CN101198698A - 通过调节缔合制备多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明发现了通过将多肽间缔合时形成界面的氨基酸残基修饰成具有同种电荷的氨基酸可以调节该缔合。通过本发明可以高效率形成杂分子(hetero molecule)。例如，在制作双特异性抗体时，可以适当采用本发明。

Description

通过调节缔合制备多肽的方法
技术领域
本发明涉及一种通过调节各分子内或各分子间的缔合(association)来制备多肽的方法、调节各分子内或各分子间缔合的多肽和含有该多肽作为有效成分的药物组合物等。
背景技术
抗体由于在血中的稳定性高、副作用少，因此作为医药品而被关注。其中包括可以同时识别两种抗原的双特异性抗体。目前正在进行临床试验的MDX-210就是一种IgG型双特异性抗体，该抗体将表达FcγRI的单核细胞等重新定靶(retargeting)到表达HER-2/neu的癌细胞中(参照非专利文献1)。通常多采用基因重组技术制备抗体。该技术具体如下：由杂交瘤、产生抗体的致敏淋巴细胞等的抗体产生细胞或提供抗体基因的噬菌体库克隆编码抗体蛋白的DNA，将该DNA***到适当的载体中，再将该载体导入到宿主细胞中生产抗体。采用基因重组技术制备IgG型双特异性抗体时，是将构成两种目标IgG的H链和L链的基因、总计四种基因导入到细胞中，通过共表达来分泌抗体。在上述表达中，表达野生型H链和L链的构成基因时，随机发生两种H链之间的共价键合或H链和L链之间的非共价键合，因此目标双特异性抗体的比率变得非常少。具体而言，在10种抗体中只有1种是目标双特异性抗体，生产效率降低。目标抗体的生产效率降低，不仅妨碍目标抗体的纯化，还使批间差等不均匀性增大，导致生产成本增加。
作为改善双特异性抗体生产效率的方法，有人报道了通过对IgGH链的CH3区实施氨基酸取代，使具有H链的异源组合的IgG优先分泌(参照专利文献1和非专利文献2和3)。该方法具体如下：将存在于一条H链的CH3区的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob，突起)，将存在于另一条H链的CH3区的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole，空隙)，从而将突起配置在空隙内，以促进异源H链的形成和抑制同源H链的形成。还有报道称：在H链可变区(以下记作VH)和L链可变区(以下记作VL)缔合的界面，使用同样的“突起”和“空隙”(参照非专利文献4)。根据Zhe等人的报告，通过取代存在于VH和VL的界面的两种(两条链共四种)氨基酸，可以以1.28倍的效率促进异源分子的形成(野生型：72％；变异型：92％)。另外，通过取代一种氨基酸(两条链为两种)，得到和野生型相同的效率。但是，还不能说在VH和VL中设置knob(突起)和hole(空隙)的方法可充分促进异源分子的形成。
专利文献1：国际公开第96/27011号
非专利文献1：Segal DM等著，Current Opinion in Immunology，1999年，第11卷，第558-562页
非专利文献2：Ridgway JB等著，Protein Engineering，1996年，第9卷，第617-621页
非专利文献3：Merchant AM等著，Nature Biotechnology，1998年，第16卷，第677-681页
非专利文献4：Zhe Z等著，Protein Science，1997年，第6卷，第781-788页
发明内容
发明所要解决的问题
本发明鉴于上述状况而设，其目的在于提供一种调节多肽缔合的方法和调节缔合的多肽、以及该多肽的制备方法。作为本发明的一个方案，其目的在于提供一种通过调节VH和VL在界面的缔合来高效率制备双特异性抗体的方法。另一目的在于提供一种高效率制备sc(Fv)2的另一种构象异构体的方法。
解决问题的方法
本发明人等选择抗体的VH和VL作为经受缔合调节的多肽，对可以调节上述VH和VL缔合的方法进行了深入研究。
结果发现：通过将存在于VH和VL的界面的氨基酸取代成荷电氨基酸，可以抑制VH和VL的缔合，较上述使用knob和hole的方法能高效率形成异源分子。
令人惊奇的是，根据本发明的方法，只取代存在于VH和VL的界面的各一种氨基酸(VH和VL中总计两种氨基酸)，就可以高效率形成异源分子。另外，从抗原性方面考虑，氨基酸的取代以少为宜。根据本发明的一个方案，只取代存在于VH和VL的界面的一种氨基酸，就可以高效率形成异源分子。
即，根据本发明人等的发现，可以调节VH和VL的缔合。本发明不仅可用于调节VH和VL的缔合，还可用于调节任意的多肽间的缔合。
并且，本发明人等确认：通过本发明的缔合调节方法获得的双特异性抗体，实际上保持着功能。
如上所述，本发明人等成功开发了一种能够调节任意的多肽间的缔合的方法，从而完成了本发明。
本发明涉及一种调节多肽缔合的方法和调节缔合的多肽、以及该多肽的制备方法，更具体而言，本发明提供以下[1]～[97]：
[1]一种多肽突变体的制备方法，其为在多肽内形成界面的氨基酸残基中具有突变以调节多肽的缔合，该制备方法包括：(a)自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制多肽内的缔合，上述氨基酸残基形成多肽内的界面；(b)培养宿主细胞，使其表达上述核酸；(c)自宿主细胞培养物中回收该多肽。
[2]一种异源多聚体(heteromultimer)的制备方法，上述异源多聚体中形成多肽间的界面的氨基酸残基中具有突变以调节异源多聚体的缔合，该制备方法包括：(a)自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制多肽间的缔合，上述氨基酸残基形成多肽间的界面；(b)培养宿主细胞，使其表达上述核酸；(c)自宿主细胞培养物中回收该异源多聚体。
[3][1]的方法，该方法是在能够形成多种构象异构体的多肽中，自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制形成一种以上构象异构体的多肽的缔合，上述氨基酸残基形成多肽内的界面。
[4][2]的方法，该方法是在能够形成多种多聚体的异源多聚体中，自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制形成一种以上多聚体的多肽间的缔合，上述氨基酸残基形成多肽间的界面。
[5][1]或[2]的方法，其中步骤(a)的修饰是指：修饰原始核酸以便向该界面导入氨基酸残基的突变，使形成界面的多个氨基酸残基带有同种电荷。
[6][5]的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
[7][5]的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
[8][5]的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
[9][5]的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
[10][5]的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
[11][1]或[2]的方法，其中步骤(a)的修饰是指：修饰原始核酸以向该界面导入氨基酸残基的突变，使存在于界面的形成疏水核的氨基酸残基成为荷电氨基酸残基。
[12][11]的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
[13][11]的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
[14][11]的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
[15][11]的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
[16][11]的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
[17][1]或[2]的方法，其中多肽的界面由抗体的重链可变区和轻链可变区形成。
[18][1]或[2]的方法，其中多肽的界面由多种重链可变区形成。
[19][1]或[2]的方法，其中多肽的界面由抗体的重链恒定区和轻链恒定区形成。
[20][1]或[2]的方法，其中多肽的界面由多种重链恒定区形成。
[21][1]的方法，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
[22][2]的方法，其中异源多聚体为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
[23][22]的方法，其中异源多聚体为双特异性抗体。
[24]通过[1]或[2]的方法制备的多肽突变体或异源多聚体。
[25]一种多肽突变体，其包含原始多肽内形成界面的氨基酸残基的修饰，以抑制上述多肽内的缔合。
[26]一种异源多聚体，其包含原始多肽间形成界面的氨基酸残基的修饰，以抑制上述多肽间的缔合。
[27][25]的多肽突变体，其中原始多肽能够形成多种构象异构体。
[28][26]的异源多聚体，其中原始多肽能够形成多种多聚体。
[29][25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰是指：向该界面导入氨基酸残基的突变，使形成界面的多个氨基酸残基带有同种电荷。
[30][29]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
[31][29]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
[32][29]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
[33][29]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
[34][29]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
[35][25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰是指：向该界面导入氨基酸残基的突变，使存在于界面的形成疏水核的氨基酸残基成为荷电氨基酸残基。
[36][35]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
[37][35]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
[38][35]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
[39][35]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
[40][35]的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
[41][25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体，其中多肽界面由抗体的重链可变区和轻链可变区形成。
[42][25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体，其中多肽界面由多种重链可变区形成。
[43][25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体，其中多肽界面由抗体的重链恒定区和轻链恒定区形成。
[44][25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体，其中多肽界面由多种重链恒定区形成。
[45][25]的多肽突变体，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
[46][26]的异源多聚体，其中异源多聚体为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
[47][46]的异源多聚体，其中异源多聚体为双特异性抗体。
[48]一种组合物，其包括[25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体和医药上可接受的载体。
[49]一种核酸，其编码[25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体。
[50]一种宿主细胞，其含有[49]的核酸。
[51][25]的多肽突变体或[26]的异源多聚体的制备方法，该制备方法包括：培养[50]的宿主细胞的步骤和自细胞培养物中回收多肽的步骤。
[52]一种调节多肽缔合的方法，该方法包括修饰原始多肽内形成界面的氨基酸残基，以抑制多肽内的缔合。
[53]一种调节异源多聚体缔合的方法，该方法包括修饰原始多肽间形成界面的氨基酸残基，以抑制多肽间的缔合。
[54][52]的方法，该方法是在能够形成多种构象异构体的多肽中，修饰多肽内形成界面的氨基酸残基，以抑制形成一种以上构象异构体的多肽的缔合。
[55][53]的方法，该方法是在能够形成多种多聚体的异源多聚体中，修饰多肽间形成界面的氨基酸残基，以抑制形成一种以上多聚体的多肽间的缔合。
[56][52]或[53]的方法，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰是指：向该界面导入氨基酸残基的突变，使形成界面的多个氨基酸残基带有同种电荷。
[57][56]的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
[58][56]的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
[59][56]的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
[60][56]的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
[61][56]的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
[62][52]或[53]的方法，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰是指：向该界面导入氨基酸残基的突变，使存在于界面的形成疏水核的氨基酸残基成为荷电氨基酸残基。
[63][62]的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
[64][62]的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
[65][62]的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
[66][62]的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
[67][62]的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
[68][52]或[53]的方法，其中多肽界面由抗体的重链可变区和轻链可变区形成。
[69][52]或[53]的方法，其中多肽界面由多种重链可变区形成。
[70][52]或[53]的方法，其中多肽界面由抗体的重链恒定区和轻链恒定区形成。
[71][52]或[53]的方法，其中多肽界面由多种重链恒定区形成。
[72][52]的方法，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
[73][53]的方法，其中异源多聚体为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
[74][73]的方法，其中异源多聚体为双特异性抗体。
[75]一种抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中以下(1)和(2)的氨基酸残基带有同种电荷：
(1)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6的氨基酸序列中的39位(谷氨酸)的氨基酸残基；
(2)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的44位(谷氨酸)的氨基酸残基。
[76]一种抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中以下(1)和(2)的氨基酸残基带有同种电荷：
(1)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6的氨基酸序列中的45位(亮氨酸)的氨基酸残基；
(2)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的50位(脯氨酸)的氨基酸残基。
[77]一种抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中以下(1)或(2)中的任一种为荷电氨基酸残基：
(1)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6的氨基酸序列中的45位(亮氨酸)的氨基酸残基；
(2)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的50位(脯氨酸)的氨基酸残基。
[78][75]或[76]的抗体，其中上述带有同种电荷的氨基酸残基选自以下(a)或(b)中的任一组所含的氨基酸残基：
(a)谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
[79][77]的抗体，其中上述荷电氨基酸残基为：谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)。
[80][75]～[77]中任一项的抗体，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
[81][75]～[77]中任一项的抗体，其中多肽为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
[82][81]的抗体，其中多肽为双特异性抗体。
[83]一种组合物，其包括[75]～[77]中任一项的抗体和医药上可接受的载体。
[84]一种核酸，其编码[75]～[77]中任一项的构成抗体的多肽。
[85]一种宿主细胞，其含有[84]的核酸。
[86][75]～[77]中任一项的抗体的制备方法，该制备方法包括：培养[85]的宿主细胞的步骤和自细胞培养物中回收多肽的步骤。
[87]一种抗体，其包括多种重链CH3区，其中第1重链CH3区中选自以下(1)～(3)所示氨基酸残基组的一组至三组的氨基酸残基带有同种电荷：
(1)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于356位和439位；
(2)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于357位和370位；
(3)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于399位和409位。
[88][87]的抗体，其为第2重链CH3区中选自上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的氨基酸残基组，其中对应于上述第1重链CH3区中带有同种电荷的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的一组至三组的氨基酸残基，带有和上述第1重链CH3区中对应的氨基酸残基相反的电荷。
[89][87]的抗体，其中上述带有同种电荷的氨基酸残基选自以下(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基：
(a)谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
[90][87]的抗体，其中上述第1重链CH3区和第2重链CH3区通过二硫键进行交联。
[91][87]的抗体，其为具有多种重链恒定区的抗体。
[92][87]的抗体，其为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
[93][92]的抗体，其为双特异性抗体。
[94]一种组合物，其包括[87]的抗体和医药上可接受的载体。
[95]一种核酸，其编码[87]的构成抗体的多肽。
[96]一种宿主细胞，其含有[95]的核酸。
[97][87]的抗体的制备方法，该制备方法包括：培养[96]的宿主细胞的步骤和自细胞培养物中回收多肽的步骤。
附图简述
图1是模建人源化SB04的Fv区的图，(A)表示VH和VL界面的氨基酸残基H39和L38，(B)表示VH和VL界面的氨基酸残基H45和L44。
图2是表示对H39和L38的修饰抗体的H链和L链的缔合进行评价的结果的照片。结果表明：在所有修饰抗体中，与野生型相比目标抗体的缔合比率均上升。
电泳泳道的说明：
M：分子量标记；
1：人源化XB12H链(Q)+人源化XB12L链(Q)；
2：人源化XB12H链(Q)+人源化SB04L链(Q)；
3：野生型：人源化XB12H链(Q)+人源化XB12L链(Q)+人源化SB04L链(Q)；
4：D变异型：人源化XB 12H链(D)+人源化XB12L链(Q)+人源化SB04L链(D)；
5：E变异型：人源化XB12H链(E)+人源化XB12L链(Q)+人源化SB04L链(E)；
6：R变异型：人源化XB12H链(R)+人源化XB12L链(Q)+人源化SB04L链(R)；
7：K变异型：人源化XB12H链(K)+人源化XB12L链(Q)+人源化SB04L链(K)。
图3表示对H39和L38的修饰抗体的凝固活性进行评价的结果。结果表明，将XB12H链(H39)和SB04L链(L38)修饰成Glu而得到的双特异性抗体具有和野生型同等以上的凝固活性。
图4表示对H39和L38的修饰抗体的因子IXa结合活性进行评价的结果。结果表明，所有修饰抗体均具有和野生型同等的结合活性。
图5表示对H39和L38的修饰抗体的因子X结合活性进行评价的结果。结果表明，所有修饰抗体均具有和野生型同等的结合活性。
图6是表示对L44的修饰抗体的H链和L链的缔合进行评价的结果的照片。结果表明：所有修饰抗体中，与野生型相比目标抗体的缔合比率均上升。
电泳泳道的说明：
1：野生型：人源化XB12H链+人源化XB12L链(P)+人源化SB04L链(P)；
2：D变异型：人源化XB12H链+人源化XB12L链(P)+人源化SB04L链(D)；
3：E变异型：人源化XB12H链+人源化XB12L链(P)+人源化SB04L链(E)；
4：R变异型：人源化XB12H链+人源化XB12L链(P)+人源化SB04L链(R)；
5：K变异型：人源化XB12H链+人源化XB12L链(P)+人源化SB04L链(K)。
图7表示对L44的修饰抗体的凝固活性进行评价的结果。结果表明，所有修饰抗体均具有高于野生型的凝固活性。
图8表示对L44的修饰抗体的因子X结合活性进行评价的结果。结果表明，所有修饰抗体均具有和野生型同等的结合活性。
图9是表示对H39、L38和L44的修饰抗体的H链和L链的缔合进行评价的结果的照片。结果表明：所有修饰抗体中，与野生型相比目标抗体的缔合比率均上升。
电泳泳道的说明：
1：野生型：人源化XB12H链(H39:Q)+人源化XB12L链(L38:Q)+人源化SB04L链(L38:Q，L44:P)；
2：E+D变异型：人源化XB12H链(H39:E)+人源化XB12L链(L38:Q)+人源化SB04L链(L38:E，L44:D)；
3：E+E变异型：人源化XB12H链(H39:E)+人源化XB12L链(L38:Q)+人源化SB04L链(L38:E，L44:E)；
4：E+R变异型：人源化XB12H链(H39:E)+人源化XB12L链(L38:Q)+人源化SB04L链(L38:E，L44:R)；
5：E+K变异型：人源化XB12H链(H39:E)+人源化XB12L链(L38:Q)+人源化SB04L链(L38:E，L44:K)；M：分子量标记。
图10表示对H39、L38和L44的修饰抗体的凝固活性进行评价的结果。结果表明，XB12H链(H39)和SB04L链(L38，L44)修饰的的双特异性抗体，具有和野生型同等以上的凝固活性。
图11表示对H39、L38和L44的修饰抗体的因子IXa结合活性进行评价的结果。结果表明，所有修饰抗体均具有和野生型同等的结合活性。
