IT201900011676A1

IT201900011676A1 - Anticorpo ricombinante umano contro il recettore di membrana LAG3, suoi usi medici e diagnostici.

Info

Publication number: IT201900011676A1
Application number: IT102019000011676A
Authority: IT
Inventors: Alessandro Ascione; Maurizio Paolo Maria Federico; Alessandra Mallano; Michela Flego; Stefano Vella
Original assignee: St Superiore Di Sanita
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2021-01-12

Description

ANTICORPO RICOMBINANTE UMANO CONTRO IL RECETTORE DI

MEMBRANA LAG3, SUOI USI MEDICI E DIAGNOSTICI

La presente invenzione riguarda un anticorpo umano ricombinante diretto contro il recettore di membrana LAG3, e suoi relativi impieghi medici e diagnostici. In particolare, la presente invenzione riguarda un frammento variabile a catena singola anti-LAG3 (scFv) derivato dalla tecnologia del ‘phage display’ che ha come bersaglio i linfociti CD8 disfunzionali, e che quindi può essere vantaggiosamente utilizzato nel trattamento delle malattie caratterizzate da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3, come alcuni tumori, e nella diagnosi in vitro di dette malattie.

È noto che nelle malattie croniche, tra cui alcuni tumori, forse a causa di un'esposizione persistente dell’antigene, si verifica una espressione alterata di molecole ad attività regolatoria sul sistema immune (denominate checkpoint immunitari, IC), tra le quali LAG3, con la conseguente acquisizione di un fenotipo disfunzionale dei linfociti specifici, i quali perdono progressivamente le loro proprietà immunoprotettive [1]. La comprensione di questo meccanismo di "fuga" del tumore ha aperto la strada a nuovi strategie immunoterapeutiche basate sull'uso di anticorpi monoclonali in grado di legare alcuni recettori inibitori (IR) - appartenenti a un gruppo di molecole IC over-espresse sui linfociti tumore- specifici - e in grado di interferire con i loro segnali inibitori al fine di ripristinare una risposta immunitaria clinicamente significativa contro le cellule tumorali [1, 2].

Questo disegno terapeutico ha suscitato un notevole entusiasmo nel campo dell'oncologia da quando ha fornito benefici clinici persistenti per un numero significativo di pazienti con carcinoma avanzato. Sfortunatamente, tuttavia, nonostante i risultati sorprendenti e persistenti ottenuti su un numero importante di pazienti con gli anticorpi "pionieri" di questa nuova classe di prodotti farmaceutici biologici - diretti contro i recettori CTLA-4 e PD-1 - molti pazienti continuano a non rispondere alle attuali terapie basate sugli ‘IC Blockers’ (ICB). Inoltre, l'attivazione immunitaria può associarsi con eventi avversi immuno-relati che colpiscono diversi organi, tra cui pelle, intestino, cuore, polmoni e ossa [3]. Le ragioni devono essere ricercate nella complessità delle risposte del sistema immunitario, così come nelle differenze tra i differenti casi clinici, nel background genetico di ciascuno paziente e nel coinvolgimento di altri molecole inibitorie coinvolte nell'acquisizione di una condizione disfunzionale del sistema immunitario [4-6,7, 8].

Gli IR garantiscono la tolleranza verso il ‘self’ e modulano durata e ampiezza delle risposte immunitarie fisiologiche, ma è ormai chiaro che i tumori potrebbero dirottare alcuni pathways regolatori come meccanismo principale di resistenza immunitaria, in particolare nei linfociti T CD8 specifici per gli antigeni tumorali. In questo contesto, anticorpi monoclonali (mAb) specifici costituiscono potenti agenti terapeutici a causa della loro capacità di legare selettivamente gli IRs interferendo così con i percorsi regolatori che essi controllano, ripristinando un'efficace risposta immunitaria [9]. Nel frattempo, sta emergendo la consapevolezza che diversi IRs possono essere coinvolti nella disfunzionalità dei linfociti [4-6]. Ne segue che usando un approccio combinatorio rivolto ai diversi IRs espressi potrebbe aumentare la qualità dei risultati nella clinica oncologica [10,11]. Una prima conferma di questa ipotesi è venuta dal fatto che la combinazione di due ‘IR blockers’ (bloccanti), ovvero mAb anti-PD1 e anti-CTLA4, ha ottenuto un tasso di risposta più elevato di quello osservato con i singoli trattamenti anticorpali.

Pertanto, al giorno d'oggi l'attenzione è posta sulla valutazione di nuovi inibitori dei checkpoint immunitari e sulle loro combinazioni per aumentarne l'efficacia e allo stesso tempo ridurre la tossicità [12].

Lymphocyte activate gene (LAG)3 (noto anche come CD223) è proteina transmembrana di 498 aa di tipo I che agisce come recettore immunitario inibitorio (IR). LAG3 [13], insieme ad altre molecole già utilizzate per scopi clinici (come PD1 e CTLA-4), è una recettore di membrana appartenente alla famiglia dei "punti di controllo immunitario" (ICP), proteine solitamente coinvolte nella regolazione delle risposte immunitarie [14, 15]. LAG3 mostra circa il 20% di identità con il CD4 [13] e, come CD4, lega molecole MHC di classe II, anche se ad un sito distinto e con una maggiore affinità [16,17]. LAG3 non è espresso dalle cellule T a riposo, ma è invece sovra-regolato su linfociti T attivati (sia le sottopopolazioni CD4 che CD8 ), su linfociti B, cellule ‘natural killer’, e cellule dendritiche plasmacitoidi (DC). Nei linfociti attivati, l'espressione di LAG3 è coinvolta nel controllo negativo dell'attivazione/proliferazione cellulare per assicurare la modulazione e il controllo delle risposte immunitarie.

Oltre alle molecole MHC di classe II, è stato dimostrato che LAG3 lega Galectin-3 [18, 19], LSECtin [20] e, nel sistema nervoso centrale, α-synuclein [21]. L’attivazione di LAG3 porta a una regolazione negativa dell’attivazione della cellula T. Tuttavia, il meccanismo di trasduzione del segnale di LAG3 è ancora in gran parte sconosciuto. Un paio di domini unici ancora ampiamente conservati, vale a dire l'EP [22] e KIEELE [23], sembrano importanti per la trasmissione dei segnali inibitori intracellulari. Inoltre, LAG3 mostra una attività di segnalazione bidirezionale, come dedotto dalla modulazione dell’attivazione/maturazione di DC osservata in seguito all'interazione con linfociti che esprimono LAG3 [24, 25].

LAG3 è stato identificato come uno dei maggiori recettori inibitori (IR) coinvolti nella disfunzione dei linfociti T che si verifica in genere nelle malattie oncologiche [26]. Alla luce dell'espressione dis-regolata di LAG3 nei linfociti infiltranti il tumore, mAb specifici anti-LAG3 sono attualmente in studio nel tentativo di risanare la immunosoppressione associata al cancro. Insieme con altri IR, ovvero CTLA-4 e PD-1, LAG3 è ora considerato un bersaglio importante della cosiddetta strategia antitumorale basata sul blocco dei checkpoint immunitari (ICB) attraverso la somministrazione di mAbs contro IR [1].

In particolare, nel contesto oncologico, e più specificamente nei tumori solidi, LAG3 è up-regolato sui linfociti infiltrati nel tumore (TIL) e il blocco dei segnali innescati da LAG3 ottenuto con anticorpi specifici può migliorare le risposte delle cellule T antitumorali. È stato dimostrato, sia nel topo che nell'uomo, che il blocco simultaneo di PD1 e LAG3 è ancora più efficiente dell'interferenza su sola solo delle due molecole [13, 27]. Inoltre, è stato dimostrato che una precedente esposizione agli anticorpi anti-PD1 può migliorare l'espressione di LAG3, promuovendo il fenotipo disfunzionale delle cellule T, e probabilmente determinando una resistenza ai farmaci anti-PD1.

L'interesse per l'identificazione e la caratterizzazione di nuovi ICB è in continua crescita come testimoniato dai vari studi clinici e dalla pubblicazione piuttosto recente di lavori che descrivono i tentativi per l'isolamento di nuovi anticorpi (Abs) anti-IR, compresi anticorpi anti-LAG3.

Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono molecole ampiamente utilizzate in terapia, diagnostica e biotecnologia. In alcuni casi, l'efficacia delle molecole anticorpali intere può essere limitata per alcune applicazioni in considerazione della loro ampia struttura etero-tetramericana. Per questo motivo, la struttura complessa degli Abs può essere ridotta in diversi modi senza che questo influisca sulla loro efficacia. Tra queste modalità, il frammento variabile a catena singola (scFv) è una delle immunoglobuline più semplice che mantengono inalterata l’attività del legame con l'antigene [28]. Questa molecola è formata dalle regioni variabili di catene sia pesanti che leggere unite da a linker peptidico. Sebbene gli scFv abbiano il significativo vantaggio che possono essere espressi da una singola cornice di lettura, la loro bassa stabilità e la breve farmacocinetica possono limitare le loro applicazioni. La fusione di un scFv con i domini CH2 e CH3 della regione immunoglobulinica (Ig) Fc possono superare tali inconvenienti [29].

Per evitare risposte immunitarie indesiderabili, gli Abs umani rappresentano i reagenti più adatti per scopi terapeutici. Gli scFv umani possono essere isolati attraverso la consolidata tecnica del ‘phage display’. Uno studio di Everett e dei suoi collaboratori (coll.) riporta l'isolamento di Abs anti-LAG3 in grado di interagire sia con il LAG3 umano che murino mediante un ulteriore dominio di legame ingegnerizzato all'interno della regione CH3 della porzione Fc [30]. L 'attività in vitro di questi nuovi costrutti anticorpali ha dimostrato di aumentare il rilascio di IL-2 da PBMC stimolati. In particolare, Everett descrive l’isolamento di molecole in grado di legare LAG3, isolate da una libreria generata su uno ‘scaffold’ di tipo Fc, vale a dire introducendo sequenze randomizzate nella regione CH3 della porzione costante di una IgG1 umana. Questi reagenti (chiamati FcAb) sono stati quindi progettati per produrre molecole ricombinanti bispecifiche con una struttura simile a quella di un anticorpo tradizionale ma con tre siti di legame, uno dei quali in corrispondenza della fine della porzione costante Fc. La funzionalità è stata valutata in termini di effetto correlato all’ interferenza dell'interazione LAG3-MHCII, in particolare attraverso un test in vitro basato sulla quantizzazione di IL-2 (con kit ELISA) nei surpernatanti di co-colture di una linea di linfociti T CD4 - Do11.10 OVA (trasdotto per ottenere una sovraespressione di LAG3) e una linea di linfoma A20 che esprime (a livello endogeno) MHCII. Infatti, l'interazione LAG3-MHCII in questo modello comporta un'espressione ridotta di IL-2, che invece risulta migliorata in presenza di molecole che interferiscono con questa interazione. Inoltre, Sasso e i suoi colleghi [31] hanno descritto una procedura per la selezione di Abs basata sul legame di particelle fagemidiche su linfociti umani attivati per generare un repertorio di scFvs contro diversi IR tra cui LAG3. In particolare, Sasso et al. descrivono l’isolamento di anticorpi scFv umani da una libreria sintetica (Andrew D.Griffiths et al.), poi ricostruiti in un isotipo anticorpale intero di tipo igG4.

