ITMI992711A1 - Composti organici - Google Patents

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ITMI992711A1 IT1999MI002711A ITMI992711A ITMI992711A1 IT MI992711 A1 ITMI992711 A1 IT MI992711A1 IT 1999MI002711 A IT1999MI002711 A IT 1999MI002711A IT MI992711 A ITMI992711 A IT MI992711A IT MI992711 A1 ITMI992711 A1 IT MI992711A1
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Description

La presente invenzione riguarda combinazioni di un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore con un composto organico in grado dì legarsi ad una al-glicoproteina acida (AGP), e riguarda anche preparati farmaceutici e/o terapie, in relazione a malattie che rispondono ad una inibizione della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore. In particolare l'invenzione riguarda prodotti oppure combinazioni che contengono un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore con un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida (AGP), in combinazione fissa oppure per una somministrazione distribuita nel tempo oppure contemporanea, e riguarda l'impiego combinato di due classi di composti o in combinazione fissa oppure per una somministrazione distribuita nel tempo oppure contemporanea, per il trattamento di malattie proliferative, in particolare malattie tumorali, in modo specifico quelle che possono venire trattate mediante inibizione della attività della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore.
Base dell'Invenzione
Sono noti numerosi composti che inibiscono la proliferazione di cellule mediante inibizione della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore Per esempiof la Domanda di Brevetto Internazionale No. WO 97/02266, la Domanda di Brevetto Internazionale No. WO 98/35958 e in modo particolare la Domanda di Brevetto Europeo EP 0.564.409-A, e anche la Domanda Internazionale No. WO 99/03854, che vengono qui incorporati tutti come riferimento, citano composti che sono inibitori di almeno una delle tirosina-chinasi citate sopra. Ulteriori composti che sono interessanti sono Tyrphostìn AG957 (vedere Kaur et al., Anticancer Drugs _5, 213-222 (1994), Herbimycin A (Okabe e Uehara, Leukemia and Lymphoma 12, 2156-2162 (1994), Blood 80, 1330-1338 (1994) and Leuk. Res. _18, 213-220 (1994), e anche Rioran et al., Oncogene 1_6, 133-1542 (1998)); Tyrphostins AG 1295, AG 1296 (vedere Kovalenko et al., Cancer Res. 54, 6106-6114 (1994); Lipson 'et al., Pharmacol & Exp-Therap. 285, 844-852 (1998); Krystal et al., Cancer Res. 57, 2203-2208 (1997)); SU 101 (Leflunomide) , e anche come suo metabolita (vedere· Shawer et al., Clin. Cancer Res. 3, 1167-1177 (1997), Mattar et al-, FEBS Lett. 334, 161-164 (1993), Cherwinskyi et al., Inflanuti. Res.3, 1167-1177 (1997), e Strawn et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 533-573 (1998)); e Piridopirimidine (vedere per esempio Hamby et al., J. Med. Chem. 4_0, 2296-2303 (1997); Dahring et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 281, 1446-1456 (1997); Klutcho et ao, Life Sci. 62, 143-150 (1998); Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444; Boschelli et al., J. Med. Chem. 41, 4^65-4377 (1998)). Tutte le citazioni riportate sopra vengono qui incorporate come riferimento.
Si è dimostrato che questi composti, come descritti nelle domande di brevetto citate sopra e in altre pubblicazioni, a causa di questa capacità sono efficaci nella profilassi e in particolare nel trattamento di malattie che vengono provocate da una deregolazione della fosforilazione e/o dell’attività delle tirosina-chinasi appena citate.
La fosforilazione di proteine è nota da lungo tempo come stadio essenziale nella differenziazione e nella divisione delle cellule. La fosforilazione viene catalizzata dalle proteina-chinasi suddivise in serina/treonina-chinasi e tirosina-chinasi. Le tirosina-chinasi comprendono una tirosina-chinasi del recettore di PDGF {fattore di crescita derivato dalle piastrine = PDGF-R-TK, abl-tirosina-chinasi (abl) ; e tirosina-c<'>ninasi del kit-recettore (kit-R-TK). Quando queste tirosina-chinasi vengono deregolate, per esempio mediante mutazione oppure mediante attivazione tramite fattori esterni, per esempio composti (composti naturali interni, come PDGF, oppure composti esterni) che si legano ad esse, il risultato tra l'altro è una deregolazione della crescita di cellule.
Il PDGF {fattore di crescita derivato dalle piastrine) è un fattore di crescita che è presente molto spesso, che ha un ruolo importante sia nella crescita normale che nella proliferazione cellulare patologica come nella carcinogenesi e nei disturbi delle cellule della muscolatura liscia dei vasi sanguigni, per esempio nella aterosclerosi e nella trombosi. La sua inibizione può venire misurata in analogia al procedimento descritto in EP 0.564.409 citato sopra (vedere anche E. Andrejauskas-Buchdunger e U. Regenass in Cancer Research 52, 5353-5358 (1992)).
L'inibizione della abl-chinasi, per esempio v-abl-tirosina-chinasi viene determinata secondo i metodi di N. Lydon et al., Oncogene Research 5, 161-173 (1990) e J. F. Geissler et al., Cancer Research 52, 4492-4498 (1992). In questi metodi come substrati si usano [Val<5>]-angiotensina II e [γ-<32>Ρ]-ΑΤΡ.
L'inibizione delia tirosina-chinasi del kit-recettore può venire misurata per esempio sotto forma di un saggio di c-Kit-chinasi in vitro:
Il saggio di c-Kit-chinasi in vitro viene effettuato in piastre da 96 pozzetti come saggio di legame su filtro, impiegando il dominio della c-Kit-chinasi fuso con GST ricombinante (glutatione-S-trasferasi ) espresso in baculovirus e purificato su glutationesefarosio. La proteina di fusione di GST viene fatta incubare in condizioni ottimali in presenza oppure in assenza di un farmaco e si misura l'inibizione della chinasi rivelando la diminuzione nella fosforilazione del poly (GluTyr ) (4:1) peptide P-275. Si usa gamma- [<33>P-ATP ] come donatore di fosfato. Come alternativa è possibile usare un saggio cellulare per c-Kit: Cellule che iperesprimono C-Kit vengono raccolte dal siero e vengono fatte incubare per 90 minuti a 37°C con un farmaco prima della stimolazione con un fattore di cellule staminali umane ricombinanti. Quantità uguali di proteina proveniente dai lisati di cellule vengono analizzate per la inibizione della fosforilazione di c-Kit mediante Western blotting impiegando anticorpi anti-fosfotirosina .
A causa delle proprietà descritte, i composti che presentano una inibizione di una delle tirosina-chinasi citate sopra possono venire usati come sostanze terapeutiche, in particolare per il trattamento di malattie prolif erative, come cancro, in particolare tumori e leucemie.
D'altra parte i composti possono venire usati non soltanto come ingredienti attivi di inibizione dei tumori ma anche come farmaci contro malattie proliferative non maligne, per esempio aterosclerosi, trombosi, psoriasi, sclerodermiti e fibrosi. Essi sono adatti anche per le ulteriori applicazioni citate sopra come C-modulatori di proteina-chinasi e possono venire usati in particolare nel trattamento di malattie che rispondono alla inibizione della chinasi del PDGF-recettore .
Un inibitore della tirosina-chinasi come descritto sopra inibisce anche BCR-àbl-chinasi (vedere Nature Medicine 2, 561-566 (1996)) e così è adatto per il trattamento di malattie cancerose e tumorali BCR-abl-positive come leucenpe (in particolare leucemia mieloide cronica e leucemia linfoblastica acuta, in cui si trovano in particolare meccanismi apoptotici di azione), e presenta inoltre effetti sul sottogruppo delle cellule staminali leucemiche e anche come sostanza potenziale <■ >per la purificazione di queste cellule in vitro dopo allontanamento di dette cellule (per esempio allontanamento del midollo osseo) e reimpianto delle cellule una volta che esse sono state ripulite da cellule cancerose (per esempio reimpianto di cellule di midollo osseo purificate).
Inoltre, un inibitore di tirosina-chinasi come descritto sopra può presentare effetti utili nel trattamento di disturbi che derivano come risultato di un trapianto, per esempio un allo-trapìanto, in particolare un rigetto di tessuto, come per esempio in particolare bronchiolite obliterativa (OB), ossia un rigetto cronico di trapianti allogenici del polmone. Contrariamente a pazienti senza OB, quelli che presentano OB spesso presentano una elevata concentrazione di PDGF in fluidi di lavaggio degli alveoli bronchiali. Gli inibitori della tirosinachinasi possono essere efficaci in malattie associate con la migrazione e la proliferazione di cellule della muscolatura liscia vascolare (in cui PDGF e PDGF-R spesso hanno anche un ruolo), come restenosi e aterosclerosi. Essi possono essere in grado anche di inibire 1’angiogenesi.
Tutti questi impieghi vengono descritti dettagliatamente in EP 0.564.409, WO 97/02266, WO 99/03854 e WO 98/35958, oppure nelle altre citazioni riportate sopra.
Un esempio di un composto che presenta una attività inibitrice sulle tirosina-chinasi citate sopra è il composto denominato 4- {4-metilpiperazin-1-ilmetil) -N- [4-metil-3- (4-piridin-3-il)pirimidin-2-ilammino) fenil )benzammide, che viene descritto in EP 0.564.409 e, sotto forma. del sale metansolfonato (qui di seguito STI571), preferibilmente nella forma di cristalli β, viene descritto in WO 99/03854.
Questo composto è un inibitore potente di bcr/abl, una proteina di fusione oncogenica che provoca la leucemia mieloide cronica (CML). Tuttavia si è osservato in prove cliniche in atto che i pazienti affetti da CML in crisi respiratoria e pazienti Ph+-ALL con recidiva presentano soltanto risposte temporanee nei confronti di STI571, dopodiché in un breve periodo di tempo è seguito lo sviluppo della resistenza.
La Richiedente in precedenza ha dimostrato che questo composto può curare topi iniettati con cellule leucemiche BCR/ABL+ umane se si mantiene una continua inibizione della attività di chinasi di bcr/abl. Questo modello è stato usato per studiare il possibile sviluppo della resistenza nei confronti di STI571. Quando sono stati trattati animali che portano tumor-i grandi {con un peso maggiore ςϋ 400 mg), si è osservata una riduzione del tumore in tutti gli animali, con la scomparsa del tumore in alcuni. Tuttavia nessun animale era guarito, animali con recidive non rispondono ad un ulteriore 'trattamento e l'attività di bcr/abl-chinasi non è stata inibita da STI571 somministrata in vivo, sebbene si fossero ottenute concentrazioni attive nel plasma (circa 10 μΜ) Tumori sono stati recisi da animali resistenti, con recidiva, sono stati posti in coltura e sono stati esaminati entro 24 ore per la sensibilità in vitro.
5/5 tumori esaminati hanno presentato una CI50 (0,1-0,3 μΜ) non differente in modo significativo da quella della linea KU812 parentale.
La resistenza può svilupparsi come risultato di parecchi fattori che operano o a livello cellulare oppure soltanto in vivo. Una resistenza ai farmaci, per esempio, può svilupparsi come risultato di una mutazione/amplificazione del gene bersaglio, di una induzione di metabolismo,* e in modo paradossale di una aumentata degradazione di traduzione della proteina bersaglio e di fattori simili.
Sorprendentemente, si è trovato che i dati farmacocinetici indicano che gli animali con recidive hanno raggiunto concentrazioni di picco simili a quelle dei controlli/ però essi presentavano una diminuzione significativamente più lenta nelle concentrazioni di STI571 col passare del tempo. La Richiedente ha ora trovato che ciò è dovuto alla presenza di un fattore di legame nel plasma di animali che hanno avuto recidive, in grado di far diminuire la distribuzione nei tessuti e la depurazione di STI571. In vitro si sono esaminate numerose proteine per la loro capacità di inibire l’attività biologica di STI571. Mentre l'albumina non influisce sulla inibizione da parte di STI571 della proliferazione di KU812, la αΐ-glicoproteina acida (AGP) in effetti influisce in corrispondenza di concentrazioni fisiologiche facendo aumentare il valore CI50 per STI571 fino a 90 volte. AGP inibisce inoltre l’effetto di STI571 sulla fosforilazione bcr/abl in vitro. Si calcola che la costante di associazione (Ka) per il legame specifico con STI571 e si trova che essa è 60 volte più elevata in AGP che in albumina. I livelli di AGP vengono misurati nei topi mediante un immunosaggio. Si trova una forte correlazione tra il peso del tumore e le concentrazioni di AGP. Inoltre, un pre-trattamento con STI571 in vivo fa aumentare anche i livelli di AGP nel plasma. Pertanto, animali preventivamente trattati con STI571 e quindi iniettati con cellule KU812 trattati con STI571 nelle 24 ore successive/ rispondono meno al trattamento rispetto a controlli (animali guariti 8/16 rispetto a 16/16, p<0,01). Questi risultati suggeriscono che un aumento nei livelli di AGP o indotti dal tumore oppure dal trattamento stesso sono responsabili dello sviluppo della resistenza nei confronti di STI571.
La presente invenzione ha il compito di mettere a disposizione un metodo per superare la resistenza che si sviluppa in animali a sangue caldo se durante il trattamento di una malattia come indicata sopra si applica STI571 oppure uno qualsiasi di altri inibitori delle tirosina-chinasi citate sopra.
Il risultato sorprendente consiste nel fatto che la resistenza contro un inibitore delle -tirosinachinasi, in particolare STI571 può essere dovuta ad un legame di AGP e così concentrazioni inferiori del farmaco attivo libero nel plasma del sangue costituiscono una base della ricerca per una soluzione, per esempio inibendo una molecola regolatrice, per esempio una proteina regolatrice, consentendo l’attivazione della trascrizione del gene AGP, mediante interruzione dell’amplificazione del gene AGP, mediante inibizione della trascrizione genetica del mRNA che codifica AGP, mediante inibizione della traduzione del mRNA nella proteina matura, influendo sulla sua distribuzione nella glicoproteina finale, inibendo la sua secrezione nel plasma sanguigno, per mezzo di un dosaggio maggiore dell<1 >inibitore della tirosina-chinasi , mediante neutralizzazione di AGP per esempio con anticorpi, mediante attivazione del metabolismo oppure eliminazione dal plasma, mediante attivazione della degradazione post-traduzione di AGP oppure di suoi precursori, e simili.
Inaspettatamente, in base a riferimenti che hanno indicato che vi è un dubbio sulla relazione dello spostamento di farmaci durante una terapia combinata con farmaci (vedere per esempio Kremer et al., Pharmacological Rev. ^0(1), 1-471988)), si è trovato ora che è possibile, superare questo tipo di resistenza, combinando uno o più composti che legano AGP con un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore
Pertanto, la presente invenzione consente un importante miglioramento nella terapia di pazienti che presentano una delle malattie citate nella presente descrizione.
Riassunto dell'invenzione
Questa invenzione riguarda una combinazione di (a) un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore (componente (a)} e di (b) un composto organico in grado di legarsi alla al-glicoproteina acida (AGP) (componente (b)), e riguarda anche preparati farmaceutici e/o terapie, in relazione a stati di malattie che rispondono ad una inibizione della abl- tiros ina-chinas i del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore. In particolare, questa invenzione riguarda prodotti oppure combinazioni che contengono (a) un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o dpi Kit-recettore e (b) un composto organico in grado di legarsi ad una al-glicoproteina acida (AGP) , o in combinazione stabilita oppure per una somministrazione distribuita nel tempo oppure contemporanea, e l’impiego combinato di due classi di composti, o in combinazione stabilita oppure per una somministrazipne distribuita nel tempo oppure contemporanea, per il trattamento di malattie proliferative, in particolare malattie tumorali, in particolare quelle che possono venire trattate mediante inibizione dell'attività della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore.
Descrizione delle Figure
Le Figure 1 A e B illustrano l’effetto del peso iniziale del tumore e della durata di un trattamento con STI571.
Figura 1 A: Due gruppi di 12 topi "nude" vengono iniettati con 50 x 10° cellule della leucemia KU312 in corrispondenza del giorno 1. Un trattamento con STI571 (160 mg/kg per os ogni 8 ore per 11 giorni) viene iniziato in corrispondenza del giorno 2 (quadrati) oppure in corrispondenza del giorno 8 (rombi) in presenza di un peso medio del tumore di 276 ± 97 mg. Figura 1 B: Topi "nude" iniettati con cellule KU812 vengono trattati in corrispondenza del giorno 2 (gruppo 1), del giorno 8 (gruppo 11), con un peso medio del tumore di 253 ± 122 mg) , oppure in corrispondenza del giorno 15 (gruppo III, peso medio del tumore di 1054 ± 258 mg). I risultati rappresentano la media di tre esperimenti consecutivi.
Figura 1 C: Animali che appartengono al gruppo 11 vengono lasciati non trattati (controlli) oppure vengono trattati per 11 oppure 18 giorni senza STI571.
La Figura 2 illustra l'effetto di un nuovo trattamento con STI571 su, una recidiva del tumore dopo una risposta iniziale nei confronti di STI571. Le linee tratteggiate si riferiscono alla crescita dei tumori non trattati (vedere la parte relativa ai metodi negli esempi).
