JP2021511782A

JP2021511782A - 安定化された免疫グロブリンドメイン

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Publication number: JP2021511782A
Application number: JP2020537583A
Authority: JP
Inventors: ディークローラコダリ; シュテファンデングル; イエンスフィッシャー; トマスホーファー; ローランラリヴィエール; エッケハルトメスナー; シュテファンゼーバー; パブロウマニャ; アン−クレールザグドーン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2021-05-13
Also published as: US20210054021A1; CN111630063A; JP2024038187A; WO2019149715A1; EP3746470A1

Abstract

本発明は、自律VHドメインを安定化するために、52a位と71位または33位と52位にシステインを有する自律VHドメイン（aVH）に関する。これらのシステインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成することができ、かつ/またはジスルフィド結合を形成する。本発明はさらにaVHライブラリーに関する。

Description

発明の分野
本発明は、改変された免疫グロブリンドメイン、より具体的には、安定性が改善された改変型免疫グロブリン重鎖可変ドメインと、そのような免疫グロブリンドメインのライブラリーに関する。本発明はさらに、そのような免疫グロブリンドメインを作製するための方法、ならびにそうした免疫グロブリンドメインを使用する方法に関する。

背景
単一ドメイン抗体フラグメントは、ラクダ科動物種の天然に存在する重鎖IgG（VHHと呼ばれる）または軟骨サメのIgNAR（VNARと呼ばれる）に由来し得る。単一ドメイン抗体には、臨床開発の興味深い候補となるいくつかの特性があるが、非ヒト単一ドメイン抗体は、ヒトにおけるその免疫原性のため、治療用途には適していない。

従来のヒトIgGに由来する単一ドメイン抗体フラグメントは、しかしながら、安定性と溶解性が低いため、凝集する傾向があり（Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)（非特許文献1））、このことはタンパク質の安定性が不可欠である治療への応用を制限する。不安定なタンパク質は、部分的にアンフォールディングして凝集しがちであり、最終的には治療効果の低下と望ましくない副作用をもたらす。

単一ドメイン抗体フラグメントおよび他の組換え抗体フラグメントの安定性/溶解性を改善するためのいくつかのアプローチが企てられてきた。選択ベースのアプローチには、例えば、高温、極端なpH、またはプロテアーゼもしくは変性剤の存在下での、抗体のライブラリー選択が含まれる。エンジニアリング（改変・設計）ベースのアプローチには、抗体へのジスルフィド結合および他の安定化変異の導入が含まれる。

安定性が改善された単一ドメイン抗体を取得するための1つの方法は、多種類の単一ドメイン抗体を含むライブラリーからの選択である。そのようなライブラリーを作製するために、1つの単一ドメイン抗体を足場として使用して、安定性が向上するようにそれを改変することができる。その後、従来のパンニングによってライブラリーから所望の標的結合特異性を有する子孫単一ドメイン抗体を選択することができ、結果的に、それらは親足場の改善された特性を主に受け継ぐであろう。安定性が向上した単一ドメイン抗体を取得するための別の方法は、以前に選択した所望の結合特性を有する単一ドメイン抗体に、表面に露出される親水性アミノ酸または荷電アミノ酸などの安定化変異を導入することである。

人工ジスルフィド結合のタンパク質への導入は、タンパク質の立体配座安定性を高めるための戦略として認識されている。しかし、不適切な位置のジスルフィド結合は、タンパク質の安定性を高めるどころか、折りたたまれたタンパク質の周囲のアミノ酸に好ましくない影響を及ぼしたり、既存の好ましい相互作用を妨害したりする可能性がある。ジスルフィド架橋のための適切な位置の選択が不可欠であるのに、そのための確立された規則は存在しない。

人工的な非カノニカル（non-canonical）ジスルフィド結合の導入による単一ドメイン抗体のエンジニアリングは、その安定性を改善するための戦略として提案されている。

重鎖可変（VH）ドメインは、もともとシステイン残基23と104の間に高度に保存されたジスルフィド結合を含み（IMGTのナンバリング；Kabatのナンバリングシステムによると残基22と92に対応）、これは、VHのコアにある2本のβ鎖BおよびFを連結して、それらの安定性と機能に極めて重要である。

ラクダ類VHH（Saerens et al., J Mol Biol 377, 478-488 (2008)（非特許文献2）；Chan et al., Biochemistry 47, 11041-11045 (2008)（非特許文献3）；Hussack et al., Plos One 6, e28218 (2011)）（非特許文献4）またはヒトVH（Kim et al., Prot Eng Des Sel 25, 581-589 (2012)（非特許文献5）；WO 2012/100343（特許文献1））への54位と78位（IMGTのナンバリング；Kabatのナンバリングシステムによると49位と69位に対応）の間の2つ目の非天然ジスルフィド結合の導入は、その熱安定性および（VHHの場合には）プロテアーゼ耐性の増加につながることが示された（Hussack et al., Plos One 6, e28218 (2011)）。この特定のジスルフィド結合は、ユニークなヒトコブラクダVHH中に天然に存在するとして以前に同定されていた（Saerens et al., J Biol Chem 279, 51965-51972 (2004)（非特許文献6）)。それは、VHH疎水性コアにあるフレームワーク領域2（FR2）とフレームワーク領域3（FR3）を連結する。

原理的には有効であるが、このアプローチは、親和性、特異性、発現収量の低下など、いくつかの欠点なしには進展しない（Hussack et al., Plos One 6, e28218 (2011)）。

したがって、自律（autonomous）VHドメインを含めて、安定化された単一ドメイン抗体の必要性が依然として存在する。

WO 2012/100343

Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989) Saerens et al., J Mol Biol 377, 478-488 (2008) Chan et al., Biochemistry 47, 11041-11045 (2008) Hussack et al., Plos One 6, e28218 (2011)） Kim et al., Prot Eng Des Sel 25, 581-589 (2012) Saerens et al., J Biol Chem 279, 51965-51972 (2004)

本発明は、自律VHドメインが非カノニカルなシステインの導入により安定化され得る、という知見に基づいており、該システインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成することができ、かつ/またはジスルフィド架橋を形成する。

本発明が提供する第1の局面では、自律VHドメインは、Kabatのナンバリングによる（i）52a位と71位または（ii）33位と52位にシステインを含み、ここで、該システインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成することができ、かつ/またはジスルフィド結合を形成する。特に、自律VHドメインは、単離された自律VHドメインである。自律VHドメインは安定性が向上している。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、Kabatのナンバリングによる44E、45E、45R、(101-1)Yおよび101Dからなる群より選択される置換を含む。特に、自律VHドメインは、Kabatのナンバリングによる44E、45Eまたは45R、(101-1)Yおよび101Dの置換を含む。さらに好ましい態様では、自律VHドメインは、KabatのナンバリングによるG44E、T45E、T45R、F(101-1)YおよびA101Dからなる群より選択される置換を含む。特に、自律VHドメインは、KabatのナンバリングによるG44E、T45E、T45R、F(101-1)YおよびA101Dの置換を含む。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、Kabatのナンバリングによる44E、45Eおよび(101-1)Yからなる群より選択される置換を含む。特に、自律VHドメインは、Kabatのナンバリングによる44E、45Eおよび(101-1)Yの置換を含む。さらに好ましい態様では、自律VHドメインは、自律VHドメインに存在する場合、KabatのナンバリングによるG44E、T45EおよびF(101-1)Yからなる群より選択される置換を含む。特に、自律VHドメインは、KabatのナンバリングによるG44E、T45EおよびF(101-1)Yの置換を含む。本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、以下を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む：
（a）SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR1、
（b）SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR2、
（c）SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR3、および
（d）SEQ ID NO: 210のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR4。

本発明の別の好ましい態様では、自律VHドメインは、以下を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む：
（a）SEQ ID NO: 211のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR1、
（b）SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR2、
（c）SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR3、および
（d）SEQ ID NO: 210のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR4。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、以下を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む：
（a）SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列を含むFR1、
（b）SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列を含むFR2、
（c）SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列を含むFR3、および
（d）SEQ ID NO: 210のアミノ酸配列を含むFR4。

本発明の別の好ましい態様では、自律VHドメインは、以下を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む：
（a）SEQ ID NO: 211のアミノ酸配列を含むFR1、
（b）SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列を含むFR2、
（c）SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列を含むFR3、および
（d）SEQ ID NO: 210のアミノ酸配列を含むFR4。

SEQ ID NO: 207〜211に示されるFR1〜FR4はヒトにおいて免疫原性がないため、この自律VHドメインは特に有用である。したがって、本発明の自律VHドメインは、抗原結合分子を同定するためのVHライブラリーを作製するのに有望な候補である。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、またはSEQ ID NO: 180の配列を含む。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、またはSEQ ID NO: 180のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含む。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、細胞死受容体5（death receptor 5：DR5）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、トランスフェリン受容体1（TfR1）、またはリンパ球活性化遺伝子3（LAG3）に結合する。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、MCSPに結合し、以下を含む：
（i）SEQ ID NO: 212のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 213のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 214のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（ii）SEQ ID NO: 215のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 216のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 217のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（iii）SEQ ID NO: 218のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 219のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 220のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（iv）SEQ ID NO: 221のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 222のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 223のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（v）SEQ ID NO: 224のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 225のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 226のアミノ酸配列を含むCDR3。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、TfR1に結合し、以下を含む：
（i）SEQ ID NO: 227のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 228のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 229のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（ii）SEQ ID NO: 230のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 231のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 232のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（iii）SEQ ID NO: 233のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 234のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 235のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（iv）SEQ ID NO: 236のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 237のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 238のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（v）SEQ ID NO: 239のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 240のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 241のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（vi）SEQ ID NO: 242のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 243のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 244のアミノ酸配列を含むCDR3；または
（vii）SEQ ID NO: 245のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 246のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 247のアミノ酸配列を含むCDR3。

自律VHドメインはMCSPに結合し得る。MCSPに結合する自律VHドメインは、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。自律VHドメインはTfR1に結合し得る。TfR1に結合する自律VHドメインは、SEQ ID NO: 194のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 195のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 196のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 197のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 198のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 199のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 200のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。自律VHドメインはLAG3に結合し得る。Lag3に結合する自律VHドメインは、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ, ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、LAG3に結合し、以下を含む：（i）SEQ ID NO: 146のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 148のアミノ酸配列を含むCDR-H3；または（ii）SEQ ID NO: 149のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 150のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 151のアミノ酸配列を含むCDR3；または（iii）SEQ ID NO: 152のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 153のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 154のアミノ酸配列を含むCDR3；または（iv）SEQ ID NO: 155のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 156のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 157のアミノ酸配列を含むCDR3；または（v）SEQ ID NO: 158のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 159のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 160のアミノ酸配列を含むCDR3；または（vi）SEQ ID NO: 161のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 162のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 163のアミノ酸配列を含むCDR3；または（vii）SEQ ID NO: 164のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 165のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 166のアミノ酸配列を含むCDR3；または（viii）SEQ ID NO: 167のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 168のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 169のアミノ酸配列を含むCDR3；または（ix）SEQ ID NO: 170のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 171のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 172のアミノ酸配列を含むCDR3；または（x）SEQ ID NO: 173のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 174のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 175のアミノ酸配列を含むCDR3；または（xi）SEQ ID NO: 176のアミノ酸配列を含むCDR1、SEQ ID NO: 177のアミノ酸配列を含むCDR2、およびSEQ ID NO: 178のアミノ酸配列を含むCDR3。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、H35G、Q39R、L45EおよびW47Lからなる群より選択される置換をさらに含む。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、L45T、K94SおよびL108Tからなる群より選択される置換を含む。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、特にハーセプチン（Herceptin）のVH配列に基づいた、VH3_23フレームワークを含む。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインはFcドメインに融合される。

本発明の好ましい態様では、FcドメインはヒトFcドメインである。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、Fcドメインの端部のN末端またはC末端に融合される。本発明の好ましい態様では、Fcドメインは、本明細書に記載される「ノブイントゥーホール（knob-into-hole）技術」に関連して、knob（ノブ）変異またはhole（ホール）変異、特にknob変異を含む。両方のN末端およびC末端Fc融合では、グリシン-セリン（GGGGSGGGGS）リンカー、リンカー配列「DGGSPTPPTPGGGSA」を有するリンカー、または任意の他のリンカーが、自律VHドメインとFcドメインとの間で発現されることが好ましい。自律VHドメインとFcドメインの例示的な好ましい融合体は、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。自律VHドメインとFcドメインの例示的な好ましい融合体は、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される様々な自律VHドメインを含むVHドメインライブラリーに関する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される複数の自律VHドメインを含むVHドメインライブラリーに関する。本発明のさらなる局面は、様々なポリヌクレオチドから作製された本明細書に開示される複数の自律VHドメインを含むVHドメインライブラリーに関する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示されるVHドメインライブラリーを作製する方法に関する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される複数の自律VHドメインをコードする複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーに関する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される自律VHドメインをコードするポリヌクレオチドに関する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関し、該ポリヌクレオチドは本明細書に開示される自律VHドメインをコードする。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞、特に真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞に関する。

本発明のさらなる局面は、抗体、特に二重特異性抗体または多重特異性抗体に関する。抗体、特に二重特異性抗体または多重特異性抗体は、本明細書に開示される自律VHドメインを含む。特に、該抗体は単離された抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は3つ以上の結合特異性を有する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ある標的の2つ（またはそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体および多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして作製することができる。多重特異性抗体の様々な分子フォーマットは当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106を参照のこと）。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示されるVHドメインライブラリーを用いて抗原結合分子を同定するための方法に関する。この方法は、（i）VHドメインライブラリーを標的と接触させる段階、および（ii）ライブラリーの該標的に結合するVHドメインを同定する段階を含む。段階（ii）では、ライブラリーの該標的に結合するVHドメインを、その同定のために単離することができる。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドライブラリーを用いて抗原結合分子を同定するための方法に関する。この方法は、（i）ポリヌクレオチドライブラリーを、特に宿主細胞において、発現させる段階、（i）発現させたVHドメインライブラリーを標的と接触させる段階、および（ii）発現させたVHドメインライブラリーの該標的に結合するVHドメインを同定する段階を含む。段階（ii）では、ライブラリーの該標的に結合するVHドメインを、その同定のために単離することができる。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される方法で本明細書に開示されるVHドメインライブラリーを使用することに関する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される方法で本明細書に開示されるポリヌクレオチドライブラリーを使用することに関する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される自律VHドメインの使用に関する。本発明のさらなる局面は、本明細書に開示されるVHドメインライブラリーの使用によって、または本明細書に開示されるポリヌクレオチドライブラリーの使用によって同定された、自律VHドメインの使用に関する。

本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 260の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 261の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 262の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 260の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 263の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 264の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 265の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 266の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 267の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 268の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 269の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 270の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 271の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 272の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 273の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 274の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 275の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 276の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 277の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 278の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 279の配列を含む、FAPに結合する自律VHドメインに関する。

本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 300の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 301の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 302の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 303の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 304の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 305の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 306の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 307の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 308の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 309の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 310の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 311の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 312の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 313の配列を含む、CEAに結合する自律VHドメインに関する。

本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 328の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 329の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 330の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 331の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 332の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 333の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 334の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 335の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 336の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 337の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 338の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 339の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 340の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 341の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 342の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 343の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 344の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 345の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 346の配列を含む、CD28に結合する自律VHドメインに関する。

本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 375の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 376の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 377の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 378の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 379の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 380の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 381の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 382の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 383の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 384の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 385の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 386の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 387の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 388の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 389の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 390の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 391の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 392の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 393の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 394の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 395の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 396の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 397の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 398の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 399の配列を含む自律VHドメインに関する。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO: 400の配列を含む自律VHドメインに関する。

新しいaVHライブラリーの配列およびランダム化戦略。図1A：ハーセプチン重鎖と、単量体型の安定した自律ヒト重鎖可変ドメインの発現を可能にする改変配列（Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 2008, 283:3639-3654）との配列アラインメント。図1B：最初のaVHライブラリーにおけるCDR3領域のランダム化戦略。フレームワーク3領域の一部と、Kabatのナンバリングによると3つの異なるCDR3配列長を有するCDR3領域（ボックスで囲ってある）と、フレームワーク4領域を示す。太字の文字は、配列B1abと比較して異なる配列を示し、（X）はランダム化された位置を表す。作製されたFcベースのaVH構築物の概略図。図2A：DNAレベルで、aVHドメインをコードするヌクレオチド配列を、2重GGGGSリンカーまたはリンカー配列DGGSPTPPTPGGGSAをコードするDNA配列に融合させ、該リンカーをFcドメインコード配列をコードするDNA配列に融合させた。最終的なタンパク質構築物では、aVHドメインが、前述のリンカーの1つを介してヒト由来のIgG1 Fc配列（ここではFc-knobフラグメント）のN末端に融合され、これをFc-holeフラグメントをコードする配列と共発現させると、Fc二量体あたり単量体のディスプレイになる。Fc-knobとFc-holeの両方はPG-LALA変異をも含み得る。図2B：IgG抗体のVHドメインをコードするヌクレオチド配列を、aVHドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換えた。さらに、κ軽鎖の可変ドメインをコードする配列を欠失させて、唯一のκドメインの発現を生じさせた。共発現させると、2価のaVHディスプレイを有するIgG様構築物が得られる。図2C：DNAレベルで、aVHドメインをコードするヌクレオチド配列を、2重GGGGSリンカーをコードするDNA配列に融合させ、該リンカーをFcドメインコード配列をコードするDNA配列に融合させた。最終的なタンパク質構築物では、aVHドメインが、前述のリンカーを介してヒト由来のIgG1 Fc配列（ここでは野生型FcドメインまたはPG-LALA変異を有するFcドメインのいずれか）のN末端に融合される。発現させると、2価のaVHディスプレイを有するIgG様構築物が得られる。ジスルフィド安定化aVHと新しいライブラリー用にデザインされたテンプレートとの配列アラインメント。図3A：aVHライブラリーテンプレートのアラインメントを、P52aC/A71Cの組み合わせに基づいて示す。図3B：aVHライブラリーテンプレートのアラインメントを、Y33C/Y52Cの組み合わせに基づいて示す。フローサイトメトリーによる細胞結合解析。1価のaVH-Fc融合構築物としての、選択したMCSP特異的クローンのMV3細胞への結合解析。濃度範囲を0.27〜600nMとした。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。 TfR1特異的aVHクローンのFRET解析。テルビウムで標識した膜貫通TfR1-SNAPタグ融合タンパク質を発現する一過性トランスフェクト細胞についてのFRET解析。抗体を0.4〜72nMの範囲の濃度で添加し、続いて抗ヒトFc-d2（最終的にウェルあたり200nM）をアクセプター分子として添加することによって、解析を行った。3時間後に特異的FRETシグナルを測定して、K_D値を算出した。親6H1配列と、生化学的特性を改善するためのその安定化変異のアラインメント。クローン6H1の配列と、以前に同定された位置に単一の点変異またはそれらの組み合わせを含むバリアントが示される。生化学的特性が改善された新しいaVHクローンを作製するための変異を含む新しいライブラリーテンプレート。図7A：同定された変異G44E、T45EおよびF(101-1)Yを含む3つの新しいライブラリーテンプレートの配列。図7B：3つの新しいaVHライブラリーにおけるCDR2および3領域のランダム化戦略。「X」のマークが付いた位置は、新しいテンプレートにおけるランダム化位置を表す。カッコ内の位置（X）は、新しく作製されたライブラリーにおけるCDR3領域の3つの異なる長さを示す。 FAP特異的aVHクローンのFRET解析。テルビウムで標識した膜貫通hu FAP-SNAPタグ融合タンパク質を発現する一過性トランスフェクト細胞についてのFRET解析。aVHを0.005〜100nMの範囲の濃度で添加し、続いてd2標識抗hisタグ抗体（最終的にウェルあたり200nM）をアクセプター分子として添加することによって、解析を行った。3時間後に特異的FRETシグナルを測定して、KD値を算出した。 CEA特異的aVHクローンのFRET結合解析。テルビウムで標識した膜貫通hu CEA-SNAPタグ融合タンパク質を発現する一過性トランスフェクト細胞についてのFRET解析。aVHを0.005〜100nMの範囲の濃度で添加し、続いてd2標識抗hisタグ抗体（最終的にウェルあたり200nM）をアクセプター分子として添加することによって、解析を行った。3時間後に特異的FRETシグナルを測定して、KD値を算出した。 TGN1412競合aVHクローンを同定するためのCD28特異的aVHクローンのFRET競合解析。テルビウムで標識した膜貫通hu CD28-SNAPタグ融合タンパク質を発現する一過性トランスフェクト細胞とd2標識TGN1412をインキュベートした後、この混合物に精製aVHクローンを0.014nM〜2500nMの範囲の濃度で加えた。TGN1412と同じエピトープを共有するクローンは結合をめぐって競合するため、クローンの濃度が上がるにつれてFRETシグナルが減少する。

