CZ298531B6

CZ298531B6 - Krystalická forma derivátu N-fenyl-2-pyridinaminu, zpusob její prípravy a farmaceutické prostredky s jejím obsahem

Info

Publication number: CZ298531B6
Application number: CZ20000149A
Authority: CZ
Inventors: Zimmermann@Jürg; Sutter@Bertrand; Michael Bürger@Hans
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 2007-10-31
Also published as: CN1264375A; HUP0003230A2; CO4940418A1; IL133906A0; JP2001510192A; TW491845B; TR200000060T2; DE69818674D1; IL133906A; SK287276B6; MY128664A; NO20052755D0; IL174082A; ID24093A; BR9810920A; DE69818674T2; NZ502295A; NO319486B1; IL168972A; ZA986362B

Abstract

Krystalická forma adicní soli 4-(4-methylpiperazin-1-ylmethyl)-N-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu vzorce I s kyselinoumethansulfonovou, která na rentgenovém difrakcnímdiagramu vykazuje pík u úhlu refrakce 2theta 20.degree., pricemž uvedený pík vykazuje v porovnání snejintenzivnejší linií diagramu relativní intenzitu linie cinící 65 %, zpusob její prípravy a farmaceutické prostredky s jejím obsahem, které lze použít napr. pri lécení nádorových onemocnení.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká specifické adiční soli 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-A^/-[4-methyl-3-(4pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu s kyselinou methansulfonovou, obsahující určité krystaly, způsobů její přípravy, farmaceutických kompozic obsahujících tuto krystalickou formu a jejího použití k výrobě farmaceutických přípravků pro použití při diagnostických metodách, nebo s výhodou k léčebným účelům u teplokrevných živočichů, zejména u lidí.

Dosavadní stav techniky

Příprava 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-A-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu a jeho použití, především jako protinádorové účinné látky, je popsána v příkladu 21 dokumentu EP A-0 564 409, který byl zveřejněn 6. října 1993, a v souběžných přihláškách v mnoha dalších státech. Tato sloučenina je uvedena v příkladech zmíněných publikací pouze ve volné formě (nikoliv jako sůl).

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že za určitých podmínek se může u soli této sloučeniny s methansulfonovou kyselinou vyskytovat krystalická forma, která je níže popisována jako β-krystalická forma, a která má velmi výhodné vlastnosti.

Podstata vynálezu

Vynález se týká adiční soli sloučeniny vzorce I, která obsahuje krystaly, jež nemají tvar jehlic, zejména β-krystalické formy adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou.

Tedy především se vynález týká v podstatě čisté krystalické formy, s výhodou takové, která je níže označována jako β-krystalická forma adiční soli 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-7V-[4methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu vzorce I

(I) s kyselinou methansulfonovou.

- 1 CZ 298531 B6

Tam, kde je výše a níže použit termín adiční sůl sloučeniny vzorce I nebo 4—(4— methylpiperazin1 -ylmethyl)-V-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu s kyselinou methansulfonovou, tento znamená především sůl kyseliny methansulfonové vzorce II

(II) Termínem „v podstatě čistý“ se rozumí v kontextu tohoto vynálezu především to, že alespoň 90, s výhodou alespoň 95 a nej vhodněji alespoň 99 % hmotn. krystalů adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou je v krystalické formě podle vynálezu, především v β-krystalické formě.

V souvislosti s konstatováním, že adiční sůl s kyselinou vzorce II vykazuje rtg. difrakční diagram v podstatě jako na obr. 2, znamená termín „v podstatě“, že musí být přítomny alespoň hlavní linie diagramu zobrazeného na obr. 2, tj. ty, jejichž relativní intenzita linie činí, v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu, více než 10 %, zejména více než 20 %.

Vynález se tedy především týká takových forem adičních soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou, ve kterých jsou krystaly krystalové formy podle vynálezu, především β-krystalické formy, v podstatě v čisté formě spolu s jinými krystalovými formami nebo/a amorfní formou methansulfonátu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-/V-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu. Výhodná je však adiční sůl s kyselinou vzorce II, která je v podstatě v čisté formě, a to v β-krystalické formě.

Nová krystalická forma, zejména β-krystalická forma, má následující vlastnosti:

Teplota tání β-krystalické formy na DSC termogramu je 217 °C a α-krystalické formy je 226 °C (začátek tání).

Rtg. difrakční diagram β-krystalické formy nevykazuje pík α-krystalické formy označený (1) a vykazuje pouze ve velice malém rozsahu pík označený (3) (viz obr. 1 a 2). Oproti tomu je na obr. 2 zobrazen nový, další pík označený (4). Na obr. 2 se rovněž objevuje nový pík označený (5).

Rtg. difrakční diagramy ukazují také další označené rozdíly.

Při výhodném provedení vykazuje v podstatě čistá adiční sůl sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou v β-kiystalické formě rtg. difrakční diagram znázorněný na obr. 2.

(i) Výhodná je krystalická forma adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou, která nevykazuje pík označený (1) na obr. 1/3 na rtg. difrakčním diagramu, tato krystalická forma se převážně vyskytuje v podstatě v čisté formě.

-2CZ 298531 B6 (ii) Výhodná je rovněž krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, která nevlhne při 93% relativní vlhkosti a při teplotě 25 °C, tato krystalická forma se převážně vyskytuje v podstatě v čisté formě.

(iii) Vynález se týká s výhodou β-krystalické formy adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, která je charakterizována přítomností krystalů, které mají formu znázorněnou na obr. 3/3 dole; zejména β-krystalická forma je v podstatě v čisté formě.

(iv) . Mimořádnou přednost má β-krystalická forma adiční osli methansulfonové kyseliny se sloučenou vzorce I, která má teplotu tání nižší než 225 °C, zejména v rozmezí od 217 do 225 °C.

(v) Mimořádnou přednost má i β-krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, která má teplotu tání nižší než 217 °C, definovanou jako začátek tání na DSC termogramu.

(vi) Mimořádnou přednost má rovněž β-krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučenou vzorce I, která při rtg. difrakci má vrchol označený (4) na obr. 2/3.

(vii) Mimořádnou přednost má také β-krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, která při rtg. difrakci má vrchol označený (5) na obr. 2/3.

(viii) Ještě výraznější přednost má β-krystalická forma adiční soli kyseliny methansulfonové se sloučeninou vzorce I, která má rtg. difrakční diagram typu, který je znázorněn na obr. 2/3, zejména takový, kde relativní intenzity každého vrcholu se neodchylují více než 10 % od relativních intenzit vrcholů na obr. 2/3, zejména ten rtg. difrakční diagram, který je shodný s diagramem na obr. 2/3.

(ix) Největší přednost má β-krystalická forma adiční soli kyseliny methansulfonové se sloučeninou vzorce I, která má dvě z vlastností uvedených v odstavcích (i) až (viii), větší přednost se dává třem z vlastností uvedených ve zmíněných odstavcích, zejména všem uvedeným vlastnostem a obzvláště těm vlastnostem, které jsou definovány jako výhodné.

