WO2007114325A1

WO2007114325A1 - 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法

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Publication number: WO2007114325A1
Application number: PCT/JP2007/057058
Authority: WO
Inventors: Tomoyuki Igawa; Hiroyuki Tsunoda
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2007-10-11
Also published as: JP6055271B2; ES2654040T3; HK1217217A1; EP4218801A2; US9670269B2; EP3345616A1; DK2009101T3; JPWO2007114325A1; US20170283483A1; US20090263392A1; CN105177091A; EP2009101B1; JP6219877B2; JP2015146822A; JP2013078313A; JP5144499B2; EP2009101A1; EP2009101A4; US10934344B2; EP4218801A3

Abstract

　二重特異性抗体を構成する2種類の抗体が、抗体可変領域の表面に存在するアミノ酸を改変することによって、2種類の抗体のH鎖の間に等電点の差異を導入し、等電点の違いを利用して、二重特異性抗体をクロマトグラフィーカラムで効率的に精製する方法を見出した。また等電点に差のある抗体の定常領域に各抗原結合部位（重鎖可変領域）を組み込み、これらを共発現させることによって、二重特異性抗体をクロマトグラフィーカラムで効率的に精製する方法を見出した。

Description

明細書

二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法

技術分野

[0001] 本発明は、二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法、該二重特異性抗体の分離方法、および該二重特異性抗体を有効成分として含有する医薬組成物等に関する。

背景技術

[0002] 抗体は血中での安定性が高ぐ副作用も少ないことから医薬品として注目されている。その中には二種類の抗原 (抗原 Aと抗原 B)を同時に認識できる二重特異性抗体がある（非特許文献 1)。現在、臨床試験が行なわれている MDX-210は、 Fc y RIを発現してレ、る monocyte等を HER-2/neuを発現してレ、る癌細胞に retargetingする IgG型二重特異性抗体である（非特許文献 2)。抗体の製造は、一般的に遺伝子組み換え技術を用いることが多レ、。具体的には、抗体の蛋白質をコードする DNAをハイブリド一マ、抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞、または抗体遺伝子を提示しているファージライブラリーからクローユングし、適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入し産生させる技術である。遺伝子組み換え技術を用いた IgG型二重特異性抗体の製造は、目的の二種類の IgGを構成する H鎖及び L鎖の遺伝子、合計 4種の遺伝子を細胞に導入し、共発現により分泌させる。このような発現において、野生型の H鎖及び L鎖の構成遺伝子を発現させた場合には、 2種類の H鎖の会合や H 鎖と L鎖の会合はランダムに起こるため、目的の二重特異性抗体の比率は極めて少なくなる。具体的には、目的の二重特異性抗体は 10種類中 1種類のみであり、生産効率は低下してしまう。目的抗体の生産効率の低下は、目的抗体の精製の障害になるばかりでなぐロット間差などの不均一性を増大させ、生産コストの肥大を招くことになる。

[0003] 二重特異性抗体を開発するための効率的な二重特異性抗体作製方法として、両 H 鎖に共通する L鎖を取得するための共通 L鎖取得技術および H鎖へテロ会合化のための Knobs-into-holes技術が報告されている。具体的には、抗原 Aと抗原 Bを認識する各 H鎖に対して、両抗原結合活性を維持することができる共通の L鎖をファージライブラリー（Phage library)等から見出し、さらに、一方の H鎖の CH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（knob;突起）に置換し、もう一方の H鎖の CH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖 (hole;空隙）に置換することにより突起が空隙内に配置されるようにして H鎖へテロダイマーの形成を促進し、目的の二重特異性抗体を効率的に取得することができる (特許文献 1、非特許文献 3、非特許文献 4)。

[0004] しかしながら、 H鎖へテロダイマーのために Knobs-into-holes技術を用いた場合でも、非特許文献 3、非特許文献 4に示されたように Knobs-into-holes技術によって目的の A鎖 B鎖へテロダイマーの含有率を最大 95%程度まで高めることが可能だ力残りの 5%は A鎖ホモダイマー、 B鎖ホモダイマーであり不純物となってしまう。医薬品として、二重特異性抗体を開発するためには、共通 L鎖 (非特許文献 3,非特許文献 4) を用いた場合に産生される 3種類の分子種 (A鎖ホモダイマー、 B鎖ホモダイマー、 A 鎖 B鎖へテロダイマー）の中から、可能な限り高純度に A鎖 B鎖へテロダイマーを精製する必要がある。そのため残りの 5%の不純物である A鎖ホモダイマー、 B鎖ホモダイマーを取り除き、 A鎖 B鎖へテロダイマーを医薬品として開発可能な高純度まで精製する必要がある。共通 L鎖を用い、 Knobs-into-holes技術を用いない場合は、理論上、 A鎖ホモダイマー、 A鎖 B鎖へテロダイマー、 B鎖ホモダイマーが 1： 2 : 1で産生され、 50%の不純物である A鎖ホモダイマー、 B鎖ホモダイマーを取り除く必要がある。

[0005] 医薬品の製造レベルのクロマトグラフィーによる分離において、 A鎖 B鎖へテロダイマーと A鎖ホモダイマー、 B鎖ホモダイマーを分離する方法がこれまでにいくつか報告されている。 A鎖 B鎖へテロダイマーを選択的に精製する方法として、非特許文献 5 には A鎖に mouse IgG2a、 B鎖に rat IgG2bを使用し、 mouse IgG2aと rat IgG2bの各 H 鎖に対する protein Aへのァフィ二ティーの違いを利用し、 protein Aからの溶出 pHをコントロールすることで、 A鎖 B鎖へテロダイマーを精製する方法が報告されているが、 mouseおよび ratの定常領域を使用しているため、抗原性の観点から同方法はヒトに対する医薬品への応用は困難である。またこの方法では同じサブクラスの H鎖からなる A鎖 B鎖へテロダイマーを分離することはできないため、利用は限定される。

[0006] 非特許文献 6には疎水相互作用クロマトグラフィーを用いた A鎖 B鎖へテロダイマーを精製する方法が報告されている力 Anti-CD3 mouse IgG2aと anti_CD19 mouse Ig Glからなる目的の A鎖 B鎖へテロダイマーが十分にピーク分離しておらず、また、異なるサブクラスの H鎖を用い、その疎水性の違いを利用して分離していると考えられること力ら、同じサブクラスの H鎖からなる A鎖 B鎖へテロダイマーを必ずしも分離できるとは限らない。

[0007] 非特許文献 7には Thiophilic affinityクロマトグラフィーを用いた A鎖 B鎖へテロダイマ一を精製する方法が報告されている力 mouse IgGlと rat IgG2aを用レ、、そのヒンジ領域におけるフリーのシスティン (チオール基）を利用していることから、同じサブクラスの H鎖からなる A鎖 B鎖へテロダイマーの分離には利用できず、またフリーのシスティンは保存中のァグリゲーシヨンに関与するため、安定な医薬品製剤の開発には適さない。

[0008] 非特許文献 8には抗原を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーが報告されている。しかし、タンパク質あるいはペプチド抗原を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーは、カラムのコストや安定性に課題があるため、ァフィ二ティークロマトグラフィーを用いた医薬品の製造は一般的ではない。また両抗原に結合する A鎖 B鎖へテロダイマ一の精製のためにはァフィ二ティークロマトグラフィーを 2回実施する必要があり、コストが高くなることが予想される。また抗原の立体構造のみを認識する抗体や低ァフィ二ティで目的の機能を有する抗体が報告されており、このような性質を持つ抗体は抗原を利用したァフィ二ティクロマトグラフィーを使用することが困難である。従って、ァフィニティークロマトグラフィーを用いた二重特異性抗体の精製は汎用的ではないと考えられる。

[0009] このように二重特異性抗体の A鎖 B鎖へテロダイマー精製は限られた範囲内でしか行われておらず、同じ H鎖サブクラス'定常領域配列からなる二重特異性抗体の A鎖 B鎖へテロダイマーを、医薬品として許容されるような高い純度まで精製する方法は報告されていない。二重特異性抗体を構成する 2種類の抗体が同じ定常領域配列を有する場合、可変領域配列の違いのみにより、 A鎖 B鎖へテロダイマーを分離する必要があるが、抗体の可変領域のアミノ酸配列は抗体間で非常にホモロジ一が高く（非特許文献 9)、可変領域配列の違いだけで A鎖 B鎖へテロダイマーを医薬品として許容されるような高い純度まで精製することは困難であった。

[0010] 特許文献 1 :国際公開第 96/27011号

非特午文献 1： Marvm JS,および Zhu Z.: 、「Recombmant approaches to Igu-like bis pecific antibodies.」、 Acta Pharmacol Sin., 2005年 Jun、 Vol.26(6)、 p.649-58.

非特許文献 2 : Segal DMら著、 Current Opinion in Immunology, 1999年、 Vol.11, p.5

58-562.

非特許文献 3 : Merchant AM,外 6名著、「An efficient route to human bispecific IgG. J , Nat Biotechnol.、 1998年 Jul、 Vol.16(7), p.677-81.

非特許文献 4 : Carter P.著、「Bispecific human IgG by design.」、 J Immunol Methods. 、 2001年 Feb 1、 Vol.248(l- 2)、 p.7-15.

非特許文献 5 : Lindhofer H,外 3名著、「Preferential species-restricted heavy/light c hain pairing in rat/mouse quadromas. Implications for a single-step purification of bi specific antibodies.] , J Immunol.、 1995年 Jul 1、 Vol. l55(l)、 p.219-25.

非特許文献 6 : Manzke 0，外 3名著、「Single_step purification of bispecific monoclon al antibodies for immunotherapeutic use by hydrophobic interaction chromatography .」、 J Immunol Methods. , 1997年 Oct 13、 Vol.208(l)、 p.65-73.

非特許文献 7 : Kreutz FT,外 2名著、「Efficient bispecific monoclonal antibody purific ation using gradient thiophilic affinity chromatography -」、 J Chromatogr B Biomed Sc i Appl.、 1998年 S印 4、 Vol.714(2)、 p.161- 70·

非特許文献 8 : Gupta S,および Suresh M.者、「Affinity chromatography and co-chro matography of bispecific monoclonal antibody immunoconjugates.J、 J Biochem Bioph ys Methods.、 2002年 May 31、 Vol.51(3)、 p.203-16. Review.

非特許文献 9 : Carl Branden著、 Introduction to Protein Structure 2nd edition, Newto n Press.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、二重特異性抗体を効率的に精製するための抗体可変領域のアミノ酸改変の方法、改変された二重特異性抗体からなる医薬組成物、並びに、二重特異性抗体医薬組成物の製造方法を提供することにある。また本発明は、重鎖定常領域が改変された二重特異性抗体、改変された二重特異性抗体からなる医薬組成物、並びに、二重特異性抗体医薬組成物の製造方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明者らは、目的物の精製が従来困難であった二重特異性抗体を汎用的なクロマトグラフィーカラムを用いることで効率的に精製できる方法として、抗体可変領域のアミノ酸置換による方法にっレ、て、鋭意研究を行った。

[0013] その結果、二重特異性抗体を構成する 2種類の抗体が抗体可変領域の表面に存在するアミノ酸を改変することによって、 2種類の抗体の H鎖の間に等電点の差異を導入し、等電点の違いを利用して、二重特異性抗体をクロマトグラフィーカラムで効率的に精製する方法を見出した。具体的には、抗体の H鎖において、抗体の機能（活性)を低下させることなぐ等電点のみを制御することが可能な改変箇所を見出した。さらに本発明者らは、本発明の方法によって取得された二重特異性抗体が、実際に機能を保持していることを確認した。

[0014] 上述の如く本発明者らは、任意の二重特異性抗体を汎用的なクロマトグラフィー力ラムを用いることで効率的に精製できる方法として、抗体可変領域のアミノ酸置換による方法の開発に成功し、本発明を完成させた。

[0015] また本発明者らは、二重特異性抗体を構成する 2種類の H鎖の定常領域に対して、元来等電点に差のある異なるサブクラスの定常領域をそれぞれの H鎖に用いることで、等電点の違いを利用して、二重特異性抗体をクロマトグラフィーカラムで効率的に精製する方法を見出した。さらに本発明者らは、本発明の方法によって取得された二重特異性抗体が、実際に機能を保持していることも確認した。

[0016] 本発明は、クロマトグラフィーカラムを用いることで効率的に精製するための抗体可変領域のアミノ酸置換方法、および、改変された二重特異性抗体からなる医薬組成物、および、二重特異性抗体医薬組成物の製造方法に関し、さらに重鎖定常領域が改変された二重特異性抗体、および、改変された二重特異性抗体からなる医薬組成物、および、二重特異性抗体医薬組成物の製造方法に関し、より具体的には、〔1〕第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドを含む多重特異性抗体の製造方法であって、

(a)第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点に差がつくように、第 1のポリべプチドのアミノ酸残基をコードする核酸および第 2のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸の両方またはいずれか一方を改変し、

(b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、

(c)宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、

を含む多重特異性抗体の製造方法、

[2] 工程（a)の改変が、第 1のポリペプチドのホモ多量体、第 2のポリペプチドのホモ多量体、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体力標準的なクロマトグラフィーを使用した分析により分離したピークとなるように、核酸を改変することである〔1〕に記載の方法、

〔3〕前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖可変領域を含む〔 1〕に記載の方法、

〔4〕前記多重特異性抗体が、軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含み、前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドがそれぞれ該第 3のポリペプチドと多量体を形成する〔3〕に記載の方法、

〔5〕前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖定常領域を含む〔 1〕〜〔4〕のレ、ずれか 1項に記載の方法、

〔6〕前記第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドに含まれる重鎖定常領域が互いに等電点の異なる重鎖定常領域である〔5〕に記載の方法、

〔7〕前記等電点の異なる重鎖定常領域が IgGlと IgG4、又は、 IgGlと IgG2である〔6〕に記載の方法、

〔8〕前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である〔1〕に記載の方法、〔9〕〔1〕に記載の方法により製造される多重特異性抗体、

〔10〕第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドを含む多重特異性抗体の精製方法であって、

(b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、

(c)宿主細胞培養物から標準的なクロマトグラフィーにより該多重特異性抗体を精製すること、

を含む多重特異性抗体の精製方法、

〔11〕工程（a)の改変が、第 1のポリペプチドのホモ多量体、第 2のポリペプチドのホモ多量体、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体力標準的なクロマトグラフィーを使用した分析により分離したピークとなるように、核酸を改変することである〔10〕に記載の方法、

[12] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖可変領域を含む〔10〕に記載の方法、

〔13〕前記多重特異性抗体が、軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含み、前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドがそれぞれ該第 3のポリペプチドと多量体を形成する〔12〕に記載の方法、

〔14〕前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖定常領域を含む〔10〕〜〔13〕のレ、ずれか 1項に記載の方法、

〔15〕前記第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドに含まれる重鎖定常領域が互いに等電点の異なる重鎖定常領域である〔14〕に記載の方法、

〔16〕前記等電点の異なる重鎖定常領域が IgGlと IgG4、又は、 IgGlと IgG2である〔1 5〕に記載の方法、

[17] 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である〔10〕に記載の方法、〔18〕〔10〕に記載の方法により精製する工程を含む多重特異性抗体の製造方法、〔19〕〔18〕に記載の方法により製造される多重特異性抗体、

[20] 第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドを含む多重特異性抗体であって

、第 1のポリペプチドが重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域を含み、該重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43位および 105 位のアミノ酸残基、若しくは、該重鎖定常領域における EUナンバリングによる 137位、 196位、 203位、 214位、 217位、 233位、 268位、 274位、 276位、 297位、 355位、 392位、 419位、 435位のアミノ酸残基から選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基が電荷を有し、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点が互いに異なる多重特異性抗体、

〔21〕第 2のポリペプチドが重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域を含み、該重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43位および 105位のアミノ酸残基、若しくは、該重鎖定常領域における EUナンバリングによる 1 37位、 196位、 203位、 214位、 217位、 233位、 268位、 274位、 276位、 297位、 355位、 3 92位、 419位、 435位のアミノ酸残基から選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基が、前記第 1のポリペプチドに含まれる重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域において選ばれる、電荷を有するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、または電荷を有しない〔20〕に記載の多重特異性抗体、

〔22〕前記電荷を有するアミノ酸残基と当該アミノ酸残基とは反対の電荷を有するァミノ酸残基の組み合わせが、以下の（a)または (b) V、ずれかの群に含まれるアミノ酸残基からそれぞれ選択される〔20〕に記載の多重特異性抗体：

