CN116635062A - 使用表达嵌合抗原受体（car）的细胞的组合疗法 - Google Patents

使用表达嵌合抗原受体（car）的细胞的组合疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN116635062A
CN116635062A CN202180082205.7A CN202180082205A CN116635062A CN 116635062 A CN116635062 A CN 116635062A CN 202180082205 A CN202180082205 A CN 202180082205A CN 116635062 A CN116635062 A CN 116635062A
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
seq
sequence
cells
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180082205.7A
Other languages
English (en)
Inventor
A·M·查伯恩
S·I·阿古尔尼克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN116635062A publication Critical patent/CN116635062A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A61K31/635—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide having a heterocyclic ring, e.g. sulfadiazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Abstract

本披露提供了通过施用如本文所述的CD19 CAR疗法与如本文所述的BCL2抑制剂的组合来治疗B细胞淋巴瘤的方法。

Description

使用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的组合疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月13日提交的美国临时申请63/113,749的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表特此通过引用以其全文并入。所述ASCII副本创建于2021年11月9日，名称为N2067-7171WO_SL.txt，大小为490,552字节。
技术领域
本发明总体上涉及表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞与BCL2抑制剂组合用于治疗癌症(例如，淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤)的用途。
背景技术
使用自体T细胞(尤其是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)的过继转移(ACT)疗法在复发性或难治性血液学癌症的治疗中显示出前景。存在对用于治疗例如复发性或难治性B细胞淋巴瘤的CAR T细胞疗法和具有改善的疗效的组合疗法的医学需求。
发明内容
本披露至少部分涉及治疗血液学癌症(例如，淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤)的方法，该方法包括施用表达结合B细胞抗原(例如，本文所述的B细胞抗原)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞与细胞凋亡抑制剂(例如，BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或其组合)或MYC抑制剂中的一种或多种的组合。在一些实施例中，表达CAR的细胞结合CD19，例如，本文所述的表达CD19 CAR的细胞。在一些实施例中，B细胞淋巴瘤是高级别B细胞淋巴瘤(例如，双和/或三打击(triple hit)淋巴瘤或非特指型(NOS)高级别淋巴瘤)、DLBCL(例如，复发性和/或难治性DLBCL)、多发性骨髓瘤或滤泡性淋巴瘤。本文还描述了包含上述组合的组合物和向选择的受试者施用所述组合的另外方法。
在一方面，本披露提供了用于治疗患有或被鉴定为患有淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤)的受试者的方法，例如，其中所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性。所述方法包括：
向所述受试者施用包含表达与B细胞抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群的疗法与BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种的组合，从而治疗所述受试者的淋巴瘤。
在另一方面，本披露提供了治疗患有淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤)的受试者的方法，所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性(例如，高级别B细胞淋巴瘤)。所述方法包括：
向所述受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种，其中所述受试者是或被鉴定为是与B细胞抗原结合的CAR疗法的无应答者、部分应答者或复发者。
在又另一方面，本披露提供了治疗或预防患有淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤)的受试者对表达结合B细胞抗原的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群发生复发的方法，所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性。所述方法包括：
向已经历、正在经历、或将接受CAR疗法的受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂、或其组合，
从而治疗或预防对所述CAR疗法发生的复发。
在本文提供的任何方法的一些实施例中，CAR与选自CD19、CD22、CD20、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b和/或CD79a的B细胞抗原结合。在一些实施例中，CAR与CD19结合(“CD19 CAR疗法”)。在一些实施例中，CAR19疗法是包含免疫效应细胞的疗法，这些免疫效应细胞表达抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，BCL2抑制剂是维奈托克(venetoclax)。
在本文提供的任何方法的一些实施例中，淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。在一些实施例中，B细胞淋巴瘤选自高级别B细胞淋巴瘤(例如，双和/或三打击淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，复发性和/或难治性DLBCL)或滤泡性淋巴瘤(FL)。在一些实施例中，B细胞淋巴瘤是高级别B细胞淋巴瘤，例如，双和/或三打击(DH/TH)淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤。在一些实施例中，DH/TH淋巴瘤是复发性或难治性DH/TH淋巴瘤。在一些实施例中，高级别B细胞淋巴瘤是双打击(double hit)(DH)淋巴瘤。在一些实施例中，高级别B细胞淋巴瘤是三打击(TH)淋巴瘤。在一些实施例中，淋巴瘤是DLBCL，例如，复发性和/或难治性DLBCL。在一些实施例中，淋巴瘤是FL，例如，复发性和/或难治性FL。在一些实施例中，淋巴瘤是多发性骨髓瘤。
本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明这些特定实施例的许多等效形式。这种等同物旨在由以下列举的实施例涵盖。
列举的实施例
1.一种用于治疗患有或被鉴定为患有淋巴瘤，例如，B细胞淋巴瘤的受试者的方法，例如，其中所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性，其中所述方法包括：
向所述受试者施用包含表达与B细胞抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群的疗法与BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种的组合，从而治疗所述受试者的淋巴瘤。
2.一种治疗患有淋巴瘤的受试者的方法，所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性，所述方法包括：
向所述受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种，其中所述受试者是或被鉴定为是所述CAR疗法的无应答者、部分应答者或复发者。
3.如实施例2所述的方法，其中所述受试者已经历、正在经历、或将接受所述CAR疗法，例如，CD19 CAR疗法。
4.一种治疗或预防患有淋巴瘤的受试者对表达与B细胞抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群发生复发的方法，所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性，所述方法包括：
向已经历、正在经历、或将接受所述CAR疗法的受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种，
从而治疗或预防对所述CAR疗法发生的复发。
5.如实施例1至4中任一项所述的方法，其中所述CAR结合选自CD19、CD20、CD22、CD20、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b和/或CD79a的B细胞抗原。
6.如实施例1至5中任一项所述的方法，其中，所述CAR与CD19结合(“CD19 CAR疗法”)。
7.如实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有MYC基因或基因产物的改变，或抗凋亡基因或基因产物的改变，或其组合。
8.如实施例7所述的方法，其中所述改变导致增加的所述MYC基因或基因产物和/或所述抗凋亡基因或基因产物水平，例如，表达和/或活性。
9.如实施例7或8所述的方法，其中所述抗凋亡基因的改变包含BCL2基因或BCL6基因的改变，或其组合。
10.如实施例7至9中任一项所述的方法，其中例如，与不具有所述改变的MYC或抗凋亡基因相比，所述MYC基因或所述抗凋亡基因的改变诱导所述基因或基因产物(例如，蛋白质)的高表达。
11.如实施例7至10中任一项所述的方法，其中所述MYC基因或所述抗凋亡基因的改变是重排，例如易位。
12.如实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有所述MYC基因中的重排，例如易位，以及所述BCL2基因或所述BCL6基因中的一个或两个中的重排，例如易位。
13.如实施例1至12中任一项所述的方法，其中与参照例如健康受试者或未患有高级别淋巴瘤的受试者相比，所述受试者具有或被鉴定为具有增加的BCL2或BCL6基因或基因产物水平。
14.如实施例1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有增加的MYC基因或MYC基因产物水平，例如，增加的对MYC基因或MYC基因产物呈阳性的细胞的数量，例如，如通过使用FISH测定或免疫组织化学测定检测重排，例如易位而鉴定的。
15.如实施例14所述的方法，其中例如，通过检测来自所述受试者的样品例如肿瘤活检或血液样品中大于40％的细胞对MYC基因产物的表达呈阳性，例如，通过免疫组织化学测定的，所述受试者被鉴定为是MYC阳性的。
16.如实施例15所述的方法，其中所述MYC阳性受试者被进一步鉴定为具有增加的BCL2基因或基因产物和/或BCL6基因或基因产物水平，例如，如通过使用FISH测定或免疫组织化学测定检测样品例如肿瘤活检或血液样品中的重排，例如易位而鉴定的。
17.如实施例15-16中任一项所述的方法，其中具有增加的所述BCL2基因或基因产物水平或增加的所述BCL6基因或基因产物水平的所述MYC阳性受试者被鉴定为患有双打击(DH)淋巴瘤，例如MYC和BCL2或MYC和BCL6阳性淋巴瘤。
18.如实施例15至17中任一项所述的方法，其中具有增加的BCL2基因或基因产物水平和BCL6基因或基因产物水平的所述MYC阳性受试者被鉴定为患有三打击(TH)淋巴瘤，例如MYC、BCL2和BCL6阳性淋巴瘤。
19.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述淋巴瘤选自高级别B细胞淋巴瘤(例如，双或三打击淋巴瘤、或非特指型NOS高级别淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或滤泡性淋巴瘤。
20.如实施例19所述的方法，其中所述淋巴瘤是高级别B细胞淋巴瘤。
21.如实施例20所述的方法，其中所述高级别B细胞淋巴瘤是双打击淋巴瘤。
22.如实施例20所述的方法，其中所述高级别B细胞淋巴瘤是三打击淋巴瘤。
23.如实施例19所述的方法，其中淋巴瘤是DLBCL，例如，复发性或难治性DLBCL。
24.如实施例19或16所述的方法，其中所述DLBCL产生于包含生发中心B细胞(GCB细胞)、活化的B细胞(ABC细胞)或未分类细胞的细胞群。
25.如实施例24所述的方法，其中所述DLBCL产生于包含生发中心B细胞(GCB细胞)的细胞群。
26.如实施例19或23-25中任一项所述的方法，其中所述DLBCL是复发性或难治性DLBCL。
27.如实施例19所述的方法，其中所述淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤。
28.如实施例19或27所述的方法，其中所述滤泡性淋巴瘤是复发性或难治性FL。
29.如实施例19所述的方法，其中所述淋巴瘤是多发性骨髓瘤。
30.如实施例19或29所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤是复发性或难治性多发性骨髓瘤。
31.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或已经被鉴定为具有低水平的肿瘤浸润CD3+T细胞，例如小于或等于至少约0％-3％、0.5％-2.5％、1％-2％、1.5％-2.5％、2％-3％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％或0％ CD3+T细胞，例如，如例如通过使用荧光免疫组织化学测定在样品，例如肿瘤活检样品或血液样品中鉴定的。
32.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或已经被鉴定为具有增加的LAG3+CD3+T细胞数量，例如大于或等于至少约5％-30％、5％-20％、10％-25％、10％-20％、15％-20％、15％-25％、15％-30％、5％-15％、5％、10％、15％、20％、25％或30％ LAG3+CD3+T细胞，例如，如例如通过使用荧光免疫组织化学测定在样品，例如肿瘤活检样品或血液样品中鉴定的。
33.如实施例1至2或4至32中任一项所述的方法，其中所述受试者已经历、正在经历所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法，或将接受所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法。
34.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在用所述CAR疗法，例如所述CD19CAR疗法治疗后，所述受试者已经复发，或被鉴定为已经复发。
35.如前述实施例中任一项所述的方法，其中基于以下项中的一项或多项，所述受试者已经复发或被鉴定为已经复发：
(1)在完全应答后，骨髓受累，例如病变的再现；
(2)在完全应答后，恶性积液的再现；
(3)在完全应答后，通过CT扫描或MRI检测到大于1.5cm的结节性病变(例如，先前正常的***变得大于1.5cm)的再现；
(4)在完全应答后，通过CT扫描或MRI检测到离散的结外病变(包括肝脏或脾脏)的再现；或者
(5)残留***或肿块的大小，例如自所述***或肿块的基线的长轴增加≥50％。
36.如前述实施例中任一项所述的方法，其中并行或依序施用所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法和所述BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合。
37.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述CD19 CAR疗法之前、并行和/或之后，用所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂中的一种或多种治疗所述受试者。
38.如实施例1至37中任一项所述的方法，其中在所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法之前施用所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂、或其组合。
39.如实施例1至37中任一项所述的方法，其中在施用所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂、或其组合之前施用所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法。
40.如实施例38或39中任一项所述的方法，所述方法进一步包括施用一种或多种，例如，1、2、3、4、5、10、20、30或更多种后续剂量的所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂、或其组合。
41.如实施例1-38中任一项所述的方法，其中在施用所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂、或其组合后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天或28天施用所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法。
42.如实施例2-41中任一项所述的方法，其中响应于确定所述受试者已经对所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法复发，施用所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂、所述MYC抑制剂或其组合。
43.如实施例42所述的方法，所述方法进一步包括施用第二疗法，例如，B细胞抑制剂。
44.如实施例43所述的方法，其中所述第二疗法包含与B细胞抗原，例如CD19、CD22、CD20、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a抗原结合的第二CAR疗法。
45.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在接受所述CAR疗法，例如所述CD19CAR疗法或所述BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂中的一种或多种之前、期间或之后，评估所述受试者是否存在所述MYC基因或基因产物的改变，或所述抗凋亡基因或基因产物的改变，或其组合。
46.如实施例45所述的方法，其中在接受所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法之前评估所述受试者。
47.如实施例45所述的方法，其中在接受所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂、所述MYC抑制剂或其组合之前评估所述受试者。
48.如实施例45所述的方法，其中在接受所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法或所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂、所述MYC抑制剂或其组合中的一种或两种之前评估所述受试者。
49.如实施例45所述的方法，其中在接受所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法之后，但在开始施用所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂、所述MYC抑制剂或其组合之前，评估所述受试者。
50.如实施例1至44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在接受所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法或所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂中的一种或多种之前、期间或之后，评估所述受试者是否存在所述MYC基因或基因产物的改变，或所述抗凋亡基因或基因产物的改变，或其组合。
51.如实施例50所述的方法，其中在接受所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法或所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂中的一种或两种之前评估所述受试者。
52.如实施例51所述的方法，其中在接受所述CD19 CAR疗法之后，但在开始施用所述BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合中的一种或多种之前，评估所述受试者。
53.如实施例50至52中任一项所述的方法，其中所述评估发生在所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法之前、之后和/或期间的至少两个时间点。
54.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CAR疗法是CD19 CAR疗法，其中所述CD19 CAR疗法包含含有抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域的CD19CAR。
55.如实施例54所述的方法，其中所述CD19 CAR的抗CD19结合结构域包含表2或3中列出的任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个，以及表2或3中列出的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
56.如实施例54或55所述的方法，其中所述CD19 CAR的抗CD19结合结构域包含SEQID NO:1-12或SEQ ID NO:59的氨基酸序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
57.如实施例54或55所述的方法，其中所述抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:59的序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
58.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR包含SEQ ID NO:31-42、SEQ ID NO:5008或SEQ ID NO:58中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
59.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR包含SEQ ID NO:31-42或SEQ ID NO:58中任一个的氨基酸序列，其中所述CAR包含或不包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的前导序列。
60.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:58的氨基酸序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
61.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR疗法是包含CTL-019或CTL-119或两者的疗法。
62.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CAR是CD19CAR，例如，包含SEQID NO:5002、SEQ ID NO:5005、SEQ ID NO:5013或SEQ ID NO:5018的scFv氨基酸序列的CAR，或包含SEQ ID NO:5001、SEQ ID NO:5004、SEQ ID NO:5011或SEQ ID NO:5016的氨基酸序列的CAR。
63.如实施例62所述的方法，其中所述抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:5002、SEQ ID NO:5005、SEQ ID NO:5013或SEQ ID NO:5018的氨基酸序列。
64.如实施例62或63所述的方法，其中所述CD19 CAR包含具有SEQ ID NO:5001、SEQ ID NO:5004、SEQ ID NO:5011或SEQ ID NO:5016的氨基酸序列的多肽。
65.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CAR，例如所述CD19 CAR包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154。
66.如前述实施例中任一项所述的方法，所述抗原结合结构域通过铰链区连接至所述跨膜结构域，其中，任选地，所述铰链区包含SEQ ID NO:14或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
67.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域：
a.包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域；
b.包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含获得自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)；
c.包含含有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的氨基酸序列的共刺激结构域；
d.包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域；或者
e.包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
68.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述CAR进一步包含前导序列，其中，任选地，所述前导序列包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:5020。
69.如实施例68所述的方法，其中所述前导序列包含SEQ ID NO:13。
70.如实施例68所述的方法，其中所述前导序列包含SEQ ID NO:5020。
71.如前述实施例中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法。
72.如前述实施例中任一项所述的方法，其中经约15分钟至约45分钟的时间段静脉内施用所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法。
73.如前述实施例中任一项所述的方法，其中以至少约1-3x106至1-3x109个细胞的浓度施用所述CAR疗法，例如所述CD19 CAR疗法。
74.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述BCL2抑制剂选自维奈托克(ABT-199)、那维托克莱克斯(navitoclax)(ABT-263)、ABT-737、BP1002、SPC2996、APG-1252、奥巴克拉甲磺酸盐(obatoclax mesylate)(GX15-070MS)、PNT2258或奥利默森(oblimersen)(G3139)、或组合。
75.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述BCL2抑制剂是维奈托克。
76.如前述实施例中任一项所述的方法，其中以固定剂量施用所述BCL2抑制剂。
77.如实施例1至75中任一项所述的方法，其中以多剂量，例如爬坡周期施用所述BCL2抑制剂。
78.如实施例77所述的方法，其中所述BCL2抑制剂以爬坡周期施用例如，约5周，随后以固定剂量施用例如，约24个月。
79.如前述实施例中任一项所述的方法，其中以约10mg至约400mg，例如约10mg至约30mg、约40mg至约60mg、约80mg至约120mg、约150mg至约250mg或约350mg至约450mg的剂量施用所述BCL2抑制剂。
80.如实施例79所述的方法，其中以约20mg、100mg、约200mg或约400mg的剂量施用所述BCL2抑制剂。
81.如实施例77至80中任一项所述的方法，其中所述BCL2抑制剂(a)以约20mg的剂量每天一次施用例如，约1周，(b)以约50mg的剂量每天一次施用例如，约1周，(c)以约100mg的剂量每天一次施用例如，约1周，(d)以约200mg的剂量每天一次施用例如，约1周，(e)以约400mg的剂量每天一次施用例如，约1周，以及(f)以约400mg的固定剂量每天一次施用例如，约24个月。
82.如前述实施例中任一项所述的方法，其中每日施用所述BCL2抑制剂。
83.如前述实施例中任一项所述的方法，其中每天一次施用所述BCL2抑制剂。
84.如前述实施例中任一项所述的方法，其中施用所述BCL2抑制剂至少连续5-10天。
85.如前述实施例中任一项所述的方法，其中口服施用所述BCL2抑制剂。
86.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述BCL6抑制剂包含BI-3812、化合物79-6、或FX1。
87.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述MYC抑制剂包含MLN0128、9-ING-41、CUDC-907或Oncomyc。
88.如前述实施例中任一项所述的方法，所述方法进一步包括施用针对B细胞淋巴瘤，例如高级别B细胞淋巴瘤或DLBCL的标准护理，例如，CD20抑制剂、化学治疗剂和/或皮质类固醇。
89.如实施例88所述的方法，其中所述CD20抑制剂是抗CD20抗体。
90.如实施例89所述的方法，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗或奥比妥珠单抗。
91.如实施例88-55中任一项所述的方法，其中所述化学治疗剂是环磷酰胺、长春新碱和/或多柔比星。
92.如实施例88-56中任一项所述的方法，其中所述皮质类固醇是***。
93.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，例如人。
94.如前述实施例中任一项所述的方法，所述方法可以预防、延迟或减少所述高级别淋巴瘤的进展。
95.如前述实施例中任一项所述的方法，所述方法可以改善所述受试者的应答。
96.如前述实施例中任一项所述的方法，所述方法与单独用所述CAR疗法，例如CD19 CAR疗法相比，使得无病生存期增加。
97.如前述实施例中任一项所述的方法，所述方法与单独用所述CAR疗法，例如CD19 CAR疗法相比，使得无进展生存期增加。
98.一种组合，其包含结合B细胞抗原和BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种的CAR，例如，用于如前述实施例中任一项所述的方法使用。
99.一种CAR，其结合B细胞抗原，用于在如实施例1-97中任一项所述的方法中与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种组合使用。
100.BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种，其用于在如实施例1-97中任一项所述的方法中与结合B细胞抗原的CAR组合使用。
101.一种组合，其包含CD19 CAR疗法和BCL2抑制剂，例如，用于如实施例1-97中任一项所述的方法使用。
102.一种CD19 CAR疗法，其用于在如实施例1-97中任一项所述的方法中与BCL2抑制剂组合使用。
103.一种BCL2抑制剂，其用于在如实施例1-97中任一项所述的方法中与CD19 CAR组合使用。
104.一种组合，其包含所述CAR疗法，例如CD19 CAR疗法和所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂中的一种或多种，用于在如前述实施例中任一项所述的治疗所述淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤的方法中使用。
105.一种组合，其包含CD123 CAR疗法和BCL2抑制剂，例如，用于如实施例1-97中任一项所述的方法使用。
106.一种CD123 CAR疗法，其用于在如实施例1-97中任一项所述的方法中与BCL2抑制剂组合使用。
107.一种BCL2抑制剂，其用于在如实施例1-97中任一项所述的方法中与CD123CAR组合使用。
108.一种用于治疗患有或被鉴定为患有白血病，例如B细胞白血病的受试者的方法，其中所述方法包括：
向所述受试者施用包含表达与B细胞抗原，例如CD123 CAR结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群的疗法与BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种的组合，从而治疗所述受试者的白血病。
109.如实施例108所述的方法，其中所述B细胞抗原是CD123。
110.一种组合，其包含CAR疗法，例如CD123 CAR疗法和所述BCL2抑制剂、所述BCL6抑制剂或所述MYC抑制剂中的一种或多种，用于在治疗白血病，例如B细胞白血病的方法中使用。
111.如实施例110所述使用的组合，其中所述CAR疗法是CD123CAR疗法。
112.如实施例108-109所述的方法或如权利要求114-111所述使用的组合，其中所述白血病是急性髓性白血病(AML)。
113.如实施例108-109或112所述的方法或如权利要求110-111所述使用的组合，其中所述BCL-2抑制剂包含维奈托克。
附图说明
图1A-1B示出了复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者对CART19疗法的应答，该应答通过存在或不存在MYC表达以及MYC、BCL2和/或BCL6基因重排来分类以进一步识别双/三打击(DH/TH)淋巴瘤。图1A示出了PFS，并且图1B示出了分层为MYC(+)DH/TH、MYC(+)非DH/TH或MYC(-)的患者在CART19疗法后的OS。
图2A-2B示出了复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者对CART19疗法的应答，该应答通过存在或不存在MYC表达以及MYC、BCL2和/或BCL6基因重排来分类以进一步识别双/三打击(DH/TH)淋巴瘤。图2A示出了PFS，并且图2B示出了分层为MYC(+)DH/TH或MYC(-)非DH/TH的患者在CART19疗法后的OS。
图3A-3B示出了复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者对CART19疗法的应答持续时间(DOR)，该应答持续时间通过存在或不存在MYC表达以及MYC、BCL2和/或BCL6基因重排来分类以进一步识别双/三打击(DH/TH)淋巴瘤。图3A示出了分层为MYC(+)DH/TH、MYC(+)非DH/TH或MYC(-)的患者的DOR。图3B示出了分层为MYC(+)DH/TH或MYC(-)非DH/TH的患者的DOR。
图4A-4C示出了在基线肿瘤活检测试基线MYC表达的患者中，用CART19疗法治疗后的应答持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。图4A示出了与MYC(-)患者相比，MYC(+)患者缓解后几个月的应答持续时间。图4B示出了与MYC(-)患者相比，MYC(+)患者的PFS。图4C示出了与MYC(-)患者相比，MYC(+)患者的OS。
图5示出了复发性或难治性DLBCL和其他B细胞淋巴瘤亚群的患者对CART19疗法的最佳总体应答(BOR)，这些患者包括治疗后1个月对MYC呈阳性的患者、对MYC呈阴性的患者和/或对DH/TH淋巴瘤呈阳性的患者。
图6示出了复发性或难治性DLBCL和其他B细胞淋巴瘤亚群的患者对CART19疗法的应答，这些患者包括治疗后6个月对MYC呈阳性的患者、对MYC呈阴性的患者和/或对DH/TH淋巴瘤呈阳性的患者。
图7示出了CART19细胞对SuDHL6双打击淋巴瘤细胞的体外活性。CART19细胞导致小于50％的SuDHL6细胞杀伤，表明这些细胞似乎对CART19活性是难治的。
图8示出了CART19细胞与BCL2抑制剂的组合对SuDHL6双打击淋巴瘤细胞的体外活性。BCL2抑制剂改善了对SuDHL6双打击淋巴瘤细胞中CART19细胞的体外应答，并增加了肿瘤细胞杀伤。
图9示出了在植入了SuDHL6双打击淋巴瘤细胞的小鼠中植入后几天的肿瘤体积，这表明植入小鼠中的SuDHL6细胞可用作体内双打击淋巴瘤模型，用于研究对CART19组合疗法(例如本文所述的CART19组合疗法)的应答。
图10A-10C示出了在双打击淋巴瘤模型中CART19细胞与BCL2抑制剂的组合的体内活性。图10A示出了用PBS媒介物对照(左)或BCL2抑制剂(右)治疗后几天小鼠中的肿瘤体积。图10B示出了用未转导的CART对照细胞(UTD)(左)或未转导的CART对照细胞与BCL2抑制剂的组合(右)治疗后几天小鼠中的肿瘤体积。图10C示出了用CART19细胞(UTD)(左)或CART19细胞与BCL2抑制剂的组合(右)治疗后几天小鼠中的肿瘤体积。
图11A-11C示出了BCL2抑制剂对T细胞增殖和动力学的影响。治疗后每周对20μL的血液中的CD3+T细胞数量进行定量。图11A示出了用未转导的CART对照细胞(UTD)(左)或BCL2抑制剂(维奈托克)(右)治疗后的T细胞的数量。图11B示出了用单独的CART19细胞(左)或CART19细胞与BCL2抑制剂(维奈托克)的组合(右)治疗后的T细胞的数量。图11C示出并概述了图11A-11B中呈现的数据，描绘了所指示治疗组中每周每20μL的血液定量的T细胞的平均数量。
图13A-13C示出了用CART19疗法治疗后患者的应答持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，这些患者通过在基线肿瘤活检中测量的CD3阳性细胞百分比(％)(TIM3/LAG3测定)进行分层。图13A示出了具有≤3％ CD3+细胞的患者与具有>3％CD3+细胞的患者相比，缓解后几个月的应答持续时间。图13B示出了具有≤3％ CD3+细胞的患者与具有>3％ CD3+细胞的患者相比的PFS。图13C示出了具有≤3％ CD3+细胞的患者与具有>3％CD3+细胞的患者相比的OS。
图14示出了复发性或难治性DLBCL和其他B细胞淋巴瘤亚群的患者对CART19疗法的应答，这些患者包括治疗后3个月对MYC呈阳性的患者、对MYC呈阴性的患者和/或对DH/TH淋巴瘤呈阳性的患者。
图15A-15C示出了用CART19疗法治疗后患者的应答持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，这些患者通过在基线肿瘤活检中测量的LAG3阳性细胞、CD3阳性细胞百分比(％)(TIM3/LAG3测定)进行分层。图15A示出了具有≤20％ LAG3+CD3+细胞的患者与具有>20％ LAG3+CD3+细胞的患者相比，缓解后几个月的应答持续时间。图15B示出了具有≤20％ LAG3+CD3+细胞的患者与具有>20％ LAG3+CD3+细胞的患者相比的PFS。图15C示出了具有≤20％ LAG3+CD3+细胞的患者与具有>20％ LAG3+CD3+细胞的患者相比的OS。
图16示出了自体抗CD19 CAR-T细胞输注后JULIET试验的患者的无进展生存期概率(％)。
图17A-17B示出了在第3个月(图17A)和第9个月(图17B)的基线活检中髓源性抑制细胞(MDSC)的百分比。所有细胞中CD11b+HLADR(-)细胞(MDSC)的百分比显示在X轴上，所有细胞中CD11b+细胞(髓系)的百分比显示在Y轴上。
图18描绘了MYC状态和正常输注前LDH水平的生存树分析。显示了输注后几个月内MYC(-)和正常输注前LDH水平(左)、MYC(+)和正常输注前LDH水平(中)以及1-2xULN输注前LDH水平(右)的无进展生存期概率(％)。
图19示出了从应答开始到CD19 CAR-T输注的时间内的无事件概率(无复发)(％)。
图20示出了自CD19 CAR-T细胞输注以来患者随时间的生存概率(％)。
图21示出了患者输注后一天内每μL的CD19+B细胞(通过M3应答)。左图示出了患有CR/PR的受试者，右图示出了进展性疾病(PD)/稳定疾病(SD)或未知应答。
图22示出了CR/PR患者(左)和无应答者(右)中CD3+T细胞在第3个月应答时的百分比。
图23示出了CR/PR患者(左)和无应答者(右)中LAG3+CD3+T细胞在第3个月应答时的百分比。
图24示出了在第3个月经历CR、PR、PD或未知的患者中基因亚型与M3应答之间的相关性。左图是Chapuy DLBCL亚群，右图是Schmitz DLBCL亚群。BN2是指BCL6融合和NOTCH2突变，EZB是指EZH2突变和BCL2易位，N1是指NOTCH1突变，并且UNK是指未知。
具体实施方式
本文尤其描述了用于治疗患有或被鉴定为患有淋巴瘤，例如，B细胞淋巴瘤的受试者的方法，例如，其中所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性(例如，高级别B细胞淋巴瘤、DLBCL、多发性骨髓瘤或FL)，该方法包括向受试者施用包含表达与B细胞抗原(例如，CD19 CAR)结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群的疗法与BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种的组合，从而治疗该受试者的淋巴瘤。在一些实施例中，BCL2抑制剂是维奈托克。
不希望受理论的束缚，据信患有或被鉴定为患有淋巴瘤(包含增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性(例如，高级别淋巴瘤，例如双/三打击淋巴瘤))的受试者可能在对CAR19疗法的应答方面具有降低的应答和/或增加的复发。已显示Bcl-2抑制因子剥夺细胞的细胞凋亡，但不阻止免疫细胞介导的杀伤的细胞凋亡，这表明细胞凋亡诱导的不同机制(Vaux等人Int Immunol.[国际免疫学]1992；4(7):821-824)。不希望受理论的束缚，据信在一些实施例中，促进直接细胞凋亡的Bcl-2与靶向B细胞抗原的CAR疗法(例如CAR19疗法)的组合的抑制可以改善CAR疗法应答的功效和在患有例如高级别淋巴瘤(例如，双/三打击淋巴瘤)的受试者中应答的持久性。
本文还披露了用于治疗患有或被鉴定为患有淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤的受试者的方法，例如，其中所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性，该方法包括向该受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种，其中该受试者是或被鉴定为是与B细胞抗原结合的CAR疗法的无应答者、部分应答者或复发者。本文还披露了用于治疗或预防患有淋巴瘤(例如B细胞淋巴瘤)的受试者对表达结合B细胞抗原的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群发生复发的方法，该淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物的水平和/或活性，该方法包括向已经历、正在经历、或将接受CAR疗法的受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂、或其组合，从而治疗或预防对该CAR疗法的复发。本文所述的组合可以根据本文所述的剂量方案使用。如本文所述，还提供了包含上述组合的组合物和向选择的受试者施用所述组合的另外方法。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)所述冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施例中典型地是两种多肽，当在免疫效应细胞中时，它为该细胞提供针对靶细胞(典型地癌细胞)的特异性，并且提供细胞内信号生成。在一些实施例中，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该细胞质信号传导结构域包含衍生自如下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，该组多肽在同一多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施例中，该组多肽彼此不邻接，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，该组多肽包括二聚化开关，该二聚化开关在二聚化分子存在下可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，该CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一方面，细胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一个实施例中，细胞质信号传导结构域进一步包含如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个实施例中，共刺激分子是本文所述的共刺激分子，例如，4-1BB(即CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含共刺激分子的功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-端)处的任选前导序列。在一个实施例中，所述CAR在细胞外抗原结合结构域的N末端进一步包含前导序列，其中所述前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜的过程中从抗原结合结构域(例如，scFv)切割。
