CN102448985B - 三或四特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及三或四特异性抗体、它们的制备和使用。

Description

三或四特异性抗体
本发明涉及新型三或四特异性抗体、它们的制备和使用。
发明背景
工程化蛋白质，诸如能够结合两种或更多种抗原的双或多特异性抗体是本领域已知的。此类多特异性结合蛋白可使用细胞融合、化学偶联、或重组DNA技术来生成。
通过例如IgG抗体格式和单链域的融合，最近已经开发了极其多种重组多特异性抗体格式，例如四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.，et.al.，Nature Biotech.15(1997)159-163；WO 2001/077342；及Morrison，S.L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。
还有，已经开发了不再保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的数种其它新格式诸如二抗体、三抗体或四抗体，微型抗体，能够结合两种或更多种抗原的数种单链格式(scFv、Bis-scFv)(Holliger，P.，et.al，NatureBiotech.23(2005)1126-1136；Fischer，N.，and Léger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14；Shen，J.，et.al.，J.Immunol.Methods 318(2007)65-74；Wu，C.，et al.，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
所有此类格式使用接头来融合抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)至别的结合蛋白(例如scFv)或融合例如两种Fab片段或scFv(Fischer，N.，and Léger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14)。虽然显而易见的是接头对于双特异性抗体的工程化具有优势，但是它们也可在治疗背景中引起问题。确实，这些外来肽可引发针对接头自身或蛋白质和接头之间连接的免疫应答。另外，这些肽的柔性性质使得它们更加倾向于蛋白水解切割，潜在导致差的抗体稳定性、聚集和升高的免疫原性。另外，通过维持高程度的与天然存在抗体的相似性，可能想要保留效应器功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，它们是经由Fc部分介导的。
如此，理想地，应当瞄准开发在一般结构方面与天然存在抗体(像IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)非常相似、相对于人序列的偏差最小的双特异性抗体。
在一种办法中，基于两种不同杂交瘤细胞系(它们表达具有双特异性抗体的期望特异性的鼠单克隆抗体)的体细胞融合，已经使用四源杂交瘤技术生成了与天然抗体非常相似的双特异性抗体(参见Milstein，C.，and Cuello，A.C.，Nature 305(1983)537-540)。由于所得杂交瘤-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内两种不同抗体重和轻链的随机配对，生成多至10种不同抗体种类，其中只有一种是期望的功能性双特异性抗体。由于错误配对副产物的存在和显著降低的生产产量，因此需要精细纯化规程(参见例如Morrison，S.L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。一般而言，如果使用重组表达技术，仍有相同的错误配对副产物的问题。
规避错误配对副产物问题的一种办法，称作‘结-入-穴’，瞄准通过将突变引入CH3域以修饰接触界面，迫使两种不同抗体重链的配对。在一条链上，将大体积氨基酸用具有短侧链的氨基酸替换以创建‘穴’。相反，将具有大侧链的氨基酸引入另一CH3域以创建‘结’。通过共表达这两条重链(和两条相同轻链，其必须适合于这两条重链)，观察到异二聚体形成(‘结-穴’)对同二聚体形成(‘穴-穴’或‘结-结’)的高产量(Ridgway，J.B.，et al.，Protein Eng.9(1996)617-621；和WO 96/027011)。通过使用噬菌体展示办法重塑两种CH3域的相互作用表面及引入二硫桥来稳定异二聚体，可进一步提高异二聚体的百分比(Merchant，A.M.，et al.，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，et al.，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。例如EP 1 870459 A1中记载了结-入-穴技术的新办法。虽然这种格式看来非常吸引人，但是当前没有获得描述通向临床的进展的数据。这种策略的一项重要约束在于两种亲本抗体的轻链不得不相同以防止错误配对和无活性分子形成。如此，这种技术不适合作为自针对第一和第二抗原的两种抗体开始容易开发针对三种或四种抗原的重组三或四特异性抗体的基础，因为首先不得不优化这些抗体的重链和/或相同轻链，然后不得不添加针对第三和第四抗原的别的抗原结合肽。
WO 2006/093794涉及异二聚体蛋白结合组合物。WO 99/37791记载了多目的抗体衍生物。Morrison，S.L.，et al.，J.Immunol.160(1998)2802-2808提到可变区域交换对IgG功能特性的影响。
发明概述
本发明涉及三特异性或四特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1彼此替换；和
c)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端。
本发明的另一个实施方案是一种用于制备依照本发明的三特异性或四特异性抗体的方法，其包括下述步骤：
a)用包含核酸分子的载体转化宿主细胞，该核酸分子编码
aa)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
ab)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1彼此替换；和
ac)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端；
b)在容许所述抗体分子合成的条件下培养该宿主细胞；并且
c)自所述培养物回收所述抗体分子。
本发明的另一个实施方案是包含载体宿主细胞，该载体包含核酸分子，该核酸分子编码：
a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1彼此替换；和
c)特异性结合另外的一种或两种抗原的其中一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端。
本发明的另一个实施方案是依照本发明的抗体的组合物，优选药物组合物或诊断组合物。
本发明的另一个实施方案是包含依照本发明的抗体和至少一种药学可接受赋形剂的药物组合物。
本发明的另一个实施方案是一种用于治疗需要治疗的患者的方法，特征在于对该患者施用治疗有效量的依照本发明的抗体。
依照本发明，通过只在特异性结合第二抗原的全长抗体(第二抗体)的重链和轻链对(HC/LC)中替换某些域，可改善想要的三特异性或四特异性抗体与不想要的副产物相比的比率。这样，可减少轻链与错误重链的不想要的错误配对(第一抗体的轻链与第二抗体的重链或第二抗体的轻链与第一抗体的重链)。
发明详述
本发明涉及三特异性或四特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1彼此替换；和
c)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在c)下包含特异性结合另外的一种或两种抗原的一个或两个抗原结合肽。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽选自下组：scFv片段和scFab片段。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽是scFv片段。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽是scFab片段。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽融合至a)和/或b)的重链的C端。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在c)下包含特异性结合一种另外的抗原的一个或两个抗原结合肽。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在c)下包含特异性结合第三抗原的两个相同抗原结合肽。优选地，所述两个相同抗原结合肽都经相同肽连接子融合至a)和b)的重链的C端。优选地，所述两个相同抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在c)下包含特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽都经相同肽连接子融合至a)和b)的重链的C端。优选地，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
依照本发明，通过只在一对重链和轻链(HC/LC)中替换某些域，可改善想要的三特异性或四特异性抗体与不想要的副产物(由于轻链与特异性结合另一抗原的抗体的“错误”重链的错误配对)相比的比率。虽然两种全长HC/LC对中第一对源自特异性结合第一抗原的抗体且基本上保持不变，但是两种全长HC/LC对中第二对源自特异性结合第二抗原的抗体，且通过下述替换被修饰：
-轻链：可变轻链域VL用特异性结合第二抗原的所述抗体的可变重链域VH替换，和/或恒定轻链域CL用特异性结合第二抗原的所述抗体的恒定重链域CH1替换，且
-重链：可变重链域VH用特异性结合第二抗原的所述抗体的可变轻链域VL替换，和/或恒定重链域CH1用特异性结合第二抗原的所述抗体的恒定轻链域CL替换。
对此比率改善的双特异性抗体，然后，特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至所述特异性结合第一和第二抗原的两种抗体的轻链或重链的C或N端，得到依照本发明的三特异性和四特异性抗体。
如此，所得依照本发明的三特异性和四特异性抗体是人工抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中所述(特异性结合第二抗原的抗体的)轻链含有可变域VH来代替VL和/或恒定域CH1来代替CL，其中所述(特异性结合第二抗原的抗体的)重链含有可变域VL来代替VH和/或恒定域CL来代替CH1。
在本发明的另一个方面，通过修饰所述三或四特异性抗体内所述特异性结合第一和第二抗原的全长抗体的CH3域，可进一步改善所述想要的二价双特异性抗体与不想要的副产物相比改善的比率。
如此，在本发明的一个优选实施方案中，通过“结-入-穴”技术，可改变依照本发明的所述三或四特异性抗体(重链中和经修饰重链中)的CH3域，“结-入-穴”技术及数个例子详细记载于例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.，et al.，Protein Eng.9(1996)617-621；及Merchant，A.M.，et al.，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681。在这种方法中，改变两种CH3域的相互作用界面以提高含有这两种CH3域的两种重链的异二聚化。(两种重链的)两种CH3域的每一个均可以是“结”，而另一是“穴”。引入二硫桥进一步稳定异二聚体(Merchant，A.M.，et al.，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，et al.，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)及提高产量。
如此，在本发明的一个方面，所述三特异性或四特异性抗体特征还在于
a)的全长抗体的重链的CH3域和b)的全长抗体的经修饰重链的CH3域在包含抗体CH3域之间初始界面的界面处相遇；其中所述界面经过改变以促进三特异性或四特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于：
i)改变一种重链的CH3域，使得在一种重链的CH3域遇见所述三或四特异性抗体内另一种重链CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一种重链的CH3域的界面内生成***，其可定位在另一种重链的CH3域的界面内的空腔中；
并且
ii)改变另一种重链的CH3域，使得在第二CH3域遇见所述三或四特异性抗体内第一CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内生成空腔，其中可定位第一CH3域的界面内的***。
优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
在本发明的一个方面，进一步改变这两种CH3域，即引入半胱氨酸(C)作为每种CH3域的对应位置中的氨基酸，使得这两种CH3域之间能形成二硫桥。
在一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含“结链”的CH3域中的T366W突变和“穴链”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V突变。也可使用CH3域之间的另一链间二硫桥(Merchant，A.M.，et al.，NatureBiotech.16(1998)677-681)，例如通过将Y349C突变引入“结链”的CH3域及将E356C突变或S354C突变引入“穴链”的CH3域。如此，在另一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含所述两种CH3域中一种中的Y349C、T366W突变和所述两种CH3域中另一种中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述三特异性或四特异性抗体包含两种CH3域中一种中的Y349C、T366W突变和两种CH3域中另一种中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(一种CH3域中的另一Y349C突变和另一种CH3域中的另一E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。但是或者/另外也可使用其它结-入-穴技术，如EP 1 870 459A1记载的。所述三特异性或四特异性抗体的一个优选例子是“结链”CH3域中的R409D；K370E突变和“穴链”CH3域中的D399K；E357K突变(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。
在另一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含“结链”CH3域中的T366W突变和“穴链”CH3域中的T366S、L368A、Y407V突变和另外“结链”CH3域中的R409D；K370E突变和“穴链”CH3域中的D399K；E357K突变。
在另一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含两种CH3域中一种中的Y349C、T366W突变和两种CH3域中另一种中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述三特异性或四特异性抗体包含两种CH3域中一种中的Y349C、T366W突变和两种CH3域中另一种中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变和另外“结链”CH3域中的R409D；K370E突变和“穴链”CH3域中的D399K；E357K突变。
术语“全长抗体”表示由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的抗体(见图1)。全长抗体的重链是N端至C端方向由抗体重链可变域(VH)、抗体重链恒定域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定域2(CH2)、和抗体重链恒定域3(CH3)组成的多肽，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；在亚类IgE的抗体的情况中，还有任选的抗体重链恒定域4(CH4)。优选地，全长抗体的重链是N端至C端方向由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。全长抗体的轻链是N端至C端方向由抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ(卡帕)或λ(拉姆达)。全长抗体链经CL域和CH1域之间的(即轻和重链之间的)和全长抗体重链铰链区之间的多肽间二硫键连接到一起。典型全长抗体的例子是天然抗体，像IgG(例如IgG1和IgG2)、IgM、IgA、IgD、和IgE。依照本发明的全长抗体可来自单一物种，例如人，或者它们可以是嵌合化或人源化抗体。依照本发明的全长抗体包含两个抗原结合位点，均由都特异性结合相同抗原的VH和VL对形成。所述全长抗体的重或轻链的C端表示所述重或轻链的C端处的最后一个氨基酸。如本发明内使用的，术语“肽连接子”表示具有优选合成起源的氨基酸序列的肽。这些依照本发明的肽连接子用于融合抗原结合肽至全长和/或经修饰全长抗体链的C或N端以形成依照本发明的三特异性或四特异性抗体。优选地，所述肽连接子在c)下是具有长度至少5个氨基酸、优选长度5至100个、更优选10至50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽连接子是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3、4、5或6，且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，且m＝0、1、2或3)，优选地，x＝4且n＝2或3，更优选地，x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽连接子是(G4S)2。
