭ３、例えば、実施例に記載への結合と比較して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図２５))の１以上が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３に対して結合が減少している；
(１３)実施例に記載の１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３およびＴＩＭ３.２５の何れかのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する；
(１４)例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(１５)Ｘ線結晶学(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図２５))により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；
(１６)(ａ)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図２５))の１、２、３、４、５、６、７、８または９が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３への結合が減少している；(ｂ)実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する；および／または(ｃ)例えば、実施例に記載のとおり１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３への結合と競合するまたは交差遮断する；
(１７)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ、２×１０－8Ｍ、１０－8Ｍまたは５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１８)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１９)実施例２２に記載の方法で測定して、カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；および／または
(２０)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－8Ｍ、５×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する。
ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号４６～５２、１２２～１２５、４１３、４１５および４７０およびそれらの保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；および軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号６６～６７および４７３およびそれらの保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号４１～４５および４６９およびそれらの保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；および軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号６４～６５および４７２およびそれらの保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗体は、上記(１)～(２０)に挙げた機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または全てを示し得る。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
保存的アミノ酸置換は、ＣＤＲ以外の部分またはそれに加えて抗体の一部にもなし得る。例えば、保存的アミノ酸修飾はフレームワーク領域またはＦｃ領域で行い得る。可変領域または重鎖または軽鎖は、ここに提供する抗ＴＩＭ３抗体配列に比して１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５または１～５０保存的アミノ酸置換を含み得る。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、保存的および非保存的アミノ酸修飾の組み合わせを含む。
VI. 同じエピトープに結合するまたは結合について競合する抗体
また提供されるのは、特定のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の１以上(例えば、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３および／またはＴＩＭ３.２－ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５)とヒトＴＩＭ３への結合について競合する抗体である。このような競合抗体は、標準ＴＩＭ３結合アッセイでモノクローナル抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３および／またはＴＩＭ３.２－ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の１以上のヒトＴＩＭ３への結合を競合的に阻害する能力に基づき同定され得る。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用でき、ここで、組み換えヒトＴＩＭ３タンパク質がプレートに固定化され、様々な濃度の非標識第一抗体を加え、プレートを洗浄し、標識第二抗体を加え、標識の量が測定される。非標識(第一)抗体(「遮断抗体」とも称する)の濃度を増加させると標識(第二)抗体の結合が阻害されるならば、第一抗体は、プレート上の標的への第二抗体の結合を阻害すると言えるまたは第二抗体の結合と競合すると言える。これに加えてまたはこれとは別に、Biacore分析を使用して、抗体が競合する能力を評価し得る。試験抗体がここに記載する抗ＴＩＭ３抗体のＴＩＭ３への結合を阻害する能力は、試験抗体が、該抗体のヒトＴＩＭ３への結合と競合できることを示す。
従って、ここに提供されるのは、例えば、次段落に記載するアッセイを使用するような、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳで測定して、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のＴＩＭ３への結合を少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を該するおよび／またはヒト細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のＴＩＭ３への結合が少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害される、抗ＴＩＭ３抗体である。
例えば、第一抗体が第二抗体の結合を遮断する(すなわち、「競合する」)かを決定する例示的競合実験は、実施例に記載のとおりまたは次のとおり実施できる：活性化ヒトＴ細胞を次のとおり調製する：末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をFicoll勾配を使用してヒト全血から単離し、１０μg／mLフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ－Ｌ)(USBiol#P3370-30)および２００ＩＵ／mL 組み換えＩＬ－２(Peprotech#200-02)で３日間活性化する。活性化Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液(５％ウシ胎児血清含有ＰＢＳ)に再懸濁し、９６ウェルプレートに１０5細胞／サンプルウェルで播種する。プレートを氷に乗せ、続いて非コンジュゲート第一抗体を０～５０μg／mL範囲の濃度(５０μg／mLの最高濃度から開始する三倍タイトレーション)を加える。無関係ＩｇＧを第一抗体のアイソタイプ対照として使用でき、同じ濃度で加える(５０μg／mLの最高濃度から開始する三倍タイトレーション)。５０μg／mL 非標識第二抗体とプレインキュベートしたサンプルを、完全遮断(１００％阻害)の陽性対照として使用でき、一次インキュベーションで抗体がないサンプルを陰性対照として使用できる(競合なし；０％阻害)。３０分間のインキュベーション後、標識、例えば、ビオチニル化第二抗体を、洗浄せずに２μg／mL／ウェル濃度で加える。サンプルを氷上でさらに３０分間インキュベートする。非結合抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄することにより除去する。細胞結合標識第二抗体を、標識を検出する試薬、例えば、ビオチン検出のためのＰＥコンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen, catalog#S21388)で検出する。サンプルをFACS Calibur Flow Cytometer(BD, San Jose)で取得し、FLOWJO(登録商標)ソフトウェア(Tree Star, Inc., Ashland, OR)で分析する。結果を％阻害として表し得る(すなわち、１００％から各濃度での標識の量を減産し、遮断抗体非存在下に得た標識の量で除する)。一般に、同じ実験を、次いで逆に、すなわち、第一抗体が第二抗体および第二抗体が第一抗体で実施する。
ある実施態様において、抗体は、他の抗体、例えば、ヒトＴＩＭ３またはその一部の標的への結合を、阻害が一方または他方の抗体が第一抗体であるときに生じるかにかかわらず、少なくとも一部(例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％)または完全に(１００％)遮断する。第一および第二抗体は、抗体が互いに両方向で、すなわち、第一抗体をまず加える競合実験および第二抗体をまず加える競合実験で競合するとき、互いに標的への結合を「交差遮断」する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、あるエピトープマッピング技術により決定して、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体(例えば、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３および／またはＴＩＭ３.２－ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５)と同じエピトープに結合する。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体と「ＴＩＭ３上の同じエピトープ」に結合する抗体を決定する技術は、例えば、エピトープマッピング法、例えば、エピトープの原子解析を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析を含む。他の方法は、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異バリエーションへの結合のモニターであり、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基修飾による結合の喪失が、しばしばエピトープ成分の指標であると考えられる(図２５参照)。さらに、エピトープマッピングのコンピューターによるコンビナトリアル法も使用され得る。方法は、コンビナトリアルファージディスプレーペプチドライブラリーから特異的短ペプチド(天然三次元形態または変性形態)を親和性単離する目的の抗体の能力も利用し得る。次いで、ペプチドをペプチドライブラリーのスクリーニングに使用する抗体に対応するエピトープを規定するためのリードとして考える。エピトープマッピングのために、コンピューターによるアルゴリズムが開発されており、これは立体的非連続エピトープをマッピングすることが示されている。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体と結合について競合するまたは同じエピトープに結合する抗体は、当分野で知られる方法を使用して同定され得る。例えば、マウスをここに記載するヒトＴＩＭ３で免疫化し、ハイブリドーマを産生し、得られたモノクローナル抗体を、ここに記載する抗体のヒトＴＩＭ３への結合と競合する能力についてスクリーニングし得る。マウスをまた抗体が結合するエピトープを含むＴＩＭ３の小フラグメントでも免疫化できる。エピトープまたはエピトープを含む領域を、例えば、ＴＩＭ３に伸びる一連の重複ペプチドへの結合についてスクリーニングして、局在化させ得る。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994の方法を使用して、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープを有し、それ故に類似性質を有する抗体の選択を誘導し得る。ファージディスプレイを使用して、第一抗ＴＩＭ３抗体の重鎖を(ヒト)軽鎖のレパートリーと対形成させてＴＩＭ３結合抗体を選択し、次いで新規軽鎖を(ヒト)重鎖のレパートリーと対形成させて、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープまたはエピトープ領域を有する(ヒト)ＴＩＭ３結合抗体を選択する。あるいはここに記載する抗体のバリアントを、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発により得ることができる。
ＴＩＭ３のCunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085により記載のアラニン走査変異誘発またはアミノ酸残基の点変異誘発のある他の形態も、ＴＩＭ３抗体結合特徴を得るために使用され得る。
特異的抗体の結合特徴は、抗体のＴＩＭ３のフラグメント、例えば、非変性または変性フラグメントを含むペプチドへの結合の評価によっても決定され得る。ＴＩＭ３(例えば、ヒトＴＩＭ３)の配列を包含する一連の重複ペプチドを、合成し、結合について、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ(ペプチドが、抗体がマイクロタイタープレートのウェルに結合したＴＩＭ３に結合する阻害する能力を評価する)またはチップでスクリーニングし得る。
抗ＴＩＭ３抗体の結合特徴はまたＭＳベースのタンパク質フットプリント法、例えば水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ－ＭＳ)およびFast Photochemical Oxidation of Proteins(ＦＰＯＰ)によっても得られ得る。ＨＤＸ－ＭＳを、例えば、ＷＯ２０１５／１８７３５およびWei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95に記載の方法で実施でき、これらの方法は引用により本明細書に明示的に包含させる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057に記載のとおり実施でき、この方法は引用により本明細書に明示的に包含させる。
抗ＴＩＭ３抗体の結合特徴はまた構造的方法、例えばＸ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３)、分子モデリングおよび核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピー(ＴＩＭ３の不安定なアミド水素が遊離のときおよび目的の抗体との複合体で結合しているときのＨ－Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含む)(Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891)によっても得られ得る。
Ｘ線結晶学に関して、結晶化を、マイクロバッチ(例えば、Chayen (1997) Structure 5: 1269-1274)、ハンギング・ドロップ－蒸気拡散法(例えば、McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303)、シーディングおよび透析を含む、当分野で知られる方法の何れかを使用して達成できる(例えば、Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189: 1-23)。少なくとも約１mg／mLまたは約１０mg／mL～約２０mg／mLの濃度のタンパク質調製物の使用が望ましい。結晶化は、ポリエチレングリコール１０００－２０,０００(ＰＥＧ；約１０００～約２０,０００Daの平均分子量)、約５０００～約７０００Daまたは約６０００Daを含む沈殿剤溶液で、約１０％～約３０％(ｗ／ｖ)濃度範囲でもっとも良好に達成され得る。タンパク質安定化剤、例えば、グリセロールを約０.５％～約２０％範囲の濃度で含むことも望まれ得る。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適当な塩も、沈殿剤溶液に、約１mM～約１０００mMの濃度範囲で望まれ得る。沈殿剤は、約３.０～約５.０のｐＨに緩衝化される。沈殿剤溶液で有用な特定の緩衝液は変わり得て、当分野で周知である(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York)。有用な緩衝液の例は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸を含むが、これらに限定されない。結晶は、２℃、４℃、８℃および２６℃を含む広範な温度で成長し得る。
抗体：抗原結晶を周知のＸ線回折技術を使用して検討し、Ｘ－ＰＬＯＲ(Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；例えば、Blundell & Johnson (1985)Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開２００４／００１４１９４参照)およびＢＵＳＴＥＲ(Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997)Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56: 1313-1323)などのコンピュータソフトウェアを使用して緻密化でき、これらの開示を、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
抗ＴＩＭ３抗体は、ここに記載する技術のようなエピトープマッピング技術により決定して、ここに記載するアミノ酸配列を有する抗ＴＩＭ３抗体の何れかと同じエピトープに結合できる。
ヒトＴＩＭ３および所望によりカニクイザルＴＩＭ３に、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体と類似する結合特徴で結合し、実施例に使用される方法の一つにより決定される抗体は、ここに包含される。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３の細胞外部分のエピトープ、例えば、細胞外領域のＩｇ様ドメインまたはＩｇＶドメインの、例えば、立体的エピトープ、すなわち、配列番号２８６のアミノ酸２２～１３０(図２５)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２８６)のアミノ酸２２～１２０または成熟ヒトＴＩＭ３(配列番号２９０)の１～９９に位置するエピトープに結合する(実施例参照)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３の配列番号２８６に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８～６４からなる領域にまたはその中のエピトープ(CPVFECG、配列番号２９６；図２５参照)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３の配列番号２８６に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１～１２０からなる領域にまたはその中のエピトープ(RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２５参照)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８～６４(CPVFECG、配列番号２９６)および配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１～１２０からなる領域(RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２５参照)からなる領域にまたはその中のエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３の配列番号２８６に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸７８～８９からなる領域にまたはその中のエピトープ(WTSRYWLNGDFR、配列番号２９７；図２５参照)に結合する。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３と実質的に同じエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、３Ｇ４と実質的に同じエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１７Ｃ３と実質的に同じエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９と実質的に同じエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９と実質的に同じエピトープに結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４(図２５)の１以上を含むエピトープ(またはヒトＴＩＭ３の領域)に結合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４の１以上が他のアミノ酸に変えられた、例えば、非保存的アミノ酸置換されたヒトＴＩＭ３タンパク質に顕著に結合しないまたは顕著に減少した結合親和性でしか結合しない(図２５)。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ここに記載するＣＤＲまたは可変領域を有する抗ＴＩＭ３抗体、例えば、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３およびＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのヒトＴＩＭ３の結合と競合する(または結合を阻害する)。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのヒトＴＩＭ３への結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある実施態様において、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３への結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのヒトＴＩＭ３への結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害し、かつ１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３への結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する(例えば、両方向で競合する)。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３への結合について抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、１４Ｈ７および２３Ｂ３(およびそのバリアント)のＣＤＲまたは可変領域を含む抗ＴＩＭ３抗体と競合する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３への結合について、抗ＴＩＭ３抗体８Ｂ９および８Ｃ４(およびそのバリアント)のＣＤＲまたは可変領域を含む抗ＴＩＭ３抗体と競合しない。
VII. エンジニアリングされ、修飾された抗体
また提供されるのは、修飾抗体を設計するためにここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上を有する抗体を出発物質として使用して製造できるエンジニアリングされ、修飾された抗体であり、その修飾抗体は出発抗体から改変された性質を有し得る。抗体を、一方または両方の可変領域内(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基の修飾によりエンジニアリングされ得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基の修飾により加工し得る。
実施され得る可変領域エンジニアリングの一タイプはＣＤＲ移植である。抗体は、標的抗原と、主に６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列より個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列が抗体－抗原相互作用の大部分を担うため、異なる性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植した特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、該特定の天然に存在する抗体の性質を模倣した組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321 :522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033；Winterの米国特許５,２２５,５３９およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
従って、ここに記載するある実施態様は、それぞれ配列番号４１～４５および４６９；配列番号４６～５２、１２２～１２５、４１３、４１５および４７０；および配列番号５３～５９、１２６～１２９、４１４、４１６および４７１；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびそれぞれ配列番号６４～６５および４７２；配列番号６６～６７および４７３；および配列番号６８～７１、４１９および４７４；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。故に、そのような抗体は、モノクローナル抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４またはＴＩＭ３.２５の何れかのＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含み、なお、これら抗体からの異なるフレームワーク配列を含み得る。
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開されたデータベースまたは公開された文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース(インターネットでwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能)、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" /. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見ることができ；この各々の内容を、全体として本明細書に明示的に包含させる。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体において使用するためのフレームワーク配列は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるのと同一配列を有するフレームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して１以上の変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある例で、抗体の抗原結合能維持または増強のためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有利であることが判明している(例えば、Queen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２；および６,１８０,３７０参照)。
ここに記載するエンジニアリングされた抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、抗体の性質を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基が修飾されている、例えば、９Ｆ６のアミノ酸１０７に変異があるものを含む。一般にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性の低減のためになされる。例えば、一つの方法は、１以上のフレームワーク残基の対応する生殖系列配列への「復帰変異」である。より具体的に、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基を、抗体フレームワーク配列と抗体が由来する生殖系列配列の比較により同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、体細胞変異は、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発により、生殖系列配列に「復帰変異」される。このような「復帰変異」抗体も、包含されることが意図される。他のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内または１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の可能性のある免疫原性を低減させることを含む。この方法は「脱免疫化」とも称され、Carr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３に記載される。
他のタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより、目的の抗体の１以上の結合性(例えば、親和性)を改善することである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発を使用して変異を導入し、目的の抗体結合または他の機能的性質への影響を、ここに記載するおよび実施例に提供するインビトロまたはインビボアッセイで評価できる。ある実施態様において、保存的修飾(上記)が導入される。変異はアミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、一般にＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５を超えない残基が改変される。
従って、さらに提供されるのは、
(ａ)配列番号４１～４５および４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４１～４５および４６９に比して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１領域；
(ｂ)配列番号４６～５２、１２２～１２５、４１３、４１５および４７０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４６～５２、１２２～１２５、４１３、４１５および４７０に比して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２領域；
(ｃ)配列番号５３～５９、１２６～１２９、４１４、４１６および４７１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５３～５９、１２６～１２９、４１４、４１６および４７１に比して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３領域；
(ｄ)配列番号６４～６５および４７２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６４～６５および４７２に比して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１領域；
(ｅ)配列番号６６～６７および４７３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６６～６７および４７３に比して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２領域；および
(ｆ)配列番号６８～７１、４１９および４７４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６８～７１、４１９および４７４に比して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３領域
を含む重鎖可変領域を含む、単離抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
抗体のＣＤＲのメチオニン残基を酸化して、可能性のある化学分解をもたらし、抗体の能力の結果的な低減をもたらし得る。従って、また提供されるのは、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの１以上のメチオニン残基が酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置換されている抗ＴＩＭ３抗体である。ある実施態様において、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのＣＤＲのメチオニン残基は、酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置換される。
同様に、脱アミド化部位を、抗ＴＩＭ３抗体、特にＣＤＲから除去し得る。
ここに記載する抗ＴＩＭ３可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃに結合(例えば、共有結合または融合)でき、これは、あらゆるアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、ＩｇＧ１について：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍｌ(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２について：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３について：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍｌｌ(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍｌ３(ｂ３)、Ｇ３ｍｌ４(ｂ４)、Ｇ３ｍｌ０(ｂ５)、Ｇ３ｍｌ５(ｓ)、Ｇ３ｍｌ６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)；およびＫについて：Ｋｍ、Ｋｍ１、Ｋｍ２、Ｋｍ３であり得る(例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1)。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３可変領域は、エフェクターレスまたは大部分エフェクターレスＦｃ、例えば、ＩｇＧ１に結合される。
一般に、ここに記載する可変領域を、一般に血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞細胞毒性などの抗体の機能的性質の１以上を変えるため、１以上の修飾を含むＦｃに結合させ得る。さらに、ここに記載する抗体を、抗体の機能的性質の１以上を変えるため、化学的修飾(例えば、１以上の化学部分を抗体に結合できる)またはそのグリコシル化を変えるための修飾をし得る。これら実施態様の各々を下にさらに詳述する。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
Ｆｃ領域は、定常領域のフラグメント、アナログ、バリアント、変異体または誘導体を含む、免疫グロブリンの定常領域由来のドメインを包含する。適当な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭなどの他のクラスを含み、免疫グロブリンの定常領域は免疫グロブリンＣ末端領域に相同な天然に存在するまたは合成により製造されたポリペプチドとして定義され、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインを別々にまたは組み合わせて含む。
Ｉｇ分子は、複数のクラスの細胞受容体と相互作用する。例えばＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的な３クラスのＦｃγ受容体(ＦｃγＲ)、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体への結合に重要な配列はＣＨ２およびＣＨ３ドメインに位置することが報告されている。抗体の血清半減期は、抗体がＦｃ受容体(ＦｃＲ)に結合する能力に影響を受ける。
ある実施態様において、Ｆｃ領域は、望ましい構造的特性および／または生物学的活性を提供するため、バリアントＦｃ領域、例えば、親Ｆｃ配列(例えば、バリアントを産生するためにその後に修飾される非修飾Ｆｃポリペプチド)に比して修飾されている(例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入により)Ｆｃ配列である。
一般に、定常領域またはその一部、例えば、ＣＨ１、ＣＬ、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異および／または最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１変異または１～１０または１～５変異を含むまたは対応する野生型領域またはドメイン(それぞれＣＨ１、ＣＬ、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン)と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、特定のバリアントを含む重鎖定常領域は必要な生物学的活性を保持する。
例えば、親Ｆｃに比して(ａ)抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)が増加または低減している、(ｂ)補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)が増加または低減している、(ｃ)Ｃ１ｑへの親和性が増加または低減しているおよび／または(ｄ)Ｆｃ受容体への親和性が増加または低減しているＦｃバリアントを作るために、Ｆｃ領域に修飾を行い得る。このようなＦｃ領域バリアントは、一般にＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。組み合わせアミノ酸修飾は特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、例えば、ここに特定する特異的Ｆｃ領域位置の２、３、４、５箇所の置換などをその中に含み得る。
バリアントＦｃ領域は、配列改変もその中に含むことができ、ここで、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去されるか他のアミノ酸に置き換えられる。このような除去は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の産生に使用する宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避し得る。システイン残基が除去されても、一本鎖Ｆｃドメインは、非共有結合で一体となる二量体Ｆｃドメインをなお形成し得る。ある実施態様において、Ｆｃ領域は、選択宿主細胞とより適合性にするための修飾であり得る。例えば、大腸菌のプロリンイミノペプチダーゼなどの消化酵素により認識され得る、典型的天然Ｆｃ領域のＮ末端近辺のＰＡ配列を除去できる。ある実施態様において、Ｆｃドメイン内の１以上のグリコシル化部位を除去し得る。一般にグリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は細胞溶解応答に寄与できる。このような残基を欠失させるかまたは非グリコシル化残基(例えば、アラニン)に置換し得る。ある実施態様において、Ｃ１ｑ結合部位などの補体との相互作用に関与する部位をＦｃ領域から除去し得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるかまたは置換し得る。ある実施態様において、Ｆｃ受容体への結合に影響する部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位を除去できる。ある実施態様において、Ｆｃ領域をＡＤＣＣ部位を除去するために修飾し得る。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られる；例えば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位についてMolec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)参照。バリアントＦｃドメインの具体例は、例えば、ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８に開示される。
