CN101323629B

CN101323629B - 4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯

Info

Publication number: CN101323629B
Application number: CN2008100081978A
Authority: CN
Inventors: 冯志强; 李永强; 陈晓光; 刘鹤; 苏富琴
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS; Jiangsu Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS; Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2007-02-16
Filing date: 2008-02-18
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2028-02-18
Also published as: CN101265274B; CN101265274A; CN101265275A; CN101265275B; CN101323629A

Abstract

本发明涉及式I所示的4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯，其可药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体或衍生物，及其制备方法，含有一个或多个这化合物的组合物，和该类化合物在治疗与蛋白酪氨酸激酶有关的疾病如免疫失调和肿瘤疾病方面的用途。

Description

4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯

技术领域

背景技术

近年来，由于肿瘤发生发展的分子机制研究取得了惊人的进展，新药的研究转向在癌的病因学和病理过程中起作用的特异性的分子生物靶点(Science，1993，260(5110)，918-919)。(Science，1995，267(5205)，1782-1787)。研究表明，80％以上的癌基因和原癌基因存在于人的癌编码蛋白酪氨酸激酶(PTK)中，人类各种癌症的产生和发展是和来自于蛋白酪氨酸激酶的异常细胞信号传导有关的，恶性细胞的一个主要特点是酪氨酸激酶活性的增加。另外，正常原致癌酪氨酸激酶的过度表达也可引起增生性疾病。实验室中已经证明：通过过分表达或变异各种受体酪氨酸激酶，增加其活性，正常细胞能够被转化成癌细胞，恶性转变的程度是与酪氨酸激酶活性密切相关；而且，通过利用受体的抗体或专门的激酶抑制剂降低受体中激酶活性又能使癌变逆转(Drugs，2000，59(4)：753)。因此，抑制酪氨酸激酶活性，阻断其活化的信号传导路径成为控制肿瘤的新途径。

蛋白酪氨酸激酶(PTK)是一种酶，除了包括受体酪氨酸激酶(RPTK)：如表皮生长因子激酶家族的成员(例如HER1和HER2)，血小板衍生生长因子(PDGF)和在血管形成中起作用的激酶(Tie-2和KDR)外，还包括非受体酪氨酸激酶Syk、JAK和Src家族的成员(例如Sro，Fyn，Lyn，Lck和Blk)(见“造血信号转导中的酪氨酸蛋白激酶的src家族”，美国联邦实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)，1992，6，3403-3409；“具有酪氨酸激酶活性的受体的信号转导作用”，细胞(Cell)，1990，61，203-212；和“造血细胞因子信号传导中的Janus蛋白酪氨酸激酶”，免疫学研讨文辑(Sem.Immun01.)，1995，7，247-254)。

PTK的活性不仅在许多恶性和非恶性增生性疾病中都显示出增强，而且PTK在免疫***的细胞调控中起关键作用。因此，PTK抑制剂会对许多种肿瘤和免疫学疾病有影响。可以通过选择性地抑制某种受体或非受体PTK，例如Lck，或者由于各类PTK之间的同源性，利用抑制剂抑制一种以上的PTK，从而使这些病症得到缓解。

特别重要的一种PTK是在T细胞中发现的Lck，它与T细胞内关键蛋白底物的磷酸化有关.它是生产性抗原受体信号传导和细胞活化所需要的。在没有Lck活性时，T细胞受体(TCR)zeta链不被磷酸化，激酶ZAP-70不被活化，而且对于T细胞活化至关重要的Ca粒子通道的激活也不能发生，因此，Lck的抑制剂可用于治疗T细胞介导的疾病。例如，T细胞起重要作用的慢性病，如类风湿性关节炎、多发性硬化病和狼疮以及已知T细胞在其中起重要作用的急性病，例如急性移植物排斥和迟发性超敏反应。

虽然人们已经发现许多小分子酪氨酸激酶抑制剂，如WO9903854，WO2004005281，WO0062778，WO2005013983对本领域作出了很大贡献，但为改进抗癌和免疫失调药物，本领域仍在继续研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的酪氨酸激酶抑制剂4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯，其可药用盐，其溶剂化物，其前药，其多晶或共晶。