(a)グルタミン酸（E)、ァスパラギン酸 (D)；

(b)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（Η)、

〔23〕第 1のポリペプチドと第 2ポリペプチドの等電点に差があり、第 1のポリペプチドのホモ多量体、第 2のポリペプチドのホモ多量体、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体力 S、標準的なクロマトグラフィーを使用した分析により分離したピークとなり得る多重特異性抗体、

[24] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖可変領域を含む [23]に記載の多重特異性抗体、

〔25〕前記多重特異性抗体が、軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含み、前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドがそれぞれ該第 3のポリペプチドと多量体を形成する〔24〕に記載の多重特異性抗体、

〔26〕前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖定常領域を含む [23]〜〔25〕のレ、ずれか 1項に記載の多重特異性抗体、〔27〕前記第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドに含まれる重鎖定常領域が互いに等電点の異なる重鎖定常領域である〔26〕に記載の多重特異性抗体、〔28〕前記等電点の異なる重鎖定常領域が IgGlと IgG4、又は、 IgGlと IgG2である〔2 7〕に記載の多重特異性抗体、

〔29〕前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である〔23〕に記載の多重特異性抗体、

〔30〕〔23〕〜〔29〕のいずれ力 4項に記載の多重特異性抗体および医薬的に許容される担体を含む組成物、

〔31〕〔23〕〜〔29〕のいずれか 1項に記載の多重特異性抗体を構成するポリべプチドをコードする核酸、

[ 32] 〔31〕に記載の核酸を有する宿主細胞、

〔33〕 [ 32]に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収する工程を含む〔23〕〜〔29〕のいずれか 1項に記載の多重特異性抗体の製造方法、

〔34〕第 1のポリペプチドの可変領域が以下の（al )〜 (a7)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、第 2のポリペプチドの可変領域が以下の（b l )〜（b3)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、第 3のポリペプチドの可変領域が以下の（c l )または（c2

)に記載のアミノ酸配列からなる〔25〕に記載の多重特異性抗体：

(al )配列番号： 7

(a2)配列番号: 8

(a3)配列番号： 9

(a4)配列番号： 10

(a5)配列番号： 1 1

(a6)配列番号： 12

(a7)配列番号： 13

(b l )配列番号： 14

(b2)配列番号： 1 5

(b3)配列番号： 16 (cl)配列番号： 17

(c2)配列番号： 18

〔35〕第 1のポリペプチドの可変領域が配列番号： 1 1に記載のアミノ酸配列からなり、第 2のポリペプチドの可変領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列からなり、第 3 のポリペプチドの可変領域が配列番号： 17に記載のアミノ酸配列からなる〔34〕に記載の多重特異性抗体、

〔36〕第 1のポリペプチドの可変領域が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列からなり、第 2のポリペプチドの可変領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列からなり、第 3 のポリペプチドの可変領域が配列番号： 18に記載のアミノ酸配列からなる〔34〕に記載の多重特異性抗体、

〔37〕第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドがヒト IgG4定常領域を含み、第 3 のポリペプチドがヒト κ定常領域を含む〔34〕〜〔36〕のレ、ずれか 1項に記載の多重特異性抗体、に関する。

図面の簡単な説明

[図 1]ヒト化二重特異性抗体（ヒト化 A69 (hA69a) /ヒトイ匕 B26 (hB26_F123e4)/ヒト化 BB A (hAL-F123j4) )の凝固活性について評価した結果を示す図である。評価の結果、キメラ二重特異性抗体と同等以上の凝固活性を示した。

[図 2]ヒト化 A69- H鎖可変領域（hA69a)とヒト化 BBA (hAL- F123j4)およびヒト化 hB26_ H鎖可変領域（hB26_F123e4)とヒト化 BBA (hAL_F123j4)を使用して抗体モデリングを実施した結果を示す図である。表面電荷を変化させることが可能なアミノ酸について側鎖を強調して示した。番号については、 Kabatデータベースの配列番号（Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins or immunological Interest. NIH)を採用した園 3]未改変および可変領域を改変したヒト化 A69抗体ホモダイマーと未改変および可変領域を改変したヒト化 B26抗体ホモダイマーを用いて等電点電気泳動による分析を実施した結果を示す写真である。分析の結果、改変により等電点が変化していることが確認された。

園 4]可変領域を改変したヒト化 A69抗体ホモダイマーを用いて陽イオン交換クロマトグラフィー分析を実施した結果を示す図である。分析の結果、未改変の抗体と比較してピークの移動が確認された。

園 5]可変領域を改変したヒト化 B26抗体ホモダイマーを用いて陽イオン交換クロマトグラフィー分析を実施した結果を示す図である。分析の結果、未改変の抗体と比較してピークの移動が確認された。

園 6]可変領域を改変したヒト化二重特異性抗体 (H鎖定常領域に knobs-into-holes 技術を利用）を用いて凝固活性を評価した結果を示す図である。評価の結果、未改変の抗体と同等の凝固活性を示した。

園 7]可変領域 (CDR)を改変したヒト化 A69抗体ホモダイマーを用いて等電点電気泳動による分析を実施した結果を示す写真である。分析の結果、未改変の抗体と比較してバンドの移動が確認された。

[図 8]可変領域（CDR)を改変したヒトイ匕 A69抗体ホモダイマーを用いて抗原である Fac tor IXaに対する結合活性を評価した結果を示す図である。評価の結果、未改変の抗体と同等の結合活性を保持していることが示された。

[図 9]未改変抗体として、ヒト化 A69-H鎖である hA69a、ヒト化 B26-H鎖である hB26_Fl 23e4とヒト化 BBA-L鎖である hAL-F123j4を用いて作製した未改変のヒト化二重特異性抗体ヒト化の陽イオン交換クロマトグラフィー分析を実施した結果を示す図である。分析の結果、二種類のホモダイマーと二重特異性抗体が分離せず 1本のピークとして溶出した。

[図 10]ヒト化 A69-H鎖の改変体である hA69-PFとヒト化 B26-H鎖の改変体である hA26 -PFとヒト化 BBA-L鎖である hAL_s8を用いて作製したヒトイ匕二重特異性 PF抗体の陽ィオン交換クロマトグラフィー分析を実施した結果を示す図である。分析の結果、二種類のホモダイマーと二重特異性抗体がそれぞれ分離し、 hA69-PFホモダイマー、ヒト化二重特異性 PF抗体、 hB26-PFホモダイマーの順に 3本のピークとして溶出した。

[図 11]精製したヒト化 A69抗体- PFホモダイマーおよびヒト化 B26-PF抗体ホモダイマ一、ヒト化二重特異性 PF抗体を用いて等電点電気泳動による分析を実施した結果を示す写真である。分析の結果、目的の二重特異性抗体が精製できていることが確認された。園 12]精製したヒト化二重特異性 PF抗体 (H鎖定常領域は野生型）を用いて凝固活性を評価した結果を示す図である。評価の結果、 H鎖定常領域に knobs-into-holes 技術を利用した二重特異性抗体 (KiH)と同等の凝固活性を示した。

[図 13]ヒト化 A69抗体ホモダイマーおよびヒト化 B26抗体ホモダイマー、ヒト化二重特異性抗体の 3種類の抗体が含まれる培養上清から製造用汎用カラムを用いて二重特異性抗体を精製した時のクロマトグラムを示した。

園 14]製造用汎用カラムを用いて精製したヒト化二重特異性抗体 (H鎖定常領域は野生型）を用いて凝固活性を評価した結果を示す図である。評価の結果、ヒト化二重特異性 PF抗体と同等の凝固活性を示した。

[図 15]未改変、 IgG2化および IgG4化ヒトイ匕 PM-1抗体を用いて等電点電気泳動による分析を実施した結果を示す写真である。分析の結果、改変により等電点が変化していることが確認された。 Aは未改変ヒト化 PM-1抗体、 Bは IgG2化ヒト化 PM-1抗体、 Cは IgG4化ヒト化 PM-1抗体を示す。

[図 16]未改変、 IgG2化および IgG4化ヒトイ匕 PM-1抗体のそれぞれの共発現抗体を用いて等電点電気泳動による分析を実施した結果を示す写真である。分析の結果、各サブクラス抗体とサブクラスハイブリッド抗体力 1差をもって分離することが示された。

Aは未改変ヒト化 PM-1抗体/ IgG2化ヒト化 PM-1抗体共発現抗体、 Bは未改変ヒト化 P M-1抗体/ IgG4化ヒト化 PM-1抗体共発現抗体、 Cはヒト化 PM-1抗体精製品（bulk)を示す。

[図 17]単独発現させた未改変、 IgG2化、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体を用いて陽イオン交換クロマトグラフィー分析を実施した結果を示す図である。分析の結果、未改変の抗体と比較してピークの移動が確認された。

[図 18]未改変、 IgG2化および IgG4化ヒトイ匕 PM-1抗体のそれぞれの共発現抗体の陽イオン交換クロマトグラフィー分析を実施した結果を示す図である。分析の結果、未改変ヒト化 PM-1抗体/ IgG2化ヒト化 PM-1抗体の組み合わせ、および、未改変ヒト化 P M-1抗体/ IgG4化ヒト化 PM-1抗体の組み合わせにおレ、て、各サブクラスのホモダイマ一、ヘテロダイマーが 3つの主ピークとして観察された。 Aは未改変ヒト化 PM-1抗体 /lgG2化ヒト化 PM-1抗体共発現抗体、 Bは未改変ヒト化 PM-1抗体 ZlgG4化ヒトイ匕 P M-l抗体共発現抗体を示す。

[図 19]未改変ヒト化 PM-1抗体/ IgG4化ヒト化 PM-1抗体を共発現させたものから陽ィオン交換クロマトグラフィーでホモダイマー、ヘテロダイマーを精製した結果を示す図である。この結果、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体ホモダイマー、未改変ヒト化 PM_l/IgG4ィ匕ヒト化 PM-1ハイブリッド抗体、未改変ヒト化 PM-1抗体ホモダイマーの順に 3本のピークとして溶出したため、これらを分取した。矢印はおよその分画範囲を示す。

[図 20]陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した未改変ヒト化 PM-1抗体ホモダイマ一、未改変ヒト化 PM_l/IgG4化ヒト化 PM-1ハイブリッド抗体、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体ホモダイマーを用いてリクロマトグラフィーを行った結果を示す図である。この結果、目的のサブクラスハイブリッド抗体が精製できてレ、ることが確認された。

[図 21]陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した未改変ヒト化 PM-1抗体ホモダイマ一、未改変/ IgG4化ヒト化 PM-1ハイブリッド抗体、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体ホモダイマ一を用いて等電点電気泳動による分析を実施した結果を示す写真である。分析の結果、目的のサブクラスハイブリッド抗体が精製できていることが確認された。 Aは未改変ヒト化 PM-1抗体/ IgG4化ヒト化 PM-1抗体共発現抗体、 Bは未改変ヒト化 PM-1抗体分取画分、 Cは未改変ヒト化 PM-l/lgG4化ヒト化 PM-1ハイブリット抗体分取画分、 Dは IgG4ィ匕ヒト化 PM-1抗体分取画分を示す。

[図 22]陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した未改変ヒト化 PM-1抗体ホモダイマ一、未改変ヒトイヒ PM-l/IgG4化ヒト化 PM-1ハイブリッド抗体、 IgG4ィヒヒトイヒ PM-1抗体ホモダイマーを用いてヒ HL-6中和活性を評価した結果を示す図である。評価の結果、いずれの抗体もヒト化 PM-1精製抗体と同等の中和活性を示した。 Aおよび Bはヒト g pl30発現 BaF3細胞株、 Cおよび Dはヒト gpl30Zヒ HL-6受容体共発現 BaF3細胞株を示す。黒丸（き）はヒト化 PM-1抗体精製品（bulk)、白四角（口）は未改変ヒト化 PM-1 抗体、白三角（△)は IgG4化ヒト化 PM-1抗体、 Xは未改変ヒト化 PM_lZlgG4化ヒトイ匕 PM-1ハイブリット抗体を示す。

発明を実施するための最良の形態

まず本発明は、多重特異性抗体を製造するための抗体改変方法を提供する。本発明の製造方法の好ましい態様としては、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点に差がつくように第 1のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸および第 2 のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸の両方またはいずれか一方を改変することを含む方法である。即ち、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのアミノ酸残基の電荷を変えることによって、ポリペプチドに等電点 (pi)の差異を導入し、当該等電点の差異を利用して多重特異性抗体を製造することができる。詳しくは以下の（a) 〜（c)の工程を含む製造方法である。

(b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、

(c)宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること

[0019] 本発明におけるポリペプチドとは、通常、 10アミノ酸程度以上の長さを有するぺプチド、およびタンパク質を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよレ、。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。

[0020] 本発明において「ポリペプチドの等電点に差がつく」とは、 2種以上のポリペプチドにおいて、表面アミノ酸の電荷の改変を行うことにより、互いの等電点が等しくならないことをいう。等電点の差は、例えば、等電点電気泳動等の手法を用いることにより観察すること力できる。また本発明においては、当該ポリペプチドの構造や機能 (活性）を変化させずに等電点を制御することが好ましレ、。

[0021] 即ち本発明は、第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドを含む多重特異性抗体の製造方法であって、

(a)第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点の差力 S0.5以上、好ましくは 0.7 以上、更に好ましくは 0.9以上となるように、第 1のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸および第 2のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸の両方またはいずれか一方を改変し、 (b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、

(c)宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、を含む多重特異性抗体の製造方法を提供する。

[0022] また本発明は、多重特異性抗体を精製するための抗体改変方法を提供する。本発明の精製方法の好ましい態様としては、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点に差がつくように第 1のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸および第 2 のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸の両方またはいずれか一方を改変することを含む方法である。即ち、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのアミノ酸残基の電荷を変えることによって、ポリペプチドに等電点 (pi)の差異を導入し、当該等電点の差異を利用して多重特異性抗体を精製することができる。詳しくは以下の（a) 〜（c)の工程を含む精製方法である。

(b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、

(c)宿主細胞培養物力標準的なクロマトグラフィーにより該多重特異性抗体を精製すること

[0023] なお、上記精製方法により精製する工程を含む多重特異性抗体の製造方法も本発明に含まれる。

[0024] 本発明における核酸は、通常、適当なベクターへクローニング (挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしては pBluescriptベクター (Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のべクターを利用することができる。本発明の多重特異性抗体 (ポリペプチド）を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現べクタ一としては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されなレ、が、例えば、試験管内発現であれば pBESTベクタ一（プロメガ社製）、大腸菌であれば pETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であれば pME18S_FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などが好ましレヽ。ベクターへの本発明の DNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反 J心により γ丁つこと力で、きる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4_11.11)。

[0025] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例:ストレブトコッカス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞 (例：酵母、ァスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフイラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： C H〇、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、 Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気ノヽ⁰ノレス穿孑し法 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel e t al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、リポフエクシヨン法、マイク口インジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。

[0026] 宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であつても、異種シグナルであってもよい。

[0027] 上記製造方法における多重特異性抗体 (ポリペプチド）の回収は、本発明のポリべプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。

[0028] 組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニゥムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ァニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ一、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。

[0029] また本発明は、本発明の多重特異性抗体、および医薬的に許容される担体を含む組成物 (薬剤）に関する。 [0030] 本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査 · 診断のための薬剤を言う。

[0031] 本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すること力 S考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。

[0032] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

[0033] 注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えば D-ソノレビトーノレ、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルペート 80 (TM)、 HCO-50等）を併用してもよい。

[0034] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び/またはベンジルアルコールを併用してもよレ、。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロ力イン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフエノール）、酸化防止剤と配合してもよレ、。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。

[0035] 本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。

投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり 0.001〜100000mgの投与量とすることもできる力本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。

[0036] また、必要に応じ本発明の多重特異性抗体を、その他の医薬成分と組み合わせて製剤化することもできる。

[0037] また本発明は、本発明の多重特異性抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに該核酸を担持するベクターもまた、本発明に含まれる。

[0038] さらに本発明は、上記核酸を有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、特に制限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを挙げることができる。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体もしくはポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用すること力 Sできる。ポリペプチド製造のための産生系には、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系及び原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