Podobně výraznou přednost má ta krystalická forma, která je definována v některém z odstavců (i) až (iv) v podstatě v čisté formě.

Zvláštní přednost má zejména β-krystalická forma adiční soli kyseliny methansulfonové se sloučeninou vzorce I, kterou lze získat tak, jak je popsáno v příkladech provedení.

Ve všech případech lze předpokládat, že z širšího hlediska vynálezu jde o formu adiční soli methansulfonové kyseliny, která obsahuje výše uvedenou krystalickou formu.

Teploty tání se stanovují DSC termogramem s použitím přístroje Mettler-Toledo TA 8000. DSC („differential scanning calorimetry“) je technika dynamické diferenciální kalorimetrie. Při použití této techniky se teplota tání jak α-krystalické formy tak i β-krystalické formy může měřit zahříváním vzorků, pokud nelze detekovat termickou, tj. endotermickou nebo exotermickou reakci pomocí ultrasenzitivních senzorů. Teploty tání uvedené v tomto textu se stanovují s použitím přístroje Mettler-Toledo TA 8000, kdy se asi 5,5 až 6,5 mg každého vzorku v hliníkovém kelímku s perforovaným víkem v klidné atmosféře vzduchu, měří při zahřívání rychlostí 10°C/min (vychází se od 20 °C).

α-Krystalická forma methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-lylmethyl)-A-[4-methyl-3-(4pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamiduje charakterizována jehlicovitě vytvářenými krystaly a je hygroskopická. U této formy nejsou krystaly příliš vhodné pro farmaceutické přípravky jako pevné dávkové formy, poněvadž jejich fyzikální vlastnosti, například charakteris-3CZ 298531 B6 tiky sypnosti, nejsou výhodné. Za určitých podmínek je ovšem možné získat methansulfonan 4(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-V-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl/pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu v takové krystalické formě, která nemá jehlicové krystaly. Tato forma je označována v tomto popisu jako β-krystalická forma.

β-Krystalická forma methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-jV-[4-methyl-3-(4pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu je výhodná tím, že její sypné vlastnosti jsou podstatně příznivější než vlastnosti cc-krystalické formy. Tato krystalická forma je dále výhodná tím, že je termodynamicky stálejší při teplotách pod 140 °C. Konečně β-krystalická forma je méně hygroskopická než α-krystalická forma a proto je i lépe skladovatelná a snáze zpracovatelná.

β-Krystalicko formu (s výhodou v podstatě čistou) lze získat

a) digescí jiné krystalické formy, zejména oc-krystalické formy nebo amorfního výchozího materiálu adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, s vhodným polárním rozpouštědlem, zejména alkoholem, nejlépe smethanolem, nebo také s ketonem (zejména ve směsi s vodou, jako je voda-aceton), především s acetonem, s nižší Λζ V-dialkylalkankarboxamidem, především s MTV-dimethylformamidem nebo A/V-dimethylacetamidem, popřípadě s hydrofilním etherem, především dioxanem, s výhodou v přítomnosti malého množství vody, nebo se směsmi rozpouštědel, v suspenzi při vhodné teplotě, s výhodou při teplotě v rozmezí od 20 °C do 50 °C, například při teplotě okolo 25 °C; nebo

b) rozpuštění jiné krystalické formy, zejména α-krystalické formy, nebo amorfního výchozího materiálu adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, ve vhodném polárním rozpouštědle, jako je především alkohol, zejména methanol nebo ethanol., keton (především ve směsi s vodou, například voda-aceton), především aceton, nižší Λζ/V-dialkylalkankarboxamid, především Λζ/V-dimethylformamid nebo A/V-dimethylacetamid, nebo hydrofílní ether, především dioxan, nebo jejich směsi, s výhodou v přítomnosti malého množství vody, při vhodné teplotě, zejména po zahřátí rozpouštědla, nebo zahřívání při rozpouštění, v obou případech s výhodou od teploty 25 °C až k teplotě varu reakční směsi pod zpětným chladičem a potom vyvoláním krystalizace přídavkem malého množství β-krystalické formy jako očkovadla, při vhodné teplotě, například v rozmezí od 0 do 70 °C, s výhodou v rozmezí od 20 do 70 °C.

Edukt, tj. α-krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se 4-(4-methylpiperazin-lylmethyl)-2V-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidem, se získá například vysrážením této soli z roztoku v jiném rozpouštědle než je alkohol, jak je methanol a bez přídavku očkovacích krystalů β-krystalické formy.

Uvedené podmínky pro selektivní přípravu jednotlivých krystalických forem nejsou rozhodující. Obecně je například možné měnit parametry, jako je hmotnostní poměr adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeniny vzorce I k rozpouštědlu. Je rovněž možné měnit dobu, která je potřebná k přípravě β-kiystalické formy, zejména když se teploty nastaví ve stejném čase.

Jedna z výhod β-krystalické formy je zejména kompaktnější krystalická forma, což se projevuje v podstatě příznivějšími sypnými vlastnostmi a tedy lepší zpracovatelností adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I v β-krystalické formě oproti α-krystalické formě, například při výrobě farmaceutických přípravků.

Je skutečností, že α-krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I je při teplotě místnosti metastabilní. Naproti tomu je ovšem β-krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I při teplotě místnosti forma termodynamicky stálá. Vyšší stabilitu lze tedy očekávat.

-4CZ 298531 B6

Nakonec je β-krystalická forma méně hygroskopická než α-krystalická forma adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, jak je zřejmé z následující tabulky.

Při měření krystalických forem až k bodu dosažení rovnováhy (nenastává další adsorpce) ve skleněné klimatizační komůrce při teplotě 25 °C a při vlhkostech uvedených níže, byly nalezeny následující hodnoty obsahu vody (hodnota v % pro konečný obsah vody se vztahuje na hmotnost za sucha):

Relativní vlhkost	Konečný obsah vody po adsorpci
(%)	α-kryst. forma	β-kryst. forma
	(%)	(mol.)	(%)	(mol.)
12	0,14	0,05	0,08	0,02
33	0,18	0,06	0,10	0,03
46	0,14	0,05	-	-
54	0,13	0,04	0,14	0,05
66	0,07	0,02	0,09	0,03
75	0,49	0,16	-	-
85	0,18	0,06	0,16	0,05
93	40	13,1	0,15	0,05
97	63	20,8	23	7,5
100	-	-	37	12

Je patrno, že při teplotě 25 °C je α-kiystalická forma hydroskopická a rychle přijímá vodu, takže při 93 % relativní vlhkosti má vzorek určitý obsah amorfní formy, zatímco β-krystalická forma zůstává za těchto podmínek suchá. Obě krystalické formy se roztěkají při 97 relativní vlhkosti, ale velice často a rychleji se to děje s α-krystalickou formou než s formou β-krystalickou.

Nižší hygroskopičnost je další výhodou při zpracovávání a skladování adiční soli s kyselinou v β-krystalické formě.

Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, která se s výhodou používá v βkrystalické formě (v dalším se adiční soli methansulfonové kyseliny se vždy rozumí β-krystalická forma), a podobně i 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-jV-[methyl-3-(4-pyridm-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamid ve volné formě, má cenné farmakologické vlastnosti a může se například používat jako protinádorové účinná látka, jako látka k léčení aterosklerózy, jako látka k léčení restenózy, k prevenci poruch vyvolaných transplantací, jako je obliterativní bronchiolitida a/nebo k prevenci napadání buněk teplokrevného živočicha některými bakteriemi, jako je Portphyromonas gingivalis.

Fosforylace bílkovin je již dlouho známa jako důležitý stupeň při rozlišování a rozdělování buněk. Fosfoiylace je katalyzována protein-kinázami, dále dělenými na serin-threonin-kinázy a tyrosin-kinázy. Tyrozin-kináza zahrnuje PDGF (Platelet-deriver Growth Factor), receptor tyrozin-kinázy.

PDGF je obecně velmi často se vyskytující růstový faktor, který má významnou úlohu jak při normálním růstu, tak i při patologické proliferaci buněk, jak je to patrno při karcinogenezi a při onemocněních buněk hladkého svalstva cév, například při ateroskleróze a trombóze.

Inhibice aktivity receptorů tyrozin-kinázy in vitro, stimulované PDGF, se měří v komplexech buněk BALB/c 3T3, imunních proti receptorů PDGF, jak popsal E. Andrejauskas-Buchdunger a U. Regenass v Cancer Research 52, 5353 až 5358 (1992). Sloučenina vzorce I, již podrobněji popsaná výše, jako je zejména její β-krystalická forma, inhibuje fosforylaci atelulámího receptoru, která je závislá na PDGF. Inhibice receptorů tyrozin-kinázy PDGF se měří mikrotitračním testem ELISA (viz Trinks se sp., J. Med. Chem. 37, 1015 až 1027 (1994)). 4-(4-methylpipera

-5CZ 298531 B6 zin-l-ylmethyl)-N-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino/fenyl]benzamid a jeho odpovídající sůl s methansulfonovou kyselinou inhibující aktivitu tyrozin-kinázy receptorů

PDGF při IC₅₀ (koncentrace, při které je aktivita inhibována z 50 % při srovnání s kontrolou) v koncentraci asi 120 nM, popřípadě 100 nM.

Díky inhibici PDGF je sloučenina vzorce 1 vhodná k léčení nádorových onemocnění, jako jsou gliomy, sarkomy, nádory prostaty, nádory tlustého střeva, prsů a vaječníků.

Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I rovněž inhibuje buněčné procesy, včetně tzv. faktoru kmenových buněk (SGF, známý rovněž jako c-kit-ligand nebo steel-faktor), jako je SCF receptor (kit) autofosforylace a SCG stimulovaná aktivace MAPK-kinázy (mitogenem aktivovaná protein-kináza).

Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, zejména její β-krystalická forma, také inhibuje autofosforylaci receptorů SCR (a proto-oktogen c-kit). Buňky M07e jsou buněčnou linií humánní promegakaryotické leukemie, která je vhledem k proliferaci závislá na SCF. Lze je získat od Groven Bagby, Oregon Health Sciences University, USA. Buňky se kultivují v médiu RPMI 1649, které je doplněno 10 FBS a 2,5 ng/ml GC-CMF. GM-CFM a SCF jsou komerčně dostupné. Séra zbavené buňky MO7e se preparují a inkubují po 90 min při teplotě 37 °C s testovanou sloučeninou, a to dříve než se stimulují rekombinantem SCF po dobu 10 min při teplotě 35 °C. Stejná množství buněčných lyzátů se analyzují barvením Western s použitím antifosfotyrozinových protilátek (Buchdunger se apod.., Proč. Nati. Acad. Sci (USA), 92, 2558 až 2562, 1995). Imunodekorativní proteiny se detekují pomocí barvicího systému ECL Western od firmy Amersham (Amersham UK). Sloučenina vzorce I, zejména krystalická forma její soli s methansulfonovou kyselinou vzorce II, inhibuje autofosforylaci SCF-R v mikromolámí koncentraci.

Na základě popsaných vlastností může být adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, zejména její β-krystalická forma, používána nejen jako látka inhibující nádory, například v malých buňkách rakoviny plic, ale také jako prostředek k léčení benigních proliferativních poruch, jako je ateroskleróza, trombóza, psoriáza, sklerodermie a fibróza a také k ochraně kmenových buněk, například v potlačení hemotoxické účinnosti chemoterapeutických léčiv, jako je 5-fluoruracil, a při astmatu. Zejména může být používána při léčení takových onemocnění, která reagují na inhibici receptor-kinázy PDGF.

Navíc adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, jako je zejména její β-krystalická forma, předchází vzniku mnohočetné rezistence při terapii rakoviny jinými chemoterapeutickými prostředky nebo při odstraňování pravděpodobné rezistence proti jiným chemoterapeutikům. Tedy bez ohledu na výše popsaný efekt může být adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I a zejména její β-krystalická forma, výhodně používání v kombinaci s jinými protinádorovými prostředky.

Také abl-kináza, zejména v-abl-kináza, je inhibována 4-(4-methylpiperazin-l-yl(methyl)-A[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidem a jeho solí s methansulfonovou kyselinou. Inhibice v-abl tyrosin-kinázy lze stanovit metodami podle N. Lydona se sp., Oncogene Research 5, 161 až 173 (1990) a J. F. Geisslera se sp., Cancer Research 52, 4492 až 4498 (1992). Při těchto metodách se jako substráty používají [Val⁵]-angiotenzin II a [γ’³²Ρ]APT. 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-A-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-y)pyrimidin-2ylamino)fenyl]benzamid zde vykazuje IC₅₀ při 38 nM.

Analogicky inhibuje sůl sloučeniny vzorce I také BCR-abl-kinázu (viz Nátuře Medicine 2, 561 až 566 (1996)) a je tedy vhodná k léčení BCR-abl-pozitivní rakoviny a nádorových onemocnění, jako je leukemie (zejména chronická myeloidní leukemie a akutní lymfoblastická leukemie, kde se nalézají aktivní apoptotické mechanismy), a rovně vykazuje účinky na podskupinu leukemických kmenových buněk a také možnosti čištění těchto buněk in vitro po odstranění těchto

-6CZ 298531 B6 buněk (například odstranění kostní dřeně) a reimplantaci těchto buněk, pokud byly jednoznačně poznány jako rakovinové buňky (například reimplantace čištěných buněk kostní dřeně).