图12表示含两种重链可变区(VH1和VH2)和两种轻链可变区(VL1和VL2)的sc(Fv)2的结构的一个例子的模式图。(a)结构的sc(Fv)2主要存在(b)所示的两种构象异构体。
图13表示利用阳离子交换层析分离u2-wz4的构象异构体-峰1和峰2的结果。
图14表示利用阳离子交换层析分离的峰1和峰2的肽图。
图15是表示u2-wz4的构象异构体-峰1和峰2、分离前的u2-wz4经枯草蛋白酶处理后进行还原SDS-PAGE的结果的照片。所得谱带的结构如右所示。
图16表示二价scFv和单链抗体经枯草蛋白酶进行有限蛋白酶解后，因二者的结构差异而产生的降解图形的差异。当为二价scFv结构时，产生用点线包围的低分子量片段。
图17表示u2-wz4的构象异构体-峰1和峰2、分离前的u2-wz4经枯草蛋白酶进行有限蛋白酶解后的凝胶过滤层析的结果。用箭头表示低分子量峰的洗脱位置。
图18表示经固定有MG10-GST融合蛋白的柱纯化后的u2-wz4、变异体v1、变异体v3的凝胶过滤层析的结果。
图19表示u2-wz4、变异体v1、变异体v3的阳离子交换层析的结果。
图20是表示u2-wz4、u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2、变异体v1、变异体v3的等电点电泳结果的照片。
图21表示u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2、变异体v1、变异体v3在有限蛋白酶解后的凝胶过滤层析的分析结果。
图22表示u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2、变异体v1、变异体v3的TPO样激动剂活性评价的结果。
图23表示u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2、变异体v1、变异体v3的DSC分析的结果。
图24表示热加速试验中，u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2、变异体v1、变异体v3经凝胶过滤层析分析得到的单体残留率。
图25表示热加速试验中，u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2、变异体v1、变异体v3经阳离子交换层析分析得到的构象异构体含有比率。
图26表示对人源化双特异性抗体(人源化A69(hA69-PFL)/人源化B26(hB26-PF)/人源化BBA(hAL-AQ))的凝固活性进行评价的结果。结果表明，具有和嵌合双特异性抗体同等以上的凝固活性。
图27是修饰H链恒定区以提高双特异性抗体的形成效率的概念图。修饰位点号码采用EU编号(Kabat EA等，1991.Sequences ofProteins of Immunological Interest(有免疫力的蛋白序列).NIH)。
图28表示修饰了CH3界面的人源化双特异性抗体(IgG4型)的IEX分析的层析图。
图29表示修饰了CH3界面的人源化双特异性抗体(IgG4型)通过IEX分析得到的A-Homo、BiAb、B-Homo的形成比率。
图30表示自修饰了CH3界面的人源化双特异性抗体(IgG4型)纯化的BiAb在60℃-1周的热加速试验后的单体残留率。
图31表示对修饰了CH3界面的人源化双特异性抗体(IgG4型)的凝固活性进行评价的结果。结果表明，具有和未修饰的双特异性抗体同等的凝固活性。
图32表示通过对修饰了CH3界面的人源化双特异性抗体(IgG1型)的A-Homo、BiAb、B-Homo进行IEX分析得到的形成比率。
实施发明的最佳方式
本发明涉及一种调节多肽的缔合或由多肽构成的异源多聚体的缔合的方法。
首先，本发明提供一种调节多肽缔合的方法，该方法包括修饰原始多肽内形成界面的氨基酸残基，以抑制多肽内的缔合。
本发明中的多肽，通常是指具有大约10个氨基酸以上长度的肽和蛋白质。通常为来源于生物的多肽，但没有特别限定，例如可以是包括人工序列的多肽。可以是天然多肽或合成多肽、重组多肽等中的任一种。而且，上述多肽的片段也包括在内。
本发明中，多肽的缔合换而言之是指例如多个多肽区相互作用的状态。
本发明中，“调节缔合”是指调节成所需的缔合状态，更具体而言，是指使在多肽内不形成不希望的缔合。
本发明中，“界面”通常是指缔合(相互作用)时的缔合面。形成界面的氨基酸残基通常是指经受该缔合的多肽区所含的一个或多个氨基酸残基，更优选缔合时接近并参与相互作用的氨基酸残基。该相互作用具体包括：缔合时接近的氨基酸残基之间形成氢键、静电相互作用、盐桥的情况等。
本发明中，“形成界面的氨基酸残基”详细而言是指构成界面的多肽区所含的氨基酸残基。构成界面的多肽区的例子有：抗体、配体、受体、底物等中，在其分子内或分子间担负选择性键合的多肽区。具体而言，抗体中可以列举出：重链可变区、轻链可变区等。
本发明的方法中，氨基酸残基的“修饰”具体是指：用其他氨基酸残基取代原始氨基酸残基、使原始氨基酸残基缺失、添加新的氨基酸残基等，优选是指用其他氨基酸残基取代原始氨基酸残基。
本发明中，“多肽”优选为能够形成多种构象异构体的多肽。该构象异构体通常是指：氨基酸序列相同而立体结构(三维结构)不同的蛋白质。通常，构象异构体之间往往是化学或物理性质中至少有一项不同。
本发明的优选方案中，涉及一种用于从能够存在的多种构象异构体中优先(有效地)获得所需构象异构体的方法。即，作为一个方案，涉及在能够形成多种构象异构体的多肽中，修饰多肽内形成界面的氨基酸残基，以抑制形成一种以上构象异构体的多肽间的缔合的方法。
例如，多肽内存在第一至第四多肽区，当上述任意两个区能够缔合时，认为主要可以存在以下三种构象异构：(1)第一和第二多肽区缔合，并且第三和第四多肽区缔合；(2)第一和第三多肽区缔合，并且第二和第四多肽区缔合；(3)第一和第四多肽区缔合，并且第二和第三多肽区缔合。
上述状况中，若准备优先获得象(1)那样进行缔合的多肽(构象异构体)，例如可以修饰存在于上述第一、三或四多肽区的形成界面的氨基酸残基，以抑制第一多肽区与第三和第四多肽区的缔合。
本发明的方法还涉及一种调节异源多聚体缔合的方法，该方法包括修饰原始多肽间形成界面的氨基酸残基，以抑制多肽间的缔合。
本发明中，“异源多聚体(heteromultimer)”是指由多种多肽构成、并且该多肽相互能够缔合的蛋白质的多聚体。更详细而言，“异源多聚体”至少具有第一多肽和第二多肽，这里的第二多肽是指，和第一多肽相比，氨基酸序列中至少有一个氨基酸残基不同的分子。对该异源多聚体没有特别限定，但优选对至少两种不同的配体、抗原、受体或底物等具有结合特异性。除了由第一和第二多肽形成的“异源二聚体”之外，该异源多聚体中还可以存在其他种多肽。即，本发明的“异源多聚体”不限于异源二聚体，还包括例如异源三聚体、异源四聚体等。
上述方法的优选方案是在能够形成多种多聚体的异源多聚体中，修饰多肽间形成界面的氨基酸残基，以抑制形成一种以上多聚体的多肽间的缔合。
例如，由第一至第四多肽构成的蛋白质多聚体中，当上述任意两种多肽能够缔合时，主要可以存在以下多聚体：(1)第一和第二多肽缔合、并且第三和第四多肽缔合的多聚体；(2)第一和第三多肽缔合、并且第二和第四多肽缔合的多聚体；或者(3)第一和第四多肽缔合、并且第二和第三多肽缔合的多聚体。
上述状况中，若准备优先获得象(1)那样进行缔合的多聚体，例如可以修饰上述第一、三或四多肽所含的氨基酸残基，以抑制第一多肽与第三和第四多肽的缔合。
本发明的调节多肽缔合的方法的优选方案中，包括：例如一种修饰形成多肽界面的氨基酸残基的方法，该方法的特征在于：向该界面导入氨基酸残基的突变，使形成界面的多个氨基酸残基带有同种电荷。
上述方法中，认为是通过修饰界面上参与缔合的多个氨基酸残基，使彼此带有同种电荷，从而利用其电荷间的排斥，来抑制上述氨基酸残基之间的缔合。
因此，上述方法中，修饰的氨基酸残基优选为在形成界面的多肽区间，缔合时相互接近的多个氨基酸残基。
缔合时接近的氨基酸残基，例如可以通过分析多肽的立体结构，研究该多肽缔合时形成界面的多肽区的氨基酸序列来识别。界面上相互接近的氨基酸残基成为本发明的方法中“修饰”的优选目标。
氨基酸中已知有荷电氨基酸。通常，荷正电的氨基酸(正电荷氨基酸)已知有：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。荷负电的氨基酸(负电荷氨基酸)已知有：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。因此，本发明中优选带有同种电荷的氨基酸是指正电荷氨基酸或负电荷氨基酸。
本发明的方法中，突变的全部氨基酸残基优选修饰成带有同种电荷，但未必受限于此。例如，当通过修饰而导入的氨基酸残基有多个时，上述氨基酸残基中可以包括少量不带电的氨基酸残基。
本发明的方法中，对经受修饰的氨基酸残基数没有特别限定，但例如当修饰抗体可变区时，为了不降低所得抗体与抗原的结合活性以及不提高其抗原性，优选尽量少数的氨基酸残基被修饰。如下述实施例所述，本发明的方法可以通过修饰界面上接近的两个氨基酸残基或其中至少一个来调节缔合。上述“少数”表示例如1～10左右的数，优选1～5左右的数，更优选1～3左右的数，最优选1或2。
本发明的优选方案中，优选通过修饰而导入的(经受修饰)氨基酸残基为所有选自上述正电荷氨基酸中的氨基酸残基，或者所有选自上述负电荷氨基酸中的氨基酸残基。
本发明中，导入的氨基酸残基优选为：谷氨酸(E)、天冬酰胺(D)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
本发明的另一优选方案为：当原始(修饰前的)多肽中形成界面的氨基酸残基(X)已经带有电荷时，修饰缔合时和该氨基酸残基接近并相对的氨基酸残基，使之成为和该氨基酸残基(X)相同的氨基酸残基(或带有同种电荷的氨基酸残基)。该方案中，可以只修饰形成界面的氨基酸残基中的一个。
本发明的缔合调节方法的优选方案中，包括一种修饰形成多肽界面的氨基酸残基的方法，该方法的特征在于：向该界面导入氨基酸残基的突变，使存在于界面的形成疏水核的氨基酸残基成为荷电氨基酸残基。
通常，“疏水核(hydrophobic core)”是指在缔合的多肽内侧，疏水性氨基酸的侧链聚集而形成的部分。疏水性氨基酸包括：丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸等。另外，除疏水性氨基酸以外的氨基酸残基(例如酪氨酸)有时也参与疏水核的形成。该疏水核和亲水性表面一起成为促进水溶性多肽缔合的驱动力，在上述亲水性表面亲水性氨基酸的侧链暴露在外侧。若两个不同结构域的疏水性氨基酸存在于分子表面并暴露在水分子中，则熵增加、自由能增加。因此，两个结构域相互缔合，以减少自由能和实现稳定化，而界面的疏水性氨基酸被埋入分子内部，形成疏水核。
在发生多肽缔合时，从形成疏水核的疏水性氨基酸修饰成荷电的极性氨基酸，从而抑制疏水核的形成，其结果，抑制了多肽的缔合。
本领域技术人员可以通过分析所需多肽的氨基酸序列，来识别是否存在疏水核和形成部位(区)等。即，本发明涉及一种缔合调节方法，该方法的特征在于：将界面上能够形成疏水核的氨基酸残基修饰成荷电氨基酸残基。
上述方法中，荷电氨基酸残基可以优选列举出：谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
本发明的缔合调节方法，可以作为一种在抗体或抗体片段和具有抗体样活性的多肽等的制备中，优先获得(制备)目标抗体的方法。
本发明中，“抗体”一词取其最广泛的意义，只要表示所需生物学活性即可，包括：单克隆抗体、多克隆抗体、抗体突变体(嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体(还包括抗体片段)、多特异性抗体等)。本发明中，“抗体”可以是多肽或异源多聚体中的任一种。优选的抗体为：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及抗体片段等小分子抗体。本发明中，当获得(制成)上述抗体时，可以适当采用本发明的缔合调节方法。
本发明中，“多特异性抗体(multispecific antibody)”(在本说明书中，和“多重特异性抗体(polyspecific antibody)”意思相同)是指能够和多种不同表位进行特异性结合的抗体。即，多特异性抗体是对至少两种不同表位具有特异性的抗体，除了识别不同抗原的抗体以外，还包括识别同一抗原上的不同表位的抗体。(例如，当抗原为异源受体(heterologous receptor)时，多特异性抗体识别构成异源受体的不同结构域；或者当抗原为单体时，多特异性抗体识别单体抗原的多个位点)。通常，这种分子和两个抗原结合(双特异性抗体(bispecificantibody)，在本说明书中和“双重特异性抗体”(dual-specific antibody)意思相同)，但是可以对两种以上(例如三种)的抗原具有特异性。
本发明中，“抗体”包括：通过对上述抗体进一步进行氨基酸的取代、缺失、添加和/或***、或嵌合或人源化等，使其氨基酸序列修饰的抗体。氨基酸的取代、缺失、添加和/或***以及人源化或嵌合等氨基酸序列的修饰，可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。同样，制作本发明的抗体作为重组抗体时，也可以通过对所用抗体的可变区和恒定区进行氨基酸的取代、缺失、添加和/或***或者嵌合或人源化等，来修饰其氨基酸序列。
本发明中的抗体，可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来源于任一种动物的抗体。而且，可以是例如嵌合抗体、特别是人源化抗体等取代了氨基酸序列的修饰抗体。还可以是结合有各种分子的抗体修饰物、抗体片段、小分子抗体等任何抗体。
“嵌合抗体”是指将来源于不同动物的序列组合而制作的抗体。例如有：包括小鼠抗体的重链、轻链的可变(V)区和人抗体的重链、轻链的恒定(C)区的抗体。嵌合抗体的制作方法众所周知，例如将编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA连接，将其***到表达载体并导入到宿主中，从而可以得到嵌合抗体。
“人源化抗体”也称作重构(reshaped)人抗体，是将来源于人以外的哺乳动物的抗体例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)移植到人抗体的CDR而得到的抗体。用于鉴定CDR的方法众所周知(Kabat等，Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987)，National Instituteof Health，Bethesda，Md.；Chothia等，Nature(1989)342：877)。另外，其通常的基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。因此，可以利用公知的方法例如确定小鼠抗体的CDR，获得编码抗体的DNA，上述抗体连接有小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区(FR)，之后通过使用通常的表达载体体系产生人源化抗体。上述DNA可以使用多个寡核苷酸作为引物，通过PCR法来合成，上述寡核苷酸制作成在CDR和FR的末端区均具有重叠部分(参照WO98/13388号公报中记载的方法)。选择经由CDR连接的人抗体的FR，使CDR形成良好的抗原结合部位。根据需要，可以修饰抗体可变区FR的氨基酸，使重构人抗体的CDR形成合适的抗原结合部位(Sato等，Cancer Res.(1993)53：851-6)。在可修饰的FR中的氨基酸残基中包括：通过非共价键直接与抗原结合的部分(Amit等，Science(1986)233：747-53)、影响或作用于CDR结构的部分(Chothia等，J.Mol.Biol.(1987)196：901-17)和与VH-VL相互作用有关的部分(EP239400号专利公报)。
本发明中，当抗体为嵌合抗体或人源化抗体时，上述抗体的C区优选使用来源于人抗体的C区。例如，在H链中可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4；在L链中可以使用Cκ、Cλ。为了改善抗体或其生产稳定性，可以根据需要修饰人抗体C区。本发明中，嵌合抗体优选含有来源于人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来源于人抗体的恒定区。而人源化抗体优选含有来源于人以外的哺乳动物的抗体的CDR和来源于人抗体的FR和C区。关于可变区，在(3)-3.中总结说明。来源于人抗体的恒定区具有各IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE等同种型所固有的氨基酸序列。本发明中，人源化抗体所使用的恒定区可以是属于任意同种型的抗体的恒定区。优选使用人IgG的恒定区，但并不受限于此。对用于人源化抗体的来源于人抗体的FR也没有特别限定，可以是属于任意同种型的抗体的FR。
本发明中，嵌合抗体和人源化抗体的可变区和恒定区，只要表示原始抗体的结合特异性即可，可以通过缺失、取代、***和/或添加等进行修饰。
使用来源于人的序列得到的嵌合抗体和人源化抗体，由于其在人体内的抗原性已经减弱，当为了治疗等而对人进行给药时实用。
关于小分子抗体，无论从其体内动力学性质方面考虑，还是从可以使用大肠杆菌、植物细胞等低成本地进行制备方面考虑，其作为抗体都是有用的。
抗体片段是一种小分子抗体。小分子抗体还包括以抗体片段作为其一部分结构的抗体。本发明中，小分子抗体只要具有抗原结合能即可，对其结构、制备方法等没有特别限定。小分子抗体中，还存在具有高于全长抗体的活性的抗体(Orita等，Blood(2005)105：562-566)。本说明书中，“抗体片段”只要是全长抗体(例如全长IgG等)的一部分即可，没有特别限定，优选包括重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。优选的抗体片段的例子有：Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv等。抗体片段中的VH或VL的氨基酸序列，可以通过取代、缺失、添加和/或***来修饰。并且，只要保持抗原结合能即可，可以缺乏VH和VL的一部分。例如，上述抗体片段中，“Fv”是包括完整的抗原识别部位和结合部位的最小抗体片段。“Fv”是一个VH和一个VL通过非共价键强力结合而成的二聚体(VH-VL二聚体)。通过各可变区的3个互补链决定区(CDR)，在VH-VL二聚体的表面形成抗原结合部位。6个CDR赋予抗体以抗原结合部位。但是，即使是一个可变区(或者是仅包括3个抗原特异性CDR的Fv的一半)，虽然和全结合部位相比亲和性低，但是也具有识别并结合抗原的能力。因此，较上述Fv小的分子也包括在本发明的抗体片段内。还可以对抗体片段的可变区进行嵌合和人源化。
小分子抗体优选包括VH和VL。小分子抗体的例子有：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv等抗体片段以及使用抗体片段制作的scFv(单链Fv)(Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：5879-83；Plickthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)”第113卷，Reaenburg和Moore编，Springer Verlag，New York，第269-315页，(1994))、双抗体(diabody)(Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：6444-8；EP404097号；WO93/11161号；Johnson等，Methodin Enzymology(1991)203：88-98；Holliger等，Protein Engineering(1996)9：299-305；Perisic等，Structure(1994)2：1217-26；John等，ProteinEngineering(1999)12(7)：597-604；Atwell等，Mol.Immunol.(1996)33：1301-12)、sc(Fv)2(Hudson等，J Immunol.Methods(1999)231：177-89；Orita等，Blood(2005)105：562-566)、三链抗体(triabody)(Journal of Immunological Mtthods(1999)231：177-89)和串联双抗体(Cancer Rrsearch(2000)60：4336-41)等。
抗体片段可以通过将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶进行处理而得到(参照Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods(1992)24：107-17；Brennan等，Science(1985)229：81)。还可以根据该抗体片段的氨基酸序列通过基因重组来制备。
具有修饰了抗体片段的结构的小分子抗体，可以利用通过酶处理或基因重组而得到的抗体片段来构建。或者，还可以构建编码小分子抗体整体的基因，并将其导入到表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达(参照例如，Co等，J.Immunol.(1994)152：2968-76；Better和Horwitz，Methods Enzymol.(1989)178：476-96；Pluckthun和Skerra，Methods Enzymol.(1989)178：497-515；Lamoyi，MethodsEnzymol.(1986)121：652-63；Rousseaux等，Methods Enzymol.(1986)121：663-9；Bird和Walker，Trends Biotechnol.(1991)9：132-7)。
上述“scFv”是单链多肽，该单链多肽中两个可变区根据需要经由接头等连接。scFv所含的两个可变区，通常是一个VH和一个VL，但也可以是两个VH或两个VL。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间含有接头，通过该接头形成用于抗原结合所必需的VH和VL的成对部分。通常，为了在相同分子内在VH和VL之间形成成对部分，一般使连接VH和VL的接头为10个氨基酸以上长度的肽接头。但是，本发明中scFv的接头，只要不妨碍scFv的形成即可，并不限于上述肽接头。scFv的综述可以参照Pluckthun“The Pharmacology of MonoclonalAntibody”第113卷(Rosenburg and Moore编，Springer Verlag，NY，第269-315页(1994))。
另外，“双抗体(Db)”是指通过基因融合而构建的二价的抗体片段(P.Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体，每一条多肽链在同一链中轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过短至无法相互结合的接头例如5残基左右的接头进行连接。编码在同一多肽链上的VL和VH，由于其间的接头短而无法形成单链V区片段(fragment)，从而形成了二聚体，因此双抗体有两个抗原结合部位。此时，若相对两个不同表位(a，b)的VL和VH同时表达通过5残基左右的接头连接的VLa-VHb和VLb-VHa的组合，则作为双特异性Db分泌。此时，两个不同表位可以是同一抗原上的两个不同位点的表位，也可以是分别位于两个不同抗原上的两个位点的表位。
双抗体含有两分子的scFv，因此含有四个可变区，其结果，双抗体具有两个抗原结合部位。与未形成二聚体的scFv的情况不同，为了形成双抗体时，通常，当各scFv分子内的连接VH和VL间的接头为肽接头时，是5个氨基酸左右的接头。但是，形成双抗体的scFv的接头，只要不妨碍scFv的表达和双抗体的形成即可，并不限于上述肽接头。
用于本发明方法的优选多肽或异源多聚体，例如有：具有抗体重链可变区和轻链可变区的多肽或异源多聚体。本发明的优选方案中，更优选本发明的多肽或异源多聚体为含有多种重链可变区和多种轻链可变区时的缔合调节方法。该多肽或异源多聚体优选识别多种表位，例如包括多特异性抗体。
本发明中，可以更优选例如双特异性抗体作为多特异性抗体。
即，本发明的优选方案中，例如涉及一种调节双特异性抗体缔合的方法，上述双特异性抗体由两种重链可变区(第一重链和第二重链)和两种轻链可变区(第一轻链和第二轻链)构成。