[0039] 宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995 ) 108: 945)、 COS, HEK293、 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero等、両生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle et al., Nature (1981 ) 291 : 338-340)、及び昆虫細胞、例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5が例示される。本発明の抗体の発現においては、 CHO_DG44、 CHO_DXl lB、 COS7細胞、 HEK293細胞、 BHK 細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CH〇細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (Boehringer Mannheim製）を用いた方法、エレクト口ポレーシヨン法、リボフヱクシヨンなどの方法で行うことが可能である。

[0040] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ.タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞およびゥキクサ（Lemna minor)が蛋白質生産系として知られており、この細胞をカルス培養する方法により本発明の抗体を産生させることができる。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属の細胞（サッカロミセス'セレビシェ（Sa ccharomyces cerevisiae)、サッカロセス ·ホンへ (Saccharomyces pombe)等)、及び糸状菌、例えば、ァスペルギルス（Aspergillus)属の細胞（ァスペルギルス'二ガー（As pergillus niger)等）を用いた蛋白質発現系が公知であり、本発明の抗体産生の宿主として利用できる。

[0041] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、上述の大腸菌（E. coli)に加えて、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗体産生に利用できる。

[0042] 本発明の宿主細胞を用いて抗体を産生する場合、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養を行レ、、ポリヌクレオチドを発現させればよい。培養は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640 、 IMDMを使用することができる。その際、 FBS、牛胎児血清（FCS)等の血清補液を併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8とするのが好ましい。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

[0043] —方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

[0044] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRU M Biotechnology Applications (1993))。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジヱニック動物を用いることができる。

[0045] 例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、ャギ βカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジエニックャギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックャギに投与してもよい（Ebert et al.， Bio/Technology (1994) 12: 699-702)。

[0046] また、本発明の抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。

カイコを用レ、る場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを揷入したバキュロウィノレスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Susumu et al.， Nature (1985) 315: 592—4)。

[0047] さらに、植物を本発明の抗体産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えば pMON 530に揷入し、このベクターをァグロバタテリゥム 'ッメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ 'タバカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Ma et al" Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8) 。また、同様のバクテリアをゥキクサ（Lemna minor)に感染させ、クローン化した後にゥキクサの細胞より所望の抗体を得ることができる（Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 200 6 Dec;24(12): 1591-1597)。

[0048] このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外 (培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて抗体を分離、精製すること力 Sできる。

[0049] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ二ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグフフィ一等げられる (Strategies for Protein Purification ana Characterizatio n: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Har bor Laboratory Press)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ァフィ二テイク口マトグラフィ一に用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D， POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。

[0050] 必要に応じ、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドぺプチダーゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。

[0051] 上述のように本発明の宿主細胞を培養し、該細胞培養物からポリペプチドを回収する工程を含む、本発明の多重特異性抗体の製造方法もまた、本発明の好ましい態様の一つである。

[0052] 本発明における「多重特異性抗体」とは、少なくとも 2種類の異なる抗原に対して特異的に結合することができる抗体である。本発明の製造方法または精製方法によつて得られる好ましい多重特異性抗体として、 2つの抗原に対して特異的に結合することができる二重特異性抗体 (bispecific antibody;BsAb) (二種特異性抗体と呼ばれる場合もある）を挙げることができる。

[0053] 本発明において、「異なる抗原」とは必ずしも抗原自体が異なる必要はなぐ抗原決定基が異なる場合等も本発明の「異なる抗原」に含まれる。従って、例えば、単一分子内の異なる抗原決定基も本発明の異なる抗原に含まれ、このような単一分子内の異なる抗原決定基を各々認識する 2つの抗体は、本発明において異なる抗原を認識する抗体として扱われる。

[0054] 本発明における多重特異性抗体は、 2種以上の異なる抗原に対して特異性を有する抗体もしくは抗体断片からなる分子である。

[0055] 本発明の上記方法における「核酸の改変」とは、第 1のポリペプチドと第 2のポリべプチドを標準的なクロマトグラフィーを使用した分析により分離したピークが得られるように、核酸を改変することが含まれる。

[0056] 本発明の方法における、「核酸を改変する」とは、本発明における「改変」によって導入されるアミノ酸残基に対応するように核酸を改変することを言う。より具体的には、元（改変前）のアミノ酸残基をコードする核酸について、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードする核酸へ改変することを言う。

[0057] 通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンとなるように、元の核酸に対して、少なくとも 1塩基を揷入、欠失または置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、 PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。

[0058] 本発明における改変位置は、例えば、（1)ポリペプチドに表面にあるアミノ酸残基、

(2)可変領域、好ましくは FR領域にあるアミノ酸残基、（3)定常領域にあるアミノ酸残基、を挙げること力 Sできる。

[0059] 「ポリペプチドの表面にあるアミノ酸」とは、その側鎖が溶媒分子（通常は水分子）に接し得るアミノ酸であり、必ずしも側鎖の全てが溶媒分子に接する必要はなぐ側鎖の一部でも溶媒分子に接する場合は、そのアミノ酸は表面にあるアミノ酸である。当業者であれば、市販のソフトウェアを用いたホモロジ一モデリング等により、ポリぺプチドゃ抗体のホモロジ一モデルを作製することができ、それにより適切な残基を表面にあるアミノ酸として選択することができる。

[0060] 当業者であれば、抗体可変領域における表面アミノ酸はホモロジ一モデリング等により作製されたホモロジ一モデルにより適宜選択することが可能である力例えば H鎖 FR領域においては HI, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H 26, H39, H42, H43, H44, H46, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83， H85， H86, H105, H108, H110, H112が表面アミノ酸として例示することができるが、本発明はこれらに限定されることはない。また H鎖 CDR領域に関しては、同様にしてホモロジ一モデルにより表面アミノ酸を選択することが可能であり、例えば H97はほとんどの抗体で表面に露出している。 L鎖 FR領域においては LI, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L 105， L106, L107, L108が表面アミノ酸として例示することができる力本発明はこれらに限定されることはなレ、。また L鎖 CDR領域に関しては、同様にしてホモロジーモデルにより表面アミノ酸を選択することが可能である。

[0061] 本発明において可変領域にあるアミノ酸残基とは、重鎖可変領域 (VH)または軽鎖可変領域 (VL)にあるアミノ酸残基が含まれるが、好ましくは、フレームワーク領域 (FR

)にあるアミノ酸残基である。

[0062] 本発明における CDR以外の FR領域において表面に露出するアミノ酸としては、例えば、 H10、 H12、 H23、 H39、 H43、 H105を例示することができる力これらに制限されない。

[0063] 本発明において、核酸を改変するポリペプチドは、好ましくは、第 1のポリペプチドのホモ多量体、第 2のポリペプチドのホモ多量体、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体である。例えば、下記実施例に記載のように、第 1のポリペプチドのホモ多量体としてヒト化 A69-H鎖とヒトイ匕 BBA-L鎖のホモダイマー、第 2のポリペプチドのホモ多量体としてヒト化 B26-H鎖とヒト化 BBA-L鎖のホモダイマー、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体としてヒト化 A69-H鎖およびヒト化 B26-H鎖とヒト化 BBA-L鎖のへテロダイマーを挙げることができる力これらに制限されない。

[0064] 本発明における標準的なクロマトグラフィーとしては、陽イオン交換クロマトグラフィ一、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイド口キシァパタイトク口マトグラフィー、疎水電荷相互作用クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等が挙げられる。

[0065] 本発明の上記方法において、第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドは、重鎖可変領域 (VH)を含んでいることが好ましい。該可変領域には、例えば相補性決定領域（CDR)、フレームワーク領域（FR)が含まれてレ、てもよレ、。

[0066] 本発明の方法において改変に供されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、抗体の可変領域を改変する場合、抗原との結合活性を低下させないために、また抗原性を上げないために、目的のポリペプチドの分離を達成するための必要最低限のアミノ酸残基を改変することが好ましい。 [0067] また好ましくは、抗原性を上げないために、改変後のアミノ酸配列がヒト配列であることが好ましいが本発明はこれに限定されることはない。さらに、改変後の FR (FR1、 F R2、 FR3、 FR4)が各 FRとしてヒト配列になるように、等電点が変化するように導入した改変以外の箇所に変異を導入してもよい。このようにして各 FRをヒト配列に置き換える方法は非特許文献（〇no K et al.， Mol Immunol. 1999 Apr;36(6):387_395.)で報告されている。また、各 FRの等電点を変化させるために、等電点が変化する他のヒト FR に改変してもよレヽ（例えば FR3を等電点が低下する他のヒト FRと交換してもよレ、）。このようなヒト化方法は非特許文献 (Dall'Acqua WF.， Methods. 2005 May;36(l):43- 60.) で報告されている。

また、僅力、な表面電荷の改変において目的のポリペプチドの分離が達成できない場合に、表面電荷の改変とポリペプチドの分離の評価を繰り返し行うことで、所望の多重特異性抗体を取得することが可能である。

[0068] さらに本発明の上記方法においては、多重特異性抗体が、軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含んでいることが好ましい。そして、第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドがそれぞれ第 3のポリペプチドと多量体を形成していることが好ましレ、。

[0069] さらに本発明の上記方法において、第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドは、重鎖定常領域を含んでいることが好ましい。重鎖定常領域としては、第 1のポリぺプチドと第 2のポリペプチドに pi差が生じるものがより好ましい。そのような重鎖定常領域としては、 pi差を有する抗体の重鎖定常領域が挙げられ、元来 piに差のある IgGl、 Ig G2、 IgG3、 IgG4の重鎖定常領域を用いて第 1と第 2のポリペプチドに pi差を導入することもできるし、第 1と第 2のポリペプチド中の重鎖定常領域における、これらサブクラス間の等電点の違いに起因するアミノ酸のみ、あるいはそれらの等電点には影響しない隣接するアミノ酸を同時に改変することにより非野生型ヒト定常領域を作製し、 2 つの定常領域に pi差を導入することもできる。定常領域に pi差を導入するための改変箇所としては、例えば H鎖定常領域の EUナンバリングで、 H鎖 137番目、 196番目、 20 3番目、 214番目、 217番目、 233番目、 268番目、 274番目、 276番目、 297番目、 355番目、 392番目、 419番目、 435番目が挙げられる。また、重鎖定常領域の糖鎖を除去することにより pi差が生じることから、糖鎖付加部位の 297番目も pi鎖を導入するための改変箇所として挙げられる。

また本発明には、上記第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドが重鎖定常領域を含む方法に対して、上述の第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドが重鎖可変領域を含む方法、および/または前記多重特異性抗体が軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含み、前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドがそれぞれ該第 3のポリペプチドと多量体を形成する方法とを組み合わせた方法も含まれる。

[0070] さらに上記方法によって製造される多重特異性抗体も本発明に含まれる。

[0071] さらに本発明によって提供される多重特異性抗体における第 1のポリペプチドが重鎖可変領域および/または重鎖定常領域を含んでいる場合には、上記「等電点に差がつくよう」にするために、例えば該重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43位および 105位のアミノ酸残基、若しくは、該重鎖定常領域における EUナンバリングによる 137位、 196位、 203位、 214位、 217位、 233位、 26 8位、 274位、 276位、 297位、 355位、 392位、 419位、 435位のアミノ酸残基から選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基が電荷を有するようにする態様を挙げることができる。上記のナンバリングで示された第 1のポリペプチドのアミノ酸残基のうち、当該電荷を有するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点に差がついていれば、当該電荷を有するアミノ酸残基と同種の電荷であつても良いし、電荷を有していなくても、反対の電荷であっても良い。

[0072] 本発明の上記多重特異性抗体は、好ましくは、第 2のポリペプチドが、第 1のポリべプチドの電荷を有するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、または電荷を有しなレ、ことを特徴とする。詳しくは、第 2のポリペプチドが重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域を含み、該重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23 位、 39位、 43位および 105位のアミノ酸残基、若しくは、該重鎖定常領域における EU ナンバリングによる 137位、 196位、 203位、 214位、 217位、 233位、 268位、 274位、 276 位、 297位、 355位、 392位、 419位、 435位のアミノ酸残基力も選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基が、前記第 1のポリペプチドに含まれる重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域において選ばれる、電荷を有するようにするアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、または電荷を有しなレ、、多重特異性抗体である。上記のナンバリングで示された第 2のポリペプチドのアミノ酸残基のうち、当該電荷を有するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点に差がついていれば、当該電荷を有するアミノ酸残基と同種の電荷であっても良いし、電荷を有していなくても、反対の電荷であっても良い。

等電点を低下させるためには、例えば、 137位は IgG2または IgG4の配歹 lj、 196位は I gGlまたは IgG2または IgG4の配歹 1J、 203位は IgG2または IgG4の配歹 1J、 214位は IgG2の配列、 217位は IgGlまたは IgG3または IgG4の配歹 1J、 233位は IgGlまたは IgG3または Ig G4の配列、 268位は IgG4の配歹 1J、 274位は IgG2または IgG3または IgG4の配歹 lj、 276位は IgGlまたは IgG2または IgG4の配歹 lj、 355位は IgG4の配歹 lj、 392位は IgG3の配歹 lj、 4 19位は IgG4の配歹 1J、 435位は IgGlまたは IgG2または IgG4の配歹 1J、を適用することが望ましレ、。また、等電点を上昇させるためには、例えば、 137位は IgGlまたは IgG3の配列、 196位は IgG3の配歹 lj、 203位は IgGlまたは IgG3の配歹 lj、 214位は IgGlまたは Ig G3または IgG4の配歹 lj、 217位は〇2の配歹1」、 233位は IgG2の配歹 lj、 268位は IgGlまたは IgG2または IgG3の配歹 lj、 274位は IgGlの配歹 lj、 276位は IgG3の配歹 lj、 355位は Ig G1または IgG2または IgG3の配歹 lj、 392位は IgGlまたは IgG2または IgG4の配歹 lj、 419 位は IgGlまたは IgG2または IgG3の配歹 lj、 435位は IgG3の配歹 lj、を適用することが望ましい。

これらの配列の適用は、両 H鎖に十分な等電点の差が付くようであればよぐ必ずしも全ての配列を適用する必要はない。

[0073] アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が知られている。一般的に正の電荷を帯びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン )、アルギニン (R)、ヒスチジン (H)が知られている。負の電荷を帯びたアミノ酸 (負電荷アミノ酸）としては、ァスパラギン酸 (D)

、グノレタミン酸 (E)等が知られている。

[0074] 上記「電荷を有するアミノ酸残基」は、好ましくは、以下の（a)または (b)いずれかの群に含まれるアミノ酸残基から適宜選択されるが、特に制限されない。

(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D) (b)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)

[0075] 上記抗体において、「同種の電荷を有する」とは、例えば、重鎖可変領域における上記 Kabatナンバリングによるアミノ酸残基、若しくは重鎖定常領域における上記 EU ナンバリングによるアミノ酸残基のいずれも力上記（_a)または (b)のレ、ずれか 1の群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。

[0076] また、「反対の電荷を有する」とは、例えば、重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域を有する第 2のポリペプチドにおける上記 Kabatナンバリング若しくは上記 EU ナンバリングによるアミノ酸残基のなかの少なくとも 1つのアミノ酸残基力第 1のポリペプチドに含まれる重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域における対応する位置のアミノ酸残基であって、上記（_a)または（b)のレ、ずれ力、 1の群に含まれるァミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。

[0077] 即ち本発明においては、前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、上記（a)または

(b)のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択される多重特異性抗体を提供する。

[0078] なお、元の（改変前の）アミノ酸残基が既に電荷を有する場合、電荷を有さないアミノ酸残基となるように改変することも本発明の好ましい態様の一つである。

[0079] 本発明においては、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点 (pi)に差が出るように、アミノ酸残基が改変されることが好ましい。また、改変によって導入されるァミノ酸残基が複数の場合、これらアミノ酸残基の中に電荷を持たなレ、アミノ酸残基が少数程度含まれてレ、てもよレ、。

[0080] さらに本発明は、第 1のポリペプチドの可変領域が以下の（al)〜（a7)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、第 2のポリペプチドの可変領域が以下の（bl )〜（b3 )のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、第 3のポリペプチドの可変領域が以下の (cl)または（c2)に記載のアミノ酸配列からなる、多重特異性抗体を提供する。