本发明的另一目的在于提供一种制备4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯的方法。

本发明的再一目的在于提供一种含有一个或多个这种化合物的药物组合物。

本发明的又一目的在于提供该类化合物在抗癌和免疫及与酪氨酸激酶有关疾病的药物中的用途。

为了完成本发明之目的，可采用如下技术方案：

本发明是涉及具有下式I结构的4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯：

或其可药用盐、水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体或衍生物。

本发明还公开了制备本发明化合物的方法，包括如下步骤：

(a)嘧啶衍生物先与磷酸酯衍生物相连，

(b)然后再与噻唑衍生物相连，

(c)再和2-氯-6-甲基苯氨相连，最终得到式I所述的化合物；

另外，上述反应中的起始原料及中间体容易得到，或对本领域熟练技术人员来说可以用有机合成中的常规方法很容易合成。

其中，步骤(a)中哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯和2-甲基-4，6-二氯嘧啶相连；反应在二异丙乙胺和溶剂无水1，4-二氧六环存在的条件下进行；得到产物4-(6-氯-2-甲基嘧啶-4)哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯。

步骤(b)中4-(6-氯-2-甲基嘧啶-4)哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯和2-氨基-5-乙氧甲酰基噻唑在溶剂无水DMF和氢化钠存在的条件下进行，得到产物2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸乙酯。

步骤(c)中2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸乙酯在溶剂甲醇存在的条件下，用氢氧化钠脱去酯基，得到2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸；

得到的2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸和2-氯-6-甲基苯氨，在三乙胺、溶剂无水DMF、氰基磷酸二乙酯(DECP)存在的条件下反应得到产物4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯。

式I所述4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯可以溶剂化物或非溶剂化物的形式存在，利用不同的溶剂进行结晶可能得到不同的溶剂化物。式I所述药学上可接受的盐包括不同酸加成盐，如下列无机酸或有机酸的酸加成盐：盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸，甲磺酸，对甲苯磺酸，三氟乙酸，枸杞酸，马来酸，酒石酸，富马酸，柠檬酸，乳酸。I所述药学上可接受的盐还包括不同碱金属盐(锂，钠，钾盐)，碱土金属盐(钙，镁盐)及铵盐，和能提供生理上可接受的阳离子的有机碱的盐，如甲胺，二甲胺，三甲胺，哌啶，吗啉及三(2-羟乙基)胺的盐。在本发明范围内的所有这些盐都可采用常规方法制备。在所述的4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-磷酸二乙酯及其溶剂化物和其盐的制备过程中，不同结晶条件可能出现多晶或共晶。

本发明还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、***、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药***。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、***胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.01-100mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明化合物是酪氨酸激酶抑制剂或其前体，不仅抑制非受体蛋白酪氨酸激酶，如Src家族激酶，而用于多种肿瘤和免疫学疾病；而且抑制受体蛋白酪氨酸激酶，如HER1和HER2，因此可用于治疗增生性疾病，如牛皮癣和癌症。这些化合物抑制HER1和其它受体激酶的能力，还使其可以作为抗血管形成剂用于治疗诸如癌症和糖尿病视网膜病等病症。另外，Src家族中Lck的抑制阻断了T细胞的活化，该类化合物可用于T细胞介导的疾病。由于该类化合物能够阻断表皮细胞PTK的活化，从而限制了诱发嗜中性结合的粘着分子的表面表达，并抑制嗜中性活化所必须的PTK，因而用于治疗局部缺血症和再灌注损伤。另外与血管平滑肌细胞迁移和增值有关的疾病有治疗作用，尤其抗肿瘤活性明显。本发明化合物具有较高的生物利用度，可用于多种人类恶性肿瘤的治疗，包括白血病，神经胶质瘤，头颈部癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌及乳腺癌，卵巢癌，扁平细胞癌等。

附图说明

图1.实施例5对K562细胞凋亡诱导作用

图2.实施例5对KR/1.6细胞凋亡诱导作用

图3.实施例5对KR/3.0细胞凋亡诱导作用

图4实施例5对Bcr-Abl，c-src，和Lyn蛋白表达水平的抑制作用

具体实施方式

以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。

测定仪器：核磁共振光谱用Vaariaan Mercury 300型核磁共振仪。质谱用ZAD-2F和VG300质谱仪。

实施例1.4-(二乙氧磷酰基甲基)-哌嗪-1-羧酸苄酯

将2.2克(10毫摩尔)哌嗪-1-羧酸苄酯和1.38克(10毫摩尔)亚磷酸二乙酯和37％的甲醛1毫升和苯120毫升置于250毫升烧瓶中加热回流至反应完全，冷却，旋去溶剂，加入乙酸乙酯溶解，碳酸氢钠溶液洗涤，水洗，盐洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，短柱分离得到产物4-(二乙氧磷酰基甲基)-哌嗪-1-羧酸苄酯.¹HNMR(300MHz，D-acetone)，δ(ppm)：7.36(m，5H，ArH)，5.10(s，2H，ArH)，4.08(m，4H，2OCH₂)，3.45(t，4H，2NCH₂)，2.60(t，4H，2NCH₂)，2.78(s，1H，CH₂)，2.74(s，1H，CH₂)，1.26(t，6H，2CH₃).FABMS：(M+1)⁺＝371.

实施例2.哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯

将370毫克(1毫摩尔)4-(二乙氧磷酰基甲基)-哌嗪-1-羧酸苄酯溶于25毫升四氢呋喃/乙醇(1∶1)混合溶剂中，加入钯碳(10％，180毫克)，40-50℃常压氢化过夜，氢化完全后过滤，旋去溶剂得到产物哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯.¹HNMR(300MHz，D-acetone)，δ(ppm)：4.09(m，4H，2OCH₂)，2.85(t，4H，2NCH₂)，2.64(t，4H，2NCH₂)，2.74(s，1H，CH₂)，2.70(s，1H，CH₂)，1.27(t，6H，2CH₃).FABMS：(M+1)⁺＝237.

实施例3.4-(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯

将236毫克(1毫摩尔)哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯和243毫克(1.5毫摩尔)2-甲基-4，6-二氯嘧啶溶于20毫升无水1，4-二氧六环中，加入130毫克(1毫摩尔)二异丙乙胺，加热回流搅拌至原料消失，旋去溶剂，加入乙酸乙酯溶解，碳酸氢钠溶液洗涤，水洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂短柱分离得到液体产物4-(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)6.30(s，1H，ArH)，4.12(m，4H，2OCH₂)，3.64(t，4H，2NCH₂)，2.83(s，1H，CH₂)，2.79(s，1H，CH₂)，2.70(t，4H，2NCH₂)，2.45(s，3H，CH₃)，1.31(t，6H，2CH₃).FABMS：(M+1)⁺＝363.

实施例4.2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸乙酯(化合物4)

将362毫克(1毫摩尔)4-(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯和172毫克(1毫摩尔)2-氨基-5-乙氧甲酰基噻唑溶于20毫升无水DMF中，搅拌下加入100毫克(2.5毫摩尔)氢化钠(60％)，室温搅拌至原料消失，冷却后倾入冰冷碳酸氢钠溶液中，乙酸乙酯萃取，水洗，盐洗，无水硫酸钠干燥，去溶剂短柱分离得到产物2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸乙酯.¹H NMR(300MHz，DMSO-D6)，δ(ppm)11.62(S，1H，NH)，8.02(S，1H，ArH)，6.04(s，1H，ArH)，4.25(q，2H，OCH₂)，4.05(m，4H，2OCH₂)，3.68(t，4H，2NCH₂)，2.84(S，1H，CH₂)，2.80(S，1H，CH₂)，2.62(m，4H，2NCH₂)，2.40(s，3H，CH₃)，1.25(m，9H，3CH₃).

FABMS：(M+1)⁺＝499.

实施例5.4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯(化合物5)

将498毫克(1毫摩尔)2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸乙酯溶于10毫升甲醇中，加入2.5N氢氧化钠10毫升，室温搅拌至原料消失，减压旋去甲醇，乙酸乙酯萃取，水层冰水浴滴加浓盐酸中和至产生大量沉淀，静置半小时后抽滤，水洗固体，干燥得到产物2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸.

将470毫克(1毫摩尔)2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸和126毫克(1毫摩尔)2-氯-6-甲基苯氨及152毫克(1.5毫摩尔)三乙胺溶于15毫升无水DMF中，搅拌下滴加326毫克(2毫摩尔)氰基磷酸二乙酯(DECP)，逐渐加热至60-70℃，搅拌原料消失，旋去溶剂后，加入无水乙醇，析出白色固体，过滤得到产物4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯.¹H NMR(300MHz，DMSO-D6)，δ(ppm)11.46(S，1H，NH)，9.86(S，1H，NH)，8.20(S，1H，ArH)，7.38(m，1H，ArH)，7.26(m，2H，ArH)，6.04(S，1H，ArH)，4.03(m，4H，2OCH₂)，3.50(m，4H，2NCH₂)，2.85(S，1H，PCH₂)，2.81(S，1H，PCH₂)，2.62(m，6H，3NCH₂)，2.39(s，3H，CH₃)，2.22(s，3H，CH₃)，1.23(t，6H，2CH₃).³¹P-NMR(200MHz，DMSO-d₆+D₂O+KH₂PO₄)δ(ppm)21.78(S).FABMS：(M+1)⁺＝594.

药理活性

体外活性评价：

1.对肿瘤细胞生长的抑制作用

1 细胞培养

实验所用K562细胞及K562耐Imatinib细胞于含5％ CO₂的37℃培养箱中培养传代，以含10％胎牛血清及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液培养，每周传代两次。

2 MTT法测定肿瘤细胞存活率

将对数生长期的细胞离心后配制成浓度为1×10⁵细胞/ml的细胞悬液，按10000个/孔接种于96孔板，每孔加100μl，加入含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μl(DMSO终浓度＜0.1％)，每组设三个平行孔，于37℃培养3天后，每孔加20μl新鲜配制的含5mg/ml MTT的无血清培养基，继续培养4小时，离心，弃上清，每孔加200μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，用MK3型酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC50：

结果：实施例5化合物对多种肿瘤细胞系的生长抑制作用

3 流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期

收集细胞，离心后去上清，PBS洗涤一次。将细胞弹开，每管加70％乙醇约2ml固定，4℃过夜。次日1,000rpm离心5分钟，去乙醇，PBS洗涤2次，1,000rpm离心5分钟，重复离心洗涤两次。弃上清，保留约0.1ml液体。加RNAase 50μl(终浓度为60μg/ml)，涡旋，37℃温育30分钟。加PI(碘化丙啶)(终浓度为50μg/ml)至0.5ml，摇匀，4℃避光，作用60分钟。经尼龙网过滤，在流式细胞仪上测定细胞各期DNA含量并进行细胞周期分析。

1)对K562细胞周期的影响

样品作用于K562细胞24小时后，采用流式细胞仪检测样品对细胞周期分布的影响。

表2.实施例5对K562细胞周期分布的影响.

2)对K562细胞凋亡诱导作用

样品作用于K562细胞48小时后，流式细胞仪检测表明，凋亡细胞比例明显增加。2.5nmol/L、5nmol/L、10nmol/L实施例5诱导产生凋亡的比例分别为92.1％、95.6％、97.0％；而dasatinib10nmol/L所诱导的凋亡率是95.2％。(见图.1)3)对KR/1.6细胞周期的影响

样品作用于KR/1.6细胞24小时后，采用流式细胞仪检测样品对细胞周期分布的影响。结果表明：实施例5对KR/1.6细胞有明显的G₁期阻滞的作用。

表3.实施例5对KR/1.6细胞周期分布的影响.