ある実施態様において、Ｆｃのヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基数が変えられる、例えば、増加または減少するように修飾される。この方法は、Bodmer et al.の米国特許５,６７７,４２５にさらに記載される。Ｆｃのヒンジ領域のシステイン残基数は、例えば、軽鎖と重鎖のアセンブリを促進するまたは抗体の安定性を増加または減少するために変えられる。ある実施態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を低減するように変異する。より具体的に、１以上のアミノ酸変異を、抗体が、ブドウ球菌プロテインＡ(ＳｐＡ)結合が天然Ｆｃ－ヒンジドメインｐＡ結合に比して障害されるように、Ｆｃ－ヒンジフラグメントのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この方法は、Ward et al.の米国特許６,１６５,７４５にさらに詳述される。
ある実施態様において、Ｆｃ領域を、抗体のエフェクター機能を変えるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることにより変える。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、３２２、３３０および／または３３１から選択された１以上のアミノ酸を、抗体はエフェクターリガンドに対する親和性が改変されるが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性が変えられるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体Ｃ１成分であり得る。この方法は、いずれもWinter et al.の米国特許５,６２４,８２１および５,６４８,２６０にさらに詳述される。
他の例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択された１以上のアミノ酸を、抗体のＣ１ｑ結合が変えられるおよび／または補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)が低減または除去されるように異なるアミノ酸残基で置き換え得る。この方法は、Idusogie et al.の米国特許６,１９４,５５１にさらに詳述される。
他の例において、アミノ酸位置２３１および２３９内の１以上のアミノ酸残基が変えられ、それにより抗体が補体を結合する能力が変えられる。この方法は、Bodmer et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに詳述される。
さらに他の例において、Ｆｃ領域を、次の位置２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９の１以上のアミノ酸の修飾により、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を低減するおよび／またはＦｃγ受容体に対する親和性を低減するように修飾され得る。置換の例は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅを含む。バリアントの例は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ７３２４Ｔを含む。ＦｃγＲおよび補体相互作用を増強するための他の修飾は、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７１、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５１および３９６Ｌを含むが、これらに限定されない。これらおよび他の修飾は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691にレビューされる。
Ｆｃγ受容体への結合を増加させるＦｃ修飾は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２４、３２７、３２９、３３０、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の何れか１以上のアミノ酸修飾を含み、ここで、Ｆｃ領域の残基のナンバリングはＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスのものである(ＷＯ００／４２０７２)。
Ｆｃに行い得る他のＦｃ修飾は、ＦｃγＲおよび／または補体タンパク質への結合を低減または除去させ、それによりＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣなどのＦｃ介在エフェクター機能を低減または除去するためのものである。修飾の例は位置２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５、３２８、３３０および／または３３１(例えば、３３０および３３１)の置換、挿入および欠失を含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵインデックスによる。置換の例は２３４Ａ、２３５Ｅ、２３６Ｒ、２３７Ａ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、３３０Ｓおよび３３１Ｓ(例えば、３３０Ｓおよび３３１Ｓ)を含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵインデックスによる。Ｆｃバリアントは２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃγＲおよび補体相互作用を低減させる他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖならびに変異もしくは酵素手段によるまたはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物での産生による２９７位のグリコシル化の除去を含む。これらおよび他の修飾は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691にレビューされる。
所望により、Ｆｃ領域は、当業者に知られるさらなるおよび／または別の位置での天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る(例えば、米国特許５,６２４,８２１；６,２７７,３７５；６,７３７,０５６；６,１９４,５５１；７,３１７,０９１；８,１０１,７２０；ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０１／５８９５７；ＷＯ０２／０６９１９；ＷＯ０４／０１６７５０；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０３５７５２；ＷＯ０４／０７４４５５；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１；ＷＯ０５／０７０９６３；ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４参照)。
阻害性受容体ＦｃγＲIIｂの親和性を増強するＦｃバリアントも使用され得る。このようなバリアントは、例えばＢ細胞および単球を含むＦｃγＲIIｂ細胞に関連する免疫調節性活性を備えたＦｃ融合タンパク質を提供できる。ある実施態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体に比してＦｃγＲIIｂへの親和性を選択的に増強する。ＦｃγＲIIｂへの結合を変える修飾は、ＥＵインデックスにより、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、３３０、３３１および３３２からなる群から選択される位置での１以上の修飾を含む。ＦｃγＲIIｂ親和性を増強する置換の例は、２３４Ａ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ａ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、３３０Ｓ、３３１Ｓおよび３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。置換の例は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含む。ＦｃγＲIIｂへの結合を増強する他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。
Ｆｃ領域のそのリガンドへの親和性および結合性は、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)または放射免疫アッセイ(ＲＩＡ))または動態試験(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析)および間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などの他の方法を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多くのインビトロアッセイ法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)により決定され得る。これらおよび他の方法は、試験する成分の１以上の標識を利用できおよび／または色素生成、蛍光、発光または同位体標識を含むが、これらに限定されない多九の検出方法を用いる。結合親和性および動態試験の詳述は、Paul, W. E., ed., Fundamental immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができ、これは、抗体－免疫原相互作用に詳しい。
ある実施態様において、抗体は、生物学的半減期が延長されるように修飾される。様々な方法が可能である。例えば、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合親和性を高めることにより行い得る。米国特許６,２７７,３７５に記載のとおり、例えば、次の残基の１以上を変異し得る：２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６。置換の具体例は、次の１以上Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓおよび／またはＴ２５６Ｆを含む。あるいは、生物学的半減期を延長するために、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６および６,１２１,０２２に記載のとおり、抗体をＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループからとったサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内を改変し得る。ＦｃＲｎへの結合を増加するおよび／または薬物動態性質を改善する他のバリアントの例は、例えば２５９１、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｌ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｘ１を含む、位置２５９、３０８、４２８および４３４に置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加させる他のバリアントは、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al. 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３１、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１ＳDall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。ＦｃＲｎ結合を調節する他の修飾は、Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671に記載される。
ある実施態様において、特定の生物学的特徴を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプが使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、２つのアイソタイプが異なる位置であるＩｇＧ３からのアミノ酸でＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ１位置を置き換えることにより構築し得る。故に、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２１、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。ここに記載するある実施態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、２つのアイソタイプが異なる位置であるＩｇＧ１からのアミノ酸でＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ２位置を置き換えることにより構築し得る。故に、１以上の置換、例えば、次のアミノ酸置換の１以上：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、－２３６Ｇ(２３６位でのグリシンの挿入をいう)および３２７Ａを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。
さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲに対するヒトＩｇＧ１の結合部位はマッピングされており、結合が改善されたバリアントは記載されている(Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604参照)。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９の特定の変異は、ＦｃγＲIIIへの結合を改善することが示された。さらに、次のＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの組み合わせ変異体はＦｃγＲIII結合を改善することが示され、これはＦｃγＲIIIａ結合およびＡＤＣＣ活性増強が示された(Shields et al., 2001)。ＦｃγＲIIIａへの結合が強力に増強した他のＩｇＧ１バリアントが同定されており、カニクイザルでＦｃγＲIIIａへの親和性の最大増加、ＦｃγＲIIｂ結合減少および強力な細胞毒性活性を示したＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有するバリアントを含む(Lazar et al., 2006)。インビトロでの大きく増強されたＡＤＣＣ活性により反映されるアレムツズマブ(ＣＤ５２特異的)、トラスツズマブ(ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的)、リツキシマブ(ＣＤ２０特異的)およびセツキシマブ(ＥＧＦＲ特異的)などの抗体への三重変異導入およびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅバリアントは、サルでＢ細胞枯渇の能力の増強を示した(Lazar et al., 2006)。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルのヒトＦｃγＲIIIａ発現トランスジェニックマウスにおいてＦｃγＲIIIａへの結合増強および同時にＡＤＣＣ活性増強を示したＬ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が同定されている(Stavenhagen et al., 2007; Nordstrom et al., 2011)。使用され得る他のＦｃ変異体はＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｌ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６ＬおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。
ある実施態様において、Ｆｃは、ＦｃγＲへの結合が減少したものが選択される。ＦｃγＲ結合が減少したＦｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃの例は、次の３アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む。
ある実施態様において、Ｆｃは、補体結合が減少したものが選択される。補体結合が減少したＦｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃの例は、次の２アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。
ある実施態様において、Ｆｃは、エフェクター機能が本質的にない、すなわち、ｃγＲへの結合が減少したかつ補体結合が減少したものが選択される。エフェクターレスであるＦｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃの例は、次の５変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。
ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、ＩｇＧ１のヒンジ配列を模倣し、それによりＩｇＧ４分子を安定化する置換Ｓ２２８Ｐを含み得る。
ある実施態様において、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、アグリコシル化抗体が製造され得る(すなわち、抗体はグリコシル化がない)。例えば、抗体の抗原への親和性増強のために、グリコシル化は変えられ得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位の改変により達成され得る。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去し、それ故に、その部位でのグリコシル化が排除される、１以上のアミノ酸置換がなされ得る。このようなアグリコシル化は抗体の抗原への親和性を高め得る。このような方法は、Co et al.の米国特許５,７１４,３５０および６,３５０,８６１にさらに詳述される。
定常領域のＮ２９７のグリコシル化は、Ｎ２９７残基を他の残基に変異させることにより、例えば、Ｎ２９７Ａおよび／または隣接アミノ酸、例えば、２９８を変異させ、それによりＮ２９７のグリコシル化を低減させることにより、阻止され得る。
これに加えてまたはこれとは別に、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセクトＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの別のタイプのグリコシル化を有する抗体が製造され得る。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣを増加することが示されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることにより、達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞は、文献に記載されており、ここに記載する組み換え抗ＴＩＭ３抗体を発現し、それにより、グリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Hanai et al. のＥＰ１,１７６,１９５は、細胞株で発現される抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載する。PrestaのＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースのＡｓｎ(２９７)結合炭水化物への結合能が減少し、同様にその宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化をもたらすバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｄ ３細胞を記載する(Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照)。Umana et al. のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、エンジニアリングされた細胞株で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性増加をもたらす バイセクトＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(ｌ,４)－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するようにエンジニアリングされた細胞株を記載する(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180も参照)。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の他の修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を延長するためにペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントを、一般にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントと結合する条件下で反応させる。ある実施態様において、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により行われる。ここで使用する用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(ＣＩ－ＣＩＯ)アルコキシ－またはアリールオキシ－ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質の誘導体化に使用されているＰＥＧのあらゆる形態を包含することが意図される。ある実施態様において、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al. のＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４参照。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域は配列番号１３０～１３３からなる群から選択される。
VIII. 抗体物理的性質
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ここに記載のものは、実施例に記載する特徴などの、ここに記載する特定の抗ＴＩＭ３抗体の物理的特徴の一部またはすべてを有する。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、軽鎖または重鎖可変領域に１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性増加または抗原結合改変による抗体のｐＫ改変がもたらされ得る(Marshall et al., (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al., (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで生じることが知られている。ある例で、抗ＴＩＭ３抗体は可変領域グリコシル化を含まない。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体の選択またはグリコシル化領域内の残基の変異により達成され得る。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化はＮ－ＧまたはＤ－Ｇ配列で生じ、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を減少させるイソアスパラギン酸残基の形成に至る(イソアスパラギン酸効果)。
各抗体は、一般に６～９.５のｐＨ範囲に入る固有の等電点(ｐｉ)を有する。ＩｇＧ１抗体のｐｉは一般に７～９.５のｐＨ範囲に入り、ＩｇＧ４抗体のｐｉは一般に６～８のｐＨ範囲に入る。ｐｉが通常の範囲外の抗体は、インビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性があるとの推測がある。故に、抗ＴＩＭ３抗体は、通常範囲内のｐｉ値を含み得る。これは、通常範囲内のｐｉを有する抗体の選択または荷電表面残基の変性により達成され得る。
各抗体は特徴的融解温度を有し、高い融解温度はインビボでの高い全体的安定性を示す(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、ＴＭｉ(最初のアンフォールディングの温度)は６０℃より高い、６５℃より高いまたは７０℃より高い可能性がある。抗体の融点は示差走査熱量測定(Chen et al., (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52)または円偏光二色性(Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)を使用して測定できる。
ある実施態様において、急速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ－ＭＳ(Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32)を使用して測定できる。
ある実施態様において、望まない免疫応答および／または改変されたまたは不都合な薬物動態を誘発し得る凝集効果が最小の抗体が選択される。一般に、抗体は、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下の凝集が許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含む技術で測定され得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、セクション(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)、(VII)、(VIII)および(IX)に記載の構造および性質の組み合わせを有する。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、本明細書の他の箇所に記載された１以上の機能的性質と組み合わせて、セクションＩおよび／またはVIに記載のとおり抗体１３Ａ３、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８、９Ｆ６、１４Ｈ７、２３Ｂ３および／またはＴＩＭ３.２－ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５と交差競合し、セクションIIIに記載のとおり生殖系列配列由来であり、セクションＶに記載のとおり保存的変異を有しおよび／またはセクションIVに記載のとおりセクションＩおよびIIの抗ＴＩＭ３抗体と相同性を有する。
IX. 抗体をエンジニアリングする方法
上記のとおり、ここに開示するＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＴＩＭ３抗体を使用して、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合する定常領域の修飾により、新規抗ＴＩＭ３抗体を作製できる。故に、ここに記載する他の態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の構造的特性を使用して、ヒトＴＩＭ３およびカニクイザルＴＩＭ３への結合などのここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の機能的性質の少なくとも１つを保持する、構造的に関連する抗ＴＩＭ３抗体を作製する。例えば、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８、９Ｆ６、１３Ａ３、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５の何れかのＣＤＲ領域の１以上を、既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み換えにより組み合わせ、上記のとおり、さらなる、組み換え技術によって作られた、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を作製できる。他のタイプの修飾は、先のセクションに記載のものを含む。操作方法のための出発物質は、ここに提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上またはそのＣＤＲ領域の１以上である。操作抗体を作製するために、ここに提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上またはそのＣＤＲ領域の１以上を有する抗体を実際作製する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列に由来する「第二世代」配列を作製し、次いで「第二世代」配列を製造し、タンパク質として発現させる。
従って、ここに提供されるのは、抗ＴＩＭ３抗体を製造する方法であって、
(ａ)(ｉ)配列番号４１～４５および４６９からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号４６～５２、１２２～１２５、４１３、４１５および４７０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号５３～５９、１２６～１２９、４１４、４１６および４７１からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および(ii)配列番号６４、６５および４７２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号６６、６７および４７３からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号６８～７１、４１９および４７４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し；
(ｂ)重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を提供し；そして
(ｃ)改変抗体配列をタンパク質として発現する
ことを含む、方法である。
標準的分子生物学技術を、改変抗体配列の製造および発現に使用できる。ある実施態様において、改変抗体配列によりコードされる抗体は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の機能的性質の一つ、一部またはすべてを保持し、それは次のものを含む。
(１)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性ヒトＴＩＭ３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、実施例に記載のBiacoreで測定して、可溶性カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１００nM以下(例えば、０.０１nM～１００nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～１μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合ヒトＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(５)例えば、実施例に記載のフローサイトメトリーで測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、２０μg／mL以下(例えば、０.０１μg／mL～２０μg／mL)のＥＣ５０で結合する；
(６)例えば、実施例に記載のスキャチャード解析で測定して、膜結合カニクイザルＴＩＭ３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM～１０nM)のＫＤで結合する；
(７)例えば、実施例に記載のとおり、(ｉ)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)のＩＦＮ－γ産生を増加させるおよび／または(ii)ＴＩＭ３発現Ｔ細胞(例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬ)の増殖を増大させることにより証明されるとおり、Ｔ細胞活性化(例えば、ＴＩＭ３の阻害効果の遮断または低減により)を誘導または増強する；
(８)例えば、実施例に記載のとおり、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイでＴ細胞増殖を刺激する；
(９)例えば、実施例に記載のとおり、例えば、ＰＳ－ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイにより測定して、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３への結合を阻害する；
(１０)細胞のＴＩＭ３に結合したとき、細胞表面ＴＩＭ３を内在化または下方制御しない；
(１１)例えば、実施例に記載のとおり、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン(配列番号２９０)の次の領域(ａ)CPVFECG(配列番号２９６)；(ｂ)RIQIPGIMND(配列番号２９８)；(ｃ)CPVFECGおよびRIQIPGIMND(それぞれ配列番号２９６および２９８)；および(ｄ)WTSRYWLNGDFR(配列番号２９７)の一つに結合する；
(１２)野生型ヒトＴＩＭ３、例えば、実施例に記載への結合と比較して、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０(配列番号２８６において番号付け(図２５))の１以上が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３に対して結合が減少している；
(１３)１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３およびＴＩＭ３.２５、例えば、実施例に記載の何れかのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について何れかの方向でまたは両方向で競合する；
(１４)例えば、実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)に結合する；
(１５)Ｘ線結晶学(例えば、実施例に記載；番号付けは配列番号２８６による(図２５))により決定して、ヒトＴＩＭ３の次のアミノ酸Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０そして所望によりＴ７０および／またはＩ１１２の少なくとも５、１０、１５、２０または全てと相互作用する重鎖および／または軽鎖可変領域を有する；
(１６)(ａ)野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比較して、アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０そして所望によりＤ１０４およびＱ１１３(番号付けは配列番号２８６による(図２５))の１、２、３、４、５、６、７、８または９が他のアミノ酸で置換されているヒトＴＩＭ３への結合が減少している；(ｂ)実施例に記載のとおり、ＨＤＸ－ＭＳにより決定して、49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)および119NDEKFNLKL127(配列番号３７３)に結合する；および／または(ｃ)例えば、実施例に記載のとおり、１３Ａ３またはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の結合と競合または交差遮断する；
(１７)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－8Ｍ、２×１０－8Ｍ、１０－8Ｍまたは５×１０－9Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１８)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；
(１９)実施例２２に記載の方法で測定して、カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－7Ｍ、２×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する；および／または
(２０)実施例２２に記載の方法で測定して、ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－8Ｍ、５×１０－8Ｍまたは１０－8Ｍ以下のＫＤで結合する。
改変抗体は、上記(１)～(１６)に示す機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または全てを示し得る。改変抗体の機能的性質は、当分分野で利用可能および／または実施例に示すようなここに記載する標準アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ)を使用して評価し得る。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の操作方法のある実施態様において、変異を、抗ＴＩＭ３抗体コード配列全体または一部に無作為にまたは選択的に導入でき、得られた修飾抗ＴＩＭ３抗体をここに記載する結合活性および／または他の機能的性質についてスクリーニングできる。変異方法は文献に記載されている。例えば、ShortのＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはそれらの組み合わせにより抗体変異を作製し、スクリーニングする方法を記載する。あるいは、Lazar et al. のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、抗体の生理化学的性質の最適化のためのコンピューターによるによるスクリーニング方法を使用する方法を記載する。
Ｘ. 核酸分子
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は細胞全体に、細胞溶解物にまたは部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術によりの細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸(例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、天然で単離ＤＮＡに結合する染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から精製されて離されたとき、「単離された」または「実質的に純粋とされた」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。ここに記載する核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでも、含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
ここに記載する核酸は、標準的分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、下にさらに記載するヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから製造したハイブリドーマ)により発現された抗体について、ハイブリドーマにより製造された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレー技術を使用)から得る抗体について、抗体をコードする核酸はライブラリーから回収され得る。