Dopo la ricostituzione in IgG4 umana, le relative attività biologiche sono state valutate mediante saggi di proliferazione dei linfociti basati sulla citometria ed ELISA per rilevare citochine. In particolare, l'attività di legame degli anticorpi e le sue proprietà funzionali sono state valutate su PBMC attivati con PHA, rispettivamente mediante analisi citofluorimetrica ed ELISA per il monitoraggio di IL-2 e INF-γ rilasciato nel surnatante di cellule trattate in diversi intervalli di tempo.

Altri anticorpi che legano il LAG-3 sono descritti in US2018066054, US2018371087.

È anche noto che il successo di immunoterapie basate sulle ICB dipenderà dalla combinazione di diversi trattamenti opzionali. In un contesto di ricerca in rapida evoluzione, la generazione di un repertorio di diversi costrutti basati su Ab immunomodulatori potrebbe giocare un ruolo essenziale nell'identificazione di efficaci agenti terapeutici, e LAG3 rappresenta sicuramente uno dei bersagli emergenti più interessanti. Il grande interesse per LAG3 è stato alimentato dalla sua forte espressione in cellule T disfunzionali associate a molti tumori umani [27, 32, 33].

Inoltre, ci sono prove evidenti che l’alterata sovra-espressione di LAG3 potrebbe mediare un meccanismo per una via di fuga del tumore dalla terapia basata sul PD1, la cui resistenza acquisita potrebbe essere superata proprio dal trattamento combinato con anti-ICB LAG3 [34-37]. Inoltre, LAG3, insieme a TIGIT e Tim-3, si prevede possa avere un migliore profilo di sicurezza nella clinica rispetto alla combinazioni CTLA4 e PD1[13, 12]. In aggiunta, il blocco di LAG3 inibisce l’attività immuno-soppressiva delle cellule Treg sia in vitro che in vivo in un modello di vasculite polmonare autoimmune [38], alimentando così l'ipotesi intrigante che un simile benefico effetto possa essere ottenuto anche nel microambiente tumorale. Per tutti questi motivi, ICB specifici per LAG3 sono attualmente in corso di valutazione in studi clinici di fase I e II in una varietà di tumori maligni solidi ed ematologici sia in monoterapia che in associazione con PD1.

Tuttavia, sebbene ci siano alcuni anticorpi anti-Lag negli studi clinici, nessun anticorpo anti- Lag3 ad oggi è stato approvato per uso clinico; Lag3 è una molecola molto complessa e probabilmente è in grado di interagire con diversi ligandi, quindi l’effetto terapeutico di differenti anticorpi diretti contro differenti epitopi possono essere ugualmente variegati, in pazienti diversi e in diversi contesti patologici. Pertanto, avere un pannello di anticorpi LAG3 significherebbe aumentare le possibilità di successo per le terapie basate sull'interferenza di questo ICP e/o ampliare le opzioni terapeutiche nella pratica clinica.

Alla luce di quanto sopra, è quindi evidente la necessità di sviluppare nuovi anticorpi anti-LAG3, che superino le limitazioni degli anticorpi anti-LAG3 già noti.

Secondo la presente invenzione, un nuovo anticorpo umano ricombinante (Ab) contro un epitopo conformazionale di LAG3 è stato ora identificato. In particolare, un anticorpo umano a frammento variabile a catena singola (scFv) è stato isolato in vitro mediante la tecnologia del ‘phage display’ utilizzando l'antigene ricombinante come esca. L'anticorpo descritto nella presente invenzione è in grado di intercettare specificamente il recettore LAG-3 e può essere vantaggiosamente utilizzato sia nella diagnosi per la preselezione dei pazienti da trattare che in terapia per il trattamento dei pazienti selezionati. L'effetto dell'anticorpo della presente invenzione è focalizzato su un particolare popolazione linfocitaria. Dati ottenuti con un modello in vitro dimostrano la capacità dell'anticorpo di agire selettivamente su cellule CD8 specifiche. L'importanza clinica di linfociti CD8 infiltrati nella massa tumorale (TIL) è nota proprio nel contesto dell'immunoterapia basata sugli inibitori di immune checkpoints. Pertanto, l'anticorpo descritto nella presente invenzione espande le opzioni terapeutiche disponibili e/o potrebbe potenziare quelle già approvate dalle autorità competenti, con l'obiettivo ultimo di migliorare l’efficacia dei trattamenti ed aumentare il bacino di pazienti che possono beneficiare di queste innovative strategie immunoterapiche.

In particolare, l'anticorpo della presente invenzione è stato selezionato da una libreria fagica ‘naive’ completamente umana mediante una strategia di ‘bio-panning’ in vitro.

Questo scFv (indicato come F7) è stato caratterizzato in termini di specificità di legame sia sull’antigene ricombinante che su cellule umane che esprimono LAG3. E’ stato poi ricostruito in un formato IgG pre-ottimizzato per uso clinico ed è stato dimostrato che il risultante costrutto bivalente preserva la sua capacità di legare LAG3 sulle cellule umane. Inoltre, in base alla presente invenzione, l'attività dell’scFvF7 anti -LAG3 è stata analizzata usando due diversi cloni linfocitari T CD8 antigenespecifici come cellule bersaglio. L’Ab anti-LAG3 F7 ricostituito lega efficacemente la membrana cellulare di entrambi i cloni cellulari dopo l'attivazione con il peptide specifico. Cosa importante, è stato osservato che il trattamento con l’Ab determina un notevole aumento della attivazione cellulare peptide-dipendente, misurata in termini di rilascio di IFN-γ sia mediante ELISA che mediante saggi ELISPOT. Quindi, dopo ricostruzione con il dominio Fc, questo Ab mantiene la sua attività di legame, e migliora sensibilmente l’attivazione dei linfociti T CD8+ antigene- specifici.

La molecola completamente nuova oggetto della presente invenzione ha come bersaglio un epitopo conformazionale dell’antigene LAG3 ed è stata isolata da una libreria fagica di tipo ‘naive’(IORISS1) [39], completamente umana e differente da quelle usate per gli anticorpi anti-LAG3 già esistenti. In quanto tale, essa è identificata da a sequenza genica e amminoacidica unica, mai isolate e pubblicate in precedenza.

L'anticorpo anti-LAG3 secondo la presente invenzione è stato sviluppato in un formato ricombinante del tipo (scFv)2- Fc (= CH2 / CH3) preottimizzato per uso clinico, che è differente da quelli descritti nei lavori pubblicati da Sasso et al. ed Everett et al.. Inoltre, l’anticorpo della presente invenzione è stato progettato per mantenere un'emivita sierica adeguata e per eliminare gli effetti collaterali dipendenti dal dominio costante Fc. Il costrutto bivalente ottenuto preserva l'efficienza di legame, come mostrato in citofluorimetria sia su cellule trasfettate con LAG3 che su linfociti umani attivati con PHA.

Diversamente dai già noti anticorpi anti-LAG3, i risultati sperimentali mostrano che l'anticorpo LAG3 descritto nella presente invenzione è in grado di aumentare fortemente l'attivazione antigene- specifica di linfociti T CD8 , utilizzando un particolare modello in vitro che consente di evidenziare l'effetto dell’anticorpo su questa particolare sottopopolazione cellulare.

Questo modello si basa infatti su cloni linfocitari umani T CD8, attivati con cellule "B LCL aventi HLA compatibile, precedentemente "caricate" con i corrispondenti specifici peptidi, precisamente un peptide tumorale (Mart-1) e un peptide virale (Nef/HIV), laddove la presenza dell'anticorpo determina un forte aumento dell'espressione di INFγ come mostrato in ELISA ed in saggi ELISPOT.

Nonostante la mancanza di metodi "standardizzati" per la valutazione funzionale e un adeguato confronto degli agenti bloccanti gli ICP, il modello usato nella presente invenzione consente di focalizzare con precisione la capacità del costrutto anticorpale scFvF7 per migliorare l'attivazione di linfociti CD8 stimolati con i loro peptidi specifici ‘presentati’ in una modalità sovrapponibile ad un normale processo fisiologico.

Questo aspetto è molto importante considerando la rilevanza clinica nota dei linfociti CD8 specifici, in particolare quelli che si infiltrano nel tumore (dove l'espressione di LAG3 risulta spesso essere disregolata), al fine di ri-orientare il sistema immunitario verso un risposta efficace. Inoltre, i requisiti di specificità, la struttura molecolare, concepita per un uso clinico, insieme alle sue proprietà funzionali, rendono l'anticorpo scFvF7 uno strumento privilegiato per diversi tipi di applicazioni.

L'anticorpo anti-LAG3 della presente invenzione può sicuramente essere usato per monitorare l'espressione dei livelli di LAG-3 su cellule umane. Pertanto – insieme con altri reagenti- esso può essere utilizzato in protocolli diagnostici che mirano a identificare i pazienti con maggiore possibilità di rispondere efficacemente a una terapia specifica con i bloccanti degli ICP, in linea con la crescente necessità di una medicina personalizzata [7, 8, 10, 11]. Inoltre, l'anticorpo scFvF7 soddisfa tutti i requisiti per essere un farmaco immunomodulatore in virtù della sua struttura completamente umana- quindi poco o affatto immunogenica - e della sua capacità di interferire con i segnali inibitori mediati da LAG-3, la cui espressione è spesso di-sregolata sui linfociti CD8 tumore specifici o virus - specifici tumore nelle patologie croniche.

È quindi oggetto specifico del presente invenzione una sequenza anticorpale ricombinante umana contro un epitopo conformazionale di LAG3 comprendente o consistente in

una sequenza VH comprendente la sequenza CDR AKDQDGGKKTDAFDI (SEQ ID NO: 3), detta sequenza VH opzionalmente comprendendo ulteriormente le seguenti sequenze CDR:

ISAGGTGT (SEQ ID NO: 2), oppure

ISAGGTGT (SEQ ID NO: 2) e GFTFSSYA (SEQ ID NO: 1), o GFTFSSYA (SEQ ID NO: 1)

e

una sequenza VL comprendente la sequenza CDR QQTGYYPLT (SEQ ID NO: 5), detta sequenza VL comprendendo opzionalmente le seguenti sequenze di CDR:

AAS, o

AAS e QGINYY (SEQ ID NO: 4), oppure

QGINYY (SEQ ID NO: 4).

Dette sequenze VH e VL sono accoppiate per riprodurre il sito di legame dell'anticorpo con metodi che sono noti ad una persona competente nel settore. Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza anticorpale ricombinante umana può essere sotto forma di una sequenza di un frammento anticorpale (scFv) variabile a catena singola umana. In questo caso, dette sequenze VH e VL sono collegate da un ‘linker’ concepito per unire dette sequenze.

Tuttavia, altri metodi sono noti per l'associazione di sequenze VH e VL; per esempio VH e VL possono essere fuse geneticamente rispettivamente ai domini costanti di catene pesanti e leggere, la cui naturale interazione favorisce l'accostamento delle regioni variabili, cruciale per la formazione del sito di legame.