包含与特定肿瘤抗原X结合的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)的CAR(如本文描述的那些)也被称为XCAR或CARX。例如，包含与CD19结合的抗原结合结构域的CAR被称为CD19 CAR或CAR19。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过应答于这样的信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。
如本文所用，术语“抗体”是指源自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，所述至少一部分保留与抗原表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR、或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、细胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中所述轻链可变区和重链可变区例如通过合成接头(例如短柔性多肽接头)是连续连接的并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生它的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，所述scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的CAR的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等人,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]中,Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426中)。在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个实施例中，所述CAR包含含有scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗原结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
包含抗原结合结构域，例如抗体或其抗体片段的本发明的CAR的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,UsingAntibodies:A Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989,Antibodies:ALaboratory Manual[抗体：实验室手册]中,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426中)。在一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[具有免疫学重要性的蛋白序列]"，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)、或其组合。根据Kabat编号方案，在一些实施例中，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些实施例中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)、和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施例中，这些CDR对应于VH(例如，哺乳动物VH，例如，人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；以及VL(例如，哺乳动物VL，例如，人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达***表达的抗体。所述术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的激活或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫应答的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用
术语“异种的”是指衍生自不同物种的动物的任何材料。
“源自”(当所述术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本文所述CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文描述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或在CAR情况下的肿瘤抗原)的结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，如但不限于，通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以针对免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞激活的一个或多个细胞质信号传导序列。在一方面，信号是初级信号，该初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且导致了介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、共FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO:9的序列(突变型CD3ζ)，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是SEQ ID NO:10中提供的序列(野生型人CD3ζ)，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫***细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，该免疫***细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以产生促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的实例，例如，在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。在实施例中，所述细胞内信号传导结构域是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能的部分。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含源自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI以及CD66d、CD32、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或替代性地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为提供为GenBank登录号BAG36664.1、或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基的蛋白质，并且“ζ刺激结构域”或替代性地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链足以在功能上传输T细胞激活所必需的初始信号的细胞质结构域的氨基酸残基。在一方面，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或是其功能性直向同源物的来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:9的序列。在一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:10的序列。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”是指具有提供为GenBank登录号AAA62478.2，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基的氨基酸序列的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一方面，“4-1BB共刺激结构域”是提供为SEQ IDNO:7或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基的序列。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和骨髓衍生的吞噬细胞。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或抑制其生长或增殖的T细胞或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括分泌细胞因子)。
术语“耗减(deplete)”或“耗减(depleting)”在本文中可互换使用，是指在进行例如，选择步骤(例如，阴性选择)的过程之后，样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量的降低或减少。耗减可以是细胞、蛋白质或大分子的完全或部分耗减。在实施例中，耗减为与进行该过程之前样品中的细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比细胞、蛋白质或大分子的水平或量的降低或减少至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
术语“富集的(enriched)”或“富集(enrichment)”在本文中可互换使用，是指在进行例如，选择步骤(例如，阳性选择)的过程之后，样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量的上升。富集可以是细胞、蛋白质或大分子的完全或部分富集。在实施例中，富集为与参考样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，所述细胞、蛋白质或大分子的水平或量上升至少1％，例如，至少1％-200％，例如，至少1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-50％、50％-70％、70％-90％、90％-110％、110％-130％、130％-150％、150％-170％或170％-200％。在一些实施例中，富集为与参考样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，该细胞、蛋白质或大分子的水平或量上升至少5％，例如，至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％，22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，富集为与参考样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，所述细胞、蛋白质或大分子的水平或量上升至少1.1倍，例如，1.1-200倍，例如，1.1-10、10-20、20-30、30-50、50-70、70-90或90-100倍。在一些实施例中，所述参考样品可以是相同样品，例如，在进行所述过程之前的样品。在一些实施例中，所述相同样品是指随后对其进行富集的样品，例如，富集前的群，例如，起始群。在一些实施例中，所述参考样品可以是不同的样品，例如，不对其进行处理的样品。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物***中产生蛋白质，则所述基因、cDNA或RNA编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者所述基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码所述蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或***或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或***引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应当解释为还包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达***中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非***细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(OxfordBioMedica)的基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体***等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学现状],2:593-596,1992。
“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性键联。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们在相同的阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其DNA或RNA的组合，及其聚合物。术语“核酸”包括基因、cDNA或mRNA。在一个实施例中，所述核酸分子是合成的(例如，化学合成的)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确说明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子和细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质存在有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，所述序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，所述序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
如在scFv的上下文中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:5023)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，以及n＝10。在一个实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:106)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一个实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)的多个重复。WO 2012/138475中描述的接头也被包括在本发明的范围内，将该文献通过引用并入本文。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是已经在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，例如，mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施例中，该聚A为50个至5000个之间(SEQ ID NO:30)(例如，大于64个，例如，大于100个，例如，大于300个或400个)聚(A)序列可以经化学修饰或酶促修饰以调制mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。多聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在细胞质中发生。在转录已经终止后，通过与RNA聚合酶缔合的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。
单采术是从个体中抽取全血，分离成选定组分，然后将其余血液恢复至循环中的过程。通常，有两种分离血液组分的方法：离心法和非离心法。白细胞单采术可以主动选择和去除患者的白细胞。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善疾病或障碍(例如，增生性障碍)的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善疾病或障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，如本发明的CAR)引起。在特定实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善疾病或障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制疾病或障碍(例如，增生性障碍)的进展。在其他实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
如本文所用，术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病症态来获得治疗效果。
如本文所用，术语“预防”意指对疾病或疾病症态的预防或保护性治疗。
如本文所用，除非另外说明，术语“预防(prevent、preventing、prevention)”是指在受试者开始患该病症或病症的复发之前发生的作用。预防无需导致完全预防该病症；本术语涵盖部分预防或减轻病症或病症的症状，或降低病症发展的风险。
如本文所用，“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有病症后并且在所述病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，第一治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，治疗因组合施用而更有效。例如，第二治疗更有效，例如，与第一治疗不存在的情况下施用第二治疗所观察到的结果相比，使用较少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗使症状减少更大的程度，或对第一治疗观察到类似的情况。在一些实施例中，与一种治疗不存在的情况下递送另一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与所述障碍相关的有他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。在一个实施例中，表达CAR的细胞以本文所述的剂量和/或给药方案施用，并且BCL2抑制剂，或增强表达CD19 CAR的细胞的活性的药剂以本文所述的剂量和/或给药方案施用。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。在一个实施例中，受试者是患者。
如果受试者中的癌症参数(例如，血液学癌症，例如癌细胞生长、增殖和/或存活)被延缓或减少可检测的量，例如约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(如通过任何适当的量度，例如质量、细胞计数或体积所测定)，则受试者对治疗作出“应答”。在一个实例中，如果受试者经历的预期寿命比不施用治疗情况下的预期寿命延长约5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多，则受试者对治疗作出应答。在另一个实例中，如果受试者具有增加的无病生存期、总生存期或增加的进展时间(例如，无进展生存期)，则受试者对治疗作出应答。可以使用若干种方法来确定患者是否对治疗作出应答，包括例如NCCN肿瘤学临床实践指南(NCCN )提供的标准。例如，在DLBCL和FL的上下文中，完全应答或完全应答者可能涉及表8中完全代谢应答和完全放射学应答的标准中的一个或多个。部分应答者可能涉及表8中部分代谢应答和部分放射学应答的标准中的一个或多个。无应答者可以显示疾病进展，例如，表8中进展性代谢疾病或进展性疾病的标准中的一个或多个。
如本文所用，术语“复发”是指在初始应答期(例如，完全应答或部分应答)后癌症的再现。应答初始期可能涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。再现可能涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。例如，像在B细胞淋巴瘤(例如DLBCL或FL)的上下文中，再现可以包含例如骨髓受累(例如病变)的再现、恶性积液的再现、基线后CT扫描或MRI上在任何轴上测量的大于1.5cm的结节性病变大于(例如，先前正常的***在任何轴上变得大于1.5cm)的再现、基线后CT扫描或MRI上离散的结外病变(包括肝脏或脾脏)的再现、或任何残留***或肿块的测量值(例如自基线的长轴)增加≥50％。更通常地，在实施例中，应答(例如，完全应答或部分应答)可能涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在实施例中，初始应答期持续至少1、2、3、4、5、或6天；至少1、2、3、或4周；至少1、2、3、4、6、8、10、或12个月；或至少1、2、3、4、或5年。
如本文所用，“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
在一些实施例中，包括CD19抑制剂的疗法(例如CD19 CAR疗法)可以复发或是难治性的。复发或抗性可由CD19丧失(例如，抗原丧失突变)或降低CD19水平的其他CD19改变造成(例如，由CD19阴性克隆的克隆选择造成)。具有这样的CD19丧失或改变的癌症在本文中称为“CD19阴性癌症”或“CD19阴性复发癌症”。应当理解，CD19阴性癌症不需要100％丧失CD19，而是足以降低CD19疗法的有效性，从而使得癌症复发或变为难治性。在一些实施例中，CD19阴性癌症由CD19 CAR疗法产生。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与受试者的组织接触，而没有不适当的毒性、刺激、过敏应答等，并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。例如，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志](1977)66:1–19中详细地描述了药学上可接受的盐。
术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，所述术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性障碍抗原”或“与过度增殖性障碍相关的抗原”是指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在某些方面，所述肿瘤抗原衍生自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、***、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、***癌、卵巢癌、胰腺癌等)。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。
术语“特异性结合”是指识别样品中存在的同族结合配偶体蛋白并与其结合的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
范围：贯穿本披露，能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及所述范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
CAR疗法
本文所述的表达CAR的细胞可以包含本文所述的组合物中的一种或多种，例如跨膜结构域、细胞内信号传导结构域、共刺激结构域、前导序列或铰链。
在一方面，本发明涵盖包含编码CAR的转基因的重组核酸构建体。在一些实施例中，核酸分子包含编码选自SEQ ID NO:61-72中的一个或多个的抗CD19结合结构域的核酸序列，其中该序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并在相同的阅读框中。可用于CAR中的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ、CD28、4-1BB等的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
在一方面，本发明考虑了产生功能等价分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以修饰CAR中包含的抗原结合结构域(例如，scFv)的VH或VL，以保留抗原结合结构域(例如，scFv)的起始VH或VL框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明考虑了整个CAR构建体的修饰，例如，在CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以为了产生功能等价分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明考虑了CDR的修饰，例如，在CAR构建体的一个或多个CDR的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以为了产生功能等价分子。例如，相对于本文提供的CDR序列，CDR可以具有例如多达且包括1、2、3、4、5或6个改变(例如，取代)。
编码所希望分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中获得基因，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。可替代地，目的核酸可以合成产生，而不是克隆产生。
除其他方面外，本发明包括表达可以直接转导到细胞中的CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建体。
本发明还包括可以直接转导到细胞中的RNA构建体。产生用于转染的mRNA的方法涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、然后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸、和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:118)。这样产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。在一个实施例中，模板包含针对CAR的序列。在实施例中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导到T细胞中。
抗原结合结构域
在一方面，本发明的CAR包含靶标特异性结合元件，在其他方面称为抗原结合结构域。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。因此，可以充当本发明的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。抗原结合结构域可以结合B细胞抗原，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原。
在一方面，通过将特异性地结合所希望抗原的抗原结合结构域工程化到CAR中，可以将CAR介导的T细胞应答针对目的抗原。
抗原结合结构域(例如，结合B细胞抗原，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原的抗原结合结构域)可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、鼠抗体、人抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科动物衍生的纳米抗体的可变结构域(VHH))以及本领域已知的用作抗原结合结构域的替代支架(如重组纤连蛋白结构域)等。
在一些情况下，抗原结合结构域源自其中最终将使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域(例如，B细胞抗原，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原)包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，包括但不限于CDR接枝(参见例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101、和5,585,089，这些文献各自通过引用以其全文并入本文)、贴面或表面重修(参见例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS[美国国家科学院院刊],91:969-973，将该文献每一个通过引用以其整体并入本文)、链改组(参见例如，美国专利号5,565,332，将该文献通过引用以其整体并入本文)、和披露于例如以下中的技术：美国专利申请公开号US 2005/0042664，美国专利申请公开号US 2005/0048617，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，国际公开号WO 9317105，Tan等人,J.Immunol.[免疫学杂志],169:1119-25(2002)，Caldas等人,Protein Eng.[蛋白质工程],13(5):353-60(2000)，Morea等人,Methods[方法],20(3):267-79(2000),Baca等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],272(16):10678-84(1997),Roguska等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9(10):895-904(1996),Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(23增刊):5973s-5977s(1995),Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(8):1717-22(1995)，Sandhu J S,Gene[基因],150(2):409-10(1994)，以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],235(3):959-73(1994)，将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供者抗体的相应残基取代，以改变例如改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知的方法来鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合和序列比较而言重要的框架残基，以鉴定特定位置处的异常框架残基。(参见例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；以及Riechmann等人,1988,Nature[自然],332:323，将这些文献通过引用以其整体并入本文。)
人源化抗体或抗体片段具有保留于其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，这些残基典型地取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和框架区，其中构成框架的氨基酸残基完全或大部分衍生自人种系。用于将抗体或抗体片段人源化的多种技术在本领域中是熟知的，并且基本上可以按照Winter和同事的方法进行(Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然],332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536(1988))，所述方法是通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；以及美国专利号4,816,567、6,331,415、5,225,539、5,530,101、5,585,089、6,548,640，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在这样的人源化抗体和抗体片段中，实质上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。抗体和抗体片段的人源化也可以通过饰面或表面重修来实现(EP 592,106；EP519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS[美国国家科学院院刊],91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择是降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901(1987)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。另一种方法采用衍生自具有特定亚组轻链或重链的全部人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(参见例如Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2623(1993)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，重链可变区的框架区(例如全部四个框架区)衍生自VH4_4-59种系序列。在一个实施例中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如来自相应鼠序列(例如，SEQ ID NO:59)处的氨基酸的取代。在一个实施例中，轻链可变区的框架区(例如全部四个框架区)衍生自VK3_1.25种系序列。在一个实施例中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如来自相应鼠序列(例如，SEQ ID NO:59)处的氨基酸的取代。
在一些方面，包含抗体片段的本发明CAR组合物的部分是人源化的，但保留了对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一方面，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序可用于说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，使得实现所希望的抗体或抗体片段特征，如对靶抗原的增加的亲和力。通常，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可保留与原始抗体相似的抗原特异性，例如，保留结合人B细胞抗原(例如，CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原)的能力。在一些实施例中，人源化抗体或抗体片段可具有改善的与人B细胞抗原(例如，CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原)结合的亲和力和/或特异性。
在一方面，结合结构域(例如，结合B细胞抗原，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原的抗原结合结构域)是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一方面，结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合B细胞抗原/蛋白，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b或CD79a蛋白。在一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合B细胞蛋白，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715(将其通过引用并入本文)。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:18)。在一个实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:106)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:107)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在一些实施例中，可以例如通过保守取代修饰抗原结合结构域(例如，结合B细胞抗原，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原的抗原结合结构域)或其他部分或整个CAR的氨基酸序列，例如可以修饰本文所述的氨基酸序列。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下的同一性百分比是指两个或更多个相同的序列。当在比较窗口上(或使用以下序列比较算法之一或通过手动校准和目视检查测量的指定区域)进行比较和比对以获得最大对应性时，如果两个序列具有相同的指定百分比的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域，或者当未指定时，在整个序列中，60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，该同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或者在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行：例如，通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的同源比对算法；通过搜索Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法；通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星州麦迪逊市科学路575号(575Science Dr.,Madison,WI)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)；或通过手动比对和目视检查(参见例如，Brent等人,(2003)Current Protocolsin Molecular Biology[当代分子生物学实验指南])。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得。
也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17)的算法、使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已并入GCG软件包(在www.gcg.com可获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
在一方面，本发明考虑了产生功能等价分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以修饰CAR中包含的结合结构域(例如，结合B细胞抗原，例如CD19、CD22、CD20、CD123、BCMA、CD34、FLT-3、ROR1、CD179b和/或CD79a抗原的抗原结合结构域)(例如scFv)的VH或VL，以保留结合结构域(例如scFv)的起始VH或VL框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。在一个方面，可以修饰CAR中包含的CD19抗原结合结构域(例如，scFv)的VH或VL，以保留抗CD19抗原结合结构域(例如，scFv)的起始VH或VL框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明考虑了整个CAR构建体的修饰，例如，在CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以为了产生功能等价分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
CD19 CAR和结合结构域
本文提供了用于使用CD19嵌合抗原受体(CAR)治疗疾病如癌症的组合物和使用方法。这些方法尤其包括，将本文所述的CD19 CAR与另一种药剂如BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合进行组合施用。在一些实施例中，将CD19 CAR(例如，如本文所述的CD19CAR)与BCL2抑制剂(例如，如本文所述的BCL2抑制剂)组合施用。这些方法还包括，例如，施用本文所述的CD19 CAR以治疗淋巴瘤(如B细胞淋巴瘤，例如高级别B细胞淋巴瘤、DLBCL或FL)。
在一方面，本发明提供了多种嵌合抗原受体(CAR)，这些嵌合抗原受体包含经工程化以特异性结合CD19蛋白的抗体或抗体片段。在一方面，本发明提供了被工程化为表达CAR的细胞(例如T细胞)，其中CAR T细胞(“CART”)展现出抗癌特性。在一方面，用CAR转化细胞，并在细胞表面上表达CAR。在一些实施例中，细胞(例如，T细胞)用编码CAR的病毒载体转导。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些这样的实施例中，细胞可以稳定地表达CAR。在另一个实施例中，细胞(例如，T细胞)用编码CAR的核酸(例如，mRNA、cDNA、DNA)转染。在一些这样的实施例中，细胞可以瞬时表达CAR。
在一方面，CAR的抗CD19蛋白结合部分是scFv抗体片段。在一方面，这样的抗体片段具有功能性，因为它们保留等同的结合亲和力，例如，它们以与衍生出它们的IgG抗体相当的亲和力结合相同的抗原。在一方面，这样的抗体片段是功能性的，因为它们提供生物学应答，所述生物学应答可以包括但不限于免疫应答的激活、起源于其靶抗原的信号转导的抑制、激酶活性的抑制等，如熟练技术人员所理解的那样。在一方面，CAR的抗CD19抗原结合结构域是scFv抗体片段，所述scFv抗体片段与它所衍生的scFv的鼠序列相比是人源化的。在实施例中，人源化抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、09％或99％同一性的氨基酸序列。在一方面，亲本鼠scFv序列是PCT公开WO 2012/079000中提供的CAR19构建体，并且在本文中提供为SEQ ID NO:59。在一个实施例中，抗CD19结合结构域是WO2012/079000中描述的并在SEQ ID NO:59或与其具有至少95％，例如95％-99％同一性的序列中提供的scFv。在实施例中，抗CD19结合结构域是PCT公开WO2012/079000中提供的CAR构建体的一部分并且在本文中提供为SEQ ID NO:58或与其具有至少95％，例如95％-99％同一性的序列。在实施例中，抗CD19结合结构域包含至少一个(例如、2、3、4、5或6个)选自表4和/或表5的CDR。
在一些方面，将本发明的抗体并入到嵌合抗原受体(CAR)中。在一方面，CAR包含在PCT公开WO2012/079000中提供为SEQ ID NO:12，以及在本文中提供为SEQ ID NO:58的多肽序列，其中scFv结构域被选自SEQ ID NO:1-12的一个或多个序列取代。在一方面，SEQ IDNO:1-12的scFv结构域是SEQ ID NO:59的scFv结构域的人源化变体，其是与人CD19特异性结合的鼠来源的scFv片段。该小鼠scFv的人源化可能是临床环境所希望的，其中小鼠特异性残基可以在接受CART19治疗(例如用由CAR19构建体转导的T细胞进行的治疗)的患者中诱导人-抗小鼠抗原(HAMA)应答。
在一方面，本发明的CAR的抗CD19结合结构域(例如，人源化scFv)部分由转基因编码，该转基因的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一方面，本发明的整个CAR构建体由转基因编码，该转基因的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。这样的密码子简并性允许相同的多肽由各种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域中已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:1中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:2中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:3中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:4中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:5中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:6中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:7中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:8中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ IDNO:9中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:10中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:11中提供的scFv部分。在一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:12中提供的scFv部分。