进一步对本发明的优选方案的“双特异性抗体”进行详述，上述“第一重链”是指形成抗体的两条H链中的一条H链，第二H链是指不同于第一H链的另一条H链。即，两条H链中，可以将任意一条作为第一H链，将另一条作为第二H链。同样，“第一轻链”是指形成双特异性抗体的两条L链中的一条L链，第二L链是指不同于第一L链的另一条L链，两条L链中，可以将任意一条作为第一L链，将另一条作为第二L链。通常，第一L链和第一H链来源于识别某种抗原(或表位)的同一抗体，而第二L链和第二H链也来源于识别某种抗原(或表位)的同一抗体。这里，将由第一H链·L链形成的L链-H链对称为第一对，将由第二H链·L链形成的L链-H链对称为第二对。制作第二对来源的抗体时所使用的抗原(或表位)优选不同于制作第一对来源的抗体时所使用的抗原(或表位)。即，第一对和第二对所识别的抗原可以相同，但优选识别不同的抗原(或表位)。这种情况下，第一对和第二对的H链和L链优选具有互不相同的氨基酸序列。当第一对和第二对识别不同的表位时，该第一对和第二对可以识别完全不同的抗原，也可以识别同一抗原上的不同部位(不同表位)。其中一对识别蛋白质、肽、基因、糖等抗原，另一对可以识别放射性物质、化疗试剂、来源于细胞的毒素等细胞毒性物质等。但是，当准备制作具有以特定的H链和L链的组合形成对的抗体时，可以任意确定其特定的H链和L链作为第一对和第二对。
应说明的是，上述“双特异性抗体”未必限于包括两种重链和两种轻链的抗体，例如可以是具有以下结构的抗体，所述结构中两种重链可变区和两种轻链可变区连接成单链(例如，sc(Fv)2)。
本发明的方法中，编码导入突变之前的抗体(本说明书中有时仅记作“本发明的抗体”)的H链或L链的基因也可以使用已知的序列，还可以按照本领域技术人员所公知的方法而获得。例如，既可以由抗体文库获得，也可以由产生单克隆抗体的杂交瘤克隆编码抗体的基因而获得。
关于抗体文库，已经有多个公知的抗体文库，另外抗体文库的制作方法也众所周知，本领域技术人员可以获取适当的抗体文库。例如，关于噬菌体抗体文库，可以参照Clackson等，Nature 1991，352：624-8；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-97；Water houses等，Nucleic Acids Res.1993，21：2265-6；Griffitbs等，EMBO J.1994，13：3245-60；Vaughan等，Nature Biotechnology 1996，14：309-14和日本特表平20-504970号公报等文献。此外，可以使用以真核细胞作为文库的方法(WO95/15393号小册子)或核糖体提示法等公知方法。而且，还已知使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，可以以人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法使之在噬菌体表面表达来选择与抗原结合的噬菌体。分析所选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。一旦清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，就可以根据该序列制作适当的表达载体，获得人抗体。上述方法已经众所周知，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
由杂交瘤获得编码抗体的基因的方法，基本上使用公知技术，使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，利用通常的细胞融合法使所得免疫细胞和公知的亲本细胞融合，再利用通常的筛选法筛选单克隆抗体产生细胞(杂交瘤)，并使用逆转录酶由所得杂交瘤的mRNA合成抗体可变区(V区)的cDNA，将该cDNA和编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接而得到。
更具体而言，并不特别限于以下例子，用于得到上述编码H链和L链的抗体基因的致敏抗原，包括具免疫原性的完全抗原和不具免疫原性的不完全抗原两者，上述不完全抗原包括半抗原等。例如，可以使用目标蛋白的全长蛋白或部分肽等。此外，已知由多糖类、核酸、脂质等构成的物质能够成为抗原，本发明抗体的抗原并没有特别限定。抗原的制备可以按照本领域技术人员所公知的方法来进行，例如可以按照使用杆状病毒的方法(例如WO98/46777等)等进行制备。杂交瘤的制作，例如可以按照Milstein等人的方法(G.Kohler和C.Milstein，Methods Enzymol.1981，73：3-46)等来进行。当抗原的免疫原性低时，可以使之和白蛋白等具免疫原性的大分子结合来进行免疫。还可以根据需要使抗原和其他分子结合，从而成为可溶性抗原。当使用受体等跨膜分子作为抗原时，可以使用受体的胞外区部分作为片段，或者使用细胞表面上表达跨膜分子的细胞作为免疫原。
抗体产生细胞可以通过使用上述适当的致敏抗原，对动物进行免疫而得到。或者，在体外对能够产生抗体的淋巴细胞进行免疫而成为抗体产生细胞。进行免疫的动物可以使用各种哺乳动物，但通常使用啮齿类、兔形目、灵长类动物。例如有：小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类；兔等兔形目；食蟹猴、恒河猴、狒狒、黑猩猩等灵长类动物。此外，还已知具有人抗体基因库(repertories)的转基因动物，通过使用上述动物，也可以得到人抗体(参照WO96/34096；Mendez等，Nat.Genet.1997，15：146-56)。不使用上述转基因动物，而是通过在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞，并使致敏淋巴细胞和人骨髓瘤细胞例如U266融合，也可以得到具抗原结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878号公报)。另外，还可以通过用所需抗原对具有完全人抗体基因库的转基因动物进行免疫得到所需的人抗体(参照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735)。
动物的免疫可如下进行：将致敏抗原用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水等适当稀释并悬浮，根据需要混合佐剂并进行乳化，然后注射到动物的腹腔内或皮下来进行免疫。之后，优选每4～21天给予数次和弗式不完全佐剂混合的致敏抗原。可以通过常规方法测定动物血清中目标抗体的效价来确认抗体的产生。
杂交瘤可如下制备：使用常用融合剂(例如聚乙二醇)，使自动物或淋巴细胞得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合来制备，上述动物经所需抗原免疫(Golding，Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)：Principles and Practice，Academic Press，1986，59-103)。根据需要培养、增殖杂交瘤细胞，并通过免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)等公知的分析方法，测定由该杂交瘤产生的抗体的结合特异性。之后，根据需要可以利用限度稀释法等方法亚克隆产生抗体的杂交瘤，上述抗体的目标特异性、亲和性或活性已测定。
接下来，可以使用能够与抗体特异性结合的探针(例如，与编码抗体恒定区的序列互补的寡核苷酸等)，由杂交瘤或抗体产生细胞(致敏淋巴细胞等)克隆编码所选择的抗体的基因。还可以通过RT-PCR由mRNA进行克隆。免疫球蛋白分为：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五个不同类别。而且，这些类别分成几个亚类(同种型)(例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2等)。本发明中，对抗体制备中使用的H链和L链没有特别限定，可以来源于属于上述任一类别和亚类的抗体，特别优选为IgG。
这里，还可以通过基因工程技术修饰编码H链和L链的基因。例如，对于小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、山羊抗体、骆驼抗体等抗体，为了减弱其对人的异种抗原性等，可以适当制作人工修饰的基因重组型抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体等。嵌合抗体是含有除了人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的H链、L链的可变区和人抗体的H链、L链的恒定区的抗体，可以通过将编码小鼠抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，将其***到表达载体中，并导入到宿主中而产生。人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体，可通过PCR法由多个寡核苷酸合成，上述寡核苷酸制作成在DNA序列的末端具有重叠部分，上述DNA序列设计成连接除人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)。将所得DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，然后***到表达载体中，并将其导入到宿主中而产生人源化抗体(参照EP239400；WO96/02576)。经由CDR连接的人抗体的FR，选择互补性决定区形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，可以取代抗体可变区的构架区氨基酸，使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合部位(K.Sato等，Cancer Res.1993，53：851-856)。
除上述人源化以外，还可以为了改善例如抗原结合性等抗体的生物学特性而进行修饰。上述修饰可以通过位点特异性诱变(参照例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)、PCR诱变、盒式诱变等方法来进行。通常，生物学特性得到改善的抗体突变体，其相对于原始抗体可变区的氨基酸序列，具有70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上(例如95％以上、97％、98％、99％等)的氨基酸序列同源性和/或相似性。本说明书中，序列同源性和/或相似性定义为：根据需要进行序列排比和间隙导入(gap introduction)，使序列同源性最大化之后，与原始抗体残基相同(相同残基)或相似(根据一般的氨基酸侧链的特性分类为同一组的氨基酸残基)的氨基酸残基的比例。通常，天然氨基酸残基根据其侧链的性质分为以下几组：(1)疏水性：丙氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和亮氨酸；(2)中性亲水性：天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸；(3)酸性：天冬氨酸和谷氨酸；(4)碱性：精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸和脯氨酸；以及(6)芳族性：酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。
通常，存在于H链和L链的可变区的共6个互补性决定区(超可变区；CDR)相互作用，形成抗体的抗原结合部位。已知即使是其中一个可变区，尽管与包括所有结合部位时相比亲和性低，但也具有识别并结合抗原的能力。因此，本发明的编码H链和L链的抗体基因，其只要编码包括H链和L链的各抗原结合部位的片段部分即可，由该基因编码的多肽只要维持与所需抗原的结合性即可。
如上所述，本发明的缔合调节方法，例如可以优先(有效地)获得所需双特异性抗体。即，可以有效地由单体混合物形成所需异源多聚体-双特异性抗体。
以下，对IgG型双特异性抗体的情况进行更详细的说明，该抗体具有两种重链可变区(VH1和VH2)和两种轻链可变区(VL1和VL2)，其他异源多聚体也同样可以采用本发明的方法。
当准备获得通过第一重链可变区(VH1)和第一轻链可变区(VL1)识别其中一个表位、并通过第二重链可变区(VH2)和第二轻链可变区(VL2)识别另一个表位的双特异性抗体时，若在该抗体的生产中表达了4种中的每一种链，则理论上可以生产10种抗体分子。
这种情况下，若进行调节以抑制例如VH1与VL2和/或VH2与VL1之间多肽间的缔合，则可以优先获得所需抗体分子。
例如，象上述那样通过修饰VH1多肽与VL2多肽之间和/或VH2多肽与VL1多肽之间形成界面的氨基酸残基，来抑制上述多肽间的缔合。
另外，利用本发明的缔合调节方法，还可以调节重链之间(VH1和VH2)或轻链之间(VL1和VL2)的缔合。
如上所述，重链可变区通常由3个CDR区和FR区构成。本发明的优选方案中，作为经受“修饰”的氨基酸残基，例如可以从位于CDR区或FR区的氨基酸残基中适当选择。通常，修饰CDR区的氨基酸残基，有时会降低对抗原的结合能。因此，本发明中对经受“修饰”的氨基酸残基没有特别限定，优选从位于FR区的氨基酸残基中适当选择。
关于欲通过本发明的方法调节缔合的所需多肽，本领域技术人员可以适当发现缔合时在FR界面上接近的氨基酸残基的种类。
本领域技术人员可以利用公共数据库等适当获得人或小鼠等生物中可用作抗体可变区的FR的序列。更具体而言，使用下述实施例中记载的方法，可以获得FR区的氨基酸序列信息。
例如，关于下述实施例所示的双特异性抗体，缔合时在FR界面接近的氨基酸残基的具体例子有：重链可变区上39位(FR2区)(例如，SEQ ID NO：6中记载的氨基酸序列的39位)的谷氨酰胺(Q)和相对(接触)的轻链可变区上38位(FR2区)(例如，SEQ ID NO：8中记载的氨基酸序列的44位)的谷氨酰胺(Q)。还可以适当列举：重链可变区上45位(FR2)(例如，SEQ ID NO：6中记载的氨基酸序列的45位)的亮氨酸(L)和相对的轻链可变区上44位(FR2)(例如，SEQ ID NO：8中记载的氨基酸序列的50位)的脯氨酸(P)。应说明的是，关于上述部位的编号，参考Kabat等人的文献(Kabat EA等，1991.Sequence of Proteins ofImmunological Interest.NIH)。
如下述实施例所示，通过修饰这些氨基酸残基并实施本发明的方法，可以优先获得所需抗体。
已知这些氨基酸残基在人和小鼠中高度保存(J.Mol.Recognit.2003；16：113-120)，因此对于除实施例所示抗体以外的VH和VL的缔合，也可以通过修饰对应于上述氨基酸残基的氨基酸残基，来调节抗体可变区的缔合。
即，优选方案中，本发明提供一种抗体(多肽(例如，sc(Fv)2)或异源多聚体(例如，IgG型抗体)等)，该抗体包括重链可变区和轻链可变区，该抗体为以下(1)和(2)、或(3)和(4)的氨基酸残基带有同种电荷。
(1)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中的39位的氨基酸残基；
(2)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列中的44位的氨基酸残基；
(3)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中的45位的氨基酸残基；
(4)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列中的50位的氨基酸残基。
应说明的是，上述SEQ ID NO：6或8中记载的氨基酸序列是用于更具体地例示本发明中经受修饰的氨基酸残基的位置，本发明并不限于重链可变区或轻链可变区为上述氨基酸序列的情形。
如下述实施例和图1所示，上述(1)和(2)、(3)和(4)中记载的各氨基酸残基在缔合时相互接近。关于所需重链可变区或轻链可变区，本领域技术人员可以通过使用市售软件进行同源模建等，找到对应于上述(1)～(4)中记载的氨基酸残基的部位，可以使该部位的氨基酸残基适当地经受修饰。
上述抗体中，“荷电氨基酸残基”优选从例如以下(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基中选择。
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
本发明还提供一种抗体(多肽或异源多聚体等)，该抗体包括重链可变区和轻链可变区，该抗体为以下(3)和(4)中的任一种氨基酸残基为荷电氨基酸残基。以下(3)和(4)所示的氨基酸残基的侧链能够相互接近而形成疏水核。
(3)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中的45位的氨基酸残基；
(4)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列中的50位的氨基酸残基。
上述抗体中，“荷电氨基酸残基”优选为例如：谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)。
通常，在人和小鼠中，上述(1)～(4)中记载的氨基酸残基分别为：(1)谷氨酰胺(Q)、(2)谷氨酰胺(Q)、(3)亮氨酸(L)、(4)脯氨酸(P)。因此，在本发明的优选方案中，使这些氨基酸残基经受修饰(例如，取代成荷电氨基酸)。应说明的是，上述(1)～(4)的氨基酸残基的种类未必限于上述氨基酸残基，可以是相当于该氨基酸的其他氨基酸。例如，当为人时，轻链可变区上对应于SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列中的44位的氨基酸例如可以是组氨酸(H)。本领域技术人员通过参照公知文献等(例如，J.Mol.Recognit.2003；16：113-120)，可以发现对应于SEQ ID NO：8上的任意位置的氨基酸残基的种类，可以对该氨基酸残基进行适当修饰(例如，取代成荷电氨基酸)。
本发明的优选方案为：上述抗体的制造方法和本发明的缔合调节方法，后者的特征在于：修饰上述(1)～(4)的氨基酸残基。
本发明的另一方案为一种方法，该方法是向重链或轻链的恒定区界面导入静电排斥，来调节重链之间或重链和轻链之间的缔合。在重链恒定区的界面相互接触的氨基酸残基例如有：对应于CH3区的377位(356位)和470位(439位)、378位(357位)和393位(370位)、427位(399位)和440位(409位)的区。在重链恒定区和轻链恒定区的界面相互接触的氨基酸残基例如有：对应于CH1区的221位(213位)和CL区的123位的区。关于抗体恒定区的编号，可参考Kabat等人的文献(Kabat EA等，1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)，重链恒定区的EU编号如括号内所示。
如下述实施例所示，通过修饰上述氨基酸残基并实施本发明的方法，可以调节抗体重链的缔合，优先获得所需抗体。
即，在优选方案中，本发明提供一种抗体，该抗体为包括多种重链CH3区的抗体和Fc区结合蛋白(例如，IgG型抗体、小分子抗体(AltM等，FEBS Letters 1999；454：90-94)、免疫黏附素(非专利文献2)等)，其中第1重链CH3区中的1组至3组氨基酸残基带有同种电荷，上述氨基酸残基选自以下(1)～(3)所示的氨基酸残基组。
(1)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于356位和439位；
(2)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于357位和370位；
(3)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于399位和409位；
在更优选的方案中，本发明提供一种抗体，该抗体中不同于上述第1重链CH3区的第2重链CH3区中的氨基酸残基组为选自上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组，其中对应于上述第1重链CH3区中带有同种电荷的上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组的一组至三组氨基酸残基带有和上述第1重链CH3区中对应的氨基酸残基相反的电荷。
如下述实施例和图27所示，上述(1)～(3)中的各氨基酸残基在缔合时相互接近。关于所需重链CH3区或重链恒定区，本领域技术人员可以通过使用市售软件进行同源模建等，找到对应于上述(1)～(3)中记载的氨基酸残基的部位，可以使该部位的氨基酸残基适当地经受修饰。
上述抗体中，“荷电氨基酸残基”优选从例如以下(a)或(b)中的任一组所含的氨基酸残基中选择。
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
上述抗体中，“带有同种电荷”是指例如多个氨基酸残基均具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基。“带有相反电荷”是指例如多个氨基酸残基中至少有一个具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基时，其余的氨基酸残基具有不同组所含的氨基酸残基。
在优选方案中，上述抗体的第1重链CH3区和第2重链CH3区可以通过二硫键进行交联。
本发明中，经受“修饰”的氨基酸残基并不限于上述抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。关于多肽突变体或异源多聚体，本领域技术人员可以通过使用市售软件进行同源模建等，找到形成界面的氨基酸残基，可以使该部位的氨基酸残基经受修饰，以便调节缔合。
本发明的方法尽管不是必需的，还可以将其与公知技术组合进行实施。例如，除了通过本发明的“修饰”来促进VH1和VL1和/或VH2和VL2的缔合之外，还可通过将存在于一条H链的可变区的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob，突起)，将存在于另一条H链的相对可变区的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole，空隙)，并将突起配置在间隙中，来促进VH1和VL1和/或VH2和VL2的缔合，结果，可以进一步抑制VH1和VL2和/或VH2和VL1的多肽间的缔合。
本发明的缔合调节方法可以适合在优先(有效地)获得所需sc(Fv)2时实施。以下，以具有两种重链可变区(H1和H2)和两种轻链可变区(L1和L2)的sc(Fv)2为例，更详细地进行说明。
通常，sc(Fv)2是一种单链多肽，其中两个重链可变区(VH1和VH2)和两个轻链可变区(VL1和VL2)通过接头连接。即，sc(Fv)2是一种将四个抗体可变区通过接头等连接而成的单链的小分子抗体。通常，sc(Fv)2是一种将两个轻链可变区和两个重链可变区这四个可变区通过接头等连接而成的单链的抗体(Hudson等，J Immunol.Methods1999；231：177-189)。
sc(Fv)2可以按照本领域技术人员所公知的方法进行制备，例如，可以用接头连接scFv来进行制备。scFv中包括抗体的VH和VL，这些区存在于一条多肽链中(scFv的综述可参照Pluckthun“ThePharmacology of Monoclonal Antibodies”第113卷(Rosenburg和Moore编(Springer Verlag，New York)第269-315页，1994))。
优选这样一种抗体，其特征在于：以单链多肽的N末端侧为基点，两个VH和两个VL按VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列。
两个VH和两个VL的顺序并不特别限于上述排列，可以按任一种顺序排列。还可以列举如以下排列：
[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]
sc(Fv)2可以含有除抗体可变区和接头以外的氨基酸序列。
上述抗体的可变区可以是可变区的全长，但只要维持抗原结合活性即可，可以是可变区的部分序列。还可以对可变区中的氨基酸序列进行取代、缺失、添加、***等。例如，为了降低抗原性，可以对其进行嵌合或人源化。
连接抗体可变区的接头可以是：能通过基因工程导入的任意肽接头或化学合成接头(例如参照Protein Engineering，9(3)，299-305，1996中公开的接头)等，本发明中优选肽接头。对肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可以根据目的而适当选择，但优选的长度为12个氨基酸以上(对上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。sc(Fv)2中包括三个肽接头时，可以全部使用长度相同的肽接头，也可以使用长度不同的肽接头。
肽接头的例子有：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly)n
可以列举[n为1以上的整数]等。但是，肽接头的长度或序列，可以由本领域技术人员根据目的而适当选择。
sc(Fv)2的优选方案例如有以下sc(Fv)2：
[VH]肽接头(15个氨基酸)[VL]肽接头(15个氨基酸)[VH]肽接头(15个氨基酸)[VL]。