(al)配列番号： 7

(a2)配列番号: 8

(a3)配列番号： 9 (a4)配列番号： 10

(a5)配列番号： 1 1

(a6)配列番号： 12

(a7)配列番号： 13

(b l)配列番号： 14

(b2)配列番号： 15

(b3)配列番号： 16

(cl)配列番号： 17

(c2)配列番号： 18

なお上記のアミノ酸配列は、本発明において改変に供するアミノ酸をより具体的に例示するためのものであり、可変領域がこれらのアミノ酸である場合に限定されなレ、。

[0081] 上記多重特異性抗体の好ましい態様の一つとして、例えば、第 1のポリペプチドの可変領域が配列番号： 1 1に記載のアミノ酸配列からなり、第 2のポリペプチドの可変領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列からなり、第 3のポリペプチドの可変領域が配列番号： 17に記載のアミノ酸配列からなる多重特異性抗体を挙げることができるさらに別の好ましい態様の一つとして、例えば、第 1のポリペプチドの可変領域が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列からなり、第 2のポリペプチドの可変領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列からなり、第 3のポリペプチドの可変領域が配列番号： 1 8に記載のアミノ酸配列からなる多重特異性抗体を挙げることができる。

[0082] さらに上記多重特異性抗体の好ましい態様の一つとして、第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドがヒト IgG4定常領域を含み、第 3のポリペプチドがヒト κ定常領域を含んでいる多重特異性抗体を挙げることができる。

[0083] 本発明において、「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体 (キメラ抗体、ヒト化抗体、低分子化抗体 (抗体断片も含む)、多重特異性抗体等)が含まれる。本発明においては、これら抗体の取得 (作成）の際に、好適に本発明の抗体改変方法を用いることができる。 [0084] 本発明における「抗体」には、上述のようにアミノ酸残基の電荷を改変した抗体に対して、さらにアミノ酸の置換、欠失、付加及び/若しくは挿入等により、アミノ酸配列が改変された抗体が含まれる。また、アミノ酸の置換、欠失、付加及び/若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、アミノ酸配列が改変された抗体に対して、さらに、ァミノ酸残基の電荷が改変された抗体が含まれる。すなわち、マウス抗体をヒト化するェ程と同時に改変してもよぐあるいは、ヒトイ匕抗体をさらに改変することであってもよい

[0085] アミノ酸の置換、欠失、付加及び/又は揷入、並びにヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。同様に、本発明における抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可変領域及び定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加及び Z若しくは揷入、またはキメラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。

[0086] 本発明における抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ャギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子抗体などいかなる抗体であってもよい。

[0087] 「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変 (V)領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常（C)領域からなる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、これを発現べクタ一に組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる

[0088] 「ヒト化抗体」とは、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region)をヒト抗体の CDRへ移植したものである。 CDRを同定するための方法は公知である (Kabat et al , sequence or Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号 EP 125023 号公報、 WO 96/02576号公報参照）。そこで公知の方法により、例えば、マウス抗体の CDRを決定し、該 CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region ; FR)とが連結された抗体をコードする DNAを取得し、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用いた系により産生することができる。このような DNAは、 CDR及び FR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて PCR法により合成することができる (W098/13388号公報に記載の方法を参照)。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、 CDRが良好な抗原結合部位を形成するように選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域における FRのアミノ酸を改変してもよい（Sato e t al.， Cancer Res. (1993) 53: 851-6)。改変できる FR中のアミノ酸残基には、抗原に直接、非共有結合により結合する部分（Amit et al.， Science (1986) 233: 747-53)、 C DR構造に影響または作用する部分（Chothia et al.， J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17 )及び VH-VL相互作用に関連する部分 (EP239400号特許公報）が含まれる。

[0089] 本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体の C領域は，好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。例えば H鎖では、 C y 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C K . C Zを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を必要に応じ修飾してもよい。本発明におけるキメラ抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の CDRと、ヒト抗体由来の FRおよび C領域とからなる。ヒト抗体由来の定常領域は、 IgG (IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgM、 IgA、 IgD及び IgE等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有する。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒト IgGの定常領域が用いられるが、これに限定されるものではない。また、ヒト化抗体に利用されるヒト抗体由来の FRも特に限定されず、どのアイソタイプに属する抗体のものであつてもよい。

[0090] 本発明におけるキメラ抗体及びヒト化抗体の可変領域及び定常領域は、元の抗体の結合特異性を示す限り、欠失、置換、揷入及び/または付加等により改変されていてもよい。

[0091] ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。

[0092] また、低分子化抗体は、体内動態の性質の面からも、大腸菌、植物細胞等を用いて低コストで製造できる点からも抗体として有用である。

[0093] 抗体断片は低分子化抗体の一種である。また、低分子化抗体は、抗体断片をその構造の一部とする抗体も含む。本発明における低分子化抗体は、抗原への結合能を有していれば特にその構造、製造法等は限定されない。低分子化抗体の中には、全長抗体よりも高い活性を有する抗体も存在する（Orita et al., Blood(2005) 105: 562-5 66)。本明細書において、「抗体断片」とは、全長抗体 (whole antibody,例えば whole I gG等)の一部分であれば特に限定されなレ、が、重鎖可変領域 (VH)又は軽鎖可変領域 (VL)を含んでいることが好ましい。好ましい抗体断片の例としては、例えば、 Fab, F(ab')2、 Fab'、 Fvなどを挙げることができる。抗体断片中の、 VHまたは VLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び/又は挿入により改変されていてもよい。さらに抗原への結合能を保持する限り、 VH及び VLの一部を欠損させてもよい。例えば、前述の抗体断片のうち「Fv」は、完全な抗原認識部位と結合部位を含む最小の抗体断片である。「Fv」は、 1つの VHおよび 1つの VLが非共有結合により強く結合したダイマー (V H-VLダイマー）である。各可変領域の 3つの相補鎖決定領域（complementarity dete rmining region ; CDR)によって、 VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。 6つの CDRが抗体に抗原結合部位を付与している。し力ながら、 1つの可変領域（または、抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半分)であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。従って、このような Fvより小さい分子も本発明における抗体断片に含まれる。又、抗体断片の可変領域はキメラ化ゃヒト化されてレ、てもよレ、。

[0094] 低分子化抗体は、 VHと VLの両方を含んでいることが好ましい。低分子化抗体の例としては、 Fab, Fab'、 F(ab')2及び Fv等の抗体断片、並びに、抗体断片を利用して作製され得る scFv (シングルチェイン Fv) (Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19 88) 85: 5879-83; Pluckthuri「The Pharmacology of Monoclonal AntibodiesJ Vol. l l3， Resenburg及び Moore編， Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))、 Diabod y (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444-8; EP404097号； W09 3/11161号; Johnson et al., Method in Enzymology (1991) 203: 88-98; Holliger et al. ， Protein Engineering (1996) 9: 299—305; Perisic et al, Structure (1994) 2: 1217—26 ； John et al, Protein Engineering (1999) 12(7): 597-604; Atwell et al, Mol. Immunol. (1996) 33: 1301-12)、 sc(Fv)2 (Hudson et al、 J Immunol. Methods (1999) 231 : 177- 89； Orita et al., Blood(2005) 105: 562-566)、 Triabody (Journal of Immunological M ethods (1999) 231 : 177-89)、及び Tandem Diabody (Cancer Research (2000) 60: 43 36-41)等を挙げることができる。

[0095] 抗体断片は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより処理して得ることができる（Morimoto et al" J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24: 107 -17; Brennan et al. , Science (1985) 229: 81参照）。また、該抗体断片のアミノ酸配列を基に、遺伝子組換えにより製造することもできる。

[0096] 抗体断片を改変した構造を有する低分子化抗体は、酵素処理若しくは遺伝子組換えにより得られた抗体断片を利用して構築することができる。又は、低分子化抗体全体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることもできる（例えば、 Co et al" J. Immunol. (1994) 152: 2968-76; Bette r and Horwitz, Methods Enzymol. (1989) 178: 476~9b; Pluckthun and Skerra, Metho ds Enzymol. (1989) 178: 497-515; Lamoyi, Methods Enzymol. (1986) 121 : 652-63; Rousseaux et al., Methods Enzymol. (1986) 121 : bり《3-9; Bird and Walker, Trends Bi otechnol. (1991) 9: 132-7参照）。

[0097] また、上記「scFv」は、 2つの可変領域を、必要に応じリンカ一等を介して、結合させた一本鎖ポリペプチドである。 scFvに含まれる 2つの可変領域は、通常、 1つの VHと 1 つの VLであるが、 2つの VH又は 2つの VLであってもよレ、。一般に scFvポリペプチドは、 VH及び VLドメインの間にリンカ一を含み、それにより抗原結合のために必要な VH 及び VLの対部分が形成される。通常、同じ分子内で VH及び VLの間で対部分を形成させるために、一般に、 VH及び VLを連結するリンカ一を 10アミノ酸以上の長さのペプチドリンカ一とする。しかしながら、本発明における scFvのリンカ一は、 scFvの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカ一に限定されるものではなレ、。 scFvの総説として、 Pluckthunu i e Pharmacology of Monoclonal Antibody』Vol. l l 3(Rosenburg and Moore ed. , Springer Verlag, NY, pp.269-315 (1994》を参照することができる。

[0098] また、「ダイァボディ (diabody; Db)」は、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent) の抗体断片を指す (P.Holliger et al.， Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90: 6444-6448 (1993) 、 EP404，097号、 W093/ 1 1 161号等)。ダイァボディは、 2本のポリペプチド鎖力構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域 (VL)及び重鎖可変領域 (VH)が、互いに結合できない位に短レ、、例えば、 5残基程度のリンカ一により結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされる VLと VHとは、その間のリンカーが短いため単鎖 V領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイァボディは 2つの抗原結合部位を有することとなる。このとき 2つの異なるェピトープ (a、 b)に対する VLと VHを VLa_VHbと VLb_VHaの組合わせで 5残基程度のリンカーで結んだものを同時に発現させると二重特異性 Dbとして分泌される。

[0099] Diabodyは、 2分子の scFvを含むことから、 4つの可変領域を含み、その結果、 2つの抗原結合部位を持つこととなる。ダイマーを形成させない scFvの場合と異なり、 Diabo dyの形成を目的とする場合、通常、各 scFv分子内の VH及び VL間を結ぶリンカ一は、ペプチドリンカ一とする場合には、 5アミノ酸前後のものとする。し力ながら、 Diabod yを形成する scFvのリンカ一は、 scFvの発現を妨げず、 Diabodyの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカ一に限定されない。

[0100] 本発明においてさらに好ましくは、多重特異性抗体として二重特異性抗体を挙げること力 Sできる。

なお、上記「二重特異性抗体」は、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が 1 本鎖として連結した構造の抗体 (例えば、 sc(Fv)2)であってもよい。また重鎖可変領域 (VH)および軽鎖可変領域 (VL)が連結した scFv (あるレ、は sc(Fv)2)を Fc領域 (CH Iドメインを欠いた定常領域)と結合した抗体様分子 (例えば、 scFv-Fc)であってもよい。 s cFv_Fcからなる多重特異性抗体は第 1のポリペプチド力 VH l-linker_VLl-Fcであり、第 2のポリペプチドが VH2- linker-VL2- Fcからなる (scFv)2-Fc型の構造をもつ。あるレ、は single domain antibodyを Fc領域と結合させた抗体様分子であってもよい（Curr Opin Drug Discov Devel. 2006， 9(2), 184-93)。

[0101] 本発明の方法における変異導入前の抗体 (本明細書においては、単に「本発明の抗体」と記載する場合あり）の H鎖又は L鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリド一マから抗体をコードする遺伝子をクローユングして取得することも可能である。

[0102] 抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、 Clackson et al, Nature 1991， 352: 624-8, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991， 222: 581-97、 Water houses et al. , Nucleic Acids Res. 1993, 21 : 2265—6、 Griffiths et al" EMBO J. 1994, 13: 3245-60、 Vaughan et al, Nature Biotechnology 1996， 14: 309-14、及び特表平 20— 504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリ一とする方法 (W095/15393号パンフレット)やリボソーム提示法等の公知の方法を用レ、ることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、 WO92/01 047、 WO92/20791 , WO93/06213, W093/11236, W093/19172, WO95/01438, W ◦95/15388を参考にすることができる。

[0103] ハイプリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞 (ハイブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイプリドーマの mR NAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域)の cDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域 (C領域)をコードする DNAと連結することにより得ることができる。

[0104] より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、上記の H鎖及び L鎖をコ一ドする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明の抗体の抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウィルスを用いた方法 (例えば、 W098/46777など)などに準じて行うことができる。ノ、イブリドーマの作製は、たとえば、ミルスティンらの方法 (G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3- 46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。

[0105] 抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ること力 Sできる。または、抗体を産生し得るリンパ球を in vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ゥサギ等のゥサギ目、力二クイザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパンジ一等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる (WO96/34096; Mendez et al, Nat. Genet. 199 7， 15: 146-56参照)。このようなトランスジヱニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球を in vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる (特公平ト 59878号公報参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジヱニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる (W093/12227、 WO92/03918、 W094 /02602、 WO96/34096、 W096/33735参照)。

[0106] 動物の免疫化は、例えば、感作抗原を Phosphate- Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。

[0107] ハイプリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤 (例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細胞と融合して作成することができる (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Pr actice, Academic Press, 1986, 59-103)。必要に応じハイプリドーマ細胞を培養'増殖し、免疫沈降、放射免疫分析 (RIA)、酵素結合免疫吸着分析 (ELISA)等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。

[0108] 続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイプリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブ (例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等)を用いてクローニングすることができる。また、 mRNAから RT-PCRによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリンは、 IgA、 IgD、 IgE、 IgG及び IgMの 5つの異なるクラスに分類される。さらに、これらのクラスは幾つかのサブクラス (アイソタイプ) (例えば、 IgG_l、 IgG_2、 IgG-3、及び IgG_4 ;IgA_l及び IgA_2等)に分けられる。本発明において抗体の製造に使用する H鎖及び L鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属する抗体に由来するものであってもよぐ特に限定されないが、 IgGは特に好ましいものである。

[0109] ここで、 H鎖及び L鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ハムスター抗体、ヒッジ抗体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の H鎖、 L鎖の可変領域とヒト抗体の H鎖、 L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相ネ甫十生決定領域 (CDR; complementary determining region)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる (EP239400; WO96/02576参照)。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよレヽ (K. Sato et al.， Cancer Res. 1993, 53: 851-856)。

上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。本発明における改変は、部位特異的突然変異 (例えば、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、 PCR変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 (例えば、 95% 以上、 97。/₀、 98%、 99%等)のアミノ酸配列相同性及び/または類似性を元となった抗体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び/または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同 (同じ残基)または類似 (一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて (1)疎水性：ァラニン、イソロイシン、バリン、メチォニン及びロイシン； (2)中性親水性：ァスパラギン、グノレタミン、システィン、スレオニン及びセリン；（3)酸性：ァスパラギン酸及びグルタミン酸； (4)塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリジン； (5)鎖の配向に影響する残基:グリシンおよびプロリン;ならびに (6)芳香族性:チロシン、トリブトファン及びフエ二ルァラニンのグループに分類される。

[0111] 通常、 H鎖及び L鎖の可変領域中に存在する全部で 6つの相補性決定領域 (超可変部; CDR)が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち 1つの可変領域であつても全結合部位を含むものよりは低レ、親和性となるものの、抗原を認識し、結合する能力があることが知られている。従って、本発明の H鎖及び L鎖をコードする抗体遺伝子は、該遺伝子によりコードされるポリペプチドが所望の抗原との結合性を維持していればよぐ H鎖及び L鎖の各々の抗原結合部位を含む断片部分をコードしていればよレ、。

本発明の方法によって、上述のように、例えば、所望の、実際に活性を保持する、二重特異性抗体を効率的に取得することができる。

[0112] 重鎖可変領域は、上述のように、通常 3つの CDR領域と 4つの FR領域によって構成されている。本発明の好ましい態様において「改変」に供するアミノ酸残基としては、例えば、 CDR領域あるいは FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択することができる。一般的に CDR領域のアミノ酸残基の改変は、抗原に対する結合能を低下させる場合がある。従って、本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、特に限定されるものではないが、 FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択することが好ましい。

[0113] また、ヒトもしくはマウス等の生物において、抗体の可変領域の FRとして利用可能な配列を、当業者であれば、公共のデータベース等を利用して適宜取得することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の手段にて、 FR領域のアミノ酸配列情報を取得することが可能である。

なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0114] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[0115] 〔実施例 1〕ハイブリッド L鎖を持つ二重特異性抗体のヒトイ匕

特願 2005-112514において血液凝固時間の短縮効果が最も高力た抗 FactorlXa 抗体 A69_VH、抗 FactorX抗体 B26_VH、ハイブリッド L鎖 (BBA)の組み合わせから成る二重特異性抗体にっレ、て、以下のようにヒト化を実施した。