在一方面，CAR19包含SEQ ID NO:5002中提供的scFv部分。在一方面，CAR19包含SEQ ID NO:5005中提供的scFv部分。在一方面，CAR19包含SEQ ID NO:5013中提供的scFv部分。在一方面，CAR19包含SEQ ID NO:5018中提供的scFv部分。
在一方面，本发明的CAR将特异性抗体的抗原结合结构域与细胞内信号传导分子组合。例如，在一些方面，细胞内信号传导分子包括但不限于CD3-ζ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。在一方面，CD19CAR包含选自SEQ ID NO:31-42、5001、5004、5008、5011或5016中的一个或多个中提供的序列的CAR。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:31中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:32中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQID NO:33中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:34中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:35中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:36中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:37中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQID NO:38中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:39中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:40中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:41中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:42中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQID NO:5001中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:5004中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:5008中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:5011中提供的序列。在一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:5016中提供的序列。
在一方面，CD19 CAR包含选自SEQ ID NO:31–42中的一个或多个中提供的序列的CAR，其中该CAR不包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的前导序列。
在一方面，CD19 CAR包含选自SEQ ID NO:5001或SEQ ID NO:5004中的一个或多个中提供的序列的CAR，其中该CAR不包含含有SEQ ID NO:5020的氨基酸序列的前导序列。
因此，在一方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域(例如包含一个或多个例如全部三个LC CDR以及一个或多个例如全部三个HC CDR的人源化抗CD19结合结构域)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，该人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，每个可变重链区包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化轻链可变区(例如在表2中)和/或本文所述的人源化重链可变区(例如在表2中)。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区(例如在表2中)，例如本文所述的至少两个人源化重链可变区(例如在表2中)。在一个实施例中，抗CD19结合结构域是scFv，该scFv包含表2的氨基酸序列的轻链和重链。在实施例中，抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，该轻链可变区包含具有表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，该重链可变区包含具有表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，编码人源化抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域是scFv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区(例如，在表2中)经由接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区(例如，在表2中)。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5、或6，例如是3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一方面，抗原结合结构域部分包含选自SEQ ID NO:1-12的一个或多个序列。在一方面，人源化CAR选自一个或多个序列，该一个或多个序列选自SEQ ID NO:31-42。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似度。
在一个实施例中，CAR分子包含抗CD19结合结构域，该抗CD19结合结构域包含本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，以及本文所述的抗CD19结合结构域(例如包含一个或多个例如全部三个LC CDR以及一个或多个例如全部三个HC CDR的抗CD19结合结构域)的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，抗CD19结合结构域包含本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，每个可变重链区包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。
在一方面，抗CD19结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一方面，包含抗原结合结构域的本发明CAR组合物的部分特异性地结合人CD19。在一方面，本发明涉及包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中该抗体结合结构域与CD19蛋白或其片段特异性结合，其中该抗体或抗体片段包含可变轻链和/或可变重链，该可变轻链和/或可变重链包括SEQ ID NO:1-12或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一方面，抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1-12或SEQ ID NO:59的scFv的氨基酸序列。在某些方面，scFv与前导序列邻接并在相同的阅读框中。在一方面，前导序列是提供为SEQ ID NO:13的多肽序列。在一些方面，scFv不包含前导序列，例如，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的前导序列。在一些方面，scFv不包含前导序列，例如，包含SEQ ID NO:5020的氨基酸序列的前导序列。
在一方面，包含抗原结合结构域的CAR的部分包含靶向CD19的抗原结合结构域。在一方面，抗原结合结构域靶向人CD19。在一方面，CAR的抗原结合结构域与描述于Nicholson等人,Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段具有相同或相似的结合特异性或包括该FMC63 scFv片段。在一方面，包含抗原结合结构域的CAR的部分包含靶向B细胞抗原(例如人B细胞抗原)的抗原结合结构域。CD19抗体分子可以是例如描述于WO2014/153270(通过引用以其全文并入本文)中的抗体分子(例如人源化抗CD19抗体分子)。WO 2014/153270还描述了测定各种CART构建体的结合和功效的方法。
在一个实施例中，抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠轻链可变区(例如在表3中)和/或本文所述的鼠重链可变区(例如在表3中)。在一个实施例中，抗CD19结合结构域是scFv，该scFv包含表3的氨基酸序列的鼠轻链和鼠重链。在实施例中，抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，该轻链可变区包含具有表3中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表3的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，该重链可变区包含具有表3中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表3的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:59的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，抗CD19结合结构域是scFv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区(例如，在表3中)经由接头(例如本文所述的接头)附接至包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区(例如，在表3中)。在一个实施例中，抗原结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5、或6，例如是3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
此外，本发明提供了(除其他方面外)CD19 CAR组合物，任选地与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合物组合，以及它们在治疗疾病、癌症或涉及表达CD19的细胞或组织的任何恶性肿瘤的药物或方法中的用途。
在一方面，本发明的CAR可用于根除表达CD19的正常细胞，从而适用于细胞移植前的细胞调理疗法。在一方面，表达CD19的正常细胞是表达CD19的正常干细胞，并且细胞移植是干细胞移植。
在一方面，本发明提供了被工程化为表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)，其中表达CAR的细胞例如CAR T细胞(“CART”)展现出抗癌特性。合适的抗原是CD19。在一方面，CAR的抗原结合结构域包含部分人源化抗CD19抗体片段。在一方面，CAR的抗原结合结构域包含含有scFv的部分人源化抗CD19抗体片段。因此，本发明提供了(除其他方面外)CD19-CAR，该CD19-CAR包含人源化抗CD19结合结构域并被工程化到免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)中，以及将它们用于过继疗法的方法。
在一方面，CAR(例如，CD19-CAR)包含选自下组的至少一个细胞内结构域：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任何组合。在一方面，CAR(例如，CD19-CAR)包含至少一个细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域来自除CD137(4-1BB)或CD28之外的一种或多种共刺激分子。
本发明涵盖但不限于包含编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中该CAR包含与CD19特异性结合的抗体或抗体片段，其中该抗体片段的序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并在相同的阅读框中。细胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链。共刺激信号传导结构域是指CAR的如下部分：该部分包括共刺激分子的细胞内结构域的至少一部分。在一个实施例中，抗原结合结构域是本文所述的鼠抗体或抗体片段。在一个实施例中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段。
在特定方面，本发明的CAR构建体包含选自由SEQ ID NO:1-12组成的组的scFv结构域或SEQ ID NO:59的scFV结构域，其中scFv前面可以是任选的前导序列(如SEQ ID NO:13中提供的)、并且后面是任选的铰链序列(如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49中提供的)、跨膜区(如SEQ ID NO:15中提供的)、包括SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的CD3ζ序列，其中这些结构域邻接并在相同的阅读框架中以形成单个融合蛋白。
本发明还包括(除其他方面外)编码选自由以下组成的组的scFv片段中的每一种的多肽的核苷酸序列：SEQ IS NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IS NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59。本发明还包括(除其他方面外)编码选自由以下组成的组的scFv片段中的每一种的多肽的核苷酸序列：SEQ ISNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IS NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59，以及SEQ ID NO:13-17的结构域中的每个，加上本发明的编码的CD19 CAR融合蛋白。
在一方面，示例性CD19 CAR构建体包含任选的前导序列、细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和细胞内刺激结构域。
在一方面，示例性CD19 CAR构建体包含任选的前导序列、细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和细胞内刺激结构域。在一些实施例中，含有本发明的人源化scFv结构域的特异性CD19 CAR构建体提供为SEQ ID NO:31-42，或含有鼠scFv结构域的提供为SEQ ID NO:59。
全长CAR序列也在本文中提供为SEQ ID NO:31-42和58，如表2和表3中所示。
示例性前导序列提供为SEQ ID NO:13。示例性铰链/间隔子序列提供为SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49。示例性跨膜结构域序列提供为SEQID NO:15。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列提供为SEQ ID NO:16。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列提供为SEQ ID NO:51。示例性CD3ζ结构域序列提供为SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43。这些序列可以例如与识别CD19的scFv组合使用。
本文提供了各种scFv片段和其他CAR组分的示例性序列。应注意，本文还提供了这些没有前导序列(例如，没有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或SEQ ID NO:54的核苷酸序列)的CAR组分(例如，SEQ ID NO:121的序列，或表2或3的序列)。
在实施例中，本文所述的CAR序列含有源自CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
在一方面，本发明涵盖重组核酸构建体，其包含编码CAR的核酸分子，其中该核酸分子包含编码例如本文所述的抗CD19结合结构域的核酸序列，该核酸序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并在相同的阅读框中。在一方面，抗CD19结合结构域选自SEQID NO:1-12和58中的一个或多个。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:61-72和97中的一个或多个中提供的序列的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:61的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:62的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:63的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:64的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:65的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:66的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ IDNO:67的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:68的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:69的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:70的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:71的核苷酸残基64至813编码。在一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:72的核苷酸残基64至813编码。
本文提供了CD19抑制剂和组合疗法。在一些实施例中，将CD19抑制剂(例如，细胞疗法或抗体)与另一种B细胞抑制剂(例如，CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、CD179b、CD79b、CD79a、FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)组合施用。CD19抑制剂包括但不限于表达CD19 CAR的细胞(例如CD19 CART细胞)、或抗CD19抗体(例如，抗CD19单或双特异性抗体)或其片段或缀合物。在实施例中，将CD19抑制剂与B细胞抑制剂(例如，本文所述的表达CAR的细胞)组合施用。
在一些实施例中，将CD19抑制剂(例如，本文所述的表达CD19 CAR的细胞)与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合进行组合施用。在一些实施例中，将CD19抑制剂(例如，本文所述的表达CD19CAR的细胞)与BCL2抑制剂(例如，本文所述的BCL2抑制剂)组合施用。在一些实施例中，BCL2抑制剂是维奈托克。在一些实施例中，将表达CD19 CAR的细胞与维奈托克组合施用。
本披露中描述了许多表达CD19 CAR的细胞。例如，在一些实施例中，CD19抑制剂包括表达抗CD19 CAR的细胞，例如CART，例如表达表2中所述的抗CD19 CAR构建体或由包含表2、4或5中所述的scFv、CDR或VH和VL链的CD19结合CAR编码的细胞。例如，表达抗CD19CAR的细胞，例如CART是通过将CD19-CAR(包含CD19结合结构域)工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)中而产生的，例如用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文还提供了将本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含来自本文(例如，表2、4或5中)列出抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自本文(例如，表2、4或5中)列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中，CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，该轻链可变区包含具有表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，该重链可变区包含具有表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在实施例中，CD19结合结构域包含表4或表5的一个或多个CDR(例如，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的每个)，或具有CDR中的一个或多个的一个、两个、三个、四个、五个或六个修饰(例如，取代)的CDR。
示例性抗CD19抗体或其片段或缀合物包括但不限于博纳吐单抗、SAR3419(赛诺菲公司(Sanofi))、MEDI-551(英商梅迪缪思有限公司(MedImmune LLC))、Combotox、DT2219ARL(共济会癌症中心(Masonic Cancer Center))、MOR-208(也称为XmAb-5574；莫弗西斯公司(MorphoSys))、XmAb-5871(森科公司(Xencor))、MDX-1342(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、SGN-CD19A(西雅图遗传学公司(Seattle Genetics))和AFM11(Affimed Therapeutics公司)。参见例如，Hammer.MAbs.[单克隆抗体]4.5(2012):571–77。博纳吐单抗是一种双特异性抗体，由两个scFv构成，一个与CD19结合，一个与CD3结合。博纳吐单抗指导T细胞攻击癌细胞。参见例如，Hammer等人；临床试验标识号NCT00274742和NCT01209286。MEDI-551是人源化抗CD19抗体，该抗体具有经工程化以具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的Fc。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT01957579。Combotox是与CD19和CD22结合的免疫毒素的混合物。免疫毒素由与去糖基化的蓖麻毒蛋白A链融合的scFv抗体片段组成。参见例如，Hammer等人；和Herrera等人J.Pediatr.Hematol.Oncol.[儿科血液学和肿瘤学杂志]31.12(2009):936-41；Schindler等人Br.J.Haematol.[英国血液学杂志]154.4(2011):471-6。DT2219ARL是靶向CD19和CD22的双特异性免疫毒素，包含两个scFv和截短的白喉毒素。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT00889408。SGN-CD19A是抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物由与合成的细胞毒性细胞杀伤剂单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)连接的抗CD19人源化单克隆抗体构成。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT01786096和NCT01786135。SAR3419是抗CD19抗体-药物缀合物(ADC)，该缀合物包含经由可切割接头与美登素衍生物缀合的抗CD19人源化单克隆抗体。参见例如，Younes等人J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]30.2(2012):2776-82；Hammer等人；临床试验标识号NCT00549185；和Blanc等人Clin Cancer Res.[临床癌症研究]2011；17:6448-58。XmAb-5871是Fc-工程化的人源化抗CD19抗体。参见例如，Hammer等人。MDX-1342是具有增强的ADCC的人Fc-工程化的抗CD19抗体。参见例如，Hammer等人。在实施例中，抗体分子是双特异性抗CD19和抗CD3分子。例如，AFM11是靶向CD19和CD3的双特异性抗体。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT02106091。在一些实施例中，本文所述的抗CD19抗体与例如以下的治疗剂缀合或以其他方式结合：化学治疗剂、肽疫苗(如描述于Izumoto等人2008J Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971中)、免疫抑制剂、或免疫清除剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、FK506、CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、或细胞因子)。
示例性抗CD19抗体分子(包括抗体或其片段或缀合物)可包括表2、4或5中描述的scFv、CDR或VH和VL链。在实施例中，CD19结合抗体分子包含：轻链可变区，该轻链可变区包含具有表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，该重链可变区包含具有表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在实施例中，CD19结合抗体分子包含表4或表5的一个或多个CDR(例如，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3中的每个)，或具有CDR中的一个或多个的一个、两个、三个、四个、五个或六个修饰(例如，取代)的CDR。抗体分子可以是例如分离的抗体分子。
在一个实施例中，针对CD19的抗原结合结构域是描述于本文表中的抗原结合结构域的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施例中，CD19抗原结合结构域可以来自任何CD19CAR，例如LG-740；美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；和16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther[第16届年会美国基因与细胞治疗学会](ASGCT)(5月15-18日,盐湖城)2013,摘要10，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有INN名称司利弗明(Tisagenlecleucel)。CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，该CTL019通过经由用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自灭活、复制缺陷型慢病毒(LV)载体转导进行稳定***来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。
在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有INN名称Axicabtageneciloleucel。在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有USAN名称brexucabtagene autoleucel。在一些实施例中，Axicabtagene ciloleucel还称为Axi-cel或KTE-C19。在一些实施例中，brexucabtagene autoleucel还称为KTE-X19或/>
在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有INN名称Lisocabtagenemaraleucel。在一些实施例中，Lisocabtagene maraleucel还称为JCAR017。
在一方面，本发明的CAR构建体的核酸序列选自SEQ ID NO:85-96、5000、5003、5007、5010或5015中的一个或多个。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:85。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:86。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ IDNO:5007。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:87。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:88。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:89。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:90。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:91。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:92。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:93。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:94。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:95。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:96。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:5000。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:5010。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:5003。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ IDNO:5015。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:97。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:98。在一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:99。
鼠抗CD19抗体的人源化
对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将该文献通过引用以其整体并入本文，包括实例1-5(第115-159页)，例如表3、4、和5(第125-147页)。
CAR构建体，例如CD19 CAR构建体
将描述于国际申请WO2014/153270中的CD19 CAR构建体中的某些序列在本文中复制。应当理解，本节中的序列也可以用于其他CAR(例如结合B细胞抗原的CAR)的上下文中。
人源化scFv片段的序列(SEQ ID NO:1-12)在下表2中提供。另外的scFv片段(SEQID NO:5002、5005、5013或5018)在下表2中提供。使用SEQ ID NO:1-12、5002、5005、5013或5018与下文所示的另外的序列SEQ ID NO:13-17和/或5020产生全长CAR构建体，以产生具有SEQ ID NO:31-42、5001、5004、5008、5011或5016的全长CAR构建体。
·前导序列(氨基酸序列)(SEQ ID NO:13)
·前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:54)
·前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:5019)
·前导序列(氨基酸序列)(SEQ ID NO:5020)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
·前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:5021)
·前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:5022)
·CD8铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:14)
·CD8铰链(核酸序列)(SEQ ID NO:55)
/>
·CD8跨膜(氨基酸序列)(SEQ ID NO:15)
·跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO:56)
·4-1BB细胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:16)
·4-1BB细胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:60)
·CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:17)
·CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:101)
·CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO:43)
·CD3ζ(核酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO:44)
/>
CD28结构域(氨基酸序列，SEQ ID NO:1317)
CD28结构域(核苷酸序列，SEQ ID NO:1318)
野生型ICOS结构域(氨基酸序列，SEQ ID NO:1319)
野生型ICOS结构域(核苷酸序列，SEQ ID NO:1320)
Y至F突变体ICOS结构域(氨基酸序列，SEQ ID NO:1321)
IgG4铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:102)
IgG4铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:103)
这些克隆均含有源自4-1BB的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
表2：CD19 CAR构建体
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
表3：鼠CD19 CAR构建体
/>
/>
/>
在一些实施例中，根据Kabat编号方案、Chothia编号方案、或其组合定义CDR。
对于scFv结构域的人源化CDR序列的序列，其重链可变结构域显示在表4中，并且其轻链可变结构域显示在表5中。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表4.重链可变结构域CDR
候选物 FW HCDR1 ID HCDR2 ID HCDR3 ID
鼠_CART19 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYNSALKS 20 HYYYGGSYAMDY 24
人源化_CART19a VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYSSSLKS 21 HYYYGGSYAMDY 24
人源化_CART19b VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYQSSLKS 22 HYYYGGSYAMDY 24
人源化_CART19c VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYNSSLKS 23 HYYYGGSYAMDY 24
表5.轻链可变结构域CDR
候选物 FW LCDR1 ID LCDR2 ID LCDR3 ID
鼠_CART19 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
人源化_CART19a VK3 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
人源化_CART19b VK3 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
人源化_CART19c VK3 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27
表9：指示Kabat和Chothia CDR的位置和序列的人源化CD19可变结构域的氨基酸序列。表9按出现的顺序分别叙述了SEQ ID NO 5024-5027。
然后将CAR scFv片段克隆到慢病毒载体中以在单个编码框架中产生全长CAR构建体，并使用EF1α启动子进行表达(SEQ ID NO:100)。
EF1α启动子
CD20 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD20 CAR的细胞(例如，表达与人CD20结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，所述表达CD20 CAR的细胞包含根据WO2016/164731和PCT/US 2017/055627(通过引用并入本文)的抗原结合结构域。示例性CD20结合序列或CD20 CAR序列披露于例如，PCT/US 2017/055627的表1-5中。在一些实施例中，CD20 CAR包含在PCT/US 2017/055627或WO 2016/164731中披露的CD20 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
CD22 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD22 CAR的细胞(例如，表达与人CD22结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，该表达CD22 CAR的细胞包含根据WO 2016/164731和PCT/US 2017/055627(通过引用并入本文)的抗原结合结构域。示例性CD22结合序列或CD22 CAR序列披露于，例如，WO2016/164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A和10B以及PCT/US2017/055627的表6-10中。在一些实施例中，CD22 CAR序列包含在PCT/US2017/055627或WO 2016/164731中披露的CD22 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
CD123 CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以与CD123特异性结合，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/130635中指定。在其他实施例中，表达CAR的细胞可以与CD123特异性结合，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/028896的表2、表6、和表9的CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO2016/028896中指定。
BCMA CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以与BCMA特异性结合，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014565的表1和表16的CAR分子(例如，BCMA-1至BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2或C13F12.1中的任一个)或抗原结合结构域。编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014565中指定。
其他示例性CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以结合B细胞抗原(例如，本文所述的B细胞抗原)。
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以与ROR1特异性结合。在一些实施例中，表达ROR1 CAR的细胞包含针对ROR1的抗原结合结构域，并且该抗原结合结构域是例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Hudecek等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US 20130101607。
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以与FLT3特异性结合。在一些实施例中，表达FLT3 CAR的细胞包含针对FLT3的抗原结合结构域，该抗原结合结构域是例如，WO2011076922、US 5777084、EP 0754230、US 20090297529中的抗体以及若干种商业目录抗体(R&D公司、电子生物科学公司(ebiosciences)、艾博抗公司(Abcam))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以与CD79a特异性结合。在一些实施例中，表达CD79a CAR的细胞包含针对CD79a的抗原结合结构域，该抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从艾博抗公司获得的抗体抗CD79a抗体[HM47/A9](ab3121)；可从细胞信号传导技术公司(Cell Signalling Technology)获得的抗体CD79A抗体号3351；或产生自兔的、可从西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)获得的抗体HPA017748-抗CD79A抗体。
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD79b。在一些实施例中，表达CD79b CAR的细胞包含针对CD79b的抗原结合结构域，该抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体维汀-珀拉妥珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79b)(描述于Dornan等人,“Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate,anti-CD79b-vc-MMAE,for the treatment of non-Hodgkin lymphoma[抗CD79b抗体-药物缀合物抗CD79b-vc-MMAE用于治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗潜力]”Blood.[血液]2009年9月24日；114(13):2721-9.doi:10.1182/blood-2009-02-205500.Epub 2009年7月24日中)，或双特异性抗体抗CD79b/CD3(描述于“4507Pre-Clinical Characterization of TCell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for BCell Malignancies[4507T细胞依赖性双特异性抗体抗CD79b/CD3的临床前表征作为B细胞恶性肿瘤的潜在疗法]”Abstracts of56th ASH[第56届ASH摘要]中)。
在一个实施例中，该抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
双特异性CAR
