JP5787446B2 - 抗体定常領域改変体 - Google Patents
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Description
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔1〕配列番号:24(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、14番目(EUナンバリング131番目)のCys、16番目(EUナンバリング133番目)のArg、103番目(EUナンバリング220番目)のCys、20番目(EUナンバリング137番目)のGlu、21番目(EUナンバリング138番目)のSer、147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArgおよび298番目(EUナンバリング419番目)のGlnが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する抗体定常領域、
〔2〕14番目のCysはSerに、16番目のArgはLysに、103番目のCysはSerに、20番目のGluはGlyに、21番目のSerはGlyに、147番目のHisはGlnに、234番目のArgはGlnに、298番目のGlnはGluに置換されることを特徴とする〔1〕に記載の抗体定常領域、
〔3〕325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysがさらに欠損したアミノ酸配列を有する〔1〕又は〔2〕に記載の抗体定常領域、
〔4〕配列番号:24(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、14番目(EUナンバリング131番目)のCys、16番目(EUナンバリング133番目)のArg、103番目(EUナンバリング220番目)のCys、20番目(EUナンバリング137番目)のGlu、21番目(EUナンバリング138番目)のSer、147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArg、298番目(EUナンバリング419番目)のGln、209番目(EUナンバリング330番目)のAla、210番目(EUナンバリング331番目)のPro、218番目(EUナンバリング339番目)のThrが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する抗体定常領域、
〔5〕14番目のCysはSerに、16番目のArgはLysに、103番目のCysはSerに、20番目のGluはGlyに、21番目のSerはGlyに、147番目のHisはGlnに、234番目のArgはGlnに、298番目のGlnはGluに、209番目のAlaはSerに、210番目のProはSerに、218番目のThrはAlaに置換されることを特徴とする〔4〕に記載の抗体定常領域、
〔6〕325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysがさらに欠損したアミノ酸配列を有する〔4〕又は〔5〕に記載の抗体定常領域、
〔7〕〔1〕〜〔6〕いずれかに記載の定常領域を有する抗体、
〔8〕〔7〕に記載の抗体を含む医薬組成物、
〔9〕102番目〜106番目に少なくとも1つのCysが存在するヒトκ鎖定常領域。
〔10〕107番目の位置にCysが存在しないヒトκ鎖定常領域、
〔11〕102番目〜106番目に少なくとも1つのCysが存在し、かつ107番目の位置にCysが存在しないヒトκ鎖定常領域、
〔12〕配列番号:32のアミノ酸配列において、1番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損していることを特徴とする〔9〕〜〔11〕いずれかに記載のヒトκ鎖定常領域、
〔13〕102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損していることを特徴とする〔12〕に記載のヒトκ鎖定常領域、
〔14〕105番目のアミノ酸が欠損していることを特徴とする〔13〕に記載のヒトκ鎖定常領域、
〔15〕106番目のアミノ酸が欠損していることを特徴とする〔13〕に記載のヒトκ鎖定常領域、
〔16〕102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysに置換されていることを特徴とする〔9〕に記載のヒトκ鎖定常領域、
〔17〕102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysに置換され、かつ107番目のCysが他のアミノ酸に置換されている又は欠損していることを特徴とする〔9〕〜〔11〕いずれかに記載のヒトκ鎖定常領域、
〔18〕〔9〕〜〔17〕いずれかに記載のヒトκ鎖定常領域を有する抗体、
〔19〕〔18〕に記載の抗体を含む医薬組成物、
〔20〕〔1〕〜〔6〕いずれかに記載の重鎖定常領域および〔9〕〜〔17〕いずれかに記載の軽鎖定常領域を含む抗体、
〔21〕〔20〕に記載の抗体を含む医薬組成物。
*抗体のヘテロジェニティーの低下:
あるアミノ酸配列をコードするDNAを発現させることによって得られるポリペプチドは、理論上は同じアミノ酸配列からなる均質なポリペプチド分子となるはずである。しかし抗体をコードするDNAを適当な宿主で発現させた場合、実際には、種々の要因によって構造の異なる異質なポリペプチドが生成することがある。抗体の製造においては、多くの異質なポリペプチドからなる抗体集団は、ヘテロジェニティーが高いと言うことができる。本発明の定常領域は、ヘテロジェニティーの原因がアミノ酸配列の改変によって除かれている。したがって、本発明の定常領域で抗体を構成することによって、ヘテロジェニティーの低い抗体を製造することができる。すなわち、抗体の重鎖定常領域に本発明によって提供された改変を導入することによって、抗体の均質性を高く維持することができる。抗体のヘテロジェニティーを低く抑えるとは、ヘテロジェニティーを改善することを意味し、医薬品の品質の維持において重要な課題である。したがって、本発明の定常領域は、抗体を含む医薬品の品質の維持に貢献する。
本発明は、好ましい態様において、抗体の薬物動態の向上に貢献する。具体的には、本発明における抗体の定常領域に、特定のアミノ酸残基の改変を加えたとき、当該定常領域で構成された抗体の血中濃度は、アミノ酸配列を改変していないものと比較して長い時間にわたって維持される。血中濃度をできるだけ長期間維持することは、抗体を医薬品として投与するときに、より少量の抗体で長期にわたって治療効果を維持できることを意味する。あるいは、抗体の投与間隔をより広くして、投与回数を少なくできる。
具体的には、次のような改変を含む定常領域は、いずれも本発明に含まれる。
*配列番号:24(ヒトIgG2定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*改変された配列番号:24(ヒトIgG2定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*配列番号:24(ヒトIgG2定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入し、更に付加的な改変も導入する。
*配列番号:32(ヒトκ鎖定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*改変された配列番号:32(ヒトκ鎖定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*配列番号:32(ヒトκ鎖定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入し、更に付加的な改変も導入する。
*配列番号:37(ヒトλ鎖定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*改変された配列番号:37(ヒトλ鎖定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*配列番号:37(ヒトλ鎖定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入し、更に付加的な改変も導入する。
本発明は、安定性、ヘテロジェニティー、免疫原性および/または薬物動態が改善された重鎖定常領域を提供する。また本発明は当該重鎖定常領域を含む抗体を提供する。
より具体的には配列番号:24に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域(IgG2定常領域)において、14番目(EUナンバリング131番目)のCys、16番目(EUナンバリング133番目)のArg、103番目(EUナンバリング220番目)のCys、20番目(EUナンバリング137番目)のGlu、21番目(EUナンバリング138番目)のSer、147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArgおよび298番目(EUナンバリング419番目)のGlnが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する重鎖定常領域及び当該重鎖定常領域を含む抗体を提供する。
より具体的には、配列番号:24に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域(IgG2定常領域)において、14番目(EUナンバリング131番目)のCys、16番目(EUナンバリング133番目)のArg、103番目(EUナンバリング220番目)のCys、20番目(EUナンバリング137番目)のGlu、21番目(EUナンバリング138番目)のSer、147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArg、298番目(EUナンバリング419番目)のGln、209番目(EUナンバリング330番目)のAla、210番目(EUナンバリング331番目)のPro、218番目(EUナンバリング339番目)のThrが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び当該重鎖定常領域を含む抗体を提供する。
酸性での安定性を改善する為のアミノ酸改変の具体例としては、例えば、配列番号:24に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、276番目(EUナンバリングの397番目)のMetを他のアミノ酸に置換する改変を挙げることができる。他のアミノ酸は特に限定されないが、Valであることが好ましい。配列番号:24に記載のアミノ酸配列において276番目(EUナンバリングの397番目)のMetが他のアミノ酸であることにより、抗体の酸性条件下での安定性を向上させることが可能である。