ここに記載する一部核酸分子は、１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５抗体の何れかのＶＨおよびＶＬ配列である。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号１６７～１７３、２４５～２５４、３５９および４２０～４２２に示す。１３Ａ３、１７Ｃ３および３Ｇ４のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号１９３に示す。８Ｂ９、８Ｃ４および１７Ｃ８のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号１９４に示す。９Ｆ６のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号１９４～１９６に示す。１４Ｈ７のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号４２７に示す。２３Ｂ３のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号１９３および４２８に示す。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３の重鎖配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号１３４～１６１、２０５～２４４、３５５～３５８および４３０～４４１に示す。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３の軽鎖配列をコードするＤＮＡ配列の例は配列番号１６２～１６６および４４２に示す。
１３Ａ３.ＩｇＧ１.１および１３Ａ３.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１６７および１９３として示す。１３Ａ３.ＩｇＧ１.１および１３Ａ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１３４および１４８として示し、１３Ａ３.ＩｇＧ１.１および１３Ａ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６２として示す。
８Ｂ９.ＩｇＧ１.１および８Ｂ９.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１６８および１９４として示す。８Ｂ９.ＩｇＧ１.１および８Ｂ９.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１３５および１４９として示し、８Ｂ９.ＩｇＧ１.１および８Ｂ９.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６３として示す。
８Ｃ４.ＩｇＧ１.１および８Ｃ４.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１６９および１９４として示す。８Ｃ４.ＩｇＧ１.１および８Ｃ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１３６および１５０として示し、８Ｃ４.ＩｇＧ１.１および８Ｃ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６３として示す。
１７Ｃ３.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ３.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１７０および１９３として示す。１７Ｃ３.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１３７および１５１として示し、１７Ｃ３.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６２として示す。
９Ｆ６.ＩｇＧ１.１および９Ｆ６.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１７１および１９７として示す。９Ｆ６.ＩｇＧ１.１および９Ｆ６.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１３８および１５２として示し、９Ｆ６.ＩｇＧ１.１および９Ｆ６.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６６として示す。
３Ｇ４.ＩｇＧ１.１および３Ｇ４.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１７２および１９３として示す。３Ｇ４.ＩｇＧ１.１および３Ｇ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１３９および１５３として示し、３Ｇ４.ＩｇＧ１.１および３Ｇ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６２として示す。
１７Ｃ８.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ８.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１７３および１９４として示す。１７Ｃ８.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ８.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１４０および１５４として示し、１７Ｃ８.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ８.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６３として示す。
１４Ｈ７.ＩｇＧ１.１および１４Ｈ７.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号４２０および４２７として示す。１４Ｈ７.ＩｇＧ１.１および１４Ｈ７.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号４３０および４３２として示し、１４Ｈ７.ＩｇＧ１.１および１４Ｈ７.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号４４２として示す。
２３Ｂ３.ＩｇＧ１.１および２３Ｂ３.ＩｇＧ１.３(同じ可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号４２１および１９３として示す。２３Ｂ３.ＩｇＧ１.１および２３Ｂ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号４３２および４３４として示し、２３Ｂ３.ＩｇＧ１.１および２３Ｂ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１６２として示す。
上記例示的核酸は、配列番号２６７～２７１および３６１に示すシグナルペプチドを含み得る。これらのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号２７２～２７６、３６２および３６３として示す。
ここに記載する核酸分子は、特異的配列、例えば、制限酵素認識配列除去またはコドン最適化のために修飾し得る。
１３Ａ３ ＩｇＧ１.１、８Ｂ９ ＩｇＧ１.１、８Ｃ４ ＩｇＧ１.１、１７Ｃ３ ＩｇＧ１.１、９Ｆ６ ＩｇＧ１.１、３Ｇ４ ＩｇＧ１.１、１７Ｃ８ ＩｇＧ１.１、１４Ｈ７ ＩｇＧ１.１、２３Ｂ３ ＩｇＧ１.１および／またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５ ＩｇＧ１.１を製造する方法は、シグナルペプチドと共に重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、例えば、１３Ａ３ ＩｇＧ１.１について、それぞれ配列番号２６９および２６８を含む細胞株で重鎖および軽鎖を発現させることを含み得る。１３Ａ３ ＩｇＧ１.３、８Ｂ９ ＩｇＧ１.３、８Ｃ４ ＩｇＧ１.３、１７Ｃ３ ＩｇＧ１.３、９Ｆ６ ＩｇＧ１.３、３Ｇ４ ＩｇＧ１.３、１７Ｃ８ ＩｇＧ１.３、１４Ｈ７ ＩｇＧ１.３、２３Ｂ３ ＩｇＧ１.３および／またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５ ＩｇＧ１.３を製造する方法は、シグナルペプチドと共に重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、例えば、１３Ａ３ ＩｇＧ１.３について、それぞれ配列番号２７４および２７３を含む細胞株で重鎖および軽鎖を発現させることを含み得る。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞はここに包含される。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを、標準組み換えＤＮＡ技術によりさらに操作して、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換し得る。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可撓性リンカーなどの他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合する。本文脈で使用する用語「操作可能に結合」は、２つのＤＮＡフラグメントが、２つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように結合されることを意図することを意味する。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを、重鎖定常領域(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)をコードする他のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを操作可能に結合することにより完全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これら領域を包含するＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合できる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを操作可能に結合することにより完全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これら領域を包含するＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ－およびＶＬコードＤＮＡフラグメントを、ＶＨおよびＶＬ配列が隣接一本鎖タンパク質として発現でき、可撓性リンカーによりＶＬおよびＶＨ領域が連結されるように、可撓性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ)３をコードする他のフラグメントと操作可能に結合される(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照)。
またここに提供されるのは、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８、９Ｆ６、１３Ａ３、１４Ｈ７、２３Ｂ３およびＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５抗体の何れかのものと相同であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子である。核酸分子の例は、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８、９Ｆ６、１３Ａ３、１４Ｈ７、２３Ｂ３またはＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５抗体の何れかのＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする。またここに提供されるのは、例えば、コドン最適化のために保存的置換(すなわち、核酸分子への翻訳により得られたアミノ酸配列を変えない置換)を有する核酸分子である。
また提供されるのは、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体などの抗ＴＩＭ３抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードする核酸であり、該核酸は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列の何れかと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
また提供されるのは、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体などの抗ＴＩＭ３抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸であり、該核酸は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列の何れかと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列をコードする。
XI. 抗体製造
ここに記載するモノクローナル抗ＴＩＭ３抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)に記載の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術などの多くの既知技術を使用して製造できる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原則として、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレー技術などの、モノクローナル抗体を製造する他の技術も用いることができる。
ハイブリドーマ製造のための好ましい動物系はマウス系である。マウスでのハイブリドーマ製造は、極めて十分に確立されている方法である。免疫化プロトコールおよび融合のための免疫化脾細胞を単離する技術は当分野で知られる。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合方法も知られる。
ここに記載するキメラまたはヒト化抗ＴＩＭ３抗体は、上記のとおり製造したマウスモノクローナル抗体に基づき製造され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得て、標準的分子生物学技術を使用して非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むようにエンジニアリングする。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を、当分野で知られる方法を使用してヒト定常領域に結合できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体を製造するために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに導入できる(例えば、Winterの米国特許５,２２５,５３９およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなＴＩＭ３に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを使用して製造できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、ここでそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称し、集合的に「ヒトＩｇマウス」と称するマウスを含む。
ＨＵＭＡＢ－マウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、内因性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的変異と共に、非再配列ヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859参照)。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現が減少し、免疫化に応答して、導入ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラススイッチングおよび体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧＫモノクローナルを製造する(Lonberg, N. et al. (1994), supra; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546にレビュー)。ＨｕＭａｂマウスの製造および使用ならびにこのようなマウスにより担持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851に記載される。全てLonbergおよびKayの米国特許５,５４５,８０６；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,８７７,３９７；５,６６１,０１６；５,８１４,３１８；５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９；Surani et al.の米国特許５,５４５,８０７；全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；およびKorman et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４もさらに参照のこと。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスなどの導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを使用して誘導される。このようなマウスは、ここでは「ＫＭマウス」と称し、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳述される。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の誘導に使用され得る。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と称する別のトランスジェニック系が使用され得る；このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許５,９３９,５９８；６,０７５,１８１；６,１１４,５９８；６,１５０,５８４および６,１６２,９６３に記載される。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソミック動物系が当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の誘導に使用され得る。例えば、「ＴＣマウス」と称されるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体両者を担持するマウスが使用され得る；このようなマウスはTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシも文献に記載され(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の誘導３抗体のために文献に記載されるさらなるマウス系は、(ｉ)キメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)がマウスで誘導され、次いで、標準的組み換えＤＮＡ技術により完全ヒト抗体に変換されるように、内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えにより、内因性マウス定常領域と操作可能に結合したヒト重鎖および軽鎖可変領域に置き換えられている、VELOCLMMUNE(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)；および(ii)マウスは非再配列ヒト重鎖可変領域だけでなく、単一再配列ヒト共通軽鎖可変領域を含む、ＭＥＭＯ(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)を含む。このようなマウスおよび抗体誘導のためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載される。
ここに記載するヒトモノクローナル抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーのスクリーニングのためにファージディスプレー方法を使用しても製造できる。ヒト抗体を単離するこのようなファージディスプレー方法は当分野で確立されている。例えばLadner et al.の米国特許５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；および５,５７１,６９８；Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１７；McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８および６,１７２,１９７；およびGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３；６,５２１,４０４；６,５４４,７３１；６,５５５,３１３；６,５８２,９１５および６,５９３,０８１参照。
ここに記載するヒトモノクローナル抗ＴＩＭ３抗体はまた、ヒト免疫細胞が免疫化によりヒト抗体応答が生じるように再構成されている、ＳＣＩＤマウスを使用しても製造できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６および５,６９８,７６７に記載される。
XI.Ａ. 免疫化
ＴＩＭ３に対する完全ヒト抗体を産生するため、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス(例えば、ＨＣｏｌ２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を、他の抗原について、例えば、Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４により記載されるとおり、ＴＩＭ３抗原および／またはＴＩＭ３またはそのフラグメントを発現する細胞の精製または富化により免疫化できる。あるいは、マウスをヒトＴＩＭ３またはそのフラグメントをコードするＤＮＡで免疫化し得る。ある実施態様において、マウスは、最初の注入時６～１６週齢である。例えば、組み換えＴＩＭ３抗原の精製または富化調製物(５～５０μg)を、ＨｕＭＡｂマウスの腹腔内免疫化に使用し得る。ＴＩＭ３抗原の精製または富化調製物を用いる免疫化が抗体をもたらさない場合、マウスを免疫応答を促進するためにＴＩＭ３発現細胞、例えば、細胞株でも免疫化し得る。細胞株の例は、ＴＩＭ３を過発現する安定なＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞株を含む。
種々の抗原での経験の蓄積により、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスがＲｉｂｉ’ｓアジュバント中の抗原でまず腹腔内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)免疫化し、続いて隔週Ｒｉｂｉ’ｓアジュバント中の抗原ででＩＰ／ＳＣ免疫化(最大計１０回)したとき最良に応答することが示されている。免疫応答を、後眼窩採血により得た血漿サンプルで免疫化プロトコールの経過中モニターできる。血漿をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ(下記のとおり)でスクリーニングし、抗ＴＩＭ３ヒト免疫グロブリンの十分な力価があるマウスを融合に使用できる。マウスを、屠殺３日前に抗原を静脈内によりブーストし、脾臓およびリンパ節除去をし得る。各免疫化で２～３融合を実施する必要があり得ると予測される。６～２４マウスが、一般に各抗原で免疫化される。通常、ＨＣｏ７、ＨＣｏｌ２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏｌ２両者の導入遺伝子を、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する単一マウス(ＨＣｏ７／ＨＣｏｌ２)に育種し得る。
XI.Ｂ. ＴＩＭ３に対するモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマの製造
ここに記載するヒトモノクローナル抗ＴＩＭ３抗体を製造するハイブリドーマを製造するために、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合し得る。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体産生についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１)にＰＥＧを用いて融合する。細胞を、平底マイクロタイタープレートに播種し、続いて選択培地でインキュベーションし得る。数週間後、細胞を培地で培養し得る。次いで、個々のウェルをＥＬＩＳＡでヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、通常１０～１４日後に培地を観察する。抗体分泌ハイブリドーマを置き換え、再びスクリーニングし、なおヒトＩｇＧに陽性であるならば、モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローン化し得る。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのため組織培養培地で少量の抗体を製造する。
ヒトモノクローナル抗体精製のため、選択ハイブリドーマを２Ｌスピナーフラスコでモノクローナル抗体精製のために増殖し得る。上清を濾過し、濃縮して、プロテインＡ－セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)で親和性クロマトグラフィーし得る。溶出ＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより確認して、純度を確実にすることができる。緩衝液溶液をＰＢＳに交換し、１.４３減衰係数を使用してＯＤ２８０により濃度を決定し得る。モノクローナル抗体を等分し、貯蔵し得る。
XI.Ｃ. ＴＩＭ３に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの製造
抗体を、当分野で周知のとおり、例えば、組み換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで製造し得る(Morrison, S. (1985)Science 229: 1202)。
例えば、抗体またはそのフラグメントを発現するために、一部または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的分子生物学技術(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング)により得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に結合するように、発現ベクターに挿入し得る。ここで、用語「操作可能に結合」は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列を、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する機能を発揮するように、ベクターにライゲートされることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別のベクターに挿入しても、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入してもよい。抗体遺伝子は、標準方法により発現ベクターに挿入される(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクターの相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないならば平滑末端ライゲーション)。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作可能に結合し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に結合するように、既に所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をコードする発現ベクターにそれらを挿入することにより、意図する抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を製造できる。
これに加えてまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム内で結合するように、ベクターにクローン化し得る。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であり得る。
ある実施態様において、ヒト抗体重鎖および軽鎖からの次のシグナルペプチドが使用され得る：MDWTWRVFCLLAVAPGAHS(配列番号２６７)；METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)；MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号２６９)；MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(配列番号２７０)；MDMRVPAQLLGLLLWLPGARC(配列番号２７１)またはMRAWIFFLLCLAGRALA(配列番号３６１)。ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の何れかの発現に使用するシグナル配列は配列番号３６１である。抗ＴＩＭ３抗体の重鎖および軽鎖を、それをクローン化したハイブリドーマからの各鎖に結合した各シグナル配列と発現させ得る。下記は、それをクローン化したハイブリドーマに存在する種々の抗ＴＩＭ３抗体のシグナル配列であり、該シグナル配列が同じ抗体または他の抗体の発現に使用され得る：
(ｉ)１３Ａ３ ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号２６９)
(ii)１３Ａ３ ＶＨシグナル配列の核酸配列：ＡＴＧAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号２７４)
(iii)１３Ａ３ ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)
(iv)１３Ａ３ ＶＬシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７３)
(ｖ)８Ｂ９ ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号２６９)
(vi)８Ｂ９ ＶＨシグナル配列の核酸配列：ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号２７４)
(vii)８Ｂ９ ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)
(viii)８Ｂ９ ＶＬシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７３)
(ix)８Ｃ４ ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列:MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号２６９)
(ｘ)８Ｃ４ ＶＨシグナル配列の核酸配列：ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号２７４)
(xi)８Ｃ４ ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)
(xii)８Ｃ４ ＶＬシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７３)
(xiii)１７Ｃ３ ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MDWTWRVFCLLAVAPGAHS(配列番号２６７)
(xiv)１７Ｃ３ ＶＨシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７２)
(xv)１７Ｃ３ ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)
(xvi)１７Ｃ３ ＶＬシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７３)
(xvii)９Ｆ６ ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(配列番号２７０)
(xviii)９Ｆ６ ＶＨシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７５)
(xix)９Ｆ６ ＶＬ１シグナル配列のアミノ酸配列：MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号２７１)
(xx)９Ｆ６ ＶＬ１シグナル配列の核酸配列：ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号２７６)
(xxi)９Ｆ６ ＶＬ２およびＶＬ３シグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)
(xxii)９Ｆ６ ＶＬ２およびＶＬ３シグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７３)
(xxiii)３Ｇ４ ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：ＭEFGLSWVFLVAIIKGVQC(配列番号２７０)
(xxiv)３Ｇ４ ＶＨシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７５)
(xxv)３Ｇ４ ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列:METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)
(xxvi)３Ｇ４ ＶＬシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７３)
(xxvii)１７Ｃ８ ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(配列番号２７０)
(xxviii)１７Ｃ８ ＶＨシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７５)
(xxix)１７Ｃ８ ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号２６８)
(xxx)１７Ｃ８ ＶＬシグナル配列の核酸配列：ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号２７３)。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体(例えば、ＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８)の重鎖および軽鎖を、それらをクローン化したハイブリドーマに存在するものと異なるシグナル配列を用いてエンジニアリングし得る。このような配列の例は、次のものを含むが、これらに限定されない。
(ｉ)重鎖のシグナル配列の核酸配列：ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGGCCGGGAGAGCGCTCGCA(配列番号３６２)
(ii)軽鎖のシグナル配列の核酸配列：ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGGCCGGGCGCGCCTTGGCC(配列番号３６３)
(iii)重鎖および軽鎖のシグナル配列のアミノ酸配列：MRAWIFFLLCLAGRALA(配列番号３６１)。
抗体鎖遺伝子に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子を制御する制御配列を担持し得る。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。このような制御配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、トランスフォームする宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子によることは、当業者に明らかである。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要な後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオー由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス制御配列が使用され得る。なおさらに、制御要素は、ＳＶ４０早期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１の長い末端反復からの配列を含むＳＲａプロモーター系などの異なる源からの配列からなる((Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子などのさらなる配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を促進する(例えば、全てAxel et alの米国特許４,３９９,２１６、４,６３４,６６５および５,１７９,０１７参照)。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(ｄｈｆｒ－宿主細胞でメトトレキサート選択／増幅と共に使用)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のため)を含む。
軽鎖および重鎖発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術で宿主細胞にトランスフェクトされる。多くの形態に使用される用語「トランスフェクション」は、外因性ＤＮＡの原核生物または真核生物宿主細胞への導入に一般に使用される多くの技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を原核生物または真核生物宿主細胞で発現させることが理論的に可能であるが、真核生物細胞および最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での高体発現が、このような真核生物細胞および特に哺乳動物細胞が、適切に折り畳まれたおよび免疫学的に活性な抗体を集合かつ分泌する可能性が原核生物細胞より高いため、最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収量の活性抗体産生に無効であることが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13)。
ここに記載する組み換え抗ＴＩＭ３抗体を発現するためのある哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載、例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 759:601-621に記載のとおり、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと使用)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞で使用するために、他の発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示のＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入したとき、抗体は、該宿主細胞を、宿主細胞で該抗体を発現させる、また、より好ましくは、宿主細胞を増殖している培養培地に抗体を分泌させるのに十分な時間培養することにより製造される。抗体を、標準的タンパク質精製法を使用して培養培地から回収し得る。