Dále má adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I výhodné účinky při léčení poruch, které vznikají jako následek transplantace, například allogenetické transplantace, zejména rejekce tkáně, jak oje především obliterativní bronchiolitida (OB), tzn. chronická rejekce allogenetických transplantátů. Na rozdíl do pacientů bez OB, ti pacienti, kteří mají OB, často vykazují zvýšenou koncentraci PDGF v bronchoalveolámím výplachu. Když se methansulfonan 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-A^f-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyljbenzamidu, zejména v β-krystalické formě, podává krysám s tracheálními allogenetickými transplantáty, například krysám s tracheálními allogenetickými transplantáty, například v dávce 50 mg/kg intraperitoneálně, může se ukázat po odstranění 10 transplantátů ve skupině, po 10 a 30 dnech, při morfometrické analýze možných lézí epitelu a uzavření dýchacích cest, a po vyšetřování imunohistochemických pochodů, že ačkoliv adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I nemá signifikantní účinek na nekrózu epitelu nebo infiltraci zánětlivými buňkami, dokáže zřetelně snižovat fíbroproliferaci a uzavření průsvitu při srovnání s kontrolami. Jsou možné synergistické účinky s jinými imunomodulačními nebo protizánětlivými látkami, například když se použijí kombinace s cilosporinem, rapamycinem nebo askomycinem, nebo s jejich imunosupresivními analogy, například s cyklosporinem A (CsA), cyklosporinem G, FK-506, rapamycinem, nebo se srovnatelnými sloučeninami, jak oje kortikosteroidy, cyklofosfamidy, azathioprin, methotrexat, brequinar, leflunomid, mizoribin, mykofenolová kyselina, mykofenolát mofetil, 15-desoxyspergualin, imunosupresivní protilátky, zejména monoklonální protilátky receptorů leukocytů, například MHC, CD 2, CD 3, CD 4, CD 7, CD 25, CD 28, B 7, CD 45, CD 58 či jejich ligandy nebo jiné imunomodulační sloučeniny, jako je CTLA 4Ig. Když se CsA (1 mg/kg subkutánně) například kombinuje s adiční solí kyseliny methansulfonové se sloučeninou vzorce (50 mg/kg), lze pozorovat synergismus.

Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I účinkuje rovněž při onemocněních, která souvisí s migrací buněk hladkého svalstva cév a proliferaci (kde PDGF a PDGF-R často hrají svou úlohu), jako je restenóza a ateroskleróza. Tyto účinky a jejich důsledky při proliferaci nebo migraci buněk hladkého svalstva cév in vitro a in vivo, je možno demonstrovat podávání adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I a také zkoumání jejího působení a ztloustnutí cévní intimy po mechanickém poškození in vivo.

Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I se používá pro studie in vitro v 0,1 N kyselině chlorovodíkové nebo v dimethylsulfoxidu v koncentraci 10 mM. Základní roztok se dále ředí buněčným kultivačním médiem a pro pokusy se používá v koncentracích od 10 do 0,1 μΜ. Pro aplikaci in vivo se adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I rozpouští například d dimethylsulfoxidu v koncentraci 200 mg/ml a potom se ředí 1 : 20 1% Tweenem v 0,9% roztoku chloridu sodného. Sonikací se získá čirý roztok. Základní roztok se připravuje každý den čerstvý před aplikací. (Sloučenina vzorce I může být rovněž jednoduše rozpouštěna v deionizované vodě pro perorální podávání nebo v 0,9% roztoku chloridu sodného pro parenterální podávání). Aplikuje se 24 h před operací. Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I se krysám podává v jedné dávce 50 mg/kg intraperitoneálně denně po celou dobu pozorování. Kontrolním kiysám se podávají stejné dávky substrátu. Perorální aplikace je také možná.

Primární kultury buněk hladkého svalstva se izolují z aorty 9 až 11 dní starých krys DA (AB-B4, RT, la), s použitím modifikované metody, kterou popsal Thyberg a sp. (viz Differentiation 25, 156 až 167 (1983)). Aorta se otevře podélným řezem a endotel se pečlivě odstraní. Adventitia a tunica media se oddělí a tunica media se digeruje s 0,1% kolagenázy a DNA-ázy ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Buňky se odstředí, suspendují v kultivačním médiu a nechají se růst v plastových zkumavkách. Primární buňky se použijí pro pokusy po pasážích 2 až 6. Subkultury se udržují v médiu. DMEM (Dulbeccovo modifikované Eaglovo medium), které je doplněno 10% telecího fetálního séra, 2 mmol/ml glutaminu,

-7 CZ 298531 B6

100 mmol/ml streptomycinu a 100 mj/ml penicilinu. Pro identifikační účely se buňky nechají růst na krycích sklíčkách a barví se na SMC-alfa aktinu (viz níže).

Migrace buněk hladkého svalstva se kvantifikuje in vitro s použitím Transwellovy vložky kultur (Costa, Cambridge, MA), kde horní a dolní komůrky jsou od sebe odděleny polykarbonátovou membránou s velikostí pórů 8 pm. Buňky (100 μΐ při koncentraci 1 milionu buněk v 1 ml) se exponuje v horní komůrce. Po 2 h se přidá 60 nG/ml PDGF-BB nebo PDGF-AA (Upstate Biotechnology lne. Lake Placid, NY) do horní komůrky, doplní se 0,5 % fetálního telecího séra a 0,1 % hovězího sérového albuminu a testovaná sloučenina se přidá v koncentracích 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 a 0,03 μΜ. Pro měření migrace závislé na fíbronektinu se Transwellovy komůrky pokryjí fibronektinem v koncentraci 10 pg/ml po dobu 24 h při teplotě 4 °C (lidský buněčný fíbronektin, Upstate Biotechnology lne.). Po 24 h migrace se filtry odstraní, fixují v methanolu a obarví Mayerovým hematoxylinem a eozinem. Migrované buňky na horní straně filtrační membrány se stanoví počítáním určených sekčních políček na filtrech s pomocí světelného mikroskopu se 400-násobným zvětšením. Inhibice migrace se kvantifikuje procentem buněk ve srovnání s kontrolou. Aby se vyloučila možnost toxického působení, testuje se životnost buněk inkorporací 3H-thymidinu v DMEM, doplněného 10% fetálního telecího séra. Lze pozorovat inhibici migrace vyvolanou PDGF-AA a zejména PDGF-BB.

Pokusná zvířata: odkryjí se tepny aorty a karotidy krysích samců Wistar (získaných od Laboratory Animal Center of the University of Helsinki, Finsko). Krysy se anestezují intraperitonálně 240 mg/kg chloralhydrátu. Buprenorfm (Temgesic, Reckitt and Coleman, Hulí UK) se podává ke zmírnění operačních a pooperačních bolestí. O všechna zvířata se pečuje dodržováním zásad podle „Principles of Laboratory Animal Care“ a „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ vNIH/NIH Publication 86-23, revidováno 1985). Pro provedení odkiytí byly použity krysy o hmotnosti 200 až 300 g. Levá tepna karotidy se oddělí od endotelu intraluminálním embolektomickým katétrem 2F (Baxter Healthcare Corporation, Santa Ana, CA, 27). Aby se odstranil endotel, provlékne se katétr průsvitem třikrát (nafouknutý 0,2 ml vzduchu). Vnější karotida se po odstranění katétru podváže a rána se uzavře. Histologické změny se hodnotí srovnáním s řezy střední karotidy 4 dny po odkrytí. Torakální aorta se oddělí od endotelu s použitím arteriálního embolektomického katétru 2F Fogarty. Katétr, nafouknutý 0,2 ml vzduchu, se zasune do torakální tepny přes levou iliac tepnu a provlékne se průsvitem pětkrát, aby se odstranil endotel. Iliac tepna se potom podváže. Třikrát (3, 7 a 14 dní) se zvolí dny pro vyhodnocení histologických změn.