Più in generale, l'architettura modulare dei domini anticorpali è stata sfruttata per creare un numero crescente di formati alternativi, tra i quali le strutture artificiali in cui l'abbinamento VH e VL è ottenuto mediante fusione genetica con proteine (o frammenti di proteine) inclini ad una associazione/multimerizzazione.

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, detta sequenza VH può comprendere o consistere in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 6) e

detta sequenza VL può comprendere o consistere in DIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRASQGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDI

(SEQ ID NO: 7), detta sequenza VL facoltativamente anche comprendente un sito di restrizione all’estremità C terminale, come KAAA (SEQ ID NO: 8).

Il linker sopra menzionato può essere ad esempio GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9).

Secondo una forma di realizzazione, la sequenza anticorpale può comprendere o consistere in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRAS QGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDI (SEQ ID NO: 10), facoltativamente comprendente ulteriormente un sito di restrizione all’estremità C terminale, come KAAA (SEQ ID NO: 8).

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza anticorpale può comprendere o consistere in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRAS QGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDIKAAADDDSDDDYKDDDDQHHHHHH

(SEQID NO: 11).

La sequenza anticorpale può comprendere ulteriormente domini immunoglobulinici costanti umani, come CH2-CH3 o CH3 in cui facoltativamente il dominio CH2 comprende le mutazioni LALA.

Ad esempio la sequenza CH2 può comprendere o consistere in APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

G (SEQ ID NO: 12), la sequenza CH3 può comprendere o consistere in QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO: 13) e la sequenza CH2 con mutazioni LALA può comprendere o consistere in APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

G (SEQ ID NO: 14).

Detti domini immunoglobulinici umani costanti possono essere collegati alla sequenza VL da una cerniera, come ad esempio EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 15).

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza anticorpale può comprendere o consistere in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRAS QGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDIKAAAASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (ID SEQ NO: 16).

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione del presente invenzione, la sequenza anticorpale può comprendere o consistere in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRAS QGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDIKAAAASEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (ID SEQ NO: 17).

La sequenza anticorpale secondo la presente invenzione può essere in forma bivalente. In particolare, la forma bivalente si ottiene dopo la traduzione delle proteine come effetto di un accoppiamento spontaneo tra le porzioni costanti (CH2-CH3 o CH3) di due molecole monovalenti.

La presente invenzione riguarda anche una sequenza nucleotide, che codifica la sequenza anticorpale come sopra definita.

La sequenza nucleotidica che codifica VH può comprendere la sequenza nucleotidica CDR GCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCTTTTGATATC (ID SEQ NO: 20), detta sequenza nucleotidica codificante VH facoltativamente può anche comprendere le seguenti sequenze nucleotidiche CDR:

ATTAGTGCTGGTGGTACTGGCACA (SEQ ID NO: 19), oppure ATTAGTGCTGGTGGTACTGGCACA (SEQ ID NO: 19) e GGATTCACCTTTAGCAGCTATGCC (SEQ ID NO: 18), oppure GGATTCACCTTTAGCAGCTATGCC (SEQ ID NO: 18), e

la sequenza nucleotidica che codifica VL può comprendere la sequenza nucleotidica CDR CAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACT (SEQ ID NO: 22), detta sequenza nucleotidica codificante VL facoltativamente comprendente inoltre le seguenti sequenze nucleotidiche CDR:

GCTGCATCC, o

GCTGCATCC e CAGGGCATTAACTATTAT (SEQ ID NO: 21), o

CAGGGCATTAACTATTAT (SEQ ID NO: 21).

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza nucleotidica codificante VH può comprendere o consistere in:

ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (ID SEQ NO: 23).

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza nucleotidica codificante VL può comprendere o consistere in:

GATATTGTGATGACGCAGTCTCCATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAG TCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCA GCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAA AGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCA CAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGG TTATTACCCTCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATC (ID SEQ NO: 24), facoltativamente comprendente inoltre una sequenza nucleotidica che codifica un sito di restrizione alla estremità 3’, ad esempio AAAGCGGCCGCA (SEQ ID NO: 25).

La sequenza nucleotidica che codifica per il sopra citato linker che collega VH e VL può essere: GGTGGAGGTGGATCTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCC (ID SEQ NO: 26).

Secondo una forma di realizzazione, la sequenza nucleotidica può comprendere o consistere in:

ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATC (SEQ ID NO: 27), facoltativamente comprendente anche una sequenza nucleotidica codificante un sito di restrizione all'estremità 3’, come AAAGCGGCCGCA (SEQ ID NO: 25).

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza nucleotidica comprendente o consistente in:

ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGCGGCCGCAGATGACGATTCTGACGATGACTA CAAGGACGACGACGACCAGCACCATCACCATCACCATTAG (SEQ ID NO: 28).

La sequenza nucleotidica anticorpale può ulteriormente comprendere una sequenza nucleotidica che codifica un dominio immunoglobulinico costante umano, come CH2-CH3 o CH3 in cui opzionalmente il dominio CH2 può comprendere le mutazioni LALA. Per esempio, la sequenza nucleotidica codificante per CH2 può comprendono o consistere in GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGG (SEQ ID NO: 29), la sequenza nucleotidica codificante per CH3 può comprendere o consistere in CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA GCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCA CAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (ID SEQ NO: 30) e la sequenza nucleotidica codificante per CH2 con mutazioni LALA può comprendere o consistere in GCACCTGAAGCTGCTGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGG (SEQ ID NO: 31).

Detta sequenza nucleotidica codificante domini immunoglobulinici costanti umani può essere collegata con la sequenza nucleotidica che codifica VL da una sequenza nucleotidica che codifica una cerniera come GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA (ID SEQ NO: 32).

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza anticorpale nucleotidica, che comprende CH2-CH3, può comprendere o consistere in:

ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGCGGCCGCAGCTAGCGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 33).

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza anticorpale nucleotidica, che comprende CH2-CH3, può comprendere o consistere in:

ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGCGGCCGCAGCTAGCGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCTGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 34).

Un ulteriore scopo della presente invenzione è un vettore comprendente la sequenza nucleotidica come definita sopra.

Il vettore può essere scelto dal gruppo costituito da vettori a DNA, vettori a RNA, plasmidi, vettori lentivirali, vettori adenovirali, vettori retrovirali o vettori non-virali.

L'invenzione riguarda anche una cellula comprendente il vettore come definito sopra, in cui detta cellula può essere preferibilmente una cellula eucariotica, più preferibilmente cellula CHO.

La presente invenzione riguarda un composizione farmaceutica comprendente o costituita da una sequenza anticorpale come definita sopra, una sequenza nucleotidica come definito sopra, un vettore come definito sopra o una cellula come definita sopra, come principio attivo, insieme a uno o più eccipienti e/o adiuvanti.

La composizione farmaceutica può ulteriormente comprendere almeno un altro principio attivo terapeutico tra cui anticorpi, citochine, farmaci chimici, preferibilmente in grado di bloccare un checkpoint immunitario, come anticorpi anti- CTLA4, anti-PD1.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è la sequenza anticorpale come definita sopra, una sequenza nucleotidica come definita sopra, un vettore come definito sopra, una cellula come definita sopra o una composizione farmaceutica come definita sopra, per l’uso come medicamento.

La presente invenzione riguarda anche la sequenza anticorpale come definita sopra, una sequenza nucleotidica come definita sopra, un vettore come definito sopra, una cellula come definita sopra o una composizione farmaceutica come definita sopra, per l'uso nel trattamento di una malattia caratterizzata da una disfunzione immune in cui è coinvolto LAG3.

Le malattie caratterizzate da un malfunzionamento dei linfociti in cui è coinvolto LAG3 possono essere selezionate da un gruppo consistente in tumori umani come NSCLC, cancro colorettale, carcinoma mammario, carcinoma epatocellulare, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, tumori solidi ed ematologici, come melanoma, linfoma follicolare, malattie infettive come malattie infettive croniche, come l’infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), da virus dell’epatite B virus (HBV) e da virus dell'epatite C (HCV).

Una alterata espressione di LAG-3 è stata trovata in un ampio spettro di tumori umani, come melanoma, NSCLC, carcinoma del colon-retto, carcinoma mammario, carcinoma epatocellulare, linfoma follicolare, carcinoma della testa e del collo a cellule squamose, ecc., ed è significativamente associata con progressione tumorale e caratteristiche clinicopatologiche aggressive.

Nuovi anticorpi anti-Lag-3 sono attualmente in corso di valutazione in diversi studi clinici, in molti tumori ematologici e solidi, dove stanno producendo entusiasmanti risultati preliminari specialmente in combinazione con altri bloccanti immunecheckpoint (ovvero anti-PD-1) e un buon profilo di sicurezza. Questi risultati sono di particolare interesse per una esplorazione più ampia di LAG-3 come un alternativo target immunoterapico e potenziale bio-marcatore predittivo.

Nelle malattie infettive, quando il sistema immunitario non riesce a sradicare l'infezione rapidamente, vengono innescati numerosi segnali inibitori, che comprendono quelli controllati da LAG-3, per frenare la risposta e prevenire eventuali danni immuno-mediati ai tessuti dell’ospite, promuovendo così una condizione disfunzionale delle risposte immuni. Pertanto, anche nel contesto delle malattie infettive croniche (come quelle causate dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dal virus dell'epatite B (HBV) e dal virus dell'epatite C (HCV)), ci sono prove a supporto di un uso clinico efficace di mAbs anti-LAG3 [40, 41].

La presente invenzione riguarda anche una combinazione di una sequenza anticorpale come definita sopra, una sequenza nucleotidica come definita sopra, un vettore come definito sopra, una cellula come definita sopra o una composizione farmaceutica come definita sopra, con almeno un'altra sostanza terapeutica attiva come anticorpi, citochine, farmaci chimici, preferibilmente bloccanti di checkpoint immunitari, come anticorpi anti-CTLA4, anti-PD1, per l’uso sequenziale o separato nel trattamento di una malattia caratterizzata da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3.

Le malattie caratterizzate da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3 possono essere selezionate dal gruppo costituito da tumori umani come NSCLC, cancro colorettale, carcinoma mammario, carcinoma epatocellulare, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, tumori solidi ed ematologici, come melanoma, linfoma follicolare, malattie infettive croniche, come infezioni causate dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dal virus dell'epatite B e dal virus dell'epatite C (HCV).

Attualmente, ci sono forti prove riguardo all’effetto sinergico di anticorpi anti-Lag-3 con antianticorpi PD-1. Tuttavia, questo è un campo giovane in continua evoluzione, e altre combinazioni (con altre molecole bloccanti ICP e con altre sostanze attive, come anticorpi, citochine, farmaci chimici) potrebbero rivelarsi efficaci nel prossimo futuro.

Secondo la presente invenzione con il termine "uso separato" si intende una somministrazione, allo stesso tempo, dei due composti della composizione secondo l'invenzione in forme farmaceutiche distinte.

Il termine "uso sequenziale" è inteso come una successiva somministrazione dei due composti della composizione secondo la presente invenzione, ciascuno dei quali in una distinta forma farmaceutica.