La Figura 3 illustra la sensibilità in vitro nei confronti di STI571 di due tumori resistenti in vivo. I valori vengono espressi come 3⁄4 dei controlli che contengono incorporati 129’362 ± 6329 cpm.
La Figura 4 mostra l'inibizione in vivo dell'attività della Bcr/Abl-chinasi da parte di STI571. Topi che portano tumori vengono trattati acutamente con STI571 per via orale (160 mg/kg)·, e vengono uccisi in corrispondenza di diversi periodi di tempo. I campioni dei tumori vengono estratti e vengono usati per l'analisi western blot con antifosfotirosina (pTyr) oppure anti-Abelson (Ahi). STI571 inibisce in modo efficace la fosforilazione della tirosina-chinasi di BCR/ABL in controlli in corrispondenza di 2 e 4 ore (inibizione dell'80% e del 50% mediante analisi densitometrica) , mentre gli estratti ottenuti da animali con recidiva sono resistenti nei confronti di un trattamento con STI571.
La Figura 5 illustra le concentrazioni nel plasma e nel tumore di STI571 in topi che portano tumore preventivamente trattati oppure non trattati con STI571. Gli animali vengono trattati con STI571 (160 mg/kg per os) e vengono uccisi in corrispondenza di 0,5, 2 e 5 ore più tardi. STI571 viene determinato mediante HPLC in campioni di plasma e in estratti di tumore. I topi di controllo non ricevono mai un precedente trattamento con STI571, mentre topi preventivamente trattati vengono sottoposti a due cicli di 11 giorni di STI571 (come in Figura 2) . I pesi medi dei tumori sono 450 ± 129 mg in controlli e 684 ± 283 mg in topi preventivamente trattati.
La Figura 6 mostra la sensibilità in vitro verso STI571 di cellule KU812 in presenza di una al-glicoproteina acida (A) e in presenza di albumina (B) (vedere assorbimento di H-timidina sotto i metodi} .
La Figura 7 mostra l'effetto di due campioni di siero che contengono differenti quantità di AGP sull'attività in vitro di ST1571 su cellule KU812.
Le Figure 8 A e B mostrano la determinazione di AGP in topi normali e topi che portano tumore.
Figura 8 A: Concentrazioni medie di AGP in topi con differenti stati di malattia oppure dì trattamento. II gruppo 1 si riferisce a topi normali, il gruppo 2 si riferisce a topi trattati con STI571 per 11 giorni (e ai quali si sono prelevati campioni 3 giorni dopo l'interruzione del trattamento), il gruppo 3 si riferisce a topi che portano un tumore di 8 giorni (peso medio 304 ± 116 mg), il gruppo 4 si riferisce a topi che portano un tumore di 15 giorni (peso medio 1.184 ± 295 mg).
-Figura 8 B: Determinazione diretta del AGP in topi normali e in topi che portano tumore mediante isoelettrofocalizzazione : le piste 1 e 2 si riferiscono a topi normali, le piste 3 e 4 si riferiscono ad animali che portano tumori grandi (con un peso maggiore di 1 g). Le differenti isoforme di AGP vengono indicate e sono comprese tra un pH di’3,4 e un pH di 4,0.
La Figura 9 illustra l'effetto di AGP (in •corrispondenza di 1 mg/ml) ed<' >eritromicina sull’attività di STI571 (in corrispondenza di 1 μΜ) su cellule KU812.
La Figura 10 illustra l'effetto di AGP ed eritromicina sulla inibizione' di una autofosforilazione di bcr/abl indotta da STI571. 3 x IO<6 >cellule per pozzetto vengono fatte incubare a 37°C con eritromicina base (100 μΜ), con STI571 (3 μΜ), AGP (2 mg/ml). Dopo 1 ora, le cellule vengono lavate 2 volte con salina tamponata con fosfato fredda (PBS) e successivamente vengono sottoposte a lisi in 500 μΐ di 1 X tampone di Laerrimli. Lisati di cellule corrispondenti a 90.000 cellule vengono analizzati mediante elettroforesi su SDS su poliacrilammide al 7,5%. Si mettono in evidenza bcr-abl endogena, . bcr-abl fosforilata con tirosina, con i corrispondenti anticorpi monoclonali di topo.
Le Figure 11 A e B illustrano l'effetto in vivo di eritromicina in seguito ;a co-somministrazione con STI571 a topi che portano tumore. Gli animali che portano rumori di 11 giorni vengono distribuiti a caso in due gruppi separati. 15 topi vengono trattati con STI571 e con eritromicina (peso medio del tumore 385 ± 53), mentre 14 hanno ricevuto STI571 (peso medio del tumore 390 ± 114 mg). I gruppi di controllo ricevono soltanto eritromicina posta in sospensione in metil cellulosa al 5% (5. topi) oppure metil cellulosa al 5% (6 topi).
Figura 11 A: Pesi medi del tumore durante il trattamento (giorno 0-20).
Figura 11 B: Percentuale di topi che portano tumore: in corrispondenza di ciascun momento la percentuale di topi che portano un tumore palpabile viene calcolata rispetto al numero totale di-topi vivi in quel momento.
La Figura 12 illustra l'effetto di un pre-trattamento sull'effetto anti-leucemico di STI571. Due gruppi di topi "nude" vengono trattati con STI571 (160 mg/kg ogni 8 ore) per 11 giorni, partendo dal giorno 1 dopo iniezione di cellule leucemiche. Le linee tratteggiate si riferiscono ad animali di controllo non preventivamente trattati. La linea intera si riferisce ad animali che hanno ricevuto un trattamento identico con STI571 14 giorni prima di venire iniettati con cellule leucemiche KU812 bcr/abl+ .
Descrizione Dettagliata dell'Invenzione
Sorprendentemente, si è osservato in modelli di eterotrapianto in topi "nude" effetti positivi e preferibilmente anche sinergici tra inibitori della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore e composti organici in grado di legarsi ad una otl-glicoproteina acida (AGP). Questa è la dimostrazione che gli inibitori della tirosina-chinasi possono venire usati non soltanto come singole sostanze ma anche in particolare in una terapia combinata con composti organici in grado di legarsi ad AGP per il trattamento di malattie costituite da cancro.
Questa combinazione offre notevoli vantaggi; in primo luogo, gli inibitori delle tirosina-chinasi possono presentare effetti laterali significativi fino ad effetti realmente tossici, in modo che una semplice compensazione del legame di AGP mediante un aumento della dose di un inibitore di tirosina-chinasi spesso è molto difficile oppure impossibile allo scopo di ottenere un equilibrio responsabile tra effetto terapeutico ed effetti laterali. Nelle nuove combinazioni qui descritte, tuttavia, è possibile far diminuire la . quantità di inibitore della tirosina-chinasi necessaria e così alleviare gli effetti laterali. In secondo luogo, il composto organico che può venire usato come composto in grado di legarsi ad AGP può venire scelto tra composti con una tollerabilità molto elevata, consentendo così una grande flessibilità nel trattamento di pazienti affetti da cancro. In terzo luogo, a causa del fatto che inibitori delle tirosina-chinasi farmaceuticamente attive vengano liberati dal legame con. AGP nel plasma apre una via completamente nuova di trattamento, è anche possibile trattare i tipi di cancro che sono stati molto difficili da trattare oppure anche non sono stati praticamente influenzati dalla terapia con composti chemioterapici standard. Come cosa più importante, è possibile superare una desensibilizzazione in vivo (resistenza) di cellule in fase di proliferazione nei confronti di un inibitore delle tirosina-chinasi, che può essere presente già all'inizio del trattamento (preferibilmente per esempio a causa di elevati livelli di AGP nel plasma sanguigno) oppure può essersi sviluppato oppure può essere in fase di sviluppo durante il trattamento con un inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore come descritto nella presente descrizione.
La presente invenzione preferibilmente riguarda un preparato in combinazione che contiene (a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e (b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida (AGP) ; oppure sali farmaceuticamente accettabili di un qualsiasi componente (a), (b) oppure (a) e (b), se è presente almeno un gruppo che forma sale.
L'invenzione riguarda inoltre un procedimento per trattare una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, in cui
(a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una ai-glicoproteina acida (AGP) vengono somministrati ad un mammifero in combinazione in una quantità che insieme è efficace dal punto di vista terapeutico contro una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale.
L'invenzione riguarda inoltre un prodotto che contiene
(a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida (AGP); in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente -almeno un gruppo che forma sale,
in presenza oppure in a'ssenza di una o più sostanze-veicolo farmaceuticamente accettabili, sotto forma di un preparato in combinazione per un impiego contemporaneo oppure distribuito nel tempo entro un periodo di tempo che sia sufficientemente piccolo perchè i composti attivi sia del componente (a) che del componente (b) facciano aumentare l'attività antiproliferativa del composto (a) nei confronti di cellule in fase di proliferazione, in particolare in un paziente, per il trattamento di una malattia proliferativa che risponde a tale composto.
L'invenzione inoltre riguarda un preparato farmaceutico che contiene una quantità che congiuntamente è efficace per trattare una malattia proli ferat iva che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, costituito da:
(a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida,
in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale,
con una o più sostanze-veicolo farmaceuticamente accettabili .
L'invenzione riguarda anche l'impiego di una combinazione di
(a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida, in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale,
per la produzione di preparati farmaceutici da impiegare sotto forma di composizioni contro una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore.
Viene incluso l'impiego in un metodo per inibire una iperproliferazione di cellule che consiste nel porre a contatto cellule in fase di iperproliferazione con un preparato o prodotto farmaceutico come specificato negli ultimi due paragrafi, in particolare un metodo per trattare una malattia proliferativa che consiste nel porre a contatto un soggetto, cellule, tessuti oppure- .un fluido dell'organismo di detto soggetto, sospettato di essere affetto da una malattia iperproliferativa con una composizione o prodotto farmaceutico come specificato negli ultimi due paragrafi.
I termini generali usati qui in precedenza e qui di seguito preferibilmente hanno i seguenti significati se non viene altrimenti indicato:
L'espressione "almeno uno" riferendosi ad a) inibitori della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore oppure b) composti organici in grado di legarsi ad una al-glicoproteina acida si riferisce a uno o più, in particolare da 1 a 5 componenti di ciascun gruppo a) oppure b) , preferibilmente ad un composto del gruppo a) e a uno 0 più, in particolare da 1 a 5, in modo più specifico 1 oppure 2 composti del gruppo b).
Con l'espressione "inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore" si intende preferibilmente uno dei seguenti composti: Un composto citato nella Domanda Internazionale No. WO 97/02266, nella Domanda di Brevetto Intemazionale WO 98/35958 e in modo specifico nella Domanda di Brevetto Europeo EP 0.564.409-A, e anche nella Domanda Internazionale No. WO 99/03854, i quali vengono tutti qui incorporati come riferimento; Tyrphostin AG957 (vedere Kaur et al., Anticancer Drugs 5, 213-222 (1994), Herbimycin A (Okabe e Uehara, Leukemia and Lymphoma 12, 2156-2162 (1994), Blood 30, 1330-1338 (1994) and Leuk. Res. Ij3, 213-220 (1994^, e anche Rioran et al., Oncogene lj>, 133-1542 (1998)); Tyrphostins AG 1295, AG 1296 (vedere Kovalenko et al., Cancer Res. 54, 6106-6114 (1994); Lipson et al., Pharmacol & Exp-Therap. 285, 844-852 (1998),; Krystal et al., Cancer Res. 57, 2203-2208 (1997)); SU 101 (Leflunomide), e anche come suo metabolita (vedere Shawer et al·., Clin. Cancer Res. 3, 1167-1177 (1997), Mattar et al., FEBS Lett. 334, 161-164 (1993), Cherwinskyi et al., Inflamm. Res. 3, 1167-1177 (1997), e Strawn et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 1_, 533-573 (1998)); e Piridopirimidine (vedere per esempio Hamby et al., J. Med. Chem. 4JD, 2296-2303 (1997); Dahring et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 281, 1446-1456 (1997); Klutcho et ao, Life Sci. ·62, 143-150· (1998); Panek et al., J.
Pharmacol . Exp . Ther. 283, '1433-1444; Boschelli et al., J. Med. Chem. 4_1, 4365-4377 (1598)). Tutte le citazioni riportate sopra vengono qui incorporate come riferimento. Gli inibitori delle tirosina-chinasi, la loro sintesi e il loro impiego possono venire dedotti da queste citazioni.
Il termine "e/o" usato in "inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore" significa che o uno o più delle tirosina-chinasi citate vengono inibite da un composto compreso da questa espressione.
Preferibilmente con l'espressione "inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore" si intende uno dei seguenti composti: (A) Un composto di formula IV,
in cui
r è compreso tra 0 e 2,
n è compreso tra 0 e 2,
m è compreso tra 0 e 4,
Ri e R2 (i) sono alchile inferiore, in particolare metile, oppure
(ii) insieme formano un ponte come illustrato nella sottoformula I*
il legame venendo realizzato tramite i due atomi di carbonio terminali, oppure
(iii) insieme formano un ponte come illustrato nella sottoformula I**
in cui uno o due membri dell'anello Ti, T2, T3 e T4 sono azoto e gli altri in ciascun caso sono CH, e il legame viene realizzato tramite Τχ e T4;
A, B, D, ed E, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono N oppure CH, con la condizione che non più di 2 di questi radicali siano N; ,
G è alchilene inferiore, alchilene inferiore sostituito con un gruppo aciìossi oppure idrossi, con -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, ossa (-0-), tia (-S-), oppure immino (-NH-);
Q è alchile inferiore, in particolare metile; R è H oppure alchile inferiore;
X è un gruppo immino, ossa, oppure tia;
Y è arile, piridile, oppure cicloalchile non sostituito oppure sostituito; e
Z è un gruppo amminico mono- oppure di-sostituito, alogeno, alchile, alchile sostituito, ossidrile, ossidrile eterificato oppure esterificato, nitro-gruppo, gruppo ciano, carbossile, carbossile esterificato, alcanoile, carbammoile, carbammoile N-mono- oppure N,N-disostituito, ammidino, guanidino, mercapto-gruppo, solfo-gruppo, feniltio, fenil-inferiore-alchiltio, alchilfeniltio, fenil soli inile, fenil-inferiore-alchilsolfinile, alchilfenilsolfinile, fenilsdlfonile, fenil-inferiorealchilsolfonile, oppure alchilfenilsolfonile, in cui, se è presente più di un radicale Z (m = > 2), i sostituenti Z sono uguali oppure differenti l'uno dall 'altro,
e in cui i legami caratterizzati, se sono presenti, con una linea ondulata sono o un legame semplice oppure un doppio legame;
oppure un N-ossido del composto definito, in cui uno o più atomi di azoto portano un atomo di ossigeno; -CH2-0- , -CH2-S-, ossa e tia;
con la condizione che, se Y è piridile oppure cicloalchile non sostituito, X è il gruppo immino, e i rimanenti radicali sono come definiti, G viene scelto dal gruppo costituito da alchilene inferiore, , ossa e tiai
oppure un suo sale. Preferibilmente, le definizioni dei sostituenti riportate sopra hanno i significati, in particolare i significati preferiti, descritti nella Domanda di Brevetto Internazionale WO 98/35958. Tra questi composti il più preferito è il composto di formula V
(V)
con la denominazione 1- (4-cloro-anilino) -4- (4-piridilmetil) -ftalazina, oppure un suo sale farmaceuticamente accettabile .