Ke kvantifikaci proliferujících buněk se použijí tři různé postupy pro značení buněk bromdesoxyuridinem (BrdU) po odkrytí krysí karotidy. V tomto modelu začíná proliferace buněk médiem 24 h po odkrytí; buňky intimy se objevují nejdříve po 72 až 96 h. Ke kvantifikaci proliferace buněk hladkého svalstva před výskytem buněk v intimě se podává 0,1 ml značkovacího činidla BrdU (ZYMED, San Francisco, CA) intravenózně v průběhu pooperační doby od 0 do 72 h po odkrytí (celkem 0,1 ml 6x). Ke kvantifikaci proliferace v průběhu počáteční vlny migrace se krysám podává 3x po 0,1 ml značkovacího činidla BrdU v intervalech po 8 h, po dobu 72 až 96 h po operaci. Ke kvantifikaci proliferace na konci počáteční vlny migrace se třetí skupině krys podává pulzující dávka 0,3 ml BrdU 3 h před usmrcením.

Histologické vzorky se fixují v 3% roztoku paraformaldehydu po dobu 4 h před uložením do parafínu. Morfologické změny se hodnotí z parafínových řezů barvených hematoxylin-eozinem podle Mayera. Počet buněk v různých řezech cév se počítá při zvětšení 400x. K identifikaci buněk v kultuře a buněk, které se objevují v neointimě v průběhu 4 dnů po poškození odkryt, se provede imunohistochemické obarvení acetonem fixovaným vzorků s použitím anti-a-aktinové protilátky, získané z buněk hladkého svalstva (Bio-Makor, Rehovot, Israel). Primární buňky hladkého svalstva se identifikují na acetonech fixovaných skleněných krysích sklíčkách stejnou barvicí metodou. Řezy se inkubují s primární protilátkou (zředění 1 : 2000), promyjí a inkubují postupně s peroxidázou konjugovaným Ig-králík-proti myši a Ig-koza-proti králíkovi, následuje promytí roztokem substrátu s chromogenem 3-amino-9-ethylkarbazolem a peroxidem vodíku.

-8CZ 298531 B6

Vzorky barvené BrdU se připraví z parafínových řezů s použitím primární myší protilátky (Bu20a, Dako, A/S, Dánsko) a Vectastain Elitě ABC-Kit (Vector Laboratories, Burliname, CA). Řezy se zbaví parafínu a ošetří v mikrovlnné troubě s 500 w (2x po 5 min v 0,1 M citrátovém pufru, pH 6), potom následuje působení 95% formamidem v 0,15 M citronanu sodném po dobu 45 min a při teplotě 70 °C. Zředění protilátek se provede podle pokynů výrobce. Řezy se obarví Mayerovým hematoxylin-eozinem a pozitivní buňky se počítají zvlášť pro intimu, médiu a adventicii.

V karotidě použitých zvířat lze nalézt signifikantní pokles počtu buněk hladkého svalstva. Adventicia a média vykazují signifikantní snížení počtu buněk. Jako důsledek působení adiční soli m ethansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I je patrný slabý pokles v absolutním počtu buněk značených BrdU, a to v intimě, médii a adventicii v průběhu prvních dvou period značení (0 - 72 až 72 - 96 h), a po 93 - 96 h pokles v počtu značených buněk je zřejmý ve všech částech. Snížení počtu buněk hladkého svalstva lze kromě toho najít u zvířat s odkrytou aortou.

Podle těchto nálezů může tedy adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I inhibovat proliferaci a zejména migraci buněk hladkého svalstva cév.

Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, zejména její β-krystalická forma, je tedy schopna inhibovat angiogenezi. To lze prokázat takto: komůrka obsahující 0,8 % agaru a2j/ml heparinu s růstovým faktorem nebo bez něho (VEGF 3 pg/ml, PDGF 1 pg/ml bFGF 0,3 pg/ml), se implantuje subkutánně normálním myším (C 57 Bl/6). Adiční sůl methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce 1 se podává perorálně v dávce vykazující dobrou protinádorovou aktivitu u nuda-myší v xenotransplantátovém modelu. Dávkování začíná jeden den před implantací komůrek. Komůrky se odstraní po 5 dnech. Angiogenetická účinnost se vyhodnocuje měřením vaskularizované tkáně, která vyrostla okolo implantátu a obsahu krve v této tkáni /externí krev/. Krev se stanoví měřením hemoglobinu. Ačkoliv cévy nevzrůstají do agaru, agar intenzivně zčervená, pokud se vyskytuje angiogenetický efekt. Když některá sloučenina inhibuje růst v krvi, který je vyvoláván růstovým faktorem, lze to pokládat za náznak toho, že tato sloučenina blokuje angiogenetický efekt příslušného růstového faktoru. Inhibice hmotnosti, nikoliv však objemu krve, působí na proliferaci fibroblastů. Potlačení kontrolní odpovědi podněcuje inhibici hojení ran. Perorální dávka 50 mg/kg jednou denně inhibuje angiogenetický efekt všech tří růstových faktorů (VEGF, PDFG, bFGF).

Není třeba se zmiňovat o tom, že všechny zmíněné inhibiční a farmakologické účinky má i volná báze 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-jV-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu nebo její další solil. Tento vynález se především týká β-krystalické formy adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I při léčení jedné ze zmíněných chorob nebo při přípravě farmakologického prostředku k jejímu léčení.

Antiproliferativní, zejména protinádorová aktivita adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I in vivo, je například popsána při léčení nádorů závislých na alb, v Nátuře Med. 2, 561 až 566, 1996).

Vynález se rovněž týká způsobu léčení teplokrevných živočichů, kteří trpí uvedenými onemocněními, především nádorovým onemocněním, při němž množství β-krystalické formy adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I, jež je účinné proti tomuto onemocnění, zejména množství s antiproliferatívním a zejména nádory inhibujícím účinkem, se podává teplokrevnímu živočichovi, pokud takové léčení potřebuje. Vynález se navíc týká použití β-krystalické formy adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I k inhibici výše zmíněné tyrozin-kinázy, zejména kinázy receptoru PDGF, v-alb-kinázy a/nebo kinázy c-kit receptoru, nebo pro přípravu farmaceutických kompozic k použití při léčení lidského nebo zvířecího těla, zejména při léčení nádorů, jako jsou gliomy, nádory vaječníků, nádory prostaty, nádory tlustého střeva a nádory plic, zejména karcinom malých plicních buněk a nádorů prsu a jiných gynekolo-9CZ 298531 B6 gických nádorů. V závislosti na druhu, věku, individuálním stavu, způsobu podávání a daném klinickém obrazu, se účinné dávky, například denní dávky v rozmezí od 1 do 2500 mg, s výhodou od 1 do 1000 mg, obzvláště od 5 do 500 mg, podávají teplokrevným živočichům s tělesnou hmotností asi 70 kg.