発明の態様の詳細な説明
I.定義
別に定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用される；適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形をも含み、逆もまた同様である。

本明細書で使用する用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体フラグメントおよび足場抗原結合タンパク質である。

本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに望ましい抗原結合活性を示す限り抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、1つまたは複数の結合部位を有する抗体であって、該結合部位のそれぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する抗体を表す。用語「二重特異性」は、抗体が2つの結合部位により2つの異なる抗原決定基に特異的に結合できることを意味し、例えば、該2つの結合部位のそれぞれは、一対の抗体重鎖可変ドメイン（VH）と抗体軽鎖可変ドメイン（VL）によって、または異なる抗原もしくは同じ抗原上の異なるエピトープに結合する一対の自律VHドメインによって形成される。そのような二重特異性抗体は、例えば、1＋1フォーマットである。他の二重特異性抗体フォーマットは、2＋1フォーマット（第1の抗原またはエピトープに対する2つの結合部位と第2の抗原またはエピトープに対する1つの結合部位を含む）または2＋2フォーマット（第1の抗原またはエピトープに対する2つの結合部位と第2の抗原またはエピトープに対する2つの部位を含む）である。典型的には、二重特異性抗体は、2つの抗原結合部位を含み、該部位のそれぞれが異なる抗原決定基に特異的である。本明細書で使用する用語「多重特異性」抗体は、異なる抗原に結合するか、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する、3つ以上の結合部位を有する抗体を指す。特定の態様では、多重特異性抗体は、少なくとも3つの異なる部位に対する結合特異性を有する、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。多重特異性抗体は、細胞傷害性の薬剤または細胞を、標的を発現する細胞に局在化するためにも使用され得る。

本出願内で使用する「価」（valent）という用語は、抗原結合分子における特定の数の結合部位の存在を意味する。したがって、「2価」、「4価」および「6価」という用語は、抗原結合分子における、それぞれ2つの結合部位、4つの結合部位、6つの結合部位の存在を表す。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも「2価」であり、「3価」または「多価」（例えば、「4価」または「6価」）であってもよい。特定の局面では、本発明の抗体は2つ以上の結合部位を有し、二重特異性または多重特異性である。すなわち、結合部位が3つ以上ある（すなわち、抗体が3価または多価である）場合でさえも、2つの結合部位が存在する場合には、その抗体は二重特異性であり得る。

本明細書で使用する用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」、および「全抗体」は、相互交換可能に使用され、天然の抗体構造と実質的に類似した構造をもつ抗体を指す。「天然の抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然のIgGクラスの抗体は、ジスルフィド結合されている2本の軽鎖と2本の重鎖で構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。N末端からC末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（CL）が続く。抗体の重鎖は、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、またはμ（IgM）と呼ばれる5つのタイプのいずれかに割り当てられ、そのうちのいくつかはさらにサブタイプ、例えば、γ1（IgG1）、γ2（IgG2）、γ3（IgG3）、γ4（IgG4）、α1（IgA1）およびα2（IgA2）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つのタイプのどちらかに割り当てられる。

「抗体フラグメント」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、限定するものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスFabフラグメント；線形抗体；一本鎖抗体分子（例：scFv）；抗体フラグメントと単一ドメイン抗体から形成された多重特異性抗体が含まれる。特定の抗体フラグメントのレビューについては、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照のこと。scFvフラグメントのレビューについては、例えば、Pluecktn, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、WO 93/16185、米国特許第5,571,894号および第5,587,458号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したFabおよびF(ab')2フラグメントの考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。ダイアボディは、2価または二重特異性であり得る2つの抗原結合部位をもつ抗体フラグメントであり、例えば、EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)；およびHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディとテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または自律VHドメインを含む抗体フラグメントである。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis社, Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516 B1号を参照のこと）。抗体フラグメントは、本明細書に記載されるような、インタクト抗体のタンパク質分解消化および宿主細胞（例えば、大腸菌）による産生を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作ることができる。

古典的には、インタクト抗体のパパイン消化は、「Fab」フラグメントと呼ばれる2つの同一の抗原結合フラグメントをもたらし、これらはそれぞれ重鎖および軽鎖可変ドメインと、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメイン（CH1）を含む。したがって、本明細書で使用する用語「Fabフラグメント」は、軽鎖のVLドメインおよび定常ドメイン（CL）を含む軽鎖フラグメントと、重鎖のVHドメインおよび第1定常ドメイン（CH1）とを含む抗体フラグメントを指す。Fab'フラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの1個以上のシステインを含むいくつかの残基が追加されている点で、Fabフラグメントとは相違する。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するFab'フラグメントである。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位（2つのFabフラグメント）およびFc領域の一部をもつF(ab')₂フラグメントをもたらす。

「クロスFabフラグメント」または「xFabフラグメント」または「クロスオーバーFabフラグメント」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているFabフラグメントを指す。クロスFabフラグメントは、軽鎖可変領域（VL）および重鎖定常領域1（CH1）で構成されるポリペプチド鎖と、重鎖可変領域（VH）および軽鎖定常領域（CL）で構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Fabアームは、正しいFab対合を誘導するようにドメイン界面（domain interface）に荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸変異を導入することによって操作することもできる。例えば、WO 2016/172485を参照のこと。

「一本鎖Fabフラグメント」または「scFab」は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体軽鎖定常ドメイン（CL）およびリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、該抗体ドメインおよび該リンカーは、N末端からC末端の方向に、次の順序：a）VH-CH1-リンカー-VL-CL、b）VL-CL-リンカー-VH-CH1、c）VH-CL-リンカー-VL-CH1、またはd）VL-CH1-リンカー-VH-CLのいずれか1つを有し、ここで、該リンカーは少なくとも30アミノ酸、好ましくは32〜50アミノ酸のポリペプチドである。一本鎖Fabフラグメントは、CLドメインとCH1ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。さらに、これらの一本鎖Fab分子は、システイン残基（例えば、Kabatのナンバリングによる可変重鎖の44位と可変軽鎖の100位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化される可能性がある。

「クロスオーバー一本鎖Fabフラグメント」または「x-scFab」は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体軽鎖定常ドメイン（CL）およびリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、該抗体ドメインおよび該リンカーは、N末端からC末端の方向に、次の順序：a）VH-CL-リンカー-VL-CH1およびb）VL-CH1-リンカー-VH-CLのいずれかを有する；VHとVLは一緒になって、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する；ここで、該リンカーは少なくとも30アミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのx-scFab分子は、システイン残基（例えば、Kabatのナンバリングによる可変重鎖の44位と可変軽鎖の100位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化される可能性がある。

「一本鎖可変フラグメント（scFv）」は、10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された、抗体の重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）の融合タンパク質である。該リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富で、溶解性のためにセリンまたはトレオニンが豊富であり、VHのN末端をVLのC末端と連結することができ、その逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。scFv抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)に記載されている。

「単一ドメイン抗体」は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。最初の単一ドメインは、ラクダ類からの抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ナノボディまたはVHHフラグメント）。さらに、単一ドメイン抗体という用語には、自律重鎖可変ドメイン（aVH）またはサメ由来のVNARフラグメントが含まれる。

用語「エピトープ」は、抗体が結合する、タンパク質性または非タンパク質性の、抗原上の部位を表す。エピトープは、連続したアミノ酸のストレッチから形成されることもあるし（直線状エピトープ）、または、抗原のフォールディングのために、すなわちタンパク質性抗原の三次フォールディングによって、空間的に接近する非連続的なアミノ酸を含むこともある（立体構造エピトープ）。直線状エピトープは、典型的には、タンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も依然として抗体によって結合されるが、立体構造エピトープは、通常、変性剤での処理により破壊される。エピトープは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、または8〜10個のアミノ酸をユニークな空間的立体構造で含む。

ある特定のエピトープに結合する抗体（すなわち、同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、当技術分野でルーチンの方法、例えば、限定するものではないが、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463参照）、ペプチド切断分析、エピトープ切り出し（epitope excision）、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Prot. Sci. 9 (2000) 487-496参照）、クロスブロッキング（cross-blocking）（“Antibodies”, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)参照）などを用いて、行うことができる。

抗原構造に基づいた抗体プロファイリング（Antigen Structure-based Antibody Profiling：ASAP）は、修飾支援プロファイリング（Modification-Assisted Profiling：MAP）としても知られており、化学的または酵素的に修飾された抗原表面への各抗体の結合プロファイルに基づいて、ある標的に特異的に結合する多数のモノクローナル抗体をビン（bin）に入れて分類することを可能にする（例えば、US 2004/0101920を参照のこと）。各ビン内の抗体は同じエピトープに結合し、該エピトープは、別のビンにより表されるエピトープとは明らかに異なるかまたは部分的にオーバーラップする、ユニークなエピトープであり得る。

また、競合的結合を使用して、ある抗体が参照抗体と同じ標的のエピトープに結合するか、または参照抗体との結合をめぐって競合するかを容易に確認することができる。例えば、参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を50％以上ブロックする抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイで該抗体のその抗原への結合を50％以上ブロックする。また、例えば、抗体が参照と同じエピトープに結合するかどうかを確認するために、参照抗体を飽和条件下で標的に結合させることができる。過剰な参照抗体を除去した後、問題の抗体が標的に結合する能力を評価する。該抗体が参照抗体の飽和結合後に標的に結合できるならば、問題の抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けられる。しかし、問題の抗体が参照抗体の飽和結合後に標的に結合できない場合には、問題の抗体は、参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。問題の抗体が同じエピトープに結合するか、または単に立体的な理由で結合から妨げられるのかを確認するために、ルーチンの実験が使用され得る（例えば、ELISA、RIA、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用するペプチド変異および結合解析）。このアッセイは、2つのセットアップで実施する必要があり、すなわち、両方の抗体を飽和抗体とする。両方のセットアップで、最初の（飽和）抗体のみが標的に結合できる場合には、問題の抗体と参照抗体は標的への結合をめぐって競合すると結論付けることができる。

いくつかの態様では、1倍、5倍、10倍、20倍または100倍過剰の一方の抗体が、競合結合アッセイで測定して、他方の抗体の結合を少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも90％、または99％以上阻害する場合、2つの抗体は同じまたは重複するエピトープに結合すると見なされる（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502を参照のこと）。

いくつかの態様では、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原の本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合をも低減または排除する場合、これらの2つの抗体は同じエピトープに結合すると見なされる。一方の抗体の結合を低減または排除するアミノ酸変異の一部のみが、他方の抗体の結合を低減または排除する場合には、2つの抗体は「重複するエピトープ」を有すると見なされる。

本明細書で使用する用語「抗原結合部位」または「抗原結合ドメイン」は、抗原決定基に特異的に結合する抗原結合分子の部分を指す。より具体的には、用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合しかつ抗原の一部または全部に相補的である領域を含む抗体の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合することができる。抗原結合部位は、例えば、1つまたは複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合部位は自律VHドメインを含む。一局面では、抗原結合部位はその抗原に結合して、その機能をブロックするまたは部分的にブロックすることができる。MCSP、TfR1、LAG3などに特異的に結合する抗原結合部位には、本明細書でさらに定義される抗体およびそのフラグメントが含まれる。さらに、抗原結合部位には、足場抗原結合タンパク質、例えば、デザインされたリピートタンパク質またはデザインされたリピートドメインに基づく結合ドメインが含まれる（例えば、WO 2002/020565を参照のこと）。

「特異的結合」とは、該結合が抗原に対して選択的であり、かつ不必要なまたは非特異的な相互作用から区別できることを意味する。抗体が1μM以下のK_dを有する場合、その抗体は、標的、例えばDR5、MCSP、TfR1またはLag3に「特異的に結合」するとされる。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）または当業者によく知られる他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）技術（BIAcore装置で分析）（Liljeblad et al., Glyco 15 J 17, 323-329 (2000)）および従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）、のいずれかによって測定することができる。一態様では、抗原結合分子の非関連タンパク質への結合の程度は、例えばSPRで測定して、抗原結合分子の抗原への結合の約10％未満である。特定の態様では、抗原に結合する分子は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例えば10^-7M以下、例えば10^-7M〜10^-13M、例えば10^-9M〜10^-13M）の解離定数（K_d）を有する。

「親和性」または「結合親和性」は、分子（例：抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例：抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強さを指す。特に明示しない限り、本明細書で使用する「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の1：1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数（K_d）により表され、これは解離速度定数と結合速度定数（それぞれ、k_offとk_on）の比である。したがって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載の方法を含めて、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（SPR）である。

本明細書で使用する場合、抗体の「高親和性」という用語は、標的抗原に対して10^-9M以下、さらにより具体的には10^-10M以下のK_dを有する抗体を指す。抗体の「低親和性」という用語は、10^-8以上のK_dを有する抗体を指す。

「親和性成熟」された抗体は、1つまたは複数の超可変領域（HVR）に1つまたは複数の改変を有する抗体を指し、これに対して親抗体はそのような改変を保持しない；そのような改変は抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。

「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。いくつかの態様では、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は一般に類似した構造を持ち、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., ページ91 (2007)を参照のこと。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。

本明細書で使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」）、かつ/または構造的に明確なループを形成し（「超可変ループ」）、かつ/または抗原接触残基を含む（「抗原接触」）、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は6つのHVRを含み、VHに3つ（H1、H2、H3）、VLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書における例示的なHVRは、以下を含む：
（a）アミノ酸残基26-32（L1）、50-52（L2）、91-96（L3）、26-32（H1）、53-55（H2）、および96-101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（b）アミノ酸残基24-34（L1）、50-56（L2）、89-97（L3）、31-35b（H1）、50-65（H2）、および95-102（H3）に存在するCDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（c）アミノ酸残基27c-36（L1）、46-55（L2）、89-96（L3）、30-35b（H1）、47-58（H2）、および93-101（H3）に存在する抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；および
（d）HVRアミノ酸残基46-56（L2）、47-56（L2）、48-56（L2）、49-56（L2）、26-35（H1）、26-35b（H1）、49-65（H2）、93-102（H3）、および94-102（H3）を含む、（a）、（b）および/または（c）の組み合わせ。

特に明示しない限り、可変ドメイン内のHVR（例えば、CDR）残基および他の残基（例えば、FR残基）は、Kabat et al., 前出に従って、本明細書では番号付けされる。

Kabat et al.はまた、あらゆる抗体に適用できる可変領域配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、配列そのもの以外のどのような実験データにも頼らずに、この「Kabatのナンバリング」のシステムを任意の可変領域配列に一義的に割り当てることができる。本明細書で使用する「Kabatのナンバリング」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)に記載されるナンバリングシステムを指す。本明細書で特に明記しない限り、Fc領域または定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるような、EUインデックスとも呼ばれる、EUナンバリングシステムに従う。

VHのCDR1を除いて、CDRは一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、「特異性決定残基」または「SDR」を含み、これらは抗原に接触する残基である。SDRは、短縮型（abbreviated）CDRまたはa-CDRと呼ばれるCDRの領域内に含まれる。例示的なa-CDR（a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3）は、L1のアミノ酸残基31-34、L2の50-55、L3の89-96、H1の31-35B、H2の50-58、およびH3の95-102に存在する。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと。）簡略化するために、自律VHドメインの文脈では、第2のポリペプチド鎖（例えば、VLドメイン）が自律VHドメインには存在しないため、本明細書ではCDR1、CDR2およびCDR3と表記される。

「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは一般に、FR1、FR2、FR3、FR4の4つのFRドメインからなる。したがって、HVRおよびFR配列は一般に、VH（またはVL）に次の順序で出現する：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。簡略化するために、自律VHドメインの文脈では、自律VHドメインが2本の鎖、特にVHドメインとVLドメインで構成されないので、本明細書ではFR1、FR2、FR3およびFR4と表記される。

本明細書における「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（VL）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークのことである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよいし、アミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様では、VHアクセプターヒトフレームワークは、配列がVHヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。

用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要なクラスIgA、IgD、IgE、IgG、IgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、この場合、HVR（例えば、CDR）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。

