JPH05203652A

JPH05203652A - 抗体酵素免疫分析法

Info

Publication number: JPH05203652A
Application number: JP3575792A
Authority: JP
Inventors: Yumiko Wada; 裕美子和田; Mitsunori Ono; 光則小野; Masayoshi Yamamoto; 正義山本; Yukio Sudo; 幸夫須藤
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1992-01-28
Filing date: 1992-01-28
Publication date: 1993-08-10

Abstract

(57)【要約】【構成】リガンドに対する抗体の半量体と、検出可能
な信号を発生することのできる抗体酵素の半量体とから
なる２頭抗体を、リガンドに接触させ、リガンドに結合
した（又はしていない）２頭抗体の抗体酵素の活性を測
定することを特徴とする抗体酵素免疫分析法。【効果】２頭抗体は通常の抗体と同様の２量体構造で
あり、化学的な修飾はされていないので抗体活性は損な
われていない。また、抗体酵素の酵素活性も、損なわれ
ることがない。この２頭抗体以外には酵素等の添加を必
要としないので、添加酵素の非特異吸着に伴うＳ／Ｎ比
の低下等も生じない。抗リガンド抗体に対する抗体酵素
の割合を最大比の１とすることになるから、高い検出感
度が望める。従って高感度かつ再現性の良い分析ができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗体酵素を用いる免疫分
析法に関するものであり、詳しくは２頭抗体を用いた抗
体酵素免疫分析法に関する。

【０００２】

【発明の背景】血液や尿等の分析は、病態の診断や治療
経過の判定に非常に有用であり、臨床検査の分野で重要
な役割を果たしている。このような微量成分（リガン
ド）の分析方法として、該微量成分に対する抗体を用い
て免疫学的に測定する方法が広く応用されている（例え
ば「免疫学イラストレイテッド」多田富雄訳、南江堂、
1990年、p327-339参照）。免疫反応は抗原と抗体との間
の特異的かつ高親和性の反応であり、抗体と抗原の平衡
状態を標識抗原又は標識抗体とを用いて解析することに
より測定対象の抗原を定量することができる。この標識
として酵素を使用して酵素による化学増幅を利用したの
が酵素免疫測定法（エンザイムイムノアッセイ；ＥＩ
Ａ）である。酵素免疫測定法は、簡便かつ高感度な分析
方法として近年盛んに利用され、その詳細は例えば石川
栄治、辻章夫ら編集、「酵素免疫測定法」（共立出版、
1987年）に記載されている。

【０００３】現在、抗原測定のために最もよく使用され
ている酵素免疫測定法はいわゆるサンドイッチ法であ
る。サンドイッチ法は、２以上の抗原決定部位を持つ多
価抗原の測定法であり、異なる抗原決定部位に対する２
種類の抗体を用いる。代表的なサンドイッチＥＩＡ法
は、例えば次のようなステップで行なうことができる。１. 試料中の抗原を、固相化抗体（第１抗体）に結合さ
せる（第１免疫反応）。２. 未結合の抗原を除去する（洗浄）。３. 酵素標識抗体（固相化抗体とは異なる第２抗体）を
添加し、固相上の抗原に結合させる（第２免疫反応）。４. 未結合の酵素標識抗体を除去する（洗浄）。５. 酵素基質を加え、結合している酵素標識抗体量を測
定する（酵素反応）。このような方法では、第２抗体を酵素で標識し酵素標識
抗体を作る必要があり、抗体と酵素を主に架橋試薬を用
いて化学的に結合していた（例えば、石川栄治、河合
忠、宮井潔著「酵素免疫測定法」（医学書院、1987
年))。

【０００４】酵素免疫測定法では、使用する酵素標識抗
体の性能が測定感度、再現性などに大きな影響を与え
る。しかし、抗体と酵素とを化学結合させて得られる酵
素標識抗体は、この性能の点で問題がある。

【０００５】架橋試薬として代表的なグルタルアルデヒ
ドは、抗体、酵素のアミノ基と結合・架橋するが、その
結合はランダムであり抗体、酵素のアミノ基に無差別に
反応して抗体活性や酵素活性を損なう。また酵素のみが
重合したり抗体のみが重合したりするため標識効率が低
い。またランダムな反応の結果、ホモポリマーやヘテロ
ポリマーが多くなり、これらポリマーは一旦形成される
と、必要とする酵素標識抗体（酵素：抗体＝１：１の割
合で結合している複合体が理想的である）との分離が困
難であるため、ＥＩＡ法の感度・再現性を低下させる原
因となっていた。