4)对KR/1.6细胞凋亡诱导作用

流式细胞仪检测结果表明，样品作用于KR/1.6细胞48小时后，凋亡细胞比例明显增加。2.5nmol/L、5nmol/L、10nmol/L实施例5诱导产生凋亡的比例分别为23.8％、84.2％、87.2％；而dasatinib10nmol/L所诱导的凋亡率是84.8％。(见图.2)5)对KR/3.0细胞周期的影响

样品作用于KR/1.6细胞24小时后，采用流式细胞仪检测样品对细胞周期分布的影响。结果表明：实施例5对KR/3.0细胞有明显的G₁期阻滞的作用(见表4)。

表4.实施例5对KR/3.0细胞周期分布的影响.

6)对KR/3.0细胞凋亡诱导作用

流式细胞仪检测结果表明，样品作用于KR/3.0细胞48小时后，凋亡细胞比例明显增加。2.5nmol/L、5nmol/L、10nmol/L实施例5诱导产生凋亡的比例分别为16.0％、36.6％、58.8％；而dasatinib10nmol/L所诱导的凋亡率是58.8％。(见图.3)

7)实施例5对Bcr-Abl，c-src，和Lyn蛋白表达水平的抑制作用(见图4)

4.白血病小鼠模型的建立

SCID小鼠，雌性，6-8周龄，体重20-25g，中国医学科学院动物研究所提供。腹腔连续2天注射环磷酰胺(CTX)2mg/只，每天注射一次，第3天取对数生长期K562细胞用于移植，以尾静脉一次性注射1×10⁷个/鼠，每次尾静脉注射的SCID小鼠数目相同。

5.动物分组

注射细胞20天后，动物皮毛起皱，萎靡少动，体重减轻。这时开始口服给药。分为五组，每组4只，对照组，白血病模型小鼠口服等量生理盐水。Dasatinib组按30mg/kg体重，实施例5按18mg/kg，36mg/kg体重口服给药，连续给药20天，而后观察小鼠的生存期。

实施例5 对人慢性粒细胞白血病K562细胞NOD/SCID异体移植模型小鼠脾指数的影响

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与正常对照组相比；#P＜0.05，##＜0.01，###＜0.001与模型组相比

实施例5 对人慢性粒细胞白血病K562细胞NOD/SCID异体移植模型小鼠外周血白细胞数的影响

Claims

1.式(I)所示的4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯化合物，其可药用盐

2.根据权利要求1的化合物，其特征在于，所述的可药用盐包括：盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐，三氟乙酸盐，枸杞酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，富马酸盐，柠檬酸盐或乳酸盐。

3.制备权利要求1的所述化合物的方法，包括如下步骤：

(a)嘧啶衍生物先与磷酸酯衍生物相连，

(b)然后再与噻唑衍生物相连，

(c)再和2-氯-6-甲基苯胺相连，最终得到式(I)所述的化合物；

4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤(a)中哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯和2-甲基-4，6-二氯嘧啶相连；反应在二异丙乙胺和溶剂无水1，4-二氧六环存在的条件下进行；得到产物4-(6-氯-2-甲基嘧啶-4)哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯。

5.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤(b)中4-(6-氯-2-甲基嘧啶-4)哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯和2-氨基-5-乙氧甲酰基噻唑在溶剂无水DMF和氢化钠存在的条件下进行反应，得到产物2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸乙酯。

6.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤(c)中2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸乙酯在溶剂甲醇存在的条件下，用氢氧化钠脱去酯基，得到2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸；

得到的2-{6-[4-(二乙氧磷酰基甲基)哌嗪-1]-2-甲基嘧啶-4-氨基}-噻唑-5-羧酸和2-氯-6-甲基苯胺，在三乙胺、溶剂无水DMF、氰基磷酸二乙酯(DECP)存在的条件下反应得到产物4-{6-[5-(2-氯-6-甲基苯胺甲酰基)-噻唑-2-氨基]-2-甲基嘧啶-4}-哌嗪-1-甲基磷酸二乙酯。

7.一种药物的组合物，其特征在于，含有权利要求1的化合物和制剂学可接受的载体。

8.权利要求1的化合物在制备预防和治疗与蛋白酪氨酸激酶有关的疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的与蛋白酪氨酸激酶有关的疾病是免疫失调、肿瘤疾病。

10.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述的肿瘤疾病是白血病，神经胶质瘤，头颈部癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌及乳腺癌，卵巢癌，扁平细胞癌。