抗体、例えば非ヒト抗体、の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けている抗体を指す。

「ヒト」抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用した非ヒト供給源に由来する抗体、のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、例えば天然に存在する突然変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の作製中に生じる可能性のあるバリアント抗体（そのようなバリアントは一般に少量で存在する）を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。一般的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特性を示しており、特定の方法で抗体を産生する必要があると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な技法によって作製することができる。

本明細書における用語「Fcドメイン」または「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Fc領域およびバリアントFc領域が含まれる。特に、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで伸びている。ただし、Fc領域のC末端リシン（Lys447）は存在してもしなくてもよい。

IgG Fc領域は、IgG CH2およびIgG CH3ドメインを含む。ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」は通常、約231位のアミノ酸残基から約340位のアミノ酸残基まで伸びている。一態様では、糖鎖はCH2ドメインに結合している。本明細書におけるCH2ドメインは、天然配列CH2ドメインまたはバリアントCH2ドメインであり得る。「CH3ドメイン」は、Fc領域のCH2ドメインのC末端の残基のストレッチ（すなわち、IgGの約341位のアミノ酸残基から約447位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書におけるCH3領域は、天然配列CH3ドメインまたはバリアントCH3ドメイン（例えば、その一方の鎖に「凸部」（「knob」）が、他方の鎖に対応して「凹部」（「hole」）が導入されたCH3ドメイン；参照により本明細書に明示的に組み入れられる米国特許第5,821,333号を参照）であり得る。そのようなバリアントCH3ドメインは、本明細書に記載されるような、2つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用することができる。本明細書で特に指定しない限り、Fc領域または定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるような、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。

「ノブイントゥーホール」技術は、例えば、US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)；およびCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、この方法は、第1のポリペプチドの界面に凸部（「knob」）を導入し、第2のポリペプチドの界面に対応する凹部（「hole」）を導入することを含み、その結果、凸部が凹部内に配置されて、ヘテロ二量体の形成を促進しかつホモ二量体の形成を妨げるようになる。凸部は、第1のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。凸部と同一または類似のサイズの対応する凹部は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、第2のポリペプチドの界面に形成される。凸部と凹部は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば部位特異的変異誘発によって、またはペプチド合成によって、形成することができる。具体的な態様では、knob改変は、Fcドメインの2つのポリペプチドの一方にアミノ酸置換T366W（EUナンバリング）を含み、hole改変は、Fcドメインの2つのポリペプチドの他方にアミノ酸置換T366S、L368AおよびY407V（EUナンバリング）を含む。さらに具体的な態様では、knob改変を含むFcドメインのポリペプチドは、アミノ酸置換S354C（EUナンバリング）をさらに含み、hole改変を含むFcドメインのポリペプチドは、アミノ酸置換Y349C（EUナンバリング）をさらに含む。これらの2つのシステイン残基の導入により、Fc領域の2つのポリペプチド間にジスルフィド架橋が形成されるようになり、該二量体がさらに安定化される（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。

「免疫グロブリンのFc領域と同等の領域」とは、免疫グロブリンのFc領域の天然に存在するアレルバリアントだけでなく、置換、付加または欠失をもたらすが、エフェクター機能（抗体依存性細胞介在性細胞傷害など）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない改変を有するバリアントをも含むことが意図される。例えば、生物学的機能を実質的に低下させることなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1個以上のアミノ酸を欠失させることができる。そのようなバリアントは、活性への影響が最小限になるように、当技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照のこと）。

用語「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のFc領域に帰せられる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、以下が挙げられる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）、抗体依存性細胞貪食（ADCP）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）のダウンレギュレーション、およびB細胞活性化。

「活性化Fc受容体」とは、抗体のFc領域の結合後に、エフェクター機能を果たすように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するFc受容体のことである。活性化Fc受容体としては、FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)、およびFcαRI (CD89)が挙げられる。特定の活性化Fc受容体はヒトFcγRIIIaである（UniProtアクセッション番号P08637、バージョン141を参照のこと）。

用語「ペプチドリンカー」は、1個以上のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される。適切な非免疫原性のリンカーペプチドは、例えば、(G4S)n、(SG4)nまたはG4(SG4)nペプチドリンカーであり、ここで、「n」は一般に1〜10の数、典型的には2〜4、特に2である。

「融合された」または「連結された」とは、複数の構成要素（例えば、抗原結合部位とFcドメイン）が、直接的にまたは1つ以上のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合でつながれることを意味する。

本出願で使用する用語「アミノ酸」は、以下を含む天然のカルボキシα-アミノ酸のグループを表す：アラニン（3文字表記：ala，1文字表記：A）、アルギニン（arg, R）、アスパラギン（asn, N）、アスパラギン酸（asp, D）、システイン（cys, C）、グルタミン（gln, Q）、グルタミン酸（glu, E）、グリシン（gly, G）、ヒスチジン（his, H）、イソロイシン（ile, I）、ロイシン（leu, L）、リシン（lys, K）、メチオニン（met, M）、フェニルアラニン（phe, F）、プロリン（pro, P）、セリン（ser, S）、トレオニン（thr, T）、トリプトファン（trp, W）、チロシン（tyr, Y）、およびバリン（val, V）。

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインし、最大の配列同一性パーセントを達成するように必要に応じてギャップを導入した後、アラインメントを目的とした配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign（DNASTAR社）ソフトウェアまたはFASTAプログラムパッケージなどの、公開されているコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の技量の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを含めて、配列をアラインするための適切なパラメータを設定することができる。しかし、本明細書においては、アミノ酸配列同一性％の値は、FASTAパッケージのバージョン36.3.8c以降のggsearchプログラムをBLOSUM50比較マトリックスと共に使用して生成される。FASTAプログラムパッケージは、W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258；およびPearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36により記載され、www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtmlまたはwww.ebi.ac.uk/Tools/sss/fastaから公的に入手可能である。あるいは、fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgiでアクセス可能な公開サーバーを使用して配列を比較し、ggsearch（グローバルなタンパク質：タンパク質)プログラムおよびデフォルトオプション（BLOSUM50；open: -10；ext: -2；Ktup＝2）を用いて、ローカルではなくグローバルなアラインメントが実行されるようにする。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダーに示される。

特定の局面では、本明細書で提供される本発明のaVHの「アミノ酸配列バリアント」が企図される。例えば、aVHの結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。aVHのアミノ酸配列バリアントは、該分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって、作製することができる。そのような改変には、例えば、aVHのアミノ酸配列からの残基の欠失、および/または該配列への残基の挿入、および/または該配列内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができるが、その最終構築物は所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件とする。置換変異誘発の対象となる部位には、HVRとフレームワーク（FR）が含まれる。保存的置換は、表Bに「好ましい置換」という見出しの下に提供され、また、アミノ酸側鎖クラス（1）〜（6）に関して以下にさらに記載される。対象となる分子にアミノ酸置換を導入して、その産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低下、またはADCCもしくはCDCの向上についてスクリーニングすることができる。

（表Ｂ）

アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループに分けることができる：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖の向きに影響を与える残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保存的置換では、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスと交換する必要がある。

用語「アミノ酸配列バリアント」には、親抗原結合分子（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する多数のバリアントが含まれる。一般的に、さらなる研究のために選択された、結果として得られるバリアントは、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ/または親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換バリアントは親和性成熟を受けた抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に作製することができる。簡単に述べると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、バリアント抗原結合分子をファージ上にディスプレイさせて、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。特定の態様では、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗原結合分子の能力を実質的に低下させない限り、1つまたは複数のHVR内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をHVRで行うことができる。変異誘発の標的となり得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャン変異誘発」と呼ばれ、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されている。この方法では、1個の残基または標的残基のグループ（例えば、Arg、Asp、His、Lys、Gluなどの荷電残基）を特定し、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置き換えて、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかを判定する。そのアミノ酸位置にさらなる置換を導入して、最初の置換に対する機能的感受性を立証してもよい。代替的に、または追加的に、抗原-抗原結合分子複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原の間の接触点を特定する。そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的化または排除され得る。バリアントは所望の特性を含むかどうか判定するためにスクリーニングすることができる。

アミノ酸配列の挿入には、長さが1残基から100残基またはそれ以上を含むポリペプチドの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基をもつ二重特異性抗体がある。該分子の他の挿入バリアントには、aVHまたはaVHを含む抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへのNまたはC末端での融合が含まれる。

「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害剤を含むがこれに限定されない、1つまたは複数の異種分子に結合された抗体のことである。

特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープ、に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は3つまたはそれ以上の結合特異性を有する。特定の態様では、結合特異性の1つはある抗原に対するものであり、他の（2つ以上の）特異性はその他の抗原に対するものである。特定の態様では、二重特異性抗体は、ある抗原の2つ（またはそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、細胞傷害性の薬剤または細胞を、抗原を発現する細胞に局在化させるためにも使用することができる。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして作製され得る。

多重特異性抗体を作製するための技術には、限定するものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)を参照）、および「ノブインホール（knob-in-hole）」エンジニアリング（例えば、米国特許第5,731,168号、およびAtwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)を参照）が含まれる。多重特異性抗体はまた、以下によっても作製することができる：抗体Fcヘテロ二量体分子を作るための静電ステアリング効果のエンジニアリング（例えば、WO 2009/089004を参照）；2つ以上の抗体またはフラグメントの架橋結合（例えば、米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)およびWO 2011/034605を参照）；軽鎖の誤対合問題を回避するための共通軽鎖技術の使用（例えば、WO 98/50431を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；一本鎖Fv（sFv）二量体の使用（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載される、三重特異性抗体の作製。

3つ以上の抗原結合部位をもつ改変された抗体、例えば「オクトパス抗体」（Octopus antibody）またはDVD-Igなども、本明細書に含まれる（例えば、WO 2001/77342およびWO 2008/024715を参照）。3つ以上の抗原結合部位をもつ多重特異性抗体の他の例は、WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO2010/145792、およびWO 2013/026831に見られる。二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントには、[[PRO]]および別の異なる抗原または[[PRO]]の2つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性FAb」（Dual Acting FAb）または「DAF」も含まれる（例えば、US 2008/0069820およびWO 2015/095539を参照）。

多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の1つまたは複数の結合アームにドメインクロスオーバーを伴って、すなわち、VH/VLドメイン（例えば、WO 2009/080252およびWO 2015/150447を参照）、CH1/CLドメイン（例えば、WO 2009/080253を参照）、または完全なFabアーム（例えば、WO 2009/080251、WO 2016/016299を参照、さらにSchaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191およびKlein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20を参照）を交換することによって、非対称形で提供され得る。一態様では、多重特異性抗体はクロスFabフラグメントを含む。用語「クロスFabフラグメント」または「xFabフラグメント」または「クロスオーバーFabフラグメント」は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているFabフラグメントを指す。クロスFabフラグメントは、軽鎖可変領域（VL）と重鎖定常領域1（CH1）で構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域（VH）と軽鎖定常領域（CL）で構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Fabアームはまた、正しいFab対合を誘導するために荷電または非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入することによっても作製され得る。例えば、WO 2016/172485を参照のこと。

多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106を参照のこと）。

特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞を殺傷するためにT細胞をリターゲティング（再標的化）するための、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の表面抗原と、T細胞受容体（TCR）複合体の活性化不変成分（例えば、CD3）とに、同時に結合するようにデザインされた二重特異性抗体であり、それらも本明細書に含まれる。

この目的のために有用でありうる二重特異性抗体フォーマットの例には、限定するものではないが、以下が含まれる：2つのscFv分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「BiTE」（二重特異性T細胞エンゲージャー）分子（例えば、WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261およびWO2008/119567；Nagorsen and Baeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)を参照）；ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）およびそれらの誘導体、例えば、タンデムダイアボディ（「TandAb」；Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)）；ダイアボディのフォーマットに基づくが、さらなる安定化のためにC末端ジスルフィド架橋を特徴とする「DART」（二重親和性リターゲティング）分子（Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)）；およびマウス/ラットIgG全ハイブリッド分子である、いわゆるトリオマブ（triomab）（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に概説）。本明細書に含まれる特定のT細胞二重特異性抗体フォーマットは、WO 2013/026833、WO2013/026839、WO 2016/020309；Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498に記載されている。

用語「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」には、ヌクレオチドのポリマーを含む化合物および/または物質が含まれる。各ヌクレオチドは、塩基、具体的にはプリンまたはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（C）、グアニン（G）、アデニン（A）、チミン（T）またはウラシル（U））と、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）と、リン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記述され、そのため前記塩基は核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には5'から3'方向に表される。本明細書では、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）、例えば相補的DNA（cDNA）およびゲノムDNA、リボ核酸（RNA）、特にメッセンジャーRNA（mRNA）、DNAまたはRNAの合成形態、およびこれらの分子の2つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は線状または環状であり得る。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方、ならびに一本鎖および二本鎖の形態を含む。さらに、本明細書に記載される核酸分子は、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例には、誘導体化された糖またはリン酸バックボーン結合をもつ修飾ヌクレオチド塩基、または化学修飾された残基が含まれる。核酸分子はまた、本発明の抗体をインビトロおよび/またはインビボで、例えば宿主または患者において、直接発現させるためのベクターとして適切である、DNAおよびRNA分子を包含する。そのようなDNA（例：cDNA）またはRNA（例：mRNA）ベクターは未修飾であるか、または修飾されたものであり得る。例えば、mRNAを対象に注入して、インビボで抗体を産生させることができるように、RNAベクターの安定性および/またはコードされた分子の発現を高めるために、mRNAを化学修飾することが可能である（例えば、Stadler et al, Nature Medicine 2017, 2017年6月12日にオンライン公開, doi:10.1038/nm.4356またはEP 2 101 823 B1を参照のこと）。

「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、その自然環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸には、その核酸分子を通常含む細胞に含まれた核酸分子が含まれるが、該核酸分子は染色体外に存在するか、またはその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。

「単離された」ポリペプチドまたはそのバリアントもしくは誘導体、特に単離された抗体とは、その自然環境に存在しないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から分離され得る。宿主細胞内で発現され、組換え的に産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明においては単離されたと見なされ、適切な技術により分離された、分画された、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドも同様である。

本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば95％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり最大5個の点変異を含み得ることを除いて、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの最大5％を欠失させたり、別のヌクレオチドで置換したりすることができ、または、参照配列中の全ヌクレオチドの5％までの数のヌクレオチドを参照配列に挿入することもできる。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の5'または3'末端位置で起こっても、それらの末端位置の間のどこかで起こってもよく、参照配列の残基間に個別に、または参照配列内の1つ以上の連続するグループとして散在させることができる。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したプログラム（例えば、ALIGN-2）などの公知のコンピュータプログラムを用いて、従来どおりに決定することができる。

本明細書で使用する用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。特定のベクターは、それらに機能的に連結されている核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、相互交換可能に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫をも含む。宿主細胞には、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸内容の点で親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は、本明細書に含まれる。

薬剤の「有効量」とは、それが投与される細胞または組織に生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。

薬剤、例えば薬学的組成物、の「治療有効量」は、必要な投与量で、必要な期間にわたり、所望の治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。薬剤の治療有効量は、例えば、疾患の有害作用を排除し、軽減し、遅延させ、最小化し、または防止する。

「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウス、ラット）が含まれるが、これらに限定されない。特に、個体または対象はヒトである。

用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態をしており、かつ該製剤を投与される対象に対して許容できないほど毒性がある追加の成分を含まない調製物を指す。

「薬学的に許容される添加剤」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の、薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される添加剤には、緩衝剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

用語「添付文書」は、治療薬の商用パッケージに通常含まれる説明書を指すために使用され、その説明書は、そのような治療薬の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌および/または警告についての情報を含む。

本明細書で使用する「治療」（treatment）（および「treat」または「treating」などのその文法的変形）は、治療される個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に、行うことができる。治療の望ましい効果には、限定するものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行率（速度）の低下、病状の改善または緩和、寛解または予後改善が含まれる。いくつかの態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅らせるか、または疾患の進行を遅くするために使用される。

本明細書で使用する用語「癌」は、以下のような増殖性疾患を指す：リンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、細気管支肺胞上皮癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（CNS）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、およびユーイング肉腫、ならびに上記の癌のいずれかの難治性型、または上記の癌の1つ以上の組み合わせ。

用語「自律VH（aVH）ドメイン」は、免疫グロブリンフォールドを保持する単一の免疫グロブリン重鎖可変（VH）ドメインを指し、すなわち、それは、最大3つの相補性決定領域（CDR）が最大4つのフレームワーク領域（FR）と共に抗原結合部位を形成している、可変ドメインである。

用語「免疫グロブリン分子」は、前述のような、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。

サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したFabおよびF(ab')₂フラグメントの考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。ダイアボディは、2価または二重特異性であり得る、2つの抗原結合部位をもつ抗体フラグメントである。例えば、EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)；およびHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディとテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、本明細書で定義される重鎖可変ドメインの全部または一部を含む抗体フラグメントである。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis社, Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516 B1号を参照のこと）。抗体フラグメントは、本明細書に記載されるような、インタクト抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製することができる。

配列表のポリペプチド配列は、Kabatのナンバリングシステムに従って番号付けされていない。しかし、配列表の配列の番号付けを、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるような、KabatのナンバリングまたはEUのナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）に変換することは、当業者の通常の技術の範囲内である。該配列がCDRに向けられる場合は、Kabatのナンバリングが適用される。該配列がFcドメインに向けられる場合は、EUインデックスが適用される。

本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および修飾を包含することを意味する。最終構築物に到達するために、その最終構築物が所望の特性を有するという条件で、置換、欠失、挿入、および修飾のどのような組み合わせを行ってもよい。アミノ酸配列の欠失および挿入には、アミノ末端および/またはカルボキシ末端でのアミノ酸の欠失および挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。ペプチドのある種の特性を変更するためには、非保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸を異なる構造的および/または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による置換、または20種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体（例：4-ヒドロキシプロリン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5-ヒドロキシリシン）による置換が含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝的または化学的方法を用いて起こさせることができる。遺伝的方法には、部位特異的変異誘発、PCR、遺伝子合成などが含まれる。アミノ酸の側鎖基を遺伝子操作以外の方法、例えば化学的修飾、により改変する方法も有用であると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な変異表示を用いることができる。例えば、VHドメインの71位のアラニンからシステインへの置換は、71C、A71C、またはAla71Cysと示される。

