JP2024504880A - 疑似fabベースの多重特異性結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年12月24日に出願された欧州出願第18306840.2号、および2019年6月21日に出願されたEP出願第19305813.8号に対する優先権を主張し、それらの内容は、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するために第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)と、(2)第1の安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含む第1の疑似Fab部分
を含み、
安定化ノックアウトドメインは、(3)標的抗原への結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(4)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記結合タンパク質を提供する。
(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)と、(2)第1の安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含む第1の疑似Fab部分
を含み、
安定化ノックアウトドメインは、(3)野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(4)参照Fab分子に対する疑似Fabの増大した熱安定性(Tm)を付与する1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Fab分子は、疑似Fab分子において、参照Fab分子のCH1およびCLドメインがVHXおよびVLXドメインで置換されることを除いて、疑似Fab分子と同一である、前記結合タンパク質を提供する。
標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した少なくとも第2のVLドメイン(VLb)
をさらに含む多重特異性結合タンパク質である。
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)と、(2)第1の安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含む第1の疑似Fab部分
b)(3)標的抗原Bと結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb)と、(4)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメインとを含む第1のFab部分
を含む多重特異性結合タンパク質であって、
安定化ノックアウトドメインは、(5)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(6)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは安定化ノックアウトドメインは、(5)野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(6)参照Fab分子に対する疑似Fabの増大した熱安定性(Tm)を付与する1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Fab分子は、疑似Fab分子において、参照Fab分子のCH1およびCLドメインがVHXおよびVLXドメインで置換されることを除いて、擬Fab分子と同一である、前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)を含む第1の疑似Fab部分と、(2)安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含み、ただし、CLドメインと対合したCH1ドメインを含まない、第1の疑似Fab部分であって、
安定化ノックアウトドメインは、(3)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(4)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは安定化ノックアウトドメインは、(3)野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(4)参照Fab分子に対する疑似Fabの増大した熱安定性(Tm)を付与する1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Fab分子は、疑似Fab分子において、参照Fab分子のCH1およびCLドメインがVHXおよびVLXドメインと置換される以外は、疑似Fab分子と同一である、第1の疑似Fab部分;
b)(5)標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb)と、(6)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメインとを含む第1のFab部分;ならびに
c)第1のFab部分および第1の疑似Fab部分を作動可能に連結するリンカー部分
を含む前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)を含む第1の疑似Fab部分と、(2)第1の安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含む第1の疑似Fab部分;
b)(3)標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb)と、(4)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメインとを含む第1のFab部分であって、
安定化ノックアウトドメインは、(5)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(6)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは安定化ノックアウトドメインは、(5)野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(6)参照Fab分子に対する疑似Fabの増大した熱安定性(Tm)を付与する1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Fab分子は、疑似Fab分子において、参照Fab分子のCH1およびCLドメインがVHXおよびVLXドメインで置換される以外は、擬Fab分子に同一である第1のFab部分;
c)第1のFab部分および第1の疑似Fab部分を作動可能に連結するリンカー部分
を含む前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
(a)VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHXおよびVLa-CLおよびVLb-L3-VLX;
(b)VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1およびVLa-L3-VLXおよびVLb-CL;
(c)VHa-CH1-L1-VHa-CH1およびVHb-L2-VHX-L3-VHb-L4-VHX、ならびに2つの鎖VLb-L5-VLX
(a)および(b)の鎖は、1回または2回存在することがおよび2つの鎖VLa-CL
のうちの1つから選択される別々のタンパク質鎖を含み;
でき、L1、L2、L3、L4およびL5は、独立して同一であるかまたは異なるリンカーである。
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa);
(2)第1のジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合した第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX);
(3)第1のヘテロ二量体化ドメイン(HD1)
を含む第1の疑似Fab部分であって、
第1のdsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは(i)野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)参照Fab分子に対する疑似Fabの増大した熱安定性(Tm)を付与する1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Fab分子は、疑似Fab分子において、参照Fab分子のCH1およびCLドメインがVHXおよびVLXドメインで置換される以外は、疑似Fab分子と同一である第1の疑似Fab部分;
b)(1)標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb);
(2)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメイン;および
