CN110343178B

CN110343178B - 抗人lag-3单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN110343178B
Application number: CN201810290569.4A
Authority: CN
Inventors: 宋宁宁; 段清; 邵晓慧; 王鹏; 卞晓娇; 王倩; 卫培培; 黄亚珺; 吴建; 王美玲; 王远东; 徐丽娜; 杨达志; 刘礼乐
Original assignee: Pharmaexplorer Ltd; Shanghai Pharmaexplorer Co Ltd
Current assignee: Pharmaexplorer Ltd; Shanghai Pharmaexplorer Co Ltd
Priority date: 2018-04-03
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2038-04-03
Also published as: CN110343178A; WO2019192493A1; US11685778B2; US20210155689A1; EP3778632A1; TW202003854A; EP3778632A4; JP2021526013A

Abstract

本发明公开了一种靶向LAG‑3的抗体、其制备方法和用途。具体地，本发明公开了一种新的靶向LAG‑3的单克隆抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合LAG‑3抗原，其具有很高的亲和力并且具有显著抗肿瘤等活性。

Description

抗人LAG-3单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种LAG-3抗体及其制备方法和应用。

背景技术

癌症免疫治疗是指通过免疫***达到对抗癌症目的的治疗方式。近来癌症免疫治疗备受关注，除了手术、化疗及放疗外，已成为癌症治疗的新手段。免疫检查点是指免疫***中存在的一些抑制性信号通路，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受。利用免疫检查点的抑制性信号通路抑制T细胞活性是肿瘤逃避免疫杀伤的重要机制。针对免疫检查点的阻断是众多激活抗肿瘤免疫的有效策略之一。

免疫检查点蛋白的抑制剂具有治疗各种肿瘤类型(如转移性黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌等)的潜力。最近癌症免疫治疗方法的研究已经显示出可喜的成果，特别是对转移癌癌症病例。此外，癌症免疫治疗在治疗血液癌症方面具有巨大的潜力，包括霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征，非霍奇金淋巴瘤等。免疫检查点抑制剂引起的副作用是可以忽略的，可逆的和可控的，有效的免疫检查点抑制剂可以显著提高癌症患者的总生存期。免疫检查点抑制剂还可以与靶向治疗或常规放射治疗和化学疗法结合使用，并且这种组合疗法可有效治疗许多类型的癌症，可能是治疗或者治愈多种癌症的希望。

淋巴细胞激活基因(LAG-3,CD223)是一种有525个氨基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫检查点(Immune Checkpoint)之一。研究表明，LAG-3-/-C57BL/6小鼠在一段时间内表现相对正常的显型，说明LAG-3在免疫***内的调节作用相当微妙，可能在免疫反应中发挥着微调的作用。在体内的动物模型试验表明用抗LAG-3抗体或者遗传学敲除LAG-3基因能够增强肿瘤发生点的抗原特异性CD8+T细胞的活性，进而阻断肿瘤的生长。Grosso JF等研究表明LAG-3和人程序性死亡受体-1(PD-1)共表达在耐受的肿瘤浸润淋巴细胞，他们共同发挥肿瘤诱导的免疫抑制作用。已经证明，在小鼠MC38结肠腺癌和Sa1N纤维肉瘤模型用抗LAG-3和抗PD-1的抗体联合应用可以治愈大多数小鼠，其治疗效果好于单独用药(Seng-Ryong Woo et al.2011，Cancer Res；72(4)；917–27)。

基于目前LAG-3抗体在研数量很少，急需开发出活性更好、适应症广和产量高的LAG-3抗体，进一步以提高治疗和检测效果。

发明内容

为了开发活性好、适应症广和产量高的LAG-3抗体，本发明提供一种亲和力高、特异性强的LAG-3抗体及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:8n+2所示的CDR1，

SEQ ID NO:8n+3所示的CDR2，和

SEQ ID NO:8n+4所示的CDR3；

其中，各n独立地为0、1、2、3、4或5；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留LAG-3结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:8n+1所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4或5。

在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:8n+6所示的CDR1'，

SEQ ID NO:8n+7所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:8n+8所示的CDR3'；

其中，各n独立地为0、1、2、3、4或5；

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8n+5所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4或5。

在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。

在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，

在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与LAG-3结合的亲和力。

在另一优选例中，所述的衍生抗体与LAG-3结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与LAG-3结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。

在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。

在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留LAG-3结合亲和力的衍生序列为同源性为至少96％的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为鼠源的，和/或所述的轻链恒定区为鼠源的。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。

在另一优选例中，所述抗体选自下组：嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的全人抗体在人中的免疫原性Z1与非全人的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。

在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：

(a)抑制肿瘤细胞迁移或转移；

(b)抑制肿瘤生长。

在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；其中，

所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:2所示的CDR1，

SEQ ID NO:3所示的CDR2，和

SEQ ID NO:4所示的CDR3；

所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1'，

SEQ ID NO:7所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:8所示的CDR3'；

或

所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:10所示的CDR1，

SEQ ID NO:11所示的CDR2，和

SEQ ID NO:12所示的CDR3；

所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:14所示的CDR1'，

SEQ ID NO:15所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:16所示的CDR3'；

或

所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:18所示的CDR1，

SEQ ID NO:19所示的CDR2，和

SEQ ID NO:20所示的CDR3；

所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:22所示的CDR1'，

SEQ ID NO:23所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:24所示的CDR3'；

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:8n+1所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:8n+5所示的氨基酸序列，其中，各n独立地为0、1、2、3、4或5。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或

所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；或

所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗体选自下组：405B8H3、556F6B8、105F1E10、409B11E12、409D4E10、553G8G8。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中，SEQ ID NO:1、SEQID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或相同性。

在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:5、SEQID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或相同性。

在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：

(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面中任一项所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

在另一优选例中，所述重组蛋白包括：

(i)如本发明的第五方面所述的抗体，以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面中任一项所述的抗体；以及

(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:49、51、53、55、57或59所示；和/或，

编码所述轻链可变区的多核苷酸如50、52、54、56、58或60所示。

在另一优选例中，编码所述重链可变区序列的多核苷酸如SEQ ID NO:49所示；并且编码所述轻链可变区序列的多核苷酸如50所示；或

编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:51所示；并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如52所示；或

编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:53所示；并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如54所示。

在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:55所示；并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如56所示。

在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:57所示；并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如58所示。

在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:59所示；并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如60所示。

在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明本发明的第七方面中任一项所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面中任一项所述的多核苷酸。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面中任一项所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第五方面中任一项所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

在本发明的第十一方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面中任一项所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或其组合，其中所述活性成分被用于制备预防和/或治疗LAG-3相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述LAG-3相关的疾病包括，但不限于下组：黑色素瘤(如转移性恶性黑色素瘤)，肾癌，***癌，乳腺癌，结肠癌，肺癌(如非小细胞肺癌)，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，胃癌，食道癌，小肠癌，肝癌，膀胱癌，口腔癌，脑癌，睾丸癌，皮肤癌，内分泌***癌症，输卵管癌，慢性或急性白血病(包括急性或慢性髓样白血病、急性或慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤，晚期实体瘤。

在本发明的第十二方面，提供了一种体外检测样品中LAG-3蛋白的组合物，其包括如本发明的第五方面中任一项所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或其组合作为活性成分。

在本发明的第十三方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面中任一项所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。

在本发明的第十四方面，提供了一种治疗LAG-3相关的疾病的方法，包括：使用如本发明的第五方面中任一项所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的药物组合物、或其组合。

在另一优选例中，所述LAG-3相关的疾病为癌症。

在另一优选例中，还包括使用抗体2。

在另一优选例中，所述抗体2选自下组：PD-1抗体、CTLA-4抗体、PDL-1抗体。

在本发明的第十五方面，提供了一种药物组合，包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分为如本发明的第五方面中任一项所述的抗体；