(B) Un composto di una 7H-pirrolo [2,3—djpirimidina di formula VI
(VI)
in cui
q è 0 oppure 1,
n è compreso tra 1 e 3 quando q è 0, oppure n è compreso tra 0 e 3 quando q è 1,
R è alogeno, alchile inferiore, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, alcossi inferiore, carbossi, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiorealchilcarbammoile, N, N-di-inferiore-alchiìcarbammoile, il gruppo ciano, un gruppo amminico, inferiorealcanoilamminico, inferiore-alchilamminico, N,N-diinferiore-alchilamminico oppure trifluorometile, essendo possibile quando sono presenti nella molecola parecchi radicali R, che questi radicali siano identici oppure differenti;
a) Ri e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, indicano a) fenile sostituito con carbammoi 1-metoss i , carbossi- me tossi, benzoilossicarbonil-metossi, inferiore-alcossicarbonil-metossi, fenile, animino, inf erior e-alcano ilammino, inferiore-alchil animino, N,N-di-inf eriore-etilammincj, ossidrile, inferiorealcanoilossi, carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N,N-diinferiore-alchilcarbammoile, gruppo ciano oppure con nitro- gruppo;
β) idrogeno;
y) pi ridi le non sostitui to oppure alogeno oppure inf eriore-alchil-sostituito;
δ) N-benzil-piridinio-2-ile; naftile; ciano; carbossile; inf eriore-alcossicarbonile; carbammoile; N-inferiorealchilcarbammoile; N, N-di-inferiore-alchilcarbammoile; N-benzilcarbammoile; formile; inferiore-alcanoile ; inf eriore-alchenile ; inf eriore-alchenilossi ; oppure ε) inf eriore-alchile sostituito con
εα) alogeno, ammino, inferiore-alchilammino, piperazino, di -inf e r io re- al chi 1 animino ;
εβ) feni lammino che è non sostitui to oppure è sostituito nella porzione fenile con alogeno, alchile inferiore, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, inferiorealcoss i , carbossile , inf eriore-alcossicarboni le , carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N, N-diinferiore-aichilcarbammoile, gruppo ciano, ammino, inferiore-alcanoilammino, inferiore-alchilammino, N,N-di-inferiore-alchilammino oppure con trif luorometile, ey) ossidrile , alcoss ile inferiore , gruppo ciano , carbossile, inf eriore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N, N-di-inferiorealchilcarbammoile, mercapto, oppure
εδ) con un radicale di formula R3-S(0)m- in cui R3 è alchile inferiore e m è 0, 1 oppure 2, oppure
b) quando q è 1, uno dei radicali Ri e R2 è alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito e gli altri radicali Ri e R2 hanno uno dei significati riportati sópra nel paragrafo a) ad eccezione di idrogeno, oppure
c) Ri e R2 insieme sono C4-C1o-l,4-alcadienilene sostituito con animino, infe riore- alcanoilammino , inferiore-alchilammino, N,N-di-inferiore-alchilammino, nitro, alogeno, ossìdrile, inferiore-alcanoilossi, carbossile, inferiore-aìcossicarbonile, carbammoile, N-inf eriore-alchilcarbammoile, N,N-di-inferiorealchilcarbammoile oppure con il gruppo ciano oppure sono aza-1, 4-alcadienilene avente fino a 9 atomi di carbonio, oppure
d) quando q è 1, Ri e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito oppure hanno uno dei significati riportati sopra nel paragrafo a), e
Rg è idrogeno, alchile inferiore, inferioreailcossicarbonile , carbammoile, N-inferiorealchilcarbamino i le oppure N,N-di-inf eriorealchilcarbammoile,
oppure un suo sale. Preferibilmente, le definizioni dei sostituenti riportati sopra hanno i significati, in particolare i significati preferiti, descritti nella Domanda di Brevetto Internazionale WO 97/02266.
Tra questi composti il più preferito è il composto di formula VII
avente la denominazione (RI-6- (4-idrossi-fenil)-4-[(1-feniletil) -ammino] -7H-pirrolo [2,3-d]pirimidina .
Il più preferito è un derivato di una N-fenil-2-pirimidina-ammina di formula I
m cui
Ri è 4-pirazinile, 1-metil-lH-pirrolile, fenile ammino- oppure ammino-inferiore-alchil-sostituito, in cui il gruppo amminico in ciascun caso è libero, alchilato oppure acilató, ΙΗ-indolile oppure lH-immidazolile legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell’anello a cinque membri, oppure piridile non sostituito oppure inferiore-alchilsostituito legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell'anello e non sostituito oppure sostituito in corrispondenza dell'atomo di azoto con ossigeno, R2 e R3, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono idrogeno oppure alchile inferiore,
uno oppure due dei radicali R4, Rs, Re, R7 e Re sono ciascuno il nitro-gruppo, inferiore-alcossi fluorosostituito oppure un radicale di formula II
in cui
Rg è idrogeno oppure alchile inferiore,
X è un osso-gruppo, un tio-gruppo, immino, N-inf eriore-alchil-immino , idrossiimmino oppure O-inferiore-al chi1-ìdros siimmino,
Y è ossigeno oppure è il gruppo NH,
n è 0 oppure 1 e
Rio è un radicale alifatico avente almeno 5 atomi di carbonio, oppure un radicale aromatico, aromaticoalifatico, cicloalif atico, cicloalifatico-alifatico, eterociclico oppure eterociclico-alifatico e gli altri radicali R4, Rs, Re» R7 e <' >Re, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono idrogeno, alchile
inferiore che è non sostituito oppure è sostituito con un gruppo amminico libero oppure alchilato, con piperazini le, piperidinile, pirrolidinile oppure con morfolinìle oppure sono alcanoile inferiore, trifluorometile, ossidrile libero, eterificato oppure esterificato, il gruppo amminico libero, alchilato oppure acilato oppure carbossile libero oppure esterificato, oppure
un sale di tali composti che hanno almeno un gruppo che forma sale . Preferibilmente, le definizioni dei sostituenti riportate sopra hanno i significati, in particolare i significati preferiti descritti nella Domanda di Brevetto Europeo ΞΡ 0.564 .409. Tra questi composti il più preferito è il composto di formula III
con la denomina z ione 4 - ( 4 -me t i 1 p ip e r a z i n - 1 -ilmetil) -N-[4-metil-3- (4-piridin-3-il) pirimidin-2-i lammino ) f enil ] benzammidè, preferibilmente nella forma del sale me t ansol f,onato come descritto in WO 99/03854 , più preferibilmente nella forma del
sale metansolfonato nella forma di cristalli β come descritto in WO 99/03854. Questo composto (nella forma del sale metansolfonato) viene denominato qui di seguito STI571.
Un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida o "AGP" in generale è un farmaco basico oppure neutro, però anche un farmaco acido, in particolare scelto dal gruppo costituito da:
alfa-bloccanti, in particolare Nicergoìina oppure Prazosin;
anestetici/analgesici , in particolare Alfentanil, Ketamine oppure Ethidocaine;
analgesici, in particolare Fentanil, Meperidina, Metadone oppure Fenilbutazone;
anestetici, in particolare Bupivacaine, Etidocaina oppure Fenciclìdina;
anestetici/antiaritmici, in particolare Lidocaina oppure Fenciclìdina;
antiaritmici, in particolare Aprindina, Disopiramide, Chinidina oppure Verapamil;
antibiotici, in particolare Eritromicina;
anticoagulanti, in particolare Acenocoumaro 1 , Dipyridamole, PCR2362 (derivato della tienopiridina) , Ticlopidine oppure Warfarin;
antiepilettici, in particolare Phenytoin oppure Carbamazepine;
agenti antiinfiammatori, in particolare Naproxen; beta-bloccanti, in particolare Alprenolol, Metoprolol, Oxprenolol, Pindolol e composti correlati, Propranolol oppure Timolol;
steroidi, come Progesterone, Cortexone, Cortisol, Testosterone, Estradiolo oppure Prednisolone; bloccanti neuromuscolari, in particolare Metocurina oppure d-Tubocurarina;
psicotropici, in particolare Amitriptilina, Cloropromazina, Cyclazindol, Desmethylimipramine, Diazepam, Doxepine, Flurazepam, Fluphenazine, Haloperidol, Imipramine, Loxapine, Mianserin, Nortriptyline, Norzimelidine, Perazìne, Perphenazine, Phenobarbital, Derivati della Fenotiazina, Promazine, Acepromazine, Protipendyl, Thioridazine, Thiothixene, Triazolam, Trif luoperazine oppure Zimelidine;
vitamine e provitamine, in particolare Vitamina B12 oppure Acido Folico;
sonde fluorescenti, in particolare DAPN (derivato del propranolol) , 1,8-Anilino-naftalen-solf onato ; ulteriori farmaci, in particolare Aminopyrìne, Amoxapine, Bupropion, Maprolitine, Nomifensine, Trazodone, farmaci con gruppo di ammonio quaternario, Ritodrine, Doxazosin, Trimazosin, Binedaìin, Amsacrine, Apazone, SKF 525A, Ciclazindol, POR 2362, Indometacina , Probenecid, Acido Retinoico, Soliinpirazone, Tolmetin, Benoxaprofen, Eparina, Sufentanil, Lofentanil, Metoclopramide, Nicardipine, <■ >Pirmenol, Mifepristone, RU 42 633, Aprindil, Auramine. O, Bepridil, Desipramine, Desmethylclomipraìne , Moxaprindine, Chinina, Lorcainide, Prothipendyl , Protriptyline, Trihexyphenidyl, Biperiden, Methaqualone, Diphenhydramine, Glutethimide, Chlordiazepoxid, L-Triptofano, Mepivacaine, Levomethadone, Opipramol, Trifluopromazine oppure Trimipramine;
plastificanti, come Tris-butossietil-fosf ato (TBEP); Staurosporina (vedere US 4.107.297) oppure Derivati della Steaurosporina, preferibilmente quelli descritti nella Domanda di Brevetto Europeo EP 0.296.110 e/o EP 0.238.011, in particolare 'N-benzoil-staurosporina (PTK412 - vedere Domanda di Brevetto Europeo No. EP 0. 296.110) oppure 7- idros si- staur ospo rina (UCN-01 - vedere Domanda di' Brevetto Europeo No. EP 0.238.211;
e anche un metabolita di uno qualsiasi di questi composti;
oppure un loro sale (in particolare farmaceuticamente accettabile) .
EP 0.238.011, US 4.107.297 ed EP 0.296.110 vengono incorporati come riferimento, come anche le seguenti pubblicazioni: Kremer et al., Pharmacol. Rev. 4_0{1), 1-47 (1988); Cancer Res. 58,' 3248-3253 (1993); Br. J. Clin. Pharmacol. 22, 499-506 (1986); Physiol. Functions, e Pharmacol., pagine 321-336: F. Bree et al., "Binding to ctl-acid glycoprotein and relevant apparent volume of distribution", Alan R. Liss Ine., 1989; Protein Binding and Drug -Transport (Tillement e Lindenlaub, ed.): "Drug binding to human αΐ-acid glycoprotein - focus on a single binding site", Stuttgart 1986. In tutte queste pubblicazioni, vengono citati i composti in grado di legarsi ad AGP che sono forme di realizzazione preferite della presente invenzione.
Più preferito è uno qualsiasi- dei composti citati sopra diversi da uno steroide. Per un impiego medico secondario (per esempio in gruppi di pazienti che hanno sviluppato resistenza, più in particolari pazienti affetti da CML in crisi di blastizzazione e pazienti Ph+-ALL recidivi), sono utili anche steroidi.
Un composto organico in grado di legarsi ad AGP da usare in combinazione secondo l'invenzione in aggiunta ad una abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore oppure del Kit--recettore può anche venire scelto da una o più ulteriori abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore oppure del Kit-recettore, il che sta ad indicare che il componente (b) nelle forme di realizzazione dell'invenzione può essere anche un tale composto.
Preferibilmente, la abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore (componente (a)) viene scelta dal gruppo costituito da 1- (4-cloro-anilino) -4- (4-piridil-metil) -ftalazina, (R)-6- (4-idrossi-fenil )-4-[ (1-feniletil) -aitimino]-7H-pirrolo (2,3-d] pi rimi dina e preferibilmente 4- (4-metilpiperazin-l-ilmetil) -N-[4-metil-3- (4-piridin-3-il) pirimidin-2-ilammino) fenil] -benzammide; oppure un suo sale; più preferibilmente il sale metan-solfonato della 4- (4-metilpiperazin-lilmetil) -N- [4-metil-3- (4-piridin-3-il )pirimidin-2-ilammino) fenil] benzammide (qui di seguito denominato anche STI571), più preferibilmente nella forma di cristalli β come descritto in WO 99/03854.
Il composto organico in grado di legarsi ad una ocl-glicoproteina acida (componente (b)) preferibilmente è un antibiotico, in particolare eritromicìna oppure staurosporina oppure un derivato della steaurosporina, in particolare N-benzoil-staurosporina (PKC412) oppure 7-idrossi-staurosporina (UCN-01), oppure un suo sale, più in particolare eritromicìna, oppure un suo sale farmaceuticamente accettabile.
Uno o più degli inibitori della tirosina-chinasi e dei composti organici in grado di legarsi ad AGP, possono venire usati in combinazione oppure in una terapia in combinazione secondo la presente invenzione.
Il termine legame significa in particolare un legame competitivo, però può essere anche qualsiasi altro tipo di legame (per esempio a s'iti di legame che presentano effetti allosterici sul componente (a) che si lega al sito) che porca ad un legame diminuito dì un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore ad AGP. Questo legame può venire determinato in vitro in analogia ai metodi descritti negli Esempi 'riportati qui di seguito.
Il legame può essere irreversibile (per esempio mediante legame covalente oppure ionico) oppure preferibilmente reversibile.
L'espressione "in grado di legarsi" sta ad indicare che il composto ha una affinità per AGP che consente un legame come descritto sopra, preferibilmente con una concentrazione in corrispondenza di un legame semi-massimo nell'intervallo da millimolare fino a sub-nanomolare, in particolare nell'intervallo compreso tra 100 μΜ e 1 nM.
Con l'espressione "malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore" si intende qualsiasi malattia qui citata; preferibilmente si intende qualsiasi malattia che risponde a tali composti; in particolare una malattia proliferativa scelte tra malattia costituita da cancro, in particolare una malattia tumorale oppure una leucemia, oppure una malattia proliferativa non maligna, per esempio aterosclerosi, trombosi, psoriasi, sclerodermatite oppure fibrosi. Più preferibilmente, si intende una malattia scelta dal gruppo costituito da CML (leucemia mieloide cronica) e ALL (leucemia linfoblastica acuta), oppure un tumore solido, in particolare scelto tra 'cancro del polmone, in particolare cancro del polmone non a cellule piccole, e cancro della prostata.
Con l'espressione "quantità che in combinazione è efficace dal punto di vista terapeutico contro una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recet tore e/o del Kit-recettore" preferibilmente si intende una qualsiasi quantità dei componenti delle combinazioni Iche in combinazione fanno diminuire la proliferazione di cellule responsabili di una qualsiasi delle malattie proliferative citate (per esempio diminuita crescita del tumore) oppure preferibilmente anche provocano una regressione, più preferibilmente anche la scomparsa parziale oppure completa di tali cellule (per esempio regressione del tumore, preferibilmente guarigione).
Preferibilmente, in una qualsiasi delle forme di realizzazione della presente invenzione la dose di ciascuno dei componenti 'della combinazione (componente (a) e (b)) viene scelta in modo che nel plasma sanguigno si raggiunga un livello del plasma sanguigno che è superiore 'alla concentrazione di legame semi-massimo del componente (b), il composto organico è in grado di legarsi ad AGP nel plasma, in vivo per almeno una parte del periodo di tempo in cui è presente il componente (a), ossia 1'inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore. Questa concentrazione può venire determinata per esempio in vitro secondo procedimenti standard, per esempio in analogia ai metodi descritti negli esempi per la determinazione del Ka, mentre la concentrazione nel plasma dpi sangue dei componenti (a) e (b) in un animale a sangue caldo (intendendo in modo particolare un paziente'umano) può anche venire determinata secondo metodi di routine.
Preferibilmente, il dosaggio del componente (b) viene scelto in modo che la concentrazione del componente (b) nel plasma sia superiore a 0,05 μΜ, più preferibilmente sia superiore a 0,1 μΜ, e nel modo più preferibile sia compresa tra 0,5 e 100, in particolare tra 1 e 50 μΜ dell'individuo trattato, per almeno una parte del periodo di tempo in cui è presente anche il componente :(a). Più preferibilmente, la concentrazione di uno qualàiasi dei componenti (a) e (b) nel plasma è superiore a 0,1 μΜ, più preferibilmente è superiore a 1 μΜ, e più preferibilmente è compresa tra 0,5 e 100, in modo particolare tra 1 e 50 μΜ dell'individuo trattato, per almeno una parte del periodo di tempo in cui è presente anche il componente (a).
Le concentrazioni nel plasma possono venire determinate secondo metodi standard, per esempio effettuando una HPLC di campioni sottoposti a lavorazione secondo procedimenti standard.
Con l'espressione "un prodotto che comprende (a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida (AGP);
in cui un qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale,
in presenza oppure in assenza di una o più sostanzeveicolo farmaceuticamente accettabili, sotto forma di un preparato in combinazione, per un impiego contemporaneo oppure distribuito nel tempo entro un periodo di tempo che è sufficientemente piccolo affinchè i composti attivi sia del componente (a) che del componente (b) facciano aumentare l'attività antiproliferativa di un composto (a) contro cellule in fase di proliferazione, in particolare in un paziente, per il trattamento di una malattia proliferativa che risponde ad un tale composto", si intende in particolare un "kit" oppure "kit di parti" nel senso che i componenti efficaci (a) e (b) della combinazione possono venire somministrati indipendentemente oppure mediante l'impiego di combinazioni determinate differenti con quantità differenziate dei componenti (a) e (b) in momenti differenti. Le parti del kit costituito da parti separate possono venire somministrate contemporanéamente oppure in modo distanziato nel tempo, ossia in momenti differenti con intervalli di tempo uguali oppure differenti per una qualsiasi parte del kit costituito da parti differenti, con la condizione che gli intervalli di tempo vengano scelti in modo che 1'effetto sulla malattia proliferativa nell'uso combinato delle parti sia maggiore rispetto all'effetto che si otterrebbe mediante l'impiego soltanto del componente (a), ossia si ha una inibizione più forte della proliferazione oppure preferibilmente una regressione più forte oppure anche una guarigione della malattia proliferativa rispetto a quando la medesima dose del solo componente (a) viene somministrata da sola nella medesima dose. Ciò viene indicato con l'espressione "aumento dell'attività antiproliferativa contro cellule in fase di proliferazione, in particolare in un paziente"; preferibilmente, si intende un aumento dell'effetto provocato dal componente (b), in particolare una reversione parziale oppure completa della resistenza di una malattia proliferativa nei confronti di uno o più composti del tipo componente (a) e/o si intende la stimolazione della regressione delle cellule in fase di proliferazione fino a comprendere la loro completa distruzione.
Con l'espressione "cellule in fase di proliferazione", si intendono preferibilmente cellule in fase di proliferazione anormale, come le cellule cancerose.
Si preferiscono combinazioni che presentano un 'aumentata attività antiproliferativa quando vengono confrontate con il singolo componente (a) da solo, in particolare combinazioni che presentano sinergismo (combinazioni sinergiche) oppure combinazioni che portano ad una regressione di tessuti proliferativi e/o alla guarigione da malattie prol iferat ive, più preferibilmente combinazioni nelle quali viene superata parzialmente eppure completamente una resistenza (intendendo resistenza presente già all'inizio del trattamento oppure resistenza che è un risultato di periodi più o meno lunghi di trattamento con il componente (a)) di una malattia proliferativa in un animale a sangue caldo, in particolare nell'uomo, nei confronti di uno o più composti della classe del componente (a).
L'espressione "sostanze-veicolo farmaceuticamente accettabili" viene spiegata di seguito nella definizione dei preparati farmaceutici.
In una qualsiasi combinazione oppure in un qualsiasi trattamento in combinazione secondo l'invenzione qui descritta, si preferisce l'impiego in combinazione allo scopo di invertire in modo completo oppure parziale una resistenza (presente prima del trattamento oppure sviluppata oppure in fase di sviluppo durante il trattamento con un farmaco che comprende un componente (a) come qui definito) di una malattia proliferativa nei confronti di un trattamento con un farmaco che comprende un componente (a)<■ >come definito qui in vivo, in particolare in un animale a sangue caldo, in particolare in un essere umano.
Resistenza completa oppure parziale in particolare significa una efficienza inferiore, per esempio in termini di interruzione oppure ritardo della proliferazione, che provoca la regressione oppure anche la guarigione, per esempio una minore inibizione della proliferazione oppure una durata di trattamento più lunga fino a che si ha una risposta prevista se non fosse presente alcuna resistenza, per esempio di un tumore oppure di una leucemia rispetto ad un animale, per esempio un essere . umano, che non presenta resistenza oppure del quale i successi iniziali del trattamento (in particolare in un paziente che sviluppa resistenza soltanto durante un trattamento con un componente (a)) non si hanno più in corrispondenza di stadi tardivi del trattamento, in particolare in pazienti affetti da CML in crisi di blastizzazione e in pazienti Ph+-ALL con recidiva.
Si deve intendere che l'invenzione riguarda inoltre qualsiasi impiego di combinazioni di un componente (a) e di un componente (b) , come definito sopra e di seguito, in un procedimento per inibire una iperprolif erazione di cellule'che consiste nel mettere a contatto cellule in fase di iperproli ferazione con un preparato farmaceutico oppure un prodotto farmaceutico nel senso di un kit costituito da parti differenti, in particolare un metodo per trattare una malattia proliferativa che r consiste nel porre a contatto un soggetto, cellule, tessuti oppure un fluido corporeo di detto soggetto, sospettato di avere una malattia iperproli ferativa . Ciò comprende in particolare il trattamento per esempio di cellule all'esterno dell'organismo con lo scopo di sostituire cellule in fase di iperproliferazione nell'organismo di un soggetto che presenta cellule in fase di iperproliferazione con cellule normali; per esempio, sangue con cellule del sistema immunitario può venire prelevato da un soggetto, può venire trattato all'esterno dell'organismo con un componente (a) e con un componente (b) in modo da selezionare cellule non-iperproliferative, le cellule staminali e le altre cellule del sangue del sistema immunitario possono venire distrutte nel soggetto per esempio mediante irradiazione oppure <1 >mediante chemioterapia e quindi le cellule normali sdlezionaté possono venire di nuovo impiantate nel | soggetto, per esempio mediante iniezione ecc. I metodi da adottare in tali tipi di trattamento sono noti a chi è esperto nel settore.
Una qualsiasi delle citazioni riportate all'interno di questa descrizione viene incorporata come riferimento, in particolare quei passaggi indicati qui come preferiti.
A condizione che siano presenti uno o più gruppi che formano sali, le sostanze che costituiscono i farmaci corrispondenti al componente (a) e/o al componente (b) possono essere presenti anche sotto forma di sali.
I sali sono in particolare i sali farmaceuticamente accettabili, per esempio sostanzialmente non tossici.
Tali sali vengono formati, per esempio, da composti aventi un gruppo acido, per esempio un gruppo carbossile, un gruppo di fosfodiestere oppure fosforotioato, e sono, per esempio, loro sali con basi adatte, come sali di metalli non tossici derivati dai metalli dei gruppi la,, Ib, Ila e Ilb della Tabella Periodica degli Elementi, in particolare adatti sali di metalli alcalini, per esempio sali di litio, sodio oppure potassio, oppure sali di metalli alcalino-terrosi, per esempio sali di magnesio oppure di calcio, inoltre sali di zinco oppure di ammonio, e anche quei sali che vengono formati con ammine organiche, come mono-, di- oppure tri-alchilammine non sostituite oppure idrossi-sostituite, in particolare mono-, di- oppure tri-inferiore-alchilammine oppure con composti di ammonio quaternario, per esempio con N-metil-N-etilammina, dietilammina, trietilammina, mono-, bis- oppure tris- (2-idrossi-inferiorealchil)ammine , come mono-, bis- oppure tris-(2-idrossietil)ammina, 2-idrossi-terz-butilammina oppure tris (idrossimetil )metilammina, N,N-di-inferiore -alchil-N- (idrossi-inf erior.e-alchil)ammine, come N,N-dimetil-N- (2-idrossietil)-ammina oppure tri-(2-idrossietil) -ammina, oppuré N-metil-D-glucammina, oppure sali di ammonio quaternario, come sali di tetrabutilammonio . Composti che hanno un gruppo basico, per esempio un gruppo amminico oppure imminico possono formare salì di addizione con acidi, per esempio con acidi inorganici, per esempio con un acido alogenidrico, come acido cloridrico, con acido solforico oppure acido fosforico, oppure con acidi organici carbossilici, solfonici, con solfo-acidi oppure fosfo-acidi oppure' con acidi solfammici N-sostituiti, come, per esempio, acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido succinico, acido maleico, acido idrossimaleico, acido metilmaleico, acido fumarico, acido malico, acido tartarico, acido gluconico, acido glucarico, acido glucuronico, acido citrico, acido benzoico, acido cinnamico, acido mandelico, acido salicilico, acido 4-amminosalicilìco, acido 2-fenossibenzoico, acido 2-acetossibenzoico, acido embonico, acido nicotinico oppure acido isonicotinico, e anche con amminoacidi, per esempio, α-ammino-acidi, e ·anche con acido metansolfonico, acido etansolfonico, acido 2-idrossietansolfonico, acido etan-1 ,2-disolf onico,<' >acido benzensolfonico, acido 4-metilbenzensolfonico, acido naftaìen-2-solfonico, 2- oppure 3-fosfoglicerato, glucosio-6-fosfato, acido N-cicloesilsolfammico (con formazione dei ciclammati) oppure con altri composti organici acidi, come acido ascorbico. Composti che hanno gruppi acidi e basici possono anche formare sali interni. Se è presente più di un gruppo che forma sale, è possibile anche che siano presenti sali misti .
Con lo scopo di isolare e purificare, è anche possibile usare sali non accettabili dal punto di vista farmaceutico, per esempio sali costituiti da picrati oppure perclorati.
I termini "composti",: "componenti" e "sali" comprendono anche espressamente singoli composti oppure singoli sali.
Come si può intendere dal testo della presente invenzione, il termine "combinazione" nei paragrafi precedenti e in particolare nei paragrafi che seguono che descrivono varianti più specifiche e preferite della presente invenzione, deve venire inteso nel senso di riferirsi a
(i) un preparato in combinazione che contiene (a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Rece ttore e/o del Kit-recettore e (b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida (AGP); oppure sali farmaceuticamente accettabili di un qualsiasi componente (a), (b) oppure (a) e (b), se è presente almeno un gruppo che forma sale; (ii) un metodo per trattare una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, in cui
(a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida (AGP)
vengono somministrati ad un mammifero in combinazione in una quantità che congiuntamente è efficace dal punto di vista terapeutico contro una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl- tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore,
in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale;
(iii) un·prodotto che contiene
(a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) alemo un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida (AGP) ;
in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale,
in presenza oppure in assenza di una o più sostanze-veicolo farmaceuticamente accettabili, sotto forma di un preparato in combinazione per un impiego contemporaneo oppure distribuito nel tempo entro un periodo di tempo che è sufficientemente piccolo affinchè i composti attivi sia del componente (a) che del componente (b) facciano aumentare l'attività antiprolif erativa di un composto (a) contro cellule in fase di proliferazione, in particolare in un paziente, per il trattamento di una malattia proliferaiiva che risponde ad un tale composto;
(iv) un preparato farmaceutico che comprende una quantità che in combinazione è efficace per trattare una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl- tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, costituito da;
(a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una ai-glicoproteina acida, in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale, con una o più sostanze-veicolo farmaceuticamente accettabili; e/o
(v) l'impiego di una combinazione costituita da
(a) almeno un inibitore dèlia abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e
(b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida,
in cui qualsiasi componente (a) e/o {b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale,
per la produzione di preparati farmaceutici da impiegare come composizioni contro una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore;
oppure qualsiasi combinazione di questi oggetti dell'invenzione, per quanto siano ammessi sotto le rispettive legislazioni sui brevetti; oppure le loro varianti più specifiche e preferite come riportate di seguito;
in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale; se non definito altrimenti oppure se non è evidente altrimenti dal contesto.
Entro i seguenti gruppi<1 >di forme di realizzazione più preferite dell'invenzione, definizioni più generali possono venire sostituite con definizioni più specifiche secondo quelle indicate sopra oppure {in particolare per quel che riguarda la definizione di composizioni farmaceutiche e di metodi di impiego) di seguito.
Si preferisce una combinazione di (a) almeno un inibitore della abl-tirosina4chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore scelto da
un composto di una 7H-pirrolo (2,3-d]pirimidina di formula VI
m cui
q è 0 oppure 1,
n è compreso tra 1 e 3 quando q è 0, oppure n è compreso tra 0 e 3 quando q ,è 1,
R è alogeno, alchile inferiore, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, alcossi inferiore, carbossi, inferiore-alcossicarbonile, .carbammoile, N-inferiorealchilcarbammoile, N, N-di-iriferiore-alchilcarbammoile, il gruppo ciano, un gruppo amminico, inferiorealcanoilamminico, inferiore-alchilamminico, N,N-diinferiore-alchilamminico oppure trif luorometile, essendo possibile quando sono presenti nella molecola parecchi radicali R, che questi radicali siano identici oppure differenti;
a) Ri e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, indicano a) fenile sostituito con carbammoi 1-metoss i , carbossi-metossi, benzoilossicarbonil-metossi, inferiore-alcossicarbonil-me<'>tossi, fenile, airanino, inf eriore-alcanoilammino , .inferiore-alchilammino, N,N-di-inf eriore-etilammino’, ossidrile, inferiorealcanoilossi , carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N,N-diinf eriore-alchilcarbammoile,<' >gruppo ciano oppure con nitro-gruppo;
β) idrogeno;
γ) piridile non sostituito oppure alogeno oppure inferiore-alchil-sostituito;
δ) N-benzil-piridinio-2-ile; naftile; ciano; carbossile; inferiore-alcossicarbonile; carbammoile; N-inferìorealchilcarbammoile; N,N-di-inferiore-alchilcarbammoile; N-benzilcarbammoile; formile; inferiore-alcanoile; inferiore-alchenile; inferiore-alchenilossi; oppure ε) inferiore-alchile sostituito con
εα) alogeno, animino, inferiore-alchilammino, piperazino, di-inferiore- alchilaminino;
εβ) fenilammino che è non sostituito oppure è sostituito nella porzione fenile con alogeno, alchile inferiore, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, inferiorealcossi, carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N,N-diinferiore-alchilcarbammoile, gruppo ciano, ammino, inferiore-alcanoilammino, inferiore-alchilammino, N, N-di-inferiore-alchilammino oppure con trif luorometile, εγ) oss idri le , aicoss ile inferiore , gruppo ciano , carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N- inferiore- a lchilcarbammo ile , N, N-di- inferiorealchilcarbammoile, mercapto, oppure
εδ) con un radicale di formula R3-S(0)m<- >in cui R3 è alchìle inferiore e m è 0, 1 oppure 2, oppure
b) quando q è 1, uno dei radicali Ri e R2 è alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito e gli altri radicali Ri e R? hanno uno dei significati riportati sopra nel paragrafo a) ad eccezione di idrogeno, oppure
c) Ri e R2 insieme sono C4-C10-l,4-alcadienilene sostituito con am ino, inferiore-alcanoilammino, inferiore-alchilammino, N,N-di-inferiore-alchilammino, nitro, alogeno, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inf eriore-alchilcarbammoile, N,N-di-inferiorealchilcarbammoile oppure con il gruppo ciano oppure sono aza-1,4-alcadienilene avente fino a 9 atomi di carbonio, oppure
d) quando q è 1, Ri e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito oppure hanno uno dei significati riportati sopra nel paragrafo a), e
R3⁄4 è idrogeno, alchile inferiore, inferiorealcossicarbonile, carbammoile, N-inferiorealchilcarbammoile oppure N, N-di- inf eriorealchilcarbammoile,
oppure un suo sale (preferibilmente, le definizioni dei sostituenti riportati sopra hanno i significati, in particolare i significati preferiti, descritti nella Domanda di Brevetto Internazionale WO 97/02266, tra questi composti il più preferito è il composto di formula VII
avente la denominazione (R)-6- (4-idrossi-fenil) -4-[(1-feniletil) -animino]-7H-pirrolo [2,3-d]pirimidina) , e
(ii) un derivato di una N-fenil-2-pirimidina-ammina di formula I
in cui
Ri è 4-pirazinile, 1-metil-lH-pirrolile, fenile ammino- oppure ammino-inferiore-alchil-sostituito, in cui il gruppo amminico in , ciascun caso è libero, alchilato oppure acilato, lH-indolile oppure lH-immidazolile legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell'anello a, cinque membri, oppure piridile non sostituito oppure inferiore-alchilsostituito legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell'anello e non sostituito oppure sostituito in corrispondenza dell'atomo di azoto con ossigeno, R2 e R3, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono idrogeno oppure alchile inferiore,
uno oppure due dei radicali R4, R5, R6, R7 e Re sono ciascuno il nitro-gruppo, inferiore-alcossi fluorosostituito oppure un radicale di formula II
in cui
Rg è idrogeno oppure alchile inferiore,
X è un osso-gruppo, un tio-gruppo, immino, N-inf eriore-alchi 1-immino , idrossiimmino oppure O-inf eriore-alchil-idrossiimmino,
Y è ossigeno oppure è il gruppo NH,
n è 0 oppure 1 e
Rio è un radicale alifatico avente almeno 5 atomi di carbonio, oppure un radicale aromatico, aromaticoalifatico, cicloalifatìco, cicloalifatico-alif atico, eterociclico oppure eteroCiclico-alifatico e gli altri radicali R4, R5, Re, R7 e Re, ciascuno indipendentemente dall’altro, sono idrogeno, alchile inferiore che è non sostituito oppure è sostituito con un gruppo amminico libero oppure alchilato, con piperazinile, piperidinile, pirrol idinile oppure con morfolinile oppure sono alcanoile inferiore, trif luorometile, ossidrile libero, eterificato oppure esterificato, il gruppo amminico libero, alchilato oppure acilato oppure carbossile libero oppure esterificato, oppure
un sale di tali composti che hanno almeno un gruppo che forma sale (preferibilmente, le definizioni dei sostituenti riportate sopra hanno i significati, in particolare i significati preferiti descritti nella Domanda di Brevetto Europeo EP 0.564.409. Tra questi composti il più preferito è il .composto di formula III
con la denominazione 4- {4-met iIp ipe raz in- 1-ilmetil )-N- [4-metil-3- (4-piridin-3-il) pirimidin-2-ilammino ) fenil ]benzammide , preferibilmente nella
forma del sale metansol fona to come descritto in
WO 99/03854, più preferibilmente nella forma del
sale metansolfonato nella fórma di cristalli β come
descritto in WO 99/03854),
con (b) almeno un (preferibilmente un) composto
organico in grado di legarsi ad una a-glicoproteina
acida (AGP) scelto dal gruppo costituito da:
Nicergolina, Prazosin, Alfentanil, Ketamine, Ethidocaine,
Fentanil, Meperidina, Metadone, Fenilbutazone ,
Bupivacaine, Etidocaina, Fenciclidina, Lidocaina,
Fenciclidina, Aprindina, Disopiramide , Chinidina,
Verapamil, Eritromicina, Acenocoumarol, Dipyridamole,
PCR2362, Ticlopidine, Warfarin, Phenytoin, Carbamazepine,
Naproxen, Alprenolol, Metoprolol, Oxprénolol, Pindolol,
Propranolol, Timolol, Progesterone,- Testosterone, Estradiolo, Prednisolone, Metocurina, d-Tubocurarina, Ami t r ip t i l i na , CI o rop r orna z ina , C yc l a z i ndo l , Desmethylimipramine, Diazepam, Doxepine, Flurazepam, Flupnenazine , Haloperidol , ; Imipramìne , Loxapine , Mianserin, Nortriptyline, Norzimelidine, Perazine, Perphenazine, Phenobarbital, Derivati della Fenotiazina, Promazine, Acepromazine, Protipendyl, Thioridazine, Thiothixene, Triazolam, Trifìuoperazine, Zimelidine, Vitamina BI2, Acido Folico, DAPN, 1, 8-Anilino-naftalensolfonato, Aminopyrine, Amoxapihe, Bupropion, Maprolitine, Nomifensine, Trazodone, Ritodrine, Doxazosin, Trimazosin, Binedalin, Amsacrine, Apazone, SKF 525A, Ciclazindol, PCR 2362, Indometacina, Probenecid, Acido Retinoico, Solf inpirazone , Tolmetin, Benoxaprofen, Eparina, Sufentanil, Lofentanil, Metoclopramide, Nicardipine, Pirmenol, Mifepristone, RU 42 633, Aprindil, Auramine 0, Bepridil, Desipramine, Desmethylclomipraine, Moxaprindine, t
Chinina, Lorcainide, Prothipendyl , Protriptyline, Trihexyphenidyl, Biperiden, Methaqualone, Diphenhydr amine, Glutethimide, Chlordiazepoxid, ‘ L-Triptofano, Mepivacaine, Levomethadone, Opipramol, Trifluopromazine, Trimipramine, Tris-butossietil-fosfato, Staurosporina, N-benzoilstaurosporina e 7-idrossi-staurosporina;
e anche un metabolita di uno qualsiasi di questi composti;
in cui qualsiasi componente (a) e/o <b) può essere presente preferibilmente nella forma libera oppure nella forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale .
Più preferita è una combinazione di (a) almeno un, preferibilmente un, inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore scelto dal gruppo costituito da 1- (4-cloro-anilino) -4- (4-piridil-metil)-ftalazina, (R)-6-(4-idrossi-fenil) -4- [(1-feniletil)-ammino] -7H-pirrolo [2,3-d]pi rimidina e preferibilmente 4- (4-metilpiperazin-l-ilmetil )-N-[4-metil-3- (4-piridin-3-il)pirimidin-2-ilammino) fenil]-benzammide; oppure un sale farmaceuticamente accettabile di uno o più di questi composti; più preferibilmente il sale metansolfonato della 4- (4-metilpiperazin-lilmetil) -N- [4-meti1-3- (4-piridin-3-il) pirimidin-2-ilammino) fenil] benzammide, più preferibilmente nella forma di cristalli β; e
(b) almeno un, preferibilmente un, composto in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida che è preferibilmente un antibiotico, in particolare eritromicina, oppure staurosporina oppure un derivato della staurosporina , in particolare N-benzoilstaurosporina oppure 7-idrossi-staurosporina, oppure un loro sale farmaceuticamente accettabile, più in particolare eri tromicina, oppure un suo sale farmaceuticamente accettabile.
Nel modo più preferibile, in tutte le forme di realizzazione citate sopra, la malattia da trattare è una malattia cancerosa, in particolare una leucemia oppure un tumore solido, preferibilmente una malattia scelta dal gruppo costituito da CML (leucemia mieloide cronica) e ALL (leucemia linfoblastica acuta), oppure un tumore solido, in particolare scelto tra cancro del polmone, in particolare cancro del polmone a cellule non piccole, e cancro della prostata.
Preferibilmente, si usa una combinazione secondo la presente invenzione nel trattamento di un animale a sangue caldo, in particolare un essere umano che soffre di una malattia proliferativa che (in modo particolare è dovuta a livelli di AGP più elevati rispetto ai livelli normali) è resistente nei confronti di un tale trattamento oppure durante il trattamento con un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore sta diventando oppure è diventato completamente oppure parzialmente resistente nei confronti di tale trattamento per esempio animali a sangue caldo che rappresentano un gruppo speciale di individui da sperimentare "probandi".
In un'altra forma di realizzazione preferita della presente invenzione, si usa la combinazione nel caso di un animale a sangue caldo, in particolare l'uomo, allo scopo di evirare già dal punto di vista profilattico la comparsa di una resistenza parziale oppure completa durante il trattamento di una malattia proliferativa con un inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore.
Composizioni (= Preparazioni) Farmaceutiche e Procedimenti Nel caso in cui, qui di seguito, venga indicato "componente (a) e/o (b)", con questa espressione si intende indicare uno qualsiasi o più dei composti definiti sopra come componente (a) e come componente (b) , come tale, oppure un sale farmaceuticamente accettabile di uno o più dei rispettivi componenti.
Le composizioni farmaceutiche che possono venire impiegate in una combinazione secondo l'invenzione comprendono uno o più dei componenti (a) e (b) aventi le proprietà secondo l'invenzione, come ingrediente attivo, che può venire usato da solo (per esempio sotto forma di combinazione fissata) oppure può venire usato sotto forma di un kit di parti. Particolarmente preferite sono composizioni per somministrazione enterale, in particolare orale oppure parenterale. Le composizioni comprendono il componente (a) e il componente (b) oppure loro' combinazioni come tali oppure, preferibilmente, insieme con una sostanzaveicolo farmaceuticamente accettabile. La dose di qualsiasi ingrediente attivo dipende dalla malattia che deve venire trattata e dalla specie, dall'età, dal peso e dalle condizioni dell'individuo e anche dal metodo di somministrazione.
Si preferisce una composizione farmaceutica oppure una combinazione di composizioni farmaceutiche che sia adatta per la somministrazione ad un animale a sangue caldo, in particolare all'uomo, che presenta una qualsiasi delle malattie qui citate; preferibilmente, significa qualsiasi malattia che risponda ad un inibitore della abl-tirosina^chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore; in particolare significa una malattia prolif erativa scelta da un cancro, in particolare un tumore oppure leucemia, oppure una malattia proliferativa non-maligna, per esempio, aterosclerosi, trombosi, psoriasi, sclerodermite oppure fibrosi; più preferibilmente, significa una malattia scelta dal gruppo costituito da CML (leucemia mieloide cronica) e ALL (leucemia linfoblastica acuta), oppure un tumore solido, in particolare scelto da cancro dei polmoni, in particolare cancro dei polmoni con cellule non-piccole, e da cancro della prostata; nel modo più preferibile, significa una qualsiasi delle malattie or ora citate che è diventata resistente oppure sta diventando resistente ad un trattamento effettuato con uno o più degli inibitori della tirosina-chinasi citati sopra, oppure che era resistente a tale trattamento prima del trattamento con uno qualsiasi di tali inibitori della tirosinachinasi, in particolare a causa delle più elevateconcentrazioni di AG? presenti nel plasma dei sangue dell'individuo da trattare.
Le composizioni farmaceutiche contengono da circa 0,0001% fino a circa 95% di un qualsiasi componente (a) e/o (b), comprendono forme di dosaggio che sono costituite da una singola dose, preferibilmente contenente da circa 10% fino a circa 90% di un componente (a) oppure (b), e forme di dosaggio che non sono presenti sotto forma di una singola dose, che contengono preferibilmente da circa 10% fino a circa 60% di ciascun componente. Forme di dosaggio unitarie, per esempio confetti, compresse, fiale oppure capsule, contengono da circa 5 mg fino a circa 1,5 g di componente (a) e/o di conponente (b), preferibilmente da 5 mg fino a circa 1 g.
Si preparano le composizioni farmaceutiche in modo di per sè noto, per esempio adottando metodi tradizionali come miscelazione, granulazione, preparazione di formulazioni, dissoluzione oppure liofilizzazione. Per esempio, si possono ottenere composizioni farmaceutiche per somministrazione orale combinando il componente (a) e/o (b) con una o più· sostanze-veicolo solide oppure liquide, in cui è necessario granulare la miscela ottenuta e lavorare la miscela dei granuli, se si desidera, oppure se è opportuno, con aggiunta di ulteriori eccipienti, per ottenere, rispettivamente, cuori dì compresse oppure cuori di confetti, oppure soluzioni .
Adatte sostanze-veicolo sono in particolare cariche, per esempio zuccheri, come lattosio, saccarosio, mannitolo oppure sorbitolo, preparati a base di cellulosa e/o fosfati di calcio, per esempio fosfato tricalcico oppure fosfato acido di calcio, e leganti, per esempio amidi, come amido di mais, di frumento, di riso oppure di patate, metilcellulosa, idrossipropilmetilcellulosa, sodio carbossimetilcellulosa e/o polivinilpirrolidone, e/o, se si desidera, disaggreganti, per esempio di amidi indicati sopra, e inoltre carbossimetil-amido, polivinilpirrolidone reticolato oppure acido alginico oppure un suo sale, per esempio alginato di sodio. Ulteriori eccipienti sono, in particolare, sostanze che favoriscono lo SCO imento lubrificanti per eserro io ac do silicico talco acido stearICO oppur loro sai per esempio tearato di magnes oppure tearato di alcio poi et lengl col oppure loro de ivat
Si possono preparare cuori (part interne di confetti usando adatti rivestimenti, eventualmente rivestimenti enterici, tra gli altri, . soluzioni di zucchero concentrate che possono contenere gomma arabica, talco, polivinilpirrolidone, polietilenglicol e/o biossido di titanio, oppure soluzioni di rivestimento in adatti solventi organici oppure in adatte miscele di solventi organici, oppure, per la preparazione di rivestimenti enterici, soluzioni di adatti preparati della cellulosa, per esempio, acetilcellulosa ftalato oppure idrossipropilmetììcellulosa ftalato. Si possono aggiungere coloranti oppure pigmenti ai rivestimenti di compresse o ai rivestimenti di confetti, per esempio, a scopo di identificazione oppure per indicare differenti dosi di sostanza attiva.
Composizioni farmaceutiche somministrabili per via orale sono inoltre capsule riempite a secco costituite da gelatina, e inoltre capsule sigillate morbide costituite da gelatina e da un plastificante, per esempio glicerolo oppure sorbitolo. Le capsule contenenti una carica secca possono contenere un componente (a) e/o (b) sótto forma di granuli, per esempio, in miscela con cariche, come amido di mais, leganti e/o sostanze che conferiscono scorrevolezza, come talco oppure stearato di magnesio e, se opportuno, stabilizzanti (vedi sopra per "adatte sostanze-veicolo"). Nel caso di capsule morbide, la sostanza attiva, preferibilmente, viene sciolta oppure viene posta in sospensione in adatti eccipienti liquidi, per esempio, olii grassi, Lauroglycol (Gattefossé S.A., Saint Prìest, Francia), Gelucire Gattefossé S.A., Saint Priest, Francia) oppur<l>e olio di sesamo, olio di paraffina oppure polietilenglicoli liquidi, per esempio PEG 300 oppure PEG, 400 (Fluka, Svizzera) , oppure polipropilenglicoli, a ciascuno dei quali si possono anche aggiungere stabilizzanti oppure detergenti, oppure in acqua che contiene inoltre sostanze-veicolo solubili come indicate sopra, per esempio, metilcellulosa oppure mannitolo.
Altre forme orali di somministrazione sono, per esempio, soluzioni oppure sciroppi, preparati in modo usuale, che contengono componente- (a) e/o (b) per esempio sotto forma di una sospensione e in una concentrazione di circa 0,001% fino a 20%, preferibilmente di circa 0,001% fino a circa 2%, oppure in una concentrazione simile che mette a disposizione una adatta dose singola quando viene somministrata, per esempio, in quantità di 0,5 mi fino a 10 mi. Inoltre, per esempio, sono adatti concentrati sotto forma di polveri oppure concentrati liquidi per preparare frullati, per esempio, nel latte. Tali concentrati possono anche venire confezionati in quantità che costituiscono dosi singole. <' >·
Sono possibili Sistemi di Cessione Transdermica, in particolare con sostanze attive neutre. Tra le formulazioni adatte sono comprese, per esempio, circa 0, 0001% fino a circa 2% in peso di componente (a) e/o (b). In un aspetto preferito, vengono realizzate formulazioni che contengono circa 2% fino a 99,9999% (ossia il complemento a 100%) di un alcool alifatico a catena corta. Tra gli alcooli adatti sono compresi etanolo, isopropanolo, propilenglicol e glicerolo. In un aspetto più preferito, queste formulazioni, inoltre, possono contenere una sostanza che favorisce lo scorrimento. Tra le sostanze che favoriscono lo scorrimento adatte sono comprese, per esempio, decilmetilsolfossido, dimetilsolfossido e anche chetoni ciclici, lattoni, anidridi ed esteri. Alcune di queste sostanze che favoriscono lo scorrimento, inoltre, fanno aumentare la ritenzione del componente (a) e/o (b) e, così, agiscono nel senso di fare aumentare la concentrazione dì esso nella pelle. Nel caso di formulazioni per un trattamento diretto (locale), per esempio un'applicazione topica alla pelle, si preferisce usare pna sostanza che favorisce lo scorrimento che non renda massimo il flusso transdermico, ma che faccia aumentare la ritenzione del componente (a) e/o (b) nella pelle. E’ stato descritto che alcune sostanze che favoriscono il miglioramento costituite da chetoni ciclici e<' >da lattoni ciclici fanno aumentare anche la ritenzione locale e, così, esse costituiscono una classe preferita di sostanze che conferiscono proprietà migliorate per una applicazione topica del componente (a) e/o (b). In formulazioni per un trattamento sistemico, è preferibile usare una sostanza che favorisce lo scorrimento che rende massimo il flusso con una minima ritenzione locale della sostanza attiva.
Adatte composizioni farmaceutiche somministrabili per via rettale sono per esempio supposte che sono costituite da una combinazione della sostanza attiva con una base per supposte. Adatto basi per supposte sono per esempio trigliceridi naturali oppure sintetici, idrocarburi paraffinici, polietilenglicoli oppure alcanoli superiori.
L'invenzione riguarda inoltre un metodo per il trattamento degli stati patologici indicati sopra. Per questo scopo, nelle combinazioni qui precedentemente descritte, uno qualsiasi del componente (a) e/o (b), oppure un suo sale farmaceuticamente accettabile, può venire somministrato, come profilassi, oppure come terapia, preferibilmente, in una quantità che sia efficace contro le malattie citate, ad un animale a sangue caldo, per esempio uomo, che richieda tale trattamento, preferibilmente sotto forma di una composizione farmaceutica. Il dosaggio di un qualsiasi componente (a) e/o (b) dipende dalla specie di animale a sangue caldo da trattare, dal suo peso corporeo, dalla sua età e dal suo singolo stato, dalle singole condizioni farmacocinetiche, dalla malattia che deve venire trattata e dalla via di somministrazione. Preferibilmente, nel caso di un peso corporeo di circa 70 kg, si somministra una dose giornalierà compresa tra 10 mg e 2500 mg, più preferibilmente compresa tra circa 50 mg e circa 2000 mg, nel modo più preferibile compresa tra circa 100 mg e circa 1500 mg, di uno qualsiasi dei componenti (a) e/o (b). Ai bambini viene somministrata una dose corrispondentemente più bassa, con riferimento alla loro area superficiale della pelle (l'area superficiale della pelle di un adulto di 70 kg come riferimento è 1,73 m<“>).
La presente invenzione può venire illustrata dagli esempi che seguono che non devono venire intesi nel senso di limitare l'ambito della presente invenzione, ma che servono semplicemente come forme di realizzazione esemplificative.
Esempi :
Introduzione
Il gene di fusione oncogena BCR/ABL codifica per la proteina ibrida bcr/abl che, a causa della sua attività di tirosina-chinasi aumentata ed essenziale, provoca tre differenti malattie: Leucemia Mieloide Cronica (CML), parte di Leucemia Linfoblastica Acuta (ALL) e Leucemia Mieloide Acuta (AML).
Il blocco della attività di bcr/abl-chinasi rappresenta una strategia nuova e razionale per il trattamento di CML, e di altri tipi di cancro provocati da questa proteina di fusione oncogena (Druker. B. J., et al.: Effects of a selective inhibitor of thè Abl tyrosine kinase on thè growth of Bcr-Abl positive cells. Nat. Med. 2: 561-6, 1996).
STI571 {precedentemente noto come CGP57148) rappresenta un inibitore attivo e relativamente specifico dell'attività di bcr/abl-chinasi. STI571 blocca la proliferazione e provoca apoptosi in cellule BCR/ABL+ in vitro; esso inibisce la crescita di cellule dei midollo osseo clonogenici ottenute da pazienti CML, e può eliminare la crescita di cellule leucemiche in vivo. L'attività di STI571 in vivo è condizionata dall'ottenimento di una inibizione bcr/abl stabile e continua, che richiede somministrazioni giornaliere multiple nel modello che è stato studiato su topi (le Coutre et al., J. Nati. Cancer Inst. 91_, 163-168 (1999).
Sulla base di questa informazione e di ulteriori informazioni, il STI571 viene ora esaminato in-prove cliniche iniziali in CML e in altre malattie associate con BCR/ABL. E' reperibile un'informazione molto limitata per ciò che riguarda la possibile manifestazione di resistenza nei confronti di STI571. Si sono selezionate in vitro due linee di cellule per ciò che riguarda la resistenza a STI571 (le Coutre P., et al., Blood 90.496a, 1997). Il meccanismo di resistenza non è noto, in un caso, mentre, nel secondo caso, esso comporta una amplificazione BCR/ABL e una sovraespressione di proteine. La rilevanza biologica di queste sottolinee scelte in vitro, tuttavia, rimane da verificare, poiché le condizioni di selezione in- vitro sono- differenti e, usualmente, sono più drastiche rispetto a quelle selezionate in vivo.
Non è reperibile alcuna informazione riguardante lo sviluppo e la caratterizzazione di una resistenza in vivo nei confronti di STI571. in un modello su topo precedentemente descritto dalla Richiedente (le Coutre P., et al., J. Nati. Cancer Inst. 9JL, 163-163 (1999) in alcuni animali si è notata una carenza del trattamento, quando questo trattamento è stato ritardato di una settimana dopo l'iniezione di cellule leucemiche, ed era già presente una massa misurabile. Pertanto, tale modello potrebbe essere utile per studiare e caratterizzare la possibile manifestazione di una resistenza nei confronti di STI571 in vivo.
In questo caso viene dimostrato un modello per la resistenza in vivo nei confronti di STI571. Inoltre, viene identificata e convalidata sperimentalmente la caratterizzazione molecolare di tale modello e anche la strategia per superare il manifestarsi di una resistenza.
PRODOTTI E METODI STI571 :
STI571 (precedentemente noto come CGP57148B) viene ottenuto come descritto in EP 0.564.409 e in WO 99/03854. Per gli esperimenti in vitro, si preparano soluzioni-madre di questo composto a concentrazioni di 1 mM e di 10 mM, che vengono filtrate e conservate a -20°C e quindi vengono scongelate prima di fare iniziare l'esperimento e vengono usate ad una concentrazione dì 0,1-10 μΜ. Le preparazioni usate per animali da esperimento vengono preparate giornalmente ad una concentrazione di 16 mg/ml e vengono sciolte in acqua oppure in una soluzione di metilcellulosa al 5% (Methocell, Fluka) e vengono mantenute a 4°C.
ERITROMICINA
Per esperimenti in vitro si usa eritromìcina base (Sigma). Si prepara una nuova soluzione-madre appena prima di ciascun esperimento ad una concentrazione di 20 mM e la si impiega ad una concentrazione dì 1-100 μΜ. Si scioglie la eritromicina in etanolo e la si diluisce ulteriormente con acqua distillata. Nel caso di esperimenti in vivo, si impiega eritromicina estolato (gentilmente fornito dalla Gist-Brocades Italy SPA, Capua, Italia) ad una concentrazione di 35 mg/ml, in una soluzione di metilcellulosa al 5% e di STI571 16 mg/ml.
SOMMINISTRAZIONE IN VIVO DI STI571
Topi nu/nu CD1 femmine aventi un'età di 7 fino a 9 settimane, acquistati presso la Charles River Breedin Laboratories (Calco, Italia) vengono mantenuti in condizioni di laboratorio standard secondo le lineeguida dell'Istituto Nazionale del Cancro, Milano, Italia. Questo studio è approvato dal comitato di etica istituzionale per animali da laboratorio usati in ricerche sperimentali. Si inietta una linea di cellule positive bcr/abl KU812 (50 x IO<6 >cellule per ogni animale) per via sottocutanea nel fianco sinistro dell’animale. Si effettua un trattamento per via orale usando una siringa collegata ad un tubo di materia plastica flessibile introdotto in esofago (sonda). Ogni 3-4 giorni sì controllano il peso del tumore (TW) e il peso totale. Si calcola il TW per mezzo della formula TW (mg)= (d<Z >xD), in cui d e D sono, rispettivamente, il diametro più corto e il diametro più lungo del tumore, misurati in millimetri. Si fa iniziare il trattamento 1-11 giorni dopo l'iniezione contro la leucemia.
LINEE DI CELLULE
Si impiega la linea di cellule KU812 della leucemia umana positiva Bcr/Abl (vedere Kishi K. A new leukemia celi line with Philadelphia chromosome characterized as basophil precursors. Leuk Res _9: 381-90, 1985). La linea KU812 è stata ottenuta da un paziente CML in crisi da blastomi, e viene mantenuta in RPMI 1640 (Bio Whittaker Europe) integrato con siero di feto di vitello (FCS) al 10% in condizioni di coltura delle cellule standard.
La linea di cellule KU812 è reperibile presso Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen e Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg, Braunschweig, Germania e ha il numero di accesso DSMZ No: ACC 378.
Altre lìnee di cellule analoghe che possono venire usate nelle prove descritte <' >gui di seguito sono:
Linea di Cellule: BV-173 (Tipo di Cellula: leucemia dei precursori di cellule B umana) DSMZ No: ACC 20; Linea di Cellule: K-562 (Tipo dì Cellula: leucemia mieloìde cronica umana in crisi da blastomi) DSMZ No: ACC 10;
Linea di Cellule: LAMA-84 (Tipo di Cellula: leucemia mieloide cronica umana -in crisi da blastomi) DSMZ No: ACC 168;
Linea di Cellule: EM-3 (Tipo di Cellula: leucemia mieloide cronica umana in crisi da blastomi) DSMZ No: ACC 134;
Linea di Cellule: MEG-01 (Tipo di Cellula: leucemia mieloide cronica umana in crisi da blastomi megacariocitici) DSMZ No: ACC 364; oppure
Linea di Cellule: NALM-1 (Tipo di Cellula: leucemia mieloide cronica umana in crisi da blastomi) DSMZ No: ACC 131.
DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITÀ’ DI PROLIFERAZIONE IN VITRO (SAGGIO DI ASSORBIMENTO DI TIMIDINA TRITIATA [<3>HtdRj
Si seminano 200 μΐ di ciascuna linea di cellule (KU 812, LAMA 84), contenente 104 cellule, a diverse concentrazioni di STI571, comprese tra 0 e 10 μΜ in piastre per microtitolazione da 96 pozzetti (Corning Costar Corp., Cambrige, MA) effettuando 6 replicazioni. Dopo 54 ore a 37°C, in ciascun pozzetto si introducono 20 μΐ di RPMI 1640/FCS 10% contenente timidina tritiata (1 pCi/pczzetto) . Dopo ulteriori 18 ore, le cellule sono state raccolte e trasferite su un filtro (Spot-on filtermat, Pharmacia Biotech Europe, Brussels, Belgio). L’assorbimento di timidina tritiata viene determinato mediante un contatore di scintillazione di liquidi 1205 betaplate (Wallac Ine., Turku, Finlandia) . Il valore CI50 (concentrazione dì inibizione 50) è definito come la concentrazione di un composto che provoca una diminuzione 50% della proliferazione in confronto con controlli non trattati .
ANALISI WESTERN BLOT
Si effettua l’analisi "immunoblotting" come precedentemente descritto (Gambacorti-Passerini, C., et al-, Blood Cells, Molecules, and Diseases 23, 380-94, 1997). Si lavano le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato, fredda (PBS) e quindi si sottopongono a lisi in 200 μΐ di tampone di IX Laemmli (Tris-HCl 50 mM pH 6,8, SDS 23⁄4, blu di bromofenolo 0,13⁄4, glicerolo 10<■>3⁄4, β-mercaptoetanolo 5%). Lisati di cellule, corrispondenti a 90.000-150.000 cellule, vengono fatti bollire a 95°C per 10 minuti, vengono sottoposti -ad ultrasuoni per 1 minuto e vengono analizzati mediante elettroforesi su gel SDS usando gel di poliacrilammidi 7,5%. Si rivelano bcr-abl endogena, bcr-abl tirosina-forforilata e actina endogena con il corrispondente anticorpo monoclonale di topo oppure antisiero di coniglio e, quindi, si effettua la visualizzazione mediante rivelazione con chemioluminescenza aumentata (ECL, Amersham Corp.) usando immunoglobulina G anti-topo oppure anti-coniglio di capra legata a perossidasi di rafano come anticorpo secondario (Amersham Corp.). L'anticorpo anti-abl monoclonale (clone Ab-3) viene acquistato da Calbiochem. L'anticorpo anti-fosfotirosina monoclonale (clone 4G10) viene acquistato da Upstate Biotechnology. La anti-actina policlonale di coniglio viene acquistata da Sigma. Si effettua un'analisi densitometrica usando un fotodensitometro Eagle Eye 11 (Stratagene) e le intensità di bande di bCr-abl tirosina-fosforilate vengono normalizzate contro i livelli di espressione di bcr-abl e dì actina.
DETERMINAZIONE DI AC-P
Livelli di siero dì glicoproteina acida alfa-1 (AGP) vengono rivelati mediante il metodo di immunodiffusione oppure mediante il metodo di isoelettrofocalizzazione. Per la immunodiffusione, si introducono 5,0 μΐ di ciascun campione in un pozzetto di una piastra di agar (SRID, saggio su piastra di immunodiffusione radiale singola, Cardiotech Services JINIC Louisville, 1KY, USA) che contiene antisiero AGP. La piastra viene sottoposta ad incubazione per 24 ore a 37°C. La quantica specifica di AGP all'interno del campione viene misurata sulla base delle dimensioni dell'anello di precipitina e viene determinata mediante confronto con standard a 1000, 250 e 125 μg/ml , forniti con ciascun kit di prova . Si effettuano le determinazioni in doppio . Per la isoelettrofocalizzazione, un IPG (gradiente a pH immobilizzato) (Gianazza, E. , Celentano, F. , Ettori, C. , Righetti, P. G., Immobilized pH gradiente: Theory and methodology. Electrophoresis .1989, 10 806-808) nell'intervallo pH 2,5-5 viene colato tra una soluzione acida contenente Immobilìna pK 1,3 mM, pK 3,6, 11,83 mM, pK 93 076 M 129 M T e soluzione basica contenente limnobilina pK 3,6, 9,28 mM, pK 4,6, 9,50 mM, e pK 9,3, 16,13 mM (Amersham Pharmacia, Uppsala, Svezia) . Dopo polimerizzazione, il gel viene lavato 3 volte in glicerolo 1%, viene essiccato e nuovamente idratato in urea 8M - 0,5% di anfoliti-veicolo, intervallo di pH 2,5-5 (Pharmacia). Successivamente, in prossimità del catodo si pongono porzioni' di siero da 7,5 μΐ, diluite fino a 25 μΐ con 2-mercaptoe tanolo al 2i. Dopo una prova notturna a 55 V/cm, i campioni vengono focalizzati per 90 minuti a 165 V/cm. Il diagramma delle proteine viene colorato con Coomassie.
VALUTAZIONE DEI PARAMETRI DI LEGAME
Plasma oppure AGP umano purificato (Sigma) oppure Albumina (diluita in PBS) vengono sottoposti a incubazione a diverse concentrazioni di STI571 a temperatura ambiente per 3Q minuti. Si determinano le concentrazioni di STI571 mediante HPLC, con un limite inferiore di rivelazione di 0,1 μΜ. Si determina STI571 libero mediante ultrafiltrazione con una soglia di separazione a 30 KD. Si costruiscono diagrammi Scatchard modificati. Si calcola la Costante di Associazione (Ka) come precedentemente descritto (Fuse, E., Tanii, .H., Kurata, N., et al., Cancer Res-, 58, 3248-53, 1998).
ANALISI STATISTICA
Si effettua un'analisi statistica secondo Fisher exact test oppure T Student usando il programma Prism: Per l'analisi di sopravvivenza, si confrontano i dati effettuando il saggio logrank. I valori P inferiori a 0,05, sono considerati statisticamente signif icativi e vengono ottenuti da prove statistiche su due lati.
Esempio 1: L'efficacia di STI571 è in relazione con il carico tumorale iniziale
Topi "nude" vengono iniettati per via sottocutanea con 50 milioni di cellule KU812. Si fa iniziare il trattamento dopo, rispettivamente, 1, 8 e 15 giorni {gruppi 1 fino a 111), in presenza di circa 50 milioni, 300 milioni e 1 bilione di cellule leucemiche. Sebbene in tutti i gruppi si osservi una regressione del tumore, si ottengono effetti di guarigione soltanto nei primi 2 gruppi. La Figura 1 A mostra i risultati di un esperimento rappresentativo. Mentre tutti gli animali presenti nel gruppo I vengono fatti guarire in modo riproducibile, i topi del gruppo II sviluppano ricadute in misura compresa tra 338 e 408; non si osserva alcuna guarigione nei topi del gruppo III. Le ricadute, usualmente, avvengono da 1 a 3 settimane dopo l'interruzione del trattamento. La Figura 1 B presenta i risultati combinati ottenuti da 3 differenti esperimenti. E' evidente una chiara relazione tra la quantità di tumore presente all’inizio del trattamento e il risultato della terapia. Una possibile spiegazione di questi risultati potrebbe consistere nell'insufficiente durata della somministrazione di STI571 nei topi del gruppo II e dei gruppo III. Per convalidare questa ipotesi, si trattano topi del gruppo II per 11 giorni oppure per 18 giorni. Il risultato di un esperimento esemplificativo viene riportato nella Figura 1 C e indica che un aumento della durata del trattamento non fa migliorare il grado di guarigione. Questi risultati indicano che, in questo modello, il trattamento con STI571 può fare guarire gli animali soltanto se il tumore viene asportato nei primi 11 giorni di trattamento. Se ciò non avviene, non si può ottenere la guarigione anche con un'esposizione prolungata al composto. In altre parole: E' comparso un certo tipo di resistenza.
Esempio 2: Tumori che si manifestano in fase di ricaduta mostrano resistenza in vivo, ma conservano la sensibilità in vitro a STI571
Animali che presentano tumori ricorrenti vengono trattati nuovamente adottando il medesimo modello STI571 (11 giorni di regime). Il trattamento viene fatto iniziare appena i tumori anche in questo caso diventano misurabili. La Figura 2 mostra un esperimento esemplificativo. E' evidente che i tumori comparsi in fase di ricaduta rispondono in modo scarso al nuovo trattamento, ed eventualmente iniziano a crescere in modo simile a quello secondo il quale crescono tumori in animali non trattati (linee tratteggiate) . Sebbene le cellule leucemiche siano resistenti in vivo a STI571, la loro sensibilità intrinseca nei confronti di STI571 non è nota. Per esaminare questo risultato, si recidono tumori dai rimanenti animali, si ottengono sospensioni di cellule e si pongono le cellule in coltura e si esaminano per la loro sensibilità in vitro nei confronti di STI571 entro 24-48 ore, come precedentemente descritto (le Coutre P., et al., J. Nati. Cancer Inst. _91, 163-168 (1999). La Figura 3 presenta i risultati ottenuti da 2 di tali tumori. Risulta evidente che le cellule leucemiche ottenute da animali resistenti conservano la loro sensibilità a STI571, in quanto il loro valore CI50 non differisce da quello della linea di cellule KU812 dalla quale esse derivano. Questi risultati ci hanno portano a valutare se l'attività di chinasi di<- >proteina thr bcr/abl viene ancora inibita da una somministrazione di STI571. Per questo scopo, si effettuano esperimenti di farmacocinetica molecolare (descritti da le Coutre P., et al., J. Nati. Cancer Inst. 9_1, 163-168 (1999), per esaminare il grado e la durata della inibizione di Bcr/Abl in vivo, in animali che non vengono pretrattati oppure in topi che hanno presentano ricadute dopo il trattamento iniziale e che erano resistenti ad un secondo ciclo di somministrazione di STI571. Topi affetti da tumore vengono sottoposti ad Un trattamento energico e vengono uccisi in corrispondenza .di 2 ore e di 4 ore. I livelli di attività di chinasi Bcr/Abl (misurata come autofosforilazione) ottenuti in un esperimento esemplificativo vengono riportati nella Figura 4. Mentre topi non sottoposti a pretrattamento mostrano l'inibizione precedentemente indicata nella fosforilazione bcr/abl in corrispondenza di 2 ore e di 4 ore (piste 4 e 6), gli animali che hanno presentato ricadute, resistenti a STI571, non vengono inibiti dal trattamento (piste 3 e 5). Questi esperimenti indicano che topi che hanno presentato ricadute sono resistenti ad un ulteriore trattamento e che in questo caso non si è avuta alcuna inibizione dell'attività di chinasi bcr/abl. Tuttavia, le cellule leucemiche conservano la loro sensibilità in vitro a STI571.
Esempio 3: Livelli plasmatici di STI571 in topi che hanno presentato ri cadute
Una possibile spiegazione dei risultati riportati sopra può consìstere in un aumentato metabolismo di STI571 in animali pretrattati, con conseguenti inferiori livelli plasmatici di STI571. Per studiare questo risultato, topi affetti da tumore, pretrattati con STI571 oppure non pretrattati con STI571 (topi di controllo) vengono uccisi in corrispondenza di mezz’ora, 2,0 ore e 5,0 ore dopo un trattamento acuto con STI571 e si determinano le concentrazioni totali piasmatiche di STI571 mediante HPLC. I risultati sono rappresentati nella Figura 5. Mentre gli animali di controllo e gli animali pre-trattati raggiungono livelli plasmatici simili in corrispondenza di 30 minuti, i livelli di, STI571 diminuiscono più rapidamente in animali di controllo, in confronto con topi pretrattati (p inferiore a 0,01). Concentrazioni intratumorali presentano un modello opposto, ossia tumori presenti in animali pretrattati contengono minori concentrazioni di STI571 in ogni momento, e questo fenomeno raggiunge un'importante statistica in corrispondenza della 5^ ora. Questi risultati non confermano la nostra ipotesi e inoltre mostrano che animali resistenti mantengono concentrazioni di STI571 più elevate nel sangue per un prolungato periodo di
compatibili presenza,
legare fare diminuire la distanza clearance
Esempio 4: La glicoproteina Acida Alfa 1 (AGP) fissa STI571 e inibisce i suoi effetti
Due proteine del plasma che possono fissare farmaci sono albumina e AGP. Preferibilmente, AGP lega molecole basiche (Kremer et al-, Drug binding to human alphal-acidic glycoprotein in health and
usano cellule KU812 in vitro per valutare l'effetto di AGP sull'attività biologica di STI571. Poiché AGP di topo non è reperibile in quantità sufficienti per questo tipo di esperimenti et al
I risultati di un esperimento esemplificativo sono riportati nella Figura 6 A. evidente che AGP
questo effetto è proporzionale alla concentrazione di
et al Blood Cells Molecules
1997) fino ad oltre 3,0 μΜ con una concentrazione di AGP di 2 mg/ml. In un esperimento separato, il valore CI50 a 2,0 mg di AGP viene calcolato in 4,5 μΜ (dati non indicati). L'albumina non fa aumentare sostanzialmente il valore CI3⁄4= per STI571, anche con una concentrazione di 5,0 g% (Figura 6 B). Pertanto, AGP, ma non l'albumina, può fare aumentare il valore CI50 per STI571 fino a valori 90 volte superiori a quelli dei controlli.
Poiché si nota un effetto di inibizione di AGP, si calcolano le Costanti di Associazione (Ka) di STI571 per AGP e per albumina. Per questo scopo, si sottopone ad incubazione una quantità fissata di AGP (5 μΜ) con differenti concentrazioni di STI571 e, mediante ultrafiltrazione, si valuta la quantità di farmaco non legato (frazione libera) . Si ottengono curve di diagrammi Scatchard da AGP e da albumina. Nel caso di AGP, si è trovato un valore di 8,7 litri/mole, che è circa 60 volte superiore rispetto al valore Ka calcolato per l'albumina (0,15). Questi risultati indicano che, sebbene l'albumina e AGP possano legare STI571, AGP lega STI571 con un'affinità molto più elevata e, come risultato, inibisce l'attività biologica di STI571.
Per confermare i risultati indicati sopra, cellule KU812 vengono trattate in vitro con sieri contenenti differenti quantità di AGP. La Figura 7 presenta un esperimento illustrativo nel quale si aggiungono 2 sieri contenenti rispettivamente 130 pg/ml e 1150 pg/ml (ad una concentrazione finale di 15%) a colture di KU812. E' evidente che l'inibizione dell'attività di STI571 è associata con il rispettivo contenuto in AGP di ciascun campione di siero. La variazione nella percentuale di siero presente nella coltura provoca un proporzionale aumento oppure una proporzionale diminuzione nella sua attività di inibizione (non mostrato). Si conclude che AGP può legare STI571, questo legame ha importanti conseguenze biologiche e blocca la possibilità di STI571 di inibire l'attività enzimatica di STI571.
Esempio 5: Relazione tra livelli di AGP nel siero, carico tumorale e trattamento con STI571
I risultati precedentemente presentati indicano che AGP, una proteina del plasma inducibile, inibisce notevolmente l’attività di STI571 in vitro. Si determinano i livelli plasmatici di AGP in topi "nude” in corrispondenza di diversi stadi di malattia, mediante immunodiffusione, per valutare se detti valori possono venire associati alla sensibilità in vivo di cellule leucemiche KU812 nei confronti di un trattamento con STI571. La Figura 8 A presenta i valori di AGP in topi in diversi stadi di malattia. I valori di AGP basali in topi sono molto bassi (96 ± 21 pg/ml). Le concentrazioni di AGP aumentano proporzionalmente in relazione alla presenza di tumori. Topi aventi un carico tumorale di 200 mg (corrispondente circa a 200 milioni di cellule leucemiche) presentano un aumento quadruplo nei valori AGP (383 ± 131), mentre topi che presentano tumori di 0,8-1 mg presentano valori di AGP superiori a 1 mg/ml (1580 ± 234). Animali con tumori misurabili che vengono curati, presentano una diminuzione progressiva nelle concentrazioni di AGP e ritornano a livelli normali in 4-8 settimane. Esperimenti effettuati con AGP purificato indicano che le variazioni nelle concentrazioni di AGP osservate tra topi normali e animali che presentano grossi tumori, provocano una variazione nella frazione di STI571 legata ad AGP compresa tra 42% e oltre il 99% (non indicato) . E’ interessante indicare che un trattamento con STI571 (160 mg/kg p.o. per 11 giorni) provoca un aumento inferiore, però statisticamente significativo, di valori di AGP (213 ± 43). I valori di AGP aumentati in topi affetti da tumore vengono inoltre evidenziati per mezzo di isoelettrofocalizzazione (Figura 8 B). Questi risultati, presi insieme, indicano che un carico tumorale (e, in minor misura, un pretrattamento con STI571) provoca la sintesi di AGP, una proteina del plasma che, a sua volta, può legare e disattivare STI571.
Esempio 6: Eritromicina, un legante di AGP, può alleviare il blocco, favorito da AGPf di attività di STI571 in vitro (a) E' noto che parecchi farmaci legano AGP, ivi compresa la eritromicina (Kremer et al., Pharmacologicai Reviews 4(3, 1-47 (1988). Se il meccanismo mediante il quale AGP blocca STI571 viene favorito dal legame di AGP a STI571, allora, una certa molecola capace di legare AGP avrà un'azione competitiva con STI571 per legare AGP, così rendendo il STI571 più disponibile per ottenere un'attività biologica. Per convalidare tali ipotesi, si aggiunge eritromicina, a 5-30 μΜ a colture di KU812 contenenti STI571 e AGP. I risultati di un esperimento illustrativo vengono rappresentati nella Figura 9. La eritromicina ripristina la sensibilità nei confronti di STI571 con una chiara relazione dose/risposta. ,La eritromicina non modifica il valore CI50 per STI571 in assenza di AGP, escludendo così un effetto diretto sull'effetto anti-leucemia di STI571 (non indicato).
(b) Gli effetti della eritromicina vengono anch'essi valutati sul blocco dell'attività di bcr/abl chinasi favorito da STI571 (Figura 10). Le cellule KU812 vengono trattate in vitro con STI571, con AGP e con eritromicina, vengono sottoposte ad incubazione a 37 °C per 60 minuti e vengono sottoposte a lisi; la quantità di attività di chinasi viene quindi valutata usando un anticorpo anti-fosfotirosina. La Figura 10 indica che AGP inibisce 1.'attività di STI571. Si può ripristinare l’attività di STI571 mediante aggiunta di eritromicina.
Gli esperimenti (a) e (b) mettono in evidenza, in 2 differenti prove, che l eritromicina può ripristinare, in vitro, la sensibilità nei confronti di STI571.
Esempio 7: Effetti in vivo della somministrazione di eritromicina e di un pretrattamento con STI571
(a) La Richiedente, avendo dimostrato l'effetto di inibizione di AGP, 'e il suo effetto inverso provocato da eritromicina in vitro, convalida sperimentalmente la modulazione in vivo di valori di AGP oppure delle loro possibilità di legame. In topi si iniettano cellule KU812 e si fa iniziare il trattamento 11 giorni dopo in presenza di un carico tumorale di circa 400 mg. In questo caso, ci si aspetta una scarsa azione di cura oppure .nessuna azione di cura da un trattamento standard con STI571. Si trattano i topi con STI571 (160 mg/kg p.o. ogni 8 ore) da solo oppure in combinazione con eritromicina estolato (350 mg/kg ogni 8 ore) per 18 giorni. Si sceglie la formulazione estolato della eritromicina poiché si è precedentemente dimostrata la sua buona biodisponibilità in topi, la dose scelta essendo quella che ci si poteva aspettare per ottenere concentrazioni di picco superiori a 20 μΜ. Come esemplificato nella Figura 11 A, il trattamento combinato provoca una diminuzione del tumore notevolmente più elevata in corrispondenza del giorno 6, e a partire dal giorno 16. E' importante notare che, mentre la regressione del tumore è progressiva in topi che sono stati sottoposti al trattamento combinato, alcuni tumori iniziano a ricrescere durante gli ultimi giorni di trattamento nel gruppo trattato soltanto con STI571. L'effetto di aggiunta di eritromicina a STI571 è anche più evidente, quando si confrontano i gradi di guarigione nei 2 gruppi (Figura 11 B). Nelle serie di topi ai quali è stato somministrato STI571 da solo, 5/15 animali presentano la scomparsa del tumore. Tuttavia, 4 animali hanno avuto ricadute tra il 25- giorno e il 40- giorno, soltanto 1/13 degli animali venendo fatto guarire in corrispondenza del 120- giorno (primo giorno di trattamento) . Nel gruppo di topi ai quali era stata applicata la terapia combinata eritromicina/STÌ571, 14/15 topi risultavano privi di tumori, e soltanto 1 animale è morto, in corrispondenza del 30- giorno. Pertanto, 10/12 animali vengono curati effettuando il trattamento combinato; questo valore è notevolmente diverso (p inferiore a 0,01) da quello (1/13) ottenuto soltanto nel gruppo trattato con STI571. I gruppi di controllo ai quali è stata somministrata eritromicina, da soli, non presentano alcuna comparsa di regressiope tumorale (-non indicata).
(b) Si valutano, inoltre, gli effetti biologici di un trattamento con STI571. I topi vengono pretrattati oppure non vengono pretrattati con STI571 per 11 giorni, vengono iniettati con cellule KU812 e quindi vengono trattati con 'STI571) (160 mg/kg ogni 8 giorni per 11 giorni), partendo 24 ore dopo avere effettuato l'iniezione di cellule leucemiche. In questi casi, ci si aspetta che 100% degli animali siano stati guariti mediante l'impiego di STI571. I risultati sono riportati nella Figura 12. Nel gruppo di controllo (topi non pretrattati), 0/14 animali hanno sviluppato crescita tumorale. Nel gruppo di topi pretrattati, si sono avute crescite di tumori di 7/14 (p inferiore a 0,05), e ciò sta ad indicare che l'aumento di AGP associato con il precedente trattamento con STI571 può anch'esso provocare un significativo effetto biologico. Questi risultati, presi insieme, mettono in evidenza sperimentalmente gli effetti di negatività di AGP sull'attività terapeutica di STI571; essi inoltre suggeriscono e mettono a disposizione una parziale valutazione sperimentale fino ad una strategia a scopo mirato, all'atto del passaggio nella resistenza in vivo favorito da AGP, usando molecole che sono in grado di legarsi ad AGP in competizione con STI571.
Esempio 8: Compresse contenenti 4- [(4-met i1-1 -piperazin-l-ilmetil) -N- [4-metil-3-[[4- (3-piridinil)-2-pirimidinil] animino]fenij]benzammide metansolfonato, forma di cristalli β '
Usualmente, si preparano compresse contenenti 100 mg della sostanza attiva indicata nel titolo, con la seguente formulazione: ,
Preparazione: Sì mescola la sostanza attiva con sostanze di supporto e si effettua la compressione in una macchina per la produzione di compresse (Korsch EKO, diametro del punzone 10 mm).
Avicel è cellulosa microcristallìna (FMC, Philadelphia, USA).
PVPPXL è polivinilpirrolidone, reticolato (BASF<'>, Germania) .
Aerosil è biossido di silicio {Degussa, Germania). Esempio 9: Capsule contenenti 4 - [(4-me t i1- 1-piperazin-l-ilmetil) -N- [4-metil-3- [[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil] ammino] fenil )benzammide metansolfonato,<' >forma di cristalli β
Usualmente, si preparano capsule contenenti 100 mg del composto indicato nel titolo come sostanza
attiva con la seguente formulazione:
Si preparano le capsule mescolando i componenti e introducendo la miscela in capsule di gelatina dura, dimensione 1. PVPPXL = Crospovidone XL (vedi Esempio 10) .
Esempio 10: Capsule contenenti 4-[(4-metil-lpiperazin-l-ilmetil )-N- [4*-metil-3- [[4- (3-piridinil)-2-pirimidinil] ammino] fenil]benzammide metansolfonato, forma di cristalli β
Crospovidone XL: Povidone reticolato = omopolimero reticolato, insolubile ,in acqua, di N-vinil-2-pirrolidone.
Aerosil 200: Gel di silice puro (area superficiale secondo BET 200 ± 25 m /g, diametro medio dei granuli 12 nm).
Avicel: cellulosa microstallina.
La composizione del riempimento delle capsule per le capsule da 100 mg, 50 mg e 25 mg è identica. Si ottengono le differenti concentrazioni di dosaggio facendo variare soltanto il peso di riempimento della capsula. Le dimensioni delle capsule desiderate sono 100 mg per il tipo 1, 50 mg per il tipo 3 e 25 mg per il tipo 4.
Tabella 1 Composizione per capsulè
Esempio 11: Composizione di una tipica formulazione di Eritromicina
In questo caso, si può usare qualsiasi formulazione standard nota per la eritromicina.
Un esempio per una formulazione con eritromicina estolato è il seguente:

Claims (9)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Preparato costituito da una combinazione che contiene (a) almeno un inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore e (b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glìcoproteina acida (AGP); oppure sali farmaceuticamente accettabili di un qualsiasi componente (a), (b) oppure (a) é (b), se è presente almeno un gruppo che forma sale, e una sostanza-veicolo farmaceuticamente accettabile.
  2. 2. Preparato costituito da una combinazione secondo la rivendicazione 1, in cui 1'inibitore della abl-tirosina-chìnasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore (a) è scelto dal gruppo costituito da: (i) un composto di una 7H~pirrolo [2,3-d]pirimidina di formula VI
    in cui q è 0 oppure 1, n è compreso tra 1 e 3 quando q è 0, oppure n è compreso tra 0 e 3 quando q è 1, R è alogeno, alchile inferiore, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, alcossi inferiore, carbossi, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiorealchilcarbammoile, N, N-di-inferiore-alchilcarbammoile, il gruppo ciano, un gruppo amminico, inferiorealcanoilamminico, inf eriore-alchilamminico, N,N-diinferiore-alchilamminico oppure trif luororaetile, essendo possibile quando Sono presenti nella molecola parecchi radicali R, che questi radicali siano identici oppure differenti; a) Ri e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, indicano a) fenile sostituito con carbammoil-metossi , carbossi-metossi, benzoilossicarbonil-metossi, inferiore-alcossicarbonil^metossi, fenile, ammino, inf eriore-alcanoi laminino, inferiore-alchi laminino, N,N-di -inf eriore-e tilaminino, ossidrile, inferiorealcanoilossi, carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N,N-diinferiore-alchilcarbammoile, gruppo ciano oppure con nitro-gruppo; β) idrogeno; γ) pi ridi le non sosti tuito oppure alogeno oppure inferiore-alchil -sostituitilo; δ) N-benzil-piridinio-2-ile; naftile; ciano; carbossile; inferiore-alcossicarbonile; carbaramoile; N-inferioreaìchilcarbammoile; N, N-di-inferiore-alchilcarbammoile; N-benzilcarbammoile; formile; inf eriore-alcanoile; inferiore-alchenile; inferiore-alchenilossi ; oppure ε) inferiore-alchile sostituito con εα) alogeno, animino, inferiore-alchil ammino, piperazino, di-inferiore-alchi laminino; εβ) fenilammino che è non sostituito oppure è sostituito nella porzione fenile con alogeno, alchile inferiore, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, inferiorealcossi , carbossile , inferiore-alcossicarbonile , carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N, N-diinferiore-alchilcarbammoile, gruppo ciano, ammino, inferiore-alcanoilammino, inferiore-alchilammino, N,N-di-inferiore-alchilammino oppure con trifluorometile, ey) ossidrile , alcossile inferiore , gruppo ciano , carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile , N, N-di-inferiorealchilcarbammoile, mercapto, oppure εδ) con un radicale di formula R3-S (0) m- in cui R3 è alchile inferiore e m è 0, 1 oppure 2, oppure b) quando q è 1, uno dei radicali Ri e R2 è alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito e gli altri radicali Ri e R2 hanno uno dei significati riportati sopra nel paragrafo a) ad eccezione di idrogeno, oppure c) Ri e R2 insieme sono C4-C10-1 , 4-alcadienilene sostituito con ammino, inf eriore-alcanoilammino, inferìore-alchilammino, N, N-di-inferiore-alchilammino, nitro, alogeno, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, carbossile, inferiore-alcossìcarbonile, carbammoile, N-inf eriore-alchilcarbammoile, N,N-di-inferiorealchilcarbammoile oppure con il gruppo ciano oppure sono aza-1, 4-alcadienilene avente fino a 9 atomi dì carbonio, oppure d) quando q è 1, Ri e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito oppure hanno uno dei significati riportati sopra nel paragrafo a) , e R6 è idrogeno, alchile inferiore, inferiorealcos sicarboni le , carbammoile, N-inferiorealchi lcarbammo i 1 e oppure N, N-di-inferiorealchilcarbammoile, oppure un suo sale; e (ii) un derivato di una N-fenil-2-pirimidina-ammina di formula I
    m cui Ri è 4-pirazinile, 1-met il-IH-pirrol ile, fenile ammino- oppure ammino^inferiore-alchil-sostituito, in cui il gruppo ammìnico in ciascun caso è libero, alchilato oppure acilato, ΙΗ-indolile oppure lH-immidazolile legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell'anello a cinque membri, oppure piridile non sostituito oppure inferiore-alchilsostituito legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell'anello e non sostituito oppure sostituito in corrispondenza dell'atomo di azoto con ossigeno, R2 e R3, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono idrogeno oppure alchile inferiore, uno oppure due dei radicali R-j, R5, R6, R7 e R8 sono ciascuno il nitro-gruppo, inferiore-alcossi fluorosostituito oppure un radicale di formula II (II), in cui Rg è idrogeno oppure alchile inferiore, X è un osso-gruppo, un tio-gruppo, immino, N-inf er iore-alchi 1-immino , idrossiimmino oppure O-inferiore-alchil-idrossiimmino, Y è ossigeno oppure è il gruppo NK, n è 0 oppure 1 e Rio è un radicale alifatico avente almeno 5 atomi di carbonio, oppure un radicale aromatico, aromaticoalifatico, cicloalif atico, cicloalifatico-alif atico, eterociclico oppure eterociclico-alifatico e gli altri radicali R4, R5, R6, R7 e Re, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono idrogeno, alchile inferiore che è non sostituito oppure è sostituito con un gruppo amminico libero oppure alchilato, con piperazinile, piperidinile , pirrol idinile oppure con morfolinile oppure ‘sono alcanoile inferiore, trif luorometile, ossidrile libero, eterificato oppure esterificato, il gruppo amminico libero, alchilato oppure acilato oppure carbossile libero oppure esterificato, oppure un sale di tali composti che hanno almeno un gruppo che forma sale; e il composto organico in grado di legarsi alla αΐ-glicoproteina acida (AGP) (b) è scelto dal gruppo costituito da: Nicergolina, Prazosin, Alfehtanil, Ketamine, Ethidocaine, Fentanil, Meperidina, Metadone, Fenilbutazone , Bupivacaine, Etidocaina, Fenciclidina, Lidocaina, Fenciclidina, Aprindina, Disopiramide, Chinidina, Verapamil, Eritromicina, Aceno coumarol, Dipyridamole, PCR2362, Ticiopidine, Warfarin, Phenytoin, Carbamazepine, Naproxen, Alprenolol, Metoprolol, Oxprenolol, Pindolol, Propranolol, Timolol, Progesterone, Testosterone, Estradiolo, Prednisolone, Metocurina, d-Tubocurarina, Am itrip ti1i na , C1 orop rornaz ina , Cyclazindol, Desmethylimipramine, Diazepam, Doxepine, Flurazepam, Fluphenazine, Haloperidol, Imipramine, Loxapine, Mianserin, Nortriptyline, Norzimelidine, Perazine, Perphenazine, Phenobarbital, Derivati della Fenotiazina, Promazine, Acepromazine, Protipendyl, Thioridazine, Thiothixene, Triazolam, Trifluoperazine, Zimelidine, Vitamina B12, Acido Folico, DAPN, 1,8-Anilino-naftalensolfonato, Aminopyrine, Amoxapine, Bupropion, Maprolitine, Nomifensine, Trazodone, Ritodrine, Doxazosin, Trimazosin, Binedalin, Amsacrine, Apazone, SKF 525A, Ciclazindol, PCR 2362, Indometacina, Probenecid, Acido Retinoico, Solf inpirazone, Tolmetin, Benoxaprof en, Eparina, Sufentanil, Lofentanil, Metoclopramide, Nicardipine, Pirmenol, Mifepristone, RU 42 633, Aprindii, Auramine 0, Bepridil, Desipramine, Desmethylclomipraine, Moxaprindine, Chinina, Lorcainide, Prothipendyl , Protriptyline, Trihexyphenidyl, Biperiden, Methaqualone, Diphenhydramine, Glutethimide, Chlordiazepoxid, L-Triptofano, Mepivacaine, Levomethadone, Opipramol, Trifluopromazine, Trimipramine, Tris-butossietil-fosfato, Staurosporina, N-benzoilstaurosporina e l-idrossi-'-staurosporina,· e anche un metabolica di uno qualsiasi di questi composti ; in cui ciascun componente (a) e/o (b) può anche essere presente sotto forma di un suo sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale.
  3. 3. Preparato costituito da una combinazione secondo la rivendicazione 1, in cui sono mescolati (a) almeno un inibitore della abl-t irosina-chinasi del PDGF-Recet tore e/o .del Kit- recettore scelto dal gruppo costituito da 1- (4-cloro-anilino) -4-(4-piridil-metil) -ftalazina, (R)-6- (4-idrossi-fenil) -4- [(1-feniletil)-animino]^7H-pirrolo [2,3-d]pirimidina e 4- (4-metilpiperazin-l-ilmetil) -N- [4-metil-3- (4-piridin-3-il)pirimidin-2-ilammino)fenil]benzammide; oppure un sale farmaceuticamente accettabile di uno qualsiasi o più di questi composti; e (b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida scelta dal gruppo costituito da un antibiotico, staurosporina, N-benzoilstaurosporina e 7-idrossi-s taurosporina, oppure un suo sale farmaceuticamente accettabile.
  4. 4. Preparato costituito da una combinazione secondo la rivendicazione 1, in cui sono combinati (a) l'inibitore della abl-tiros ina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore 4- (4-metilpiperazin-l-ilmetil )-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il) pirimidin-2-ilammino) fenil]-benzammide, oppure un Suo sale farmaceuticamente accettabile, e (b) il composto organico in grado di legarsi ad una ai-glicoproteina acida eritromicina, oppure un suo sale farmacèuticamente accettabile.
  5. 5. Un prodotto che comprende (a) almeno un inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e (b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida; in cui un qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale, in presenza oppure in assenza di una o più sostanzeveicolo farmaceuticamente accettabili, sotto forma di un preparato in combinazione, per un impiego contemporaneo oppure distribuito nel tempo entro un periodo di tempo che è sufficientemente piccolo affinchè i composti attivi sia del componente (a) che del componente (b) facciano aumentare l'attività antiproliferativa di un composto (a) contro cellule in fase di proliferazione, in particolare in un paziente, per il trattamento di una malattia proliferativa che risponde ad un tale composto.
  6. 6. Prodotto secondo la rivendicazione 5, in cui 1 ' inibitore della abl-t i rosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore è scelto dal gruppo costituito da: (i) un composto di una 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina di formula VI
    in cui q è 0 oppure 1 n è compreso tra 1 e 3 quando q è 0 oppure n è inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiorealchilcarbammoile, N,N-di>inferiore-alchilcarbammoile, il gruppo ciano, un gruppo amminico, inferiorealcanoilamminico, inf eriore-alchilamminico, N,N-diinf eriore-alchilamminico <: >oppure trif luorometile, essendo possibile quando sono presenti nella molecola parecchi radicali R, dhe questi radicali siano identici oppure differenti; a) Ri e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, indicano а) fenile sostituito con carbammoi 1-me t oss i, carbossi-metossi, benzoilossicarbonil- metossi, inferiore-alcossicarbonil-metossi, fenile, animino, inf eriore-alcanoilammino, inferiore-al chi laminino, N,N-di-inf eriore-etilammino, ossidrile, inferiorealcanoilossi, carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inferiore-alchilcarbammoile, N,N-diinferiore-alchilcarbammoile, gruppo ciano oppure con nitro-gruppo ; β) idrogeno; γ) piridile non sostituito oppure alogeno oppure inferiore-al chil-sostituito; б) N-benzil-piridinio-2-il^; naftile; ciano; carbossile; inferiore-alcossicarbonile; carbammoile; N-inferiorealchilcarbammoile; N,N-di-inferiore-alchilcarbammoile; N-benzilcarbammoile; formile; inferiore-alcanoile; inferiore-alchenile; inferiore-alchenilossi ; oppure ε) inferiore-alchile sostituito con εα) alogeno, ainmino, inferiore-alchilammino, piperazino, di-inferiore-alchil animino; εβ) fenilammino che è non sostituito oppure è sostituito nella porzione fenile con alogeno, alchile inferiore, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, inferiorealcossi, carbossile, inf eriore-alcossicarboni le , carbammoile, N-inferiore-^alchilcarbammoile, N,N-diinferiore-alchilcarbauunoile, gruppo ciano, animino, inferiore-alcanoìlammino, inferiore-alchilammino, N,N-di-inf eriore-alchilammino oppure con trifluorometile, εγ) ossidrile, alcossile inferiore, gruppo ciano, carbossile, inferiore-aldossicarbonile, carbammoile, N- inferi ore- alchi lcarbammo ile, N, N-di -infer iorealchilcarbammoile, mercapto, oppure εδ) con un radicale di formula R3-S(0)m- in cui R3 è alchile inferiore e m è 0, 1 oppure 2, oppure b) quando q è 1, uno dei radicali Ri e R2 è alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito e gli altri radicali Ri e R2 hanno uno dei significati riportati sopra nel paragrafo a) ad eccezione di idrogeno, oppure c) Ri e R2. insieme sono C4-C10-I/ 4-alcadienilene sostituito con animino, inferiore-alcanoilammino, inferiore-alchilammino, N,N-di-inferiore-alchilammino, nitro, alogeno, ossidrile, inferiore-alcanoilossi, carbossile, inferiore-alcossicarbonile, carbammoile, N-inf eriore-aìchilcarbammoile, N,N-di-inferiorealchilcarbammoile oppure con il gruppo ciano oppure sono aza-1, 4-alcadienilene avente fino a 9 atomi di carbonio, oppure d) quando q è 1, 3⁄4 e R2, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono alchile inferiore non sostituito oppure fenile non sostituito oppure hanno uno dei significati riportati sopra nel paragrafo a), e R6 è idrogeno, alchile inferiore, inferiorealcossicarbonile, carbammoile, N-inf eriorealchilcarbammoile oppure N,N-di-inf eriorealchilcarbammoile, oppure un suo sale; e <ii ) un derivato di una N-fenil-2-pirimidina-ammina di formula I
    m cui Ri è 4-pirazinile, 1-ifteti1-lH-pirrolile, fenile animino- oppure ammino-infériore-alchil-sostituito, in cui il gruppo amminico in ciascun caso è libero, alchilato oppure acilato, ΙΗ-indolile oppure IH-immidazolile legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell'anello a cinque membri, oppure piridile non sostituito oppure inferiore-alchilsostituito legato in corrispondenza di un atomo di carbonio dell'anello e non sostituito oppure sostituito in corrispondenza dell'atomo di azoto con ossigeno, R2 e R3, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono idrogeno oppure alchile inferiore, uno oppure due dei radicali R4, Rs, Rg, R7 e Rs sono ciascuno il nitro-gruppo, inferiore-alcossi fluorosostituito oppure un radicale di formula II (II), in cui Rg è idrogeno oppure alchile inferiore, X è un osso-gruppo; un tio-gruppo, immino, N-inf eriore-alchil-immino , idrossiimmino oppure O-inferiore-alchil-idrossiimmino, Y è ossigeno oppure è il gruppo NH, n è 0 oppure 1 e Rio è un radicale alifatico avente almeno -5 atomi di carbonio, oppure un radicale aromatico, aromaticoalifatico, cicloalifatico, cicloalir atico-aìifarico, eterociclico oppure eterociclico-alifatico e gli altri radicali R4/ Rs, R^, R7 e Re, ciascuno indipendentemente dall'altro, sono idrogeno, alchile inferiore che è non sostituito oppure è sostituito con un gruppo amminico libero oppure alchilato, con p ipera zini1 e, piperidinile, pi rro 1idini 1e oppure con morfolinile oppure sono alcanoile inferiore, trif luorometile, ossidrile libero, eterificato oppure esterificato, il gruppo amminico libero, alchilato oppure acilato oppure carbossile libero oppure esterificato, oppure un sale di tali composti che hanno almeno un gruppo che forma sale; e il composto organico in grado di legarsi alla αΐ-glicoproteina acida (AGP) (b) è scelto dal gruppo costituito da: Nicergolina, Prazosin, Alfentanil, Ketamine, Ethidocaine, Fentanil, Meperidina, Metadone, Fenilbutazone, Bupivacaine, Etidocaina, Fenciclidina, Lidocaina, Fenciclidina, Aprindina, Disopiramide, Chinidina, Verapamil, Eritroraicina, Acenocoumarol, Dipyridamole, PCR2362, Ticlopidine, Warfarin, Phenytoin, Carbamazepine, Naproxen, Alprenolol, Metoprolol, Oxprenolol, Pindolol., Propranolol, Timolol, Progesterone, Testosterone, Estradiolo, Prednisolone, Metocurina, d-Tubocurarina, Ami t rip ti1ina , Cloropromazina, Cyclazindol, Desmethyiimipramine, Diazepam, Doxepine, Flurazepam, Fluphenazine, Haloperidol, Imipramine, Loxapine, Mianserin, Nortriptyìine, Norzimelidine, Perazine, Perphenazine, Phenobarbital, Derivati della Fenotiazina, Promazine, Acepromazine, Protipendyl, Thioridazine, Thiothixene, Triazolam, Trifluoperazine, Zimelidine, Vitamina B12, Acido Folico·, DAPN, 1,8-Anilino-naftalensolfonato, Aminopyrine, AmoXapine, Bupropion, Maprolitine, Nomifensine, Trazodone, Ritodrine, Doxazosin, Trimazosin, Binedalin, Amsacrine, Apazone, SKF 525A, Ciclazindol, POR 2362, Indometacina, Probenecid, Acido Retinoico, Solf inpirazone, Tolmetin, Benoxaprofen, Eparina, Sufentanil, Lofentanil, Metoclopramide, Nicardipine, Pirmenol, Mifepristone, RU 42 633, Aprindil, Auramine 0, Bepridil, Desipramine, Desmethylclomipraine, Moxaprindine, Chinina, Lorcainide, Prothipendyl, Protriptyline, Trihexyphenidyl, Biperiden, Methaqualone, Diphenhydramine, Glutethimide, Chlordiazepoxid, L-Triptofano, Mepivacaine, Levomethadone, Opipramol, Trifluopromazine, Trimipramine, Tris-butossietil-fosfato, Staurosporina, N-benzoilstaurosporina e 7-idrossi-staurospori-na; e anche un metabolita <1 >di uno qualsiasi di questi composti; in cui ciascun componente (a) e/o (b) può anche essere presente sotto forma di un suo sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale.
  7. 7. Prodotto secondo 'la rivendicazione 5, in cui (a) l'inibitore della abl-t irosina-chinas i del PDGF-Recettore e/o del <'>Kit-recettore è scelto dal gruppo costituito da 1- (4-cloro-ani 1 ino)- 4- (4-piridil-metil) -ftalazina> (R)-6- (4-idrossi-fenil) -4-[(1-feniletil) -ammino] -7H-pirrolo [2,3-d]pirimidina e 4- (4-metilpiperazin-l-ilmetil)-N- [4-metil-3- (4-piridin-3-il )pirimidin-2-ilammino) fenil]benzammide; oppure un sale farmaceuticamente accettabile di uno qualsiasi o più di questi composti; e (b) il composto organico in grado di legarsi ad una αΐ-glicoproteina acida è scelto dal gruppo costituito da un antibiotico, staurosporina, N-benzoil-staurosporina e 7-idrossi-staurosporina, oppure un sale farmaceuticamente accettabile di uno qualsiasi o più di questi composti.
  8. 8. Prodotto secondò la rivendicazione 5, in cui (a) l'inibitore della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore è 4- (4-metilpiperazin-l-ilmetil )-N- [4-metil-3- {4-.piridin-3il) pirimidin-2-ilammino) feniljbenzammide, oppure un suo sale farmaceuticamente accettabile, e (b) il composto organico in grajdo di legarsi ad una alglicoproteina acida è eritromicina, oppure un suo sale farmaceuticamente accettabile.
  9. 9. Impiego di una combinazione di (a) almeno un inibitore ;della abl-tirosina-chinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore, e (b) almeno un composto organico in grado di legarsi ad una al-glicoproteina ' acida, in cui qualsiasi componente (a) e/o (b) può essere presente anche sotto forma di un sale farmaceuticamente accettabile, se è presente almeno un gruppo che forma sale, per la produzione di preparati farmaceutici da impiegare sotto forma di composizioni contro una malattia proliferativa che può venire trattata mediante somministrazione di un inibitore della abl-tirosinachinasi del PDGF-Recettore e/o del Kit-recettore.
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