XII. アッセイ
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を、例えば、標準ＥＬＩＳＡでヒトＴＩＭ３への結合について試験し得る。簡潔には、マイクロタイタープレートを精製ＴＩＭ３で被覆し、次いでウシ血清アルブミンで遮断する。抗体の希釈物(例えば、ＴＩＭ３免疫化マウスからの血漿の希釈物)を各ウェルに加え、インキュベートする。プレートを洗浄し、二次試薬(例えば、ヒト抗体について、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)コンジュゲートヤギ－抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬)とインキュベートする。洗浄後、プレートを展開し、分光光度計で分析し得る。次いで、免疫化マウスからの血清をさらにフローサイトメトリーで、ＴＩＭ３を発現しない対照細胞株ではなく、ヒトＴＩＭ３発現細胞株への結合についてスクリーニングし得る。すなわち、抗ＴＩＭ３抗体の結合を、ＴＩＭ３発現ＣＨＯ細胞と抗ＴＩＭ３抗体をインキュベートすることにより評価できる。細胞を洗浄でき、結合を抗ヒトＩｇＧ Ａｂで検出できる。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施できる。最高力価を発揮するマウスが融合に使用され得る。
上記ＥＬＩＳＡアッセイが抗体、故に、ＴＩＭ３免疫原と正の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングに使用され得る。次いで、ＴＩＭ３と高親和性で結合する抗体を産生するハイブリドーマをサブクローン化し、さらに特徴づけし得る。親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡによる)各ハイブリドーマからの１クローンを、次いで、細胞バンクの作製および抗体精製のために選択し得る。
抗ＴＩＭ３抗体精製のために、選択ハイブリドーマをモノクローナル抗体精製のために増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮して、親和性クロマトグラフィーし得る。溶出ＩｇＧを、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認して、純度を確実にし得る。緩衝液溶液を交換し、濃度を決定し得る。モノクローナル抗体を等分し、貯蔵し得る。
選択抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するかを確認するため、各抗体を、市販の試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチニル化し得る。ビオチニル化ＭＡｂ結合をストレプトアビジン標識プローブで検出し得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、上記ＴＩＭ３被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して、実施し得る。
精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して実施し得る。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを１μg／mlの抗ヒト免疫グロブリンで、一夜、４℃で被覆する。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを１μg／ml以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、環境温度で１～２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼ－コンジュゲートプローブと反応させる。プレートを上記のとおり展開および分析する。
ＴＩＭ３を発現する生存細胞へのモノクローナル抗体の結合を試験するために、実施例に記載のとおり、フローサイトメトリーが使用され得る。すなわち、膜結合ＴＩＭ３発現細胞株(標準増殖条件下増殖)を、種々の濃度のモノクローナル抗体と、０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳと、４℃で１時間インキュベートする。洗浄後、細胞をフルオレセイン標識抗ＩｇＧ抗体と、一次抗体染色と同じ条件下で反応させる。サンプルを、単一細胞をゲーティングするための光および側方散乱性質を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置により分析して、標識抗体の結合が決定される。蛍光顕微鏡を使用する別のアッセイが(フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはその代わりに)使用され得る。細胞を正確に上記のとおりに染色し、蛍光顕微鏡で試験し得る。この方法により個々の細胞が可視化できるが、抗原密度により感受性が減少し得る。
さらに抗ＴＩＭ３抗体をＴＩＭ３抗原との反応性についてウェスタンブロッティングにより試験し得る。すなわち、ＴＩＭ３発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清で遮断し、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ＩｇＧ結合を抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤で展開できる(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)。
種々の抗ＴＩＭ３抗体の結合親和性、交差反応性および結合速度論を分析する方法は、当分野で知られる標準アッセイ、例えば、BIACORETM 2000 SPR装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するBIACORETM表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を含む。
多様なアッセイが抗ＴＩＭ３抗体(例えば、種々の抗ＴＩＭ３抗体の比較に使用され得る)の生物学的活性の特徴づけに使用でき、例えば、ここに記載のものである：
(１)ヒトドナーのＰＢＭＣから得た精製Ｔ細胞を使用するアッセイなどのＴ細胞活性化アッセイ。アッセイを総Ｔ細胞またはその下位集団、例えば、Ｔｈ１細胞、Ｔ細胞毒性細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞で使用できるが、但し、それらはＴＩＭ３を発現する。活性化を、あるサイトカイン、例えば、インターフェロン－γまたはＩＬ－２の分泌レベルまたはＴ細胞増殖レベルの決定により測定し得る。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、ＴＩＭ３抗体のＴ細胞上のＴＩＭ３への結合は、ＴＩＭ３のＴＩＭ３リガンド(ＴＩＭ３推定リガンドはガレクチン－９、ＨＭＧＢ１、セマフォリン－４Ａ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＩＬＴ－４およびホスファチジルセリンを含む)への結合を阻止し、それによりＴ細胞のＴＩＭ３介在シグナル伝達を阻止し、それによりＴＩＭ３によるＴ細胞の負の制御を阻止する。Ｔｈ１アッセイ、ＴＩＬアッセイおよび混合リンパ球反応(ＭＬＲ)を含むアッセイの例は実施例に提供される；
(２)マクロファージ、例えば、Ｍ１またはＭ２マクロファージの刺激を測定するアッセイ；および
(３)ＴＩＭ３陽性骨髄細胞からの骨髄関連サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５の分泌を測定するアッセイ。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体はＴＩＭ３陽性骨髄細胞からのＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６およびＩＬ－２分泌を刺激するおよび／またはＩＬ－１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５分泌を阻害する。
一般に、免疫応答を阻害する薬剤の生物学的活性を試験するあらゆる方法、例えば、ＴＩＭ３に関連して文献(特許および特許出願を含む)に記載のものが、抗ＴＩＭ３抗体の生物学的活性の特徴づけに使用され得る。
XIII. イムノコンジュゲート、抗体誘導体および診断剤
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用され得て、この目的で、抗体(またはその抗原結合部分)を適切な検出可能剤とコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを形成し得る。診断目的で、適切な薬剤は検出可能剤であり、全身造影のための放射性同位体およびサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む。
ここに記載するＴＩＭ３抗体の何れかと結合し得る検出可能標識は、金コロイドなどの金属ゾルを含む粒子標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４タイプのペプチド性キレート剤と共に提示されるＩ125またはＴｃ99などの同位体、蛍光マーカー、発光性マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団ならびにある基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応などによる増幅後確認されるポリヌクレオチドタグを含む、インビトロ診断分野で現在使用される様々なタイプの何れかであり得る。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３－(４－(メトキシスピロ{１,２－ジオキセタン－３,２’－(５’－クロロ)トリシクロ{３.３.１.１３,７}デカン}－４－イル)フェニルホスフェート(ＣＳＰＤ)などの１,２－ジオキセタン基質の変換後の化学発光の存在または形成の測定により検出される酵素アルカリホスファターゼならびにＣＤＰおよびＣＤＰ－ＳＴＡＲ(登録商標)または当分野で周知の他の発光性基質、例えばテルビウム(III)およびユウロピウム(III)などの適当なランタノイドのキレートであり得る。検出手段は、選択標識により決まる。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適切なレベルで蓄積するならば、裸眼でまたは分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などの装置を使用して達成でき、全て標準実務にしたがう。
ある実施態様において、コンジュゲーション法は、実質的に(またはほぼ)非免疫原性である結合、例えば、ペプチド－(すなわち、アミド－)、スルフィド－、(立体障害)、ジスルフィド－、ヒドラゾン－およびエーテル結合をもたらす。これらの結合はほぼ非免疫原性であり、血清内で合理的な安定性をもたらす(例えば、Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244；ＷＯ２００９／０５９２７８；ＷＯ９５／１７８８６)。
部分および抗体の生化学的の性質によって、種々のコンジュゲーション戦略が用いられ得る。部分が天然に存在するまたは組み換えの５０～５００アミノ酸であるならば、タンパク質コンジュゲート合成の科学を記載する教科書に標準法があり、当業者は容易にそれに従い得る(例えば、Hackenberger, C. P. R. and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074参照)。ある実施態様において、マレインイミド部分と抗体または部分内のシステイン残基の反応が使用される。これは、例えば、抗体のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントが使用されるとき、特に好適なカップリング化学である。あるいは、ある実施態様において、抗体または部分のＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質、例えば、ＦａｂフラグメントのＣ末端修飾を記載のとおり実施し得る(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)。
一般に、部位特異的反応および共有結合は、天然アミノ酸の、存在する他の官能基の反応性と直交性の反応性のアミノ酸への変換に基づく。例えば、稀な配列関係内の特定のシステインを、アルデヒドに酵素変換し得る(Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427参照)。ある配列関係で天然アミノ酸とある酵素の特異的酵素反応性を使用することにより、所望のアミノ酸修飾を得ることも可能である(例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; and Protease-catalyzed formation of C-N bonds is used by Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403)。部位特異的反応および共有結合は、末端アミノ酸と適切な修飾剤の選択的反応によっても達成され得る。
部位特異的共有結合を達成するために、Ｎ末端システインとベンゾニトリルの反応性(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662参照)が使用され得る。
天然化学ライゲーションはＣ末端システイン残基も利用し得る(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96)。
ＵＳ６４３７０９５Ｂ１は、陰性荷電アミノ酸ストレッチ内のシステインと陽性荷電アミノ酸ストレッチに位置するシステインの速い反応に基づくコンジュゲーション法を記載する。
部分はまた合成ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ポリペプチドが化学合成されるとき、直交性の化学反応性を有するアミノ酸は合成中に取り込まれ得る(例えば、de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295参照)。多くの直交性官能基が議論され、合成ペプチドに導入され得るため、このようなペプチドとリンカーのコンジュゲーションは標準的化学である。
単標識ポリペプチドを得るため、１：１立体化学でのコンジュゲートを、クロマトグラフィーで他のコンジュゲーション副産物から分離し得る。この方法は、色素標識結合ペアメンバーおよび荷電リンカーの使用により促進され得る。この種の標識および高度に陰性の荷電結合ペアメンバーの使用により、分離に荷電および分子量差が使用され得るため、単コンジュゲートポリペプチドが、非標識ポリペプチドおよび１を超えるリンカーを担持するポリペプチドから容易に分離され得る。蛍光色素は、標識一価バインダーなどの非結合成分から複合体を精製するのに有用であり得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体に結合した部分は結合部分、標識部分および生物学的に活性な部分からなる群から選択される。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体はまた抗体－薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)などのイムノコンジュゲートを形成するように治療剤にもコンジュゲートされ得る。適当な治療剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡグルーブ結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核排出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはII阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および有糸***阻害剤を含む。ＡＤＣで、抗体および治療剤は、好ましくはペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーなどの開裂可能リンカーを介してコンジュゲートされる。ある実施態様において、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ(配列番号３００)、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許７,０８７,６００；６,９８９,４５２；および７,１２９,２６１；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；ＷＯ０８／０８３３１２；およびＷＯ０８／１０３６９３；米国特許公開２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；および２００６０２４７２９５に記載のとおり製造され得る。
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ここに記載のものは、ヒトＴＩＭ３、例えば、組織または組織サンプルにおけるヒトＴＩＭ３などのＴＩＭ３の検出にも使用され得る。抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーで、使用され得る。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体を、細胞、例えば、組織の細胞と、特異的結合が生じるのに適切な時間インキュベートし、次いで試薬、例えば、抗ＴＩＭ３抗体を検出する抗体を加える。アッセイの例は実施例に提供される。抗ＴＩＭ３抗体は完全ヒト抗体であってよくまたはヒト可変領域およびマウス定常領域またはその一部を有する抗体などのキメラ抗体であってよい。サンプル(細胞または組織サンプル)のＴＩＭ３、例えば、ヒトＴＩＭ３を検出する方法の例は、(ｉ)サンプルと抗ＴＩＭ３抗体を、抗ＴＩＭ３抗体とサンプルのＴＩＭ３の特異的結合が生じるのに十分な時間接触させ、そして(２)サンプルと検出試薬、例えば、抗ＴＩＭ３抗体のＦｃ領域へなど抗ＴＩＭ３抗体に特定期に結合する抗体を接触させ、それによりＴＩＭ３結合を抗ＴＩＭ３抗体により検出することを含む。抗体および／または検出試薬とのインキュベーション後に洗浄工程が含まれ得る。これらの方法で使用する抗ＴＩＭ３抗体は、別の検出試薬が使用され得るため、標識または検出試薬に結合している必要はない。
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、単剤療法または組み合わせ治療のための他の使用は、本明細書の他の箇所に、例えば、組み合わせ処置に関するセクションに提供される。
XIV. 二重特異性分子
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、二重特異性分子形成のために使用され得る。抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)で誘導体化または結合して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生し得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体を、ここに記載するタンパク質(例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲまたはＬＡＧ－３に対する抗体)などの組み合わせ処置の可能性のある標的として使用され得る何れかのタンパク質と特異的に結合する抗体またはｓｃＦｖに結合させ得る。ここに記載する抗体は、実際、２を超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異的分子を産生するために、１を超える他の機能的分子で誘導体化または結合でき；このような多特異的分子はまたここに使用する用語「二重特異性分子」に包含されることが意図される。ここに記載する二重特異性分子を作製するために、ここに記載する抗体を、二重特異性分子がもたらされるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体などの１以上の他の結合分子と機能的に結合(例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合的結合またはその他)させ得る。
従って、ここに提供されるのは、少なくとも１つのＴＩＭ３に対する第一結合特異性および第二標的エピトープに対する第二結合特異性を含む、二重特異性分子である。二重特異性分子が多特異的であるここに記載するある実施態様において、分子は、さらに第三結合特異性を含むことができる。
ある実施態様において、ここに記載する二重特異性分子は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)を含む、少なくとも１つ抗体または抗体そのフラグメントを結合特異性として含む。抗体はまたLadner et al. 米国特許４,９４６,７７８に記載のとおり、軽鎖または重鎖二量体またはＦｖなどの何らかのその最小フラグメントまたは一本鎖構築物であり得る。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、ここに記載する二重特異性分子に用いられ得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
ここに記載する二重特異性分子は、当分野で知られる方法を使用して、構成結合特異性をコンジュゲートすることにより製造され得る。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に産生し、次いで互いにコンジュゲートさせ得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、共有コンジュゲーションのために多様なカップリングまたは架橋剤が使用され得る。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’－ジチオビス(２－ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ－フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ－スクシンイミジル－３－(２－ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４－(Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサン－１－カルボキシレート(スルホ－ＳＭＣＣ)(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照)を含む。他の方法は、Paulus (1985)Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985)Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載のものを含む。あるコンジュゲート剤はＳＡＴＡおよびスルホ－ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
結合特異性が抗体であるとき、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートされ得る。ある実施態様において、コンジュゲーション前に、ヒンジ領域を修飾して、奇数、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含むようにする。
あるいは、両結合特異性を同じベクターでコードし、同じ宿主細胞で発現および集合させ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、ｍＡｂ×(ｓｃＦｖ)２、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき特に有用である。二重特異性抗体は各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含み得る。ここに記載する二重特異性分子は、一つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を製造する方法は、例えば米国特許５,２６０,２０３；米国特許５,４５５,０３０；米国特許４,８８１,１７５；米国特許５,１３２,４０５；米国特許５,０９１,５１３；米国特許５,４７６,７８６；米国特許５,０１３,６５３；米国特許５,２５８,４９８；および米国特許５,４８２,８５８に記載される。
二重特異性分子のその特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイなどの当分野で認識される方法を使用して決定され得る。これらアッセイの各々は、一般に特に興味深いタンパク質－抗体複合体の存在を、興味深い複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を使用して検出する。
XV. 組成物
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤された、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の一つまたは組み合わせまたは他の標的に対する抗体またはその抗原結合部分との組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、ここに記載する抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子の一つまたは組み合わせ(例えば、２以上の異なる)を含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合するまたは相補的活性を有する、抗体(またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性)の組み合わせを含み得る。
ある実施態様において、組成物は、抗ＴＩＭ３抗体を少なくとも１mg／ml、５mg／ml、１０mg／ml、５０mg／ml、１００mg／ml、１５０mg／ml、２００mg／ml、１～３００mg／mlまたは１００～３００mg／mlの濃度で含む。
ここに記載する医薬組成物は組み合わせ治療で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与し得る。例えば、組み合わせ治療は、少なくとも１つの他の抗癌および／または免疫調節、例えば、Ｔ細胞刺激(例えば、活性化)剤と組み合わせたここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を含み得る。組み合わせ治療で使用され得る治療剤の例は、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の使用のセクションに詳細に記載する。
ある実施態様において、ここに開示する治療組成物は、癌の処置に使用する他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤は、例えば、化学療法薬物、小分子薬物またはある癌に対する免疫応答を刺激する抗体を含みうる。ある例で、治療組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＯＸ４０(ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる)抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体またはこれらの何れかの組み合わせの１以上を含み得る。
ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である何れかの溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。ある実施態様において、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または点滴)に適する。投与経路により、活性化合物、すなわち、抗体、イムノコンジュゲートまたは二重特異性分子を、酸および化合物を不活性化し得る他の自然条件から保護する物質でコーティングし得る。
ここに記載する医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、何らかの望まない毒性効果を付与しない塩をいう(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの非毒性無機酸ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸由来のものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属ならびにΝ,Ν’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミン由来のものを含む。
ここに記載する医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水可溶性抗酸化剤；(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなどの油可溶性抗酸化剤；および(３)クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤を含む。
ここに記載する医薬組成物に用いられ得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)および適当なそれらの混合物、植物油、例えばオリーブ油および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物の存在の阻止は、上記滅菌操作および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの添加により確実にし得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に添加することも望ましいことがある。さらに、注射用剤型の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤の添加により達成され得る。
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散媒および無菌注射用溶液または分散剤の即時の調製用の無菌粉末を含む。薬学的に活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で知られる。慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合でない限り、ここに記載する医薬組成物へのその使用が意図される。医薬組成物は防腐剤を含んでよくまたは防腐剤を含まなくてよい。追加の活性化合はも組成物に入れてよい。
治療組成物は、一般に製造および貯蔵条件下、無菌かつ安定でなければならない。組成物を、高薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の秩序構造に製剤し得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により、維持され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを添加し得る。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを添加することにより達成され得る。
無菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上に挙げた成分の一つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に取り込み、続いて滅菌濾過することにより製造され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本的分散媒体およびここに挙げたものからの必要な他の成分を含む、無菌媒体に取り込むことにより製造する。無菌注射用溶液の製造のための無菌粉末の場合、一部製造方法は、あらかじめ滅菌濾過した溶液から、活性成分と何れかの付加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および特定の投与方式により変わる。単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、薬学的に許容される担体と組み合わせて、１００パーセント中、この量は、活性成分約０.０１パーセント～約９９パーセント、好ましくは約０.１パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは活性成分約１パーセント～約３０パーセントである。
投与レジメンを、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調節する。例えば、単回ボーラスを投与してよく、数分割用量を長期で投与してよくまたは治療状況の緊急さにより用量を比例的に減少または増加してよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経腸組成物を投与量単位形態で製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置対象への単位投与量として適する物理的に分かれた単位を言い、各単位は必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された予定された量の活性化合物を含む。ここに記載される投与量単位形態の詳細は、(ａ)活性化合物の特有の性質および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)個体の感受性による活性化合物の製剤の分野に固有の限界により指示され、依存する。
例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の投与について、投与量は宿主体重の約０.０００１～１００mg／kgおよびより一般に０.０１～５または１０mg／kgの範囲である。例えば投与量は、０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１～１０mg／kgの範囲内であり得る。処置レジメの例は、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月１回、３か月に１回または３～６か月に１回投与を含む。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の投与レジメン例は、静脈内投与による１mg／kg体重または３mg／kg体重を含み、抗体は次の投与スケジュールの一つを使用して投与される：(ｉ)４週毎に６回、次いで３か月毎；(ii)３週毎；(iii)３mg／kg体重１回、続いて１mg／kg体重を３週毎。
抗ＴＩＭ３抗体を一定投与量(一定投与レジメン)で投与し得る。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体を、他の抗体と固定投与量で投与し得る。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体を、体重に基づく投与量で投与する。
ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は、指示された範囲内に入る。抗体は、通常複数回投与する。一投与量間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３か月毎または毎年であり得る。間隔はまた患者における標的抗原に対する抗体の血中レベル測定により示され得る。ある方法において、投与量を、約１～１０００μg／mlおよびある方法において約２５～３００μg／mlの血漿抗体濃度を達成するように調節する。
抗ＴＩＭ３抗体を、他の抗体の投与レジメンで該他の抗体と投与し得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、抗ニボルマブ(オプジーボ(登録商標))などのＰＤ－１抗体と、２週毎に、６０分間のｉ.ｖ.点滴として、疾患進行または許容されない毒性が生じるまで投与し得る。抗ＴＩＭ３抗体を、ペムブロリズマブ(キイトルーダ(登録商標))と、３週毎に３０分間のｉ.ｖ.点滴として、疾患進行または許容されない毒性が生じるまで投与し得る。抗ＴＩＭ３抗体を、アテゾリズマブ(テセントリクＴＭ)と、３週毎に６０分または３０分間のｉ.ｖ.点滴として、疾患進行または許容されない毒性が生じるまで投与し得る。
抗体を徐放製剤として投与でき、この場合、低頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。一般に、ヒト抗体は最長半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処置が予防的かまたは治療的かにより変わり得る。予防適用において、比較的低投与量が、長期にわたり、比較的頻繁ではない間隔で投与される。一部患者は、処置を死亡まで受ける。治療適用において、比較的短い間隔での比較的高投与量が、疾患の進行が低減するかまたは停止するまで、そして患者が、疾患症状の部分的または完全改善を示すまで、必要なことがある。その後、患者に予防レジメを投与し得る。
ここに記載する医薬組成物の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方式で所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変え得る。選択投与量レベルは、用いるここに記載する特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の***速度、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および病歴および医学分野で周知の類似因子を含む、多様な薬物動態因子により変わる。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の「治療有効投与量」は、疾患症状重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患罹患による機能障害または能力障害の予防をもたらし得る。癌の状況で、治療有効用量は生存延長、例えば、全生存および／または癌に関連する身体的症状のさらなる悪化の予防をもたらし得る。癌の症状は当分野で周知であり、例えば、異常な黒子特徴、非対称、境界、色および／または直径を含む黒子の見かけ変化、新たに着色された皮膚領域、異常黒子、爪の下の黒ずんだ領域、***腫瘤、乳首変化、***嚢胞、***痛、死亡、体重減少、脱力、過度の疲労、食事困難、食欲減退、慢性咳嗽、息切れ悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、腹部膨満、鼓腸、腹水、膣出血、便秘、腹部膨満感、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、大汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉攣縮、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。
治療的有効用量は、疾患の初期または前記症状が存在するとき望まれ得るような、癌発症を予防または遅延し得る。癌の診断に使用される臨床検査は、生化学(ＴＩＭ３レベル測定を含む)、血液、血清および放射線検査を含む。従って、前記の何れかをモニターする何れかの臨床的または生化学的アッセイを使用して、特定の処置が癌処置のための治療的有効用量であるか否かを決定し得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および選択した特定の組成物または投与経路などの因子に基づき、このような量を決定できる。
ここに記載する組成物は、当分野で知られる多くの方法の１以上を使用して、１以上の投与経路で投与され得る。当業者に認識されるとおり、経路および／または投与方法は所望の結果により変わる。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体の投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含み得る。ここで使用する用語「非経腸投与」は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。
あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非経腸ではない経路で投与する可能性がある。
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、化合物を急速な放出から保護する担体と共に製剤し得る。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用し得る。このような製剤を製造するための多くの方法が特許され、または当業者に一般に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