在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在实施例中，第一表位和第二表位重叠。在实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施例中，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异源二聚体抗体分子的方案在本领域中是已知的；这些方案包括但不限于：例如，“杵臼结构”途径，例如，在US 5731168中所述；静电导向Fc配对，如例如在WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中所述；链交换工程化结构域(SEED)异源二聚体形成，如例如在WO 07/110205中所述；Fab臂交换，如例如在WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双官能试剂，通过抗体交联以产生双特异性结构，如例如在US 4433059中所述；通过对两条重链之间的二硫键进行还原和氧化的循环，通过重组来自不同抗体的半抗体(重链-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇，如例如在US 4444878中所述；三功能抗体，例如通过巯基反应性基团交联的三个Fab'片段，如例如在US 5273743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C末端尾优选通过二硫键或胺反应性化学交联作用交联的scFv对，如例如在US5534254中所述；双功能抗体，例如具有不同结合特异性的Fab片段，这些Fab片段通过已经替代恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)二聚化，如例如在US 5582996中所述；如例如US 5591828中所述的双特异性和寡特异性单价和低价受体，例如通过一个抗体的CH1区与典型地具有相关轻链的另一个抗体的VH区之间的多肽间隔子连接的两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区；双特异性DNA-抗体缀合物，例如抗体或Fab片段通过DNA的双链段交联，如例如在US 5635602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US 5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有Ig重链可变区结合区的第一结构域和Ig轻链可变区结合区的第二结构域的多肽二聚体，通常称为双体抗体(也涵盖更高级结构，产生双特异性、三特异性或四特异性分子)，如例如在US 5837242中所述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔子连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US 5837821所述；用短肽接头(例如5或10个氨基酸)连接的或在任一取向上完全没有接头连接的VH和VL结构域，这些VH和VL结构域可以形成二聚体以形成双特异性双体抗体；三聚体和四聚体，如例如在US 5844094中所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过肽键与C末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；以及具有经肽接头连接的VH和VL结构域两者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双体抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5869620中所述。另外的示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法见于例如US 5910573、US 5932448、US5959083、US 5989830、US 6005079、US 6239259、US 6294353、US 6333396、US 6476198、US6511663、US 6670453、US 6743896、US 6809185、US 6833441、US 7129330、US 7183076、US7521056、US 7527787、US 7534866、US 7612181、US 2002004587 A1、US 2002076406A1、US2002103345A1、US 2003207346A1、US 2003211078A1、US 2004219643 A1、US 2004220388A1、US 2004242847A1、US 2005003403 A1、US 2005004352 A1、US 2005069552 A1、US2005079170A1、US 2005100543 A1、US 2005136049 A1、US 2005136051A1、US 2005163782A1、US 2005266425 A1、US 2006083747 A1、US 2006120960A1、US 2006204493 A1、US2006263367 A1、US 2007004909A1、US 2007087381 A1、US 2007128150 A1、US 2007141049A1、US 2007154901A1、US 2007274985 A1、US 2008050370 A1、US 2008069820A1、US2008152645 A1、US 2008171855 A1、US 2008241884 A1、US 2008254512A1、US 2008260738A1、US 2009130106 A1、US 2009148905A1、US 2009155275 A1、US 2009162359 A1、US2009162360 A1、US 2009175851A1、US 2009175867 A1、US 2009232811 A1、US2009234105A1、US 2009263392 A1、US 2009274649 A1、EP 346087A2、WO 0006605A2、WO02072635 A2、WO 04081051 A1、WO 06020258 A2、WO 2007044887A2、WO 2007095338 A2、WO2007137760 A2、WO 2008119353A1、WO 2009021754 A2、WO 2009068630 A1、WO 9103493A1、WO 9323537 A1、WO 9409131 A1、WO 9412625 A2、WO 9509917 A1、WO 9637621A2、WO9964460 A1中。上述引用的申请的内容通过引用以其全文并入本文。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL1)上游布置有其VH(VH1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH2)上游布置有其VL(VL2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH1)上游布置有其VL(VL1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL2)上游布置有其VH(VH2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，如果构建体被布置为VH1-VL1-VL2-VH2则接头设置在两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间，例如VL1与VL2之间，如果构建体被布置为VL1-VH1-VH2-VL2则接头设置在VH1与VH2之间。接头可以是如本文所述的接头，例如，(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5、或6，优选4(SEQID NO:1264)。一般来说，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头设置在第一scFv的VL与VH之间。任选地，接头设置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中，接头中的任何两个或更多个可以相同或不同。因此，在一些实施例中，双特异性CAR在如本文描述的布置中包含VL、VH、和任选一个或多个接头。
稳定性和突变
可以参考常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理学性质(例如，热稳定性)来评估如本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv分子(例如，可溶性scFv))的稳定性。在一个实施例中，在所述测定中，人源化scFv具有比对照结合分子(例如常规scFv分子)高大于约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10摄氏度、约11摄氏度、约12摄氏度、约13摄氏度、约14摄氏度或约15摄氏度的热稳定性。
随后将本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)的改善的热稳定性赋予整个CAR构建体，从而改善CAR构建体的治疗特性。与常规抗体相比，本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)的热稳定性可以提高至少约2℃或3℃。在一个实施例中，与常规抗体相比，本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)具有1℃提高的热稳定性。在另一个实施例中，与常规抗体相比，本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)具有2℃提高的热稳定性。在另一个实施例中，与常规抗体相比，scFv具有4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃提高的热稳定性。可以例如在本文披露的scFv分子以及scFv VH和VL来源的scFv分子或抗体的Fab片段之间进行比较。可以使用本领域已知的方法测量热稳定性。例如，在一个实施例中，可以测量Tm。用于测量Tm的方法和测定蛋白质稳定性的其他方法在下文更详细地描述。
scFv中的突变(通过可溶性scFv的人源化或直接诱变来产生)可改变scFv的稳定性并且提高scFv和CAR构建体的总体稳定性。使用如Tm、温度变性和温度聚集的测量将人源化scFv与鼠scFv的稳定性进行比较。
突变scFv的结合能力可以使用本领域已知的和本文所述的测定法来确定。
在一个实施例中，本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)包含产生自人源化过程的至少一个突变，以使得突变的scFv赋予CAR构建体改善的稳定性。在另一个实施例中，本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)包含来自人源化过程的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个突变，以使得突变的scFv赋予CAR构建体改善的稳定性。
评价蛋白质稳定性的方法
可以使用例如下述方法评估抗原结合结构域的稳定性。这样的方法允许测定多个热解折叠过渡，其中最不稳定的结构域首先解折叠或限制协同解折叠的多结构域单元(例如，表现出单个解折叠过渡的多结构域蛋白质)的总体稳定性阈值。可以通过许多其他方式鉴定最不稳定的结构域。可以进行诱变以探测哪个结构域限制了整体稳定性。另外，多结构域蛋白的蛋白酶抗性可以在其中已知最不稳定的结构域固有地解折叠的条件下通过DSC或其他光谱方法进行(Fontana等人,(1997)Fold.Des.[折叠设计],2:R17-26；Dimasi等人,(2009)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]393:672-692)。一旦鉴定出最不稳定的结构域，可以将编码该结构域(或其部分)的序列用作方法中的测试序列。用于评估抗原结合结构域的稳定性(例如热稳定性、聚集倾向(聚集％)和结合亲和力)的示例性方法描述于国际公开号WO2019/210153中，该专利的内容通过引用并入本文。
在一方面，CAR的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且抗原结合结构域保留了本文所述的抗原结合结构域的所需功能特性。
在一个特定方面，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在另一方面，抗体片段包含scFv。
在各个方面，CAR的抗原结合结构域是通过以下方式被工程化：对在一个或两个可变区(例如，VH和/或VL)内，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸进行修饰。在一个特定方面，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在另一方面，抗体片段包含scFv。
本领域普通技术人员将理解，可以进一步修饰本发明的抗体或抗体片段，使得它们在氨基酸序列(例如，来自野生型)方面改变，但所希望的活性不变。例如，可以对蛋白质进行另外的核苷酸取代(导致在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代)。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施例中，一串氨基酸可被一串结构相似的、在侧链家族成员的顺序和/或组成方面不同的氨基酸替代，例如可以产生保守置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。
本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下的同一性百分比是指两个或更多个相同的序列。当在比较窗口上(或使用以下序列比较算法之一或通过手动校准和目视检查测量的指定区域)进行比较和比对以获得最大对应性时，如果两个序列具有相同的指定百分比的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域，或者当未指定时，在整个序列中，60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行：例如，通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的同源比对算法；通过搜索Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法；通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星州麦迪逊市科学路575号(575Science Dr.,Madison,WI)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)；或通过手动比对和目视检查(参见例如，Brent等人,(2003)Current Protocolsin Molecular Biology[当代分子生物学实验指南])。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得。
也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17)的算法、使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已并入GCG软件包(在www.gcg.com可获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
在一方面，本发明考虑了产生功能等价分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以修饰CAR中包含的本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)的VH或VL，以保留本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)的起始VH或VL框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明考虑了整个CAR构建体的修饰，例如，在CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以为了产生功能等价分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
嵌合TCR
在一方面，本文披露的抗体和抗体片段可以接枝到T细胞受体(“TCR”)链(例如，TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生与癌症相关抗原特异性结合的嵌合TCR。不受理论的束缚，据信嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，如本文披露的scFv可以接枝到TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域(例如，细胞外恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域的至少一部分)。作为另一个实例，抗体片段(例如，本文所述的VL结构域)可以接枝到TCRα链的恒定结构域，并且抗体片段(例如，本文所述的VH结构域)可以接枝到TCRβ链的恒定结构域(或可替代地，VL结构域可以接枝到TCRβ链的恒定结构域，VH结构域可以接枝到TCRα链)。作为另一个实例，抗体或抗体片段的CDR，例如本文的表中的任一个所述的抗体或抗体片段的CDR可以接枝到TCRα和/或β链，以产生与癌症相关抗原特异性结合的嵌合TCR。例如，本文披露的LC CDR可以接枝到TCRα链的可变结构域中，并且本文披露的HC CDR可以接枝到TCRβ链的可变结构域，或反之亦然。这样的嵌合TCR可以通过任何合适方法来产生(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy[基因疗法]2000；7:1369-1377；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]2004；11:487–496；Aggen等人,GeneTher.[基因疗法]2012年4月；19(4):365-74)。
用于抗原结合结构域的接头
发现在抗原结合结构域的可变结构域(例如，VH与VL)之间包含短接头或不包含接头的CAR分子显示出等于或大于更长形式的接头的活性。例如，在一些实施例中，与CD22-65(具有(Gly4-Ser)n接头，其中n是3(SEQ ID NO:28))相比，CD22-65s(具有(Gly4-Ser)n接头，其中n是1(SEQ ID NO:5037))在肿瘤模型中显示出相当或更大的活性和/或功效。因此，本文所述的抗原结合结构域或CAR分子中的任一种可以具有不同长度的连接抗原结合结构域的可变结构域的接头，包括例如约3至6个氨基酸、4至5个氨基酸、或约5个氨基酸的短接头。在一些实施例中，可以使用更长的接头，例如，约6至35个氨基酸，例如8至32个氨基酸、10至30个氨基酸、10至20个氨基酸。例如，可以使用(Gly4-Ser)n接头，其中n是0、1、2、3、4、5、或6(SEQ ID NO:5036)。在一个实施例中，可变结构域未经由接头(例如(Gly4-Ser)n接头，n＝0(披露为SEQ ID NO:18的“Gly4-Ser”))连接。在一些实施例中，可变结构域经由短接头(例如(Gly4-Ser)n接头，n＝1(SEQ ID NO:5037))连接。在一些实施例中，可变结构域经由(Gly4-Ser)n接头，n＝2(SEQ ID NO:49)连接。在一些实施例中，可变结构域经由(Gly4-Ser)n接头，n＝3(SEQ ID NO:28)连接。在一些实施例中，可变结构域经由(Gly4-Ser)n接头，n＝4(SEQ ID NO:106)连接。在一些实施例中，可变结构域经由(Gly4-Ser)n接头，n＝5(SEQ ID NO:5034)连接。在一些实施例中，可变结构域经由(Gly4-Ser)n接头，n＝6(SEQ ID NO:5035)连接。可变结构域(例如，其中VL和VH结构域出现在抗原结合结构域，例如scFv中)的顺序可以改变(即，VL-VH或VH-VL取向)。在一个实施例中，抗原结合结构域与CD20结合，例如如本文所述的CD20抗原结合结构域。在另一个实施例中，抗原结合结构域与CD22结合，例如如本文所述的CD22抗原结合结构域。在另一个实施例中，抗原结合结构域与CD19结合，例如如本文所述的CD19抗原结合结构域。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以设计为包含附接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜衍生的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，该细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白衍生的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，该细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)。在一方面，跨膜结构域是与CAR的其他结构域之一相关的结构域，例如，在一个实施例中，跨膜结构域可以来自衍生出信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域的相同蛋白质。在另一方面，跨膜结构域不衍生自衍生出CAR的任何其他结构域的相同蛋白质。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸取代修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在一个不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，所述结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下的一个或多个跨膜区：例如T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括以下的一个或多个跨膜区：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如，CAR的抗原结合结构域)。例如，在一个实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一个实施例中，铰链或间隔子包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列(例如由其组成)。在一方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一方面，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一个实施例中，铰链或间隔子包含氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:45)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:46)的核苷酸序列编码的铰链。
在一方面，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一个实例中，铰链或间隔子包含氨基酸序列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:47)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:48)的核苷酸序列编码的铰链。
在一方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与细胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一个方面，接头包含GGGGSGGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)。在一些实施例中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:50)的核苷酸序列编码。
在一方面，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。
用于在本发明的CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能性能力的重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞活化是由两种不同类别的细胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
含有在本发明中特别使用的初级细胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括以下的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12和CD66d。在一个实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。
在一个实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在本发明中特别有用的含有初级细胞内信号传导结构域的分子的另外实例包括DAP10、DAP12、和CD32的那些。
共刺激信号传导结构域
CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者它可以与在本发明的CAR的背景中使用的任何其他所希望的细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。在一个实施例中，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一方面，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激分子可以是除了抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，包含淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。这样的共刺激分子的其他实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和与CD83特异性结合的配体。
本发明的CAR的细胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个氨基酸之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸))可以形成细胞内信号传导序列之间的键联。在一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一个实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在实施例中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如，本文描述的接头分子)分开。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:16的信号传导结构域。在一方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:17的信号传导结构域。
在一方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一方面，CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列。在一方面，CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCC GCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCA GCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:52)的核酸序列编码。
天然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在实施例中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任一以下天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或细胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公开号WO2014/145252中，该专利的内容通过引用并入本文。
可调节的嵌合抗原受体
在一些实施例中，希望CAR活性可控制的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和功效。可以通过多种方式调节CAR活性。例如，使用例如与二聚化结构域融合的半胱天冬酶诱导的细胞凋亡(参见例如，Di等人,N Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011年11月3日；365(18):1673-1683)可用作本发明的CAR疗法中的安全开关。在一个实施例中，本发明的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)进一步包含诱导型细胞凋亡开关，其中将人半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)或修饰形式与允许条件二聚化的修饰的人FKB蛋白融合。在小分子，如雷帕霉素类似物(rapalog)(例如，AP 1903、AP20187))存在下，诱导型半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)被激活并导致本发明的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的快速凋亡和死亡。基于半胱天冬酶的诱导型细胞凋亡开关(或这样的开关的一个或多个方面)的实例已描述于，例如，US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO 1997031899；WO2014151960；WO 2014164348；WO 2014197638；WO 2014197638中，所有这些文献通过引用并入本文。
在另一个实例中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚物药物(例如利米度塞(rimiducid)(也称为AP1903(Bellicum制药公司(Bellicum Pharmaceuticals))或AP20187(阿瑞雅德公司(Ariad))时导致激活细胞的半胱天冬酶-9和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有二聚化化学诱导物(CID)结合结构域，其在存在CID的情况下介导二聚化。这导致表达CAR的细胞的诱导性和选择性耗减。在一些情况下，iCaspase-9分子由与一种或多种CAR编码载体分开的核酸分子编码。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。iCaspase-9可以提供安全性开关，以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如，Song等人Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]2008；15(10):667-75；临床试验标识号NCT02107963；和Di Stasi等人N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的可替代策略包括利用使CAR活性失活或关闭的小分子或抗体，例如，通过使表达CAR的细胞缺失，例如，通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。这样的受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如，整联蛋白αvβ3、α4、αI3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位但缺少在细胞质结构域内的一个或多个区的形式)。
例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺乏信号传导能力但保留被能够诱导ADCC的分子识别的表位，例如，西妥昔单抗使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后耗减表达CAR的细胞(参见例如，WO 2011/056894，和Jonnalagadda等人,Gene Ther.[基因疗法]2013；20(8)853-860)。另一种策略包括表达高度紧密的标志物/***基因，该基因将来自本文所述的表达CAR的细胞中的CD32和CD20抗原的靶表位组合，这些抗原结合利妥昔单抗，这导致表达CAR的细胞的选择性耗减，例如通过ADCC(参见例如，Philip等人,Blood.[血液]2014；124(8)1277-1287)。用于耗减本文所述的表达CAR的细胞的其他方法包括施用CAMPATH(选择性结合和靶向成熟淋巴细胞(例如，表达CAR的细胞)的单克隆抗CD52抗体)以便例如通过诱导ADCC进行破坏。在其他实施例中，可以使用CAR配体(例如抗独特型抗体)选择性地靶向表达CAR的细胞。在一些实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如，ADCC或ADC活性，从而减少表达CAR的细胞的数量。在其他实施例中，CAR配体(例如抗独特型抗体)可以与诱导细胞杀伤的药剂(例如毒素)偶联，从而减少表达CAR的细胞的数量。可替代地，CAR分子本身可以被配制成使得活性可以被调节，例如打开和关闭，如下所述。
在其他实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达由T细胞耗减剂识别的靶蛋白。在一个实施例中，靶蛋白是CD20，并且T细胞耗减剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这样的实施例中，一旦需要减少或消除表达CAR的细胞，就施用T细胞耗减剂，例如以减轻CAR诱导的毒性。在其他实施例中，T细胞耗减剂是抗CD52抗体，例如阿仑妥珠单抗(alemtuzumab)。
在一个方面，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施例中典型地为两个，其中本文所述的标准CAR的组分，例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域，被分配在分开的多肽或成员上。在一些实施例中，该组多肽包括二聚化开关，该二聚化开关在二聚化分子存在下可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，本发明的CAR利用二聚化开关，如例如，WO2014127261中所述的那些，该文献通过引用并入本文。本文和国际公开号WO 2015/090229中提供了这样的可调节性CAR的另外的描述和示例性构型，将该文献通过引用以其整体特此并入。
在一些实施例中，RCAR涉及开关结构域，例如，FKBP开关结构域(如SEQ ID NO:122所示)，或包含具有与FRB结合的能力的FKBP的片段(例如，如SEQ ID NO:123所示)。在一些实施例中，RCAR涉及开关结构域，该开关结构域包含FRB序列(例如，如SEQ ID NO:124所示)或突变体FRB序列(例如，如以下中的任一个所示：SEQ ID No.125-130、D V P D Y A S L GG P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y(SEQ ID NO:122)
表1.对二聚化分子具有增加的亲和力的示例性突变体FRB。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法更详细地描述于公开WO2014/055442和WO2014/055657中。简言之，分离的CAR***包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当所述细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当所述细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，所述表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全活化。
RNA转染
本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括(除其他方面外)可以直接转导到细胞中的编码RNA构建体的CAR。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、然后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸、和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:118)。这样产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。在一方面，模板包括CAR的序列。
在一方面，CAR由信使RNA(mRNA)编码。在一方面，将编码CAR的mRNA引入到免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞中，以产生表达CAR的细胞，例如CART细胞或CAR NK细胞。
产生体外转录的RNA CAR的方法描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第192-196页，该文献通过引用并入本文。
非病毒递送方法
在一些方面，可以使用非病毒方法将编码本文所述CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身***基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝***基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并***基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。
核酸递送***的示例性方法及其使用方法描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第196-198页，该文献通过引用并入本文。
编码CAR的核酸构建体
本发明还提供了编码本文所述的一种或多种CAR构建体(例如，CD19 CAR)的核酸分子。在一方面，核酸分子提供为信使RNA转录物。在一方面，核酸分子提供为DNA构建体。
因此，在一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中该CAR包含结合结构域(例如，结合B细胞抗原，例如CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a的结合结构域)、跨膜结构域和包含刺激结构域(例如，共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链)的细胞内信号传导结构域。
在一个实施例中，结合结构域是本文所述的抗CD19结合结构域(例如抗CD19结合结构域)，该抗CD19结合结构域包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59，或其具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，核酸包含编码CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a的核酸。
在一个实施例中，跨膜结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154。在一个实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，抗CD19结合结构域通过铰链区(例如本文所述的铰链)连接至跨膜结构域。在一个实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:14或SEQID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施例中，共刺激结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)。在一个实施例中，共刺激结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。在一个实施例中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16或SEQID NO:51的序列或与其具有95％-99％同一性的序列，和SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列或与其具有95％-99％同一性的序列，其中构成细胞内信号传导结构域的序列在相同的框中并且作为单个多肽链表达。
在另一方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，该CAR构建体包含SEQID NO:13的前导序列；具有选自由以下组成的组的序列(或与其具有95％-99％同一性的序的scFv结构域：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49(或与其具有95％-99％同一性的序列)的铰链区；具有SEQ ID NO:15的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的跨膜结构域；具有SEQ ID NO:16的序列的4-1BB共刺激结构域、或具有SEQ ID NO:51的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域；和具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
在另一个方面，本发明涉及由核酸分子编码的分离的多肽分子。在一个实施例中，分离的多肽分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:59，或与其具有95％-99％同一性的序列。
在另一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)分子的核酸分子，该嵌合抗原受体分子包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域、和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合结构域包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59，或与其具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，编码的CAR分子(例如，CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD34CAR、CD123 CAR、BCMA CAR、FLT-3CAR、ROR1CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR)进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施例中，共刺激结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。在一个实施例中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施例中，跨膜结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154。在一个实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和SEQ ID NO:17的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在相同的框中并且作为单个多肽链表达。在一个实施例中，抗CD19结合结构域通过铰链区连接至跨膜结构域。在一个实施例中，铰链区包含SEQ IDNO:14。在一个实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49。
在另一方面，本发明涉及编码的CAR分子，该编码的CAR分子包含SEQ ID NO:13的前导序列；具有选自由以下组成的组的序列(或与其具有95％-99％同一性的序的scFv结构域：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49的铰链区；具有SEQ ID NO:15的序列的跨膜结构域；具有SEQ ID NO:16的序列的4-1BB共刺激结构域、或具有SEQ ID NO:51的序列的CD27共刺激结构域；和具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列的CD3ζ刺激结构域。在一个实施例中，编码的CAR分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42和SEQ ID NO:59，或与其具有95％-99％同一性的序列。
编码所希望分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中获得基因，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。替代性地，目的基因可以合成产生，而不是克隆。
本发明还提供了其中***本发明的DNA的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的另外优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复(LTR)序列、和目的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如TobiasMaetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011Jun；3(6):677-713中。
在另一个实施例中，包含编码本发明所希望CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，可以使用转座子(如睡美人***(sleeping beauty))、crispr、CAS9、和锌指核酸酶来完成编码CAR的核酸的表达。参见下文June等人2009Nature ReviewsImmunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，将其通过引用并入本文。
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志物)。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入到表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。
在一些方面，使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,399,346、5,580,859、5,589,466，这些专利通过引用以其全文并入本文。在另一个实施例中，本发明提供了基因疗法载体。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的***用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送***提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因***到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒***在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在实施例中，启动子是PGK启动子，例如如本文所述的截短的PGK启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已经显示出有效地驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)。在一方面，EF1a启动子包含提供为SEQ ID NO:100的序列。
