KR20200130723A - 항체 - Google Patents

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바르트 이 씨 쥐 데 고에이
크리스텔 켐페르
패트릭 엥겔베르츠
에드워드 엔 판 덴 브린크
리크 라데마케르
데니스 베르질
셍 호르바흐
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Abstract

본 발명은 5T4 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는, 5T4에 결합하는 항체에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물 및, 치료 및 진단 절차를 위한, 특히 암 요법에서의 이러한 항체의 용도를 제공한다.

Description

항체
발명의 분야
본 발명은 5T4 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는, 5T4에 결합하는 항체에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물 및, 특히 암 요법에서의, 치료 및 진단 절차를 위한 이러한 항체의 용도를 제공한다.
5T4 (일명 영양막 당단백질 [TPBG] 또는 Wnt-활성화 억제 인자 1 [WAIF1])는 8개의 류신-풍부 반복부 (LRR) 및 7개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 함유하는 72 kDa의 단일-통과 막횡단 단백질이다 (Zhao et al., 2014 Structure 22, 612-620).
5T4 발현은 태반을 제외하고는 정상 성인 조직에서 제한된다 (Southall et al., 1990 Br J Cancer 61, 89-95). 5T4는 신장암, 자궁경부암, 난소암, 폐암, 전립선암 및 결장암을 포함한 다수의 인간 암에서 발현된다 (Stern and Harrop, 2017 Cancer Immunol Immunother 66, 415-426; Southall et al., 1990 Br J Cancer 61, 89-95). 종양 세포에서의 5T4 발현은 1) 상피 → 중간엽 전이의 촉진 (Damelin et al., 2011 Cancer Res 71, 4236-4246; Carsberg et al., 1996 Int J Cancer 68, 84-92), 및 2) 정규 Wnt/베타-카테닌 신호전달 경로의 억제 및 비-정규 Wnt 경로의 활성화 (Kagermeier-Schenk et al., 2011 Dev Cell 21, 1129-1143)에 의해 종양 발달을 구동시킨다.
5T4-표적화 항체 및 5T4-표적화 요법은 5T4를 발현하는 것으로 알려진 몇몇 암 (결장직장암, 폐암 및 신장암을 포함함)에서 임상 활성을 갖는다. 예를 들어, 납투모맙 에스타페나톡스는 조작된 초항원 변이체 SEA/E-120에 유전적으로 융합된 5T4-Fab 모이어티로 이루어진 재조합 융합 단백질이다. 이는 현재 비-소세포 폐암 (NSCLC), 신세포암 (RCC) 및 췌장암에 대한 면역요법으로서 임상 시험 중이다 (예를 들어, 문헌 [Eisen, et al., 2014 Curr Oncol Rep 16, 370]을 참조한다). 또한, 트로백스(TroVax)®는 결장직장암, 전립선암 및 신장암에서 임상 이익을 나타내는, 5T4 구축물 (MVA-5T4)을 발현하는 변형된 우두 앙카라(Ankara)이다 (예를 들어, 문헌 [Stern and Harrop, 2017 Cancer Immunol Immunother 66, 415-426]; [Scurr et al., 2017 JAMA Oncol 12, 10]을 참조한다). 추가의 항-5T4 항체가 WO2007106744, WO03038098, WO2011048369, WO2013041687, WO2017072207에 기술되어 있다.
암의 근절에 대해 상당한 진전이 이루어졌지만, 항체-기반 암 요법의 추가 개선이 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 발명의 목표는 5T4 (영양막 당단백질)에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 항체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 5에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [059]가 5T4에 결합하는 것을 차단할 수 있는 것인 항체를 제공하는 것이다.
항체는 특히 이중특이적 항체일 수 있고, CD3, 예컨대 인간 CD3ε (엡실론), 예컨대 서열식별번호: 4에 상술된 바와 같은 인간 CD3ε (엡실론)에 결합하는 항체의 항원 결합 영역을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 본원에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
b) 본원에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 핵산 구축물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 본원에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
b) 본원에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 핵산 구축물 또는 발현 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 예컨대 질환 치료에서 사용하기 위한 본원에서 정의된 바와 같은 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 항체, 조성물 또는 제약 조성물을 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 항체, 및 키트 사용을 위한 설명서를 포함하는 부분들의 키트에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 항체의 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역에 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: IgG1-5T4-A3-F405L과 조합된 IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 항체 전위. 항체 전위를 옥텟(Octet) HTX 기구 (포르테바이오(ForteBio))에서 생물층 간섭측정법에 의해 결정하였다. IgG1-5T4-A3-F405L을 바이오센서 상에 고정시키고, 인간 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질)를 로딩하였다. 이어서, 로딩된 바이오센서를 IgG1-5T4-A3-F405L, IgG1-5T4-H8-FEAR, IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 또는 IgG1-5T4-226-FEAR에 노출시켰다. 이러한 도면은 제2 항체에 노출되었을 때의 회합 반응 (500초)을 나타낸다. A-C. IgG1-5T4-A3-F405L이 고정된 IgG1-5T4-A3-F405L-5T4ECDHis 복합체에 대한 결합을 나타내지 않았고, 이는 IgG1-5T4-A3-F405L로의 교차-차단 (자가-차단)을 나타낸다. IgG1-5T4-H8-FEAR 항체는 질량 증가를 나타냈고 (고정된 IgG1-5T4-A3-F405L-5T4ECDHis 복합체에 대한 결합을 나타냄), 따라서 IgG1-5T4-A3-F405L로의 교차-차단이 없었다. A. IgG1-5T4-059-FEAR, B. IgG1-5T4-207-FEAR 및 C. IgG1-5T4-226-FEAR 모두가 초기의 질량 증가 (항체가 고정된 IgG1-5T4-A3-F405L-5T4ECDHis 복합체에 결합하는 것을 나타냄)에 이어지는 급속한 질량 감소를 나타냈다. 항체의 이러한 거동은 항체 전위를 나타낸다 (Abdiche YN, et al. (2017) Antibodies Targeting Closely Adjacent or Minimally Overlapping Epitopes Can Displace One Another. PLoS ONE 12(1): e0169535. doi:10.1371/journal.pone.0169535).
도 2: 유동 세포측정법으로 측정된 막-결합 5T4에 대한 5T4 항체의 동시 결합. 5T4 항체 IgG1-5T4-H8-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR을 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 접합시키고, 10 ㎍/mL 미접합 IgG1-5T4-H8-FEAR, IgG1-5T4-A1-F405L, IgG1-5T4-A3-F405L, IgG1-b12, IgG1-5T4-207-FEAR 또는 IgG1-5T4-226-FEAR의 존재 하에 2 ㎍/mL의 농도로 5T4-발현 SK-OV-3 세포에 첨가하였다. FITC-표지 항체의 백분율 결합을 계산하고, 평균 백분율 결합 ± 표준 편차 (SD)로서 도시하였다.
도 3: 전장 인간 및 닭 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 5T4 항체의 결합. 전장 인간 5T4 (서열식별번호: 1) (A) 또는 닭 5T4 (서열식별번호: 3) (B)로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포를 다양한 농도의 IgG1-5T4-A3-F405L, IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 또는 IgG1-5T4-226-FEAR 항체와 함께 인큐베이션하였다. R-피코에리트린 (PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2와 함께 인큐베이션한 후, 평균 형광 강도 (MFI)를 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 음성 대조군으로서, IgG1-b12-K409R (10 ㎍/mL)이 포함되었다.
도 4: 1가 5T4 항체의 내재화 능력. 1개의 Fab-아암으로 5T4를 인식하는 한편, 제2 Fab-아암으로 관련되지 않은 항원 (종양 세포 상에서 발현되지 않는 HIV-1 gp120)을 인식하는 이중특이적, 독소-접합 항체가 미접합 5T4 항체와 항체 당 1개의 듀오스타틴-3 분자가 접합된 (HIV-1 gp120-특이적) IgG1-b12 항체의 제어된 Fab-아암 교환에 의해 생성되었다. MDA-MB-468 (A) 및 HCC1954 (B) 세포를 나타낸 바와 같은 증가하는 농도의 항체와 함께 인큐베이션하였다. 5일 후에 세포 생존율을 측정하였다. 데이터는 3회의 복제 실험의 평균 백분율 생존 세포로서 제시된다. 음성 대조군으로서, 단일특이적, 듀오스타틴-3과 접합된 2가 IgG1-b12 (IgG1-b12-vcDuo3)가 포함되었다.
도 5(i): HEK-293 세포 내로 형질감염된 전장 인간 및 시노몰거스 원숭이 5T4에 대한 CD3×5T4 이중특이적 항체의 결합. 1가 및 2가 5T4 항체의 결합을 전장 인간 (왼쪽 패널) 또는 시노몰거스 원숭이 5T4 (오른쪽 패널)로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포를 사용하여 분석하였다. 세포를 나타낸 바와 같은 증가하는 농도의 항체와 함께 인큐베이션하였다. FITC 접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2로 2차 표지한 후, 유동 세포측정법에 의해 결합을 분석하였다. 음성 대조군 항체로서, IgG1-b12-K409R (3 ㎍/mL)이 포함되었다. 데이터는 2개의 기술적 복제물의 평균 형광 강도 (MFI) 값 ± SD로서 제시된다. A. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 결합. B. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 결합. C. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 결합. D. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-H8-FEAR 및 IgG1-5T4-H8-FEAR의 결합.
도 5(ii): HEK-293 세포 내로 일시적으로 형질감염된 시노몰거스 원숭이 및 인간 5T4에 대한 이중특이적 CD3×5T4 항체의 결합. 5T4 항체의 1가 및 2가 결합을 인간 5T4 (왼쪽 패널) 또는 시노몰거스 원숭이 5T4 (오른쪽 패널)로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포를 사용하여 분석하였다. 세포를 나타낸 바와 같은 증가하는 농도의 항체와 함께 인큐베이션하였다. 피코에리트린 (PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2로 2차 표지한 후, 유동 세포측정법에 의해 결합을 분석하였다. A. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 결합; B. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 결합; C. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 결합; D. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-106-FEAR의 결합; E. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-076-FEAR 및 IgG1-5T4-076-FEAR의 결합; F. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-085-FEAR 및 IgG1-5T4-085-FEAR의 결합; G. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-127-FEAR 및 IgG1-5T4-127-FEAR의 결합; H. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A1-FEAR의 결합; I. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR의 결합.
도 6(i): 5T4-양성 인간 종양 세포에 대한 CD3×5T4 이중특이적 및 5T4 단일특이적 항체의 결합. HeLa 세포 (왼쪽 패널) 또는 MDA-MB-231 세포 (오른쪽 패널)에 대한 5T4 항체의 1가 및 2가 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포를 증가하는 농도의 항체와 함께 인큐베이션하였다. FITC-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2로 2차 표지한 후, 유동 세포측정법에 의해 MFI를 결정하였다. A. HeLa 세포 (왼쪽 패널) 또는 MDA-MB-231 세포 (오른쪽 패널)에 대한 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR 항체의 결합. B. HeLa 세포 (왼쪽 패널) 또는 MDA-MB-231 세포 (오른쪽 패널)에 대한 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR 항체의 결합. C. HeLa 세포 (왼쪽 패널) 또는 MDA-MB-231 세포 (오른쪽 패널)에 대한 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR 항체의 결합. IgG1-b12-K409R (3 ㎍/mL)이 음성 대조군으로서 포함되었다 (흰색 원).
도 6(ii): HeLa 세포에 대한 CD3×5T4 이중특이적 및 5T4 단일특이적 항체의 결합. HeLa 세포에 대한 5T4 항체의 1가 및 2가 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포를 증가하는 농도의 항체와 함께 인큐베이션하였다. 피코에리트린 (PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2로 2차 표지한 후, 유동 세포측정법에 의해 평균 형광 강도 (MFI)를 결정하였다. A. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 결합; B. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 결합; C. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 결합; D. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-106-FEAR의 결합; E. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-085-FEAR 및 IgG1-5T4-085-FEAR의 결합; F. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-127-FEAR 및 IgG1-5T4-127-FEAR의 결합; G. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A1-FEAR의 결합; H. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR의 결합
도 6(iii): MDA-MB-231 세포에 대한 CD3×5T4 이중특이적 및 5T4 단일특이적 항체의 결합. MDA-MB-231 세포에 대한 5T4 항체의 1가 및 2가 결합을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포를 증가하는 농도의 항체와 함께 인큐베이션하였다. PE-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2로 2차 표지한 후, 유동 세포측정법에 의해 평균 형광 강도 (MFI)를 결정하였다. A. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 결합; B. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 결합; C. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 결합; D. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-106-FEAR의 결합; E. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-085-FEAR 및 IgG1-5T4-085-FEAR의 결합; F. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-127-FEAR 및 IgG1-5T4-127-FEAR의 결합; G. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A1-FEAR의 결합; H. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR의 결합.
도 7(i): 정제된 T 세포를 이펙터 세포로 사용하는 MDA-MB-231 세포에서의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내에서의 세포독성의 유도. MDA-MB-231 세포를 증가하는 농도의 CD3×5T4 이중특이적 항체 또는 단일특이적, 2가 5T4 항체 및 8:1의 이펙터:표적 세포 (E:T) 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 공여자 A (왼쪽 패널) 및 공여자 B (오른쪽 패널)의 2명의 상이한 공여자로부터 수득된 정제된 T 세포가 이러한 실험에 사용되었다. 72시간의 인큐베이션 후의 생존 MDA-MB-231 세포의 백분율을 측정함으로써 세포독성을 결정하였다 (% 생존 세포 = [샘플의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도]/[미처리 표적 세포의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도] × 100). A. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 존재 하에 유도된 세포독성; B. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 존재 하에 유도된 세포독성; C. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 존재 하에 유도된 세포독성.
도 7(ii): 정제된 T 세포를 이펙터 세포로 사용하여 MDA-MB-231 세포에서 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 시험관내에서 유도된 세포독성의 IC50 값. MDA-MB-231 세포에서 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR에 의해 유도된 T-세포 매개 세포독성의 IC50 값을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) V7.02 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 2명의 상이한 공여자의 평균 IC50 값 ± SD로서 제시된다.
도 8(i): 시험관내에서의 T 세포를 이펙터 세포로 사용한 MDA-MB-231 세포에서의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 세포독성의 유도. MDA-MB-231 세포를 증가하는 농도의 CD3×5T4 이중특이적 항체 또는 5T4 동종이량체 및 8:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 3명의 상이한 공여자가 이러한 실험에 사용되었다. 제시된 데이터는 시험된 3명의 공여자의 평균 % 생존　±　평균의 표준 오차 (SEM)이다. A. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 매개 세포독성 (생존 감소); B. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 매개 세포독성; C. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 매개 세포독성; D. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-106-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 매개 세포독성; E. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A1-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 매개 세포독성; F. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 매개 세포독성.
도 8(ii): 시험관내에서 T 세포를 이펙터 세포로 사용하여 MDA-MB-231 세포에서 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 세포독성의 IC50 값. MDA-MB-231 세포에서 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 T-세포 매개 세포독성의 IC50 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 3명의 상이한 공여자의 평균 IC50 값 ± SD로서 제시된다. A. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 T-세포 매개 세포독성의 IC50 값; B. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 T-세포 매개 세포독성의 IC50 값.
도 9(i): MDA-MB-231 세포의 존재 하의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T-세포 활성화. MDA-MB-231 세포를 나타낸 바와 같은 증가하는 농도의 CD3×5T4 이중특이적 항체 및 단일특이적, 2가 5T4 항체, 및 8:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 3개의 T 세포 활성화 마커 (PD1 [상부 패널], CD25 [중간 패널] 및 CD69 [하부 패널])의 발현을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 공여자 A (흑색 기호) 및 공여자 B (백색 기호)의 2명의 상이한 공여자가 이러한 실험에 사용되었다. A. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화; B. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화; C. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화.
도 9(ii): MDA-MB-231 세포의 존재 하의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T-세포 활성화의 EC50 값. MDA-MB-231 세포의 존재 하에 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR에 의해 유도된 시험관내 T-세포 활성화 마커 (PD1, CD25 및 CD69)의 EC50 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 2명의 상이한 공여자의 평균 ± SD로서 제시된다.
도 10(i): MDA-MB-231 세포의 존재 하의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T-세포 활성화. MDA-MB-231 세포를 증가하는 농도의 CD3×5T4 이중특이적 항체 및 5T4 동종이량체 및 8:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. CD4+ (왼쪽 패널) 및 CD8+ (오른쪽 패널) T 세포 집단 내의 % CD69+ 세포의 증가에 의해 T-세포 활성화를 측정하였다. 3명의 상이한 공여자가 이러한 실험에 사용되었다; 제시된 데이터는 시험된 3명의 공여자의 평균 % CD69 상향조절 ± SEM이다. A. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화; B. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화; C. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화; D. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-106-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화; E. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A1-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화; F. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR의 존재 하에 유도된 T-세포 활성화.
도 10(ii): MDA-MB-231 세포의 존재 하의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T-세포 활성화의 EC 50 값. MDA-MB-231 세포의 존재 하에 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 시험관내에서 유도된 T-세포 활성화 마커 (CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 내의 CD69+ [A-B], CD25+ [C-D] 및 PD1+ [E-F], CD25 및 CD69 세포의 %의 증가)의 EC50 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 3명의 상이한 공여자의 평균 ± SD로서 제시된다. A. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 CD69 상향조절의 EC50 값; B. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 CD69 상향조절의 EC50 값. C. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 CD25 상향조절의 EC50 값. D. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 CD25 상향조절의 EC50 값. E. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 PD1 상향조절의 EC50 값; F. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR에 의해 유도된 PD1 상향조절의 EC50 값.
도 11: 5T4-양성 종양 세포의 존재 하에 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 T 세포 사이토카인 방출. MDA-MB-231 세포를 0.2 ㎍/mL CD3×5T4 이중특이적 항체 (bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR) 및 5T4 단일특이적 항체 (IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR 또는 IgG1-5T4-059-FEAR) 및 8:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 사이토카인 방출을 U-PLEX 검정법에 의해 분석하였다. A. CD3×5T4 이중특이적 항체 또는 5T4 단일특이적 항체와 함께 72시간 인큐베이션한 후의 T 세포 (공여자 A로부터 유래됨)-종양 세포 공동-배양물의 상청액 내의 IL-10, IL-13 및 TNF의 농도. B. CD3×5T4 이중특이적 항체 또는 5T4 단일특이적 항체와 함께 72시간 인큐베이션한 후의 T 세포 (공여자 B로부터 유래됨)-종양 세포 공동-배양물의 상청액 내의 IL-10, IL-13 및 TNF의 농도.
도 12: 다양한 E:T 비에서 PBMC를 이펙터 세포로 사용한 SK-OV-3 세포에서의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내에서의 세포독성의 유도. SK-OV-3 세포를 증가하는 농도의 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR (왼쪽 패널) 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (오른쪽 패널) 및 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1 및 12:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 PBMC와 함께 인큐베이션하였다. 72시간의 인큐베이션 후의 생존 SK-OV-3 세포의 백분율을 측정함으로써 세포독성을 결정하였다 (% 생존 세포 = [샘플의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도]/[미처리 표적 세포의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도] × 100). 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC가 이러한 실험에 사용되었다: A. 공여자 C 및 B. 공여자 D.
도 13: 다양한 E:T 비에서 T 세포를 이펙터 세포로 사용한 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 SK-OV-3 세포에서의 시험관내에서의 세포독성의 유도. SK-OV-3 세포를 증가하는 농도의 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR (왼쪽 패널) 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (오른쪽 패널) 및 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 72시간의 인큐베이션 후의 생존 SK-OV-3 세포의 백분율을 측정함으로써 세포독성의 효율을 결정하였다 (% 생존 세포 = [샘플의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도]/[미처리 표적 세포의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도] × 100). 2명의 상이한 공여자로부터의 T 세포가 이러한 실험에 사용되었다: A. 공여자 E 및 B. 공여자 F.
도 14. NSG-HIS 마우스에서의 MDA-MB-231 이종이식 모델에서의 CD3×5T4 이중특이적 항체의 항-종양 활성. A. PBS (비히클 대조군), 0.5 mg/kg bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 또는 0.5 mg/kg bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR로의 처리 후의 NSG-HIS 마우스에서의 MDA-MB-231 이종이식 모델에서의 평균 종양 크기. 종양 크기를 캘리퍼 측정에 의해 평가하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. B. PBS, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR로의 처리 후에 종양 크기가 < 500 ㎣인 MDA-MB-231 세포가 주사된 NSG-HIS 마우스의 백분율.
도 15: 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같은, 인간 5T4 ECD의 위치 32 내지 355에 단일 알라닌 돌연변이가 있는 인간 5T4 변이체에 대한 직접적으로 FITC-표지된 5T4-특이적 항체의 결합. 정규화에 사용된 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체 (bsIgG1-5T4-A1-F405Lxb12-FEAR-FITC)에 비교된 결합에서의 변화에 대한 척도로서, Z-점수 (배수 변화)로서 결합이 표현되었다. x축의 숫자는 인간 5T4 (서열식별번호: 1)에서의 아미노산 위치를 지칭한다. 결합에서의 Z-점수가 -1.5 (점선으로 나타냄) 미만인 잔기는 '결합 상실 돌연변이체'로서 간주되었다. 결합에서의 Z-점수가 양수인 잔기는 비-교차 차단 5T4 특이적 대조군 항체 (bsIgG1-5T4-A1-67F-F405Lxb12-FEAR-FITC)에 대한 결합 상실 잔기이다. 아미노산 위치 38, 45, 49, 51, 54, 62, 64, 66, 68, 71, 72, 77, 91, 104, 108, 110, 112, 118, 121, 122, 135, 137, 155, 161, 167, 171, 201, 202, 205, 208, 218, 231, 269, 279, 298, 300, 303, 323, 324, 340 및 344의 잔기는 이러한 위치들이 내인성 알라닌 또는 시스테인을 함유하였기 때문에 평가되지 않았다. 제시된 데이터는 (A) bsIgG1-b12-FEALx5T4-059-FEAR-FITC, (B) bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR-FITC, (C) bsIgG1-b12-FEALx5T4-226-FEAR-FITC, 및 (D) bsIgG1-5T4-A3-F405Lxb12-FEAR-FITC의 결합에 대한 Z-점수이다. 대부분의 표면-노출 결합 상실 잔기로부터 공간적으로 분리될 것으로 예상되는 Z-점수가 -1.5 바로 아래인 매립 잔기들은 배제되었다 (bIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR-FITC의 경우: L281 [Z-점수: -1.57] 및 P326 [Z-점수: -1.54]; 및 bsIgG1-b12-FEALx5T4-226-FEAR-FITC의 경우: L273 [Z-점수: -1.58], L281 [Z-점수:-1.65], N294 [Z-점수:-1.57], L309 [Z-점수:-1.63] 및 P326 [Z-점수:-1.67]).
도 16(i): T 세포를 이펙터 세포로 사용한 상이한 적응증의 종양 세포에서의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내에서의 세포독성의 유도. 종양 세포를 증가하는 농도의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 또는 대조군 항체 (bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR, bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR) 및 4:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 72시간의 인큐베이션 후의 생존 종양 세포의 백분율을 측정함으로써 세포독성 (생존 감소)을 결정하였다. 제시된 데이터는 시험된 적어도 3명의 공여자 중 1명의 대표적인 공여자로부터의 중복 웰의 평균 % 생존 ± SEM이다. A. 췌장암 세포주에서 유도된 세포독성 (생존 감소); B. 자궁경부암 세포주에서 유도된 세포독성 (생존 감소).
도 16(ii): T 세포를 이펙터 세포로 사용하여 상이한 적응증의 종양 세포주에서 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 시험관내에서 유도된 세포독성의 IC50 값. 지시된 적응증의 종양 세포에서 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR에 의해 유도된 T-세포 매개 세포독성의 IC50 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 적어도 3명의 상이한 공여자 (표 10 참조)의 평균 IC50 값 ± SD로서 제시된다.
도 17(i): 상이한 적응증의 종양 세포의 존재 하의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T-세포 활성화. 종양 세포를 증가하는 농도의 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 또는 대조군 항체 (bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR, bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR 및 4:1의 E:T 비의 이펙터 세포로서의 단리된 T 세포와 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. CD4+ (왼쪽 패널) 및 CD8+ (오른쪽 패널) T-세포 집단 내의 CD69 (CD69+ 세포의 %)의 상향조절에 의해 T-세포 활성화를 측정하였다. 제시된 데이터는 시험된 적어도 3명의 공여자 중 1명의 대표적인 공여자로부터의 중복 웰의 평균 % CD69+ 세포 ± SD이다. A. 췌장암 세포주 BxPc-3의 존재 하에 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 T-세포 활성화; B. 췌장암 세포주 PANC-1의 존재 하에 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 T-세포 활성화; C. 자궁경부암 세포주 SiHa의 존재 하에 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 T-세포 활성화; D. 자궁경부암 세포주 Ca Ski의 존재 하에 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 T-세포 활성화.
도 17(ii): 상이한 적응증의 종양 세포주의 존재 하의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내 T-세포 활성화의 EC50 값. 상이한 적응증의 종양 세포주와의 공동-배양에서 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR에 의해 유도된 T-세포 활성화 (CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단 내의 CD69+ 세포의 %)의 EC50 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 적어도 3명의 상이한 공여자 (표 10 참조)의 평균 EC50 값 ± SD로서 제시된다. A. 지시된 종양 세포주의 존재 하에 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR에 의해 유도된 CD4+ T-세포 활성화의 EC50 값; B. 지시된 종양 세포주의 존재 하에 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR에 의해 유도된 CD8+ T-세포 활성화의 EC50 값.
상세한 설명
정의
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 전형적인 생리학적 및/또는 종양-특이적 조건 하에 유의한 기간, 예컨대 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간 이상, 적어도 약 48시간 이상, 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7일 이상 등, 또는 임의의 다른 관련된 기능적으로 정의되는 기간 (예컨대 항원에 대한 항체 결합과 연관된 생리학적 반응을 유도, 촉진, 강화 및/또는 조정하기에 충분한 시간, 및/또는 항체가 내재화되기에 충분한 시간)의 반감기로 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 있는, 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 단편, 또는 그 중 하나의 유도체를 지칭하도록 의도된다. 항원과 상호작용하는 결합 영역 (또는 본원에서 사용될 수 있는 결합 도메인 - 둘 다 동일한 의미임)은 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역을 포함한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체 시스템의 성분 예컨대 고전적인 보체 활성화의 경로의 제1 성분인 C1q를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항체"는 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 뿐만 아니라 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소에 의한 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기술에 의해 제공되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고, 독소에 접합되는 능력을 유지하는 '항체 단편' 또는 '이의 단편' (항원-결합 단편)을 포함한다. 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 항체는 본원에서의 개시내용이 달리 제한되지 않는 한 임의의 아이소타입을 보유할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 항체는, 달리 언급되거나 또는 맥락적으로 명확하게 모순되지 않는 한, 특이적으로 항원에 상호작용하는, 예컨대 결합하는 능력을 유지하는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항체"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) 경쇄 가변 도메인 (VL), 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역 도메인 1 (CH1) 도메인으로 이루어지는 1가 단편, 또는 WO 2007/059782에 기재된 바와 같은 1가 항체인 Fab' 또는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서의 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어지는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고, 도메인 항체 (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90)로도 칭해지는 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 낙타류 또는 나노바디 (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성한 단일 단백질 쇄로서 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여, 이들이 연결될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24] 및 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)]을 참조한다). 이러한 단일쇄 항체는 맥락적으로 달리 언급되거나 또는 명확하게 나타내지 않는 한 용어 항체에 포함된다. 이러한 단편들이 일반적으로 항체의 의미 내에 포함되지만, 총체적으로, 그리고 각각 독립적으로 이들은 상이한 생물학적 성질 및 유용성을 나타내는 본 발명의 독특한 특색이다. 본 발명의 맥락에서의 이러한 항체 단편 및 다른 유용한 항체 단편이 본원에서 추가로 논의된다.
항체는 상이한 시험관내 또는 생체외 발현 또는 생산 시스템으로부터, 예를 들어, 재조합으로 변형된 숙주 세포로부터, 항체를 코딩하는 핵산 서열의 시험관내 전사 및/또는 번역을 지지하는 세포 추출물을 사용하는 하이브리도마 또는 시스템으로부터 생산 및 수집될 수 있다. 다수의 상이한 항체 (항체는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같음)가 상기 언급된 바와 같은 생산 시스템에서 각각의 항체를 개별적으로 생산한 후, 항체를 혼합함으로써, 또는 여러 항체를 동일한 생산 시스템에서 생산함으로써 제공될 수 있는 항체라는 것을 이해하여야 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린 중쇄" 또는 "면역글로불린의 중쇄"는 면역글로불린의 중쇄 중 하나를 지칭하도록 의도된다. 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약기됨) 및 면역글로불린의 아이소타입을 정의하는 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로 약기됨)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인 CH1, CH2, 및 CH3으로 구성된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린"은 한 쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 한 쌍의 중쇄 (H) (4개 모두 잠재적으로 디술피드 결합에 의해 상호-연결됨)인 2개의 폴리펩티드 쇄 쌍으로 이루어지는 일군의 구조적으로 관련된 당단백질을 지칭하도록 의도된다. 면역글로불린의 구조가 잘 특성화되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다). 면역글로불린의 구조 내에서, 2개의 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호-연결된다. 중쇄와 동등하게, 각각의 경쇄는 전형적으로 여러 영역으로 구성된다; 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인 CL로 구성된다. 또한, VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명되는 더욱 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 명명되는 초가변성의 영역 (또는 구조적으로 정의되는 루프의 서열 및/또는 형태 면에서 초가변성일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 전형적으로 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR 서열은 IMGT에 따라 정의된다 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999] 및 [Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)]을 참조한다).