治療組成物は、当分野で知られる医療機器により投与し得る。例えば、ある実施態様において、ここに記載する治療組成物を、米国特許５,３９９,１６３；５,３８３,８５１；５,３１２,３３５；５,０６４,４１３；４,９４１,８８０；４,７９０,８２４；または４,５９６,５５６に開示するデバイスなど無針皮下注射器を使用して投与し得る。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体で使用するための周知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で薬物を送達するための埋め込み型マイクロインフュージョンポンプを開示する米国特許４,４８７,６０３；皮膚を介して薬物を投与するための治療デバイスを開示する米国特許４,４８６,１９４；厳密な注入速度で薬物を送達する薬物注入ポンプを開示する米国特許４,４４７,２３３；連続薬物送達のための流量可変埋め込み型点滴装置を開示する米国特許４,４４７,２２４；多チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許４,４３９,１９６；および浸透圧薬物送達系を開示する米国特許4,475,196を含む。これらの特許は、引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールは当業者に知られる。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、インビボでの適切な分布のために製剤される。例えば、血液－脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。ここに記載する治療化合物がＢＢＢを通ることを確実にするために(例えば、脳含について、望むならば)、例えば、リポソームに製剤され得る。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；および５,３９９,３３１を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１以上の部分を含み、そうして標的薬物送達が増強される(例えば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。ターゲティング部分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許5,416,016)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み；またK. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
XVI. 使用および方法
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＴＩＭ３(例えば、シグナル伝達)阻害(または拮抗)による免疫応答またはＴＩＭ３検出を含む、多くのインビトロおよびインビボ有用性がある。ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体はヒト抗体である。例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を、培養細胞にインビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与して、多くの疾患における免疫を増強し得る。従って、ここに提供されるのは、対象に、対象の免疫応答が修飾されるように、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法である。ある実施態様において、応答は増強、刺激または上方制御される。
本方法に適する対象は、免疫応答の増強が望ましいヒト患者である。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞介在免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)増強により処置し得る障害を有するヒト患者の処置に特に適する。ある実施態様において、方法は、インビボでの癌処置に特に適する。免疫の抗原特異的増強を達成するために、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を目的の抗原と共に投与できまたは抗原は処置する対象に既に存在し得る(例えば、腫瘍担持またはウイルス担持対象)。ＴＩＭ３に対する抗体を他の薬剤と共に投与するとき、これら２剤は別々にまたは同時に投与し得る。
また包含されるのは、サンプルおよび対照サンプルと、ヒトＴＩＭ３に特異的に結合するモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその一部とヒトＴＩＭ３の複合体を形成させる条件下で、接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＴＩＭ３抗原の存在を検出するまたはヒトＴＩＭ３抗原の量を測定する方法である。次いで、複合体形成を検出し、ここで、対照サンプルと比較したサンプルの複合体形成差異は、サンプルにおけるヒトＴＩＭ３抗原の存在の指標である。さらに、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、免疫親和性精製によるヒトＴＩＭ３の精製に使用され得る。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体が、ＴＩＭ３の陰性効果の阻害などにより、Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激または共刺激する能力を考慮して、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答の刺激、増強または上方制御のために、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を使用するインビトロおよびインビボ方法である。ある実施態様において、ＣＤ３刺激が提供され(例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との共インキュベーションにより)、この刺激は、抗ＴＩＭ３抗体での刺激と同時、その前または後に提供され得る。例えば、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であり、該Ｔ細胞とここに記載する抗ＴＩＭ３抗体そして所望により抗ＣＤ３抗体を、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように接触させることを含む、方法である。
抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために、抗原特異的Ｔ細胞応答の何れかの適当な指標が使用され得る。このような適当な指標の非限定的例は、抗体存在下のＴ細胞増殖増加および／または抗体存在下のサイトカイン産生増加を含む。ある実施態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン－２および／またはインターフェロン－γ産生が刺激される。
抗ＴＩＭ３抗体で増強または共刺激し得るＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞はＴｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞(例えば、Ｔｈ１細胞)またはＴ細胞毒性(Ｔｃ)細胞であり得る。
さらに包含されるのは、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が刺激されるように、対象にここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を刺激する方法である。ある実施態様において、対象は腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、造血器腫瘍であり得る。ある実施態様において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。ある実施態様において、腫瘍は非免疫原性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ－Ｌ１陽性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ－Ｌ１陰性である。対象はウイルス担持対象であってもよく、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
さらに提供されるのは、腫瘍増殖が対象において阻害されるように、対象にここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞増殖を阻害する方法である。また提供されるのは、対象におけるウイルス感染が処置されるように、対象にここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置する方法である。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体を、補助治療として対象に与える。抗ＴＩＭ３抗体での癌を有する対象の処置は、現在の標準治療に比して生存延長、例えば、長期持続性応答；少なくとも３か月、６か月、９か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の長期生存または少なくとも３か月、６か月、９か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の無再発生存に至り得る。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体での癌を有する対象の処置は、例えば、３か月、６か月、９か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上、癌再発を予防するかまたは癌再発を遅らせる。抗ＴＩＭ３処置は、第一選択、第二選択または第三選択処置として使用され得る。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１での癌を有する対象の処置は、例えば、疾患安定、部分応答、全生存延長、無疾患生存延長または無進行生存増強をもたらし得る。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、顕著に毒性ではない。例えば、ＴＩＭ３抗体は、例えば、臨床治験で検査して、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓の１以上に顕著に毒性ではない。ある実施態様において、ＴＩＭ３抗体は望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫または炎症を顕著に誘発しない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３アンタゴニスト(例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体)での対象の処置は、対象の免疫系がその後対象自体を攻撃する(例えば、自己免疫性応答)または、例えば、アナフィラキシーに至る程度に免疫系に過剰刺激をもたらさない。故に、ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体はアナフィラキシーをもたらさない。
ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体、例えば、１３Ａ３のＣＤＲまたは可変領域またはそのバリアント(例えば、ここに記載)を含む抗体または他のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体での対象の処置は、顕著な炎症性反応、例えば、免疫介在肺炎、免疫介在大腸炎、免疫介在肝炎、免疫介在腎炎または腎臓機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症または他の免疫介在有害反応をもたらさない。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３１３Ａ３のＣＤＲまたは可変領域またはそのバリアント(例えば、ここに記載)を含む抗体が原因の炎症性反応、例えば、免疫介在肺炎、免疫介在大腸炎、免疫介在肝炎、免疫介在腎炎または腎臓機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、アナフィラキシーまたは他の免疫介在有害反応は他の抗ＴＩＭ３抗体より少ない。ある実施態様において、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体、例えば、１３Ａ３のＣＤＲまたは可変領域またはそのバリアント(例えば、ここに記載)を含む抗体または他のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体での対象の処置は、顕著な心臓障害、例えば、心室性不整脈；眼障害、例えば、虹彩毛様体炎；点滴関連反応；アミラーゼ上昇、リパーゼ上昇；神経系障害、例えば、めまい、末梢および感覚性ニューロパチー；皮膚および皮下組織障害、例えば、発疹、掻痒、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、白斑症または乾癬；呼吸器、胸部および縦隔障害、例えば、咳嗽；疲労；悪心；食欲減退；便秘；関節痛；または下痢を起こさない。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、免疫系を刺激する化合物(例えば、腫瘍免疫療法薬)、例えば、ここに記載する化合物またはここに記載する標的を調節する化合物などの他の癌治療と組み合わせて相乗的抗腫瘍効果を提供する。
ヒト抗体を使用して、キメラまたはヒト化抗体とは逆に、抗薬物抗体(ＡＤＡ)レベル低減をもたらし得る。従って、ここに記載するヒト抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、ヒトではない抗体である抗ＴＩＭ３抗体に比して、ＡＤＡが低い可能性がある(例えば、ヒト化またはキメラ抗ＴＩＭ３抗体に比して)。
これらおよび他のここに記載する方法を、さらに下に詳述する。
XVI.Ａ. 癌
抗ＴＩＭ３抗体によるＴＩＭ３の阻害は、癌を有する患者の癌細胞に対する免疫応答を増強し得る。ここに提供されるのは、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻害または減少するおよび／または腫瘍が退縮するおよび／または生存延長が達成されるように対象にここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法である。抗ＴＩＭ３抗体は癌性腫瘍増殖阻害に単独で使用され得る。あるいは、抗ＴＩＭ３抗体は、下記のとおり他の薬剤、例えば、他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と共に使用され得る。
従って、ここに提供されるのは、対象における、例えば、腫瘍細胞増殖阻害により、癌を処置する方法であって、対象に、治療有効量のここに記載する抗ＴＩＭ３抗体、例えば、野生型ＩｇＧ定常領域を有するまたはエフェクター機能が低減した定常領域、例えば、ＩｇＧ１.１またはＩｇＧ１.３またはその抗原結合部分を有する、ＴＩＭ３.２、ＴＩＭ３.４、ＴＩＭ３.５、ＴＩＭ３.６、９Ｆ６、８Ｂ９、ＴＩＭ３.９、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.２４、２３Ｂ３およびＴＩＭ３.２５を投与することを含む、方法である。抗体はヒト抗ＴＩＭ３抗体(例えばここに記載するヒト抗ヒトＴＩＭ３抗体のいずれか)であり得る。本発明の抗体により増殖が阻止され得る癌は、免疫療法に一般に応答性の癌および免疫療法に一般に応答性ではない癌を含む。処置され得る癌はまた、ＴＩＭ３陽性癌を含む。癌は固形腫瘍または血液悪性腫瘍(液体腫瘍)の癌であり得る。処置のための癌の非限定的例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎臓細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(またはカルシノマ)、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児科肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫、例えば皮膚または眼内悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門部癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳癌、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源の癌(例えば、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)関連または起源腫瘍)および２つの主要な血液細胞系譜、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞産生)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞産生)の何れか由来の血液系腫瘍、例えば全タイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ球性および／または骨髄性白血病、例えば急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球系白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球白血病(Ｍ７)、孤立性顆粒球肉腫および緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞血液悪性腫瘍、例えばＢ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ １＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、原発縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病(Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真正組織球性リンパ腫、原発中枢神経系リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽細胞性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも称される)およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)；骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄腫とも称される)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫；骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；精上皮腫、奇形癌腫、星状細胞腫を含む中枢および末梢神経腫瘍、シュワン腫；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫、リンパ系造血性腫瘍、例えば小細胞および大脳様細胞型を含むＴ前リンパ球性白血病(Ｔ－ＰＬＬ)などのＴ細胞障害を含むが、これらに限定されないＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む他の腫瘍；Ｔ細胞型の大顆粒状リンパ球白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽細胞サブタイプ)；血管中心性(鼻腔)Ｔ細胞リンパ腫；頭頚部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄リンパ腫、ならびにこれらの癌の何れかの組み合わせを含む。ここに記載する方法は、転移癌、切除不能、難治性癌(例えば、例えば、遮断ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１抗体での、免疫療法に難治性の癌)および／または再発性癌にも使用し得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体を、先の処置、例えば、腫瘍免疫療法薬または免疫療法薬物での先の処置に不十分な応答または進行した癌を有する患者、または難治性または抵抗性(内因性に難治性または抵抗性(例えば、ＰＤ－１経路アンタゴニストに難治性)または抵抗性または難治性状態が後天性である)である癌を有する患者に投与される。例えば、第一治療に応答しないまたは応答が十部ではないまたは処置、例えば、抗ＰＤ－１処置後疾患進行が見られる対象を、抗ＴＩＭ３抗体単独または他の治療(例えば、抗ＰＤ－１治療)との組み合わせの投与で処置し得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、腫瘍免疫療法薬、例えば、ＰＤ－１経路アンタゴニストを先に受けていない(すなわち、処置されていない)患者に投与される。
ある実施態様において、対象における癌を処置する方法は、まず、対象がＴＩＭ３陽性であるか、例えば、ＴＩＭ３を発現する腫瘍細胞またはＴＩＬを有するかを決定し、対象がＴＩＭ３陽性癌またはＴＩＬ細胞を有するならば、対象に例えば、ここに記載する、抗ＴＩＭ３抗体を投与する。抗ＴＩＭ３抗体で癌を有する対象を処置する方法は、ＴＩＭ３を発現する癌細胞またはＴＩＬ細胞を有する対象に、治療有効量のＴＩＭ３抗体を投与することを含む。またここに提供されるのは、対象が抗ＴＩＭ３抗体での処置に応答するか否かを予測する方法であって、ここで、方法は、患者の癌またはＴＩＬ細胞におけるＴＩＭ３のレベルを決定することを含み、対象の癌またはＴＩＬ細胞がＴＩＭ３陽性であるならば、対象は、ＴＩＭ３抗体での処置に応答する可能性が高い。
ある実施態様において、対象における癌を処置する方法は、まず、対象がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１陽性である、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を発現する腫瘍細胞またはＴＩＬを有するかを決定し、対象がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１陽性癌またはＴＩＬ細胞を有するならば、対象に例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)を投与することを含む。抗ＴＩＭ３抗体(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)で癌を有する対象を処置する方法は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を発現する癌細胞またはＴＩＬ細胞に、治療有効量のＴＩＭ３抗体(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)を投与することを含み得る。またここに提供されるのは、対象が抗ＴＩＭ３抗体(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)での処置に応答するか否かを予測する方法、ここで、方法は、患者の癌またはＴＩＬ細胞におけるＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－のレベルを決定することを含み、対象の癌またはＴＩＬ細胞がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１陽性であるならば、対象はＴＩＭ３抗体(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)での処置に応答する可能性が高い。
抗ＴＩＭ３抗体を、標準治療処置と共に投与し得る。抗ＴＩＭ３抗体は維持治療、例えば、腫瘍発症または再発の予防を意図した治療として投与し得る。
抗ＴＩＭ３抗体を、他の処置、例えば、放射、手術または化学療法と共に投与し得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体補助治療を、微小転移が存在し得るリスクがあるときおよび／または再発のリスクを晴らすため投与し得る。
抗ＴＩＭ３抗体を単剤療法としてまたは唯一の免疫刺激性治療として投与し得る。ＴＩＭ３に対する抗体、例えば、抗ＴＩＭ３を、癌細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞などの免疫原性剤と組み合わせ得る(He et al.,(2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的例は、黒色腫抗原のペプチド、例えばｇｐ１００のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼまたはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む(さらに下に記載)。
ヒトにおいて、黒色腫などの一部腫瘍は免疫原性であることが示されている。ＴＩＭ３阻害によりＴ細胞活性化の閾値を下げることにより、宿主における腫瘍応答は活性化でき、非免疫原性腫瘍または限定的免疫原性のものの処置を可能とする。
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ワクチン処置プロトコールと組み合わせ得る。腫瘍に対するワクチン接種の多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738参照;またRestifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition参照)。これらの戦略の一つで、自己または同種異系腫瘍細胞を使用して、ワクチンが調製される。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ－ＣＳＦを発現するように形質導入されているとき、最も有効であることが示されている。ＧＭ－ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力な活性化物質であることが示されている(Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43)。
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義を導いている(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が由来する細胞において発現される分化抗原、例えばメラニン形成細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ－２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示され得る。ＴＩＭ３阻害は、腫瘍において発現される一連の組み換えタンパク質および／またはペプチドと関連して、これらのタンパク質に対する免疫応答を発生させるために使用され得る。これらのタンパク質は、通常免疫系により自己抗原として見なされ、それ故にそれらに対して寛容である。腫瘍抗原はまた染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒト癌の８５％超で発現され、限られた数の体細胞組織にしか発現されないタンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim, N et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はタンパク質配列を変えるまたは２つの無関係な配列間の融合タンパク質を形成する(すなわちフィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ－ａｂｌ)体細胞変異のために癌細胞で発現される「ネオ抗原」またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプであり得る。
他の腫瘍ワクチンは、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)などのヒト癌と関係するウイルスからのタンパク質を含み得る。ＴＩＭ３阻害と組み合わせて使用し得る腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織自体から単離された精製ヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらのヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは、抗原提示細胞への送達時、腫瘍免疫誘導のために高度に効率的である(Suot & Srivastava (1995)Science 269: 1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278: 117-120)。
樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答の誘導に使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣはエクスビボで産生でき、タンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を負荷できる(Nestle, et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。ＤＣはまたこれらの腫瘍抗原を同様に発現するように遺伝的手段により形質導入もされ得る。ＤＣはまた免疫化の目的で腫瘍細胞と直接融合もされ得る(Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化をＴＩＭ３阻害と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化し得る。
ＴＩＭ３阻害をまた標準的癌処置(例えば、手術、放射および化学療法)と組み合わせ得る。ＴＩＭ３阻害は、化学療法レジメと効果的に組み合わせ得る。この場合、投与される化学療法剤の用量を減らすことが可能であり得る(Mokyr, M. et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。該組み合わせの例は、黒色腫の処置のための抗ＴＩＭ３抗体とダカルバジンの組み合わせである。該組み合わせの他の例は、黒色腫の処置のための抗ＴＩＭ３抗体とインターロイキン－２(ＩＬ－２)の組み合わせである。ＴＩＭ３阻害と化学療法の組み合わせ使用の背後にある科学的根拠は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルを増加させることである。細胞死を介してＴＩＭ３阻害と相乗効果をもたらし得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン除去である。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の起源を作る。血管形成阻害剤は、ＴＩＭ３阻害とも組み合わせ得る。血管形成阻害は、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る腫瘍細胞死を導く。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化させる、二重特異性抗体と組み合わせても使用できる(例えば、米国特許５,９２２,８４５および５,８３７,２４３参照)。二重特異性抗体は、２つの別々の抗原の標的化に使用できる。例えば抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ)二重特異性抗体、腫瘍部位にマクロファージを標的化させるために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＴＩＭ３阻害の使用により増強され得る。あるいは、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用により、抗原をＤＣに直接送達し得る。
腫瘍は、広範な機序により宿主免疫監視を避ける。これらの機序の多くは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質を不活性化することにより突破され得る。これらは、数ある中で、ＴＧＦ－β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ－１０(Howard & O’Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの各々に対する抗体を、抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせて使用して、免疫抑制性因子の作用に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答を支持し得る。
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体が、抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせて使用され得る。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、効果的にＴ細胞ヘルパー活性の代替となることができ(Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478)、抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせて使用され得る。ＣＴＬＡ－４(例えば、米国特許５,８１１,０９７)、ＯＸ－４０(Weinberg et al. (2000) 免疫l 164: 2160-2169)、４－ｌＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685(1997)およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)などのＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化レベル増加のために使用され得る。ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤も抗ＴＩＭ３抗体と共に使用され得る。他の組み合わせは、本明細書の他の箇所に提供される。
骨髄移植は、造血起源の多くの腫瘍の処置に現在使用されている。移植片対宿主病はこの処置の結果であるが、移植片対腫瘍応答により治療効果を得ることができる。ＴＩＭ３阻害を、ドナー生着腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性増加に使用し得る。
抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および拡大、ならび腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞刺激のためのレシピエントへのこれら細胞の養子移入を含む、いくつかの実験的処置プロトコールもある(Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51)。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染因子に対するＴ細胞応答活性化にも使用され得る。抗ＴＩＭ３抗体存在下でのエクスビボ活性化は、養子移入Ｔ細胞の頻度および活性を増加させ得る。
XVI.Ｂ. 感染症
ここに記載する方法はまた特定の毒素または病原体に曝されている患者の処置にも使用され得る。従って、ここに記載する他の態様は、対象が感染性疾患について処置されるように、対象に抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法である。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。
上記腫瘍についての適用と同様、ＴＩＭ３阻害に介在する抗体は、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答刺激のために、単独でまたはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて、使用され得る。この治療的アプローチが特に有用であり得る病原体の例は、現在有効なワクチンがない病原体または慣用のワクチンの効果が十分ではない病原体を含み得る。これらは、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、Ｂ＆Ｃ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＴＩＭ３阻害は、感染症の経過中に提示される抗原が変わるＨＩＶなどの因子による確立された感染症に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＴＩＭ３抗体投与時に外来として認識され、それ故に強力なＴ細胞応答を誘発する。
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスの例の一部は、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バールウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、乳頭腫ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス系脳炎ウイルス(arboviral encephalitis virus)を含む。
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性細菌の例の一部は、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス症、炭疽、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌を含む。
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性真菌の例の一部は、カンジダ(アルビカンス、クルーセイ、グラブラタ、トロピカリスなど)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス(フミガーツス、ニガーなど)、ケカビ目(ムコール属、アブシディア属、リゾプス属)、スポロトリックス・シェンキイ、ブラストミセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムを含む。
ここに記載する方法より処置可能な感染症を引き起こす病原性寄生生物の例の一部は、赤痢アメーバ、大腸バランジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ科、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、ブルセイトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ原虫およびブラジル鉤虫を含む。
上記方法の全てにおいて、ＴＩＭ３阻害は、他の形態の免疫療法、例えば、ここに記載のもの、例えばサイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２)または腫瘍抗原の増強された提示を提供する二重特異性抗体治療と組み合わせ得る(例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123参照)。
XVI.Ｃ. 自己免疫性反応
抗ＴＩＭ３抗体は自己免疫性応答を誘導し、増強させ得る。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用する抗腫瘍応答の誘導は、多くの抗腫瘍応答が抗自己反応性に関与することを示している(van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)。それ故に、種々の自己タンパク質と組み合わせた抗ＴＩＭ３抗体を、疾患処置のためにこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に産生するためのワクチン接種プロトコールを作成するために考慮することが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳のアミロイド沈着物におけるＡβペプチドの不適切な蓄積を含み、アミロイドに対する抗体応答が、これらのアミロイド沈着物を除去し得る(Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177)。
アレルギーおよび喘息の処置のためのＩｇＥおよび関節リウマチのためのＴＮＦ－αなどの他の自己タンパク質も標的として使用し得る。そして、種々のホルモンに対する抗体応答が抗ＴＩＭ３抗体の使用により誘導され得る。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は避妊に使用し得る。特定の腫瘍の増殖に必要なホルモンおよび他の可溶性因子に対する中和抗体応答は、可能性のあるワクチン接種標的として考慮され得る。