启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够当需要该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如，当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如，1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能包含希望的。以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子：
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
PGK200：
PGK300：
PGK400：
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择标志物基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标志物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择标志物和报告基因二者都可以侧接适当的调控序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调控序列的功能。通常，报告基因是如下基因，该基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达***是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在实施例中，载体可以包含编码CAR(例如与CD19结合的第一CAR和第二CAR(例如与第二抗原(例如CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)特异性结合的抑制性CAR或CAR)的两个或更多个核酸序列。在这样的实施例中，编码CAR的两种或更多种核酸序列由相同框中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链。在这方面，两种或更多种CAR可以例如通过一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的：
T2A：(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:1328)
P2A：(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:1329)
E2A：(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:1330)
F2A:(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:1331)
将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆实用指南],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约。将多核苷酸引入到宿主细胞中的适合的方法是磷酸钙转染。
用于将目的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因***哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散***，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的***(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内的递送媒介物的示例性胶体***是脂质体(例如人造膜囊泡)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送***递送多核苷酸)的其他方法。
在使用非病毒递送***的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适用的脂质描述于2016年4月8日提交的国际申WO 2016/164731的第209页，该申请通过引用并入本文。
无论用于将外源核酸引入对宿主细胞中的方法还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。
本发明进一步提供了包含编码CAR的核酸分子的载体。在一方面，CAR载体可以直接转导到细胞(例如T细胞)中。在一方面，载体是克隆或表达载体，例如，包括但不限于以下的载体：一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环、微型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一方面，该载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR构建体。在一方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。
细胞来源
在扩增和基因修饰或其他修饰之前，可以从受试者获得细胞来源，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。
在本披露的某些方面，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术(如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞，例如T细胞。在一个优选的方面，通过单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一方面，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆部分，并任选地将细胞置于合适的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在本发明的一个实施例中，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤这些细胞。在替代性实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。
在不存在钙的情况下的初始激活步骤可以导致放大的激活。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力A、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。可替代地，可以除去单采术样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一方面，通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗减单核细胞，从外周血淋巴细胞分离T细胞。
本文所述的方法可以包括，例如使用例如(例如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，所述亚群是T调节性细胞耗减的群，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节性耗减的细胞群含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体IL-2从群中除去T调节性细胞(例如CD25+T细胞)。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一个实施例中，抗CD25抗体或其片段与如本文所述的底物缀合。
在一个实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗减药剂从群中除去T调节性细胞(例如CD25+T细胞)。在一个实施例中，细胞与CD25耗减药剂的比率是1e7个细胞至20uL、或1e7个细胞至15uL、或1e7个细胞至10uL、或1e7个细胞至5uL、或1e7个细胞至2.5uL、或1e7个细胞至1.25uL。在一个实施例中，例如对于T调节性细胞(例如CD25+)耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在另一方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施例中，待耗减的免疫效应细胞群包括约6x 109个CD25+T细胞。在其他方面，有待耗减的免疫效应细胞群包括约1x 109至1x1010个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一个实施例中，所得群T调节耗减的细胞具有2x 109个T调节性细胞(例如，CD25+细胞)或更少(例如，1x 109个、5x 108个、1x 108个、5x 107个、1x 107个或更少的CD25+细胞)。
在一个实施例中，使用具有耗减管组(例如，像管162-01)的CliniMAC***从所述群除去T调节性细胞(例如，CD25+细胞)。在一个实施例中，将CliniMAC***在耗减设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间减少受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗减TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减、及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，耗减)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采术样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
在实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗发生复发的风险。在实施例中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间、或之后发生。
在实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗发生复发的风险。在实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗发生复发的风险。
在一个实施例中，有待除去的细胞群既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞)。在一个实施例中，设想将这样的细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行除去、或者在所述耗减之后、或以另一种顺序除去。
本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、BCMA、CD20、CD14或CD11b)的群除去细胞，从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群，该细胞群适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一个实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以例如，以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如，本文所述的检查点抑制剂)的群除去细胞(例如，PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性耗减的(例如，CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)群。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以例如，以任何顺序发生。
本文所述的方法可以包括阳性选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合的珠(如M-450CD3/CD28 T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施例中，时间段是约30分钟。在另外的实施例中，所述时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另外的实施例中，所述时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个实施例中，所述时间段是10至24小时，例如24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在所述过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。
在一个实施例中，可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法来确定。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、或50亿/ml的浓度。在一方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95、或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒(如珠))，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一方面，所使用的细胞的浓度是5x 106/ml。在其他方面，所使用的浓度可以是从约1x 105/ml至1x 106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他方面，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中除去粒细胞及在一定程度上除去单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％勃脈力-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或含有例如Hespan和勃脈力-A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所描述进行解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法激活之前在室温静置1小时。
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞(如T细胞)以便后续用于免疫效应细胞疗法中，以用于将受益于免疫效应细胞疗法的任意数目的疾病或病症，如本文所述的那些。在一方面，血液样品或单采术取自基本健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采术取自基本健康的受试者，所述受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供以后使用。在某些方面，可以将T细胞扩增、冷冻、并在以后使用。在某些方面，在诊断如本文描述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另一方面，在任何数量的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采术分离细胞，这些相关治疗模式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本发明的在另一方面，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫***的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改善的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在所述恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病状，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口期间。说明性细胞类型包括免疫***的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。
在一个实施例中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞获自已接受低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。
在其他实施例中，已经被、或将经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群可以通过接触一定量的mTOR抑制剂离体进行处理，所述mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的数量、或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。
在一个实施例中，T细胞群是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如，施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。可替代地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施例中，T细胞群是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达IkarosRNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如，施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。替代性地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在一些实施例中，T细胞群是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如，不表达DGK和Ikaros，或者具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文所述的任何方法产生这样的DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。
同种异体CAR
在本文所述的一些实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如该细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如经工程化以使其表面上不表达任何功能性TCR，经工程化以使其不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基，或者经工程化以使其表面上产生非常少的功能性TCR。替代性地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式表达严重受损的TCR。术语“严重受损的TCR”意指该TCR将不在宿主中引发不利的免疫反应。
本文描述的T细胞可以例如被工程化，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，可以工程化本文描述的T细胞，使得其细胞表面HLA(例如HLA 1类和/或HLA II类)表达被下调。
在一些实施例中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I类和/或HLAII类)。
缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何适合的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指内切核酸酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是例如通过本文所述的任何方法不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，该细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，该抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在一些实施例中，可以使用例如如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施例中，可以使用靶向编码T细胞中的TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA来抑制TCR表达和/或HLA表达。
siRNA和shRNA在T细胞中的表达可以使用任何常规表达***(例如像慢病毒表达***)来实现。
下调TCR的组分的表达的示例性shRNA描述于例如美国公开号：2012/0321667中。下调HLA I类和/或HLA II类基因表达的示例性siRNA和shRNA描述于例如美国公开号：US2007/0036773中。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这组重复序列的***。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”***是指衍生自CRISPR和Cas的***，该***可以用于使TCR和/或HLA基因沉默或突变。
在大约40％的测序的真细菌基因组和90％的测序的古细菌中发现了天然存在的CRISPR/Cas***。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]8:172。此***是赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式的原核免疫***。Barrangou等人(2007)Science[科学]315:1709-1712；Marragini等人(2008)Science[科学]322:1843-1845。
已经修饰CRISPR/Cas***用于真核生物(如小鼠或灵长类动物)的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature[自然]482:331-8。这是通过向真核细胞中引入含有特异设计的CRISPR和一种或多种适当的Cas的质粒来实现的。
CRISPR序列(有时称为CRISPR基因座)包含可替代的重复序列和间隔子。在天然存在的CRISPR中，间隔子通常包含对于细菌而言外来的序列，如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLA CRISPR/Cas***中，间隔子衍生自TCR或HLA基因序列。
来自CRISPR基因座的RNA是组成型表达的并由Cas蛋白加工成小RNA。这些包含由重复序列侧接的间隔子。RNA指导其他Cas蛋白在RNA或DNA水平沉默外源性遗传元件。Horvath等人(2010)Science[科学]327:167-170；Makarova等人(2006)Biology Direct[生物学快讯]1:7。因此，类似于siRNA，间隔子充当RNA分子的模板。Pennisi(2013)Science[科学]341:833-836。
由于这些天然存在于许多不同类型的细菌中，因此CRISPR的确切排列，和Cas基因的结构、功能和数量及其产物在物种之间略有不同。Haft等人(2005)PLoS Comput.Biol.[公共科学图书馆医学杂志第一版]1:e60；Kunin等人(2007)Genome Biol.[基因组生物学]8:R61；Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]60:174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:653-663；和Stern等人(2010)Trends.Genet.[遗传学趋势]28:335-340。例如，Cse(Cas亚型，大肠杆菌)蛋白质(例如，CasA)形成功能性复合物Cascade，其将CRISPR RNA转录物处理成保留Cascade的间隔子重复单元。Brouns等人(2008)Science[科学]321:960-964。在其他原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体失活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1或Cas2。强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和其他原核生物中的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白形成具有小CRISPR RNA的功能性复合物，其识别和切割互补的靶RNA。更简单的CRISPR***依赖于蛋白质Cas9，其是具有两个活性切割位点的核酸酶，各自对应用于双螺旋的每条链。将Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA组合可用于基因编辑***。Pennisi(2013)Science[科学]341:833-836。
因此，CRISPR/Cas***可用于编辑TCR和/或HLA基因(添加或删除碱基对)，或引入提前终止，该提前终止从而降低TCR和/或HLA的表达。替代性地，可以像RNA干扰一样使用CRISPR/Cas***，以可逆的方式关闭TCR和/或HLA基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至TCR和/或HLA启动子，空间上阻断RNA聚合酶。
可以使用本领域中已知的技术产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas***，例如，描述于美国公开号20140068797和Cong(2013)Science[科学]339:819-823中的技术。还可以产生本领域已知的其他人工CRISPR/Cas***，其抑制TCR和/或HLA，例如描述于以下：Tsai(2014)Nature Biotechnol.[自然生物技术],32:6 569-576，美国专利号：8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945、和8,697,359。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录激活因子样效应子核酸酶，其为可以用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割域进行融合来人工产生TALEN。可以工程化转录激活因子样作用(TALE)以结合任何所希望的DNA序列，包括HLA或TCR基因的部分。通过将工程化的TALE与DNA切割域组合，可以产生对任何所希望的DNA序列(包括HLA或TCR序列)具有特异性的限制酶。然后可以将这些引入细胞中，其中它们可以用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:135-6；和Boch等人(2009)Science[科学]326:1509-12；Moscou等人(2009)Science[科学]326:3501。
TALE是由黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列，但第12和第13氨基酸除外。这两个位置高度变化，显示出与特定核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以被工程化以结合所希望的DNA序列。
为了产生TALEN，将TALE蛋白质与核酸酶(N)融合，该核酸酶是野生型或突变的FokI内切核酸酶。针对其在TALEN中的用途已经对FokI作出若干突变；这些例如，改善切割特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.[核酸研究]39:e82；Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:731-734；Wood等人(2011)Science[科学]333:307；Doyon等人(2010)Nature Methods[自然方法]8:74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.[自然生物技术]25:786-793；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]200:96。
FokI结构域作为二聚体起作用，这需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当取向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI切割域之间的氨基酸残基的数量和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8。
可以使用HLA或TCR TALEN在细胞内产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源末端连接不正确地修复断裂，则可以在断裂位点引入突变。例如，不正确的修复可以引入移码突变。替代性地，可以将外来DNA与TALEN一起引入到细胞中；取决于外来DNA的序列和染色体序列，此过程可以用于校正HLA或TCR基因中的缺陷或将这样的缺陷引入wt HLA或TCR基因中，从而降低HLA或TCR的表达。
可以使用本领域已知的任何方法构建对HLA或TCR中的序列特异的TALEN，这些方法包括使用模块组分的各种方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE[公共科学图书馆综合]6:e19509。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可以用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
像TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶域(或其衍生物)。就ZFN而言，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。Carroll等人(2011)Genetics Society ofAmerica[美国遗传学学会]188:773-782；和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:1156-1160。
锌指是被一种或多种锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可包含例如Cys2His2，并且可识别大约3-bp序列。可以将已知特异性的各种锌指组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交***、细菌单杂交和双杂交***、以及哺乳动物细胞。
像TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须与DNA的相反链结合，其中它们的核酸酶适当地间隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:10570-5。
也像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果不正确地修复则可以产生移码突变，这导致细胞中HLA和/或TCR的表达和量的减少。ZFN还可以与同源重组一起使用以在HLA或TCR基因中产生突变。
可以使用本领域已知的任何方法构建对HLA和/或TCR中的序列特异性的ZFN。参见例如，Provasi(2011)Nature Med.[自然医学]18:807-815；Torikai(2013)Blood[血液]122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.[分子疗法]16:1200-7；Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230。
端粒酶表达
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)。因此，在实施例中，免疫效应细胞(例如，T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶的催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT。在一些方面，本披露提供了产生表达CAR的细胞的方法，所述方法包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如，端粒酶的催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与核酸接触。
在一方面，本披露内容的特点在于制备免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)群的方法。在实施例中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)群，使免疫效应细胞群与编码CAR的核酸接触；以及在允许CAR和端粒酶表达的条件下，使免疫效应细胞群与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。
在实施例中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在实施例中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在实施例中，hTERT具有GenBank蛋白ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亚基基因，在肿瘤细胞和永生化过程中上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)如下：
在实施例中，hTERT具有与SEQ ID NO:363的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96^、97％、98％或99％同一性的序列。在实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:363的序列。在实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含缺失(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。在实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含转基因氨基酸序列(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。
在实施例中，hTERT由GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulatedin Tumor Cells and during Immortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亚基基因，在肿瘤细胞和永生化过程中上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785–795页)。免疫效应细胞(例如，T细胞)的激活和扩增
免疫效应细胞(如T细胞)通常可以使用如描述于例如以下中的方法进行激活和扩增：美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
造血干细胞和祖细胞的离体扩增程序描述于美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)中，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于离体扩增细胞的任何特定方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增可以包括：(1)从哺乳动物收集来自外周血收获物或骨髓外植体的CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可以用于培养和扩增细胞。
免疫效应细胞的扩增方法、将CAR核酸分子引入免疫效应细胞的方法以及检测CAR表达的方法描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第236-246页中，该文献通过引用以其全文并入本文。
其他测定，包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评价本文描述的CAR。
可替代地，或者与本文披露的方法组合的，披露了用于以下的一种或多种的方法和组合物：表达CAR的细胞的检测和/或定量(例如体外或体内(例如临床监测))；免疫细胞扩增和/或激活；和/或涉及CAR配体使用的CAR特异性选择。在一个示例性实施例中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或与细胞外结合结构域的恒定区结合的抗体)。在其他实施例中，CAR配体是CAR抗原分子(例如，如本文所述的CAR抗原分子)。
在其他实施例中，提供了用于耗减(例如，减少和/或杀伤)表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；以及基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀伤表达CAR的细胞。在一个实施例中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在另一个实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可用于本文披露的方法的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to DetectCD19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受体(CAR)特异性单克隆抗体检测临床试验中CD19特异性T细胞]”,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838中，将其内容通过引用并入。在一些方面和实施例中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群进行了优化，例如，如2015年7月31日提交的美国序列号PCT/US2015/043219中所述，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，与对照T细胞(例如，表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，优化的T细胞亚群示出了增强的持久性。
在一些实施例中，CD4+T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD4+T细胞(例如，ICOS域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CD8+T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD8+T细胞(例如，4-1BB域、CD28域，或ICOS域以外的其他共刺激结构域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如包含抗原结合结构域的CAR。
在一个方面，本文描述了治疗受试者(例如患有癌症的受试者)的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的：
1)包含CAR的CD4+T细胞(CARCD4+)，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS域；以及
2)包含CAR的CD8+T细胞(CARCD8+)，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如，第二共刺激结构域，例如，4-1BB域、CD28域、或除ICOS域以外的另一种共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，该方法进一步包括施用：
3)包含CAR的第二CD8+T细胞(第二CARCD8+)，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含细胞内信号传导结构域，例如，共刺激信号传导结构域，不存在于CARCD8+上，并且任选地不包含ICOS信号传导结构域。
生物聚合物递送方法
在一些实施例中，如本文所披露的一种或多种表达CAR的细胞可以经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不诱导炎性或免疫应答)和/或可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第1004-1006段中，所述申请通过引用以其全文并入本文。
BCL2抑制剂
在一些实施例中，本文所述的组合包括BCL2抑制剂。在一些实施例中，BCL2抑制剂选自维奈托克、奥利默森(G3139)、APG-2575、APG-1252、那维托克莱克斯(ABT-263)、ABT-737、BP1002、SPC2996、奥巴克拉甲磺酸盐(GX15-070MS)或PNT2258。在一些实施例中，将BCL2抑制剂与CAR疗法(例如，如本文所述的CD19 CAR疗法)组合施用。
示例性BCL2抑制剂
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含维奈托克(CAS登记号：1257044-40-8)或美国专利号8,546,399、9,174,982和9,539,251(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。维奈托克(venetoclax)还称为venclexta或ABT-0199或4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-(3-硝基-4-{[(噁烷-4-基)甲基]氨基}苯磺酰基)-2-{1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基}苯甲酰胺。在某些实施例中，BCL2抑制剂是维奈托克。在某些实施例中，BCL2抑制剂(例如，维奈托克)具有以下化学结构：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含具有式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
A1是C(A2)；
A2是H、F、Br、I或Cl；
B1是R1、OR1、NHR1、NHC(O)R1、F、Br、I或Cl；
D1是H、F、Br、I或Cl；
E1是H；并且
Y1是H、CN、NO2、F、Cl、Br、I、CF3、R17、OR17、SR17、SO2R17或C(O)NH2；
R1是R4或R5；
R4是环烷基或杂环烷基；
R5是烷基或炔基，它们中的每一个未被取代或被独立地选自由以下组成的组的一个或两个或三个取代基取代：R7、OR7、NHR7、N(R7)2、CN、OH、F、Cl、Br和I；
R7是R8、R9、R10或R11；
R8是苯基；
R9是杂芳基；
R10是环烷基、环烯基或杂环烷基，它们中的每一个与R10A未稠合或稠合；R10A是杂芳烃；
R11是烷基，其未被取代或被独立地选自由以下组成的组的一个或两个或三个取代基取代：R12、OR12和CF3；
R12是R14或R16；
R14是杂芳基；
R16是烷基；
R17是烷基或炔基，它们中的每一个未被取代或被独立地选自由以下组成的组的一个或两个或三个取代基取代：R22、F、Cl、Br和I；
R22是杂环烷基；
其中由R4、R8、R10和R22表示的环部分独立地未被取代或被独立地选自由以下组成的组的一个或两个或三个或四个或五个取代基取代：R57A、R27、OR57、SO2R57、C(O)R57、C(O)OR57、C(O)N(R57)2、NH2、NHR57、N(R57)2、NHC(O)R57、NHS(O)2R57、OH、CN、(O)、F、Cl、Br和I；
R57A是螺烷基或螺杂烷基；
R57是R58、R60或R61；
R58是苯基；
R60是环烷基或杂环烷基；
R61是烷基，其未被取代或被独立地选自由以下组成的组的一个或两个或三个取代基取代：R62、OR62、N(R62)2、C(O)OH、CN、F、Cl、Br和I；
R62是R65或R66；
R65是环烷基或杂环烷基；
R66是烷基，其未被取代或被OR67取代；
R67是烷基；
其中由R57A、R58和R60表示的环部分未被取代或被独立地选自由以下组成的组的一个或两个或三个或四个取代基取代：R68、F、Cl、Br和I；
R68是R71或R72；
R71是杂环烷基；并且
R72是烷基，其未被取代或被一个或两个F取代。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含具有式II的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含选自以下的化合物：