본원에서 사용되는 경우에, 용어 "절반 분자", "Fab-아암" 및 "아암"은 1개의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다. 이중특이적 항체가 제1 항체"로부터 유래된" 절반-분자 항체, 및 제2 항체"로부터 유래된" 절반-분자 항체를 포함하는 것으로 기재되는 경우, 용어 "~로부터 유래된"은 이중특이적 항체가, 임의의 공지된 방법에 의해, 상기 제1 및 제2 항체 각각으로부터의 상기 절반-분자를 생성되는 이중특이적 항체 내로 재조합시킴으로써 생성되었다는 것을 나타낸다. 이러한 맥락에서, "재조합시킴"은 임의의 특정한 재조합 방법에 의한 것에 제한되도록 의도되지 않고, 따라서, 절반-분자 교환에 의해 재조합시키는 것, 뿐만 아니라 핵산 수준에서 및/또는 2개의 절반-분자의 동일한 세포에서의 공동-발현을 통해 재조합시키는 것을 예를 들어 포함하여, 본원에서 하기에서 기재된 이중특이적 항체를 생산하는 방법 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항원-결합 영역" 또는 "결합 영역"은 항원에 결합할 수 있는 항체의 영역을 지칭한다. 항원은 예를 들어 세포, 박테리아, 또는 비리온 상에 존재하는 폴리펩티드와 같은 임의의 분자일 수 있다. 용어 "항원" 및 "표적"은, 맥락적으로 모순되지 않는 한, 본 발명의 맥락에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "항원-결합 영역" 및 "항원-결합 부위"는, 맥락적으로 모순되지 않는 한, 본 발명의 맥락에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "결합을 차단한다" 또는 "항체의 결합을 차단함" 또는 "결합을 교차-차단함" 또는 "결합을 교차-차단한다"는 특정 항원에 결합된 한 항체가 제2 항체가 동일한 항원에 결합하는 것을 방지하거나 또는 그 반대인 상황을 지칭한다. 다른 항체의 부재 하에, 각각의 항체는 유의한 결합 반응에 의해 결정되는 바와 같은 항원에 결합하는 능력을 갖는 반면, 항체 중 하나는 다른 항체가 존재하는 경우에 결합 반응이 결여된다. 한 항체가 또 다른 항체의 결합을 차단하는 능력을, 예를 들어 본 출원의 실시예 3에서, 그리고 문헌 [Abdiche et al.] (Abdiche YN, Malashock DS, Pinkerton A, Pons J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 2009; 386(2): 172-180)에 의해 기술된 바와 같이, 고전적인 샌드위치 에피토프 비닝 검정법 형식으로 생물층 간섭측정법에 의해 결정할 수 있다. 간략하게, 샌드위치 에피토프 비닝 검정법에서, 용액 내의 항체를 고정된 항체를 통해 먼저 포착된 이의 특이적 항원에 결합하는 것에 대해 시험한다. 본 발명의 맥락에서, 한 항체가 하기의 "전위"의 정의에 따라 다른 항체를 "전위"시킬 수 있으면 이는 또 다른 항체의 결합을 차단하지 않는다. 용어 "결합을 차단한다" 및 "항체의 결합을 차단함" 및 "결합을 교차-차단함" 및 "결합을 교차-차단한다"는, 맥락적으로 모순되지 않는 한, 본 발명의 맥락에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 한 항체가 또 다른 항체의 결합을 차단하는 능력은 전장 항체를 사용하여 결정된다.
용어 "전위" 또는 "전위시키는 능력" 또는 "전위시킴"은 2개의 항체가 이들의 특이적 항원에 대한 서로의 결합을 일시적인 3분자성 복합체의 형성을 통해 동역학적으로 변경시킴으로써 항원에 대한 서로의 결합을 교란시키고, 상기 복합체는 한 항체를 항원에 유지시키고 다른 항체를 전위시키는 것에 의해 신속하게 붕괴되는 상황을 지칭한다. 문헌 [Abdiche et al., 2017] (Abdiche YN, Yeung AY, Ni I, Stone D, Miles A, Morishige W, et al. (2017) Antibodies Targeting Closely Adjacent or Minimally Overlapping Epitopes Can Displace One Another. PLoS ONE 12(1): e0169535. doi:10.1371/journal.pone.0169535)에서 항체 전위가 정의된다. 문헌 [Abdiche et al. 2017] 및 본 출원의 실시예 4에 기재된 바와 같이 고전적인 샌드위치 검정법 형식으로 실시간 무표지 바이오센서를 사용하여 생물층 간섭측정법에 의해 항체 전위를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 항체 전위는 IgG 형식인 항체를 사용하여 결정된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "결합"은 항체를 리간드로, 항원을 피분석물로 사용하여 생물층 간섭측정법에 의해 결정되는 경우에, 전형적으로는 1E-6 M 이하, 예를 들어 5E-7 M 이하, 1E-7 M 이하, 예컨대 5E-8 M 이하, 예컨대 1E-8 M 이하, 예컨대 5E-9 M 이하, 또는 예컨대 1E-9 M 이하의 K D에 상응하는 결합 친화도로, 항체가 미리 결정된 항원 또는 표적에 결합하는 것을 지칭하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하는 것에 대한 이의 친화도보다 적어도 10배 더 낮은, 예컨대 적어도 100배 더 낮은, 예를 들어 적어도 1,000배 더 낮은, 예컨대 적어도 10,000배 더 낮은, 예를 들어 적어도 100,000배 더 낮은 K D에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "K D" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하고, k d를 k a로 나눔으로써 수득된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "k d" (초-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 k오프 값 또는 오프-레이트로 또한 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "k a" (M-1 × 초-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 k온 값 또는 온-레이트로 또한 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "5T4"는 5T4라는 명칭의 단백질을 지칭하고, 이는 영양막 당단백질, 5T4 종양태아 항원, 5T4 종양태아 영양막 당단백질, TPBG, WAIF1 및 M6P1로도 지칭된다. 이는 광범위하게 N-연결된 글리코실화 코어가 있는 72-80 kDa 막횡단 단백질이다. 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens))에서, 5T4 단백질은 서열식별번호: 1 (인간 영양막 당단백질: 유니프롯(Uniprot) 수탁 번호 Q13641)에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 서열식별번호: 1에서 제시된 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기 1-31은 신호 펩티드이고, 아미노산 잔기 32-420은 성숙 폴리펩티드이다. 시노몰거스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))에서, 5T4 단백질은 서열식별번호: 2 (유니프롯 수탁 번호 Q4R8Y9)에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 서열식별번호: 2에서 제시된 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기 1-34는 신호 펩티드이고, 아미노산 잔기 35-420는 성숙 폴리펩티드이다. 닭 (갈루스 갈루스(Gallus gallus))에서, 5T4 단백질은 서열식별번호: 3 (유니프롯 수탁 번호 R4GM46)에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 서열식별번호: 3에서 제시된 서열에서, 아미노산 잔기 1-27은 신호 펩티드이고, 아미노산 잔기 28-379는 성숙 폴리펩티드이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CD3"은 T-세포 공동-수용체 단백질 복합체의 일부분이고 4개의 별개의 쇄로 구성된 인간 분화 클러스터 3 단백질을 지칭한다. CD3은 다른 종에서도 발견되고, 따라서, 용어 "CD3"은 맥락적으로 모순되지 않는 한 인간 CD3에 제한되지 않는다. 포유동물에서, 복합체는 CD3γ (감마) 쇄 (인간 CD3γ 쇄 유니프롯KB/스위스-프롯(Swiss-Prot) 번호 P09693, 또는 시노몰거스 원숭이 CD3γ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 Q95LI7), CD3δ (델타) 쇄 (인간 CD3δ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 P04234, 또는 시노몰거스 원숭이 CD3δ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 Q95LI8), 2개의 CD3ε (엡실론) 쇄 (인간 CD3ε 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 P07766; 아미노산 잔기 1-22는 신호 펩티드이고, 아미노산 잔기 23-207은 성숙 CD3ε 폴리펩티드이며, 이는 본원에서 서열식별번호: 4로 식별된다; 시노몰거스 원숭이 CD3ε 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 Q95LI5; 또는 리서스 원숭이 CD3ε 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 G7NCB9), 및 CD3ζ-쇄 (제타) 쇄 (인간 CD3ζ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 P20963, 시노몰거스 원숭이 CD3ζ 유니프롯KB/스위스-프롯 번호 Q09TK0)를 함유한다. 이러한 쇄들은 T-세포 수용체 (TCR)로 공지된 분자와 회합되고, T 림프구에서 활성화 신호를 생성시킨다. TCR 및 CD3 분자가 함께 TCR 복합체를 구성한다.
용어 "항체 결합 영역"은 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 항원의 영역을 지칭한다. 항체 결합 영역은 생물층 간섭측정법을 사용하여 에피토프 비닝에 의해, 알라닌 스캔에 의해, 또는 셔플 검정법 (항원의 영역이 또 다른 종의 것으로 교환된 항원 구축물을 사용하고, 항체가 여전히 항원에 결합하는지 또는 그렇지 않은지 여부를 결정함)에 의해 결정될 수 있다. 수소/중수소 교환 질량 분광법 및 자신의 항원에 결합된 항체의 결정학에 의해 항체와의 상호작용에서 수반되는 항체 결합 영역 내의 아미노산이 결정될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 결정기를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산, 당 측쇄 또는 이의 조합물과 같은 분자의 표면 군체화로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체형상 및 비-입체형상 에피토프는 전자에 대한 결합은 변성 용매의 존재 하에 상실되지만, 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에서 직접적으로 수반되는 아미노산 잔기, 및 결합에서 직접적으로 수반되지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 항체가 항원에 결합되는 경우에 항체에 의해 효과적으로 차단 또는 커버되는 아미노산 잔기 (달리 말하면, 이러한 아미노산 잔기는 특이적 항체의 발자국 내에 있거나 또는 이에 밀접하게 인접한다)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체", "모노클로날 Ab", "모노클로날 항체 조성물", "mAb" 등은 단일한 분자 조성의 항체 분자들의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일한 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일한 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소멀 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 재조합으로 변형된 숙주 세포, 또는 항체를 코딩하는 핵산 서열의 시험관내 전사 및/또는 번역을 지지하는 세포 추출물을 사용하는 시스템으로부터 생산될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 면역글로불린 클래스 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 또는 이의 임의의 동종이형, 예컨대 IgG1m(za) 및 IgG1m(f))를 지칭한다. 추가로, 각각의 중쇄 아이소타입은 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄와 조합될 수 있다.
본원에서 사용된 경우의 용어 "전장 항체"는 그러한 아이소타입의 야생형 항체의 중쇄-경쇄 쌍에서 정상적으로 발견되는 모든 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인을 각각 함유하는, 중쇄 및 경쇄의 1개 또는 2개의 쌍을 포함하는 항체 (예를 들어, 모체 또는 변이체 항체)를 지칭한다. 전장 변이체 항체에서, 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인은 전장 모체 또는 야생형 항체에 비교할 때 항체의 기능적 성질을 개선시키는 아미노산 치환을 특히 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 (i) CDR 서열을 완전한 중쇄 서열 및 완전한 경쇄 서열을 포함하는 적절한 벡터 내로 클로닝하는 단계, 및 (ii) 적절한 발현 시스템에서 완전한 중쇄 및 경쇄 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다. CDR 서열 또는 전체 가변 영역 서열로부터 시작했을 때 전장 항체를 생산하는 것은 통상의 기술자의 지식 내에 속한다. 따라서, 통상의 기술자는 본 발명에 따른 전장 항체를 생산하는 방법을 알 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 프레임워크 영역 및 인간 면역글로불린 불변 도메인이 있는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 또 다른 비-인간 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그래프팅된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인, 및 인간 가변 도메인에 대한 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된 비-인간 가변 도메인을 함유하는, 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는 함께 항원 결합 부위를 형성하는 6개의 비-인간 항체 상보성-결정 영역 (CDR)을 상동성 인간 어셉터 프레임워크 영역 (FR) 상에 그래프팅시킴으로써 달성될 수 있다 (WO92/22653 및 EP0629240을 참조한다). 모체 항체의 결합 친화성 및 특이성을 완전히 재구성시키기 위해, 모체 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 인간 프레임워크 영역 내로의 치환 (역-돌연변이)이 요구될 수 있다. 구조적 상동성 모델링이 항체의 결합 성질에 중요한 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 비-인간 아미노산 서열로의 하나 이상의 아미노산 역-돌연변이를 임의적으로 포함하는 주로 인간형인 프레임워크 영역, 및 완전히 인간형인 불변 영역을 포함할 수 있다. 임의적으로, 반드시 역-돌연변이일 필요는 없는 추가적인 아미노산 변형이 바람직한 특성, 예컨대 친화성 및 생화학적 성질이 있는 인간화 항체를 수득하기 위해 적용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "Fc 영역"은, 항체의 N-말단 끝부분에서 C-말단 끝부분으로의 방향으로, 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 영역을 지칭한다. 항체의 Fc 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체 시스템의 성분을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "힌지 영역"은 면역글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 기재된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 216-230에 상응한다. 그러나, 힌지 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 아유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CH1 영역" 또는 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH1 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 인간 IgG1 항체의 CH1 영역은 동일 문헌 [Kabat]에 기재된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 118-215에 상응한다. 그러나, CH1 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 아유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 동일 문헌 [Kabat]에 기재된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 아유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 동일 문헌 [Kabat]에 기재된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 341-447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 아유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "Fc-매개 이펙터 기능"은 폴리펩티드 또는 항체가 세포 막 상의 자신의 표적 또는 항원에 결합하는 것의 결과인 기능을 지칭하도록 의도되고, 여기서 Fc-매개 이펙터 기능은 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역에 기인한다. Fc-매개 이펙터 기능의 예는 (i) C1q 결합, (ii) 보체 활성화, (iii) 보체-의존적 세포독성 (CDC), (iv) 항체-의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC), (v) Fc-감마 수용체 (FcgR)-결합, (vi) 항체-의존적, FcγR-매개 항원 가교, (vii) 항체-의존적 세포성 포식작용 (ADCP), (viii) 보체-의존적 세포성 세포독성 (CDCC), (ix) 보체-강화 세포독성, (x) 항체에 의해 매개되는 옵소닌화 항체의 보체 수용체에 대한 결합, (xi) 옵소닌화, 및 (xii) (i) 내지 (xi) 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "불활성", "불활성인" 또는 "비-활성화"는 적어도 임의의 FcγR에 결합할 수 없거나, FcγR의 Fc-매개 가교를 유도할 수 없거나, 또는 개별적인 항체의 2개의 Fc 영역을 통한 표적 항원의 FcγR-매개 가교를 유도할 수 없거나, 또는 C1q에 결합할 수 없는 Fc 영역을 지칭한다. 단일특이적 또는 이중특이적 형식의 항체를 사용하여 항체의 Fc 영역의 불활성을 시험할 수 있다.
항체의 맥락에서 사용된 경우의 용어 "전장"은 항체가 단편이 아니라, 자연에서 특정 아이소타입에 대해 정상적으로 발견되는 특정 아이소타입의 모든 도메인, 예를 들어 IgG1 항체에 대한 VH, CH1, CH2, CH3, 힌지, VL 및 CL 도메인을 함유한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "1가 항체"는 오직 1개의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 1개의 Fab 아암)으로 항원 상의 특이적 에피토프와 상호작용할 수 있는 항체 분자를 지칭한다. 이중특이적 항체의 맥락에서, "1가 항체 결합"은 이중특이적 항체가 오직 1개의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 1개의 Fab 아암)으로 항원 상의 1개의 특이적 에피토프에 결합하는 것을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "단일특이적 항체"는 1개의 에피토프에 대해서만 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 단일특이적 1가 항체 (즉, 1개의 항원 결합 영역만 보유함) 또는 단일특이적 2가 항체 (즉, 2개의 동일한 항원 결합 영역을 갖는 항체)일 수 있다.
용어 "이중특이적 항체"는 2개의 동일하지 않은 항원 결합 도메인, 예를 들어, 2개의 동일하지 않은 Fab-아암 또는 동일하지 않은 CDR 영역이 있는 2개의 Fab-아암을 갖는 항체를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는다. 이러한 에피토프들은 동일한 또는 상이한 항원 또는 표적 상에 있을 수 있다. 에피토프들이 상이한 항원 상에 있는 경우, 이러한 항원들은 동일한 세포 또는 상이한 세포, 세포 유형 또는 구조물, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 소포 및 가용성 단백질 상에 있을 수 있다. 따라서 이중특이적 항체는 다중 항원, 예를 들어 2개의 상이한 세포를 가교시킬 수 있다.
용어 "2가 항체"는 1개 또는 2개의 표적 또는 항원 상의 에피토프들에 결합하거나 또는 동일한 항원 상의 1개 또는 2개의 에피토프에 결합하는 2개의 항원 결합 영역이 있는 항체를 지칭한다. 따라서, 2가 항체는 단일특이적 2가 항체 또는 이중특이적 2가 항체일 수 있다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 제한적으로 이해되지 않아야 한다. 아미노산은 각각의 아미노산에 대해 특이적인 측쇄 (R 기)와 함께 아민 (-NH2) 및 카르복실 (-COOH) 관능기를 함유하는 유기 화합물이다. 본 발명의 맥락에서, 아미노산은 구조 및 화학적 특성에 기초하여 분류될 수 있다. 따라서, 아미노산의 클래스가 하기 표 중 하나 또는 둘 다에서 반영될 수 있다:
R 기의 구조 및 일반적인 화학적 특성에 기초하여 하는 주요 분류
Figure pct00001
아미노산 잔기의 대안적인 물리적 및 기능적 분류
Figure pct00002
한 아미노산이 또 다른 것을 치환하는 것은 보존적 또는 비-보존적 치환으로 분류될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "보존적 치환"은 한 아미노산이 유사한 구조 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것, 예컨대 한 아미노산 잔기가 상기 2개의 표 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 동일한 클래스의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다: 예를 들어, 류신이 이소류신으로 치환될 수 있는데, 이들이 둘 다 지방족의 분지된 소수성 물질이기 때문이다. 유사하게, 아스파르트산이 글루탐산으로 치환될 수 있는데 둘 다 음으로 하전된 소형 잔기이기 때문이다.
본 발명의 맥락에서, 항체에서의 치환은 하기와 같이 나타낸다:
원래의 아미노산 - 위치 - 치환된 아미노산;
아미노산에 대한 널리 인식된 명명법을 참조로, 임의의 아미노산 잔기를 지시하기 위한 코드 "Xaa" 또는 "X"를 포함하여, 3문자 코드 또는 1문자 코드가 사용된다. 따라서, Xaa 또는 X는 전형적으로 20개의 천연 발생 아미노산 중 임의의 것을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "천연 발생"은 하기 아미노산 잔기 중 어느 하나를 지칭한다; 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 메티오닌, 및 시스테인. 따라서, 표기법 "K409R" 또는 "Lys409Arg"는 항체가 아미노산 위치 409에서 리신이 아르기닌으로 치환된 것을 포함한다는 것을 의미한다.
소정의 위치의 아미노산이 임의의 다른 아미노산으로 치환되는 것은 하기와 같이 지칭된다:
원래의 아미노산 - 위치; 또는 예를 들어 "K409"
원래의 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 1개를 초과하는, 그러나 모두는 아닌 아미노산(들)을 포함할 수 있는 변형의 경우, 1개를 초과하는 아미노산이 "," 또는 "/"에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 위치 409에서 리신이 아르기닌, 알라닌 또는 페닐알라닌으로 치환되는 것은 하기와 같다:
"Lys409Arg,Ala,Phe" 또는 "Lys409Arg/Ala/Phe" 또는 "K409R,A,F" 또는 "K409R/A/F" 또는 "K409 → R, A, 또는 F".
이러한 지칭은 본 발명의 맥락에서 상호교환가능하게 사용될 수 있지만, 동일한 의미 및 목적을 갖는다.
추가로, 용어 "치환"은 임의의 1개 또는 다른 19개의 천연 아미노산, 또는 다른 아미노산, 예컨대 비-천연 아미노산으로의 치환을 포괄한다. 예를 들어, 위치 409에서의 아미노산 K의 치환은 하기의 치환 각각을 포함한다: 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409G, 409H, 409I, 409L, 409M, 409N, 409Q, 409R, 409S, 409T, 409V, 409W, 409P, 및 409Y. 그런데, 이는 지칭 409X [식 중, X는 원래의 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 명시함]와 등가이다. 이러한 치환은 K409A, K409C 등, 또는 K409A,C 등, 또는 K409A/C/ 등으로 지칭될 수도 있다. 이러한 치환 중 어느 하나를 본원에서 구체적으로 포함하기 위해, 본원에서 언급된 각각의 모든 위치에 대해 유추에 의해 동일하게 적용된다.
본 발명에 따른 항체는 또한 아미노산 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 결실은 "del"로 표기될 수 있고, 예를 들어, K409del로 적는 것을 포함한다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 위치 409의 리신은 아미노산 서열로부터 결실되었다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하도록 의도된다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 또한 지칭하도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모체 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들어, 트랜스펙토마, 예컨대 CHO 세포, HEK-293 세포, Expi293F 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, 및 림프구 세포, 및 원핵생물 세포 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 진핵생물 숙주 예컨대 식물 세포 및 진균을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "트랜스펙토마"는 항체 또는 표적 항원을 발현하는 재조합 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, HEK-293 세포, Expi293F 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함하는 진균을 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)의 니들(Needle) 프로그램, 바람직하게는 버전 5.0.0 또는 이후 버전에서 실행되는 바와 같은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성이 결정된다. 사용된 파라미터는 갭 오픈 페널티 10, 갭 확장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 행렬이다. "최장 동일성" (-노브리프(nobrief) 옵션을 사용하여 수득됨)으로 표지된 니들 결과가 퍼센트 동일성으로 사용되고, 하기와 같이 계산된다:
(동일한 잔기 × 100)/(정렬 길이 - 정렬 내의 갭의 총수).
또한 또는 대안적으로 유사한 잔기의 보유를 BLAST 프로그램 (예를 들어, 표준 설정 BLOSUM62, 오픈 갭=11 및 확장 갭=1을 사용하는 NCBI를 통해 입수가능한 BLAST 2.2.8)을 사용하여 결정된 바와 같은 유사성 점수에 의해 측정할 수 있다. 적절한 변이체는 전형적으로 모체 서열에 대해 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 55%, 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 이를 초과하는 % (예를 들어, 약 99%)의 유사성을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "내재화된" 또는 "내재화"는 분자 예컨대 본 발명에 따른 항체가 세포 막에 의해 포식되고 세포의 내부로 들어가는 생물학적 프로세스를 지칭한다. 내재화는 "세포내이입"으로 지칭될 수도 있다.
항체
제1 측면에서, 본 발명은 5T4 (영양막 당단백질)에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체이고, 여기서 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단할 수 있는 항체를 제공한다:
a) 서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [059],
b) 서열식별번호: 12에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 16에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [076],
c) 서열식별번호: 19에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 23에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [085],
d) 서열식별번호: 26에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 30에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [106],
e) 서열식별번호: 33에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 37에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [127],
f) 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [207]; 및
g) 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 51에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [226].
특히, 본 발명은 5T4 (영양막 당단백질)에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 항체는 서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [059]가 5T4에 결합하는 것을 차단할 수 있는 것인 항체를 제공한다.
항체는 특히
a) 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [207],
b) 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 51에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [226]; 및
서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [059]
로 이루어진 군으로부터 선택된 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단할 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 항체는
a) 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [207]; 및
b) 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 51에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [226]
로 이루어진 군으로부터 선택된 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 인간 (호모 사피엔스) 5T4에 대한 특이성 또는 이에 결합하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본원에서 언급된 바와 같은 5T4는 특히 인간 5T4, 예컨대 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드일 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 항체는 시노몰거스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스) 5T4에 대한 특이성 또는 이에 결합하는 능력, 예컨대 인간 및 시노몰거스 원숭이 5T4 둘 다에 대한 특이성 또는 이에 결합하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 시노몰거스 원숭이 5T4는 특히 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드일 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 닭 (갈루스 갈루스) 5T4에 대한 특이성 또는 이에 결합하는 능력, 예컨대 인간 5T4 및 닭 5T4에 대한 특이성 또는 이에 결합하는 능력 또는 인간, 시노몰거스 원숭이 및 닭 5T4에 대한 특이성 또는 이에 결합하는 능력을 갖고, 여기서 닭 5T4는 특히 서열식별번호: 3의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 인간 5T4 예컨대 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 및 시노몰거스 원숭이 5T4, 예컨대 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드에 대한 특이성을 가질 수 있거나 또는 이에 결합할 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 항체는 인간 5T4, 예컨대 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드, 시노몰거스 원숭이 5T4 예컨대 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드 및 닭 5T4, 예컨대 서열식별번호: 3의 성숙 폴리펩티드에 대한 특이성을 가질 수 있거나 또는 이에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 1E-7 M 이하의 K D 값, 예컨대 약 1E-7 M 이하, 5E-8 M 이하, 약 5E-8 M 이하, 1E-8 M 이하, 약 1E-8 M 이하, 5E-9 M 이하, 약 5E-9 M 이하, 예컨대 1E-9 M 이하 또는 예컨대 약 1E-9 M 이하의 K D 값에 상응하는 결합 친화도로, 예컨대 1E-7 내지 5E-10 M의 범위 내, 예컨대 약 1E-7 내지 약 5E-10 M, 예컨대 1E-7 내지 1E-9 M, 예컨대 약 1E-7 내지 약 1E-9 M, 예컨대 5E-8 내지 5E-10 M, 예컨대 약 5E-8 내지 약 5E-10 M, 예컨대 5E-8 내지 1E-9 M, 예컨대 약 5E-8 내지 약 1E-9 M, 예컨대 1E-8 내지 5E-10 M, 예컨대 약 1E-8 내지 약 5E-10 M, 예컨대 1E-8 내지 1E-9 M, 예컨대 약 1E-8 내지 약 1E-9 M, 예컨대 1E-8 내지 5E-9 M 또는 예컨대 약 1E-8 내지 약 5E-9 M의 범위 내인 K D 값에 상응하는 결합 친화도로 인간 5T4, 시노몰거스 원숭이 및/또는 닭 5T4에 결합할 수 있다.
자신의 표적에 결합하는 것에 대한 항체의 친화도를 결정하는 것은 통상의 기술자의 능력 내에 속하지만, 5T4에 대한 본 발명에 따른 항체의 결합 친화도는 특히 생물층 간섭측정법에 의해, 임의적으로는 본원에서 실시예 2에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 항체의 결합 친화도를
I) 항체를 1 ㎍/mL의 양으로 600초 동안 항-인간 IgG Fc 포착 바이오센서 상에 고정시키는 단계;
II) 100 nM 내지 1.56 nM 범위의 2배 희석 시리즈를 사용하여, 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질) 또는 시노몰거스 원숭이 5T4 (서열식별번호: 2의 성숙 단백질), 또는 재조합 시노몰거스 원숭이 5T4 단백질 (쿠사바이오(Cusabio); 카탈로그 번호 CSB-MP024093MOV)의 200초의 기간에 걸친 회합 및 1000초의 기간에 걸친 해리를 결정하는 단계;
III) 데이터를 완충제 대조군 (0 nM)에 대조하는 단계
를 포함하는 절차, 예컨대 생물층 간섭측정법 절차를 사용하여 결정할 수 있다.
특히 본 발명에 따른 항체의 결합 친화도는 단일특이적 2가 항체인 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체, 예컨대 전장 IgG1인 항체를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 항체는 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역 또는 결합 부위를 인식하거나 또는 이에 결합하고, 상기 결합 부위 또는 에피토프 또는 항체 결합 영역은
a) 서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [059],
b) 서열식별번호: 12에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 16에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [076],
c) 서열식별번호: 19에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 23에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [085],
d) 서열식별번호: 26에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 30에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [106],
e) 서열식별번호: 33에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 37에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [127],
f) 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [207]; 및
g) 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 51에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [226]
로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중 어느 하나에 의해 인식된다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는
a) 서열식별번호: 87에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [H8],
b) 서열식별번호: 83에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 84에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [A1]; 및
c) 서열식별번호: 85에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [A3]
로 이루어진 군으로부터 선택된 항체에 의해 결합되는 항체 결합 영역, 결합 부위 또는 에피토프가 아니거나 또는 이러한 항체에 의해 결합되는 항체 결합 영역, 결합 부위 또는 에피토프와 상이한, 5T4 상의 항체 결합 영역, 결합 부위 또는 에피토프를 인식하거나 또는 이에 결합한다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체가 5T4에 결합하는 것은 서열식별번호: 85에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [A3]가 5T4에 결합하는 것에 의해 차단된다. 각각 서열식별번호: 85 및 86에 기재된 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 WO2007106744에 개시된 3개의 뮤린 5T4 항체 중 하나인 항체 A3이다. 부연 설명: 단일 아미노산 치환이 있는 항체 A3. CDR 서열에서?
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 또는 5T4의 His-태그 세포외 도메인 (예를 들어 5T4ECDHis/서열식별번호: 99의 성숙 단백질)에 결합된 항체의 전위를 나타내고, 5T4에 결합된 상기 항체는 서열식별번호: 85에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역 [A3]을 포함한다. 이러한 전위 거동은 본 발명의 항체가 항체 A3이 결합하는 에피토프와 상이하지만, A3이 결합하는 에피토프에 인접할 수 있거나 또는 심지어 이와 중첩될 수 있는 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
"전위" 또는 결합된 항체를 전위시키는 능력을 생물층 간섭측정법 검정법에서, 예컨대 본 출원의 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행되는 검정법에서 결정할 수 있다.
"교차-차단", 또는 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하는 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 항체의 능력을 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 검정법을 사용함으로써, 예컨대 실시예 5에서 기술된 바와 같이 수행되는 검정법에서 결정할 수 있다.
특히, "교차-차단", 또는 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하는 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 항체의 능력은 접합 항체의 결합을 차단하는 미접합 항체의 능력으로서 결정되고, 임의적으로,
i) 각각의 샘플이 인간 난소 선암종 SK-OV-3 세포, 5T4에 결합하고 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 접합된 항체, 및 5T4를 표적화하는 과량의 미접합 항체의 혼합물을 포함하는 샘플 세트를 제공하는 단계,
ii) 샘플을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후, 샘플을 원심분리에 적용하는 단계,
iii) 각각의 샘플로부터 상청액을 제거하고, 세포를 완충제에 재현탁시키고, 유동 세포측정기를 사용하여 FITC의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정하는 단계; 및
iv) FITC-접합 항체 및 미접합 항체의 혼합물과 함께 인큐베이션된 세포와 FITC-접합 또는 미접합 항체 없이 인큐베이션된 세포 사이의 MFI 차이에 100을 곱한 후, FITC-접합 항체 및 IgG-b12 항체의 혼합물과 함께 인큐베이션된 세포와 FITC-접합 또는 미접합 항체 없이 인큐베이션된 세포 사이의 MFI 차이로 나눔
과 같이 결합 백분율을 계산하는 단계
를 포함하는 절차에서 결정된다.
통상의 기술자는 또 다른 항체가 자신의 표적에 결합하는 것을 차단하거나 또는 자신의 표적에 결합된 또 다른 항체를 전위시키는 항체의 능력을 결정하기 위한 적절한 기술에 익숙할 것이지만, 본 출원은 결합 차단 및 전위를 결정하는 데 적절한 절차를 개시한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하거나 또는 5T4에 결합된 또 다른 항체를 전위시키는 본 발명에 따른 항체의 능력을 생물층 간섭측정법을 사용하여, 예컨대 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행되는 생물층 간섭측정법에서 결정할 수 있다.
특히, 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하거나 또는 5T4에 결합된 또 다른 항체를 전위시키는 본 발명에 따른 항체의 능력이
i) 본 발명에 따른 항체를 10 mM 아세트산나트륨 완충제 중 20 ㎍/mL의 양으로 활성화된 아민-반응성 2세대 바이오센서에 고정시키는 단계,
ii) 고정된 항체가 있는 바이오센서를 에탄올아민 pH 8.5에서 켄칭시키는 단계,
iii) 고정된 항체가 있는 바이오센서를 3.6 ㎍/mL (100 nM)의 인간 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질)를 포함하는 조성물에 500초의 기간 동안 함침시키는 단계, 및
iv) 그 후, 고정된 항체 및 5T4ECDHis가 있는 바이오센서를 5T4를 표적화하는 10 ㎍/mL의 다른 항체를 포함하는 조성물에 함침시키고, 500초의 기간에 걸쳐 회합 반응을 결정하는 단계
를 포함하고, 단계 i)-iv)가 30℃의 온도에서 1000 rpm으로 진탕시키면서 수행되는 절차에서 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 제공되는 항체는 아미노산 잔기 R73, Y92 및 R94를 포함하는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
아미노산 잔기 S69, R73, Y92 및 R94를 포함하는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체가 또한 본원에서 제공된다.