(3)第2のヘテロ二量体化ドメイン(HD2)
を含む第1のFab部分
を含む前記多重特異性抗体を提供する。
(Ia)N-VHa-L1-VHX-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(IIa)N-VLa-L2-VLX-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す。
(Ib)N-VHX-L1-VHa-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(IIb)N-VLX-L2-VLa-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す。
(Ic)N-VLa-L1-VHX-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(IIc)N-VHa-L2-VLX-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す。
(Id)N-VHX-L1-VLa-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、式:
(IId)N-VLX-L2-VHa-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す。
(i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号77のアミノ酸配列を含むVHX;
(ii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号78のアミノ酸配列を含むVHX;ならびに
(iii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号79のアミノ酸配列を含むVHX
からなる群から選択される。
(a)第1のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1およびL2は、独立して同一であるかまたは異なるアミノ酸リンカーである。
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2およびL3はアミノ酸リンカーであり
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2およびL3はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4およびL5はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し、
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
(a)ポリペプチドは、次の式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-L3-VLc-L4-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLcは第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHcは第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
VLXは第1の安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは第1の安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4、L5およびL6はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)第3のVLドメイン(VLc)は第3のVHドメイン(VHc)と対合して、標的抗原Cに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(4)式IIIのポリペプチドおよび式IVのポリペプチドは、交差軽鎖-重鎖対(CODV)を形成し;
(5)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合した、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
(a)ポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-L3-VLc-L4-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLcは第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHcは第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
VLXは第1の安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは第1の安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4、L5およびL6はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)第3のVLドメイン(VLc)は第3のVHドメイン(VHc)と対合して、標的抗原Cに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(4)式IIIのポリペプチドおよび式IVのポリペプチドは、交差軽鎖-重鎖対(CODV)を形成し;
(5)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)参照Fab分子の標的抗原に対するその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
(i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号77のアミノ酸配列を含むVHX;
(ii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号78のアミノ酸配列を含むVHX;ならびに
(iii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号79のアミノ酸配列を含むVHX
からなる群から選択される。
(i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号77のアミノ酸配列を含むVHX;
(ii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号78のアミノ酸配列を含むVHX;ならびに
(iii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、
配列番号79のアミノ酸配列を含むVHX
からなる群から選択される。
配列番号1:トラスツズマブの可変軽鎖配列。
開示をより容易に理解できるように、選択された用語を以下に定義する。
ある種の実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、少なくとも1つの疑似Fab部分を含む。本明細書で使用される場合、「疑似Fab」部分は、可変軽鎖(VL)ドメインと可変重鎖(VH)の対合によって形成される機能性抗原結合部分を含むという点で、従来の抗体のFab部分と類似している。しかしながら、従来のFabのVLおよびVHドメインは、それぞれ定常軽鎖(CL)ドメインおよび定常重鎖1(CH1)ドメインと直接融合または連結されるが、疑似Fab部分はCH1およびCLドメインを欠いている。代わりに、疑似FabのVLおよびVHドメインは、標的抗原(例えば、任意の標的抗原)に特異的に結合することができない不活性または非機能的結合部分(本明細書では「安定化ノックアウト」部分またはドメイン)を形成する、第2の対の安定化ノックアウトVLおよびVHドメイン(本明細書ではVLXおよびVHXと称する)に作動可能に連結されている。ある種の実施形態では、疑似Fab部分は、それが由来する対応するFab部分の標的抗原に結合することができない。疑似Fab部分はCHおよびCLドメインを欠いている。
(I)VHa-L1-VHX;または
(II)VHb-L1-VHX
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(III)VLa-L2-VLX;または
(IV)VLb-L2-VLX
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含むかまたはそれからなり、
式中、
VHXはVLXと会合してノックアウトドメインを形成し、
VHはVLと会合して第1の機能的抗原結合ドメインを形成し、
L1およびL2はリンカーであり、存在するかまたは存在しない。
(a)VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHXおよびVLa-CLおよびVLb-L3-VLX;
(b)VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1およびVLa-L3-VLXおよびVLb-CL;