本明細書で使用する用語「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合ともいう）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2個以上のアミノ酸の鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2個以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、そして用語「ポリペプチド」は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語と交換可能に使用される。用語「ポリペプチド」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むがこれらに限らない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって産生され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。それは、化学合成を含めて、どのような方法で作製されてもよい。本発明のポリペプチドは、約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、明確な三次元構造を持つことがあるが、必ずしもそのような構造を持たなくてもよい。明確な三次元構造を持つポリペプチドは、フォールディングされたといわれ、また、明確な三次元構造を持たず、むしろ多数の異なるコンフォメーションをとることができるポリペプチドは、アンフォールディングされたといわれる。

ジスルフィド結合の形成を可能にする条件は、例えば、細菌のペリプラズムまたは真核細胞の小胞体に見られるような、酸化条件に関係している。さらに、ジスルフィドを形成するアミノ酸対は、4〜6ÅのCα/Cα間の距離を持つ必要がある。

II.発明の態様
aVH
一局面では、本発明は、一部には、安定化された自律VHドメインに基づく。特定の態様では、Kabatのナンバリングによる52a位と71位または33位と52位にシステインを含む自律VHドメインが提供される。前記システインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成することができ、かつ/またはジスルフィド結合を形成する。本発明のさらなる局面では、Kabatのナンバリングによる52a位、71位、33位および52位にシステインを含む自律VHドメインが提供される。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1、またはSEQ ID NO: 208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2、またはSEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3、またはSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1およびSEQ ID NO: 208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1およびSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1およびSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1、SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3およびSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1、SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2およびSEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列によるフレームワーク領域1、SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2、SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3およびSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2、SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3およびSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2およびSEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列によるフレームワーク領域2およびSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい態様では、aVHは、SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列によるフレームワーク領域3およびSEQ ID NO: 210のアミノ酸配列によるフレームワーク領域4を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。あるいは、フレームワーク領域1は、フレームワーク領域1がSEQ ID NO: 207により定義された上記の態様において、SEQ ID NO: 211によるものである。

本発明の好ましい一態様では、aVHはVH3_23ヒトフレームワークを含む。本発明の好ましい一態様では、このフレームワークは、ハーセプチン（Herceptin（登録商標）：トラスツズマブ）のVHフレームワークに基づいている。

aVHテンプレート
本発明のさらなる局面では、テンプレートaVHが提供される。好ましい態様では、自律VHドメインはSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含む（テンプレート1）。SEQ ID NO: 40のアミノ酸配列は、位置P52aCおよびA71Cのシステイン変異に基づく。好ましい態様では、自律VHドメインはSEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含む（テンプレート2）。SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列は、位置P52aCおよびA71Cのシステイン変異に基づき、かつさらなる変異、すなわちG26Sを含む。好ましい態様では、自律VHドメインはSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含む（テンプレート3）。SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列は、位置P52aCおよびA71Cのシステイン変異に基づき、かつ31a位にセリンの挿入を含む、つまり、セリンが該配列の31位と32位の間に追加されたことを意味する。好ましい態様では、自律VHドメインはSEQ ID NO: 46のアミノ酸配列を含む（テンプレート4）。SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列は、位置P52aCおよびA71Cのシステイン変異に基づき、かつ31a位と31b位に2つのセリンの挿入を含む、つまり、2個のセリンが該配列の31位と32位の間に追加されたことを意味する。好ましい態様では、自律VHドメインはSEQ ID NO: 180のアミノ酸配列を含む（テンプレート5）。SEQ ID NO: 180のアミノ酸配列は、位置Y33CおよびY52のシステイン変異に基づく。SEQ ID NO: 40、42、44、46および180の配列は、さらなる安定化のために、K94SおよびL108Tの変異を含む。しかしながら、テンプレート1〜5はK94Sおよび/またはL198Tの変異を含む必要はない。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、SEQ ID NO: 40のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含む。本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含む。本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含む。本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、SEQ ID NO: 46のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含む。本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、SEQ ID NO: 180のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含む。

本発明の好ましい態様では、自律VHドメインは、H35G、および/またはQ39R、および/またはL45EもしくはL45T、および/またはW47Lの変異を含む。

特定の標的に対するaVH結合剤
さらなる局面では、本発明は、一部には、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）に結合するaVHドメインに基づく。好ましい態様では、MCSPに結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 57のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、MCSPに結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 59のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、MCSPに結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 61のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、MCSPに結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、MCSPに結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 65のアミノ酸配列を含む。

さらなる局面では、本発明は、一部には、トランスフェリン受容体1（TfR1）に結合するaVHドメインに基づく。好ましい態様では、TfR1に結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 194のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、TfR1に結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 195のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、TfR1に結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 196のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、TfR1に結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 197のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、TfR1に結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 198のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、TfR1に結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 199のアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、TfR1に結合するaVHドメインはSEQ ID NO: 200のアミノ酸配列を含む。

一局面では、本発明は、一部には、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）に結合するaVHドメインに基づく。好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（i）SEQ ID NO: 146の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 147の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 148の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 77のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（ii）SEQ ID NO: 149の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 150の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 151の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 79のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（iii）SEQ ID NO: 152の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 153の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 154の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 81のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（iv）SEQ ID NO: 155の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 156の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 157の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 83のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（v）SEQ ID NO: 158の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 159の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 160の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 85のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（vi）SEQ ID NO: 161の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 162の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 163の配列をもつCDR3を含む（抗LAG3 aVHドメインP110D1のCDRsに対応する）。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 87のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（vii）SEQ ID NO: 164の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 165の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 166の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 89のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（viii）SEQ ID NO: 167の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 168の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 169の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 91のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（ix）SEQ ID NO: 170の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 171の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 172の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 93のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（x）SEQ ID NO: 173の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 174の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 175の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 95のアミノ酸配列を含む。

好ましい態様では、LAG3に結合するaVHドメインは、（xi）SEQ ID NO: 176の配列をもつCDR1、SEQ ID NO: 177の配列をもつCDR2、およびSEQ ID NO: 178の配列をもつCDR3を含む。本発明のより好ましい態様では、該aVHドメインはSEQ ID NO: 97のアミノ酸配列を含む。

VHライブラリー
本明細書に記載の自律VHドメインを含むVHライブラリーを作製するために、テンプレート配列をランダム化した。テンプレート1（SEQ ID NO：40による）は、3つ全てのCDRにおいてランダム化した。テンプレート2、3および4（それぞれ、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46による）は、CDR2とCDR3でランダム化した。テンプレート5（SEQ ID NO：180による）は、第1のライブラリーでは3つ全てのCDRにおいてランダム化し、第2のライブラリーではCDR2とCDR3でのみランダム化した。

III.実施例
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上記の一般的な説明を考慮すると、様々な他の態様を実施できることが理解されよう。

組換えDNA技術
DNAを操作するために、Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold spring Harbor, New York, 1989に記載されるような、標準方法を採用した。分子生物学試薬は、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に示される。

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要な場合、適切なテンプレートを用いてPCRにより作製するか、またはGeneart AG（Regensburg, ドイツ）で合成オリゴヌクレオチドとPCR産物から自動遺伝子合成により合成した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位が両端に隣接する遺伝子セグメントは、標準的なクローニング/シーケンシングベクターにクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、UV分光法で濃度を測定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシーケンシングにより確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするために適切な制限部位を含むようにデザインした。真核細胞における分泌に使用される全ての構築物は、リーダーペプチドをコードする5'末端DNA配列を含むようにデザインした。SEQ ID NO: 1および2が代表的なリーダーペプチドを示す。

抗原発現ベクターのクローニング
特異的aVHドメインの選択のために、3種類の異なる抗原が作製された。

「成熟黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」（MCSP，Uniprot：Q6UVK1）のアミノ酸1553-2184をコードするDNA断片を、N末端リーダー配列を含む哺乳動物レシピエントベクターにインフレームでクローニングした。さらに、この構築物は、Bir Aビオチンリガーゼとの共発現中に特異的ビオチン化を可能にするC末端aviタグと、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）による精製に使用されるHisタグを含む（SEQ ID NO: 3および4）。

ヒトトランスフェリン受容体1（TfR1，Uniprot：P02786）のアミノ酸122-760をコードする増幅DNA断片を、溶解性および精製タグとして機能するヒトIgG1 Fcコード断片の下流で哺乳動物レシピエントベクターにインフレームで挿入した。N末端のaviタグはインビボビオチン化を可能にした。この抗原を単量体状態で発現させるために、Fc-TfR1融合構築物は「hole」変異（SEQ ID NO: 5および6）を含み、「Fc-knob」対応物（SEQ ID NO: 7および8）と組み合わせて共発現させた。

細胞死受容体5（DR5，Uniprot：O14763）では、細胞外ドメイン（アミノ酸1-152）をコードするDNA断片を、ヒトIgG1 Fcコード断片の上流でN末端リーダー配列を含む哺乳動物レシピエントベクターにインフレームで挿入した。C末端のaviタグは特異的なインビボビオチン化を可能にした（SEQ ID NO: 9および10）。

MCSP、TfR1およびDR5の抗原発現は一般にMPSVプロモーターによって駆動され、転写はコード配列の下流にある合成polyAシグナル配列によって終結される。発現カセットに加えて、各ベクターは、EBV-EBNA発現細胞株での自律複製のためのEBV oriP配列を含む。

ビオチン化C末端Aviタグ付きの可溶性ヒトLag3-IgG1-Fc-の作製では、プラスミド21707_pIntronA_shLag3_huIgG1-Fc-Aviを、ヒトLag3細胞外ドメイン（sw:lag3_humanの位置23-450）、およびN末端側のIEGRMDリンカー、ヒトIgG1重鎖cDNA発現ベクターの位置Pro100からGly329までの遺伝子合成（GeneArt GmbH）により作製し、C末端側に結合されたAviタグ配列

を有する（SEQ ID NO: 11および12）。

Fc融合構築物とHisタグ構築物の作製および精製
DR5-Fc-avi、単量体TfR1-Fc-avi、ならびに1価および2価のaVH Fc構築物の発現のために、該構築物を、EBV由来タンパク質EBNAを安定して発現するHEK 293細胞に一過性にトランスフェクトした。標準的なプロトコルに従って、ろ過済みの細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、Fc含有タンパク質をプロテインAセファロースカラム（GE healthcare社）にアプライして、PBSで洗浄した。溶出をpH2.8で行い、その後すぐにサンプルを中和した。凝集したタンパク質は、PBS中での、または20mMヒスチジン、150mM NaCl pH6.0中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200，GE Healthcare社）によって単量体画分から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、（必要に応じて）MILLIPORE Amicon Ultra（30 MWCO）遠心濃縮機を用いて濃縮し、-20℃または-80℃で凍結保存した。その後のタンパク質分析および解析評価（例えば、SDS-PAGEによる）、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または質量分析のために、サンプルの一部を提供した。

LAG3-Fc-aviの発現のために、最終プラスミド21707_pIntronA_shLag3_huIgG1-Fc-Aviを、Expi293（商標）発現システム（Life Technologies社）に2リットル規模で、製造元の指示に従ってトランスフェクトした。上清を回収し、プロテインAカラムクロマトグラフィーで精製した。精製済みのタンパク質は、BirAビオチン-タンパク質リガーゼ標準反応キット（Avidity社）により製造元の指示に従ってビオチン化した。タンパク質の分解を避けるために、プロテアーゼ阻害剤mini EDTAフリー（Roche社）を添加した。ゲルろ過カラム（Superdex200 16/60，GE社）の使用により、遊離ビオチンとBirAリガーゼをビオチン化タンパク質から除去した。ストレプトアビジンを加えることによってビオチン化を確認した。得られたビオチン化タンパク質/ストレプトアビジン複合体は、分析用SECクロマトグラムで保持時間のシフトを示した。

hisタグを発現する構築物を、EBV由来タンパク質EBNAを安定して発現するHEK 293細胞（HEK EBNA）に一過性にトランスフェクトした。同時にトランスフェクトされた、ビオチンリガーゼBirAをコードするプラスミドにより、インビボでのaviタグ特異的ビオチン化が可能になった。固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）とその後のゲルろ過を使用した標準プロトコルに従って、ろ過済みの細胞培養上清からタンパク質を精製した。単量体タンパク質画分をプールし、（必要に応じて）濃縮し、-20℃または-80℃で凍結保存した。その後のタンパク質分析および解析評価（例えば、SDS-PAGEによる）、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または質量分析のために、サンプルの一部を提供した。

実施例1
包括的な（generic）自律ヒト重鎖可変ドメイン（aVH）ライブラリーの作製
包括的なaVHライブラリーは、Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 2008, 283:3639-3654により公開された自律ヒト重鎖可変ドメインのハーセプチン由来テンプレートである配列B1ab（SEQ ID NO: 13および14）に基づいて作製された。B1abでは、軽鎖界面の不在下では表面に露出されるようになる4個の残基を、ファージディスプレイによって同定された残基で置き換えた。これらの変異は、VHドメインフォールドの構造と適合することがわかっている。それらは親水性を高め、それゆえ足場の安定性を向上させて、軽鎖パートナーの不在下で安定かつ可溶性であるaVHドメインの発現を可能にする（図1A）。

B1abの配列に基づいた、かつCDR3領域でランダム化された、aVHファージディスプレイライブラリーの作製のために、2本のフラグメントを「重複伸長によるスプライシング」（splicing by overlapping extension：SOE）PCRによって組み立てた。フラグメント1は、フレームワーク3が含まれるaVHコード遺伝子の5'末端を含み、一方フラグメント2は、aVHフラグメントのフレームワーク3の末端、ランダム化されたCDR3領域、およびフレームワーク4を含む。

次のプライマーの組み合わせを使用して、ライブラリーフラグメントを作製した：フラグメント1（LMB3 (SEQ ID NO: 15)とDP47_CDR3 back (mod) (SEQ ID NO: 16)）およびフラグメント2（DP47-v4プライマー類(SEQ ID NO: 18〜20)とfdseqlong (SEQ ID NO: 17)）（表1）。このライブラリーの作製では、3つの異なるCDR3の長さを使用した（図2B）。十分な量の完全長ランダム化aVHフラグメントを組み立てた後、それらをNcoI/NotIで消化し、並行してアクセプターファージミドベクターを同様に切断した。6μgのFabライブラリーインサートを24μgのファージミドベクターに連結した。精製した連結反応物を60回の形質転換に使用すると、6×10⁹の形質転換体が得られた。aVHライブラリーをディスプレイするファージミド粒子をレスキューし、PEG/NaCl精製により精製して、選択のために使用した。

（表１）CDR3ランダム化aVHライブラリーの作製のためのプライマーの組み合わせ

包括的aVHライブラリーからの抗DR5結合剤の選択
新しいライブラリーの機能をテストするために、DR5の細胞外ドメイン（ECD）に対する選択を、HEK293発現タンパク質を用いて実施した。パンニングのラウンドを次のパターンに従って溶液中で行った：（1.）総容量1ml中で0.5時間での100nMビオチン化抗原タンパク質への約10¹²個のファージミド粒子の結合；（2.）10分間での5.4×10⁷のストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加によるビオチン化抗原の捕捉および特異的結合ファージの結合；（3.）5×1ml PBS/Tween20および5×1ml PBSを用いた該ビーズの洗浄；（4.）10分間での1mlの100mMトリエチルアミン（TEA）の添加によるファージ粒子の溶出、および500μlの1M Tris/HCl pH7.4の添加による中和；（5.）上清中のファージ粒子による指数関数的増殖期の大腸菌（E. coli）TG1細胞の再感染、ヘルパーファージVCSM13による感染、および後続の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子のその後のPEG/NaCl沈殿。

選択は、抗原濃度を（10^-7Mから5×10^-9Mへ）下げながら3ラウンドにわたって実施した。ラウンド2では、抗原：ファージ複合体の捕捉を、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて行った。特異的結合剤をELISAで次のように同定した：ウェルあたり100μlの50nMビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートにコーティングした。Fab含有細菌上清を添加し、結合するFabを、そのFlagタグを介して、抗Flag/HRP二次抗体の使用により検出した。バックグラウンドに対して顕著なシグナルを示すクローンを、配列決定のためにショートリストに載せた（SEQ ID NO: 21〜28）。

実施例2
安定化ジスルフィド架橋を含むaVHドメインの同定
aVH足場をさらに安定させるために、タンパク質鎖の柔軟性を拘束する追加のジスルフィド架橋の導入を試験した。システインに変異させたときジスルフィド架橋の形成を可能にする位置は、1）構造モデリングにより、または2）追加の安定化ジスルフィドを有する天然のIg様Vタイプ配列を検索することにより、同定した。

第1のアプローチでは、使用したaVHに構造ホモロジーが最も近い分子の結晶構造を特定した(www.pdb.org, エントリー番号3B9V)。コンピュータアルゴリズムを使用して、Cα/Cα対の距離が5Å未満の63対のアミノ酸を同定した。この63対から、コアパッキングに強い影響を与えるか、またはCβ/Cβジオメトリの明らかな妨害があるアミノ酸対を除外した。その結果として、8つの異なるアミノ酸対が選択された。

第2のアプローチでは、22位と92位（Kabatのナンバリング）の間のカノニカルなジスルフィド結合に加えて、ジスルフィド架橋を含む免疫グロブリンファミリーの生殖細胞系列コード化Vタイプドメインを同定するために、マニュアルのデータベーススクリーンを行った。既に知られているラマ、ラクダ、ウサギからのジスルフィドパターンは明確に回避された。一例として、33位と52位に2個の追加のシステインを含むナマズ（アメリカナマズ（Ictalurus punctatus），AY238373）由来の配列が同定された。タンパク質構造データベース（www.pdb.org）を検索すると、このジスルフィドパターンが存在する2つの既存の天然抗体（PDBエントリー1AI1および1ACY）が明らかになり、これをヒト抗体足場に初めて導入した。

2個の追加のシステイン（それらがごく接近しているため、安定化ジスルフィド架橋の形成を可能にする）を有する全ての選択されたバリアントを、該ドメインの安定性に対する有益な影響について個別にテストした。全てのバリアントは、以前に同定されたDR5特異的結合剤の配列誘導体（SEQ ID NO: 38）に基づいて作製した。ジスルフィド安定化効果の分析のために、全てのバリアントを、CH3領域にknob変異を有するFc（knob）フラグメントのN末端に融合させた（SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38）。それぞれのFc-holeフラグメントとの共発現は、非対称の1価のaVH-Fc融合構築物をもたらした（図2A）。HEK-EBNA細胞における発現および精製は、上記のように行った。構築物の安定性は、動的光散乱（DLS）により測定される加熱誘導凝集（heat-induced aggregation）によって評価した。表3は、各構築物の測定された凝集温度を示す。これらの結果に基づいて、2つのバリアント（DS-Des9（Cys Y33C/Y52C）（SEQ ID NO: 30）およびDS-Des2（Cys P52aC/A71C）（SEQ ID NO: 37））がaVHランダム化ライブラリーを作製するための土台として選択された。