化学合成接头(化学交联剂)是通常用于肽交联的交联剂，例如有：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(Sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-DST)、双[2-(琥珀酰亚氨氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚氨氧基羰基氧基)乙基]砜(Sulfo-BSOCOES)等，上述交联剂市场上可以买到。
在连接四个抗体可变区时，通常需要三个接头，这些接头可以使用相同的也可以使用不同的。
sc(Fv)2中的构象异构体例如有：单链双抗体型(single chaindiabody)和二价scFv型。
当sc(Fv)2以[可变区1](接头1)[可变区2](接头2)[可变区3](接头3)[可变区4]的顺序排列时，本发明中二价scFv型是指具有以下结构的sc(Fv)2，所述结构为：可变区1和可变区2缔合、并且可变区3和可变区4缔合。本发明中，单链双抗体型是指具有以下结构的sc(Fv)2，所述结构为：可变区1和可变区4缔合、并且可变区2和可变区3缔合。
单链双抗体型例如是：具有图12(b)的右侧所示结构的sc(Fv)2；二价scFv型例如是：具有图12(b)的左侧所示结构的sc(Fv)2。
例如，可以通过有限蛋白酶解法分析sc(Fv)2中是否具有单链双抗体型或二价scFv型结构。例如可以通过以下方法进行分析。
使用可以部分地有限分解sc(Fv)2的接头部分的一种蛋白酶-枯草蛋白酶A，对受检sc(Fv)2进行有限分解。
当sc(Fv)2为单链双抗体型时，无论sc(Fv)2的三个接头中的哪一个被切断，表观分子量都不会因VH和VL之间的相互作用而发生变化。
而当sc(Fv)2为二价scFv型时，若中央接头被切断，则生成一半分子量的分子种。
因此，通过分析反应产物，可以判别二价scFv型和单链双抗体型。
例如，可以通过凝胶过滤层析法分析反应产物。还可以利用层析，根据峰面积来定量评价sc(Fv)2中所含的二价sc(Fv)2结构和单链双抗体结构的存在比例。
当准备优先获得所需型的上述sc(Fv)2，即单链双抗体型或二价scFv型时，可以适当使用本发明的缔合调节方法。
更具体而言，当sc(Fv)2具有VH1-(接头)-VL1-(接头)-VH2-(接头)-VL2型结构时，若准备使用本发明的缔合调节方法优先获得二价scFv型sc(Fv)2，例如，只要抑制VH1和VL2和/或VH2和VL1之间的缔合即可(例如，导入突变使VH1和VL2之间形成界面的氨基酸残基带有同种电荷)。
另外，若准备优先获得单链双抗体型sc(Fv)2，例如只要抑制VH1和VL1和/或VH2和VL2之间的缔合即可(例如，导入突变使VH1和VL1之间形成界面的氨基酸残基带有同种电荷)。
当sc(Fv)2为单特异性抗体(monospecific antibody)时，也可以同样实施本发明。
除上述技术外，还可以通过二硫键使VH和VL的各结构域交联(Clin Cancer Res.1996 Fed：2(2)：245-52)。
通过采用本发明的缔合调节方法，例如可以有效地作成具有活性的抗体或多肽。上述活性例如有：结合活性、中和活性、细胞毒活性、激动剂活性、拮抗剂活性、酶活性等。激动剂活性是指通过抗体与受体等抗原结合，向细胞内传递信号等，诱导某种生理活性的变化的活性。生理活性例如有：增殖活性、存活活性、分化活性、转录活性、膜转运活性、结合活性、蛋白酶解活性、磷酸化/脱磷酸化活性、氧化还原活性、转移活性、溶核活性、脱水活性、诱导细胞死亡的活性、诱导细胞凋亡的活性等，但并不受限于此。
根据本发明的方法，可以有效地作成识别所需抗原或与所需受体结合的抗体或多肽。
对该抗原没有特别限定，可以是任一种抗原。抗原的例子有：受体或其片段、癌抗原、MHC抗原、分化抗原等，但并不特别受限于此。
该受体的例子有：属于造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶型受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G-蛋白偶联型受体家族、GPI锚定型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、黏着因子家族、激素受体家族等受体家族的受体等。有关属于上述受体家族的受体及其特征，已有多篇文献报道，例如有：Cooke BA.，King RJB.，van der Molen HJ.编，New ComprehesiveBiochemistry第18B卷“Hormones and their Actions Part II(激素及其作用第II部分)”第1-46页(1988)Elsevier Science Publishers BV.，NewYork，USA；Patthy L.(1990)Cell，61：13-14.；Ullrich A.等(1990)Cell，61：203-212.；Massagul J.(1992)Cell，69：1067-1070.；Miyajima A.等，(1992)Annu.Rev.Immunol.，10：295-331.；Taga T.和Kish imoto T.(1992)FASEB J.，7：3387-3396.；Fantl W1.等，(1993)Annu.Rev.Biochem.，62：453-481.；Smith CA.等，(1994)Cell，76：959-962.；Flower DR.(1999)Biochim.Biophys.Acta，1422：207-234.；阪昌之修，细胞工程增刊小册子系列“黏着因子小册子”(1994)(秀润社，东京，日本)等。属于上述受体家族的具体受体例如有：人或小鼠红细胞生成素(EPO)受体、人或小鼠粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)受体、人或小鼠血小板生成素(TPO)受体、人或小鼠胰岛素受体、人或小鼠Flt-3配体受体、人或小鼠血小板源性生长因子(PDGF)受体、人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体、人或小鼠瘦蛋白受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白细胞介素(IL)-10受体、人或小鼠***(IGF)-I受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等(hEPOR：Simon，S.等(1990)Blood 76，31-35.；mEPOR：D’Andrea，AD.等(1989)Cell 57，277-285.；hG-CSFR：Fukunaga，R.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87，8702-8706.；mG-CSFR：Fukunaga，R.等(1990)Cell 61，341-350.；hTPOR：Vigon，I.等(1992)89，5640-5644.；mTPOR：Skoda.RC.等(1993)12，2645-2653.；hInsR：Ullrich，A.等(1985)Nature 313，756-761.；hFlt-3：Small，D.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91，459-463.：hPDGFR：Gronwald，RGK.等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85，3435-3439.；hIFNα/βR：Uze，G.等(1990)Cell 60，225-234.和Novick，D.等(1994)Cell 77，391-400.)。
癌抗原是随着细胞的恶化而表达的抗原，又被称作肿瘤特异性抗原。另外，细胞癌变时细胞表面或蛋白质分子上出现的异常糖链也成为癌抗原，特别被称作癌糖链抗原。癌抗原的例子例如有：CA19-9、CA15-3、シリァルSSEA-1(SLX)等。
MHC抗原大致区分为：MHC类别I抗原和MHC类别II抗原，MHC类别I抗原包括：HLA-A，-B，-C，-E，-F，-G，-H；MHC类别II抗原包括：HLA-DR，-DQ，-DP。
分化抗原包括：CD1，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD13，CD14，CD15s，CD16，CD18，CD19，CD20，CD21，CD23，CD25，CD28，CD29，CD30，CD32，CD33，CD34，CD35，CD38，CD40，CD41a，CD41b，CD42a，CD42b，CD43，CD44，CD45，CD45RO，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD51，CD54，CD55，CD56，CD57，CD58，CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD64，CD69，CD71，CD73，CD95，CD102，CD106，CD122，CD126，CDw130等。
本发明还提供通过本发明的方法调节缔合的多肽突变体或异源多聚体。即，本发明涉及通过本发明的缔合调节方法获得的多肽或异源多聚体。
本发明的优选方案提供一种多肽突变体，其具有在原始多肽内形成界面的氨基酸残基的修饰以抑制上述多肽内的缔合。
本发明的另一方案提供一种异源多聚体，其具有在原始多肽间形成界面的氨基酸残基的修饰以抑制上述多肽间的缔合。
本发明中，“原始多肽”是指通过本发明的方法进行修饰以调节缔合之前的多肽。
本发明的上述多肽突变体的一个例子例如是一种突变体，该突变体中原始多肽能够形成两种构象异构体。上述异源多聚体的一个例子例如是一种多聚体，该多聚体中原始多肽能够形成多种多聚体。
本发明还包括：通过本发明的上述缔合调节方法使缔合得到调节的多肽突变体或异源多聚体。即，在上述缔合调节方法的优选方案中，缔合得到调节的多肽或异源多聚体也是本发明的优选方案之一。
本发明还提供一种多肽或多源多聚体的制备方法，该方法中多肽或多源多聚体的缔合得到调节。
本发明的制备方法的优选方案提供一种多肽突变体的制备方法，上述多肽突变体中形成多肽内界面的氨基酸残基中存在突变以调节多肽的缔合，该制备方法包括：(a)自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制多肽内的缔合，上述氨基酸残基为多肽内形成界面的氨基酸残基；(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；(c)自宿主细胞培养物中回收该多肽。
本发明的制备方法的另一方案提供一种异源多聚体的制备方法，上述异源多聚体中形成多肽间界面的氨基酸残基中存在突变以调节异源多聚体的缔合，该制备方法包括：(a)自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制多肽间的缔合，上述氨基酸残基为多肽间形成界面的氨基酸残基；(b)培养宿主细胞，使其表达该核酸；(c)自宿主细胞培养物中回收该异源多聚体。
下述方法也是本发明的上述制备方法的优选方案之一，该方法包括以下步骤：利用本发明的上述缔合调节方法，自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸，以调节多肽的缔合，上述氨基酸残基为多肽内(间)形成界面的氨基酸残基。
本发明的上述方法中，“修饰核酸”是指修饰核酸以使之对应通过本发明的“修饰”而导入的氨基酸残基。更具体而言，是指将编码原始(修饰前)氨基酸残基的核酸修饰成编码通过修饰而导入的氨基酸残基的核酸。通常是指对原始核酸进行***、缺失或取代至少一个核苷酸等基因操作或突变处理，以形成编码目标氨基酸残基的密码子。即，编码原始氨基酸残基的密码子被编码通过修饰而导入的氨基酸残基的密码子取代。上述核酸的修饰，可由本领域技术人员使用公知技术例如位点特异性诱变法、PCR诱变法等适当实施。
另外，通常将本发明的核酸负载(***)到适当的载体上，并导入到宿主细胞中。对该载体没有特别限定，只要稳定保持***的核酸即可，例如使用大肠杆菌作为宿主时，克隆用载体优选pBluescript载体(Stratagene公司制)等，但也可以使用各种市售载体。当为了生产本发明的多肽而使用载体时，表达载体特别实用。对表达载体没有特别限定，只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体即可，例如，在试管内表达多肽时，优选pBEST载体(Promega公司制)；在大肠杆菌内表达多肽时，优选pET载体(Invitrogen公司制)；在培养细胞内表达多肽时，优选pME18S-FL3载体(GenBankAccession No.AB009864)；在生物个体内表达多肽时，优选pME18S载体(Mol Cell Biol.8：466-472(1988))等。向载体中***本发明的DNA，可以利用常规方法例如使用限制酶位点进行的连接酶反应来进行(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)出版.John Wiley&Sons.Section 11.4-11.11)。
对上述宿主细胞没有特别限定，根据目的可以使用各种宿主细胞。作为用于表达多肽的细胞，例如有：细菌细胞(例如：链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、枯草杆菌(Bacillus subtilis))；真菌细胞(例如：酵母(Yeat)、曲霉(Aspergillus))；昆虫细胞(例如：果蝇S2(DrosophilaS2)、草地夜蛾SF9(Spodoptera SF9))；动物细胞(例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤细胞)和植物细胞。向宿主细胞中导入载体，例如可以通过磷酸钙沉淀法、电穿孔法(Currentprotocols in Molecular Biology edit.Ausubel等.(1987)出版.John Wiley&Sons.Section 9.1-9.9)、脂质转染胺(lipofectamine)法(GIBCO-BRL公司制)、显微注射法等公知方法来进行。
可以向目标多肽中***适当的分泌信号，以使宿主细胞中表达的多肽分泌到内质网的内腔、周质间隙或胞外环境中。相对于目标多肽而言，上述信号可以是内源性信号，也可以是异源信号。
上述制备方法中多肽的回收，若本发明的多肽分泌到培养基中，则回收培养基。若本发明的多肽在细胞内产生，则首先溶解该细胞，之后再回收多肽。
自重组细胞培养物中回收并纯化本发明的多肽时，可以使用以下公知方法：硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲合层析、羟基磷灰石层析和凝聚素层析。
本发明还涉及一种组合物(药物)，该组合物包括：本发明的多肽突变体或本发明的异源多聚体和医药上可接受的载体。
本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防或者检查、诊断的药物。
本发明的药物组合物，可以按照本领域技术人员所公知的方法制成制剂。例如，可以制成和水或水以外的药学上可接受的液体的无菌溶液或悬浮液，以注射剂形式进行非胃肠道给药。例如，可以考虑和药理学上可接受的载体或介质，具体而言，和灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、结合剂等适当组合，以满足制药实施要求的单位用量形态进行混合以制成制剂。上述制剂中的有效成分量设定为得到预定范围的适当容量。
用于注射的无菌组合物，可以使用注射用蒸馏水等媒介物，按照通常的制剂流程进行配制。
注射用水溶液例如有：生理盐水和等渗溶液，该等渗溶液中包括葡萄糖或其他辅药(例如，D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)。可以并用适当的助溶剂，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(吐温80(TM)、HCO-50等)。
油性液体有：芝麻油、大豆油，可以并用苯甲酸苄酯和/或苄醇作为助溶剂。还可以和缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、缓和剂(例如，盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，苄醇和苯酚)、抗氧化剂混合。制备的注射液通常填充到适当的安瓿中。
本发明的药物组合物，优选通过非胃肠道给药。例如，可以制成注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药型的组合物。例如，可以通过静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部给药。
给药方法可以根据患者的年龄、症状而适当选择。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物，其给药量例如可以设定为：每次每kg体重0.0001mg～1000mg的范围。或者，给药量可以是例如每位患者0.001～100000mg，但本发明未必限于上述数值。给药量和给药方法根据患者的体重、年龄、症状等而变化，本领域技术人员可以考虑上述条件，设定适当的给药量和给药方法。
还可以根据需要，将本发明的多肽或异源多聚体和其他药物成分组合制成制剂。
本发明还提供一种核酸，该核酸编码本发明的多肽突变体或本发明的异源多聚体。而且，负载该核酸的载体也包括在本发明内。
本发明还提供具有上述核酸的宿主细胞。对该宿主细胞没有特别限定，例如有大肠杆菌和各种动物细胞等。宿主细胞可以用作例如用于制备和表达本发明的抗体或多肽的产生***。用于制备多肽的产生***包括：体外(in vitro)和体内(in vivo)产生***。体外产生***例如有：使用真核细胞进行的产生***和使用原核细胞进行的产生***。
可用作宿主细胞的真核细胞例如有：动物细胞、植物细胞、真菌细胞。动物细胞包括：哺乳动物细胞例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108：945)、COS、3T3、骨髓瘤细胞、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等；两栖动物细胞例如非洲爪蟾***(Xenopus laevisoocytes)(Valle等，Nature(1981)291：338-340)；以及昆虫细胞例如Sf9、Sf21、Tn5。本发明的抗体表达中适合使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7细胞、BHK细胞。动物细胞中，以大量表达为目的时，特别优选CHO细胞。关于向宿主细胞内导入载体，例如可以通过以下方法来进行：磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、使用阳离子脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim制)的方法、电穿孔法、脂质转染法等。
植物细胞例如有来源于烟草的细胞，其作为蛋白质产生***而众所周知，利用愈伤组织培养该细胞的方法可以产生本发明的抗体。使用真菌细胞的蛋白质表达***是公知的，这些真菌细胞可以用作产生本发明抗体的宿主，上述真菌细胞例如有：酵母例如酵母菌(Saccharomyces)属的细胞(啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharmyces pombe)等)；以及丝状菌，例如曲霉属(Aspergillus)的细胞(黑曲霉(Aspergillus niger)等)。
用于产生***的原核细胞可以使用细菌细胞。已知细菌细胞除了上述大肠杆菌(E.coli)以外，还有枯草杆菌，这些细菌细胞可以用于产生本发明的抗体。
使用本发明的宿主细胞来产生抗体时，可以通过培养经表达载体转化的宿主细胞来表达多核苷酸，上述表达载体含有编码本发明抗体的多核苷酸。可以按照公知方法进行培养。例如，以动物细胞作为宿主时，可以使用例如DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM作为培养液。此时，可以并用FBS、胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可以通过无血清培养来培养细胞。培养时的pH优选为约6～8。通常是在约30～40℃下培养约15～200小时，根据需要可以交换培养基或进行通气、搅拌。
另一方面，作为在体内产生多肽的***例如有：使用动物的产生***或使用植物的产生***。向这些动物或植物中导入目标多核苷酸，使在动物或植物体内产生多肽并回收。本发明的“宿主”包括这上述动物和植物。
用于产生***的动物包括哺乳动物和昆虫。哺乳动物可以使用：山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM BiotechnologyApplications(1993))。另外，哺乳动物可以是转基因动物。
例如，制备编码本发明抗体的多核苷酸，将其作为和山羊β-酪素等乳汁中固有产生的编码多肽的基因的融合基因。然后，将包括该融合基因的多核苷酸片段注入到山羊胚胎中，将该胚胎移植到雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以得到目标抗体。为了使转基因山羊产生的含有抗体的乳汁量增加，可以给予上述转基因山羊适当的激素(Ebert等，Bio/Technology(1994)12：699-702)。
产生本发明抗体的昆虫例如可以使用蚕。使用蚕时，通过使蚕感染***有编码目标抗体的多核苷酸的杆状病毒，可以从该蚕的体液中得到目标抗体(Susumu等，Nature(1985)315：592-4)。
用于产生本发明抗体的植物可以使用烟草(tabacoo)。使用烟草时，将编码目标抗体的多核苷酸***到植物表达用载体例如pMON530中，将该载体导入到根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等细菌中。用该细菌感染烟草例如烟草(Nicotiana tabacum)，可以从该烟草的叶中得到所需抗体(Ma等，Eur.J.Immunol.(1994)24：131-8)。
如此操作而得到的抗体，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)分离，并纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以使用通常多肽的纯化中所使用的分离、纯化方法，但没有任何限制。例如，可以选择适当组合层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来分离、纯化抗体。
层析例如有：亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization(蛋白质纯化与鉴定实验指南)：A Laboratory CourseManual.Ed Daniel R.Marshark等(1996)Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。上述层析可以使用液相层析例如HPLC、FPLC等来进行。亲合层析柱有：蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有：Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia制)等。
根据需要，可以在纯化抗体之前或之后，使适当的蛋白修饰酶和抗体作用，以任意地进行修饰或部分性地去除肽。蛋白修饰酶例如使用：胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
本发明的又一优选方案为本发明的多肽突变体或异源多聚体的制备方法，该方法包括以下步骤：按上述方式培养本发明的宿主细胞，并自该细胞培养物中回收多肽。
应说明的是，本说明书中引用的所有先行技术文献，均作为参照而纳入本说明书。
实施例
以下，通过实施例来具体说明本发明，但本发明并不受限于这些实施例。
[实施例1]抗因子IXa(F.IXa)非中和抗体的制作
1-1.免疫和杂交瘤的制作