(c)VHa-CH1-L1-VHa-CH1およびVHb-L2-VHX-L3-VHb-L4-VHXならびに2つの鎖VLb-L5-VLXおよび2つの鎖VLa-CL
のうちの1つから選択される別個のタンパク質鎖を含み、
(a)および(b)の鎖は、1回または2回存在することができ、L1、L2、L3、L4およびL5は、独立して同一であるかまたは異なるリンカーである。
疑似Fabの「ノックアウト」ドメインは、正常に機能する抗原結合部位の結合親和性または特異性の抑制または減少をもたらす任意の手段によって生成することができる。ある種の実施形態では、疑似Fabのノックアウトドメインは、ノックアウトドメインのVLXおよびVHXドメインの1つまたは両方における1つまたは複数の突然変異によって不活性または非機能性にされている。一実施形態では、ノックアウト修飾は、アミノ酸置換である。他の実施形態では、ノックアウト修飾は、アミノ酸の挿入または欠失である。別の実施形態では、ノックアウト修飾は、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入およびアミノ酸欠失の組合せである。さらに他の実施形態では、ノックアウトドメインは、例えば、標的抗原に結合する可変ドメインの能力を妨げる部分を用いた共有結合修飾によって非機能性にされる。
ある種の実施形態では、ノックアウトドメインは、その野生型対応物と比較して、熱安定性が増加した安定化ノックアウトドメインである。例えば、ある種の例示的な実施形態では、ノックアウトドメインの融解温度(Tm)は、それが由来する野生型対応物と比較して、少なくとも0.25℃、少なくとも0.5℃、少なくとも0.75℃、少なくとも1℃、少なくとも2℃、少なくとも3℃、少なくとも4℃、少なくとも5℃、または少なくとも10℃内である。他の例示的な実施形態では、ノックアウトドメインのTmは、その野生型対応物に関して増加した。例えば、Tmは、それが由来する野生型対応物と比較して、少なくとも0.25℃、少なくとも0.5℃、少なくとも0.75℃、少なくとも1℃、少なくとも2℃、少なくとも3℃、少なくとも4℃、少なくとも5℃、または少なくとも10℃増加し得る。熱安定性は、当業者が日常的に使用する示差走査蛍光測定法(DSF)または他の生物分析法によって測定することができる。
他の態様では、本明細書に記載される疑似Fab部分を含む多重特異性結合タンパク質が提供される。疑似Fab部分の高度にモジュラー性は、多種多様な多重特異性構造を形成することを可能にする。
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa);
(2)第1のジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合した第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX);
(3)第1のヘテロ二量体化ドメイン(HD1)
を含む第1の疑似Fab部分であって、
第1のdsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む第1の疑似Fab部分;
b)(1)標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb);
(2)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメイン;および
(3)第2のヘテロ二量体化ドメイン(HD2)
を含む第1のFab部分
を含む。
ある種の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、Fc-ヘテロ二量体化C1またはC2ドメインをさらに含み得る。一部の実施形態では、Fc二量体化ドメインは、ヘテロ二量体化Fcまたはその断片、特にFc部分のノブ-イン-ホール(KIH)変異体およびそのエフェクター修飾変異体、またはヘテロ二量体化Fcもしくはその断片、特にFcのEV-RWT変異体およびそのエフェクター修飾変異体からなる群から選択される。一部の実施形態では、Fcは、1つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異を含む。1つの可能性は、例えば、H435R、Y436Fからなる群から選択される突然変異によって、第1の親和性試薬に対する選択的認識部位を除去し、第2の親和性試薬の選択的認識部位を導入することである。あるいは、第2の親和性試薬に対する選択的認識部位のみを導入することができる。
ある種の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、ホモ二量体化ドメインをさらに含むことができる。一部の実施形態では、ホモ二量体化ドメインは、Fc領域およびそのエフェクター修飾変異体;1つまたはそれ以上のCH2ドメイン、例えば、IgG、IgEまたはIgMの1つまたはそれ以上のCH2ドメイン;1つまたはそれ以上のCH3ドメイン、例えば、IgG、IgAまたはIgDの1つまたはそれ以上のCH3ドメイン;ならびに1つまたはそれ以上のCH4ドメイン、例えば、IgEまたはIgMの1つまたはそれ以上のCH4ドメインからなる群から選択される。
(a)対称的な四価構築体
別の実施形態では、結合ポリペプチドは、追加の結合ドメインを形成するための疑似Fabのポリペプチド鎖と会合する追加のポリペプチド鎖を含む疑似Fab含有結合タンパク質を含む。これらの疑似Fab含有結合ポリペプチドをさらにFcヘテロ二量体化ドメインに融合させて、従来のY字型抗体の半分を形成する。
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2およびL3はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合した、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2およびL3はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
結合ポリペプチドの二量体化であって、1つのみが疑似Fabを含むものは、さらなる特異性を有する非対称構築物をもたらす。これらの疑似Fab含有結合ポリペプチドをさらにFcヘテロ二量体化ドメインに融合させて、従来の全長Y字型IgG抗体の半分を形成する。
(a)第1のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1およびL2は、独立して同一であるかまたは異なるアミノ酸リンカーである。
(1)第1のVLドメイン(VLa)を第1のVHドメイン(VHa)と対合させて、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4およびL5はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
(a)第1のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-L3-VLc-L4-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLcは第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHcは第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4、L5およびL6はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)第3のVLドメイン(VLc)は第3のVHドメイン(VHc)と対合して、標的抗原Cに結合する第3の機能的抗原結合部位を形成し;
(4)式IIIのポリペプチドおよび式IVのポリペプチドは、交差軽鎖-重鎖対(CODV)を形成し;
(5)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO2)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
(a)第1のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-L3-VLc-L4-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLcは第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHcは第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4、L5およびL6はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)第3のVLドメイン(VLc)は第3のVHドメイン(VHc)と対合して、標的抗原Cに結合する第3の機能的抗原結合部位を形成し;
(4)式IIIのポリペプチドおよび式IVのポリペプチドは、交差軽鎖-重鎖対(CODV)を形成し;
(5)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO2)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)参照Fab分子の標的抗原に対するその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