La presente invenzione riguarda anche l'uso di una sequenza anticorpale secondo la presente invenzione per la diagnosi in vitro di una malattia che è caratterizzato da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3.

È un oggetto della presente invenzione un kit per diagnosi in vitro di una malattia che è caratterizzata da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3, detto kit comprendente una sequenza anticorpale secondo la presente invenzione.

Come accennato in precedenza, le malattie caratterizzate da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3, possono essere selezionate dal gruppo costituito da tumori umani come NSCLC, carcinoma del colon-retto, carcinoma mammario, carcinoma epatocellulare, carcinoma a cellula squamosa della testa e del collo, tumori ematologici e solidi, come ad esempio melanoma, linfoma follicolare, malattie infettive croniche, come infezioni causate dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dal virus dell'epatite B e dal virus dell'epatite C (HCV).

La presente invenzione verrà ora descritta in un modo illustrativo, ma non limitativo, secondo le sue forme di realizzazione preferite, con particolare riferimento ai disegni allegati, che mostrano:

Fig. 1. Isolamento e ‘screening’ di scFv anti-LAG3 mediante la tecnologia del ‘Phage display’. A. Schema della selezione di fagi basata sull'affinità per LAG3, a partire dalla Libreria anticorpale IORISS1. B. ELISA anti-LAG3 effettuato con i surnatanti di 90 colonie batteriche isolate dopo cinque cicli di panning. La piastra era rivestita con 0,5 µg di antigene per ogni micro-pozzetto. I numeri identificano ogni clone positivo. O.D .: densità ottica.

Fig. 2. Sequenze nucleotidica e aminoacidica di scFvF7. E’ riportata l'intera sequenza scFvF7, inclusi i tag. Le regioni CDR1, CDR2 e CDR3 di VH e di VL sono indicate in grassetto. La regione del linker è riportata sottolineata (sequenza nucleotidica 373-417, sequenza aminoacidica 125 - 139. La sequenza tag-flag (sequenza aminoacidica 256-263) è anche sottolineato, mentre gli ultimi sei residui di aminoacidi rappresentano la regione tag con 6 istidinine, posizionata immediatamente prima della tripletta nucleotidica di stop (‘TAG’).

Fig. 3. Caratterizzazione dell'scFvF7 anti-LAG3. A. Analisi in SDS-PAGE di 1 e 5 µg di scFvF7. I marcatori molecolari in kilodalton (kDa) sono riportati a destra. B. ELISA per il rilevamento dell'antigene LAG3 effettuato con dosi decrescenti di scFvF7 purificato. GO: glucosio ossidasi. O.D .: densità ottica. Sono indicate le medie dei valori ± SEM calcolati dai risultati di tre saggi indipendenti. C. Analisi FACS effettuate con scFvF7 su linfociti T CD4 umani non stimolati o stimolati con PHA. Inserto: sono riportati i risultati dello stesso test effettuato con il mAb murino 17B4 anti-LAG3. I dati indicati sono rappresentativi di quattro esperimenti indipendenti. D. Analisi di legame del scFvF7. 0,5 µg di proteine LAG3 ricombinante e glucosio ossidasi (GO) sono state caricate in repliche di pozzetti su un SDS-PAGE 12% e poi trasferite su carta da filtro. Strisce ottenute dal filtro sono state quindi incubate con gli anticorpi indicati. Un mAb anti-His 6 è stato usato come controllo positivo per la proteina ricombinante LAG3 (che ha un tag di 6 istidine alla sua estremità C terminale). Come ulteriori controlli negativi, due strisce di filtro sono state incubate rispettivamente con l'anticorpo anti-Flag e con l’anticorpo anti-topo coniugato con l'HRP, al fine di monitorare eventuali segnali non specifici dovuti agli anticorpi secondari utilizzati per rilevare gli anticorpi scFv. L'ELISA riportato in basso (eseguito con gli stessi Abs secondari) è un controllo per la reattività dei supernatanti contenenti gli scFvs (scFvGO e scFvF7) utilizzati nel saggio. Le frecce indicano i segnali rilevanti. I marcatori molecolari in kilodaltons (kDa) sono riportati sulla destra. E’ riportato il risultato rappresentativo di tre diversi esperimenti.

Fig. 4. Costruzione e caratterizzazione del Ab scFvF7-Fc divalente. A. Schema del vettore che esprime la cornice di lettura del scFvF7-Fc. Sono indicate riportate le posizioni del promotore hEF1α / HTLVI, le sequenze segnale di IL-2 (IL-2 SS) che agiscono da peptide segnale, il sito multiplo di clonaggio (MCS) e la regione cerniera. E’ anche illustrata la mappa dei domini del prodotto proteico risultante e, sulla destra, la struttura generale dell'Ab divalente. B.

Analisi in western blot con mAb anti-6 × istidina, effettuata sui surnatanti di cellule CHO trasfettate con un vettore che esprime scFvF7-Fc (corsia 1) o trasfettate con il vettore vuoto (corsia 2). I marcatori molecolari (Mk) sono riportati sulla sinistra. I risultati sono rappresentativi di quattro saggi indipendenti. C. ELISA eseguito con surnatanti di cellule CHO trasfettate con il vettore che esprime scFvF7-Fc. I pozzetti della piastra sono stati rivestiti o con LAG3 ricombinante o con glucosio ossidasi (GO). Vengono riportati i valori medi ± SEM calcolati dai risultati di tre saggi indipendenti.

Fig. 5. Proprietà di legame del costrutto anticorpale bivalente scFvF7-Fc. A. Curva di legame di scFvF7-Fc divalente purificato su LAG3 ricombinante. Cento ng di LAG3 ricombinante sono stati fatti aderire sul fondo di micro-pozzetti di una piastra ELISA e quindi diverse quantità di Ab ricostituito F7 sono state incubate per un'ora. Il legame con l’Ab è stato finalmente rivelato mediante incubazione con un anticorpo anti-umano coniugato con HRP. Sono indicati i valori medi ± SEM calcolati da pozzetti in quadruplicato di un esperimento rappresentante di due esperimenti indipendenti. O.D: densità ottica. B. Analisi FACS sulle cellule 293T sovra-esprimenti LAG3. Sia le cellule 293T parentali che quelle ingegnerizzate per l’espressione di LAG3 sono state incubate con l’Ab divalente scFvF7-Fc, e poi con un secondario anti- IgG umano coniugato con FITC. Vengono qui mostrati i dati di un esperimento rappresentantivo di sei esperimenti indipendenti. C. Curva di legame ‘dose-risposta’ dell'Ab F7 ricostituito sulla membrana cellulare di linfociti T CD8 umani attivati. I PBMC sono stati isolati dal sangue periferico di donatori sani, e quindi la frazione CD8 T è stata isolata mediante selezione immuno-magnetica. Le cellule sono state poi attivate con PHA e, dopo sei giorni, messe in incubazione con le quantità di scFvF7-Fc bivalente indicate. Come controllo, le cellule attivate sono state incubate con soltanto l'Ab secondario. Come controllo aggiuntivo, cellule CD8 T non stimolate sono state incubate con la concentrazione più alta di Ab anti-LAG3. Sono mostrati i risultati rappresentativi di due esperimenti indipendenti.

Fig. 6. Legame del scFvF7-Fc bivalente su linfociti T CD8+ antigene-specifici. Linfociti T CD8 umani specifici per Nef e Mart1 sono stati stimolati attraverso la co-coltivazione con B-LCL con HLA compatibile precedentemente caricati con peptidi specifici (stimolati) o non corrispondenti (non stimolati). Dopo co-coltivazione per una notte (o.n.), le co-culture sono state incubate con l’Ab F7 Ab ricostituito, seguito da incubazione con secondario anti- IgG umano coniugato con FITC. Quindi, le cellule sono state incubate con mAb anti-CD8 coniugato con PE. Come controllo, cellule T CD8 derivati da PBMC non stimolate o attivate con PHA sono state incubate con il secondario o con Ab scFvF7-Fc (pannelli superiori). Nei pannelli in basso, vengono mostrati gli istogrammi dei profili di fluorescenza legati al FITC di cellule PE-positive. Vengono riportati risultati rappresentativi di quattro esperimenti indipendenti.

Fig. 7. Trattamento con Ab scFvF7-Fc bivalente aumenta l'attivazione di linfociti T CD8 antigenespecifici stimolati con il relativo peptide. A. Sia i linfociti T CD8 specifici per Nef che per Mart1 sono stati messi in co-coltura con B-LCL con HLA compatibile precedentemente trattati con i peptidi appropriati e in presenza di uno dei seguenti anticorpi, Ab bivalente scFvF7-Fc o mAb anti-LAG3 murino 17B4. Come controllo, entrambi i B-LCL (non trattati o trattati con peptidi appropriati) e cellule T CD8 sono stati coltivati da soli o in co-cultura. Dopo incubazione o.n., sono stati raccolti i supernatanti, chiarificati e testati per il contenuto in IFN-γ. Sono indicati i valori medi ± SEM calcolati da pozzetti in triplicato da un test rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. B. Effetto dose-risposta del Ab bivalente scFvF7-Fc e inibizione da parte del LAG3 ricombinante. Co-culture comprendenti B-LCL e linfociti T CD8 specifici per Nef sono stati trattati come riportato per il pannello A, tuttavia questa volta in presenza di diverse quantità di Ab F7 ricostituito. Sono state anche incluse condizioni con la massima concentrazione di scFvF7 bivalente e dosi crescenti di LAG3 ricombinante. Dopo coltivazione o.n., i supernatanti sono stati testati per il contenuto di IFN-γ. Sono indicati i valori medi ± SEM calcolati da pozzetti in triplicato da un test rappresentativo di due esperimenti indipendenti. C. Effetti del scFvF7-Fc bivalente come rilevato da test ELISPOT per IFN-γ. Risposta cellulare T CD8 specifico per IFN-γ rilevata dal test ELISPOT dopo co-colture della durata di una notte di cellule T CD8 specifiche per Nef con B-LCL pre-incubate o meno con il peptide specifico. Le co- culture erano allestite in presenza o assenza di sia del Ab scFvF7-Fc bivalente che del mAb murino anti -LAG3 17B4. Le prime co-culture sono state realizzate anche in presenza di LAG3 ricombinante o della stessa quantità di una proteina ricombinante non correlata (ad es. HIV-1 gp120). I risultati sono espressi in unità formanti spot (SFU) / 105 CD8 cellule T, e sono rappresentativi di due esperimenti realizzati con pozzetti in triplicato.

ESEMPIO 1: Isolamento dell’Ab scFv umano anti-LAG3 della presente invenzione mediante tecnologia del phage display, ingegnerizzazione dell’ Ab divalente scFvF7-Fc secondo la presente invenzione e studio delle capacità del F7 ricostituito con Fc di legare linfociti T CD8 antigene-specifici attivati mediante peptide e di aumentare la produzione di IFNγ in linfociti CD8 T antigene-specifici.