使用因子IXaβ(Enzyme Research Laboratories，Inc.)，按以下方式对8只BALB/c小鼠(雄性，免疫开始时6周龄，日本Charles River)和5只MRL/lpr小鼠(雄性，免疫开始时6周龄，日本Charles River)进行免疫。将用FCA(弗式完全佐剂H37 Ra(Difco laboratories))乳化的因子IXaβ按40μg/只进行皮下给药作为初次免疫。两周后，将用FIA(弗式不完全佐剂(Difco laboratories))乳化的因子IXaβ按40μg/只进行皮下给药。以后，每隔一周进行加强免疫总计3～7次。用1-2所示的ELISA(酶联免疫吸附测定)确认抗因子IXaβ的血清抗体效价上升后，将用PBS(-)(不含钙离子、镁离子的磷酸缓冲盐溶液)稀释的因子IXa β按40μg/只进行静脉内给药作为最终免疫。最终免疫3天后，按照使用PEG1500(Roche Diagnostics)的常规方法，将小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8U.1(称作P3U1，ATCC CRL-1597)融合。将悬浮在含10％FBS(Invitrogen)的RPMI1640培养基(Invitrogen)(以下称作10％FBS/RPMI1640)中的融合细胞播种到96孔培养板中，融合1、2、3、5天后，将培养基替换成HAT选择培养基(10％FBS/RPMI1640/2％HAT50x concentrate(大日本制药)/5％BM-Condimed H1(RocheDiagnostics))，进行杂交瘤的选择培养。使用融合后第8天或第9天采集的培养上清液，利用1-2所示的ELISA测定对因子IXa的结合活性，由此选择具有因子IXa结合活性的杂交瘤。接下来，用5-3所示的方法测定因子IXa的酶活性的中和活性，选择对因子IXa不具有中和活性的杂交瘤。向96孔培养板中每孔播种一个细胞，进行此有限稀释两次，来克隆杂交瘤，建立产生抗因子IXa抗体的杂交瘤XB12。
1-2.因子IXa ELISA
将用包被缓冲液(100mM碳酸氢钠，pH9.6，0.02％叠氮化钠)稀释至1μg/mL的因子IXaβ按100μL/孔分注到Nunc-Immuno板(Nunc-ImmunoTM 96MicroWellTM plates MaxiSorpTM(Nalge Nunc International))中，之后在4℃下培育过夜。用含有Tween(R)20的PBS(-)洗涤3次后，室温下将板用稀释缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.1，1％牛血清白蛋白，1mM MgCl2，0.15M NaCl，0.05％Tween(R)20，0.02％叠氮化钠)封闭2小时。除去缓冲液后，按100μL/孔向板中添加经稀释缓冲液稀释的小鼠抗血清或杂交瘤培养上清液，室温下培育1小时。将板洗涤3次后，按100μL/孔添加用稀释缓冲液1/2000稀释的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(Zymed Laboratories)，室温下培育1小时。将板洗涤6次后，按100μL/孔添加显色底物Blue-PhosTM磷酸底物(Kirkegaad&Perry Laboratories)，室温下培育20分钟。按100μL/孔添加Blue-PhosTM终止液(Kirkegaad&Perry Laboratories)，之后用3550型酶标仪(Microplate Reader Model 3550)(Bio-Rad Laboratories)测定595nm的吸光度。
1-3.因子IXa中和活性测定
用注射用蒸馏水溶解磷脂(Sigma-Aldrich)，并进行超声波处理，制备400μg/mL的磷脂溶液。在96孔板中将40μL含0.1％牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷缓冲生理食盐液(以下记作TBSB)、10μL(30ng/mL)的因子IXaβ(Enzyme Research Laboratories)、5μL(400μg/mL)的磷脂溶液、5μL含100mM CaCl2、20mM MgCl2的TBSB和10μL杂交瘤培养上清液混合，室温下培育1小时。向该混合溶液中加入20μL(50μg/mL)的因子X(Enzyme Research Laboratories)和10μL(3U/mL)的因子VIIIa(Amrican diagnostica)，在室温下反应30分钟。向其中添加10μL(0.5M)的EDTA使反应停止。向该反应溶液中添加50μL的S-2222溶液(Chromogenix)，室温下培育30分钟，之后用3550型酶标仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)测定检测波长405nm、对照波长655nm的吸光度。
[实施例2]抗因子X(F.X)非中和抗体的制作
2-1.免疫和杂交瘤制作
使用因子X(Enzyme Research Laboratories)，按以下方式对8只BALB/c小鼠(雄性，免疫开始时6周龄，日本Charles River)和5只MRL/lpr小鼠(雄性，免疫开始时6周龄，日本Charles River)进行免疫。将用FCA乳化的因子X按40μg/只进行皮下给药作为初次免疫。两周后，将用FIA乳化的因子X按20或40μg/只进行皮下给药。以后每隔一周进行加强免疫总计3～6次。用2-2所示的ELISA确认抗因子X血清抗体效价上升后，将经PBS(-)稀释的因子X按20或40μg/只进行静脉内给药作为最终免疫。最终免疫3天后，按照使用PEG1500的常规方法融合小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞P3U1。将悬浮在10％FBS/RPMI1640培养基中的融合细胞播种到96孔培养板中，融合1、2、3、5天后，将培养基替换成HAT选择培养基，进行杂交瘤的选择培养。使用融合后第8天采集的培养上清液，通过2-2所示的ELISA测定对因子X的结合活性。选择具有因子X结合活性的杂交瘤，用2-3所示方法测定因子Xa的酶活性的中和活性。通过进行2次有限稀释来克隆对因子Xa不具有中和活性的杂交瘤，建立产生抗因子X抗体的杂交瘤SB04。
2-2.因子X ELISA
将用包被缓冲液稀释至1μg/mL的因子X按100μl/孔分注到Nunc-Immuno板中，之后在4℃下培育过夜。将板用含Tween(R)20的PBS(-)洗涤3次后，室温下用稀释缓冲液封闭2小时。除去缓冲液后，向板中添加用稀释缓冲液稀释的小鼠抗血清或杂交瘤培养上清液，室温下培育1小时。将板洗涤3次后，添加用稀释缓冲液1/2000稀释的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，室温下培育1小时。将板洗涤6次后，按100μL/孔添加显色底物Blue-PhosTM磷酸底物(Kirkegaad&PerryLaboratories)，室温下培育20分钟。按100μL/孔添加Blue-PhosTM终止液(Kirkegaad&Perry Laboratories)后，用3550型酶标仪(Bio-RadLaboratories)测定595nm的吸光度。
2-3.因子Xa中和活性测定
将10μL用TBSB1/5稀释的杂交瘤培养上清液和40μLTBCP(含2.78mM CaCl2、22.2μM磷脂(磷脂酰胆碱∶磷脂酰丝氨酸＝75∶25，Sigma-Aldrich)的TBSB)混合，室温下培育1小时，上述TBCP含250pg/mL因子Xa(Enzyme Research Laboratories)。向该混合溶液中添加50μL TBCP，室温下反应10分钟，上述TBCP含20μg/mL的凝血酶原(Enzyme Research Laboratories)和100ng/mL的活化凝血因子V(因子Va(Haematologic Technologies))。添加10μL(0.5M)的EDTA使反应停止。向该反应溶液中添加50μL(1mM)的S-2238溶液(Chromogenix)，室温下培育30分钟，之后用3550型酶标仪(Bio-RadLaboratories)测定405nm的吸光度。
[实施例3]嵌合双特异性抗体表达载体的构建
3-1.制备来源于杂交瘤的编码抗体可变区的DNA片段
使用QIAGEN(R)RNeasy(R)微型试剂盒(QIAGEN)，按照说明书记载的方法，从产生抗F.IXa抗体的杂交瘤XB12或产生抗F.X抗体的杂交瘤SB04中提取总RNA。将总RNA溶解在40μL灭菌水中。以1～2μg纯化的RNA为模板，使用SuperScript cDNA合成***(Invitrogen)，按照说明书记载的方法，通过RT-PCR法合成单链cDNA。
3-2.通过PCR扩增抗体H链可变区和序列分析
准备Krebber等人的报告(J.Immunol.Methods 1997；201：35-55)中记载的HB引物混合物和HF引物混合物，作为小鼠抗体H链可变区(VH)cDNA的扩增用引物。使用0.5μL(100μM)的HB引物混合物和0.5μL(100μM)的HF引物混合物，制备25μL反应液(2.5μl 3-1制备的cDNA溶液、KOD plus缓冲液(东洋纺织)、0.2mM dNTPs、1.5mMMgCl2、0.75units DNA聚合酶KOD plus(东洋纺织))。PCR如下进行：使用热循环仪GeneAmp PCR***9700(Parkin Elmer)，根据cDNA片段的扩增效率，在条件A(98℃下加热3分钟后；98℃20秒、58℃20秒、72℃30秒的反应为1次循环，循环32次)或条件B(94℃下加热3分钟后；94℃20秒、46℃20秒、68℃30秒的反应为1次循环，循环5次；再94℃20秒、58℃20秒、72℃30秒的反应为1次循环，循环30次)任一种条件下进行。PCR之后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法，纯化目标尺寸(约400bp)的扩增片段，并用30μL灭菌水洗脱。各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(BigDye Terminator CycleSequencing Kit)(Applied Biosystems)，利用DNA测序仪ABI PRISM3100遗传分析仪(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法来确定。通过本方法确定的序列组，用分析软件GENETYX-SV/RC 6.1版(Genetyx)进行比较分析，选择具有不同序列的DNA片段。
3-3.用于克隆的抗体可变区DNA片段的制备
为了向抗体可变区扩增片段的两末端添加用于克隆的限制酶Sfi I切割位点，进行以下操作。
为了扩增添加有Sfi I切割位点的VH片段(Sfi I-VH)，准备一种引物(引物VH-5’末端)，该引物是引物HB的(Gly4Ser)2-接头序列变更为具有Sfi I切割位点的序列。使用0.5μL(10μM)的序列特异性引物VH-5’末端和0.5μL(10μM)的引物scfor(J.Immunol.Mthods 1997；201：35-55)，制备20μL反应液(1μl 3-2制备的纯化VH cDNA扩增片段溶液、KOD plus缓冲液(东洋纺织)、0.2mM dNTPs、1.5mM MgCl2、0.5单位DNA聚合酶KOD plus(东洋纺织))。PCR如下进行：使用热循环仪GeneAmp PCR***9700(Parkin Elmer)，根据片段的扩增效率，在条件A(98℃下加热3分钟后；98℃20秒、58℃20秒、72℃30秒的反应为1次循环，循环32次)或条件B(94℃下加热3分钟后；94℃20秒、46℃20秒、68℃30秒的反应为1次循环，循环5次；再94℃20秒、58℃20秒、72℃30秒的反应为1次循环，循环30次)任一种条件下进行。PCR之后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法，纯化目标尺寸(约400bp)的扩增片段，用30μL灭菌水洗脱。
为了扩增小鼠抗体L链可变区(VL)cDNA片段，首先，使用Krebber等人的报告(J.Immunol.Mthods 1997；201：35-55)中记载的0.5μL(100μM)的LB引物混合物和0.5μL(100μM)的LF引物混合物，制备25μL反应液(2.5μl 3-1制备的cDNA溶液、KOD plus缓冲液(东洋纺织)、0.2mM dNTPs、1.5mM MgCl2、0.75单位DNA聚合酶KOD plus(东洋纺织))。PCR如下进行：使用热循环仪GeneAmp PCR***9700(ParkinElmer)，根据片段的扩增效率，在94℃下加热3分钟后；94℃20秒、46℃20秒、68℃30秒的反应为1次循环，循环5次；再94℃20秒、58℃20秒、72℃30秒的反应为1次循环，循环30次。PCR之后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法，纯化目标尺寸(约400bp)的扩增片段，并用30μL灭菌水洗脱。该片段的状态为：在其C末端添加有来源于引物LF的(Gly4Ser)3-接头序列。为了向该片段C末端附加Sfi I切割位点，准备一种引物(引物VL-3’末端)，该引物是引物LF的(Gly4Ser)3-接头序列变更为具有Sfi I切割位点的序列。为了扩增添加有Sfi I切割位点的VL片段(Sfi I-VL)，使用0.5μL(10μM)的VL-3’末端引物混合物和0.5μL(10μM)的scback引物，制备20μL反应液(1μl纯化VL cDNA扩增片段溶液、KOD plus缓冲液(东洋纺织)、0.2mMdNTPs、1.5mM MgCl2、0.5单位DNA聚合酶KOD plus(东洋纺织))。PCR如下进行：使用热循环仪GeneAmp PCR***9700(Parkin Elmer)，在94℃下加热3分钟后；94℃20秒、46℃20秒、68℃30秒的反应为1次循环，循环5次；再94℃20秒、58℃20秒、72℃30秒的反应为1次循环，循环30次。PCR之后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法，纯化目标尺寸(约400bp)的扩增片段，并用30μL灭菌水洗脱。
按照附录说明书记载的方法制备反应液，在该反应液中50℃下用Sfi I(Takara Bio)消化纯化的Sfi I-VH和Sfi I-VH片段一夜。之后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法纯化上述反应液，并用上述试剂盒中所含的30μLEB缓冲液洗脱。
3-4.用于表达人IgG4-小鼠嵌合双特异性IgG抗体的质粒
为了在产生目标双特异性IgG抗体时，在各H链中形成异源分子，参考IgG1的knobs-into-holes技术(非专利文献3)，制作IgG4的CH3部分被取代的氨基酸取代体。型a(IgG4γa)为Y349C、T366W取代体，型b(IgG4γb)为E356C、T366S、L368A、Y407V取代体。而且，还向两取代体的铰链区导入取代(-ppcpScp--＞-ppcpPcp)。利用本技术几乎全部能够形成异源体，但L链未必如此，不必要的抗体分子的生成可能会影响此后的活性测定。因此，在本方案中，为了分别表达具有各种特异性的抗体分子单臂(称作HL分子)，并在细胞内有效地制备目标型双特异性IgG抗体，使用以不同药物诱导的载体作为对应各HL分子的表达载体。
作为抗体分子单臂(one arm)(***滑。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法纯化该平滑的末端片段，并用Not I(Takara Bio)消化。使用Ligation High(东洋纺织)，按照附录说明书记载的方法，对pcDNA4进行连接反应，上述pcDNA4经该Not I-blunt片段(分别约1.6kb或1.0kb)和该Eco RV-Not I消化。利用该反应液对大肠杆菌DH5α株(Competent high DH5α(东洋纺织))进行转化。使用QIAprep SpinMiniprep试剂盒(QIAGEN)，自所得氨苄青霉素抗性克隆中分离各质粒DNA。
对于另一单臂(习惯上称作左臂HL分子)，按照上述方法制作各H链或L链区(pIND-g4H或pIND-g4L)，将该区***到蜕皮素类似体诱导型载体pIND(Invitrogen)中，即将适当的小鼠抗体可变区(VH或VL)和人IgG4γb恒定区(SEQ ID NO：11)或κ恒定区***到动物细胞用信号序列(IL3ss)(EMBO.J.1987；6：2939)的下游，并分离各质粒DNA。
3-5.构建双特异性抗体表达载体
用Sfi I消化3-4制备的四环素诱导型表达质粒(pcDNA4-g4H或pcDNA4-g4L)，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。将去除了原始抗体可变区部分(VH或VL)的片段(约5kb)，用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)按照附录说明书记载的方法进行纯化，并用30μL灭菌水洗脱。使用快速连接试剂盒(Quick Ligation Kit)(New Egland Biolabs)，按照附录说明书记载的方法，使上述片段和各自对应的3-3制备的SfiI-VH或Sfi I-VL片段进行连接反应，上述Sfi I-VH或Sfi I-VL片段来源于Sfi I消化抗F.IXa抗体XB 12。用该反应液对大肠杆菌DH5α株(Competent high DH5α(东洋纺织))进行转化。按照与上述相同的方法，从3-4制备的Sfi I消化蜕皮素类似物诱导型表达质粒(pIND-g4H或pIND-g4L)中除去抗体可变区部分(VH或VL)，将所得片段和各自对应的3-3制备的Sfi I-VH或Sfi I-VL片段按照相同方法进行合并，上述SfiI-VH或Sfi I-VL片段来源于Sfi I消化抗F.X抗体SB04。
各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，利用DNA测序仪ABI PRISM 3100遗传分析仪(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法来确定。使用分析软件GENETYX-SV/RC 6.1版(Genetyx)，对通过本方法确定的序列组进行分析。
使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)，从该目标克隆中分离各质粒DNA，并将其溶解在100μL灭菌水中。将抗F.IXa抗体嵌合H链表达载体、抗F.IXa抗体嵌合L链表达载体、抗F.X抗体嵌合H链表达载体以及抗F.X抗体嵌合L链表达载体分别命名为：pcDNA4-g4XB12H、pcDNA4-g4XB12L、pIND-g4SB04H以及pIND-g4SB04L。
[实施例4]嵌合双特异性抗体的制备
4-1.DNA溶液的制备
用四环素对抗体右臂HL分子的表达载体(pcDNA4-g4XB12H以及pcDNA4-g4XB12L)进行表达诱导。当不存在四环素的条件下，为了完全抑制表达，需要编码四环素抑制子(Tet-repressor)的质粒pcDNA6/TR(Invitrogen)。对抗体左臂HL分子的表达载体(pIND-g4SB04H以及pIND-g4 SB04L)，用昆虫激素-蜕皮素类似物(松甾酮A)进行表达诱导。此时，需要编码蜕皮素受体和类视色素X受体的质粒pVgRXR(Invitrogen)，上述两种受体和松甾酮A反应进行诱导。因此，为了转染动物细胞，共制备6种质粒DNA混合液。制备10mL细胞培养液，使用了各3μg的pcDNA4-g4 XB12H、pcDNA4-g4 XB12L、pIND-g4 SB04H以及pIND-g4 SB04L和各18μg的pcDNA6/TR以及pVgRXR。
4-2.动物细胞的转染
将来源于人胎儿肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮在含10％FCS(MOREGATE)的DMEM培养基(Invitrogen)中，并以5×105个/mL的细胞密度向黏着细胞用皿(直径10cm，CORNING)的各皿中分别播种10mL，在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养一昼夜。将4-1制备的质粒DNA混合液加入到以下混合液中，所述混合液含有：转染试剂、75.8μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)和2708μL Opti-MEM I培养基(Invitrogen)，之后在室温下静置20分钟，再将所得混合液加入到各孔的细胞，在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养4～5小时。
4-3.双特异性IgG抗体的表达诱导
自按前项方式转染的细胞培养液中吸除培养基，并加入10mL含1μg/mL四环素(和光纯药工业)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基，在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养1天，进行抗体右臂HL分子的第一次表达诱导。之后，吸除培养基，一旦用10mL CHO-S-SFM-II培养基洗涤后，加入10mL含5μM松甾酮A(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II培养基，在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养3天，进行抗体左臂HL分子的第二次表达诱导，向培养基中分泌双特异性IgG抗体。回收培养上清液后，离心(约2000g，5分钟，室温)除去细胞，再通过0.22μm滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)进行灭菌。该样品在使用之前一直在4℃下保存。
4-4.抗体纯化
向通过实施例4-3的方法得到的10mL培养上清液中添加100μL的rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，4℃下翻倒混合4小时以上。将该溶液转移到0.22μm过滤杯Ultrafree(R)-MC(Millipore)中，用500μL含0.01％Tween(R)20的TBS洗涤3次后，将rProtein A SepharoseTM树脂悬浮在100μL含0.01％Tween(R)20的10mMHCl(pH2.0)中，静置2分钟后，使抗体溶出。立即加入5μL的1MTris-HCl(pH8.0)进行中和。
4-5.人IgG浓度的定量
将山羊抗人IgG(Biosource International)用包被缓冲液调整至1μg/mL，并固定在Nunc-Immuno板(Nunc)上。用稀释缓冲液(D.B.)封闭处理后，添加用D.B.适当稀释的培养上清液样品。另外，同样添加人IgG4(人源化抗TF抗体，参照WO99/51743)，作为用于计算抗体浓度的标准，上述人IgG4用D.B.从2000ng/mL起按3倍递次稀释法稀释11阶段。洗涤3次后，使山羊抗人IgG和碱性磷酸酶(BiosourceInternational)反应。洗涤5次后，以Sigma 104(R)磷酸酶底物(Sigma-Aldrich)为底物进行显色，使用吸光度读数器3550型(Bio-RadLaboratories)，以655nm为参照波长，测定405nm的吸光度。使用Microplate Manger III(Bio-Rad Laboratories)软件，由标准曲线算出培养上清液中的人IgG浓度。
[实施例5]血浆凝固分析
为了明确双特异性抗体是否能够校正血友病A血液的凝固能力，使用因子VIII缺乏血浆，研究上述双特异性抗体对活化部分的凝血致活酶时间(APTT)的影响。将50μL各种浓度的抗体溶液、50μL因子VIII缺乏血浆(Biomerieux)和50μL APTT试剂(Dade Behring)的混合液在37℃下加热3分钟。向上述混合液中加入50μL 20mM的CaCl2(DadeBehring)来引发凝血反应。使用连接有CR-A(Amelung)的KC10A(Amelung)测定凝固所需的时间。
以因子VIII缺乏血浆的凝固时间为0％、以正常血浆的凝固时间为100％，制作标准曲线，由添加双特异性抗体时的凝固时间算出双特异性抗体的因子VIII样活性(％)。
[实施例6]双特异性抗体的人源化
如下所述，对凝血时间的缩短效果最强的抗因子IXa抗体XB12和抗因子X抗体SB04实施人源化。
6-1.人抗体的同源性检索
从一般公开的Kabat数据库(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/)获取人抗体氨基酸序列数据，使用构建的数据库，分为小鼠XB12-H链可变区、小鼠XB-12L链可变区、小鼠SB04-H链可变区、小鼠SB04-L链可变区，进行同源性检索。其结果，确认了和以下所示的人抗体序列具有高度同源性，因此决定用于人源化抗体的构架区(以下，记作FR)。
(1)XB12-H链可变区：KABATID-020619(Kabat数据库)(Mariette等，Arthritis Rheum.1993；36：1315-1324)
(2)XB12-L链可变区：EMBL Accession No.X61642(IMGT数据库)(Mark等，J Mol Biol.1991；222：581-597.)
(3)SB04-H链可变区：KABATID-025255(Kabat数据库)(Demaison等，Immunogetetics 1995；42：342-352)
(4)SB04-L链可变区：EMBL Accession No.AB064111(IMGT数据库)(未公开的数据)
制作将各小鼠抗体的互补性抗原决定区(以下，记作CDR)移植到(1)-(4)的人抗体FR中的人源化抗体。
使用NCBI公开的同源性检索网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，检索和(1)-(4)的人抗体具有高度同源性的人抗体的分泌信号序列。使用由检索得到的以下所示的分泌信号序列。
(1)XB12-H链可变区：GenBank Accession No.AF062120
(2)XB12-L链可变区：GenBank Accession No.M74019
(3)SB04-H链可变区：GenBank Accession No.BC019337
(4)SB04-L链可变区：GenBank Accession No.AY2047566-2.人源化抗体基因表达载体的构建
在核苷酸序列中交替制作12条大约50碱基的合成寡DNA，使3’末端约20碱基退火，上述核苷酸序列编码从分泌信号序列到抗体可变区的氨基酸序列。并且，制作在抗体可变区基因的5’末端退火且具有XhoI切割序列的引物和在抗体可变区基因的3’末端退火且具有SfiI切割序列的引物。
将各1μL调整至2.5μM的合成寡DNA混合，加入1x TaKaRa ExTaq缓冲液、0.4mM dNTPs、0.5单位TaKaRa Ex Taq(均为宝酒造)，制备48μL反应液。在94℃保温5分钟后，反应在94℃2分钟、55℃2分钟、72℃2分钟下循环2次，进行各合成寡DNA的装配和伸长反应。然后，添加1μL均为10μM的在抗体基因的5’末端和3’末端退火的引物，反应在94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟下循环35次，然后在72℃下反应5分钟，扩增抗体可变区基因。PCR之后，将全部反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法，纯化目标尺寸(约400bp)的扩增片段，用30μL灭菌水洗脱。使用pGEM-T Easy载体***(Promega)，按照附录说明书记载的方法克隆该片段。各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，利用DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA Seguencer(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法来确定。
将确认为具有正确的人源化抗体可变区基因序列的质粒经EcoRI和SfiI消化后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法，纯化目标尺寸(约400bp)的DNA片段，用30μL灭菌水洗脱。将实施例3-3制备的四环素诱导型表达质粒(pcDNA4-g4H、pcDNA4-g4L)和蜕皮素类似物诱导型表达质粒(pIND-g4H、pIND-g4L)经EcoRI和SfiI消化后，使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法，纯化含有抗体恒定区的片段(约5kp)，用30μL灭菌水洗脱。使用快速DNA连接试剂盒(Rapid DNA Ligation Kit)(Roche Diagnostics)，按照附录说明书记载的方法，使经EcoRI和SfiI消化的人源化XB12抗体基因片段(H链可变区或L链可变区)和经EcoRI和SfiI消化的四环素诱导型表达质粒(pcDNA4-g4H、pcDNA4-g4L)进行连接反应。另外，使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)，按照附录说明书记载的方法，使经EcoRI和SfiI消化的人源化SB04抗体基因片段(H链可变区或L链可变区)和经EcoRI和SfiI消化的蜕皮素类似物诱导型表达质粒(pIND-g4H、pIND-g4L)进行连接反应。使用各反应液的一部分，对大肠杆菌DH5α株(东洋纺织)进行转化。
另外，为了作为非双特异性抗体的普通人源化抗体来表达，如下制作表达载体。将在pCAGGS(Niwa等，1991 Gene，108：193-199.)中***有野生型抗体恒定区的质粒(pCAG-g4H、pCAG-gκ)经XhoI和SfiI消化来制作表达质粒，上述pCAGGS具有鸡β-肌动蛋白启动子，上述表达质粒中***有人源化XB12抗体基因片段(H链可变区或L链可变区)或人源化SB04抗体基因片段(H链可变区或L链可变区)，而上述片段是将上述双特异性抗体表达载体经XhoI和SfiI消化后回收得到的。DNA连接反应则使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)来进行，对大肠杆菌DH5α株(东洋纺织)进行转化。
6-3.人源化双特异性抗体的制备
使用4种人源化双特异性抗体表达载体和pcDNA6/TR、pVgRXR，按照实施例4-2、4-3所示的方法向HEK293H中导入基因并进行表达诱导。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
6-4.人源化抗体的制备
为了表达非双特异性抗体的普通人源化抗体，使用实施例6-3制作的人源化H链抗体表达载体和人源化L链抗体表达载体，按照实施例4-2所示的方法向HEK293H中导入基因。导入基因之后，向其中添加10mL的CHO-S-SFM-II培养基(Invitrogen)，之后再除去该培养基以洗涤细胞，随后再添加10mL的CHO-S-SFM-II，将细胞在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中培养3天，使之分泌人源化抗体。
6-5.人源化双特异性抗体的活性评价和抗体序列的修饰
为了评价所制备的人源化双特异性抗体和嵌合双特异性抗体(XB12/SB04)的血浆凝固能，按照实施例5的方法，使用F.VIII缺乏血浆，研究抗体对APTT的影响。对于降低血液凝固能的人源化双特异性抗体，以提高活性为目标，修饰人抗体FR的氨基酸。另外，还对于可能降低热稳定性等的XB12抗体VH的CDR3的半胱氨酸残基，将其修饰成丙氨酸残基。具体而言，使用QuikChange定点突变试剂盒(QuikChange site-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene)，按照附录说明书记载的方法，向人源化抗体可变区导入突变。通过反复FR序列的氨基酸修饰和血液凝固能的评价，获得具有和XB12/SB04同等活性的人源化双特异性抗体(人源化XB12抗体(VH：hXB12f-A，VL：hXBVL)/人源化SB04抗体(VH：hSB04e，VL：hSBVL-F3f))。各抗体可变区序列如以下SEQ ID NO所示。
(1)人源化XB12抗体VH(hXB12f-A)SEQ ID NO：1(核苷酸序列)、SEQ ID NO：2(氨基酸序列)
(2)人源化XB12抗体VL(hXBVL)SEQ ID NO：3(核苷酸序列)、SEQID NO：4(氨基酸序列)
(3)人源化SB04抗体VH(hSB04e)SEQ ID NO：5(核苷酸序列)、SEQID NO：6(氨基酸序列)
(4)人源化SB04抗体VL(hSBVL-F3f)SEQ ID NO：7(核苷酸序列)、SEQ ID NO：8(氨基酸序列)
[实施例7]人源化抗体的模建
为了确认人源化SB04抗体的VH和VL界面的氨基酸残基，使用MOE软件(Chemical Computing Group Inc.)，通过同源模建来制作抗体Fv区模型。确认在VH和VL的界面，H39和L38的氨基酸皆为谷氨酰胺(Gln)，并通过两残基的侧链形成氢键(图1(A))。另外，确认H45和L44的氨基酸分别为亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)，两残基的侧链非常接近，并且形成疏水核(图1(B))。有报道称，上述两个位点的氨基酸残基在人抗体中高度保存(Vargas-Madrazo E等，J.Mol.Recognit.2003，16：113-120)。有关H39、L38、H45、L44等抗体的编号，参考Kabat等人的文献(Kabat EA等，1991.Sequences of Proteins ofImmunological Interest NIH)。
[实施例8]修饰了H39、L38氨基酸的人源化抗体的制作和评价
8-1.修饰了H39和L38的抗体表达载体的构建
基于实施例7的发现，取代人源化XB12H链的H39的谷氨酰胺和人源化SB04L链的L38的谷氨酰胺，以抑制人源化XB12的H链和人源化SB04的L链的缔合。具体而言，将两氨基酸(H39、L38)取代成侧链荷正电的赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)、或侧链荷负电的谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)，以抑制谷氨酰胺侧链的氢键，而形成静电排斥。人源化抗体基因的取代通过使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)，按照附录说明书记载的方法导入突变来进行。将氨基酸已被取代的各人源化抗体基因片段***到实施例6-2中使用的双特异性抗体表达载体或通常的抗体表达载体中。
8-2.缔合调节评价用抗体的制备和缔合调节评价
为了对H链和L链的缔合调节进行评价，使用制作的人源化XB12H链(H39修饰)、人源化SB04L链(L38修饰)、野生型人源化XB12L链三种抗体表达载体，按照实施例4-2所示的方法向HEK293H中导入基因，使在培养上清液中分泌抗体。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
在样品缓冲液(TEFCO)中对200ng纯化抗体进行还原处理，并将其注入到14％SDS-PAGE微型凝胶(TEFCO)中，进行电泳。电泳之后，在含10％甲醇的7％乙酸溶液中浸渍30分钟进行固定处理，之后在SYPRO(R)Ruby蛋白凝胶染液(BIO-RAD)中浸渍一昼夜进行染色。随后，在含10％甲醇的7％乙酸溶液中浸渍1小时进行脱色处理，使用荧光检测装置FluorImagerSI(Amersham Biosciences)进行图像分析，获得显影图像。使用所得图像，通过Image Quant ver4.2(AmershamBiosciences)算出H链和L链的谱带荧光强度。
结果如图2所示。使用算出的荧光强度强度值，通过“XB12-L链/L链总量(XB12-L链+SB04-L链)×100”算出目标XB12-L链的比率(％)。当人源化XB12H链(H39)和人源化SB04L链(L38)的氨基酸为野生型谷氨酰胺(Gln)时，比率为50％；相对于此，当取代H39和L38时，人源化XB12L链的比率上升；当取代成谷氨酸(Glu)时，确认到比率上升1.6倍达到82％。
8-3.凝固活性评价用的双特异性抗体的制备和凝固活性评价
为了评价凝固活性，使用制作的人源化XB12H链(H39修饰)和人源化SB04L链(L38修饰)双特异性抗体表达载体以及野生型的人源化XB12L链和人源化SB04H链双特异性抗体表达载体、pcDNA6/TR、pVgRXR，按照实施例4-2、4-3所示的方法，向HEK293H中导入基因和进行表达诱导。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
凝固活性的评价按实施例5所示方法进行。结果如图3所示。在缔合调节评价中，确认到：比率上升至82％的谷氨酸(Glu:E)修饰抗体，其和野生型比较，显示出同等以上的凝固活性。
8-4.结合活性评价用抗体的制备
为了对因子IXa和因子X的结合活性进行评价，使用人源化XB12H链(H39修饰)和野生型人源化XB12L链抗体表达载体、或野生型人源化SB04H链和人源化SB04L(L38修饰)抗体表达载体，按照实施例4-2所示的方法向HEK293H中导入基因，使在培养上清液中分泌抗体。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
按照实施例1-2、2-2所示的方法对因子IXa和因子X的结合活性进行评价。结果如图4、图5所示。确认到：取代H39和L38的氨基酸，并没有改变结合活性。
以上结果表明：通过修饰XB12H链的H39和SB04L链的L38，可以提高目标双特异性抗体的比率，而不降低对抗原的结合活性和代替因子VIII的凝固活性等生物活性。迄今为止，包括使用knob和hole进行的方法在内，都没有报道过以下例子，即只向多肽中一个位点氨基酸中导入突变，就可以调节缔合而不降低功能。因此，本发明的发现可以说是史无前例的。
[实施例9]修饰了L44氨基酸的人源化抗体的制作和评价
9-1.修饰了L44的抗体表达载体的构建
基于实施例7的发现，将人源化SB04L链的L44的脯氨酸取代成侧链荷电的氨基酸，以抑制人源化XB12的H链和人源化SB04的L链的缔合。具体而言，将存在于VH和VL界面的疏水核中的脯氨酸取代成侧链荷正电的赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)、或侧链荷负电的谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)。人源化抗体基因的取代通过使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)，按照附录说明书记载的方法导入突变来进行。将氨基酸已被取代的各人源化抗体基因片段***到实施例6-2中使用的双特异性抗体表达载体或通常的抗体表达载体中。
9-2.缔合调节评价用抗体的制备和缔合调节评价
为了对H链和L链的缔合调节进行评价，使用制作的人源化SB04L链(L44修饰)、野生型人源化XB12H链、野生型人源化XB12L链三种抗体表达载体，按照实施例4-2所示的方法向HEK293H中导入基因，使在培养上清液中分泌抗体。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
在样品缓冲液(TEFCO)中对200ng纯化抗体进行还原处理，将其注入到14％SDS-PAGE微型凝胶(TEFCO)中，进行电泳。电泳之后，在含10％甲醇的7％乙酸溶液中浸渍30分钟进行固定处理，并在SYPRO(R)Ruby蛋白凝胶染液(BIO-RAD)中浸渍一昼夜进行染色。随后，在含10％甲醇的7％乙酸溶液中浸渍1小时进行脱色处理，使用荧光检测装置FluorImagerSI(Amersham Biosciences)进行图像分析，获得显影图像。使用所得图像，通过Image Quant ver4.2(AmershamBiosciences)算出H链和L链的谱带荧光强度。
结果如图6所示。使用算出的荧光强度强度值，通过“XB12-L链/L链总量(XB12-L链+SB04-L链)×100”算出目标XB12-L链的比率(％)。当人源化SB04L链(L44)的氨基酸为野生型脯氨酸(Pro)时，XB12-L链的比率为47％；相对于此，当取代L44时，确认到人源化XB12L链的比率上升1.8-1.9倍，达到86～90％。
9-3.凝固活性评价用的双特异性抗体的制备和凝固活性评价
为了评价凝固活性，使用制作的人源化SB04L链(L44修饰)双特异性抗体表达载体和野生型人源化XB12H链、人源化XB12L链和人源化SB04H链双特异性抗体表达载体、pcDNA6/TR、pVgRXR，按照实施例4-2、4-3所示的方法向HEK293H中导入基因和进行表达诱导。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
凝固活性的评价按照实施例5所示的方法进行。结果如图7所示。缔合调节评价中，确认到：比率上升的所有抗体所显示出的凝固活性均超过野生型的凝固活性。
9-4.结合活性评价用抗体的制备
为了对因子X的结合活性进行评价，使用野生型人源化SB04H链和人源化SB04L链(L44修饰)抗体表达载体，按照实施例4-2所示的方法向HEK293H中导入基因，使在培养上清液中分泌抗体。再按照实施例4-6所示的方法进行培养上清液中的抗体浓度的定量。
对因子X的结合活性的评价，使用培养上清液，按照实施例2-2所示的方法来进行。结果如图8所示。确认到：取代L44的氨基酸并没有改变结合活性。
以上结果表明：通过修饰SB04L链的L44这一个位点的氨基酸，可以提高目标双特异性抗体的比率，而不降低对抗原的结合活性和代替因子VIII的凝固活性等生物活性。迄今为止，包括使用knob和hole的方法在内，都不曾报道过以下例子，即只向多肽中的一个位点氨基酸中导入突变，就可调节缔合而不降低功能。因此，本发明的发现可以说是史无前例的。
[实施例10]修饰了H39、L38氨基酸和L44氨基酸的人源化抗体的制作和评价
10-1.修饰了H39、L38和L44的抗体表达载体的构建
基于实施例8和9的发现，将人源化XB12H链的H39和人源化SB04L链的L38和L44取代成侧链荷电的氨基酸，以抑制人源化XB12的H链和人源化SB04的L链的缔合。具体而言，将人源化XB12H链的H39和人源化SB04L链的L38这两个氨基酸取代成实施例8中效果最明显的谷氨酸(Glu)，并且将存在于人源化SB04L链的L44的脯氨酸取代成侧链荷正电的赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)、或侧链荷负电的谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)。人源化抗体基因的取代通过使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)，按照附录说明书记载的方法导入突变来进行。将氨基酸已被取代的各人源化抗体基因片段***到实施例6-2中使用的双特异性抗体表达载体或通常的抗体表达载体中。
10-2.缔合调节评价用抗体的制备和缔合调节评价
为了对H链和L链的缔合调节进行评价，使用变异型人源化SB04L链、变异型人源化XB12H链、野生型人源化XB12L链三种抗体表达载体，按照实施例4-2所示的方法向HEK293H中导入基因，使在培养上清液中分泌抗体。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
在样品缓冲液(TEFCO)中对200ng纯化抗体进行还原处理，并将其注入到14％SDS-PAGE微型凝胶(TEFCO)中，进行电泳。电泳之后，在含10％甲醇的7％乙酸溶液中浸渍30分钟进行固定处理，之后在SYPRO(R)Ruby蛋白凝胶染液(BIO-RAD)中浸渍一昼夜进行染色。随后，在含10％甲醇的7％乙酸溶液中浸渍1小时进行脱色处理，使用荧光检测装置FluorImagerSI(Amersham Biosciences)进行图像分析，获得显影图像。使用所得图像，通过Image Quant ver4.2(AmershamBiosciences)算出H链和L链的谱带荧光强度。
结果如图9所示。使用算出的荧光强度强度值，通过“XB12-L链/L链总量(XB 12-L链+SB04-L链)×100”算出目标XB12-L链的比率(％)。当将人源化XB12H链(H39)和人源化SB04L链(L38)这两个氨基酸修饰成谷氨酸(Glu)、且人源化SB04L链(L44)为野生型脯氨酸(Pro)时，比率为82％；相对于此，当将人源化XB12H链(H39)和人源化SB04L链(L38)这两个氨基酸修饰成谷氨酸(Glu)，除此之外还取代L44时，人源化XB12L链的比率上升至94～96％。与实施例9中单独取代L44时比率为86～90％相比，该比率上升得更高。
10-3.凝固活性评价用的双特异性抗体的制备和凝固活性评价
为了评价凝固活性，使用制作的变异型人源化XB12H链、人源化XB12L链和人源化SB04H链双特异性抗体表达载体和野生型人源化XB12H链、人源化XB12L链和人源化SB04H链双特异性抗体表达载体、pcDNA6/TR、pVgRXR，按照实施例4-2、4-3所示的方法向HEK293H中导入基因和进行表达诱导。再按照实施例4-5、4-6所示的方法进行抗体纯化和抗体浓度的定量。
凝固活性的评价按照实施例5所示的方法来进行。结果如图10所示。缔合调节评价中，确认到：比率上升的所有修饰抗体均显示出和野生型的凝固活性同等的凝固活性。
10-4.结合活性评价用抗体的制备
为了对因子X的结合活性进行评价，使用野生型人源化SB04H链和变异型人源化SB04L链抗体表达载体，按照实施例4-2所示的方法向HEK293H中导入基因，使在培养上清液中分泌抗体。再按照实施例4-6所示的方法进行培养上清液中的抗体浓度的定量。
对因子X的结合活性的评价，使用培养上清液，按照实施例2-2所示的方法来进行。结果如图11所示。确认到：取代L38和L44的两个氨基酸并没有改变结合活性。
以上结果表明：通过修饰XB12H链的H39和SB04L链的L38、L44的氨基酸，可以提高目标双特异性抗体的比率，而不降低对抗原的结合活性和代替因子VIII的凝固活性等生物活性。确认到：双特异性抗体的比率随界面上氨基酸修饰数目的增加而上升。
[实施例11]hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2的构象异构体的分离和结构鉴定
11-1.人源化抗人Mp1抗体hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2的制作
人源化抗Mp1抗体hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2(以下记作u2-wz4)的制作方法如WO2005/56604所示。该基因如下制作：使用编码接头序列(GlyGlyGlyGlySer)x3的核苷酸序列，按照PCR法进行制作，使具有由VH-接头序列-VL-接头序列-VH-接头序列-VL构成的核苷酸序列(SEQID NO：12；参照WO2005/56604的SEQ ID NO：286)。确认基因的核苷酸序列后，将DNA片段克隆到表达载体pCXND3中来构建表达载体，通过向CHO-DG44细胞中导入基因，来制作稳定表达的细胞株。具体而言，将20μg表达载体和0.75mL悬浮在PBS中的CHO-DG44细胞(1×107细胞/mL)混合，将所得混合物在冰上冷却10分钟，并转移到试管中，之后使用Gene Pulser Xcell(BioRad)，以1.5kV、25μFD的容量给予脉冲。室温下恢复10分钟后，将电穿孔处理过的细胞加入到含500μg/mL Geneticin(Invitrogen)的CHO-S-SFMII培养基(Invitrogen)中并进行选择，建立产生u2-wz4的CHO细胞株。
人源化抗体hVB22B u2-wz4sc(Fv)2，由于其上未附加FLAG标签(Flag tag)，所以利用识别表位MG10(人MpI氨基酸序列中从Gln213到Ala231)和GST的融合蛋白，自培养上清液中纯化。对于MG10和GST融合蛋白的纯化，使用谷胱甘肽-琼脂糖4B(Glutathione Sepharose 4B)(Amersham Bioscience公司制)，按照制造商的流程进行纯化。再将纯化的MG10和GST融合蛋白按照制造商的流程固定在HiTrap NHS-活化HP(Amersham Bioscience公司制)上，制作亲合柱。将表达人源化抗体hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2的CHO细胞的培养上清液加到固定有MG10-GST融合蛋白的柱上，使人源化抗体hVB22B u2-wz4sc(Fv)2吸附在柱上，之后用100mM甘氨酸-HCl(pH3.5)、0.01％Tween80洗脱。洗脱组分立即用1M Tris-HCl(pH7.4)进行中和，使用HiLoad 16/60Superdex200pg(Amersham Bioscience公司制)进行凝胶过滤层析以纯化单体。凝胶过滤层析的缓冲液使用20mM枸橼酸缓冲液(pH7.5)，其中含300mM NaCl、0.01％Tween80。
11-2.hVB22B u2-wz4sc(Fv)2的构象异构体的分离和纯化
hVB22B u2-wz4sc(Fv)2是具有序列VH1-接头-VL2-接头-VH3-接头-VL4的sc(Fv)2，因此认为其和VB22B sc(Fv)2一样，根据Fv(在VH和VL之间非共价结合的分子)的组合，其结构中存在以下两种构象异构体：二价scFv型，其中VH1和VL2、VH3和VL4分别形成Fv；以及单链双抗体型，其中VH1和VL4、VH2和VL3分别形成Fv(图12)。
对hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2的构象异构体的分离进行了研究，结果表明：使用阳离子交换层析BioAssist S(TOSOH)，在下述洗脱条件下可以分离hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2中的各种成分。
流动相A：20mM磷酸纳，pH7.5
流动相B：20mM磷酸纳，500mM NaCl，pH7.5
流速：0.8ml/分钟
梯度：B0％→B35％(30分钟)
在上述条件下，hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2分离成两个峰。得到图13所示的层析图，从保持时间短的峰开始，分别命名为峰1和峰2。
使用Q-TOF型质谱仪(Q T of Ultima，Micro Mass)测定峰1和峰2的分子量。向Q-TOF内注入试样溶液，对所得多价离子光谱(+)用附属软件(MassLynx)进行去卷积，结果：峰1的分子量为53768Da，峰2的分子量为53769Da。由此可知，峰1和峰2具有相同分子量。
对峰1和峰2作肽图。在还原变性、羧甲基化之后，用胰蛋白酶将其分解成肽片段，通过反相层析(YMC-Pack-ODS)得到肽图。比较峰1和峰2的肽图，如图14所示，峰1和峰2的肽图的图形相同，由此可知氨基酸一级结构相同。
由于hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2不具有糖链，峰1和峰2由TOF-MASS测定的分子量相同，峰1和峰2肽图图形相同，由以上可知：峰1和峰2是立体结构互不相同的构象异构体。
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2是具有序列VH1-接头-VL2-接头-VH3-接头-VL4的sc(Fv)2，如图12所示，根据Fv(在VH和VL之间非共价结合的分子)的组合，其结构中存在两种构象异构体：二价scFv型，其中VH1和VL2、VH3和VL4分别形成Fv；以及单链双抗体型，其中VH1和VL4、VH2和VL3分别形成Fv。认为峰1和峰2分别为二价scFv型和单链双抗体型中的某一种结构。
鉴定两种构象异构体的分析方法已开发了有限蛋白酶解法。sc(Fv)2的接头部分的结构比较自由，对蛋白酶的耐受性低，因此使用蛋白酶中的一种-枯草蛋白酶A，在下述条件下，使之和峰1、峰2和hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2(峰1∶峰2～1∶4)反应。
20mM枸橼酸钠，150mM NaCl，pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2峰1或峰2：0.15mg/mL
枯草蛋白酶A：10μg/mL
37℃，30分钟
反应后，用12.5％的Phastgel Homogeneous进行还原SDS-PAGE。其结果，如图15所示，hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2整体(bulk)、峰1、峰2均显示出相同的谱带图形。将hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2的三个接头部分切断，则所得各片段具有特异性谱带，因此通过使用上述反应条件，可以部分地且有限分解hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2的接头部分。
在二价scFv型和单链双抗体型的结构中，当3个接头中有1个被切断时，如图16所示，在未变性状态下，在单链双抗体型结构中，由于VH和VL之间的非共价键，3个接头中无论哪一个被切断，都不会改变表观分子量；而在二价scFv型中，当中央接头被切断时，生成具有一半分子量的分子种。因此，在上述反应条件下部分性地切断接头，将所得hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2整体、峰1、峰2用TSK SuperSW2000(TOSHO)进行凝胶过滤层析。凝胶过滤层析按以下条件进行。
流动相：DPBS(-)，pH7.4
流速：0.2ml/分钟
其结果，如图17所示，峰2中完全没有观察到低分子量的峰；相对于此，峰1中观察到低分子量(约一半分子量)的峰。峰1和峰2的混合物-hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2整体中观察到低分子量的峰，该峰的量对应峰1的存在比。因此，通过本结果确定：峰1为二价scFv型、峰2为单链双抗体型。
[实施例12]VH/VL界面修饰型sc(Fv)2的制作、构象异构体分析和鉴定
12-1.VH/VL界面修饰型sc(Fv)2的制作
按以下方法制作VH/VL界面修饰型sc(Fv)2，以便确认对于小分子抗体sc(Fv)2而言，当通过修饰VH/VL界面来调节缔合时，是否可以调节sc(Fv)2的构象异构体的形成。
如下操作，修饰形成u2-wz4的VH/VL界面的氨基酸-VH的39位(SEQ ID NO：13中记载的氨基酸序列中的39位；参照WO2005/56604的SEQ ID NO：289)的Gln和VL的38位(SEQ ID NO：14中记载的氨基酸序列中的43位；参照WO2005/56604的SEQ ID NO：289)的Gln。首先，制作基因hVB22B u2-wz4(v1) sc(Fv)2(以下记作v1，核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；由该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：16所示)，该基因中，将VH1的39位的Gln(遗传密码子CAG)变为Glu(遗传密码子GAG)、将VL2的38位的Gln(遗传密码子CAG)变为Glu(遗传密码子GAG)、将VH3的39位的Gln(遗传密码子CAG)变为Lys(遗传密码子AAG)、将VL4的38位的Gln(遗传密码子CAG)变为Lys(遗传密码子AAG)。再制作基因hVB22B u2-wz4(v3)sc(Fv)2(以下记作v3，核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；由该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示)，该基因中，将VH1的39位的Gln(遗传密码子CAG)变为Glu(遗传密码子GAG)、将VL2的38位的Gln(遗传密码子CAG)变为Lys(遗传密码子AAG)、将VH3的39位的Gln(遗传密码子CAG)变为Lys(遗传密码子AAG)、将VL4的38位的Gln(遗传密码子CAG)变为Glu(遗传密码子GAG)。基因的修饰使用QuikChange定点突变试剂盒(STRATAGENE公司制)，按照制造商的流程导入点突变来进行。确认各基因的核苷酸序列后，将DNA片段克隆到表达载体pCXND3中，以构建表达载体，通过向CHO-DG44细胞中导入基因，来制作稳定表达的细胞株。按照实施例11所示的方法，建立产生v1的CHO细胞株和产生v3的CHO细胞株。
对于变异体v1、v3，按照实施例11所示的方法，用固定有MG10-GST融合蛋白的柱子纯化其单体分子。由图18所示的凝胶过滤层析的结果可知：就变异体v1、v3而言，在培养上清液中二聚体以上的聚集物有所减少；而单体比率较修饰前的u2-wz4的单体比率(59％)有所上升，v1的单体比率上升至89％，v3的单体比率上升至77％。推测在变异体v1、v3中，通过修饰VH/VL界面的氨基酸，利用静电排斥来抑制不希望的缔合，并促进希望的缔合。由以上可知，通过该缔合调节，成功且有效地表达了单体分子。
12-2.VH/VL界面修饰型sc(Fv)2的构象异构体分析和鉴定
利用阳离子交换层析和等电点电泳，分析所得VH/VL界面变异体v1、v3和未修饰体u2-wz4中的构象异构体存在比。另外，通过有限蛋白酶解法进行结构鉴定。
阳离子交换层析如下进行。
柱：TSK-gel Bioassist S，4.6mmφ×50mm(TOSOH公司制)
流速：0.8mL/分钟
检测波长：220nm
洗脱条件：
洗脱液A：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)
洗脱液B：20mmol/L磷酸盐缓冲液/500mmol/L NaCl(pH7.0)
梯度：
时间(分钟)                         B％
0                                  0
5                                  0
25                                 30
25.1                               100
35                                 100
35.1                               0
如下进行等电点电泳。将PhastGel Dry IEF凝胶(AmershamBiosciences公司制)用以下凝胶膨润液膨润30分钟以上。向先前膨润的凝胶中添加试样，使用PhastSystem按以下电泳条件进行电泳。电泳后，在20％TCA溶液中浸渍30分钟，之后用Milli-Q水洗涤5分钟×3次以上，根据试样的蛋白质浓度，进行考马斯染色或银染色。考马斯染色中，使用含0.1％CuSO4(w/v)的0.02％CBB作为染色液进行染色，再用含10％乙酸的30％甲醇进行脱色。银染色中，使用银染试剂盒、Protein(Amersham Biosciences公司制)，按照试剂盒上附带的标准流程进行染色。
<凝胶膨润液>
Pharmalyte 8.5-10                   80μL
Biolyte 7-9                         10μL
Biolyte 3-9                         10μL
20％甘油                            2.0mL
<电泳程序>
SAMPLE APPLICATION DOWN AT step2    0Vh
SAMPLE APPLICATION UP AT step2         0Vh
步骤12000V    2.5mA    3.5W    15℃    75Vh
步骤2200V     2.5mA    3.5W    15℃    15Vh
步骤32000V    2.5mA    3.5W    15℃    410Vh
利用有限蛋白酶解法，按以下条件进行结构鉴定。使用枯草蛋白酶A，在以下条件下使之与u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2、变异体v1和变异体v3反应。
20mM枸橼酸钠，150mM NaCl，pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2峰1或峰2：0.15mg/mL
枯草蛋白酶A：10μg/mL
37℃，30分钟
通过凝胶过滤层析，按以下条件分析所得反应液。
柱：TSKgel Super2000sw(TOSOH)
洗脱液：50mM磷酸钠，300mM KCl，pH7.0
流速：0.2mL/分钟
检测：220nm
通过阳离子交换层析和等电点电泳分析构象异构体，由图19和图20所示的分析结果可知：u2-wz4作为两种构象异构体的混合物而表达，其中24％为二价scFv型，76％为单链双抗体型；相对于此，100％的变异体v1作为单链双抗体型构象异构体而表达；100％的变异体v3作为二价scFv型构象异构体而表达。另外，如图21所示，从有限蛋白酶解的结果可知：变异体v3中和u2-wz4纯化峰1一样，可见低分子的峰；变异体v1中和u2-wz4纯化峰2一样，观察不到低分子的峰，以上表明：变异体v1作为单链双抗体型构象异构体而表达；变异体v3作为二价scFv型构象异构体而表达。
[实施例13]VH/VL界面修饰型sc(Fv)2的活性评价和稳定性评价
13-1.VH/VL界面修饰型sc(Fv)2的生物活性评价
据文献(Blood 2005；105：562-566)报道，抗人Mp1抗体VB22Bsc(Fv)2显示出TPO样激动剂活性。因此，使用显示出TPO依赖性增殖的BaF3-人Mp1或BaF3-猴Mp1，评价分离的构象异构体的TPO样激动剂活性。
将各细胞用含1％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI1640(Invitrogen)洗涤2次，之后悬浮在含10％胎牛血清的RPMI1640中，使浓度为4×105cells/mL，按60μL/孔分注到96孔板中。向各孔中加入40μL各种浓度的rhTPO(R&D)或构象异构体样品，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。按10μL/孔加入WST-8试剂(Cell Count Reagent SF，NakalaiTesque)，立即用Benchmark Plus测定450nm的吸光度(对照655nm)，培养2小时后，再次测定450nm的吸光度(对照655nm)。WST-8试剂根据活细胞数目而在450nm呈现显色反应，因此以2小时的吸光度变化为指标，评价TPO样激动剂活性。
使用纯化的VB22B sc(Fv)2的构象异构体，评价BaF3-人Mp1、BaF3-猴Mp1的TPO样激动剂活性，结果分别如图17所示。比较峰1和峰2的构象异构体的激动剂活性时发现：峰2显示出显著高的活性。以上表明：为了发挥TPO样激动剂活性，抗Mp1抗体sc(Fv)2必需形成单链双抗体型结构。
按照实施例1所示的方法，评价VH/VL界面变异体v1和v3的激动剂活性。构象异构体之间的激动剂活性有很大不同，如图12所示，单链双抗体结构的峰2显示出非常高的激动剂活性；而二价scFv结构的峰1的活性极低。如图22所示，变异体v1显示出与峰2同等的活性，变异体v3显示出与峰1大致相同的活性。因此，生物活性也表明：变异体v1形成单链双抗体结构，变异体v3形成二价scFv结构。
13-2.VH/VL界面修饰型sc(Fv)2的稳定性评价
利用差示扫描量热法，按以下条件测定变性中间温度(Tm值)，评价u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2和变异体v1、变异体v3的稳定性。
DSC：N-DSCII(Applied Thermodynamics公司制)
溶液条件：20mM枸橼酸钠，300mM NaCl，pH7.0
蛋白质浓度：0.1mg/mL
扫描速度：1℃/分钟
各DSC测定结果如图23所示。可知：u2-wz4纯化峰2和变异体v1的Tm值与未修饰体大致相等，稳定性也相同。u2-wz4纯化峰1和变异体v3相比，变异体v3的稳定性略低。按照使用knobs-into-hole技术进行的方法调节界面时，例如有报道(Acta Pharmacol Sin.2005 26(6)：649-58)称：在IgG的CH3结构域的异源缔合中，未修饰CH3结构域的Tm值为80.4℃，而修饰CH3结构域的Tm值为69.4℃，Tm值显著降低，稳定性也降低。相对于此，本发明中确认：可以调节缔合而不降低稳定性。
接下来，按以下条件进行热加速试验，评价u2-wz4纯化峰1、u2-wz4纯化峰2和VH/VL界面修饰体-变异体v1和v3的稳定性。
<热加速条件>
溶液条件：20mM枸橼酸钠，pH6.0
蛋白质浓度：0.25mg/mL
加速条件：40℃-6天，12天
通过凝胶过滤层析和阳离子交换层析，按以下条件分析热加速样品。
如图24所示，由凝胶过滤层析的分析结果可知：u2-wz4纯化峰2和变异体v1的单体残留率大致相同，缔合稳定性大致相同。另外，u2-wz4纯化峰1和变异体v3的单体残留率也大致相同，两种构象异构体中，缔合稳定性大致相同。
如图25所示，由阳离子交换层析的分析结果可知：未修饰体的纯化峰1通过异构化反应异构化成峰2，未修饰体纯化峰2通过异构化反应异构化成峰1；相对于此，VH/VL界面变异体v1和v3即使在热加速后也未发生异构化反应。由此可知：通过修饰VH/VL界面，两种构象异构体中仅有一种构象异构体可以以100％的状态表达；此外，所得各构象异构体未发生异构化反应，可以稳定保存。
本实施例中，通过使用适于v1和v3的VH/VL界面修饰，发现：两种构象异构体中仅一种构象异构体可以以100％存在的状态表达。作为用于得到目标结构的单链抗体的VH/VL界面调节，已知有使用knobs-into-hole技术调节双特异性双抗体结构的方法(Protein Sci.1997Apr；6(4)：781-8，Remodeling domain interfaces to enchance heterodimerformation.(重建结构域界面促进异源二聚体形成)，Zhu Z，Presta LG，Zapata G，Carter P.)。据报道，该方法中每个VH/VL界面中共修饰4个位点的氨基酸，从而将目标异源二聚体结构的形成率从72％提高到92％。相对于此，本发明通过修饰4个位点的氨基酸，成功地以100％的比率获得目标结构，而不降低热稳定性和构象异构体的稳定性。
[实施例14]具有杂交L链的双特异性抗体的人源化
按以下方式对双特异性抗体(特愿2005-112514)施行人源化，上述双特异性抗体中包括：抗因子IXa抗体A69-VH、抗因子X抗体B26-VH、杂交L链(BBA)的组合，该组合缩短凝血时间的效果最强。
14-1.人抗体的同源性检索
由一般公开的Kabat数据库(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/)获取人抗体氨基酸序列数据，使用构建的数据库，分为小鼠A69-H链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO：57)、小鼠B26-H链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO：58)、小鼠BBA-L链可变区(氨基酸序列：SEQ ID NO：59)，进行同源检索。其结果，确认：与以下所示的人抗体序列具有高度同源性，因此决定用作人源化抗体的构架区(以下，记作FR)。
(1)A69-H链可变区：KABATID-000064(Kabat数据库)(Kipps等，J Clin Invest.1991；87：2087-2096)
(2)B26-H链可变区：EMBL Accession No.AB063872(IMGT数据库)(未公布的数据)
(3)BBA-L链可变区：KABATID-024300(Kabat数据库)(Welschof等，J Immunol Method.1995；179：203-214)
制作了将各小鼠抗体的互补性抗原决定区(以下，记作CDR)移植到(1)-(3)的人抗体FR中的人源化抗体。
使用由NCBI公开的同源性检索网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，检索与(1)-(3)的人抗体具有高度同源性的人抗体的分泌信号序列。使用由检索得到的以下所示的分泌信号序列。
(1)A69-H链可变区：GenBank Accession No.AF062257
(2)B26-H链可变区：GenBank Accession No.AAC18248
(3)BBA-L链可变区：GenBank Accession No.AAA59100
14-2.人源化抗体基因表达载体的构建
在核苷酸序列中交替制作12条大约50碱基的合成寡DNA，使3’末端侧约20碱基退火，上述核苷酸序列编码从分泌信号序列到抗体可变区的氨基酸序列。进一步制作以下两种引物，其中一种在抗体可变区基因的5’末端退火并具有XhoI切割序列，另一种在抗体可变区基因的3’末端退火并具有SfiI切割序列，而且还编码内含子序列的5’末端序列。
将各1μL调整至2.5μM的合成寡DNA混合，加入1x TaKaRa ExTaq缓冲液、0.4mM dNTPs、0.5单位TaKaRa Ex Taq(均为宝酒造)，制备48μL反应液。将反应液在94℃下保温5分钟后，反应在94℃2分钟、55℃2分钟、72℃2分钟下循环2次，进行各合成寡DNA的装配和伸长反应。随后，添加1μL皆为10μM的在抗体基因的5’末端和3’末端侧退火的引物，反应在94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟下循环35次，再在72℃下反应5分钟，扩增抗体可变区基因。PCR之后，将全部反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法纯化目标尺寸(约400bp)的扩增片段，并用30μL灭菌水洗脱。使用pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)，按照附录说明书记载的方法克隆上述片段。各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，利用DNA测序仪ABI PRISM 3730xL DNA Seguencer(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法进行确定。
将***有H链可变区片段的质粒经XhoI和SfiI消化、***有L链可变区片段的质粒经EcoRI消化，上述质粒均确认具有正确的人源化抗体可变区基因序列。之后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法纯化目标尺寸(约400bp)的DNA片段，并用30μL灭菌水洗脱。之后，如下制作动物细胞用表达载体。为了优先表达H链为异源组合的IgG4，参考IgG1的knobs-into-holes技术(非专利文献3)，使用CH3部分被氨基酸取代的IgG4。进一步向铰链中导入取代的氨基酸(-ppcpScp-→-ppcpPcp-)，以促进H链的二聚体的形成。向具有鸡β-肌动蛋白启动子的pCAGGS(Niwa等，1991 Gene，108：193-199.)中***被Y349C、T366W取代的恒定区基因得到表达载体，向所得表达载体中***人源化A69H链可变区抗体基因片段，制作人源化A69H链表达载体。另外，向pCAGGS中***被E356C、T366S、L368A、Y407V取代的恒定区基因得到表达载体，向所得表达载体中***人源化B26H链可变区抗体基因片段，制作人源化B26H链表达载体。将向pCAGGS中***野生型抗体L链恒定区而得到的质粒(pCAG-gκDNA)经EcoRI消化，制作***有人源化BBA L链可变区抗体基因片段的表达载体。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)进行连接反应，对大肠杆菌DH5α株(东洋纺织)进行转化。
14-3.人源化双特异性抗体的制备
使用实施例4-2中记载的方法或以下方法表达人源化双特异性抗体。将来源于人胎儿肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮在含10％FCS(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中，以5～6×105个/mL的细胞密度，向黏着细胞用皿(直径10cm，CORNING)的每个皿中播种10mL，在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养一昼夜，之后吸除培养基，添加6.9mL CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基。将14-2制备的总计13.8μg的质粒DNA混合液、20.7μL 1μg/mL的聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)和690μLCHO-S-SFMII培养基混合，室温下静置10分钟，将所得混合物加入到各皿的细胞中，在CO2培养箱(37℃，5％CO2)内培养4～5小时。之后，添加6.9mL CHO-S-SFM-II培养基，在CO2培养箱内培养3天。回收培养上清液，之后离心(约2000g，5分钟，室温)以除去细胞，再通过0.22μm滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)灭菌。该样品在使用之前一直在4℃下保存。
接下来，按照实施例4-4所示的方法进行抗体纯化，并按照实施例4-5所示的方法或以下方法进行抗体浓度的定量。使用BIAcore3000(BIACORE)，将蛋白A固定在Sensor Chip CM5(BIACORE)上。具体而言，按照制造商的流程，使蛋白A溶液以5μL/分钟的流速和活化传感器芯片反应30分钟，上述蛋白A溶液用10mM的乙酸钠水溶液(pH4.0，BIACORE)稀释至50μg/mL。之后，进行封闭操作，制作固定有蛋白A的传感器芯片。使用该传感器芯片，采用BIAcore Q测定培养上清液和纯化品的浓度。在传感器芯片的固定和浓度测定中使用HBS-EP缓冲液(BIACORE)。使用人IgG4(人源化抗TF抗体，参照WO99/51743)作为浓度测定时的标准品，上述人IgG4经HBS-EP缓冲液从2000ng/mL起按2倍递次稀释法稀释6阶段。
14-4.人源化双特异性抗体的活性评价和抗体序列的修饰
为了评价所制备的人源化双特异性抗体和嵌合双特异性抗体(A69/B26/BBA)的血浆凝固能，按照实施例5的方法，使用F.VIII缺乏血浆，研究抗体对APTT的影响。对于降低血液凝固能的人源化双特异性抗体，以提高活性为目标，修饰人抗体FR的氨基酸。另外，在表达分泌时，以下3种抗体被表达：人源化A69/人源化BBA抗体、人源化B26/人源化BBA抗体、人源化A69/人源化B26/人源化BBA双特异性抗体。分离这3种抗体，并修饰氨基酸，使人源化A69H链可变区的等电点降低、人源化B26H链可变区的等电点上升，以便仅纯化双特异性抗体。具体而言，使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)，按照附录说明书记载的方法，向人源化抗体可变区导入突变。将***有H链可变区片段的质粒经XhoI和SfiI消化、***有L链可变区片段的质粒经EcoRI消化，上述质粒均确认具有目标人源化抗体可变区基因序列。之后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法纯化目标尺寸(约400bp)的DNA片段，并用30μL灭菌水洗脱。之后，按照实施例14-2所示的方法制作动物细胞用表达载体。按照实施例14-3所示的方法制备人源化双特异性抗体，按照实施例5所示的方法评价凝血活性。
通过反复FR序列的氨基酸修饰和血液凝固能的评价，获得具有和嵌合双特异性抗体(A69/B26/BBA)同等活性的人源化双特异性抗体(人源化A69(hA69-PFL)/人源化B26(hB26-PF)/人源化BBA(hAL-AQ))(图26)。各抗体可变区序列如以下SEQ ID NO所示。
(1)人源化A69抗体VH(hA69-PFL)SEQ ID NO：19(核苷酸序列)、SEQ ID NO：20(氨基酸序列)
(2)人源化B26抗体VH(hB26-PF)SEQ ID NO：21(核苷酸序列)、SEQID NO：22(氨基酸序列)
(3)人源化BBA抗体VL(hAL-AQ)SEQ ID NO：23(核苷酸序列)、SEQID NO：24(氨基酸序列)
[实施例15]选择恒定区的氨基酸修饰位点以提高双特异性抗体的形成效率
修饰存在于恒定区CH3界面的氨基酸，研究通过静电排斥提高异源二聚体-双特异性抗体的形成效率。首先，从CH3区的晶体结构(Protein Data bank、PDB code 1OQX)入手，寻找在形成CH3同源二聚体时形成静电相互作用的氨基酸对。结果发现：在形成CH3同源二聚体时的界面中，H链第356位和第439位、第357位和第370位、第399位和第409位这三对氨基酸(号码按EU编号排序(Kabat EA等，1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH))分别带正电和负电，并发生静电相互作用，因此将它们选作修饰位点。转换荷正电和荷负电的氨基酸对的电荷，认为通过这种方法可促进异源二聚体的形成。这种调节的原理如图27所示。还尝试着同时向CH3界面导入二硫键来进行修饰。修饰的氨基酸位点总结在表1中。
[实施例16]修饰人源化双特异性抗体的恒定区CH3界面的氨基酸
为了修饰实施例15选定的H链恒定区CH3界面的氨基酸，进行如下操作。以人IgG1和人IgG4的H链恒定区基因为模板，使用5’末端引物和另一引物，通过PCR扩增各H链恒定区，上述5’末端引物设计成核苷酸序列成为NheI识别序列(GCTAGC)，上述核苷酸序列编码H链恒定区的N末端侧的两个氨基酸(Ala-Ser)；另一引物设计成在3’末端退火且具有NotI识别位点。之后，制作与载体连接的pBCH(包括IgG1恒定区基因)和pBCH4(包括IgG4恒定区基因)，上述载体是用Nhe1和NotI(均为宝酒造)消化pBluescriptKS+载体(东洋纺)而得到的。使用两个引物进行PCR，其中一个引物与人源化A69抗体和人源化B26抗体的H链可变区的5’末端核苷酸序列互补，并具有Kozak序列(CCACC)和EcoRI识别序列；另一个引物位于具有NheI识别序列的3’末端核苷酸序列上。将所得PCR产物***经EcoRI和NheI(均为宝酒造)消化的pBCH或pBCH4中，连接可变区和恒定区。接着，使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)，按照附录说明书记载的方法向H链恒定区导入突变，以修饰存在于H链恒定区的CH3界面的氨基酸。将***有H链基因片段的质粒经EcoRI和NotI(均为宝酒制)消化，上述质粒确认具有目标H链恒定区基因序列。之后，将反应液供给1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书记载的方法纯化目标尺寸(约1400bp)的H链基因片段，并用30μL灭菌水洗脱。之后，将该片段***到经EcoRI和NotI消化的pCAGGS中，制作表达质粒。人源化双特异性抗体的制备按照实施例14-3所示的方法来进行。修饰的氨基酸位点总结在表1中。表1中的修饰位点的号码按EU编号排序(Kabat EA等，1991.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.NIH))。修饰位点编号之前的字母是修饰前的氨基酸的一个文字标记，修饰位点编号之后的字母是修饰后的氨基酸的一个文字标记。
[表1]
Figure A20068001884100921
上表中，KiH表示使用非专利文献3中记载的Knobs-into-holes技术得到的变异体。
[实施例17]修饰了CH3界面的双特异性抗体(IgG4型)的形成效率和稳定性评价
利用阳离子交换层析(IEX)分析IgG4型的野生型、KiH、s1、s2、s3、w1、w2、w3、s1C、s2C、s3C、w3C、w3C2，评价双特异性抗体(以下记作BiAb)的形成效率。阳离子交换层析分析条件如下，算出人源化A69抗体的同源二聚体A-Homo、人源化A69抗体和人源化B26抗体的异源二聚体BiAb、人源化B26抗体的同源二聚体B-Homo的峰面积比。
柱：ProPac WCX-10，4×250mm，(Dionex)
流动相：A：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH6.25
B：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，500mmol/L NaCl，pH6.25
流速：1.0mL/分钟
梯度：10％B(5分钟)→(40分钟)→60％B→(5分钟)→100％B(5分钟)
检测：220nm
利用上述IEX分析野生型、KiH、s2、s3、s1C、s2C、s3C、w3C、w3C2时，通过收集BiAb峰组分来纯化BiAb。将BiAb组分用AmiconUltra，MWCO 10000(Millipore)浓缩后，用20mM乙酸钠、150mM NaCl(pH6.0)在冷却下透析一夜，之后回收。将BiAb浓度统一为0.1mg/mL，分注到小瓶中作为初始样品和60℃-1周的样品，每种样品各制备2瓶，进行60℃-1周的稳定性试验。利用凝胶过滤层析(SEC)进行分析，算出单体峰的残留率(60℃-1周的样品的单体峰面积/初始样品的单体峰面积×100)。凝胶过滤层析分析条件如下。
柱：Super3000(TOSOH)
流动相：50mM磷酸纳，300mM KCl，pH7.0
流速：0.2mL/分钟
检测：220nm
IgG4型的野生型、s1、s2、s3、w1的IEX层析如图28所示；野生型、KiH、s1、s2、s3、w1、w2、w3、s1C、s2C、s3C、w3C、w3C2的A-Homo、BiAb、B-Homo的形成比率如图29所示。60℃-1周后的单体残留率如图30所示。
如图28、图29所示，和野生型相比，本实施例中发现的CH3界面修饰体的目标BiAb形成效率均显著提高。由于CH3位于恒定区，当修饰天然氨基酸时，从抗原性方面考虑，希望修饰位点少。在KiH中，为了导入knob和hole，两条H链中共有4个位点被修饰；此外，为了导入二硫键，还有2个位点被修饰，故总共有6个位点被修饰。因此，如图29所示，BiAb的形成效率高。但是，由图30所示的稳定性试验结果可知：虽然导入了二硫键，但和野生型相比，热稳定性仍显著降低。为了将抗体开发成医疗用医药品，要求稳定的制剂，因此希望热稳定性高。
另一方面，和野生型相比，本实施例中发现的CH3界面修饰体均成功地使目标BiAb形成效率大幅提高。上述变异体中，例如s2、s3、w1、w2、w3、s1C，通过总计2个位点或4个位点的、少于KiH(6个位点修饰)的修饰，得到了90％以上的高BiAb形成效率，认为其抗原性风险更小。另外，由图30所示的稳定性试验结果可知：变异体中，例如s2、s3、w3、w3C、w3C2，具有90％以上的高BiAb形成效率，并且较KiH的热稳定性高(单体残留率高)；s3、s2C、s3C、w3C、w3C2具有比野生型更高的热稳定性，在开发稳定的医药制剂上有用。
本实施例中发现：通过修饰CH3界面中H链第356、第357、第370、第399、第409、第439位的氨基酸，导入电荷产生的分子排斥，可以大幅提高目标BiAb形成效率。还发现：通过单独导入上述修饰或将其组合以及导入二硫键，可以大幅提高BiAb形成效率，而修饰较KiH少；可以在保持高于KiH的稳定性、甚至高于野生型的热稳定性的条件下，大幅提高BiAb形成效率。
[实施例18]修饰了CH3界面的双特异性抗体的凝固活性评价
使用实施例16中纯化的修饰了CH3界面的IgG4型双特异性抗体(s1、s2、s3、w1、w2、w3)，按照实施例5所示的方法评价凝固活性。如图31所示，即使修饰恒定区CH3界面的氨基酸，凝固活性也没有发生变化，这表明CH3界面的氨基酸修饰没有对可变区的结构造成影响，上述可变区参与和抗原的反应。
[实施例19]修饰了CH3界面的双特异性抗体(IgG1型)的形成效率评价
利用阳离子交换层析(IEX)分析IgG1型的野生型、KiH、w1、w2、w3，评价BiAb形成效率。阳离子交换层析分析条件如下，算出人源化A69抗体的同源二聚体A-Homo、人源化A69抗体与人源化B26抗体的异源二聚体BiAb、人源化B26抗体的同源二聚体B-Homo的峰面积比。
柱：ProPac WCX-10，4×250mm，(Dionex)
流动相：A：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH6.25
B：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，500mmol/L NaCl，pH6.25
流速：1.0mL/分钟
梯度：10％B(5分钟)→(40分钟)→60％B→(5分钟)→100％B(5分钟)
检测：220nm
IgG1型的野生型、KiH、w1、w2、w3的A-Homo、BiAb、B-Homo的形成比率如图32所示。和IGg4型一样，与野生型相比，目标BiAb形成效率均大幅提高。和IgG4型一样，利用较KiH少的4个位点修饰，得到90％以上的高BiAb形成效率，认为抗原性的风险更小。本实施例表明：修饰CH3界面中H链第356、第357、第370、第399、第409、第439位的氨基酸的方法，不仅适用于抗体恒定区的亚类IgG4，还适用于IgG1，可以应用于全体IgG抗体。
产业实用性
本发明的方法中，只需取代少数的氨基酸，就可以调节缔合而不改变原始多肽的结构和功能(活性)，实用性非常高。对抗原性的影响亦少。
通过使用本发明的方法，可以有效地获得实际上保持活性的双特异性抗体。
序列表
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<120>通过调节缔合制备多肽的方法
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<151>2005-12-28
<160>59
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>423
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>1
atgaaacacc tgtggttctt cctcctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtctcag     60
gtgcagctgc agcagtcagg acctggcctc gtgaaacctt ctgagactct gtctctcacc    120
tgcactgtct ctggctactc catctccagt ggttattact ggacctggat ccggcagcct    180
ccaggaaagg gtctggaatg gattggctac atatccttcg acggtaccaa tgactacaac    240
ccatctctca aaaatcgagt caccatctct cgtgacacat ctaagaacaa tttttccctg    300
aagttgaact ctgtaactgc tgcagacaca gctgtatatt actgtgcaag aggccccccc    360
gctacttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctt caggtaagtc ggcctcgggg    420
gcc                                                                  423
<210>2
<211>115
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Asn Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Pro Ala Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>3
<211>384
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>3
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc     60
agatgtgaaa ttgtgttgac gcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga    120
gtcaccatca cttgcagggc cacctcaagt gtaaattaca tttactggta tcagcagaaa    180
ccagggaaag cccctaagct cctgatctat tatacatcca acctggctcc tggggtccca    240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcaa cagcctgcag    300
cctgaagatt ttgcaactta ctattgccag cagttttcta gttccccatg gacgttcggc    360
ggagggacca agctggagat caaa                                           384
<210>4
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Ser Ser Pro Trp Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>5
<211>443
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>5
atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag ctccaggtgc tcactcccag     60
gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc    120
tgcaaggcat ctggatacac cttcacccac tttgttttgc actgggtgcg acaggcccct    180
ggacaagggc ttgagtggat gggatatatt attccttaca atgatggtac taagtacaat    240
gagaagttca aaggcagagt caccatgacc agtgacacgt ccacgagcac agtctacatg    300
gagctgagca tcctgaaatc tgaggacacg gccgtgtatt tctgtgcgag agggaatagg    360
tacgacgtag gttcctatgc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctca    420
tcaggtaagt ggcctcgggg gcc                                            443
<210>6
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Phe
            20                  25                  30
Val Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Asn Arg Tyr Asp Val Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Ser Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>7
atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg tgcctacggg     60
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc    120
atcaactgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc    180
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atccactagg    240
gaatctgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcaag    300
atcagccgcg tgcaggctga agatgtggga gtttattact gtcagcaata ttataggttt    360
ccgtacacgt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa                           399
<210>8
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Arg Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>9
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser SerIle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>10
<211>107
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210>11
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>12
<211>1572
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>12
atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcccag     60
gtgcagctgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc    120
tgcaaggctt ctggatacac cttcaccaac tcctggatga actgggtgag gcagaggcct    180
ggaaagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagaaac tatctacaat    240
gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg    300
caactgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat    360
gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt    420
ggatccggag gtggtggatc gggtggtgga ggatcggata ttgtgatgac tcagtctcca    480
ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg gcctccatct cctgcaggtc tagtaagagt    540
ctcctgcata gtaatggcaa cacttacttg tattggttcc tgcagaagcc agggcagtct    600
ccacagctcc tgatctatcg gatgtccaac cttgcctcag gggtccctga caggttcagt    660
ggcagtggat caggcacaga ttttacactg aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt    720
ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa    780
ctggaaatca aaggaggtgg tggatcgggt ggtggtggtt cgggaggcgg tggatcgcag    840
gtgcagctgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc    900
tgcaaggctt ctggatacac cttcaccaac tcctggatga actgggtgag gcagaggcct    960
ggaaagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagaaac tatctacaat   1020
gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg   1080
caactgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat   1140
gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt   1200
ggatccggag gtggtggatc gggtggtgga ggatcggata ttgtgatgac tcagtctcca   1260
ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg gcctccatct cctgcaggtc tagtaagagt   1320
ctcctgcata gtaatggcaa cacttacttg tattggttcc tgcagaagcc agggcagtct   1380
ccacagctcc tgatctatcg gatgtccaac cttgcctcag gggtccctga caggttcagt   1440
ggcagtggat caggcacaga ttttacactg aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt   1500
ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa   1560
ctggaaatca aa                                                       1572
<210>13
<211>118
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Arg Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>14
<211>112
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
                85                  90                  95
Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>15
<211>1572
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>15
atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcccag   60
gtgcagctgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc  120
tgcaaggctt ctggatacac cttcaccaac tcctggatga actgggtgag ggagaggcct  180
ggaaagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagaaac tatctacaat  240
gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg  300
caactgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat  360
gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt  420
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ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg gcctccatct cctgcaggtc tagtaagagt  540
ctcctgcata gtaatggcaa cacttacttg tattggttcc tggagaagcc agggcagtct  600
ccacagctcc tgatctatcg gatgtccaac cttgcctcag gggtccctga caggttcagt  660
ggcagtggat caggcacaga ttttacactg aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt  720
ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa  780
ctggaaatca aaggaggtgg tggatcgggt ggtggtggtt cgggaggcgg tggatcgcag  840
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gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 1080
caactgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat 1140
gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt 1200
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ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa  1560
ctggaaatca aa                                                      1572
<210>16
<211>524
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>16
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
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    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Phe Arg Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
145                 150                 155                 160
Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg
                165                 170                 175
Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp
            180                 185                 190
Phe Leu Glu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met
        195                 200                 205
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
    210                 215                 220
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val
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Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
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Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Ile Glu Tyr Pro
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<210>17
<211>1572
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>17
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<210>18
<211>524
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成序列
<400>18
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys
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Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg
                165                 170                 175
Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp
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        195                 200                 205
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
    210                 215                 220
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val
225                 230                 235                 240
Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly
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Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro
        275                 280                 285
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
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<211>411
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>19
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<210>20
<211>137
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
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<210>21
<211>414
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>21
atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactccgag     60
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<211>138
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>22
Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Gln Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Asp Asn Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
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Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Ile Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
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Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210>23
<211>384
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>23
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc     60
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<210>24
<211>128
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
            100                 105                 110
Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210>25
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75              80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>26
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>27
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>28
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>29
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Lys Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>30
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>31
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn G1n Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>32
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>33
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Lys Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>34
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>35
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>36
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>37
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>37
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Lys Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>38
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>38
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>39
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>40
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>41
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Lys Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>42
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>43
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Lys Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gl nGlu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>44
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>44
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>45
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Lys Lys Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>46
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>47
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Lys Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>48
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>49
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>50
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp As nSer Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>51
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>52
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>53
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>54
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>55
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>56
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                 70                 75                 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Lys
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>57
<211>119
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>57
Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp
            20                  25                  30
Tyr Tyr Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Leu Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys
    50                  55                  60
Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65                  70                  75                  80
Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>58
<211>120
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>58
Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
            20                  25                  30
Asn Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Lys
    50                  55                  60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65                  70                  75                  80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>59
<211>107
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>59
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser lle Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
            100                 105

Claims (97)

1.多肽突变体的制备方法，上述突变体中在形成多肽内界面的氨基酸残基中具有突变以调节多肽的缔合，该制备方法包括：(a)自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制多肽内的缔合，上述氨基酸残基形成多肽内的界面；(b)培养宿主细胞，使其表达上述核酸；(c)自宿主细胞培养物中回收该多肽。
2.异源多聚体的制备方法，上述异源多聚体中形成多肽间界面的氨基酸残基中具有突变以调节异源多聚体的缔合，该制备方法包括：(a)自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制多肽间的缔合，上述氨基酸残基形成多肽间的界面；(b)培养宿主细胞，使其表达上述核酸；(c)自宿主细胞培养物中回收该异源多聚体。
3.权利要求1的方法，该方法是在能够形成多种构象异构体的多肽中，自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制形成一种以上构象异构体的多肽的缔合，上述氨基酸残基形成多肽内的界面。
4.权利要求2的方法，该方法是在能够形成多种多聚体的异源多聚体中，自原始核酸中修饰编码氨基酸残基的核酸以抑制形成一种以上多聚体的多肽间的缔合，上述氨基酸残基形成多肽间的界面。
5.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的修饰为修饰原始核酸以向该界面导入氨基酸残基的突变，使形成界面的多个氨基酸残基带有同种电荷。
6.权利要求5的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
7.权利要求5的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
8.权利要求5的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
9.权利要求5的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
10.权利要求5的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
11.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的修饰为修饰原始核酸以向该界面导入氨基酸残基的突变，使存在于界面的形成疏水核的氨基酸残基成为荷电氨基酸残基。
12.权利要求11的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
13.权利要求11的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
14.权利要求11的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
15.权利要求11的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
16.权利要求11的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
17.权利要求1或2的方法，其中多肽的界面由抗体的重链可变区和轻链可变区形成。
18.权利要求1或2的方法，其中多肽的界面由多种重链可变区形成。
19.权利要求1或2的方法，其中多肽的界面由抗体的重链恒定区和轻链恒定区形成。
20.权利要求1或2的方法，其中多肽的界面由多种重链恒定区形成。
21.权利要求1的方法，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
22.权利要求2的方法，其中异源多聚体为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
23.权利要求22的方法，其中异源多聚体为双特异性抗体。
24.利用权利要求1或2的方法制备的多肽突变体或异源多聚体。
25.多肽突变体，其包含原始多肽内形成界面的氨基酸残基的修饰，以抑制上述多肽内的缔合。
26.异源多聚体，其包含原始多肽间形成界面的氨基酸残基的修饰，以抑制上述多肽间的缔合。
27.权利要求25的多肽突变体，其中原始多肽能够形成多种构象异构体。
28.权利要求26的异源多聚体，其中原始多肽能够形成多种多聚体。
29.权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰为向该界面导入氨基酸残基的突变，使形成界面的多个氨基酸残基带有同种电荷。
30.权利要求29的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
31.权利要求29的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
32.权利要求29的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
33.权利要求29的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
34.权利要求29的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
35.权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰为向该界面导入氨基酸残基的突变，使存在于界面的形成疏水核的氨基酸残基成为荷电氨基酸残基。
36.权利要求35的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
37.权利要求35的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
38.权利要求35的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
39.权利要求35的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
40.权利要求35的多肽突变体或异源多聚体，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
41.权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体，其中多肽界面由抗体的重链可变区和轻链可变区形成。
42.权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体，其中多肽界面由多种重链可变区形成。
43.权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体，其中多肽界面由抗体的重链恒定区和轻链恒定区形成。
44.权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体，其中多肽界面由多种重链恒定区形成。
45.权利要求25的多肽突变体，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
46.权利要求26的异源多聚体，其中异源多聚体为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
47.权利要求46的异源多聚体，其中异源多聚体为双特异性抗体。
48.组合物，其包括权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体和医药上可接受的载体。
49.核酸，其编码权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体。
50.宿主细胞，其包含权利要求49的核酸。
51.权利要求25的多肽突变体或权利要求26的异源多聚体的制备方法，该制备方法包括：培养权利要求50的宿主细胞的步骤；和自细胞培养物中回收多肽的步骤。
52.调节多肽缔合的方法，该方法包括修饰原始多肽内形成界面的氨基酸残基，以抑制多肽内的缔合。
53.调节异源多聚体缔合的方法，该方法包括修饰原始多肽间形成界面的氨基酸残基，以抑制多肽间的缔合。
54.权利要求52的方法，该方法是在能够形成多种构象异构体的多肽中，修饰多肽内形成界面的氨基酸残基，以抑制形成一种以上构象异构体的多肽的缔合。
55.权利要求53的方法，该方法是在能够形成多种多聚体的异源多聚体中，修饰多肽间形成界面的氨基酸残基，以抑制形成一种以上多聚体的多肽间的缔合。
56.权利要求52或53的方法，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰为向该界面导入氨基酸残基的突变，使形成界面的多个氨基酸残基带有同种电荷。
57.权利要求56的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
58.权利要求56的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
59.权利要求56的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
60.权利要求56的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
61.权利要求56的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
62.权利要求52或53的方法，其中上述形成多肽界面的氨基酸残基的修饰为向该界面导入氨基酸残基的突变，使存在于界面的形成疏水核的氨基酸残基成为荷电氨基酸残基。
63.权利要求62的方法，其中导入的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
64.权利要求62的方法，其中导入的氨基酸残基为天冬氨酸(D)。
65.权利要求62的方法，其中导入的氨基酸残基为赖氨酸(K)。
66.权利要求62的方法，其中导入的氨基酸残基为精氨酸(R)。
67.权利要求62的方法，其中导入的氨基酸残基为组氨酸(H)。
68.权利要求52或53的方法，其中多肽界面由抗体的重链可变区和轻链可变区形成。
69.权利要求52或53的方法，其中多肽界面由多种重链可变区形成。
70.权利要求52或53的方法，其中多肽界面由抗体的重链恒定区和轻链恒定区形成。
71.权利要求52或53的方法，其中多肽界面由多种重链恒定区形成。
72.权利要求52的方法，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
73.权利要求53的方法，其中异源多聚体为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
74.权利要求73的方法，其中异源多聚体为双特异性抗体。
75.抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中以下(1)和(2)的氨基酸残基带有同种电荷：
(1)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6的氨基酸序列中的39位的氨基酸残基；
(2)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的44位的氨基酸残基。
76.抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中以下(1)和(2)的氨基酸残基带有同种电荷：
(1)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6的氨基酸序列中的45位的氨基酸残基；
(2)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的50位的氨基酸残基。
77.抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中以下(1)或(2)中的任一种为荷电氨基酸残基：
(1)重链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：6的氨基酸序列中的45位的氨基酸残基；
(2)轻链可变区所含的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的50位的氨基酸残基。
78.权利要求75或76的抗体，其中上述带有同种电荷的氨基酸残基选自以下(a)或(b)中的任一组所含的氨基酸残基：
(a)谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
79.权利要求77的抗体，其中上述荷电氨基酸残基为：谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)。
80.权利要求75～77中任一项的抗体，其中多肽为多个重链可变区和多个轻链可变区通过接头连接的单链多肽。
81.权利要求75～77中任一项的抗体，其中多肽为，包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
82.权利要求81的抗体，其中多肽为双特异性抗体。
83.组合物，其包括权利要求75～77中任一项的抗体和医药上可接受的载体。
84.核酸，其编码权利要求75～77中任一项的构成抗体的多肽。
85.宿主细胞，其包含权利要求84的核酸。
86.权利要求75～77中任一项的抗体的制备方法，该制备方法包括：培养权利要求85的宿主细胞的步骤；和自细胞培养物中回收多肽的步骤。
87.抗体，其包括多种重链CH3区，其中第1重链CH3区中选自以下(1)～(3)所示氨基酸残基组的一组至三组的氨基酸残基带有同种电荷：
(1)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于356位和439位；
(2)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于357位和370位；
(3)重链CH3区所含的氨基酸残基，按照EU编号位于399位和409位。
88.权利要求87的抗体，其为第2重链CH3区中选自上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的氨基酸残基组，其中对应于上述第1重链CH3区中带有同种电荷的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的一组至三组的氨基酸残基，带有和上述第1重链CH3区中对应的氨基酸残基相反的电荷。
89.权利要求87的抗体，其中上述带有同种电荷的氨基酸残基选自以下(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基：
(a)谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
90.权利要求87的抗体，其中上述第1重链CH3区和第2重链CH3区通过二硫键进行交联。
91.权利要求87的抗体，其为具有多种重链恒定区的抗体。
92.权利要求87的抗体，其为包括多种重链可变区和多种轻链可变区的多特异性抗体。
93.权利要求92的抗体，其为双特异性抗体。
94.组合物，其包括权利要求87的抗体和医药上可接受的载体。
95.核酸，其编码权利要求87的构成抗体的多肽。
96.宿主细胞，其包含权利要求95的核酸。
97.权利要求87的抗体的制备方法，该制备方法包括：培养权利要求96的宿主细胞的步骤；和自细胞培养物中回收多肽的步骤。
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