第5の態様では、本発明は、結合タンパク質の一方または両方を含む疑似Fabをコードするヌクレオチド配列と、本発明の第1、第2または第3の態様のいずれかの多重特異性結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、単離された核酸分子に関する。
第7の態様では、本発明は、本発明の第5の態様の核酸分子、または本発明の第6の態様の発現ベクターを含む単離された宿主細胞に関する。
1.発現方法
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかを生成する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、
a)宿主細胞が結合タンパク質を発現するような条件下で、単離された核酸、ベクター、および/またはベクター系(例えば、本明細書に記載される単離された核酸、ベクター、および/またはベクター系のいずれか)を含む宿主細胞(例えば、本明細書に記載される宿主細胞のいずれか)を培養する工程;ならびに
b)宿主細胞から結合タンパク質を単離する工程
を含む。タンパク質を発現する条件下で宿主細胞を培養する方法は、当業者に周知である。培養宿主細胞からタンパク質を単離する方法は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、続くサイズ排除クロマトグラフィーを含む2段階アフィニティークロマトグラフィー)によるなど、当業者に周知である。
第4の態様において、本発明は、
(i)多重特異性結合タンパク質を含む溶液を、第1、第2または第3のアフィニティー試薬について多重特異性結合タンパク質の認識部位に特異的に結合する第1、第2、または第3のアフィニティー試薬に適用する工程;
(ii)第1、第2もしくは第3のアフィニティー試薬に結合しない多重特異性結合タンパク質、または第1もしくは第3のアフィニティー試薬に結合する多重特異性結合タンパク質のいずれかを回収する工程
を含む、本発明の第3の態様の多重特異性結合タンパク質を精製する方法に関し、第1、第2および第3のアフィニティー試薬の各々は、多重特異性結合タンパク質の異なる認識部位に結合する。
第8の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と、本発明の第1から第3の態様のいずれか1つの治療有効量のタンパク質とを含む医薬組成物に関する。
第9の態様において、本発明は、抗原活性が有害である障害を治療する方法に関し、本発明の第1から第3の態様のいずれか1つの結合タンパク質の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、薬剤として使用するための多重特異性結合タンパク質が提供される。
本明細書に開示される結合タンパク質は、種々の抗体フォーマットにおけるノックアウトVH/VLドメインによる1つのCH1/CL対の置換を含む(図1、2、7、および10~13を参照されたい)。CH1/CL二量体を置換するための適切な置換足場を同定するために、ある種のVH/VL対へのジスルフィド架橋の導入を調べた。さらに、発現性および別のVH/VL対への融合を調べた。
VH44およびVL100位でのシステイン残基は、トラスツズマブのVH/VL間のジスルフィド結合(本明細書ではds-トラスツズマブと呼ばれる)を生成し、それによってヘテロ二量体を安定化させるのに適合していることが決定された。その熱安定性を決定するために、ds-トラスツズマブドメインをD-PBS緩衝液(GIBCO)中1mg/mLの濃度で14日間40℃でインキュベートした。同じ濃度の対照試料を-80℃および4℃に保持した。ストレス試験の完了後、試料をその凝集含量について分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により分析した。分析用SECは、TSKgel SuperSW3000カラム(4.6mm×300mm)およびTSKgel SuperSW HPLCガードカラム(Tosoh Bioscience)を用いて25℃でBioSECcurity装置(PSS Polymer)を用いて行った。250mMのNaCl、100mMリン酸Na pH6.7を用いて0.25ml/分の流速で分析物を泳動し、280nmおよび260nmで検出した。静的光散乱を436nmで検出した。5μlのタンパク質試料(1mg/ml)をカラムに適用した。データ評価をWinGPCソフトウェアv8.1(PSS Polymer)を用いて行った。分子量を推定するために、SECカラムを6.5~670kDaの分子量範囲のタンパク質標準で較正した。
CH1/CLの置換足場としてジスルフィド結合安定化トラスツズマブ骨格を含む疑似IgG1構築物を作製した。ds-トラスツズマブ足場をG4Sまたは(G4S)2リンカーで目的のVH/VL対に融合させた(図6を参照されたい)。
融点(Tm)を示差走査蛍光測定法(DSF)を用いて測定した。試料をD-PBS緩衝液(Invitrogen)中で希釈して、白色セミスカート96ウェルプレート(BIORAD)のD-PBS中にSYPRO-オレンジ色素の4倍濃縮溶液(Invitrogen、DMSO中の5000×ストック)を含む最終濃度0.2μg/μlとした。すべての測定は、MyiQ2リアルタイムPCR装置(BIORAD)を用いて二重に行った。融解曲線の負の一次微分曲線(-d(RFU)/dT)をiQ5ソフトウェアv2.1(BIORAD)で生成した。次に、データをExcelにエクスポートして、Tm決定およびデータのグラフィック表示を行った。
トラスツズマブの結合活性は、受容体チロシン-タンパク質キナーゼerbB-2(HER2)に対する抗体の結合能力に影響を与えるために、トラスツズマブ抗体のパラトピック領域に4つの重要なアミノ酸残基突然変異を導入することによってノックアウトされた。トラスツズマブは、PDB公開データベースにおいて入手可能であるPDB構造1N8Zに基づいてモデル化された。重鎖上の4つの位置は、ds-トラスツズマブとその抗原の相互作用を潜在的に破壊することが同定された。これらの位置には、HER2上のグルタミン酸とアスパラギン酸を結合するアルギニンR59とR50の両方が含まれる。アルギニン残基をグルタミン酸残基に突然変異させることによる電荷の反転は、HER2の反発をもたすべきである。科学的理論に拘束されることを意図せずに、他の2つの位置チロシンY33およびY105は、フェニルアラニンとのπ-π相互作用によって複合体を安定化するようであった。科学的理論にとらわれることを意図せずに、アラニンの突然変異はこの相互作用を妨げるべきである。1N8Zファイルの結晶学的データをBIOVIA Discovery Studioスイートで分析した。抗体(トラスツズマブfab)とその標的(HER2タンパク質ドメイン)の間の既存の界面領域に特に注意を払った(図4を参照されたい)。
抗体および標的界面領域分析の間、すべての非共有相互作用は、BIOVIA Discovery Studio非結合相互作用モニターを用いて適格化された。得られた表の抽出物を表5に示す。表5は、各相互作用について、相互作用する原子間の距離、相互作用のタイプの性質、および相互作用する原子の特徴を示す。
以下の4つのアミノ酸残基突然変異は、元のトラスツズマブ配列を維持するために、非結合相互作用データに基づいて選択された。
抗体のこのアルギニン残基は、HER2残基のグルタミン酸558およびアスパラギン酸560と塩架橋相互作用を起こす。HER2残基のグルタミン酸558およびアスパラギン酸560の反発を生じさせるために、アルギニン50をグルタミン酸残基に突然変異させた。
抗体のこのアルギニン残基は、HER2残基のグルタミン酸558およびアスパラギン酸560と塩架橋相互作用を起こす。HER2残基のグルタミン酸558およびアスパラギン酸560の反発を生じさせるために、アルギニン59をグルタミン酸残基に突然変異させた。
抗体のこのチロシン33残基は、HER2残基のフェニルアラニン573とπ相互作用を起こす。抗体とその標的の間で生じるこれらのπ相互作用を破壊させるために、チロシン33をアラニン残基に突然変異させた。
抗体のこのチロシン105残基は、HER2残基のフェニルアラニン573とπ相互作用を起こす。抗体とその標的の間で生じるこれらのπ相互作用を破壊するために、チロシン105をアラニン残基に突然変異させた。
dsTrasKO変異体を疑似IgG(単一特異性)フォーマット(図6A参照)および疑似Fab(図6B参照)において評価した。試験した疑似IgGおよび疑似Fabフォーマットは、親抗体の発現および精製特徴と類似していた(表7を参照されたい)。
dsTrasKO2ドメインは、天然IgG構造を有する二重特異性抗体における置換足場として評価された。特に、FcにおけるRF突然変異を有する抗IL4-dsTrasKO(Var2)×抗IL13-huIgG1二重特異性設計を合成した(図7を参照されたい)。
対応する構築物の両重鎖(dsTrasKO2ノブおよびWT-ホール)および両軽鎖(dsTrasKOおよびWT-カッパ/ラムダ)をコードする発現プラスミドを大腸菌(DH5α)中で増殖させた。トランスフェクションに使用されるプラスミドをQiagen EndoFree Plasmid Megaキットを用いて大腸菌から調製した。