METODI

Ab phage library

La libreria fagica anticorpale umana ‘naive’ IORISS1 [39] è costituita da una grande schiera (ovvero più di 10<9 >combinazioni) di polipeptidi Ab in forma di scFv espressi sulla superficie di fagi M13. E’ stata costruita amplificando catene anticorpali leggere e pesanti da un gruppo di donatori sani, poi unite in modo randomizzato per mezzo di un appropriato peptide linker e clonando i risultanti scFvs in un vettore fagemidico come precedentemente descritto [39].

Strategia di biopanning per la selezione di scFv specifici per LAG3.

La procedura di biopanning è stata eseguita in ISS nel rispetto degli obblighi relativi agli OGM, derivati da normative nazionali e comunitarie.

La libreria IORISS è derivata da una collaborazione di ricerca scientifica tra Istituto Superiore di Sanità(ISS) e IOR; tutta la procedura sperimentale relativa alla costruzione della libreria IORISS eseguita in ISS è stata eseguita in conformità con gli obblighi sugli OGM, derivati dalle autorità nazionali e dai Regolamenti UE.

Gli Abs specifici in formato scFv sono stati isolati dalla libreria di fagi come precedentemente riportato [42]. In breve, una aliquota di fagi derivati da IORISS contenente circa 10<13 >unità formanti colonie (cfu) sono state messe a contatto con immunotubi (Nunc Maxisorp) precedentemente rivestiti con la proteina LAG3 ricombinante purificata (Acrobiosystem), messa in incubazione una notte intera a temperatura ambiente (r.t.) alla concentrazione di 5 µg/mL in 4 ml di una soluzione salina di fosfato tamponata (PBS).

Dopo il biopanning, i fagi -derivati da una versione modificata del vettore pdN332, che è una fagemide derivato dal pHEN1 (per i dettagli, consultare ref [39] per quanto riguarda la libreria di Ab umana naive IORISS1)-, sono stati eluiti in 1 mL di 100 mM trimetilammina e la soluzione è stata immediatamente neutralizzata aggiungendo 0,5 mL di 1M Tris – HCl pH 7,4.

Il termine fagi indica particelle "simili a fagi" prodotte con l'assistenza di un "fago helper" commerciale M13 K07 (commercialmente disponibile, ad esempio da New England Biolabs).

I fagi eluiti sono stati usati per infettare batteri TG1 E. coli [da Lucigen, genotipo: [F 'traD36 proAB lacIqZ ΔM15] supE thi-1 Δ (lac-proAB) Δ (mcrB-hsdSM) 5 (rK- mK -)] in fase log e amplificati per un ulteriore ciclo di selezione come precedentemente descritto [42]. In breve, 50 ml di 2 × YT di mezzo (Sigma) contenenti 100 µg / mL di ampicillina (2 × YTA) e glucosio al 2% erano inoculati con sufficiente sospensione batterica per produrre una densità ottica (O.D.) a 600 nm di 0,05-0,1. La coltura è stato cresciuta fino a 0,4-0,5 O.D. e quindi infettata con fago helper commerciale M13 K07 (commercializzato da Creative Biolabs, Thermo Fisher Scientific, New England Biolab, Stratagene) in una molteplicità di infezione di 20. I fagi recuperati erano concentrati mediante precipitazione con polietilenglicole (PEG) 6000, e utilizzati per i successivi round di panning. Piastrando su agar cellule TG1 infettate con il pool di fagi esprimenti gli Abs recuperati nell'ultimo ciclo di selezione è stato possibile far crescere i singoli cloni contenenti fagemidi. Diversi cloni batterici sono stati testati per la loro capacità di secernere scFvs anti-LAG3 funzionali.

Per la preparazione di scFv solubili, le singole colonie sono state coltivate in pozzetti a fondo piatto di una piastra da 96 (Nunc) per 2 ore a 37 ° C in 180 µL di terreno 2 × YTA e glucosio 0,1%, poi indotte con 50 µL di terreno 2 × YTA integrato con 6 mM di isopropile β ditiogalactopyranoside (IPTG, Sigma). Il giorno seguente, le piastre sono state centrifugate a 1.800 × g per 10 minuti, e i surnatanti sono stati recuperati e testati per la presenza di scFv.

Caratterizzazione e sequenze del DNA

Il DNA plasmidico proveniente dalle singole colonie batteriche è stato amplificato e analizzato mediante digestione con enzimi di restrizione Nco I e Not I (cioè i siti di restrizione utilizzati per clonare i frammenti anticorpali nella libreria IORISS1) per verificare la presenza degli inserti codificanti scFv. Successivamente, gli ORF degli scFv dei cloni positivi sono stati sequenziati con un sequenziatore di DNA automatizzato (Eurofins Genomics) utilizzando i seguenti primer: scFv forward: 5′-atgaaacaaagcactattgcact-3 ′ (SEQ ID NO: 35); scFv reverse: 5′-ttgatattcacaaacgaatgg-3 ′ (ID SEQ NO: 36). Le sequenze sono state infine analizzate usando il Database IMGT.

La tabella 1 mostra le famiglie di geni IgG che sono state identificato da IMGT.

Tabella 1

VH gene families (IMGT)

V-GENE and allele Homsap IGHV3-23*04 F J-GENE and allele Homsap IGHJ3*02 F

D-GENE and allele

by IMGT/Junction Analysis Homsap IGHD4-23*01 ORF VH gene families (IMGT)

V-GENE and allele Homsap IGKV1-9*01

J-GENE and allele Homsap IGKJ3*01 F

ELISA sulla proteina LAG3 ricombinante

Le piastre ELISA a 96 pozzetti sono state rivestite con 50 µL / pozzetto di 10 µg / mL di LAG3 ricombinante in PBS a 4 ºC. Il giorno successivo, una soluzione bloccante composta per il 2% da latte in PBS (MPBS) è stata aggiunta e dopo 2 ore le piastre sono state lavate con PBS contenente lo 0,1% di Tween 20 (TPBS). Le piastre sono state poi incubate per 2 ore a temperatura ambiente con 50 µl di surnatanti contenenti Abs scFv solubili, Ab anti-flag M2 (2,5 µg / mL, Sigma) e Ab anti-topo coniugato con HRP (5 μg / mL, Dako). Tutti gli anticorpi sono stati risospesi in MPBS al 2%. La reazione è stata sviluppata con tetrametilbenzidina 3,3 "-5,5" (BM blu, substrato POD, Roche), e arrestata aggiungendo 50 µL di acido solfidrico 1 M. La reazione è stata rilevata da un lettore ELISA (lettore di micropiastre, BioRad, modello 680) e i risultati sono stati espressi in termini di assorbanza (A) = A450 nm-A620 nm.

Per l’analisi di legame dell'anti-LAG3 scFv ricostituito con Fc, il rivestimento delle piastre è stato eseguito con 50 ng di LAG3 ricombinante / pozzetto. L'Ab ricostituito era poi incubato per un'ora a r.t., seguito dall’incubazione con un Ab anti-umano coniugato con HRP (Thermo Fisher Scientific). Le rimanenti fasi erano eseguito come sopra descritto.

Purificazione scFv solubile

Per la produzione di scFv solubili, cellule E. coli TG1 infettate con i fagi specifici sono state coltivate a 37 ºC in 2 × TY contenente 100 µg / mL di ampicillina e 0,1% glucosio fino ad una O.D. di 0,5. Dopo induzione degli Ab aggiungendo IPTG ≥1 mM, le cellule sono state incubate tutta la notte a 30ºC. Quindi, le colture batteriche sono state centrifugate e i supernatanti contenenti gli scFv recuperati. Gli anticorpi scFv erano precipitati con solfato di ammonio e poi dializzati in PBS. Gli Abs scFv essendo dotati di un tag di 6 istidine sono stati purificati mediante metallo cromatografia di affinità usando una resina di agarosio con Ni2+ acido nitriloacetico (Qiagen). I frammenti ScFv sono stati eluiti con imidazolo 250 mM in PBS, dializzati, aliquotati e conservati a -80 ºC.

Colture cellulari eucariotiche

I PBMC sono stati ottenuti mediante centrifugazione a gradiente di densità in Ficoll – Hypaque da campioni di sangue eparinizzato di donatori sani. I PBMC sono stati purificati da buffy coat ottenuti dal Centro trasfusionale dell’Università degli Studi di Roma "La Sapienza" come materiale di scarto derivante dalle procedure di isolamento di plasma / piastrine / globuli rossi da sangue intero di donatori sani, che avevano dato il consenso informato scritto. Essi erano volontari. In linea con la legge italiana in materia (Decreto legislativo del Ministero della Salute italiano del 25 gennaio 2001, pubblicato sulla Gazzetta ufficiale del 3 aprile 2001) l'età dei donatori era compresa tra 21 e 60 anni per le donne e 21-65 anni per gli uomini. Non ci sono stati restrizioni per i donatori di sangue in merito a sesso ed etnia, ad eccezione dei bambini, individui con disabilità mentali e donne in gravidanza. Tutti i donatori erano sani, adulti non medicati, ed erano preselezionato per esposizione ad agenti infettivi. Il sangue è stato ottenuto mediante puntura su vena secondo procedure medicali standard usando tecnica sterile e una compressione a bandeggio nell’area del prelievo. Una registrazione del donatore e del risultato dell’ ematocrito è archiviato al Centro trasfusionale. I ricercatori non hanno accesso a dati personali o altre informazioni riguardante i donatori in accordo con la legge italiana (Numero 675 del 31 dicembre 1996).

Le cellule T purificate sono state ottenute da PBMC per selezione negativo usando un kit per la selezione di cellule T umane (Miltenyi) secondo il protocollo del produttore, e sono state coltivate in terreno RPMI complementato con il 10% di siero di vitello fetale inattivato al calore (FCS) (HyClone). Sia le cellule CHO-K1 (ATCC® CCL-61 ™) che le HEK293T (HEK293-EBNA, Invitrogen, n. Di catalogo R620-07) (ATCC) sono state coltivate in DMEM arricchito con il 10% FCS. Sia le cellule B-LCL HLA-A02 che HLA – B7 sono state coltivate in terreno RPMI integrato con FCS al 10%. Le B-LCLs sono state generate mediante infezione in vitro con EBV di colture ex vivo di linfociti B [43]. L’isolamento e l’espansione dei cloni di cellule T CD8 specifiche per Mart (melanoma-associated recognized by T cells) -1 e per HIV-1 Nef sono state precedentemente descritte [43, 44]. Le cellule T CD8 Mart1- specifiche riconoscono la sequenza peptidica AAGIGILTV 27-35 ‘ristretta’ per HLA-A.02 (SEQ ID NO: 37) (HLA- A.02 sequenza peptidica dall’ aminoacido 27 aal 35), mentre le cellule T CD8 specifiche per Nef riconoscono il peptide TPGPGVRYPL 128-137 ‘ristretto’ per l'HLA-B7- (SEQ ID NO: 38)(Sequenza di peptidi HLA-B7 dall’ aminoacido 128 al 137). Entrambi i cloni di cellule T CD8 antigene-specifici sono stati coltivati in RPMI più il 10% di siero umano AB (Gibco) e regolarmente monitorate per la loro specificità.