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[1-四氢-2H-吡喃-4-基哌啶-4-基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(1-甲基哌啶-4-基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H--吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(4-甲基哌嗪-1-基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H--吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-4-(4-({[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({4-[(4-吗啉-4-基环己基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(2-甲氧基乙基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并-[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(3-硝基-4-{[(3S)-四氢-2H-吡喃-3-基甲基]氨基}苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-{[4-(1,4-二噁烷-2-基甲氧基)-3-硝基苯基]磺酰基}-2-(1H-吡咯并(2,3-b)吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(3-硝基-4-{[(3R)-四氢-2H-吡喃-3-基甲基]氨基}苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(2-甲氧基乙基)氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-N-({4-[(四氢-2H-吡喃-4--基甲基)氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基}磺酰基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-{[3-硝基-4-(四氢-2H-吡喃-4-基甲氧基)苯基]磺酰基}-2-(-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[(2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({4-[(1,4-二噁烷-2-基甲基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H--吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(2,2,2-三氟乙基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(3,3,3-三氟丙基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H--吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(2S)-1,4-二噁烷-2-基甲氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；顺式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(4-{[(4-甲氧基环己基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(2R)-1,4-二噁烷-2-基甲氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(4-{[(4-甲氧基环己基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(4-氟四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-{[3-(氨基羰基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基甲氧基)苯基]磺酰基}--4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
顺式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({4-[(4-吗啉-4-基环己基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并(2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基]-3-硝基苯基-}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-({3-氯-5-氰基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-4-(4-{(2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-({4-[(1-乙酰基哌啶-4-基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-4-(4-{[2-(4--氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-2-(1H--吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-({2-氯-5-氟-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(3-吗啉-4-基丙基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H--吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({4-[(4-吗啉-4-基环己基)氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-h]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(2-氰乙基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2-,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-N-{[4-({4-[双(环丙基甲基)氨基]环己基}氨基)-3-硝基苯基]磺酰基}-4-(4-{(2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(吗啉-3-基甲基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(4-吗啉-4-基丁-2-炔基)氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
叔丁基3-{[4-({[4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}-哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰基]氨基}磺酰基-)-2-硝基苯氧基]甲基}吗啉-4-甲酸；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-{[4-(吗啉-3-基甲氧基)-3-硝基苯基]磺酰基}-2-(1H-吡咯并-[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(1,1-二氧化四氢-2H-噻喃-4-基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-[(4-氯-3-硝基苯基)磺酰基]-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5--基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(3-硝基-4-{[1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基]氨基}苯基-)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-({3-氯-5-氟-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-{[4-({1-[2-氟-1-(氟甲基)乙基]哌啶-4-基}氨基)-3-硝基苯基]磺酰基}-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基]-N-({4-[(1-环丙基哌啶-4-基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)--2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[(1-吗啉-4-基环己基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(4-{[4-(二环丙基氨基)环己基]氨基}-3-硝基苯基-)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(4-乙基吗啉-3-基)甲氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1-H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(4-四氢-2H-吡喃-4-基吗啉-3-基)甲氧基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(3-硝基-4-{[(3S)-1-四氢-2H-吡喃-4-基哌啶-3-基]氨基-}苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(1,1-二氧代硫代吗啉-4-基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基-)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-[(4-{[(4-氨基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-氰基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-[(1S,3R)-3-吗啉-4-基环戊基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[(1R,3S)-3-吗啉-4-基环戊基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(吗啉-2-基甲基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢呋喃-3-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2--(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-{[4-({1-[顺式-3-氟四氢-2H-吡喃-4-基]哌啶-4-基}氨基)-3-硝基苯基]磺酰基}-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(1-四氢-2H-吡喃-4-基氮杂环丁烷-3-基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(1-四氢呋喃-3-基氮杂环丁烷-3-基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-{[3-硝基-4-({[(3R)-1-四氢-2H-吡喃-4-基吡咯烷-3-基]甲基}氨基)苯基]磺酰基}-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-((反式-4-羟基环己基)-甲氧基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺；
2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-((顺式-4-甲氧基环己基)甲氧基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺；
顺式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(4-{[4-(环丙基氨基)环己基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(3-硝基-4-{[4-四氢-2H-吡喃-4-基氨基)环己基]氨基}苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({4-[(4-甲氧基环己基)甲氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)--2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
叔丁基4-{[4-({[4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}-哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰基]氨基}磺酰基-)-2-硝基苯氧基]甲基}-4-氟哌啶-1-甲酸；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(4-氟哌啶-4-基)甲氧基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2-(-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
反式-4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(3-硝基-4-{(4-(4-四氢-2H-吡喃-4-基哌嗪-1-基)环己基]氨基}苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-{[4-({1-[2-氟-1-(氟甲基)乙基]哌啶-4-基}甲氧基)-3-硝基苯基]磺酰基}-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(3-硝基-4-{[(3R)-1-四氢-2H-吡喃-4-基吡咯烷-3-基]氨基}苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-[(3R)-1-(2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)吡咯烷-3-基-]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(3-硝基-4-{[(3S)-1-四氢-2H-吡喃-4-基吡咯烷-3-基]氨基}苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[(3S)-1-(2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)吡咯烷-3-基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(4-{[(4-甲基吗啉-2-基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-{[4-({[4-(2-甲氧基乙基)吗啉-2-基]甲基}氨基)-3-硝基苯基]磺酰基}-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
N-[(4-{[(4-乙酰基吗啉-2-基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-4-(-4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-([反式-4-(氟甲基)-1-氧杂环丁烷-3-基吡咯烷-3-基]甲氧基-}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[(4-氟四氢-2H-吡喃-4-基)甲基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(1-氧杂环丁烷-3-基哌啶-4-基)氨基]苯基}磺酰基)--2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({4-[(1-环丁基哌啶-4-基)氨基]-3-硝基苯基}磺酰基)-2--(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[{4-([1-(2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)哌啶-4-基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-[(4-{[(3S)-1-环丙基吡咯烷-3-基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(1-四氢呋喃-3-基哌啶-4-基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺；或
其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，以约10mg至约500mg，例如约20mg至约400mg、约50mg至约350mg、约100mg至约300mg、约150mg至约250mg、50mg至约500mg、约100mg至约500mg、约150mg至约500mg、约200mg至约500mg、约250mg至约500mg、约300mg至约500mg、约350mg至约500mg、约400mg至约500mg、约450mg至约500mg、约10mg至约400mg、约10mg至约350mg、约10mg至300mg、约10mg至约250mg、约10mg至约200mg、约10mg至约150mg、约10mg至约100mg、约10mg至约50mg、约50mg至约150mg、约150mg至约250mg、约250mg至约350mg、或约350mg至约400mg的剂量施用BCL2抑制剂。在一些实施例中，以约20mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg或500mg的剂量施用BCL2抑制剂。在一些实施例中，每天施用BCL2抑制剂。在一些实施例中，至少每天一次施用BCL2抑制剂。在一些实施例中，施用BCL2抑制剂至少连续5-10天。在一些实施例中，口服施用BCL2抑制剂。在一些实施例中，以固定剂量施用BCL2抑制剂。在一些实施例中，以爬坡周期施用BCL2抑制剂。在一些实施例中，以爬坡周期，随后以固定剂量施用BCL2抑制剂。
在一些实施例中，BCL2抑制剂以爬坡周期施用例如，约5周，随后以固定剂量施用例如，至少约24个月。在一些实施例中，BCL2抑制剂以约10mg至约30mg(例如约20mg)的剂量每天一次施用例如，约1周；随后以约40mg至约60mg(例如，约50mg)的剂量每天一次施用例如，约1周；随后以约80mg至约120mg(例如，约100mg)的剂量每天一次施用例如，约1周；随后以约150mg至约250mg(例如，约200mg)的剂量每天一次施用例如，约1周；随后以约350mg至约450mg(例如，约400mg)的剂量每天一次施用例如，约1周；以及随后以固定剂量(例如约350mg至约450mg(例如约400mg)每天一次施用例如，至少约24个月。
其他示例性BCL2抑制剂
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含奥利默森，例如奥利默森钠(oblimersensodium)(CAS登记号：190977-41-4)。奥利默森或奥利默森钠还称为根纳三思(Genasense)、Augmerosen、BCL2反义寡脱氧核苷酸G3139或十七碳钠(heptadecasodium)；1-[(2R,4S,5R)-5-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-[[[(2R,3S,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-2-[[[(2R,3S,5R)-2-(羟基甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代嘧啶-1-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(5-甲基-2,4-二氧代嘧啶-1-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(6-氨基嘌呤-9-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(5-甲基-2,4-二氧代嘧啶-1-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-5-(6-氨基嘌呤-9-基)氧杂环戊-3-基]氧基-氧化膦基硫代基]氧基甲基]-4-羟基甲基氧杂环戊-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮。奥利默森具有分子式C172H221N62O91P17S17。奥利默森钠是硫代磷酸反义寡核苷酸的钠盐，其靶向BCL2 mRNA的起始密码子区域，在该区域抑制BCL2 mRNA翻译，并披露于例如Banerjee Curr Opin Mol Ther.[分子治疗学新观点]1999；1(3):404-408中。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含APG-2575。APG-2575还称为BCL2抑制剂APG2575、APG 2575或APG2575。APG-2575是选择性BCL2抑制剂，具有潜在的促凋亡和抗肿瘤活性。口服施用时，BCL2抑制剂APG 2575靶向、结合并抑制BCL2的活性。APG-2575披露于例如Fang等人Cancer Res.[癌症研究]2019(79)(增刊13)2058中。在一些实施例中，以约20mg至约800mg(例如约20mg、50mg、100mg、200mg、400mg、600mg或800mg)的剂量施用APG-2575。在一些实施例中，每天一次施用APG-2575。在一些实施例中，口服施用APG-2575。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含APG-1252。APG-1252还称为BCL2/Bcl-XL抑制剂APG-1252或APG 1252。APG-1252是BCL2同源(BH)-3模拟物和BCL2和Bcl-XL的选择性抑制剂，具有潜在的促凋亡和抗肿瘤活性。施用后，APG-1252特异性结合并抑制促存活蛋白BCL2和Bcl-XL的活性，其恢复凋亡过程并抑制BCL2/Bcl-XL依赖性肿瘤细胞中的细胞增殖。APG-1252披露于例如Lakhani等人Journal of Clinical Oncology[临床肿瘤学杂志]2018 36:增刊15,2594-2594中。在一些实施例中，以约10mg至约400mg(例如约10mg、约40mg、约160mg或约400mg)的剂量施用APG-1252。在一些实施例中，每周施用两次APG-1252。在一些实施例中，静脉内施用APG-1252。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含那维托克莱克斯。那维托克莱克斯还称为ABT-263或4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己-1-基]甲基]哌嗪-1-基]-N-[4-[[(2R)-4-吗啉-4-基-1-苯基磺酰基丁烷-2-基]氨基]-3-(三氟甲基磺酰基)苯基]磺酰基苯甲酰胺。那维托克莱克斯是合成的小分子，是BCL2蛋白的拮抗剂。其选择性地与凋亡抑制蛋白BCL2、Bcl-XL和Bcl-w结合，这些蛋白在癌细胞中经常过表达。对这些蛋白质的抑制阻止了它们与凋亡效应蛋白Bax和Bak的结合，该结合触发凋亡过程。那维托克莱克斯披露于例如Gandhi等人J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]2011 29(7):909-916中。在一些实施例中，口服施用那维托克莱克斯。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含ABT-737。ABT-737还称为4-[4-[[2-(4-氯苯基)苯基]甲基]哌嗪-1-基]-N-[4-[[(2R)-4-(二甲基氨基)-1-苯基磺酰基丁烷-2-基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基苯甲酰胺。ABT-737是具有促凋亡和抗肿瘤活性的小分子BCL2同源3(BH3)模拟物。ABT-737与抗凋亡BCL2蛋白家族的多个成员(包括BCL2、Bcl-xl和Bcl-w)的疏水性凹槽结合。这抑制了这些促存活蛋白的活性，并通过激活Bak/Bax介导的细胞凋亡恢复了肿瘤细胞的凋亡过程。ABT-737披露于例如Howard等人Cancer Chemotherapy andPharmacology[癌症化疗与药理学]2009 65(1):41-54中。在一些实施例中，口服施用ABT-737。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含BP1002。BP1002是反义治疗剂，该治疗剂由靶向BCL2 mRNA的不带电荷的对乙氧基反义寡脱氧核苷酸组成。BP1002披露于例如Ashizawa等人Cancer Research[癌症研究]2017 77(13)中。在一些实施例中，将BP1002掺入脂质体中用于施用。在一些实施例中，静脉内施用BP1002。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含SPC2996。SPC2996是锁核酸硫代磷酸反义分子，其靶向BCL2癌蛋白的mRNA。SPC2996披露于例如Durig等人Leukemia[白血病]2011 25(4)638-47中。在一些实施例中，静脉内施用SPC2996。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含奥巴妥拉(例如，奥巴克拉甲磺酸盐(GX15-070MS))。奥巴克拉甲磺酸盐还称为(2E)-2-[(5E)-5-[(3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-4-甲氧基吡咯-2-亚基]吲哚；甲磺酸。其是奥巴妥拉的甲磺酸盐，该奥巴妥拉是BCL2蛋白家族的合成小分子抑制剂，并且具有促凋亡和抗肿瘤活性。奥巴妥拉与BCL2蛋白家族成员结合，阻止它们与促凋亡蛋白Bax和Bak结合。这促进了BCL2过表达细胞的凋亡的激活。奥巴克拉甲磺酸盐披露于例如O’Brien等人Blood[血液]2009 113(2):299-305中。在一些实施例中，静脉内施用奥巴克拉甲磺酸盐。
在一些实施例中，BCL2抑制剂包含PNT2258。PNT225是磷酸二酯DNA寡核苷酸，其与BCL2基因5’非翻译区的基因组序列杂交，并通过DNA干扰(DNAi)过程抑制其转录。PNT2258披露于例如Harb等人Blood[血液](2013)122(21):88中。在一些实施例中，静脉内施用PNT2258。
BCL6抑制剂
在一些实施例中，本文所述的组合包括BCL6抑制剂。在一些实施例中，BCL6抑制剂选自化合物79-6、BI-3812或FX1。
在一些实施例中，BCL6抑制剂是化合物79-6。化合物79-6披露于例如Cerchietti等人Cancer Cell[癌细胞]2010；17(4):400-411中。化合物79-6是结合BCL6的BTB结构域并诱导BCL6靶基因的表达的小分子抑制剂。
在一些实施例中，BCL6抑制剂是BI-3812。BI-3812披露于例如Kerres等人CellReports[细胞报告]2017；20:2860-2875中。BI-3812结合并抑制BCL6的BTB结构域。
在一些实施例中，BCL6抑制剂是FX1。FX1披露于例如Cardenas等人Journal ofClincal Investigation[临床调查杂志]2016；126(9):3351-3362中。FX1结合BCL6侧面凹槽的重要区域，并破坏BCL6抑制复合物的形成，重新激活BCL6靶基因。
在一些实施例中，将BCL6抑制剂与CAR疗法(例如，如本文所述的CD19 CAR疗法)组合施用。
MYC抑制剂
在一些实施例中，本文所述的组合包括MYC抑制剂。在一些实施例中，MYC抑制剂间接抑制MYC，例如抑制MYC上游和/或下游的基因靶标。在一些实施例中，MYC抑制剂抑制MYC相关因子X(Max)、泛素蛋白酶体、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)、糖原合酶激酶-3(GSK-3β)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、BET溴域或Aurora A和Aurora B激酶、polo样激酶-1(PLK-1)中的至少一种。
在一些实施例中，MYC抑制剂是MLN0128。MLN0128抑制mTOR。在一些实施例中，MYC抑制剂是9-ING-41。9-ING-41抑制GSK-3β，mTOR的下游靶标和MYC的上游靶标。在一些实施例中，MYC抑制剂是CUDC-907。CUDC-907是HDAC和PI3K的抑制剂。CUDC-907还称为非美诺司他(fimepinostat)。MLN0128、9-ING-41和CUDC-907披露于例如Li等人Expert Review ofHematology[血液学专家评论]2019；12(7):507-514中。
在一些实施例中，MYC抑制剂是Omomyc。Omomyc披露于例如Demma等人ASMMolecular and Cellular Biol.[ASM分子与细胞生物学]2019；39(22):e00248-19中。Oncomyx结合Max并抑制Max/MYC异源二聚体形成。
在一些实施例中，将MYC抑制剂与CAR疗法(例如，如本文所述的CD19 CAR疗法)组合施用。
组合疗法
在一些方面，本披露提供了治疗受试者的方法，该方法包括施用如本文所述产生的CAR疗法(例如，结合B细胞抗原的CAR)与一种或多种其他疗法的组合。在一些方面，本披露提供了治疗受试者的方法，该方法包括施用包含如本文所述的CAR疗法的反应混合物与一种或多种其他疗法的组合。在一些方面，本披露提供了运送或接收反应混合物的方法，该反应混合物包含如本文所述的表达CAR的细胞。在一些方面，本披露提供了治疗受试者的方法，该方法包括接收如本文所述产生的表达CAR的细胞，并且进一步包括向受试者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其他疗法的组合。在一些方面，本披露提供了治疗受试者的方法，该方法包括产生如本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步包括向该受试者施用表达CAR的细胞，与一种或多种其他疗法的组合。在一些实施例中，将CAR疗法(例如，结合B细胞抗原的CAR)与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合进行组合施用。在一些实施例中，B细胞抗原选自CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3或ROR1。在一些实施例中，B细胞抗原是CD19。在一些实施例中，B细胞抗原是CD20。在一些实施例中，B细胞抗原是CD22。在一些实施例中，B细胞抗原是CD34。在一些实施例中，B细胞抗原是CD123。在一些实施例中，B细胞抗原是BCMA。在一些实施例中，B细胞抗原是FLT-3。在一些实施例中，B细胞抗原是ROR1。
在一些实施例中，CAR疗法是CD19 CAR疗法。在一些实施例中，将CD19 CAR疗法(例如，如本文所述的CD19 CAR)与BCL2抑制剂(例如，本文所述的BCL2抑制剂)组合施用。在一些实施例中，BCL2抑制剂是维奈托克。
在一些实施例中，将CD123 CAR疗法(例如，如本文所述的CD123CAR)与BCL2抑制剂(例如，本文所述的BCL2抑制剂)组合施用。在一些实施例中，BCL2抑制剂是维奈托克。
在一些实施例中，将CAR疗法与BCL2、BLC6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种组合施用，任选地进一步包括施用一种或多种其他疗法。在一些实施例中，其他疗法可以是例如B细胞抑制剂(例如，CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3或ROR1中的一种或多种抑制剂，例如如本文所述的)或癌症疗法，如R-CHOP、DA-EPOC-R、R-CODOX-M/IVAC、R-Hyper-CVAD和/或化疗。
如本文所述的CAR(例如，或本文所述的表达CD19 CAR的细胞和例如如本文所述的BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种)的组合可以与其他已知的药物和疗法组合使用。
B细胞抑制剂、包含其的组合疗法及其用途描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731中，该申请通过引用以其全文并入本文。
在另外的方面，本文所述的CAR疗法的组合(例如，CD19 CAR疗法与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种的组合)可以与以下组合用于治疗方案：手术、化疗、放射、mTOR通路抑制剂、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体、或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子、和照射，如描述于Izumoto等人2008J Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971中的肽疫苗。
在一个实施例中，本文所述的CAR疗法(例如CD19 CAR疗法)与一种或多种BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或MYC抑制剂的组合可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环霉素(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑珠单抗、吉妥单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调制剂如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。
考虑用于组合疗法的一般化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素/>白消安/>白消安注射液卡培他滨/>N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀/>苯丁酸氮芥/>顺铂克拉屈滨/>环磷酰胺(/>或/>)、阿糖胞苷、胞嘧啶***糖苷/>阿糖胞苷脂质体注射液/>达卡巴嗪/>更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液/>***、多西他赛/>盐酸多柔比星/> 依托泊苷磷酸氟达拉滨/>5-氟尿嘧啶/>氟他胺/>替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星/>异环磷酰胺/>伊立替康/>L-天冬酰胺酶/>亚叶酸钙、美法仑/>6-巯基嘌呤/>甲氨蝶呤/>米托蒽醌/>麦罗塔、紫杉醇/>nab-紫杉醇/>菲尼克斯(phoenix)(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀的植入物/>枸橼酸他莫昔芬/>替尼泊苷/>6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明注射用盐酸托泊替康/>长春碱/>长春新碱/>和长春瑞滨/>
在实施例中，在施用表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细胞之前施用化学治疗剂。在需要多于一次施用化学治疗剂的化疗方案中，化疗方案在施用表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细胞之前开始或完成。在实施例中，在施用表达CAR分子的细胞之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天或30天施用化学治疗剂。在实施例中，在施用表达CAR分子的细胞之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天或30天开始或完成化疗方案。在实施例中，化疗剂是增加癌细胞(例如肿瘤细胞)上CD19、CD20或CD22表达(例如，与正常或非癌细胞上的表达相比)的化学治疗剂。表达可以通过例如免疫组织化学染色或流式细胞术分析来确定。例如，化学治疗剂是阿糖胞苷(Ara-C)。
与本发明化合物组合的特别感兴趣的抗癌剂包括：抗代谢物；抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶或p70S6激酶FK506)或抑制p70S6激酶的药物；烷化剂；mTOR抑制剂；免疫调节剂；蒽环霉素；长春花生物碱；蛋白体抑制剂；GITR激动剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；CDK4激酶抑制剂；BTK激酶抑制剂；MKN激酶抑制剂；DGK激酶抑制剂；或溶瘤病毒。
示例性抗代谢物包括但不限于叶酸拮抗剂(在本文中也称为抗叶酸剂)、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂：甲氨蝶呤5-氟尿嘧啶/> 氟尿苷/>阿糖胞苷(Tarabine PFS)、6-巯基嘌呤/>6-硫代鸟嘌呤(Thioguanine/>)、磷酸氟达拉滨/>喷司他丁/>培美曲塞/>雷替曲塞/>克拉屈滨/>氯法拉滨 巯基嘌呤/>卡培他滨/>奈拉滨/>阿扎胞苷/>和吉西他滨/>优选的抗代谢物包括例如5-氟尿嘧啶/>氟尿苷卡培他滨/>培美曲塞/>雷替曲塞和吉西他滨/>
示例性的烷化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil/>
Uracil nitrogen )、氮芥(chlormethine)/>环磷酰胺( RevimmuneTM)、异环磷酰胺/>美法仑/>苯丁酸氮芥/>哌泊溴烷三乙烯蜜胺/>三乙烯硫代磷酰胺、替莫唑胺/>噻替派/>白消安 卡莫司汀/>洛莫司汀/>链脲佐菌素/>和达卡巴嗪/>另外的示例性烷化剂包括而不限于奥沙利铂/>替莫唑胺(/>和/>)；更生霉素(也称为放线菌素-D、/>)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯丙氨酸氮芥、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、/>)；卡莫司汀苯达莫司汀/>白消安(/>和/>)；卡铂洛莫司汀(也称为CCNU、/>)；顺铂(也称为CDDP、/>和-AQ)；苯丁酸氮芥/>环磷酰胺(/>和/>)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、/>)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、/>)；异环磷酰胺/>Prednumustine；丙卡巴肼二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、盐酸氮芥和盐酸二氯甲基二乙胺、)；链脲佐菌素/>噻替派(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、)；环磷酰胺/> 和盐酸苯达莫司汀/>
在实施例中，将本文所述的CAR疗法组合与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和/或皮质类固醇(例如，***)组合进一步施用于受试者。在实施例中，将本文所述的CAR疗法组合与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***(R-CHOP)组合施用于受试者。在一些实施例中，将CD19 CAR疗法与BCL2抑制剂组合施用，任选地进一步包括施用R-CHOP。在实施例中，受试者患有高级别B细胞淋巴瘤(例如，双和/或三打击淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在实施例中，受试者患有双打击淋巴瘤。在实施例中，受试者患有三打击淋巴瘤。在实施例中，受试者患有非大块的有限阶段DLBCL(例如，包含尺寸/直径小于7cm的肿瘤)。在实施例中，将受试者用与R-CHOP组合的辐射进行治疗。例如，向受试者施用R-CHOP(例如，1-6个循环，例如，1、2、3、4、5或6个R-CHOP循环)，然后进行辐射。在一些情况下，向受试者施用R-CHOP(例如，1-6个循环，例如，1、2、3、4、5或6个R-CHOP循环)，然后进行辐射。
在实施例中，将本文所述的CAR疗法组合与依托泊苷、***、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和/或利妥昔单抗组合进一步施用于受试者。在实施例中，将本文所述的CAR疗法组合与依托泊苷、***、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和利妥昔单抗(EPOCH-R)组合进一步施用于受试者。在实施例中，将本文所述的CAR疗法组合与剂量调整的EPOCH-R(DA-EPOCH-R)组合进一步施用于受试者。在一些实施例中，将CD19 CAR疗法与BCL2抑制剂组合施用，任选地进一步包括施用EPOCH-R或DA-EPOCH-R。在实施例中，受试者患有B细胞淋巴瘤(例如，高级别B细胞淋巴瘤(例如，双和/或三打击淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤)、DLBCL或FL。
在实施例中，将本文所述的CAR疗法组合与环磷酰胺、长春新碱、阿霉素(adriamycin)、***(R-Hyper-CVAD)组合进一步施用于受试者。在一些实施例中，将CD19 CAR疗法与BCL2抑制剂组合施用，任选地进一步包括施用Hyper-CVAD。在实施例中，受试者患有B细胞淋巴瘤(例如，高级别B细胞淋巴瘤(例如，双和/或三打击淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤)、DLBCL或FL。
在实施例中，将本文所述的CAR治疗组合与环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、甲氨蝶呤组合，与异环磷酰胺、依托泊苷和高剂量阿糖胞苷(R-CODOX-M/IVAC)交替进一步施用于受试者施用。在一些实施例中，将CD19 CAR疗法与BCL2抑制剂组合施用，任选地进一步包括施用R-CODOX-M/IVAC。在实施例中，受试者患有B细胞淋巴瘤(例如，高级别B细胞淋巴瘤(例如，双和/或三打击淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤)、DLBCL或FL。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗和/或来那度胺组合施用于受试者。来那度胺((RS)-3-(4-氨基-1-氧代1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)是免疫调节剂。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗和来那度胺组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有滤泡性淋巴瘤(FL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。在实施例中，受试者患有FL并且之前未用癌症疗法治疗。在实施例中，将来那度胺以约10-20mg(例如，10-15或15-20mg)的剂量施用，例如每天施用。在实施例中，例如静脉内地将利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、或475-500mg/m2)的剂量施用。
示例性mTOR抑制剂包含例如坦罗莫司；地磷莫司(ridaforolimus)(正式地称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且描述于PCT公布号WO 03/064383中)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，/>)；塞马莫德(simapimod)(CAS 164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-,内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)(SEQ ID NO:1316)和XL765。/>
示例性免疫调节剂包括例如阿托珠单抗(可购自)；聚乙二醇非格司亭来那度胺(CC-5013，/>)；沙利度胺/>actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白介素1、白介素2、和干扰素γ的人细胞因子的混合物，CAS 951209-71-5，可购自IRX治疗公司(IRX Therapeutics))。
示例性蒽环霉素包括例如，多柔比星(和/>)；博莱霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素、和盐酸红比霉素，/>)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸盐脂质体，/>)；米托蒽醌(DHAD，)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(/>Idamycin/>)；丝裂霉素C/>格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。
示例性长春花生物碱包括例如，酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛/>)；长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，/>和/>)；和长春瑞滨/>