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、抗体への抗原の結合を評価した。抗体構築物への抗原の結合は、HBS-EP緩衝液(GE Healthcare)を用いたBIAcore 3000装置(GE Healthcare)による表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて測定された。ヒトIL4(IL004、Millipore)およびヒトIL13(IL012、Millipore)、ヒトHER2(11292-ER、R&D Systems)、ヒトTNFa(H8916、SIGMA Aldrich)、ヒトCTLA4(CT4-H5229、ACRO Biosystems)、ヒトPD-1(8986-PD、R&D Systems)、およびヒトIL6Ra(227-SR/CF、R&D Systems)を抗原として使用した。抗ヒトFc捕捉抗体(ヒト抗体捕捉キット、GE Life Sciences)を標準手順を用いて、研究グレードCM5チップ(GE Life Sciences)上の第1級アミン基(11000RU)を介して固定化した。リガンドを10μl/分の流速で捕捉し、調整されたRU値を用いて、分析物結合の最大値を30RUとした。HER2との結合試験は、抗原を抗ヒトFc抗体で捕捉することによって行われた。試験した抗体構築物を分析物として使用し、30μL/分の流速にて100nM濃度で240秒間注入し、解離時間は300秒であった。結合動力学測定は、捕捉された抗体を用いて、3nM~100nMの分析物の2倍系列希釈液を注入して行った。ヒトIL4およびIL13について、それぞれ0.1nM~3nMおよび0.8nM~25nMの希釈系列を使用した。チップ表面を捕捉キットとともに提供される再生緩衝液を2分間注入することにより再生した。センサグラムは、ブランクチップ表面およびHBS-EP緩衝液ブランクで二重参照した。データ分析は、BIA評価ソフトウェアv4.1を用いて行われた。mAb、疑似IgGおよび二重特異体(bispecifics)の結合特性を下記の表9に示す。
ヘテロ二量体構築物のタンパク質完全性および潜在的な誤対合をLC-質量分析(LC-MS)により分析した。タンパク質試料を、37℃で15時間、0.5μlのPNGaseF(グリセロール不含、New England Biolabs)で処理されたD-PBS緩衝液中で0.5mg/mlに希釈した12.5μgのタンパク質を用いて脱グリコシル化した。LC-MS分析は、6540UHD精密質量Q-TOF LC/MS装置(Agilent)を用いて行われた。逆相(RP)クロマトグラフィーは、180μL/分でガードカラムPoroshell 300SB-C8、5μm、2.1×12.5mm(Agilent)を有するポロシェル300SB-C8、5μm、75×0.5mm(Agilent)を用いて行われた。溶出液は、LC水、0.1%ギ酸(A)および90%アセトニトリル、10%LC水、0.1%ギ酸(B)であった。2μgのタンパク質をカラムに注入し、0%から100%Bの直線勾配を用いて13分間で溶出した。データ分析はMassHunterソフトウェアB.06(Agilent)を用いて行われた。分子量は、GPMAWソフトウェアバージョン9.13a2(Lighthouseデータ)を用いて、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算された。dsTrasKO2-抗体融合タンパク質は、ほとんど無傷であり、正しいヘテロ二量体対合を示すことが示された(下記の表10を参照されたい)。
dsTrasKO2疑似IgGおよび二重特異性試料の熱安定性は、上記実施例2に記載されるように評価された。融点(Tm)は、実施例3に記載されるように、示差走査蛍光測定法(DSF)を用いて決定された。dsTrasKO2ベースの構築物は、親モノクローナルIgGと比較して融解温度の低下を示し、2週間の熱安定性アッセイ(40℃、4℃および-80℃)において安定性の障害は検出されなかった(下記表11を参照されたい)。
dsTrasKO2-IL13-疑似Fabの結晶化を構造研究のために行った。結晶化試験は、1:1のタンパク質:リザーバー比を用いた標準的な2滴、96ウェルMRCプレートにおける座滴実験として設定し、20℃でインキュベートした。TrasKO2-CH1/CLと抗IL13-TrasKO2の両方は、市販されている種々の疎マトリックススクリーンに対する結晶化ヒットについてスクリーニングされた。20mMのHEPES pH7.5、0.1M塩化ナトリウム中のTrasKO2-CH1/CL(15mg/mlのストック)および抗IL13-TrasKO2(15.6mg/mlのストック)用のスクリーニング液滴は、100nlのタンパク質溶液を100nlのリザーバー溶液と混合することによって調製され、80μlのリザーバーに対する座滴蒸気拡散実験において平衡化された。データ回収および構造溶液に適したTrasKO2-CH1/CLの最終結晶は、0.1Mリン酸クエン酸ナトリウムpH4.2、20%(w/v)ポリエチレングリコール8000および0.2M塩化ナトリウムからなるリザーバー溶液を用いて20℃で成長させた。回折品質抗IL13-TrasKO2結晶は、0.1MのCHES pH9.5および20%(w/v)ポリエチレングリコール8000からなるリザーバー溶液で成長させた。すべての結晶は、25%(w/v)エチレングリコール(最終濃度)の添加により液体窒素中でのフラッシュ冷却の前に凍結保護された。
回折データをSwiss Light Source(SLS)、Villingen、SwitzerlandのビームラインPSIIで収集した。回折データは、CCP4プログラムスイート(Winnら、2011年)のXDS(Kabsch、2010年)およびAIMLESS(Evans & Mushudov、2013年)の組合せを用いて処理された。TrasKO2-CH1/CLは、空間群I23中で結晶化され、セルパラメータは153.23Å、153.23Å、153.23Å、90.00°、90.00°、90.00°であり、データは3.70Åの解像度に拡張された。抗IL13-TrasKO2の結晶は、空間群P3221に属し、セルパラメータは145.37 145.37 52.06 90.00 90.00 120.00であり、1.85Åに回折した。
dsTrasKO2ドメインが、二重特異性タンデムIgG設計における置換足場として評価された。特に、抗GITR-dsTrasKO2×抗OX40-カッパ]-huIgG1タンデムIgG設計を合成し、試験した(図10~12を参照されたい)。
対応する構築物の重鎖および両軽鎖(dsTrasKOおよびWT-カッパ/ラムダ)をコードする発現プラスミドを大腸菌DH5a中で増殖させた。トランスフェクションに使用されるプラスミドをQiagen EndoFree Plasmid Megaキットを用いて大腸菌から調製した。F17無血清懸濁培養(Invitrogen)中で増殖するHEK293-FS細胞をポリエチレンイミントランスフェクション試薬を用いて、指示されたLCおよびHCプラスミドでトランスフェクトした。37℃で7日間培養した後、遠心分離により細胞を除去し、上清を0.22μmフィルター上に通過させて粒子を除去した。精製のために、抗体をMabSelect SuReカラム(カタログ番号:11-0034-93、GE Healthcare)に捕捉し、0.1Mクエン酸緩衝液pH3.0で溶出し、HiPrep26/10脱塩カラム(カタログ番号:17-05087-02、GE Healthcare)を用いて直接脱塩した。可能なホモ二量体dsTrasKO2単一特異性分子は、追加のKappaSelect捕捉工程(0.1MグリシンpH2.7溶出緩衝液)を用いることによって選別される(図14を参照されたい)。Superdex200 26/60(GE)および最終限外濾過濃度工程を用いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によりタンパク質を最終精製した後、タンパク質をさらなる特徴付けのために使用した。代表的な二重特異性設計および精製の結果については図12A~12Dを参照されたい。
dsTrasKO2ドメインは、三重特異性クロスオーバー変異体ドメイン(CODV)設計における置換足場として評価された。特に、CODV-抗Ox40×抗PD1]×抗CD137-dsTrasKO2-hulgHuG1-LALA-KIH-RF構築物を合成し、試験した(図13を参照されたい)。
重鎖および両軽鎖(dsTrasKOおよびWT)をコードする発現プラスミド、ならびに対応する構築物の両重鎖(CODV-ノブおよびdsTrasKO2-ホール)および両軽鎖(CODVおよびdsTrasKO)をコードする発現プラスミドを大腸菌DH5a中で増殖させた。トランスフェクションに使用されるプラスミドをQiagen EndoFree Plasmid Megaキットを用いて大腸菌から調製した。F17無血清懸濁培養(Invitrogen)中で増殖するHEK293-FS細胞をポリエチレンイミントランスフェクション試薬を用いて、指示されたLCおよびHCプラスミドでトランスフェクトした。37℃で7日間培養した後、遠心分離により細胞を除去し、上清を0.22μmフィルター上に通過させて粒子を除去した。精製のために、抗体をMabSelect SuReカラム(カタログ番号:11-0034-93、GE Healthcare)に捕捉し、0.1Mクエン酸緩衝液pH3.0で溶出し、HiPrep26/10脱塩カラム(カタログ番号:17-05087-02、GE Healthcare)を用いて直接脱塩した。試料をさらに、MonoS陽イオン交換カラム(カタログ番号:17-5169-01、GE Healthcare、0.01MのL-ヒスチジンpH6.0緩衝液中の0~1MのNaCl塩勾配)で精製した。限外濾過濃縮工程の後、タンパク質をさらに特徴付けるために使用した。代表的な三重特異性設計および精製結果については図13A~図13Dを参照されたい。