如使用的，术语“抗原结合肽”指全长抗体的单价抗原结合片段或衍生物，其包括抗体重链可变域(VH)和/或抗体轻链可变域(VL)，或自全长抗体衍生的VH/VL对，或抗体片段诸如VH域和/或VL域、单链Fv(scFv)片段、或单链Fab(scFab)片段。优选地，抗原结合肽至少包含抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)。在一个优选实施方案中，此类抗原结合肽选自下组：VH域，单链Fv(scFv)片段，和单链Fab(scFab)片段，优选选自下组：单链Fv(scFv)片段和单链Fab(scFab)片段。
如本文中使用的，术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗体分子中配体(例如它的抗原或抗原片段)实际结合的及自抗体衍生的区域。抗原结合位点包括抗体重链可变域(VH)和/或抗体轻链可变域(VL)，或VH/VL对。
特异性结合期望抗原的抗原结合位点可衍生自a)针对该抗原的已知抗体或b)通过从头免疫接种方法使用抗原蛋白质或核酸或其片段等或者通过噬菌体展示获得的新抗体或抗体片段。
本发明抗体的抗原结合位点可含有六个互补决定区(CDR)，其对结合位点对抗原的亲和力做出不同程度的贡献。有三个重链可变域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和框架区(FR)的范围通过与氨基酸序列的汇编数据库(其中已经依照序列间的变异性定义那些区)比较来确定。本发明的范围还包括由更少CDR构成的功能性抗原结合位点(即其中结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。例如，少于全套6个CDR可能足够进行结合。在一些情况中，VH或VL域会是足够的。
抗体特异性指抗体对特定抗原表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。双特异性抗体是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。三特异性抗体因而是具有三种不同抗原结合特异性的本发明抗体。依照本发明的四特异性抗体是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。
若抗体具有超过一种特异性，识别的表位可以与一种抗原或与超过一种抗原相关。
如本文中使用的，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点，其中每一个结合相同抗原的相同表位的抗体。
如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。例如，天然抗体或依照本发明的全长抗体具有两个结合位点且是二价的。如此，术语“三价”表示抗体分子中存在三个结合位点。如本文中使用的，术语“三价三特异性”抗体表示具有三个抗原结合位点，每一个结合另一种抗原(或所述抗原的另一种表位)的抗体。本发明的抗体具有三个至六个结合位点，即是三、四、五、或六价的(优选三或四价的)且是三或四特异性的。
“scFv片段”或“单链Fv片段”(见图2b)是由抗体重链可变域(VH)、抗体轻链可变域(VL)、和单链Fv接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述单链Fv接头N端至C端方向具有下述次序之一：a)VH-单链Fv接头-VL，b)VL-单链Fv接头-VH；优选a)VH-单链Fv接头-VL，且其中所述单链Fv接头是具有长度至少15个氨基酸、在一个实施方案中长度至少20个氨基酸的氨基酸序列的多肽。术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端”表示C端最后一个氨基酸。
如单链Fv片段内使用的，术语“单链Fv接头”表示具有优选合成起源的氨基酸序列的肽。所述单链Fv接头是具有长度至少15个氨基酸、在一个实施方案中长度至少20个氨基酸和优选长度介于15和30个氨基酸之间的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3且n＝4、5或6)或(x＝4且n＝3、4、5或6)，优选地，x＝4，n＝3、4或5，更优选地，x＝4，n＝3或4。在一个实施方案中，所述单链Fv接头是(G4S)3或(G4S)4。
另外，所述单链Fv片段优选是二硫化物稳定的。单链抗体的此类进一步二硫化物稳定化通过引入单链抗体的可变域之间的二硫键来实现，而且记载于例如WO 94/029350，Rajagopal，V.，et al，Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Kobayashi，H.，et al.，Nuclear Medicine & Biology 25(1998)387-393；或Schmidt，M.，et al.，Oncogene 18(1999)1711-1721。
在二硫化物稳定的单链Fv片段的一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fv片段的可变域之间的二硫键对于每一个单链Fv片段，独立地选自：
i)重链可变域位置44至轻链可变域位置100，
ii)重链可变域位置105至轻链可变域位置43，或
iii)重链可变域位置101至轻链可变域位置100。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fv片段的可变域之间的二硫键在重链可变域位置44和轻链可变域位置100之间。
“scFab片段”或“单链Fab片段”(见图2a)是由抗体重链可变域(VH)、抗体恒定域1(CH1)、抗体轻链可变域(VL)、抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头N端至C端方向具有下述次序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸、优选介于32和50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL经CL域和CH1域之间的天然二硫键稳定化。术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端”表示C端最后一个氨基酸。
如本发明内使用的，术语“接头”表示具有优选合成起源的氨基酸序列的肽。这些依照本发明的肽用于连接a)VH-CH1至VL-CL，b)VL-CL至VH-CH1，c)VH-CL至VL-CH1或d)VL-CH1至VH-CL以形成下述依照本发明的单链Fab片段：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。单链Fab片段内的所述接头是具有长度至少30个氨基酸、优选长度32至50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10且m＝0、1、2或3)或(x＝4且n＝6、7或8且m＝0、1、2或3)，优选地，x＝4，n＝6或7且m＝0、1、2或3，更优选地，x＝4，n＝7且m＝2。在一个实施方案中，所述接头是(G4S)6G2。
在一个优选实施方案中，所述单链Fab片段中的所述抗体域和所述接头N端至C端方向具有下述次序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，或b)VL-CL-接头-VH-CH1，更优选地，VL-CL-接头-VH-CH1。
在另一个优选实施方案中，所述单链Fab片段中的所述抗体域和所述接头N端至C端方向具有下述次序之一：a)VH-CL-接头-VL-CH1或b)VL-CH1-接头-VH-CL。
任选地，在所述单链Fab片段中，在CL域和CH1域之间的天然二硫键的之外，抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)也是二硫化物稳定的，通过引入下述位置之间的二硫键来实现：
i)重链可变域位置44至轻链可变域位置100，
ii)重链可变域位置105至轻链可变域位置43，或
iii)重链可变域位置101至轻链可变域位置100(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。
单链Fab片段的此类进一步二硫化物稳定化通过引入单链Fab片段的可变域VH和VL之间的二硫键来实现。为了稳定单链Fv而引入非天然二硫桥的技术记载于例如WO 94/029350，Rajagopal et al.，Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Kobayashi et al.，Nuclear Medicine & Biology 25(1998)387-393；或Schmidt et al.，Oncogene 18(1999)1711-1721。在一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fab片段的可变域之间的任选二硫键在重链可变域位置44和轻链可变域位置100之间。在一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fab片段的可变域之间的任选二硫键在重链可变域位置105和轻链可变域位置43之间(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。
在一个实施方案中，没有单链Fab片段的可变域VH和VL之间的所述任选二硫化物稳定化的单链Fab片段是优选的。
本发明的全长抗体包含一类或多类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白的类包括IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE同种型，及在IgG和IgA的情况中的它们的亚型。在一个优选实施方案中，本发明的全长抗体具有IgG型抗体的恒定域结构。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。
术语“嵌合抗体”指包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区至少一部分的抗体，通常通过重组DNA技术来制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中恒定区相对于初始抗体的恒定区经过修饰或改变以生成依照本发明的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的。此类嵌合抗体也称作“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因表达的产物。用于生成嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA，而且基因转染技术是本领域公知的。参见例如Morrison，S.L.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238及US 5,204,244。
术语“人源化抗体”指其中框架或“互补决定区”(CDR)经过修饰以包含特异性与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann，L.，et al.，Nature 332(1988)323-327；及Neuberger，M.S.，et al.，Nature 314(1985)268-270。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中恒定区相对于初始抗体的恒定区经过另外修饰或改变以生成依照本发明的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的。
如本文中使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术公知的(van Dijk，M.A.，and van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。也可在免疫接种时能够在内源免疫球蛋白生成缺失下生成人抗体的完整全集或选集的转基因动物(例如小鼠)中生成人抗体。在此类种系突变型小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列会导致在抗原攻击时生成人抗体(参见例如Jakobovits，A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，et al.，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.，et al.，Year Immunol.7(1993)33-40)。也可在噬菌体展示文库中生成人抗体(Hoogenboom，H.R.，and Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.，et al.，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole，et al.，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；及Boerner，P.，et al.，J.Immunol.147(1991)86-95)。正如关于依照本发明的嵌合和人源化抗体早就提到的，如本文中使用的，术语“人抗体”也包括在恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性，尤其是关于C1q结合和/或FcR结合的此类抗体，例如通过“类转换”，即Fc部分的改变或突变(例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
如本文中使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，正如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或自对于人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体或使用转染入宿主的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然衍生自及涉及人种系VH和VL序列，但是可以在体内在人抗体种系全集中不是天然存在的序列。
如本文中使用的，“可变域”(轻链的可变域(VL)、重链的可变域(VH))表示直接涉及抗体结合抗原的轻和重链对中每一个。人轻和重链的可变域具有相同的一般结构，而且每种域包含其序列广泛保守、通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接的四个框架(FR)区。框架区采取β-片层构象，而CDR可形成环，连接β-片层结构。每条链中的CDR在它们的三维结构中通过框架区保持，并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，因此提供了本发明的另一个目标。
在本文中使用时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中本文中定义的高变区残基以外的那些区。因此，抗体的轻和重链N至C端包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。每条链上的CDR由此类框架氨基酸分开。尤其，重链的CDR3是对抗原结合贡献最多的区。CDR和FR区依照Kabat，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义来确定。
如本文中使用的，术语“结合”/“特异性结合”指体外测定法中，优选使用纯化的野生型抗原的等离振子共振测定法(BIAcore，GE-HealthcareUppsala，Sweden)中抗体对抗原表位的结合。结合的亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合的速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)来定义。在一个实施方案中，结合或特异性结合表示10-8mol/l或更少、优选10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)。如此，依照本发明的三或四特异性抗体优选以10-8mol/l或更少、优选10-9至10-13mol/l的结合亲和力(KD)特异性结合它所特异性的每一种抗原。
抗体对FcγRIII的结合可通过BIAcore测定法(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)来调查。结合的亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合的速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)来定义。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面成组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，而且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗原中受到抗体结合的区域。
在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或高分子的复杂混合物中优先识别它的靶抗原时，就说它特异性结合抗原。
在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG1亚类的或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的。
在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG2亚类的。
在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG3亚类的。
在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG4亚类的或具有另一突变S228P的人IgG4亚类的。
优选地，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG1亚类的或具有另一突变S228P的人IgG4亚类的。
现在已经发现依照本发明的三或四特异性抗体具有改善的特征，诸如生物学或药理学活性、药学特性或毒性。它们可用于例如治疗疾病，诸如癌症。
如本申请内使用的，术语“恒定区”表示抗体中可变区以外的域之和。恒定区不直接涉及抗原结合，但是展现各种效应器功能。根据它们的重链恒定区氨基酸序列，抗体分成类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，而且这些中的数类可进一步分成亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4、IgA1和IgA2。与抗体的不同类对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ、和μ。能在所有五类抗体中找到的轻链恒定区(CL)称作κ(卡帕)和λ(拉姆达)。
如本申请中使用的，术语“自人起源衍生的恒定区”表示亚类IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的人抗体的重链恒定区和/或轻链卡帕或拉姆达恒定区。此类恒定区是现有技术公知的，而且例如记载于Kabat，E.A.，(参见例如Johnson，G.and Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。
虽然IgG4亚类的抗体显示降低的Fc效应器(FcγRIIIa)结合，但是其它IgG亚类的抗体显示强结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(丧失Fc碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、和His435是在改变时也提供降低的Fc受体结合的残基(Shields，R.L.，et al.，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund，J.，et al.，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.，et al.，Immunology86(1995)319-324；EP 0 307 434)。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体具有与IgG1抗体相比降低的FcR结合。如此，关于FcR结合，全长亲本抗体是IgG4亚类的或具有S228、L234、L235和/或D265中的突变的IgG1或IgG2亚类的，和/或含有PVA236突变。在一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变在IgG4S228P中和在IgG1L234A和L235A中。
抗体的恒定区直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)是由补体因子C1q结合大多数IgG抗体亚类的恒定区启动的。C1q结合抗体是由所谓结合位点处的限定蛋白质-蛋白质相互作用引起的。此类恒定区结合位点是现有技术已知的且记载于例如Lukas，T.J.，et al.，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Bunkhouse，R.and Cobra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.，et al.，Nature 288(1980)338-344；Thomason，J.E.，et al.，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idiocies，E.E.，et al.，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hearer，M.，et al.，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.，et al.，Immunology86(1995)319-324；及EP 0 307 434。此类恒定区结合位点特征在于例如氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、和P329(编号方式依照Kabat的EU索引)。
术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)”指在效应细胞存在下依照本发明的抗体对人靶细胞的裂解。优选地，在效应细胞诸如新鲜分离的PBMC或自血沉棕黄层纯化的效应细胞，像单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系存在下通过用依照本发明的抗体处理抗原表达细胞制备物来测量ADCC。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”表示由补体因子C1q结合大多数IgG抗体亚类的Fc部分启动的过程。C1q结合抗体是由所谓结合位点处的限定蛋白质-蛋白质相互作用引起的。此类Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上文)。此类Fc部分结合位点特征在于例如氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、和P329(编号方式依照Kabat的EU索引)。亚类IgG1、IgG2、和IgG3的抗体通常显示补体激活，包括C1q和C3结合，而IgG4不激活补体***且不结合C1q和/或C3。
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可通过工程化改造它们的寡糖成分来增强，如Umana，P.，et al.，Nature Biotechnol.17(1999)176-180及US6,602,684记载的。IgG1型抗体，最常用的治疗性抗体，是在每一个CH2域的Asn297处具有保守N连接糖基化位点的糖蛋白。附着至Asn297的两个复合双触角寡糖埋藏在CH2域之间，形成与多肽主链的广泛接触，而且它们的存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely，M.，R.，et al.，Glycobiology 5(1995)813-822；Jefferis，R.，et al.，Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright，A.，and Morrison，S.L.，Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana，P.，et al.，Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO 99/54342显示了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达β(1，4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(“GnTIII”)，一种催化二分寡糖形成的糖基转移酶，显著提高抗体的体外ADCC活性。Asn297碳水化合物的组成变化或其消除也影响对FcγR和C1q的结合(Umana，P.，et al.，Nature Biotechnol.17(1999)176-180；Davies，J.，et al.，Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura，Y.，et al.，J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547；Radaev，S.，et al.，J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields，R.L.，et al.，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields，R.L.，et al.，J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740；Simmons，L.C.，et al.，J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。
增强单克隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法报告于例如WO2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2004/065540，WO2005/011735，WO 2005/027966，WO 1997/028267，US 2006/0134709，US2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835，WO 2000/061739。
在本发明的一个优选实施方案中，三或四特异性抗体是在Asn297处被糖链糖基化的(如果它包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的，优选IgG1或IgG3亚类的Fc部分的话)，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低(编号方式依照Kabat)。在另一个实施方案中，所述糖链内岩藻糖的量介于5％和65％之间，优选介于20％和40％之间。依照本发明，“Asn297”表示位于Fc区中大约位置297的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变异，Asn297也可位于位置297上游或下游的一些氨基酸(通常不超过±3个氨基酸)，即介于位置294和300之间。在一个实施方案中，依照本发明的IgG亚类糖基化抗体是人IgG1亚类的、具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的或IgG3亚类的。在另一个实施方案中，所述糖链内N-乙醇酰基神经氨酸(NGNA)的量是1％或更少和/或N端α-1，3-半乳糖的量是1％或更少。优选地，糖链显示附着至CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接聚糖的特征。
术语“糖链显示附着至CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接聚糖的特征”表示依照本发明的全长亲本抗体的Asn297处的糖链具有与未修饰CHO细胞中表达的抗体，例如WO 2006/103100中报告的那些相同的结构和糖残基序列，除了岩藻糖残基。
如本申请内使用的，术语“NGNA”表示糖残基N-乙醇酰基神经氨酸。
人IgG1或IgG3的糖基化发生于Asn297，核心岩藻糖基化双触角复合寡糖糖基化以多至两个Gal残基作为末端。IgG1或IgG3亚类的人恒定重链区详细报告于Kabat，E.，A.，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)及Brüggemann，M.，et al.，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love，T.，W.，et al.，Methods Enzymol.178(1989)515-527。根据末端Gal残基的量，这些结构称作G0、G1(α-1，6-或α-1，3-)、或G2聚糖残基(Raju，T.，S.，Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化记载于例如Routier，F.，H.，Glycoconjugate J.14(1997)201-207。在未糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常以至少85％的量在Asn297处岩藻糖基化。全长亲本抗体的经修饰寡糖可以是杂合的或复合的。优选地，二分还原/非岩藻糖基化寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，二分还原/非岩藻糖基化寡糖是复合的。
依照本发明，“岩藻糖的量”表示通过MALDI-TOF质谱术测量并作为平均值计算的，Asn297处的糖链内所述糖相对于附着至Asn297的所有糖结构总和(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的量。岩藻糖的相对量是通过MALDI-TOF，含岩藻糖结构相对于经N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有糖结构(例如分别为复合、杂合和寡和高甘露糖结构)的百分比。
通过重组手段来生产依照本发明的抗体。如此，本发明的一个方面是编码依照本发明的抗体的核酸，而另一个方面是包含所述编码依照本发明的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术公知的，而且包括原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体且通常纯化至药学可接受纯度。为了在宿主细胞中表达上述抗体，通过标准方法将编码各经修饰轻和重链的核酸***表达载体。在适宜原核或真核宿主细胞像CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母、或大肠杆菌细胞中实施表达，并自细胞(上清液或裂解后的细胞)回收抗体。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术公知的，而且记载于例如综述论文Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，et al.，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880。
通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析，将依照本发明的三或四特异性抗体与培养液适当分开。编码单克隆抗体的DNA和RNA易于使用常规规程分离和测序。杂交瘤细胞可充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可将DNA***表达载体，然后将其转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
通过将适宜核苷酸变化引入抗体DNA或通过核苷酸合成来制备三或四特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。可实施此类修饰，然而，只在非常有限的范围中，例如如上所述。例如，修饰不改变上文所述抗体特征，诸如IgG同种型和抗原结合，但可改善重组生产的产量、蛋白质稳定性或促进纯化。
如本申请中使用的，术语“宿主细胞”表示可工程化改造以生成依照本发明的抗体的任何类别的细胞***。在一个实施方案中，使用HEK293细胞和CHO细胞作为宿主细胞。如本文中使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类称谓包括后代。如此，词语“转化子”和“经转化细胞”包括原代受试细胞及自其衍生的培养物，不管转移次数。还要理解，所有后代在DNA内容方面可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。包括与对初始转化细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同称谓时，根据上下文会是清楚的。
NS0细胞中的表达记载于例如Barnes，L.M.，et al.，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes，L.M.，et al.，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬时表达记载于例如Durocher，Y.，et al.，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9。可变域的克隆记载于Orlandi，R.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Norderhaug，L.，et al.，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。一种优选的瞬时表达***(HEK 293)记载于Schlaeger，E.-J.，and Christensen，K.，in Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods 194(1996)191-199。
例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和聚腺苷酸化信号。
当一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中时，它是“可操作连接”的。例如，若前序列(pre-sequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(pre-protein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般地，“可操作连接”表示相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中表示相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳、和本领域公知的其它技术，实施抗体的纯化以清除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel，F.，et al.，ed.Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。不同方法已完善建立且广泛用于蛋白质纯化，诸如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如使用β巯基乙醇和其它SH配体)、疏水相互作用或芳香族吸附层析(例如使用苯基-sepharose、氮杂-亲砷树脂、或间氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析、和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
本发明的一个方面是包含依照本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是依照本发明的抗体用于制备药物组合物的用途。本发明的另一个方面是用于制备包含依照本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面，本发明提供含有依照本发明的抗体、与药物载体一起配制的组合物，例如药物组合物。
本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的依照本发明的三或四特异性抗体。
本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。
本发明的另一个方面是依照本发明的抗体用于制备治疗癌症的药物的用途。
本发明的另一个方面是治疗患有癌症的患者的方法，其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的抗体来进行。
如本文中使用的，“药物载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、等等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
本发明的组合物可通过本领域已知的多种方法来施用。正如熟练技术人员会领会的，施用路径和/或模式会随期望结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发明的化合物，可能必须用某材料包被化合物或与某材料一起共施用化合物以防止其失活。例如，可以在适宜载体例如脂质体或稀释剂中对受试者施用化合物。药学可接受稀释剂包括盐水和含水缓冲溶液。药物载体包括无菌含水溶液或分散体和用于临场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂对药学活性物质的使用是本领域已知的。
如本文中使用的，短语“胃肠外施用”表示肠和表面施用以外的施用模式，通常通过注射，而且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
如本文中使用的，术语癌症指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、***区癌、胃癌、胃的癌症、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、阴门癌、何杰金氏病、食管癌、小肠癌、内分泌***癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经***(CNS)新生物、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、施旺细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌规程(见上文)及通过包括各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、等等)二者，可确保防止存在微生物。可能还想要在组合物中包括等张剂，诸如糖、氯化钠、等等。另外，通过包括延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶，可引起可注射药物形式的延长吸收。
不管选择的施用路径，通过本领域技术人员已知的常规方法，将本发明的化合物(其可以以合适水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平可有所变化，以获得对于特定患者、组合物、和施用模式有效实现期望治疗响应，对患者没有毒性的活性组分量。选择的剂量水平会取决于多个药动学因素，包括采用的本发明特定组合物的活性、施用路径、施用时间、采用的特定化合物的***速率、治疗持续时间、与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和在先医学史、医学领域公知的等等因素。
组合物必须是无菌的且流动性程度达到可通过注射器来投递组合物。在水之外，载体优选是等张缓冲盐水溶液。
恰当的流动性可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、通过维持所需粒度(在分散的情况中)及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况中，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。
如本文中使用的，术语“转化”指载体/核酸转移入宿主细胞的过程。如果使用没有难对付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞的话，例如通过磷酸钙沉淀法进行转染，如Graham and Van der Eh，Virology 52(1978)546以下记载的。然而，也可使用其它用于将DNA导入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或含有坚固细胞壁构造的细胞的话，例如一种转染方法是使用氯化钙的钙处理，如Cohen，F.N，et al.，PNAS 69(1972)7110等等记载的。
如本文中使用的，“表达”指核酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称作转录物)随后翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸衍生自基因组DNA的话，真核细胞中的表达可包括mRNA剪接。
“载体”是将***的核酸分子转移入宿主细胞和/或在宿主细胞之间转移的核酸分子，特别是自我复制的。该术语包括主要发挥将DNA或RNA***细胞(例如染色体整合)功能的载体、主要发挥复制DNA或RNA功能的主要复制载体、和发挥转录和/或翻译DNA或RNA功能的表达载体。还包括提供超过一项所述功能的载体。
“表达载体”是在导入适宜宿主细胞时能转录和翻译成多肽的多核苷酸。“表达***”通常指包含表达载体、能发挥功能来生成期望表达产物的合适宿主细胞。
提供下述实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中列出。要理解，所列规程中可进行更改而不背离本发明的精神。
氨基酸序列描述
SEQ ID NO：1轻链<Ang-2>
SEQ ID NO：2具有C端融合的<EGFR>scFv的结-重链<Ang-2>
SEQ ID NO：3具有CH1-CL交换的轻链<VEGF>
SEQ ID NO：4具有CH1-CL交换和C端融合的<IGF-1R>scFv的穴-重链
            <VEGF>
SEQ ID NO：5具有C端融合的<EGFR>scFab的结-重链<Ang-2>
SEQ ID NO：6具有CH1-CL交换和C端融合的<IGF-1R>scFab的穴-重链
            <VEGF>
SEQ ID NO：7具有CH1-CL交换和C端融合的<EGFR>scFv的穴-重链
            <VEGF>
SEQ ID NO：8具有CH1-CL交换的穴-重链<VEGF>
SEQ ID NO：9具有CH1-CL交换和C端融合的<EGFR>scFab的穴-重链
            <VEGF>
SEQ ID NO：10具有C端融合的<IGF-1R>scFab的结-重链<Ang-2>
附图简述
图1     特异性结合第一抗原1、无CH4域的全长抗体的示意结构，
        其具有以典型次序包含可变和恒定域的两对重和轻链。
图2a    特异性结合抗原的四种可能单链Fab片段的示意结构。
图2b    特异性结合抗原的单链Fv片段的示意结构。
图3a-d  依照本发明的不同三或四特异性抗体的示意结构，其特征
        在于特异性结合第二抗原的抗体的全长抗体轻/重链中的
        VL/VH域和/或CL/CH1域替换(CH3域无和有别的结入穴
        修饰)。
图4a    依照本发明识别血管生成素(Angiopoietin)-2、VEGF-A、
        EGFR和IGF-1R的四特异性抗体的示意结构，其是四价的
        且使用二硫化物稳定的单链Fv片段作为抗原结合肽(实施
        例1)。
图4b    依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R
        的四特异性抗体的示意结构，其是四价的且使用单链Fab
        片段作为抗原结合肽(实施例1)。
图5a    依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异
        性抗体的示意结构，其是四价的且使用二硫化物稳定的单
        链Fv片段作为抗原结合肽(实施例2)。
图5b    依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异
        性抗体的示意结构，其是四价的且使用单链Fab片段作为
     抗原结合肽(实施例2)。
图6  依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异
     性抗体的示意结构，其是三价的且使用二硫化物稳定的单
     链Fv片段作为抗原结合肽(实施例3)。
图7  依照本发明识别EGFR、IGF-1R、c-Met和HER3的四特异
     性抗体的示意结构，其是四价的且使用二硫化物稳定的单
     链Fv片段作为抗原结合肽。
图8  依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R
     的四特异性抗体在高载荷26/60Superdex 200柱上的大小
     排阻层析，其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合
     肽(实施例1)。
图9  依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R
     的四特异性抗体在天然和变性条件下的SDS-PAGE分析，
     其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例
     1)。
图10 依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异
     性抗体在高载荷26/60Superdex 200柱上的大小排阻层析，
     其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例
     2)。
图11 依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异
     性抗体在天然和变性条件下的SDS-PAGE分析，其是四价
     的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例2)。
实施例
材料和一般方法
关于人免疫球蛋白轻和重链核苷酸序列的一般信息见：Kabat，E.A.，etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。抗体链的氨基酸依照EU编号方式来编号和提及(Edelman，G.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat，E.A.，et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th ed.，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991))。
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中记载的。依照制备商的说明书来使用分子生物学试剂。
基因合成
自通过化学合成生成的寡核苷酸制备期望基因区段。通过退火和连接寡核苷酸来装配侧翼为唯一限制性内切核酸酶位点的600-1800bp长基因区段，包括PCR扩增，随后经指定限制性位点例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆入基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体。通过DNA测序来验证亚克隆的基因片段的DNA序列。在Geneart(Regensburg，Germany)依照给定规格订购基因合成片段。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，Germany)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten，Germany)实施的双链测序来测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包10.2版和Infomax的Vector NT1 Advance套件8.0版来进行序列创建、绘图、分析、注解和说明。
表达载体
为了表达描述的抗体，为了瞬时表达(例如在HEK293EBNA或HEK293-F细胞中)应用基于有或无CMV内含子A启动子的cDNA组织或基于具有CMV启动子的基因组组织的表达质粒变体。
在抗体表达盒之外，载体含有：
-容许此质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体基因的转录单元由下述元件构成：
-5’端处的一种或多种唯一限制性位点，
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-在cDNA组织的情况中，接着是内含子A序列，
-人抗体基因的5’非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-人抗体链(野生型或具有域交换的)，作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组织的基因组组织，
-3’非翻译区及聚腺苷酸化信号序列，和
-3’端处的一种或多种唯一限制性位点。
通过PCR和/或基因合成生成包含如下所述抗体链的融合基因，并通过已知重组方法和技术通过连接相应核酸区段来装配，例如使用各载体中的唯一限制性位点。通过DNA测序来验证亚克隆的核酸序列。为了瞬时转染，通过来自经转化大肠杆菌培养物的质粒制备(NucleobondAX，Macherey-Nagel)来制备更大数量的质粒。
细胞培养技术
使用标准细胞培养技术，如Current Protocols in Cell Biology(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.and Yamada，K.M.(eds.)，John Wiley & Sons，Inc.中记载的。
如下所述通过各表达质粒在贴壁生长的HEK293-EBNA中或在悬浮生长的HEK29-F细胞中的瞬时共转染来表达三或四特异性抗体。
HEK293-EBNA***中的瞬时转染
通过各表达质粒(例如编码重链和经修饰重链的，以及对应轻链和经修饰轻链的)在补充有10％Ultra Low IgG FCS(胎牛血清，)、2mM L-谷氨酰胺和250μg/ml遗传霉素的DMEM(Dulbecco氏改良Eagle氏培养基，)中培养的贴壁生长HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959 218)中的瞬时共转染来表达三或四特异性抗体。为了转染，以4∶1(范围为3∶1至6∶1)的FuGENETM试剂(μl)对DNA(μg)之比使用FuGENETM 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals)。分别使用1∶1(等摩尔)(范围为1∶2至2∶1)的(修饰型和野生型)轻链和重链编码质粒之摩尔比自各质粒表达蛋白质。第3天给细胞补料L-谷氨酰胺ad 4mM、葡萄糖[Sigma]和NAA转染后5至11天通过离心收获含有三或四特异性抗体的细胞培养物上清液并保存于-20℃。关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息见Meissner，P.et al.，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。
HEK293-F***中的瞬时转染
使用HEK293-F***(Invitrogen)依照制备商的指令通过各质粒(例如编码重链和经修饰重链的，以及对应轻链和经修饰轻链的)的瞬时转染来生成三或四特异性抗体。简言之，用四种表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染在摇瓶中或在搅拌式发酵罐中在无血清FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，以1.0E*6个细胞/mL的密度在600mL中接种HEK293-F细胞，并于120rpm，8％CO2温育。次日，以大约1.5E*6个细胞/mL的细胞密度用大约42mL混合物A)带有600μg等摩尔比的编码重链或经修饰重链和对应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μl/mL)转染细胞。发酵过程期间根据葡萄糖消耗添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，并自上清液直接纯化抗体或将上清液冷冻并保存。
蛋白质测定
使用依照Pace，et al.，Protein Science，1995，4，2411-1423根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测定280nm处的光密度(OD)来测定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。