示例性蛋白体抑制剂包含硼替佐米卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；艾沙佐米柠檬酸盐(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与本妥昔单抗(brentuximab)组合施用于受试者。本妥昔单抗是抗CD30抗体和单甲基奥瑞斯他汀E的抗体-药物缀合物。在实施例中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)，例如复发性或难治性HL。在实施例中，受试者包含CD30+HL。在实施例中，受试者已经历了自体干细胞移植(ASCT)。在实施例中，受试者未经历ASCT。在实施例中，例如每3周，例如静脉内地将本妥昔单抗以约1-3mg/kg(例如约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3mg/kg)的剂量施用。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与本妥昔单抗和达卡巴嗪组合或与本妥昔单抗和苯达莫司汀组合施用于受试者。达卡巴嗪是化学名称为5-(3,3-二甲基-1-三苄基)咪唑-4-甲酰胺的烷化剂。苯达莫司汀是化学名称为4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷化剂。在实施例中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)。在实施例中，受试者先前未用癌症疗法治疗。在实施例中，受试者的年龄是至少60岁，例如60、65、70、75、80、85岁或更大年龄。在实施例中，例如静脉内地将达卡巴嗪以约300-450mg/m2(例如约300-325、325-350、350-375、375-400、400-425、或425-450mg/m2)的剂量施用。在实施例中，例如静脉内地将苯达莫司汀以约75-125mg/m2(例如75-100或100-125mg/m2，例如约90mg/m2)的剂量施用。在实施例中，例如每3周，例如静脉内地将本妥昔单抗以约1-3mg/kg(例如约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3mg/kg)的剂量施用。
在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与CD20抑制剂，例如抗CD20抗体(例如抗CD20单或双特异性抗体)或其片段组合向受试者施用。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、TRU-015(Trubion制药公司)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、和Pro131921(基因泰克公司(Genentech))。参见例如，Lim等人Haematologica.[血液学]95.1(2010):135-43。
包含CD20抑制剂的给药方案描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731中，该申请通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，将本文所述的一种或多种表达CAR的细胞与溶瘤病毒组合施用。在实施例中，溶瘤病毒能够选择性地复制并引发癌细胞的死亡或减缓其生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞没有影响或影响很小。溶瘤病毒包括但不限于溶瘤腺病毒、溶瘤性单纯疱疹病毒、溶瘤性逆转录病毒、溶瘤性细小病毒、溶瘤性痘苗病毒、溶瘤性辛奈病毒(oncolytic Sinbis viru)、溶瘤性流感病毒、或溶瘤性RNA病毒(例如，溶瘤性呼肠孤病毒、溶瘤性新城疫病毒(NDV)、溶瘤性麻疹病毒、或溶瘤性水疱性口炎病毒(VSV))。
在一些实施例中，溶瘤病毒是US 2010/0178684 A1中描述的病毒，例如重组溶瘤病毒，该专利通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，重组溶瘤病毒包含编码免疫应答或炎性应答抑制剂的核酸序列(例如，异源核酸序列)，例如如US 2010/0178684 A1中所述，该专利通过引用以其全文并入本文。在实施例中，重组溶瘤病毒(例如溶瘤NDV)包含促凋亡蛋白(例如凋亡蛋白)、细胞因子(例如GM-CSF、干扰素-γ、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α)、免疫球蛋白(例如针对ED-Bfirbonectin的抗体)、肿瘤相关抗原、双特异性衔接蛋白(例如针对NDV HN蛋白的双特异性抗体或抗体片段以及T细胞共刺激受体，如CD3或CD28；或人IL-2与针对NDV HN蛋白的单链抗体之间的融合蛋白)。参见例如，Zamarin等人FutureMicrobiol.[未来微生物学]7.3(2012):347-67，该文献通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，溶瘤病毒是描述于US 8591881 B2、US 2012/0122185 A1、或US 2014/0271677A1(每个专利均通过引用以其全文并入本文)中的嵌合溶瘤NDV。
在一些实施例中，将本文所述的溶瘤病毒通过注射(例如，皮下、动脉内、静脉内、肌肉内、鞘内、或腹膜内注射)施用。在实施例中，将本文所述的溶瘤病毒通过肿瘤内、透皮、经粘膜、口服、鼻内、或经由肺部施用。
在实施例中，与降低Treg细胞群的分子组合向受试者施用表达本文所述CAR的细胞。减少(例如，耗减)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如，CD25耗减、环磷酰胺施用、调制GITR功能。不希望受理论的束缚，据信在单采术之前或施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量，并降低受试者的复发风险。
在实施例中，与降低Treg细胞群的分子组合向受试者施用本文所述的表达CAR的细胞。减少(例如，耗减)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如，CD25耗减、环磷酰胺施用和调制GITR功能。不希望受理论的束缚，据信在单采术之前或施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量，并降低受试者的复发风险。在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子(如GITR激动剂和/或耗减调节性T细胞(Treg)的GITR抗体)组合施用至受试者。在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与环磷酰胺组合施用至受试者。在一个实施例中，GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或耗减Treg的GITR抗体)在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采术之前施用。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，将环磷酰胺施用于受试者。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，将环磷酰胺和抗GITR抗体施用于受试者。
在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如，本文所述的GITR激动剂)组合施用至受试者。在一个实施例中，在表达CAR的细胞之前施用GITR激动剂。例如，在一个实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采之前施用。
示例性GITR激动剂包括例如，GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，例如，像描述于以下中的GITR融合蛋白，美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505B1、美国专利号：8,586,023、PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754，或描述于例如以下的抗GITR抗体：美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO 2013/039954、PCT公开号：WO 2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO 2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO2001/03720、PCT公开号：WO99/20758、PCT公开号：WO 2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号：7,618,632、和PCT公开号：WO 2011/051726。
在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与激酶抑制剂组合施用。示例性激酶抑制剂及其用途描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731中，该申请通过引用以其全文并入本文。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂组合施用于受试者。IDO酶及其用途描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第292-293页，该文献通过引用并入本文。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)的调节剂组合施用于受试者。MDSC和可用于调制MDSC的组合物描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第293-294页，该文献通过引用并入本文。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与CD19 CART细胞(例如，CTL019，例如如WO2012/079000中所述，该专利通过援引并入本文)组合施用于受试者。在实施例中，在施用(例如，输注)表达非CD19CAR的细胞(例如本文所述的表达非CD19 CAR的细胞)之前、并行或之后向受试者施用CD19 CART。
在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还表达靶向CD19的CAR，例如CD19 CAR。在实施例中，将表达本文所述CAR的细胞和CD19 CAR施用于受试者以治疗本文所述的癌症。在实施例中，CAR分子的一者或两者的构型包括初级细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在另一个实施例中，CAR分子的一者或两者的构型包含初级细胞内信号传导结构域和两个或更多个(例如2、3、4或5个或更多个)共刺激信号传导结构域。在这样的实施例中，本文所述的CAR分子和CD19 CAR可具有相同或不同的初级细胞内信号传导结构域、相同或不同的共刺激信号传导结构域、或相同数量或不同数量的共刺激信号传导结构域。替代性地，本文所述的CAR和CD19 CAR被配置为分离型CAR，其中CAR分子之一包含抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，4-1BB)，而另一CAR分子包含抗原结合结构域和初级细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)。
在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽、或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如hetIL-15(Admune疗法有限公司(Admune Therapeutics,LLC)))两者的组合进行组合施用至受试者。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的异源二聚体非共价复合物。hetIL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413、和U.S.2011/0081311中，这些文献通过引用并入本文。在实施例中，皮下施用het-IL-15。
在实施例中，向患有本文所述的疾病(例如血液学障碍，例如淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤)的受试者施用本文所述的表达CAR的细胞与2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731第296-297页所述的试剂的组合，该申请通过引用并入本文。
药物组合物和治疗
在一些方面，本发明的药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如如本文所述的多种表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的总量和频率将由如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。
在一个实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自由以下组成的组的污染物：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体封装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施例中，细菌是选自由以下组成的组的至少一种：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。在一些实施例中，可以将包含本文所述的细胞(例如，T细胞)的药物组合物以下述剂量施用：104至109个细胞/kg体重，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。在一些实施例中，可以将本文所述的细胞(例如，T细胞)以3x104、1x106、3x106或1x107个细胞/kg体重施用。还可以将细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包含约1x 105、2x 105、5x105、1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x108或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包含至少约1x 105、2x 105、5x 105、1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19细胞)的剂量包含高达约1x 105、2x 105、5x 105、1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19或CAR细胞)的剂量包含约0.1x 106–1.8x 107个细胞/kg、约0.1x 106至3.0x106个细胞/kg、约0.5x 106至约2.5x 106个细胞/kg、约8x 105–3.0x 106个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19细胞)的剂量包含约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5x 106个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括约0.2x 106个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括约0.6x 106个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括约1.2x 106个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括约2.0x 106个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括约1x107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x109、2x 109或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括至少约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括高达约1x 107、2x 107、5x 107、1x108、2x 108、5x108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞。
在某些方面，可能需要将激活的细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至受试者，并且然后随后重新抽取血液(或进行单采术)，根据本发明激活来自血液的细胞，并用这些激活和扩增的细胞重新输注入患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以将来自10cc至400cc抽血的细胞(例如，T细胞或NK细胞)激活。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的细胞(例如，T细胞或NK细胞)激活。
能以任何常规方式施用主题组合物，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文所述的组合物。在一方面，通过皮内或皮下注射将本发明的细胞组合物(例如，T细胞或NK细胞组合物)施用至患者。在一方面，通过i.v.注射来施用本发明的细胞组合物(例如，T细胞或NK细胞组合物)。可以将细胞组合物(例如，T细胞或NK细胞组合物)直接注射到肿瘤、***或感染部位。
在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采法，其中离体收集、富集、或耗减白细胞以选择和/或分离目的细胞(例如T细胞)。可以将这些细胞分离物(例如，T细胞或NK细胞分离物)通过本领域已知的方法扩增，并进行处理，使得可以引入本发明的一种或多种CAR构建体，从而产生本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后或与移植并行，受试者接受扩增的本发明的表达CAR的细胞的输注。在另外的方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
有待向患者施用的以上治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和该治疗的受者而变化。可以根据本领域接受的做法来进行人施用的剂量的缩放。治疗剂，例如抗体，例如CAMPATH对于成人患者的剂量例如可以在1至约100mg的范围内，例如每日施用，持续1天与30天之间的时间段。合适的日剂量为每天1至10mg，但在一些情况下，可以使用每天多达40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。
在一个实施例中，例如使用体外转录将CAR引入到细胞(例如，T细胞或NK细胞)中，并且使受试者(例如，人)接受本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)的初始施用以及本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)的一次或多次后续施用，其中将一次或多次后续施用在先前的施用之后少于15天，例如在14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天进行施用。在一个实施例中，将本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)的多于一次施用每周施用至受试者(例如，人)，例如每周施用本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)的2、3、或4次施用。在一个实施例中，受试者(例如，人受试者)每周接受多于一次表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)的施用(例如每周2、3或4次施用)(在本文中也称为周期)，随后一周未施用表达CAR的细胞(例如，未施用CAR T细胞)，并且然后将表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)的一次或多次另外的施用(例如，每周表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)的多于一次的施用)施用至受试者。在另一个实施例中，受试者(例如，人受试者)接受表达CAR的细胞(例如，CART细胞)的多于一次的周期，并且每个周期之间的时间小于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一个实施例中，每隔一天施用表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)，每周施用3次。在一个实施例中，施用本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)持续至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一些实施例中，受试者可以是成人受试者(即18岁及以上)。在某些实施例中，受试者可以在1岁与30岁之间。在一些实施例中，受试者为16岁或以上。在某些实施例中，受试者在16与30岁之间。在一些实施例中，受试者是儿童受试者(即1与18岁之间)。
在一方面，使用慢病毒病毒载体(如慢病毒)产生表达CAR的细胞，例如CART。以这种方式产生的表达CAR的细胞，例如CART将具有稳定的CAR表达。
在一方面，使用病毒载体如γ逆转录病毒载体(例如本文所述的γ逆转录病毒载体)产生表达CAR的细胞，例如CART。使用这些载体产生的CART可以具有稳定的CAR表达。
在一方面，转导后，表达CAR的细胞，例如CART瞬时表达CAR载体，持续4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR的瞬时表达可能受RNA CAR载体递送的影响。在一方面，通过电穿孔将CAR RNA转导到细胞(例如，NK细胞或T细胞)中。
适应症
在一些实施例中，本披露提供了治疗患有血液学癌症(例如淋巴瘤)的受试者的方法。在一些方面，本披露提供了治疗患有淋巴瘤(例如，本文披露的B细胞淋巴瘤，例如高级别B细胞淋巴瘤、DLBCL、多发性骨髓瘤或FL)或有患淋巴瘤风险的受试者的方法，该方法包括施用表达结合B细胞抗原(例如，本文所述的B细胞抗原)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞与细胞凋亡抑制剂(例如，BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或其组合)或MYC抑制剂中的一种或多种的组合。在一些方面，本披露提供了治疗患有白血病(例如，本文披露的急性白血病，例如急性髓性白血病(AML))或有患白血病风险的受试者的方法，该方法包括施用表达结合B细胞抗原(例如，本文所述的B细胞抗原)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞与细胞凋亡抑制剂(例如，BCL2抑制剂、BCL6抑制剂或其组合)或MYC抑制剂中的一种或多种的组合。
在其他方面，本披露提供了治疗患有淋巴瘤(例如，本文所述的淋巴瘤)的受试者的方法，该淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性(例如，高级别B细胞淋巴瘤)。该方法包括向该受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂中的一种或多种，其中该受试者是或被鉴定为是与B细胞抗原结合的CAR疗法的无应答者、部分应答者或复发者。
在另一方面，本披露提供了用于治疗或预防患有淋巴瘤(例如本文所述的淋巴瘤)的受试者对表达结合B细胞抗原的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群发生复发的方法，该淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物的水平和/或活性，该方法包括向已经历、正在经历、或将接受CAR疗法的受试者施用BCL-2抑制剂、BCL-6抑制剂或MYC抑制剂、或其组合，从而治疗或预防对该CAR疗法的复发。
在一些方面，受试者患有或已经被鉴定为患有白血病，例如，急性白血病，包括但不限于急性髓性白血病(AML)、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、急性淋巴性白血病(ALL)；或慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施例中，白血病是急性髓性白血病(AML)。
在一些方面，受试者患有或已经被鉴定为患有淋巴瘤(例如，复发性和/或难治性淋巴瘤)。在一些实施例中，淋巴瘤选自：高级别B细胞淋巴瘤、DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病症、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或浆母细胞性淋巴瘤。在一些实施例中，淋巴瘤是高级别B细胞淋巴瘤(例如，双和/或三打击淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤)。在一些实施例中，淋巴瘤是双打击淋巴瘤。在一些实施例中，淋巴瘤是三打击淋巴瘤。在一些实施例中，淋巴瘤是DLBCL(例如。复发性和/或难治性DLBCL)。在一些实施例中，淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤(FL)。
在一些实施例中，本文所述的B细胞淋巴瘤是复发性或难治性淋巴瘤，其中受试者包含表8中部分代谢应答和部分放射学应答，或进展性代谢疾病或进展性疾病的一个或多个标准。在一些实施例中，患有复发性或难治性B细胞淋巴瘤的受试者可能包含例如，新的骨髓受累、新的恶性积液、基线后CT扫描或MRI上任何轴>1.5cm(例如，先前正常的***在任何轴上变得>1.5cm)的新的结节性病变、或基线后CT扫描或MRI上的任何离散的结外病变(包括肝脏或脾脏)、或自任何残留***或肿块的基线的长轴增加≥50％。
表8：B细胞淋巴瘤(例如DLBCL和FL)的总体应答评估
/>
/>
/>
高级别B细胞淋巴瘤
在一些实施例中，受试者患有高级别B细胞淋巴瘤，例如，双打击淋巴瘤、三打击淋巴瘤或非特指型(NOS)高级别淋巴瘤。在一些实施例中，受试者患有双打击淋巴瘤。在一些实施例中，受试者患有三打击淋巴瘤。在一些实施例中，受试者小于18岁。在一些实施例中，受试者是成人。
在一些实施例中，患有高级别淋巴瘤(例如，双或三打击淋巴瘤)的受试者具有MYC基因或基因产物的改变和抗凋亡基因产物(例如，BCL2和/或BCL6)的改变，导致增加的MYC基因或基因产物和抗凋亡基因或基因产物(例如，BCL2和/或BCL6)表达和/或活性。在一些实施例中，改变是基因重排，例如易位。在一些实施例中，双打击淋巴瘤通过MYC基因或基因产物、BCL2基因或基因产物、和/或BCL6基因或基因产物的改变来分类。在一些实施例中，三打击淋巴瘤通过MYC基因或基因产物、BCL2基因或基因产物、和BCL6基因或基因产物的改变来分类。在一些实施例中，高级别淋巴瘤(例如，双打击淋巴瘤)包含8q24/MYC和18q21/BCL2、或8q24/MYC和3q27/BCL-6的染色体断裂点。在一些实施例中，高级别淋巴瘤(例如，三打击淋巴瘤)包含8q24/MYC、18q21/BCL2和3q27/BCL-6的染色体断裂点。
在一些实施例中，使用FISH测定和/或免疫组织化学测定通过肿瘤活检来诊断患有高级别B细胞淋巴瘤(例如，双打击或三打击淋巴瘤)的受试者。
DLBCL和复发性/难治性DLBCL
在一些实施例中，受试者患有DLBCL。在一些实施例中，受试者患有复发性或难治性DLBCL。在一些实施例中，受试者为至少18岁。在一些实施例中，DLBC产生于包含生发中心B细胞(GCB细胞)的细胞群。在一些实施例中，DLBCL产生于包含活化的B细胞(ABC细胞)的细胞群。在一些实施例中，DLBCL产生于未分类细胞群。在一些实施例中，DLBCL的来源细胞通过基于免疫组织化学(IHC)的算法(例如，Choi算法)或微阵列来鉴定
在一些实施例中，患有DLBCL(例如，复发性或难治性DLBCL)的受试者先前已经施用了以下中的一种或多种：抗CD20疗法、基于蒽环类的化疗或干细胞治疗，例如同种异体或自体SCT，例如如本文所述，作为例如第一、第二或第三线疗法。在一些实施例中，受试者对例如复发性、难治性、进展性疾病或已失败的第一、第二或第三线疗法没有应答。
在一些实施例中，例如，根据本文所述的剂量方案，向患有复发性或难治性DLBCL的受试者施用组合疗法，该组合疗法包含BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合以及表达CAR的细胞。在一些实施例中，受试者先前已经用BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合治疗，例如至少4-6周或8-10周。
在一些实施例中，在单采前，例如至少约21天(例如21-30天，例如单采前28天)，每天向受试者施用BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合。在一些实施例中，在单采后和CAR疗法施用(例如输注)之前，向受试者施用BTK抑制剂至少约21天，例如10-100天。
在一些实施例中，与单采并行或单采之后，向受试者施用BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合。在一些实施例中，在单采后和CAR疗法施用(例如输注)之前，向受试者施用BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合至少约21天，例如10-100天。在一些实施例中，例如每天向受试者连续施用BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合。在一些实施例中，向受试者施用0.6-6.0x 108个表达CAR的细胞。
在一些实施例中，在开始BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合之后，但在施用CAR疗法之前，向受试者施用淋巴细胞耗减。在一些实施例中，淋巴细胞耗减包括施用环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施例中，淋巴细胞耗减包括每天施用500mg/m2环磷酰胺持续2天，以及每天施用30mg/m2氟达拉滨持续3天。在一些实施例中，淋巴细胞耗减包括每天施用250mg/m2环磷酰胺持续3天，以及每天施用25mg/m2氟达拉滨持续3天。在一些实施例中，淋巴细胞耗减始于施用第一剂量的氟达拉滨。在一些实施例中，环磷酰胺和氟达拉滨在同一天施用。在一些实施例中，环磷酰胺和氟达拉滨不在同一天施用。在一些实施例中，连续几天施用每日剂量。在实施例中，淋巴细胞耗减包括施用苯达莫司汀。在一些实施例中，例如静脉内地将苯达莫司汀以约75-125mg/m2(例如75-100或100-125mg/m2，例如约90mg/m2)的剂量每日施用(例如，每日两次)。在一些实施例中，以90mg/m2每日的剂量施用苯达莫司汀，例如2天。在一些实施例中，受试者患有癌症(例如，如本文所述的血液学癌症)。
在实施例中，向受试者施用第一淋巴细胞耗减方案和/或第二淋巴细胞耗减方案。在实施例中，第一淋巴耗减方案在第二淋巴耗减方案之前施用。在实施例中，第二淋巴耗减方案在第一淋巴耗减方案之前施用。在实施例中，第一淋巴细胞耗减方案包括环磷酰胺和氟达拉滨，例如，每天250mg/m2环磷酰胺持续3天，以及每天25mg/m2氟达拉滨持续3天。在实施例中，第二淋巴细胞耗减方案包括苯达莫司汀，例如每天90mg/m2，例如持续2天。在实施例中，第二淋巴细胞耗减方案作为替代性淋巴细胞耗减施用，例如，如果受试者经历了对包含环磷酰胺的淋巴细胞耗减方案的副作用，例如4级***。在一些实施例中，淋巴瘤是DLBCL，例如复发性或难治性DLBCL(例如，r/r DLBCL)，例如，CD19+r/r DLBCL。在一些实施例中，受试者是成人，并且淋巴瘤是r/r DLBCL。
在一些实施例中，施用本文所述的疗法(例如，包含表达CAR的疗法的疗法，例如，包含表达CAR19疗法的疗法(例如，表达CAR19的疗法与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合的组合))的受试者先前已经接受例如，施用了疗法的一个或多个线，例如疗法的2、3、4或5个线或更多个线(例如，如本文所述的一种或多种治疗)，和/或受试者不符合干细胞疗法(SCT)的条件或已经失败，例如自体或同种异体SCT。在一些实施例中，受试者先前已经接受了疗法的2个或更多个线，该疗法包含利妥昔单抗和蒽环类。在一些实施例中，受试者不符合自体SCT的条件或已经失败。在一些实施例中，将表达CAR19的疗法(例如，与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合进行组合)施用于先前经历了疗法的2个或更多个线和/或不适合或已经失败的自体SCT的受试者，导致对该疗法(例如，包含表达CAR19的疗法的疗法(例如，与BCL2抑制剂、BCL6抑制剂、MYC抑制剂或其组合的组合))的应答，例如，高应答率和/或持久应答。在一些实施例中，受试者患有血液学癌症，例如，DLBCL，例如复发性和/或难治性DLBCL。
滤泡性淋巴瘤
在一些实施例中，受试者患有滤泡性淋巴瘤(FL)。在一些实施例中，FL也被称为非霍奇金淋巴瘤。在一些实施例中，受试者患有复发性或难治性FL。在一些实施例中，可以将FL分类为I期淋巴瘤、II期淋巴瘤、III期淋巴瘤或IV期淋巴瘤。FL和FL的标准护理描述于Luminaari S等人(2012)；Rev Bras Hematol Hemoter.[Bras血液透析仪评论]34(1):54-59中，该文献的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，患有FL(例如，复发性或难治性FL)的受试者先前已经施用了以下中的一种或多种：例如作为一线、二线或三线疗法的化疗、免疫疗法、放射疗法或放射免疫疗法。在一些实施例中，受试者已经施用了：抗CD20疗法(例如，利妥昔单抗)；基于蒽环类的化疗；干细胞疗法，例如同种异体或自体SCT；或放射免疫疗法。在一些实施例中，受试者对例如复发性、难治性、进展性疾病或已失败的第一、第二或第三线疗法没有应答。
在一些实施例中，FL进展为高级别淋巴瘤(例如，双打击淋巴瘤)。
多发性骨髓瘤
在一些实施例中，受试者患有多发性骨髓瘤。在一些实施例中，受试者患有无症状性骨髓瘤(例如，冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)。在一些实施例中，受试者患有复发性或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施例中，可以使用修订版国际分期***(RISS)将多发性骨髓瘤分类为I期、II期或III期多发性骨髓瘤。
在一些实施例中，患有多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)的受试者先前已经施用了以下中的一种或多种：例如作为一线、二线或三线疗法的化疗、免疫疗法、放射疗法或放射免疫疗法。在一些实施例中，受试者已经施用了：抗CD20疗法(例如，利妥昔单抗)；基于蒽环类的化疗；干细胞疗法，例如同种异体或自体SCT；或放射免疫疗法。在一些实施例中，受试者对例如复发性、难治性、进展性疾病或已失败的第一、第二或第三线疗法没有应答。在一些实施例中，受试者对多发性骨髓瘤疗法的应答是基于IMWG 2016标准来确定的，例如，如Kumar等人,Lancet Oncol.[柳叶刀肿瘤学]17,e328-346(2016)，其通过引用以其整体并入本文，例如，如表16中所述。
实例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
实例1：JULIET试验中肿瘤亚型和基因组学与司利弗明治疗复发性/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(r/r DLBCL)患者疗效结果的相关性
在JULIET试验中，司利弗明(自体抗CD19 CAR-T细胞疗法)在患有r/r DLBCL的成年患者中显示出持久的应答和可管理的安全性。本实例描述了基因组分析，以进一步表征接受司利弗明治疗的r/r DLBCL患者亚组的疗效结果。
方法：JULIET(NCT02445248)是患有r/r DLBCL(对疗法的≥2个先前线复发或难治)的成年患者的全球性的自体抗CD19 CAR-T细胞疗法的2期试验。中位随访时间为40.3个月。评估了MYC过表达、肿瘤微环境(TME)特征(包括CD3+T细胞浸润、骨髓衍生的抑制细胞[MDSC]和通过荧光免疫组织化学[IHC]表达的LAG3)、活化的B细胞/生发中心B细胞[ABC/GCB]亚型、双/三打击(DH/TH)状态和基因突变(包括TP53)与疗效结果(最佳总体应答[BOR]、在第3个月[M3]的应答、无进展和总生存期[PFS/OS])之间的关系。
结果：115名患者接受了自体抗CD19 CAR-T细胞输注。在6个月时接受CR的患者中，估计86％的患者在第36个月时仍有应答。此外，在有应答的61名患者中，在第24个月和第30个月时无复发的概率为60.4％；未达到中位应答持续时间(DOR)(95％ CI，10-不可估计[NE])(图19)。所有115名输注患者的中位OS为11.1个月(95％CI，6.6-23.9)。第12、24和36个月的生存概率分别为48.2％、40.4％和36.2％(图20)。在M3时，未达到CR(n＝37)或PR(n＝7)的患者的中位OS；80％的完全应答(CR)患者的OS受益≥20个月。没有检测到新的安全信号。在23名持续CR和B细胞计数可用的患者中，11名患者的CD19+B细胞在1年后恢复正常(80个细胞/μL)，其中CD20+和CD22+B细胞的模式相似(图21)。第24个月和第42个月的PFS分别为33％和31％(图16)。在6个月时出现CR的患者中，3名患者在6个月后复发，1名患者在12个月后复发(图16)。
对于MYC表达，在通过免疫组织化学(IHC)检测基线肿瘤活检的111名患者中，73名患者对MYC表达呈阳性(MYC(+)定义为>40％的细胞表达MYC，如由IHC测量的)，38名患者对MYC表达呈阴性(MYC(-)定义为≤40％的细胞表达MYC，如由IHC测量的)。MYC(+)和MYC(-)患者的BOR率分别为44％(95％CI，32-56)和63％(95％CI，46-78)；M3应答率分别为30％(95％CI，20-42)和50％(95％CI，33-67)(表6和图14)。到第6个月，与18/73(25％)的MYC(+)患者相比，18/38(47％)MYC(-)患者为CR/PR。MYC(-)患者(n＝24)在第6个月时开始，DOR处于79％的平台期。与MYC(+)患者相比，基线MYC(-)状态与改善的结果相关，包括更长的中位DOR(未达到，并且分别为19个月[95％ CI，3.4-NE])，PFS(分别为6.2个月[95％ CI，2.9-NE]和2.5个月[95％ CI，1.7-3.0])，以及OS(分别为21个月[95％ CI，10-NE]和7.8个月[95％ CI，4.6-18])(图4A-AC)。因此，与MYC(-)患者相比，MYC(+)患者倾向于具有更短的PFS和OS，并且治疗前患者中高基线的MYC表达与更差的PFS和OS相关(图4A-4C)。
表6：在MYC阳性和MYC阴性患者中测量的最佳总体应答和第3个月时的应答
在73名MYC(+)患者中，其中70名还通过FISH测试了MYC、BCL2和BCL6的重排，以识别双打击(DH)(MYC/BCL2或MYC/BCL6)或三打击(TH)(MYC/BCL2/BCL6)淋巴瘤。在70名MYC(+)患者中，20名患有DH/TH淋巴瘤，并且BOR率为40％(95％ CI，19-64)。MYC(+)但非DH/TH淋巴瘤患者的BOR率为48％(95％ CI，34-63)。患有DH/TH淋巴瘤的患者在M3时的应答率为20％(95％ CI，6-44)，而MYC(+)但非DH/TH淋巴瘤患者的应答率为36％(95％ CI，23-51)(表7和图14)。与其他患者相比，患有DH/TH淋巴瘤的患者也倾向于具有更短的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)(图1A-B，比较MYC阴性患者、MYC阳性和DH/TH阴性患者以及MYC阳性和双/三打击阳性患者；图2A-2B，比较MYC阴性和DH/TH阴性患者，以及MYC阳性和DH/TH阳性患者)。通过Choi算法评估的ABC/GCB亚型似乎与应答无关。
表7：在对双或三打击(DH/TH)淋巴瘤也为阳性或阴性的MYC阳性患者以及MYC阴性患者中测量的最佳总体应答和第3个月时的应答
此外，在以下患者中评估了对CART19疗法的应答持续时间(DOR)：MYC(-)患者；MYC(-)患者和双/三打击阴性患者；MYC(+)和双/三打击阴性患者；以及MYC(+)和双/三打击阳性患者，并且被IHC鉴定为MYC阳性的少于75％的患者对CART19疗法保持超过6个月的应答(图3A-3B)。
当在治疗后1个月评估时，复发性或难治性DLBCL和其他B细胞淋巴瘤亚群的患者(包括对MYC呈阳性的患者、对MYC呈阴性的患者和/或对DH/TH淋巴瘤呈阳性的患者)对CART19治疗的应答是相当的(图5)。然而，在3个月(图14)和6个月(图6)时，患有DH/TH淋巴瘤和具有高MYC表达的患者似乎更频繁地复发。
此前有报道称，高水平的基线乳酸脱氢酶(LDH)和3-4级神经事件(NE)与不良疗效结果相关(Westin等人ASH 2019)。与其他患者的14％(12/88)相比，40％(8/20)的患有DH/TH淋巴瘤的患者的LDH水平>正常值上限的2倍。在多变量Cox分析中，当对基线LDH和NE分级进行调整时，DH/TH与较短的PFS和OS相关，而MYC+状态与较短的PFS相关，但与OS无关。
在基线活检的TME分析中，与CD3+T细胞>3％的患者(n＝64)相比，肿瘤浸润CD3+T细胞的低频率(临界值≤3％；n＝16)与较短的中位DOR、PFS(分别为2.2个月[95％ CI，0.92-2.8]和4.2个月[95％ CI，2.6-21])和OS(分别为7个月[95％ CI，1.8-12]和21个月[95％ CI，6.7-NE])相关(图13A-13C)。在第6个月，基线肿瘤中肿瘤浸润CD3+T细胞≤3％的患者中，只有2/16(13％)有应答，而肿瘤浸润CD3+T细胞>3％的患者中，只有23/36(64％)有应答。基线肿瘤活检中肿瘤浸润性CD3+T细胞低或无(≤3％)的患者(n＝16)富含无应答者(图22)。
对肿瘤浸润性CD3+细胞上检查点分子表达的询问显示，与LAG3+CD3+T细胞<20％的患者相比，CD3+T细胞中LAG3+CD3+频率最高的患者(临界值≥20％；n＝12)在基线时的中位PFS(2.1[95％ CI，0.82-3.1]，并且为4.2个月[95％ CI，2.4-21])和OS(4.3[95％ CI，2.7-10]和21个月[95％ CI，10-NE])降低(n＝68；图15A-15C)。肿瘤浸润CD3+T细胞群中LAG3+CD3+细胞频率最高的患者(临界值>20％；n＝12)在第3个月时大多是无应答者(图23)，并且所有12名LAG3+CD3+细胞(来自肿瘤浸润CD3+T细胞)>20％的患者在第6个月时是无应答者。
此外，在一个小数据集中，基线时代表骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)表型的CD11b+HLA-DR细胞频率最高的患者富含无应答者。在TME的所有CD11b+髓系细胞中，在第3个月和第9个月，大约6/9和7/9的无应答者分别具有高水平(≥1％)的CD11b+HLADR-MDSC(图17A和图17B)。
在包括浸润的T细胞、CD3+LAG3+T细胞、MYC和LDH的生存树分析中，与正常LDH和MYC(+)相比，MYC(-)状态和输注前LDH水平正常的患者(n＝16)具有更好的PFS，并且具有比正常上限(ULN)高1-2倍或>2倍的LDH的患者具有较差的PFS(图18和表10)。具有正常LDH的MYC(-)患者(n＝16)在6个月时发生PFS的概率为81％，并且从12个月开始稳定在75％。
表10：输注前LDH水平
对46名基线患者样品进行全外显子组测序，以研究基因亚型与M3应答之间的相关性。将样品分组为新鉴定的DLBCL亚群(Chapuy等人Nat Med[自然医学]2018；Schmitz等人NEngl J Med[新英格兰医学杂志]2018)没有揭示与应答的关联(在单基因水平的突变中没有观察到与应答的显著关联)(图24)。据报道，TP53的缺失/突变是DLBCL的危险因素。发现28％(13/46)的测序患者有TP53突变，但未观察到与应答的关联。与没有应答的患者相比，在获得应答的患者中没有观察到肿瘤突变负荷的明显差异。
概述JULIET研究的长期数据显示，有应答的患者持续受益，其中80％的CR患者从司利弗明中获得长期OS受益(≥20个月)。然而，与来自具有复发性或难治性DLBCL的非GCB亚型的患者相比，JULIET试验中表现出双或三打击淋巴瘤以及高MYC表达的患者倾向于对CART19治疗的更快地复发。MYC过表达或T细胞应答受限的免疫抑制性TME可能会影响DLBCL患者的CART细胞疗效，因为低至无CD3+T细胞以及TME内CD3+LAG3+T细胞或MDSC的增加与更差的结果相关。与MYC过表达和高输注前LDH水平相比，MYC(-)状态和正常输注前LDH水平显示了改善的结果。综上所述，生物标志物分析的结果暗示了潜在的耐药或免疫抑制机制，这些机制可能通过限制T细胞应答和促进不利的TME来影响DLBCL患者的CAR-T细胞疗效。
实例2：体外双打击淋巴瘤模型对CART19治疗敏感性的评估
该实例描述了体外双打击淋巴瘤细胞系的CART19杀伤的评估。
将SuDHL6双打击淋巴瘤细胞用Cell Trace Far Red染料标记，并以50,000个细胞/孔的浓度铺在96孔板中。这些细胞在增加量的染料标记的CART19细胞或不含CAR(UTD)的未转导的T细胞(阴性对照)的存在下生长，并孵育44小时。以使得效应T细胞与SuDHL6靶细胞的计算比率(E:T)为0.63、1.25、2.5、5和10的浓度添加CART19细胞或未转导的对照T细胞(图1)。作为对照，在不存在任何效应细胞的情况下，经SuDHL6细胞进行铺板并使其生长。孵育后，将经处理和未经处理的SuDHL6细胞洗涤，并用活力染料Zombie Aqua染色，随后通过流式细胞仪分析。基于活/死细胞表型对细胞进行分类和门控。通过从活的、未经处理的SuDHL6细胞的百分比中减去用CART19细胞或未转导的对照T细胞处理后剩余的活细胞的百分比，计算被添加的效应细胞杀死的细胞的百分比(％)。
如图7所示，SuDHL6双打击淋巴瘤细胞似乎对CART19活性难治，因为对于所研究的效应细胞与肿瘤细胞的所有比率，观察到低于50％的杀伤。
实例3：体外双打击淋巴瘤模型对CART19治疗与BCL2抑制剂的组合的敏感性的评估
该实例描述了CART19细胞与BCL2抑制剂的组合在体外杀死双打击淋巴瘤细胞的评估。