一般的方法
分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
分析SECは、AdvanceBio 300カラム(4.6mm×300mm)およびAdvanceBio 300ガードカラム(Agilent Technologies)を備えたBioSECcurity装置(PSS Polymer)を用いて25℃で行われた。2×濃縮したD-PBS緩衝液(Thermo Fisher Scientific)を用いて0.5ml/分の流速で分析を行い、280nmで検出した。10μlのタンパク質試料(1mg/ml)をカラムに適用した。データ評価はWinGPCソフトウェアv8.1(PSS Polymer)を用いて行った。分子量を推定するために、SECカラムをタンパク質較正標準ミックス(Agilent Technologies)で較正した。
分析用HICは、TSKgel Butyl-NPRカラム(2.5μm、4.6×35mm)(Tosoh Bioscience)を備えたLC10 HPLC装置(Shimadzu)またはVanquish HPLC装置(Thermo Fisher Scientific)を用いて25℃で行われた。流速1ml/分で分析を行い、280nmで検出した。5μgの未希釈タンパク質試料をカラムに適用した。勾配溶出は、15%Bから85%Bまで7分間、続いて100%Bまで1分間、次に15%Bまで1分間とし、次に15%Bで3分間平衡化した。緩衝液Aは、1.5M硫酸アンモニウム、25mMリン酸ナトリウムpH7.0で構成される。緩衝液Bは、25mMリン酸ナトリウムpH7.0で構成された。データ評価は、LabSolutionsソフトウェア v5.85(Shimadzu)またはChromeleon 7ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific)のいずれかを用いて行われた。
タンパク質変性の開始温度(T開始)および融点(Tm)をナノ示差走査蛍光測定(nanoDSF)を用いて測定した。試料を製剤緩衝液中で0.5μg/μlの最終濃度に希釈し、ナノDSFキャピラリー(Nanotemper Technologies)中に二重に装填した。すべての測定は、Prometheus NT.plexナノDSFデバイス(Nanotemper Technologies)を用いて行った。加熱速度は20℃~95℃で1℃/分であった。データは、PR.ThermControl Software v2.3.1(Nanotemper Technologies)を用いて記録され、PR.Stability Analysis Software v1.0.3(Nanotemper Technologies)を用いて分析された。
抗体構築物への抗原の結合をHBS-EP+緩衝液(GE Healthca)を用いたBIAcore 8K装置(GE Healthca)による表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて測定した。結合動力学および親和性決定のために、ヒトCD3εδ-Fc-HisおよびヒトCD123-Fc-His融合タンパク質(両方とも内部源由来)を抗原として使用した。抗His捕捉抗体(His捕捉キット、GE Life Science)を標準手順を用いて、研究グレードCM5チップ(GE Life Science)上の第1級アミン基(11000RU)を介して固定化した。抗原は、10~30RUの間の抗体結合レベルに到達させるために、10μL/分の流速で90秒間、抗His捕捉チップ表面によって捕捉された。CD123親和性を決定するために100nM~3.1nMの2倍希釈系列において、およびCD3結合親和性を決定するために400nM~3.1nMまたは100nM~3.1nMの2倍希釈系列において、抗体を240秒間、30μL/分で注入した。解離は、HBS-EP+緩衝液を1200秒間注入することにより30μL/分で測定された。再生緩衝液(His捕捉キット、GE Life Sciences)を注入することにより、チップ表面を再生した。センサグラムは、ブランクチップ表面およびHBS-EP+緩衝液ブランクで二重参照した。データは、Biacore 8K Evaluationソフトウェアv1.11.7442(GE Healthcare)を用いて、動力学ならびに親和性定数ka、kdおよびKDを決定するための1:1のLangmuir結合モデルに適合させた。
ヘテロ二量体構築物のタンパク質完全性および潜在的な誤対合をLC-質量分析(LC-MS)により分析した。タンパク質試料をLC-MSグレード水(Thermo Scientific)中で0.17mg/mLに希釈した12.5μgのタンパク質を用いて脱グリコシル化し、0.5μLのPNGaseF(グリセロール不含、New England Biolabs)で37℃にて16時間処理した。LC-MS分析は、Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質量分析装置を用いて行われた。逆相(RP)クロマトグラフィーは、MabPac RP HPLCカラム、分析用粒子サイズ4μm、2.1×100mm(Thermo Scientific)を用いて300μL/分で行われた。溶出液は、LC水、0.1%ギ酸(A)および90%アセトニトリル、10%LC水、0.1%ギ酸(B)であった。2μgのタンパク質溶液をカラムに注入し、0%から95%Bの直線勾配を用いて12分間で溶出した。データ分析はExpressionistソフトウェア13.0.3(Genedata)を用いて行われた。分子量は、GPMAWソフトウェアバージョン10.32b1(Lighthouseデータ)を用いて、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算された。
二重特異性TrasKO2分子は、初代ヒトT細胞を用いた細胞毒性アッセイにおいて分析された。健康なドナーの血液からのヒト末梢単核細胞を15mLのHistopaque(Sigma-Aldrich、#10771)および10分間、1000×gでの遠心分離を用いてLeucosep-Tubes(Greiner Bio-One、#227290)中で単離した。単離されたPBMCを5%MACS BSAストック溶液(Miltenyi Biotec、#130-091-370)が補足されたautoMACSリンシング緩衝液(Miltenyi Biotec、#130-091-222)中で2回洗浄した。一次ヒトT細胞をMACSproセパレーター(Miltenyi Biotec)およびPan T細胞単離キット(Miltenyi Biotec、#130-096-535)を用いて、製造業者のプロトコルを用いてヒトPBMCから単離した。単離されたヒトT細胞を10%FCS HI(Gibco、#10082-147)が補足されたRPMI GlutaMAX I培地(Gibco、#72400)に5×106細胞/mLで再懸濁した。細胞毒性アッセイに先立って、THP-1標的細胞(ADCC TIB-202)を1μMのCFSE(Invitrogen、#C1157)で15分間、37℃にて染色した。細胞をRPMI+GlutaMAX I培地中で2回洗浄し、400×gで5分間遠心分離した。THP-1標的細胞を10%FCS HIが補足されたRPMI培地に5×105細胞/mLで再懸濁した。CFSE標識されたTHP-1細胞およびヒトパンT細胞を10:1のエフェクター対標的比で混合し、96ウェルアッセイプレート(Greiner BioOne、#650185)中で100μl/ウェルの全体積で播種した。5μL/ウェルの体積で10nM~0nM(1:6希釈)から開始した11希釈系列において二重特異性TrasKO2分子を細胞に添加し、20時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を5μg/mLの7-AAD(Invitrogen、#A1310)で30分間、4℃にて染色した。細胞毒性を決定するために、LSRIIフローサイトメーター(BD)上でCFSE/7-AAD二重陽性THP-1細胞をゲートすることにより死細胞を測定し、EC50値をXlfitソフトウェアを用いて決定した。
Claims (36)
- 結合タンパク質であって、
(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)と、(2)第1の安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含む少なくとも1つの疑似Fab部分
を含み、