Vynález se týká též farmaceutických přípravků, které obsahují účinné množství, zejména množství účinné při prevenci nebo léčení některého ze jmenovaných onemocnění, adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I v β-krystalické formě, zároveň s farmaceuticky přijatelnými nosiči, které jsou vhodné pro topické či enterální, například perorální nebo rektální nebo parenterální podávání a mohou to být látky anorganické nebo organické a tuhé nebo kapalné. Pro perorální podávání se především používají tablety nebo želatinové tobolky, které obsahují účinnou substanci spolu se zřeďovadly, jako je například laktóza, dextróza, sacharóza, mannitol, sorbitol, celulóza a/nebo glycerol a/nebo klouzadla, například oxid křemičitý, mastek, stearová kyselina nebo její soli, zejména stearan hořečnatý nebo vápenatý, a/nebo polyethylenglykol. Tablety mohou kromě toho obsahovat pojivá, například křemičitan hořečnato-hlinitý, škroby, ponejvíce škrob kukuřičný, pšeničný nebo rýžový, želatinu, methylcelulózu, sodnou sůl karboxymethylcelulózy a/nebo polyvinylpyrrolidon, a pokud je to žádoucí i rozvolňovadla, například škroby, agar, algovou kyselinu nebo její sůl, zejména alginát sodný a/nebo šumivé směsi nebo adsorbenty, barviva, aromatické látky a sladidla. Farmakologicky účinné sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být dále používány ve formě přípravků pro parenterální podávání nebo ve formě infuzních roztoků. Takové roztoky jsou s výhodou izotonické vodné roztoky nebo suspenze, které se mohou připravovat před podáváním, například v případě lyofilizovaných přípravků, které obsahují účinnou substanci buď samotnou nebo spolu s nosičem, například mannitolem. Farmaceutické substance mohou být sterilizovány a/nebo mohou obsahovat excipienty, například konzervační látky, stabilizátory, smáčedla a/nebo emulgační činidla, solubilizační činidla, soli k regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jmenované farmaceutické přípravky, které, pokud je to žádoucí, mohou obsahovat další farmakologicky účinné látky jako antibiotika se připravují známým způsobem, například běžným mícháním, granulaci, potahováním, rozpouštěním nebo lyofilizací a obsahují asi od 1 % do 100 %, zejména asi od 1 % do 20 %, jedné účinné substance nebo více účinných substancí.

V souladu s výše uvedeným je předmětem vynálezu krystalická forma adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou, která na rentgenovém difrakčním diagramu vykazuje pík v úhlu refrakce 2theta 20°, přičemž uvedený pík vykazuje v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu relativní intenzitu linie činící 65 %.

Dalším provedením vynálezu je krystalická forma monomethansulfonátové adiční soli sloučeniny vzorce I, která na rentgenovém difrakčním diagramu vykazuje píky u následujících úhlů refrakce 2theta: 9,7°, přičemž uvedený pík vykazuje v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu relativní intenzitu linie činící 40 % a 20,0° 2theta, přičemž uvedený pík vykazuje v porovnání s nejintenzivnější linií diagramu relativní intenzitu linie činící 65 %.

Výhodná je výše uvedená krystalická forma, která na rentgenovém difrakčním diagramu vykazuje linie s relativní intenzitou linie činící, v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu, 20 % či více u následujících úhlů refrakce 2theta: 9,7°, 13,9°, 14,7°, 17,5°, 18,2°, 20,0°, 20,6°, 21,1°, 22,1°, 22,7°, 23,8°, 29,8° a 30,8°.

Výhodnější je výše uvedená krystalická forma, která vykazuje tepotu tání ve výši 217 °C, definovanou jako počátek tání na diferenciálním skenovacím kalorimetrickém termogramu, a která v podstatě vykazuje rentgenový difrakční diagram zobrazený na obr. 2, kde je úhel refrakce 2theta vynesen na horizontální ose a relativní intenzita linie na vertikální ose, přičemž výraz „v podstatě“ znamená, že musí být přitom alespoň hlavní linie diagramu zobrazeného na obr. 2, tj· ty, jejichž relativní intenzita linie činí, v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu, více než 20 %.

-10CZ 298531 B6

Dalším provedení vynálezu je výše uvedená krystalická forma, která je ve skleněné klimatické komoře při 25 °C a relativní vlhkosti až 93 % včetně nehygroskopická.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutická kompozice obsahující výše uvedenou krystalickou formu adiční soli sloučeniny vzorce 1 s kyselinou methansulionovou a farmaceuticky přijatelný nosič.

Jiným provedením vynálezu je adiční sůl sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou v krystalické formě, která obsahuje alespoň 90 % hmotn., výhodně alespoň 95 % hmotn., a ještě výhodněji alespoň 99 % hmotn., krystalů výše uvedené krystalické formy a zůstává suchá při 93% relativní vlhkosti a 25 °C. Výhodná je jedna z těchto adičních solí, která dále vykazuje teplotu tání nižší než 225 °C, s výhodou nižší než 217 °C, definovanou jako počátek tání na diferenciálním skenovacím kalorimetrickém termogramu.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy výše uvedené krystalické formy adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou zahrnující stupně, při nichž se

a) digeruje jiná krystalická forma nebo amorfní výchozí materiál adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou pomocí vhodného polárního rozpouštědla v suspenzi při teplotě mezi 20 a 50 °C, nebo se

b) jiná krystalická forma nebo amorfní výchozí materiál adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou rozpustí v polárním rozpouštědle při vhodné teplotě činící od 25 °C až po teplotu varu reakční směsi pod zpětným chladičem a poté se vyvolá krystalizace přidáním malého množství beta krystalové formy jako očkovacího krystalu při teplotě pohybující se mezi 20 a 70 °C.

Dále je předmětem vynálezu použití výše uvedených krystalických forem adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou k přípravě léčiva pro ošetřování nádorového onemocnění.

Předmětem vynálezu je rovněž krystalická forma monomethansulfonátové adiční soli sloučeniny vzorce I, která se vyznačuje přítomností píku označeného (1) na rentgenovém difrakčním diagramu zobrazeném na obr. 1. Výhodně tato krystalická forma v podstatě vykazuje rentgenový difrakční diagram zobrazený na obr. 1, přičemž výraz „v podstatě“ znamená, že musí být přítomny alespoň hlavní linie diagramu zobrazeného na obr. 1, tj. ty, jejichž relativní intenzita linie činí, v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu, více než 20 %. Výhodně má tato krystalická forma jehlicovité krystaly. Tato krystalická forma výhodně vykazuje teplotu tání ve výši 226 °C, definovanou jako počátek tání na diferenciálním skenovacím kalorimetrickém termogramu.

Předmětem vynálezu je rovněž krystalická forma monomethansulfonové adiční soli sloučeniny vzorce I, která je ve skleněné klimatické komoře při 25 °C a relativní vlhkosti až 93 % včetně nehygroskopická.

Následující příklady provedení vynálezu ilustrují, aniž by omezovaly jeho rozsah. Hodnoty Rf se zjišťují na deskách TLC potažených silikagelem (Měrek, Darmstadt, Německo). Vzájemný poměr rozpouštědel v použitých systémech rozpouštědel je vyjádřen objemově (obj./obj.) a teploty jsou udávány ve stupních Celsia (°C).

- 11 CZ 298531 B6

Příklady provedení vynálezu

Eluenty (gradienty)

Gradient HPLC:

% b) v a) po dobu 20 min, potom 0 % —> 30 % b) v a) po dobu 10 min, potom 30 % b) v a) po dobu 10 min, potom 30 % b) v a) po dobu 5 min.

Eiuent a): iontově párové činidlo a methanol (420 ml a 580 ml)

Eluent b): iontově párové činidlo a methanol (40 ml a 960 ml).

Iontově párové činidlo: 7,5 g 1-oktansulfonové kyseliny rozpuštěné asi v 800 ml vody, hodnota pH nastavena na 2,5 fosforečnou kyselinou, zředěno vodou do 1000 ml.

Sloupec: 150 x 3,9 mm, plněný Symmetry Cl8 5 μ (Waters), předem ekvilibrovaný eluent a).

Rychlost průtoku 1,2 ml/mi, UV detekce při 267 nm.

Příklad 1

Příprava β-krystalické formy methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-/V-[methyl3-/4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu - varianta 1

Suspenze obsahující 11 % (hmotn./hmotn.) methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-jV-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl)]benzamidu v a-krystalické formě se digeruje v methanolu po dobu dvou dnů při teplotě okolo 25 °C. Krystaly se izolují filtrací na skleněném filtru s fritou G4 a suší přes noc při teplotě místnosti na filtračním papíře. Teplota tání (s DSC): 217 °C (začátek tání).

Výchozí materiál, methansulfonan 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-jV-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamid, se připraví takto: 98,6 g (0,2 mol) volného 4(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-/V-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu (příprava viz například EP-A-0 564 409) se dá do 1,4 litru ethanolu. Ktéto béžové suspenzi se přikapává po dobu 20 min 19,2 g (0,2 mol) methansulfonové kyseliny. Roztok se vaří pod zpětným chladičem po dobu 20 min a potom čiře zfiltruje při teplotě 65 °C. Filtrát se odpaří na 50 % a odparek se odfiltruje při teplotě 25 °C (filtrovaný materiál A). Matečný louh se odpaří do sucha. Tento odparek a filtrovaný materiál A se suspendují ve 2,2 litru ethanolu a rozpustí za varu pod zpětným chladičem za přídavku 30 ml voda. Ochlazením přes noc na teplotu 25 °C, filtrací a sušením při teplotě 65 °C do konstantní hmotnosti se získá 4-(4-methylpiperazin-lylmethyl)-/V-[4-methyl-3-4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino/fenyl]benzamid v podobě světle béžového krystalického methansulfonátu (α-krystalické formy).

Příklad 2

Příprava β-krystalické formy methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-.V-[4methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu - varianta 2

50,0 g (100 mmol) 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-V-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu se suspenduje ve 480 ml methanolu. Přidá se 9,71 g (101 mmol) kyseliny methansulfonové a 20 ml methanolu, zahřeje se na teplotu 50 °C, přidá se 5,0 g aktivní

-12CZ 298531 B6 ho uhlí a tato směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 30 min, zfiltruje se a koncentruje odpařením. Odparek se rozpustí ve 150 ml methanolu a naočkuje methansulfonanem 4-(4methylpiperazin-l-ylmethyl)-7V-[4-methyl-3-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu (β-beta-modifikací, několik mg), což vyvolá krystalizaci produktu. Sušením za tlaku 0,5 kPa a teploty 60 °C se získá β-modifíkace methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-lylmethyl)-jV-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-3-ylamino)fenyl]benzamidu; Rf = 0,58 (methylenchlorid : ethylacetát: methanol : koncentrovaný vodný roztok hydroxidu amonného = 60 : 10 : 30 : 2); HPLC t_ret = 10,2 min.

Příklad 3

Příprava β-krystalické formy methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-A-[4methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-3-ylamino)fenyl]benzamidu-varianta3

670 g (1136 mmol) α-modifikace methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-V-[4methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-3-ylamino)fenyl]benzamidu se zahřeje v 1680 ml methanolu. Roztok se při teplotě 60 °C naočkuje 5 mg β-modifíkace methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-jV-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-3-ylamino)fenyl]benzamidu, načež produkt začne krystalovat. Sušením za tlaku 0,5 kPa a teplotě 100 °C se získá βmodifíkace methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-jV-[4-methyl-3-(4-pyridin-3yl)pyrimidin-3-yiamino)fenyl]benzamidu; R_f = 0,58 (methylenchlorid : ethylacetát : methanol : koncentrovaný vodný roztok hydroxidu amonného = 60 : 10:30:2); HPLC: t_ret = 10,2 min.)

Příklad 4

Tablety s obsahem β-krystalické formy methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-7V[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-3-yl)pyrimidin-3-ylamino)fenyl]benzamidu

Tablety, které obsahují 100 mg účinné substance uvedené v titulu, se obvykle připravují ve formě následující kompozice:

Účinná složka Krystalická laktóza Avicel	100 mg 240 mg 80 mg
PVPPXL	20 mg
Aerosil	2 mg
Stearan hořečnatý	5 mg 447 mg

Příprava: účinná složka se smíchá s nosným materiálem a vylisuje na tabletovacím stroji (Korsch EKO, průměr razidla 10 mm). Avicel je mikrokrystalická celulóza (FMC, Philadelphia, USA). PVPPXL je polyvinylpolypyrrolidon příčně vázaný (BASF, Německo). Aerosil je oxid křemičitý (Degussa, Německo).

-13 CZ 298531 B6

Příklad 5

Tobolky s obsahem β-krystalické formy methansulfonanu 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)jV-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-3-ylamino)fenyl]benzamidu

Tobolky, které obsahují 100 mg sloučeniny uvedené v titulu jako účinná složka, se obvykle připravují ve formě následující kompozice:

Účinná složka 100mg

Avicel 200mg

PVPPXL 15mg

Aerosil 2mg

Stearan hořečnatý 1,5 mg

318,5 mg

Tobolky se připraví smícháním složek a plnění směsi do tvrdých želatinových tobolek velikosti 1.

Průmyslová využitelnost

Nová β-krystalická forma adiční soli methanosulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I je snadno dostupná z amorfního výchozího materiálu nebo z α-krystalické formy. Pro své výhodné fyzikální vlastnosti je tato nová krystalická forma vhodná pro technicky jednoduchou a provozně nenáročnou výrobu farmaceutických přípravků, které jsou použitelné pro diagnostické a terapeutické účely, například pro prevenci nebo léčbu různých nádorových onemocnění.

Vynález je ilustrován následujícími výkresy na obr. 1/3 až 3/3.

Na obr. 1/3 je znázorněn rtg. difrakční diagram α-krystalické formy adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I. Na obr. 2/3 je znázorněn rtg. difrakční diagram β-krystalické formy adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce I. Na obr. 3/3 jsou nahoře zobrazeny krystaly α-krystalické formy a dole krystaly β-krystalické formy 4-(4-methylpiperazin-l-ylmethyl)-A^ř-[4-methyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]benzamidu (=adiční soli methansulfonové kyseliny se sloučeninou vzorce 1).

Na obou diagramech je úhel refrakce 2theta zakreslen na horizontální ose (oxa x) a relativní intenzita linie (intenzita vrcholu korigovaná pozadím) na vertikální ose (osa y). Diagramy se získají takto: nejprve se rtg. difrakční diagram zachytí na film s použitím Guinierovy kamery (Enraf-Nonius model FR 552) s Guinierrovým filmem 258-94C a výboje mezi měděnými elektrodami (záření Kal, vlnové délka λ = 1, 54Ο6’¹⁰ m). Optická hustota linií na filmuje úměrná intenzitě světla. Film se potom skenuje s použitím řádkovacího skeneru (LS 18, Johansson, Taby, Švédsko), se software SCANPI.

Podle obr. 2/3 jsou linie, které mají relativní intenzitu 20 nebo více u následujících úhlů refrakce 2thera (relativní intenzity linií jsou uvedeny v závorkách): 9,71 (40), 13,9° (26), 14,7° (23), 17,5° (57), 18,2° (90), 20,0° (65), 20,6° (76), 21,1° (100), 22,1° (89), 22,7° (38), 23,8° (44), 29,8° 23 a 30,8° (20). Skutečnost, že na obr. 2/3 se relativní intenzita linie při 30,8° zdá být vyšší než při 29,8°, je způsobena další linií při 31,0°, která má relativní intenzitu linie 13.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Krystalická forma adiční soli sloučeniny vzorce I (I) s kyselinou methansulfonovou, která na rentgenovém difrakčním diagramu vykazuje pík u úhlu refrakce 2theta 20°, přičemž uvedený pík vykazuje v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu relativní intenzitu linie činící 65 %.

2. Krystalická forma monomethansulfonátové adiční soli sloučeniny vzorce I uvedeného v nároku 1, která na rentgenové difrakční diagram vykazuje píky u následujících úhlů refrakce 2theta: 9,7°, přičemž uvedený pík vykazuje v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu relativní intenzitu linie činící 40 % a 20,0° 2theta, přičemž uvedený pík vykazuje v porovnání s nejintenzivnější linií diagramu relativní intenzitu linie činící 65 %.

3. Krystalická forma podle nároku 2, která na rentgenovém difrakčním diagramu vykazuje linie s relativní intenzitou linie činící, v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu, 20 % činí více u následujících úhlů refrakce 2theta: 9,7°, 13,9°, 14,7°, 17,5°, 18,2°, 20,0°, 20,6°, 21,1°, 22,1°, 22,7°, 23,8°, 29,8° a 30,8°.

4. Krystalická forma podle nároku 1, 2 nebo 3, která vykazuje teplotu tání ve výši 217 °C, definovanou jako počátek tání na diferenciálním skenovacím kalorimetrickém termogramu, a která v podstatě vykazuje rentgenový difrakční diagram zobrazený na obr. 2, kde je úhel refrakce 2theta vynesen na horizontální ose a relativní intenzita linie na vertikální ose, přičemž výraz „v podstatě“ znamená, že musí být přítomny alespoň hlavní linie diagramu zobrazeného na obr. 2, tj. ty, jejichž relativní intenzita linie činí, v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu, více než 20 %.

5. Krystalická forma podle libovolného z nároků 1 až 4, která je ve skleněné klimatické komoře při 25 °C a relativní vlhkosti až 93 % včetně nehygroskopická.

6. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje krystalickou formu adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou podle libovolného z nároků 1 až 5 a farmaceuticky přijatelný nosič.

7. Adiční sůl sloučeniny vzorce I uvedeného v nároku 1 s kyselinou methansulfonovou v krystalické formě, která obsahuje alespoň 90 % hmotn. krystalů krystalické formy podle libovolného z nároků 1 až 5 a zůstává suchá při 93 % relativní vlhkosti a 25 °C.

8. Adiční sůl sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou v krystalické formě podle nároku 7, která obsahuje alespoň 95 % hmotn. krystalů krystalické formy podle libovolného z nároků 1 až 5 a zůstává suchá při 93% relativní vlhkosti a 25 °C.

- 15CZ 298531 B6

9. Adiční sůl sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou v krystalické formě podle nároku 8, která obsahuje alespoň 99 % hmotn. krystalů krystalické formy podle libovolného z nároků 1 až 5 a zůstává suchá při 93% relativní vlhkosti a 25 °C.

10. Adiční sůl sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou v krystalické formě podle libovolného z nároků 7 až 9, která obsahuje alespoň 99 % hmotn. krystalů krystalické formy podle libovolného z nároků 1 až 5 a vykazuje teplotu tání nižší než 225 °C.

11. Adiční sůl sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou v krystalické formě podle nároku 10, která obsahuje alespoň 99% hmotn. krystalů krystalické formy podle libovolného z nároků 1 až 5 a vykazuje teplotu tání nižší než 217 °C, definovanou jako počátek tání na diferenciálním skenovacím kalorimetrickém termogramu.

12. Způsob přípravy krystalické formy adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou podle libovolného z nároků laž5, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně, při nichž se

b) jiná krystalická forma nebo amorfní výchozí materiál adiční soli sloučeniny vzorce 1 s kyselinou methansulfonovou rozpustí v polárním rozpouštědle při vhodné teplotě činící od 25 °C až po teplotu varu reakční směsi pod zpětným chladičem a poté se vyvolá krystalizace přidáním malého množství beta krystalové formy jako očkovacího krystalu při teplotě pohybující se mezi 20 a 70 °C.

13. Použití krystalických forem adiční soli sloučeniny vzorce I s kyselinou methansulfonovou podle libovolného z nároků 1 až 11 k přípravě léčiva pro ošetřování nádorového onemocnění.

14. Krystalická forma monomethansulfonátové adiční soli sloučeniny vzorce I (I), která se vyznačuje přítomností píku označeného (1) na rentgenovém difrakčním diagramu zobrazeném na obr. 1.

15. Krystalická forma podle nároku 14, která v podstatě vykazuje rentgenový difrakční diagram zobrazený na obr. 1, přičemž výraz „v podstatě“ znamená, že musí být přítomny alespoň hlavní linie diagramu zobrazeného na obr. 1, tj. ty, jejichž relativní intenzita linie činí, v porovnání s nej intenzivnější linií diagramu, více než 20 %.

16. Krystalická forma podle nároku 14 nebo 15, která má jehlicovité krystaly.

-16CZ 298531 B6

17. Krystalická forma podle libovolného z nároků 14 až 16, která vykazuje teplotu tání ve výši

226 °C, definovanou jako počátek tání na diferenciálním skenovacím kalorimetrickém termogramu.

5 18. Krystalická forma monomethansulfonové adiční soli sloučeniny vzorce I ve kterém je ve skleněné klimatické komoře při 25 °C a relativní vlhkosti až 93 % včetně nehygroskopická.