Saggio citofluorimetrico su cellule umane T Cellule T CD4 isolate da PBMC (per l'origine, vedi sopra) sono state seminate alla concentrazione di 2 × 10<6 >/ mL e attivate con 5 µg / mL di PHA. Durante la fase di screening, scFvF7 è stato preliminarmente testato su cellule TCD4 ad una concentrazione unica (50 µg/mL), solo per avere una risposta del tipo "sì / no" riguardo alla capacità di riconoscere l'antigene sulla superficie cellulare. Circa 1 × 10<6 >cellule sono state risospese in PBS contenente l’anticorpo primario scFv e incubate per 1 ora a r.t.. Dopo un lavaggio, le cellule sono state risospese per 30 minuti a 4 ° C in PBS contenente 25 μg / mL di un anticorpo anti-FLAG di topo M2 (Sigma), e quindi incubate per altri 30 minuti a 4 ° C con 6 μg / mL di anticorpi di capra anti- IgG di topo coniugati con FITC (Pierce, Illinois, Stati Uniti). Come controllo negativo è stato usato un anticorpo irrilevante diretto contro un antigene irrilevante (glucosio ossidasi, GO). Dopo la marcatura, i campioni di cellule erano lavati, mantenuti a 4 ° C e immediatamente analizzati al FACScan (Becton-Dickinson, NJ, USA) equipaggiato con laser argon 15 mW, 488-nm. La compensazione della fluorescenza era eseguita usando campioni incubati con scFv antiglucosio e con anticorpo secondario di capra anti-topo coniugato con FITC.

Per quanto concerne l'analisi citofluorimetrica su cellule HEK293 T (sia le la linea cellulare parentale LAG3-negative che quella da essa derivata esprimente LAG3, gentilmente fornite dal team di ricerca del Prof. Pantaleo, Losanna), 2,5 × 10<5 >cellule erano incubato con l’Ab scFvF7 ricostituito con Fc (10 µg / mL) per 1 ora a r.t., e poi dopo il lavaggio con un anticorpi di capra anti- IgG1 umano FITC- coniugato (Pierce) per 30 minuti a 4 °C.

Allo stesso modo, sia le cellule T CD8 derivate da PBMC che i linfociti T CD8 antigene-specifici (1x10<6 >cellule / test) erano incubate con l’scFv anti-LAG3 ricostituito con Fc, a diverse concentrazioni, come specificato in ciascuna test sperimentale (comprese tra 0,1 e 20 µg / mL) per 1 ora a r.t .; il mAb anti-LAG3 murino 17B4 (EnzoLab, 10 µg / mL) è stato usato come controllo. Quindi, le cellule sono state lavate e incubate con secondario anti-IgG1 umano coniugato con FITC (per rilevare scFvF7 ricostituito) o con secondario di capra anti- IgG1 murino (per il rilevamento mouse 17B4 mAb) (Pierce). In tutti i casi, le cellule sono state poi analizzate sulla piattaforma FACscan (BD Biosciences).

Per quanto riguarda gli esperimenti riguardanti le cellule T CD8 derivate da PBMC, essi sono stati eseguiti presso il CHUV di Lousanne; il presente studio è stato approvato dal Consiglio di revisione istituzionale del Centro Hospitalier Universitaire Vaudois e tutti gli individui hanno dato il consenso informato scritto. Le cellule mononucleate del sangue utilizzati nei test funzionali in vitro sono state ottenute mediante leucoferesi eseguita su donatori sani. Le cellule mononucleari del sangue sono state isolate come in precedenza descritto (Perreau e Kremer, 2005) e crioconservate in azoto liquido.

Western blotting

I supernatanti delle cellule trasfettate (50 µL) erano separati in SDS-PAGE al 10%, quindi trasferiti su membrana di nitrocellulosa. Dopo la fase di ‘blocking’ con il 5% di latte, le membrane sono state lavate e incubate per 1 ora a r.t. con anticorpi di capra anti-IgG umano coniugati con HRP (Diluizione 1: 2.000, DAKO) e sviluppate utilizzando un reagente per la chemiluminescenza (prodotti NEN Life Science). Per l'analisi del legame dell’scFv anti-LAG3 con la proteina LAG3 ricombinante nel test Western Blot, 0,5 μg di LAG3 ricombinante e, come controllo, di glucosio ossidasi (GO) (Sigma-Aldrich), sono stati caricati in più pozzetti ed è stata eseguita una separazione in SDS-PAGE al 12%. Dopo traferimento su nitrocellulosa, differenti strisce di filtro sono state incubate con anticorpo anti-6 × His (sfruttando la presenza di un tag 6 × His all’estremità C-terminale della proteina LAG3 ricombinante), o con scFvGO (cioè un Ab umano a catena singola contro l'enzima glucosio ossidasi) [45], o con scFvF7 oppure, come controllo, con anticorpi di topo anti-Flag e anticorpi di anti-topo coniugati con HRP. Come Abs secondari, sono stati usati anticorpi di capra anti-IgG di topo (Dako) o anti IgG umano (Thermo Fisher Scientific) coniugati con HRP.

Costruzione genetica e produzione del Ab bivalente anti-LAG3 scFvF7-Fc

La procedura seguita era conforme agli obblighi relativi agli OGM secondo le norme nazionali e comunitarie.

La sequenza di codificante l’scFv anti-LAG3 è stata amplificata dal vettore fagemidico IORISS1 [39] mediante PCR con appropriati primer. Il frammento amplificato è stato quindi digerito con gli enzimi Xho I ed Eco RI, purificato in gel e unito con il Vettore pFUSEss-CHIg-HG1 (Invivogen) - che esprime le sequenze Fc umane sia del dominio CH2, comprese le mutazioni LALA [46] che del dominio CH3-doppio digerito con Xho I / Eco RI. Il costrutto risultante è stato trasfettato in Cellule CHO-K1 (ATCC® CCL-61 ™) per una produzione in scala pilota del Ab bivalente scFvF7-Fc. In breve, 10<6 >cellule erano trasfettate con 1 µg di DNA plasmidico in una piastra per coltura tissutale da 6 pozzetti con reagente lipofectamina Plus (Life Technologies) secondo le istruzioni del produttore. I supernatanti erano raccolti 48 ore dopo per valutare la produzione di Ab tramite analisi Western Blot e ELISA.

Produzione su larga scala dell’ Ab scFvF7-Fc bivalente.

La procedura, eseguita presso i laboratori del CHUV di Losanna, era conforme ai regolamenti relativi agli OGM.

L’Ab divalente scFvF7-Fc è stato prodotto attraverso transfezione transiente di cellule CHO DG44 (ATCC® CRL-9096 ™) seguita da incubazione per 6 giorni in terreno ProCHO5 privo di siero (Lonza). L’ Ab scFvF7-Fc era purificato dal mezzo cellulare usando una colonna di proteina A (Thermo Fisher), eluito con tampone glicina 100 mM pH 3.0 poi neutralizzato con Tris-HCl 1M a pH 8,0. Gli Abs sono stati poi dializzati due volte contro PBS, concentrati usando un filtro per centrifuga JumboSep con cut-off di 3 kDa (Pall Laboratories) e filtrati in sterilità usando Millex GP 0,22 μm come dimensione dei pori (Millipore). Prima di valutare scFvF7-Fc nei test funzionali in vitro, gli Abs sono stati testati con il Kit Endosafe-PTS (Charles River Laboratory) autorizzato da FDA, il quale ha mostrato un contenuto di endotossine <5 EU per mg di proteine.

Saggi ELISA ed ELISPOT per IFN-γ

Le cellule T CD8 sono state pre-incubate con differenti concentrazioni di scFv anti-LAG3 ricostituito per 2 ore e poi co-coltivate in un rapporto 2: 1 con B-LCL HLA- compatibili ‘pulsate’ in precedenza con 100 ng / mL di peptide appropriato. Le co-colture sono state incubate o.n., e infine i surnatanti chiarificati e analizzati per il contenuto di IFN-γ mediante ELISA (Immunological Sciences). Per i saggi ELISPOT, le co-colture erano mantenute per 16 ore in micro-pozzetti ELISPOT precedentemente rivestiti con un mAb diretto contro IFN-γ umano (clone D1K, Mabtech). Successivamente, le cellule sono state rimosse ed è stato aggiunto un Ab biotinilato diretto contro l'IFN-γ umano, seguito dall'aggiunta di una streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina. La piastra è stata quindi sviluppata utilizzando il substrato BCIP / NBT(Sigma). Le cellule formanti spot sono state analizzate e contate utilizzando un lettore ELISPOT (Amplimedical Bioline A-EL-VIS GmbH).

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il Software GraphPad Prism versione 5.01. I dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). Il test t -student è stato utilizzato per determinare la significatività. È stato considerato un valore di p <0,05 come statisticamente significativo.

Abbreviazioni:

B-LCL: linee cellulari B-linfoblastoide; DC: cellule dendritiche; ELISA: saggio enzimatico immunosorbente; ELISPOT: saggio enzimatico immunospot; Fc: frammento cristallizzabile; FCS: siero di vitello fetale; GO: glucosio ossidasi; kDa: kilodaltons; HLA: antigene leucocitario umano; ICB: bloccante di checkpoint immunitario; IFN: interferone; Ig: immunoglobulina; IPTG: isopropil βdithiogalactopyranoside; IR: recettore inibitorio; LAG3: gene 3 di attivazione dei linfociti; mAb: anticorpo monoclonale; O.D .: densità ottica; PBMC: cellule mononucleari da sangue periferico; o.n .: intera notte; PBS: soluzione fosfato salina tamponata; PHA: fitoemagglutinina; r.t .: temperatura ambiente; scFv: frammento variabile a catena singola; SE: errore standard; TIL: linfociti infiltranti il tumore.

RISULTATI

Isolamento di un anticorpo scFv umano anti-LAG3 mediante tecnologia del phage display.

ScFv ricombinanti umani contro LAG3 sono stati ottenuti mediante un processo di arricchimento per affinità in vitro (bio-panning) come precedentemente descritto [39], e rappresentato in Fig. 1A. In sostanza, un'aliquota di fagi esprimenti scFvs, adeguata per rappresentare la complessità della libreria IORISS1 [39], è stata sottoposta a cicli di legame con la proteina LAG3 ricombinante usata come esca, immobilizzata sulla superficie di immunotubi, a cui viene fatto seguire un processo di eluizione. Dopo ciascun ciclo di selezione è stato registrato un progressivo aumento del titolo fagico (Tab.1). Cinque round di selezione sono stati necessari per isolare una popolazione fagica anti-LAG3 rilevabile in ELISA. Gli scFvs solubili derivati da singole colonie batteriche sono state ottenute dopo la piastramento di batteri TG1 infettati con i fagi selezionati. Molti scFvs hanno dimostrato di legare la proteina LAG3 ricombinante (Fig. 1B). Il DNA codificante gli scFv è stato isolato dai cloni positivi e il sequenziamento ha rivelato un'identità genetica comune (Fig. 2). Un clone rappresentativo, indicato come scFvF7, è stato prodotto in batteri (TG1) e purificato mediante metallo cromatografia di affinità sfruttando il tag di 6 × istidine situato alla sua estremità C-terminale. L'analisi SDS-PAGE ha mostrato una singola banda da 31 kilodalton (kDa), della dimensione attesa per un frammento Ab, in assenza di contaminanti e prodotti degradati (Fig. 3A).

L’scFv purificato è stato quindi testato per il legame con l’ antigene LAG3 ricombinante in ELISA. Il saggio di legame evidenzia una specifica associazione dose-dipendente con LAG3 e mancanza di legame con la proteina glucosio ossidasi (GO) utilizzata come antigene irrilevante (Fig. 3B).

Per quanto riguarda l'attività di associazione di scFvF7 su cellule eucariotiche esprimenti LAG3, l’ analisi citofluorimetrica su linfociti T CD4 effettuata dopo 3 giorni di stimolazione con fitoemagglutinina (PHA) ha dimostrato che scFvF7 è in grado di legare anche LAG3 in conformazione nativa con un profilo comparabile a quello di un Ab anti-LAG3 murino commerciale usato come controllo (Fig. 3C). Al contrario, scFvF7 non reagisce con il suo bersaglio molecolare nel saggio Western Blot SDS-PAGE (Fig.3D), suggerendo il riconoscimento di un epitopo conformazionale.

Costruzione dell’Ab bivalente scFvF7-Fc

L'uso di Abs a dominio singolo (scFv) supera alcuni delle limitazioni tipiche degli anticorpi tetramerici, ad esempio la captazione non specifica, il limitato accesso ai tessuti di interesse. D'altra parte, è stato dimostrato che gli scFvs hanno una bassa stabilità in vivo come conseguenza della loro rapida eliminazione dal sangue. Quindi, per aumentare la nota instabilità in vivo in vista di un possibile uso in clinica, scFvF7 è stato fuso con i domini CH2 e CH3 di un Fc umano. Abbiamo generato un costrutto scFvF7-Fc bivalente risultante in un Ab ricombinante che incorpora due molecole scFvF7, ognuna delle quali unita ai domini immunoglobulinici costanti CH2 e CH3. Similmente al classico anticorpo, la loro spontanea dimerizzazione si traduce in due siti di legame anti-LAG3 sulla stessa molecola, con il vantaggio importante che la molecola bivalente può essere espressa da una singola cornice di lettura (Fig. 4A). La presenza di una regione di cerniera tra scFv e i domini costanti garantisce una flessibilità simile a quella delle immunoglobuline naturali. Inoltre, le mutazioni LALA all'interno delle regioni costanti CH2 [46] risultano particolarmente utili per un possibile utilizzo in vivo in quanto esse riducono il rischio di effetti indesiderati Fc-dipendenti, come ad esempio la citotossicità anticorpale cellula-dipendente. Il frame di lettura aperto dell’scFvF7 è stato clonato ‘in frame’ con sequenze CH2 e CH3 della regione Fc nel contesto del vettore pFUSEss-CHIghGI che esprime anche la sequenza peptidica leader secretoria per IgG1 umana (Fig. 4A).

Il costrutto molecolare risultante è stato trasfettato in cellule CHO al fine di verificare la corretta sintesi e secrezione del costrutto in un sistema eucariotico. Il test Western Blot eseguito in condizioni non riducenti con i surnatanti delle cellule trasfettate, utilizzando anticorpi anti- Fc umano come rivelatore, ha evidenziato un segnale dominante in una posizione compatibile con il peso molecolare atteso (∼140 kDa) dell'Ab anti-LAG3 ricostituito (Fig. 4B). Questi supernatanti hanno reagito in modo efficace e specifico in ELISA sulla proteina LAG3 (Fig. 4C).

Successivamente, l’ Ab F7 ricostituito con Fc è stato prodotto su larga scala mediante transfezione transitoria in cellule CHO, è stato poi purificato e formulato in PBS sterile. Il costrutto Ab divalente purificato conserva la sua specificità come evidenziato sia dalla sua reattività in ELISA contro LAG-3 ricombinante (Fig. 5A) che dal suo legame con cellule umane HEK 293 che esprimono stabilmente LAG3 (Fig. 5B). Infine, i test FACS hanno dimostrato che l’ Ab F7 ricostituito lega specificamente cellule T CD8 umane attivate con PHA, in una modalità dipendente dalla concentrazione (Fig. 5C).

L’Ab F7 ricostituito con Fc lega linfociti T CD8 antigene-specifici attivati con il relativo peptide Oltre a CTLA-4 e PD1, LAG3 è ora considerato a obiettivo importante per l'immunoterapia del cancro basata su mAb. Gli ICB vengono selezionati in base alla loro capacità di invertire l’inefficienza immunitaria dipendente dai linfociti, una tipica condizione disfunzionale che colpisce i TIL infiltrati nei tumori solidi, in particolare la sottopopolazione T CD8 (12). In questo contesto, la possibilità che l’Ab F7 possa essere proposto come nuovo candidato ICB per le nuove terapie antitumorali di combinazione si basa sulla valutazione della sua attività sui linfociti T CD8 antigene-specifici. A questo scopo, abbiamo effettuato un test funzionale su un paio di cloni di cellule T CD8 antigene-specifici, ovvero un clone ‘HLA-B7 ristretto’ specifico per HIV-1 Nef e uno HLA-A.02 ristretto specifico per l'antigene del melanoma umano Mart-1.

In primo luogo, eravamo interessati a valutare la capacità di rilevamento dell'espressione LAG3 con Ab F7 ricostituito sui cloni cellulari T CD8 in seguito all'attivazione specifica.

I due cloni sono stati co-coltivati insieme con linee cellulari B linfoblastoidi (B-LCL) - HLA compatibili precedentemente trattate con 100 ng / mL di ciascun peptide specifico. Come controllo positivo, linfociti T CD8 isolati dal sangue periferico di donatore sano (PBMC) sono stati trattati con PHA per tre giorni. Le cellule stimolate erano incubate con F7 ricostituito e marcate con anticorpo secondario anti-IgG umano coniugati con PE. Come mostrato in Fig. 6, dopo l’attivazione, l’ Ab ricostituito F7 legava entrambi i cloni T CD8 , un risultato che era coerente con l’attesa l'up-regolazione di LAG3. Questi dati hanno convalidato i due cloni di cellule T CD8 come candidati affidabili per saggi funzionali dedicati a valutare l'attività del costrutto scFvF7 bivalente.

Incremento della produzione di IFN-γ in Linfociti T CD8+ antigene-specifici trattati con Ab scFvF7 ricostituito con Fc

Le cellule B-LCL sono state trattate con peptidi specifici per 3 ore. Le APC caricate con i peptidi furono quindi co-coltivate con i cloni T CD8 appropriati in un rapporto 1:1 in presenza o in assenza di un anticorpo IgG di controllo non specifico oppure di Abs anti-LAG3 (o scFvF7 ricostituito con Fc o un mAb murino) in un volume totale di 100 µL. Dopo un'incubazione notturna (o.n.), i supernatanti sono stati raccolti e la produzione di IFN-γ è stata valutata in ELISA. I risultati riportati in Fig. 7A dimostrano chiaramente che il trattamento con scFvF7 Fc-ricostituito aumenta il rilascio di IFN-γ in modo anche più efficiente rispetto al mAb anti-LAG3 murino validato per attività funzionale. L'effetto è di più pronunciato nelle cellule T CD8 specifiche per Nef, il che è coerente con il livello apparentemente più elevato di LAG3 rilevato da scFvF7 bivalente rispetto a quello osservato sul clone linfocitario T CD8+ specifico per Mart-1 (Fig.6).

La specificità dell'effetto funzionale di scFvF7-Fc è supportato dai dati presentati in Fig. 7B, dove l'Ab bivalente è stato incubato con le cellule in presenza o l'assenza di quantità crescenti di proteina LAG3 ricombinante. L' Ab F7 induce la produzione di IFN-γ in modo dipendente dalla concentrazione che viene efficacemente inibita con l'aggiunta dell’ antigene LAG3 solubile. L'effetto specifico dell’ Ab divalente F7 sull'attivazione delle cellule T CD8 è stato ulteriormente confermato mediante saggi ELISPOT per IFN-γ (Fig. 7C). Nel loro insieme, i dati funzionali indicano che l’Ab bivalente umano scFvF7-Fc lega in modo efficiente LAG3 sulla superficie dei linfociti T CD8 antigene-specifici, aumentando così potentemente il loro stato di attivazione. Sulla base della sua capacità di contrastare l’effetto inibitorio mediato da LAG3 su linfociti T CD8 attivati dall'antigene, scFvF7-Fc può essere proposto come nuovo candidato per il trattamento di patologie caratterizzato da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3.

La combinazione dei risultati che sono stati ottenuti in Western Blot e ELISA sono compatibili con un legame dell’ scFvF7 con un epitopo conformazionale di LAG3. Inoltre, i test funzionali effettuati con linfociti T CD8 antigene-specifici hanno dimostrato che scFvF7 bivalente fuso con Fc ha attività biologica comparabile a quella del mAb murino anti-LAG3 17B4. Considerando l'origine umana di scFvF7, questi risultati sono particolarmente rilevanti in vista dei possibili usi in vivo di questo anticorpo e dei costrutti da esso derivati.

L'attività biologica di scFvF7 è stata valutata per mezzo di test funzionali su linfociti T CD8 specifici per antigeni virali o tumorali. L'interesse è stato focalizzato sulle cellule T CD8 per valutare l'efficacia di scFvF7 come nuovo candidato ICB perché l’immuno-riattivazione guidata di cellule T CD8+ dovrebbe avere un significativo effetto terapeutico per contrastare la condizione disfunzionale di questa sottopopolazione linfocitaria nel cancro ma anche nelle malattie infettive croniche.

CONCLUSIONI

Ci si aspetta che un numero crescente di Abs contro le emergenti molecole regolatorie possa giocare un ruolo chiave sia nel promuovere analisi sistematiche per la definizione di robusti bio-marcatori utili per prevedere l’efficacia terapeutica e/o la tossicità dei trattamenti, sia per l’allestimento di terapie combinate, disegnate su misura per i pazienti, nel contesto di una medicina di precisione. Nel presente studio viene descritto l'isolamento e l'attività funzionale di un nuovo Ab ricombinante anti-LAG3. Mentre ulteriori studi di caratterizzazione sono necessari per confermare il potenziale di scFvF7 come candidato clinico per il trattamento di alcune condizioni patologiche in combinazione con altri ICB, i dati presentati supportano questo agente come valida impalcatura per lo sviluppo di nuovi interventi basati su LAG3.

Infine, la flessibilità della piattaforma biotecnologica descritta consente una facile esplorazione di costrutti terapeutici alternativi, tra cui Abs bispecifici o bifunzionali. Questi nuovi Abs potrebbero ulteriormente potenziare l'attività funzionale sostituendo una porzione legante l'antigene con un altro ligando/citochina e promuovendo l'accoppiamento dei relativi eterodimeri mediante inserimento di specifiche mutazioni; per esempio un anticorpo bispecifico recante su un braccio anticorpale il sito di legame di scFvF7 (specifico per Lag3) e sull'altro un sito di associazione specifico per un altro iCP (es. PD1); oppure un costrutto anticorpale recante su un braccio il sito di legame di scFvF7(specifico per Lag3) e sull'altro una citochina immunostimolante come l'IL-15 (ad es. mediante mutazioni Knob/Hole [47] sulle regioni costanti).

Claims

RIVENDICAZIONI 1)Sequenza di anticorpo ricombinante umana diretta contro un epitopo conformazionale di LAG3 comprendente o consistente in una sequenza VH comprendente la sequenza CDR AKDQDGGKKTDAFDI (SEQ ID NO: 3), detta sequenza VH opzionalmente comprendendo inoltre le seguenti sequenze CDR: ISAGGTGT (SEQ ID NO: 2), oppure ISAGGTGT (SEQ ID NO: 2) e GFTFSSYA (SEQ ID NO: 1), o GFTFSSYA (SEQ ID NO: 1) e una sequenza VL comprendente la sequenza CDR QTGYYPLT (SEQ ID NO: 5), detta sequenza VL opzionalmente comprendendo inoltre le seguenti sequenze CDR: AAS, o AAS e QGINYY (SEQ ID NO: 4), oppure QGINYY (SEQ ID NO: 4), in cui dette sequenze VH e VL sono opzionalmente collegate da un linker. 2)Sequenza di anticorpo secondo la rivendicazione 1, in cui detta sequenza VH comprende o consiste in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 6) e detta sequenza VL comprende o consiste in DIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRASQGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDI (SEQ ID NO: 7), detta sequenza VL opzionalmente comprendendo inoltre un sito di restrizione all’estremità C terminale, come KAAA (SEQ ID NO: 8). 3)Sequenza di anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui detto linker è GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ IDNO: 9). 4)Sequenza di anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, detta sequenza di anticorpo comprendendo o essendo consistente in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMQSPSLLSASVGDRVTITCRASQ GINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDI (SEQ ID NO: 10), facoltativamente comprendendo inoltre un sito di restrizione all’estremità C terminale, come KAAA (SEQ ID NO: 8). 5)Sequenza di anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, detta sequenza di anticorpo comprendendo o essendo consistente in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRAS QGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDIKAAADDDSDDDYKDDDDQHHHHHH (SEQ ID NO: 11). 6)Sequenza di anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, che comprende inoltre domini umani costanti di immunoglobuline, come CH2-CH3 o CH3 in cui opzionalmente il dominio CH2 comprende mutazioni LALA, in cui detti domini sono collegati alla sequenza VL da una cerniera, come EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 15). 7)Sequenza di anticorpo secondo la rivendicazione 6, detta sequenza di anticorpo comprendendo o essendo consistente in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRAS QGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDIKAAAASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (ID SEQ NO: 16). 8)Sequenza di anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-7, detta sequenza di anticorpo comprendendo o essendo consistente in MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISA GGTGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQDGGKKTDA FDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSLLSASVGDRVTITCRAS QGINYYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQTGYYPLTFGPGTKVDIKAAAASEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:17) 9)Sequenza di anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-8, che è in forma bivalente. 10)Sequenza nucleotidica che codifica la sequenza di anticorpo come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9. 11)Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 10, in cui la sequenza nucleotidica che codifica VH comprende la sequenza nucleotidica CDR GCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCTTTTGATATC (SEQ ID NO: 20), detta sequenza nucleotidica codificante VH, facoltativamente comprendendo inoltre le seguenti sequenze nucleotidiche CDR: ATTAGTGCTGGTGGTACTGGCACA (SEQ ID NO: 19), oppure ATTAGTGCTGGTGGTACTGGCACA (SEQ ID NO: 19) e GGATTCACCTTTAGCAGCTATGCC (SEQ ID NO: 18), oppure GGATTCACCTTTAGCAGCTATGCC (SEQ ID NO: 18), e la sequenza nucleotidica che codifica VL comprende la sequenza nucleotidica CDR CAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACT (SEQ ID NO: 22), detta sequenza nucleotidica codificante VL opzionalmente comprendendo inoltre le seguenti sequenze nucleotidiche CDR: GCTGCATCC, o GCTGCATCC e CAGGGCATTAACTATTAT (SEQ ID NO: 21), oppure CAGGGCATTAACTATTAT (SEQ ID NO: 21). 12)Sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-11, in cui la sequenza nucleotidica che codifica VH comprende o consiste in: ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (ID SEQ NO: 23) 13)Sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-12, in cui la sequenza nucleotidica codificante VL comprende o consiste in: GATATTGTGATGACGCAGTCTCCATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAG TCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCA GCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAA AGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCA CAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGG TTATTACCCTCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATC (ID SEQ NO: 24), facoltativamente comprendendo inoltre una sequenza nucleotidica che codifica un sito di restrizione alla fine di 3’, ad esempio AAAGCGGCCGCA (SEQ ID NO: 25). 14)Sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-13, in cui la sequenza nucleotidica codificante il linker che collega VH e VL è: GGTGGAGGTGGATCTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCC (ID SEQ NO: 26). 15)Sequenza nucleotidica secondo ciascuna delle rivendicazioni 10-14, detta sequenza nucleotidica comprendendo o essendo consistente in: ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATC (SEQ ID NO: 27), facoltativamente comprendendo anche una sequenza nucleotidica codificante un sito di restrizione all’estremità 3’, come AAAGCGGCCGCA (SEQ ID NO: 25). 16)Sequenza nucleotidica secondo ciascuna delle rivendicazioni 10-15, detta sequenza nucleotidica comprendendo o essendo consistente in: ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGCGGCCGCAGATGACGATTCTGACGATGACTA CAAGGACGACGACGACCAGCACCATCACCATCACCATTAG (SEQ ID NO: 28) 17)Sequenza nucleotidica anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 16, in cui detta sequenza nucleotidica anticorpale comprende inoltre una sequenza nucleotidica codificante domini immunoglobulinici costanti umani, come CH2-CH3 o CH3 in cui facoltativamente il dominio CH2 comprende mutazioni LALA, che sono collegate alla sequenza nucleotidica che codifica VL da un sequenza nucleotidica che codifica una cerniera come GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA (SEQ ID NO:32) 18)Sequenza nucleotidica anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-17, detta sequenza nucleotidica comprendendo o essendo consistente in: ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGCGGCCGCAGCTAGCGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO:33) 19)Sequenza nucleotidica anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-18, detta sequenza nucleotidica comprendendo o essendo consistente in: ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAA CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCT GGTGGTACTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATCAGGACGGTGGTAAGAAGACTGATGCT TTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGTGGAT CTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGTTCCGATATTGTGATGACGCAGTCTCC ATCCCTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGT CAGGGCATTAACTATTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGACTGGTTATTACCCTCTCACTTTCGGCC CTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGCGGCCGCAGCTAGCGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCTGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 34) 20)Vettore comprendente la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-19. 21)Vettore secondo la rivendicazione 20, in cui detto vettore è scelto dal gruppo che consiste in un vettore a DNA, un vettore a RNA, un plasmide, un vettore lentivirale, un vettore adenovirale, un vettore retrovirale o un vettore non virale. 22)Cellula comprendente il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 20-21, in cui detta cellula è preferibilmente una cellula eucariotica, più preferibilmente una cellula CHO. 23)Composizione farmaceutica comprendente o consistente in una sequenza anticorpale come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, una sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 10-19, un vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 20-21 o una cellula come definita nella rivendicazione 22, come principio attivo, insieme ad uno o più eccipienti e/o adiuvanti. 24)Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 23, che comprende inoltre almeno un altro principio attivo terapeutico quali anticorpi, citochine, farmaci chimiche, preferibilmente bloccanti checkpoint immunitari, come anticorpi anti-CTLA4, anti-PD1. 25)Sequenza anticorpale come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, una sequenza nucleotidica come definita in ciascuna delle rivendicazioni 10-19, un vettore come definito in ciascuna delle rivendicazioni 20-21, una cellula come definita nella rivendicazione 22 o una composizione farmaceutica come definita in ciascuna delle rivendicazioni 23-24, per uso come medicamento. 26)Sequenza anticorpale come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, una sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 10-19, un vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 20-21, una cellula come definita nella rivendicazione 22 o una composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 23-24, per l'uso nel trattamento di una malattia che è caratterizzata da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3. 27)Sequenza anticorpale come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, una sequenza nucleotidica come definita una qualsiasi delle rivendicazioni 20-21, una cellula come definita nella rivendicazione 22 o una composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 23-24, per l'uso secondo la rivendicazione 26, in cui detta malattia caratterizzata da disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3 è selezionata dal gruppo consistente in tumori umani come NSCLC, carcinoma del colon-retto, cancro del seno, carcinoma epatocellulare, carcinoma testa e collo a cellule squamose, tumori ematologici e solidi come melanoma, linfoma follicolare, malattie infettive come la malattie infettive croniche, quali per esempio infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV) e virus dell'epatite C (HCV). 28)Combinazione di una sequenza anticorpale come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, una sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 10-19, un vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 20-21, una cellula come definita nella rivendicazione 22 o una composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 23-24, con almeno un altro principio attivo terapeutico come anticorpi, citochine, farmaci chimici, preferibilmente bloccanti dei checkpoint immunitari, come anticorpi anti-CTLA4, anti-PD1, per l’uso sequenziale o separato nel trattamento di una malattia caratterizzata da una disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3. 29)Combinazione, secondo la rivendicazione 28, per l'uso secondo la rivendicazione 28, in cui detta malattia caratterizzata da disfunzione linfocitaria in cui è coinvolto LAG3 è selezionata dal gruppo consistente in tumori umani come NSCLC, carcinoma del colon-retto, carcinoma mammario, carcinoma epatocellulare, tumore a cellule squamose della testa e del collo, tumori ematologici e solidi, come ad esempio melanoma, linfoma follicolare, malattie infettive come malattie infettive croniche, quali ad esempio infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), e virus dell'epatite C (HCV). 30)Uso della sequenza anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9 per la diagnosi in vitro di una malattia che è caratterizzata da un malfunzionamento linfocitario in cui è coinvolto LAG3. 31)Uso secondo la rivendicazione 29, in cui detta malattia caratterizzata da un malfunzionamento linfocitario in cui è coinvolto LAG3 è selezionata dal gruppo consistente in tumori umani come NSCLC, carcinoma del colon-retto, carcinoma mammario, carcinoma epatocellulare, tumore a cellule squamose della testa e del collo, tumori ematologici e solidi, come ad esempio melanoma, linfoma follicolare, malattie infettive come malattie infettive croniche, quali ad esempio infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), e virus dell'epatite C (HCV). 32)Kit per diagnosi in vitro di una malattia che è caratterizzata dall'esaurimento dei linfociti guidato da LAG3, detto kit comprendendo una sequenza di anticorpi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9. 33)Kit secondo la rivendicazione 32, in cui detta malattia caratterizzata un malfunzionamento linfocitario in cui è coinvolto LAG3 è selezionata dal gruppo consistente in tumori umani come NSCLC, carcinoma del colon-retto, carcinoma mammario, carcinoma epatocellulare, tumore a cellule squamose della testa e del collo, tumori ematologici e solidi, come ad esempio melanoma, linfoma follicolare, malattie infettive come malattie infettive croniche, quali ad esempio infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), e virus dell'epatite C (HCV).