(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括抗体2。

在本发明的第十六方面，提供了本发明的第五方面中任一项所述的抗体，或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的药物组合物与另外一种抗体2的组合在制备用于治疗LAG-3相关疾病的药物中的用途。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1 LAG-3-hFc蛋白与其配体MHCII的结合活性。

图2 LAG-3-hFc蛋白与其配体LSECtin的结合活性。

图3 LAG-3基因转染的HEK293细胞FACS检测结果。

图4 ELISA检测LAG-3-hFC蛋白免疫后小鼠血清抗体效价。

图5a FACS检测LAG-3抗体与HEK293-hLAG-3的结合反应。

图5b FACS检测LAG-3抗体与HEK293-hLAG-3的结合反应。

图6a FACS检测LAG-3抗体与HEK293-cLAG-3的结合反应。

图6b FACS检测LAG-3抗体与HEK293-cLAG-3的结合反应。

图7a LAG-3抗体对LAG-3蛋白与其受体MHC II的结合的抑制。

图7b LAG-3抗体对LAG-3蛋白与其受体MHC II的结合的抑制。

图8a LAG-3抗体在抗原特异性T淋巴细胞刺激试验中对IL-2分泌的影响。

图8b LAG-3抗体在抗原特异性T淋巴细胞刺激试验中对IL-2分泌的影响。

图9a LAG-3抗体105F1E10重链可变区蛋白和基因序列。

图9b LAG-3抗体105F1E10轻链可变区蛋白和基因序列。

图10a LAG-3抗体405B8H3重链可变区蛋白和基因序列。

图10b LAG-3抗体405B8H3轻链可变区蛋白和基因序列。

图11a LAG-3抗体556F6B8重链可变区蛋白和基因序列。

图11b LAG-3抗体556F6B8轻链可变区蛋白和基因序列。

图12a LAG-3抗体409B11E12重链可变区蛋白和基因序列。

图12b LAG-3抗体409B11E12轻链可变区蛋白和基因序列。

图13a LAG-3抗体409D4E10重链可变区蛋白和基因序列。

图13b LAG-3抗体409D4E10轻链可变区蛋白和基因序列。

图14a LAG-3抗体553G8G8重链可变区蛋白和基因序列。

图14b LAG-3抗体553G8G8轻链可变区蛋白和基因序列。

图15酶联免疫吸附实验中LAG-3鼠-人嵌合抗体与人LAG-3胞外区蛋白反应活性。

图16酶联免疫吸附实验中LAG-3鼠-人嵌合抗体与猴LAG-3胞外区蛋白反应活性。

图17酶联免疫吸附实验中LAG-3鼠-人嵌合抗体与鼠LAG-3胞外区蛋白反应活性。

图18 FACS检测LAG-3鼠-人嵌合抗体与HEK293-hLAG-3的结合反应。

图19 FACS检测LAG-3鼠-人嵌合抗体与HEK293-cLAG-3的结合反应。

图20 LAG-3鼠-人嵌合抗体对LAG-3蛋白与其受体MHC II的结合的抑制。

图21 LAG-3鼠-人嵌合抗体对LAG-3蛋白与其受体LSECtin的结合的抑制。

图22 LAG-3鼠-人嵌合抗体在抗原特异性T淋巴细胞刺激试验中对IL-2分泌的影响。

图23 LAG-3鼠-人嵌合抗体在SEB依赖的PBMC刺激试验中对IL-2分泌的影响。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，采用免疫小鼠/杂交瘤技术，意外地获得高活性的与人淋巴细胞活化基因(LAG-3)相结合的特异性单克隆抗体(鼠源抗体)。实验结果表明，本发明抗体(鼠-人嵌合抗体)与抗原蛋白具有高度亲和力(例如405B8H3的K_D为1.96E-09M)，能够结合LAG-3受体的胞外区并能够在蛋白水平和细胞水平有效封闭LAG-3与配体MHC class II、LSECtin的结合；抗原特异性T淋巴细胞刺激实验证明所得LAG-3抗体具有良好的生物活性。本发明抗体的用途，包括但不限于抑制LAG-3/MHC II和/或LAG-3/LSECtin介导的信号通路的负调控，激活肿瘤特异免疫反应，单独或与抗PD-1，CTLA-4单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合应用于用于肿瘤免疫治疗。

本发明抗体可变区与人源抗体恒定区组合为鼠-人嵌合抗体分子，或者通过人源化技术转变为人源化抗体分子，或者根据特定用途构建成其它分子形式如双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、单片段抗体等。

本发明中的抗体可以是全长蛋白(如IgG1,IgG2a,IgG2b或者IgG2c)，也可以是包含抗原抗体结合域的蛋白片段(例如Fab，F(ab’),sdAb,ScFv片段)。本发明中的抗体可以是野生型蛋白，也可以是经过特定突变已达到某种特定效果的突变型蛋白，例如利用突变消除抗体的效应子功能。

在此基础上完成了本发明。

术语

LAG-3

淋巴细胞激活基因(LAG-3,CD223)是一种有525个氨基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫检查点(Immune Checkpoint)之一(Blank et al,2005,Cancer Immunotherapy,54:307-314)。LAG-3主要表达在激活的T淋巴细胞，NK细胞以及树突细胞。LAG-3在结构上属于免疫球蛋白超家族，它的胞外具有4个IgG样结构域，它与CD4类似，都需要和它们的配体-II类主要组织相容性复合体(MHC class II)结合发挥其生物学活性，但其与MHC II结合能力强于CD4。LAG-3与其配体MHC class II结合可以抑制CD4+T淋巴细胞的活化与增殖，进而下调相关的体内细胞免疫反应。在体外的抗原特异性T细胞反应研究中，加入抗LAG-3抗体阻断LAG-3/MHC II信号通路的负调控作用，可以导致T细胞增殖以及促进细胞因子的分泌，激活免疫***。另外LAG-3还表达在调节性T细胞(Treg)上，通过促进Treg细胞活性。进而负调节T细胞活化和增殖以及树突状细胞(DC细胞)的成熟(Workman et al,2005,Immunol,174:688-695)。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

抗LAG-3的抗体

本发明提供一种针对LAG-3的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。

优选地，重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:2所示的CDR1，

SEQ ID NO:3所示的CDR2，和

SEQ ID NO:4所示的CDR3；

轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1'，

SEQ ID NO:7所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:8所示的CDR3'；

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLMNIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。

本发明抗体可以是靶向人LAG-3的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。

在另一优选例中，所述靶向LAG-3的抗体为405B8H3、556F6B8、105F1E10、409B11E12、409D4E10或553G8G8。

在另一优选例中，所述抗体405B8H3的重链可变区(VH)氨基酸序列为如SEQ IDNO.:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体405B8H3的轻链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO.:5所示的氨基酸序列。

抗体的制备

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。

本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

应用

本发明还提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗LAG-3相关的疾病的药物。所述LAG-3相关的疾病包括相关的疾病包括肿瘤发生、生长和/或转移相关疾病等。

本发明抗体的用途，包括(但并不限于)：

(i)诊断、预防和/或治疗黑色素瘤(如转移性恶性黑色素瘤)，肾癌，***癌，乳腺癌，结肠癌，肺癌(如非小细胞肺癌)，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，胃癌，食道癌，小肠癌，肝癌，膀胱癌，口腔癌，脑癌，睾丸癌，皮肤癌，内分泌***癌症，输卵管癌，慢性或急性白血病(包括急性或慢性髓样白血病、急性或慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤，晚期实体瘤。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。