抗ＴＩＭ３抗体の使用についての上の記載と同様の方法を、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着物、ＴＮＦ－αおよびＩｇＥなどのサイトカインなどの他の自己抗原の不適切な蓄積を有する患者の処置のための治療的自己免疫性応答の誘導のために使用し得る。
XVI.Ｄ. ワクチン
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、抗ＴＩＭ３抗体と目的の抗原(例えば、ワクチン)の共投与により、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用され得る。従って、ここに提供されるのは、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であり、対象に(ｉ)抗原；および(ii)抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように投与することを含む。抗体はヒト抗ヒトＴＩＭ３抗体(例えばここに記載するヒト抗ＴＩＭ３抗体のいずれか)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上のセクションに記載したもの、例えば上記腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記ウイルス、細菌または他の病原体からの抗原を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質が、抗ＴＩＭ３抗体の代わりにまたはそれに加えて、ワクチンとして使用される。
インビボおよびインビトロでここに記載する抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異的および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート)を投与する適当な経路は当分野で周知であり、当業者により選択され得る。例えば、抗体組成物は注射により投与され得る(例えば、静脈内または皮下)。使用する分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重および抗体組成物の濃度および／または製剤による。
先に記載のとおり、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を、１以上の他の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射性毒性剤または免疫抑制剤と共投与し得る。抗体を該薬剤と結合でき(免疫複合体として)または該薬剤と別に投与し得る。後者の場合(別の投与)、抗体を、他の既知治療、例えば、抗癌治療、例えば、放射の前、後または同時に投与し得る。このような治療剤は、数ある中で、それ自体、患者に毒性または準毒性であるレベルでしか有効ではない、抗新生物剤、例えばドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素を含む。シスプラチンは、１００mg／ml投与量で４週に１回静脈内投与され、アドリアマイシンは、６０～７５mg／ml投与量で２１日毎に１回静脈内投与される。ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体または抗原結合そのフラグメントと化学療法剤の共投与は、異なる作用機序で作用する２つの抗癌剤を提供し、これは、ヒト腫瘍細胞に細胞毒効果を生じる。このような共投与は、薬物への抵抗性獲得または抗体に反応しなくなる腫瘍細胞の抗原性変化による問題を解決し得る。
またここに記載する範囲内であるのは、ここに記載する抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性または多特異的分子またはイムノコンジュゲート)および使用の指示を含む、キットである。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬または１以上のさらなるここに記載するヒト抗ＴＩＭ３抗体(例えば、第一ヒト抗体と異なるＴＩＭ３抗原のエピトープに結合する、相補的活性を有するヒト抗体)を含み得る。キットは、一般には、キットの中身の意図する使用を示すラベルを含む。用語ラベルは、キット上にまたはキットと共に提供されるまたは他の方法でキットに付随する何らかの書面または記録媒体を含む。
XVI.Ｅ. 組み合わせ治療
上記組み合わせ治療に加えて、抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ここに記載のものを、下記のとおり、例えば、癌の処置に組み合わせ治療としても使用し得る。
ここに提供されるのは、抗ＴＩＭ３抗体が、免疫応答を刺激し、それにより対象の免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御するのに有効である、１以上のさらなる薬剤、例えば、小分子薬物、抗体またはその抗原結合部分と共投与される、組み合わせ治療の方法である。
一般に、例えば、ここに記載する、抗ＴＩＭ３抗体を、Ｔ細胞などの免疫細胞の(ｉ)刺激(例えば、共刺激)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストおよび／または(ii)阻害性シグナルまたは分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストと組み褪せることができ、このいずれも抗原特異的Ｔ細胞応答などの免疫応答を増強させる。ある態様において、腫瘍免疫療法薬は、細胞、例えば、Ｔ細胞活性化を阻害するものまたは自然免疫に関与するもの、例えば、ＮＫ細胞の(ｉ)刺激(共刺激を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストまたは(ii)阻害性(共阻害性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストであり、ここで、腫瘍免疫療法薬は自然免疫を増強する。このような腫瘍免疫療法薬は、しばしば免疫チェックポイント調節剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント刺激剤と称される。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体を、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーである刺激性または阻害性分子を標的とする薬剤と投与する。例えば、ここに記載する、抗ＴＩＭ３抗体を、対象に、例えば、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤と投与して、免疫応答を増加させ得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体を、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１(ＰＤ－Ｌ１)、Ｂ７－ＤＣ(ＰＤ－Ｌ２)、Ｂ７－Ｈ２(ＩＣＯＳ－Ｌ)、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７－Ｈ６を含む膜結合リガンドのＢ７ファミリーのメンバーを標的とする(または特異的に結合する)薬剤または共刺激またはＢ７ファミリーメンバーに特異的結合する共阻害性受容体またはリガンドと共に投与し得る。
抗ＴＩＭ３抗体は、分子のＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバー(リガンドまたは受容体)、例えばＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４－ｌＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２－Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ １４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴｐＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンフォトキシンａ／ＴＮＦｐ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦａ、ＬＴｐＲ、リンフォトキシンａ １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹおよびＮＧＦＲを標的とする薬剤とも共投与し得る(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00: 1参照)。
Ｔ細胞応答を、例えば、ＴＩＭ３.２、ＴＩＭ３.４、ＴＩＭ３.５、ＴＩＭ３.６、９Ｆ６、８Ｂ９、ＴＩＭ３.９、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.７およびＴＩＭ３.８の可変領域を有する抗ＴＩＭ３抗体と次の薬剤の１以上の組み合わせにより刺激し得る：
(１)Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質のアンタゴニスト(阻害剤または遮断剤)(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)、例えばＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＧＩＴＲおよびＬＡＧ－３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ－１およびＴＩＭ－４；および／または
(２)Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト、例えばＢ７－１、Ｂ７－２、ＣＤ２８、４－１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８Ｈ。
上記タンパク質の１つを調節し、癌の処置に抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ここに記載のものと組む合わせ得る薬剤の例は、ヤーボイ(登録商標)(イピリムマブに対する)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ－４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ－９３６５５８(ＰＤ－１に対する)、ＭＫ－３４７５(ＰＤ－１に対する)、アテゾリズマブ(テセントリク(登録商標))、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ－９３６５５９(Ｂ７－Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７－Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ－５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ－３に対する)、ＢＭＳ－６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ－０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ－１１２７(ＣＤ２７に対する)、抗ＯＸ４０(Providence Health Services)、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌに対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ－８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ－ＣＤ３(ＣＤ３に対する)；抗ＧＩＴＲ抗体ＭＫ４１６６、ＴＲＸ５１８、Ｍｅｄｉ１８７３、ＩＮＢＲＸ－１１０、ＬＫ２－１４５、ＧＷＮ－３２３、ＧＩＴＲＬ－Ｆｃまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
癌の治療のために抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるその他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストを含む。例えば、抗ＴＩＭ３抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせることができる。
Ｔ細胞活性化は、可溶性サイトカインによっても制御され、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストとともに、例えば癌を有する対象に投与され得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体を、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害する、ＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤もしくは遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ；「免疫抑制性サイトカイン」)のアンタゴニストおよび／または(ii)免疫応答を刺激するための、例えば、癌などの増殖性疾患を治療するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせて使用できる。
組み合わせ治療のためのさらに他の薬剤は、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇する薬剤を含み、ＣＳＦ－１Ｒアンタゴニスト、例えばＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、Ｗ０１３／８７６９９、Ｗ０１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４)またはＦＰＡ－００８(ＷＯ１１／１４０２４９；Ｗ０１３１６９２６４；ＷＯ１４／０３６３５７)を含むＣＳＦ－１Ｒアンタゴニスト抗体を含むが、これらに限定されない。
抗ＴＩＭ３抗体はまた、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する薬剤とともに投与してもよい。
抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるさらなる薬剤は、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモド、または腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法(例えば、アントラサイクリン)を含む。
抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるさらなる他の治療法は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇または遮断する治療、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する薬剤を含む。
抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができる他の治療は、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療である。
抗ＴＩＭ３抗体とともに使用され得る別のクラスの薬剤は、アデノシンの形成を阻害する薬剤、例えばＣＤ７３阻害剤またはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤を含む。
癌を治療するために抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができる他の治療法は、Ｔ細胞アネルギーまたは疲弊を逆転／防止する治療法ならびに腫瘍部位における自然免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療を含む。
癌を治療するために抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるその他の治療は、ＩＬ－８を遮断する治療法、例えば、ＨｕＭａｘ－ＩＬ８を用いるものが挙げられる。
抗ＴＩＭ３抗体は、１を超える腫瘍免疫療法薬と組み合わせてもよく、例えば、次の：腫瘍抗原の提示を増強する治療(例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド)；例えば、ＣＴＬＡ－４および／もしくはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を阻害するならびに／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞を枯渇もしくは遮断することによって、負の免疫制御を阻害する治療；例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０および／もしくはＣＤ４０もしくはＧＩＴＲ経路を刺激するアゴニストならびに／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストを用いて、正の免疫調節を刺激する治療；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大させる治療；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト(例えば、ダクリズマブ)を使用してまたはエクスビボでの抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって腫瘍におけるＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療；腫瘍における抑制骨髄系細胞の機能に影響を及ぼす治療；腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療(例えば、アントラサイクリン)；遺伝子修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって修飾された細胞(ＣＡＲ－Ｔ療法)を含む、養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療；Ｔ細胞アネルギーまたは疲弊を逆転／防止する治療；腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療；免疫刺激サイトカインの投与；あるいは免疫抑制サイトカインの遮断の１つ以上など、免疫経路の複数の要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせてもよい。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体は、１以上の、陽性共刺激性受容体をライゲーションするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断薬、アンタゴニストならびに１以上の、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増大する薬剤、腫瘍微小環境内のそれぞれの免疫抑制経路を遮断し(例えば阻害性受容体結合(例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用)を遮断しＴｒｅｇを枯渇または阻害し(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)を使用して、またはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって)、ＩＤＯなどの代謝酵素を阻害するか、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を逆転させる／防ぐ)薬剤および自然免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症を誘導する薬剤と共に使用できる。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、対象が、ＢＲＡＦ Ｖ６００突然変異に関して陽性である場合、ＢＲＡＦ阻害剤と一緒に対象に投与される。
ここに記載する組み合わせ治療での使用のための適当なＰＤ－１アンタゴニストは、リガンド、抗体(例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体)および多価薬剤を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ＰＤ－１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、Ｆｃ融合タンパク質、例えばＡＭＰ－２４４である。ある実施態様において、ＰＤ－１アンタゴニストは抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
例示的抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ(ＢＭＳ－９３６５５８)またはＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１種のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体がある。ある実施態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＭＫ－３４７５(ランブロリズマブ)；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＡＭＰ－５１４；またはＰＤＲ００１；である。さらに公知のＰＤ－１抗体およびその他のＰＤ－１阻害剤として、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号ならびに米国特許公開第２００９／０３１７３６８号に記載されるものを含む。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＰＤ－１抗体のいずれかも使用してもよい。これらの抗体のうち１種と同様に、結合についてＰＤ－１上の同一エピトープと競合する、および／またはＰＤ－１上の同一エピトープと結合する抗ＰＤ－１抗体も、併用治療において使用してもよい。
ある実施態様において、組み合わせ治療に有用な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号では１２Ａ４と呼ばれる)またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号に記載される３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体である。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６(デュルバルマブおよび抗Ｂ７－Ｈ１としても知られている)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(アテゾリズマブおよびＲＧ７４４６としても知られている)、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(アベルマブとしても知られている、ＷＯ２０１３／７９１７４)またはｒＨｉｇＭ１２Ｂ７である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号および米国特許公開第２００９／１４５４９３号において開示される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれも使用してもよい。これらの抗体のいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体も、併用治療において使用してもよい。
ある実施態様において、本開示の抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体とともに使用することができる。ある実施態様において、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヤーボイ(登録商標)(ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載されるイピリムマブまたは抗体１０Ｄ１)、トレメリムマブ(以前は、チシリムマブ、ＣＰ－６７５,２０６)、モノクローナルまたは以下の刊行物：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６,２０７,１５６；Hurwitz et al. (1998) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145):Abstract No. 2505(抗体CP-675206)；およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304のいずれかに記載される抗ＣＴＬＡ－４抗体の群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれも、使用してよい。
ある実施態様において、本開示の抗ＴＩＭ３抗体は、ＬＡＧ３アンタゴニストと組み合わせて使用される。抗ＬＡＧ３抗体の例は、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２、ＷＯ１０／１９５７０およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体を含む。ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、ＢＭＳ－９８６０１６である。使用できる、その他の当技術分野で認識される抗ＬＡＧ－３抗体は、ＵＳ２０１１／００７０２３、ＷＯ０８／１３２６０１およびＷＯ０９／４４２７３に記載されるＩＭＰ７３１およびＩＭＰ－３２１を含む。ＩＭＰ－３２１もまた、使用され得る。これらの抗体のいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＬＡＧ－３抗体も、併用治療において使用してもよい。
ある実施態様において、本開示の抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤ１３７(４－１ＢＢ)アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ１３７抗体と組み合わせて投与され得る。好適なＣＤ１３７抗体としては、例えば、ウレルマブまたはＰＦ－０５０８２５６６(Ｗ０１２／３２４３３)が挙げられる。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＯＸ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＯＸ４０抗体と組み合わせて投与され得る。好適なＯＸ４０抗体としては、例えば、ＭＥＤＩ－６３８３、ＭＥＤＩ－６４６９またはＭＯＸＲ０９１６(ＲＧ７８８８、ＷＯ０６／０２９８７９)が挙げられる。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ４０抗体と組み合わせて投与され得る。ある実施態様において、腫瘍免疫療法薬は、ＣＤ４０アンタゴニスト、例えば、アンタゴニストＣＤ４０抗体である。適当なＣＤ４０抗体は、例えば、ルカツムマブ(ＨＣＤ１２２)、ダセツズマブ(ＳＧＮ－４０)、ＣＰ－８７０,８９３またはＣｈｉ Ｌｏｂ ７／４を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤ２７アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ２７抗体と組み合わせて投与され得る。好適なＣＤ２７抗体は、例えば、バルリルマブ(ＣＤＸ－１１２７)を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有する抗体、例えば、例として、ＷＯ２００６／１０５０２１に記載される６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体；ＷＯ２０１１／０２８６８３に記載される抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＪＰ２００８２７８８１４に記載される抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＷＯ２０１５／０３１６６７、ＷＯ２０１５／１８７８３５、ＷＯ２０１５／１８４０９９、ＷＯ２０１６／０５４６３８、ＷＯ２０１６／０５７８４１もしくはＷＯ２０１６／０５７８４６に記載される抗ＧＩＴＲ抗体または本明細書に記載される、もしくは参照される他の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体と共に投与される。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)(ＷＯ１１／１０９４００)と組み合わせて投与される。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＫＩＲアンタゴニスト、例えば、リリルマブと組み合わせて投与される。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、ＩＤＯアンタゴニストと組み合わせて投与される。好適なＩＤＯアンタゴニストは、例えば、ＩＮＣＢ－０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２)、インドキシモド(indoximod)、ＮＬＧ－９１９(ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７)またはＦ００１２８７を含む。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、例えば、ＴＬＲ２／４アゴニスト(例えば、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin))；ＴＬＲ７アゴニスト(例えば、ヒルトノール(Hiltonol)またはイミキモド)；ＴＬＲ７／８アゴニスト(例えば、レシキモド)；またはＴＬＲ９アゴニスト(例えば、ＣｐＧ７９０９)と組み合わせて投与される。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３は、ＴＧＦ－β阻害剤、例えば、ＧＣ１００８、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ７１９７またはＩＭＣ－ＴＲ１と組み合わせて投与される。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体および組み合わせ治療抗ＴＩＭ３抗体および組合せ療法を、治療されている適応症(例えば、癌)に対するその特定の有用性について選択されるその他の周知の療法とともに使用してもよい。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の組合せを、公知の医薬上許容される薬剤と逐次使用してもよい。
例えば、ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体および組み合わせ治療は、放射線照射および／または化学療法、(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ－１１)、５－フルオロウラシル(５－ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン－パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５－ＦＵまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘ ｃｏｍｂｏ)を使用する)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ－２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ－２’(ｂｃｌ－ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ－１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０、インドキシモド、ＮＬＧ－９１９、またはＦ００１２８７)、ＡＴ－１０１(Ｒ－(－)－ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ－２６３(小分子)、ＧＸ－１５－０７０(オバトクラックス(obatoclax))またはＭＣＬ－１(骨髄系白血病細胞分化タンパク質－１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質の阻害剤)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ－３５１５６(ＧＥＭ－６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管新生阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤(例えば、アバスチン)、合成トリテルペノイド(Hyer et al, Cancer Research 2005;65:4799-808を参照のこと)、ｃ－ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲｙ(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド(Lenalildomide)、ＧＳＫ３Ｐ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる治療と組み合わせて(例えば、同時または別個に)使用できる。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体および組み合わせ治療は、１以上の抗増殖性細胞傷害性薬剤と組み合わせてさらに使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、次のものを含むが、これらに限定されない：
アルキル化剤(制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標))ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む)：メトトレキサート、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカププリン、６－チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
当分野で知られる他のマイクロチューブリン分解防止剤に加えて、抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせるのに適した、タキサン、パクリタキセル(パクリタキセルは、ＴＡＸＯＬＴＭとして市販されている)、ドセタキセル、ディスコデルモリド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシド(Peloruside)Ａ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］－デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３－シクロプロピル－エポチロンＡ、Ｃ６－Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス－９,１０－デヒドロエポチロンＤ、シス－９,１０－デヒドロエポチロンＤ、１６－デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢＩＯ、ディスコデルモリド(discoderomolide)、パツピロン(patupilone)(ＥＰＯ－９０６)、ＫＯＳ－８６２、ＫＯＳ－１５８４、ＺＫ－ＥＰＯ、ＡＢＪ－７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモリド(discoderomolide))、ＴＺＴ－１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ－６５１(タシドチン塩酸塩(tasidotin hydrochloride))、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩(Eribulin mesylate)(Ｅ－７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ－２８６)、Ｅ－７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ－３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート(ＤＭ－１)、ＭＫＣ－１、ＡＢＴ－７５１、Ｔ１－３８０６７、Ｔ－９００６０７、ＳＢ－７１５９９２(イスピネシブ(ispinesib))、ＳＢ－７４３９２１、ＭＫ－０７３１、ＳＴＡ－５３１２、エリュテロビン、１７β－アセトキシ－２－エトキシ－６－オキソ－Ｂ－ホモ－エストラ－１,３,５(１０)－トリエン－３－オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４－エピ－７－デヒドロキシ－１４,１６－ジデメチル－(＋)－ディスコデルモリドおよびクリプトチロン(cryptothilone)１であるが、これらに限定されない抗増殖性薬剤。
ここに記載する抗ＴＩＭ３抗体を用いる治療とともに、またはそれに先立って異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合には、１７ａ－エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル－テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ZOLADEXTM(登録商標)などのホルモンおよびステロイド(合成類似体を含む)も、患者に投与できる。ここに記載する方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床設定において腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望まれるように投与できる。
ある実施態様において、ここに記載の抗ＴＩＭ３抗体および第２の薬剤の組合せを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の抗ＴＩＭ３抗体および第２の薬剤を有する別個の組成物として同時に、投与できる。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体および第２の薬剤の組合せは、逐次的に投与され得る。２つの薬剤の投与は、例えば、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日間、５日間、７日間、または１週間もしくは数週間離れた時点で開始してもよく、または第２の薬剤の投与は、例えば、第１の薬剤を投与した３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、３日後、５日後、７日後、または１週間後もしくは数週間後に開始してもよい。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体および／または第２の薬剤と組み合わせることができる抗新生物抗体としては、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、リンホサイド(Lymphocide)(登録商標)(エプルツズマブ(eprtuzumab))、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)またはこれらの何れかの組合せが挙げられる。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体との組み合わせ治療に有用な第２の抗体は、抗体薬物コンジュゲートであり得る。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、単独または別の薬剤と組み合わせて、造血起源の様々な腫瘍を処置するために、骨髄移植と同時にまたは逐次的に使用される。