さらに、本発明はヒンジ領域のヘテロジェニティーを改善する為に用いることが可能な軽鎖定常領域を提供する。また本発明は当該軽鎖定常領域を含む抗体を提供する。
より具体的にはヒトκ鎖定常領域において、102番目〜106番目の位置に少なくとも1つのCysが存在するヒトκ鎖定常領域、及び当該ヒトκ鎖定常領域を含む抗体を提供する。例えば、配列番号:32に記載のアミノ酸配列を有するヒトκ鎖において、102番目〜106番目の位置に少なくとも1つのCysが存在するとは、102番目のPhe〜106番目のGluの位置に少なくとも1つのCysが存在することを意味する。
・102〜106番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する
・102〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する
・1〜106番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる
さらに、本発明はヒンジ領域のヘテロジェニティーを改善する為に用いることが可能な軽鎖定常領域を提供する。また本発明は当該軽鎖定常領域を含む抗体を提供する。
より具体的にはヒトλ鎖定常領域において、99番目〜103番目の位置に少なくとも1つのCysが存在するヒトλ鎖定常領域、及び当該ヒトλ鎖定常領域を含む抗体を提供する。例えば、配列番号:37に記載のアミノ酸配列を有するヒトλ鎖において、99番目〜103番目の位置に少なくとも1つのCysが存在するとは、99番目のVal〜103番目のGluの位置に少なくとも1つのCysが存在することを意味する。
・99〜103番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する
・99〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する
・1〜103番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる。
一方、本発明のヒトκ鎖定常領域のようにシステインの位置をN末端側に移動させることにより、このシステインと一方のH鎖のEUナンバリング219番目のシステインとの距離が遠くなり、2つのH鎖のうち片一方のH鎖に存在するEUナンバリング219番目のシステインとしかジスルフィド結合を形成できなくなる。その結果としてヒンジ領域のヘテロジェニティーが減少すると考えられる(図16参照)。つまり、ヒトκ鎖定常領域のシステインと一方のH鎖EUナンバリング219番目のシステインとの距離を遠くすることにより、ヒンジ領域のヘテロジェニティーを軽減できると考えられる。同様の方法により、ヒトλ鎖定常領域においても、一方のH鎖EUナンバリング219番目のシステインとの距離を遠くすることにより、ヒンジ領域のヘテロジェニティーを軽減できると考えられる。
さらに、本発明の軽鎖定常領域の改変は、ヒト以外の動物由来の軽鎖定常領域を対象とすることも可能である。ヒト以外の動物由来の軽鎖定常領域の例としては、マウス抗体のκ鎖定常領域(配列番号:40)、ラット抗体のκ鎖定常領域(配列番号:41)、ラビット(ウサギ)抗体のκ鎖定常領域(配列番号:42または配列番号:43)などを挙げることができるがこれらに限定されない。
ラビットκ鎖定常領域(配列番号:42)の場合、好ましくは101番目、102番目または103番目であり、より好ましくは102番目又は103番目であり、特に好ましくは103番目である。
ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43)の場合、好ましくは103番目、104番目または105番目であり、より好ましくは104番目又は105番目であり、特に好ましくは105番目である。
又、ラビットκ鎖定常領域(配列番号:42)の場合、好ましくは99アミノ酸〜104アミノ酸であり、より好ましくは102アミノ酸〜103アミノ酸であり、さらに好ましくは103アミノ酸である。
又、ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43)の場合、好ましくは101アミノ酸〜106アミノ酸であり、より好ましくは104アミノ酸〜105アミノ酸であり、さらに好ましくは105アミノ酸である
・102〜106番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する
・102〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する
・1〜106番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる
・99〜103番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する
・99〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する
・1〜103番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる
・101〜105番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する
・101〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する
・1〜105番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる
本発明のκ鎖定常領域の好ましい態様として、κ鎖定常領域において102番目〜106番目の位置に少なくとも1つのCysが存在し、かつ107番目の位置にCysが存在しないκ鎖定常領域を挙げることができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、例えば、1番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損しているκ鎖定常領域を挙げることができる。例えば、配列番号:40または41に記載のアミノ酸配列を有するκ鎖定常領域において、106番目のGluが欠損した場合、107番目のCysは106番目に移動することから、106番目にCysが存在し、107番目にCysが存在しないκ鎖定常領域となる。アミノ酸が欠損する部位は特に限定されないが、102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損することが好ましく、105番目又は106番目のアミノ酸が欠損することがさらに好ましい。
又、欠損するアミノ酸の数は特に限定されず、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個のアミノ酸を欠損することができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、105番目のアミノ酸が欠損しているκ鎖定常領域、または106番目のアミノ酸が欠損しているκ鎖定常領域を挙げることができる。
又、上述の、107番目の位置にCysが存在しないマウスκ鎖定常領域またはラットκ鎖定常領域の好ましい他の態様として、102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysに置換され、かつ107番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されているκ鎖定常領域を挙げることができる。Cysに置換されるアミノ酸の数は特に限定されないが、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個である。
Cysに置換される部位は特に限定されないが、好ましい置換部位として、105番目または106番目を挙げることができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、105番目のAsnがCysに置換され、かつ107番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されたヒトκ鎖定常領域、または106番目のGluがCysに置換されかつ107番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されたκ鎖定常領域を挙げることができる。
本発明のマウスκ鎖定常領域またはラットκ鎖定常領域は、上述のアミノ酸の改変に加えて、他のアミノ酸改変が行われてもよい。上述のアミノ酸改変が行われる限り、さらに他のアミノ酸の改変や修飾が行われたκ鎖定常領域も、本発明のκ鎖定常領域に含まれる。
本発明のκ鎖定常領域の好ましい態様として、κ鎖定常領域において99番目〜103番目の位置に少なくとも1つのCysが存在し、かつ104番目の位置にCysが存在しないκ鎖定常領域を挙げることができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、例えば、1番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損しているκ鎖定常領域を挙げることができる。例えば、配列番号:42に記載のアミノ酸配列を有するκ鎖定常領域において、103番目のAspが欠損した場合、104番目のCysは103番目に移動することから、103番目にCysが存在し、104番目にCysが存在しないκ鎖定常領域となる。アミノ酸が欠損する部位は特に限定されないが、99番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損することが好ましく、102番目又は103番目のアミノ酸が欠損することがさらに好ましい。
又、欠損するアミノ酸の数は特に限定されず、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個のアミノ酸を欠損することができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、102番目のアミノ酸が欠損しているκ鎖定常領域、または103番目のアミノ酸が欠損しているκ鎖定常領域を挙げることができる。
又、上述の、104番目の位置にCysが存在しないラビットκ鎖定常領域の好ましい他の態様として、99番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysに置換され、かつ104番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されているκ鎖定常領域を挙げることができる。Cysに置換されるアミノ酸の数は特に限定されないが、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個である。