安定化ノックアウトドメインは、(3)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(4)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記結合タンパク質。 - 結合タンパク質が、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した少なくとも第2のVLドメイン(VLb)をさらに含む多重特異性結合タンパク質である、請求項1に記載の結合タンパク質。
- 多重特異性結合タンパク質であって、
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)と、(2)第1の安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含む第1の疑似Fab部分;
b)(3)標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb)と、(4)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメインとを含む第1のFab部分
を含み、
安定化ノックアウトドメインは、(5)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(6)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記多重特異性結合タンパク質。 - 多重特異性結合タンパク質であって、
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa)と、(2)第1の安定化ノックアウトドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)と対合した第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)とを含む第1の疑似Fab部分;
b)(3)標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb)と、(4)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメインとを含む第1のFab部分;および
c)第1のFab部分および第1の疑似Fab部分を操作可能に連結するリンカー部分
を含み、
安定化ノックアウトドメインは、(5)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(6)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記多重特異性結合タンパク質。 - リンカー部分がペプチドリンカーである、請求項1~4のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- ペプチドリンカーが、式(Gly4Ser)n(nは1~10である)のGly-Serリンカーである、請求項5に記載の結合タンパク質。
- リンカー部分がヘテロ二量体化ドメインである、請求項1~6のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 独立して1つまたは2つの第1の疑似Fab部分および1つまたは2つの第1のFab部分を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 以下の群:
(a)VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHXおよびVLa-CLおよびVLb-L3-VLX;
(b)VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1およびVLa-L3-VLXおよびVLb-CL;
(c)VHa-CH1-L1-VHa-CH1およびVHb-L2-VHX-L3-VHb-L4-VHX、ならびに2つの鎖VLb-L5-VLXおよび2つの鎖VLa-CL
のうちの1つから選択される別々のタンパク質鎖を含み、
(a)および(b)の鎖は1回または2回存在することができ、L1、L2、L3、L4およびL5は、独立して同一であるかまたは異なるリンカーである、請求項1~8のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第1の疑似Fab部分が、式:
(Ia)N-VHa-L1-VHX-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(IIa)N-VLa-L2-VLX-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す、請求項1~9のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第1の疑似Fab部分が、式:
(Ib)N-VHX-L1-VHa-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(IIb)N-VLX-L2-VLa-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す、請求項1~10のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第1の疑似Fab部分が、式:
(Ic)N-VLa-L1-VHX-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(IIc)N-VHa-L2-VLX-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す、請求項1~11のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第1の疑似Fab部分が、式:
(Id)N-VHX-L1-VLa-C
で表される構造を有する第1のポリペプチド鎖、および式:
(IId)N-VLX-L2-VHa-C
で表される構造を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
式中、L1およびL2はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、NおよびCはそれぞれN末端およびC末端を表す、請求項1~12のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 結合タンパク質のN末端またはC末端に作動可能に連結されている1つまたはそれ以上のさらなる結合ドメインをさらに含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 1つまたはそれ以上のさらなる結合ドメインが、第1または第2の疑似Fab部分のN末端に作動可能に連結されている、請求項1~14のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 多重特異性結合タンパク質であって、
a)(1)標的抗原Aに結合する第1の抗原結合部位を形成するための第1のVHドメイン(VHa)と対合した第1のVLドメイン(VLa);
(2)第1のジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成するための第1の安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合した第1に安定化ノックアウトVLドメイン(VLX);
(3)第1のヘテロ二量体化ドメイン(HD1)
を含み、第1のdsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む第1の疑似Fab部分;
b)(1)標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成するための第2のVHドメイン(VHb)と対合した第2のVLドメイン(VLb);
(2)第1のCLドメインと対合した第1のCH1ドメイン;および
(3)第2のヘテロ二量体化ドメイン(HD2)
を含む第1のFab部分
を含む前記多重特異性結合タンパク質。 - 第1および第2のヘテロ二量体化ドメインが第1および第2のFcドメインを含む、請求項16に記載の結合タンパク質。
- Fcドメインが一般構造ヒンジ-CH2ドメイン-CH3ドメインを含む、請求項16または17に記載の結合タンパク質。
- 少なくとも2つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む多重特異性結合タンパク質であって、
(a)第1のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域と、CH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むFcドメインであり;ならびに
L1およびL2は、独立して同一であるかまたは異なるアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記多重特異性結合タンパク質。 - 4つの抗原結合部位を形成する6つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域と、CH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むFcドメインであり;