아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94 및 N95를 포함하는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체가 본원에서 추가로 제공된다.
본원의 실시예 16에서 제공된 결과에 기초하여, 이론에 의해 제한되는 것을 원치 않으면서, 이러한 아미노산 잔기들 (즉 S69, R73, T74, Y92, R94 및 N95) 중 임의의 하나 이상이, 예컨대 (예를 들어, 항체의 CDR 서열 내의 아미노산 잔기와의) 비-공유결합 상호작용에 의해, 항체의 결합에서 직접적으로 수반되는 것으로 가정된다. 이러한 가정은 문헌 [Zhao, Y., Malinauskas, T., Harlos, K., & Jones, E. Y. (2014). Structural insights into the inhibition of Wnt signaling by cancer antigen 5T4/Wnt-activated inhibitory factor 1. Structure, 22(4), 612-620]에서 공개된 바와 같이 이러한 잔기들이 5T4의 구조 (4cnm; RCSB PDB 단백질 데이터 뱅크; DOI: 10.2210/pdb4CNM/pdb에서 제공됨) 상에서 표면에 노출되는 것으로 확인되었다는 사실에 의해 뒷받침된다.
하기의 추가적인 아미노산 잔기 중 하나 이상이, 예를 들어, 단백질 폴딩 및/또는 항체의 결합에서 직접적으로 수반되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 위치결정에 영향을 미치는 것에 의해, 항체의 결합에서 수반될 수 있고, 예컨대 간접적으로 수반될 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다: L89, F111, L117, F138, L144, D148, N152. 특히, L89, F111, L117, F138, L144가 문헌 [Zhao et al., Structure, 22(4), 612-620]에 기재된 바와 같이 5T4 내의 소수성 코어의 일부로서 확인되었다.
추가로, 본원에 개시된 항체는 아미노산 잔기 R73, Y92 및 R94가 항체의 결합에서 직접적으로 수반되고, 아미노산 잔기 F111, F138, L144 및 D148 중 하나 이상이 상기 결합에서 간접적으로 수반되는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
본원에서 제공되는 항체는 아미노산 잔기 S69, R73, Y92 및 R94가 항체의 결합에서 직접적으로 수반되고, 아미노산 잔기 F111, F138, 및 D148 중 하나 이상이 상기 결합에서 간접적으로 수반되는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
또한, 본 개시내용은 아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94 및 N95가 항체의 결합에서 직접적으로 수반되고, 아미노산 잔기 F138이 상기 결합에서 간접적으로 수반되는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체를 제공한다.
상기 에피토프 또는 항체 결합 영역에 의해 포함되는 아미노산 잔기 및 임의적으로는 결합에서 간접적으로 수반되는 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기는 서열식별번호: 1에 기재된 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 5T4의 알라닌 스캐닝에 의해, 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355를 포함하는 폴리펩티드의 알라닌 스캐닝에 의해 확인될 수 있다.
알라닌 스캐닝은 특히 본원에서 실시예 16에서 기재된 바와 같이 또는 본질적으로 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
추가로, 알라닌 스캐닝은
i) 각각의 돌연변이체 또는 야생형 5T4에 대해 70-90,000개의 세포, 예컨대 80,000개의 세포를 포함하는 샘플이 제공되도록, 시스테인 및 알라닌을 제외한 인간 5T4의 세포외 도메인 내의 모든 아미노산 잔기 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355에 상응함)가 개별적으로 알라닌으로 치환된 돌연변이체 인간 5T4 폴리펩티드, 및 야생형 5T4 폴리펩티드 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355)를 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 HEK 293 세포에서 개별적으로 발현시키는 단계,
ii) 각각의 샘플 내의 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합 항체에 접합된 20 ㎕의 상기 항체 (3 ㎍/mL; FACS 완충제 중)와 함께 40분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 각각의 샘플을 150-180 ㎕ FACS 완충제 (포스페이트-완충 염수 [PBS; 론자(Lonza), 카탈로그 번호 BE17-517] + 0.1% [w/v] BSA [로슈(Roche), 카탈로그 번호 10735086001] + 0.02% [w/v] 아지드화나트륨 [NaN3; 에멜카 바이오사이언스(EMELCA Bioscience), 카탈로그 번호 41920044-3])에서 2회 세정하고, 각각의 샘플 내의 세포를 30 ㎕ FACS 완충제에 재현탁시키는 단계,
iii) 각각의 샘플에 대해, 상기 샘플 내의 생존 단일 세포 집단에 대한 형광 강도의 기하 평균 (gMFI)으로서 세포 당 결합된 항체의 평균량을 결정하고, 하기 식을 사용하여 각각의 시험 항체에 대한 데이터를 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체의 결합 강도에 대해 정규화하는 단계이며:
Figure pct00003
[식 중, '아미노산 위치'는 알라닌으로 돌연변이된 위치를 지칭함],
여기서 Z-점수가 하기 계산에 따라 항체 결합의 상실 또는 획득을 표현하도록 계산되고:
Figure pct00004
[식 중, μ 및 σ는 각각 모든 돌연변이체로부터 계산된 정규화된 gMFI의 평균 및 표준 편차임],
특정 5T4 돌연변이체에 대한 대조군 항체의 gMFI가 평균 gMFI대조군 항체 - 2.5 × 평균 gMFI대조군 항체의 SD (모든 돌연변이체로부터의 것)보다 낮으면 데이터가 분석으로부터 배제되고, 임의적으로
잔기가 -1.5 바로 아래 (예를 들어 -1.5 내지 -1.8, 예컨대 -1.5 내지 -1.7 또는 예컨대 -1.5 내지 -1.6)의 Z-점수로 결합하고, 이러한 잔기가 매립되고, 표면에 노출될 것으로 예상되고 이에 대한 결합 상실 또는 결합 감소가 결정되는 대부분의 잔기로부터 공간적으로 분리될 것으로 예상되면, 데이터가 분석으로부터 배제되는 것인 단계
를 포함하는 절차에 의해 수행될 수 있다.
단계 iii)에서 사용될 적절한 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체는
- 서열식별번호: 83에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 84에 기재된 바와 같은 VL 서열 [A1]을 포함하는 항원-결합 영역; 및
- 서열식별번호: 97에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 98에 기재된 바와 같은 VL 서열 [B12]을 포함하는 항원 결합 영역
을 포함하는 이중특이적 항체이다.
본 발명은 아미노산 잔기 R73, Y92 및 R94 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 항체를 제공한다.
특히, 항체는 아미노산 잔기 S69, R73, Y92 및 R94 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
추가로, 항체는 아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94 및 N95 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
또한, 본원에 개시된 항체는 아미노산 잔기 L89, F111, L117, F138, L144, D148, N152 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
추가로, 항체는 아미노산 잔기 R73, Y92, R94, F111, F138, L144 및 D148 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
항체는 아미노산 잔기 S69, R73, Y92, R94, F111, F138, 및 D148 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94, N95 및 F138 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합할 수 있고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭한다.
상기에서 제공된 알라닌 치환 중 임의의 것의 효과를 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355를 포함하는 폴리펩티드의 알라닌 스캐닝에 의해 결정할 수 있다.
특히, 알라닌 치환의 효과를 본원에서 실시예 16에서 기재된 바와 같은 또는 본질적으로 기재된 바와 같은 절차에 의해 결정할 수 있다.
결합 상실은 결합에서의 Z-점수가 1.5보다 낮은 것으로서 정의될 수 있고, 임의적으로 Z-점수는 본원에서 실시예 16에서 기재된 바와 같이 또는 본질적으로 기재된 바와 같이 계산된다
알라닌 치환 중 임의의 것의 효과를
i) 각각의 돌연변이체 또는 야생형 5T4에 대해 70-90,000개의 세포, 예컨대 80,000개의 세포를 포함하는 샘플이 제공되도록, 시스테인 및 알라닌을 제외한 인간 5T4의 세포외 도메인 내의 모든 아미노산 잔기 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355에 상응함)가 개별적으로 알라닌으로 치환된 돌연변이체 인간 5T4 폴리펩티드, 및 야생형 5T4 폴리펩티드를 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 HEK 293 세포에서 개별적으로 발현시키는 단계,
ii) 각각의 샘플 내의 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합 항체에 접합된 20 ㎕의 상기 항체 (3 ㎍/mL; FACS 완충제 중)와 함께 40분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 각각의 샘플을 150-180 ㎕ FACS 완충제 (포스페이트-완충 염수 [PBS; 론자, 카탈로그 번호 BE17-517] + 0.1% [w/v] BSA [로슈, 카탈로그 번호 10735086001] + 0.02% [w/v] 아지드화나트륨 [NaN3; 에멜카 바이오사이언스, 카탈로그 번호 41920044-3])에서 2회 세정하고, 각각의 샘플 내의 세포를 30 ㎕ FACS 완충제에 재현탁시키는 단계,
iii) 각각의 샘플에 대해, 상기 샘플 내의 생존 단일 세포 집단에 대한 형광 강도의 기하 평균 (gMFI)으로서 세포 당 결합된 항체의 평균량을 결정하고, 하기 식을 사용하여 각각의 시험 항체에 대한 데이터를 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체의 결합 강도에 대해 정규화하는 단계이며:
Figure pct00005
[식 중, '아미노산 위치'는 알라닌으로 돌연변이된 위치를 지칭함],
여기서 Z-점수가 하기 계산에 따라 항체 결합의 상실 또는 획득을 표현하도록 계산되고:
Figure pct00006
[식 중, μ 및 σ는 각각 모든 돌연변이체로부터 계산된 정규화된 gMFI의 평균 및 표준 편차임],
특정 5T4 돌연변이체에 대한 대조군 항체의 gMFI가 평균 gMFI대조군 항체 - 2.5 × 평균 gMFI대조군 항체의 SD (모든 돌연변이체로부터의 것)보다 낮으면 데이터가 분석으로부터 배제되고, 임의적으로
잔기가 -1.5 바로 아래 (예를 들어 -1.5 내지 -1.8, 예컨대 -1.5 내지 -1.7 또는 예컨대 -1.5 내지 -1.6)의 Z-점수로 결합하고, 이러한 잔기가 매립되고, 표면에 노출될 것으로 예상되고 이에 대한 결합 상실 또는 결합 감소가 결정되는 대부분의 잔기로부터 공간적으로 분리될 것으로 예상되면, 데이터가 분석으로부터 배제되는 것인 단계
를 포함하는 절차에 의해 결정할 수 있다.
상기 절차의 단계 iii)에서의 적절한 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체는
- 서열식별번호: 83에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 84에 기재된 바와 같은 VL 서열 [A1]을 포함하는 항원-결합 영역; 및
- 서열식별번호: 97에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 98에 기재된 바와 같은 VL 서열 [B12]을 포함하는 항원 결합 영역
을 포함하는 이중특이적 항체이다.
본 발명에 따른 항체는 서열식별번호: 87에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 유사한 접합 항체 [H8]에 비교하여 세포독성 모이어티에 접합되는 경우의 감소된 세포독성에 의해 나타나는 바와 같이 감소된 내재화 능력을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 각각 서열식별번호: 87 및 88에 기재된 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 H8 항체로 또한 칭해지는 뮤린 5T4 항체 mAb5T4일 수 있다 (Shaw et al. (2002), Biochem. J. 363: 137-45, WO98/55607). 항체 H8의 다양한 키메라 또는 인간화 버전이 WO06/031653에서 개시된다.
5T4에 1가로 결합하는 5T4 항체의 세포독성 또는 내재화를 본 출원의 실시예 7에서 기재된 바와 같은 절차를 사용하여 결정할 수 있다. 특히, 세포독성을
i) 이전 청구항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체의 제1-Fab 아암 및 HIV 바이러스 단백질 gp120 (HIV-1 gp120)에 결합할 수 있는 제2 Fab 아암을 포함하는, 5T4에 1가로 결합하는 독소-접합 이중특이적 항체를 제공하고, 여기서 HIV-1 gp120-특이적 Fab-아암이 듀오스타틴-3에 접합된 것인 단계,;
ii) 5일 동안 37℃에서 5T4-양성 유방암 세포 MDA-MB-468 (ATCC 클론 HTB-132) 또는 HCC1954 (ATCC 클론 CRL-1338)를 5T4에 1가로 결합하는 상기 이중특이적 항체와 접촉시키는 단계; 및
iii) 세포의 생존율을 결정하는 단계
를 포함하는 검정법에서 결정할 수 있다.
IgG-b12는 HIV-1 gp120 특이적 항체이다 (Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5; 230(3):812-23). 중쇄 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 서열이 서열식별번호: 97 및 98에 각각 기재된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
a) 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059],
b) 서열식별번호: 13, 14 및 15의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [076],
c) 서열식별번호: 20, 21 및 22의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [085],
d) 서열식별번호: 27, 28 및 29의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [106],
e) 서열식별번호: 34, 35 및 36의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [127],
f) 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207],
g) 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226], 및
h) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 a) 내지 g) 중 어느 하나에서 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 비교할 때 총합으로 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
a) 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059],
b) 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207],
c) 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]; 및
d) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 a) 내지 c) 중 어느 하나에서 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 비교할 때 총합으로 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것이다.
특히, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059]을 포함하는 것일 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207]으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
a) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059],
b) 각각 서열식별번호: 13, 14 및 15의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 17, DAS 및 서열식별번호:18의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [076],
c) 각각 서열식별번호: 20, 21 및 22의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 24, DAS 및 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [085],
d) 각각 서열식별번호: 27, 28 및 29의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 31, DVS 및 서열식별번호: 32의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [106],
e) 각각 서열식별번호: 34, 35 및 36의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 38, DAS 및 서열식별번호: 39의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [127],
f) 각각 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 45, DAS 및 서열식별번호: 46의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207],
g) 각각 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 52, DAS 및 서열식별번호: 53의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]; 및
h) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 a) 내지 g) 중 어느 하나에서 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 비교할 때 총합으로 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 항원 결합 영역(들)의 6개의 상보성-결정 영역 (CDR)이,
i) 서열식별번호: 6, 7, 8, 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR 서열 [059],
ii) 서열식별번호: 41, 42, 43, 45, DAS 및 서열식별번호: 46의 CDR 서열 [207]; 또는
iii) 서열식별번호: 48, 49, 50, 52, DAS 및 서열식별번호: 53의 CDR 서열 [226]
에 비교할 때, 총합으로, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 항체일 수 있다
바람직하게는, 상기 아미노산 치환 중 1개, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개가 보존적 아미노산 치환(들)이다.
항체는 특히 상보성-결정 영역 3 (CDR3)이 서열식별번호: 102 (YYGMDV)에 기재된 서열의 6개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 1개 또는 2개의 중쇄 가변 영역 [059, 207, 226]을 포함할 수 있다. 이러한 6개의 연속적인 아미노산 잔기는 CDR3 내의 가장 C-말단인 아미노산 잔기일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 41 (GGSFSGYY)의 CDR1 서열, 서열식별번호: 103 (IDHSX1ST)의 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 104 (AX2WFGELX3X4YYYGMDV)의 CDR3 서열을 포함하는 1개 또는 2개의 중쇄 가변 영역(들) (VH), 및 서열식별번호: 105 (QSVSSX5)의 CDR1 서열, CDR2 서열 DAS, 및 서열식별번호: 46 (QQRSNWPLT)의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [식 중 X1은 G 또는 E이고, X2는 A 또는 G이고, X3은 W 또는 Y이며, X4는 D 또는 H이고, X5는 Y 또는 F이다] [207, 226]을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 6, 7, 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059]을 포함하는 것일 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 45, DAS 및 서열식별번호: 46의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207]을 포함하는 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 52, DAS 및 53의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]을 포함하는 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
a) 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059],
b) 서열식별번호: 12의 서열 또는 서열식별번호: 12의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [076],
c) 서열식별번호: 19의 서열 또는 서열식별번호: 19의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [085],
d) 서열식별번호: 26의 서열 또는 서열식별번호: 26의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [106],
e) 서열식별번호: 33의 서열 또는 서열식별번호: 33의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [127],
f) 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207]; 및
g) 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]
으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059]을 포함하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207]을 포함하는 것일 수 있다
추가적으로, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]을 포함하는 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
a) 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 9의 서열 또는 서열식별번호: 9의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059],
b) 서열식별번호: 12의 서열 또는 서열식별번호: 12의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16의 서열 또는 서열식별번호: 16의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [076],
c) 서열식별번호: 19의 서열 또는 서열식별번호: 19의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 23의 서열 또는 서열식별번호: 23의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [085],
d) 서열식별번호: 26의 서열 또는 서열식별번호: 26의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 30의 서열 또는 서열식별번호: 30의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [106],
e) 서열식별번호: 33의 서열 또는 서열식별번호: 33의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 37의 서열 또는 서열식별번호: 37의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [127],
f) 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 44의 서열 또는 서열식별번호: 44의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207],
g) 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 51의 서열 또는 서열식별번호: 51의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]
으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체이다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 결합 영역은
a) 서열식별번호: 5의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [059],
b) 서열식별번호: 12의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [076],
c) 서열식별번호: 19의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 23의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [085],
d) 서열식별번호: 26의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [106],
e) 서열식별번호: 33의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 37의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [127],
f) 서열식별번호: 40의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 44의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [207],
g) 서열식별번호: 47의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 51의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]
으로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 영역에 걸쳐, 최대 10개의 돌연변이 또는 치환, 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 4개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 3개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 2개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 1개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 최대 10개의 돌연변이 또는 치환, 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 4개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 3개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 2개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 1개의 돌연변이 또는 치환이 전체 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 전장에 걸쳐 허용된다. 다른 실시양태에서, 최대 10개의 돌연변이 또는 치환, 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 4개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 3개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 2개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 최대 1개의 돌연변이 또는 치환이 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 내의 6개의 CDR 서열 중 어느 것 내에도 있지 않을 수 있다
최대 10개의 돌연변이 또는 치환이 각각의 결합 영역의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 전장에 걸쳐 분포될 수 있다. 일부 또는 모든 돌연변이 또는 치환은 한 아미노산 잔기가 상기에서의 본원의 "아미노산" 정의 하에 나타낸 바와 같은 동일한 클래스의 아미노산 잔기로 치환되는 보존적 치환일 수 있다; 예를 들어, 산성 아미노산이 또 다른 산성 아미노산 잔기를 치환하고, 방향족 잔기가 또 다른 방향족 잔기를 치환할 수 있다. 변이체 내의 치환의 35% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상 또는 94% 이상이 보존적 아미노산 잔기 교체인 것이 바람직할 수 있다.
특히, 일부 또는 모든 돌연변이 또는 치환은 이들이 치환하는 각각의 아미노산 잔기와 동일한 물리적 또는 기능적 성질을 각각 갖는 아미노산 잔기(들)로의 것일 수 있다. 물리적 및 기능적 성질을 공유하는 아미노산 잔기는, 예를 들어, 상기에서의 본원의 "아미노산" 정의 하에, 상기에서 본원의 "아미노산" 정의 하에 제공된다; 예를 들어, 소수성 잔기가 또 다른 소수성 아미노산 잔기를 치환할 수 있거나 또는 시클로알케닐-연관 잔기가 또 다른 시클로알케닐-연관 잔기를 치환할 수 있다.
상기 개시된 바와 같은 치환 또는 돌연변이를 포함하는 항체는, 특히, 서열 식별기호를 참조로 상기에서 정의된 VL 영역, VH 영역, 또는 하나 이상의 CDR의 기능적 변이체일 수 있다. 본 발명의 항체의 맥락에서 사용된 VL, VH, 또는 CDR의 기능적 변이체는 여전히 항체가 모체 항체의 친화성 및/또는 특이성/선택성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이를 초과하는 %)을 유지하도록 허용하고, 일부 경우에, 이러한 5T4 항체는 심지어 모체 항체보다 더 큰 친화성, 선택성 및/또는 특이성과 연관될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 항체는 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
a) 서열식별번호: 5의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [059],
b) 서열식별번호: 12의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [076],
c) 서열식별번호: 19의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 23의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [085],
d) 서열식별번호: 26의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [106],
e) 서열식별번호: 33의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 37의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [127],
f) 서열식별번호: 40의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 44의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [207]; 및
g) 서열식별번호: 47의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 51의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]
으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것이다.
본 발명의 항체는 전장 항체, 예컨대 전장 IgG1 항체일 수 있다.
추가로, 본 발명의 항체는 1가 항체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 2가 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따라 제공되는 항체는 단일특이적 항체이다.
대안적으로, 본 개시내용에 따른 항체는 이중특이적 항체일 수 있다.
CD3, 예컨대 인간 CD3ε (엡실론), 예컨대 서열식별번호: 4에 상술된 바와 같은 인간 CD3ε (엡실론)에 결합하는 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 항체를 제공하는 것이 추가로 본 개시내용의 범주 내에 속한다.
특히, 본 개시내용은 상기 개시된 바와 같은 항체의 제1 항원 결합 영역, 및 상기 정의된 바와 같은 CD3, 예컨대 인간 CD3에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 이중특이적 항체 분자의 예는 (i) 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 2개의 아암이 있는 단일 항체, (ii) 예를 들어, 여분의 펩티드 링커에 의해 일렬로 연결된 2개의 scFv를 통해, 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 단일쇄 항체; (iii) 각각의 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결을 통해 2개의 가변 도메인을 일렬로 함유하는 이중-가변-도메인 항체 (DVD-Ig™) (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) 화학적으로 연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (v) 각각의 표적 항원에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 초래하는 2개의 단일쇄 디아바디의 융합물인 탠댑(Tandab)®; (vi) 다가 분자를 초래하는 디아바디와 scFv의 조합물인 플렉시바디; (vii) Fab에 적용되는 경우, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어지는 3가 이중특이적 결합 단백질을 산출시킬 수 있는, 단백질 키나제 A의 "이량체화 및 도킹 도메인"에 기초한 소위 "독 앤드 락(dock and lock)" 분자 (독-앤드-락(Dock-and-Lock)®); (viii) 예를 들어, 인간 Fab-아암의 양쪽 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는, 소위 스콜피온(Scorpion) 분자; 및 (ix) 디아바디를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 디아바디, 크로스-바디, 예컨대 크로스맵(CrossMab), 또는 제어된 Fab 아암 교환 (예컨대 WO 2011/131746에 기술됨)을 통해 수득되는 이중특이적 항체이다.
상이한 클래스의 이중특이적 항체의 예는 (i) 이종이량체화를 강요하도록 상보적인 CH3 도메인이 있는 IgG-유사 분자; (ii) 분자의 2개의 측면 각각이 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부분을 함유하는, 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자; (iii) 전장 IgG 항체가 추가의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부분에 융합된 IgG 융합 분자; (iv) 단일쇄 Fv 분자 또는 안정화된 디아바디가 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 이의 일부분에 융합된 Fc 융합 분자; (v) 상이한 Fab-단편들이 함께 융합되고, 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 이의 일부분에 융합된 Fab 융합 분자; 및 (vi) 상이한 단일쇄 Fv 분자 또는 상이한 디아바디 또는 상이한 중쇄 항체 (예를 들어 도메인 항체, 나노바디즈(Nanobodies)®)가 서로 또는 또는 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 이의 일부분에 융합된 또 다른 단백질 또는 담체 분자에 융합된 ScFv-및 디아바디-기반 및 중쇄 항체 (예를 들어, 도메인 항체, 나노바디즈®)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
상보적인 CH3 도메인 분자가 있는 IgG-유사 분자의 예는 트리오맙(Triomab)® (트리온 파마(Trion Pharma)/프레세니우스 바이오테크(Fresenius Biotech), WO/2002/020039), 놉스-인투-홀즈(Knobs-into-Holes) (제넨테크(Genentech), WO9850431), 크로스맙 (로슈, WO2011117329), 및 정전기적으로 매칭된 것 (암젠(Amgen), EP1870459 및 WO2009089004; 추가이(Chugai), US201000155133; 옹코메드(Oncomed), WO2010129304), LUZ-Y (제넨테크), DIG-바디 및 PIG-바디 (파맙신(Pharmabcine)), 가닥 교환-조작 도메인 바디 (시드바디(SEEDbody)) (이엠디 세로노(EMD Serono), WO2007110205), 바이클로닉스(Biclonics) (메루스(Merus)), FcΔAdp (리제네론(Regeneron), WO 2010/015792), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (화이자(Pfizer)/리내트(Rinat), WO11143545), 아지메트릭(Azymetric) 스캐폴드 (자임웍스(Zymeworks)/머크(Merck), WO2012058768), mAb-Fv (젠코르(Xencor), WO2011028952), 2가 이중특이적 항체 (로슈, WO2009/080254) 및 듀오바디(DuoBody)® 분자 (젠맵 에이/에스(Genmab A/S), WO 2011/131746)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자의 예는 이중 표적화 (DT)-Ig (GSK/도만티스(Domantis)), 투-인-원(Two-in-one) 항체 (제넨테크), 가교 Mab (카르마노스 캔서 센터(Karmanos Cancer Center)), mAb2 (에프-스타(F-Star), WO2008003116), 자이바디즈(Zybodies)™ (진제니아(Zyngenia)), 공통 경쇄로의 접근법 (크루셀(Crucell)/메루스, US 7,262,028), κλ바디즈(κλBodies) (노브이뮨(NovImmune)) 및 CovX-바디 (CovX/화이자)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
IgG 융합 분자의 예는 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig™ (애보트(Abbott), US 7,612,181), 이중 도메인 이중 헤드 항체 (유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO20100226923), IgG-유사 이중특이적 (임클론(ImClone)/일라이 릴리(Eli Lilly)), Ts2Ab (메드이뮨(MedImmune)/AZ) 및 BsAb (자이모제네틱스(Zymogenetics)), 허큘레스(HERCULES) (바이오젠 아이덱(Biogen Idec), US007951918), scFv 융합물 (노바티스(Novartis)), scFv 융합물 (창저우 아담 바이오테크 인크(Changzhou Adam Biotech Inc), CN 102250246) 및 TvAb (로슈, WO2012025525, WO2012025530)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
Fc 융합 분자의 예는 ScFv/Fc 융합물 (아카데믹 인스티튜션(Academic Institution)), 스콜피온(SCORPION) (이머전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루비온(Trubion), 자이모제네틱스/BMS), 이중 친화성 재표적화 기술 (Fc-DARTTM) (마크로제닉스(MacroGenics), WO2008157379, WO2010/080538) 및 이중(ScFv)2-Fab (국립 항체 의학 연구 센터 - 중국)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
Fab 융합 이중특이적 항체의 예는 F(ab)2 (메다렉스(Medarex)/암젠(AMGEN)), 이중-작용 또는 Bis-Fab (제넨테크), 독-앤드-록® (DNL) (이뮤노메딕스(ImmunoMedics)), 2가 이중특이적 (바이오테크놀(Biotecnol)) 및 Fab-Fv (UCB-셀텍(UCB-Celltech))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
scFv-, 디아바디-기반 및 도메인 항체의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(Engager) (BiTE®) (마이크로메트(Micromet)), 탠덤 디아바디 (탠댑™) (어피메드(Affimed)), 이중 친화성 재표적화 기술 (DART) (마크로제닉스), 단일쇄 디아바디 (아카데믹(Academic)), TCR-유사 항체 (AIT, 리셉터로직스(ReceptorLogics)), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합물 (메리맥(Merrimack)) 및 콤바디(COMBODY) (에피젠 바이오테크(Epigen Biotech)), 이중 표적화 나노바디즈® (애블링스(Ablynx)), 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용에 따른 항체는, 특히, CD3에 결합하는 항원 결합 영역이
각각 서열식별번호: 54, 55 및 56의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [huCD3-H1L1] (WO2015001085 (젠맵 A/S);
및, 임의적으로
각각 서열식별번호: 58, GTN 및 59의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [huCD3-H1L1]
을 포함하는 항체일 수 있다.
CD3에 결합하는 항원 결합 영역이
서열식별번호: 57의 서열, 또는 서열식별번호: 57의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [huCD3-H1L1];
및, 임의적으로
서열식별번호: 60의 서열, 또는 서열식별번호: 60의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [huCD3-H1L1]
을 포함하는 항체가 또한 개시된다.
본 개시내용은
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059]을 포함하고;
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [huCD3-H1L1]을 포함하는 항체를 추가로 제공한다.
또한, 본 개시내용은
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 45, DAS 및 46의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207]을 포함하고;
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [huCD3-H1L1]을 포함하는 항체를 제공한다.
또한, 본 개시내용은
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 52, DAS 및 53의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226 - VH + VL CDR1, -2 및 -3 서열]을 포함하고;
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [huCD3-H1L1]을 포함하는 항체를 제공한다.
항원 결합 영역은 CD3에 200 - 1000 nM의 범위 내, 예컨대 300 - 1000 nM의 범위 내, 400 - 1000 nM의 범위 내, 500 - 1000 nM의 범위 내, 300 - 900 nM의 범위 내, 400 - 900 nM의 범위 내, 400 - 700 nM의 범위 내, 500 - 900 nM의 범위 내, 500 - 800 nM의 범위 내, 500 - 700 nM의 범위 내, 600 - 1000 nM의 범위 내, 600 - 900 nM의 범위 내, 600 - 800 nM의 범위 내, 또는 예컨대 600 - 700 nM의 범위 내의 평형 해리 상수 K D로 결합할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열식별번호: 57에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열 [huCD3-H1L1]을 포함하는 항원-결합 영역을 갖는 항체보다 더 낮은 인간 CD3ε 결합 친화도를 갖고, 바람직하게는, 상기 친화도는 적어도 2배 더 낮거나, 예를 들어 적어도 5배 더 낮거나, 예컨대 적어도 10배 더 낮거나, 예를 들어 적어도 20배 더 낮거나, 적어도 30배 더 낮거나, 적어도 40배 더 낮거나, 적어도 45배 더 낮거나, 적어도 50배 더 낮거나, 적어도 55배 더 낮거나, 또는 예컨대 적어도 60배 더 낮다.
특히, CD3에 결합하는 항원 결합 영역은 1 - 100 nM의 범위 내, 예컨대 5 - 100 nM의 범위 내, 10 - 100 nM의 범위 내, 1 - 80 nM의 범위 내, 1 - 60 nM의 범위 내, 1 - 40 nM의 범위 내, 1 - 20 nM의 범위 내, 5 - 80 nM의 범위 내, 5 - 60 nM의 범위 내, 5 - 40 nM의 범위 내, 5 - 20 nM의 범위 내, 10 - 80 nM의 범위 내, 10 - 60 nM의 범위 내, 10 - 40 nM의 범위 내, 또는 예컨대 10 - 20 nM의 범위 내의 평형 해리 상수 K D로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 항체가 CD3에 결합하는 친화도를 상기에서 기술되거나 또는 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같은 절차의 변형을 사용하여 생물층 간섭측정법에 의해 결정할 수 있고, 여기서 항체를 인간 IgG Fc 포착 바이오센서에 고정하고, 고정된 항체에 대한 CD3E27-GSKa (서열식별번호: 101의 성숙 단백질)의 회합 및 해리를 결정한다. 추가로, 본 발명에 따른 항체가 CD3에 결합하는 친화도를 본원의 실시예 9에서 제공된 바와 같은 생물층 간섭측정법에 의해 결정할 수 있다.
감소된 친화도로 CD3, 특히 인간 CD3에 결합하는 항체가 WO 2017/009442에서 제공되고, 이러한 항체 중 임의의 것이 5T4에 결합하는 능력에 더하여 감소된 친화도로 CD3에 결합하는 능력을 또한 갖는 본 발명에 따른 항체를 생성시키기 위한 기초로서의 역할을 할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는
CD3에 결합하는 항원 결합 영역이 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하고,
중쇄 가변 (VH) 영역이, 서열식별번호: 57에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역에 비교할 때, CDR 서열 중 하나 내에 아미노산 치환을 갖고, 이러한 치환이 T31, N57, H101, G105, S110 및 Y114로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있으며, 이러한 위치는 서열식별번호: 57의 서열에 따라 넘버링되고;
야생형 경쇄 가변 (VL) 영역이 각각 서열식별번호: 58, GTN 및 서열식별번호: 59에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체이다.
서열식별번호: 57에 기재된 서열에 비교할 때, CD3에 결합하는 항원 결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이, 총합으로, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직하다.
CD3에 결합하는 항원 결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 야생형 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%의 서열 동일성, 적어도 97%의 서열 동일성, 적어도 98%의 서열 동일성 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있고, 서열 동일성은 CD3에 결합하는 항원 결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열로 이루어지는 아미노산 서열과 야생형 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 정렬하는 것에 기초하여 계산된다.
특히, CD3에 결합하는 항원 결합 영역은 T31M, T31P, N57E, H101G, H101N, G105P, S110A, S110G, Y114M, Y114R, Y114V로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함할 수 있고, 이러한 위치는 서열식별번호: 57의 기준 서열에 따라 넘버링된다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 상기 항체가 Fc-매개 이펙터 기능이 결여되거나 감소되고 ("불활성" 항체"), CD3에 결합하는 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체인 경우, 항체가
a) 예를 들어, 본원에서 실시예 14에 기술된 바와 같이 검정될 때, 정제된 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 또는 T 세포를 이펙터 세포로서 사용할 때 SK-OV-3 세포의 농도-의존적 세포독성을 매개할 수 있고/거나,
b) 예를 들어, 본원에서 실시예 13에서 기술된 바와 같이 검정될 때, 정제된 T 세포를 이펙터 세포로서 사용할 때 MDA-MB-231 세포의 농도-의존적 세포독성을 매개할 수 있고/거나,
c) 예를 들어, 본원에서 실시예 13 (II)에서 기술된 바와 같이 검정될 때, MDA-MB-231 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T-세포를 활성화시킬 수 있고/거나,
d) 예를 들어, 본원에서 실시예 17에서 기술된 바와 같이 검정될 때, BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T-세포를 활성화시킬 수 있고/거나,
e) 예를 들어, 본원에서 실시예 17에서 기술된 바와 같이 검정될 때, 정제된 T 세포를 이펙터 세포로서 사용할 때 BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 세포독성을 유도할 수 있고/거나,
f) 예를 들어, 실시예 15에서 기술된 바와 같이 결정될 때, 인간 MDA-MB-231 종양 세포가 접종된 인간화 면역 조혈 줄기 세포 재구성 마우스 이종이식 모델, 예컨대 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ에서 항-종양 활성, 예컨대 종양 성장의 억제 또는 지연된 종양 성장을 나타내는 항체이다.
추가로, 본 발명에 따른 항체는, 유동 세포측정법 또는 ELISA에 의해 평가될 때, 백혈구 FcγR에 결합하지 않고, C1q에 결합하는 것에 의해 표적 (5T4)-특이적 종양 세포의 부재 하에 CD3-항체 의존적, FcγR-매개 CD3-가교를 유도하지 않는 항체이다.
Fc-매개 이펙터 기능이 감소되거나 없는 항체 ("불활성" 항체)의 더욱 상세한 개시내용이 본원에서 하기에서 확인될 수 있다.
SK-OV-3 세포의 농도-의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력은
i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 PBMC 또는 T 세포를 단리하는 단계,
ii) 각각의 샘플이 PBMC 및 인간 난소 선암종 SK-OV-3 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 PBMC:SK-OV-3 세포 비가 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1, 및 12:1인 제1 샘플 세트; 및
각각의 샘플이 T 세포 및 인간 난소 선암종 SK-OV-3 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T 세포:SK-OV-3 세포의 비가 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1인 제2 샘플 세트
를 제공하는 단계,
iii) 항체를 각각의 샘플 세트에 0.0128 ng/mL 내지 1000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하고, 샘플을 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계, 및
iv) 그 후, 레사주린(Resazurin) (7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드)을 사용하여 SK-OV-3 세포의 생존율을 평가하는 단계
를 포함하는 시험관내 세포독성 검정법에서 결정된다.
MDA-MB-231 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T 세포를 활성화시키는 능력은
i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 T 세포를 단리하는 단계,
ii) 각각의 샘플이 T-세포 및 인간 유방 선암종 MDA-MB-231 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T-세포:MDA-MB-231 세포의 비가 8:1인 샘플 세트를 제공하는 단계,
iii) 항체를 샘플 세트에 0.0128 ng/mL 내지 1000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하고, 샘플을 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계,
iv) T-세포를 T-세포 활성화 마커에 대한 형광-표지 항체, 예컨대 CD69-APC, CD25-PE-Cy7 및 CD279/PD 1-BV 604 항체로 4℃에서 30분 동안 상기 항체와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 염색하는 단계; 및
v) 유동 세포측정법에 의해 T 세포를 분석하는 단계
를 포함하는 검정법에서 결정될 수 있다.
APC 항-인간 CD69 (CD69-APC) 항체는, 예를 들어 바이오레전드(BioLegend) (카탈로그 # 310909 및 310910)로부터, 상업적으로 입수가능하다. CD25 모노클로날 항체, PE-시아닌7 (CD25-PE-Cy7) 또한, 예를 들어 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) (카탈로그 # 25-0259-42) 및 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences) (카탈로그 # 557741)로부터, 상업적으로 입수가능하다. 마지막으로, CD279/PD 1-BV 604 항체는 진스크립트(Genscript) (카탈로그 # A01828)로부터 상업적으로 입수될 수 있다.
BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 존재 하의 시험관내에서의 T 세포의 활성화를
i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 T 세포를 단리하는 단계,
ii) 각각의 샘플이 상기 T 세포 및 BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 또는 SiHa 종양 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T 세포:종양 세포의 비가 4:1인 샘플 세트를 제공하는 단계,
iii) 항체를 샘플 세트에 0.0128 ng/mL 내지 5000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하고 (예컨대 5배 희석), 샘플을 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계,
iv) 각각의 샘플로부터 T 세포를 함유하는 상청액 110 ㎕를 수집하고, T 세포를 T-세포 마커에 대한 형광-표지 항체, 예컨대 CD3-이플루오르(eFluor)450, CD4-APC-이플루오르780, DC8-AF700, 및 T-세포 마커에 대한 항체, 예컨대 69-APC, CD25-PE-Cy7 및 CD279/PD1-BV604 항체로 4℃에서 30분 동안 상기 항체와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 염색하는 단계; 및
v) 유동 세포측정법에 의해 샘플을 분석하는 단계
를 포함하는 절차에서 결정할 수 있다.
BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 세포독성을 유도하는 능력을
i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 T 세포를 단리하는 단계,
ii) 각각의 샘플이 96웰 조직 배양 플레이트의 바닥에 부착되도록 허용된 BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 또는 SiHa 종양 세포 및 상기 T-세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T-세포:종양 세포의 비가 4:1인 시험 샘플 및 대조군 샘플의 세트를 제공하는 단계,
iii) 항체를 시험 샘플의 세트에 0.0128 ng/mL 내지 5000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하는 한편 (예컨대 5배 희석), 대조군 샘플은 미처리로 남기거나 또는 5 μM 스타우로스포린과 함께 인큐베이션하고, 모든 샘플을 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하는 단계,
iv) 부착성 세포를 10% (w/w) 공여자 소 혈청 + 철 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지 중에서 10% (w/w) 7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드 (레사주린)에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하는 단계,
v) 세포의 흡광도를 측정하고, 스타우로스포린과 함께 인큐베이션된 세포의 흡광도를 0% 생존율로, 미처리 세포를 100% 생존율로 설정하고, 백분율 생존 세포를 하기와 같이 계산하는 단계:
Figure pct00007
를 포함하는 절차에서 결정할 수 있다.
본 발명의 항체는, 특히, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
a) 각각 서열식별번호: 61, 55, 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [VH CDR1-T31P + 야생형 VH CDR 2,3], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3], 또는
b) 각각 서열식별번호: 63, 55, 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [VH CDR1-T31M + 야생형 VH CDR 2,3], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
c) 각각 서열식별번호: 54, 65, 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [VH CDR-N57E + 야생형 VH CDR 1,3], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
d) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
e) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 69에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101N], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
f) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 71에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-G105P], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
g) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 73에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-S110A], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
h) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 75에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-S110G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
i) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 77에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-Y114V], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
j) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 79에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-Y114M], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
k) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 81에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-Y114R], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각
을 포함하는 항체일 수 있다.
특정 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함한다.
추가로, 본 발명은
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059]을 포함하고;
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함하는,
상기 정의된 바와 같은 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 45, DAS 및 46의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207]을 포함하고;
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함하는,
상기 정의된 바와 같은 항체를 제공한다.
추가로, 본 발명은
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 52, DAS 및 53의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]을 포함하고;
CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함하는,
상기 정의된 바와 같은 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 항체에서, 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역은
a) 서열식별번호: 62에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH T31P] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
b) 서열식별번호: 64에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH T31M] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
c) 서열식별번호: 66에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH N57E] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
d) 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
e) 서열식별번호: 70에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101N] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
f) 서열식별번호: 72에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH G105P] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
g) 서열식별번호: 74에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH S110A] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
h) 서열식별번호: 76에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH S110G] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
i) 서열식별번호: 78에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH Y114V] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
j) 서열식별번호: 80에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH Y114M] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열; 및
k) 서열식별번호: 82에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH Y114R] 및서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열
로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 항체는 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059]을 포함하고;
인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207]을 포함하고;
인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것이다
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는
5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]을 포함하고;
인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것이다.
통상의 기술자에게 널리 공지될 바와 같이, 항체의 각각의 항원-결합 영역은 일반적으로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 각각의 가변 영역은 각각 3개의 CDR 서열 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 각각 4개의 프레임워크 서열 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 이러한 구조는 본 발명에 따른 항체에서도 확인될 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 항체는 2개의 중쇄 불변 영역 (CH), 및 2개의 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 제1 및 제2 중쇄, 예컨대 각각 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 제1 및 제2 중쇄를 포함한다. CH3 영역 내에 소수의 비대칭 돌연변이만을 함유하는 2개의 동종이량체 출발 단백질에 기초하여, 예를 들어, WO 2008/119353 및 WO 2011/131746에서 제공된 바와 같은 소위 Fab-아암 교환에 의해, 안정적인 이종이량체 항체가 높은 수율로 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환된 제1 중쇄, 및 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환된 제2 중쇄를 포함하고, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 중쇄의 상기 치환은 동일한 위치에 있지 않고, 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 상기 제1 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 R이고, 상기 제2 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치의 아미노산이 L이거나, 또는 그 반대인 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는, 항원-결합 영역에 더하여, 2개의 중쇄의 Fc 서열로 이루어지는 Fc 영역을 포함한다. 제1 및 제2 Fc 서열은 각각 임의의 인간 아이소타입, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, 또는 IgA 아이소타입 또는 혼합 아이소타입을 포함하는 임의의 아이소타입의 것일 수 있다. 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 아이소타입 또는 혼합 아이소타입, 예컨대 인간 IgG1 아이소타입이다.
본 발명에 따른 항체는 항체를 불활성 또는 비-활성화 항체가 되도록 하는 Fc 영역 내의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 항체에서, 항체가 비-변형 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비교하여 더 낮은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 1개 또는 둘 다의 중쇄가 변형될 수 있다. T 세포 상에서의 Fc-매개 CD69 발현 (즉, CD3 항체-매개, Fcγ 수용체-의존적 CD3 가교의 결과로서의 CD69 발현)을 결정하는 것에 의해, Fcγ 수용체에 결합하는 것에 의해, C1q에 결합하는 것에 의해, 또는 FcγR의 Fc-매개 가교의 유도에 의해 Fc-매개 이펙터 기능을 측정할 수 있다. 특히, Fc-매개 CD69 발현이 야생형 (미변형) 항체에 비교할 때 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소되도록 중쇄 불변 서열이 변형될 수 있고, 여기서 상기 Fc-매개 CD69 발현은, 예를 들어 WO2015001085의 실시예 3에 기재된 바와 같이, PBMC-기반 기능적 검정법에서 결정된다. 중쇄 및 경쇄 불변 서열의 변형은 상기 항체에 대한 C1q의 결합 감소를 또한 초래할 수 있다. 미변형 항체에 비교하여, 감소는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100%만큼일 수 있고, C1q 결합은 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 상기 항체가 미변형 항체에 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소된 Fc-매개 T-세포 증식을 유도하도록 Fc 영역이 변형될 수 있고, 여기서 상기 T-세포 증식은 PBMC-기반 기능적 검정법에서 측정된다.
예를 들어 IgG1 아이소타입 항체에서, 변형될 수 있는 아미노산 위치의 예는 위치 L234 및 L235를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 각각 F 및 E인 제1 및 제2 중쇄를 포함할 수 있다.
추가적으로, D265A 아미노산 치환이 모든 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시킬 수 있고, ADCC를 방지할 수 있다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604). 따라서, 본 발명에 따른 항체는 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 A인 제1 및 제2 중쇄를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 실시양태는 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나, 예컨대 둘 다에서, 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산이 각각 F, E, 및 A인 항체를 제공한다. 본 출원에서, 3개의 아미노산 치환 L234F, L235E 및 D265A의 조합 및 추가적으로 상기에서 본원에 개시된 K409R 또는 F405L 돌연변이를 갖는 항체는 각각 접미사 "FEAR" 또는 "FEAL"로 명명된다.
야생형 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 본원에서 서열식별번호: 89로서 확인된다. 상기 개시된 실시양태와 일관되게, 본 발명의 항체는 F405L 치환을 보유하고 서열식별번호: 90에 기재된 아미노산 서열을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역 및/또는 K409R 치환을 보유하고 서열식별번호: 94에 기재된 아미노산 서열을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
L234F, L235E 및 D265A 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 본원에서 서열식별번호: 91로서 확인된다. L234F, L235E, D265A 및 F405L 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 본원에서 서열식별번호: 92로서 확인된다. L234F, L235E, D265A 및 K409R 치환을 보유하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 본원에서 서열식별번호: 93으로서 확인된다.
본 발명은
a) 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역(들)이 인간화되고/거나,
b) 존재하는 경우, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 인간화된 항체를 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역(들)이 인간형이고/거나,
b) 존재하는 경우, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 인간형인 항체를 제공한다.
추가로, 본 발명은
a) 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역(들)이 키메라이고/거나,
b) 존재하는 경우, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 키메라인 항체를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 카파 (κ) 경쇄를 포함한다. 이중특이적 항체에 관한 본 발명의 특정 실시양태에서, 카파 경쇄는 상기 개시된 바와 같은 5T4 항체 경쇄의 CDR1, -2 및 -3 서열을 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 이전 청구항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 상기 항체는 람다 (λ) 경쇄를 포함한다. 이중특이적 항체에 관한 본 발명의 특정 실시양태에서, 람다 경쇄는 상기 개시된 바와 같은 CD3 항체 경쇄의 CDR1, -2 및 -3 서열, 특히 상기 개시된 바와 같이 CD3에 대한 친화도가 감소된 CD3 항체의 CDR1, -2 및 -3 서열을 포함한다. 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 본원에서 서열식별번호: 95로서 포함되고, 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이 본원에서 서열식별번호: 96으로서 포함된다.
특정한 실시양태에서, 항체는 람다 (λ) 경쇄 및 카파 (κ) 경쇄를 포함한다; 예를 들어, CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 람다 경쇄, 및 5T4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 카파 경쇄를 갖는 항체.
면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 항체, 및 치료 모이어티, 예컨대 세포독성제, 화학요법 약물, 사이토카인, 면역억제제, 항생제, 또는 방사성동위원소를 포함하는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. 일반적으로, 통상의 기술자는 그의 재량으로 다수의 세포독성제, 화학요법 약물, 사이토카인, 면역억제제, 항생제 및 방사성동위원소를 가질 것이고, 치료 모이어티의 최적의 선택은 면역접합체의 원하는 적용에 좌우된다. 특정 적용을 위해, 바람직한 세포독성제는 미세관-파괴제, 예컨대 듀오스타틴, 예를 들어 듀오스타틴-3일 수 있다.
핵산 구축물
본 발명의 추가 측면은
a) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
b) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다.
이러한 핵산 구축물은
a) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
b) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
을 추가로 포함할 수 있다.
발현 벡터
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 특히, 발현 벡터는
a) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
b) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
을 포함할 수 있다.
발현 벡터는
a) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
b) 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
을 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 발현 벡터는 항체, 예를 들어 인간 IgG1,κ 모노클로날 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다의 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 맥락에서의 발현 벡터는 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터 (적절한 발현 제어 요소 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함하는 임의의 적절한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-5T4 항체-코딩 핵산은 예를 들어 선형 발현 요소를 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터 (예를 들어, 문헌 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)]에 기재된 바와 같음), 압축 핵산 벡터 (예를 들어, US 6,077, 835 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같음), 플라스미드 벡터 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "미지(midge)" 최소 크기 핵산 벡터 (예를 들어, 문헌 [Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)]에 기재된 바와 같음) 내에, 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaP04-침전 구축물 (예를 들어, WO 00/46147, 문헌 [Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986)], [Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)], 및 [Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)]에 기재된 바와 같음)로서 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 이의 용도는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972를 참조한다).
한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 세포에서의 항-5T4 항체의 발현에 적절하다. 이러한 벡터의 예는 블루스크립트(BlueScript) (스트라타진(Stratagene)), pIN 벡터 (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503 5509 (1989), pET 벡터 (노바젠(Novagen), 위스컨신주 매디슨) 등과 같은 발현 벡터를 포함한다.
발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 효모 시스템에서의 발현에 적절한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적절한 임의의 벡터를 사용할 수 있다. 적절한 벡터는, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터 예컨대 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터를 포함한다 (문헌 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 및 Wiley InterScience New York (1987)], 및 [Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516 544 (1987)]에서 검토됨).
핵산 구축물 및/또는 벡터는 폴리펩티드, 예컨대 신생 폴리펩티드 쇄를 원형질막 주위공간으로 또는 세포 배양 배지 내로 표적화할 수 있는, 분비/국소화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 이러한 서열은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 분비 리더 또는 신호 펩티드, 소기관 표적화 서열 (예를 들어, 핵 국소화 서열, ER 유지 신호, 미토콘드리아 통과 서열, 엽록체 통과 서열), 막 국소화/앵커 서열 (예를 들어, 이동 정지 서열, GPI 앵커 서열) 등을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터에서, 항-5T4 항체-코딩 핵산은 임의의 적절한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현-촉진 요소를 포함하거나 또는 이와 회합될 수 있다. 이러한 요소의 예는 강한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서, 뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리 (A) 종결 서열, 이. 콜라이에서의 플라스미드 생성물에 대한 복제 기원, 선별성 마커로서의 항생제 저항성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)를 포함한다. 핵산은 구성적 프로모터와 반대되는 바와 같은 유도성 프로모터 예컨대 CMV IE를 또한 포함할 수 있다 (통상의 기술자는 이러한 용어가 실제로 특정 조건 하에서의 유전자 발현의 정도의 기술어임을 인식할 것이다).
한 실시양태에서, 항-5T4-항체-코딩 발현 벡터는 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물 내에 놓이고/거나 이에 전달될 수 있다.
세포 및 숙주 세포
추가 측면에서, 본 발명은 본원에서 상기 정의된 바와 같은 핵산 구축물, 또는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 이러한 세포는 숙주 세포를 상기 핵산 구축물 또는 발현 벡터로 형질감염시킴으로써, 예컨대 재조합 숙주 세포에 의해 수득되었을 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
숙주 세포는 인간 기원의 것, 예컨대 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 예컨대 HEK/Expi 세포일 수 있다. 대안적으로, 이는 설치류 기원의 것, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포, 예컨대 CHO/N50 세포일 수 있다. 추가로, 숙주 세포는 박테리아 기원의 것일 수 있다.
세포는 세포 게놈 내로 안정적으로 통합된 본 발명의 항체 또는 이의 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포는 본 발명의 항-5T4 항체 또는 이의 일부분의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 비-통합 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함할 수 있다. 특히, 숙주 세포는 항-5T4 항체 또는 이의 일부분의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 비-통합 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 선형 발현 요소를 포함할 수 있다.
조성물
본 발명의 추가 측면은 항체, 예를 들어, 상기에서 정의된 바와 같은 이중특이적 항체 또는 면역접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 항체, 이중특이적 항체 또는 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물일 수 있다.
제약 조성물은 통상적인 기술 예컨대 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 개시된 것들에 따라 담체, 부형제 및/또는 희석제, 뿐만 아니라 공지된 아주반트를 포함하여 제약 조성물에 적절한 임의의 다른 성분과 함께 제형화될 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 희석제, 뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제는 본 발명의 항체 또는 항체 접합체 및 선택된 투여 방식에 적절하여야 한다. 제약 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적절성은 선택된 본 발명의 화합물 또는 제약 조성물의 원하는 생물학적 성질에 대한 유의한 부정적 영향의 결여 (예를 들어, 항원 결합에 대한 실질적인 것 미만의 영향 [10% 이하의 상대적 억제, 5% 이하의 상대적 억제] 등)에 기초하여 결정된다.
본 발명의 제약 조성물은 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제 (예를 들어, 비이온성 세제, 예컨대 트윈(Tween)-20 또는 트윈-80), 안정화제 (예를 들어, 당 또는 단백질 무함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 제약 조성물 내에 포함하기에 적절한 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용된 특정한 본 발명의 조성물 또는 이의 아미드, 투여 경로, 투여 시간, 사용 중인 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 중인 환자의 연령, 성별, 체중, 컨디션, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 널리 공지되어 있는 유사한 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 좌우될 것이다.
제약상 허용되는 담체는 본 발명의 화합물과 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 적절한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 작용제, 항산화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에서 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 및 참기름, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드 용액, 트라가칸트 검 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충제를 포함한다. 기타 담체들이 제약 분야에 널리 공지되어 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약상 활성인 물질을 위한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속-킬레이팅제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 조성물 내에 등장성 작용제, 예컨대 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약 조성물의 저장 수명 또는 유효성을 강화시킬 수 있는, 선택된 투여 경로에 적절한 하나 이상의 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 급속 방출에 대해 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 마이크로-캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 함께 제조될 수 있다. 이러한 담체는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리-오르토-에스테르, 및 폴리락트산을 단독으로 또는 왁스와 함께, 또는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 생체내에서 적합한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제약상 허용되는 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약상 활성인 물질을 위한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 다른 활성 또는 치료 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
주사용 제약 조성물은 전형적으로 멸균성이고 제조 및 보관 조건 하에 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적절한 다른 정돈된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 함유하는 수성 또는 비-수성 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 조성물 내에 등장성 작용제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 장기 흡수가 초래될 수 있다. 주사가능한 멸균 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라, 예를 들어 상기 열거된 바와 같은 성분 중 하나 또는 조합물과 함께, 적합한 용매 내에 혼입시킨 후, 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 예를 들어 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 산출시키는 진공-건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
주사가능한 멸균 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께, 적합한 용매 내에 혼입시킨 후, 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 산출시키는 진공-건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
본 발명의 제약 조성물은 하나의 본 발명의 항체, 이중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체 (ADC), 본 발명에 따른 항체, 이중특이적 항체 또는 ADC와 또 다른 치료 화합물의 조합물, 또는 본 발명의 화합물들의 조합물을 함유할 수 있다.
제약 조성물은 임의의 적절한 경로 및 양식으로 투여될 수 있다. 생체내에서 및 시험관내에서 본 발명의 화합물을 투여하는 적절한 경로가 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구로, 즉 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식으로, 일반적으로는 주사에 의해 투여되고, 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 힘줄내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척주내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 특히, 본 발명의 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다.
용도 및 치료 적용
본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에서 정의된 바와 같은 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 또는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)를 추가로 제공한다. 본 발명의 항-5T4 항체 또는 면역접합체는 5T4를 발현하는 세포를 수반하는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 이중특이적 항체, 즉 5T4 및 CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 항체가 5T4를 발현하는 세포의 특이적 표적화 및 T-세포 매개 사멸을 원하는 치료 환경에서 유용할 수 있고, 이는 이러한 적응증 및 환경에서 정규 항-5T4 항체에 비교하여 더욱 효율적일 수 있다.
한 실시양태에서, 암의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 또는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)가 본원에서 개시된다. 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 또는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)는 종양 세포의 적어도 일부에서의 5T4의 발현을 특징으로 하는 암의 치료에서 특히 사용될 수 있다.
암은 특히 신장암/신암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 난소암, 방광암, 자궁암/자궁내막암/자궁경부암, 폐암, 위장암, 위암, 췌장암, 갑상선암, 두경부암, 림프종, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 의약, 예컨대 암, 예를 들어 신장암/신암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 난소암, 방광암, 자궁암/자궁내막암/자궁경부암, 폐암, 위장암, 위암, 췌장암, 갑상선암, 두경부암, 림프종, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 항체, 면역접합체, 조성물, 예컨대 제약 조성물 또는 항체-약물 접합체 (ADC)를 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 방법은 암의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 방법은 특히
a) 5T4를 발현하는 종양 세포를 포함하는 암 및/또는 5T4를 발현하는 것으로 공지된 암을 앓고 있는 대상체를 선택하는 단계; 및
b) 대상체에게 본 발명의 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 제약 조성물 또는항체-약물 접합체 (ADC)를 투여하는 단계
를 포함할 수 있다.
암은 특히 신장암/신암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 난소암, 방광암, 자궁암/자궁내막암/자궁경부암, 폐암, 위장암, 위암, 췌장암, 갑상선암, 두경부암, 림프종, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 치료 방법 및 용도에서의 투여 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 치료 상황의 요건에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물이 투여량 단위 형태로 제형화될 수 있다.
항체에 대한 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료될 질환 또는 병태에 좌우되고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료적 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.001 - 10 mg/kg, 예컨대 약 0.001 - 5 mg/kg, 예를 들어 약 0.001 - 2 mg/kg, 예컨대 약 0.001 - 1 mg/kg, 예를 들어 약 0.001, 약 0.01, 약 0.1, 약 1 또는 약 10 mg/kg이다. 본 발명의 항체의 치료적 유효량에 대한 또 다른 예시적인 비제한적 범위는 약 0.1 - 100 mg/kg, 예컨대 약 0.1 - 50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1 - 20 mg/kg, 예컨대 약 0.1 - 10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 예컨대 0.3, 약 1, 약 3, 약 5, 또는 약 8 mg/kg이다.
관련 기술 분야의 통상적인 기술이 있는 의사는 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에서 사용되는 항체의 용량을 원하는 치료 효과를 달성하는 데 요구되는 것보다 낮은 수준에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 적절한 일일 용량은 치료 효과를 일으키는 데 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 투여는, 예를 들어, 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 mg/m2에 의해 계산된 매주 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여량은, 예를 들어, 하기에 따라 상기에서 제공된 mg/kg 투여량에 기초할 수 있다: 용량 (mg/kg) × 70: 1.8. 이러한 투여를, 예를 들어, 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복할 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸친 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 독성 부작용을 감소시키도록 장기간, 예컨대 24시간 초과에 걸친 느린 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 1주일에 1회 제공되는 경우에 최대 8회, 예컨대 4 내지 6회 동안 고정 용량으로서 계산된 매주 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 6개월 또는 12개월 후에, 필요하다면 이러한 요법을 1회 이상 반복할 수 있다. 이러한 고정 투여량은, 예를 들어, 70 kg의 체중 추정치로, 상기에서 제공된 mg/kg 투여량에 기초할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플을 취하고, 본 발명의 항체의 5T4 항원 항원-결합 영역을 표적화하는 항-이디오타입 항체를 사용하는 것에 의해, 투여 시의 혈액 내의 본 발명의 항체의 양을 측정함으로써 투여량을 결정하거나 또는 조정할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 유지 요법으로서, 예를 들어, 6개월 이상의 기간 동안 주 1회로 투여될 수 있다.
또한 항체는 암이 발달될 위험을 감소시키고/거나, 암 진행에서의 이벤트 발생의 개시를 지연시키고/거나, 암이 완화 중일 때 재발 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 조합 요법에서 투여될 수 있고, 즉, 치료될 질환 또는 병태와 관련된 다른 치료제와 조합될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 항체-함유 의약은 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 세포독성제, 화학요법제 또는 항혈관형성제와 조합하기 위한 것이다.
항체 생산
본 발명의 항체, 예컨대 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 본원에서 또한 제공된다. 특히,
a) 본원에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 배양 배지로부터 상기 항체를 정제하는 단계
를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
항체가 5T4에 결합할 수 있는 결합 영역 및 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 본 발명의 실시양태에서,
a) 5T4에 결합할 수 있는 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 본원에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 5T4에 결합할 수 있는 항체를 정제하는 것에 의해 5T4에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계;
b) CD3에 결합할 수 있는 항체의 발현을 허용하는 조건 하에
I) 본원에서 상기에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및
II) 본원에서 상기에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 CD3에 결합할 수 있는 항체를 정제하는 것에 의해 CD3에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계;
c) 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪도록 허용하는 데 충분한 환원 조건 하에 5T4에 결합할 수 있는 상기 항체를 CD3에 결합할 수 있는 상기 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, 및
d) 상기 항체를 수득하는 단계
포함하는 방법을 사용하여 항체를 생산할 수 있다.
키트
본 발명은 상기 개시된 바와 같은 항체를 포함하는, 동반 진단으로 사용하기 위한/환자 집단 내에서 본원에서 상기에서 정의된 바와 같은 항체 또는 본원에서 상기에서 정의된 바와 같은 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)로의 치료에 반응할 경향을 갖는 환자를 확인하기 위한, 또는 환자 치료에서 사용되는 경우의 상기 항체 또는 면역접합체 또는 ADC의 효능 또는 항-종양 활성을 예측하기 위한 부분들의 키트, 예컨대 키트를 추가로 제공하고, 이러한 키트는 상기 정의된 바와 같은 항체 및 상기 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
항-이디오타입 항체
추가 측면에서, 본 발명은 5T4에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체, 즉 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역에 결합한다.
항-이디오타입 (Id) 항체는 일반적으로 항체의 항원-결합 부위와 회합된 독특한 결정기를 인식하는 항체이다. 항-Id 항체는 항-5T4 모노클로날 항체의 공급원과 동일한 종 및 유전자 유형의 동물을 이에 대한 항-Id가 제조되는 모노클로날 항체로 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 전형적으로 면역화 항체의 이디오타입 결정기를 이러한 이디오타입 결정기에 대한 항체 (항-Id 항체)를 생산하는 것에 의해 인식하고 이에 반응할 수 있다. 이러한 항체가 예를 들어 US 4,699,880에 기재되어 있다. 이러한 항체는 본 발명의 추가 측면이다.
항-Id 항체는 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도하여 소위 항-항-Id 항체를 생산하기 위한 "면역원"으로서 또한 사용될 수 있다. 항-항-Id 항체는 항-Id 항체를 유도한 원래의 모노클로날 항체와 에피토프적으로 동일할 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체의 이디오타입 결정기에 대한 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론을 확인할 수 있다. 항-Id 항체는 임의의 적절한 기술, 예컨대 본 발명의 5T4-특이적 항체와 관련하여 본원의 다른 곳에 기재된 것들에 의해 변화되고/거나 (이에 의해 항-Id 항체 변이체가 생산됨), 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항-Id 항체가 담체 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 커플링되어, BALB/c 마우스를 면역화시키는 데 사용될 수 있다. 전형적으로 이러한 마우스로부터의 혈청은 원래의/모체 항-5T4 항체와 동일하지는 않더라도 유사한 결합 성질을 갖는 항-항-Id 항체를 함유할 것이다.
서열
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
본 발명이 하기 실시예에 의해 추가로 예시되고, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1 - 5T4 항체 및 스크리닝 물질의 생성
5T4에 대한 발현 구축물
다양한 전장 5T4 변이체의 발현을 위한 하기의 코돈-최적화 구축물들이 생성되었다: 인간 (호모 사피엔스) 5T4 (유니프롯 수탁 번호 Q13641), 시노몰거스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스) 5T4 (유니프롯 수탁 번호 Q4R8Y9), 및 닭 (갈루스 갈루스) 5T4 (유니프롯 수탁 번호 R4GM46). 추가적으로, 다양한 5T4 세포외 도메인 (ECD) 변이체를 위한 하기의 코돈-최적화 구축물이 생성되었다: C-말단 His 태그 (5T4ECDHis)가 있는 인간 5T4의 ECD (유니프롯 수탁 번호 Q13641로부터의 아미노산 1-355) (서열식별번호: 99), 및 토끼 Fc 도메인 및 C-말단 His-태그 (5T4ECD91-FcRbHis)에 융합된 인간 5T4의 ECD (아미노산 1-91). 서열식별번호: 99에서, 아미노산 잔기 1-31은 신호 펩티드이다; 따라서, 성숙 5T4ECDHis 단백질은 서열식별번호: 99의 아미노산 잔기 32-363에 상응한다. 마찬가지로, 서열식별번호: 100의 아미노산 잔기 1-31은 신호 펩티드이고, 성숙 5T4ECD91-FcRbHis 단백질은 서열식별번호: 100의 아미노산 잔기 32-327에 상응한다.
구축물은 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 및 최적의 코작 (GCCGCCACC) 서열 (Kozak, M., Gene 1999;234(2):187-208)을 함유하였다. 전장 인간 5T4 및 시노몰거스 원숭이 5T4 코돈-최적화 구축물을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.3 (인비트로젠(Invitrogen))에서 클로닝하였다. 전장 닭 5T4 코돈-최적화 구축물을 CMV 프로모터 및 HSV-TK 폴리A 신호로 이루어진 발현 카세트에 플랭킹된 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 인버터 말단 반복부를 함유하는 포유동물 발현 벡터인 pSB에서 클로닝하였다.
전장 인간, 시노몰거스 또는 닭 5T4를 일시적으로 발현하는 HEK-293F 세포주의 생성
프리스타일(Freestyle)™ 293-F (현탁 성장 및 화학적으로 규정된 프리스타일 배지에 적응된 HEK-293 서브클론 [HEK-293F]) 세포를 인비트로젠 (카탈로그 번호 R790-07)으로부터 수득하고, 제조사의 설명서에 따라 293펙틴 (인비트로젠, 카탈로그 번호 12347-019)을 사용하여 상기 기재된 코돈-최적화 구축물로 형질감염시켰다.
His-태그 5T4의 정제
5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질)를 상기 기술된 바와 같이 HEK-293F 세포에서 발현시켰다. 5T4ECD91-FcRbHis를 본질적으로 제조사가 기술한 바와 같이 Expi293F 발현 플랫폼 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬, 카탈로그 번호 A14527)을 사용하여 발현시켰다.
His-태그는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피로의 정제를 가능하게 한다. 이러한 공정에서, 크로마토그래피 수지 상에 고정된 킬레이터가 Co2+ 양이온으로 하전된다. His-태그 단백질을 함유하는 상청액을 배치 모드 (즉, 용액)에서 수지와 함께 인큐베이션하였다. His-태그 단백질은 수지 비드에 강하게 결합하는 한편, 배양 상청액에 존재하는 다른 단백질은 결합하지 않거나 또는 His-태그 단백질에 비교하여 약하게 결합한다. 인큐베이션 후, 비드를 상청액으로부터 회수하고, 칼럼 내로 패킹하였다. 약하게 결합된 단백질을 제거하기 위해 칼럼을 세정하였다. 그 후, 강하게 결합된 His-태그 단백질을 His가 Co2+에 결합하는 것과 경쟁하는 이미다졸을 함유하는 완충제로 용리시켰다. 용리액을 탈염 칼럼 상에서의 완충제 교환에 의해 제거하였다.
면역화
항체 IgG1-5T4-207 및 IgG1-5T4-226의 생성을 위해, HCo17-BalbC 트랜스제닉 마우스 (브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb), 미국 뉴욕주 뉴욕)를 14일 간격으로 시그마(Sigma) 아주반트 시스템 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스, 카탈로그 번호 S6322) 내의 20 ㎍의 5T4ECDHis 단백질로 교대로 복막내 (IP) 및 피하 (SC) 면역화시켰다. 총 8회의 면역화를 수행하였다: 4회의 IP 및 4회의 SC.
항체 IgG1-5T4-076 및 IgG1-5T4-059의 생성을 위해, HCo12-BalbC (IgG1-5T4-076) 및 HCo20-BalbC (IgG1-5T4-059) 트랜스제닉 마우스 (브리스톨-마이어스 스큅)를 14일 간격으로 시그마 아주반트 시스템 내의 20 ㎍의 5T4ECDHis 단백질로 교대로 IP 및 SC 면역화시켰다. 총 8회의 면역화를 수행하였다: 4회의 IP 및 4회의 SC.
항체 IgG1-5T4-085의 생성을 위해, HCo17-BalbC 트랜스제닉 마우스를 14일 간격으로 시그마 아주반트 시스템 내의 20 ㎍의 5T4ECDHis 단백질 및 20 ㎍의 5T4ECD91-FcRbHis 성숙 단백질로 교대로 IP 및 SC 면역화시켰다. 총 8회의 면역화를 수행하였다: 4회의 IP 및 4회의 SC.
항체 IgG1-5T4-106 및 IgG1-5T4-127의 생성을 위해, HCo12-BalbC (IgG1-5T4-106) 및 HCo17-BalbC (IgG1-5T4-127) 트랜스제닉 마우스를 14일 간격으로 시그마 아주반트 시스템 내의 20 ㎍의 5T4ECD91-FcRbHis 성숙 단백질로 교대로 IP 및 SC 면역화시켰다. 총 8회의 면역화를 수행하였다: 4회의 IP 및 4회의 SC.
하기 기술된 바와 같은 항원 특이적 스크리닝 형광측정 미세 부피 검정법 기술 (FMAT)에서 적어도 2개의 순차적인 5T4 특이적 항체 역가를 갖는 마우스에 10 ㎍의 5T4ECDHis 또는 10 ㎍ 5T4ECD91-FcRbHis (PBS 중, 정맥내 주사)를 부스팅하고, 3-4일 후에 이러한 마우스의 비장세포 및 림프절 세포를 융합시켰다.
균질 항원 특이적 스크리닝 검정법
면역화된 마우스의 혈청 또는 HuMAb (인간 모노클로날 항체) 하이브리도마 또는 트랜스펙토마 배양 상청액 내의 5T4 항체의 존재를 FMAT (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하는 균질 항원 특이적 스크리닝 검정법에 의해 결정하였다. 이를 위해, 4가지 세포 기반 검정법의 조합을 사용하였다.
면역화된 마우스로부터의 혈청, 또는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마 배양 상청액 샘플을 인간 항체가 인간 5T4를 일시적으로 발현하는 HEK-293F 세포, 시노몰거스 원숭이 5T4를 일시적으로 발현하는 HEK-293F 세포, 5T4ECD91-FcRBHis로 코팅된 스트렙타비딘-코팅 폴리스티렌 입자 (0.5% w/v; 6.7 ㎛; 스페로테크(Spherotech), 미국 일리노이주 레이크 포레스트, 카탈로그 번호 SVP-60-5), 및 HEK-293 야생형 세포 (음성 대조군)에 결합하는 것에 대해 분석하였다.
5T4에 결합하는 것을 허용하도록 샘플을 세포에 첨가하였다. 이어서, HuMAb의 결합을 형광 접합체 (어피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-인간 IgG Fc 감마-알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647; 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 109-605-098)를 사용하여 검출하였다. IgG1-5T4-H8-F405L이 양성 대조군으로서 사용되었고, 크롬퓨어(ChromPure) 인간 IgG, 전체 분자 (잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 009-000-003)가 음성 대조군으로서 사용되었다. 샘플을 이미지익스프레스 벨로스(ImageXpress Velos) (몰레큘러 디바이시즈 엘엘씨(Molecular devices LLC), 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 스캐닝하고, 총 형광을 판독물로서 사용하였다. 카운트가 50을 초과하고, 카운트 × 형광이 음성 대조군보다 적어도 3배 더 높은 경우에 샘플이 양성으로 진술되었다.
HuMAb 하이브리도마 생성
충분한 항원-특이적 역가 발달 (상기 기술됨)이 있는 HuMAb 마우스를 희생시키고, 비장 및 복부 대동맥 및 대정맥 측면의 림프절을 수집하였다. 본질적으로 제조사의 설명서에 따라 사이토펄스(CytoPulse) CEEF 50 전기융합 시스템 (셀렉티스(Cellectis), 프랑스 파리)을 사용하여 전기융합에 의해 비장세포 및 림프절 세포를 마우스 골수종 세포주 (SP2.0 세포)에 융합시켰다. 다음으로, 항원-양성 1차 웰을 클론픽스(ClonePix) 시스템 (제네틱스(Genetix), 영국 햄프셔)을 사용하여 서브클로닝하였다. 이를 위해, 특이적 1차 웰 하이브리도마를 40% 클론미디어(CloneMedia) (제네틱스, 영국 햄프셔) 및 60% HyQ 2× 완전 배지 (하이클론(Hyclone), 미국 월섬)로부터 제조된 반고체 배지에 시딩하였다. 서브클론을 상기 기술된 항원-특이적 결합 검정법에 따라 5T4 결합에 대해 다시 시험하고, 아이소사이트(IsoCyte) 시스템 (몰레큘러 디바이시즈)을 사용하여 스캐닝하였다. 추가 확장을 위한 최상의 생산 클론/1차 웰을 선별하기 위해 옥텟 시스템 (포르테바이오, 미국 멘로 파크)을 사용하여 IgG 수준을 측정하였다. 생성된 HuMAb 하이브리도마를 표준 프로토콜 (예를 들어, 문헌 [Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006]에 기술된 바와 같음)에 기초하여 추가로 확장 및 배양시켰다.
5T4 항체 가변 도메인의 서열 분석 및 발현 벡터에서의 클로닝
2 내지 5×106개의 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 제조하고, 제조사의 설명서에 따라 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (클론테크(Clontech))를 사용하여, 100 ng의 총 RNA로부터 5'-RACE-상보적 DNA (cDNA)를 제조하였다. VH 및 VL 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, 라이게이션 독립적 클로닝 (Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74)에 의해, p33G1f 및 p33카파 발현 벡터 (각각 코돈 최적화 인간 IgG1m(f) 및 카파 불변 도메인이 있는 pcDNA3.3 기반 벡터)에 인-프레임으로 직접적으로 클로닝하였다. 이러한 발현 벡터들로부터의 가변 도메인을 시퀀싱하고, IMGT 정의 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999] 및 [Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)])에 따라 CDR을 주해하였다. 정확한 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 갖는 클론을 발현시켰고, 항원에 결합하는 것에 대해 시험하였다. 선도 패널을 코돈 최적화 서열로서 정하고 (진아트(GeneArt), 써모 피셔 사이언티픽), 제조사의 설명서 (써모 피셔 사이언티픽)에 따라 Expi293 발현 시스템으로 생산하였다. 이러한 상청액 내의 항체를 정제하고, 기능적 특성화에 사용하였다. 생성된 선도 클론의 서열이 상기 표에서 제시된다.
5T4 대조군 항체
실시예 중 일부에서, 기존에 WO2007/106744에서 기술된 5T4에 대한 비교 항체를 사용하였다 (IgG1-5T4-H8, IgG1-5T4-A3 및 IgG1-5T4-A1). 코돈 최적화 항체 코딩 서열을 합성하고, pCDNA3.3 발현 벡터 (써모 피셔 사이언티픽)에서 클로닝하였다.
IgG1-b12 항체
실시예 중 일부에서, HIV-1 gp120 특이적 항체인 항체 b12 (Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5; 230(3):812-23)가 음성 대조군으로서 사용되었다. 이러한 대조군 항체에 대한 코돈 최적화 항체 코딩 서열을 합성하고, pCDNA3.3 발현 벡터 (써모 피셔 사이언티픽) 내로 클로닝하였다. 가변 중쇄 (VH) 영역의 서열 및 가변 경쇄 (VL) 영역의 서열이 각각 서열식별번호: 97 및 98로서 본원에 포함된다.
실시예 2 - 생물층 간섭측정법을 사용한 5T4 특이적 항체의 결합 친화도의 결정
재조합 5T4 단백질에 대한 5T4 항체의 친화도를 옥텟 HTX 기구 (포르테바이오, 영국 포츠머스) 상에서 무표지 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정하였다. 5T4 항체 (1 ㎍/mL)를 600초 동안 항-인간 IgG Fc 포착 바이오센서 (포르테바이오) 상에 고정시켰다. 기준선 측정 (100초) 후, 30℃에서 1000 rpm으로 진탕하면서, 3.58 ㎍/mL (100 nM)의 인간 5T4ECDHis 또는 3.99 ㎍/mL (100 nM) 시노몰거스 5T4에서 시작하는 2배 희석 시리즈 (100 nM 내지 1.56 nM 범위)를 사용하여, 샘플 희석제 (포르테바이오) 내의 인간 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질) 또는 재조합 시노몰거스 원숭이 5T4 단백질 (쿠사바이오; 카탈로그 번호 CSB-MP024093MOV)의 회합 (200초) 및 해리 (1000초)를 결정하였다. 데이터 분석 소프트웨어 v9.0.0.12 (포르테바이오)로 데이터를 분석하였다. 각각의 항체에 대해 개별적으로, 회합 및 해리 단계 동안 샘플 희석제만 함유하는 기준 웰의 값을 항원을 함유하는 웰의 값으로부터 차감하였다. Y축을 기준선의 마지막 10초에 대해 정렬하고, 해리에 대한 단계간 보정 정렬, 뿐만 아니라 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 필터링을 적용하였다. 반응 < 0.05 nm는 분석으로부터 제외하였다. 200초 회합 시간 및 1000초 또는 50초 해리 시간을 관심 영역(Window of Interest)으로 하여 1:1 모델 및 글로벌 풀 핏(global full fit)을 사용하여 데이터를 핏팅하였다. 완전한 해리 시간 (1000초)을 관심 영역으로 하는 핏이 디폴트로 사용되었다. R2 값 및 핏의 육안 검사에 기초하여, IgG1-5T4-127-FEAR에 대해 50초의 해리 시간이 관심 영역으로서 사용되었다.
표 1은 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 인간 5T4ECDHis에 대한 5T4 항체의 회합 속도 상수 k a (1/Ms), 해리 속도 상수 k d (1/s) 및 평형 해리 상수 K D (M)를 나타낸다. 인간 5T4에 대한 항체의 친화도의 범위가 1.3×10-9 - 2.7×10-8 M 범위로 측정되었다. IgG1-5T4-085-FEAR의 반응은 0.05 nm보다 낮았고, 이는 데이터의 적합한 핏팅을 방지하였다 (이러한 핏에 대한 낮은 R2 값). 추가로, IgG1-5T4-076-FEAR의 반응이 적합하게 핏팅될 수 없었다. 이러한 데이터는 이탤릭체로 제시된다.
표 2는 생물층 간섭측정법으로 결정된 시노몰거스 원숭이 5T4에 대한 회합 속도 상수 k a (1/Ms), 해리 속도 상수 k d (1/s) 및 평형 해리 상수 K D (M)를 나타낸다. 시노몰거스 원숭이 5T4에 대한 항체의 친화도의 범위가 1.1×10-9 - 4.1×10-8 M 범위로 측정되었다. IgG1-5T4-085-FEAR, IgG1-5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-H8-FEAR의 반응은 0.05 nm보다 낮았고, 이는 데이터의 적합한 핏팅을 방지하였다 (이러한 핏에 대한 낮은 R2 값). 추가로, IgG1-5T4-076-FEAR의 반응이 적합하게 핏팅될 수 없었다. 이러한 데이터는 이탤릭체로 제시된다.
표 1: 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 인간 5T4 세포외 도메인에 대한 단일특이적, 2가 5T4 항체의 결합 친화도.
Figure pct00017
표 2: 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 시노몰거스 원숭이 5T4 세포외 도메인에 대한 단일특이적, 2가 5T4 항체의 결합 친화도.
Figure pct00018
실시예 3 - 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 5T4 항체의 교차-차단
항체 교차-차단 분석 (에피토프 비닝)을 옥텟 HTX 기구 (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법을 사용하여 수행하였다. 5T4 항체 (10 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 6.0 내의 20 ㎍/mL, 포르테바이오)를 제조사의 설명서에 따라 아민-반응성 2세대 (AR2G) 바이오센서 (포르테바이오) 상에 고정시켰다. 샘플 희석제 (포르테바이오)에서의 기준선 측정 (100초) 후, 고정된 항체를 함유하는 바이오센서에 500초 동안 인간 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질) 100 nM (3.6 ㎍/mL)을 로딩하였다. 다음으로, 제2 5T4 항체 (10 ㎍/mL)의 회합 반응을 500초 동안 결정하였다. 10 mM 글리신 pH 2.5에 이어서 샘플 희석제에 5초 동안 노출시키는 것 3회에 의해 바이오센서를 재생시키고, 기준선 단계로부터 시작하여 제2 5T4 항체의 새로운 세트로 측정을 반복하였다. 각각의 바이오센서가 4회 사용되었다. 1000 rpm의 진탕기 속도를 사용하여 30℃에서 측정을 수행하였다. 데이터 분석 소프트웨어 v9.0.0.12 (포르테바이오)를 사용하여 데이터를 분석하였다. Y축을 회합 단계에 대해 정렬하고, 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. 고정된 항체로부터의 5T4ECDHis의 해리에 대해 보정하기 위해 회합 단계 동안의 샘플 희석제의 반응을 제2 항체의 회합 반응으로부터 차감하였다. 보정된 회합 반응을 행렬 형식으로 플롯팅하였다. 일반적으로, 반응 > 0.1 nm는 비-차단 항체 쌍 (백색)으로 간주된 한편, -0.1 내지 0.1 nm의 반응은 차단 항체 쌍 (진회색)으로 간주되었다. 일부 항체 쌍의 경우, 제2 항체가 초기의 양성 반응에 이어서 신호 감소를 나타냈다. 이는 항체 전위 (담회색), 즉 제2 항체가 제1 항체와 항원 사이의 상호작용을 전위시키는 것으로 간주되었다 (Abdiche YN, Yeung AY, Ni I, Stone D, Miles A, Morishige W, et al. (2017) Antibodies Targeting Closely Adjacent or Minimally Overlapping Epitopes Can Displace One Another. PLoS ONE 12(1): e0169535. doi:10.1371/journal.pone.0169535). 일부 경우에, 데이터 곡선은 항체 쌍에 차단, 비-차단 또는 전위 성질을 할당하기 위해 전문가에 의한 육안 검사를 필요로 하였다.
교차-차단 실험을 항체 IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-076-FEAR, IgG1-5T4-085-FEAR, IgG1-5T4-106-FEAR, IgG1-5T4-127-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR, 및 종래 기술 항체 IgG1-5T4-H8-FEAR, IgG1-5T4-A1-F405L 및 IgG1-5T4-A3-F405L에 대해 수행하였다. 결과가 표 3에서 요약된다.
(IgG1-5T4-A1-F405L 자체를 제외하고는) 항체 중 어느 것도 IgG1-5T4-A1-F405L이 5T4ECDHis에 결합하는 것을 차단하지 않았다. 항체 IgG1-5T4-076-FEAR, IgG1-5T4-085-FEAR, IgG1-5T4-127-FEAR, IgG1-5T4-106-FEAR, IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR (뿐만 아니라 IgG1-5T4-H8-FEAR 자체)는 IgG1-5T4-H8-FEAR이 5T4ECDHis에 결합하는 것을 차단하였다. 항체 IgG1-5T4-076-FEAR, IgG1-5T4-085-FEAR, 및 IgG1-5T4-127-FEAR (뿐만 아니라 IgG1-5T4-A3-F405L 자체)은 또한 IgG1-5T4-A3-F405L이 5T4ECDHis에 결합하는 것을 차단한 한편, 항체 IgG1-5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-H8-FEAR은 IgG1-5T4-A3-F405L이 5T4ECDHis에 결합하는 것을 차단하지 않았다. 항체 IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR은 IgG1-5T4-A3-F405L과 조합되어 항체 전위를 나타냈고, 이는 실시예 4에서 더욱 상세하게 기술된다.
표 3: 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 항체 교차-차단
제1 열은 고정된 항체를 나타내고, 제1 행은 용액 내의 항체를 나타낸다. 용액 내의 항체의 보정된 회합 반응이 제시된다. 항체들의 교차-차단은 진회색에 의해 나타내고, 전위 항체 조합은 담회색 및 별표로 나타낸다. 비-차단 항체 조합은 표시되지 않는다 (투명 배경).
Figure pct00019
실시예 4 - IgG1-5T4-A3-F405L과 조합된 IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR의 항체 전위
옥텟 HTX 기구 (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법을 사용하여 항체 전위가 입증되었다. IgG1-5T4-A3-F405L (10 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 6.0 내의 20 ㎍/mL, 포르테바이오)을 제조사의 설명서에 따라 아민-반응성 2세대 (AR2G) 바이오센서 (포르테바이오) 상에 고정시켰다. 샘플 희석제 (포르테바이오)에서의 기준선 측정 (100초) 후, 고정된 IgG1-5T4-A3-F405L 항체를 함유하는 바이오센서에 500초 동안 인간 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질) 100 nM (3.6 ㎍/mL)을 로딩하였다. 다음으로, 제2 5T4 항체 (IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 또는 IgG1-5T4-226-FEAR; 10 ㎍/mL) 또는 샘플 희석제 (완충제 대조군)의 회합 반응을 500초 동안 결정하였다. 1000 rpm의 진탕기 속도를 사용하여 30℃에서 실험을 수행하였다. 데이터 분석 소프트웨어 v9.0.0.12 (포르테바이오)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 고정된 IgG1-5T4-A3-F405L로부터의 인간 5T4ECDHis의 해리를 보정하기 위해 완충제 대조군 반응을 제2 항체의 반응으로부터 차감하고, Y축을 회합 단계에 대해 정렬하고, 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, IgG1-5T4-A3-F405L이 결합을 나타내지 않았고, 이는 IgG1-5T4-A3-F405L로의 교차-차단 (자가-차단)을 나타낸다. IgG1-5T4-H8-FEAR은 5T4ECDHis에 결합하는 것을 나타냈고, 따라서 IgG1-5T4-A3-F405L과의 교차-차단이 없었다. IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR은 초기에는 양성 반응을 나타냈고 (IgG1-5T4-A3-F405L과의 교차-차단 대신 IgG1-5T4-A3-F405L-5T4ECDHis 복합체에 결합하는 것을 나타냄), 이어서 반응이 감소하였으며, 반응이 IgG1-5T4-A3-F405L의 자가-차단 반응 미만으로 하락하였다. 이것은 IgG1-5T4-A3-F405L-5T4ECDHis 복합체로부터의 질량 손실을 나타내고, 이는 IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR이 복합체에 결합 시 IgG1-5T4-A3-F405L로부터의 인간 5T4ECDHis의 해리를 유도한다는 것을 나타낸다. 이러한 현상은 항체 전위로서 기술되고, 에피토프들이 밀접하게 인접하거나 또는 최소한으로 중첩된다는 것을 나타낸다 (Abdiche YN, Yeung AY, Ni I, Stone D, Miles A, Morishige W, et al. (2017) Antibodies Targeting Closely Adjacent or Minimally Overlapping Epitopes Can Displace One Another. PLoS ONE 12(1): e0169535. doi:10.1371/journal.pone.0169535)). 이것은 항체 IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR이 IgG1-5T4-A3-F405L과 비교하여 5T4 상의 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - 유동 세포측정법으로 측정된 막-결합 5T4에 대한 5T4 항체의 동시 결합
IgG1-5T4-A1-F405L 및 IgG1-5T4-A3-F405L의 존재 하의 막-결합 5T4에 대한 IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. IgG1-5T4-H8-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR을 제조사의 설명서에 따라 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC, 써모 피셔 사이언티픽)에 접합시켰다. 약 20,000개의 5T4 분자/세포를 발현하는 SK-OV-3 세포 (조건 당 50,000개의 세포)를 10 ㎍/mL 미접합 5T4 항체 (IgG1-5T4-H8-FEAR, IgG1-5T4-A1-F405L, IgG1-5T4-A3-F405L, IgG1-b12, IgG1-5T4-207-FEAR 또는 IgG1-5T4-226-FEAR) 및 2 ㎍/mL FITC-접합 5T4 항체 (IgG1-5T4-H8-FEAR-FITC, IgG1-5T4-207-FEAR-FITC 및 IgG1-5T4-226-FEAR-FITC)의 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 표 4는 시험 조합물의 개관을 나타낸다. 4℃에서의 30분 인큐베이션 후, 세포를 1200 RPM으로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 세포를 1:4000 토프로-3-아이오다인 (몰레큘러 프로브스(Molecular Probes))이 보충된 100 ㎕ FACS-완충제에 재현탁시켰다. 유동 세포측정기 (FACS 포르테사(Fortessa), BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 FITC 신호의 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하였다. 하기 식을 사용하여 결합 백분율을 계산하였다:
Figure pct00020
도 2는 IgG1-5T4-H8-FEAR-FITC, IgG1-5T4-207-FEAR-FITC 및 IgG1-5T4-226-FEAR-FITC의 결합이 이들의 미접합 대응물의 존재 하에 차단되었음을 나타낸다. 그러나, 막-결합 5T4에 대한 IgG1-5T4-207-FEAR-FITC 및 IgG1-5T4-226-FEAR-FITC의 결합이 IgG1-5T4-A1-F405L, IgG1-5T4-A3-F405L 또는 IgG1-b12의 존재 하에 여전히 관찰되었고, 미접합 IgG1-5T4-A1-F405L, IgG1-5T4-A3-F405L 또는 IgG1-b12의 존재 하의 막-결합 5T4에 대한 IgG1-5T4-H8-FEAR-FITC의 결합과 유사하였다. 이것은 항체 IgG1-5T4-H8-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR이 항체 IgG1-5T4-A1-F405L 및 IgG1-5T4-A3-F405L과 비교하여 5T4 상의 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다.
표 4: 유동 세포측정법 실험에서 사용된 항체 조합의 개관
Figure pct00021
실시예 6 - 인간 또는 닭 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 5T4 항체의 결합
5T4 항체가 전장 인간 또는 닭 5T4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포 (실시예 1에 기술된 바와 같이 생성됨)에 결합하는 것을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 세포 (5×104개의 세포/웰)를 4℃에서 30분 동안 50 ㎕ PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제) 내의 일련의 5T4 항체 희석물 (3배 희석 단계로 0.01 내지 10 ㎍/mL 범위)와 함께 폴리스티렌 96웰 둥근바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner bio-one), 카탈로그 번호 650180)에서 인큐베이션하였다. 염색 완충제에서 2회 세정한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 50 ㎕ R-피코에리트린 (PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (염색 완충제 중 1:500; 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈 인크(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 펜실베니아주 웨스트 그로브, 카탈로그 번호 109-116-098)에서 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충제에서 2회 세정하고, 20 ㎕ 염색 완충제에 재현탁시키고, iQue 스크리너 (인텔리사이트 코포레이션(Intellicyt Corporation), 미국) 상에서 분석하였다. 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하는 비-선형 회귀 (가변 기울기의 S자형 용량-반응)에 의해 결합 곡선을 분석하였다.
도 3A는 전장 인간 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR, IgG1-5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-F405L의 용량-의존적 결합을 나타낸다. 도 3B는 전장 닭 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 용량-의존적 결합이 관찰된 한편, IgG1-5T4-A3-F405L은 전장 닭 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 최소 결합을 나타냈음을 나타낸다. 음성 대조군 항체인 IgG1-b12-K409R은 10 ㎍/mL의 농도에서 전장 인간 또는 닭 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다.
실시예 7 - 종양 세포에서의 5T4 항체의 내재화 능력
1가 5T4 항체의 내재화 능력을 특성화하기 위해 실험을 수행하였다. 세포내 페이로드 전달 및 생성된 세포독성이 표적 결합 시의 5T4 항체의 내재화의 판독물로서 사용되었다. 1개의 Fab-아암으로 5T4를 인식하는 한편 제2 Fab-아암으로 관련되지 않은 항원 (종양 세포 상에서 발현되지 않는 HIV-1 gp120)을 인식하는 이중특이적, 독소-접합 항체가 미접합 5T4 항체와 미세관-파괴제 듀오스타틴-3이 접합된 (HIV-1 gp120-특이적) IgG1-b12 항체의 제어된 Fab-아암 교환에 의해 생성되었다. 생성된 이중특이적 듀오스타틴-3 접합 항체는 항체 당 1개의 독소 분자를 보유한다 (약물-항체 비 1). 5T4에 1가로 결합하는 듀오스타틴-3 접합 이중특이적 항체의 일련의 희석물 (0.00152-10 ㎍/mL, 3배)을 편평바닥 96웰 조직 배양 플레이트 (5,000개의 세포/웰; 그라이너-바이오-원, 네덜란드, 카탈로그 번호 655180)에 시딩된 MDA-MB-468 (유방암 세포주, ATCC, 클론 HTB-132) 또는 HCC1954 (유방암 세포주, ATCC, 클론 CRL-2338) 세포에 첨가하였다. 세포를 5일 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 제조사의 설명서에 따라 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 발광성 세포 생존율 검정법 (프로메가(Promega), 미국, 카탈로그 번호 G7570)을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하는 비-선형 회귀 (가변 기울기의 S자형 용량-반응)를 사용하여 세포독성 곡선을 분석하였다.
도 4는 MDA-MB-468 (A) 또는 HCC1954 세포 (B)에서의 5T4에 1가로 결합하는 듀오스타틴-3 접합 이중특이적 항체의 세포독성 능력을 나타낸다. bsIgG1-5T4-H8-FEARxb12-vcDuo3은 고도로 세포독성을 유도할 수 있고, 이는 항체의 효과적인 내재화 능력을 나타낸다. 대조적으로, bsIgG1-5T4-076-FEARxb12-vcDuo3, bsIgG1-5T4-085-FEARxb12-vcDuo3 및 bsIgG1-5T4-127-FEARxb12-vcDuo3은 어떠한 세포독성도 유도하지 않았다; 용량 반응 곡선이 비-결합 IgG1-b12-vcDuo3 대조군 항체의 것과 유사하였다. 이는 막-결합 5T4에 결합 시의 이러한 항체의 불량한 내재화를 나타낸다. bsIgG1-5T4-059-FEARxb12-vcDuo3, bsIgG1-5T4-106-FEARxb12-vcDuo3, bsIgG1-5T4-207-FEARxb12-vcDuo3, 및 bsIgG1-5T4-226-FEARxb12-vcDuo3은 둘 다의 시험된 세포주에서 중등도의 세포독성을 유도하였고, 이는 이러한 1가 5T4 항체들이 내재화를 유도하지만, bsIgG1-5T4-H8-FEARxb12-vcDuo3보다 더 적은 정도라는 것을 나타낸다.
실시예 8 - CD3×5T4 이중특이적 항체의 생성을 위한 인간화 CD3 항체
인간화 항체 IgG1-huCD3-H1L1의 생성이 WO2015/001085의 실시예 1에서 기술된다. IgG1-huCD3-H1L1은 본원에서'IgG1-huCD3'으로 지칭된다. 항체 IgG1-huCD3-H1L1-FEAL은 제어된 Fab-아암 교환을 통해 이중특이적 항체의 생성을 허용하는 돌연변이에 더하여, IgG Fc 수용체 (Fc 감마 수용체 [FcγR]) 및 보체와의 상호작용을 방지하는 Fc 도메인 내의 아미노산 치환이 있는 본원의 변이체이다; 본원에서 상기 기술된 바와 같은 L234F, L235E, D265A 및 F405L. 이러한 돌연변이는 이들이 도입되는 항체의 표적 결합에 대한 효과가 없다는 것이 이전에 입증되었다 (예를 들어, US 2015/0337049를 참조한다)
인간화 항체 IgG1-huCD3-H1L1-H101G의 생성이 WO2017/009442의 실시예 2에서 기술된다. IgG1-huCD3-H1L1-H101G은 'IgG1-huCD3-H101G'로 지칭될 것이다. 항체 IgG1-huCD3-H101G-FEAL은 본원에서 상기 기술된 바와 같은 아미노산 치환 L234F, L235E, D265A 및 F405L이 있는 본원의 변이체이다.
실시예 9 - 생물층 간섭측정법을 사용한 CD3 결합 친화도 결정
IgG1-huCD3 및 IgG1-huCD3-H101G를 포함하는 선택된 CD3 항체의 결합 친화도를 WO2017/009442의 실시예 7에 기술된 바와 같이 결정하였다.
간단하게, 재조합 가용성 CD3ε (CD3E27-GSKa) (서열식별번호: 101의 성숙 단백질)에 대한 IgG1-huCD3-FEAL 형식의 선택된 CD3 항체의 결합 친화도를 포르테바이오 옥텟 HTX (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정하였다. 항-인간 Fc 포착 바이오센서 (포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5060)에 600초 동안 hIgG (1 mg/mL)를 로딩하였다. 기준선 측정 (200초) 후, 3배 희석 단계 (샘플 희석제, 포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5028)로 27.11 ㎍/mL - 0.04 ㎍/mL (1000 nM - 1.4 nM)의 CD3E27-GSKa 농도 범위를 사용하여 CD3E27-GSKa의 회합 (1000초) 및 해리 (2000초)를 결정하였다. 계산을 위해, 아미노산 서열에 기초하는 CD3E27-GSKa의 이론적 분자 질량, 즉 27.11 kDa을 사용하였다. 30℃에서 1000 rpm으로 진탕하면서 실험을 수행하였다. 각각의 항체를 적어도 2회의 독립적인 실험에서 시험하였다. 1000초 회합 시간 및 100초 해리 시간으로 1:1 모델 및 글로벌 풀 핏을 사용하여, 포르테바이오 데이터 분석 소프트웨어 v8.1로 데이터를 분석하였다. 기준 곡선 (바이오센서 상의 항체, 샘플 희석제 단독으로의 측정)에 의해 데이터 트레이스를 보정하고, Y축을 기준선의 마지막 10초에 대해 정렬하고, 단계간 보정 정렬, 뿐만 아니라 사비츠키-골레이 필터링을 적용하였다. 반응 <0.05 nm의 데이터 트레이스는 분석에서 배제하였다.
표 5는 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 재조합 CD3ε에 대한 회합 속도 상수 k a (1/Ms), 해리 속도 상수 k d (1/s) 및 평형 해리 상수 K D (M)를 나타낸다. IgG1-huCD3-H101G-FEAL (K D: 638 nM)에 비교하여 IgG1-huCD3-FEAL은 재조합 CD3ε에 대한 비교적 높은 (K D: 15 nM) 결합 친화도를 나타냈다.
표 5: 무표지 생물층 간섭측정법에 의해 결정된 바와 같은 재조합 CD3ε에 대한 단일특이적, 2가 CD3 항체의 결합 친화도
Figure pct00022
실시예 10 - 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성
듀오바디(DuoBody)® 플랫폼 기술, 즉 WO2011147986, WO2011131746 및 WO2013060867 (Genmab) 및 라브린(Labrijn) 등의 문헌 [Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50]; [Gramer et al., MAbs 2013, 5: 962-973]에 기술된 바와 같은 2-MEA-유도 Fab-아암 교환을 사용하여 시험관내에서 이중특이적 항체를 생성시켰다. 이러한 방법에 의한 이중특이적 항체의 생산을 가능하게 하기 위해, CH3 도메인 내에 단일 돌연변이를 보유하는 IgG1 분자가 생성되었다: 한 모체 IgG1 항체에서는 F405L 돌연변이 (즉, CD3 항체), 다른 모체 IgG1 항체에서는 K409R 돌연변이 (즉, 5T4 또는 대조군, HIV-1 gp120-특이적, 항체). 이러한 돌연변이에 더하여, 모체 IgG1 항체는 IgG Fc 수용체 (Fc 감마 수용체) 및 보체와 상호작용할 수 없는 Fc 도메인을 초래하는 치환을 포함하였다: L234F, L235E, D265A (FEA).
이중특이적 항체를 생성시키기 위해, 2개의 모체 항체를 PBS 완충제 (포스페이트 완충 염수; 8.7 mM HPO4 2-, 1.8 mM H2PO4 -, 163.9 mM Na+, 140.3 mM Cl-, pH 7.4)에서 동일한 질량으로 혼합하였다. 2-메르캅토에틸아민-HCl (2-MEA)을 75 mM의 최종 농도로 첨가하고, 반응 혼합물을 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 사슬간 디술피드 결합의 재산화 및 무손상 이중특이적 항체의 형성을 허용하기 위해 제조사의 설명서에 따라 10 kDa 분자량 차단 슬라이드-A-라이저(Slide-A-Lyzer) 캐리어지 (써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 PBS 완충제 내로 투석함으로써 2-MEA를 제거하였다.
하기의 항체가 실시예에서 사용되었다:
CD3 항체
IgG1-huCD3-FEAL (서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 60에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐).
IgG1-huCD3-H101G-FEAL (서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 60에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
5T4 항체
IgG1-5T4-207-FEAR (서열식별번호: 40 및 서열식별번호: 44에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-226-FEAR (서열식별번호: 47 및 서열식별번호: 51에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-059-FEAR (서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 9에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-076-FEAR (서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 16에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-085-FEAR (서열식별번호: 19 및 서열식별번호: 23에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-106-FEAR (서열식별번호: 26 및 서열식별번호: 30에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-127-FEAR (서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 37에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-H8-FEAR (와이어스(Wyeth) (WO 2007/106744 및 US2010/0173382)로부터의 5T4 항체 H8에 기초하고, 서열식별번호: 87 및 서열식별번호: 88에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-A1-F405L (와이어스 (WO 2007/106744 및 US8044178)로부터의 5T4 항체 A1에 기초하고, 서열식별번호: 83 및 서열식별번호: 84에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-A1-FEAR (와이어스 (WO 2007/106744 및 US8044178)로부터의 5T4 항체 A1에 기초하고, 서열식별번호: 83 및 서열식별번호: 84에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-A3-F405L (와이어스 (WO 2007/106744 및 US8759495)로부터의 5T4 항체 A3에 기초하고, 서열식별번호: 85 및 서열식별번호: 86에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
IgG1-5T4-A3-FEAR (와이어스 (WO 2007/106744 및 US8759495)로부터의 5T4 항체 A3에 기초하고, 서열식별번호: 85 및 서열식별번호: 86에 기재된 VH 및 VL 서열을 가짐)
이중특이적 항체
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-076-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-085-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-127-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-H8-FEAR
bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-H8-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR
bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR
bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR
플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지 이중특이적 항체
bsIgG1-b12-FEALx5T4-059-FEAR-FITC
bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR-FITC
bsIgG1-b12-FEALx5T4-226-FEAR-FITC
bsIgG1-5T4-A1-F405Lxb12-FEAR-FITC
bsIgG1-5T4-A3-F405Lxb12-FEAR-FITC
듀오스타틴-3 접합 이중특이적 항체
bsIgG1-5T4-H8-FEARxb12-vcDuo3
bsIgG1-5T4-076-FEARxb12-vcDuo3
bsIgG1-5T4-085-FEARxb12-vcDuo3
bsIgG1-5T4-127-FEARxb12-vcDuo3
bsIgG1-5T4-059-FEARxb12-vcDuo3
bsIgG1-5T4-106-FEARxb12-vcDuo3
bsIgG1-5T4-207-FEARxb12-vcDuo3
bsIgG1-5T4-226-FEARxb12-vcDuo3.
비-결합 대조군 항체
IgG-b12는 실시예 중 일부에서 이중특이적 항체에 대한 음성, 비-결합, 대조군 제2 아암으로서 사용되는 HIV-1 gp120 특이적 항체이다 (Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5; 230(3):812-23).
IgG1-b12-F405L은 치환 F405L이 있는 본원의 변이체이다.
IgG1-b12-FEAL은 제어된 Fab-아암 교환을 통해 이중특이적 항체의 생성을 허용하는 돌연변이에 더하여, IgG Fc 수용체 (Fc 감마 수용체) 및 보체와 상호작용할 수 없는 Fc 도메인을 초래하는 치환이 있는 본원의 변이체이다: L234F, L235E, D265A 및 F405L.
IgG1-b12-K409R은 치환 K409R이 있는 본원의 변이체이다.
IgG1-b12-FEAR은 제어된 Fab-아암 교환을 통해 이중특이적 항체의 생성을 허용하는 돌연변이에 더하여, IgG Fc 수용체 (Fc 감마 수용체) 및 보체와 상호작용할 수 없는 Fc 도메인을 초래하는 치환이 있는 본원의 변이체이다: L234F, L235E, D265A 및 K409R.
실시예 11 - HEK-293 세포에서 발현된 시노몰거스 원숭이 및 인간 5T4에 대한 CD3×5T4 이중특이적 항체의 결합
인간 5T4 또는 시노몰거스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스) 5T4로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포 (실시예 1에 기술된 바와 같이 생성됨)의 형질막에 대한 이중특이적, 1가 CD3×5T4 항체 및 단일특이적, 2가 5T4 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
세포 (3×104개의 세포/웰)를 4℃에서 30분 동안 100 ㎕ PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제) 내의 일련의 항체 희석물 (3배 희석 단계로 0.0137 내지 10 ㎍/mL 범위)와 함께 폴리스티렌 96웰 둥근바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원), 카탈로그 번호 650180)에서 인큐베이션하였다. 실험을 기술적 중복으로 수행하였다. 염색 완충제에서 2회 세정한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 50 ㎕ 2차 항체에서 인큐베이션하였다. 2차 항체로서, 염색 완충제에 1:200 희석된 FITC-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (서던 바이오테크(Southern Biotech), 미국, 카탈로그 번호 2043-02)가 모든 실험에서 사용되었다. 세포를 염색 완충제에서 2회 세정하고, 30 ㎕ 염색 완충제에 재현탁시키고, iQue 스크리너 (인텔리사이트 코포레이션, 미국) 상에서 분석하였다. 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하는 비-선형 회귀 (가변 기울기의 S자형 용량-반응)를 사용하여 결합 곡선을 분석하였다.
도 5(i) (왼쪽 패널)은 5T4에 1가로 결합하는 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (A), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR (B), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR (C) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-H8-FEAR (D)이 인간 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 용량-의존적 결합을 나타내고, 이는 각각 단일특이적, 2가 5T4 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR, IgG1-5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-H8-FEAR의 결합과 유사하였음을 나타낸다.
도 5(i) (오른쪽 패널)은 5T4에 1가로 결합하는 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (A), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR (B), 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR (C)이 시노몰거스 원숭이 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 용량-의존적 결합을 나타내고, 이는 각각 단일특이적, 2가 5T4 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR의 결합과 유사하였음을 나타낸다. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-H8-FEAR 및 IgG1-5T4-H8-FEAR은 시노몰거스 원숭이 5T4에 대한 불량한 결합을 나타내고, 이는 실시예 2 및 WO2007/106744에 기술된 실험과 일치한다. 음성 대조군으로서, IgG1-b12-K409R (3 ㎍/mL)이 이러한 실험에 포함되었고, 이는 인간 또는 시노몰거스 원숭이 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다.
제2 실험에서, 미미한 조정과 함께 상기 기술된 바와 같이 염색을 수행하였다. 세포를 5배 희석 단계로 0.000128 내지 10 ㎍/mL 범위의 일련의 항체 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 2차 항체로서, 염색 완충제에 1:200 희석된 피코에리트린 (PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치, 영국, 카탈로그 번호 109-116-098)가 사용되었다.
도 5(ii)는 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR (A), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR (B), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR (C), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-106-FEAR (D), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-076-FEAR 및 IgG1-5T4-076-FEAR (E), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-085-FEAR 및 IgG1-5T4-085-FEAR (F), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-127-FEAR 및 IgG1-5T4-127-FEAR (G), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A1-FEAR (H), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR (I)이 인간 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포 (왼쪽 패널), 뿐만 아니라 시노몰거스 원숭이 5T4로 형질감염된 HEK-293 세포 (오른쪽 패널)에 대한 용량-의존적 결합을 나타낸다는 것을 나타낸다. 또 다시, 2가, 단일특이적 및 이중특이적, 1가 항체의 결합 곡선이 인간과 시노몰거스 5T4 사이에서 유사한 경향을 나타낸다.
실시예 12 - 5T4-양성 인간 종양 세포에 대한 CD3×5T4 이중특이적 항체의 결합
5T4-발현 인간 종양 세포주 HeLa (자궁경부 선암종; ATCC, 카탈로그 번호 CCL-2) 및 MDA-MB-231 (유방 선암종; ATCC, 카탈로그 번호 HTB-26) 세포주에 대한 CD3×5T4 이중특이적 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. HeLa 또는 MDA-MB-231 세포는 CD3을 발현하지 않는다.
세포 (3×104개의 세포/웰)를 4℃에서 30분 동안 100 ㎕ PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제) 내의 일련의 항체 희석물 (3배 희석 단계로 0.000152 내지 3 ㎍/mL 범위)와 함께 폴리스티렌 96웰 둥근바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원), 카탈로그 번호 650180)에서 인큐베이션하였다. 염색 완충제에서 2회 세정한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 50 ㎕ 2차 항체에서 인큐베이션하였다. 2차 항체로서, 염색 완충제에 1:400 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (서던 바이오테크, 미국, 카탈로그 번호 2043-02)가 제1 실험에 사용되었다. 다음으로, 세포를 염색 완충제에서 2회 세정하고, 120 ㎕ 염색 완충제에 재현탁시키고, BD LSR포르테사(BD LSRForetessa) FACS (BD 바이오사이언시즈, 미국) 상에서 분석하였다. 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하는 비-선형 회귀 (가변 기울기의 S자형 용량-반응)를 사용하여 결합 곡선을 분석하였다.
도 6(i) (왼쪽 패널)은 CD3×5T4 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (A) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR (B)가 HeLa 세포에 대한 용량-의존적 결합을 나타내고, 이때 단일특이적, 2가 5T4 항체 IgG1-5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR보다 최대 결합이 더 높다는 것을 나타낸다. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR (C)의 경우, 최대 결합이 HeLa 세포 상에서 단일특이적, 2가 5T4 항체 IgG1-5T4-226-FEAR의 것과 유사하였다.
도 6(i) (오른쪽 패널)은 CD3×5T4 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (A), bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR (B) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR (C)가 MDA-MB-231 세포에 대한 용량-의존적 결합을 나타내고, 이때 단일특이적, 2가 5T4 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR보다 최대 결합이 더 높다는 것을 나타낸다. 이러한 실험에 포함된 음성 대조군 항체인 IgG1-b12-K409R (3 ㎍/mL)는 HeLa 및 MDA-MB-231 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다.
제2 실험에서, 미미한 조정과 함께 상기 기술된 바와 같이 염색을 수행하였다. 세포를 5배 희석 단계로 0.000128 내지 10 ㎍/mL 범위의 일련의 항체 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 2차 항체로서, 염색 완충제에 1:200 희석된 피코에리트린 (PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치, 영국, 카탈로그 번호 109-116-098)가 사용되었다.
도 6(ii) 및 6(iii)은 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 IgG1-5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR 및 IgG1-5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-085-FEAR 및 IgG1-5T4-085-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-127-FEAR 및 IgG1-5T4-127-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR이 HeLa 및 MDA-MB-231 종양 세포에 대한 용량-의존적 결합을 나타낸다는 것을 나타낸다. 일반적으로, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR, IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR, IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-106-FEAR, IgG1-5T4-085-FEAR 및 IgG1-5T4-127-FEAR은 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR, IgG1-5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR에 비교하여 더 낮은 항체 농도에서 결합을 나타낸다.
실시예 13 - 정제된 T 세포를 이펙터 세포로 사용하는 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내에서의 T-세포 활성화, 사이토카인 방출 및 세포독성의 유도
5T4-양성 종양 세포주를 표적 세포로, 정제된 T 세포를 이펙터 세포로 사용하여 시험관내 세포독성 검정법에서 CD3×5T4 이중특이적 항체를 시험하였다. T 세포는 건강한 인간 공여자 백혈구 연층 (산퀸(Sanquin), 네덜란드 암스테르담)으로부터 유래되었고, 제조사의 설명서에 따라 로제트셉(RosetteSep) 인간 T 세포 강화 칵테일 (스템셀 테크놀로지즈(Stemcell Technologies), 프랑스, 카탈로그 번호 15061)을 사용하여 단리되었다. 단리 후 생존 T 세포 (T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포)의 백분율을 결정하기 위해, 단리된 T 세포의 샘플 (조건 당 2.5×105개의 세포)을 30분 동안 4℃에서 U웰 96웰 플레이트 (셀스타(Cellstar), 카탈로그 번호 650180)에서 하기 항체를 사용하여 염색하였다: 100 ㎕ PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제) 내의 퍼시픽 블루(Pacific Blue)-항-CD3 (이바이오사이언시즈(eBiosciences), 클론 OKT3), APC-Cy-항-CD4 (이바이오사이언시즈, 클론 OKT4), AF700-항-CD8 (바이오레전드(Biolegend), 클론 RPA-T8) 및 생존율 마커 FVS 510 (BD 바이오사이언시즈). 다음으로, 세포를 염색 완충제에서 2회 세정하고, 120 ㎕ 염색 완충제에 재현탁시키고, BD LSR포르테사 FACS (BD 바이오사이언시즈, 미국)에서 분석하였다. 세포독성 실험에서 사용된 각각의 공여자에 대한 CD3+, CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포의 백분율이 표 6에서 기술된다.
표 6: 공여자 당 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 비
Figure pct00023
MDA-MB-231 세포 (16,000개의 세포/웰)를 편평바닥 96웰 플레이트 (그라이너-바이오-원, 네덜란드, 카탈로그 번호 655180) 내로 시딩하고, 4시간 동안 37℃에서 부착되도록 방치하였다. T 세포를 E:T 비 = 8:1로 종양 세포에 첨가하였다. 이중특이적 CD3×5T4 항체 또는 단일특이적, 2가 5T4 항체의 일련의 희석물을 첨가하고 (1000 내지 0.0128 ng/mL 범위의 최종 농도; 5배 희석), 플레이트를 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, T 세포를 함유하는 110 ㎕ 상청액을 U-바닥 96웰 배양 플레이트 (셀스타, 카탈로그 번호 650180)로 옮겼다. 플레이트를 3분 동안 4℃에서 원심분리 (300×g)한 후, 75 ㎕의 상청액을 사이토카인 생산 측정을 위한 새로운 플레이트로 옮기고, T 세포는 T 세포 활성화 마커 (하기 기술됨)를 평가하기 위해 유지시켰다. 0.2 ㎍/mL CD3×5T4 이중특이적 항체에 의해 유도된 사이토카인 생산을 제조사의 설명서에 따라 다중 U-플렉스 검정법 (메조 스케일 디스커버리(MeSo Scale Discovery), 미국, 카탈로그 번호 K15049K)에 의해 분석하였다.
T 세포를 T-세포 마커 CD3 (1:200; 이바이오사이언스, 클론 OKT3, 이플루오르450에 접합됨), CD4 (1:50; 이바이오사이언스, 클론 OKT4, APC-이플루오르780에 접합됨), CD8 (1:100; 바이오레전드, 클론 RPA-T8, AF700에 접합됨), 및 T-세포 활성화 마커 CD69 (1:50; BD 바이오사이언시즈, 클론 AB2439, APC에 접합됨), CD25 (1:50; 이바이오사이언스, 클론 BC96, PE-Cy7에 접합됨) 및 CD279/PD1 (1:50; 바이오레전드, 클론 EH12.2H7, BV605에 접합됨)에 대해 염색하였다. 울트라콤프(Ultracomp) 비드로의 단일 염색 샘플 (5 ㎕; 인비트로젠, 카탈로그 번호 01-2222-42)이 유동 세포측정기의 보상 조정을 위해 사용되었다. 4℃에서의 30분 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제)로 3회 세정하였다. 세포를 120 ㎕ 염색 완충제에 재현탁시키고, FACS 포르테사 (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 분석하였다. 플로우조(FlowJo) (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 데이터를 프로세싱하였다.
병행으로, 종양 세포의 생존율을 레사주린 (7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드)을 사용하여 평가하였다. 부착성 종양 세포를 PBS로 2회 세정하고, 10% 공여자 소 혈청 + 철 (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies), 네덜란드, 카탈로그 번호 10371-029) 및 페니실린/스트렙토마이신 (론자(Lonza), 카탈로그 번호 DE17-603E)을 함유하는 RPMI-1640 (론자, 스위스, 카탈로그 번호 BE12-115F) 배지 중에서 10% 레사주린 (150 ㎕; 라이프 테크놀러지즈, 네덜란드, 카탈로그 번호 DAL1100)과 함께 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인비전(Envision) 다중표지 플레이트 판독기 (펄킨엘머(PerkinElmer), 미국)로 흡광도를 측정하였다. 스타우로스포린-처리 (시그마-알드리치, 미국, 카탈로그 번호 S6942) 종양 세포 샘플의 흡광도를 0% 생존율로 설정하고, 미처리 종양 세포 샘플의 흡광도를 100% 생존율로 설정하였다. '백분율 생존 세포'를 하기와 같이 계산하였다:
% 생존 세포 = ([샘플의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도]/[미처리 표적 세포의 흡광도 - 스타우로스포린 처리 표적 세포의 흡광도]) × 100.
용량-반응 곡선, EC50 및 IC50 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하는 비-선형 회귀 (가변 기울기의 S자형 용량-반응)를 사용하여 분석하였다.
도 7(i)은 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3- FEALx5T4-059-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR이 5T4-양성 종양 세포주 MDA-MB-231에서 용량-의존적 세포독성 (% 생존 세포의 감소로 나타남)을 유도하였음을 나타낸다. 공여자-대-공여자 변동이 관찰되었지만, 둘 다의 공여자의 T 세포가 1 ㎍/mL CD3×5T4 이중특이적 항체의 존재 하에 최대 사멸을 유도하였다. 단일특이적 2가 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR은 세포독성을 유도하지 않았다. 그래프로부터 계산된 IC50 값이 도 7(ii)에서 제시된다. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR의 IC50 값이 각각 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR에 비교하여 더 낮았다. 대조적으로, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR의 IC50 값은 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR과 유사하였다.
도 8(i)은 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR이 MDA-MB-231 세포주에서 T-세포 매개 세포독성 (종양 세포 생존의 감소로 나타남)을 유도하였음을 나타낸다. 2가 단일특이적 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR, IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-106-FEAR, IgG1-5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR은 T-세포 매개 세포독성을 유도하지 않았다. 그래프로부터 계산된 IC50 값은 도 8(ii)에 제시된다. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR에 의해 유도된 T-세포 매개 세포독성의 IC50 값이 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR의 IC50 값보다 더 낮다. 또한, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR에 의해 유도된 T-세포 매개 세포독성의 IC50 값이 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR의 IC50 값보다 더 낮다.
활성화 마커 PD1, CD25 및 CD69에 대한 염색을 통해 유동 세포측정법에 의해 T-세포 활성화를 결정하였다 (도 9(i)). 단일특이적 2가 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR은 이러한 T-세포 활성화 마커의 상향조절을 유도하지 않은 한편, 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR은 PD1, CD25 및 CD69의 용량-의존적 상향조절을 유도하였다. 그래프로부터 계산된 EC50 값이 도 9(ii)에 제시된다. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR에 의한 PD1, CD25 및 CD69의 상향조절에 대한 EC50 값이 각각 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR과 비교하여 더 낮았다. bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR에 의한 CD25 및 CD69의 상향조절에 대한 EC50 값은 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR에 비교하여 더 낮은 한편, PD1 상향조절에 대한 EC50 값은 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR과 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR 사이에서 유사하였다.
도 10(i)은 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR이 MDA-MB-231 세포주와 함께 인큐베이션되었을 때 T-세포 활성화 (도 10(i)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 내의 % CD69+ T 세포의 증가에 의해 예시됨)를 유도한 한편, 2가 단일특이적 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR, IgG1-5T4-059-FEAR, IgG1-5T4-106-FEAR, IgG1-5T4-A1-FEAR 및 IgG1-5T4-A3-FEAR은 T-세포 활성화를 유도하지 않았음을 나타낸다. 3개의 T-세포 활성화 마커의 EC50 값이 도 10(ii)에서 제시된다. 일반적으로, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-106-FEAR에 의해 유도된 T-세포 활성화 (CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 내의 % CD69+, CD25+ 및 PD1+ 세포의 증가)의 EC50 값이 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-A3-FEAR의 EC50 값보다 더 낮다. 또한, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-106-FEAR에 의해 유도된 T-세포 활성화 (CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 내의 CD69+, CD25+ 및 PD1+ T 세포의 %의 증가)의 EC50 값이 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A1-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-A3-FEAR의 EC50 값보다 더 낮다.
T 세포 및 MDA-MB-231 세포의 공동-배양물을 0.2 ㎍/mL CD3×5T4 이중특이적 항체에 노출시킨 후의 사이토카인 IL-10, IL-13 및 TNF의 생산을 배양 상청액에서 다중 U-플렉스 검정법에 의해 측정하였다. 도 11은 이중특이적 항체와의 인큐베이션 후의 T 세포-종양 세포 공동-배양물의 상청액 내의 사이토카인 수준을 나타낸다. 2명의 상이한 건강한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 실험을 수행하였다; 도 11A는 공여자 A로부터 유래된 T 세포와의 공동-배양물로부터의 결과를 나타내고, 도 11B는 공여자 B로부터 유래된 T 세포와의 공동-배양물로부터의 결과를 나타낸다. 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-226-FEAR, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-059-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-059-FEAR 모두 사이토카인 방출을 유도하였지만, IgG1-huCD3-H101G-FEAL-유래 CD3-특이적 Fab-아암을 함유하는 CD3×5T4 이중특이적 항체와 함께 인큐베이션된 T 세포-종양 세포 공동-배양물에서의 사이토카인 수준이 IgG1-huCD3-FEAL-유래 CD3-특이적 Fab-아암을 함유하는 이중특이적 항체와 함께 인큐베이션된 공동-배양물에서의 사이토카인 수준보다 더 낮았다. 단일특이적 항체 IgG1-5T4-207-FEAR, IgG1-5T4-226-FEAR 및 IgG1-5T4-059-FEAR은 어떠한 사이토카인 방출도 유도하지 않았다.
실시예 14 - 다양한 이펙터 대 표적 비의 PBMC 또는 정제된 T 세포를 이펙터 세포로 사용한 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 시험관내에서의 세포독성의 유도
이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR의 T-세포 매개 사멸의 효율을 더욱 상세하게 결정하기 위해, 이펙터 대 표적 세포 (E:T) 비를 다양하게 하여, 세포독성 검정법을 실시예 13에 기술된 바와 같이 수행하였다. 추가적으로, 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 또는 단리된 T 세포를 이펙터 세포로서 사용하였다. 난소암 세포주 SK-OV-3 (9,000개의 세포/웰, ATCC, 카탈로그 번호 HTB-77)를 표적 세포주로서 사용하였다. 제조사의 설명서에 따라 피콜(Ficoll) 구배 (론자; 림프구 분리 배지, 카탈로그 번호 17-829E)를 사용하여 인간 혈액 (산퀸)의 백혈구 연층 40 mL로부터 PBMC를 단리하였다. T 세포를 실시예 13에 기술된 바와 같이 단리하였다. PBMC의 경우, 하기의 E:T 비가 사용되었다: 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1 및 12:1. 단리된 T 세포의 경우, 하기의 E:T 비가 사용되었다: 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1. 각각의 실험에서, 2명의 별개의 공여자로부터의 이펙터 세포를 사용하였다. 표 7은 각각의 공여자로부터의 PMBC 또는 T-세포 단리물 내의 CD3+, CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포의 백분율의 개관을 제공한다 (실시예 13에 기술된 바와 같이 결정됨).
표 7: 공여자 당 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 비
Figure pct00024
도 12에 나타난 바와 같이, 2명의 상이한 공여자로부터의 이펙터 세포를 사용하여, 4:1 내지 12:1의 E:T 비가 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR의 존재 하에 SK-OV-3 세포의 효율적인 PBMC-매개 사멸을 초래하였다. 2:1 이하의 E:T 비에서는, 사용된 최고 항체 농도 (1000 ng/mL)에서 SK-OV-3 세포의 최대 사멸이 달성되지 않았다. 단리된 T 세포가 이펙터 세포로 사용되었을 때 유사한 결과가 관찰되었다 (도 13). 2명의 상이한 공여자로부터의 이펙터 세포를 사용하여, 4:1 및 8:1의 E:T 비는 사용된 최고 항체 농도 (1000 ng/mL)에서 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR의 존재 하에 SK-OV-3 세포의 최대 T-세포 매개 사멸을 초래한 반면, 더 낮은 E:T 비는 최대 사멸을 유도하기에 충분하지 않았다. 따라서, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR에 의해 유도된 T-세포 매개 사멸의 효능이 충분하게 높은 E:T 비에 의존적이다.
실시예 15 - 인간화 면역계 마우스 이종이식 모델에서의 CD3×5T4 이중특이적 항체의 항-종양 활성
CD3×5T4 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR의 생체내 항-종양 효능을 인간 MDA-MB-231 종양 세포가 피하 접종된 인간화 (3-4주령에 CD34+ 조혈 줄기 세포 [HSC]가 꼬리 정맥으로 주사됨) NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG-HIS) 마우스 (더 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory)로부터 수득됨)에서 평가하였다. NSG-HIS 마우스의 면역계의 인간화를 이식 16주 후에 유동 세포측정법에 의해 확인하였다. 이어서, HSC 공여자 (#5239 또는 #2328), 및 말초혈 내의 인간 CD45+ 집단 내의 인간 CD3+ T 세포의 백분율 (각각 평균 %hCD45+ 및 %hCD3+ 세포; PBS 군의 군의 경우 42% hCD45+ 및 39% hCD3+, bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR 군의 경우 34% hCD45+ 및 25 %hCD3+, 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR의 경우 36% hCD45+ 및 29% hCD3+)에 기초하여, NSG-HIS 마우스를 3개의 군 (군 당 8마리 마우스)으로 무작위화하였다. 5×106개의 MDA-MB-231 세포 (100 ㎕ PBS 내)를 마우스의 옆구리에 피하 (SC) 주사하였다; 이를 연구 제0일로 나타냈다. 제14일, 제18일, 제21일 및 제25일에, 마우스에 0.5 mg/kg 항체 또는 PBS를 정맥내 (IV) 주사하였다. 처리 군이 표 8에서 제시된다. 캘리퍼를 사용하여 주 2회로 종양 성장을 평가하였다 (제14일에 시작함). 캘리퍼 치수로부터 0.52 × (길이) × (폭)2으로서 종양 부피 (㎣)를 계산하였다.
결과가 도 14에서 제시된다. 도 14A는 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR (p<0.01) 및 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (p<0.05) 둘 다가 대조군에 비교하여 제43일에 맨-휘트니 통계 분석에 기초하여 효율적으로 종양 성장을 억제하였음을 나타낸다. 추가로, 만텔 콕스 검정을 사용한 무종양 생존 곡선 (카플란 마이어 플롯, 종양 크기 < 500 ㎣을 차단값으로 사용함)의 통계 분석은 무종양 생존에서의 차이가 통계적으로 상이하여, 미처리 동물에 비교하여 bsIgG1-huCD3-FEALx5T4-207-FEAR (p<0.001) 또는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR (p < 0.001)로 처리된 동물에서의 무종양 생존 증가를 나타낸다는 것을 입증하였다 (도 14B).
표 8. 처리 군
Figure pct00025
실시예 16. 알라닌 스캐닝을 사용한 항체 결합에 대한 5T4 아미노산 잔기의 기여의 결정.
라이브러리 디자인
인간 5T4 (유니프롯 ID Q13641) 단일 잔기 알라닌 라이브러리가 합성되었고 (진아트, 써모 피셔 사이언티픽), 여기서 이미 알라닌 또는 시스테인을 함유하는 위치를 제외한 인간 5T4의 세포외 도메인 내의 모든 아미노산 잔기가 개별적으로 알라닌으로 돌연변이되었다. 항원의 구조적 파괴의 가능성을 최소화하기 위해, 시스테인은 돌연변이되지 않았다. 라이브러리를 CMV/TK-폴리A 발현 카세트, 앰피실린 저항성 유전자 및 pBR322 복제 기원을 함유하는 pMAC 발현 벡터에 클로닝하였다.
라이브러리 생산 및 스크리닝
야생형 5T4 및 알라닌 돌연변이체를 제조사의 설명서 (써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 12347-019)에 따라 프리스타일 HEK293 세포에서 개별적으로 발현시켰다. 형질감염 1일 후, 세포를 수확하였다. 약 80,000개의 세포를 실온에서 40분 동안 20　㎕ FITC-접합 항체 (3 ㎍/mL; FACS 완충제 (PBS [론자, 카탈로그 번호 BE17-517] + 0.1% [w/v] BSA [로슈, 카탈로그 번호 10735086001] + 0.02% [w/v] 아지드화나트륨 [NaN3; 에멜카 바이오사이언스, 카탈로그 번호 41920044-3]) 중; 표 9)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 150-180 ㎕ FACS 완충제를 사용하여 원심분리에 의해 세포를 2회 세정하였다. 세포를 30 ㎕ FACS 완충제에 재현탁시키고, iQue 스크리너 (인텔리사이트 코포레이션)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다.
전체 실험을 2회 수행하여, 이중 측정이 산출되었다.
표 9: 알라닌 스캐닝을 사용하여 항체 결합에서의 5T4 아미노산 잔기의 기여를 결정하는 데 사용된 항체. 실험을 수행하기 전에 5T4에 1가로 결합하는 항체가 FITC (써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 46425)로 표지되었다. IgG1-5T4-A1-F405L 및 IgG1-5T4-A3-F405L은 각각 F405L 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 백본 내로 클로닝된 대용물 A1 및 A3 항체이다. 따라서, 대용물 A1 항체는 WO2007106744에 개시된 A1 항체의 것과 동일한 가변 영역을 갖는다. 마찬가지로, A3 대용물 항체는 WO2007106744에 개시된 A3 항체의 것과 동일한 가변 영역을 갖는다. 둘 다의 항체에서, Fc 도메인은 F405L 치환을 보유한다.
Figure pct00026
데이터 분석
모든 샘플에 대해, 생존 단일 세포 집단에 대한 형광 강도의 기하 평균 (gMFI)으로서 세포 당 결합된 항체의 평균량을 결정하였다. gMFI는 5T4 돌연변이체에 대한 항체의 친화도 및 세포 당 5T4 돌연변이체의 발현 수준에 영향을 받는다. 특정한 알라닌 돌연변이가 돌연변이체 5T4의 표면 발현 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 그리고 일반적으로 각각의 5T4 돌연변이체에 대한 발현 차이를 보정하기 위해, 각각의 시험 항체에 대한 데이터를 하기 식을 사용하여 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체의 결합 강도에 대해 정규화하며:
Figure pct00027
[식 중, '아미노산 위치'는 알라닌으로 돌연변이된 위치를 지칭함], Z-점수는 하기 계산에 따라 항체 결합의 상실 또는 획득을 표현하도록 계산된다:
Figure pct00028
[식 중, μ 및 σ는 모든 돌연변이체로부터 계산된 정규화된 gMFI의 평균 및 표준 편차임].
특정 5T4 돌연변이체에 대한 대조군 항체의 gMFI가 평균 gMFI대조군 항체 - 2.5 × 평균 gMFI대조군 항체의 SD (모든 돌연변이체로부터의 것)보다 낮으면, 데이터가 분석으로부터 배제되었다 (이러한 5T4 돌연변이체에 대한 발현 수준은 결론을 내리기에 충분하지 않았다고 가정하였다). 이는 위치 296 (서열식별번호: 1)의 아미노산 W의 경우였다.
결과
도 15는 ECD에서의 단일 알라닌 돌연변이가 있는 인간 5T4 변이체에 대한 시험 항체의 결합 결과를 나타낸다: 위치 32 내지 355 (서열식별번호: 1에 따름). 결과는 인간 5T4의 위치 73의 R, 위치 74의 T, 위치 92의 Y, 위치 94의 R, 위치 95의 N 또는 위치 138의 F 아미노산이 알라닌으로 돌연변이되었을 때 항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-059-FEAR-FITC가 결합 상실을 나타냈다는 것을 나타낸다. 이는 항체 IgG1-5T4-059-04-FEAR의 결합이 적어도 인간 5T4 (서열식별번호: 1)의 아미노산 R73, T74, Y92, R94, N95, F138에 의존적이라는 것을 시사한다. 항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR-FITC는 인간 5T4의 위치 69의 S, 위치 73의 R, 위치 92의 Y, 위치 94의 R, 위치 111의 F, 위치 138의 F, 위치 148의 D 아미노산이 알라닌으로 돌연변이되었을 때 결합 상실을 나타냈다. 이는 항체 IgG1-5T4-207-FEAR의 결합이 적어도 인간 5T4 (서열식별번호: 1)의 아미노산 S69, R73, Y92, R94, F111, F138 및 D148에 의존적이라는 것을 시사한다. 항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-226-FEAR-FITC는 인간 5T4의 위치 73의 R, 위치 92의 Y, 위치 94의 R, 위치 111의 F, 위치 138의 F, 위치 144의 L 또는 위치 148의 D 아미노산이 알라닌으로 돌연변이되었을 때 결합 상실을 나타냈다. 이는 항체 IgG1-5T4-226-FEAR의 결합이 적어도 인간 5T4 (서열식별번호: 1)의 아미노산 R73, Y92, R94, F111, F138, L144 및 D148에 의존적이라는 것을 시사한다. 항체 bsIgG1-5T4-A3-F405Lxb12-FEAR-FITC는 인간 5T4의 위치 60의 D, 위치 61의 Q, 위치 88의 D, 위치 89의 L, 위치 92의 Y, 위치 111의 F, 위치 115의 P, 위치 117의 L, 위치 138의 F, 위치 148의 D 또는 위치 152의 N 아미노산이 알라닌으로 돌연변이되었을 때 결합 상실을 나타냈다. 이는 항체 IgG1-5T4-A3-FEAR의 결합이 인간 5T4 (서열식별번호: 1)의 아미노산 D60, Q61, D88, L89, Y92, F111, P115, L117, F138, D148 및 N152에 의존적이라는 것을 시사한다.
일부 아미노산은 결합에 간접적으로 수반될 수 있다. 예를 들어, 소수성 잔기를 알라닌으로 돌연변이시키는 것은 국소적인 폴딩에 영향을 미칠 수 있고, 직접적으로 상호작용하는 잔기의 위치결정에 영향을 줄 수 있다 (Zhao et al., 2014 Structure 22, 612-620). 구조 데이터 (인간 5T4 결정 구조 4cnm; RCSB 단백질 데이터뱅크)에 기초하여, 하기의 잔기들이 매립되고, 따라서 항체에 결합하는 것에 간접적으로 기여할 것으로 예상된다:
Figure pct00029
항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-059-04-FEAR-FITC: F138,
Figure pct00030
항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR-FITC: F111, F138, D148,
Figure pct00031
항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-226-FEAR-FITC: F111, F138, L144, D148,
Figure pct00032
항체 bsIgG1-5T4-A3-F405Lxb12-FEAR-FITC: L89, F111, L117, F138, D148, N152.
표면-노출 잔기만 항체와 직접적으로 상호작용할 수 있기 때문에, 하기의 잔기들이 항체와 직접적으로 상호작용할 것으로 예상된다:
Figure pct00033
항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-059-FEAR-FITC: R73, T74, Y92, R94 및 N95,
Figure pct00034
항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR-FITC: S69, R73, Y92 및 R94,
Figure pct00035
항체 bsIgG1-b12-FEALx5T4-226-FEAR-FITC: R73, Y92 및 R94,
Figure pct00036
항체 bsIgG1-5T4-A3-F405Lxb12-FEAR-FITC: D60, Q61, D88, Y92 및 P115.
종합적으로, 이러한 결과들은 항체 IgG1-5T4-059, IgG1-5T4-207 및 IgG1-5T4-226 모두가 아미노산 잔기 R73, Y92 및 R94와의 직접적인 상호작용에 의해 결합한다는 것을 제안한다. 결과는 항체 IgG1-5T4-059, IgG1-5T4-207 및 IgG1-5T4-226 각각이 IgG1-5T4-A3이 결합하는 에피토프와 상이하지만 부분적으로 중첩되는 에피토프에 결합한다는 것을 또한 나타낸다. 이것은 실시예 3 및 4에서 기술된 전위 거동과 일치한다.
실시예 17: 시험관내에서의 상이한 적응증의 세포주에서의 CD3×5T4 이중특이적 항체에 의한 T-세포 활성화 및 세포독성의 유도
췌장암 및 자궁경부암의 종양 세포주를 표적 세포로, 정제된 T 세포를 이펙터 세포로 사용하여 CD3×5T4 이중특이적 항체를 시험관내 세포독성 검정법에서 시험하였다. 각각의 적응증 (췌장암 및 자궁경부암)에 대해, 2개의 대표적인 세포주가 선택되었다. 시험관내 세포독성 검정법에서 사용된 종양 세포주가 표 10에서 요약된다. T 세포는 인간 공여자 백혈구 연층 (산퀸, 네덜란드, 암스테르담)으로부터 유래되었고, 제조사의 설명서에 따라 로제트셉 인간 T 세포 강화 칵테일 (스템셀 테크놀로지즈, 프랑스, 카탈로그 번호 15061)을 사용하여 단리되었다. 각각의 세포주에 대해, 표 10에 요약된 바와 같이, 적어도 3명의 상이한 공여자를 시험관내 세포독성 검정법 및 T-세포 활성화 분석에서 시험하였다.
표 10: 시험관내 세포독성 검정법에 사용된 종양 세포주
Figure pct00037
종양 세포 (16,000개의 세포/웰)를 편평바닥 96웰 플레이트 (그라이너-바이오-원, 네덜란드, 카탈로그 번호 655180) 내로 시딩하고, 4시간 동안 37℃에서 부착되도록 방치하였다. T 세포를 E:T 비 = 4:1로 종양 세포에 첨가하였다. bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR 또는 대조군 항체 (bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR, bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR)의 일련의 희석물을 첨가하고 (5000 내지 0.0128 ng/mL 범위의 최종 농도; 5배 희석), 플레이트를 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, T 세포를 함유하는 110 ㎕ 상청액을 둥근바닥 96웰 배양 플레이트 (셀스타, 카탈로그 번호 650180)로 옮기고, 3분 동안 4℃에서 원심분리 (300×g)하였다. T 세포를 50 ㎕ PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (염색 완충제)에 희석된 CD3-이플루오르450 (1:200; 이바이오사이언스, 클론 OKT3), CD4-APC-이플루오르780 (1:50; 이바이오사이언스, 클론 OKT4), CD8-AF700 (1:100; 바이오레전드, 클론 RPA-T8) 및 T-세포 활성화 마커 CD69-APC (1:50; BD 바이오사이언시즈, 클론 AB2439), CD25-PE-Cy7 (1:50; 이바이오사이언스, 클론 BC96) 및 CD279/PD1-BV605 (1:50; 바이오레전드, 클론 EH12.2H7)와의 인큐베이션에 의해 T-세포 마커에 대해 염색하였다. 울트라콤프 비드로의 단일 염색 샘플 (5 ㎕; 인비트로젠, 카탈로그 번호 01-2222-42)이 유동 세포측정기의 보상 조정을 위해 사용되었다. 4℃에서의 30분 인큐베이션 후, 플레이트를 염색 완충제로 3회 세정하였다. 세포를 120 ㎕ 염색 완충제에 재현탁시키고, FACS 포르테사 (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 분석하였다. 플로우조 (버전 10, BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 데이터를 프로세싱하였다.
병행으로, 종양 세포의 생존율을 레사주린 (7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드)을 사용하여 평가하였다. 부착성 종양 세포를 PBS로 2회 세정하고, 10% 공여자 소 혈청 + 철 (라이프 테크놀러지즈, 네덜란드, 카탈로그 번호 10371-029) 및 페니실린/스트렙토마이신 (론자, 카탈로그 번호 DE17-603E)가 보충된 RPMI-1640 배지 (론자, 스위스, 카탈로그 번호 BE12-115F) 내의 10% 레사주린 (150 ㎕; 라이프 테크놀러지즈, 네덜란드, 카탈로그 번호 DAL1100)과 함께 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인비전 다중표지 플레이트 판독기 (펄킨엘머, 미국)로 흡광도를 측정하였다. 스타우로스포린-처리 (시그마-알드리치, 미국, 카탈로그 번호 S6942) 세포의 흡광도를 0% 생존율로 설정하고, 미처리 세포의 흡광도를 100% 생존율로 설정하였다. '백분율 생존 세포'를 하기와 같이 계산하였다:
% 생존 세포 = ([샘플의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도]/[미처리 표적 세포의 흡광도 - 스타우로스포린-처리 표적 세포의 흡광도]) × 100.
세포독성 곡선, T-세포 활성화 곡선, IC50 (세포독성) 및 EC50 (T-세포 활성화) 값을 그래프패드 프리즘 V7.02 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하는 비-선형 회귀 (가변 기울기의 S자형 용량-반응)를 사용하여 분석하였다.
도 16(i)은 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR이 상이한 적응증의 광범위한 세포주에서 세포독성을 유도한 한편, 종양 세포 또는 T 세포만 표적화하는 대조군 이중특이적 항체 (bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR, bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR)는 어떠한 세포독성도 나타내지 않았음을 나타낸다. 도 16(ii)는 상이한 공여자들 (적어도 n=3)로 시험된 각각의 세포주에 대한 평균 IC50 값을 나타낸다. 도 17(i)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 CD69 (CD4+ 또는 CD8+ 집단 내의 CD69+ 세포의 %)의 상향조절에 의해 측정된 바와 같은 상이한 적응증의 광범위한 세포주에서 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR에 의해 유도된 T-세포 활성화를 나타낸다. 종양 세포 또는 T 세포만 표적화하는 대조군 이중특이적 항체 (bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR, bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR)는 어떠한 T-세포 활성화도 유도하지 않았다. 도 17(ii)은 상이한 공여자들 (적어도 n=3)로 시험된 각각의 세포주에 대한 평균 EC50 값을 나타낸다.
이러한 데이터는 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALx5T4-207-FEAR은 췌장암 및 자궁경부암에서 특이적으로 T-세포 매개 세포독성 및 T-세포 활성화를 유도할 수 있는 한편, 대조군 이중특이적 항체 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR 및 bsIgG1-b12-FEALx5T4-207-FEAR은 T-세포 활성화 및 T-세포 매개 세포독성을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
참고 문헌
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
SEQUENCE LISTING <110> Genmab A/S Satijn, David Parren, Paul Horbach, Sjeng Verzijl, Dennis Rademakers, Rik van den Brink, Edward Engelberts, Patrick Kemper, Kristel de Goeij, Bart Breij, Esther <120> Antibodies <130> P/0131-WO-PCT <150> EP18161293.8 <151> 2018-03-12 <150> EP 18175347.6 <151> 2018-05-31 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 420 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu 35 40 45 Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala 50 55 60 Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg 65 70 75 80 Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu 85 90 95 Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala 100 105 110 Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser 115 120 125 Arg Leu 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Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu 35 40 45 Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala 50 55 60 Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg 65 70 75 80 Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu 85 90 95 Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala 100 105 110 Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser 115 120 125 Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu 130 135 140 Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro Phe 145 150 155 160 Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val 165 170 175 Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Gln Asn 180 185 190 Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Ala 195 200 205 Leu Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr 210 215 220 Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asp 225 230 235 240 Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn 245 250 255 Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val 260 265 270 Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Ile Arg 275 280 285 Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp 290 295 300 Met Val Thr Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg 305 310 315 320 Leu Thr Cys Ala Tyr Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu 325 330 335 Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu 340 345 350 Gln Thr Ser His His His His His His His His 355 360 <210> 100 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 100 Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu 35 40 45 Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala 50 55 60 Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg 65 70 75 80 Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Ala Pro Ser Thr Cys 85 90 95 Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 100 105 110 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 115 120 125 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu 130 135 140 Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg 145 150 155 160 Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser 165 170 175 Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys 180 185 190 Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 195 200 205 Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly 210 215 220 Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met 225 230 235 240 Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn 245 250 255 Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser 260 265 270 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu 275 280 285 Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 290 295 300 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys His 305 310 315 320 His His His His His His His 325 <210> 101 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 101 Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Pro Met Val Trp Ala Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 50 55 60 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 65 70 75 80 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu 85 90 95 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 100 105 110 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 115 120 125 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 130 135 140 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr 145 150 155 160 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 165 170 175 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 180 185 190 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 195 200 205 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 210 215 220 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 225 230 235 240 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 245 250 255 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 260 265 270 Asn Arg Gly Glu 275 <210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR consensus sequence <400> 102 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR consensus sequence <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is G or E <400> 103 Ile Asp His Ser Xaa Ser Thr 1 5 <210> 104 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR consensus sequence <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is A or G <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is W or Y <220> <221> Xaa <222> (9)..(9) <223> Xaa is D or H <400> 104 Ala Xaa Trp Phe Gly Glu Leu Xaa Xaa Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR consensus sequence <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is Y or F <400> 105 Gln Ser Val Ser Ser Xaa 1 5

Claims (133)

  1. 5T4 (영양막 당단백질)에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체이고, 여기서 항체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 5에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [059]가 5T4에 결합하는 것을 차단할 수 있는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    a) 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [207],
    b) 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 51에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [226]; 및
    c) 서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [059]
    로 이루어진 군으로부터 선택된 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하는 것인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가
    a) 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [207]; 및
    b) 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 51에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [226]
    로 이루어진 군으로부터 선택된 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4가 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) 5T4, 예컨대 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 서열인 항체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4가 시노몰거스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 5T4, 예컨대 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드 서열인 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4가 닭 (갈루스 갈루스(Gallus gallus)) 5T4, 예컨대 서열식별번호: 3의 성숙 폴리펩티드 서열인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4가 인간 5T4, 예컨대 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 및 시노몰거스 원숭이 5T4, 예컨대 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4가 인간 5T4, 예컨대 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 서열, 시노몰거스 원숭이 5T4, 예컨대 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드 서열 및 닭 5T4, 예컨대 서열식별번호: 3의 성숙 폴리펩티드 서열인 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 K D 값 1E-7 M 이하, 예컨대 5E-8 M 이하, 1E-8 M 이하, 5E-9 M 이하 또는 예컨대 1E-9 M 이하에 상응하는 결합 친화도로, 예컨대 1E-7 내지 5E-10 M의 범위, 예컨대 1E-7 내지 1E-9 M, 예컨대 5E-8 내지 5E-10 M, 5E-8 내지 1E-9 M, 예컨대 1E-8 내지 5E-10 M, 1E-8 내지 1E-9 M 또는 예컨대 1E-8 내지 5E-9 M의 범위 내인 K D 값에 상응하는 결합 친화도로 인간 5T4, 시노몰거스 원숭이 및/또는 닭 5T4에 결합할 수 있는 것인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 결합 친화도가 임의적으로는 본원에서 실시예 2에서 기재된 바와 같이 생물층 간섭측정법에 의해 결정되는 것인 항체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 결합 친화도가
    I) 항체를 1 ㎍/mL의 양으로 600초 동안 항-인간 IgG Fc 포착 바이오센서 상에 고정시키는 단계;
    II) 100 nM 내지 1.56 nM 범위의 2배 희석 시리즈를 사용하여, 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질) 또는 시노몰거스 원숭이 5T4 (서열식별번호: 2의 성숙 단백질), 또는 재조합 시노몰거스 원숭이 5T4 단백질 (쿠사바이오(Cusabio); 카탈로그 번호 CSB-MP024093MOV)의 200초의 기간에 걸친 회합 및 1000초의 기간에 걸친 해리를 결정하는 단계;
    III) 데이터를 완충제 대조군 (0 nM)에 대조하는 단계
    를 포함하는 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정되는 것인 항체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 친화도가 단일특이적 2가 항체, 예컨대 전장 IgG1인 항체인 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 사용하여 결정되는 것인 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역 또는 결합 부위를 인식하고, 상기 항체 결합 영역, 결합 부위 또는 에피토프가
    a) 서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 9에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [059],
    b) 서열식별번호: 12에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 16에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [076],
    c) 서열식별번호: 19에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 23에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [085],
    d) 서열식별번호: 26에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 30에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [106],
    e) 서열식별번호: 33에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 37에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [127],
    f) 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [207]; 및
    g) 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 51에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [226]
    로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중 어느 하나에 의해 인식되는 것인 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가
    a) 서열식별번호: 87에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [H8],
    b) 서열식별번호: 83에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 84에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [A1]; 및
    c) 서열식별번호: 85에 기재된 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 [A3]
    로 이루어진 군으로부터 선택된 항체에 의해 결합되는 항체 결합 영역 또는 결합 부위 또는 에피토프가 아니거나 또는 이러한 항체에 의해 결합되는 항체 결합 영역, 결합 부위 또는 에피토프와 상이한, 5T4 상의 항체 결합 영역, 결합 부위 또는 에피토프에 결합하는 것인 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 5T4에 결합하는 것이 서열식별번호: 85에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [A3]가 5T4에 결합하는 것에 의해 차단되는 것인 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질)에 결합된 항체의 전위를 나타내고, 5T4에 결합된 상기 항체가 서열식별번호: 85에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역 [A3]을 포함하는 것인 항체.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 교차-차단, 또는 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체의 능력이 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 검정법에 의해, 예컨대 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행되는 검정법에서 결정되는 것인 항체.
  18. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 교차-차단, 또는 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체의 능력이 접합 항체의 결합을 차단하는 미접합 항체의 능력으로서 결정되고, 임의적으로,
    i) 각각의 샘플이 인간 난소 선암종 SK-OV-3 세포, 5T4에 결합하고 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 접합된 항체, 및 5T4를 표적화하는 과량의 미접합 항체의 혼합물을 포함하는 샘플 세트를 제공하는 단계,
    ii) 샘플을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후, 샘플을 원심분리에 적용하는 단계,
    iii) 각각의 샘플로부터 상청액을 제거하고, 세포를 완충제에 재현탁시키고, 유동 세포측정기를 사용하여 FITC의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정하는 단계; 및
    iv) FITC-접합 항체 및 미접합 항체의 혼합물과 함께 인큐베이션된 세포와 FITC-접합 또는 미접합 항체 없이 인큐베이션된 세포 사이의 MFI 차이에 100을 곱한 후, FITC-접합 항체 및 IgG-b12 항체의 혼합물과 함께 인큐베이션된 세포와 FITC-접합 또는 미접합 항체 없이 인큐베이션된 세포 사이의 MFI 차이로 나눔
    과 같이 결합 백분율을 계산하는 단계
    를 포함하는 절차에서 결정되는 것인 항체.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하거나 또는 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질)에 결합된 또 다른 항체를 전위시키는 상기 항체의 능력이 생물층 간섭측정법을 사용하여, 예컨대 실시예 3에 기술된 바와 같은 검정법에서 결정되는 것인 항체.
  20. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 또 다른 항체가 5T4에 결합하는 것을 차단하거나 또는 5T4에 결합된 또 다른 항체를 전위시키는 항체의 능력이
    i) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 10 mM 아세트산나트륨 완충제 중 20 ㎍/mL의 양으로 활성화된 아민-반응성 2세대 바이오센서에 고정시키는 단계,
    ii) 고정된 항체가 있는 바이오센서를 에탄올아민 pH 8.5에서 켄칭시키는 단계,
    iii) 고정된 항체가 있는 바이오센서를 3.6 ㎍/mL (100 nM)의 인간 5T4ECDHis (서열식별번호: 99의 성숙 단백질)를 포함하는 조성물에 500초의 기간 동안 함침시키는 단계, 및 그 후
    iv) 고정된 항체 및 5T4ECDHis가 있는 바이오센서를 5T4를 표적화하는 10 ㎍/mL의 다른 항체를 포함하는 조성물에 함침시키고, 500초의 기간에 걸쳐 회합 반응을 결정하는 단계
    를 포함하고, 단계 i)-iv)가 30℃의 온도에서 1000 rpm으로 진탕시키면서 수행되는 절차에서 생물층 간섭측정법을 사용하여 결정되는 것인 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, Y92 및 R94를 포함하는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 S69, R73, Y92 및 R94를 포함하는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94 및 N95를 포함하는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 항체의 결합에서 직접적으로 수반되는 것인 항체.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어, 단백질 폴딩 및/또는 항체의 결합에서 직접적으로 수반되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 위치결정에 영향을 미치는 것에 의해, L89, F111, L117, F138, L144, D148, N152의 추가적인 아미노산 잔기 중 하나 이상이 항체의 결합에서 수반되고, 예컨대 결합에서 간접적으로 수반되며, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, Y92 및 R94가 항체의 결합에서 직접적으로 수반되고, 아미노산 잔기 F111, F138, L144 및 D148 중 하나 이상이 상기 결합에서 간접적으로 수반되는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 S69, R73, Y92 및 R94가 항체의 결합에서 직접적으로 수반되고, 아미노산 잔기 F111, F138, 및 D148 중 하나 이상이 상기 결합에서 간접적으로 수반되는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94 및 N95가 항체의 결합에서 직접적으로 수반되고, 아미노산 잔기 F138이 상기 결합에서 간접적으로 수반되는 인간 5T4 상의 에피토프 또는 항체 결합 영역에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프 또는 항체 결합 영역에 의해 포함되는 아미노산 잔기 및 임의적으로는 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기가 서열식별번호: 1에 기재된 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 5T4의 알라닌 스캐닝에 의해 확인되는 것인 항체.
  30. 제29항에 있어서, 알라닌 스캐닝이 본원에서 실시예 16에서 기재된 바와 같이 또는 본질적으로 기재된 바와 같이 수행되는 것인 항체.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 알라닌 스캐닝이
    i) 각각의 돌연변이체 또는 야생형 5T4에 대해 70-90,000개의 세포, 예컨대 80,000개의 세포를 포함하는 샘플이 제공되도록, 시스테인 및 알라닌을 제외한 인간 5T4의 세포외 도메인 내의 모든 아미노산 잔기 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355에 상응함)가 개별적으로 알라닌으로 치환된 돌연변이체 인간 5T4 폴리펩티드, 및 야생형 5T4 폴리펩티드 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355)를 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 HEK 293 세포에서 개별적으로 발현시키는 단계,
    ii) 각각의 샘플 내의 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합 항체에 접합된 20 ㎕의 상기 항체 (3 ㎍/mL; FACS 완충제 중)와 함께 40분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 각각의 샘플을 150-180 ㎕ FACS 완충제 (포스페이트-완충 염수 + 0.1% [w/v] BSA + 0.02% [w/v] 아지드화나트륨)에서 2회 세정하고, 각각의 샘플 내의 세포를 30 ㎕ FACS 완충제에 재현탁시키는 단계,
    iii) 각각의 샘플에 대해, 상기 샘플 내의 생존 단일 세포 집단에 대한 형광 강도의 기하 평균 (gMFI)으로서 세포 당 결합된 항체의 평균량을 결정하고, 하기 식을 사용하여 각각의 시험 항체에 대한 데이터를 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체의 결합 강도에 대해 정규화하는 단계이며:
    Figure pct00042

    [식 중, '아미노산 위치'는 알라닌으로 돌연변이된 위치를 지칭함],
    여기서 Z-점수가 하기 계산에 따라 항체 결합의 상실 또는 획득을 표현하도록 계산되고:
    Figure pct00043

    [식 중, μ 및 σ는 각각 모든 돌연변이체로부터 계산된 정규화된 gMFI의 평균 및 표준 편차임],
    특정 5T4 돌연변이체에 대한 대조군 항체의 gMFI가 평균 gMFI대조군 항체 - 2.5 × 평균 gMFI대조군 항체의 SD (모든 돌연변이체로부터의 것)보다 낮으면 데이터가 분석으로부터 배제되고, 임의적으로
    잔기가 -1.5 바로 아래 (예를 들어 -1.5 내지 -1.8, 예컨대 -1.5 내지 -1.7 또는 예컨대 -1.5 내지 -1.6)의 Z-점수로 결합하고, 이러한 잔기가 매립되고, 표면에 노출될 것으로 예상되고 이에 대한 결합 상실 또는 결합 감소가 결정되는 대부분의 잔기로부터 공간적으로 분리될 것으로 예상되면, 데이터가 분석으로부터 배제되는 것인 단계
    를 포함하는 절차에 의해 수행되는 것인 항체.
  32. 제31항에 있어서, 단계 iv)의 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체가
    - 서열식별번호: 83에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 84에 기재된 바와 같은 VL 서열 [A1]을 포함하는 항원-결합 영역; 및
    - 서열식별번호: 97에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 98에 기재된 바와 같은 VL 서열 [B12]을 포함하는 항원 결합 영역
    을 포함하는 이중특이적 항체인 항체.
  33. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, Y92 및 R94 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  34. 제1항 내지 제20항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 S69, R73, Y92 및 R94 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  35. 제1항 내지 제20항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94 및 N95 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  36. 제1항 내지 제20항 및 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 L89, F111, L117, F138, L144, D148, N152 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  37. 제1항 내지 제20항 및 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, Y92, R94, F111, F138, L144 및 D148 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  38. 제1항 내지 제20항 및 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 S69, R73, Y92, R94, F111, F138, 및 D148 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  39. 제1항 내지 제20항 및 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아미노산 잔기 R73, T74, Y92, R94, N95 및 F138 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 치환되면 결합 상실이 있거나 또는 결합이 감소되도록 5T4에 결합하고, 각각의 아미노산 잔기의 넘버링은 서열식별번호: 1 내의 그의 위치를 지칭하는 것인 항체.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌 치환의 효과가 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355를 포함하는 폴리펩티드의 알라닌 스캐닝에 의해 결정되는 것인 항체.
  41. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌 치환의 효과가 본원에서 실시예 16에서 기재된 바와 같은 또는 본질적으로 기재된 바와 같은 절차에 의해 결정되는 것인 항체.
  42. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 상실이 결합에서의 Z-점수가 1.5보다 낮은 것으로서 정의되고, 임의적으로 Z-점수가 본원에서 실시예 16에서 기재된 바와 같이 또는 본질적으로 기재된 바와 같이 계산되는 것인 항체.
  43. 제42항에 있어서, 알라닌 치환의 효과가
    i) 각각의 돌연변이체 또는 야생형 5T4에 대해 70-90,000개의 세포, 예컨대 80,000개의 세포를 포함하는 샘플이 제공되도록, 시스테인 및 알라닌을 제외한 인간 5T4의 세포외 도메인 내의 모든 아미노산 잔기 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 32-355에 상응함)가 개별적으로 알라닌으로 치환된 돌연변이체 인간 5T4 폴리펩티드, 및 야생형 5T4 폴리펩티드를 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 HEK 293 세포에서 개별적으로 발현시키는 단계,
    ii) 각각의 샘플 내의 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합 항체에 접합된 20 ㎕의 상기 항체 (3 ㎍/mL; FACS 완충제 중)와 함께 40분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 각각의 샘플을 150-180 ㎕ FACS 완충제 (포스페이트-완충 염수 + 0.1% [w/v] BSA + 0.02% [w/v] 아지드화나트륨)에서 2회 세정하고, 각각의 샘플 내의 세포를 30 ㎕ FACS 완충제에 재현탁시키는 단계,
    iii) 각각의 샘플에 대해, 상기 샘플 내의 생존 단일 세포 집단에 대한 형광 강도의 기하 평균 (gMFI)으로서 세포 당 결합된 항체의 평균량을 결정하고, 하기 식을 사용하여 각각의 시험 항체에 대한 데이터를 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체의 결합 강도에 대해 정규화하는 단계이며:
    Figure pct00044

    [식 중, '아미노산 위치'는 알라닌으로 돌연변이된 위치를 지칭함],
    여기서 Z-점수가 하기 계산에 따라 항체 결합의 상실 또는 획득을 표현하도록 계산되고:
    Figure pct00045

    [식 중, μ 및 σ는 각각 모든 돌연변이체로부터 계산된 정규화된 gMFI의 평균 및 표준 편차임],
    특정 5T4 돌연변이체에 대한 대조군 항체의 gMFI가 평균 gMFI대조군 항체 - 2.5 × 평균 gMFI대조군 항체의 SD (모든 돌연변이체로부터의 것)보다 낮으면 데이터가 분석으로부터 배제되고, 임의적으로
    잔기가 -1.5 바로 아래 (예를 들어 -1.5 내지 -1.8, 예컨대 -1.5 내지 -1.7 또는 예컨대 -1.5 내지 -1.6)의 Z-점수로 결합하고, 이러한 잔기가 매립되고, 표면에 노출될 것으로 예상되고 이에 대한 결합 상실 또는 결합 감소가 결정되는 대부분의 잔기로부터 공간적으로 분리될 것으로 예상되면, 데이터가 분석으로부터 배제되는 것인 단계
    를 포함하는 절차에 의해 결정되는 것인 항체.
  44. 제43항에 있어서, 단계 iii)의 비-교차 차단 5T4-특이적 대조군 항체가
    - 서열식별번호: 83에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 84에 기재된 바와 같은 VL 서열 [A1]을 포함하는 항원-결합 영역; 및
    - 서열식별번호: 97에 기재된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 98에 기재된 바와 같은 VL 서열 [B12]을 포함하는 항원 결합 영역
    을 포함하는 이중특이적 항체인 항체.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 87에 기재된 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 [H8]에 비교하여 세포독성 모이어티에 접합되는 경우의 감소된 세포독성에 의해 나타나는 바와 같이 상기 항체가 감소된 내재화 능력을 갖는 것인 항체.
  46. 제45항에 있어서, 세포독성이 실시예 7에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 예컨대
    i) 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체의 제1 Fab 아암 및 HIV 바이러스 단백질 gp120 (HIV-1 gp120)에 결합할 수 있고 듀오스타틴-3에 접합된 제2 Fab 아암을 포함하는 1가 항체를 제공하는 단계;
    ii) 5일 동안 37℃에서 유방암 세포 MDA-MB-468 (ATCC 클론 HTB-132) 또는 HCC1954 (ATCC 클론 CRL-1338)를 상기 1가 항체와 접촉시키는 단계; 및
    iii) 세포의 생존율을 결정하는 단계
    를 포함하는 절차에서 결정되는 것인 항체.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
    a) 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059],
    b) 서열식별번호: 13, 14 및 15의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [076],
    c) 서열식별번호: 20, 21 및 22의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [085],
    d) 서열식별번호: 27, 28 및 29의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [106],
    e) 서열식별번호: 34, 35 및 36의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [127],
    f) 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207],
    g) 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226], 및
    h) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 a) 내지 g) 중 어느 하나에서 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 비교할 때 총합으로 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 중쇄 가변 영역 (VH)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항체.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
    a) 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059],
    b) 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207],
    c) 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]; 및
    d) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 a) 내지 c) 중 어느 하나에서 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 비교할 때 총합으로 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 중쇄 가변 영역 (VH)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059]을 포함하는 것인 항체.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207]으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항체.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
    a) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059],
    b) 각각 서열식별번호: 13, 14 및 15의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 17, DAS 및 서열식별번호:18의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [076],
    c) 각각 서열식별번호: 20, 21 및 22의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 24, DAS 및 서열식별번호: 25의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [085],
    d) 각각 서열식별번호: 27, 28 및 29의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 31, DVS 및 서열식별번호: 32의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [106],
    e) 각각 서열식별번호: 34, 35 및 36의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 38, DAS 및 서열식별번호: 39의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [127],
    f) 각각 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 45, DAS 및 서열식별번호: 46의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207],
    g) 각각 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 52, DAS 및 서열식별번호: 53의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]; 및
    h) 각각의 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 a) 내지 g) 중 어느 하나에서 정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 비교할 때 총합으로 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 영역
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항체.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 항원 결합 영역(들)의 6개의 상보성-결정 영역 (CDR)이,
    iv) 서열식별번호: 6, 7, 8, 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR 서열 [059],
    v) 서열식별번호: 41, 42, 43, 45, DAS 및 서열식별번호: 46의 CDR 서열 [207]; 또는
    vi) 서열식별번호: 48, 49, 50, 52, DAS 및 서열식별번호: 53의 CDR 서열 [226]
    에 비교할 때, 총합으로, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
  54. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 1개, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개가 보존적 아미노산 치환(들)인 항체.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 상보성-결정 영역 3 (CDR3)이 서열식별번호: 102 (YYGMDV)에 기재된 서열의 6개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 1개 또는 2개의 중쇄 가변 영역 [059, 207, 226]을 포함하는 것인 항체.
  56. 제55항에 있어서, 상기 6개의 연속적인 아미노산 잔기가 CDR3 내의 가장 C-말단인 아미노산 잔기인 항체.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 41 (GGSFSGYY)의 CDR1 서열, 서열식별번호: 103 (IDHSX1ST)의 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 104 (AX2WFGELX3X4YYYGMDV)의 CDR3 서열을 포함하는 1개 또는 2개의 중쇄 가변 영역(들) (VH), 및 서열식별번호: 105 (QSVSSX5)의 CDR1 서열, CDR2 서열 DAS, 및 서열식별번호: 46 (QQRSNWPLT)의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207, 226]을 포함하고, 여기서 X1은 G 또는 E이고, X2는 A 또는 G이고, X3은 W 또는 Y이고, X4는 D 또는 H이고, X5는 Y 또는 F인 항체.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 6, 7, 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059]을 포함하는 것인 항체.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 45, DAS 및 서열식별번호: 46의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207]을 포함하는 것인 항체.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 52, DAS 및 53의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]을 포함하는 것인 항체.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
    a) 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059],
    b) 서열식별번호: 12의 서열 또는 서열식별번호: 12의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [076],
    c) 서열식별번호: 19의 서열 또는 서열식별번호: 19의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [085],
    d) 서열식별번호: 26의 서열 또는 서열식별번호: 26의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [106],
    e) 서열식별번호: 33의 서열 또는 서열식별번호: 33의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [127],
    f) 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207]; 및
    g) 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항체.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059]을 포함하는 것인 항체.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207]을 포함하는 것인 항체.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226]을 포함하는 것인 항체.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
    a) 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 9의 서열 또는 서열식별번호: 9의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059],
    b) 서열식별번호: 12의 서열 또는 서열식별번호: 12의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16의 서열 또는 서열식별번호: 16의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [076],
    c) 서열식별번호: 19의 서열 또는 서열식별번호: 19의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 23의 서열 또는 서열식별번호: 23의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [085],
    d) 서열식별번호: 26의 서열 또는 서열식별번호: 26의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 30의 서열 또는 서열식별번호: 30의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [106],
    e) 서열식별번호: 33의 서열 또는 서열식별번호: 33의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 37의 서열 또는 서열식별번호: 37의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [127],
    f) 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 44의 서열 또는 서열식별번호: 44의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207],
    g) 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 51의 서열 또는 서열식별번호: 51의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항체.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 5T4에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역이
    a) 서열식별번호: 5의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059],
    b) 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [076],
    c) 서열식별번호: 19의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 23의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [085],
    d) 서열식별번호: 26의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [106],
    e) 서열식별번호: 33의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 37의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [127],
    f) 서열식별번호: 40의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207]; 및
    g) 서열식별번호: 47의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 51의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항체.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 전장 항체, 예컨대 전장 IgG1 항체인 항체.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 항체인 항체.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 2가 항체인 항체.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체인 항체.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, CD3, 예컨대 인간 CD3ε (엡실론), 예컨대 서열식별번호: 4에 상술된 바와 같은 인간 CD3ε (엡실론)에 결합하는 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 항체.
  73. 제72항에 있어서, CD3에 결합하는 항원-결합 영역이
    각각 서열식별번호: 54, 55 및 56의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 항-CD3 (SP34/인간화 SP34, WO2015001085 (젠맵(Genmab))) - VH CDR 서열];
    및, 임의적으로
    각각 서열식별번호: 58, GTN 및 59의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 항-CD3, VL CDR 서열]
    을 포함하는 것인 항체.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, CD3에 결합하는 항원 결합 영역이
    서열식별번호: 57의 서열, 또는 서열식별번호: 57의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 항-CD3 - VH 전장 서열];
    및, 임의적으로
    서열식별번호: 60의 서열, 또는 서열식별번호: 60의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 항-CD3 - VL 전장 서열]
    을 포함하는 것인 항체.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 57에 기재된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열 [야생형 항-CD3 (인간화 SP34, WO2015001085 (젠맵)) VH 및 VL 서열]을 포함하는 항원-결합 영역을 갖는 항체보다 더 낮은 인간 CD3ε 결합 친화도를 갖고, 바람직하게는 상기 친화도가 적어도 5배 더 낮거나, 예컨대 적어도 10배 더 낮거나, 예를 들어 적어도 20배 더 낮거나, 적어도 30배 더 낮거나, 적어도 40배 더 낮거나, 적어도 45배 더 낮거나 또는 예컨대 적어도 50배 더 낮은 것인 항체.
  76. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 영역이 CD3에 200 - 1000 nM의 범위 내, 예컨대 300 - 1000 nM의 범위 내, 400 - 1000 nM의 범위 내, 500 - 1000 nM의 범위 내, 300 - 900 nM의 범위 내, 400 - 900 nM의 범위 내, 400 - 700 nM의 범위 내, 500 - 900 nM의 범위 내, 500 - 800 nM의 범위 내, 500 - 700 nM의 범위 내, 600 - 1000 nM의 범위 내, 600 - 900 nM의 범위 내, 600 - 800 nM의 범위 내, 또는 예컨대 600 - 700 nM의 범위 내의 평형 해리 상수 K D로 결합하는 것인 항체.
  77. 제72항 또는 제75항에 있어서, 상기 항원 결합 영역이 CD3에 1 - 100 nM의 범위 내, 예컨대 5 - 100 nM의 범위 내, 10 - 100 nM의 범위 내, 1 - 80 nM의 범위 내, 1 - 60 nM의 범위 내, 1 - 40 nM의 범위 내, 1 - 20 nM의 범위 내, 5 - 80 nM의 범위 내, 5 - 60 nM의 범위 내, 5 - 40 nM의 범위 내, 5 - 20 nM의 범위 내, 10 - 80 nM의 범위 내, 10 - 60 nM의 범위 내, 10 - 40 nM의 범위 내, 또는 예컨대 10 - 20 nM의 범위 내의 평형 해리 상수 K D로 결합하는 것인 항체.
  78. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3에 결합하는 항원 결합 영역이 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하고,
    중쇄 가변 (VH) 영역이, 서열식별번호: 57에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역에 비교할 때, CDR 서열 중 하나 내에 아미노산 치환을 갖고, 이러한 치환이 T31, N57, H101, G105, S110 및 Y114로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있으며, 이러한 위치는 서열식별번호: 57 [VH_huCD3-H1L1]의 서열에 따라 넘버링되고;
    야생형 경쇄 가변 (VL) 영역이 각각 서열식별번호: 58, GTN 및 서열식별번호: 59에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체.
  79. 제72항에 있어서, 서열식별번호: 57에 기재된 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 비교할 때, CD3에 결합하는 항원 결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 총합으로, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
  80. 제72항 또는 제73항에 있어서, CD3에 결합하는 항원 결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 야생형 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%의 서열 동일성, 적어도 97%의 서열 동일성, 적어도 98%의 서열 동일성 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 서열 동일성이 CD에 결합하는 항원 결합 영역의 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열로 이루어지는 아미노산 서열과 야생형 중쇄 가변 (VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 정렬하는 것에 기초하여 계산되는 것인 항체.
  81. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 결합하는 항원 결합 영역이 T31M, T31P, N57E, H101G, H101N, G105P, S110A, S110G, Y114M, Y114R, Y114V로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 것인 항체.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 Fc-매개 이펙터 기능이 결여되거나 감소되고 ("불활성" 항체"), CD3에 결합하는 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체인 경우, 항체가
    a) 예를 들어, 본원에서 실시예 14에 기술된 바와 같이 검정될 때, 정제된 PBMC 또는 T 세포를 이펙터 세포로서 사용할 때 SK-OV-3 세포의 농도-의존적 세포독성을 매개할 수 있고/거나,
    b) 예를 들어, 본원에서 실시예 13에서 기술된 바와 같이 검정될 때, 정제된 T 세포를 이펙터 세포로서 사용할 때 MDA-MB-231 세포의 농도-의존적 세포독성을 매개할 수 있고/거나,
    c) 예를 들어, 본원에서 실시예 13에서 기술된 바와 같이 검정될 때, MDA-MB-231 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T-세포를 활성화시킬 수 있고/거나,
    d) 예를 들어, 본원에서 실시예 17에서 기술된 바와 같이 검정될 때, BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T-세포를 활성화시킬 수 있고/거나,
    e) 예를 들어, 본원에서 실시예 17에서 기술된 바와 같이 검정될 때, 정제된 T 세포를 이펙터 세포로서 사용할 때 BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 세포독성을 유도할 수 있고/거나,
    f) 예를 들어, 실시예 15에서 기술된 바와 같이 결정될 때, 인간 MDA-MB-231 종양 세포가 접종된 인간화 면역 조혈 줄기 세포 재구성 마우스 이종이식 모델, 예컨대 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ에서 항-종양 활성, 예컨대 지연된 종양 성장을 나타내는 것인 항체.
  83. 제82항에 있어서, SK-OV-3 세포의 농도-의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력이
    i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 또는 T 세포를 단리하는 단계,
    ii) 각각의 샘플이 PBMC 및 인간 난소 선암종 SK-OV-3 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 PBMC:SK-OV-3 세포 비가 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1, 및 12:1인 제1 샘플 세트; 및
    각각의 샘플이 T 세포 및 인간 난소 선암종 SK-OV-3 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T 세포:SK-OV-3 세포의 비가 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1인 제2 샘플 세트
    를 제공하는 단계,
    iii) 항체를 각각의 샘플 세트에 0.0128 ng/mL 내지 1000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하고, 샘플을 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계, 및 그 후
    iv) 레사주린(Resazurin) (7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드)을 사용하여 SK-OV-3 세포의 생존율을 평가하는 단계
    를 포함하는 시험관내 세포독성 검정법에서 결정되는 것인 항체.
  84. 제82항에 있어서, MDA-MB-231 종양 세포의 존재 하에 시험관내에서 T 세포를 활성화시키는 능력이
    i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 T 세포를 단리하는 단계,
    ii) 각각의 샘플이 T-세포 및 인간 유방 선암종 MDA-MB-231 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T-세포:MDA-MB-231 세포의 비가 8:1인 샘플 세트를 제공하는 단계,
    iii) 항체를 샘플 세트에 0.0128 ng/mL 내지 1000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하고, 샘플을 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계,
    iv) T-세포를 T-세포 활성화 마커에 대한 형광-표지 항체, 예컨대 CD69-APC, CD25-PE-Cy7 및 CD279/PD1-BV604 항체로 4℃에서 30분 동안 상기 항체와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 염색하는 단계; 및
    v) 유동 세포측정법에 의해 샘플을 분석하는 단계
    를 포함하는 검정법에서 결정되는 것인 항체.
  85. 제82항에 있어서, BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 존재 하의 시험관내에서의 T 세포의 활성화가
    i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 T 세포를 단리하는 단계,
    ii) 각각의 샘플이 상기 T 세포 및 BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 또는 SiHa 종양 세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T 세포:종양 세포의 비가 4:1인 샘플 세트를 제공하는 단계,
    iii) 항체를 샘플 세트에 0.0128 ng/mL 내지 5000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하고 (예컨대 5배 희석), 샘플을 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계,
    iv) 각각의 샘플로부터 T 세포를 함유하는 상청액 110 ㎕를 수집하고, T 세포를 T-세포 마커에 대한 형광-표지 항체, 예컨대 CD3-이플루오르(eFluor)450, CD4-APC-이플루오르780, DC8-AF700, 및 T-세포 마커에 대한 항체, 예컨대 69-APC, CD25-PE-Cy7 및 CD279/PD1-BV604 항체로 4℃에서 30분 동안 상기 항체와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 염색하는 단계; 및
    v) 유동 세포측정법에 의해 샘플을 분석하는 단계
    를 포함하는 절차에서 결정되는 것인 항체.
  86. 제82항에 있어서, BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 및/또는 SiHa 종양 세포의 세포독성을 유도하는 능력이
    i) 건강한 인간 공여자의 백혈구 연층으로부터 T 세포를 단리하는 단계,
    ii) 각각의 샘플이 96웰 조직 배양 플레이트의 바닥에 부착되도록 허용된 BxPC-3, PANC-1, Ca Ski 또는 SiHa 종양 세포 및 상기 T-세포를 포함하고, 상기 샘플 내의 T-세포:종양 세포의 비가 4:1인 시험 샘플 및 대조군 샘플의 세트를 제공하는 단계,
    iii) 항체를 시험 샘플의 세트에 0.0128 ng/mL 내지 5000 ng/mL 범위의 농도로 첨가하는 한편 (예컨대 5배 희석), 대조군 샘플은 미처리로 남기거나 또는 5 μM 스타우로스포린과 함께 인큐베이션하고, 모든 샘플을 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하는 단계,
    iv) 부착성 세포를 10% (w/w) 공여자 소 혈청 + 철 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지 중에서 10% (w/w) 7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드 (레사주린)에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하는 단계,
    v) 세포의 흡광도를 측정하고, 스타우로스포린과 함께 인큐베이션된 세포의 흡광도를 0% 생존율로, 미처리 세포를 100% 생존율로 설정하고, 백분율 생존 세포를 하기와 같이 계산하는 단계:
    Figure pct00046

    를 포함하는 절차에서 결정되는 것인 항체.
  87. 제72항 및 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
    a) 각각 서열식별번호: 61, 55, 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [VH CDR1-T31P + 야생형 VH CDR 2,3], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3], 또는
    b) 각각 서열식별번호: 63, 55, 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [VH CDR1-T31M + 야생형 VH CDR 2,3], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
    c) 각각 서열식별번호: 54, 65, 및 56에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [VH CDR-N57E + 야생형 VH CDR 1,3], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
    d) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
    e) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 69에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101N], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
    f) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 71에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-G105P], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
    g) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 73에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-S110A], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
    h) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 75에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-S110G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각,
    i) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 77에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-Y114V], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
    j) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 79에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-Y114M], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각, 또는
    k) 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 81에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-Y114R], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각
    을 포함하는 것인 항체.
  88. 제72항 및 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함하는 것인 항체.
  89. 제72항 및 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 10, AAS 및 서열식별번호: 11의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059]을 포함하고;
    CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함하는 것인 항체.
  90. 제72항 및 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 45, DAS 및 46의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207]을 포함하고;
    CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함하는 것인 항체.
  91. 제47항 및 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 48, 49 및 50의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 52, DAS 및 53의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226]을 포함하고;
    CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 54, 55, 및 67에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [야생형 VH CDR 1,2 + VH CDR3-H101G], 및 각각 서열식별번호: 58에 기재된 바와 같은 서열, 서열 GTN, 및 서열식별번호: 59에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [야생형 VL CDR 1,2,3] 각각을 포함하는 것인 항체.
  92. 제72항 및 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이
    a) 서열식별번호: 62에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH T31P 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열 [야생형 전장 서열],
    b) 서열식별번호: 64에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH T31M 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    c) 서열식별번호: 66에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH N57E 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    d) 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    e) 서열식별번호: 70에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101N 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    f) 서열식별번호: 72에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH G105P 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    g) 서열식별번호: 74에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH S110A 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    h) 서열식별번호: 76에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH S110G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    i) 서열식별번호: 78에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH Y114V 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열,
    j) 서열식별번호: 80에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH Y114M 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열; 및
    k) 서열식별번호: 82에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH Y114R 전장 서열] 및서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열 및 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  93. 제72항 및 제78항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  94. 제78항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [059 - VH 전장 서열]을 포함하고;
    인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  95. 제72항 및 제78항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [207 - VH 전장 서열]을 포함하고;
    인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  96. 제47항 및 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) [226 - VH 전장 서열]을 포함하고;
    인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  97. 제72항 및 제78항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 5의 서열 또는 서열식별번호: 5의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 9의 서열 또는 서열식별번호: 9의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [059]을 포함하고,
    인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  98. 제72항, 제78항 내지 제93항, 및 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 40의 서열 또는 서열식별번호: 40의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 44의 서열 또는 서열식별번호: 44의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [207 - VH + VL 전장 서열]을 포함하고,
    인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  99. 제72항, 제78항 내지 제93항, 및 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
    5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 47의 서열 또는 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 51의 서열 또는 서열식별번호: 51의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) [226 - VH + VL 전장 서열]을 포함하고,
    인간 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 서열식별번호: 68에 기재된 바와 같은 VH 서열 [VH H101G 전장 서열] 및 서열식별번호: 60에 기재된 바와 같은 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 항원-결합 영역이 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 상기 가변 영역 각각이 각각 3개의 CDR 서열 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 4개의 프레임워크 서열 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 것인 항체.
  101. 제100항에 있어서, 항체가 2개의 중쇄 불변 영역 (CH), 및 2개의 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 것인 항체.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 상기 제1 및 제2 중쇄 각각이 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하고, 상기 제1 중쇄에서, 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되었고, 상기 제2 중쇄에서, 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되었으며, 상기 제1 및 상기 제2 중쇄의 상기 치환이 동일한 위치에 있지 않고, 아미노산 위치가 EU 넘버링에 따라 넘버링된 것인 항체.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치의 아미노산이 R이고, 상기 제2 중쇄에서 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치의 아미노산이 L이거나, 또는 그 반대인 항체.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 각각 F 및 E인 항체.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 A인 항체.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역(들)이 인간화되고/거나,
    b) 존재하는 경우, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 인간화된 것인 항체.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역(들)이 인간형이고/거나,
    b) 존재하는 경우, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 인간형인 항체.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역(들)이 키메라이고/거나,
    b) 존재하는 경우, CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역이 키메라인 항체.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 제1 중쇄 및 임의적으로 제2 중쇄를 포함하고, 제1 중쇄 및 존재하는 경우의 제2 중쇄가 항체가 동일한 비-변형 항체에 비교하여 더 낮은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 변형된 것인 항체.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 카파 (κ) 경쇄를 포함하는 것인 항체.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 람다 (λ) 경쇄를 포함하는 것인 항체.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 람다 (λ) 경쇄 및 카파 (κ) 경쇄를 포함하고, 예를 들어 CD3에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 람다 경쇄 및 5T4에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 중쇄 및 카파 경쇄를 갖는 항체를 포함하는 것인 항체.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 치료 모이어티, 예컨대 세포독성제, 화학요법 약물, 사이토카인, 면역억제제, 항생제, 또는 방사성동위원소를 포함하는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC).
  114. a) 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
    b) 제72항 내지 제113항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하는 핵산 구축물.
  115. 제114항에 있어서,
    a) 제72항 내지 제113항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
    b) 제72항 내지 제113항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
    을 추가로 포함하는 핵산 구축물.
  116. a) 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
    b) 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하는 발현 벡터.
  117. 제116항에 있어서,
    a) 제72항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
    b) 제72항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
    을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  118. 제114항 또는 제115항에서 정의된 바와 같은 핵산 구축물, 또는 제116항 또는 제117항에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 세포, 예컨대 상기 핵산 구축물 또는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 수득된 세포, 예컨대 재조합 숙주 세포.
  119. 제118항에 있어서, 상기 숙주 세포가 인간 기원의 것, 예컨대 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 예컨대 HEK/Expi 세포이거나, 또는 설치류 기원의 것, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포, 예컨대 CHO/N50 세포인 세포.
  120. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물.
  121. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  122. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항체.
  123. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 치료에서 사용하기 위한 항체.
  124. 제122항 또는 제123항에 있어서, 질환이 암인 항체.
  125. 제124항에 있어서, 암이 종양 세포의 적어도 일부에서의 5T4의 발현을 특징으로 하는 것인 항체.
  126. 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 신장암/신암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 난소암, 방광암, 자궁암/자궁내막암/자궁경부암, 폐암, 위장암, 위암, 췌장암, 갑상선암, 두경부암, 림프종, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  127. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체, 제120항에서 정의된 바와 같은 조성물, 또는 제121항에서 정의된 바와 같은 제약 조성물을 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 방법이 암 치료를 위한 것인 방법.
  129. 제128항에 있어서, 암이 신장암/신암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 난소암, 방광암, 자궁암/자궁내막암/자궁경부암, 폐암, 위장암, 위암, 췌장암, 갑상선암, 두경부암, 림프종, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  130. a) 제114항 또는 제117항에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 배양 배지로부터 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 정제하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 방법.
  131. a) 5T4에 결합할 수 있는 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 제116항 또는 제117항에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 5T4에 결합할 수 있는 항체를 정제하는 것에 의해 5T4에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계;
    b) CD3에 결합할 수 있는 항체의 발현을 허용하는 조건 하에
    I) 제72항 내지 제1123항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및
    II) 제72항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 CD3에 결합할 수 있는 항체를 정제하는 것에 의해 CD3에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계;
    c) 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪도록 허용하는 데 충분한 환원 조건 하에 5T4에 결합할 수 있는 상기 항체를 CD3에 결합할 수 있는 상기 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, 및
    d) 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 수득하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 방법.
  132. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체 및 키트 사용을 위한 설명서를 포함하는, 동반 진단으로 사용하기 위한/환자 집단 내에서 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체 또는 제113항에서 정의된 바와 같은 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)로의 치료에 반응할 경향을 갖는 환자를 확인하기 위한, 또는 환자 치료에서 사용되는 경우에 상기 항체 또는 면역접합체 또는 ADC의 효능을 예측하기 위한 부분들의 키트, 예컨대 키트.
  133. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 5T4에 결합할 수 있는 항원-결합 영역에 결합하는 항-이디오타입 항체.
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