ここに提供されるのは、第２の薬剤を伴って、または伴わずに対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患(例えば、癌)の治療と関連する有害事象を変更するための方法である。例えば、ここに記載する方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体誘導性大腸炎または下痢の罹患率を低減する方法を提供する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるグルココルチコイドである。ここに記載するある実施態様において、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって代謝される局所活性糖質コルチコイドである。ENTOCORT EC(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の治療のために米国において承認されている。ある実施態様において、非吸収性ステロイドを伴う抗ＴＩＭ３抗体を、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸は、例えば、スルファサラジン(AZULFIDINE(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(DJPENTUM(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(COLAZAL(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(ASACOL(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA(登録商標)、Shire US；CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA(登録商標)、Solvay)などの５－ＡＳＡ薬剤を含む。
本開示の実施には、別途示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来的な技法が用いられ、これらは、当業者の技能の範囲内である。そのような技法は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)、D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II、Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis、Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195、Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization、Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation、Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)、Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)、Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning、the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)、Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155、Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)、Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV、Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); )、Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照のこと。
上記に引用された参考文献のすべて、ならびに本明細書において引用されるすべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるものである。
実施例１：ヒト抗ＴＩＭ３抗体の同定
ヒトＩｇＧトランスジェニック(ＫＭ)マウスを、ヒトＴＩＭ－３をトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３ヒト細胞の原形質膜画分を用いて免疫処置した。免疫処置したすべてのマウスからのリンパ節細胞を、ＳＰ２／０融合パートナーと融合させた。ハイブリドーマ上清を、まず、ハイスループットアッセイを使用して、ヒトＩｇＧ抗体の存在に関してスクリーニングした。次いで、抗原特異性を、ヒトＴＩＭ－３をトランスフェクトした細胞においてＦＡＣＳ結合によって判定した。すなわち、４７回の融合を行い、３９３５個のＩｇＧ陽性クローンを同定し、そのうちの４４８個が、ＥＬＩＳＡによって、ｈＴＩＭ３陽性であると同定され、このうち１２６個が、ｈＴＩＭ３ ＦＡＣＳによって陽性であることが見出された。これらのうち、１１７個のクローン(または抗体)を、次のものを含む種々の方法によってさらに分析した：(１)Biacoreによって行われるエピトープビニング、(２)ＥＣ５０を判定するための、ＴＩＭ３の、ＴＩＭ－３をトランスフェクトした細胞株(２９３－ＴＩＭ３)との結合、(３)Ｔｈ１アッセイ(以下にさらに記載される)および(４)ＴＩＬアッセイ(以下にさらに記載される)。１１７個のうち、完全ヒト抗ヒトＴＩＭ３抗体を発現する９個のハイブリドーマ：１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３を、望ましい特徴を有するとして選択した。これらのハイブリドーマによって産生された抗体の可変ドメインのアミノ酸およびそれらをコードするヌクレオチド配列を、図１Ａ～９Ｄに提供し、ＣＤＲ、可変領域ならびに重鎖および軽鎖ならびにそれらのアイソタイプの配列番号を、図１３に提供する(ハイブリドーマ名の行を参照のこと)。ハイブリドーマおよびそれによって分泌される抗体は、同じ名称を有する(例えば、１３Ａ３)。
抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３のＣＤＲおよび／または可変ドメインを有する抗体を、宿主細胞への組み換えにより発現させた。特に断らない限りＶＫ１を２３Ｂ３およびそのバリアント(例えば、ＴＩＭ３.２５)の軽鎖として使用した。組み換え抗体をその名称「ＴＩＭ３.２」～「ＴＩＭ３.１８」、「ＴＩＭ３.２０」、「ＴＩＭ３.２１」、「ＴＩＭ３.２２」、「ＴＩＭ３.２３」、「ＴＩＭ３.２４」および「ＴＩＭ３.２５」と指称する。「ＴＩＭ３.２」～「ＴＩＭ３.１８」、「ＴＩＭ３.２０」、「ＴＩＭ３.２１」、「ＴＩＭ３.２２」、「ＴＩＭ３.２３」、「ＴＩＭ３.２４」および「ＴＩＭ３.２５」の名称によりこれら組み換え抗体の何れかを指称するとき、特定の定常領域は参照されない、すなわち、抗体ＴＩＭ３.２～ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２０、ＴＩＭ３.２１、ＴＩＭ３.２２、ＴＩＭ３.２３、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５は、何れかの所望の定常領域、例えば、図１６に示すものを有し得る。
ＣＤＲおよび可変ドメインは、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むエフェクターレスＩｇＧ１定常領域(アロタイプ「ｆ」)(「ＩｇＧ１.１ｆ」)および置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａを含む、すなわち、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ置換を有しないことによってのみＩｇＧ１.１ｆと異なる、ＩｇＧ１.３ｆ、エフェクターレスＩｇＧ１定常領域(アロタイプ「ｆ」)の状況で発現させた。ＣＤＲおよび可変領域を、ＩｇＧ４、例えば、ＩｇＧ４Ｐ(すなわち、「Ｓ２２８Ｐ」置換を有するＩｇＧ４)の状況でも使用し得る。これらの抗体のあるＣＤＲおよびフレームワーク領域も変異させている。具体的に、１３Ａ３および８Ｂ９のＶＨ ＣＤＲ２、１３Ａ３のＶＨ ＣＤＲ３、９Ｆ６のＶＨ ＦＲ４および２３Ｂ３のＶＨ ＦＲ１およびＦＲ３が変異されている。製造したまたは製造され得る抗体の一覧を図１６、表１および配列表に示す。組み換えにより発現される抗体は、下記実施例のものならびにＩｇＧ１.１ｆ抗体を発現している抗体３Ｇ４、８Ｃ４、９Ｆ６、８Ｂ９、１７Ｃ８を含む。
抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、１４Ｈ７および２３Ｂ３の重鎖および軽鎖可変領域の配列アライメントは、それぞれ図１０Ａおよび１１Ａに提供される。ＶＨおよびＶＬ領域配列指示は、それぞれ図１０Ｂおよび１１Ｂに提供する。野生型および変異１３Ａ３重鎖の配列アライメントは図１２に提供する。野生型および変異９Ｆ６重鎖の配列アライメントは図１３に提供する。野生型および変異８Ｂ９重鎖の配列アライメントは図１４に提供する。野生型および変異２３Ｂ３重鎖の配列アライメントは図１５に提供する。
実施例２：ヒト抗ＴＩＭ３抗体の特徴づけ
選択抗ＴＩＭ３抗体を、フローサイトメトリーを使用してＴＩＭ３発現細胞への結合についてアッセイした。図１７Ａおよび１７Ｂに示すとおり、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３、１７Ｃ３、１７Ｃ８、３Ｇ４、８Ｂ９および９Ｆ６は、類似する親和性でヒトＴＩＭ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞(図１７Ａ)および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ヒトＴ細胞(図１７Ｂ)両者に結合できた。抗ＴＩＭ３抗体８Ｃ４はまた活性化ヒトＴ細胞に結合した(図１７Ｂ)。同様に、抗ＴＩＭ３抗体１４Ｈ７および２３Ｂ３も活性化ヒトＴ細胞に結合した(図１８)。
抗ＴＩＭ３抗体を、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトしたカニクイザルＴＩＭ３に結合する能力について試験した。図１９Ａに示すとおり、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３、１７Ｃ３および３Ｇ４はカニクイザルＴＩＭ３に結合でき、一方抗体９Ｆ６、８Ｂ９および１７Ｃ８はできなかった。カニクイザルＴＩＭ３に結合したこの３抗体のうち、１３Ａ３抗体は最強親和性であった(提供されたＥＣ５０値に基づく)。図２０に示すとおり、抗ＴＩＭ３抗体１４Ｈ７および２３Ｂ３は、ヒトまたはカニクイザルＴＩＭ３でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合できた。
抗ＴＩＭ３抗体が活性化カニクイザルＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合するか否かを評価するために、カニクイザル血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を４日間プレート結合抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８で刺激した。次いで、関連抗ＴＩＭ３抗体を培養に加え、活性化カニクイザルＴ細胞への結合をフローサイトメトリーを使用して評価した。抗ＴＩＭ３抗体のいくつかは、ＣＨＯ細胞に発現されたカニクイザルＴＩＭ３に結合でき(上記のとおり)、１３Ａ３、１４Ｈ７および２３Ｂ３抗体のみが、活性化カニクイザルＴ細胞と反応性であった抗ＴＩＭ３抗体であった(図１９Ｂおよび１９Ｃ)。
実施例３：表面プラズモン共鳴により決定されるヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３に対する抗ＴＩＭ３抗体の結合親和性
抗ＴＩＭ３ １３Ａ３ Ｆａｂ断片の、ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３に対する動態および親和性を、以下にさらに記載されるとおり、３７℃、０.０５％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ－２０を補充したＰＢＳ ｐＨ７.４において、Biacore T200機器で判定した。使用したヒトＴＩＭ３タンパク質は、マウスＦｃに連結されたヒトＴＩＭ３の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)からなり、したがって、二量体ｈＴＩＭ３ ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質(「ｈＴＩＭ３－ｍＦｃ」)を形成していた。この融合タンパク質は、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から発現させ、プロテインＡ親和性、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、培地から精製した。使用した組換えカニクイザルＴＩＭ３タンパク質は、カニクイザルＴＩＭ３の細胞外ドメイン、続いて、リンカーおよび親和性タグからなり、したがって、単量体カニクイザルＴＩＭ３ ＥＣＤタンパク質(「カニクイザルＴＩＭ３－ＭｙｃＨｉｓＡｖｉ」)を形成していた。この融合タンパク質は、一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞(Life Tech)から発現させ、このタンパク質を、親和性タグを使用して(６ｘ Ｈｉｓ)、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって、培地から単離し、精製した。
ｈＴＩＭ３－ｍＦｃのアミノ酸配列は次のとおりであった。
(配列番号３７５)
カニクイザルＴＩＭ３－ＭｙｃＨｉｓＡｖｉのアミノ酸配列は次のとおりであった。
(配列番号３７６)
ヒスチジンテイルに結合した１３Ａ３およびＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のＦａｂを使用した。１３Ａ３重鎖(ＨＣ) Ｆａｂ ６ｘＨｉｓのアミノ酸配列は次のとおりであった。
(配列番号３６５)
１３Ａ３重鎖(ＨＣ) Ｎ６０Ｑ Ｄ１０１Ｅ Ｆａｂ ６ｘＨｉｓのアミノ酸配列は次のとおりであった。
(配列番号３６６)
組換え１３Ａ３およびＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３ Ｆａｂを、Ｅｘｐｉ２９３(Life Tech)の一過的トランスフェクションを使用して作製した。発現されたＦａｂは、重鎖可変領域、続いて、ｈＩｇＧ１のＣＨ１、および軽鎖可変領域、続いて、ｈＫａｐｐａのＣＬドメインを含んだ。発現されたＦａｂは、培地に分泌され、親和性タグ(６ｘＨｉｓ)を使用して、精製した。
抗マウス抗体捕捉チップを、Biacoreマウス抗体用捕捉キット(catalog #BR-1008-38)を使用して、Biacore CM4シリーズＳチップ(GE Healthcare Life Sciences catalog #BR-1005-34)に調製した。ヒトＴＩＭ３－マウスＦｃ融合タンパク質を、フローセル２および３に、２つの異なる表面密度で捕捉した。カニクイザルＴＩＭ３－マウスＦｃ融合タンパク質を、フローセル４に捕捉した。フローセル１(ブランク捕捉表面)は、参照としての機能を果たした。組換えで発現させたＨｉｓタグ化抗体Ｆａｂ断片を、検体として、上方濃度１.０μMおよび下方濃度４.１nMで、３倍の６回希釈系列において、すべての表面に流した。結果として得られたセンサグラムを、二重参照し(フローセル１および緩衝液ブランクを使用して)、質量移動を伴う１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。フローセル２および３からのデータを、全体に当てはめた。
複合体の形成(Ｋａ)および解離(ＫＤ)の速度、ならびに全体的な解離定数(ＫＤ)を、表２に提供する。
１３Ａ３を用いた実験は、ＴＩＭ３.１８を用いた実験と同日には行わなかった。
実施例４：スキャッチャード解析によるヒトおよびカニクイザルへのＴＩＭ３抗体の結合親和性
ＴＩＭ３.１８ＩｇＧＩ.３抗体を、IODO-GEN(登録商標)固相ヨウ素化試薬(１,３,４,６－テトラクロロ－３ａ－６ａ－ジフェニルグリコウリル; Pierce Catalog 28601)を使用して、１２５Ｉ－Ｎａ(１mCi; PerkinElmer Catalog NEZ033H001MC)で放射ヨウ素標識した。過剰なヨウ素を、脱塩カラム(Pierce Catalog 43243)を使用して、除去した。標識した抗体の画分を採取し、Wizard 1470ガンマカウンター(PerkinElmer)で放射活性について分析した。各画分における１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧＩ.３抗体濃度を、InvitrogenのQubitフルオロメーターを用いて計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射活性画分(Pinestar Technology Catalog 151-005)の薄層クロマトグラフィーによって確立した。
放射性ヨウ素標識したＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の、ヒトまたはカニクイザルＴＩＭ３を発現するＣＨＯ細胞との結合を、ヒトまたはカニクイザルＴＩＭ３を発現するＣＨＯ細胞を、１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の滴定物とともにインキュベートすることによって、示した。非特異的結合を、１００倍モル過剰の非標識抗体の滴定物の存在下における結合によって決定し、これを、次いで、ＣＰＭの合計から差し引いて、特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の濃度の線形標準曲線を使用して、特異的活性、最大のnMでの１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
結果を図３２Ａおよび３２Ｂに示す。125Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体標準曲線(図３２Ａ)は、１nMの１２５Ｉ標識化抗体が、８１１１９.３cpmに等しいことを示す。細胞１個当たりの受容体数は、以下の等式によって計算した：(Bmax)×(アボガドロ数)×(アッセイ体積)／１ウェル当たりの細胞数。結果は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体が、ＣＨＯ細胞上の過剰発現したヒトＴＩＭ３(細胞１個当たり４１４,７２０個の受容体を有する)に対して、０.２６～０.４８nMの親和性を有し、過剰発現したカニクイザルＴＩＭ３(細胞１個当たり２３５,９４４個の受容体を有する)に対して、０.３６～０.４８nMの親和性を有することを示した。
２ドナーに由来する活性化ヒトＴｈ１細胞(細胞５０,０００個／ウェル)において１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体を用いて行った同様の分析により、ドナー間で細胞１個当たりの受容体数がほぼ４倍異なるにもかかわらず、０.１２５～０.１６４nMの親和性が得られた(図３３)。放射ヨウ素標識したＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の、ヒトＴＩＭ３との結合を、活性化初代ヒトＴｈ１細胞(本明細書の他の実施例に記載されるとおり調製)を、１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の滴定物とともにインキュベートすることによって、示した。非特異的結合を、１００倍モル過剰の非標識抗体の滴定物の存在下における結合によって決定し、これを、次いで、ＣＰＭの合計から差し引いて、特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の濃度の線形標準曲線を使用して、最大のnMでの１２５Ｉ－ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
まとめて、上記データは先の実施例の結果を確認し、バリアントＴＩＭ３.１８を含む抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３がヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３両者に強い親和性で結合することを示した。
実施例５：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の、ヒトＴＩＭ１、ヒトＴＩＭ４およびマウスＴＩＭ３との交差反応性の欠如
遺伝子バンク全体に対してＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインをｂｌａｓｔ検索すると、最も高い相同性の分子は、ＴＩＭ１およびＴＩＭ４(４５％同一性)であった。ヒトＴＩＭ１またはＴＩＭ４をトランスフェクトした細胞株を使用したフローサイトメトリーによるＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の選択的なプロファイリングでは、ＴＩＭ１またはＴＩＭ４に対する交差反応性は示されなかった(データは示していない)。マウスＴＩＭ３をトランスフェクトした細胞におけるフローサイトメトリーによって、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、マウスＴＩＭ－３をトランスフェクトした細胞と交差反応性ではないこともまた、示された(データは示していない)。
実施例６：腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)によるＩＦＮ－γ産生は、抗ＴＩＭ３抗体によって増強される
抗ＴＩＭ３抗体をさらに特徴付け、インビボで有意なＴ細胞刺激活性を有する可能性が高いものを同定するために、特定のＴ細胞アッセイを開発した。アッセイは、新しい腫瘍組織から単離され、ＣＤ３を発現する照射したＣＨＯ細胞(「ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞」)の存在下においてインキュベートした、腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)から分泌されるＩＦＮ－γの量を、ＴＩＭ３抗体の存在下または非存在下(または対照)において、測定する。特定の作用機序に限定されることを望むものではないが、所与の抗ＴＩＭ３抗体の存在下におけるＩＦＮ－γの分泌は、その抗体が、ＴＩＬ上のＴＩＭ３によって通常提供される負のシグナル伝達を阻害し、ＴＩＬの活性化(すなわち、ＩＦＮ－γ産生)を刺激することを示す。
腎臓細胞癌
腎細胞癌患者に由来する新しい腫瘍組織[腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)を含む]を、酵素消化(Miltenyi, Catalog #130-095-929)による単一細胞懸濁液に調製した。細胞生存率は、ＦＡＣＳによって判定した場合、８０％を上回っていた。約１.５×１０５個の細胞を、２.５×１０４個の照射した(１時間２０分間で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator, RS-2000 Biological System)ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞とともに、ＩＬ－２含有培地[ＩＬ－２(Peprotech, Catalog # 200-02)、２０IU／ml]において、アイソタイプ対照抗体または異なる濃度の抗ＴＩＭ３抗体のいずれかの存在下で、５日間共培養した。培養の５日目に、細胞上清を収集し、ＩＦＮ－γレベルを、ＥＬＩＳＡ(BD Opteia ｈＩＦＮγ ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ、Catalog # 555152)によって評価した。図２１に示される結果は、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８および９Ｆ６が、腎細胞癌ＴＩＬによるＩＦＮ－γ産生を刺激できたことを示す。
肺癌
肺癌患者に由来する新しい腫瘍組織を、Miltenyi酵素消化キット(Miltenyi, Catalog #130-095-929)を用いて消化させた。単一細胞懸濁液を、照射した(１時間２０分間で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞とともに、ＩＬ－２含有培地[ＩＬ－２(Peprotech、Catalog # 200-02)、２０ＩＵ／ml]において、アイソタイプ対照抗体または異なる濃度の抗ＴＩＭ３抗体の存在下で、５日間共培養した。培養の５日目に、細胞上清を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ(BD Opteia ｈＩＦＮγ ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ、Catalog # 555152)のために収集した。図２２Ａに示すとおり、試験した抗ＴＩＭ３抗体(すなわち、１３Ａ３および３Ｇ４)は、肺癌ＴＩＬによるＩＦＮ－γ産生を刺激できた。
さらに、ＩＬ－２の存在下においてアイソタイプ対照抗体または抗ＴＩＭ３抗体で処置した、肺癌腫瘍組織からの細胞懸濁液と照射した(１時間２０分で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞との共培養の３.５日目に、細胞を、BD GolgiStopとともに一晩インキュベートした。続いて、細胞を、まず、細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＩＭ３およびＰＤ１で染色し、次いで、BD Cytofix/Cytopermキットによる固定化および透過処理を行った後、細胞内ＩＦＮ－γ染色を行った。図１７Ｂに示される結果は、細胞内ＩＦＮ－γ発現細胞の割合が、抗ＴＩＭ３抗体で処置した場合、ＣＤ８＋細胞(下のパネル)において増大されることを示す。
さらなる癌
図２３は、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３または３Ｇ４(すなわち、図の全ての点は、１３Ａ３または３Ｇ４で処理した１患者腫瘍サンプルからのＴＩＬを表す)に応答した複数の腫瘍ＴＩＬ実験から集められたデータを示す(上記実施例のとおり実施)。上記データに一致して、抗ＴＩＭ３抗体は全腎臓細胞癌(ＲＣＣ)および肺癌患者から単離したＴＩＬでＩＦＮ－γ産生を誘発した。同様に、２膵臓癌患者からのＴＩＬも抗ＴＩＭ３抗体に応答してＩＦＮ－γを産生した。対照的に、１甲状腺腫瘍患者からのＴＩＬは、抗ＴＩＭ３抗体処置に応答したＩＦＮ－γは見られなかった。
まとめて、上記データは、ここに開示する抗ＴＩＭ３抗体が種々の癌からのＴＩＭ３に効率的に結合し、ＴＩＬ(主にＣＤ８＋ Ｔ細胞)を誘発し、ＩＦＮ－γを産生することができることを示す。
実施例７：ＦＡＣＳに基づく抗ＴＩＭ３抗体の交差遮断
全ヒトＴ細胞を、Miltenyi Ｔ細胞精製キットを使用して、ＰＢＭＣから単離し、プレート結合型抗ＣＤ３(１μg／ml、抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３、eBioscience、カタログ番号１６－００３７－８５)および可溶性抗ＣＤ２８(１μg／ml、抗ＣＤ２８クローンＣＤ２８.２、BD Biosciences、カタログ番号５５５７２５)を用いて、４日間活性化させた。ＴＩＭ３は、ＦＡＣＳによって判定した場合、Ｔ細胞の８０％超に発現していた。Ｔ細胞を、種々の抗ＴＩＭ３抗体とともに、３０分間インキュベートした後、選択されたビオチン標識化抗ＴＩＭ３抗体とともに、３０分間インキュベートし、ＰＥコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出した。図２４Ａおよび２４Ｂに示される結果は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、１４Ｈ７および２３Ｂ３が、同一のビニング群(群Ｉ)である、すなわち、互いに交差競合するが、一方で、抗体８Ｂ９および８Ｃ４は、別個のビニング群(群II)である、すなわち、群Ｉの抗体とは交差競合しないが、互いには交差競合することを示す。ビニング群Ｉの抗体は、生物学的活性を有することが示されたが(実施例を参照のこと)、一方で、ビニング群IIのものは、それよりも弱い活性を有した。群Ｉまたは群IIのいずれとも交差競合しなかった２つの抗ＴＩＭ３抗体は、いずれの生物学的活性も有するとは見えなかった。ビニング群Ｉの抗体はまた、ＴＩＭ３のＰＳとの結合を妨害した(本明細書においてさらに記載される)。
実施例８：酵母表面提示法によるエピトープマッピング
ヒトＴＩＭ３(ＮＭ＿０３２７８２)の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列、すなわち、
(配列番号２９０)を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位へのライゲーションによって、酵母提示プラスミドＰＤＶ００２３にクローニングした。Agilent TechnologiesからのGeneMorph II Random Mutagenesisキットを使用して、低い割合のランダム突然変異誘発を、この配列に行って、ＴＩＭ３をコードする領域全体に単一点突然変異を起こさせた。９.８×１０６個のクローンのライブラリーを、ＶＷＫ１８ｇａｌ出芽酵母細胞において生成した。２×１０８個のライブラリー細胞を、継代させ、抗体標識および細胞分取のために誘導した。約２×１０７個の誘導された細胞を、１００nMの一次標的抗ヒトＴＩＭ３抗体および１００nMの抗ｃＭｙｃ(９Ｅ１０)抗体とともに、２５℃で１時間、インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、蛍光標識化したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥおよびヤギ抗マウスＩｇＧ－Ａ６３３二次抗体で、４℃で４５分間検出を行って、細胞表面に結合した一次抗体を検出した。標識化された細胞を、BD FACSARIA II機器で、酵母培養培地中に分取した。抗Ｍｙｃ抗体で正に標識化され、抗ヒトＴＩＭ３で負に標識化された細胞を、収集した。ＡＰＣ＋／ＰＥ－の細胞集団を増殖させ、継代し、２回目の同一標識化および分取のために誘導し、所望される集団を濃縮した。酵母プラスミドＤＮＡを、約２ １０７個の未選択ライブラリーに由来する細胞および２回の選択を経て収集された細胞から、精製した。それぞれの細胞集団について、ＴＩＭ３標的配列を、回収し、ヒトＴＩＭ３配列に隣接するベクター特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによって酵母プラスミドＤＮＡから精製した。標的配列のＰＣＲ産物を、IlluminaからのIllumina Sequencing用のNextera XT DNA Libraryキットを使用して、ＮＧＳライブラリー調製に付した。調製されたライブラリーを、IlluminaからのＭｉＳｅｑプラットフォームにおける３００サイクル／フローセルでのハイスループットシーケンシングのために、EA/Q2 Solutionsに送った。それぞれのライブラリーの５０～１００万個の配列リードを、野生型ＴＩＭ３配列と比較し、配列に沿ってそれぞれの位置における突然変異について、表を作成した。選択した場合と未選択のライブラリーとの間での、それぞれの残基位置における突然変異頻度の差異を、計算し、抗体結合に重要な残基を判定するために使用した。高い突然変異頻度を有する位置を、マウスＴＩＭ３の公知の結晶構造(ＰＤＢ：２ＯＹＰおよびＰＤＢ：３ＢＩＢ)に基づいて、ヒトＴＩＭ３構造モデルを使用して、表面露出に関して試験した。高い突然変異頻度の表面に露出した残基は、エピトープの一部と考えられるが、一方で、高い突然変異頻度の包埋した残基は、偽陽性と考えられる。偽陽性残基は、通常、タンパク質の局所的または中心的のいずれかのフォールディングを破壊し、抗体のその表面エピトープとの結合を間接的に変更するものである。
図２５は、使用した抗ＴＩＭ３抗体(すなわち、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３および８Ｂ９)のそれぞれについて、ヒトＴＩＭ３におけるエピトープの一部と判定された残基を示した。加えて、Ｄ１０４は、すべてのマッピングにおいて、正の突然変異スコアを示し、Ｒ８１に対する構造的塩架橋であり得る。８Ｂ９のエピトープについては、Ｌ８４が、高い突然変異頻度を示すが、エピトープ残基を補助する構造に包埋されていると考えられた。Ｑ１１３は、１３Ａ３抗体について、低いが陽性のスコアを示した。この残基は、エピトープ領域の構造的補助の役割を果たすが、いくらかの表面露出を有する可能性が高い。
実施例９：ＴＩＭ３抗体のＴＩＭ３－ＰｔｄＳｅｒ相互作用の遮断
図２６Ａに示される「タンデム遮断アッセイ」を使用して、ここに開示する抗ＴＩＭ３抗体が、ヒトＴＩＭ３とホスファチジルセリン(「ＰｔＳｅｒ」または「ＰＳ」)との間の相互作用を阻害するかどうかを判定した。ＰＳは、水溶性ではないため、ＰＳ－リポソームを、アッセイのために作製した。すなわち、脂質を、メタノール／クロロホルムと混合し、次いで、クロロホルムを、窒素流および真空下において、一晩蒸発させた。続いて、脂質を、マイクロチップを用いて超音波処理し、脂質を完全に分散させて、リポソームを作製した。これらを、さらに、１０回よりも多く押出器を通過させて、確実に均一なサイズになるようにした。
ＰＳリポソームを、クロロホルム中に懸濁したＰＳ[Ｌ－α－ホスファチジルセリン(脳、ブタ)Avanti Polar Lipids Cat# 840032C]を用いて生成した。ＰＳストックを、まず、クロロホルム中に希釈して必要な量にし、クロロホルムを、液体が見えなくなるまで窒素流下において蒸発させた。微量のクロロホルムを除去するために、乾燥させたＰＳを、真空下に一晩おいた。乾燥させたＰＳを、次いで、ボルテックスおよび短時間の超音波処理により、溶液が混濁するまでＰＢＳ中に懸濁した。サイズが定まったＰＳリポソームを作製するために、１００nmのフィルターを備える押出器を使用した。懸濁したＰＳを、押出器に充填し、少なくとも１０回、フィルターを通過させた。この時点で、ＰＳリポソームを、必要とされる濃度までＰＢＳ中に希釈した。
「タンデム遮断アッセイ」において、ＴＩＭ３(ＥＣＤ)－Ｆｃを、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーで捕捉し、抗ＴＩＭ３抗体およびＰＳ－リポソームを、ＴＩＭ３タンパク質に結合させた。抗ＴＩＭ３抗体が、ＰＳの結合を遮断する領域に結合したとき、ＰＳ－リポソームは、結合を示さない。
図２６Ｂに示す結果は、抗体３Ｇ４、１３Ａ３、１７Ｃ３および１７Ｃ８がＰｔＳｅｒのヒトＴＩＭ３への結合を阻害できたことを示した。対照的に、異なる領域(すなわち、ＡｂＡおよびＡｂＢ)でＴＩＭ３に結合する二つの他の抗ＴＩＭ３抗体は結合を阻害しなかった。実施例にさらに記載するとおり(例えば、実施例６および１３参照)、ＴＩＭ３へのＰｔＳｅｒ結合を阻害した抗体は、最強機能活性のものでもあった(Ｔｈ１およびＴＩＬアッセイで決定)。
実施例１０：ＴＩＭ３抗体のＨＤＸ－ＭＳエピトープマッピング
水素／重水素交換質量分析法(ＨＤＸ－ＭＳ)を利用して、抗体１３Ａ３および３Ｇ４と結合するｈＴＩＭ－３のエピトープを調べた。
ＨＤＸ－ＭＳにより、骨格アミドの水素原子の重水素交換の速度および程度をモニタリングすることによって、溶液中のタンパク質のコンホメーションおよびコンホメーション動態を調べる。ＨＤＸのレベルは、骨格アミドの水素原子の溶媒接触可能性およびタンパク質の水素結合に依存する。ＨＤＸ時のタンパク質の質量増大を、ＭＳによって正確に測定することができる。この技術を酵素消化と組み合わせた場合、ペプチドレベルでの構造特性を解析することができ、表面に露出しているペプチドを、内部に折り畳まれているもの、またはタンパク質－タンパク質複合体の接合部で封鎖されているものと、区別することが可能となる。通常、重水素標識および続いて反応停止処理の実験を行い、続いて、酵素消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を行った。
エピトープマッピング実験の前に、非重水素化実験を行って、組換えヒトＴＩＭ－３[(ｈＴＩＭ３－ＥＣＤ(２２－２００)Ｈｉｓ－タグ化(図３０参照)、１０μM、Sino Biological Inc.]の一般的なペプチドならびにｈＴＩＭ－３と抗体１３Ａ３および３Ｇ４のＦａｂとのタンパク質複合体(１：１のモル比)の一覧を作成した。サンプルを、Waters Enzymate BEHペプシン酵素カラム(２.１×３０mm)に注入し、２００℃で３分間消化させた。クロマトグラフィー要素をすべて収容したＵＰＬＣシステムの冷却チャンバを、測定の全時間の間、０.０±０.１℃で保持した。注入したペプチドを、１００μL／分で３分間、トラップし、脱塩した後、６５μL／分で５～４０％のアセトニトリル－水の勾配によって、６分間で分離した。分離カラムは、１.０mm×５０.０mmのACQUITY UPLC BEH C18カラム(Waters)であった。消化性ペプチドの同定は、Waters HDX-MSシステムにおいてProteinLynx Global SERVER 2.5(Waters)を使用して、厳密な質量分析およびＭＳＥの組合せによって達成した。
ＨＤＸ－ＭＳ実験では、５μLのそれぞれのサンプル(ｈＴＩＭ－３または抗体１３Ａ３もしくは３Ｇ４のＦａｂを有するｈＴＩＭ－３)を、５５μLのＤ２Ｏ緩衝液(１０mMリン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＨ７.０)中に希釈して、標識反応を開始した。反応は、異なる期間：１分間、１０分間および２４０分間行った。各標識反応期間の終わりに、反応停止緩衝液(４Ｍ ＧｄｎＣｌおよび０.４Ｍ ＴＣＥＰを含む１００mMリン酸緩衝液、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ)を添加することによって、反応を停止させた。５０μLの反応停止処理したサンプルを、非重水素化実験におけるものと同一の条件を使用して、オンラインで消化させた。すべての比較実験は、同一の実験条件下で行った。すべての実験は、２連に行った。結果として得られた相対的な重水素レベルを、ソフトウェアプログラムDynamX 3.0(商標)(Waters)の使用により、交換時間に対してプロットした。
図３０に示されるように、ｈＴＩＭ－３の９７.３％の配列カバレッジが、ＨＤＸ－ＭＳ実験において得られた。図３１に示されるように、抗体１３Ａ３および３Ｇ４のＦａｂと結合したとき、ｈＴＩＭ－３のＨＤＸ－ＭＳデータ分析により、次の不連続なエピトープが同定された：
ｍＡｂ １３Ａ３：49VPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６７)、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３６８)およびそのフラグメント119NDEKFNLKL127；および
ｍＡｂ ３Ｇ４：40YTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFE62(配列番号３６９)、66VVLRTDERDVNY77(配列番号３７０)、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95(配列番号３７１)および110ＣRIQIPGIMNDEKFNLKL127(配列番号３７２)。
図３１は、本実施例に記載されるＨＤＸ－ＭＳプロトコールを使用して判定した場合に、抗体１３Ａ３および３Ｇ４が結合するＨＤＸ－ＭＳペプチドを示す。
故に、上記データは抗体１３Ａ３が、ｈＴＩＭ３のアミノ酸残基４９～６２および１１１～１２７の領域と相互作用するが、他の領域、例えば、アミノ酸残基Ｙ４０またはＶ４９に対してＮ末端側である領域、アミノ酸残基Ｅ６２とＲ１１１との間に位置する領域、およびアミノ酸残基Ｌ１２７に対してＣ末端側である領域とは有意に相互作用しないことを示す。データはまた１３Ａ３が、ＴＩＭ－３ ＩｇＶドメインのホスファチジルセリン結合ループと結合することも示す。
実施例１１：ヒト組織交差反応性におけるＴＩＭ３.１８による標的を定めたＩＨＣ染色
免疫組織化学的検査(ＩＨＣ)を、ヒトおよびカニクイザルの脾臓の凍結切片において、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３を用いて行った。いずれの種でも、１３Ａ３(０.５μg／mL)により、静脈洞様血管の内皮が染色された。予測した通り、カニクイザルＴＩＭ－３と交差反応しない抗体３Ｇ４は、ヒト脾臓は染色したが、カニクイザル脾臓は染色しなかった(データは示していない)。
予備的な組織交差反応性分析において、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体を、大脳、小脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、ＰＢＭＣスメア、脾臓、扁桃腺、胸腺、皮膚、結腸、小腸、胃、膵臓、末梢神経、下垂体、甲状腺、前立腺、および胎盤(それぞれ１ドナー)を含む、２０種類の異なる正常なヒト組織に由来する凍結切片またはスメアに適用した(データは示していない)。特異的染色が、ＰＢＭＣ、脾臓および扁桃腺の単核細胞(ＭＮＣ)ならびに胸腺の上皮網状細胞またはマクロファージのサブセットにおいて、観察された(データは示していない)。最も顕著な染色は、マクロファージ／ＤＣ様細胞におけるものであり、これは、組織特異的マクロファージ(例えば、肝臓におけるクッパー細胞、皮膚における真皮マクロファージ／ＤＣおよび胎盤におけるホーフバウワー細胞)を含め、試験したすべての組織において観察された。器官レベルでは、最も強力な染色は、脾臓において見出された。ＭＮＣの小さなサブセット以外では、強力な染色は、赤脾髄における脾臓内皮細胞において非常に頻繁に見られた。加えて、陽性染色は、腎皮質における皮質尿細管上皮細胞の小さなサブセットにおいて観察された(データは示していない)。