本发明的药物组合物可直接用于结合LAG-3蛋白分子，因而可用于预防和***等疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明抗体具有一系列的优异特征：

①可变区序列与现有抗体不同(同源性<92％)；

②与BMS986016结合的抗原表位不同；

③本发明抗体与LAG-3具有较强的亲和力(例如405B8H3的KD值为1.96nM)；

④本发明抗体具有很好的刺激T细胞激活活性。

(2)本发明采用杂交瘤技术获得抗体，与噬菌体库获得的抗体相比，抗体亲和力高，序列表达良好。

(3)本发明获得了序列不同的抗体，能够与LAG-3抗体特异性结合，其结合活性低于纳摩尔，并且能够阻断LAG-3与其配体MHCII/LSECtin的结合，通过逆转LAG-3对T细胞激活活性的抑制，从而激活T细胞分泌IL-2，各项活性比较好。

(4)本发明抗体结合细胞表面的猴(例如中国猴)LAG-3蛋白能力强于对照抗体。本发明抗体与猴抗原具有交叉结合反应，可应用于进行灵长类动物的体内实验，用于进行临床前毒理学研究和临床前药代动力学研究。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

通用方法

本发明采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。传统的杂交瘤制备技术由Kohlerand Milstein在40年前建立(Kohler and Milstein 1975，Nature 256:495)，现在已广泛应用于科研、诊断、治疗等许多相关的单克隆抗体的制备和生产之中。其基本方法虽然延用至今，但在许多方面都有所变化、改进和创新，包括不同品系动物如转基因动物的使用、电融合技术的引入、高效筛选技术设备的应用如ClonePix设备等，使杂交瘤技术的应用更多样化和高效化。常规动物如小鼠等制备的单抗，可以通过常规分子生物学方法克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因，可变区基因可以嫁接到人源抗体恒定区基因从而形成人鼠嵌合抗体(U.S.Pat.No.4,816,567，Cabilly et al)，以大大降低人体使用时的免疫原性。此外，鼠源抗体可变区的CDR结构域可以嫁接到人源抗体架构上，从而使鼠源抗体成分降低到5％以下，大大增加了抗体在人体内使用的安全性。这一途径得到抗体称为人源化抗体，并且是目前抗体药物市场的主要产品(U.S.Pat.No.5,225,539to 55,winter,andU.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762and 6,180,370to Queen et al.)。根据目前最新的单抗技术进展，本发明采用优化的杂交瘤技术来制备所需的抗LAG-3抗体。

实施例1 LAG-3特异性抗体的制备

制备包括胞外区LAG-3蛋白、LAG-3重组细胞株、LAG-3DNA载体的表达质粒等免疫原。

免疫原1)，将人源LAG-3蛋白胞外区氨基酸序列23-450(如序列表SEQ ID No.61所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and ManiatisT.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle ^TM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含LAG-3蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(Mabselect Sure，购自GE Healthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的LAG-3蛋白(LAG-3-hFc)，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原人LAG-3-hFc蛋白。免疫原LAG-3-hFc蛋白在使用前需要进行一系列质控检测，如检测其蛋白浓度、纯度、分子量和生物活性等。

其中，免疫原LAG-3-hFc与MHC II的结合活性采用FACS检测，具体为：

将表达MHC II的Raji细胞在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，离心弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次,进行细胞计数后将细胞用封闭液(PBS，2％胎牛血清)稀释至1-2×10⁶细胞每毫升，冰上孵育20-30分钟，然后用封闭液(PBS，2％胎牛血清)洗涤2次。将收集的细胞用封闭液(PBS，2％胎牛血清)悬浮至2×10⁶细胞/ml，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中(每孔2×10⁵细胞)，离心弃去培养基，将带hFc标签的LAG-3蛋白梯度稀释,然后按照每孔100微升加入Raji细胞中，冰上孵育1-2小时。用封闭液(PBS，2％胎牛血清)离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗，冰上孵育0.5-1.0小时。用封闭液(PBS，2％胎牛血清)离心洗涤2-3次，加入每孔100微升PBS悬浮细胞，用FACS(FACSVerse,BD)检测和分析结果。

其中，免疫原LAG-3-hFc与LSECtin的结合活性采用ELISA检测，具体为：

将带hFc标签的LAG-3蛋白(LAG-3-hFc，即免疫原)，用PBS稀释至1μg/mL，以100μl/孔加入ELISA微孔板，4℃孵育过夜。用ELISA封闭液(含1％BSA，pH7.4的PBS磷酸缓冲液，所述百分比为质量百分比)37℃封闭两小时后，再加入梯度稀释的LSECtin-His标签，37℃温育1小时。所述LSECtin-His购自R&D system，商品号2947-CL。加入抗His标签的辣根过氧化物酶(购自GenScript商品号A00612)，室温孵育30分钟后加入100微升/孔TMB显色液。室温孵育15分钟后，加入50微升1N盐酸终止显色反应，用ELISA读板机读取OD450nm读数。每个步骤之后都需要洗板。

结果如图1、图2和表1、表2所示。

表1 LAG-3-hFc蛋白与其配体MHCII的结合活性

表2 LAG-3-hFc蛋白与其配体LSECtin的结合活性

结果表明，LAG-3与MHCII在细胞水平的结合随LAG-3-hFC的浓度变化而变化，LAG-3与LSECtin在蛋白水平的结合随LAG-3-hFC的浓度变化而变化，其中对照蛋白为非LAG-3融合蛋白。表达的配体和受体蛋白有正确的构象，适合进行免疫、建立受体-配体结合阻断检测方法及进行抗体活性鉴定。

LAG-3蛋白免疫采用6-8周龄BabL/C和SJL小鼠(上海斯莱克动物中心繁殖提供)，小鼠接收后在SPF条件下饲养。初次免疫LAG-3蛋白用福氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，50微克蛋白每只小鼠。加强免疫LAG-3蛋白用福氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，50微克蛋白每只小鼠。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血，用ELISA和FACS检测血清中抗体效价和特异性。

免疫原2)，人源LAG-3全长氨基酸序列克隆到pIRES载体(购自Clontech)并制备质粒。对HEK293细胞系和CHOK1细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(转染使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，购自Roche公司，货号Cat#06 366 236 001，并按说明书操作)后，在含0.5μg/ml嘌呤霉素的含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO₂培养。大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的LAG-3抗体染色，经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原LAG-3重组细胞株。具体选择结果如表3和图3所示，表3中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比，MFI是所测细胞群的平均荧光强度值。

表3 LAG-3基因转染的HEK293细胞FACS筛选检测结果

结果表明，HEK293细胞有较高水平LAG-3的表达，适合用做免疫原和进行抗体结合活性鉴定。

LAG-3细胞免疫采用6-8周龄BabL/C和SJL小鼠(上海斯莱克动物中心繁殖提供)，小鼠接收后在SPF条件下饲养。人LAG-3转染的HEK293稳定细胞系在T-75细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，吸尽培养基，用DMEM基础培养基洗涤1-2次，然后用无酶细胞解离液处理和收集细胞。用DMEM基础培养基洗涤1-2次,进行细胞计数后将细胞用PBS稀释至1-2x10⁷细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间隔2周，以后每次免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血，用FACS检测血清中抗体效价和特异性。

免疫原3)，LAG-3全长氨基酸序列cDNA被克隆到pCDNA3.1载体并包被到1.0um金胶体子弹上，用Helios基因枪(Bio-rad)免疫。详细方法根据Helios基因枪说明书进行制定。

6-8周龄BabL/C和SJL小鼠(上海斯莱克动物中心繁殖提供)接收后在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用基因枪免疫3-4次，每次3-4枪，每枪1.0微克cDNA量。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血，用ELISA检测血清中抗体效价。通常大部分小鼠经2-3次免疫后ELISA效价可达到1:1000以上。表4和图4为LAG-3-hFC蛋白免疫血清，用ELISA进行抗体效价检测的结果。

表4 ELISA检测LAG-3-hFC蛋白免疫后小鼠血清抗体效价

结果表明：以免疫原进行免疫，大部分小鼠经3次免疫后ELISA效价可达到1:100000以上，说明小鼠对免疫原产生较好的体液免疫反应，其脾细胞可以用来进行杂交瘤细胞制备。

效价符合要求的小鼠可选择进行细胞融合和杂交瘤制备。细胞融合前，小鼠最后一次免疫用每只50-100微克纯化的LAG-3-hFc腹腔注射。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(购自ATCC)，采用高效电融合或PEG方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1×HAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1×10⁵/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO₂、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后用ELISA和Acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，将ELISA中OD_450nm>1.0和Acumen中MFI值>100的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)胎牛血清的DMEM(Invitrogen)的培养基中，在37℃，5％(v/v)CO₂条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析。用ELISA、FACS确定对LAG-3蛋白和LAG-3阳性细胞的结合活性，配体受体结合实验确定抗体样品对LAG-3受体的封闭活性。

根据24孔板筛选结果，挑选ELISA实验中OD_450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和配体受体结合实验中杂交瘤细胞培养上清对LAG-3受体的封闭抑制率达到60％的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆。选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自Invitrogen)37℃，5％(v/v)CO₂条件下培养。亚克隆后10天用ELISA和Acumen进行初步筛选，挑选阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用FACS确定抗原结合阳性并用LAG-3受体配体结合实验评估生物活性(评估标准为ELISA实验中OD_450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和配体受体结合实验中杂交瘤细胞培养上清对MHCII配体的封闭抑制率达到60％)。

根据24孔板样品检测结果，阳性克隆在含10％(w/w)FBS的DMEM(购自Invitrogen)培养基中，在37℃，5％(v/v)CO₂条件下进行扩大培养，细胞悬浮于冻存液[含有20％(w/w)FBS和10％(w/w)DMSO的DMEM]中，按常规方法液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产、纯化和氨基酸序列测定。

实施例2 纯化抗体的鉴定

(一)流式细胞实验(FACS)检测抗体与LAG-3表达细胞的结合

将实施例1制备免疫原2中所述含有编码人源LAG-3全长核苷酸序列的pIRES质粒转染293F细胞株得含人LAG-3的293F稳转细胞株(此处称为HEK293-hLAG-3稳定细胞株)，将带有猴源全长基因的pIRES质粒，转染HEK293细胞株构建含猴LAG-3的HEK293稳转细胞株(此处称为HEK293-cLAG-3稳定细胞株)。将HEK293-hLAG-3稳定细胞株和HEK293-cLAG-3稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用HBSS(Hanks'Balanced Salt Solution)洗涤1-2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution:Lifetechnology)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞1-2次,进行细胞计数后将细胞用HBSS稀释至1-2x10⁶细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，冰上孵育20-30分钟，然后用HBSS离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(HBSS+1％BSA)悬浮至2x10⁶细胞/ml,按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入待测抗体样品每孔100微升，冰上孵育1-2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗，冰上孵育0.5-1.0小时。用FACS缓冲液离心洗涤2-3次，加入每孔100微升固定液(4％Paraformaldehyde)悬浮细胞，5-10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。结果如表5和表6、图5a、图5b和图6a、图6b所示，待测抗体可结合细胞表面的人或猴LAG-3蛋白，各抗体活性相当，表明抗体与LAG-3结合能力较强。其中IgG对照为鼠源IgG，表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。

表5 FACS检测LAG-3抗体与HEK293-hLAG-3的结合反应

表6 FACS检测LAG-3抗体与HEK293-cLAG-3的结合反应

(二)LAG-3受体配体结合实验检测LAG-3抗体阻断LAG-3与其配体MHC II的结合

将表达MHC II的Raji细胞在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，离心弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次,进行细胞计数后将细胞用封闭液(PBS，2％胎牛血清)稀释至1-2×10⁶细胞每毫升，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中(每孔1×10⁵细胞)，冰上孵育20-30分钟，将待测抗体样品与1ug/ml的LAG-3-hFc蛋白等体积混合，并在室温孵育30分钟后，将孵育Raji细胞的FACS反应板离心弃掉上清，按照每孔100微升将上述的混合物加入Raji细胞中，冰上孵育1-2小时。用封闭液(PBS，2％胎牛血清)离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗，冰上孵育1.0小时。用封闭液(PBS，2％胎牛血清)离心洗涤2-3次，加入每孔100微升PBS悬浮细胞，用FACS(FACS Calibur,BD)检测和分析结果。结果如表7和图7a、图7b所示，其中IgG对照为鼠源IgG，表中的数据为抑制率(％)。

表7 LAG-3抗体对LAG-3蛋白与其受体MHC II的结合的抑制

结果表明，所得抗体可不同程度的抑制LAG-3蛋白与其配体MHCII的结合，所测抗体活性相当。

(三)抗原特异性T淋巴细胞刺激实验检测LAG-3抗体对淋巴细胞活性的影响

抗原特异性T淋巴细胞刺激实验检测LAG-3抗体阻断LAG-3与MHC II的结合从而解除对T淋巴细胞活性的抑制，从而刺激T细胞的增殖。

1.抗原特异性T淋巴细胞的获得，首先，使用小鼠CD4分离试剂盒,利用免疫磁珠技术和联合抗体，从OVA转基因小鼠的淋巴细胞样品中阴性筛选CD4+T细胞，分离出抗原特异性的CD4+T淋巴细胞。将获得的T细胞与小鼠胸腺瘤细胞系BW5147.G.1.4按5:1的比率混合，采用聚乙二醇(PEG)细胞融合方法进行细胞融合。融合后的细胞用1×HAT含次黄嘌呤、氨基蝶啶和胸苷的培养基进行选择性培养，将获得的单克隆扩增到24孔板扩大培养，2-3天后对单克隆进行筛选。用体外抗原提呈实验筛选克隆，用同品系普通C57BL/6小鼠的脾细胞混合特异性抗原OVA323-339的混合物加入到单克隆细胞的培养基中，孵育单克隆细胞过夜收集上清(具体方法参见David H等，Methods Mol Biol，2013，960:297–307)。酶联免疫吸附检测检测上清中的小鼠白介素2(mouse IL2，mIL2)的含量，挑选细胞生长状态良好、传代(至少十几代)稳定，且分泌mIL-2量高的最优单克隆进行扩大培养、液氮冻存。最终选择T淋巴细胞杂交瘤(8B2)为最优克隆。

过表达免疫抑制因子稳定细胞株的构建，将人LAG-3的全长基因序列克隆到pIRES表达载体上，并包装成慢病毒(上海吉玛)。对T淋巴细胞杂交瘤细胞株8B2进行慢病毒感染，转染后的细胞在含抗生素的培养基中选择性培养，2周后，用有限稀释法在96孔培养板中亚克隆。待克隆长大后，将单克隆孔细胞扩增到6孔板中或培养瓶中。对扩增后的克隆用抗LAG-3特异性抗体经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。最终选择T淋巴细胞杂交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)为最优克隆。

2.抗原特异性T淋巴细胞刺激实验，将T淋巴细胞杂交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)在T-175细胞培养瓶中培养至75-90％汇合度，弃去培养基，用PBS洗涤1-2次；计数后将细胞以1-2E5个细胞50微升每孔铺至96孔细胞培养板，然后将两倍于终浓度的待测抗体稀释液加入培养板，室温孵育30min，同时用同品系普通C57BL/6小鼠的脾细胞与特异性抗原OVA_323-339混合室温孵育30min，最后将其混合物50微升每孔加入到培养板，保证每个反应孔200ul体积，将反应板于37℃5％CO2培养箱培养过夜后收集上清，低于-20°冻存待测。

3.细胞上清中细胞因子白介素IL-2酶联免疫吸附检测。

细胞上清中细胞因子白介素IL-2酶联免疫吸附检测使用R&D system相关检测试剂盒Mouse IL-2DuoSet ELISA(DY402)，并按照说明书操作。除检测抗体外的所有检测试剂均由检测试剂盒提供。

测定细胞上清中细胞因子白介素IL-2含量的酶联免疫吸附检测采用双抗夹心ELISA试剂盒(购自R&D Systems，IL-2Cat#DY402)。实验操作严格按照试剂盒说明书要求，所有检测试剂均由试剂盒提供。具体实验简述如下：将IL-2多克隆抗体包被于ELISA微孔板上，用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液洗板4次，加入封闭液室温封闭1-2小时。用洗板液洗板4次，将步骤2.获得的细胞上清液作为待测样品，加入标准品和待测样品室温孵育2小时。每孔加入400微升洗液，重复洗板4次；再加入抗人IL-2的辣根过氧化物酶标抗体，室温孵育2小时，与微孔板上的IL-2形成免疫复合物，清洗微孔；加入底物显色，避光室温30分钟，最终加入终止液，用酶标仪测定A450nm吸光度。

检测LAG-3抗体在步骤2.所述抗原特异性T淋巴细胞刺激实验中对IL-2分泌的影响。结果如图8a、图8b)，和表8所示，其中mIgG对照为鼠IgG，表中的数据为IL-2值(pg/mL)。

表8 LAG-3抗体在抗原特异性T淋巴细胞刺激试验中对IL-2分泌的影响

结果表明，在抗原特异性T淋巴细胞刺激试验中待测抗体可使T淋巴细胞的IL-2分泌增强，并且激活作用呈浓度梯度依赖性，其中405B8H3活性率优于其它抗体。

(四)抗原表位预测

在人LAG-3蛋白胞外区的包含一具有以下氨基酸序列的暴露的外环(eatraloop)：GPPAAAPGHPLAPGPHP AAPSSWGPRPRRY。为了检验纯化抗体与这一区域的结合并预测每个抗体所结合的表位，在整个这一区域内进行肽扫描实验。

制备了包括外环序列的全长在内的15种重叠肽并将在C端偶联生物素。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与这些肽段的结合，链霉亲和素(sigma,Cat#M5432)用PBS稀释到终浓度1.0μg/ml,然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2次，加入封闭液(PBS+0.01％Tween20+1％BSA)室温封闭1-2小时。倒掉封闭液，加入生物素化的肽段，终浓度1ug/ml,以每孔100ul加到96孔ELISA板，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。然后将待测抗体样品100μl每孔,37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育15-30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(TiterMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值。肽扫描实验的结果总结如下表9所示。

表9肽扫描实验的结果

基于上述表9的结果，可确定553G8G8和556F6B8不识别该外环序列，405B8H3、409B11E12和409D4E10识别在包括氨基酸序列SSWGPRPR的外环内的一区域，105F1E10识别包括氨基酸序列APSSWGPR的外环内的一区域。

结果表明：本发明抗体与BMS的LAG-3抗体BMS986016结合的表位不一致，本发明抗体不会对BMS的专利CN102176921A所保护的抗原表位HPAAPSSW造成侵权。

实施例3 轻重链可变区氨基酸序列测定

总RNA分离：亚克隆培养的上清检验过抗原结合后，通过离心搜集1-5×10⁷杂交瘤细胞。加入1mL Trizol混匀并转移到1.5ml离心管中，室温静置5min；加0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min后于4℃离心，12000g×5min，取上清转移到新的1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min后于4℃离心，12000g×15min，弃上清；加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，12000g×5min，弃上清并晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解(55℃水浴促溶10min)。

逆转录与PCR：取1μg tRNA，配置20ul体系，加入逆转录酶后于42℃反应60min，于70℃反应10min终止反应。配置50μl PCR体系，包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs；设置PCR程序，预变性95℃3min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃35s，35个循环后再额外于72℃延伸5min。注：延伸温度可根据实际情况有所调整。

克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化；进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时；取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞中，冰浴5min，而后于42℃水浴热激1min，放回冰上1min后加入650μl无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30min，取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μl PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含抗生素的LB固体培养皿上以保存菌株；PCR反应结束后，取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。其中，测序的步骤参见Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutesof Health,Bethesda,Md.(1991)。

测序结果：本发明抗体产品的重链可变区蛋白和基因(DNA)序列、轻链可变区蛋白和基因序列如下：

抗体105F1E10见图9a、图9b；抗体405B8H3见图10a、图10b；抗体556F6B8见图11a、图11b；抗体409B11E12见图12a、图12b；抗体409D4E10见图13a、图13b；抗体553G8G8见图14a、图14b。

实施例4 鼠-人嵌合抗体构建、以及抗体的生产和纯化

质粒构建与准备：将杂交瘤抗体重链可变区序列克隆到包含信号肽和人源重链抗体IgG4恒定区的pCP表达载体当中，将轻链可变区重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa(lambda)恒定区的表达pCP载体当中，并经测序验证。使用碱裂解法试剂盒中量抽提高纯度质粒，经0.22μm滤膜过滤，供转染使用。

细胞转染：使用Freestyle 293F细胞，培养基为Freestyle 293 expressionmedium，使用时添加10％F68指终浓度0.1％。转染时将细胞密度培养至每毫升1-1.5×10⁶细胞；摇床设置为37℃，130RPM，8％CO₂浓度。取5毫升培养基和PEI混匀(200μg/ml)，取5毫升培养基和一定量质粒混匀(质粒用量为100μg/ml)，5min后合并混匀，静置15分钟；缓缓加到细胞中，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养；第二天加入蛋白胨(sigma)至终浓度为0.5％；第5～7天，测培养液抗体效价，第6～7天，离心(3500RPM，30min)、过滤收集上清以供纯化。

抗体纯化：对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料，使用0.1M NaOH处理30min或者5个柱体积0.5M NaOH冲洗；对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1MNaOH浸泡1h，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％Triton X100对柱料清洗。使用5个柱体积的PBS进行平衡，将过滤好的细胞上清上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用1/10体积的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和。收获抗体后，在1×PBS中透析过夜，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒检测抗体内毒素含量。

实施例5 鼠-人嵌合抗体的鉴定

(一)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与LAG-3蛋白的结合

将实施例1制备免疫原1中所述的人源LAG-3蛋白胞外区氨基酸序列23-450(如序列表SEQ ID No.61所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体，转染HEK293细胞，收集细胞培养液，纯化得到带hFc标签的人LAG-3蛋白(此处称为hLAG-3-hFc蛋白)；将猴源LAG-3蛋白胞外区氨基酸序列18-449(如序列表SEQ ID No.62所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体，转染HEK293细胞，收集细胞培养液，纯化得到带hFc标签的猴LAG-3蛋白(此处称为cLAG-3-hFc蛋白)；将鼠源LAG-3蛋白胞外区氨基酸序列24-442(如序列表SEQID No.63所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体，转染HEK293细胞，收集细胞培养液，纯化得到带hFc标签的鼠LAG-3蛋白(此处称为mLAG-3-hFc蛋白)。纯化的人、猴、鼠LAG-3胞外区蛋白(hLAG-3-hFc、cLAG-3-hFc、mLAG-3-hFc)用PBS稀释到终浓度1.0μg/ml,然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2次，加入封闭液(PBS+0.01％Tween20+1％BSA)室温封闭1-2小时。倒掉封闭液，加入待测抗体样品50-100μl每孔,37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育15-30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(TiterMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值。结果如图15,图16和图17，表10,表11和表12所示。

表10酶联免疫吸附实验中LAG-3鼠-人嵌合抗体与人LAG-3胞外区蛋白反应活性

表11酶联免疫吸附实验中LAG-3鼠-人嵌合抗体与猴LAG-3胞外区蛋白反应活性

表12酶联免疫吸附实验中LAG-3鼠-人嵌合抗体与鼠LAG-3胞外区蛋白反应活性

结果表明：本发明所得鼠-人嵌合抗体可结合人和猴LAG-3胞外区蛋白，且各抗体活性接近；不能结合鼠LAG-3蛋白。其中IgG对照为人IgG，表中的数据为A450nm数值。

(二)流式细胞实验(FACS)检测抗体与LAG-3表达细胞的结合

实验方法见实施例2(一)，对所获鼠-人嵌合LAG-3抗体与细胞表达LAG-3的结合活性进行鉴定,结果如图18和图19，表13和表14所示。其中IgG对照为人IgG，表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。

表13 FACS检测LAG-3鼠-人嵌合抗体与HEK293-hLAG-3的结合反应

表14 FACS检测LAG-3鼠-人嵌合抗体与HEK293-cLAG-3的结合反应

结果表明：本发明所得鼠-人嵌合抗体可结合细胞表面的人和猴LAG-3蛋白。并且本发明抗体结合细胞表面的猴LAG-3蛋白能力强于对照抗体(BMS986016)。

实验中猴LAG-3的序列是从中国猴的组织样品中得到的。本发明抗体与猴抗原具有交叉结合反应，将来可进行灵长类动物的体内实验，用于进行临床前毒理学研究和临床前药代动力学研究。

(三)：LAG-3受体配体结合实验检测LAG-3抗体阻断LAG-3与其配体MHC I I和LSECtin的结合

(1)LAG-3受体配体结合实验检测LAG-3抗体阻断LAG-3与其配体MHC II的结合

实验方法见实施例2(二)，对所获鼠-人嵌合LAG-3抗体进行阻断活性鉴定，检测结果分别如图20和表15所示。

表15 LAG-3鼠-人嵌合抗体对LAG-3蛋白与其受体MHC II的结合的抑制

结果表明：本发明所得鼠-人嵌合抗体LAG-3抗体能够不同程度地阻断LAG-3与配体MHCII的结合。

(2)LAG-3受体配体结合实验检测LAG-3抗体阻断LAG-3与其配体LSECtin的结合

LAG-3胞外区蛋白(LAG-3-hFc)用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板2次，加入封闭液[含0.01％(v/v)Tween20和1％(w/w)BSA的PBS]室温封闭2小时。倒掉封闭液，先加入实施例2所得的纯化的LAG-3抗体待测样品50μl每孔，后加入LSECtin蛋白(LSECtin-His)，每孔50微升，混匀后37℃孵育。2小时后，用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入抗His标签的HRP(辣根过氧化物酶)稀释液(购自GenScript)每孔100微升，37℃孵育2小时后，用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值。检测结果分别如图21和表16所示。

表16 LAG-3鼠-人嵌合抗体对LAG-3蛋白与其受体LSECtin的结合的抑制

结果表明：本发明所得鼠-人嵌合抗体LAG-3抗体能够不同程度地阻断LAG-3与配体LSECtin的结合。

(四)：抗原特异性T淋巴细胞刺激实验检测LAG-3抗体对淋巴细胞活性的影响

实验方法见实施例2(三)，结果见表17和图22，其中IgG对照为人IgG(hIgG)，表中的数据为鼠IL-2浓度。

表17 LAG-3鼠-人嵌合抗体在抗原特异性T淋巴细胞刺激试验中对IL-2分泌的影响

结果表明：本发明所得鼠-人嵌合抗体在抗原特异性T淋巴细胞刺激试验中能够刺激IL-2分泌，并且该活性具有浓度梯度依赖效应，表明LAG-3抗体能够逆转LAG-3对T细胞激活的抑制作用，从所测结果可以看出，本发明所得抗体活性水平相当。

(五)淋巴细胞刺激实验检测LAG-3抗体对淋巴细胞活性的影响

淋巴细胞刺激实验检测LAG-3抗体阻断LAG-3蛋白与其受体MHC II的结合从而解除其对T淋巴细胞活性的抑制，从而刺激T细胞的增殖。

1.Ficoll分离全血获取外周血单核淋巴细胞PBMC

将新鲜获取的全血用磷酸缓冲液PBS以1:1的体积比例稀释得稀释后的全血，用无菌吸管轻轻将稀释后的全血铺平在Ficoll液面(购自GE Healthcare)，Ficoll与稀释后的全血的体积比为3:4，避免震荡混匀，以400g转速室温20℃梯度离心30分钟，离心后的离心管分为三层，上层为血浆，中间乳白色分层即为单核淋巴细胞。用无菌吸管轻轻吸取中间层细胞，收集至新的离心管，用PBS磷酸缓冲液稀释至三倍体积，100g转速室温离心10分钟，弃上清。将淋巴细胞用PBS磷酸缓冲液重悬至10mL，重复前面步骤取出血小板。最后将淋巴细胞重悬至10mL含有10％胎牛血清的多组份RPMI1640培养基(购自Invitrogen)备用，即为外周血单核淋巴细胞PBMC，所述百分比为质量百分比。

2.SEB依赖的PBMC刺激实验

试验前，配制等体积比稀释的待测的鼠-人嵌合抗体LAG-3抗体，得待测样品溶液。

将获得的外周血单核淋巴细胞PBMC以1×10⁵个细胞100微升每孔铺至96孔细胞培养板，然后将所述的待测样品溶液加入培养板，室温培养30分钟。最后加入超抗原SEB，每反应孔中含有50微升400ng/ml SEB,保证每个反应孔200μL体积，将反应板于37℃、5％CO₂培养箱培养72小时后收集上清，得细胞上清液，于-20℃冻存，所述百分比为体积百分比。

3.细胞上清中细胞因子白介素IL-2酶联免疫吸附检测

细胞上清中细胞因子白介素IL-2酶联免疫吸附检测使用R&D system相关检测试剂盒human IL-2DuoSet ELISA(DY202)，并按照说明书操作。除检测抗体外的所有检测试剂均由检测试剂盒提供。

测定细胞上清中细胞因子白介素IL-2含量的酶联免疫吸附检测采用双抗夹心ELISA试剂盒(购自R&D Systems，IL-2Cat#DY202)。实验操作严格按照试剂盒说明书要求，所有检测试剂均由试剂盒提供。具体实验简述如下：将IL-2多克隆抗体包被于ELISA微孔板上，用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液洗板4次，加入封闭液室温封闭1-2小时。用洗板液洗板4次，将步骤2.获得的细胞上清液作为待测样品，加入标准品和待测样品室温孵育2小时。每孔加入400微升洗液，重复洗板4次；再加入抗人IL-2的辣根过氧化物酶标抗体，室温孵育2小时，与微孔板上的IL-2形成免疫复合物，清洗微孔；加入底物显色，避光室温30分钟，最终加入终止液，用酶标仪测定A450nm吸光度。

检测LAG-3抗体在步骤2.所述SEB依赖的PBMC刺激实验中对IL-2分泌的影响。结果如图23，和表18所示。

表18 LAG-3鼠-人嵌合抗体在SEB依赖的PBMC刺激试验中对IL-2分泌的影响

结果表明，在SEB依赖的PBMC淋巴细胞刺激试验中，本发明所得抗体可使PBMC的IL-2分泌增强，并且该活性具有浓度梯度依赖效应，表明LAG-3抗体能够逆转LAG-3对T细胞激活的抑制作用，从所测结果可以看出，本发明所得抗体活性水平相当。其中hIgG对照为人IgG，表中的数据为IL-2值(pg/mL)。

(六)抗体亲和力检测试验

首先，准备用氨基偶联方法将anti-human Fc IgG固定在CM5芯片表面至6000-10000RU，FC1作为参比通道。偶联过程如下：用新鲜配置的1:1的50mM NHS和200mM EDC的混合物活化7分钟，然后注入10-50ug/ml稀释在10mM醋酸纳ph5.0缓冲液中的anti-human FcIgG。剩余的活化位点用1M乙醇胺封闭。然后，用HBS-EP+缓冲液将待测抗体稀释至5ug/ml(可根据捕获水平适当调整)，以10ul/min的流速捕获到芯片上，得到大约100～300RU的响应值。接着将抗原蛋白稀释至100nM(最高浓度暂定100nM)，以30ul/min的流速流经芯片表面。若得到足够的信号值，然后将抗原蛋白倍比稀释几个浓度梯度，分别流经芯片表面。在每个循环结束后，芯片表面用10mM，PH 1.5的Glycine进行再生。动力学速率常数需减去空白对照，用global fit分析方法1：1结合模型进行数据拟合。解离平衡速率常数(KD)用以下公式计算：KD＝kd/ka。结果见表19。

表19抗LAG-3抗体亲和力的分析测定

克隆ID	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				105F1E10	3.85E+04	9.66E-05	2.51E-09
405B8H3	8.04E+04	1.58E-04	1.96E-09
				556F6B8	1.22E+05	4.59E-04	3.77E-09

结果表明，本发明所得抗体的KD值均在纳摩(nM)水平，且与工具抗体相当，表明这些抗体对人LAG-3ECD均有较好的亲和力，其中，405B8H3抗体对人LAG-3ECD的亲和力最好。

讨论

目前百时美施贵宝公司的LAG-3抗体BMS986016的临床研究主要用于恶性实体瘤的治疗，而且也主要集中于它和其他疗法或靶点药物的联合使用，开发适应症广的抗体从而扩大其适用的临床症状，包括不可切除的转移性黑色素瘤、晚期实体癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、复发性胶质母细胞瘤、头颈癌、膀胱癌、转移性直结肠癌、胃肠道间质肿瘤、腺泡细胞癌、高级恶性固体肿瘤、非小细胞肺癌等。

抗体本身的活性受可变区序列和恒定区结构的影响。抗体的可变区序列决定了识别抗原的决定簇、结合亲和力及在体内代谢速率，都会影响其体内活性，甚至不同病患个人的临床效果。

本领域亟待开发产量更高的LAG-3抗体以降低患者的治疗成本，惠及更多患者。目前肿瘤免疫治疗价格昂贵，急需发明并且生产新的抗体以降低成本。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明的序列信息：

LAG-3抗体的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的氨基酸序列和编码所述重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的核苷酸序列，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'、CDR3'分别用下划线标示出来：

mAb103-405B8H3-VH SEQ ID No.1

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGATDPETGNSAYN QKFKGKAIMTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCISTGWNDWGQGTSLTVSS

mAb103-405B8H3-VH(342bp)SEQ ID No.49

CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCCACTGATCCTGAAACTGGTAATAGTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATAATGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTATATCAACTGGG TGGAATGACTGGGGCCAAGGCACCAGTCTCACAGTCTCCTCA

mAb103-405B8H3-VL SEQ ID No.5

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRADRLLDGVPSR FSGSGSGQDYSLTISSLEYGDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK

mAb103-405B8H3-VL(321bp)SEQ ID No.50

GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAGACAGATTGTTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGGAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

mAb123-556F6B8-VH SEQ ID No.9

RVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLIKYGVHWVRQSPGEGLEWLGVIWRGGITDYNA AFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKWDGPLAMDYWGQGTSVTVSSmAb123-556F6B8-VH(351 bp)SEQ ID No.51

CGGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATAACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAATTAAGTACGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAGAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGAGGTGGCATCACAGACTACAATGCAGCTTTCATGTCCAGACTGAGCATCACCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACTGCCATATACTACTGTGCCAAATGGGACGGG CCCCTGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

mAb123-556F6B8-VL SEQ ID No.13

DIVMTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVGTTVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDR FTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK

mAb123-556F6B8-VL(321 bp)SEQ ID No.52

GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCTTGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTACTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTAGAAATAAAA

mAb009-105F1E10-VH SEQ ID No.17

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCRASGYTFTDFKMHWMKQSHGKSLEWIGYIAPNNGGTAYN QKFRGKATLTVNESSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCVDWDDVDYWGQGTTLTVS S

mAb009-105F1E10-VH SEQ ID No.53

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAGGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTTCAAAATGCACTGGATGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGCCCCTAACAATGGTGGTACTGCCTACAATCAGAAATTCAGGGGCAAGGCCACATTGACTGTAAACGAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCGGAAGATTCTGCAGTCTATTACTGTGTGGACTG GGACGACGTTGACTACTGGGGC CAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

mAb009-105F1E10-VL SEQ ID No.21

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKSGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYVEFPLTFGAGTKLELK

mAb009-105F1E10-VL SEQ ID No.54

GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAATCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAATAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGTTGAGTTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

mAb104-409B11E12-VH SEQ ID No.25

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTTVHGLEWIGATDPETSYSAYNQKFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCIATGWNDWGQGTSLTVSS

mAb104-409B11E12-VH(342 bp)SEQ ID No.55

CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACAACTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCCACTGATCCTGAAACTAGTTATAGTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTATAGCAACTGGG TGGAACGACTGGGGCCAAGGCACCAGTCTCACAGTCTCCTCA

mAb104-409B11E12-VL SEQ ID No.29

DLKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLLDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK

mAb104-409B11E12-VL(321 bp)SEQ ID No.56

GACCTCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGTTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGTTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACATTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

mAb112-409D4E10-VH SEQ ID No.33

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGNTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGATDPETDNTAYNQKFKGKAILTTDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCITSGWNDWGQGTSLTVSS

mAb112-409D4E10-VH(342 bp)SEQ ID No.57

CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCAACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCCACTGATCCTGAAACTGATAATACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATACTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTATTGCATAACAAGTGGG TGGAACGACTGGGGCCAAGGCACCAGTCTCACAGTCTCCTCA

mAb112-409D4E10-VL SEQ ID No.37

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLLDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYNEFPYTFGGGTKLEIK

mAb112-409D4E10-VL(321 bp)SEQ ID No.58

GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGTTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTAC AGTATAATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

mAb120-553G8G8-VH SEQ ID No.41

RVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLIKYGVHWVRQSPGEGLEWLGVIWRGGITDYNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKWDGPLAMDYWGQGTSVTVSSmAb120-553G8G8-VH SEQ IDNo.59

mAb120-553G8G8-VL SEQ ID No.45

DVQMIQSPSSLSASLGDMVTMTCQASQGTNINLNWFQQKPGKAPKLLIYGASNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLEDEDMATYFGLQHSYLPLTFGAGTKLELK

mAb120-553G8G8-VL SEQ ID No.60

GATGTCCAGATGATTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTTTGGGAGACATGGTCACCATGACTTGCCAGGCAAGTCAGGGCACTAACATTAATTTAAACTGGTTTCAGCAAAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAAGCAACTTGGAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTAGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGGATGAAGATATGGCAACGTATTTCGGTCTACAGCATAGTTATCTCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA表20 LAG3-抗体的CDR区序列及其氨基酸序列编号(SEQ IDNo.)如下：

其中VH为重链可变区，VL为轻链可变区。

人LAG-3蛋白氨基酸序列SEQ ID No.61

MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL

猴LAG-3蛋白氨基酸序列SEQ ID No.62

MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPPQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAPAPGHPPAPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALRAGHLPLFLILGVLFLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPELEPEPELERELGPEPEPGPEPEPEQL*

鼠LAG-3蛋白氨基酸序列SEQ ID No.63

MREDLLLGFLLLGLLWEAPVVSSGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPGVGTPSLLIAKWTPPGGGPELPVAGKSGNFTLHLEAVGLAQAGTYTCSIHLQGQQLNATVTLAVITVTPKSFGLPGSRGKLLCEVTPASGKERFVWRPLNNLSRSCPGPVLEIQEARLLAERWQCQLYEGQRLLGATVYAAESSSGAHSARRISGDLKGGHLVLVLILGALSLFLLVAGAFGFHWWRKQLLLRRFSALEHGIQPFPAQRKIEELERELETEMGQEPEPEPEPQLEPEPRQL

序列表

<110> 上海开拓者生物医药有限公司

<120> 抗人LAG-3单克隆抗体及其应用

<130> P2017-2573

<160> 63

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Ser Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ile Ser Thr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Ala Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Ser Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Thr Gly Trp Asn Asp

1 5

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asp Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Gly Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Arg Ala Asp Arg Leu Leu Asp

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Arg Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Lys Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Trp Asp Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Lys Tyr Gly Val His

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

Val Ile Trp Arg Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

Trp Asp Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Thr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Thr Val Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Lys Met His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Glu Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Asp Trp Asp Asp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

Asp Phe Lys Met His

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

Tyr Ile Ala Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

Trp Asp Asp Val Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Glu Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

Leu Gln Tyr Val Glu Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 25

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Thr Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Thr Asp Pro Glu Thr Ser Tyr Ser Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ile Ala Thr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

Ala Thr Asp Pro Glu Thr Ser Tyr Ser Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

Thr Gly Trp Asn Asp

1 5

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

Asp Leu Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 33

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Thr Asp Pro Glu Thr Asp Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ile Thr Ser Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

Ala Thr Asp Pro Glu Thr Asp Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

Ser Gly Trp Asn Asp

1 5

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Glu Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

Leu Gln Tyr Asn Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 41

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

Arg Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Lys Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Trp Asp Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 42

Lys Tyr Gly Val His

1 5

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 43

Val Ile Trp Arg Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 44

Trp Asp Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 45

Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Met Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Asn Ile Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp

65 70 75 80

Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Gly Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 46

Gln Ala Ser Gln Gly Thr Asn Ile Asn Leu Asn

1 5 10

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 47

Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 48

Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 49

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 49

caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggagcc actgatcctg aaactggtaa tagtgcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccataatg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtat atcaactggg 300

tggaatgact ggggccaagg caccagtctc acagtctcct ca 342

<210> 50

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 50

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcagacagat tgttagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

ggagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 51

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 51

cgggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccata 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaatt aagtacggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggagagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagag gtggcatcac agactacaat 180

gcagctttca tgtccagact gagcatcacc aaggacaact ccaagagcca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaagc tgatgacact gccatatact actgtgccaa atgggacggg 300

cccctggcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351

<210> 52

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 52

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc ttgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actactgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tagaaataaa a 321

<210> 53

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 53

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaggg cttctggata cacattcact gacttcaaaa tgcactggat gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgccccta acaatggtgg tactgcctac 180

aatcagaaat tcaggggcaa ggccacattg actgtaaacg agtcctccaa cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atcggaagat tctgcagtct attactgtgt ggactgggac 300

gacgttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345

<210> 54

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 54

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaatca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaatagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgttgagt ttcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 55

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 55

caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120

actgtgcatg gcctggaatg gattggagcc actgatcctg aaactagtta tagtgcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtat agcaactggg 300

tggaacgact ggggccaagg caccagtctc acagtctcct ca 342

<210> 56

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 56

gacctcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gttggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tgttagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac attcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 57

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 57

caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60

tcctgcaagg cttcgggcaa cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggagcc actgatcctg aaactgataa tactgcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attattgcat aacaagtggg 300

tggaacgact ggggccaagg caccagtctc acagtctcct ca 342

<210> 58

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 58

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tgttagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggaatat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tataatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 59

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 59

cgggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccata 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaatt aagtacggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggagagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagag gtggcatcac agactacaat 180

gcagctttca tgtccagact gagcatcacc aaggacaact ccaagagcca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaagc tgatgacact gccatatact actgtgccaa atgggacggg 300

cccctggcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351

<210> 60

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 60

gatgtccaga tgattcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctttgggaga catggtcacc 60

atgacttgcc aggcaagtca gggcactaac attaatttaa actggtttca gcaaaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatggt gcaagcaact tggaagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtagata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctggaggat 240

gaagatatgg caacgtattt cggtctacag catagttatc tcccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 61

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 61

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro

465 470 475 480

Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln

485 490 495

Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu

515 520 525

<210> 62

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 62

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro

65 70 75 80

Ala Pro Gly His Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Gln Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val

275 280 285

Gly Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg

325 330 335

Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro

370 375 380

Leu Asn Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly

435 440 445

His Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro

465 470 475 480

Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln

485 490 495

Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Glu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro

515 520 525

Glu Pro Glu Gln Leu

530

<210> 63

<211> 521

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 63

Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp

1 5 10 15

Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu

65 70 75 80

His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr

85 90 95

Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu

100 105 110

His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe

115 120 125

Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His

130 135 140

Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu

145 150 155 160

Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys

165 170 175

Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg

180 185 190

Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr

195 200 205

Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln

210 215 220

Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu

245 250 255

Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val

260 265 270

Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu

275 280 285

Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala

305 310 315 320

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu

325 330 335

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala

355 360 365

Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg

370 375 380

Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala

405 410 415

Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg

420 425 430

Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Val Leu Val Leu Ile Leu

435 440 445

Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Gly Phe His

450 455 460

Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu His

465 470 475 480

Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln Arg Lys Ile Glu Glu Leu Glu Arg

485 490 495

Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln Leu

515 520

Claims

1.一种抗LAG-3抗体，其特征在于，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区；其中，

(1)所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:2所示的CDR1，

SEQ ID NO:3所示的CDR2，和

SEQ ID NO:4所示的CDR3；

并且所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR；

SEQ ID NO:6所示的CDR1'，

SEQ ID NO:7所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:8所示的CDR3'；

或

(2)所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR；

SEQ ID NO:10所示的CDR1，

SEQ ID NO:11所示的CDR2，和

SEQ ID NO:12所示的CDR3；

并且所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR；

SEQ ID NO:14所示的CDR1'，

SEQ ID NO:15所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:16所示的CDR3'。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或

所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

3.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：

(i)如权利要求1所述的抗体；以及

(ii)协助表达和/或纯化的标签序列。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的抗体；以及

(2)如权利要求3所述的重组蛋白。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQID NO:49所示和

编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:50所示。

6.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQID NO:51所示；并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:52所示。

7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的载体或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求3所述的重组蛋白、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

10.一种活性成分在制备预防和/或治疗LAG-3相关疾病的药物中的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求3所述的重组蛋白、或其组合，并且，所述LAG-3相关疾病选自下组：黑色素瘤、结肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、肾癌、或乳腺癌。

11.一种体外检测样品中LAG-3蛋白的组合物，其特征在于，其包括如权利要求1中所述的抗体或如权利要求3所述的重组蛋白。

12.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如权利要求1中所述的抗体或如权利要求3所述的重组蛋白。