[0116] ヒト抗体の相同性検索

Database (ftp://ftp. ebi. ac. uk/ pub/ databases/kabat/) および IMGT Database (http://imgt. cines. fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手し、構築したデータベースを用いてマウス A69-H鎖可変領域（アミノ酸配列：配列番号： 19)、マウス B26- H鎖可変領域 (アミノ酸配歹 1J：配列番号： 20)、マウス BBA- L鎖可変領域 (アミノ酸配歹 IJ :配列番号： 21)に分けてホモロジ一検索を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことから、ヒト化抗体のフレームワーク領域（以下、 FR)に使用することにした。

[0117] (1)A69-H鎖可変領域： KABATID-000064 (Kabat Database)

(Kippsら、 J Clin Invest. 1991 ; 87 : 2087-2096)

(2) B26-H鎖可変領域： EMBL Accession No. AB063872(IMGT Database)

(Unpublished data)

(3) BBA_L鎖可変領域： KABATID-024300 (Kabat Database)

(Welschofら、 J Immunol Method. 1995； 179： 203-214)

[0118] (l)-(3)のヒト抗体の FRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域 (以下、 CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。

[0119] また、 NCBIより一般公開されている相同性検索 Web site (http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)を使用して、（4)-(6)のヒト抗体に相同性の高レ、ヒト抗体の分泌シグナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用した

(4) A69_H鎖可変領域： GenBank Accession No. AF062257

(5) B26- H鎖可変領域： GenBank Accession No. AAC 18248

(6) BBA_L鎖可変領域： GenBank Accession No. AAA59100 [0120] 1 2.ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築

分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、 50 base程度の合成オリゴ DNAを 3，末端側が約 20 base程度ハイブリダィズするように交互に 12本作製した。合成オリゴ DNAは 5'末端側にヒト配歹 1J、 3'末端側にマウス配列をコードするカまたは全塩基がヒト配列をコードするように設計した。さらに、抗体可変領域遺伝子の 5 '末端にァニールし、 Xhol切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の 3 '末端にァニールし、 Sfil切断配列を有し且つイントロン配列の 5 '末端配列をコードするプライマーを作製した。

[0121] 2.5 μ Μに調製した合成オリゴ DNAを各 1 μ Lで混合し、 lx TaKaRa Ex Taq Buffer, 0 .4 mM dNTPs, 0.5 units TaKaRa Ex Taq (全て宝酒造)を加え、反応液 48 μ Lになるように調製した。 94°C 5分保温した後に、 94°C 2分、 55°C 2分、 72°C 2分からなる反応を 2サイクル行レ、、各合成オリゴ DNAのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次に、抗体遺伝子の 5 '末端および 3 '末端にァニールするプライマー (各 10 /i M)を 1 μ L 添加し、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分力なる反応を 35サイクル行い、 72°C 5分反応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。 PCR後、反応液全量を 1 %ァガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約 400 bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extracti on Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 μ ΐで溶出した。該断片を pGEM-T Easy Vector Systems (Promega)を用いて、添付説明書記載の方法でクローニングを行った。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3730x L DNA Sequencerまたは ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。

[0122] 正しいヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認された H鎖可変領域断片揷入プラスミドを Xholおよび Sfilで、 L鎖可変領域断片揷入プラスミドを EcoRIで消化した後に、反応液を 1 %ァガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ (約 400 bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 μ 1で溶出した。その後、以下のようにして動物細胞用発現べクタ一を作製した。 Η鎖がヘテロな組み合わせである IgG4を優先的に発現させるために、 IgGlの knobs-into-hole技術 (Merchant AMら、 Nature Biotechnology, 1998年、 V ol. l6、 p.677-681)を参考に IgG4の CH3部分へのアミノ酸置換体を用いた。さらに H鎖のダイマー形成促進のためにヒンジにもアミノ酸置換（-ppcpScp-→-ppc_PPcp-)を導入した。ニヮトリ βァクチンプロモーターを有する pCAGGS (Niwaら、 Gene、 1991年、 V ol. 108、 p.193-199)に Y349C、 T366Wに置換した定常領域遺伝子を組み込んだ発現ベクターにヒト化 A69 H鎖可変領域抗体遺伝子断片を揷入し、ヒト化 A69H鎖発現ベクターを作製した。また、 pCAGGSに E356C、 T366S、 L368A、 Y407Vに置換した定常領域遺伝子を組み込んだ発現ベクターにヒト化 B26 H鎖可変領域抗体遺伝子断片を揷入し、ヒト化 B26H鎖発現ベクターを作製した。また、 pCAGGSに野生型の抗体 L鎖定常領域が揷入されたプラスミド (pCAG-g κ DNA)を EcoRIで消化し、ヒト化 BBA L 鎖可変領域抗体遺伝子断片を揷入した発現ベクターを作製した。連結反応は Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用レ、、大腸菌 DH5ひ株（東洋紡績)を形質転換した。

1 3.ヒト化二重特異性抗体の発現

ヒト化二重特異性抗体の発現は、以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来ヒト化二重特異性抗体の発現は、実施例 1 2に記載した方法か以下の方法を用レヽて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来 HEK293H株（Invitrogen)を 10 % Fetal Bovine Ser urn (Invitrogen)を含む DMEM培地 (Invitrogen)へ懸濁し、 5〜6 X 10⁵個 /mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（直径 10 cm, CORNING)の各ディッシュへ 10 mLずつ蒔きこみ COインキュベーター（37°C、 5 % CO )内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、 1 %の Fetal Bovine Serum(Invitrogen)を含む CHO-S-SFM-II (Invitrogen) 培地 6.9 mLを添カ卩した。 1― 2で調製したプラスミド DNA混合液（合計 13.8 μ g)を 1 μ g /mL Polyethylenimine (Polysciences Inc.) 20.7 μ Lと CHO-S-SFMII培地 690 μ Lと混合して室温 10分間静置したものを各ディッシュの細胞へ投入し、 4〜5時間、 COインキュベータ一（37。Cにて 5 % CO )内でインキュベートした。その後、 1 %の Fetal Bovine

360«11 1^ (^611)を含む。^^0-3-3?\4-11 (1 1"(¾611)培地6.9 mLを添加して、 3日間 COインキュベーター内で培養した。培養上清を回収した後、遠心分離 (約 2000 g、

5分間、室温）して細胞を除去し、さらに 0.22 μ τηフィルター MILLEX^(R)-GV (Millipore) を通して滅菌した。該サンプノレは使用するまで 4°Cで保存した。

[0124] 1 4.ヒト化二重特異性抗体の精製

実施例 1 2に記載の方法で得られた培養上清に 100 μ Lの rProtein A Sepharose^T M Fast Flow (Amersham Biosciences)を添加し、 4°Cで 4時間以上転倒混和した。その溶液を 0.22 μ mのフィルターカップ Ultrafree(^R)- MC (Millipore)に移し、 0.01 % Tween^(R) 20を含む TBS 500 μ Lにて 3回洗浄後、 rProtein A S印 harose™樹脂に 100 μ Lの 0.0 1 % Tween^(R) 20を含む 50 mM酢酸ナトリウム水溶液， pH 3.3に懸濁して 2分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、 6.7 μ Lの 1.5 M Tris-HCl， pH 7.8を加えて中和した。

[0125] 1一 5.ヒト化二重特異性抗体の濃度定量

以下に示すとおり、 2種類の方法で測定した。

Goat anti-human IgG (Biosource International) coating buffer!¹こて丄 μ g/mLiこ誠製し、 Nunc-Immuno plate(Nunc)に固相化した。 Diluent buffer (D.B.)にてブロッキング処理した後、 D.B.を用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、 2000 ng/mLから 3倍系列で D.B.にて 11段階希釈したヒ HgG4 (ヒト型化抗 TF抗体、 WO 99/51743参照）を同様に添加した。 3回洗净し 7この、 Goat anti-human Ig , alkaline phosphatase (Biosource International) ¾r 反応させた。 5回洗浄したのち、 Sigma 104^(R) phosphatase substrate (Sigma- Aldrich) を基質として発色させ、吸光度リーダー Model 3550 (Bio-Rad Laboratories)により、参照波長 655 nmとして 405 nmの吸光度を測定した。 Microplate Manager III (Bio-Rad L aboretories)ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒ HgG濃度を算出した。

[0126] また、 BiacorelOOO(BIACORE)を使用し、 ProteinAを固定化した Sensor Chip CM5(B IACORE)を用いて定量した。具体的にはメーカーのプロトコールに従レ、、活性化したセンサーチップに 10 mM酢酸ナトリウム水溶液 (pH 4.0, BIACORE)で 50 μ g/mLに希釈した ProteinA(SIGMA)溶液を 5 μ L/分で 30分間反応させ、その後ブロッキング操作を実施して ProteinA固定化センサーチップを作製した。このセンサーチップを用いて、 Biacore 1000(BIACORE)を使用して培養上清および精製品の濃度を測定した。センサーチップの固定および濃度測定には HBS-EP Buffer(BIACORE)を使用した。また、濃度測定時の標準品として 4000 ng/mLから 2倍系列で HBS-EP Bufferにて 6段階希釈したヒト化 IgG4抗体 (ヒト型化抗 TF抗体、 WO 99/51743参照）を使用した。

[0127] 1 - 6.ヒト化二重特異性抗体の血液凝固活性評価

血友病 A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、 Fact or VIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT)に対する同抗体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液 50 μレ Factor VIII欠乏血漿（Biomeri eux) 50 μ L及び APTT試薬（Dade Behring) 50 μ Lの混合液を 37°Cで 3分間加温した。凝固反応は 20 mMの CaCl (Dade Behring) 50 μ Lを同混合液に加えることにより開始

2

させた。 CR-A (Amelung)が接続された KClOA (Amelung)により凝固するまでの時間を測定した。

[0128] Factor VIII欠乏血漿の凝固時間を 0 %、正常血漿の凝固時間を 100 %としたときに作製される検量線を用いて、二重特異性抗体を添加した際の凝固時間から二重特異性抗体の Factor VIII様活性 (%)を算出した。

[0129] 1 - 7.血液凝固活性を保持したヒト化二重特異性抗体の取得

上述した血液凝固活性評価において、血液凝固能が低下したヒト化二重特異性抗体について、活性上昇を目指してヒト抗体 FRのアミノ酸を改変した。具体的には、 Qui kChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) 用レヽて、添付兑明書載の方法でヒト化抗体可変領域に変異を導入した。目的のヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認された H鎖可変領域断片挿入プラスミドを Xholおよび Sfilで、 L鎖可変領域断片挿入プラスミドを EcoRIで消化した後に、反応液を 1 %ァガローズゲノレ電気泳動に供した。目的のサイズ (約 400 bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 μ ΐで溶出した。その後、実施例 1一 2に示す方法で、動物細胞用発現プラスミドを作製した。実施例 1一 3、 1 -4, 1一 5に示す方法でヒト化二重特異性抗体を調製し、実施例 1一 6に示す方法で血液凝固活性を評価した。

[0130] FR配列のアミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことでキメラ二重特異性抗体 (Α69/Β26/ΒΒΑ)と同等の活性を有するヒト化二重特異性抗体（ヒト化 Α69 (hA6 9a) /ヒト化 B26 (hB26-F123e4)/ヒト化 BBA (hAL-F123j4) )を取得した（図 1)。各抗体可変領域配列を以下の配列番号に示した。

[0131] (1)ヒト化 A69抗体 VH (hA69a) 配列番号： 1 (塩基配列）、配列番号： 2 (アミノ酸配歹 1J )

(2)ヒト化 B26抗体 VH (hB26_F123e4) 配列番号： 3 (塩基配列）、配列番号： 4 (ァミノ酸配列）

(3)ヒト化 BBA抗体 VL (hAL-F123j4) 配列番号： 5 (塩基配列）、配列番号： 6 (ァミノ酸配列）

[0132] 〔実施例 2〕二重特異性抗体の分離に向けた可変領域のアミノ酸改変箇所の選定二重特異性抗体を調製する際の発現において、 2種類の H鎖と 1種類の L鎖を使用すると、ヒト化 A69- H鎖とヒト化 BBA-L鎖のホモダイマー、ヒト化 B26-H鎖とヒトイ匕 BBA- L鎖のホモダイマー、ヒト化 A69-H鎖およびヒトイ匕 B26-H鎖とヒトイ匕 BBA-L鎖のへテロダイマーの 3種類の抗体が発現する。この 3種類の抗体を分離し、二重特異性抗体のみ精製することを目的として、ヒト化 A69 H鎖可変領域の等電点を下降させ、ヒト化 B2 6 H鎖可変領域の等電点を上昇させるアミノ酸改変を行った。

[0133] はじめにヒト化 A69抗体とヒト化 B26抗体の可変領域表面に露出するアミノ酸残基を確認するために、 MOEソフトウェア（Chemical Computing Group Inc. )を用いて、ホモロジーモデリングによりヒト化 A69抗体およびヒト化 B26抗体の抗体 Fv領域モデルを作製した。モデルを図 2に示した。本モデルの詳細な解析により、 CDR以外の FR配列においては表面に露出するアミノ酸の中で、 H10、 H12、 H23、 H39、 H43、 H105 (Kabat ナンノくリング、 Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Intere st. NIH)が、活性を低下させること無ぐ等電点を変化させることができる候補になると考えられた。

[0134] 〔実施例 3〕ヒト化二重特異性抗体の可変領域アミノ酸の改変

実施例 2において選定された箇所について改変抗体を作製するためのアミノ酸改変を行った。具体的には、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) を用いて、添付説明書記載の方法で作製したヒト化 A69抗体 H鎖可変領域 (hA69a、塩基配列番号： 1)およびヒト化 B26抗体 H鎖可変領域 (hB26_F123e4、塩基配列番号： 3)に変異を導入した。目的のヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認された H鎖可変領域断片挿入プラスミドを Xholおよび Sfilで消化した後に、反応液を 1 %ァガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約 400 bp)の DNA断片を QIAquick G el Extraction Kit (QIAGEN)を用いて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 μ 1 で溶出した。実施例 1 _ 2に示す方法で、調製した DNA断片を knobs-into-hole技術を参考に定常領域アミノ酸を置換した発現プラスミドおよび野生型定常領域をもつ発現プラスミドに揷入し、 H鎖発現ベクターを作製した。その後、実施例 1— 3、 1—4、 1 一 5に示す方法でヒト化二重特異性抗体を調製した。改変したヒト化抗体の可変領域配列を以下の表 1に記載される配列番号に示した。

[表 1]

[0136] 〔実施例 4〕改変したヒト化抗体の等電点電気泳動による分析

可変領域のアミノ酸改変による表面電荷の変化について評価するために、改変抗体の調製および等電点電気泳動による分析を実施した。

[0137] ヒト化 BBA- L鎖 (hAL- F123j4)発現ベクターとヒトイ匕 A69- H鎖を改変した hA69 - _P18、h A69-p8、 hA69_pl7、 hA69_pl6および未改変の hA69aの各 H鎖発現ベクターを組み合わせて同時に発現させることにより hA69a、 hA69-pl8、 hA69_p8、 hA69_pl7、 hA69 -pl6の 5種類のホモダイマーで構成される抗体を調製した。同様に、ヒト化 BBA-L鎖発現ベクターとヒト化 B26-H鎖を改変した hB26-pl9、 hB26_pl5および未改変の hB26 -F123e4の各 H鎖発現ベクターを組み合わせて同時に発現させることにより hB26_Fl 23e4、 hB26_pl9、 hB26_pl5の 3種類のホモダイマーで構成される抗体を調製した。等電点電気泳動は以下のとおり行った。 Phastsystem Cassette (AmerchamBioscienc e社製）を用いて以下の膨潤液で 30 minほど Phast- Gel Dry IEF (AmerchamBioscienc e社製)ゲルを膨潤させた。

[0138] 20% Glycerol 0.95 mL

ミリ Q水 0.95 mL

Bio-Lyte 7/9 (BioRad社製） 10 μ L

Bio-Lyte3/ 10 (BioRad社製） 10 μ L

Pharmalyte 8-10.5 for IEF (AmerchamBioscience社製) 80 μ L

[0139] 膨潤したゲルを用いて PhastSystem(AmerchamBioscience社製)により以下のプログラムで電気泳動を行った。サンプルは Step 2でゲルに添加した。 piマーカーとして、 C alibration Kit for pI(AmerchamBioscience社製) 使用した。