Cysに置換される部位は特に限定されないが、好ましい置換部位として、102番目または103番目を挙げることができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、102番目のGlyがCysに置換され、かつ104番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されたヒトκ鎖定常領域、または103番目のAspがCysに置換されかつ104番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されたκ鎖定常領域を挙げることができる。
本発明のラビットκ鎖定常領域は、上述のアミノ酸の改変に加えて、他のアミノ酸改変が行われてもよい。上述のアミノ酸改変が行われる限り、さらに他のアミノ酸の改変や修飾が行われたκ鎖定常領域も、本発明のκ鎖定常領域に含まれる。
本発明のκ鎖定常領域の好ましい態様として、κ鎖定常領域において101番目〜105番目の位置に少なくとも1つのCysが存在し、かつ106番目の位置にCysが存在しないκ鎖定常領域を挙げることができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、例えば、1番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損しているκ鎖定常領域を挙げることができる。例えば、配列番号:43に記載のアミノ酸配列を有するκ鎖定常領域において、105番目のAspが欠損した場合、106番目のCysは105番目に移動することから、105番目にCysが存在し、106番目にCysが存在しないκ鎖定常領域となる。アミノ酸が欠損する部位は特に限定されないが、101番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つが欠損することが好ましく、104番目又は105番目のアミノ酸が欠損することがさらに好ましい。
又、欠損するアミノ酸の数は特に限定されず、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個のアミノ酸を欠損することができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、104番目のアミノ酸が欠損しているκ鎖定常領域、または105番目のアミノ酸が欠損しているκ鎖定常領域を挙げることができる。
又、上述の、106番目の位置にCysが存在しないラビットκ鎖定常領域の好ましい他の態様として、101番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysに置換され、かつ106番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されているκ鎖定常領域を挙げることができる。Cysに置換されるアミノ酸の数は特に限定されないが、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個である。
Cysに置換される部位は特に限定されないが、好ましい置換部位として、104番目または105番目を挙げることができる。
このようなκ鎖定常領域の好ましい例としては、104番目GlyがCysに置換され、かつ106番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されたヒトκ鎖定常領域、または105番目のAspがCysに置換されかつ106番目のCysが欠損または他のアミノ酸に置換されたκ鎖定常領域を挙げることができる。
本発明のラビットκ鎖定常領域は、上述のアミノ酸の改変に加えて、他のアミノ酸改変が行われてもよい。上述のアミノ酸改変が行われる限り、さらに他のアミノ酸の改変や修飾が行われたκ鎖定常領域も、本発明のκ鎖定常領域に含まれる。
さらに、本発明は上述のいずれかに記載のアミノ酸改変を有する軽鎖定常領を含む軽鎖、および少なくとも一つのCysが他のアミノ酸に置換された重鎖定常領域を含む抗体を提供する。重鎖定常領域は特に限定されないが、IgG2定常領域であることが好ましい。重鎖定常領域がIgG2定常領域の場合、置換されるCysは特に限定されないが、例えば、EUナンバリング131(配列番号:24の14番目)、EUナンバリング219(配列番号:24の102番目)、EUナンバリング220(配列番号:24の103番目)のCysの少なくとも1つが他のアミノ酸に置換された定常領域を挙げることができる。2つのCysが他のアミノ酸に置換される場合、その組み合わせは特に限定されず、EUナンバリング131とEUナンバリング219の組み合わせ、EUナンバリング131とEUナンバリング220の組み合わせ等を挙げることができる。
さらに、本発明は上述のいずれかに記載のアミノ酸改変を有する軽鎖定常領域を含む軽鎖、およびEUナンバリング219(配列番号:24の102番目)がCysであり、EUナンバリング220(配列番号:24の103番目)がCysでない重鎖定常領域を含む重鎖を含む抗体を提供する。重鎖定常領域は特に限定されないが、好ましくはIgG2定常領域、より好ましくはM66又はM106である。抗体定常領域は1または複数のアミノ酸(例えば、20アミノ酸以内、10アミノ酸以内など)が置換、欠失、付加および/または挿入されていてもよい。
本発明の抗体を構成する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であることが出来る。本発明における好ましい可変領域として、抗原の中和作用を有する抗体の可変領域を示すことが出来る。たとえば、IL6受容体、IL31受容体、RANKLの中和作用を有する抗体の可変領域を、本発明の抗体を構成する可変領域とすることが出来る。
また、上述の抗体定常領域は生理活性ペプチド、抗原結合ペプチド等の様々な分子と結合させて、融合蛋白質とすることも可能である。
(a)定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換または欠損された重鎖および/または定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換または欠損された軽鎖をコードするDNAを発現させる工程
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程
重鎖定常領域のアミノ酸残基の改変としては、例えば以下が挙げられるがこれらに限定されない。
(1)IgG2定常領域(配列番号:24のアミノ酸配列)において、14番目(EUナンバリング131番目)のCysをSerに、16番目(EUナンバリング133番目)のArgをLysに、103番目(EUナンバリング220番目)のCysをSerに、20番目(EUナンバリング137番目)のGluをGlyに、21番目(EUナンバリング138番目)のSerをGlyに、147番目(EUナンバリング268番目)のHisをGlnに、234番目(EUナンバリング355番目)のArgをGlnに、298番目(EUナンバリング419番目)のGlnをGluに置換する。このような置換により、安定性が向上した抗体、免疫原性および/または薬物動態が改善された抗体を製造することが可能である。
(2)IgG2定常領域(配列番号:24のアミノ酸配列)において、14番目(EUナンバリング131番目)のCysをSerに、16番目(EUナンバリング133番目)のArgをLysに、103番目(EUナンバリング220番目)のCysをSerに、20番目(EUナンバリング137番目)のGluをGlyに、21番目(EUナンバリング138番目)のSerをGlyに、147番目(EUナンバリング268番目)のHisをGlnに、234番目(EUナンバリング355番目)のArgをGlnに、298番目(EUナンバリング419番目)のGlnをGluに、209番目(EUナンバリング330番目)のAlaをSerに、210番目(EUナンバリング331番目)のProをSerに、218番目(EUナンバリング339番目)のThrをAlaに置換する。このような置換により、Fcγレセプターへの結合を低下させた抗体を製造することが可能である。
(3)IgG2定常領域(配列番号:24のアミノ酸配列)において、325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysを欠損させる。このような欠損により、C末端のヘテロジェニティーが改善された抗体を製造することが可能である。
(4)IgG2定常領域(配列番号:24のアミノ酸配列)において、276番目(EUナンバリングの397番目)のMetをValに置換する。このような置換により、酸性条件下での安定性が向上した抗体を製造することが可能である。
(1)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、102番目〜106番目に少なくとも1つのCysが存在するようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(2)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、107番目の位置にCysが存在しないようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(3)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、102番目〜106番目に少なくとも1つのCysが存在し、かつ107番目の位置にCysが存在しないようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(4)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、1番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させる。
(5)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させる。
(6)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、105番目のアミノ酸を欠損させる。
(7)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、106番目のアミノ酸を欠損させる。
(8)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysに置換する。
(9)ヒトκ鎖定常領域(配列番号:32のアミノ酸配列)、マウスκ鎖定常領域(配列番号:40のアミノ酸配列)またはラットκ鎖定常領域(配列番号:41のアミノ酸配列)において、102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysを置換し、かつ107番目のCysを他のアミノ酸に置換する又は欠損させる。
(10)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、99番目〜103番目に少なくとも1つのCysが存在するようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(11)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、104番目の位置にCysが存在しないようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(12)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、99番目〜103番目に少なくとも1つのCysが存在し、かつ104番目の位置にCysが存在しないようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(13)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、1番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させる。
(14)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、99番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させる。
(15)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、102番目のアミノ酸を欠損させる。
(16)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、103番目のアミノ酸を欠損させる。
(17)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、99番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysに置換する。
(18)ヒトλ鎖定常領域(配列番号:37のアミノ酸配列)またはラビットκ鎖定常領域(配列番号:42のアミノ酸配列)において、99番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysを置換し、かつ104番目のCysを他のアミノ酸に置換する又は欠損させる。
(19)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、101番目〜105番目に少なくとも1つのCysが存在するようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(20)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、106番目の位置にCysが存在しないようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(21)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、101番目〜105番目に少なくとも1つのCysが存在し、かつ106番目の位置にCysが存在しないようにアミノ酸を置換または欠損させる。
(22)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、1番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させる。
(23)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、101番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させる。
(24)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、104番目のアミノ酸を欠損させる。
(25)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、105番目のアミノ酸を欠損させる。
(26)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、101番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysに置換する。
(27)ラビットκ鎖定常領域(配列番号:43のアミノ酸配列)において、101番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つがCysを置換し、かつ106番目のCysを他のアミノ酸に置換する又は欠損させる。
より具体的には、以下の工程を含む、本発明のアミノ酸の改変を有する重鎖定常領域及び/又は本発明のアミノ酸の改変を有する軽鎖定常領域を含む抗体の製造方法を提供する。
(a)本発明のアミノ酸の改変を有する重鎖定常領域を含む抗体重鎖をコードするポリヌクレオチド及び/又は本発明のアミノ酸の改変を有する軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖をコードする遺伝子が導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程、
(b)当該遺伝子によりコードされる抗体重鎖及び/又は抗体軽鎖を取得する工程。
重鎖定常領域のアミノ酸の改変としては上述の(1)〜(4)に記載のアミノ酸置換やアミノ酸欠損が挙げられるがこれらに限定されない。
軽鎖定常領域のアミノ酸の改変としては上述の(1)〜(27)に記載のアミノ酸置換やアミノ酸欠損が挙げられるがこれらに限定されない。
(a)可変領域と定常領域を含む抗体の重鎖と、軽鎖をコードするDNAを宿主細胞で発現させる工程;、および
(b)(a)において発現された抗体を回収する工程;
例えば、可変領域のN末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である。したがって、本発明の抗体は、その重鎖のN末端がグルタミンの場合には、それがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含む。
なお本発明の改変には、上アミノ酸の置換、欠損、付加及び/又は挿入、並びにそれらの組み合わせが含まれる。
また本発明は、配列番号:24に記載のヒトIgG2定常領域のアミノ酸を改変する工程を含む、抗体の機能を向上させる方法に関する。また本発明は、当該工程を含む方法によって製造された抗体に関する。抗体の機能向上としては、抗体の安定性の向上、免疫原性の低減、薬物動態を改善などが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法は以下(a)〜(h)の工程を含む。
(a)配列番号:24の14番目(EUナンバリング131番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)配列番号:24の16番目(EUナンバリング133番目)のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)配列番号:24の103番目(EUナンバリング220番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)配列番号:24の20番目(EUナンバリング137番目)のGluを他のアミノ酸に置換する工程、
(e)配列番号:24の21番目(EUナンバリング138番目)のSerを他のアミノ酸に置換する工程、
(f)配列番号:24の147番目(EUナンバリング268番目)のHisを他のアミノ酸に置換する工程、
(g)配列番号:24の234番目(EUナンバリング355番目)のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(h)配列番号:24の298番目(EUナンバリング419番目)のGlnを他のアミノ酸に置換する工程。
325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysを欠損させる工程、
をさらに含んでもよい。
(a)配列番号:24の14番目(EUナンバリング131番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)配列番号:24の16番目(EUナンバリング133番目)のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)配列番号:24の103番目(EUナンバリング220番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)配列番号:24の20番目(EUナンバリング137番目)のGluを他のアミノ酸に置換する工程、
(e)配列番号:24の21番目(EUナンバリング138番目)のSerを他のアミノ酸に置換する工程、
(f)配列番号:24の147番目(EUナンバリング268番目)のHisを他のアミノ酸に置換する工程、
(g)配列番号:24の234番目(EUナンバリング355番目)のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(h)配列番号:24の298番目(EUナンバリング419番目)のGlnを他のアミノ酸に置換する工程、
(i)配列番号:24の209番目(EUナンバリング330番目)のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(j)配列番号:24の210番目(EUナンバリング331番目)のProを他のアミノ酸に置換する工程、
(k)配列番号:24の218番目(EUナンバリング339番目)のThrを他のアミノ酸に置換する工程。
325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysを欠損させる工程、
をさらに含んでもよい。
具体的には本発明は、重鎖定常領域EUナンバリング219のCysと軽鎖C末端領域のCysとの間で特異的にジスルフィド結合を形成させる工程を含む、抗体の薬物動態を向上させる方法に関する。
上述の工程においては、さらに重鎖定常領域EUナンバリング220のCysと軽鎖C末端領域のCysとの間でジスルフィド結合を形成させないことが好ましい。
本発明の方法においては必ずしも全ての抗体が重鎖EUナンバリング219のCysと軽鎖C末端領域のCysとの間でジスルフィド結合を形成する必要はなく、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは99%以上の抗体が重鎖EUナンバリング219のCysと軽鎖C末端領域のCysとの間でジスルフィド結合を形成していればよい。
本発明においては、EUナンバリング220のCysとともに、さらにEUナンバリング131番目のCysも他のアミノ酸に置換してもよい。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、例えばSerに置換することが可能である。
本発明の方法で使用されるIgG2定常領域は、配列番号:24に記載のアミノ酸配列から1又は複数(例えば20アミノ酸以内、10アミノ酸以内、など)のアミノ酸が欠失、置換、付加および/または挿入されていてもよい。又、本発明の方法で使用されるIgG2は、本明細書の記載から特定可能な改変又はその組み合わせを含むことが出来る。
又、本発明の方法で使用されるヒトκ鎖定常領域は、配列番号:32に記載のアミノ酸配列から1又は複数(例えば20アミノ酸以内、10アミノ酸以内、など)のアミノ酸が欠失、置換、付加および/または挿入されていてもよい。
又、本発明の方法で使用されるヒトλ鎖定常領域は、配列番号:37に記載のアミノ酸配列から1又は複数(例えば20アミノ酸以内、10アミノ酸以内、など)のアミノ酸が欠失、置換、付加および/または挿入されていてもよい。
又、本発明の方法で使用されるヒトκ鎖定常領域、ヒトλ鎖定常領域は、本明細書の記載から特定可能な改変又はその組み合わせを含むことが出来る。
また本発明は、配列番号:32に記載のヒトκ定常領域、配列番号:40に記載のマウスκ鎖定常領域または配列番号:41に記載のラットκ鎖定常領域において、102番目〜106番目に少なくとも1つのCysを導入する工程を含む、ヒンジ領域のヘテロジェニティーを減少させる方法に関する。また本発明は、当該工程を含む方法によって製造された抗体に関する。
本発明において、102番目〜106番目に少なくとも1つのCysを導入するとは、ヒトκ鎖定常領域の102番目〜106番目に少なくとも1つのCysが存在する状態にすることを言う。
本発明において、107番目のCysを消失させるとは、ヒトκ鎖定常領域の107番目の位置にCysが存在しない状態にすることを言う。
(a)102番目〜106番目に少なくとも1つのCysを導入する工程、および
(b)107番目のCysを消失(欠損)させる工程
を含む、ヒンジ領域のヘテロジェニティーを減少させる方法に関する。また本発明は、当該工程を含む方法によって製造された抗体に関する。
本発明において、102番目〜106番目に少なくとも1つのCysを導入する工程と107番目のCysを消失させる工程は単一の工程で行われてもよい。
Cysが導入される位置は特に限定されないが、好ましくは104番目、105番目または106番目であり、より好ましくは105番目又は106番目であり、特に好ましくは106番目である。
・102〜106番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する工程
・102〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する工程
・1〜106番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる工程
・107番目のCysを欠損する工程
・107番目のCysを他のアミノ酸に置換する工程
・107番目の位置に他のアミノ酸を挿入する工程
・1〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させることにより107番目のCysを他の位置に移動させる工程
ヒトκ鎖定常領域の1〜106番目のアミノ酸において1〜5アミノ酸を欠損させる工程
を挙げることができる。1〜106番目の1〜5アミノ酸を欠損させることにより、107番目のCysが102番目〜106番目に移動するので、102番目〜106番目に少なくとも1つのCysを導入する工程と107番目のCysを消失させる工程を同時に行うことが可能である。
又、欠損するアミノ酸の数は特に限定されず、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個のアミノ酸を欠損することができる。
・105番目のアミノ酸を欠損させる工程、または
・106番目のアミノ酸を欠損する工程
(a)102番目〜106番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysに置換する工程および
(b)107番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
を含む方法が挙げられる。Cysに置換されるアミノ酸の数は特に限定されないが、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個である。Cysに置換される部位は特に限定されないが、好ましい置換部位として、105番目または106番目を挙げることができる。
(a)105番目のGlyまたは106番目のGluをCysに置換する工程、および
(b)107番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
を挙げることができる。
またマウスおよびラットκ鎖定常領域の場合、
(a)105番目のAsnまたは106番目のGluをCysに置換する工程、および
(b)107番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
を挙げることができる。
本発明において、99番目〜103番目に少なくとも1つのCysを導入するとは、ヒトλ鎖定常領域の99番目〜103番目に少なくとも1つのCysが存在する状態にすることを言う。
本発明において、104番目のCysを消失させるとは、ヒトλ鎖定常領域の104番目の位置にCysが存在しない状態にすることを言う。
(a)99番目〜103番目に少なくとも1つのCysを導入する工程、および
(b)104番目のCysを消失させる工程
を含む、ヒンジ領域のヘテロジェニティーを減少させる方法に関する。
本発明において、99番目〜103番目に少なくとも1つのCysを導入する工程と104番目のCysを消失させる工程は単一の工程で行われてもよい。
Cysが導入される位置は特に限定されないが、好ましくは101番目、102番目または103番目であり、より好ましくは102番目又は103番目であり、特に好ましくは103番目である。
・99〜103番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する工程
・99〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する工程
・1〜103番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる工程
・104番目のCysを欠損する工程
・104番目のCysを他のアミノ酸に置換する工程
・104番目の位置に他のアミノ酸を挿入する工程
・1〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させることにより105番目のCysを他の位置に移動させる工程
ヒトλ鎖定常領域の1〜103番目のアミノ酸において1〜5アミノ酸を欠損させる工程
を含む方法を挙げることができる。1〜103番目の1〜5アミノ酸を欠損させることにより、104番目のCysが99番目〜103番目に移動するので、99番目〜103番目に少なくとも1つのCysを導入する工程と104番目のCysを消失させる工程を同時に行うことが可能である。
又、欠損するアミノ酸の数は特に限定されず、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個のアミノ酸を欠損することができる。
・102番目のアミノ酸を欠損させる工程または
・103番目のアミノ酸を欠損する工程
(a)99番目〜103番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysに置換する工程および
(b)104番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
を含む方法が挙げられる。Cysに置換されるアミノ酸の数は特に限定されないが、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個である。Cysに置換される部位は特に限定されないが、好ましい置換部位として、102番目または103番目を挙げることができる。
(a)102番目のThrまたは103番目のGluをCysに置換する工程および
(b)104番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
また配列番号:42に記載のラビットκ鎖定常領域の場合、以下を挙げることが出来るがこれらに限定されない。
(a)102番目のGlyまたは103番目のAspをCysに置換する工程および
(b)104番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
本発明において、101番目〜105番目に少なくとも1つのCysを導入するとは、ラットκ鎖定常領域の101番目〜105番目に少なくとも1つのCysが存在する状態にすることを言う。
本発明において、106番目のCysを消失させるとは、ラビットκ鎖定常領域の106番目の位置にCysが存在しない状態にすることを言う。
(a)101番目〜105番目に少なくとも1つのCysを導入する工程、および
(b)106番目のCysを消失させる工程
を含む、ヒンジ領域のヘテロジェニティーを減少させる方法に関する。
本発明において、101番目〜105番目に少なくとも1つのCysを導入する工程と106番目のCysを消失させる工程は単一の工程で行われてもよい。
Cysが導入される位置は特に限定されないが、好ましくは103番目、104番目または105番目であり、より好ましくは104番目又は105番目であり、特に好ましくは105番目である。
・101番目〜105番目の位置に少なくとも1つのCysを挿入する工程
・101番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysで置換する工程
・1〜105番目のアミノ酸のうち1〜5個のアミノ酸を欠損させる工程
・106番目のCysを欠損する工程
・106番目のCysを他のアミノ酸に置換する工程
・106番目の位置に他のアミノ酸を挿入する工程
・1〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つを欠損させることにより106番目のCysを他の位置に移動させる工程
ラビットκ鎖定常領域の1〜105番目のアミノ酸において1〜5アミノ酸を欠損させる工程
を含む方法を挙げることができる。1〜105番目の1〜5アミノ酸を欠損させることにより、106番目のCysが101番目〜105番目に移動するので、101番目〜105番目に少なくとも1つのCysを導入する工程と106番目のCysを消失させる工程を同時に行うことが可能である。
又、欠損するアミノ酸の数は特に限定されず、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個のアミノ酸を欠損することができる。
・104番目のアミノ酸を欠損させる工程または
・105番目のアミノ酸を欠損する工程
(a)101番目〜105番目のアミノ酸の少なくとも1つをCysに置換する工程および
(b)106番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
を含む方法が挙げられる。Cysに置換されるアミノ酸の数は特に限定されないが、通常1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1個又は2個、より好ましくは1個である。Cysに置換される部位は特に限定されないが、好ましい置換部位として、104番目または105番目を挙げることができる。
(a)104番目のGlyまたは105番目のAspをCysに置換する工程および
(b)106番目のCysを欠損または他のアミノ酸に置換する工程
本発明は、本発明の抗体または本発明の定常領域を含む、医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、重鎖定常領域EUナンバリング219のCysと軽鎖C末端領域のCysとの間でジスルフィド結合が形成した抗体の割合が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは99%以上である抗体医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、抗体または定常領域に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
アラニン:Ala:A
アルギニン:Arg:R
アスパラギン:Asn:N
アスパラギン酸:Asp:D
システイン:Cys:C
グルタミン:Gln:Q
グルタミン酸:Glu:E
グリシン:Gly:G
ヒスチジン:His:H
イソロイシン:Ile:I
ロイシン:Leu:L
リジン:Lys:K
メチオニン:Met:M
フェニルアラニン:Phe:F
プロリン:Pro:P
セリン:Ser:S
スレオニン:Thr:T
トリプトファン:Trp:W
チロシン:Tyr:Y
バリン:Val:V
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
H鎖C末端ΔGK抗体の発現ベクター構築
IgG抗体のH鎖C末端配列のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の2アミノ酸のグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.)。抗IL-6レセプター抗体であるTOCILIZUMABにおいても、その主成分は塩基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リジンが残存している副成分およびグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化された副成分もヘテロジェニティーとして存在する。目的物質/関連物質のヘテロジェニティーの製造間差を維持しつつ医薬品として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながるため、可能な限り単一物質であることが望まれる。抗体を医薬品として開発する上にはこれらのヘテロジェニティーが低減されていることが望ましい。よって医薬品として開発する上ではH鎖C末端のヘテロジェニティーは存在しないことが望ましい。
精製した抗体のヘテロジェニティーの評価を陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてはProPac WCX-10, 4×250 mm (Dionex) を使用し、移動相Aは25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1、移動相Bは25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1を使用し、適切な流量およびグラジエントを用いて実施した。精製したIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG1ΔK /L0-k0およびIL6R H0-IgG1ΔGK /L0-k0陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図1に示した。
天然型IgG1と天然型IgG2のヘテロジェニティー
標的細胞をエフェクター機能等で殺傷するような癌に対する抗体医薬の場合は、エフェクター機能を有するIgG1の定常領域(アイソタイプ)が好ましいが、標的抗原の機能を中和するような抗体医薬、あるいは、標的細胞に対して結合はするが殺傷することは避ける必要がある抗体医薬の場合は、Fcγレセプターへの結合は好ましくない。
天然型IgG1においては、IgG1のH鎖定常領域配列(アミノ酸配列番号:23)のH鎖EUナンバリング220番目のシステインとL鎖214番目(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242のナンバリングを参照)のシステインがジスルフィド結合をしている(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72、Anal Chem. 2008 Mar 15;80(6):2001-9.)。一方、天然型IgG4においては、IgG4のH鎖定常領域配列(アミノ酸配列番号:25)のH鎖EUナンバリング131番目のシステインと L鎖214番目((Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242のナンバリングを参照)のシステインがジスルフィド結合をしている(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72、Protein Sci. 1997 Feb;6(2):407-15.)。このように天然型IgG1と天然型IgG4においては、H鎖とL鎖を結ぶジスルフィド結合のパターンが異なることが報告されている。天然型IgG1と天然型IgG4のジスルフィド結合のパターンを図5に示した。しかしながら、これまでH鎖とL鎖を結ぶジスルフィド結合のパターンの及ぼす安定性への影響に関する報告はない。
天然型IgG2のジスルフィド結合の掛け違いによるヘテロジェニティーを低減する方法として、H鎖のヒンジ領域に存在するEUナンバリング219番目のシステインのみをセリンに改変する方法、および、220番目のシステインのみをセリンに改変する方法が考えられる(Biochemistry. 2008 Jul 15;47(28):7496-508.)。具体的には、天然型IgG2のH鎖定常領域配列(アミノ酸番号:24)のEUナンバリング219番目のシステインをセリンに改変したH鎖定常領域であるSC(配列番号:26)、および、EUナンバリング220番目のシステインをセリンに改変したH鎖定常領域であるCS(配列番号:27)が考えられる。しかしながら、これらH鎖定常領域であるSCおよびCSについては、図6に示すとおり、天然型IgG2のジスルフィド結合のパターンが単一ではなく、複数のパターンが考えられ、その中には上述のようにH鎖EUナンバリング131番目のシステインと L鎖214番目(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242のナンバリングを参照)のシステインがジスルフィド結合することで安定性が低下するような好ましくないジスルフィド結合のパターンが存在する。
各種天然型IgG2変異体ヘテロジェニティーの評価方法として、上述に記載した陽イオン交換クロマトグラフィーによる方法を用いて実施した。IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、および天然型IgG2変異体であるIL6R H0-SC/L0-k0、IL6R H0-CS/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0およびIL6R H0-M58/L0-k0の陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図8に示した。
一般に抗体を医薬品として開発するためにはヘテロジェニティーが少ないことに加えて、安定な製剤を調製するため高い安定性を有することが望ましい。そこでIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、および天然型IgG2変異体であるIL6R H0-SC/L0-k0、IL6R H0-CS/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0およびIL6R H0-M58/L0-k0の安定性の評価方法として、上述と同様に示差走査型熱量測定(DSC)による熱変性中間温度(Tm値)の評価を行った(VP-DSC、Microcal社製)。精製した抗体を20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行い、約0.1mg/mLのタンパク質濃度で、40℃から100℃まで1℃/minの昇温速度でDSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線を図9に、Fab部分のTm値を以下の表2に示した。
抗IL-6レセプター抗体以外の抗体として、抗IL-31レセプター抗体であるIL31R H0-IgG1/L0-k0(H鎖アミノ酸配列 配列番号:11、L鎖アミノ酸配列 配列番号:12)、抗RANKL抗体であるRANKL H0-IgG1/L0-k0(H鎖アミノ酸配列 配列番号:15、L鎖アミノ酸配列 配列番号:16)、を使用した。それぞれの抗体に対して、H鎖定常領域をIgG1からIgG2に変換したIL31R H0-IgG2/L0-k0(H鎖アミノ酸配列 配列番号:13、L鎖アミノ酸配列 配列番号:12)およびRANKL H0-IgG2/L0-k0(H鎖アミノ酸配列 配列番号:17、L鎖アミノ酸配列 配列番号:16)、さらにH鎖定常領域をIgG1からM58に変換したIL31R H0-M58/L0-k0(H鎖アミノ酸配列 配列番号:14、L鎖アミノ酸配列 配列番号:12)およびRANKL H0-M58/L0-k0(H鎖アミノ酸配列 配列番号:18、L鎖アミノ酸配列 配列番号:16)の発現ベクターを作製した。これらの発現と精製は参考例1で記した方法で実施した。
IgGタイプの抗体の薬物動態
IgG分子の血漿中滞留性が長い(消失が遅い)のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが機能しているためである(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25)。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下(pH6.0付近)においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへ進みライソソームで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下(pH7.4付近)においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
ヒトFcRnの調製は参考例2に記された方法で実施した。ヒトFcRnへの結合評価にはBiacore 3000 を用い、センサーチップに固定化したProtein Lあるいはウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体へ結合させた抗体に、アナライトとしてヒトFcRnを相互作用させた際のヒトFcRnの結合量よりaffinity(KD)を算出した。具体的には、ランニングバッファーとして150mM NaClを含む50mM Na-phosphate buffer、pH6.0を用い、アミンカップリング法によりセンサーチップ CM5 (BIACORE) にProtein Lあるいはウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体を固定化した。その後、IL6R H0-IgG1/L0-k0およびIL6R H0-M58/L0-k0をそれぞれ0.02% Tween20を含むランニングバッファーで希釈してインジェクトしチップに抗体を結合させた後、ヒトFcRnをインジェクトし、ヒトFcRnの抗体への結合性を評価した。
ヒト FcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories)における体内動態の評価は以下の通り行った。IL6R H0-IgG1/L0-k0およびIL6R H0-M58/L0-k0をそれぞれマウスに1 mg/kgの投与量で静脈内に単回投与し適時採血を行った。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。血漿中濃度はELISA法を用いて測定した(参考例3参照)。
上記に示したとおり、抗IL-6レセプター抗体であるIL6R H0-IgG1/L0-k0において、H鎖定常領域をIgG1からM58に変換することにより、ヒトFcRnへの結合性が向上し、ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて薬物動態が向上することが見出された。そこで、抗IL-6レセプター抗体以外のIgG1抗体に対しても、H鎖定常領域をM58に変換することで薬物動態を向上できるかどうかを検討した。
新規定常領域M66-k0の作製
実施例2に示したようにIgG分子のヒンジ領域のジスルフィド結合のパターンが大きく、ヘテロジェニティーと安定性に影響を与えることが示され、実施例3においてH鎖定常領域M58がIgG1よりも優れた薬物動態を有することが示された。そこで、さらにヒンジ領域のジスルフィド結合のパターンを最適化することで、M58よりも優れた薬物動態を示す新規定常領域を作ることが出来ないかと考え、検討を行った。
実施例3に記した方法で、ヒト FcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories)を用いたIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0およびIL6R H0-M66/L0-k0の薬物動態の評価を行った。
安定性の評価方法として、実施例2と同様に示差走査型熱量測定(DSC)による熱変性中間温度(Tm値)の評価を行った(N-DSCII、Calorimety Sceince Corporation製)。精製したIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0およびIL6R H0-M66/L0-k0を20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行い、約0.1mg/mLのタンパク質濃度で、40℃から100℃まで1℃/minの昇温速度でDSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線を元にFab部分のTm値を算出し表5に示した。
実施例2に記載した方法によるIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k0の陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図14に示した。
新規定常領域M66-k3、M66-k4の作製
実施例4において確認されたIL6R H0−M66/L0のヘテロジェニティー(2種類の成分)は、H鎖とL鎖のジスルフィド結合パターンが異なることにより形成されると考えられた。すなわち、L鎖(k0 アミノ酸配列番号:32)のC末端の214番目(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242のナンバリングを参照)のシステイン(アミノ酸配列番号32のk0における107番目のシステイン)が両方のH鎖のH鎖EUナンバリング219番目のシステインとジスルフィド結合を形成することができるため、図15に示す2種類のジスルフィド結合パターンを示す2種類の成分が検出されると考えられた。そこでヘテロジェニティーを低減させる(1種類の成分のみが生成するようにする)ためには、図16に示しようにL鎖のシステインが、いずれか一方のH鎖のH鎖EUナンバリング219番目のシステインとジスルフィド結合を形成できるようにすればよいと考えられた。そこで、ヘテロジェニティーを低減することを目的に、上述のL鎖のC末端のシステインの位置をN末側に移動させることを考えた。これによりL鎖のC末端のシステインは、一方のH鎖のH鎖EUナンバリング219番目のシステインとは距離が遠くなることで、もう一方のH鎖のH鎖EUナンバリング219番目とのみジスルフィド結合が出来るようになると考えた。L鎖のC末端のシステインの位置をN末側に移動させる方法として、L鎖のC末端近傍のペプチド鎖の長さを短くする改変を検討した。具体的には、天然型L鎖定常領域k0(アミノ酸配列番号:32)の106番目のグルタミン酸を欠損させた抗体の新規L鎖定常領域であるk3(アミノ酸配列番号:33)、天然型L鎖定常領域k0(アミノ酸配列番号:32)の105番目のグリシンを欠損させた抗体の新規L鎖定常領域であるk4(アミノ酸配列番号:34)を検討した。そこで、L鎖定常領域としてk3を有するIL6R L0-k3(アミノ酸配列番号:21)およびk4を有するIL6R L0-k4(アミノ酸配列番号:22)の発現ベクターを参考例1の方法に従って作製した。
実施例2に記載した方法によるIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3およびIL6R H0-M66/L0-k4の陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図17に示した。
IgGはFcRnと2価のavidityで結合することが知られている(Traffic. 2006 Sep;7(9):1127-42.)。実施例3で行った方法は、IgGをセンサーチップに固定し、アナライトとしてFcRnを流すことからIgGとFcRnの1価のaffinityで結合する。そこで、より生体内を模倣するため本実施例においては、ヒトFcRnをセンサーチップに固定化し、アナライトとしてIgGを流すことでIgGとFcRnの2価のavidityでの結合を評価した。Biacore T100 (GE Helthcare)を用い、センサーチップ上に固定化したFcRnに対して、H0-IgG1/L0-k0、H0-M58/L0-k0、H0-M66/L0-k0およびH0-M66/L0-k3をアナライトとして流すことにより、改変体のpH6.0におけるヒトFcRnに対する親和性解析を実施した。
安定性の評価方法として、実施例2と同様に示差走査型熱量測定(DSC)による熱変性中間温度(Tm値)の評価を行った(N-DSCII、Calorimety Sceince Corporation製)。精製したIL6R H0-IgG1/L0-k0 IL6R、H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3およびIL6R H0-M66/L0-k4を20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行い、約0.1mg/mLのタンパク質濃度で、40℃から100℃まで1℃/minの昇温速度でDSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線を元にFab部分のTm値を算出し表7に示した。
新規定常領域M106-k3の作製
抗原を中和することが目的の抗体医薬においてはFc領域の有するADCC等のエフェクター機能は必要ではなく、従って、Fcγレセプターへの結合は不必要である。免疫原性や副作用の点から考えるとFcγレセプターへの結合は好ましくない可能性も考えられる(Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92.、Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.)。例えばヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABはIL-6レセプターに特異的に結合し、その生物学的作用を中和することで、関節リウマチ等のIL-6が関連する疾患の治療薬として利用可能であり、Fcγレセプターへの結合は不必要である。
実施例2に記載した方法によるIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M106/L0-k0、IL6R H0-M106/L0-k3およびIL6R H0-M106/L0-k4の陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図18に示した。
H0-IgG1/L0-k0、H0-IgG2/L0-k0およびH0-M106/L0-k3のFcγレセプターへの結合の評価を活性化FcγレセプターであるFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIaを用いて評価した。