【０００６】過ヨウ素酸法は、酵素の糖鎖を酸化してア
ルデヒド基を形成させ、このアルデヒド基と抗体のアミ
ノ基とを反応・結合させるものである。この方法では、
酵素活性の低下は少ないものの、抗体のアミノ基に対す
る選択性はないので、抗体活性の低下は免れない。また
糖鎖をもたない酵素には適用できない。

【０００７】マレイミド法は、ＩｇＧ抗体のヒンジ部に
あるチオール基に、酵素に導入したマレイミド基を結合
・架橋させる。この方法では、抗体活性部位から離れた
ヒンジ部分に選択的に酵素を結合できるので、抗体活性
の低下は少ない。しかし、酵素のアミノ基に対する選択
性はないから、酵素に２以上のアミノ基があれば酵素活
性は多少とも低下する。また１分子の酵素に２分子以上
の抗体が結合することになれば、抗体１分子当たりに対
する標識酵素の濃度は低くなり、感度の上昇は望めな
い。

【０００８】化学結合による酵素標識法は他にも種々あ
るが、得られる酵素標識抗体はいずれも上記と大同小異
の欠点を有している。またこれら化学結合による酵素標
識抗体は、抗体と酵素という分子量の大きい分子同士が
結合したものであるため、マイクロタイタープレートや
ビーズ等の固相に対する非特異的吸着性が増大するとい
う欠陥も生じやすい。そのため期待通りの感度が得られ
なくなったり、再現性が乏しくなるという問題もあっ
た。

【０００９】また，我々は、従来のような化学的に結合
した酵素抗体複合体を用いる代りに、酵素を２頭抗体
（ＢＳ抗体；Bi-specific antibody) に免疫学的に結合
させて酵素免疫分析を行う方法も開発し、この性能も検
討した（特願平3-113774）。この２頭抗体を用いる方法
によって感度、再現性に著しい向上が見られた。しかし
この方法は、反応系に多量の酵素を添加しなければなら
ないため、添加酵素の非特異的吸着によりＳ／Ｎ比が低
下するという新たな問題が生じてきた。

【００１０】

【発明の目的】本発明は、以上のような事情に鑑みなさ
れたものであり、抗体活性の低下が少なく、高感度かつ
再現性の良い分析が、Ｓ／Ｎ比の低下を伴わずに行なう
ことが出来る免疫測定法を提供することを目的とする。

【００１１】

【発明の構成】このような本発明の目的は、リガンドに
対する抗体の半量体と、検出可能な信号を発生すること
のできる抗体酵素の半量体とからなる２頭抗体を、リガ
ンドに接触させ、リガンドに結合した（又はしていな
い）２頭抗体の抗体酵素の活性を測定することを特徴と
する抗体酵素免疫分析法により達成された。

【００１２】

【作用】本発明では、従来のような化学的に結合した酵
素抗体複合体を用いる代りに、抗体酵素の２頭抗体（Ｂ
Ｓ抗体；Bi-specific antibody) を用いて免疫分析を行
う。これは、検出可能なシグナルを発生することのでき
る抗体酵素の半量体と、被検物（リガンド）に対する抗
原特異性を有する特異抗体の半量体とからなる２頭抗体
を用いることにより、問題となる感度の低下が見られな
くなるという発明者による知見に基づくものである。

【００１３】２頭抗体は通常の抗体と同様の２量体構造
であり、化学的な修飾はされていないので抗体活性は損
なわれていない。また、抗体酵素の酵素活性も、損なわ
れることがない。また、この２頭抗体以外には酵素等の
添加を必要としないので、添加酵素の非特異吸着に伴う
Ｓ／Ｎ比の低下等も生じない。

【００１４】

【発明の構成の詳細な説明】抗体酵素本発明における抗体酵素とは、その特異的結合対を別の
生成物に換える能力を有する抗体のいう。言い換えれ
ば、酵素活性（または触媒活性）を保持する抗体のこと
である。抗体酵素(Antibody Enzyme) は、また、触媒抗
体（catalytic Antibody）、Abzyme等と呼ばれるよばれ
ることもある。

【００１５】一般に、抗体は特定の分子（抗原）を識別
して特異的に結合する蛋白質として特徴づけられる。一
方、同じ蛋白質である酵素は特定の分子（酵素基質）に
特異的に結合するだけでなく、その分子の化学反応を触
媒する機能を有する。すなわち、酵素も抗体も特異的な
物質と結合対をつくることのできる生体内蛋白質ではあ
るが、抗体は、化学反応を触媒する能力がないという点
で、酵素と区別することができる。しかし、抗体は原理
的のほとんど全ての分子に対して特異的なものを得るこ
とが可能であることから、抗体と酵素とが共有する特
性、すなわち特異的に結合するという性格を基礎にし
て、化学反応を触媒するような抗体を得ることができな
いかとの試みがなされた。ただ初期の研究では、基質に
対する抗体を作製するものであったため、触媒効果を持
つ抗体を見つけるには至らなかった（Biochemistry, 5,
2836(1966) 、FEBS Letter, 100, 137(1979) ）。これ
に対して、P.G.SchulzらやR.A.Lernerらは、“酵素の活
性中心は、反応の遷移状態と相補的な構造を持つ”とい
うL.Pauling の考えに基づき、反応の遷移状態のアナロ
グに対する抗体を作製し、この抗体が触媒活性を持つこ
とを発見した（Science, 234, 1570(1986)，Science, 2
34,1566(1986)) 。その後、多数の研究者によりこのよ
うな触媒活性を持つ抗体が作製され、抗体酵素（触媒抗
体，Abzyme）という考えが広く認められるに至ってい
る。

【００１６】遷移状態アナログとは、ある酵素反応にお
いて遷移状態にある物質（中間体）と形も電荷もよく似
た安定な類似体であり、このような遷移状態アナログ
は、抗原として働いて抗体を誘導し、又できた抗体は、
反応過程の遷移状態にある物質に結合し、これを安定化
し、さらに触媒として機能する。例えばカルボン酸エス
テルの加水分解反応では、反応物であるエステルは一般
に電荷をもたない平面上の分子構造をとる。加水分解は
水分子の攻撃により始まり、電荷をもった四面体型中間
体（遷移状態）を経たのち、速やかにカルボン酸とアル
コールに分解するという経過をたどる。この中間体で
は、原子間の結合方向も変わるし、原子間距離も約1.2
倍ほどに伸びる。このような不安定な特徴からこれを単
離することはできず、その抗体を得ることはできない
（下記化１参照）。

【００１７】

【化１】

【００１８】しかし、この四面体構造の中央の炭素原子
（Ｃ）をリン原子（Ｐ）に置き換えると、よく似た立体
配置をとるリン酸エステルと呼ばれる安定な化合物とな
る。しかもリン−酸素間の結合距離は、通常の炭素−酸
素間の結合よりも約２０％長く、実際の遷移状態の結合
距離に近い。実際このような性質を備えたリン酸エステ
ルは、ある種の加水分解酵素を阻害することが知られて
いる。このような遷移状態アナログを抗原として免疫す
ることにより、この酵素活性をもった抗体、すなわち抗
体酵素を得ることができる。

【００１９】本発明における２頭抗体の半量体の一方と
して使用する抗体酵素とは、このような酵素活性を有す
る抗体をいう。本発明では抗体酵素を、従来の標識酵素
の代わりとして用いる。従って、ここで使用する抗体酵
素とは、基質から、検出可能な信号を発生することので
きる生成物又は分解物を生じることができるものであ
る。例えば、前記式１中のエステル分解により生じる生
成物が色素であるような物質を基質とするものがある。
なお、抗体酵素としては、遷移状態アナログをそのまま
免疫して得られたポリクローナルな抗体をそのまま用い
るよりも、モノクローナル抗体を作製して、高い触媒活
性を有するものを選択して、これを本発明の２頭抗体の
材料とするのが好ましい。

【００２０】２頭抗体免疫グロブリン（抗体）は１種類のものではなく、その
化学構造から幾つかのクラスに分類されるが、その基本
構造はＩｇＧに見られる構造である。すなわち、分子量
約25,000のＬ鎖と分子量約50,000のＨ鎖とがＳ−Ｓ結合
（ジスルフィド結合）して１つの単位（半量体）とな
り、これら等価な半量体がさらにＨ鎖のＳ−Ｓ結合で２
量体化して１つのＩｇＧ分子を形成する。抗原結合部位
（Ｆab部位）は各半量体にそれぞれ存在する。つまり、
ＩｇＧは抗原特異性は１つであるが２つの抗原分子に結
合する能力（同種２価）を有している。この同種２価の
ＩｇＧを化学的に処理することにより異なる２つの抗原
特異性を有する抗体（異種２価のいわゆる２頭抗体）を
作ろうとする概念自体は既に存在し、種々の方法が開発
されている。本発明で使用する２頭抗体はこれら公知技
術により作ることができ、検出可能なシグナルを発生す
ることのできる抗体酵素の半量体と、被検物（リガン
ド）に対する特異抗体の半量体とから構成される。

【００２１】例えば、Nisonoffら方法に従い、２種のＩ
ｇＧをペプシン消化してＦｃ部分を除去した後、それぞ
れ還元して半量体のＦab' を得、これを再酸化すること
により２頭抗体を作成できる（Arch. Biochem. Biophy
s.,90, 460-462, (1961))。この方法では、相異なる抗
体の半量体Ｆab' が結合した異種２価抗体の他に、同じ
抗原特異性の半量体Ｆab' が結合（自己会合）した同種
２価抗体も形成される。従ってこの場合には、同種２価
抗体から異種２価抗体を分離・精製する。或いは、Bren
nan らの方法に従い、半量体Ｆab' の一方をＳＨ基をニ
トロ安息香酸で一時的に保護してもよい（Science, 22
9, 81, (1985)) 。これにより２種のモノクローナル抗
体から異種２価の２頭抗体を選択的に作成できる。Bren
nanらの手法をさらに簡便化した奥村らの方法に従って
もよい（特開平2-76899)。

【００２２】なお上記の２頭抗体では、いずれもＦｃ部
分を除去したＦ(ab')₂を用いているが、Ｆｃ部分を除去
しないで還元して半量体を得て、これを他の半量体と酸
化・結合させてもよい。しかし、Ｆｃ部分は固相に非特
異的吸着しやすい。従って、高感度測定のためには、Ｉ
ｇＧをペプシン消化してＦｃ部分を除去し、さらに還元
して得られるＦab' を２頭抗体の材料とするのが望まし
い。

【００２３】また、２頭抗体は、２種類のハイブリドー
マを融合し、ヘテロハイブリドーマを作製することによ
っても作製することができる。また、ハイブリドーマ
と、脾臓細胞を融合することによっても作製することが
できる。モノクローナル抗体の作成方法、その精製方
法、Ｆ(ab')₂断片の取得方法は種々の成書に記載されて
いる方法により得ることができる（例えば、富山朔二ら
編、「単クローン抗体実験マニュアル」講談社刊、1988
年）。

【００２４】分析方法本発明による抗体酵素免疫分析法は、具体的には以下の
ように行うことができる。（図１参照）。 1) 試料中の抗原（リガンドＬ）１２を固相化抗体１０
に結合させる（第１免疫反応）。 2) 未結合の抗原１２を除去する（洗浄）。 3) リガンド特異抗体の半量体１４ａと酵素抗体の半量
体１４ｂからなる２頭抗体（BS-Ab)１４を添加し、固相
化抗原１０に結合している抗原１２に結合させる（第２
免疫反応）。 4) 抗原１２に未結合の２頭抗体を除去する（洗浄）。 5) 酵素基質（Ｓ）を加え、生成物（Ｐrod)を検出する
ことにより結合した２頭抗体量を測定する（酵素反
応）。

【００２５】以上は、サンドイッチ法に本発明を適用し
固相に結合した２頭抗体の抗体酵素活性を測定するよう
にしたものであるが、固相に結合しなかった遊離の２頭
抗体に結合した抗体酵素の活性を測定するようにしても
よい。また本発明の実施方法がこのようなサンドイッチ
法に限定されるわけではない。例えば、一定量の固相抗
原と試料中の抗原（リガンド）とを一定量の２頭抗体に
対して競合させ、固相に結合した２頭抗体の量を抗体酵
素活性測定により求めるようにしてもよい。また固相抗
原に予め２頭抗体を結合させておき、後から添加した試
料中の抗原（リガンド）との競合により減少した固相上
の２頭抗体の量を測定するようにしてもよい（いわゆる
置換法）。

【００２６】

【合成例１】抗体酵素用ハプテンの合成下記反応式により基質１からp-ニトロフェノール（黄
色：400nm に吸収）を生成する反応を想定し、これを触
媒する酵素抗体の作製を行なった。

【００２７】

【化２】

【００２８】まず上記反応の遷移状態アナログ（ハプテ
ン）として下記構造式の化合物を合成した。

【００２９】

【化３】

【００３０】その反応合成経路の概略を図２に示す。ま
ず、図２の化合物１（17g; 0.1モル）と化合物２（20g;
0.1モル）を混合し、160 ℃にて７時間加熱した。冷却
後、蒸留により低沸点部分を溜去すると目的とする化合
物３が13ｇ無色油として得られた。化合物３（6.5g; 0.
026 モル）を10mLのエタノールに溶解し、12N 塩酸を80
mL加えた。混合物を160 ℃に2.5 時間加熱した。冷却
後、溶媒を減圧溜去すると目的とする化合物４が4.4g固
形物として得られた。化合物４（5.1g; 0.028 モル）を
塩化チオニル40mLに溶解させ、４時間室温にて撹拌した
（この反応により化合物５が生成する）。過剰の塩化チ
オニルを減圧溜去後、残査をクロロホルム40mLに溶解
し、その中にｐ−ニトロフェノール（12g; 0.086モル）
とトリエチルアミン（8.7g; 0.086 モル）のクロロホル
ム溶液40mLを滴下した。滴下後、２時間室温にて撹拌
後、通常の後処理を行い、有機層を溜去すると結晶が得
られた。この結晶を酢酸エチル／ヘキサン混合溶媒にて
再結晶すると、目的とする化合物６が7.2g得られた。化
合物６（3.0g; 0.005 モル）を200mL の0.2N NaOH 溶液
に加えて、100 ℃にて1.5 時間加熱撹拌した。塩酸にて
酸性化した後、エーテルにて繰り返し抽出してニトロフ
ェノールを除去した。水層を集め、これをエバポレータ
ーで濃縮すると、白色結晶が析出した。エタノールにて
再結晶することにより、目的とする化合物７（遷移状態
アナログ）900mg が得られた。

【００３１】

【合成例２】ハプテン−ＫＬＨ複合体の合成合成例１で得た化合物７をハプテンとして、担体蛋白質
キーホール・リンペッド・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結
合し免疫用のハプテン−ＫＬＨを合成した。ハプテン
（化合物７：５mg）、Ｎ−ヒドロキシサクシミド（4mg
）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（7.4mg ）、ピ
ロリヂノピリジン（0.4mg ）を２mLの塩化メチレンに溶
解し，室温で１日反応させた。生成した尿素体を除去
後、ＫＬＨ水溶液（6mg/mL) を１mL静かに添加し、室温
で３時間反応させた。その後、水で２日間透析し、ハプ
テン−ＫＬＨ複合体を合成した。全く同様な手法によ
り、抗体力価測定用のハプテン−ＢＳＡ複合体を合成し
た。

【００３２】

【合成例３】基質の合成Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，２１７４−２
１７６（１９８７）に記載の方法により、下記構造の基
質１を合成した。

【００３３】

【化４】

【００３４】

【実施例】（１−１）抗体酵素の作製合成例２で合成したハプテン−ＫＬＨ複合体を，燐酸緩
衝溶液（10mM, pH7.4,0.9% NaCl含有) に溶かし、40μg
/mL溶液とした。これを等量のフロイント完全アジュバ
ントと混合したもの（追加免疫では、フロイントの不完
全アジュバントと混合して使用）500 μL を、Balb/Cマ
ウスに免疫した。追加免疫は、３週間ごとに４回行っ
た。その後、２月間免疫を中止した後、２週間ごとに２
回免疫をし抗体力価確認後、免疫マウスの脾臓を取り出
し、この脾臓細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２）とをポリ
エチレングリコールを用いる常法に従って細胞融合させ
た。ハプテン−ＢＳＡ複合体を固定したマイクロタイタ
ープレートを使用してＥＬＩＳＡ法でスクリーニング
し、ハプテン結合性の抗体産生細胞を９３種選択した。
この細胞をBalb/Cマウスに腹腔注射した。マウス腹腔内
で生産された抗体含有腹水を集め、硫酸アンモニウム沈
澱法によりＩｇＧ分画を回収した。得られたＩｇＧ分画
は、プロテインＡカラム（MAPS-2キット；バイオラッド
社製）により精製した。

【００３５】（１−２）抗体酵素の触媒能力の評価実施例１−１で選んだハプテン結合能力のある抗体の中
から、触媒能力の有る抗体を、次のような手法で選びだ
した。合成例３の基質１（0.12mg/mL;10mM Tris-HCl 緩
衝液; pH8.5 ）0.2mL と、精製抗体（2mg/ml) 0.1mL を
混合し、基質１が分解して生じたパラニトロフェノ−ル
の吸収を400nm で追跡した。９３種の抗体より、基質を
分解する能力のある抗体（抗体酵素）が、３クロ−ン
（抗体酵素４Ａ１，５Ｈ２，１Ｇ２）見つかった（図３
参照）。

【００３６】最も触媒能力が高かった抗体酵素４Ａ１に
ついて、その精製ＩｇＧを10mg/mL(酢酸緩衝液；pH4.2)
にして、その１mLに0.5mg のペプシン（Sigma 社製）を
添加し、37℃で20時間反応させた。反応後、Superdex-2
00カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過し、Ｆ(ab')₂
画分を得た。

【００３７】（２）抗ＣＲＰ抗体の作製市販のＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）を燐酸緩衝溶液（10mM,
pH7.4, 0.9% NaCl含有) に溶かし、400 μg/mL溶液とし
た。これを等量のフロイント完全アジュバントと混合し
たもの（追加免疫では、生理食塩水と混合して使用）50
0 μL を、Balb/Cマウスに免疫した。追加免疫は、２週
間ごとに５回行った。抗体力価確認後、免疫マウスの脾
臓を取り出し、この脾臓細胞とミエローマ細胞（ＳＰ
２）とをポリエチレングリコールを用いる常法に従って
細胞融合させた。ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングして得
られた抗体産生融合細胞をBalb/Cマウスに腹腔注射し
た。マウス腹腔内で生産された抗ＣＲＰ抗体含有腹水を
集め、硫酸アンモニウム沈澱法によりＩｇＧ分画を回収
した。得られたＩｇＧ分画は、プロテインＡカラム（MA
PS-2キット；バイオラッド社製）により精製した。精製
ＩｇＧを10mg/mL(酢酸緩衝液；pH4.2)にして、その１mL
に0.5mg のペプシン（Sigma 社製）を添加し、37℃で20
時間反応させた。反応後、Superdex-200カラム（ファル
マシア社製）でゲル濾過し、Ｆ(ab')₂画分を得た。

【００３８】（３）２頭抗体の作製（１−２）で作製した抗体酵素４Ａ１のＦ(ab')₂分画の
3mg/mL溶液（燐酸緩衝液;pH6）0.45mLに、0.5Mの2-メル
カプトアミン0.05mLを添加し、30℃で90分反応させて、
還元した。反応後、セファデックスG-25カラムによりゲ
ル濾過して、抗体酵素の半量体Ｆab' を得た。一方、
（２）で作製した抗ＣＲＰ抗体のＦ(ab')₂分画の3mg/mL
溶液（燐酸緩衝液;pH6）0.45mLには、5mM のジチオスラ
イトール0.05mLを添加し、30℃で30分反応させて還元し
た。反応後ジチオビスニトロ安息香酸（50mM）を0.05mL
添加して反応停止すると共に還元されたチオール基をマ
スキングした。このセファデックスG-25カラムによりゲ
ル濾過して、半量体の抗ＣＲＰ−Ｆab' を得た。こうし
て得られた抗体酵素の半量体Ｆab' と、抗ＣＲＰ抗体の
半量体Ｆab' とを、等量混合し室温下10時間放置するこ
とにより、会合させた。結合したＦ(ab')₂（２頭抗体）
はSuperdex-200カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過
して精製した。

【００３９】（４）比較例比較例として、化学結合による抗体酵素標識抗体を用い
た。すなわち、（１−１）の抗体酵素４Ａ１単量体と、
（２）の抗ＣＰＰ抗体単量体とを、グルタルアルデヒド
２段階法で結合させ、抗ＣＲＰ−抗体酵素複合体を作製
した。

【００４０】（５）抗ＣＲＰ固定化プレートの作製（２）で作製した抗ＣＲＰ・ＩｇＧ（50μg/mL,PBS溶
液）50μL を、96穴マイクロタイターテストプレート
（Nunc社製）の各ウェルに入れ、４℃で一晩感作した。
その後、各ウェルをＰＢＳで洗浄し、300 μL の３％BS
A 含有ＰＢＳ溶液を各ウェルに入れて、非特異的吸着部
位をブロックした。なお本実施例のサンドイッチ法で
は、固相化する第１抗体と２頭抗体の半量体とされた第
２抗体とは１つの抗原の異なる抗原決定基に結合するも
のであり、本来は異なる抗原特異性を有するものを使用
する。しかし、ＣＲＰは５量体であるので、本実施例で
は、２頭抗体に使用した抗ＣＲＰ抗体と同じ抗体を固相
化した。ただし固相化した抗ＣＲＰ抗体はペプシン消化
していないインタクトなＩｇＧを用いた。

【００４１】（６）ＣＲＰの定量ＣＲＰをＰＢＳ溶液で段階的に希釈し、各50μL を
（５）で作製した抗ＣＲＰ抗体固定化プレートの各ウェ
ルに入れ、37℃で２時間反応させた（第１免疫反応）。
その後ＰＢＳ溶液で３回洗浄して、未結合のＣＲＰを除
去した。各ウェルに（３）で作製した２頭抗体（10μg/
mL) を含有するＰＢＳ溶液100μL を加え、37℃で60分
間反応させた（第２免疫反応）。その後ＰＢＳ溶液で３
回洗浄した。次いで、合成例３の基質１を0.08mg/mL 含
有するTris-HCl緩衝液（pH8.5)を200 μL 加え、室温で
20分間放置した。その後、マイクロプレートリーダー
（コロナ社製）で各ウェルの400nm 吸光度を測定して、
検量線を作成した。

【００４２】比較例では，２頭抗体の代わりに、（４）
で作製した抗ＣＲＰ−抗体酵素複合体（12μg/mL) を含
有するＰＢＳ溶液を使用した。反応は、２頭抗体の場合
と同じである。図４に示すように、実施例（−○−）の
方が比較例（−●−）よりも約１０倍高感度であった。
このことは、抗体酵素は標識試薬として酵素活性を有す
るだけでなく、これを半量体として、抗リガンド抗体の
半量体と組み合わせた２頭抗体とした方が、より高感度
な免疫分析が可能となることを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫分析方法の説明概略図である。

【図２】本発明の実施例において抗体酵素作製のために
使用したハプテン（遷移状態アナログ）の合成経路を示
す図である。

【図３】ハプテン結合性抗体３６クローンの触媒活性能
を示す図である。

【図４】実施例及び比較例の結果を示す検量線を示す図
である。

【符号の説明】

１０固相化抗体、１２抗原（リガンド）１４２頭抗体１４ａ抗リガンド特異抗体の半量体１４ｂ酵素抗体の半量体

フロントページの続き (72)発明者須藤幸夫埼玉県朝霞市泉水三丁目11番46号富士写真フイルム株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リガンドに対する抗体の半量体と、検出
可能な信号を発生することのできる抗体酵素の半量体と
からなる２頭抗体を、リガンドに接触させ、リガンドに
結合した２頭抗体の抗体酵素の活性を測定することを特
徴とする抗体酵素免疫分析法。
【請求項２】リガンドに対する抗体の半量体と、検出
可能な信号を発生することのできる抗体酵素の半量体と
からなる２頭抗体を、リガンドに接触させ、リガンドに
結合していない２頭抗体の抗体酵素活性を測定すること
を特徴とする抗体酵素免疫分析法。