上清液中的抗体浓度测定
用蛋白A琼脂糖珠(Roche)通过免疫沉淀来评估细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。将60μL蛋白A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，1％Nonidet-P40)中清洗三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清液应用至在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠。于室温温育1小时之后，将珠在Ultrafree-MC-滤器柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40清洗一次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲盐水(2xPBS，Roche)清洗两次，并用0.5mL100mM柠檬酸钠pH 5，0简单清洗四次。通过添加35μlLDS样品缓冲液(Invitrogen)来洗脱结合的抗体。分别将一半样品与样品还原剂组合或保持不还原，并于70℃加热10min。因此，将5-30μl应用至4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(MOPS缓冲液用于非还原SDS-PAGE，带抗氧化剂运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液用于还原SDS-PAGE)，并用考马斯蓝染色。
通过亲和HPLC层析定量测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简言之，在Agilent HPLC 1100***上，将含有结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养物上清液应用至200mM KH2PO4，100mM柠檬酸钠，pH 7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱，并用200mM NaCl，100mM柠檬酸，pH 2，5自基质洗脱。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。纯化的标准IgG1抗体充当标准。
或者，通过三明治式IgG-ELISA测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简言之，将StreptaWell高结合链霉亲合素A-96孔微量滴定板(Roche)用100μL/孔0.1μg/mL生物素化抗人IgG捕捉分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)于室温包被1小时或于4℃包被过夜，随后用200μL/孔PBS，0.05％Tween(PBST，Sigma)清洗三次。将100μL/孔各含有抗体的细胞培养物上清液在PBS(Sigma)中的稀释系列添加至孔，并在微量滴定板摇床上于室温温育1-2小时。将孔用200μL/孔PBST清洗三次，并在微量滴定板摇床上用100μl 0.1μg/mL F(ab’)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体于室温检测结合的抗体1-2小时。三次用200μL/孔PBST洗掉未结合的检测抗体，并通过添加100μL ABTS/孔来检测结合的检测抗体。在Tecan荧光分光仪上实施吸光度测定，测量波长405nm(参照波长492nm)。
蛋白质纯化
参照标准方案自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之，将抗体应用至蛋白A Sepharose柱(GE healthcare)，并用PBS清洗。在pH 2.8实现抗体洗脱，接着立即中和样品。通过大小排阻层析(Superdex 200，GEHealthcare)在PBS中或在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0中将聚集的蛋白质与单体抗体分开。合并单体抗体级分，使用例如MILLIPORE AmiconUltra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(在需要时)，冷冻并保存于-20℃或-80℃。提供部分样品进行后续蛋白质分析和分析性表征，例如通过SDS-PAGE、大小排阻层析(SEC)或质谱术。
SDS-PA GE
依照制备商的指令使用Pre-Cast凝胶***(Invitrogen)。特别地，使用10％或4-12％ Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和MES(还原的凝胶，有抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原的凝胶)运行缓冲液。
分析性大小排阻层析
通过HPLC层析来实施用于测定抗体聚集和寡聚状态的大小排阻层析(SEC)。简言之，将蛋白A纯化的抗体应用至Agilent HPLC 1100***上300mM NaCl，50mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSK凝胶G3000SW柱或至Dionex HPLC***上2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。BioRad凝胶过滤标准151-1901充当标准。
质谱术
经电喷射离子化质谱术(ESI-MS)测定并验证交换型抗体的去糖基化总质量。简言之，以高至2mg/ml的蛋白质浓度将100μg纯化的抗体用50mU N-糖苷酶F(PNGaseF，ProZyme)在100mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7中于37℃去糖基化12-24h，随后在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上经HPLC脱盐。在去糖基化和还原之后通过ESI-MS测定各重和轻链的质量。简言之，将115μl中的50μg抗体与60μl 1M TCEP和50μl 8M胍-盐酸一起温育，随后脱盐。在配备有源的Q-Star Elite MS***上经ESI-MS测定总质量及还原重和轻链的质量。
IGF-1R、EGFR、HER3和c-Met ECD Biacore
使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，Sweden)通过表面等离振子共振来调查生成的抗体对人IGF-1R、EGFR、HER3和c-Met ECD(胞外域)的结合。简言之，为了亲和力测量，经胺偶联在CM5芯片上固定化山羊抗人IgG，JIR 109-005-098抗体以呈现针对人ECD-Fc标签的抗体。在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween 20，ph 7.4)中于25℃测量结合。在溶液中以各种浓度添加来自c-Met、IGF-1R或EGFR的ECD(R&D Systems或内部纯化)。通过80秒钟至3分钟的ECD注射来测量结合；通过用HBS缓冲液清洗芯片表面3-10分钟来测量解离，并使用1∶1Langmuir结合模型来估算KD值。由于低加载密度和捕捉水平，获得单价ECD结合。自样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)以修正***内在基线漂移及降低噪声信号。使用Biacore T100评估软件1.1.1版来分析传感图及技术亲和力数据。图11显示Biacore测定法的纲要。
ANGPT2和VEGF结合BIACORE
还使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，Sweden)通过表面等离振子共振来调查生成的抗体对人ANGPT2和VEGF的结合。简言之，为了亲和力测量，经胺偶联在CM5或CM4芯片上固定化山羊<hIgG-Fcg>多克隆抗体以呈现针对人ANGPT2和VEGF的抗体。在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween 20，ph 7.4)中有或无5mM Ca2+于25℃测量结合。在溶液中以各种浓度分别添加纯化的ANGPT2-His或VEGF165/VEGF121-His(R&D Systems或内部纯化)。通过3分钟的ANGPT2/VEGF注射来测量结合；通过用HBS缓冲液清洗芯片表面3-5分钟来测量解离，并使用1∶1Langmuir结合模型来估算KD值。自样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)以修正***内在基线漂移及降低噪声信号。使用Biacore T100评估软件1.1.1版来分析传感图及技术亲和力数据。BIACORE中的同时结合
四和三特异性抗体分别对EGFR、IGF-1R、Ang-2和VEGF或者EGFR、IGF-1R、HER3和c-Met或者EGFR、Ang-2和VEGF的同时结合。
将四或三特异性抗体格式的结合与衍生结合模块和双特异性抗体的‘野生型’IgG的结合比较。如上所述通过应用表面等离振子共振(Biacore)来进行这些分析。为了显示同时结合，使用Biacore T100仪器(Biacore AB，Uppsala)通过表面等离振子共振技术(SPR)来分析结合特性。
使用胺偶联化学在CM5生物传感器芯片的表面上固定化捕捉用抗人IgG抗体。用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M 3-(N，N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺的1∶1混合物以5μl/min的流速活化流动室。在乙酸钠，pH 5.0中以10μg/ml注射抗人IgG抗体，这导致大约12000RU的表面密度。以相同方式但只用媒介缓冲液代替捕捉用抗体处理参照对照流动室。用1M乙醇胺/HCl，pH8.5注射来封闭表面。在HBS-P中稀释多特异性抗体，并以5μl/min的流速注射。对于浓度介于1和50nM之间的抗体，接触时间(结合阶段)为1min。分别以渐增浓度注射EGFR/IGF-1R/HER3/c-Met-ECD和Ang-2或VEGF。于25℃(标准温度)实施所有相互作用。在每一个结合循环之后以5μl/min流注射再生溶液3M氯化镁60sec以除去任何非共价结合的蛋白质。以每秒一个信号的速率检测信号。以渐增浓度注射样品。
实施例1：识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的四特异性和四价抗体的生成、表达、纯化和表征
在第一个实例中，通过经(G4S)4连接子融合二硫化物稳定的针对EGFR的scFv和针对IGF-1R的scFv分别至具有结-入-穴、以它的可变域识别血管生成素-2和VEGF的CH1/CL(C卡帕)域交换抗体的第一重链和第二重链的C端部分，生成了识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的四特异性和四价抗体(图4a)。4条抗体链的序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
  关键数据
  表达(产量)-mg/mL   14，5
  纯化(蛋白A同质性)-％   91，3
  SEC后的产量-mg/mL   10，4
  制备性SEC后的同质性-％   99，7
在第二个实例中，通过经(G4S)2连接子融合针对EGFR的scFab和针对IGF-1R的scFab分别至具有结-入-穴、以它的可变域识别血管生成素-2和VEGF的CH1/CL(C卡帕)域交换抗体的第一重链和第二重链的C端部分，生成了识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的四特异性和四价抗体(图4b)。4条抗体链的序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6。
  关键数据
  表达(产量)-mg/mL   12，2
  纯化(蛋白A同质性)-％   74，4
  SEC后的产量-mg/mL   6，8
  制备性SEC后的同质性-％   98，4
在与第二个实例类似的另一个实例中，通过经(G4S)2连接子融合针对EGFR的scFab和针对IGF-1R的scFab分别至具有结-入-穴、以它的可变域识别血管生成素-2和VEGF的CH1/CL(C卡帕)域交换抗体的第二重链和第一重链的C端部分，生成了识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的四特异性和四价抗体(与图4b类似，但是针对IGF-1R的scFab融合至结ANG2结合重链且针对EGFR的scFab融合至穴VEGF结合重链)。4条抗体链的序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
如上文一般方法部分所述通过经典分子生物学技术生成这些抗体变体，并如上所述在HEK293F细胞中瞬时表达。随后，通过蛋白A亲和层析和大小排阻层析的组合自上清液纯化它们。对获得的产物表征身份(通过质谱术)和分析特性诸如纯度(通过SDS-PAGE)、单体含量和稳定性(图8-9，基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)。
使用上文所述方法通过Biacore显示四种抗体特异性对四种所覆盖的抗原(血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R)的(同时)结合。
表：基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的四特异性和四价抗体的结合。
  分析物   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(nM)
  EGFR(HER1)   3.1E+05*   3.9E-05*   12.8*
  IGF-1R   低结合亲和力
  Ang-2   n.d.***   n.d.***   138***
  VEGF   5.0E+04*   ＜1E-06*   ＜1E-11*
*经抗人抗体捕捉
**经HER1捕捉
***Ang-2表面
实施例2：识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异性和四价抗体的生成、表达、纯化和表征
在第一个实例中，通过经(G4S)4连接子融合二硫化物稳定的针对EGFR的scFv至具有结-入-穴、以它的可变域识别血管生成素-2和VEGF的CH1/CL(C卡帕)域交换抗体的两条重链的C端部分，生成了识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的三特异性和四价抗体(图5a)。4条抗体链的序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7。
  关键数据
  表达(产量)-mg/mL   20，1
  纯化(蛋白A同质性)-％   64，1
  SEC后的产量-mg/mL   12，0
  制备性SEC后的同质性-％   100
表：依照图5a，识别血管生成素-2、VEGF-A、和EGFR的三特异性和四价抗体的结合。
  结合亲和力   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(nM)
  EGFR(HER1)   4.7E+04   2.3E-04   6
  hAng-2   1E+06   1.7E-04   0.2
  hVEGF   1E+05   ＜1E-06   ＜0.1
在第二个实例中，通过经(G4S)2连接子融合针对EGFR的两个scFab至具有结-入-穴、以它的可变域识别血管生成素-2和VEGF的CH1/CL(C卡帕)域交换抗体的两条重链的C端部分，生成了识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的三特异性和四价抗体(图5b)。4条抗体链的序列分别见SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9。
如上文一般方法部分所述通过经典分子生物学技术生成这些抗体变体，并如上所述在HEK293F细胞中瞬时表达。随后，通过蛋白A亲和层析和大小排阻层析的组合自上清液纯化它们。对获得的产物表征身份(通过质谱术)和分析特性诸如纯度(通过SDS-PAGE)、单体含量和稳定性(图10-11，基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9)。
使用上文所述方法通过Biacore显示四种抗体特异性对三种所覆盖的抗原(血管生成素-2、VEGF-A和EGFR)的(同时)结合。
表：依照图5b，识别血管生成素-2、VEGF-A、和EGFR的三特异性和四价抗体的结合。
  分析物   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(nM)
  EGFR(HER1)   3.7E+04*   3.4E-04*   2.7*
  Ang-2   n.d.**   n.d.**   176**
  VEGF   6.7E+04*   ＜1E-06*   ＜0.01*
*经抗人抗体捕捉
**Ang-2表面
实施例3：识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异性和三价抗体的生成、表达、纯化和表征
在第一个实例中，通过经(G4S)4连接子融合二硫化物稳定的针对EGFR的scFv至具有结-入-穴、以它的可变域识别血管生成素-2和VEGF的CH1/CL(C卡帕)域交换抗体的两条重链的C端部分，生成了识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的三特异性和三价抗体(图6)。4条抗体链的序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8。
如上文一般方法部分所述通过经典分子生物学技术生成这些抗体变体，并如上所述在HEK293F细胞中瞬时表达。随后，通过蛋白A亲和层析和大小排阻层析的组合自上清液纯化它们。对获得的产物表征身份(通过质谱术)和分析特性诸如纯度(通过SDS-PAGE)、单体含量和稳定性。
  关键数据
  表达(产量)-mg/mL   40，9
  纯化(蛋白A同质性)-％   77，3
  SEC后的产量-mg/mL   22，3
  制备性SEC后的同质性-％   100
使用上文所述方法通过Biacore显示四种抗体特异性对三种所覆盖的抗原(血管生成素-2、VEGF-A和EGFR)的(同时)结合。

Claims (15)

1.一种三特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中恒定域CL和CH1彼此替换；和
c)其中特异性结合另外的一种抗原的一个抗原结合肽经肽连接子融合至a)或b)的重链的C端，其中所述肽连接子是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3时，n＝3、4、5或6且m＝0、1、2或3，x＝4时，n＝2、3、4或5且m＝0、1、2或3，所述抗原结合肽选自下组：scFv片段和scFab片段，并且；
a)的全长抗体的重链的CH3域和b)的全长抗体的经修饰重链的CH3域在构成所述抗体CH3域之间初始界面的界面处相遇；其中所述界面经过改变以促进所述三特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于：
i)改变一种重链的CH3域，使得在一种重链的CH3域遇见所述三特异性抗体内另一种重链CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一种重链的CH3域的界面内生成***，其可定位在另一种重链的CH3域的界面内的空腔中；
并且
ii)改变另一种重链的CH3域，使得在第二CH3域遇见所述三特异性抗体内第一CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内生成空腔，其中可定位第一CH3域的界面内的***。
2.一种三特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中恒定域CL和CH1彼此替换；和
c)其中特异性结合另外的一种抗原的两个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和b)的重链的C端，其中所述肽连接子是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3时，n＝3、4、5或6且m＝0、1、2或3，x＝4时，n＝2、3、4或5且m＝0、1、2或3，所述抗原结合肽选自下组：scFv片段和scFab片段，并且；
a)的全长抗体的重链的CH3域和b)的全长抗体的经修饰重链的CH3域在构成所述抗体CH3域之间初始界面的界面处相遇；其中所述界面经过改变以促进所述三特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于：
i)改变一种重链的CH3域，使得在一种重链的CH3域遇见所述三特异性抗体内另一种重链CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一种重链的CH3域的界面内生成***，其可定位在另一种重链的CH3域的界面内的空腔中；
并且
ii)改变另一种重链的CH3域，使得在第二CH3域遇见所述三特异性抗体内第一CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内生成空腔，其中可定位第一CH3域的界面内的***。
3.依照权利要求2的抗体，特征在于其在c)下包含特异性结合第三抗原的两个相同抗原结合肽，所述抗原结合肽选自下组：scFv片段和scFab片段。
4.一种四特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中恒定域CL和CH1彼此替换；和
c)其中特异性结合另外的两种抗原的两个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和b)的重链的C端，其中所述肽连接子是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3时，n＝3、4、5或6且m＝0、1、2或3，x＝4时，n＝2、3、4或5且m＝0、1、2或3，所述抗原结合肽选自下组：scFv片段和scFab片段，并且；
a)的全长抗体的重链的CH3域和b)的全长抗体的经修饰重链的CH3域在构成所述抗体CH3域之间初始界面的界面处相遇；其中所述界面经过改变以促进所述四特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于：
i)改变一种重链的CH3域，使得在一种重链的CH3域遇见所述四特异性抗体内另一种重链CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一种重链的CH3域的界面内生成***，其可定位在另一种重链的CH3域的界面内的空腔中；
并且
ii)改变另一种重链的CH3域，使得在第二CH3域遇见所述四特异性抗体内第一CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内生成空腔，其中可定位第一CH3域的界面内的***。
5.依照权利要求1至4任一项的抗体，特征在于所述抗原结合肽是scFv片段。
6.依照权利要求1至4任一项的抗体，特征在于所述抗原结合肽是scFab片段。
7.依照权利要求1-4任一项的抗体，特征在于所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，且所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
8.依照权利要求5的抗体，特征在于所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，且所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
9.依照权利要求6的抗体，特征在于所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，且所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
10.依照权利要求1、2和4任一项的抗体，特征在于进一步改变这两种CH3域，即引入半胱氨酸(C)作为每种CH3域的对应位置中的氨基酸，使得这两种CH3域之间能形成二硫桥。
11.一种用于制备依照权利要求1-10任一项的抗体的方法，包括下述步骤：
a)用包含核酸分子的载体转化宿主细胞，该核酸分子编码依照权利要求1-10任一项的抗体；
b)在容许所述抗体分子合成的条件下培养该宿主细胞；并且
c)自培养物回收所述抗体分子。
12.包含依照权利要求11中所述的载体的宿主细胞。
13.包含依照权利要求1至10任一项的抗体的组合物。
14.依照权利要求13的组合物，其是药物组合物或诊断组合物。
15.包含依照权利要求1至10任一项的抗体和至少一种药学可接受赋形剂的药物组合物。
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Families Citing this family (288)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2667729T3 (es) 2007-09-26 2018-05-14 Ucb Biopharma Sprl Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
DK2334705T3 (en) 2008-09-26 2017-03-27 Ucb Biopharma Sprl BIOLOGICAL PRODUCTS
PL2344540T3 (pl) 2008-10-02 2018-05-30 Aptevo Research And Development Llc Białka wiążące wiele celów antagonistyczne względem cd86
EP2414391B1 (en) 2009-04-02 2018-11-28 Roche Glycart AG Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
JO3182B1 (ar) * 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
RU2573915C2 (ru) 2009-09-16 2016-01-27 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение
LT2519543T (lt) * 2009-12-29 2016-10-10 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimerus rišantys baltymai ir jų panaudojimas
GB201000467D0 (en) * 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
EP2596359A1 (en) 2010-07-19 2013-05-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
EP2848940A1 (en) 2010-07-19 2015-03-18 F. Hoffmann-La Roche AG Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
CA2805564A1 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stefan Jenewein Anti-mhc antibody anti-viral cytokine fusion protein
BR112013001847A2 (pt) 2010-08-24 2016-05-31 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico, método de preparação do anticorpo biespecífico, do anticorpo biespecífico trivalente, métodos e composição farmacêutica
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
EP2647707B1 (en) 2010-11-30 2018-09-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
TW201309330A (zh) * 2011-01-28 2013-03-01 Abbott Lab 包含糖基化抗體之組合物及其用途
MX342034B (es) 2011-02-28 2016-09-12 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
EP2681239B8 (en) 2011-02-28 2015-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding proteins
JP5588086B2 (ja) * 2011-04-19 2014-09-10 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 単一特異性および二重特異性抗ＩＧＦ‐１Ｒ抗体および抗ＥｒｂＢ３抗体
BR112013026423A2 (pt) 2011-04-20 2016-11-29 Roche Glycart Ag método e construtos para a passagem de pendente do ph da barreira sangue-cérebro
CA2837914A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-human epo receptor antibodies and methods of use
AR086982A1 (es) 2011-06-22 2014-02-05 Hoffmann La Roche Eliminacion de celulas diana por parte de celulas t citotoxicas especificas de virus utilizando complejos que comprenden mhc de clase i
US20130078250A1 (en) * 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
MX349095B (es) * 2011-08-23 2017-07-11 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno.
KR101870555B1 (ko) * 2011-08-23 2018-06-22 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법
HUE038225T2 (hu) * 2011-08-23 2018-10-29 Roche Glycart Ag Bispecifikus, T-sejtaktiváló antigénkötõ, molekulák
CA2844143C (en) * 2011-08-23 2018-07-31 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab fragments and methods of use
EP3388451A1 (en) 2011-09-29 2018-10-17 Apo-T B.V. Multi specific binding molecules targeting aberrant cells
DK2773671T3 (da) 2011-11-04 2021-11-15 Zymeworks Inc Udformning af stabilt heterodimert antistof med mutationer i fc-domænet
EP2795335B1 (en) 2011-12-19 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the detection of free binding partner of a multispecific binder
EP2794878B1 (en) 2011-12-22 2020-03-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Expression vector organization, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
CN113881702A (zh) 2011-12-22 2022-01-04 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
RU2625033C2 (ru) 2011-12-22 2017-07-11 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Система индикации на основе полноразмерного антитела для эукариотических клеток и ее применение
WO2013105856A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Apo-T B.V. Aberrant cell-restricted immunoglobulins provided with a toxic moiety
WO2013113663A1 (en) 2012-02-01 2013-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the detection of a binding partner of a multispecific binder
US10633451B2 (en) 2012-02-03 2020-04-28 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibody molecules with antigen-transfected T-cells and their use in medicine
EP2812357B1 (en) 2012-02-10 2020-11-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Single-chain antibodies and other heteromultimers
CA2860600C (en) 2012-02-15 2022-07-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
WO2013134414A1 (en) * 2012-03-06 2013-09-12 Galaxy Biotech, Llc Bispecific antibodies with an fgf2 binding domain
BR112014025830A8 (pt) 2012-04-20 2017-10-10 Emergent Product Dev Seattle Polipeptídeos de ligação ao cd3
BR112014026990A2 (pt) 2012-05-24 2017-07-11 Hoffmann La Roche anticorpo , ácido nucleico , vetores , célula hospedeira , composição farmacêutica , uso de um anticorpo e método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia.