実施例１２：マウスにおける抗ＴＩＭ３およびＰＤ－１抗体の組合せの抗腫瘍活性
ラット抗マウスＴＩＭ－３(ＲＭＴ３ ２３)およびＰＤ－１(ＲＭＰ１－１４)の市販の抗体(Ｂｉｏ－Ｘ－Ｃｅｌｌ)を、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおいて評価した。実験の設計は、インビボでの研究Ngiow et al. (2011) Cancer Res. 71:3540においてこれまでに説明されているものと同様であった。ＴＩＭ－３は、この腫瘍モデルでは比較的後期(１５日目)に発現されるため、腫瘍成長が最小限となり、ＴＩＭ－３発現の時間が得られるように、少量の腫瘍細胞(２×１０５個)を、それぞれのマウスの側腹部に移植した。８日目に、腫瘍が容易にわかるようになったときに、マウスを、１０匹ずつのマウスで４つの処置群に、平均腫瘍体積は４０mm３で無作為化した。ＲＭＴ３－２３(抗ＴＩＭ－３抗体)およびＲＭＰ１－１４(抗ＰＤ－１抗体)を、単剤または組合せの薬剤(それぞれの抗体の１回の注射当たり２５０μg)のいずれかとして、腹腔内注射によって投与し、アイソタイプ対照は、１回の注射当たり５００μgで投与した。それぞれの実験動物は、それぞれの注射で、２５０μgの１種類の抗体または５００μgの２種類の抗体の組合せを、合計３回の用量で受容させた。腫瘍サイズを、２週間に１回評価した。
図２９Ａに示すとおり、単一または組み合わせ試験抗体を受けた各群のマウスは、幾分抗腫瘍活性を示したが、抗ＴＩＭ３抗体と抗ＰＤ－１抗体の組み合わせを受けた動物で最大活性が観察された。例えば、試験の最後に、抗ＰＤ－１単剤療法群の２／１０マウスが無腫瘍であり、組み合わせ抗ＰＤ－１および抗ＴＩＭ３群では、マウスの６／１０が無腫瘍であった(図２９Ａ)。同じデザインの先のＣＴ２６は類似結果をもたらし、抗ＰＤ－１単剤療法群で３／１０マウスおよび組み合わせ抗ＰＤ－１および抗ＴＩＭ３群で７／１０マウスが無腫瘍であった。単剤として投与した抗ＴＩＭ３は抗腫瘍活性がないか、僅かであった(図２９Ａ、上部右パネル)。
顕著なことに、ＲＭＴ３－２３の活性化マウスＴ細胞との結合のＥＣ５０値は、１.７nMであり、これは、ＴＩＭ３.１８のヒトＴＩＭ－３との結合のＥＣ５０よりも１７倍弱い(例えば、実施例２および図１７Ａおよび１７Ｂ参照)。ＲＭＴ３－２３を交差遮断する別のラット抗マウスＴＩＭ－３抗体(Ａｂ Ｍ)は、活性化マウスＴ細胞との結合について、０.１nMのＥＣ５０を有するが、これは、ＴＩＭ３.１８のＥＣ５０と同等である。ＲＭＴ３－２３と同様に、Ａｂ Ｍは、マウスＴＩＭ－３のＰＳ－結合ループにマッピングする。ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ(Ｆｃ不活性アイソタイプ)重鎖定常領域を有するこの抗体を使用することにより、これが、抗ＰＤ－１に対する抗腫瘍応答を増強したことが示された(図２９Ｂ)。
実施例１３：ＴＩＭ３抗体(全長またはＦａｂ)遮断によるＴｈ１細胞増殖アッセイ
抗ＴＩＭ３抗体をさらに特徴付けるために、インビトロで分極化したＴｈ１細胞を使用する特定のＴ細胞増殖アッセイを開発した。分極化Ｔｈ１細胞を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を反復的に再刺激することによって得た。これらの細胞を、次いで、抗ＴＩＭ３抗体(または対照)の存在下において、照射した(成長を停止させた)ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞とともにインキュベートし、Ｔｈ１細胞増殖を測定した。
ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を、以下のように、Ｔｈ１メモリー様Ｔ細胞に分極化させた。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を、MiltenyiからのナイーブＣＤ４ Ｔ細胞単離キットを使用して、ＰＢＭＣから精製した。細胞を、細胞３.６×１０５個／mlで、ビーズ１に対して細胞１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングした(それぞれ８０％／２０％)ビーズ、１０ng／mlのヒトＩＬ－２、１ng／mlのヒトＩＬ－１２および１００００ng／mlの抗ヒトＩＬ－４抗体の存在下において、ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ中で３～４日間、培養した。インキュベーションの後に、細胞を、チューブに収集し、ビーズを、磁石を用いて除去し、細胞を、培養のために新しいフラスコに戻した。組換えヒトＩＬ－２を添加して、最終濃度４ng／mlにし、細胞を、さらに３日間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、１×ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳで洗浄した。細胞を計数し、細胞４.１×１０５個／mlで、ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、ビーズ１に対して細胞１の比率で、ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングした(それぞれ８０％／２０％)ビーズ、１０ng／mlのヒトＩＬ－２、１ng／mlのヒトＩＬ－１２および１００００ng／mlの抗ヒトＩＬ－４抗体の存在下において、３～４日間培養した。インキュベーションの後に、細胞を、チューブに収集し、ビーズを、磁石を用いて除去し、細胞を、培養のために新しいフラスコに戻した。組換えヒトＩＬ－２を添加して、最終濃度４ng／mlにし、細胞を、さらに２～３日間インキュベートした。次いで、分極化したＴｈ１細胞を、採取し、３回洗浄した。アッセイ構築の日に、分極化したＴｈ１細胞を、完全培地中に再懸濁した。
次の試薬を使用した。
ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコ中で成長させ、照射した(１時間２０分で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)。アネキシンＶ染色によって確認した場合、照射したＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞により、Ｔ細胞刺激およびホスファチジルセリン(phophatidylserine)(ＰＳ)の露出がもたらされた。
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３またはアイソタイプ対照を、２０μg／mLから４倍連続希釈によって滴定し、それぞれの条件を３連に構築した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３ Ｆａｂを、５３μg／mLから、これも４倍連続希釈によって滴定した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３ Ｆａｂ断片は、結晶構造解析実験において使用されたものと同一であった(実施例参照)。
培養物を、平底ＴＣ処理９６ウェルプレート(Costar)に、０.１μg／mlの抗ＣＤ２８(クローンＣＤ２８.２、BD Biosciences, Catalog # 5557２５)の存在下において、ウェルごとに２００μLの完全培地中の１×１０５個の分極化したＴｈ１細胞および２.５×１０４個の照射したＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞(ＣＨＯ：Ｔ細胞の比、１：４)を配置し、３７℃および５％ＣＯ２で、３日間インキュベートした。次いで、プレートを、ウェルごとに、１μＣｉのトリチウム化チミジン(Perkin Elmer, Catalog # ＮＥＴ０２７００１ＭＣ)で、１６時間パルス処理した後、細胞を、増殖を評価するためのトリチウム化チミジンの組込みの分析のために、フィルタープレート(Perkin Elmer)に採取した。
図３４Ａおよび３４Ｂに示される結果は、抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、ＣＨＯ－ＯＫＴ３／Ｔｈ１共培養細胞アッセイにおいて、用量依存的様式で、Ｔｈ１細胞増殖を増大させたことを示した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の全体的な活性は、その親抗体１３Ａ３(ＩｇＧ４アイソタイプ)のものと同等であった(図３４Ａ)。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３ Ｆａｂ断片もまた、ＣＨＯ－ＯＫＴ３／Ｔｈ１細胞アッセイにおいて、増殖の用量依存性誘導(図３４Ｂ)を示した。類似の結果がＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５抗体で観察された(図３５)。
故に、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３(全長およびＦａｂの両方)が、照射したＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞との共培養物において、用量依存的様式で、Ｔｈ１細胞活性を強化した。Ｆａｂ断片による活性の存在により、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、アンタゴニスト抗体として機能すること、およびＴＩＭ－３をＴ細胞機能の阻害性受容体であるとして確認し。Ｆｃ架橋は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３生物学的アッセイには必要なかった。
実施例１４：ＴＩＭ ３およびＰＤ １の共遮断によるＴｈ１細胞増殖アッセイ
このアッセイは、抗ＣＤ２８の存在下における、ヒトＰＤ－Ｌ１(ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１)をトランスフェクトした照射した(成長を停止させたもの、１時間２０分で、６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞とＴｈ１細胞との間で、ＣＨＯ：Ｔ細胞の比１：４での共培養であった。ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコにおいて成長させ、照射した。分極化したＴｈ１細胞を、本明細書の他の実施例に記載されるとおり、調製した。アッセイ構築の日に、分極化したＴｈ１細胞を、完全培地中に再懸濁した。
抗ＰＤ－１抗体ニボルマブを、１０μg／mLから１０倍連続希釈によって滴定し、それぞれの条件を３連に構築した。抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３またはアイソタイプ対照を、２０μg／mLでスパイクした。
培養物を、平底ＴＣ処理９６ウェルプレート(Costar)に、[０.１μg／mlの抗ＣＤ２８(クローンＣＤ２８.２、BD Biosciences, Catalog # 555725)の存在下において、ウェルごとに２００μLの完全培地中の１×１０５個のＴｈ１細胞および２.５×１０４個のＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１細胞を配置し、３７℃および５％ＣＯ２で、３日間インキュベートした。次いで、プレートを、ウェルごとに、１μＣｉのトリチウム化チミジン(Perkin Elmer, Catalog # NET027001MC)で、１６時間パルス処理した後、細胞を、増殖を評価するためのトリチウム化チミジンの組込みの分析のために、フィルタープレート(Perkin Elmer)に採取した。
図３６に示される結果は、抗ＰＤ－１抗体ニボルマブが、用量依存的様式で、ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１で刺激した細胞により刺激されたＴｈ１ Ｔ細胞の増殖を増大させたこと、ならびに増殖が、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３との組合せで大幅に増強されたことを示す。ＴＩＭ－３およびＰＤ－１経路の共遮断により、このアッセイにおいて相加効果が示され、実施例１２に先に記載した抗腫瘍活性データと一致した。
実施例１５：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３遮断による腫瘍浸潤リンパ球ＩＦＮ－γ放出アッセイ
このアッセイについては、新しい腫瘍組織を、外科手術により摘出されたヒト腎細胞癌サンプルまたは乳癌サンプルから得た。腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)を、酵素的解離キット(Miltenyi、カタログ１３０－０９５－９２９)を使用して単離した。ＴＩＬに、２０ＩＵ／mL ＩＬ－２(組換えヒトＩＬ－２、Peprotech、カタログ２００－０２)を補充し、照射した(成長を停止させたもの、１時間２０分で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞とともに、ＣＨＯ：Ｔの比１：６で、共培養した。ＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコにおいて成長させ、照射した。
ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３またはアイソタイプ対照を、２０μg／mLから４倍連続希釈によって滴定し、それぞれの条件を３連に構築した。培養物を、平底ＴＣ処理９６ウェルプレート(Costar)に、ＩＭＤＭ＋５％ＦＢＳおよび５％ヒトＡＢ血清(Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ番号１００－５１２)中、ウェルごとに２００μLの１.５×１０５個のＴ細胞および２.５×１０４個の照射したＣＨＯ－ＯＫＴ３細胞を配置し、３７℃および５％ＣＯ２で、５日間インキュベートした。上清を、ＥＬＩＳＡ(BD Opteia ｈＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ、カタログ５５５１５２)によって、ＩＦＮ－γ測定のために、それぞれのサンプルから採取した。
腎細胞癌ＴＩＬについては、図３７に示され、乳癌ＴＩＬについては、図３８に示される結果は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、ＣＨＯ－ＯＫＴ３／ＴＩＬ共培養アッセイにおいて、用量依存的様式で、ＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示し、腎細胞癌ＴＩＬアッセイにおける陰性対照でのより高い濃度のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の比べて最大４倍の増大であった。
実施例１６：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、Ｍ０：Ｔ同種ＭＬＲアッセイにおいて、ＩＦＮ－γ分泌を促進する
健常なドナーから単離されたＣＤ１４＋単球を、Ｍ－ＣＳＦを含有する培養培地において、Ｍ０期に分化させた。培養後６日目に、ＦＡＣＳ染色によると、有意なマクロファージ集団が、ＣＤ１６３＋およびＣＤ２０６＋を細胞表面上に発現しており、抑制性マクロファージのシグネチャーと一致した。抗ＴＩＭ－３抗体を用いたフローサイトメトリーにより、ＴＩＭ－３は、Ｍ０マクロファージに発現されることが示された(図３９)。次いで、これらのＭ０マクロファージに、照射を行い(７分間で５,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System)、同種ドナーの全Ｔ細胞とともに共培養し、共培養後６日目に、混合細胞を、Ｔ細胞増殖を評価するために、３Ｈ－チミジンで一晩パルス処理した。
図４０に示される結果は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、アイソタイプ対照と比較して、Ｔ細胞増殖を増大させたことを示す。
実施例１７：ｈＴＩＭ３と相互作用するＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３ Ｆａｂの結晶構造
ｈＴＩＭ３ ＩｇＶ領域を、以下のように、ＴＩＭ３.１８のＦａｂ断片とともに共結晶化した。使用した配列は、以下の通りであった。
ｈＴｉｍ３＿ＩｇＶ：
(配列番号３７７；ＴＩＭ３配列は下線)
Ｔｉｍ３.１８＿Ｆａｂ：
(配列番号３６６)
Ｔｉｍ３.１８＿カッパ：
(配列番号２９)
発現および精製。ヒスチジンタグ化ｈＴｉｍ３ ＩｇＶドメインを、ｐＥＴ４７ｂベクターを用いて、大腸菌(ＢＬ２１ ＤＥ３)において発現させた。精製およびリフォールディングは、ｍＴｉｍ３について、以下の公開されているプロトコールに従って行った(DeKruyff et al. J. Immunology 2010)。Ｔｉｍ３.１８ Ｆａｂを、ＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させ、重鎖のＣ末端Ｈｉｓタグにより精製した。
複合体の結晶化および構造の判定。Ｔｉｍ３.１８ Ｆａｂを有するｈＴｉｍ３ ＩｇＶドメインの結晶構造を、１.５Åに分解した。Ｆａｂ：抗原複合体を、まず、Hampton Researchからの種々のスクリーニングで結晶化条件に関してスクリーニングし、結晶クラスターを、６.５～５.５の範囲のｐＨで、ＰＥＧ ３３５０の条件下で観察した。結晶の成長条件を、単結晶の成長を可能にするようにさらに最適化した。単結晶を、グリセロールを凍結保護剤として用いて採取し、液体窒素中で瞬間凍結させた。データの収集を、ＡＰＳにおいて、ＩＭＣＡ－ＣＡＴでPilatus-6M検出器を使用して行った。回折画像を、Global Phasingソフトウェアで処理し、Ｔｉｍ３.１８のＦａｂモデルを使用してフェージングした。ＣＣＰ４スイート、Coot、Phenix、およびGlobal Phasingスイートのソフトウェアを使用して、複数回の精査を行った。
分解されたｈＴｉｍ３ ＩｇＶドメインは、公開されているｈＴｉｍ３構造(ＰＤＢ：５Ｆ７１、worldwideweb.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?pdbId=5F71)、ならびにＰＳとの複合体において分解されたｍＴｉｍ３構造(ＰＤＢ：３ＫＡＡ、ｗorldwideweb.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3kaa、Rosemarie et al. (2010) J Immunol 184:1918)のものと十分に一致する。ｈＴｉｍ３におけるＰＳ結合ポケットは、これらの構造的アライメントにより推測した。加えて、ＰＳ結合ポケットの位置は、ヒトおよびマウスにおいて、ＴＩＭメンバー間で保存されている(Freemen et al. (2010) Immunol Rev. 235: 172)。
ｈＴｉｍ３タンパク質におけるＴＩＭ３.１８の接触残基は、ｈＴＩＭ３：ＴＩＭ３.１８ Ｆａｂ結晶構造とｈＴＩＭ３構造単独との間の接触可能性表面積の差を計算することによって、同定した(「表面包埋法」)。ＴＩＭ３.１８ Ｆａｂと複合体を形成したときに包埋された表面積を示すｈＴＩＭ３残基を、接触残基の一部であるとして定義した。タンパク質の溶媒接触可能表面は、プローブスフェア(半径１.４－Åの溶媒分子を表す)の中心の遺伝子座として定義されるが、これは、それが、タンパク質のファンデルワールス表面上を転がるためである。溶媒接触可能表面積は、プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ(http://www.ccp4.ac.uk/newsletters/newsletter38/03_surfarea.html)において実装されるように、それぞれの原子の周りに拡張したスフェア上に表面点を生成し(原子およびプローブの半径の和と等しい原子中心からの距離で)、隣接する原子と会合した等価のスフェア内にあるものを排除することによって計算した。
図４１および４２に示される結果は、上述の表面包埋法によって同定した場合、以下のアミノ酸が、接触残基であることを提供する：Ｐ２９、Ｖ３０、Ｃ３１、Ｐ３８、Ｖ３９、Ｆ４０、Ｅ４１、Ｃ４２、Ｇ４３、Ｎ４４、Ｖ４５、Ｖ４６、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｔ４９、Ｄ５０、Ｅ５１、Ｄ５３、Ｒ９０、Ｑ９２、Ｇ９５、Ｉ９６、Ｍ９７、Ｄ９９(成熟ｈＴＩＭ３細胞外ドメインである配列番号２９０によるナンバリング)またはＰ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｔ７０、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０(シグナルペプチドを有するｈＴＩＭ３である配列番号２８６(図２５)によるナンバリング)。これらの結果は、ヒトＴＩＭ３上のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の接触残基が、ヒトＴＩＭ３上のＰＳ結合ポケットと重複することを示す。具体的には、ＴＩＭ３.１８の重鎖ＣＤＲ２が、ＰＳ結合ポケットを占有する。ＰＳ結合ループとのさらなる接触は、重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３によって行われる。ここで生成された構造データにより、実施例９に記載音ＰＳ遮断アッセイにおいて得られた結果が確認される。
結晶構造解析の結果はまた、ｈＴＩＭ３の以下のアミノ酸残基が、ＴＩＭ３.１８ Ｆａｂのアミノ酸残基の原子の５Å以内に位置する原子を有することを示す(「５Å距離法」)：Ｐ２９、Ｖ３０、Ｃ３１、Ｐ３８、Ｖ３９、Ｆ４０、Ｅ４１、Ｃ４２、Ｇ４３、Ｎ４４、Ｖ４５、Ｖ４６、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｄ５０、Ｅ５１、Ｄ５３、Ｒ９０、Ｉ９１、Ｑ９２、Ｇ９５、Ｉ９６、Ｍ９７、Ｄ９９(成熟ｈＴＩＭ３細胞外ドメインである配列番号２９０による番号付け)またはＰ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｉ１１２、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０(シグナルペプチドを有するｈＴＩＭ３である配列番号２８６(図２０)による番号付け)。ＦａｂおよびｈＴＩＭ３タンパク質の相互作用する具体的な残基を、表３に記載する。
両方の方法によって同定されたアミノ酸残基の比較により、表面包埋法によってのみ同定された残基Ｔ４９および「５Å距離法」によってのみ同定された残基Ｉ９１を除き、残基が、本質的には同じであることが示される。
実施例１８：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の追加の特徴
ＣＨＯ細胞において発現されるＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の生物学的特徴を、表４に提供する。
単一のＮグリコシル化部位が、重鎖のＮ２９７において確認され、グリカンプロファイルは、ＣＨＯにより発現されたＩｇＧ１モノクローナル抗体のグリカンプロファイルと一致した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４とは結合せず、これが、あらゆるＦｃ－ＦｃＲ媒介性エフェクター機能に対して不活性であることを示唆する。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、良好な熱安定性(Ｔｍ１＝６８.１℃、Ｔｍ２＝８０.３℃、Ｔｍ３＝８２.６℃)および熱可逆性(７４℃で９５.６％、８０℃で２５.５％)を有し、これにより、この分子が、熱ストレス下において構造的完全性を保持し、ストレスが解放された場合には強力なリフォールディング特性を有することが示唆される。
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の安定性特徴は表５に提供する。
物理的な安定性の問題は、５０mg／mLにおいて凍結－解凍ストレス(６サイクル)中に観察されなかった。５０mg／mLでの強制分解研究を、４℃、２５℃および４０℃で構築した。ＣＤＲ領域における化学修飾は、試験したいずれの条件下においても、１２週間にわたって観察されなかった。
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の潜在的な免疫原性の危険性を、コンピュータ方法によって評価した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のコンピュータによるｉＤＡＢ分析では、このｍＡｂのＣＤＲに、ＨＬＡ結合配列の可能性がほとんど示されず、ヒト免疫応答の誘導の危険性が低いことが示された。
実施例１９：サルにおけるＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のＰＫ／ＰＤ
単回用量のＰＫ／ＰＤおよび寛容性研究において、すべてのサルを、２.５mgのサル免疫不全ウイルス(ＳＩＶ)ＮｅｆおよびＧａｇタンパク質を発現するキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)ベクターおよび非増殖性組換えアデノウイルス－５(Ａｄ５)ベクター(３×１０９個のそれぞれのベクター)を用いて、筋肉内に免疫処置した。免疫処置の後に、サルに、０(ビヒクル)、０.５、１０または２５mg／kg(Ｎ＝３匹／群、性別混合)の用量で、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３を静脈内投与した。血清サンプルを、薬物動態(ＰＫ)および抗薬物抗体(ＡＤＡ)の評価のために、最大４２日間採取し、血液サンプルを、受容体占有率の評価のために、最大４２日間採取した。追加の血清サンプルを、可溶性ＴＩＭ－３のレベルを含む、その他の試験的エンドポイントのために、保管した。
ＡＵＣ０－１６８ｈは、０.５～２５mg／kgで、用量に比例した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、約２週間のＴ１／２および０.１８mL／ｈ／kgの総血清クリアランスを示した。定常状態での分布量は、６８～８４mL／kgの範囲に及び、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、主として、細胞外空間に存在することを示唆した(表６)。

*外挿したAUCは、20%のカットオフを上回り、21%～55%の範囲に及んだ。
カニクイザルにおけるＰＫおよび相対成長率に基づいて、概算されたヒト総血清クリアランスは、０.１０mL／ｈ／kgであり、８８mL／kgのＶｓｓである。結果として、概算されたヒト半減期は、約２６日である。
実施例２０：予備的なサイトカイン放出アッセイ
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３での処置が、サイトカイン放出症候群の危険性を及ぼすかどうかを判定するために、１６人のヒトドナーに由来する全血を、溶液中、２０μg／mLのＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３または陽性対照とともにインキュベートした。７５種類の血清サイトカインおよびケモカインのパネルを、それぞれのドナーについて試験した。Ｔ細胞に由来するサイトカインまたはケモカインの放出の増強の根拠は認められず、サイトカイン放出症候群の危険性は低いことが示唆された。数人のドナーからの全血アッセイでは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＧ－ＣＳＦの上昇があり、ＴＩＭ－３の遮断が、単球またはマクロファージに由来するサイトカインの産生を増大するという上記に提示された証拠と一致した(データは示していない)。
実施例２１：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、受容体の下方制御または内部移行を引き起こさない
１３Ａ３が、細胞膜上のヒトＴＩＭ３と結合した場合に、それを下方制御または内部移行するかどうかを判定するために、図４３に示される蛍光消光研究を行った。３時間の処置の後の結果は、図４４に示されるが、１３Ａ３抗体も変異体Ｄ１０１ＥまたはＮ６０Ｑも、活性化ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞において、細胞内ＴＩＭ３抗体の用量依存性蓄積を引き起こさなかったことを示し、抗体が、内部移行されないことが示唆された。
下方制御の可能性を判定するために、活性化ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を、様々な量の１３Ａ３、１３Ａ３.Ｄ１０１.Ｉｇ１.１ｆ、１３Ａ３.Ｄ１０１Ｅ／Ｎ６０Ｑ.ＩｇＧ１.１ｆもしくは対照抗体の存在下において、または抗体なしで、２時間インキュベートし、細胞表面上のＴＩＭ３の量を、判定した。結果は、抗ＴＩＭ３抗体とのインキュベーションが、細胞表面ＴＩＭ３を下方制御しなかったことを示した。
実施例２２：ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３に対するＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５抗体の結合親和性
ＴＩＭ３.２４(１４Ｈ７)およびＴＩＭ３.２５(２３Ｂ３ ＶＨ－Ｇ６Ｅ－Ｄ７９Ｙ)のヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３への結合親和性を次のとおり決定した。ヒトＴＩＭ３－ＩｇＶ(０.６３ｇ／Ｌ)、カニクイザルＴＩＭ３－ＩｇＶ(０.５ｇ／Ｌ)およびカニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤ(０.３ｇ／Ｌ)を次の方法で使用した：Biacore T200、３７℃、０.０５％Ｔｗｅｅｎ－２０および１ｇ／Ｌ ＢＳＡを添加されたランニング緩衝液ＨＢＳ ｐＨ７.４。ＥＤＡで遮断した固定Jackson anti-hFc pAb(cat# 109-005-098)を伴うＣＭ４チップを使用した。
抗体をフローセル２、３および４で捕捉した。フローセル１を対照として使用した。ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３タンパク質を、５メンバー、５倍希釈で、２５０nM名目上最高濃度で、一サイクル速度論オプションを使用して注入した。全データを二重参照し、物質移動律速を伴う１：１結合モデルに適合させた。
結果を下に示す：
結果は次のことを示す：
－ このアッセイで、ＴＩＭ３.２４(１４Ｈ７)はｃｙＴＩＭ３にｈＴＩＭ３より高い親和性で結合する。
－ １３Ａ３および２３Ｂ３バリアント(それぞれＴＩＭ３.１８およびＴＩＭ３.２５)は、ｃｙＴＩＭ３より高い親和性でｈＴＩＭ３に結合する。親和性差異は、ＴＩＭ３.１８で中程度(５×)およびＴＩＭ３.２５で強い(３９×)ものである。
－ 完全長カニクイザルＥＣＤへの結合は、おそらくサイズ、また恐らく異なるサンプル活性が原因で、全３抗体について、カニクイザルＩｇＶドメインへの結合より約２倍遅かった。ｃｙＴｉｍ３－ＩｇＶで見られた幾分非特異的結合にかかわらず、解離速度は極めて類似した。
実施例２３：ｈＴＩＭ３への結合にＴＩＭ３.１８と相互作用しないかつｈＴＩＭ３－ＰＳ相互作用を阻止しない抗ＴＩＭ３抗体
ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.２４およびＴＩＭ３.２５が結合するのと異なるｈＴＩＭ３の領域に結合する抗体を同定した。この抗体は、５Ｄ６と称し、それぞれ配列番号４６９、４７０および４７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４５０、４７２および４７４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４４９および４５０を含むＶＨおよびＶＬを含む(「ＴＩＭ３.２０」)。Ｎ３０Ｓ変異を重鎖に導入した抗体も作製し、変異ＶＨは配列番号４５６(「ＴＩＭ３.２２」)を含んだ。配列番号４４９または４５６を含むＶＨを含む抗体を、ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆアイソタイプの条件で製造した。これら抗体はまた配列番号６３(ＶＫ２)を含む、別の軽鎖でも製造し、ＴＩＭ３.２１(５Ｄ６ ＶＫ２)およびＴＩＭ３.２３(５Ｄ６ＶＨ＿Ｎ３０Ｓ ＶＫ２)と称したが、ｈＴＩＭ３への結合は見られなかった。
抗体ＴＩＭ３.２０およびＴＩＭ３.２２を交差競合アッセイで使用し、ｈＴＩＭ３とＴＩＭ３.１８の結合に競合しないことが判明した。さらに、ＴＩＭ３.２０およびＴＩＭ３.２２はｈＴＩＭ３のホスファチジルセリン(ＰＳ)への結合を阻止せず、低Ｔｈ１刺激活性(ＴＩＭ３.１８に比して)を有した。故に、ＴＩＭ３.２０およびＴＩＭ３.２２は、ＴＩＭ３.１８が結合と異なるｈＴＩＭ３のエピトープに結合し、Ｔ細胞刺激に活性が低い。
このＰＣＴ出願は、２０１８年１月１２日出願の米国仮出願６２／６１６,７２３の利益を主張し、それを引用により全体として本明細書に包含させる。

Claims (17)

  1. ヒトＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）に結合し、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで、
    （ａ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号４５、４１３、および４１４をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号６４、６６、および６９をそれぞれ含む；
    （ｂ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号４５、４１５、および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号６４、６６、および６８をそれぞれ含む；または
    （ｃ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号４５、４１５、および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号６４、６６、および４１９をそれぞれ含む、
    単離抗体。
  2. 重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号４５、４１３、および４１４をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号６４、６６、および６９をそれぞれ含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号４５、４１５、および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号６４、６６、および６８をそれぞれ含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号４５、４１５、および４１６をそれぞれ含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が配列番号６４、６６、および４１９をそれぞれ含む、請求項１に記載の抗体。
  5. 重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、
    （ａ）ＶＨが配列番号４１０または４１１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む；または
    （ｂ）ＶＬが配列番号４１７または４１８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  6. 重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨが配列番号４１０を含み、ＶＬが配列番号４１７を含む、請求項１、２および５の何れかに記載の抗体。
  7. 重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨが配列番号４１１を含み、ＶＬが配列番号４１８を含む；またはＶＨが配列番号４１２を含み、ＶＬが配列番号６０を含む、請求項１および３～５の何れかに記載の抗体。
  8. 重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離抗体であって、ここで
    （ａ）重鎖ＣＤＲ１は配列番号４５を含み、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４１５を含み、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号４１６を含み、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号６４を含み、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号６６を含み、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号６８を含む；または
    （ｂ）重鎖ＣＤＲ１は配列番号４５を含み、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４１３を含み、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号４１４を含み、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号６４を含み、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号６６を含み、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号６９を含む、
    単離抗体。
  9. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１～８の何れかに記載の抗体。
  10. エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、請求項９に記載の抗体。
  11. （ａ１）配列番号３８６または３８７を含む重鎖配列および配列番号４０８を含む軽鎖配列；
    （ａ２）配列番号３８８または３８９を含む重鎖配列および配列番号４０８を含む軽鎖配列；
    （ａ３）配列番号３９０または３９１を含む重鎖配列および配列番号４０８を含む軽鎖配列；
    （ａ４）配列番号３９２または３９３を含む重鎖配列および配列番号４０８を含む軽鎖配列；
    （ｂ１）配列番号３９４または３９５を含む重鎖配列および配列番号２９を含む軽鎖配列；
    （ｂ２）配列番号３９４または３９５を含む重鎖配列および配列番号４０９を含む軽鎖配列；
    （ｂ３）配列番号３９６または３９７を含む重鎖配列および配列番号２９を含む軽鎖配列；
    （ｂ４）配列番号３９８または３９９を含む重鎖配列および配列番号２９を含む軽鎖配列；
    （ｂ５）配列番号４００または４０１を含む重鎖配列および配列番号２９を含む軽鎖配列；
    （ｂ６）配列番号４０２または４０３を含む重鎖配列および配列番号２９を含む軽鎖配列；
    （ｂ７）配列番号４０４または４０５を含む重鎖配列および配列番号２９を含む軽鎖配列；または
    （ｂ８）配列番号４０６または４０７を含む重鎖配列および配列番号２９を含む軽鎖配列、
    を含む、請求項１および８～１０の何れかに記載の抗体。
  12. 次の性質の１以上を有する、請求項１～１１の何れかに記載の抗体：
    （１）フローサイトメトリーで測定して膜結合ヒトＴＩＭ３に１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で結合する；
    （２）膜結合カニクイザルＴＩＭ３に結合する；
    （３）ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに５×１０－８ Ｍ以下のＫＤで結合する；
    （４）ｈＴＩＭ３－ＩｇＶに１×１０－７ Ｍ以下のＫＤで結合する；
    （５）カニクイザルＴＩＭ３－ＥＣＤに５×１０－７ Ｍ以下のＫＤで結合する；
    （６）ｈＴＩＭ３－ＥＣＤに８×１０－８ Ｍ以下のＫＤで結合する；および／または
    （７）Ｔ細胞活性化を誘導または増強する。
  13. 第二の結合特異性を有する分子に結合している、請求項１～１２の何れかに記載の抗体を含む二重特異性分子。
  14. 請求項１～１２の何れかに記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬをコードする、核酸。
  15. 請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクターでトランスフォームされた、細胞
  16. 薬剤に結合した請求項１～１２の何れかに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
  17. 対象における癌を処置するための、請求項１～１２の何れかに記載の抗体、請求項１３に記載の二重特異性分子、請求項１４に記載の核酸、請求項１５に記載の細胞または請求項１６に記載のイムノコンジュゲートを含む、医薬組成物。
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