L1、L2およびL3はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質。 - 4つの抗原結合部位を形成する6つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中:
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域と、CH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むFcドメインであり;
L1、L2およびL3はアミノ酸リンカーであり、
式中、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質。 - 4つの抗原結合部位を形成する6つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
(a)第1および第2のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]および[II]
で表される構造を含み、
(b)第3および第4のポリペプチドは、式:
VLb-CL[III]および[IV]
で表される構造を含み、
(c)第5のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1[V]
で表される構造を含み、
(d)第6のポリペプチドは、式:
VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2[VI]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域と、CH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4およびL5はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質。 - 3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
(a)第1のポリペプチドは、式:
VLa-L1-VLX[I]
で表される構造を含み、
(b)第2のポリペプチドは、式:
VHa-L2-VHX-FC1[II]
で表される構造を含み、
(c)第3のポリペプチドは、式:
VLb-L3-VLc-L4-CL[III]
で表される構造を含み、
(d)第4のポリペプチドは、式:
VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]
で表される構造を含み、
式中、
VLaは第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLbは第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VLcは第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHaは第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VHbは第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインである;
VHcは第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
VLXは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり;
VHXは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり;
FC1およびFC2は、免疫グロブリンヒンジ領域と、CH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むFcドメインであり;
L1、L2、L3、L4、L5およびL6はアミノ酸リンカーであり、
(1)第1のVLドメイン(VLa)は第1のVHドメイン(VHa)と対合して、標的抗原Aに結合する第1の機能的抗原結合部位を形成し;
(2)第2のVLドメイン(VLb)は第2のVHドメイン(VHb)と対合して、標的抗原Bに結合する第2の機能的抗原結合部位を形成し;
(3)第3のVLドメイン(VLc)は第3のVHドメイン(VHc)と対合して、標的抗原Cに結合する第3の機能的抗原結合部位を形成し;
(4)式IIIのポリペプチドおよび式IVのポリペプチドは、交差軽鎖-重鎖対(CODV)を形成し;
(5)安定化ノックアウトVLドメイン(VLX)は安定化ノックアウトVHドメイン(VHX)と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト(dsKO2)ドメインを形成し;
dsKOドメインは、(i)標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(ii)1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質。 - Fcドメインが1つまたはそれ以上のノブ-イン-ホール(KIH)突然変異を含む、請求項17~23のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 疑似Fab部分の融点(Tm)が、参照Fab分子よりも少なくとも4℃高い、請求項1~24のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合のうちの少なくとも1つがVH44C-VL100Cである、請求項1~25のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 標的抗原Aおよび標的抗原Bが同一抗原の異なるエピトープである、請求項1~26のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- VLX/VHX対が、
(i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号77のアミノ酸配列を含むVHX;
(ii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号78のアミノ酸配列を含むVHX;ならびに
(iii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号79のアミノ酸配列を含むVHX
からなる群から選択される、請求項1~27のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 多重特異性結合タンパク質における重鎖-軽鎖の誤対合を低減させるための安定化ノックアウトドメインの使用であって、安定化ノックアウトドメインは、(1)野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる1つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、(2)参照Fab分子に対する疑似Fabの熱安定性(Tm)の増大を付与する1つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むVHKおよびVLXドメインを含み、参照Fab分子は、疑似Fab参照分子において、参照Fab分子のCH1およびCLドメインがVHXおよびVLXドメインで置換される以外は、疑似Fab分子と同一である、前記使用。
- VLX/VHX対が、
(i)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号77のアミノ酸配列を含むVHX;
(ii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号78のアミノ酸配列を含むVHX;ならびに
(iii)配列番号76のアミノ酸配列を含むVLX、および
配列番号79のアミノ酸配列を含むVHX
からなる群から選択される、請求項29に記載の使用。 - 請求項1~28のうちのいずれか1項に記載の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 請求項31に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項31に記載の核酸分子または請求項32に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 請求項1~28のいずれか1項に記載の結合タンパク質を生成する方法であって、請求項33に記載の宿主細胞を該結合タンパク質が発現されるような条件下で培養する工程;および該宿主細胞から該結合タンパク質を精製する工程を含む前記方法。
- 薬学的に許容される担体と、治療有効量の請求項1~28のいずれか1項に記載の多重特異性結合タンパク質とを含む医薬組成物。
- 抗原活性が有害である障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項1~28のいずれか1項に記載の多重特異性結合タンパク質を投与する工程を含む前記方法。
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