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
JP6203838B2 (ja) 2012-06-27 2017-09-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる結合実体を含む、テーラーメイドの高度に選択的かつ多重特異的なターゲティング実体を選択および作製するための方法、ならびにその使用
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
WO2014006123A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-biotin antibodies and methods of use
CN104428006B (zh) 2012-07-04 2017-09-08 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 共价连接的抗原‑抗体缀合物
WO2014006118A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-theophylline antibodies and methods of use
CN104471397B (zh) 2012-07-13 2018-03-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于检测多特异性结合物的方法
IN2015DN01299A (zh) * 2012-07-23 2015-07-03 Zymeworks Inc
JP6405311B2 (ja) 2012-09-14 2018-10-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる実体を含む分子を作製および選択するための方法ならびにその使用
EP2905290B1 (en) 2012-10-05 2019-12-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Heterodimeric protein composition
RU2015117393A (ru) * 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
SG11201502538TA (en) 2012-11-08 2015-05-28 Hoffmann La Roche Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
US10590202B2 (en) * 2012-11-19 2020-03-17 Baliopharm Ag Recombinant bispecific antibody binding to CD20 and CD95
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
CN105026430A (zh) 2012-11-28 2015-11-04 酵活有限公司 工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途
GB201223276D0 (en) * 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
CN105051069B (zh) 2013-01-14 2019-12-10 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
KR20210094673A (ko) 2013-02-26 2021-07-29 로슈 글리카트 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
CN105143270B (zh) * 2013-02-26 2019-11-12 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
KR20150122203A (ko) * 2013-02-26 2015-10-30 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
WO2014144357A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Merck Patent Gmbh Tetravalent bispecific antibodies
AU2014232416B2 (en) 2013-03-15 2017-09-28 Xencor, Inc. Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102049990B1 (ko) * 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
RU2019108429A (ru) 2013-04-29 2019-05-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифицированные асимметричные антитела, связывающие fc-рецептор, и способы их применения
MY172430A (en) 2013-04-29 2019-11-25 Hoffmann La Roche Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
EP2992011B1 (en) 2013-04-29 2017-12-13 F. Hoffmann-La Roche AG Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
WO2015025054A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 Medizinische Universität Wien Dye-specific antibodies for prestained molecular weight markers and methods producing the same
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
CN104558194B (zh) * 2013-10-17 2018-04-27 泰州迈博太科药业有限公司 一类抗CD20-Flex双功能融合蛋白、其制备方法及用途
CN111499742B (zh) 2013-11-21 2024-05-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-α-突触核蛋白抗体及使用方法
CA2925677A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
BR112016013562A2 (pt) 2013-12-20 2017-10-03 Hoffmann La Roche Anticorpos anti-tau(ps422) humanizados, seus usos, e formulações farmacêuticas
TW201609805A (zh) 2013-12-23 2016-03-16 美國禮來大藥廠 結合ｅｇｆｒ及ｍｅｔ之多功能抗體
JP6521464B2 (ja) 2014-01-03 2019-05-29 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 共有結合で連結されたポリペプチド毒素−抗体コンジュゲート
RU2694981C2 (ru) 2014-01-03 2019-07-18 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Ковалентно связанные конъюгаты хеликар-антитело против хеликара и их применения
EP3960768A1 (en) 2014-01-03 2022-03-02 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
BR112016015589A2 (pt) 2014-01-06 2017-10-31 Hoffmann La Roche módulos de trânsito monovalentes para a barreira hematoencefálica
KR20160107190A (ko) 2014-01-15 2016-09-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 변형된 FcRn-결합 및 유지된 단백질 A-결합 성질을 갖는 Fc-영역 변이체
EA201691925A1 (ru) 2014-03-28 2017-06-30 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела, которые связываются с cd38 и cd3
SG10202107077QA (en) 2014-04-02 2021-07-29 Hoffmann La Roche Method for detecting multispecific antibody light chain mispairing
TWI726842B (zh) 2014-04-07 2021-05-11 日商中外製藥股份有限公司 免疫活化抗原結合分子
EP2930188A1 (en) * 2014-04-13 2015-10-14 Affimed Therapeutics AG Trifunctional antigen-binding molecule
KR102223502B1 (ko) * 2014-05-09 2021-03-05 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR/항 Her3 다중 특이 항체 및 이의 이용
US11505605B2 (en) * 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
CA3177027A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
EP3148580B1 (en) 2014-05-29 2021-01-20 MacroGenics, Inc. Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
MX2016015280A (es) 2014-06-26 2017-03-03 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-bromodesoxiuridina(brdu) y metodos de uso.
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
TW201623329A (zh) 2014-06-30 2016-07-01 亞佛瑞司股份有限公司 針對骨調素截斷變異體的疫苗及單株抗體暨其用途
CN106661119A (zh) 2014-07-01 2017-05-10 辉瑞公司 双特异性异二聚化双抗体及其用途
WO2016005545A1 (en) 2014-07-10 2016-01-14 Affiris Ag Substances and methods for the use in prevention and/or treatment in huntington's disease
HUE044814T2 (hu) 2014-08-04 2019-11-28 Hoffmann La Roche Bispecifikus, T-sejt-aktiváló antigénkötõ molekulák
AP2017009823A0 (en) 2014-09-26 2017-03-31 Macrogenics Inc Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
CN107108720A (zh) 2014-11-06 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 具有改变的FCRN结合的Fc区变体及其使用方法
WO2016071377A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
PL3789402T3 (pl) 2014-11-20 2022-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona składająca się z dwuswoistych cząsteczek wiążących antygen aktywujących limfocyty T oraz antagonistów wiązania osi PD-1
PE20171103A1 (es) 2014-11-26 2017-08-07 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38
BR112017011092A2 (pt) 2014-11-26 2017-12-26 Xencor Inc anticorpos heterodiméricos que ligam cd3 e antígenos de tumor
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
WO2016087514A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies
ES2764111T3 (es) 2014-12-03 2020-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos
JP6904902B2 (ja) * 2014-12-05 2021-07-21 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ ドメイン交換抗体
BR112017011170A2 (pt) 2014-12-18 2018-02-27 Hoffmann La Roche método para determinar a citotoxicidade dependente do complemento de uma composição
WO2016105450A2 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
EP3250601A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 MacroGenics, Inc. Multivalent molecules comprising dr5-binding domains
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
EP3744732A1 (en) 2015-06-24 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
KR20180021875A (ko) * 2015-06-30 2018-03-05 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 다중특이적 결합 단백질
SI3456346T1 (sl) 2015-07-30 2021-11-30 Macrogenics, Inc. Molekule za vezavo PD-1 in LAG-3 in postopki za uporabo le-teh
CN108367004B (zh) 2015-09-21 2022-09-13 阿帕特夫研究和发展有限公司 Cd3结合多肽
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CA2990755A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffman-La Roche Ag Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
HUE056033T2 (hu) 2015-10-02 2022-01-28 Hoffmann La Roche Anti-pd1 antitestek és felhasználási módszerek
CN108139394B (zh) 2015-10-02 2020-10-30 豪夫迈·罗氏有限公司 用于确定同时结合的基于细胞的fret测定法
WO2017062619A2 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Macrogenics, Inc. Combination therapy for the treatment of cancer
KR20180069839A (ko) 2015-10-08 2018-06-25 자임워크스 인코포레이티드 카파 및 람다 경사슬을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드 구조체 및 이의 용도
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
EP4015533A1 (en) 2015-10-29 2022-06-22 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-variant fc-region antibodies and methods of use
US11660340B2 (en) 2015-11-18 2023-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
US10227410B2 (en) 2015-12-07 2019-03-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
CA2997406C (en) 2015-12-09 2024-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release
GEP20217328B (en) 2015-12-14 2021-12-10 Macrogenics Inc Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof
CN108712911A (zh) 2015-12-30 2018-10-26 科达制药股份有限公司 抗体及其缀合物
WO2017118675A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
US20170233472A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof
HRP20230528T1 (hr) 2016-03-22 2023-08-04 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecifične molekule t stanica aktivirane proteazom
CN109069638B (zh) * 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
EP3442574A4 (en) 2016-04-15 2019-12-11 MacroGenics, Inc. NOVEL B7-H3 BINDING MOLECULES, THEIR ANTIBODY-MEDICINAL CONJUGATES AND METHODS OF USE
MX2018015592A (es) 2016-06-14 2019-04-24 Xencor Inc Anticuerpos inhibidores de puntos de control biespecificos.
EP3472177A2 (en) 2016-06-17 2019-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Purification of multispecific antibodies
JP7021127B2 (ja) 2016-06-28 2022-02-16 ゼンコア インコーポレイテッド ソマトスタチン受容体２に結合するヘテロ二量体抗体
CA3030841A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Multiple bi-specific binding domain constructs with different epitope binding to treat cancer
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CN116731197A (zh) 2016-09-19 2023-09-12 豪夫迈·罗氏有限公司 基于补体因子的亲和层析
EP3519437B1 (en) 2016-09-30 2021-09-08 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies against p95her2
AU2017337073A1 (en) * 2016-09-30 2019-04-18 Baylor College Of Medicine Antibody based gene therapy with tissue-directed expression
WO2018060035A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Spr-based dual-binding assay for the functional analysis of multispecific molecules
MX2019004327A (es) 2016-10-14 2019-10-14 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15ra y fragmentos de anticuerpo pd-1.
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
US20230192896A1 (en) 2016-11-23 2023-06-22 Bioverativ Therapeutics Inc. Bispecific antibodies binding to coagulation factor ix and coagulation factor x
MX2019006123A (es) 2016-12-21 2019-08-12 Hoffmann La Roche Metodo para glicomanipulacion in vitro de anticuerpos.
BR112019009839A2 (pt) 2016-12-21 2019-09-17 Hoffmann La Roche método para a produção enzimática de um anticorpo e anticorpo
AU2017384276B9 (en) 2016-12-21 2020-11-26 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro glycoengineering of antibodies
AR110424A1 (es) 2016-12-23 2019-03-27 Macrogenics Inc Moléculas de unión a adam9 y métodos de uso de las mismas
US20190352429A1 (en) 2017-02-02 2019-11-21 Merck Patent Gmbh Preferred pairing of antibody domains
IL268836B2 (en) 2017-02-24 2024-04-01 Macrogenics Inc Bispecific molecules that bind CD137 and cancer antigens and their uses
JP7247101B2 (ja) 2017-04-03 2023-03-28 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｓｔｅａｐ－１に結合する抗体
HUE060019T2 (hu) 2017-04-05 2023-01-28 Hoffmann La Roche Anti-LAG3 antitestek
SG11201909154SA (en) 2017-04-05 2019-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
IL271257B1 (en) * 2017-06-25 2024-07-01 Systimmune Inc Multispecific antibodies and methods for their preparation and use
SG11201912865VA (en) * 2017-06-25 2020-01-30 Systimmune Inc Multi-specific antibodies and methods of making and using thereof
CN110831978A (zh) 2017-06-30 2020-02-21 酵活有限公司 稳定的嵌合fab
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
JP6951545B2 (ja) * 2017-07-21 2021-10-20 トリアンニ インコーポレイテッドＴｒｉａｎｎｉ，Ｉｎｃ． 単鎖ｖｈ及び重鎖抗体
US11161911B2 (en) 2017-10-23 2021-11-02 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-MUC1 antibodies and their uses
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
AU2018366199A1 (en) 2017-11-08 2020-05-28 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
AU2018374469B2 (en) 2017-11-29 2022-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Target interference suppressed anti-drug antibody assay
KR20200098590A (ko) 2017-12-12 2020-08-20 마크로제닉스, 인크. 이중특이적 cd16-결합 분자 및 질환 치료에서의 그것의 용도
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
BR112020011469A2 (pt) 2017-12-21 2020-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, uso do anticorpo, método de tratamento de uma doença e invenção
US11945839B2 (en) 2017-12-22 2024-04-02 Hoffmann-La Roche Inc. Depletion of light chain mispaired antibody variants by hydrophobic interaction chromatography
WO2019129677A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-vegf antibodies and methods of use
WO2019149716A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
EP3746470A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 F. Hoffmann-La Roche AG Stabilized immunoglobulin domains
CA3089287A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
US11685781B2 (en) 2018-02-15 2023-06-27 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
EP3775184A1 (en) 2018-03-29 2021-02-17 F. Hoffmann-La Roche AG Modulating lactogenic activity in mammalian cells
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
SG11202010163QA (en) 2018-04-18 2020-11-27 Xencor Inc Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
JOP20200303A1 (ar) 2018-05-24 2020-11-23 Janssen Biotech Inc عوامل ربط psma واستخداماتها
MX2020013348A (es) 2018-06-09 2021-03-09 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos biespecificos contra dll3-cd3.