[0140] Ste 1 : 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 75 Vh

Step 2: 200 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 15 Vh

Step 3: 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 410 Vh

[0141] 泳動後のゲルは 20 % TCAで固定した後、 Silver staining Kit, protein(AmerchamBi oscience社製)を用レ、、キットに添付されているプロトコールに従い銀染色を行った。染色後、 piマーカーの既知等電点からサンプノレの等電点を算出した。

[0142] 未改変および改変したヒト化 A69抗体のホモダイマー、ヒト化 B26抗体のホモダイマ一の分析結果を図 3に示した。表面電荷の改変により等電点電気泳動においてバンドの移動が観察された。 piマーカーを参考に推測した各抗体の等電点は、未改変の hA69aホモダイマーが約 8.8であるのに対して、改変した11八69_ 18が約8.4、 hA69_pl 7が約 8.2、 11八69- 8が約8.2、 hA69_pl6が約 8.1であり、改変により最大約 0.7の等電点の差を付与することができた。ヒト化 B26ホモダイマーも同様に、未改変の hB26_Fl 23e4が約 9.1であるのに対して、改変した1^26- 19が約9.3、 hB26_pl5が約 9.4であり、改変により最大約 0.3の等電点の差を付与することができた。本検討において選択した可変領域の H12、 H23、 H39、 H43、 H105の表面アミノ酸を電荷的に改変することによって等電点を変化させることが可能であることが示された。

[0143] 〔実施例 5〕改変したヒト化抗体の陽イオン交換クロマトグラフィー分析

実施例 4において作製した改変抗体を用いて以下の方法で陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析を行い、改変による両抗体の分離に及ぼす影響を評価した。陽ィオン交換クロマトグラフィー分析条件は以下のとおりであり、ヒト化 A69抗体のホモダイマー、ヒト化 B26抗体のホモダイマーの保持時間を算出した。

[0144] カラム： ProPac WCX— 10, 4 X 250 mm, (Dionex)

移動相： A: 10 mmol/L NaH PO /Na HP〇， pH 6.25

2 4 2 4

B: 10 mmol/L NaH PO /Na HP〇， 500 mmol/L NaCl, pH 6.25

2 4 2 4

流速： 1.0 mL/min

グラジェント： 10 %B(5 min)→(40 min)→60 %B→(5 min)→100 %B (5 min) 検出： 220 nm

[0145] 未改変および改変した 5種のヒト化 A69抗体のホモダイマーの分析結果を図 4に、未改変および改変した 3種のヒト化 B26抗体のホモダイマーの分析結果を図 5に示した。未改変ヒト化 A69抗体のホモダイマーとヒト化 B26抗体のホモダイマーの保持時間はともに 25 min前後であり、両ホモダイマーの分離、まして目的の二重特異性抗体の分離は出来なレ、。未改変抗体の等電点を低下させる改変を行ったヒト化 A69抗体は未改変の抗体と比較してピークの移動が観察され、改変の数に伴い保持時間は約 22.4 min,約 21.2 min,約 20.2 minと短くなつた。可変領域の等電点を上昇させる改変を行ったヒト化 B26抗体も未改変の抗体と比較してピークの移動が観察され、改変の数に伴い保持時間は約 28.4 min,約 29.4 minと長くなつた。本検討において選択した可変領域の H12、 H23、 H39、 H43、 H105の表面アミノ酸の電荷的に改変することによつて、 2種類の抗体の表面電荷が変化し、それにより保持時間を変化させることが可能であることが示された。

[0146] 実施例 4において測定された等電点によると、未改変の hA69aホモダイマーと未改変の hB26_F123e4ホモダイマーは piに 0.3の差があるが両者の保持時時間はともに 25 min前後であり分離できなかったが（図 9)、未改変の hA69aホモダイマーと hB26-pl9 は piに 0.5の差が付与され、その結果両者は保持時間約 2.6minの差で分離されており、また hA69-pl8と hB26ホモダイマーは piに 0.7の差が付与され、その結果両者は保持時間約 3.4minの差で分離されており、最大で hA69_pl6と hB26_pl5は piに 1.3の差が付与され、その結果保持時間約 9.2 minの差で分離された。このように、改変により 2つのホモダイマーの分離が初めて可能になった。

[0147] 〔実施例 6〕改変したヒト化二重特異性抗体の凝固活性評価

実施例 4、実施例 5の分析により表面電荷の変化が観察されたことを受けて、改変した 2種類のヒト化抗体 H鎖（hA69-p8、 hB26-pl5)とヒト化 L鎖 (hAL_F123j4)を発現させてヒト化二重特異性抗体を調製した。 H鎖発現ベクターには、ヘテロダイマーを効率的に促進させるために、 knobs-into-holes技術を利用した IgG4定常領域が組み込まれた発現ベクターを使用した。調製したヒト化二重特異性抗体を用いて、以下に示す方法に従って凝固活性を評価した。

[0148] 血友病 A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、 Fact or VIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT)に対する同抗体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液 50 /i L、 Factor VIII欠乏血漿（Biomeri eux) 50 μ L及び APTT試薬（Dade Behring) 50 μ Lの混合液を 37°Cで 3分間加温した。凝固反応は 20 mMの CaCl (Dade Behring) 50 /i Lを同混合液に加えることにより開始

2

[0149] Factor VIII欠乏血漿の凝固時間を 0 %、正常血漿の凝固時間を 100 %としたときに作製される検量線を用いて、二重特異性抗体を添加した際の凝固時間から二重特異性抗体の Factor VIII様活性 (%)を算出した。

[0150] 活性評価結果を図 6に示した。可変領域を改変したヒト化二重特異性抗体は、未改変のヒト化二重特異性抗体と同等の凝固活性を示したことから、本実施例における可変領域の改変は抗体の活性には影響がないことが示された。

[0151] 〔実施例 7〕 CDRを改変したヒト化抗体の作製と評価

実施例 2で作製したヒト化 A69抗体のモデルを解析した結果、 H97は表面に露出するアミノ酸であることが確認された。表 1に示した抗体においてヒト化 A69-H鎖である h A69-N97Rは CDR3に存在する 97番目のァスパラギンをアルギニンに改変した配列を持つ。実施例 1— 2の方法に従って hA69_N97Rをもつ発現ベクターを作製し、ヒトイ匕 B BA-L鎖である hAL_F123j4とともに発現し、改変抗体を調製した。この抗体の表面電荷の変化を評価するために、実施例 4の方法に従って等電点電気泳動を行った。図 7に示すとおり、未改変の抗体（hA69a I hAL_F123j4)の等電点は 8.9であるのに対して、改変抗体（hA69- N97R I hAL-F123j4)は 9.1であり、 CDRのアミノ酸置換にぉレヽても表面電荷の変化が観察された。

[0152] また改変抗体の機能を評価するために、以下の方法で抗原である Factor IXaに対する結合活性を評価した。 Coating buffer (100 mM sodium bicarbonate, pH 9.6, 0.02 % sodium azide)で 1 μ g/mLに布釈した Factor IXa β (Enzyme Research Labratories) を、 Nunc-Immuno plate (Nunc- Immuno 96 MicroWell plates MaxiSorp Nalge N unc International) )に 100 μ L/wellで分注後、 4°Cでー晚インキュベーションした。 Twe en^(R) 20を含む PBS (-)で 3回洗浄後、 diluent buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 1 % bov ine serum albumin, ImM MgCl , 0.15 M NaCl, 0. 05 % Tween^(R) 20, 0.02 % sodium az ide)で plateを室温で 2時間 blockingした。 Bufferを除去後、 diluent bufferで希釈した精製抗体を 100 μ L/well添加し、室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1/4000希釈したアルカリホスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG (BI OSOURCE)を 100 μ L/well添加し、室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 5回洗浄後、発色基質（Sigma)を 100 μ L/well添加し、室温で 30分インキュベーションした。 405 nm (対照 655 nm)における吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio_Rad La boratories)で測定した。その結果、図 8に示すとおり、表面電荷を変化させるために CDRを改変した抗体は改変前の抗体と同等の結合活性を示した。このように表面電荷を改変する際に、改変する箇所は実施例 5に示した FRのみでなぐ CDRであっても構わないことが示された。

[0153] 〔実施例 8〕ヒト化二重特異性 PF抗体の作製と評価

未改変の抗体として、表 1に示した抗体においてヒトイヒ A69-H鎖である hA69a、ヒト化 B26-H鎖である hB26_F123e4とヒトイ匕 BBA-L鎖である hAL_F123j4 (配列番号： 5)を用いて、未改変のヒト化二重特異性抗体を作製した。改変抗体として、表 1に示した抗体においてヒト化 A69-H鎖の改変体である hA69-PFLとヒト化 B26-H鎖の改変体である hB26_PFとヒト化 BBA-L鎖である hAL_s8 (配列番号： 17)を用いて、ヒト化二重特異性 PF抗体を作製した。 H鎖は野生型の定常領域をもつ発現ベクターを使用して、実施例 1一 2に示すとおりに発現ベクターを構築し、実施例 1一 3、実施例 1一 4、実施例 1 _ 5の方法に従って抗体を調製した。この 2種類のホモダイマーと二重特異性抗体を含む混合溶液を用いて、実施例 5に示す方法で陽イオン交換クロマトグラフィ一分析を実施した。

[0154] 未改変のヒト化二重特異性抗体とヒト化二重特異性 PF抗体分析結果を図 9、図 10 に示した。その結果、未改変のヒト化二重特異性抗体においては、二種類のホモダイマーと二重特異性抗体が分離せず 1本のピークとして溶出したのに対して、ヒト化二重特異性 PF抗体は、二種類のホモダイマーと目的の二重特異性抗体がそれぞれ分離し、 hA69-PFホモダイマー、ヒトイ匕二重特異性 PF抗体、 hB26_PFホモダイマーの順に 3本のピークとして溶出した。陽イオン交換クロマトグラフィー分析の際に 3種類のピークを分取することで、二種類のホモダイマーとヒト化二重特異性 PF抗体を精製した。この画分を Amicon Ultra, MWCO 10000 (Millipore)による濃縮後、 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0に対してー晚冷所で透析を行い、濃度測定を行った

[0155] 各抗体を精製した後に、実施例 4に示す方法に従って等電点電気泳動を行った。

図 11に示すとおり、陽イオン交換クロマトグラフィー分析を行う前の抗体は 3本のバンドが存在するが、陽イオン交換クロマトグラフィーにより各抗体が精製できることが確認された。ヒト化 A69-PF抗体のホモダイマー、ヒトイ匕二重特異性 PF抗体、ヒト化 B26-P F抗体のホモダイマーの等電点は約 7.9、約 8.6、約 9.2であり、ヒト化 A69-PF抗体のホモダイマーのヒトイ匕二重特異性 PF抗体等電点の差は約 0.7であり、ヒト化 B26-PF抗体のホモダイマーのヒト化二重特異性 PF抗体等電点の差は約 0.6であることが確認された。

[0156] つづいて、実施例 6に示す方法に従って精製した二重特異性 PF抗体の凝固活性を評価した。前述した knobs-into-holes技術を利用した IgG4定常領域を用いて発現させたキメラ二重特異性抗体、可変領域を改変していない hA69a (配列番号： 2)、 hB 26-F123e4 (配列番号: 4)、 hAL-F123j'4 (配列番号： 6)から成る二重特異性抗体、精製した二重特異性 PF抗体と同じ可変領域をもち、 knobs-into-holes技術を利用した Ig G4定常領域を用いている二重特異性抗体の 3種類の抗体と凝固活性を比較した。評価結果を図 12に示した。 Knobs-into-holes技術を利用した IgG4定常領域をもつ二重特異性 PF抗体と野生型定常領域をもち陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した二重特異性 PF抗体の凝固活性は同等であり、本実施例の H10、 H12、 H23、 H39 、 H43、 H105の可変領域改変により活性に影響することなく高純度にて二重特異性抗体が精製できることが示された。

[0157] 〔実施例 8〕ヒト化二重特異性抗体発現細胞株の樹立

改変したヒト化二重特異性抗体を調製するために、以下のようにして抗体発現細胞株を樹立した。

[0158] ヒ HgG4の野生型 H鎖定常領域遺伝子を铸型にして H鎖定常領域の N末端側の 2ァミノ酸 (Ala-Ser)をコードする塩基配列が Nhel認識配列 (GCTAGC)になるように設計した 5'末端側プライマーと 3'末端側にアニーリングし、かつ Notl認識部位を持つように設計したプライマーを用いて H鎖定常領域を PCR増幅し、 pBluescriptKS+ベクター（東洋紡）を Nhel, Notl (ともに宝酒造)で消化したベクターと連結した pBCH4(IgG4定常領域遺伝子を含む)を作製した。表 1に示すヒト化 A69-H鎖抗体 (hA69-KQ)およびヒトィ匕 B26-H鎖抗体 (hB26_PF)の H鎖可変領域の 5'末端側塩基配列に相補的でコザック配列 (CCACC)および EcoRI認識配列を有するプライマーと Nhel認識配列を有する 3 '末端側塩基配列にプライマーを用いて PCRを行い、得られた PCR産物を EcoRI, Nh el (ともに宝酒造)で消化、同様に EcoRI, Nhelで消化した pBCH4に揷入して可変領域と定常領域を連結した。作製したヒト化 A69-H鎖抗体ベクターを EcoRI, Notl (ともに宝酒造)で消化し、同様に EcoRI, Notlで消化した動物細胞用発現ベクター pCXND3にクローニングした。

[0159] 本ベクター pCXND3の構築の流れにっレ、て、以下に述べる。 DHFR- Δ E-rVH-PM l-f(W〇92Zl9759参照）の抗体 H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素 EcoRI, Smal部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、 EcoRI-Notl -BamHI adap tor (宝酒造）をクローニングした。このベクターを pCHOIと命名した。 pCHOIの DHFR 遺伝子発現部位を pCXN (Niwaら、 Gene 1991； 108： 193-200)の制限酵素 Hindlll部位にクローニングしたベクターを pCXND3と命名した。また、作製したヒト化 B26-H鎖抗体ベクターを EcoRI, Notl (ともに宝酒造)で消化し、同様に EcoRI, Notlで消化した動物細胞用発現ベクター pCXZDlにクローニングした。 pCXZDlベクターは pCXND3 ベクターのネオマイシン耐性遺伝子をゼォシン耐性遺伝子に置き換えた発現べクタ一である。また、ヒト化 BBA-L鎖抗体 (hAL-AQ、配列番号： 18)の L鎖可変領域の 5' 末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよび Bsi WI部位を有する 3'末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて PCR を行い、得られた PCR産物をヒト kappa鎖定常領域が pBluescriptKS+ベクターに揷入されている pBCLベクターにクローユングした。 BsiWI部位により、ヒト L鎖可変領域と定常領域が連結してレ、る。作製された L鎖遺伝子断片を発現ベクター pUCAGにクローニングした。本ベクター pUCAGは、 pCXN (Niwaら、 Gene 1991； 108： 193-200)を制限酵素 BamHIで消化して得られる 2.6 kbpの断片を pUC19ベクター（東洋紡）の制限酵素 BamHI部位に連結し、クローニングしたべクタ一である。 L鎖を pUCAGにクローニングしたベクターを制限酵素 BamHIで消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクター pHygDHFR_4bにクローニングした。作製した 3種類の発現ベクターを制限酵素で直鎖上にしたのちに、 CHO-DG44細胞に遺伝子導入して抗体発現細胞株を榭した。

安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。 GenePulserll (Bio-Rad)を用いたエレクト口ポレーシヨン法により遺伝子導入した。各抗体発現ベクターと PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 10⁷細胞/ mL)の 0.75 mLを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5 kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrog en)を 1倍濃度で含む CHO_S_SFMII培地（Invitrogen) 40 mLに懸濁した。同様の培地で 10倍希釈液を作製し、 96ゥヱル培養用プレートに 100 x L/wellで分注した。 C〇ィンキュベータ一（5 % CO )で 24時間培養後、 Geneticin (Invitrogen)を 0.5 mg/mL、 Ze ocm (Invitrogen)を 0.り mg/mL、 HygromycmB (Invitrogenノを 0.4 mg/mLにるつに、添加して 2週間培養した。薬剤耐性を示す形質転換細胞のコロニーを順次拡大培養し、樹立した高産生細胞株を用いて大量培養を行い、培養上清を得た。

[0161] 〔実施例 9〕ヒト化二重特異性抗体の製造用汎用カラムによる分離精製

実施例 8で得られた培養上清から以下の方法で二重特異性抗体を精製した。培養上清を平衡化バッファー（20 mmol/L Sodium Phosphate buffer, 1 mol/L NaCl)で平渙 Ϊィ匕した rProtein A Sepharose Fast Flowカフム (Amersham Biosciences^ 50 mml.D. X 9.9 cmH. = 194.3 mL-resin)に添加し、洗浄用バッファー 1 (20 mmol/L Sodium Pho sphate buffer, 1 mol/L NaCl, pH7.0)、洗浄用バッファー 2 (50 mmol/L Sodium Aceta te buffer, pH 6.0)で洗浄した後に 100 mmol/L Acetic acidを用いて溶出した。溶出後に直ちに 20 mmol/L Sodium Acetate buffer, pH6.0で 3倍希釈した。

[0162] 得られた精製溶液を Solvent A (20 mmol/L sodium Acetate buffer, pH 6.0)で平衡ィ匕した製造用汎用カラムである SP TOYOPEARL 650Mカラム（東ソ一、 26 mml.D. X 2 2.3 cmH. = 118.3 mL-resin)に添加した。以下に示すような溶液および Gradientで抗体の表面電荷の差を用いた分離を行った。

[0163] olvent A ： 20 mmol/L Sodium Acetate buffer, pH6.0

Solvent B ： 20 mmol/L Sodium Acetate buffer, 1 mol/L Naul, pH6.0 Flow rate ： 10 mL/min (113 cm/h)溶出時のみ 5.3 mL/min (60 cm/h) Gradient ： 0→15%B Step wise 3 Column Volume (CV)逾ィ夂

15→22 %B gradient 2.5 CV

22→30 %B gradient 6 CV

30→100 %B Step wise 3 CV通液

[0164] 溶出の結果、図 13に示すような 3本のピークが検出され、製造用汎用カラムを使用した場合にも二重特異性抗体が分離精製できることが示された。

[0165] 〔実施例 10〕改変したヒト化二重特異性抗体の活性評価

実施例 9で調製したヒト化二重特異性抗体について、実施例 6に示す方法に従って凝固活性を評価した。評価結果を図 14に示した。実施例 8で調製したヒト化二重特異性 PF抗体と比較して実施例 9で精製したヒト化二重特異性抗体の凝固活性は同等であった。 hA69_PFLと hA69-KQのように可変領域のアミノ酸配列が若干異なっていても、製造用汎用カラムを使用して精製した抗体であっても活性には影響がないことが示された。

[0166] 以上のことから、二重特異性抗体を調製する際に、 H鎖可変領域の改変により構造や抗体の機能（活性）を変えることなく表面電荷を変化させることで、目的のヒト化二重特異性抗体と二種のホモダイマーを形成する抗体とを分離精製できることが見出された。本方法を用いることで製造用汎用カラムにおいても二重特異性抗体が分離精製可能であることが示されたことから、二重特異性抗体からなる医薬品の製造方法として有用である。

[0167] 〔実施例 11〕サブクラスハイブリッド抗体の作成

11 - 1.ヒト IgG2抗体 H鎖定常領域遺伝子のクローニング

ヒト IgG2抗体 H鎖定常領域の遺伝子をクローニングするため、以下の操作を行った cDNA断片増幅のために 50 /i Lの反応液（各 l Lの 20 μ Μ K62プライマー（5' cac c gt etc etc age etc cac caa 3 Z酉己列番"^ ":22)、 K6<3プフィマ' ~~ (5 gtg gca etc att tac ccg gag aca 3'/配列番号： 23)、 5 μ Lの MTC Multiple Tissue cDNA Panels (periph eral leukocytes) (Clontech)、 4 μ Lの 5 X Prime STAR Buffer, 4 μしの2.5 mM dNTPs 、 1 μ Lの PrimeSTAR HS DNA Polymerase (以上 TaKaRa) )を調製し、 PCRに供した。

PCRは、サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、 98 °Cで 2分間加熱後、 98°C 10秒、 60°C 5秒、 72°C 2 minからなる反応を 30 cycle行い、最後に 72°Cで 10 min加熱した。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約 1000 bp)の増幅断片を QIAqucick Gel Extractio Kit (QIAGEN) にて添付説明書記載の方法に従って精製し、滅菌水 50 z Lで溶出した後、増幅断片の末端に A (Adenosine)を付加するため r-Taq処理をおこなった。 r_Taq処理は、得られた増幅断片を 10 μ Lの rTaq反応液（1 μ Lの 10 X rTaq反応溶液、 1 μ Lの 2.5 mM d NTPs、 1 μ Lの rTaq、 7 μ Lの上記増幅断片）を 72°Cで 30 min保温した。 r_Taq処理した断片を PCR2.1-TOPO vector (Invitrogen)へクローニングし、塩基配列を決定した。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用レ、、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3730xL Genetic Analyzer (Appl ied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。

[0168] 決定した塩基配列を Accession.No.BX640623と比較し、翻訳したアミノ酸配列が異なっている塩基は PCR増幅時に挿入された変異と考え、 Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いてアミノ酸置換を行レ、、 BX640623のアミノ酸配歹 IJと同じ配列になるように改変した。 Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (St ratagene)は添付説明書記載の方法に従って行った。さらに、ヒ HgG2- H鎖定常領域遺伝子と目的の可変領域遺伝子を連結するために、ヒト IgG2-H鎖定常領域の最初の 2アミノ酸 (AlaSer)が制限酵素 Nhel認識配列（GCTAGC)になるように変異させた。本試験に使用したヒ HgG2_H鎖定常領域の塩基配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号： 24および配列番号： 25に示した。

[0169] 11 - 2.サブクラス置換抗体の発現ベクター構築

ヒト化 PM- 1抗体の H鎖可変領域とヒト IgGl、ヒト IgG2、ヒト IgG4の各種 H鎖定常領域を連結した抗体発現ベクターを以下のように作製した。

非特許文献（Sato K et al, Cancer Research 1993， 53: 851-856)に示されているヒト化抗ヒトインターロイキン 6受容体抗体 (ヒト化 PM-1抗体)の H鎖可変領域の 5'末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよび制限酵素 N hel認識配列を有し、 3'末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて P CRを行い、得られた PCR産物をヒト IgGl-H鎖定常領域（Sato K et al, Cancer Resear ch 1993, 53: 851-856参照）が pBluescript KS+ベクター（TOYOBO)に挿入されている pB-CHベクターにクローニングした。 H鎖可変領域と定常領域が連結した H鎖遺伝子断片をニヮトリ βァクチンプロモーターにより発現が制御される pCAGGSベクター（ Niwa et al. 1991 Gene, 108: 193-199)に揷入した。 PCR増幅したヒトイ匕 PM-1抗体の H鎖可変領域遺伝子をヒ HgG4定常領域遺伝子 (WO 99/51743参照）および実施例 11 _ 1で作製したヒト IgG2-H鎖遺伝子の 5'末端の Nhelと連結して pCAGGSベクターに揷入した。各種 H鎖発現ベクターは、 Nhel配列によりヒト化 PM-1抗体の H鎖可変領域とヒト H鎖定常領域が連結して H鎖を発現する。

[0170] 同様にヒト化 PM-1抗体の L鎖可変領域の 5'末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよび制限酵素 BsiWI認識配列を有する 3'末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて PCRを行レ、、得られた PCR産物をヒト kappa鎖定常領域力 ¾Bluescript KS+ベクター（TOYOBO)に挿入されている pB_ CLベクターにクローニングした。 L鎖可変領域と定常領域が連結した L鎖遺伝子断片をニヮトリ βァクチンプロモーターにより発現が制御される pCAGGSベクターに揷入した。 BsiWI配列によりヒト化 PM-1抗体の L鎖可変領域とヒト kappa鎖定常領域が連結して L鎖を発現する。

[0171] 11 - 3.サブクラスハイブリッド抗体の発現

サブクラスハイブリッド抗体はヒト IgGl、ヒト IgG2、ヒト IgG4の各種定常領域を有するヒト化 PM-1抗体 H鎖発現ベクターをそれぞれ二種類ずつ組み合わせ、ヒト化 PM-1抗体 L鎖発現ベクターとともに発現用細胞で共発現させることにより可能となる。各抗体の発現は、実施例 4一 2に記載した方法か以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来 HEK293H株（Invitrogen)を 10% Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を含む DM EM培地 (Invitrogen)へ懸濁し、 5〜6 X 10⁵個 /mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（直径 10 cm, CORNING)の各ディッシュへ 10 mLずつ蒔きこみ COインキュベータ一（37°C、 5% CO )内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、 CHO-S-SFM-lKl nvitrogen)培地 6.9 mLを添加した。 11— 2で調製したプラスミド DNAを用いて以下のように各サブクラス抗体発現用混合液とハイブリッド抗体発現用の混合液 (合計 13.8 / g)を調製した。

(1) L鎖発現ベクター 6.9 μ g、 IgGl-H鎖発現ベクター 6.9 μ g

(2) L鎖発現ベクター 6.9 μ g、 IgG2-H鎖発現ベクター 6.9 μ g

(3) L鎖発現ベクター 6.9 μ g、 IgG4-H鎖発現ベクター 6.9 μ g

(4) L鎖発現ベクター 6.9 μ g、 IgGl-H鎖発現ベクター 3.45 μ g、 IgG2_H鎖発現べクタ一 3·45 μ g

(5) L鎖発現ベクター 6.9 μ g、 IgG2-H鎖発現ベクター 3.45 μ g、 IgG4_H鎖発現べクタ一 3·45 μ g

(6) L鎖発現ベクター 6.9 μ g、 IgGl-H鎖発現ベクター 3.45 μ g、 IgG4_H鎖発現べクタ一 3·45 μ g

[0172] 混合液それぞれを 1 μ g/mL Polyethylenimine (Polysciences Inc.) 20.7 μ Lおよび C HO-S-SFMII培地 690 _β Lと混合して室温 10分間静置したものを各ディッシュの細胞へ投入し、 4〜5時間、 COインキュベーター（37°Cにて 5% CO )内でインキュベートした。その後、 CHO-S-SFM-II (Invitrogen)培地 6.9 mLを添加して、 3日間 COインキュベータ一内で培養した。培養上清を回収した後、遠心分離 (約 2000 g、 5分間、室温）して細胞を除去し、さらに 0.22 μ mフィルター MILLEX(R)-GV (Millipore)を通して滅菌した。該サンプルは使用するまで 4°Cで保存した。

[0173] 1 1 - 4.サブクラスハイブリッド抗体の精製

実施例 1 1一 3に記載の方法で得られた培養上清に 100 μ Lの rProtein A Sepharose ™ Fast Flow (Amersham Biosciences)を添加し、 4°Cで 4時間以上転倒混和した。その溶液を 0.22 μ mのフィルターカップ Ultrafree(^R)-MC (Millipore)に移し、 TBS 500 μ L にて 3回洗浄後、 rProtein A S印 harose™樹脂に 100 μ Lの 50 mM酢酸ナトリウム水溶液、 pH 3.0に懸濁して 2分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、 6.7 x Lの 1.5 M Tris-HCU 150 mM NaCl、 pH 8.0を加えて中和した。得られた抗体溶液は活性測定用として PBSに、また、 DSC測定用として 150 mM NaClを含む 20 mM酢酸緩衝液、 pH 6.0に透析することで緩衝液を置換した。精製されたヒ HgGlの H鎖定常領域を有する抗体は「未改変ヒト化抗 PM- 1抗体」、ヒ HgG2の H鎖定常領域を有する抗体は「Ig G2化ヒト化抗 PM-1抗体」、ヒ HgG4の H鎖定常領域を有する抗体は「IgG4ィ匕ヒトイ匕抗 P M- 1抗体」と以下に記載する。

[0174] 1 1 - 5.サブクラスハイブリッド抗体の濃度定量

1 1—4で得た抗体を含む溶液 2 Lを ND- 1000 Spectrophotometer (NanoDrop) ,あるいは 50 μ Lを分光光度計 DU-600 (BECKMAN)に供し、 280 nmでの吸光度を測定した。得られた値から以下の式を用いて抗体濃度を算出した。ブランクには PBSまたは 150 mM NaClを含む 20 mM酢酸緩衝液、 pH6.0を使用した。

[0175] 抗体濃度（mg/mL) =吸光度 X希釈倍率 ÷ 14.6 X 10

[0176] 〔実施例 1 2〕サブクラスハイブリッド抗体の分析

1 2 - 1 .サブクラスハイブリッド抗体の等電点電気泳動による分析

定常領域の置換による表面電荷の変化について評価するために、等電点電気泳動による分析を実施した。 [0177] 等電点電気泳動は以下のとおり行った。 Phastsystem Cassette (AmerchamBioscien ce社製）を用いて以下の膨潤液で 30 minほど Phast-Gel Dry IEF (AmerchamBioscien c_e社製)ゲルを膨潤させた。

[0178] 20% Glycerol 1.5 mL

Pnarmalyte 8—10.5 for IEF (AmerchamBioscience社製) 100 μ L

[0179] 膨潤したゲルを用いて PhastSystem(AmerchamBioscience社製)により以下のプログラムで電気泳動を行った。サンプルは St印 2でゲルに添加した。 piマーカーとして、 C alibration Kit for pi (AmerchamBioscience社製) 使用した。

[0180] Step丄： 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 75 Vh

Step 2: 200 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 15 Vh

Step ό : 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 410 Vh

[0181] 泳動後のゲルは 20% TCAで固定した後、 Silver staining Kit, protein (AmerchamBi oscience社製）を用レ、、キットに添付されているプロトコールに従い銀染色を行った。染色後、 piマーカーの既知等電点からサンプノレの等電点を算出した。

[0182] 未改変、 IgG2化および IgG4化ヒトイ匕 PM-1抗体の分析結果を図 15に示す。サブクラス置換により等電点電気泳動においてバンドの移動が観察された。 piマーカーを参考に推測した各抗体の等電点は未改変ヒト化 PM-1抗体が約 9.3であるのに対して、 I gG2化ヒト化 PM-1抗体が約 8.9、 IgG4ィ匕ヒト化 PM-1抗体が約 8.7であり、置換により最大約 0.6の等電点の差を付与することができた。本検討において抗体サブクラスの定常領域を置換することによって等電点を変化させることが可能であることが示された。

[0183] 次に、未改変、 IgG2化ヒト化 PM-1抗体および未改変、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体の共発現抗体分析結果を図 16に示す。これより、いずれの組み合わせにおいても各サブクラスのホモダイマー、ヘテロダイマーカ ¾つの主バンドとして観察され、 piマーカーを参考に推測した各サブクラスハイブリット抗体の等電点は、未改変ヒト化 ΡΜ-1/IgG 2化ヒト PM-1のハイブリッド抗体が 9.2、未改変ヒト化 PM-l/IgG4化ヒト PM-1のハイブリッド抗体力であった。本検討にぉレ、て各サブクラス抗体の発現ベクターを組み合わせて共発現させることで、サブクラスハイブリッド抗体を作成することが可能であり、それらが等電点の差をもって分離することが示された。 [0184] 12- 2.サブクラスハイブリッド抗体の陽イオン交換クロマトグラフィー分析実施例 11におレ、て作製したサブクラスハイブリッド抗体を用いて以下の方法で陽ィオン交換クロマトグラフィーによる分析を行い、サブクラス置換が分離に及ぼす影響を評価した。陽イオン交換クロマトグラフィー分析条件は以下のとおりであり、未改変ヒト化 PM-1抗体、 IgG2化ヒト化 PM-1抗体、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体、および未改変ヒト化 PM-1抗体/ IgG2化ヒト化 PM-1抗体のハイブリッド抗体、未改変ヒト化 PM-1抗体/ Ig G4化ヒト化 PM-1抗体のハイブリッド抗体の保持時間を算出した。

[0185] カラム： ProPac WCX-10, 4 X 250 mm (Dionex)

移動相： A: 25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1

B: 25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1

流速： 0.5 mL/min

グラジェント：25 %B(5 min)→(105 min)→67 %B→(1 min)→100 %B (5 min) 検出： 280 nm

[0186] 単独発現させた未改変、 IgG2化および IgG4化ヒ H匕 PM-1抗体の分析結果を図 17 に示す。未改変ヒト化 PM-1抗体、 IgG2化ヒト化 PM-1抗体および IgG4ィ匕ヒト化 PM-1抗体の保持時間はそれぞれ約 60.2 min, 30.5 minおよび 30.3 minであり、サブクラス置換によって 30分弱保持時間が変化した。一方、等電点電気泳動から pi差が認められた IgG2化ヒト化 PM-1抗体と IgG4化ヒト化 PM-1抗体の保持時間はほぼ同じであった。次に、未改変、 IgG2化および未改変、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体の共発現抗体分析結果を図 18に示した。未改変ヒトイ匕 PM-1抗体/ IgG2化ヒト化 PM-1抗体の組み合わせ、および、未改変ヒト化 PM-1抗体/ IgG4化ヒト化 PM-1抗体の組み合わせにおいて、各サブクラスのホモダイマー、ヘテロダイマーが 3つの主ピークとして観察された。保持時間は未改変ヒト化？\4_1/¾〇2化ヒト？\4-1のハィブリッド抗体が約43.8 min,未改変ヒト化 PM-l/IgG4化ヒト PM-1のハイブリッド抗体が約 45.1 minであり、それぞれのホモダイマーとは 10分以上の保持時間差で分離した。本検討において、各サブクラス抗体の発現ベクターを組み合わせて共発現させることでサブクラスハイブリッド抗体を作成することが可能であり、それらがイオン交換クロマトグラフィーをもって分離可能であることが示された。 [0187] 〔実施例 13〕サブクラスハイブリッド抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離精製

実施例 11で得られた抗体溶液を Amicon-Ultra4 (Amicon)で濃縮後 EasySep (トミー精ェ）に封入し、 5 mMクェン酸緩衝液 (pH 6.5)に対し透析することで緩衝液を置換後、以下の条件でサブクラスハイブリッド抗体を精製した。

[0188] カラム： Poly CAT A, 4.6 X 100 mm,粒子径 3 μ m,孔径 150 nm (Poly LC)

移動相： A: 25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1

B: 25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L酢酸ナトリウム， pH 6.1 流速： 1.0 mL/min

グラジェント：35 %B(5 min)→(54 min)→65 %B→(1 min)→100 %B (5 min) 検出： 280 nm

[0189] 一回につき約 100 - 200 μ gを注入し、未改変ヒト化 PM-1抗体、未改変ヒト化 PM-1/

IgG4化ヒト化 PM-1サブクラスハイブリット抗体、 IgG4化ヒト化 PM-1抗体ピークを分取した。分取時のクロマトグラムを図 19に示す。複数回のピーク分取画分をそれぞれ混合して Amicon-Ultra4 (Amicon)で濃縮後 EasySep (トミー精ェ）に封入し、活性測定用として PBSに、また、 DSC測定用として 150 mM NaClを含む 20 mM酢酸緩衝液、 pH 6 .0に透析することで緩衝液を置換した。分取ピークを上記同様の条件で再分析した結果を図 20に示す。これより、サブクラスハイブリット抗体力 Sイオン交換クロマトグラフ法で分取精製可能であることが示された。

[0190] 本技術は、共通の H鎖可変領域を持つ抗体を pi値の異なるサブクラスの定常領域を利用して分離することが出来たことから、 pi差のない異なる H鎖可変領域であっても pi値の異なるサブクラスの H鎖定常領域と連結することにより二重特異性抗体をィォン交換クロマトグラフィーで分離することが可能である。また、異なる H鎖可変領域を持つ場合、実施例 9に示した可変領域への変異導入技術と組み合わせることで更に分子間の pi差を増大し、分離精製をより容易にすることができる。 H鎖可変領域への変異導入が困難な場合、これらを天然に存在する IgGサブクラス配列に変換することで、抗原性を考慮することなく二重特異性抗体のイオン交換クロマトグラフィーによる分離精製が可能となる。 [0191] 〔実施例 14〕サブクラスハイブリッド抗体分取精製品の等電点電気泳動分取品の純度を評価するために、等電点電気泳動による分析を実施した。

[0192] 等電点電気泳動は以下のとおり行った。 Phastsystem Cassette (AmerchamBioscien ce社製）を用いて以下の膨潤液で 30 minほど Phast- Gel Dry IEF (AmerchamBioscien ce社製)ゲルを膨潤させた。

[0193] ミリ Q水 1.5 mL

Pharmalyte 5—8 ror lEr (AmerchamBioscience社製) 50 μ L

Pharmalyte 8—10.5 for IEF (AmerchamBioscience社製) 50 μ L

[0194] 膨潤したゲルを用いて PhastSystem(AmerchamBioscience社製)により以下のプログラムで電気泳動を行った。サンプルは St印 2でゲルに添加した。 piマーカーとして、 C alibration Kit for pi (AmerchamBioscience社製) 使用した。

[0195] Step丄： 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 75 Vh

Step 2: 200 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 15 Vh

Step 3: 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 410 Vh

[0196] 泳動後のゲルは 20% TCAで固定した後、 Silver staining Kit, protein (AmerchamBi oscience社製）を用レ、、キットに添付されているプロトコールに従い銀染色を行った。

[0197] サブクラスハイブリッド抗体分取精製品の分析結果を図 21に示す。イオン交換クロマトグラフィ一により、各サブクラスのホモダイマーをほとんど含まずに精製できることが示された。

[0198] 〔実施例 15〕サブクラスハイブリッド抗体分取精製品の活性評価

15— 1.ヒト gpl30発現 BaF3細胞株、ヒト gpl30/ヒ HL-6受容体共発現 BaF3細胞株の樹立

IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒト gpl30を発現した BaF3細胞株の樹立を行った。

全長ヒト gpl30 cDNA (Hibiら、 Cell 1990 ; 63 : 1149-1157 (GenBank # NM_002184)) を PCRにより増幅し、 pCHOI (Hirataら、 FEBS Letter 1994 ; 356 : 244- 248)の DHFR遺伝子発現部位を除去し、 Zeodn耐性遺伝子発現部位を揷入した発現ベクター pC〇S 2Zeoにクローニングし、 pCOS2Zeo/gpl30を構築した。 [0199] 10 μ gの pCOS2Zeo/gpl30を PBSに懸濁した BaF3細胞（0.8 x 10^?cells)に混合し、 G ene Pulser (Bio-Rad)を用いて 0.33 kV, 950 /i FDの容量でパルスを加えた。エレクト口ポーレーシヨン処理により遺伝子導入した BaF3細胞を 0.2 ng/mLの mouse interleuk in-3 (P印 rotech)、 10% Fetal Bovine Serum (以下 FBS、 HyClone)を含む RPMI1640培地（Invitrogen)で一昼夜培養し、 100 ng/mLの human interieukin-6 (R&D)、 100 ng/m Lの human interleukin-6 soluble receptor (R&D systems)および 10% FBSを含む RP MI1640培地を加えて選抜し、ヒト gpl30発現 BaF3細胞株（以下、 BaF3/gpl30)を樹立した。

[0200] 15— 2.サブクラスハイブリッド抗体分取精製品のヒ HL-6中和活性評価

IL-6依存性増殖を示す BaF3/gpl30を用いて、以下に示すとおり、 IL-6中和活性を評価した。精製した未改変ヒト化 PM-1抗体、未改変/ IgG4化ヒト化 PM-1サブクラスハイブリツド抗体および IgG4化ヒト化 PM-1抗体を 10 μ g/mLになるように 10% FBSを含む RPMI1640に希釈した。この溶液を用いて希釈公比 3、合計 7系列の希釈液を調製し、 96wel卜 plate (CORNING)の各 wellに 50 /i Lずつ分注した。次に、 BaF3/gpl30を 10% F BS (HyClone)を含む RPMI1640培地で 3回洗浄した後に、 5 x 10⁴cells/mLとなるように 60 ng/mLの human interleukin-6 (TORAY)、 60 ng/mLの可溶性ヒト IL-6受容体（自社調製品）および 10% FBSを含む RPMI1640培地に懸濁し、各 wellに 50 μ Lずつ混合した後、抗体サンプルを分注した。ヒト可溶性 IL-6受容体は以下に示す方法で調製した。ヒト可溶性 IL-6受容体（Yamasakiら、 Science 1988； 241： 825-828 (GenBank # X 12830) )の 1番目から 344番目のアミノ酸をコードする遺伝子を CHO細胞に導入後に培養上清から精製して調製した。 37°C、 5% CO条件下で、 72時間培養し、 PBSで 2倍に希釈した WST- 8試薬（Cell Counting Kit- 8、株式会社同仁化学研究所）を 20 μ L/ wellで加え、直後に SUNRISE CLASSIC (TECAN)を用いて 450 nmの吸光度（参照波長 620 nm)を測定した。 2時間培養した後に、再度 450 nmの吸光度（参照波長 620 n m)を測定し、 2時間の吸光度変化を指標に IL-6中和活性を評価した。

[0201] その結果、図 22に示すとおり、分取精製した未改変ヒト化 PM-1抗体、未改変/ IgG4 化ヒト化 PM-1サブクラスハイブリッド抗体、および IgG4化ヒト化 PM-1抗体はヒト化 PM- 1抗体精製品（bulk)と中和活性が同等であった。以上より、サブクラスハイブリット抗体は本来の抗原結合能を失わず、中和抗体としての機能を有することが示された。産業上の利用可能性

本発明の方法においては、アミノ酸の置換数が少数でよぐその構造'機能 (活性）を変化させることなく等電点を制御させることが可能であり、それにより二重特異性抗体を汎用的なクロマトグラフィーカラムを用いることで効率的に、且つ、医薬品として開発可能な高純度まで精製することが可能になるため、医薬品として二重特異性抗体を開発する上で非常に有用性が高い。

本発明の方法を用いることにより、実際に活性を保持する二重特異性抗体の効率的な取得が可能である。

Claims

請求の範囲

[1] 第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドを含む多重特異性抗体の製造方法であって、

(b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、

(c)宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、

を含む多重特異性抗体の製造方法。

[2] 工程（a)の改変が、第 1のポリペプチドのホモ多量体、第 2のポリペプチドのホモ多量体、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体力標準的なク口マトグラフィーを使用した分析により分離したピークとなるように、核酸を改変することである請求項 1に記載の方法。

[3] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖可変領域を含む請求項 1に記載の方法。

[4] 前記多重特異性抗体が、軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含み、前記第

1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドがそれぞれ該第 3のポリペプチドと多量体を形成する請求項 3に記載の方法。

[5] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖定常領域を含む請求項：!〜 4のいずれか 1項に記載の方法。

[6] 前記第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドに含まれる重鎖定常領域が互いに等電点の異なる重鎖定常領域である請求項 5に記載の方法。

[7] 前記等電点の異なる重鎖定常領域が IgGlと IgG4、又は、 IgGlと IgG2である請求項

6に記載の方法。

[8] 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である請求項 1に記載の方法。

[9] 請求項 1に記載の方法により製造される多重特異性抗体。

[10] 第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドを含む多重特異性抗体の精製方法であってヽ (a)第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点に差がつくように、第 1のポリべプチドのアミノ酸残基をコードする核酸および第 2のポリペプチドのアミノ酸残基をコードする核酸の両方またはいずれか一方を改変し、

(b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、

を含む多重特異性抗体の精製方法。

[11] 工程（a)の改変が、第 1のポリペプチドのホモ多量体、第 2のポリペプチドのホモ多量体、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体力標準的なク口マトグラフィーを使用した分析により分離したピークとなるように、核酸を改変することである請求項 10に記載の方法。

[12] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖可変領域を含む請求項 10に記載の方法。

[13] 前記多重特異性抗体が、軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含み、前記第

1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドがそれぞれ該第 3のポリペプチドと多量体を形成する請求項 12に記載の方法。

[14] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖定常領域を含む請求項 10〜： 13のいずれか 1項に記載の方法。

[15] 前記第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドに含まれる重鎖定常領域が互いに等電点の異なる重鎖定常領域である請求項 14に記載の方法。

[16] 前記等電点の異なる重鎖定常領域が IgGlと IgG4、又は、 IgGlと IgG2である請求項

15に記載の方法。

[17] 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である請求項 10に記載の方法。

[18] 請求項 10に記載の方法により精製する工程を含む多重特異性抗体の製造方法。

[19] 請求項 18に記載の方法により製造される多重特異性抗体。

[20] 第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドを含む多重特異性抗体であって、第 1 のポリペプチドが重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域を含み、該重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43位および 105位のアミノ酸残基、若しくは、該重鎖定常領域における EUナンバリングによる 137位、 196 位、 203位、 214位、 217位、 233位、 268位、 274位、 276位、 297位、 355位、 392位、 419 位、 435位のアミノ酸残基から選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基が電荷を有し、第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドの等電点が互いに異なる多重特異性抗体。

[21] 第 2のポリペプチドが重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域を含み、該重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43位および 105 位のアミノ酸残基、若しくは、該重鎖定常領域における EUナンバリングによる 137位、 196位、 203位、 214位、 217位、 233位、 268位、 274位、 276位、 297位、 355位、 392位、 419位、 435位のアミノ酸残基から選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基力前記第 1のポリペプチドに含まれる重鎖可変領域および Zまたは重鎖定常領域ににおいて選ばれる、電荷を有するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、または電荷を有しない請求項 20に記載の多重特異性抗体。

[22] 前記電荷を有するアミノ酸残基と当該アミノ酸残基とは反対の電荷を有するアミノ酸残基の組み合わせが、以下の（a)または (b)レ、ずれかの群に含まれるアミノ酸残基からそれぞれ選択される請求項 20に記載の多重特異性抗体：

(a)グルタミン酸（E)、ァスパラギン酸 (D)；

(b)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（Η)。

[23] 第 1のポリペプチドと第 2ポリペプチドの等電点に差があり、第 1のポリペプチドのホモ多量体、第 2のポリペプチドのホモ多量体、および第 1のポリペプチドと第 2のポリペプチドのヘテロ多量体力 S、標準的なクロマトグラフィーを使用した分析により分離したピークとなり得る多重特異性抗体。

[24] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖可変領域を含む請求項 23に記載の多重特異性抗体。

[25] 前記多重特異性抗体が、軽鎖可変領域を含む第 3のポリペプチドを含み、前記第

1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドがそれぞれ該第 3のポリペプチドと多量体を形成する請求項 24に記載の多重特異性抗体。

[26] 前記第 1のポリペプチドおよび前記第 2のポリペプチドが重鎖定常領域を含む請求項 23〜25のいずれか 1項に記載の多重特異性抗体。

[27] 前記第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドに含まれる重鎖定常領域が互いに等電点の異なる重鎖定常領域である請求項 26に記載の多重特異性抗体。

[28] 前記等電点の異なる重鎖定常領域が IgG lと IgG4、又は、 IgG lと IgG2である請求項

27に記載の多重特異性抗体。

[29] 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である請求項 23に記載の多重特異性饥体。

[30] 請求項 23〜29のいずれか 1項に記載の多重特異性抗体および医薬的に許容される担体を含む組成物。

[31] 請求項 23〜29のいずれか 1項に記載の多重特異性抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸。

[32] 請求項 31に記載の核酸を有する宿主細胞。

[33] 請求項 32に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収する工程を含む請求項 23〜29のいずれか 1項に記載の多重特異性抗体の製造方法。

[34] 第 1のポリペプチドの可変領域が以下の（al )〜 (a7)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、第 2のポリペプチドの可変領域が以下の（b l )〜（b3)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、第 3のポリペプチドの可変領域が以下の（c l )または（c2) に記載のアミノ酸配列からなる請求項 25に記載の多重特異性抗体：

(al )配列番号： 7

(a2)配列番号: 8

(a3)配列番号： 9

(a4)配列番号： 10

(a5)配列番号： 1 1

(a6)配列番号： 12

(a7)配列番号： 13

(b l )配列番号： 14

(b2)配列番号： 1 5

(b3)配列番号： 16 (cl)配列番号： 17

(c2)配列番号： 18

[35] 第 1のポリペプチドの可変領域が配列番号： 1 1に記載のアミノ酸配列からなり、第 2 のポリペプチドの可変領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列からなり、第 3のポリペプチドの可変領域が配列番号： 17に記載のアミノ酸配列からなる請求項 34に記載の多重特異性抗体。

[36] 第 1のポリペプチドの可変領域が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列からなり、第 2 のポリペプチドの可変領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列からなり、第 3のポリペプチドの可変領域が配列番号： 18に記載のアミノ酸配列からなる請求項 34に記載の多重特異性抗体。

[37] 第 1のポリペプチドおよび第 2のポリペプチドがヒト IgG4定常領域を含み、第 3のポリペプチドがヒト κ定常領域を含む請求項 34〜36のいずれか 1項に記載の多重特異性抗体。