（表３）aVH足場に導入されたジスルフィド対のリストおよびそれぞれの凝集温度

実施例3
安定化された包括的自律ヒト重鎖可変ドメイン（aVH）ライブラリーを作製するための新しいライブラリーテンプレート
より高い安定性を示すaVHライブラリーを作製するために、SEQ ID NO: 30および37に基づいて、新しいaVHライブラリーテンプレートをデザインした。テンプレート配列に次の任意の改変を行った：（1）変異K94Sの導入；（2）抗体Jエレメントによく見られる配列バリアントである変異L108Tの導入。しかし、上記の変異は特異的効果を及ぼさない。全てのライブラリーテンプレートの概要を図3に示す。

安定化ジスルフィド架橋52a/71を有する新しい包括的自律ヒト重鎖可変ドメイン（aVH）ライブラリーの作製
52a位と71位の間の追加の安定化ジスルフィド架橋に基づいた新しいaVHライブラリーの作製のために、4つの新しいテンプレートをデザインした（SEQ ID NO: 39、41、43、45）。4つのテンプレートのうち3つは、CDR1領域に追加の配列改変を含む（図3A）。テンプレート2（SEQ ID NO: 42）では、グリシン26がセリンに置き換えられ（G26S改変）、テンプレート3および4（SEQ ID NO: 44および46）は、それぞれ31aおよび31a/bの位置に1つおよび2つのセリン挿入を有する（S31aおよびS31ab改変）。テンプレート1（SEQ ID NO: 40）は3つ全てのCDRでランダム化され、テンプレート2〜4（SEQ ID NO: 42、44、46）はCDR2とCDR3でのみランダム化された。全てのランダム化では、3つのフラグメントを「重複伸長によるスプライシング」（SOE）PCRによって組み立てた。フラグメント1は、フレームワーク1、CDR1、およびフレームワーク2の一部が含まれるaVH遺伝子の5'末端を有する。フラグメント2は、フレームワーク2でフラグメント1と重複し、CDR2およびフレームワーク3領域をコードする。フラグメント3は、フラグメント2とアニーリングし、CDR3領域およびaVHのC末端を保持する。

3つ全てのCDRをランダム化するために、次のプライマーの組み合わせを使用して、ライブラリーフラグメントを作製した：フラグメント1 (LMB3 (SEQ ID NO: 14)およびaVH_P52aC_A71C_H1_rev_Primer_TN (SEQ ID NO: 47)、フラグメント2 (aVH_P52aC_A71C_H2_for_Primer_TN (SEQ ID NO: 48)およびaVH_H3 reverse Primer (SEQ ID NO: 49)、フラグメント3 (aVH_H3_4/5/6_for_Primer_TN (SEQ ID NO: 50〜52)およびfdseqlong (SEQ ID NO: 17))（表4）。CDR2とCDR3でのみランダム化された3つのライブラリーを作製するために、ランダム化プライマーSEQ ID NO: 15を、コンスタントプライマーSEQ ID NO: 53に置き換えた（表5）。十分な量の完全長ランダム化aVHフラグメントを組み立てた後、それらをNcoI/NotIで消化し、並行してアクセプターファージミドベクターを同様に処理した。6μgのaVHライブラリーインサートを24μgのファージミドベクターに連結した。精製した連結反応物を60回の形質転換に使用すると、5×10⁹〜10¹⁰の形質転換体が得られた。aVHライブラリーをディスプレイするファージミド粒子をレスキューし、PEG/NaCl精製により精製して、選択のために使用した。

（表４）3つ全てのCDRでランダム化された新しい安定化aVHライブラリーを作製するためのプライマーの組み合わせ

（表５）CDR1とCDR2でランダム化された新しい安定化aVHライブラリーを作製するためのプライマーの組み合わせ

安定化ジスルフィド架橋33/52を有する新しい包括的自律ヒト重鎖可変ドメイン（aVH）ライブラリーの作製
33位と52位でのジスルフィド架橋によって安定化された、aVHテンプレート5（図3B；DNA：SEQ ID NO: 179；タンパク質：SEQ ID NO: 180）をランダム化するために、前述と同じPCR戦略が選択された。3つのCDRでランダム化されたライブラリーの作製では、フラグメント1はプライマーLMB3 (SEQ ID NO: 15)およびaVH_Y33C_Y52C_H1_rev_Primer_TN (SEQ ID NO: 54)を用いて、フラグメント2はaVH_Y33C_Y52C_H2_for_Primer_TN (SEQ ID NO: 55)およびaVH_H3 reverse Primer (SEQ ID NO: 49)を用いて、フラグメント3はaVH_H3_4/5/6_for_Primer_TN (SEQ ID NO: 50〜52)およびfdseqlong (SEQ ID NO: 17)を用いて作製された（表6）。CDR2とCDR3でのみランダム化されたライブラリーの作製では、ランダム化プライマーSEQ ID NO: 54を、コンスタントプライマーSEQ ID NO: 53に置き換えた（表7）。得られたファージライブラリーのサイズは、約5×10⁹の形質転換体であった。

（表６）3つ全てのCDRでランダム化された新しい安定化aVHライブラリーを作製するためのプライマーの組み合わせ

（表７）CDR1とCDR2でランダム化された新しい安定化aVHライブラリーを作製するためのプライマーの組み合わせ

実施例4
包括的ジスルフィド安定化aVHライブラリーからの抗MCSPおよび抗TfR1結合剤の選択
前記ライブラリーの複雑性の質をテストし、かつ得られた結合剤をさらに特徴付けるために、組換えMCSPおよびTfR1に対する概念実証選択（proof of concept selection）を前述のように溶液中で行った。両方の選択のために、6つ全てのファージライブラリーを個別に、上記の抗原に対する結合剤についてスクリーニングした。抗原濃度を（10^-7Mから×10^-8Mへ）下げながら選択を3ラウンドにわたって実施した。ラウンド2では、抗原：ファージ複合体の捕捉を、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて行った。特異的結合剤をELISAにより次のように同定した：ウェルあたり100μlの50nMビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートにコーティングした。個々のaVH含有細菌上清を添加し、結合するaVHを、そのFlagタグを介して、抗Flag/HRP二次抗体の使用により検出した。バックグラウンドに対して顕著なシグナルを示すクローンを、配列決定（例示的なDNA配列を、MCSP特異的aVHではSEQ ID NO: 56、58、60、62、64として、TfR1特異的aVHではSEQ ID NO: 66、67、68、69、70、71、72としてリストに載せた）およびさらなる解析のためにショートリストに載せた。

大腸菌からのaVHの精製
選択したクローンをさらに特性評価するために、ELISA陽性aVH（MCSP特異的aVHではSEQ ID NO: 57、59、61、63、65としてリストに載せた可変ドメインの例示的タンパク質配列）を速度論的パラメータの正確な分析のために精製した。各クローンについて、500mlの培養物に、対応するファージミドを有する細菌を接種し、OD₆₀₀ 0.9で1mM IPTGにより誘導した。その後、該培養物を25℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを25mlのPPBバッファー（30mM Tris-HCl pH8、1mM EDTA、20％スクロース）中で20分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離して、上清を回収した。25mlの5mM MgSO₄溶液を用いてこのインキュベーション段階を1回繰り返した。両方のインキュベーション段階の上清をプールし、ろ過し、IMACカラム（His gravitrap，GE Healthcare社）にロードした。続いて、そのカラムを40mlの洗浄バッファー（500mM NaCl、20mMイミダゾール、20mM NaH₂PO₄ pH7.4）で洗浄した。溶出（500mM NaCl、500mMイミダゾール、20mM NaH₂PO₄ pH7.4）後、溶出液をPD10カラム（GE Healthcare社）を使用して再緩衝化し、その後ゲルろ過段階を行った。精製されたタンパク質の収量は500〜2000μg/lの範囲であった。

SPRによるMCSP特異的ジスルフィド安定化aVHクローンの親和性決定
選択したaVHクローンの親和性（K_D）は、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上に固定したビオチン化MCSP抗原を用いて、25℃でProteOn XPR36機器（Biorad社）を使用して、表面プラズモン共鳴により測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化：抗原をPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、200、400または800レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。アナライトの注入：ワンショット反応速度論的（one-shot kinetics）測定のため、注入方向を水平配向に変えた；精製したaVHの2倍希釈系列（200〜6.25nMの間の様々な濃度範囲）を、結合時間〜180秒、解離時間800秒で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、バッファー（PBST）を6番目のチャネルに沿って注入した。結合速度定数（k_on）と解離速度定数（k_off）は、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングさせることにより、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアで単純なLangmuirの1対1結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（K_D）は、k_off/k_on比として算出した。分析したクローンは、非常に広い範囲（8〜193nM）のK_D値を示した。全てのクローンの速度論的および熱力学的データ、凝集温度、ランダム化されたCDR、ならびに安定化ジスルフィド架橋の位置を表8にまとめてある。

（表８）安定化された抗MCSP aVHドメインの速度論的および熱力学的パラメータ

選択したジスルフィド安定化aVHクローンの、Fcをベースとしたフォーマットへの変換
選択したaVHクローンをさらに特徴付けるために、全ての結合剤をFcベースのフォーマットに変換した。MCSP特異的aVH配列を、「knob」変異を有するヒトIgG1 FcドメインにN末端で融合させた。特に、同定されたaVH DNA配列（SEQ ID NO: 56、58、60、62、64）がSEQ ID NO: 73のテンプレートaVHコード配列に置き換わった。aVH-Fc融合配列を、「hole」変異をもつFc配列（SEQ ID NO: 74）と組み合わせて発現させると、N末端単量体aVHをもつFcドメインが得られた（図2A）。

TfR1特異的結合剤の場合には、Fcをベースとした別のフォーマットが選択された：ヒトIgG1抗体に基づいて、そのVHドメインをコードする配列を、選択したaVHドメインをコードするDNA配列フラグメント（SEQ ID NO: 66、67、68、69、70、71、72）に置き換えた。さらに、κタイプの軽鎖をコードする発現構築物では、VLドメインを欠失させて、定常κドメイン（SEQ ID NO: 75）をシグナル配列に直接融合させた。両方のプラスミドを共発現させると、全ての抗体定常ドメインと各CH1のN末端に融合されたaVHドメインからなる2価の構築物が得られる（図2B）。これらの構築物を全てのさらなる特性評価に使用した。

MCSP特異的ジスルフィド安定化aVHクローンの結合解析
ジスルフィド安定化MCSP特異的クローンのMV3細胞株への結合をFACSにより測定した。陰性対照として、無関係の抗体を使用した。96ウェルの丸底プレートにおいて、20万個/ウェルの細胞を単量体aVH-Fc融合構築物（0.27、0.8、2.5、7.4、22.2、66.6、200、および600nM）と300μlのPBS（0.1％BSA）中4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBS（0.1％BSA）で洗浄することにより未結合分子を除去した。結合した分子は、FITC結合AffiniPureヤギ抗ヒトIgG Fcγフラグメント特異的二次F(ab')2フラグメント（Jackson ImmunoResearch社＃109-096-098；希釈標準溶液：PBS、0.1％BSA中1：20）を用いて検出した。4℃で30分のインキュベーション後、未結合抗体を洗浄により除去し、1％PFAを用いて細胞を固定した。BD FACS CantoII（ソフトウェアBD DIVA）を用いて細胞を解析した。全てのクローンの結合（図4）が観察された。SPRで測定された親和性と結合解析での感度は相関し、クローン2（SEQ ID NO: 57）はSPR分析と細胞結合試験の両方で最高の結合剤であった。

選択したMCSP特異的ジスルフィド安定化aVHクローンの特性評価
選択および精製したaVHをさらに特性評価するために、MCSP特異的クローンの凝集温度を前述のように測定した。興味深いことに、全てのジスルフィド安定化MCSP特異的クローンの凝集温度は59〜64℃であり、追加のジスルフィド架橋の安定化効果を明確に示している（表8）。

TfR1特異的ジスルフィド安定化aVHクローンの蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
TfR1特異的2価aVH-Fc構築物の、TfR1発現細胞上のそれらのエピトープへの結合は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）解析により測定した。この解析では、SNAPタグをコードするDNA配列（Cisbio社から購入したプラスミド）をPCRで増幅し、全長TfR1配列（Origene社）を含む発現ベクターに連結した。得られた融合タンパク質はC末端SNAPタグを有する全長TfR1で構成される。トランスフェクション試薬としてLipofectamine 2000を用いて、Hek293細胞を10μgのDNAでトランスフェクトした。20時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、100nM SNAP-Lumi4Tb（Cibsio社）を含むLabMedバッファー（Cisbio社）中37℃で1時間インキュベートすると、SNAPタグの特異的ラベリングが生じた。続いて、細胞をLabMedバッファーで4回洗浄して未結合の色素を除去した。ラベリング効率は、バッファーと比較して615nmでテルビウムの発光を測定することにより決定した。その後、細胞を-80℃で最大6ヶ月間凍結保存した。ラベルした細胞（ウェルあたり100個）にTfR1特異的aVH Fc融合物を0.5〜60nMの範囲の濃度で添加し、続いてFRETのアクセプター分子として抗ヒトFc-d2（Cisbio社，ウェルあたり200nMの最終濃度とした）を添加することにより結合を測定した。室温で3時間のインキュベーション後、アクセプター色素（665nm）ならびにドナー色素（615nm）の発光を、蛍光リーダー（Victor 3, Perkin Elmer社）を用いて測定した。アクセプターとドナーの発光の比率を計算し、バックグラウンド対照（抗huFc-d2を含む細胞）の比率を差し引いた。曲線をGraphPad Prism5で解析し（図5）、K_Dを算出した（表9）。

（表９）安定化された抗TfR1 aVHドメインの熱力学的パラメータ

実施例5
包括的ジスルフィド安定化aVHライブラリーからの抗LAG3特異的結合剤の選択
LAG3特異的aVHの選択は前述のように行われた。この選択のために、6つ全てのファージライブラリーを上記抗原に対する結合剤について個別にスクリーニングした。抗原濃度を（10^-7Mから×10^-8Mへ）下げながら選択を3ラウンドにわたって実施した。ラウンド2では、抗原：ファージ複合体の捕捉を、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて行った。特異的結合剤をELISAで次のように同定した：ウェルあたり100μlの50nMビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートにコーティングした。aVH含有細菌上清を添加し、結合するaVHを、そのFlagタグを介して、抗Flag/HRP二次抗体の使用により検出した。バックグラウンドに対して顕著なシグナルを示すクローンを、配列決定（DNA配列をSEQ ID NO: 76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96としてリストに載せた；タンパク質配列をSEQ ID NO: 77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97としてリストに載せた）およびさらなる解析のためにショートリストに載せた。

SPRによるLAG3特異的ジスルフィド安定化aVHクローンの親和性決定
選択したaVHクローンの親和性（K_D）は、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上に固定したビオチン化LAG3-Fc抗原を用いて、25℃でProteOn XPR36機器（Biorad社）を使用して、表面プラズモン共鳴により測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化：抗原をPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、200、400または800レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。LAG3結合相互作用の陰性対照として、ビオチン化Fcドメインを同じ条件で固定化した。アナライトの注入：ワンショット反応速度論的測定のため、注入方向を水平配向に変えた。精製した大腸菌由来aVHの2倍希釈系列（200〜6.25nMの間の様々な濃度範囲）を、結合時間300秒、解離時間360秒として、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6番目のチャネルに沿ってバッファー（PBST）を注入した。結合速度定数（k_on）と解離速度定数（k_off）は、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングさせることにより、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアで単純なLangmuirの1対1結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（K_D）は、k_off/k_on比として算出した。分析したクローンは、非常に広い範囲（5〜766nM）のK_D値を示した。全てのクローンの速度論的および熱力学的データ、凝集温度、ランダム化されたCDR、ならびに安定化ジスルフィド架橋の位置を表10にまとめてある。

（表１０）抗LAG3 aVHドメインの熱力学的パラメータ

細菌から精製されたaVHドメインとのA375細胞上でのMHCII競合アッセイ
LAG3がT細胞上に発現されたMHCIIに結合するのを遮断および阻止する細菌精製LAG3特異的aVHドメインの能力を評価するために、細菌から精製されたaVHドメインを用いて細胞ベースの結合阻害アッセイを行った。第1の段階では、20μg/ml〜0.05μg/mlの範囲のaVHドメインの連続希釈液を、PFAEバッファー（2％FCS、0.02％アジ化ナトリウム、および1mM EDTAを含むPBS）中で1μg/mlのビオチン化LAG3-Fcと共にインキュベートした。室温で20分後、この混合物を2×10⁵個のPFAE洗浄A375細胞に加えた。4℃で30分後、細胞をPFAEで1回洗浄した。A375細胞上に発現されたMHCIIへのLAG3-Fcの結合は、Alexa 647標識ヤギ抗ヒトFcの添加により検出した。30分のインキュベーション後、細胞をPFAEバッファーで洗浄し、FACS caliburフローサイトメーターを用いて結合解析を行った。

実施例6
選択したジスルフィド安定化aVHクローンの、Fcをベースとしたフォーマットへの変換
選択したaVHクローンをさらに特徴付けるために、全ての結合剤をFcベースのフォーマットに変換した。aVHコード配列を、ヒトIgG1 Fcドメインまたは「knob」変異を有するヒトIgG1 FcドメインにN末端で融合させた。両方のFcバリアントは、FcγR結合を完全に廃止するPG-LALA変異を含んでいた。P329G、L234AおよびL235A（EUナンバリング）のFcドメイン中の変異に関連するPG-LALA変異は、WO 2012/130831に記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。

得られたaVH-Fc (PG-LALA)融合配列（DNA配列はSEQ ID NO: 98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118を有し、それぞれのタンパク質配列はSEQ ID NO: 99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119を有する）の発現は2価のFc融合構築物をもたらし（図2C）、一方aVH Fc(knob, PG-LALA)融合構築物（DNA配列はSEQ ID NO: 120、122、124、126、128、120、132、134、136、138、140を有し、それぞれのタンパク質配列はSEQ ID NO: 121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141を有する）と、「hole」変異をもつFc配列フラグメント（SEQ ID NO: 74）との共発現は、1価のaVH-Fc融合構築物をもたらした（図2A）。これらの分子の作製および精製は、先に記載したとおりに行った。

1価のaVH-Fc融合構築物の生化学的特性評価
それらの生化学的および生物物理学的特性を特徴付けて比較するために、全ての1価aVH-Fc融合構築物を詳細に分析した：

化学分解試験
サンプルを3つのアリコートに分け、それぞれ20mM His/His-HCl、140mM NaCl pH6.0（His/NaCl）中またはPBS中に再緩衝化して、40℃（His/NaCl）または37℃（PBS）で2週間保存した。対照サンプルは-80℃で保存した。

インキュベーションが終了した後、サンプルを相対活性濃度（SPR）、凝集（SEC）および断片化（CE-SDS）について分析し、未処理の対照と比較した。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）
見かけの疎水性は、20μgのサンプルを、25mMリン酸Na、1.5M硫酸アンモニウムpH7.0で平衡化したHIC-Ether-5PW（Tosoh社）カラムに注入することで測定した。溶出は、0％から100％のバッファーB（25mMリン酸Na pH7.0）の直線勾配で60分以内に行った。保持時間を、疎水性が知られているタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は0〜0.35の相対保持時間を示す。

熱安定性
サンプルを20mM His/His-HCl、140mM NaCl pH6.0中に1mg/mLの濃度で調製し、0.4μmフィルタープレートを通した遠心分離によりオプティカル384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆う。サンプルを25℃から80℃まで0.05℃/分の速度で加熱しながら、流体力学半径をDynaProプレートリーダー（Wyatt社）で動的光散乱により繰り返し測定する。

FcRnアフィニティクロマトグラフィー
FcRnを、記載されるとおりに（Schlothauer et al.）発現させ、精製して、ビオチン化した。カップリングのために、調製した受容体をストレプトアビジン-セファロース（GE Healthcare社）に添加した。得られたFcRn-セファロースマトリックスをカラムハウジングに詰めた。そのカラムを20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸（MES）、140mM NaCl、pH5.5（溶離液A）により0.5ml/分の流速で平衡化した。30μgの抗体サンプルを溶離液Aにより1：1の体積比で希釈し、FcRnカラムにアプライした。該カラムを5カラム体積の溶離液Aで洗浄し、続いて35カラム体積の20％から100％の20mM Tris/HCl、140mM NaCl、pH8.8（溶離液B）の直線勾配で溶出した。カラムオーブンを用いて25℃で分析を行った。280nmでの吸光度を連続測定することで溶出プロファイルをモニタリングした。保持時間を、親和性が知られているタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は0〜1の相対保持時間を示す。

表11は、様々な試験サンプルの生物物理学的および生化学的特性をまとめたものである。全てが予想外に高い熱安定性と見かけの疎水性を示した。しかしながら、クローン17D7および19G3はFcRnへの異常に強い結合を示した。全てのサンプルはストレス時にほんのわずかな断片化を示したが（表12）、クローンP11E2およびP11E9はストレス時に顕著な凝集傾向を示した（表12）。最後に、SPR測定により、P11A2を除く全サンプルは、ストレス後にLag3標的への結合特性の大部分を保持することが示された（相対活性濃度＞80％）（表13）。

（表１１）様々な試験分子の生物物理学的および生化学的特性

¹対応する対称2価分子を用いて行った実験

（表１２）ストレス後の様々な試験分子の完全性（integrity）

（表１３）ストレス後の様々な試験分子の相対活性濃度（％）

¹n.a.：入手不可

実施例7
2価aVH-Fc融合構築物のインビトロ特性評価
下記のインビトロ実験では、次の試薬を使用した。全ての結果の要約は表14に見ることができる。

使用した材料は、次のものであった：PBS (DPBS, PAN, P04-36500)、BSA (Roche, 10735086001)、Tween 20 (ポリソルベート20 (usb, ＃20605, 500ml))、PBSTブロッキングバッファー(PBS (10×, Roche, ＃11666789001)/2％BSA (ウシ血清アルブミン画分V, 脂肪酸フリー, Roche, ＃10735086001)/0.05％Tween 20)、ワンステップELISAバッファー(OSEP) (PBS (10×, Roche, ＃11666789001)、0.5％BSA (ウシ血清アルブミン画分V, 脂肪酸フリー, Roche, ＃10735086001)、0.05％Tween 20)。

（表１４）2価aVH-Fc融合構築物のインビトロ特性評価

* 低いフィット
X＝プラトーに達しない

ヒトLag3に対するELISA
Nunc maxisorpプレート（Nunc 464718）に、PBSバッファーでタンパク質濃度800ng/mlに希釈した組換えヒトLAG3 Fcキメラタンパク質（R&D Systems社, 2319-L3）を25μl/ウェルでコーティングして、4℃で一晩または室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、各ウェルを90μlのブロッキングバッファー（PBS＋2％BSA＋0.05％Tween 20）と室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、1000または3000〜0.05ng/mlの濃度の25μlの抗Lag3 aVHサンプル（OSEPバッファーで1：3希釈）を加えて、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトIgG F(ab')2-HRPコンジュゲート（Jackson社, JIR109-036-006）を1：800希釈で加えて、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、25μl/ウェルのTMB基質（Roche社, 11835033001）を加えて、2〜10分間インキュベートした。測定は、Tecan Safire 2機器を用いて370/492nmで行った。対照抗体MDX25F7（US2011/0150892およびWO2014/008218に開示）と比較して、大部分のaVHクローンはより高いEC50値を示した。さらに、マウスLAG3-Fc抗原（R&D Systems社, 3328-L3-050）を用いたそれぞれのELISA実験から、どの結合剤もマウスLAG3と交差反応しないことが明らかになった（データは示してない）。

オフレート（off-rate）の測定
ヒトLag3への結合からの抗Lag3 aVH Fc融合構築物のオフレートは、BIACORE B4000またはT200機器（GE Healthcare社）を用いて表面プラズモン共鳴により測定した。全ての実験は、ランニングバッファーとしてPBSTバッファー（pH7.4＋0.05％Tween20）を用いて25℃で行った。抗ヒトFc（JIR109-005-098, Jackson社）をシリーズS C1センサーチップ（GE Healthcare社）上に固定して約240〜315 RUとした。1または5μg/mlの抗Lag3 aVH抗体を10μl/分で60秒間捕捉した。次の段階では、ヒトIgG（Jackson社, JIR-009-000-003）を2×120秒の注入、10μl/分、250μg/mlの濃度で注入することにより、遊離の抗ヒトFc結合部位をブロックした。0、5および25nMのヒトLAG-3 Fcキメラタンパク質（R&D Systems社, 2319-L3）を30μl/分の流速で180秒間アプライした。解離領域（dissociation phase）を、ランニングバッファーで洗浄することにより900秒間モニタリングした。H3PO4（0.85％）を30μl/分の流速で70秒間注入することにより表面を再生させた。

バルク屈折率差は、モック（mock）表面から得られた応答を差し引くことで修正した。ブランク注入を差し引いた（二重参照）。導出された曲線は、BIAevaluationソフトウェアを用いてLangmuirの1：1結合モデルにフィットした。測定されたオフレートを以前に測定された1価aVHドメインのオフレートと比較すると、2価aVH-Fc構築物の結合は非常に強くアビディティ（avidity）媒介されると結論付けることができる。

実施例8
細胞上のaVH-Fc融合構築物の特性評価
以下のセクションでは、選択したaVH-Fc融合構築物をいくつかの細胞ベースのアッセイで特徴付けた。下記のインビトロ実験で、次の試薬を使用した。全ての結果の要約は表15に見ることができる。

（表１５）2価aVH-Fc融合構築物の細胞ベースの特性評価

X＝プラトーに達しない

細胞表面Lag3結合ELISA
25μl/ウェルのLag3細胞（Lag3を発現する組換えCHO細胞、10,000個/ウェル）を組織培養処理済みの384ウェルプレート（Corning社, 3701）に播種し、37℃で1〜2日間インキュベートした。翌日、培地の除去後、25μlの2価抗Lag3 aVH-Fc構築物（OSEPバッファーで1：3希釈、6μg/mlの濃度で開始）を添加し、4℃で2時間インキュベートした。洗浄（PBSTで1×90μl）後、30μl/ウェルのグルタルアルデヒド（Sigmaカタログ番号：G5882）を0.05％の最終濃度まで加えて、細胞を室温で10分間固定した。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトIgG H+L-HRPコンジュゲート（Jackson社, JIR109-036-088）を1：2000希釈で添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、25μl/ウェルのTMB基質（Roche社, 11835033001）を加えて、6〜10分間インキュベートした。Tecan Safire 2機器を用いて370/492nmで測定を行った。要約すれば、試験した全ての分子は、LAG3を組換え発現するCHO細胞に結合した。それらのEC50値は主にサブナノモル範囲にあって、非常に強いアビディティ媒介結合を示し、かつELISAで測定して強い結合が確認された（表14）。

A375 MHCII競合ELISA
25μl/ウェルのA375細胞（10,000個/ウェル）を組織培養処理済みの384ウェルプレート（Corning社, 3701）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。2価抗Lag3 aVH-Fc構築物を、ビオチン化Lag3（250ng/ml）と、細胞培養液中1：3希釈、3μg/mlの抗体濃度で開始して、1時間プレインキュベートした。細胞を播種したウェルから培地を除去した後、25μlのプレインキュベートしたaVH-Lag3混合物を該ウェルに移し、4℃で2時間インキュベートした。洗浄（PBSTで1×90μl）後、30μl/ウェルのグルタルアルデヒド（Sigmaカタログ番号：G5882）を0.05％の最終濃度まで加えて、細胞を室温で10分間固定した。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、25μl/ウェルのPoly-HRP40-Streptavidin（Fitzgerald社, 65R-S104PHRPx）を1：2000または1：8000希釈で加えて、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBSTバッファーで3×90μl/ウェル）後、25μl/ウェルのTMB基質（Roche社, 11835033001）を加えて、2〜10分間インキュベートした。Tecan Safire 2機器を用いて370/492nmで測定を行った。対照抗体MDX25F7と比較して、いくつかのaVHクローンは、3μg/mlの濃度で同様のまたはより優れた阻害を示し、かつ同等のIC50値を示した。

aVH-Fc構築物の組換えカニクイザル（cyno）Lag3陽性HEK細胞への結合
ヒトLAG3を組換え発現するCHO細胞を用いた結合解析に加えて、カニクイザル（cynomolgus）Lag3陽性HEK細胞への結合をも評価した。この実験では、以前にカニクイザルLAG3で一過性にトランスフェクトされた凍結HEK293F細胞を解凍し、遠心分離して、PBS/2％FBS中に再懸濁した。1.5×10⁵個/ウェルの細胞を96ウェルプレートに播種した。一連の2価抗Lag3 aVH-Fc融合構築物を加えて、最終正規化濃度を10μg/mlにした。参照のため、また、対照として、自己蛍光および陽性対照（MDX 25F7およびMDX 26H10）、ならびにアイソタイプ対照（Sigma社からのhuIgG1、カタログ番号＃I5154）抗体を準備し、この実験で測定した。HEK細胞を示されたaVH-Fc構築物または抗体と共に氷上で45分間インキュベートし、200μlの氷冷PBS/2％FBSバッファーで2回洗浄した後、二次抗体（APC標識ヤギ抗ヒトIgG-κ, Invitrogen社, カタログ番号＃MH10515）を加えて（ウェルあたりFACSバッファーで1：50に希釈）、さらに氷上で30分間インキュベートした。細胞を再度200μlの氷冷PBS/2％FBSバッファーで2回洗浄してから、最後にサンプルを150μlのFACSバッファーに再懸濁し、FACS CANTO-II HTSモジュールで結合を測定した。

実施例9
さらなる包括的自律ヒト重鎖可変ドメイン（aVH）ライブラリーの作製
所望の遺伝子セグメントは、必要な場合、適切なテンプレートを用いてPCRにより作製するか、またはGeneart AG（Regensburg, ドイツ）で合成オリゴヌクレオチドとPCR産物から自動遺伝子合成により合成した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位が両端に隣接する遺伝子セグメントは、標準的なクローニング/シーケンシングベクターにクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、UV分光法で濃度を測定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシーケンシングにより確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするために適切な制限部位を含むようにデザインした。真核細胞における分泌に使用される全ての構築物は、リーダーペプチドをコードする5'末端DNA配列を含むようにデザインした。SEQ ID NO: 248および249が代表的なリーダーペプチドを示す。

特異的aVHドメインの選択のために、3つの異なる抗原が作製された。

抗原1：CEACAM5ベースの抗原（その最初の2つのドメインNおよびA1を含む）を作製するために、2つのCEACAM5および2つのCEACAM1 Igドメインからなるキメラタンパク質を作製した。CEACAM1の配列に基づいて、CEACAM1の第1および第2のドメインをCEACAM5ドメインNおよびA1に置き換えた。C末端のaviタグとhisタグを、部位特異的ビオチン化と精製のために融合させた。得られたタンパク質をhu(NA1)BA-avi-Hisと命名した（SEQ ID NO: 250）。さらに、CEACAM1の4つのIgドメインと、C末端のaviタグおよびhisタグからなる分子を作製した。この分子は、ファージディスプレイパンニング中の陰性選択のツールとして、また、スクリーニング中の対照分子として使用した（SEQ ID NO: 255）。用語「CEA」は、本明細書では用語「CEACAM5」の同義語として使用される。

抗原2：ヒトCD28（Uniprot: P10747）の細胞外ドメイン（成熟タンパク質のアミノ酸1-134）をコードするDNAフラグメントを、2つの異なる哺乳動物レシピエントベクターに溶解性および精製タグとして機能するヒトIgG1 Fcフラグメントをコードするフラグメントの上流でインフレームで挿入した。これらの発現ベクターの一方はFc領域に「hole」変異を含み、もう一方は「knob」変異、ならびにBir Aビオチンリガーゼとの共発現中に特異的ビオチン化を可能にするC末端aviタグ

を含んでいた。さらに、両方のFcフラグメントにはPG-LALA変異が含まれていた。両方のベクターを、BirAビオチンリガーゼをコードするプラスミドと組み合わせて同時トランスフェクトして、C末端の1価ビオチン化aviタグおよびFc-knob鎖を有する二量体CD28-Fc構築物を得た（SEQ ID NO: 251および252）。

抗原3：可溶性の組換えプロリルエンドペプチダーゼFAPを作製するために、アミノ酸27-760（ヒトFAP, Uniprot: Q12884, SEQ ID NO: 253）または27-761（マウスFAP, Uniprot: P97321, SEQ ID NO: 254）をコードするそれぞれのDNA断片を、N末端リーダー配列を含む哺乳動物レシピエントベクターにインフレームでクローニングした。さらに、これらの構築物には、Bir Aビオチンリガーゼとの共発現中に特異的ビオチン化を可能にするC末端aviタグと、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーによる精製に使用されるhisタグが含まれる。

選択したクローンのさらなる特性評価では、速度論的パラメータの正確な解析のために、ELISA陽性aVHが精製された。各クローンについて、500mlの培養物に、対応するファージミドを有する細菌を接種し、OD600 0.9で1mM IPTGにより誘導した。その後、培養物を25℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを25mlのPPBバッファー（30mM Tris-HCl pH8、1mM EDTA、20％スクロース）中で20分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーション段階を、25mlの5mM MgSO₄溶液を用いて1回繰り返した。両インキュベーション段階の上清をプールし、ろ過し、IMACカラム（His gravitrap, GE Healthcare社）にロードした。続いて、このカラムを40mlの洗浄緩衝液（500mM NaCl、20mMイミダゾール、20mM NaH₂PO₄ pH7.4）で洗浄した。溶出（500mM NaCl、500mMイミダゾール、20mM NaH₂PO₄ pH7.4）後、PD10カラム（GE Healthcare社）を用いて溶出液を再緩衝化し、その後ゲルろ過段階を行った。精製されたタンパク質の収量は500〜2000μg/lの範囲であった。

選択したaVHクローンをさらに特徴付けるために、結合剤がFcベースのフォーマットに変換された。aVH配列のDNAを、「knob」変異を有するヒトIgG1 Fcフラグメントをコードする配列にN末端で融合させた。グリシン-セリンリンカー

により、aVHのC末端をFcフラグメントのN末端から分離した。aVH-Fc融合構築物を、「hole」変異を有するFc配列（SEQ ID NO: 259）をコードするプラスミドと組み合わせて共発現させた。両方のFc鎖（knobおよびhole）には、FcγR結合を完全に廃止するPG-LALA変異が含まれていた。得られた構築物は、N末端単量体aVHをもつFcフラグメントであった（図2A）。

CD28-Fc-aviおよびaVH-Fc構築物の発現のために、それぞれの発現構築物を、EBV由来タンパク質EBNAを安定して発現するHEK 293細胞に一過性にトランスフェクトした。必要ならば、ビオチンリガーゼBirAをコードするプラスミドを同時にトランスフェクトして、インビボでのaviタグ特異的ビオチン化を可能にした。標準プロトコルに従って、ろ過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、Fc含有タンパク質をプロテインAセファロースカラム（GE healthcare社）にアプライして、PBSで洗浄した。溶出をpH2.8で行い、その後すぐにサンプルを中和した。凝集したタンパク質は、PBS中での、または20mMヒスチジン、150mM NaCl pH6.0中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200, GE Healthcare社）によって単量体画分から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、（必要に応じて）例えばMILLIPORE Amicon Ultra（30 MWCO）遠心濃縮機を用いて濃縮し、-20℃または-80℃で凍結保存した。その後のタンパク質分析および解析評価（例えば、SDS-PAGEによる）、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または質量分析のために、サンプルの一部を提供した。

hisタグを発現する構築物を、EBV由来タンパク質EBNAを安定して発現するHEK 293細胞（HEK EBNA）に一過性にトランスフェクトした。ビオチンリガーゼBirAをコードするプラスミドを同時にトランスフェクトして、インビボでのaviタグ特異的ビオチン化を可能にした。固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）とその後のゲルろ過を使用した標準プロトコルに従って、ろ過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。単量体タンパク質画分をプールし、（必要に応じて）濃縮し、-20℃または-80℃で凍結保存した。その後のタンパク質分析および解析評価（例えば、SDS-PAGEによる）、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または質量分析のために、サンプルの一部を提供した。

1価aVH-Fc融合構築物の生化学的特性評価

疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）
見かけの疎水性は、20μgのサンプルを、25mMリン酸Na、1.5M硫酸アンモニウムpH7.0で平衡化したHIC-Ether-5PW（Tosoh社）カラムに注入することで測定した。溶出は、0％から100％のバッファーB（25mMリン酸Na、pH7.0）の直線勾配で60分以内に行った。保持時間を、疎水性が知られているタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は0〜0.35の相対保持時間を示す。

熱安定性
サンプルを20mMヒスチジン/ヒスチジン塩化物、140mM NaCl、pH6.0中に1mg/mLの濃度で調製し、0.4μmフィルタープレートを通した遠心分離によりオプティカル384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。サンプルを25℃から80℃まで0.05℃/分の速度で加熱しながら、流体力学半径をDynaProプレートリーダー（Wyatt社）で動的光散乱により繰り返し測定した。

ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー
ヘパリン親和性は、50mM Tris、pH7.4で平衡化したTSKgel Heparin-5PW（Tosoh社）カラムに30〜50μgのサンプルを注入することで測定した。溶出は、0％から100％のバッファーB（50mM Tris、1M NaCl、pH7.4 mM）の直線勾配で37分以内に行った。保持時間を、親和性が知られているタンパク質標準と比較した。

実施例10
aVH安定化変異の同定および安定化されたaVHライブラリーの作製
以前のVH-VL界面に特定の変異を導入したにもかかわらず、これまでに報告されたaVH分子の一部は依然として熱安定性が低く、疎水性が高かった。aVHフレームワークをさらに安定化させ、該ドメインの親水性を高めるために、ラクダ類のVHHドメインに保存されている露出した疎水性アミノ酸または残基を同定して、親水性残基またはラクダ類のコンセンサス残基に置き換えた。こうした変異が生化学的特性を改善するかどうかを明らかにするために、これらの変異の導入では、好ましくない生化学的特性を有するaVHドメイン（クローン6H1）が選択された。6H1は52a位と71位（Kabatのナンバリング）にシステインを含む。特に、これらのシステインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成することができ、かつ/またはジスルフィド結合を形成する。変異は個別に、または組み合わせて導入された（図6）。表16は、変異の位置と論理的根拠をまとめたものである。先行する位置101のKabatのナンバリングはCDR3領域の長さによって変化することを考慮して、この位置は、簡略化のために、位置「101-1」として定義されることに留意されたい。

（表１６）aVHフレームワークの改善のために変異させた、ラクダ類のVHHドメインに保存されている露出した位置または残基の同定

それらの生化学的および生物物理学的特性を特徴付けて比較するために、全てのバリアントを1価aVH-Fc融合構築物（SEQ ID No: 376〜390）に変換し、Fc-hole鎖（SEQ ID NO: 259）と共発現させて、詳細に分析した。得られた構築物は、N末端単量体aVHをもつFcフラグメントであった（図6）。

それらの生化学的および生物物理学的特性を特徴付けて比較するために、上記の安定化変異を含む全ての1価aVH-Fc融合バリアントを、本明細書に記載のプロトコルに従って、詳細に分析した。結果を表17にまとめてある。

（表１７）フレームワーク安定化変異を含むaVHバリアントの生化学的分析

要約すると、全てのクローンは必要とされる凝集温度58℃を超えている。親配列バリアントとは対照的に、いくつかの変異は単量体のオリゴマー状態をもたらした：親クローン6H1はホモ二量体を形成する固有の傾向がありかつ疎水性表面の増加を示すことがわかったが、いくつかの単一の変異は両方の基準を改善することが見出された。特に、変異G44E、T45E、T45R、F(101-1)YおよびA101Dは、親クローン6H1の生化学的特性を改善した。

以前に特徴付けられたaVH結合剤への変異の組み合わせの導入
クローン6H1の生化学的特性を改善することが示された同定済みの変異が他のaVHにとっても有益であるかどうかを調べるために、異なる生化学的特性を有する3つのaVH（クローン9B4 (SEQ ID NO: 391)、クローン17B5 (SEQ ID NO: 396)、クローン20G3 (SEQ ID NO: 401)）を選択して、変異の4つの組み合わせを各親配列に挿入した（表18）。9B4、17B5および20G3はそれぞれ、33位と52位（Kabatのナンバリング）にシステインを含み、これらは適切な条件下でジスルフィド結合を形成することができ、かつ/またはジスルフィド結合を形成する。

（表１８）3つの親aVHクローンとそれらのaVHフレームワーク安定化変異の生化学的分析

その後、得られたクローンバリアントを、単量体のaVH-Fc融合構築物として作製して精製し、それらの生化学的特性を分析した（クローン9B4のバリアント1〜4 (SEQ ID No: 392〜395)、クローン17B5のバリアント1〜4 (SEQ ID No: 397〜4000)、クローン20G3のバリアント1〜4 (SEQ ID No: 402〜405)）。いくつかのバリアントでは、本明細書で同定された変異に加えて、変異L47Tおよび94Kを挿入した。L47Tは、例えば上記の各バリアント3におけるように、安定化を目的としてのみ導入された。94Kは、例えば上記の各バリアント1におけるように、94位の生殖細胞系列残基に戻すために導入された。

表18に要約されるバリアントを互いに比較すると、G44E、T45EおよびF(101-1)Yを含むバリアント2は、3つ全てのクローン9B4、17B5および20G3において最も好ましい生化学的特性を示した。そのため、新しいaVHライブラリーの作製に使用される3つの新しいテンプレートにこれらの変異を導入した（SEQ ID NO: 256、257、258）。

実施例11
安定化された包括的自律ヒト重鎖可変ドメイン（aVH）ライブラリーを作製するための新しいライブラリーテンプレート
より安定性の高いaVHライブラリーを作製するために、新しいaVHライブラリーテンプレートをデザインした。以前のテンプレートをさらに安定化するために、全てのテンプレート配列に次の改変を行った：変異G44E、T45EおよびF(101-1)Yの導入。得られたタンパク質配列（SEQ ID NO: 256、257、258）とランダム化の位置を図7AおよびBに示す。

52a/71の位置にジスルフィド結合を形成する安定化システインを有する、新しい包括的自律ヒト重鎖可変ドメイン（aVH）ライブラリーの作製。

新しいaVHライブラリーの作製のために、3つの新しいテンプレートをデザインした（SEQ ID NO: 256、257、258）。その新しいテンプレートを「ファージミドテンプレート_G44E_T45E_F(100-1)Y_Y33C_Y52C」、「ファージミドテンプレート_G44E_T45E_F(100-1)Y_P52aC_A71C_S31ab」、および「ファージミドテンプレート_G44E_T45E_F(100-1)Y_P52aC_A71C_G26S」と命名した。全ての新しいライブラリーは、CDR2およびCDR3でランダム化された。3つ全てのライブラリーについて、3つのフラグメントを「重複伸長によるスプライシング」（SOE）PCRによって組み立てた。フラグメント1は、フレームワーク1、CDR1、およびフレームワーク2の一部が含まれるaVH遺伝子の5'末端を含む。フラグメント2は、フレームワーク2でフラグメント1と重複し、CDR2およびフレームワーク3領域をコードする。フラグメント3はフラグメント2とアニーリングし、CDR3領域とaVHのC末端を保持する。

最初のフラグメントの作製では、次のプライマーの組み合わせを使用した：LMB3 (SEQ ID NO: 374)およびH2_Reverse constant primer (SEQ ID NO: 368)。2番目のフラグメントの作製では、次のプライマーの組み合わせを使用した：テンプレート「ファージミドテンプレート_G44E_T45E_F(100-1)Y_Y33C_Y52C」に基づいたライブラリーでは、aVH_H2_forward Primer (Y33C/Y52C) (SEQ ID NO:366)およびaVH_H3 reverse Primer (constant) (SEQ ID NO: 372)を使用した。テンプレート「ファージミドテンプレート_G44E_T45E_F(100-1)Y_P52aC_A71C_S31ab」および「ファージミドテンプレート_G44E_T45E_F(100-1)Y_P52aC_A71C_G26S」に基づいたライブラリーの2番目のフラグメントの作製では、「aVH_H2_forward Primer (P52aC/A71C)」(SEQ ID NO:367)および「aVH_H3 reverse Primer (constant)」(SEQ ID NO: 372)と命名したプライマーを使用した。3番目のフラグメントの作製では、「aVH_H3_5_for_Primer_TN」、「aVH_H3_6_for_Primer_TN」、および「aVH_H3_7_for_Primer_TN」(SEQ ID NO: 369〜371)と命名したプライマーを、プライマー「fdseqlong」(SEQ ID NO: 373)と組み合わせて個別に使用した。プライマーの組み合わせの概要を表19および20に示す。

（表１９）CDR2およびCDR3でランダム化された新しい安定化aVHライブラリーを作製するためのプライマーの組み合わせ（ファージミドテンプレートG44E_T45E_F(100-1)Y_P52aC_A71C_G26S, SEQ ID NO:256およびG44E_T45E_F(100-1)Y_P52aC_A71C_S31ab, SEQ ID NO:257）

（表２０）CDR2およびCDR3でランダム化された新しい安定化aVHライブラリーを作製するためのプライマーの組み合わせ（ファージミドテンプレート_G44E_T45E_F(100-1)Y_Y33C_Y52C, SEQ ID NO:258）

十分な量の全長ランダム化aVHフラグメントを組み立てた後、それらをNcoI/NotIで消化し、並行してアクセプターファージミドベクターを同様に処理した。6μgのaVHライブラリーインサートを24μgのファージミドベクターに連結した。精製した連結反応物を20回の形質転換に使用すると、2〜5×10⁹から10¹⁰の形質転換体が得られた。aVHライブラリーをディスプレイするファージミド粒子をレスキューし、PEG/NaCl精製により精製して、選択のために使用した。

実施例11
包括的aVHライブラリーからの抗FAPの選択
新しいライブラリーの質をテストし、かつ得られた結合剤をさらに特徴付けるために、組換えヒトおよび/またはマウスFAPに対する概念実証選択を前述のように溶液中で行った。抗原濃度を（10^-7Mから×10^-8Mへ）下げながら、かつ洗浄段階を増やしながら、選択を4ラウンドにわたって実施した。3つ全てのライブラリーの選択は、ヒトまたはマウスFAPに対して、または両方の抗原に対して交互に行った。その場合、1回目と3回目のパンニングラウンドはヒトFAPに対して、2回目と3回目のラウンドはマウスFAPに対して行った。

全てのラウンドとストリームラインで、ファージ粒子を1mlの100mMトリエチルアミン（TEA）の添加により10分間溶出し、その後500μlの1M Tris/HCl pH7.4で中和した。溶出したファージを、指数関数的に増殖する大腸菌TG1の再感染に使用した。続いて、細菌にヘルパーファージVCSM13を感染させて、一晩培養した。翌日、ファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿により回収し、後続の選択ラウンドで使用した。

特異的結合剤は、プレートサイトメーターMirrorball（TTP Labtech社）で測定されるミックス・アンド・リード（mix-and-read）アッセイを適用して、次のように同定した：各384ウェルプレートのために、10μlのSol-R2およびSol-R4ストレプトアビジンビーズ（TTP labtechキット）をPBSで個別に2回洗浄し、1ml PBS中に再懸濁した。ビオチン化FAP-avi-HisをSol-R2含有溶液に加えて最終濃度を80nMとした。無関係のビオチン化タンパク質を同じ濃度でSol-R4ビーズに加えた。室温で1時間後、未結合タンパク質を除去するために、ビーズを再度PBSで洗浄した。両タイプのビーズを8mlのPBSに再懸濁して、プールした。次の段階では、二次FITC標識抗FLAGタグ抗体を800ng/mlの最終濃度へと添加し、35μl/ウェルのこの最終混合物を384ウェルプレートに分注した。個々のaVH含有細菌上清（5μl）を各ウェルに加えた後、プレートを暗所で4℃にて一晩インキュベートした。翌日、各ウェルの蛍光シグナルを両タイプのビーズについて測定した。バックグラウンドに対して顕著なシグナルを示すクローンを、配列決定とさらなる解析のためにショートリストに載せた（SEQ ID No: 260〜279）。

Mirrorball機器を用いて実施した「ミックス・アンド・リードアッセイ」で同定されたクローンを表面プラズモン共鳴（SPR）によってさらに分析した。選択したaVHクローンのオフレートは、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上に固定化したビオチン化ヒトおよびマウスFAP抗原を用いて、ProteOn XPR36機器（Biorad社）により25℃で測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化：抗原をPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、400、800または1600レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。アナライトの注入：注入方向を水平配向に変えた；PBSTで1：3に希釈した5つの個別のaVH含有上清を、結合時間120〜180秒、解離時間600秒で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、希釈したaVH不含細菌上清を6番目のチャネルに沿って注入した。解離速度定数（k_off）は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの「k_off-rate」計算を用いて算出した。表21に、最良のクローンの測定されたk_off値をまとめてある。

（表２１）SPRにより細菌上清で測定されたFAP特異的aVHのオフレート

選択した4つの精製aVHクローンの親和性（KD）は、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップ上に固定化したビオチン化FAP抗原を用いて、ProteOn XPR36機器（Biorad社）を使用した表面プラズモン共鳴により、25℃で測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化：抗原をPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、200、400または800レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。アナライトの注入：ワンショット反応速度論的測定のため、注入方向を水平配向に変えた；精製したaVHの2倍希釈系列（200〜6.25nMの間の様々な濃度範囲）を、結合時間120〜180秒、解離時間1200秒で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、バッファー（PBST）を6番目のチャネルに沿って注入した。結合速度定数（k_on）と解離速度定数（k_off）は、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングさせることにより、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアで単純なLangmuirの1対1結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（KD）は、k_off/k_on比として算出した。分析したクローンは、1桁または下位桁のナノモル範囲のKD値を示した（表22）。

（表２２）SPRによる選択した精製済みFAP特異的aVHの速度論的および熱力学的パラメータの測定

選択した一連の精製aVH結合剤の、FAP発現細胞上のそれらのエピトープへの結合は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）解析により測定した。この解析では、SNAPタグをコードするDNA配列（Cisbio社から購入したプラスミド）をPCRで増幅し、全長ヒトFAP配列を含む発現ベクターに連結した。得られた融合タンパク質はC末端SNAPタグを有する全長FAPで構成されていた。トランスフェクション試薬としてLipofectamine 2000を用いて、HEK293細胞を10μgのDNAでトランスフェクトした。20時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、100nM SNAP-Lumi4Tb（Cibsio社）を含むLabMedバッファー（Cisbio社）中37℃で1時間インキュベートすると、SNAPタグの特異的ラベリングが生じた。続いて、細胞をLabMedバッファーで4回洗浄して未結合の色素を除去した。ラベリング効率は、バッファーと比較して615nmでテルビウムの発光を測定することにより決定した。その後、細胞を-80℃で最大6ヶ月間凍結保存した。結合を測定するために、ラベルした細胞（ウェルあたり100個）にFAP特異的aVH結合剤を0.005〜100nMの範囲の濃度で添加し、続いてFRETのアクセプター分子としてd2標識抗hisタグ抗体（Cisbio社，ウェルあたり200nMの最終濃度とした）を添加した。室温で3時間のインキュベーション後、アクセプター色素（665nm）ならびにドナー色素（615nm）の発光を、蛍光リーダー（Victor 3, Perkin Elmer社）を用いて測定した。アクセプター発光対ドナー発光の比率を計算し、バックグラウンド対照（抗hisタグ抗体とのみインキュベートした細胞）の比率を差し引いた。曲線をGraphPad Prism5で解析し（図8）、KDを算出した（表23）。

（表２３）細胞上のTagLiteによる選択したヒトFAP特異的aVH結合剤の結合解析

それらの生化学的および生物物理学的特性を特徴付けて比較するために、全ての結合剤を1価aVH-Fc融合構築物（SEQ ID No: 280〜299）に変換し、Fc-hole鎖（SEQ ID NO: 259）と共発現させ、精製して、詳細に分析した。得られた構築物は、N末端単量体aVHをもつFcドメインであった（図2A）。

それらの生化学的および生物物理学的特性を特徴付けて比較するために、全ての1価aVH-Fc融合構築物を詳細に分析した。結果を表24にまとめてある。

（表２４）試験した様々な分子の生物物理学的および生化学的特性

要約すると、全てのクローンは必要とされる凝集温度58℃に一致するか、またはそれを超えており、大多数のクローンは疎水性およびヘパリンとの相互作用に関して許容できる特性を示した。

実施例12
包括的aVHライブラリーからの抗CEA特異的aVH結合剤の選択および特性評価
ビオチン化抗原「hu(NA1)BA-avi-His」を使用したCEAのN-およびA1-ドメインに対する選択は、前述のように溶液中で行った。全ての選択およびライブラリーについて、キメラ抗原hu(NA1)BA-avi-HisのCEACAM1由来ドメインに対する結合剤を回避するために、最初に、200nMビオチン化ヒトCEACAM1（ニュートラアビジンプレートにコーティングした）による事前クリアリング（pre-clearing）段階を実施した。その後、ライブラリーを、CEACAM5抗原に対する特異的結合剤について個別に選択した。抗原濃度を（10^-7Mから2×10^-8Mへ）下げながら、かつ洗浄段階を増やしながら、選択を4ラウンドにわたって実施した。あるいは、パンニングラウンド3および4を、全長ヒトCEAで安定にトランスフェクトされたCHO-K1細胞で実施した。その場合、非特異的aVH結合剤を枯渇させるために、ライブラリーを1000万個のCEA陰性CHO細胞と、穏やかに回転するチューブローテーター（tube rotator）を使用して、4℃で60分間インキュベートした。この段階の後、CHO細胞をペレット化した。ファージライブラリーを含む上清を回収し、500万個のCEA発現CHO細胞と4℃でインキュベートした。60分後、細胞をPBSで5回洗浄してから、ファージ粒子を溶出させた。全てのラウンドおよびストリームラインで、ファージ粒子を2つの代替手法により溶出した：1）1mlの100mMトリエチルアミン（TEA）の10分間の添加と、その後の500μlの1M Tris/HCl pH7.4による中和；または2）抗原：ファージ複合体と30分間インキュベートされるCEA特異的抗体（200nM）を用いた競合による溶出。溶出したファージを、指数関数的に増殖する大腸菌TG1の再感染に使用した。次に、細菌にヘルパーファージVCSM13を感染させて、一晩培養した。翌日、ファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿により回収し、後続の選択ラウンドで使用した。

特異的結合剤は、プレートサイトメーターMirrorball（TTP Labtech社）で測定されるミックス・アンド・リードアッセイを適用して、次のように同定した：各384ウェルプレートのために、10μlのSol-R2およびSol-R4ストレプトアビジンビーズ（TTP labtechキット）をPBSで個別に2回洗浄し、1mlのPBS中に再懸濁した。ビオチン化hu(NA1)BA-avi-HisをSol-R2含有溶液に加えて最終濃度を80nMとした。ビオチン化CEACAM1-avi-hisを同じ濃度でSol-R4ビーズに加えて、陰性対照として使用した。室温で1時間後、未結合タンパク質を除去するために、ビーズを再度PBSで洗浄した。両タイプのビーズを8mlのPBSに再懸濁して、プールした。次の段階では、二次FITC標識抗FLAGタグ抗体を800ng/mlの最終濃度へと添加し、35μl/ウェルのこの最終混合物を384ウェルプレートに分注した。個々のaVH含有細菌上清（5μl）を各ウェルに加えた後、プレートを暗所で4℃にて一晩インキュベートした。翌日、各ウェルの蛍光シグナルを両タイプのビーズについて測定した。バックグラウンドに対して顕著なシグナルを示すクローンを、配列決定とさらなる解析のためにショートリストに載せた（SEQ ID No: 300〜313）。

Mirrorball機器を用いて実施した「ミックス・アンド・リードアッセイ」で同定されたクローンを表面プラズモン共鳴（SPR）によってさらに分析した。選択したaVHクローンのオフレートは、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上に固定化したビオチン化hu(NA1)BA-avi-Hisを用いて、ProteOn XPR36機器（Biorad社）により25℃で測定した。CEACAM1-avi-hisを陰性対照として使用した。組換え抗原（リガンド）の固定化：抗原をPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、400、800または1600レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。アナライトの注入：注入方向を水平配向に変えた；PBSTで1：3に希釈した5つの個別のaVH含有上清を、結合時間120〜180秒、解離時間800秒で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/分で同時に注入しした。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、希釈したaVH不含細菌上清を6番目のチャネルに沿って注入した。解離速度定数（k_off）は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの「k_off-rate」計算を用いて算出した（表25）。

（表２５）SPRによる細菌上清からのCEA特異的aVHクローンのk_offレートの測定

選択した精製aVHクローンの親和性（KD）は、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップ上に固定化したビオチン化hu(NA1)BA-avi-His抗原を用いて、ProteOn XPR36機器（Biorad社）を使用した表面プラズモン共鳴により、25℃で測定した。再度、CEACAM1-avi-hisを陰性対照として使用した。組換え抗原（リガンド）の固定化：抗原をPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、200、400または800レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。アナライトの注入：ワンショット反応速度論的測定のため、精製したaVHの2倍希釈系列（200〜6.25nMの間の様々な濃度範囲）を、結合時間120〜180秒、解離時間800秒で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、バッファー（PBST）を6番目のチャネルに沿って注入した。結合速度定数（k_on）と解離速度定数（k_off）は、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングさせることにより、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアで単純なLangmuirの1対1結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（KD）は、k_off/k_on比として算出した。分析したクローンは、非常に広い範囲（7〜144nM）のKD値を示した（表26）。

（表２６）SPRとTagLiteによる精製CEA特異的aVHクローンの親和性の測定

選択した一連の精製aVH結合剤の、CEA発現細胞上のそれらのエピトープへの結合は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）解析により測定した。この解析では、SNAPタグをコードするDNA配列（Cisbio社から購入したプラスミド）をPCRで増幅し、全長ヒトCEA配列を含む発現ベクターに連結した。得られた融合タンパク質はN末端SNAPタグを有する全長CEAで構成されていた。トランスフェクション試薬としてLipofectamine 2000を用いて、HEK293細胞を10μgのDNAでトランスフェクトした。20時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、100nM SNAP-Lumi4Tb（Cibsio社）を含むLabMedバッファー（Cisbio社）中37℃で1時間インキュベートすると、SNAPタグの特異的ラベリングが生じた。続いて、細胞をLabMedバッファーで4回洗浄して未結合の色素を除去した。ラベリング効率は、バッファーと比較して615nmでテルビウムの発光を測定することにより決定した。その後、細胞を-80℃で最大6ヶ月間凍結保存した。結合を測定するために、ラベルした細胞（ウェルあたり100個）にCEA特異的aVH結合剤を0.005〜100nMの範囲の濃度で添加し、続いてFRETのアクセプター分子としてd2標識抗hisタグ抗体（Cisbio社，ウェルあたり200nMの最終濃度とした）を添加した。室温で3時間のインキュベーション後、アクセプター色素（665nm）ならびにドナー色素（615nm）の発光を、蛍光リーダー（Victor 3, Perkin Elmer社）を用いて測定した。アクセプター発光対ドナー発光の比率を計算し、バックグラウンド対照（抗hisタグ抗体とのみインキュベートした細胞）の比率を差し引いた。曲線をGraphPad Prism5で解析し（図9）、KDを算出した（表26）。以前にSPRで測定されたように、分析したクローンは、9〜190nMの非常に広い範囲のKD値を示した。

全ての結合剤を1価aVH-Fc融合構築物（SEQ ID No: 314〜327）に変換し、Fc-hole鎖（SEQ ID NO: 259）と共発現させて、精製した。得られた構築物は、N末端単量体aVHをもつFcドメインであった（図2A）。

実施例13
包括的aVHライブラリーからの抗CD28特異的aVH結合剤の選択および特性評価
ビオチン化抗原「hu CD28-Fc」を使用したヒトCD28に対する選択は、前述のように溶液中で行った。全ての選択およびライブラリーについて、キメラ抗原のFcフラグメントに対する結合剤を回避するために、最初に、300nMビオチン化ヒトFc（ニュートラアビジンプレートにコーティングした）による事前クリアリング段階を実施した。その後、ライブラリーを、CD28細胞外ドメインに対する特異的結合剤について個別に選択した。抗原濃度を（100×10^-9Mから25×10^-9Mへ）下げながら、かつ洗浄段階を増やしながら、選択を4ラウンドにわたって実施した。

全てのラウンドおよびストリームラインで、ファージ粒子を2つの代替手法により溶出した：1）1mlの100mMトリエチルアミン（TEA）の10分間の添加と、その後の500μlの1M Tris/HCl pH7.4による中和；または2）抗原：ファージ複合体と30分間インキュベートされるスーパーアゴニスト抗体TGN142（400nM）を用いた競合による溶出。溶出したファージを、指数関数的に増殖する大腸菌TG1の再感染に使用した。次に、細菌にヘルパーファージVCSM13を感染させて、一晩培養した。翌日、ファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿により回収し、後続の選択ラウンドで使用した。

特異的結合剤は、プレートサイトメーターMirrorball（TTP Labtech社）で測定されるミックス・アンド・リードアッセイを適用して、次のように同定した：各384ウェルプレートのために、10μlのSol-R2およびSol-R4ストレプトアビジンビーズ（TTP labtechキット）をPBSで個別に2回洗浄し、1mlのPBS中に再懸濁した。ビオチン化huCD28-FcをSol-R2含有溶液に加えて最終濃度を80nMとした。ビオチン化非関連タンパク質を同じ濃度でSol-R4ビーズに加えて、陰性対照として使用した。室温で1時間後、未結合タンパク質を除去するために、ビーズを再度PBSで洗浄した。両タイプのビーズを8mlのPBSに再懸濁して、プールした。次の段階では、二次FITC標識抗FLAGタグ抗体を800ng/mlの最終濃度へと添加し、35μl/ウェルのこの最終混合物を384ウェルプレートに分注した。個々のaVH含有細菌上清（5μl）を各ウェルに加えた後、プレートを暗所で4℃にて一晩インキュベートした。翌日、各ウェルの蛍光シグナルを両タイプのビーズについて測定した。バックグラウンドに対して顕著なシグナルを示すクローンを、配列決定とさらなる解析のためにショートリストに載せた（SEQ ID No: 328〜346）。

Mirrorball機器を用いて実施した「ミックス・アンド・リードアッセイ」で同定されたクローンを表面プラズモン共鳴（SPR）によってさらに分析した。選択したaVHクローンのオフレートは、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上に固定化したビオチン化hu CD28-Fcを用いて、ProteOn XPR36機器（Biorad社）により25℃で測定した。ビオチン化Fcフラグメントを陰性対照として使用した。組換え抗原（リガンド）の固定化：抗原をPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、400、800または1600レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。アナライトの注入：注入方向を水平配向に変更した；PBSTで1：3に希釈した5つの個別のaVH含有上清を、結合時間120〜180秒、解離時間800秒で、別々のチャネル1〜5に沿って60μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、希釈したaVH不含細菌上清を6番目のチャネルに沿って注入した。解離速度定数（k_off）は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの「k_off-rate」計算を用いて算出した。さらなる解析のために選択されたこれらのクローンのk_offレートの要約を表27に示す。

（表２７）細菌上清からのCD28特異的aVHクローンのk_offレートの測定

それらの生化学的および生物物理学的特性を特徴付けて比較するために、全ての結合剤を1価aVH-Fc融合構築物（SEQ ID No: 347〜365）に変換し、Fc-hole鎖（SEQ ID NO: 259）と共発現させて、詳細に分析した。得られた構築物は、N末端単量体aVHをもつFcフラグメントであった（図2A）。

SPRによるTGN1412エピトープ競合aVHの同定
TGN1412と同じエピトープを共有するaVHクローンを同定するために、競合分析をSPRにより行った。ビオチン化hu CD28-FcをPBST（10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween 20）で10μg/mlに希釈し、次に30μl/分で様々な接触時間で注入して、800レスポンスユニット（RU）の固定化レベルを垂直配向で達成した。次に、注入方向を水平配向に変更し、結合飽和が達成されるまで（180秒）、200nM TGN1412 IgGをチャネル2に沿って注入した。この段階の直後に、aVH-Fcクローンをチャネル1（TGN1412の事前注入なし）とチャネル2（TGN1412の事前注入あり）に沿って、結合時間240秒、解離時間800秒で注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、タンパク質を含まないPBSを6番目のチャネルに沿って注入した。4個のクローン（クローンP023.001、P019.020、P023.017、およびP023.057）は、チャネル1で結合を示すが、チャネル2では結合を示さない。この実験は、これらの結合剤がTGN1412と同じエピトープを共有しており、そのため事前に結合されたTGN1412の存在下ではヒトCD28に結合できないことを示している。

TGN1412エピトープ競合aVHの蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
クローンP023.001、P019.020、P023.017、およびP023.057がTGN1412と同じエピトープを共有することを確認するために、ヒトCD28を過剰発現する細胞で競合実験を行った。この解析では、SNAPタグをコードするDNA配列（Cisbio社から購入したプラスミド）をPCRで増幅し、全長ヒトCD28配列を含む発現ベクターに連結した。得られた融合タンパク質は、N末端SNAPタグを有する全長CD28で構成されていた。トランスフェクション試薬としてLipofectamine 2000を用いて、Hek293細胞を10μgのDNAでトランスフェクトした。20時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、100nM SNAP-Lumi4Tb（Cisbio社）を含むLabMedバッファー（Cisbio社）中37℃で1時間インキュベートすると、SNAPタグの特異的ラベリングが生じた。続いて、細胞をLabMedバッファーで4回洗浄して未結合の色素を除去した。ラベリング効率は、バッファーと比較して615nmでテルビウムの発光を測定することにより決定した。その後、細胞を-80℃で最大6ヶ月間凍結保存した。

最初の段階では、d2標識TGN1412（最終濃度0.15nM）を、テルビウム標識CD28-SNAPタグを過剰発現する細胞と1時間インキュベートした。このインキュベーションの後、aVH-Fc融合構築物を2500nMから0.014nMまでの範囲の濃度（3倍連続希釈）で添加した。陽性対照として、非標識TGN1412 IgGを250nMから0.0014nMまでの範囲の濃度（3倍連続希釈）で添加した。TGN1412の2価構造とそのアビディティ駆動結合（avidity-driven binding）のため、非標識TGN1412の濃度範囲は、1価のaVH-Fc構築物と比較して10分の1に減らした。

室温で4時間のインキュベーション後、アクセプター色素（665nm）の発光ならびにドナー色素（620nm）の発光を、蛍光リーダー（Victor 3, Perkin Elmer社）を用いて測定した。アクセプターとドナーの発光の比率を計算し、バックグラウンド対照（d2標識抗hisタグ抗体とのみインキュベートした細胞）の比率を差し引いた。曲線をGraphPad Prism5で解析し（図6）、Kiを算出した（表28）。

（表２８）TGN1412エピトープ競合aVHのKi値

以前にSPRで同定されたように、クローンP023.001、P019.020、P023.017、およびP023.057は、CD28への結合について標識TGN1412と競合することができ、これはFRETシグナルの明らかな減少につながる。一方、別のエピトープをもつCD28結合aVH-Fc構築物であるクローンP020.027は、TGN1412と競合せず、そのためFRETシグナルを減少させないか、ごくわずかにしか減少させない。一方、非標識TGN1412は、その2価の性質のため、その標識対応物との競合においてはるかに効率的である。

SEQ ID No: 248〜405

Claims

Kabatのナンバリングによる（i）52a位と71位または（ii）33位と52位にシステインを有する自律（autonomous）VHドメインであって、該システインが、適切な条件下でジスルフィド結合を形成することができ、かつ/またはジスルフィド結合を形成する、前記自律VHドメイン。
Kabatのナンバリングによる44E、45Eおよび(101-1)Yからなる群より選択される置換を含む、請求項1に記載の自律VHドメイン。
Kabatのナンバリングによる44E、45Eおよび(101-1)Yの置換を含む、請求項2に記載の自律VHドメイン。
KabatのナンバリングによるG44E、T45EおよびF(101-1)Yからなる群より選択される置換を含む、請求項1に記載の自律VHドメイン。
KabatのナンバリングによるG44E、T45EおよびF(101-1)Yの置換を含む、請求項4に記載の自律VHドメイン。
（a）SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR1、
（b）SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR2、
（c）SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR3、および
（d）SEQ ID NO: 210のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR4；
または
（a）SEQ ID NO: 211のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR1、
（b）SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR2、
（c）SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR3、および
（d）SEQ ID NO: 210のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含むFR4
を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の自律VHドメイン。
SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、またはSEQ ID NO: 180のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の自律VHドメイン。
SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、またはSEQ ID NO: 180の配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の自律VHドメイン。
細胞死受容体5（DR5）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、トランスフェリン受容体1（TfR1）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、またはCD28に結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の自律VHドメイン。
（A）MCSPに結合し、自律VHドメインが、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか；
（B）TfR1に結合し、自律VHドメインが、SEQ ID NO: 194のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 195の配列、SEQ ID NO: 196のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 197のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 198のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 199のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 200のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか；
（C）LAG3に結合し、自律VHドメインが、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85 SEQ、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか；
（D）FAPに結合し、自律VHドメインが、SEQ ID NO: 260、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 262、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 264、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 266、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 270、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 272、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 274、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 276、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 278、SEQ ID NO: 279からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか；
（E）CEAに結合し、自律VHドメインが、SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 302、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 304、SEQ ID NO: 305、SEQ ID NO: 306、SEQ ID NO: 307、SEQ ID NO: 308、SEQ ID NO: 309、SEQ ID NO: 310、SEQ ID NO: 311、SEQ ID NO: 312、SEQ ID NO: 313からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか；または
（F）CD28に結合し、自律VHドメインが、SEQ ID NO: 328、SEQ ID NO: 329、SEQ ID NO: 330、SEQ ID NO: 331、SEQ ID NO: 332、SEQ ID NO: 333、SEQ ID NO: 334、SEQ ID NO: 335、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 337、SEQ ID NO: 338、SEQ ID NO: 339、SEQ ID NO: 340、SEQ ID NO: 341、SEQ ID NO: 342、SEQ ID NO: 343、SEQ ID NO: 344、SEQ ID NO: 345、SEQ ID NO: 346からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項9に記載の自律VHドメイン。
自律VHドメインが、特にハーセプチン（Herceptin（登録商標））（トラスツズマブ）のVHフレームワークに基づいた、VH3_23ヒトフレームワークを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の自律VHドメイン。
Fcドメインに融合された、請求項1〜11のいずれか一項に記載の自律VHドメイン。
FcドメインがヒトFcドメインである、請求項12に記載の自律VHドメイン。
FcドメインのN末端またはC末端に融合された、請求項12または13に記載の自律VHドメイン。
Fcドメインがknob変異またはhole変異を含み、特にknob変異を含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の自律VHドメイン。
請求項1〜15のいずれか一項に記載の複数の自律VHドメインを含む、VHドメインライブラリー。
様々なポリヌクレオチドから作製された、請求項1〜15のいずれか一項に記載の複数の自律VHドメインを含むVHドメインライブラリー。
請求項1〜15のいずれか一項に記載の様々な自律VHドメインをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドライブラリー。
請求項1〜15のいずれか一項に記載の自律VHドメインをコードする、ポリヌクレオチド。
請求項19に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
請求項20に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞、特に真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞。
請求項1〜15のいずれか一項に記載の自律VHドメインを含む、抗体、特に二重特異性抗体または多重特異性抗体。
請求項16または17に記載のVHドメインライブラリーを用いて抗原結合分子を同定するための方法であって、
（i）VHドメインライブラリーを標的と接触させる段階；および
（ii）ライブラリーの該標的に結合するVHドメインを同定する段階
を含む、前記方法。
請求項18に記載のポリヌクレオチドライブラリーを用いて抗原結合分子を同定するための方法であって、
（i）ポリヌクレオチドライブラリーを、特に宿主細胞において、発現させる段階；
（i）発現されたVHドメインライブラリーの標的への結合をアッセイする段階；および
（ii）発現されたVHドメインライブラリーの該標的に結合するVHドメインを同定する段階
を含む、前記方法。
請求項23に記載の方法における請求項16または17に記載のVHドメインライブラリーの使用。
請求項24に記載の方法における請求項18に記載のポリヌクレオチドライブラリーの使用。