Fcγレセプターへの結合の評価はBiacore T100 (GE Healthcare) を用い、センサーチップ上に固定化したProtein Lで捕捉した抗体に対して、ヒトFcγレセプターを相互作用させ、その結合量を比較することによって行った。具体的には、ランニングバッファーにHBS-EP+ (GE Healthcare) を用い、ProteinL (ACTIgen)をアミンカップリング法によりセンサーチップCM5 (Biacore) に固定化した。その後、H0-IgG1/L0-k0、H0-IgG2/L0-k0、H0-M106/L0-k3をセンサーチップ上のProtein Lに捕捉させ、ランニングバッファーおよびランニングバッファーで10 μg/mLに希釈したFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa (R&D systems) をアナライトとして相互作用させた。この際、各抗体のProtein Lへの捕捉量を一定にすることは困難であることから、各抗体のProtein Lへの捕捉量を一定とみなすための補正を行った。具体的には、各抗体に対する各ヒトFcγレセプターの結合量から、ランニングバッファーのみを相互作用させたときの結合量を引いて得られた値を各抗体の捕捉量で割り、得られた値に100をかけたものをNormalized responseとした。
H鎖としてIL6R H0-IgG2(アミノ酸配列番号:5)、L鎖としてIL6R L0-k3 (アミノ酸配列番号:21)からなるIL6R H0-IgG2/L0-k3の発現と精製を参考例1で記した方法で実施した。実施例2に記載した方法を用いて、IL6R H0-IgG1/L0-k0およびIL6R H0-IgG2/L0-k0およびIL6R H0-IgG2/L0-k3の陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図20に示した。
その結果、図20に示すとおり、IgG2-k0においてヘテロジェニティーが認められたが、IgG2-k3においてはヘテロジェニティーが低減された。天然型IgG2であるIgG2-k0は複数のジスルフィド結合パターンを有するためヘテロジェニティーが認められるが、L鎖のC末端近傍のペプチド鎖の長さを短くすることでL鎖のC末端のシステインの位置をN末側に移動させるだけで(IgG2-k3)、ヘテロジェニティーが低減することができることが見出された。
実施例3に記した方法で、ヒト FcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories)を用いたIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3、IL6R H0-M106/L0-k3およびIL6R H0-IgG2/L0-k3の薬物動態の評価を行った。
IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3、IL6R H0-M106/L0-k3およびIL6R H0-IgG2/L0-k3のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性の評価を行った結果、図21に示すとおり、IL6R H0-M66/L0-k0と比較してIL6R H0-M66/L0-k3は薬物動態の向上が確認された。これは実施例5において確認されたFcRnへの結合評価の結果を反映していると考えられた。L鎖定常領域であるk3(アミノ酸配列番号:33)は、天然型L鎖定常領域k0(アミノ酸配列番号:32)の106番目のグルタミン酸を欠損させたL鎖であり、L鎖をL0-k0からL0-k3に置換したことにより血漿中滞留性が向上したと考えられた。FcRnはH鎖定常領域のFc部分に結合するため、一般的にL鎖定常領域は抗体の薬物動態に影響しないと考えられ、実際にこれまでにヒト FcRnトランスジェニックマウスにおいて、L鎖定常領域のアミノ酸置換により薬物動態が向上したという報告は無い。本検討により初めてL鎖定常領域をアミノ酸置換することで薬物動態が改善することが見出された。さらにIL6R H0-M106/L0-k3はL6R H0-M66/L0-k3と比較して血漿中滞留性が向上した。
本検討より、定常領域M66-k3、M106-k3、IgG2-k3は、陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価において単一ピークとして溶出し、Fcγレセプターへの結合が天然型IgG1よりも著しく減弱し、且つ、ヒト FcRnトランスジェニックマウスにおいて天然型IgG1と比較して大幅に薬物動態が向上することが示された。
目的の抗体のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする遺伝子は、PCR等を用いて当業者公知の方法で行った。アミノ酸置換の導入はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)あるいはPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)を10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5〜6 × 105個/mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ(直径10 cm, CORNING)の各ディッシュへ10 mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター(37℃、5% CO2)内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培地6.9 mLを添加した。調製したプラスミドをlipofection法により細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、遠心分離(約2000 g、5分間、室温)して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV(Millipore)を通して滅菌して培養上清を得た。得られた培養上清からrProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
FcRnはFcRnとβ2-microglobulinの複合体である。公開されているヒトFcRn遺伝子配列(J. Exp. Med. 180 (6), 2377-2381 (1994))を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調整した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞外領域(Met1-Leu290)をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した(ヒトFcRnアミノ酸配列番号:35)。同様に、公開されているヒトβ2-microglobulin遺伝子配列(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含むβ2-microglobulin全長(Met1-Met119)をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した(ヒトβ2-microglobulinアミノ酸配列 配列番号:36)。
マウス血漿中抗体濃度測定は、抗ヒトIgG抗体を用いたELISA法にて、それぞれの抗体をスタンダードとして使用して、当業者公知の方法で測定した。
また本発明は、定常領域のアミノ酸配列を改変することによって、薬物動態が改善された抗体を提供した。本発明によって薬物動態が改善された抗体は、生体中において、より長い時間にわたって活性を維持する。したがって、たとえばIL6レセプターに対する抗体であるTOCILIZUMAB(一般名)の定常領域を、本発明によって提供される定常領域と置換することによって、その薬物動態を改善し、生体内における作用濃度をより長期にわたって維持しうる抗体とすることができる。
Claims (12)
- 配列番号:24(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、14番目(EUナンバリング131番目)のCysのSerへの置換;16番目(EUナンバリング133番目)のArgのLysへの置換;かつ、102番目又は103番目(EUナンバリング219番目又は220番目)のCysのSerへの置換を含む改変された抗体定常領域であって、当該定常領域を含む抗体は、野生型IgG2定常領域の安定性を維持しつつ、ヘテロジェニティ―が低減されている、抗体定常領域。
- さらに、20番目(EUナンバリング137番目)のGluのGlyへの置換、21番目(EUナンバリング138番目)のSerのGlyへの置換、147番目(EUナンバリング268番目)のHisのGlnへの置換、234番目(EUナンバリング355番目)のArgのGlnへの置換、298番目(EUナンバリング419番目)のGlnのGluへの置換を含む、請求項1に記載の抗体定常領域。
- さらに、209番目(EUナンバリング330番目)のAlaのSerへの置換、210番目(EUナンバリング331番目)のProのSerへの置換、かつ、218番目(EUナンバリング339番目)のThrのAlaへの置換を含む、請求項2に記載の抗体定常領域。
- 配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有する、改変された抗体定常領域。
- 配列番号:30に記載のアミノ酸配列を有する、改変された抗体定常領域。
- 配列番号:31に記載のアミノ酸配列を有する、改変された抗体定常領域。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体定常領域を有する、野生型IgG2定常領域の安定性を維持しつつ、ヘテロジェニティ―が低減されている抗体。
- 前記抗体が抗IL-6レセプター抗体である、請求項7に記載の抗体。
- 前記抗体が抗IL-31レセプター抗体である、請求項7に記載の抗体。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の重鎖定常領域および以下の(1)又は(2)に記載の改変された軽鎖定常領域を含む抗体:
(1)配列番号:32のアミノ酸配列において、105番目のアミノ酸が欠損していることを特徴とする、改変されたヒトκ鎖定常領域;又は
(2)配列番号:32のアミノ酸配列において、106番目のアミノ酸が欠損していることを特徴とする、改変されたヒトκ鎖定常領域。 - 請求項11に記載の抗体を含む組成物。
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