BR112021001201A2 (pt) 2018-07-25 2021-04-27 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. anticorpo anti-tigit e uso do mesmo
AR114544A1 (es) * 2018-08-08 2020-09-16 Dragonfly Therapeutics Inc Proteínas de unión multiespecíficas que unen a bcma, nkg2d y cd16, y métodos de uso
CA3051549A1 (en) 2018-08-09 2020-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
EP3861016A2 (en) 2018-10-03 2021-08-11 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CN109633053B (zh) * 2018-12-19 2021-04-30 杭州奕安济世生物药业有限公司 细胞培养物蛋白质表达量和蛋白质聚集体量的检测方法
TWI829831B (zh) 2018-12-21 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合cd3之抗體
KR20210108421A (ko) 2018-12-24 2021-09-02 사노피 돌연변이 Fab 도메인을 포함하는 다중특이성 결합 단백질
JP2022515473A (ja) 2018-12-28 2022-02-18 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 免疫応答が増幅された患者における治療的使用のためのペプチド－ｍｈｃ－ｉ－抗体融合タンパク質
JP7241888B2 (ja) 2018-12-30 2023-03-17 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ｐＨ勾配ＳＰＲに基づく結合アッセイ
CN114173875A (zh) 2019-03-01 2022-03-11 Xencor股份有限公司 结合enpp3和cd3的异二聚抗体
EP3948281A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 F. Hoffmann-La Roche AG Spr-based binding assay for the functional analysis of multivalent molecules
EP3947440A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 F. Hoffmann-La Roche AG Method for generating avid-binding multispecific antibodies
BR112021020532A2 (pt) 2019-04-19 2022-03-15 Janssen Biotech Inc Métodos para tratamento de câncer de próstata com um anticorpo anti-psma/cd3
WO2020229378A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Interference-suppressed pharmacokinetic immunoassay
CN114008212A (zh) 2019-06-19 2022-02-01 豪夫迈·罗氏有限公司 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生三价抗体表达细胞的方法
MX2021015648A (es) 2019-06-19 2022-02-03 Hoffmann La Roche Metodo para la generacion de una celula que expresa un anticuerpo multiespecifico multivalente mediante integracion dirigida de multiples casetes de expresion en una organizacion definida.
BR112021025425A2 (pt) 2019-06-19 2022-02-01 Hoffmann La Roche Método para produzir uma célula de mamífero recombinante e uso de mrna de recombinase cre
CN114008081A (zh) 2019-06-19 2022-02-01 豪夫迈·罗氏有限公司 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生二价双特异性抗体表达细胞的方法
AU2020297940A1 (en) 2019-06-19 2021-12-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of a multivalent, bispecific antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
JP7450647B2 (ja) 2019-06-26 2024-03-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｓｉｒｔ－１遺伝子ノックアウトを有する哺乳類細胞株
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
CN114174342A (zh) 2019-07-31 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
CN114174338A (zh) 2019-07-31 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
US20210040197A1 (en) 2019-08-08 2021-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel antigen binding molecule formats
EP4031579A2 (en) 2019-09-18 2022-07-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
JP2022553640A (ja) 2019-10-10 2022-12-26 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド 眼障害を処置する方法
CN114641270A (zh) 2019-11-15 2022-06-17 豪夫迈·罗氏有限公司 防止水性蛋白质溶液中可见颗粒的形成
KR20220113791A (ko) 2019-12-18 2022-08-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ccl2 항체
MX2022007635A (es) 2019-12-18 2022-07-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a hla-a2/mage-a4.
IL294131A (en) 2019-12-23 2022-08-01 Genentech Inc Antibodies specific for apolipoprotein l1 and methods of use
WO2021136772A1 (en) 2020-01-02 2021-07-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining the amount of a therapeutic antibody in the brain
AR121061A1 (es) 2020-01-15 2022-04-13 Hoffmann La Roche Métodos para disminuir impurezas de los procesos de fabricación de proteínas recombinantes
EP4127153A2 (en) 2020-03-26 2023-02-08 Genentech, Inc. Modified mammalian cells having reduced host cell proteins
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
EP4149421A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 F. Hoffmann-La Roche AG Prevention of visible particle formation in parenteral protein solutions
EP4153130A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 F. Hoffmann-La Roche AG The use of chelators for the prevention of visible particle formation in parenteral protein solutions
US20230340081A1 (en) 2020-06-08 2023-10-26 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-hbv antibodies and methods of use
AU2021294222A1 (en) 2020-06-16 2023-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining the free antigen of an antibody in a sample
AR122658A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
US11780920B2 (en) 2020-06-19 2023-10-10 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to CD3 and CD19
CN115916826A (zh) 2020-06-19 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 与CD3和FolR1结合的抗体
WO2021262783A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
EP4175650A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Kiromic BioPharma, Inc. Mesothelin isoform binding molecules and chimeric pd1 receptor molecules, cells containing the same and uses thereof
EP4178529A1 (en) 2020-07-07 2023-05-17 F. Hoffmann-La Roche AG Alternative surfactants as stabilizers for therapeutic protein formulations
JP2023534458A (ja) 2020-07-17 2023-08-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｎｏｔｃｈ２抗体及び使用方法
CA3192204A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
CA3192344A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Genentech, Inc. Crispr/cas9 multiplex knockout of host cell proteins
AU2021342566A1 (en) 2020-09-21 2023-03-02 Genentech, Inc. Purification of multispecific antibodies
IL301366A (en) 2020-09-24 2023-05-01 Hoffmann La Roche Mammalian cell lines with genetic knockout
TW202233671A (zh) 2020-10-20 2022-09-01 美商建南德克公司 Ｐｅｇ結合抗ｍｅｒｔｋ抗體及其使用方法
CA3202233A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Kiromic BioPharma, Inc. Gamma-delta t cell manufacturing processes and chimeric pd1 receptor molecules
EP4261225A1 (en) 2020-12-10 2023-10-18 Eutilex Co., Ltd. Anti-pd-1 antibody and uses thereof
KR20230120665A (ko) 2020-12-17 2023-08-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-hla-g 항체 및 이의 용도
CN116670282A (zh) 2020-12-22 2023-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 靶向xbp1的寡核苷酸
CA3203257A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Li Li Anti-b7-h3 antibody and uses thereof
EP4286408A1 (en) * 2020-12-29 2023-12-06 Samsung Biologics Co., Ltd. Bi- or multi-specific antibody
CN114716548A (zh) 2021-01-05 2022-07-08 (株)爱恩德生物 抗-fgfr3抗体及其用途
MX2023008909A (es) 2021-01-28 2023-10-23 Janssen Biotech Inc Proteínas de unión a psma y usos de estas.
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
WO2022175217A1 (en) 2021-02-18 2022-08-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for resolving complex, multistep antibody interactions
CA3211407A1 (en) * 2021-02-19 2022-08-25 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-gprc5dxbcmaxcd3 trispecific antibody and use thereof
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
JP2024512377A (ja) 2021-03-12 2024-03-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体、及び使用方法
EP4320444A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 F. Hoffmann-La Roche AG Process for selecting cell clones expressing a heterologous polypeptide
IL307501A (en) 2021-04-19 2023-12-01 Hoffmann La Roche Modified mammalian cells
CN117396599A (zh) 2021-05-21 2024-01-12 基因泰克公司 用于生产目的重组产物的经修饰的细胞
CN113278071B (zh) 2021-05-27 2021-12-21 江苏荃信生物医药股份有限公司 抗人干扰素α受体1单克隆抗体及其应用
JP2024523033A (ja) * 2021-06-17 2024-06-25 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 新規の三重特異的結合分子
KR20240021859A (ko) 2021-06-18 2024-02-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ccl2 항체
US20230197278A1 (en) 2021-07-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Multi-variate model for predicting cytokine release syndrome
WO2023284806A1 (zh) * 2021-07-14 2023-01-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合cd38、bcma和cd3的抗原结合分子及其医药用途
EP4373859A1 (en) 2021-07-22 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Heterodimeric fc domain antibodies
WO2023012147A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies and methods of use
CN113603775B (zh) 2021-09-03 2022-05-20 江苏荃信生物医药股份有限公司 抗人白介素-33单克隆抗体及其应用
CN113683694B (zh) 2021-09-03 2022-05-13 江苏荃信生物医药股份有限公司 一种抗人tslp单克隆抗体及其应用
WO2023094282A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Quantification of low amounts of antibody sideproducts
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023117325A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the determination of hydrolytic activity
CA3241882A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
WO2023175171A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Bk polyomavirus antibodies and uses thereof
WO2023202967A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2023232961A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079069A1 (en) 2022-10-12 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for classifying cells
WO2024110426A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for increasing recombinant protein expression
WO2024129594A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 Genentech, Inc. Optimizing polypeptide sialic acid content
CN117805397A (zh) * 2024-02-29 2024-04-02 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 检测游离vegf的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6982321B2 (en) * 1986-03-27 2006-01-03 Medical Research Council Altered antibodies
CN101205255A (zh) * 2006-12-14 2008-06-25 上海中信国健药业有限公司 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4843008A (en) 1984-12-24 1989-06-27 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Novel microorganisms and a novel process for producing antibiotics
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
GB9221657D0 (en) * 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5731168A (en) * 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US20020062010A1 (en) * 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DK1049787T3 (da) * 1998-01-23 2005-04-04 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofderivater med flere anvendelsesmuligheder
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US7074405B1 (en) * 1998-06-22 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20070274998A1 (en) * 2002-04-29 2007-11-29 Genpatzz Pharmacogentetics Ag Novel Bispecific Molecules For Use In Therapy And Diagnosis
US7534427B2 (en) * 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
ES2542885T3 (es) 2003-01-22 2015-08-12 Roche Glycart Ag Constructos de fusión y uso de los mismos para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora
CA2534077A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
CA2536408A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
EP1663306A2 (en) 2003-09-05 2006-06-07 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20050064509A1 (en) * 2003-09-23 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Use of templated self assembly to create novel multifunctional species
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
CN101218251A (zh) * 2005-02-28 2008-07-09 森托科尔公司 异二聚体蛋白结合组合物
KR101374454B1 (ko) * 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
JP5838021B2 (ja) * 2005-04-15 2015-12-24 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 共有結合型ダイアボディとその使用
JP5315489B2 (ja) 2005-04-26 2013-10-16 アール クレア アンド カンパニー エフェクター機能が増強されたヒトＩｇＧ抗体を作製する方法
EP1874816A4 (en) 2005-04-26 2010-08-25 Medimmune Inc MODULATION OF THE ANTIBODY EFFECTOR FUNCTION BY "HINGE" DOMENGINE ENGINEERING
CA2618482C (en) 2005-08-19 2014-10-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
AU2007227292B2 (en) 2006-03-17 2012-04-12 Biogen Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
US20070274985A1 (en) * 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
AU2008282218A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
US8227577B2 (en) * 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) * 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) * 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP2342231A1 (en) * 2008-09-26 2011-07-13 Roche Glycart AG Bispecific anti-egfr/anti-igf-1r antibodies
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
EP2414391B1 (en) 2009-04-02 2018-11-28 Roche Glycart AG Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6982321B2 (en) * 1986-03-27 2006-01-03 Medical Research Council Altered antibodies
CN101205255A (zh) * 2006-12-14 2008-06-25 上海中信国健药业有限公司 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
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US20150030598A1 (en) 2015-01-29
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KR101431319B1 (ko) 2014-08-20
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CA2761233A1 (en) 2010-12-02
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