将SuDHL6双打击淋巴瘤细胞用Cell Trace Far Red染料标记，并用浓度递增(30nM、100nM和300nM)的BCL2抑制剂(Bcl2i)维奈托克或DSMO(阴性对照)预孵育四小时。然后如实例1所述将SuDHL6细胞铺板，并使其在增加量的染料标记的CART19细胞或不含CAR(UTD)的未转导的T细胞(阴性对照)存在下生长至少44小时。以使得效应T细胞与SuDHL6靶细胞的计算比率(E:T)为0.31、0.63、1.25、2.5、5和10的浓度添加CART19细胞或未转导的对照T细胞(图8)。作为对照，在不存在任何效应细胞或BCL2抑制剂的情况下，经SuDHL6细胞进行铺板并使其生长。如实例1中所述，孵育后，将经处理和未经处理的SuDHL6细胞洗涤，并用活力染料Zombia Aqua染色，随后通过流式细胞仪分析。通过从活的、未经处理的SuDHL6细胞的百分比中减去用CART19细胞或未转导的对照T细胞处理后剩余的活细胞的百分比，计算被添加的效应细胞杀死的细胞的百分比(％)。
如图8所示，与单独的CART19细胞或BCL2抑制剂相比，添加BCL2抑制剂与CART19细胞的组合导致对SuDHL6细胞的杀伤的剂量依赖性增加。当SuDHL6细胞与300nM的BCL2抑制剂预孵育，随后用CART19细胞以效应细胞与靶细胞的比率为2处理时，特别观察到这种杀伤的增加，因为这导致60％的双打击淋巴瘤细胞的杀伤，相比之下，在相同的效应子与靶细胞的比率下仅用CART19细胞杀死20％的细胞。因此，BCL2抑制剂改善了对SuDHL6双打击淋巴瘤细胞中CART19细胞的体外应答。
实例4：双打击淋巴瘤体内模型的评估
该实例描述了双打击淋巴瘤的体内鼠模型的发展。
将十只NOD scidγ(NSG)小鼠皮下植入5e6个SuDHL6细胞/小鼠的剂量。从植入后第11天开始，每三天对这些小鼠的肿瘤生长进行监测，这是肿瘤首次可触知的时候。在采样的每个时间点通过卡尺测量来量化肿瘤体积(图9)。如图9所示，所有十只小鼠在植入后第11天出现可触知的肿瘤，并且这些肿瘤在植入后第19-28天达到大约1000-15000mm3的体积。该实例证明，植入小鼠中的SuDHL6细胞可用作体内双打击淋巴瘤模型，用于研究对CART19组合疗法(例如，本文所述的CART19组合疗法)的应答。
实例5：体内双打击淋巴瘤模型对CART19治疗与BCL2抑制剂的组合的敏感性的发展
该实例描述了在鼠模型中CART19细胞与BCL2抑制剂的组合在体内杀死双打击淋巴瘤细胞的评估。
将NOD scidγ(NSG)小鼠皮下植入5e6个SuDHL6细胞/小鼠的剂量。在植入后第15天，将小鼠随机分成治疗组，这些组包括：PBS媒介物阴性对照(图10A)；PBS媒介物和100mg/kg的BCL2抑制剂维奈托克(图10A)；不含CAR(UTD)的1.45e6个未转导T细胞(图10B)；不含CAR(UTD)的1.45e6个未转导的T细胞和100mg/kg BCL2抑制剂维奈托克(图10B)；1e6个CART19细胞(阳性率为68％，注射的细胞总数为1.45e6)(图10C)；以及1e6和CART19细胞和100mg/kg的BCL2抑制剂维奈托克(图10C)。每日施用BCL2抑制剂，直到处死。每三天监测一次这些小鼠的肿瘤生长情况。在采样的每个时间点通过卡尺测量来量化肿瘤体积(图10A-C)。与PBS载媒介物处理的对照(图10A，左)或未转导的CART对照细胞(图10B，左)相比，当作为单一药剂施用时，BCL2抑制剂(图10A，右)和CART19细胞(图10C，左)减缓了肿瘤生长。然而，与单独施用CART19细胞(图10C，左)相比，BCL2抑制剂与CART19细胞组合施用(图10C，右)产生更好的肿瘤细胞杀伤和更有效的肿瘤清除。
此外，从治疗后第1周到第4周，每周收集血液。将血液溶解以去除红细胞，并对剩余的白细胞进行染色用于标志以定量CD3+T细胞(图11A-11C)。BCL2抑制剂维奈托克与未转导的CART对照细胞(图11A)或CART19细胞(图11B)组合施用不影响治疗小鼠中的T细胞生长或动力学。图11C提供了一个概述，描绘了所指示治疗组中每周每20μL的血液定量的T细胞的平均数量。
等同物
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容据此通过引用以其全文并入本文。虽然已经参照具体方面披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等同变化。

Claims (38)

1.一种用于治疗患有或被鉴定为患有B细胞淋巴瘤的受试者的方法，所述B细胞淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性，所述方法包括：
向所述受试者施用包含表达与CD19结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群的疗法(“CD19 CAR疗法”)与BCL2抑制剂的组合，从而治疗所述受试者的B细胞淋巴瘤。
2.一种治疗患有B细胞淋巴瘤的受试者的方法，所述B细胞淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性(例如，高级别B细胞淋巴瘤)，所述方法包括：
向所述受试者施用BCL2抑制剂，其中所述受试者是或被鉴定为是所述CD19 CAR疗法的无应答者、部分应答者或复发者。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述受试者已经历、正在经历、或将接受所述CD19CAR疗法。
4.一种治疗或预防患有淋巴瘤的受试者对表达与CD19结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群(“CD19 CAR疗法”)发生复发的方法，所述淋巴瘤具有增加的MYC基因或基因产物和/或抗凋亡基因或基因产物水平和/或活性(例如，高级别B细胞淋巴瘤)，所述方法包括：
向已经历、正在经历、或将接受所述CD19 CAR疗法的受试者施用BCL2抑制剂，从而治疗或预防对所述CD19 CAR疗法发生的复发。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有MYC基因或基因产物的改变，或抗凋亡基因或基因产物的改变，或其组合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有增加的MYC基因或MYC基因产物水平，例如，增加的对MYC基因或MYC基因产物呈阳性的细胞的数量，例如，如通过使用FISH测定或免疫组织化学测定检测重排，例如易位而鉴定的。
7.如权利要求6所述的方法，其中例如，通过检测来自所述受试者的样品例如肿瘤活检或血液样品中大于40％的细胞对MYC基因产物的表达呈阳性，例如，通过免疫组织化学测定的，所述受试者被鉴定为是MYC阳性的。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述MYC阳性受试者被进一步鉴定为具有增加的BCL2基因或基因产物和/或BCL6基因或基因产物水平，例如，如通过使用FISH测定或免疫组织化学测定检测样品例如肿瘤活检或血液样品中的重排，例如易位而鉴定的。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中具有增加的所述BCL2基因或基因产物水平或增加的所述BCL6基因或基因产物水平的所述MYC阳性受试者被鉴定为患有双打击(DH)淋巴瘤，例如MYC和BCL2或MYC和BCL6阳性淋巴瘤。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中具有增加的BCL2基因或基因产物水平和BCL6基因或基因产物水平的所述MYC阳性受试者被鉴定为患有三打击(TH)淋巴瘤，例如MYC、BCL2和BCL6阳性淋巴瘤。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述淋巴瘤选自高级别B细胞淋巴瘤(例如，双打击淋巴瘤、三打击淋巴瘤或非特指型NOS高级别淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或滤泡性淋巴瘤。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述淋巴瘤是高级别B细胞淋巴瘤。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述高级别B细胞淋巴瘤是双打击淋巴瘤。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述高级别B细胞淋巴瘤是三打击淋巴瘤。
15.如权利要求11所述的方法，其中淋巴瘤是DLBCL，例如，复发性或难治性DLBCL。
16.如权利要求11或15所述的方法，其中所述DLBCL产生于包含生发中心B细胞(GCB细胞)、活化的B细胞(ABC细胞)或未分类细胞的细胞群。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述DLBCL产生于包含生发中心B细胞(GCB细胞)的细胞群。
18.如权利要求11或15-17中任一项所述的方法，其中所述DLBCL是复发性或难治性DLBCL。
19.如权利要求11所述的方法，其中所述淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤(FL)。
20.如权利要求11或19所述的方法，其中所述FL是复发性或难治性FL。
21.如权利要求1-2或4-20中任一项所述的方法，其中所述受试者已经历、正在经历所述CD19 CAR疗法，或将接受所述CD19 CAR疗法。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用所述CD19CAR疗法治疗后，所述受试者已经复发，或被鉴定为已经复发。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于以下项中的一项或多项，所述受试者已经复发或被鉴定为已经复发：
(1)在完全应答后，骨髓受累，例如病变的再现；
(2)在完全应答后，恶性积液的再现；
(3)在完全应答后，通过CT扫描或MRI检测到大于1.5cm的结节性病变(例如，先前正常的***变得大于1.5cm)的再现；
(4)在完全应答后，通过CT扫描或MRI检测到离散的结外病变(包括肝脏或脾脏)的再现；或者
(5)残留***或肿块的大小，例如自所述***或肿块的基线的长轴增加≥50％。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中并行或依序施用所述CD19 CAR疗法和所述BCL2抑制剂。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述CD19 CAR疗法之前、并行和/或之后，用所述BCL2抑制剂治疗所述受试者。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在接受所述CD19CAR疗法或所述BCL2抑制剂之前、期间或之后，评估所述受试者是否存在所述MYC基因或基因产物的改变，或所述抗凋亡基因或基因产物的改变，或其组合。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR疗法包含含有抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域的CD19 CAR。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述CD19 CAR的抗CD19结合结构域包含表2或3中列出的任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个，以及表2或3中列出的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述CD19 CAR的抗CD19结合结构域包含SEQID NO:1-12或SEQ ID NO:59的氨基酸序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
30.如权利要求27或28所述的方法，其中所述抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:59的序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR包含SEQ ID NO:31-42或SEQ ID NO:58中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:58的氨基酸序列，或与其具有至少95％同一性的序列。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CD19 CAR疗法是包含CTL-019或CTL-119或两者的疗法。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述CD19 CAR疗法。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述BCL2抑制剂选自维奈托克(ABT-199)、那维托克莱克斯(ABT-263)、ABT-737、BP1002、SPC2996、APG-1252、奥巴克拉甲磺酸盐(GX15-070MS)、PNT2258或奥利默森(G3139)、或组合。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述BCL2抑制剂是维奈托克。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括施用针对DLBCL的标准护理，例如，CD20抑制剂、化学治疗剂和/或皮质类固醇。
38.一种组合，所述组合包含CD19 CAR疗法和BCL2抑制剂。
CN202180082205.7A 2020-11-13 2021-11-12 使用表达嵌合抗原受体（car）的细胞的组合疗法 Pending CN116635062A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063113749P 2020-11-13 2020-11-13
US63/113,749 2020-11-13
PCT/US2021/059143 WO2022104061A1 (en) 2020-11-13 2021-11-12 Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116635062A true CN116635062A (zh) 2023-08-22

Family

ID=79317133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180082205.7A Pending CN116635062A (zh) 2020-11-13 2021-11-12 使用表达嵌合抗原受体（car）的细胞的组合疗法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240033358A1 (zh)
EP (1) EP4243857A1 (zh)
JP (1) JP2023549504A (zh)
KR (1) KR20230107617A (zh)
CN (1) CN116635062A (zh)
AU (1) AU2021378316A1 (zh)
CA (1) CA3198447A1 (zh)
IL (1) IL302700A (zh)
MX (1) MX2023005609A (zh)
WO (1) WO2022104061A1 (zh)

Family Cites Families (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4433059A (en) 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
DE3381783D1 (de) 1982-03-03 1990-09-13 Genentech Inc Menschliches antithrombin iii, dns sequenzen dafuer, expressions- und klonierungsvektoren die solche sequenzen enthalten und damit transformierte zellkulturen, verfahren zur expression von menschlichem antithrombin iii und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JPH021556A (ja) 1988-06-09 1990-01-05 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ハイブリッド抗体及びその作製方法
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5273743A (en) 1990-03-09 1993-12-28 Hybritech Incorporated Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
GB9012995D0 (en) 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
DE69309472T2 (de) 1992-01-23 1997-10-23 Merck Patent Gmbh Fusionsproteine von monomeren und dimeren von antikörperfragmenten
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
DE69318016D1 (de) 1992-05-08 1998-05-20 Creative Biomolecules Inc Mehrwertige Chimäre Proteine Anologe und Verfahren zu deren Anwendungen
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5844094A (en) 1992-09-25 1998-12-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization Target binding polypeptide
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
GB9323648D0 (en) 1992-11-23 1994-01-05 Zeneca Ltd Proteins
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
WO1996013583A2 (en) 1994-10-20 1996-05-09 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
JPH11508126A (ja) 1995-05-23 1999-07-21 モルフォシス ゲゼルシャフト ファー プロテインオプティマイルング エムベーハー 多量体タンパク質
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
AU731826B2 (en) 1996-02-28 2001-04-05 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Synthetic Multimerizing Agents
DE19608769C1 (de) 1996-03-07 1997-04-10 Univ Eberhard Karls Antikörper BV10A4H2
JP2000508892A (ja) 1996-04-04 2000-07-18 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ 多価および多特異的抗原結合タンパク
EP1947183B1 (en) 1996-08-16 2013-07-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Mammalian cell surface antigens; related reagents
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
AU7266898A (en) 1997-04-30 1998-11-24 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2304254C (en) 1997-06-11 2012-05-22 Hans Christian Thogersen Trimerising module
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
JP2001520039A (ja) 1997-10-21 2001-10-30 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子レセプター様タンパク質、ｔｒ１１，ｔｒ１１ｓｖ１およびｔｒ１１ｓｖ２
US6670453B2 (en) 1997-10-27 2003-12-30 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent antigen-binding proteins
EP1049787B1 (en) 1998-01-23 2004-11-24 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Multipurpose antibody derivatives
CA2319236A1 (en) 1998-02-09 1999-08-12 Genentech, Inc. Novel tumor necrosis factor receptor homolog and nucleic acids encoding the same
US20040040047A1 (en) 1998-03-30 2004-02-26 Spencer David M. Regulated apoptosis using chemically induced dimerization of apoptosis factors
CZ121599A3 (cs) 1998-04-09 1999-10-13 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
ATE376837T1 (de) 1999-07-12 2007-11-15 Genentech Inc Stimulierung oder hemmung von angiogenese und herzvaskularisierung mit tumor nekrose faktor ligand/rezeptor homologen
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2001062895A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
EP1299419A2 (en) 2000-05-24 2003-04-09 Imclone Systems, Inc. Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
CA2417185A1 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Shui-On Leung Multivalent target binding protein
US20040242847A1 (en) 2000-10-20 2004-12-02 Naoshi Fukushima Degraded agonist antibody
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
WO2002072635A2 (en) 2001-03-13 2002-09-19 University College London Specific binding members
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
WO2003049684A2 (en) 2001-12-07 2003-06-19 Centocor, Inc. Pseudo-antibody constructs
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
ATE512989T1 (de) 2002-04-15 2011-07-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verfahren zur herstellung von scdb-bibliotheken
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
WO2004094613A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
CA2525717A1 (en) 2003-05-23 2004-12-09 Wyeth Gitr ligand and gitr ligand-related molecules and antibodies and uses thereof
US7700097B2 (en) 2003-06-27 2010-04-20 Biogen Idec Ma Inc. Purification and preferential synthesis of binding molecules
JP5026072B2 (ja) 2003-07-01 2012-09-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 二重特異性抗体の多価キャリヤー
EP1660126A1 (en) 2003-07-11 2006-05-31 Schering Corporation Agonists or antagonists of the clucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor (gitr) or its ligand for the treatment of immune disorders, infections and cancer
US7696322B2 (en) 2003-07-28 2010-04-13 Catalent Pharma Solutions, Inc. Fusion antibodies
EP2272566A3 (en) 2003-08-18 2013-01-02 MedImmune, LLC Humanisation of antibodies
EP1660534A2 (en) 2003-08-22 2006-05-31 MedImmune, Inc. Humanization of antibodies
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
WO2005055808A2 (en) 2003-12-02 2005-06-23 Genzyme Corporation Compositions and methods to diagnose and treat lung cancer
WO2005062916A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Centocor, Inc. Methods for generating multimeric molecules
GB0329825D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Celltech R&D Ltd Biological products
US20050266425A1 (en) 2003-12-31 2005-12-01 Vaccinex, Inc. Methods for producing and identifying multispecific antibodies
US8383575B2 (en) 2004-01-30 2013-02-26 Paul Scherrer Institut (DI)barnase-barstar complexes
WO2006107617A2 (en) 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
WO2006083289A2 (en) 2004-06-04 2006-08-10 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
EP1866339B8 (en) 2005-03-25 2021-12-01 GITR, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
CA2605024C (en) 2005-04-15 2018-05-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
PL1899364T3 (pl) 2005-05-17 2020-08-24 University Of Connecticut Kompozycje i sposoby immunomodulacji w organizmie
US20060263367A1 (en) 2005-05-23 2006-11-23 Fey Georg H Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
RU2515108C2 (ru) 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
DE602005018477D1 (de) 2005-08-26 2010-02-04 Pls Design Gmbh Bivalente IgY Antikörperkonstrukte für diagnostische und therapeutische Anwendungen
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US8623356B2 (en) 2005-11-29 2014-01-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerization-activated therapeutic agents
GEP20135924B (en) 2005-12-02 2013-10-10 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York Univ Chimeric viruses presenting non-native surface proteins and usage thereof
CN102796743B (zh) 2006-01-13 2015-11-18 美国政府健康及人类服务部国立卫生研究院 用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的IL-15和IL-15Rα基因
EP1981969A4 (en) 2006-01-19 2009-06-03 Genzyme Corp ANTI-GITRANT ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
JP2009526857A (ja) 2006-02-15 2009-07-23 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 機能性抗体
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
US8946391B2 (en) 2006-03-24 2015-02-03 The Regents Of The University Of California Construction of a multivalent scFv through alkyne-azide 1,3-dipolar cycloaddition
ES2654040T3 (es) 2006-03-31 2018-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos
ES2469676T3 (es) 2006-05-25 2014-06-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Complejos moleculares dim�ricos
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
JP2009539413A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 トゥルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質
US8497246B2 (en) 2006-08-18 2013-07-30 Armagen Technologies, Inc. Methods for diagnosing and treating CNS disorders by trans-blood-brain barrier delivery of protein compositions
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
WO2008140477A2 (en) 2006-11-02 2008-11-20 Capon Daniel J Hybrid immunoglobulins with moving parts
WO2008140621A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
EP2626372B1 (en) 2007-03-29 2018-03-21 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
WO2008131242A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
ES2466916T3 (es) 2007-06-27 2014-06-11 Admune Therapeutics Llc Complejos de IL-15 e IL-15R alfa y usos de los mismos
ES2591281T3 (es) 2007-07-12 2016-11-25 Gitr, Inc. Terapias de combinación que emplean moléculas de enlazamiento a GITR
JP2010535032A (ja) 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
WO2009021754A2 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Monospecific and multispecific antibodies and method of use
EP2650311A3 (en) 2007-11-27 2014-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
TW200944231A (en) 2007-11-30 2009-11-01 Glaxo Group Ltd Antigen-binding constructs
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
AR071891A1 (es) 2008-05-30 2010-07-21 Imclone Llc Anticuerpos humanos anti-flt3 (receptor tirosina cinasa 3 tipo fms humano)
KR20110044992A (ko) 2008-07-02 2011-05-03 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 ＴＧＦ-β 길항제 다중-표적 결합 단백질
CN102149820B (zh) 2008-09-12 2014-07-23 国立大学法人三重大学 能够表达外源gitr配体的细胞
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
US8546399B2 (en) 2009-05-26 2013-10-01 Abbvie Inc. Apoptosis inducing agents for the treatment of cancer and immune and autoimmune diseases
ES2598005T3 (es) 2009-08-14 2017-01-24 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Uso de IL-15 para aumentar la salida del timo y para tratar la linfopenia
LT3023438T (lt) 2009-09-03 2020-05-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-gitr antikūnai
US9181527B2 (en) 2009-10-29 2015-11-10 The Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient T cell compositions
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
SI2496698T1 (sl) 2009-11-03 2019-07-31 City Of Hope Skrajšan epiderimalni receptor faktorja rasti (EGFRt) za selekcijo transduciranih T celic
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US9023996B2 (en) 2009-12-23 2015-05-05 Synimmune Gmbh Anti-FLT3 antibodies
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
WO2011159847A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1) single chain fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
CA2805442C (en) 2010-07-21 2020-05-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of an hla locus
KR102062407B1 (ko) 2010-12-09 2020-01-03 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도
EP2694549B1 (en) 2011-04-08 2018-08-15 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant iii chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2013039954A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Sanofi Anti-gitr antibodies
CN104114579B (zh) 2011-10-27 2020-01-24 健玛保 异二聚体蛋白的生成
CN104159909A (zh) 2012-02-22 2014-11-19 宾夕法尼亚大学董事会 产生用于癌症治疗的t细胞持续性群体的组合物和方法
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
KR20200110711A (ko) 2012-09-07 2020-09-24 제넨테크, 인크. Ｉｉ형 항-ｃｄ20 항체와 선택적 ｂｃｌ-2 억제제와의 병용 치료요법
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
JP6552965B2 (ja) 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
PT3300745T (pt) 2013-02-15 2019-11-27 Univ California Recetor de antigénio quimérico e métodos de utilização do mesmo
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
NZ711946A (en) 2013-03-14 2020-05-29 Icahn School Med Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
AU2014236726A1 (en) 2013-03-14 2015-09-17 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlling T cell proliferation
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
EP3004168A4 (en) 2013-05-24 2017-03-01 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
JP6467406B2 (ja) 2013-06-05 2019-02-13 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド カスパーゼポリペプチドを使用して部分的なアポトーシスを誘導するための方法
JP6793902B2 (ja) 2013-12-20 2020-12-02 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
SI3280729T1 (sl) 2015-04-08 2022-09-30 Novartis Ag Terapije CD20, terapije CD22 in kombinacija terapij s celico, ki izraža himerni antigenski receptor CD19 (CAR)
US9615622B2 (en) 2015-09-02 2017-04-11 Nike, Inc. Footwear with rimmed sole structure
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20220249637A1 (en) * 2019-06-12 2022-08-11 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell-mediated cytotoxic therapy and an inhibitor of a prosurvival bcl2 family protein

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230107617A (ko) 2023-07-17
CA3198447A1 (en) 2022-05-19
AU2021378316A1 (en) 2023-06-01
EP4243857A1 (en) 2023-09-20
US20240033358A1 (en) 2024-02-01
IL302700A (en) 2023-07-01
MX2023005609A (es) 2023-05-29
JP2023549504A (ja) 2023-11-27
WO2022104061A1 (en) 2022-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11939389B2 (en) BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
US11084880B2 (en) Anti-BCMA chimeric antigen receptor
EP3283619B1 (en) Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3172234B1 (en) Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
CN107580628B (zh) 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
WO2018201056A1 (en) Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN114945382A (zh) Cd19和cd22嵌合抗原受体及其用途
EP3856782A1 (en) Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
US20240033358A1 (en) Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
RU2785658C2 (ru) Химерные антигенные рецепторы для bcma и пути их применения
BR122023022573A2 (pt) Moléculas de ácido nucleico isoladas, receptores de antígeno quimérico de bcma e usos dos mesmos, moléculas de polipeptídeo isoladas, domínios de ligação anti-bcma, vetores, células e métodos de produção das mesmas
BR112016022798B1 (pt) Usos de células que expressam car19, método de produção de células que expressam car19, misturas reacionais, e composições e seus usos

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination