CN104114579B - 异二聚体蛋白的生成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法。

Description

异二聚体蛋白的生成
发明领域
本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括在还原性条件下温育第一和第二同二聚体蛋白的第一步和使从第一步获得的组合物经受氧化条件的第二步。本发明的方法特别适合于包含抗体的异二聚体蛋白的大规模生产。
发明背景
近年来单克隆抗体已成为成功的治疗分子，特别是用于治疗癌症。双特异性抗体可进一步能够提高单克隆抗体疗法的效力和功效，例如它们可以用于将药物或毒性化合物引导至靶细胞，用于将效应器机制再引导至疾病相关部位或提高对肿瘤细胞的特异性，例如通过与只见于肿瘤细胞的靶分子的组合结合。此外，通过在一种双特异性抗体中组合两种单克隆抗体的特异性可以潜在连结较大的一批作用机制，即其组合的作用机制。
最近Chames and Baty(2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12:276已经综述了关于双特异性抗体的不同形式和用途。开发双特异性抗体的主要障碍之一是通过传统技术难以制备足够质量和数量的材料，所述传统技术诸如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin andZhu(2005)Acta Pharmacol Sin 26:649)。由不同重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞中的共表达，除了产生期望的双特异性抗体以外，还产生可能的抗体产物的混合物。
已描述数种策略以利于在不同抗体构建体共表达后形成异二聚的(即双特异性)产物。
Lindhofer等(1995J Immunol 155:219)公开了大鼠/小鼠四源杂交瘤(quadroma)中优先的物种限制性重/轻链配对。
用于形成双特异性抗性的技术是所谓的“隆突-入-空穴(knob-into-hole)”策略(美国专利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO 2009089004(Amgen)描述了有利于在不同抗体域在宿主细胞中共表达后形成异二聚体的其它策略。在这些方法中，构成重链恒定域3(CH3)，即两个CH3域中的CH3-CH3界面的一个或更多个残基被荷电氨基酸置换，使得在静电上不利于形成同二聚体且在静电上利于异二聚体化。WO2007110205(Merck)描述了又一种策略，其中利用IgA与IgG CH3域之间的差异促使异二聚体化。
Dall’Acqua等(1998Biochemistry 37:9266)已鉴定五个参与CH3同二聚体界面处的CH3-CH3接触的在能量上关键的氨基酸残基(366、368、405、407和409)。
WO 2008119353(Genmab)描述了用于抗体生成的离体方法。
WO 11/131746(Genmab)公开了含有抗体Fc的异二聚体蛋白及其生成方法。
本发明涉及用于生成异二聚体蛋白，诸如稳定的IgG1双特异性抗体的方法，其中所述方法特别适合于稳定的异二聚体蛋白的大规模生产，其中将二硫键再氧化。通过在同二聚体的CH3域中引入不对称的突变，可以迫使Fab臂交换反应由于CH3域的互补性而变为方向性的，且由此产生高度稳定的异二聚体蛋白。
发明概述
在一个方面，本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
a)在还原性条件下将第一同二聚体蛋白与第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原性条件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且
其中所述第一同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第一CH3区，且所述第二同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，且其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，
b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
在另一个方面，本发明步骤a)用下列步骤替换：
x)提供编码包含第一免疫球蛋白的Fc区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第一Fc区包含第一CH3区，
y)提供编码包含第二免疫球蛋白的Fc区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第二Fc区包含第一CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，且
其中所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有除了Lys、Leu或Met外的氨基酸，且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405和407，
和/或
其中所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个所述CH3区的同二聚体相互作用的解离常数介于0.01和10微摩尔，诸如介于0.05和10微摩尔之间，更优选介于0.01和5之间，诸如介于0.05和5微摩尔之间，甚至更优选介于0.01和1微摩尔之间，诸如介于0.05和1微摩尔之间，介于0.01和0.5之间或介于0.01和0.1之间，
z)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体。
附图简述
图1：通过种间Fab-臂交换生成双特异性抗体。通过ELISA测定GSH诱导的指定的抗EGFR(2F8)和CD20(7D8)IgG4抗体之间的体外Fab-臂交换后双特异性抗体的生成。在ELISA中分析0-1μg/mL的浓度系列(总抗体)。双特异性结合在Fab-臂交换后在猕猴(Rh)和人(Hu)IgG4抗体之间比在同一物种的两种抗体之间高。
图2：人和猕猴抗体同种型的核心铰链(即人IgG1中的CPPC序列，其包含潜在形成重链间二硫键的两个半胱氨酸残基和其它人和猕猴同种型中的相应残基)和CH3-CH3界面的氨基酸序列的比对。
图3：使用参与进行Fab-臂交换的突变体人IgG1生成双特异性抗体。通过ELISA测定通过GSH诱导的人CD20(7D8)IgG4抗体和指定的人EGFR(2F8)IgG1抗体之间的体外Fab-臂交换进行的双特异性抗体生成。呈现的图显示了三次独立Fab-臂交换实验的平均数，其中使用总抗体浓度1μg/mL进行ELISA。双特异性结合在Fab-臂交换后在IgG1-2F8-CPSC-ITL和IgG4-7D8之间比在两种IgG4抗体之间高。组合IgG4-7D8与IgG1-2F8、IgG1-2F8-CPSC或IgG1-2F8-ITL在使用的条件下不生成双特异性抗体。
图4：通过人IgG4和突变体IgG1抗体的体内Fab-臂交换生成双特异性抗体。通过ELISA测定通过在免疫缺陷小鼠中人CD20(7D8)IgG4和指定的人EGFR(2F8)IgG1和IgG4突变体抗体之间的体内Fab-臂交换进行的双特异性抗体生成。呈现的图显示了平均数(n＝4)。双特异性反应性以相对于总IgG浓度的双特异性抗体浓度(百分比)呈现。具有稳定化铰链(CPPC)或CH3域中的R409K突变的人IgG4不能参与Fab-臂交换。具有铰链中的CPSC序列和CH3域中的K409R突变两者的的IgG1参与进行Fab-臂交换。(*)含有IgG1-2F8、IgG4-2F8-CPPC或IgG4-2F8-R409K的混合物的双特异性结合低于检测线，因此任意设置为0。
图5：使用2-巯基-乙胺·HCl-(2-MEA-)诱导的人IgG1和IgG4抗体之间的Fab-臂交换生成双特异性抗体。通过ELISA测定2-MEA诱导的指定人EGFR(2F8)和CD20(7D8)抗体之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。测试0-40mM2-MEA的浓度系列。呈现的图显示了ELISA的结果，其中使用20μg/mL的总抗体浓度。2-MEA也在含有稳定化铰链(CPPC)的抗体之间有效诱导Fab-臂交换。关于CH3域，与两种野生型IgG4抗体相比，人IgG4 x具有三重突变T350I-K370T-F405L的人IgG1的组合产生更高水平的双特异性反应性。
图6：使用2-MEA诱导的人IgG1和IgG4抗体之间的Fab-臂交换生成双特异性抗体。
对0-40mM 2-MEA的浓度系列的所有样品通过质谱术测定2-MEA诱导的指定人EGFR(2F8)和CD20(7D8)抗体之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。(A)显示了用0mM、7mM和40mM2-MEA进行IgG1-2F8-ITL xIgG4-7D8-CPPC之间的Fab-臂交换反应的样品的质谱图的代表性例子。(B)在量化质谱数据后，计算百分比双特异性抗体，并相对于Fab-臂交换反应中的2-MEA浓度绘图。IgG4-2F8x IgG4-7D8生成最大约50％的双特异性抗体。IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC生成最大约95％的双特异性抗体。
图7：通过2-MEA诱导的Fab-臂交换获得的异二聚体双特异性抗体的稳定性分析。通过在存在指定浓度的无关IgG4的情况中在GSH诱导的Fab-臂交换反应后在ELISA中测量EGFR/CD20双特异性结合测试通过组合IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC(A)或IgG4-2F8 xIgG4-7D8(B)通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的双特异性样品的稳定性。相对于起始材料(对照)的双特异性结合(其设置为100％)呈现双特异性结合。(A)2-MEA诱导的源自IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC的双特异性产物的双特异性结合是保留的，指示不参与在GSH条件下的Fab-臂交换的稳定产物。(B)2-MEA诱导的源自IgG4-2F8x IgG4-7D8的双特异性产物的双特异性EGFR/CD20结合是减少的，指示参与在GSH条件下与无关IgG4的Fab-臂交换的产物。
图8：通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的异二聚体双特异性抗体的血浆清除率。给三组小鼠(每组3只小鼠)注射指定的抗体：(1)100μg双特异性抗体，其通过体外2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC之间的Fab-臂交换生成；(2)100μg双特异性抗体+1,000μg无关IgG4；(3)50μgIgG1-2F8-ITL+50μg IgG4-7D8-CPPC。(A)随时间的总抗体浓度，其通过ELISA测定。总抗体血浆浓度的曲线对于所有抗体是相同的。(B)双特异性抗体浓度，如通过ELISA测定的。注射抗体的双特异性在添加和不添加过量的无关IgG4的情况中是相同的。(*)IgG1-2F8-ITL+IgG4-7D8-CPPC混合物的双特异性结合低于检测限，因此相应的符号不能在此图中绘制。显示了两次ELISA实验的平均值。
图9：通过人IgG1-2F8and IgG4-7D8-CPPC之间的Fab-臂交换生成的双特异性抗体的纯度。(A)还原性SDS-PAGE(a)显示了双特异性样品和IgG1对照样品两者的重链和轻链的条带。非还原性SDS-PAGE(b)显示了完整的IgG。(B)来自HP-SEC的峰结果显示了>98％的双特异性样品是均质的，且实际上没有检测到抗体聚集物。(C)质谱显示了Fab-臂交换生成约100％双特异性产物。
图10：在通过与人IgG4-7D8的Fab-臂交换生成双特异性抗体中三重突变体(ITL)、双重突变体(IT、IL、TL)和单突变体(L)人IgG1-2F8之间的比较。通过ELISA测定在2-MEA诱导的人IgG1-2F8三重和双重突变体和具有CPSC铰链的野生型IgG4-7D8(A)或具有稳定化铰链的突变体IgG4-7D8-CPPC(B)，或单突变体IgG1-2F8-F405L和具有野生型CPSC或稳定化CPPC铰链的IgG4-7D8(C)之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。对于包括双重和单突变体的实验，在ELISA中分别分析0-20μg/mL或0-10μg/mL的浓度系列(总抗体)。IgG4与双重突变体IgG1-2F8-IL和–TL的组合与三重突变体IgG1-ITL产生相似的双特异性EGFR/CD20结合。与IgG1-2F8-IT的组合不生成双特异性产物。IgG4野生型和具有稳定化铰链的IgG4两者与单突变体IgG1-2F8-F405L的组合产生双特异性EGFR/CD20结合。
图11：在不同温度使用2-MEA诱导的Fab-臂交换生成双特异性抗体。通过于0℃、20℃和37℃在2-MEA诱导的体外Fab-臂交换反应中组合指定的人EGFR(2F8)和CD20(7D8)抗体进行的双特异性抗体生成在时间上继之以ELISA。双特异性结合的诱导于37℃最有效，并且于20℃较慢。于0℃，没有测量到双特异性结合的产生。
图12：通过由不同还原剂诱导的体外Fab-臂交换生成双特异性抗体。使用ELISA测量通过用浓度系列的指定还原剂的还原反应中组合人IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC进行的双特异性抗体生成。在用DTT(在2.5mM DTT获得最大值)和2-MEA(在25mM2-MEA获得最大值)，但不用GSH的反应后测量双特异性结合。(*)由于形成抗体聚集体而排除GSH浓度>10mM的数据。
图13：2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL和IgG1-7D8-K409X突变体之间的Fab-臂交换。通过ELISA测定2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL和指定的IgG1-7D8-K409X突变体之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。(A)分析0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)。阳性对照是纯化的一批源自IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC的双特异性抗体。(B)交换以20μg/mL时相对于阳性对照(黑色柱形)的双特异性结合呈现。暗灰色柱形表示IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)、阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间和IgG1-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgG1-7D8-K409X突变体和IgG1-2F8-ITL之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
图14：抗体去糖基化不影响通过2-MEA诱导的Fab-臂交换进行的双特异性抗体生成。通过ELISA测定2-MEA诱导的指定EGFR(2F8)和CD20(7D8)抗体之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。与其酶促去糖基化的变体比较与7D8抗体的交换。在ELISA中分析0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)。牵涉去糖基化(deglyc)抗体的Fab-臂交换反应与源自其的糖基化变体显示了相同的双特异性结合曲线。
图15：参与Fab-臂交换的能力与CH3-CH3相互作用强度相关联。(A)、(B)和(C)通过具有指定突变的IgG1-2F8和IgG1-7D8(A)或IgG4-2F8和IgG4-7D8(B和C)构建体之间的GSH诱导的Fab-臂交换生成双特异性抗体，其在ELISA中随时间以双特异性结合呈现。相对于24小时后IgG4-2F8 xIgG4-7D8对照呈现双特异性。(D)和(E)基于IgG1的(D)或基于IgG4的(E)分子的表观KD(表2)和24小时后的双特异性抗体生成(图15A/B/C)之间的关系。
图16：IgG1、IgG4和(部分)IgG3主链中抗EGFr抗体2F8的序列比对。描绘了依照Kabat和依照EU索引的氨基酸编号方式(两者记载于Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。SEQ ID NO:10中给出2F8–G1，SEQ ID NO:11中给出2F8-G3(部分)，而SEQ ID NO:12中给出2F8-G4。
图17：通过由不同还原剂诱导的体外Fab-臂交换生成双特异性抗体。使用ELISA测量通过在用浓度系列的指定还原剂的还原反应中组合人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的双特异性抗体生成。相对于源自2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC之间的Fab-臂交换的双特异性对照样品的信号(其设置为100％)标准化测量的OD值。在用浓度范围0.5-50mM的DTT、浓度范围25-50mM的2-MEA和浓度范围0.5-5.0mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，但不用GSH的反应后测量最大双特异性结合。(*)由于形成抗体聚集体而排除GSH浓度≥25mM的数据。
图18：使用2-MEA诱导的人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成双特异性抗体。
(A)通过ELISA测定2-MEA诱导的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。呈现的图显示了ELISA的结果，其中使用20μg/mL的总抗体浓度。2-MEA有效诱导人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换。(B)对于浓度系列0-40mM2-MEA的所有样品，通过质谱术测定2-MEA诱导的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。在量化质谱数据后，计算双特异性抗体的百分比，并且相对于Fab-臂交换反应中的2-MEA浓度绘图。IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换在测试的最高2-MEA浓度产生约100％双特异性抗体，这确认ELISA数据。
图19：通过人IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性抗体的纯度。质谱法显示了Fab-臂交换生成约100％双特异性产物。
图20：通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的双特异性抗体的血浆清除。给两组小鼠(每组3只小鼠)注射指定的抗体：(1)100μg双特异性抗体，其通过体外2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成；(2)100μg双特异性抗体+1,000μg无关IgG4(10x IgG4)。(A)随时间的总抗体浓度，其通过ELISA测定。对于所有抗体，总抗体血浆浓度的曲线是相同的。(B)双特异性抗体浓度，如通过ELISA测定的。注射抗体的双特异性在添加和不添加过量的无关IgG4的情况中是相同的。
图21：双特异性抗体对CD20表达细胞的CDC介导的细胞杀伤，所述双特异性抗体通过2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成。使用浓度系列的指定抗体测试其介导对Daudi(A)和Raji(B)细胞的CDC的能力。这两种细胞系都表达CD20，而非EGFR。在IgG1-7D8中引入K409R不影响其诱导CDC的能力。源自2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405Lx IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换的双特异性抗体仍然能够诱导CDC。
图22：双特异性抗体对EGFR表达细胞的ADCC介导的细胞杀伤，所述双特异性抗体通过2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成。使用浓度系列的指定抗体测试其介导对A431细胞的ADCC的能力。IgG1-7D8不能结合CD20阴性A431细胞，因此不诱导ADCC。EGFR抗体IgG1-2F8在CH3域中引入F405L突变后也诱导ADCC。IgG1-2F8-F405L的ADCC效应器功能在通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换获得的双特异性形式中得到保留。
图23：2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换。通过ELISA测定在2-MEA诱导的指定IgG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。(A)在ELISA中分析0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)。阳性对照是纯化的一批源自IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R的双特异性抗体。(B)交换以20μg/mL时相对于阳性对照(黑色柱形)的双特异性结合呈现。暗灰色柱形表示IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R或对照之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
图24：2-MEA诱导的IgG1-2F8-Y407X mutants and IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换。通过ELISA测定在2-MEA诱导的指定IgG1-2F8-Y407X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。(A)在ELISA中分析0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)。阳性对照是纯化的一批源自IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R的双特异性抗体。(B)交换以20μg/mL时相对于阳性对照(黑色柱形)的双特异性结合呈现。暗灰色柱形表示IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgG1-2F8-Y407X突变体和IgG1-7D8-K409R或对照之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
图25：通过非还原性(图25(A))和还原性(图25(B))条件下的SDS-PAGE分析通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的双特异性抗体
图26：同二聚体起始材料IgG1-2F8-F405L(图26(B))、同二聚体起始材料IgG1-7D8-K409R(图26(A))、这两种同二聚体的混合物(1:1)(图26(C))、和通过2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物(图26(D))的HP-SEC谱。
图27：同二聚体起始材料IgG1-2F8-F405L(图27(B))、同二聚体起始材料IgG1-7D8-K409R(图27(A))、这两种同二聚体的混合物(1:1)(图27(C))、和通过2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物(图27(D))的质谱法(ESI-MS)。
图28：同二聚体起始材料IgG1-2F8-F405L(图28(A))、同二聚体起始材料IgG1-7D8-K409R(图28(B))、这两种同二聚体的混合物(1:1)(图28(C))、和通过2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物(图28(D))的毛细管等电聚焦(cIEF)图。
图29：同二聚体起始材料IgG1-2F8-F405L(图29(A))、同二聚体起始材料IgG1-7D8-K409R(图29(B))、这两种同二聚体的混合物(1:1)(图29(C))、和通过2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物(图29(D))的HPLC-CIEX图。
图30：同二聚体IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的交换反应，如在不同时间点注射后通过高压液相层析阳离子交换(HPLC-CIEX)监测的。
图31：交换反应后残留的同二聚体，如用CIEX方法检测的(以箭头标示)。
图32：IgG浓度、2-MEA浓度、温育温度和温育时间对双特异性抗体生成的影响，如ELISA测定的。
图33：多个IgG浓度、2-MEA浓度、温育温度和时间的双特异性抗体生成，如通过ELISA测定且与任意设置为100％的对照相比。
图34：多个IgG浓度、2-MEA浓度、温育温度和时间的双特异性抗体生成，如通过HPLC-CIEX分析的。
图35：使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA测定2-MEA诱导的指定IgG1-2F8-L368X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成(图35(A))。阳性对照是纯化的一批源自IgG1-2F8-F405L xIgG1-7D8-K409R的双特异性抗体。图35(B)显示了在20μg/mL时相对于阳性对照(黑色柱形)的双特异性结合。暗灰色柱形表示IgG4对照(IgG4-7D8xIgG4-2F8)和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgG1-2F8-L368X突变体和IgG1-7D8-K409R之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
图36：使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA测定2-MEA诱导的指定IgG1-2F8-K370X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成(图36(A))。阳性对照是纯化的一批源自IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R的双特异性抗体。图36(B)显示了在20μg/mL时相对于阳性对照(黑色柱形)的双特异性结合。暗灰色柱形表示IgG4对照(IgG4-7D8 x IgG4-2F8)和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgG1-2F8-D370X突变体和IgG1-7D8-K409R之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
图37：使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA测定2-MEA诱导的指定IgG1-2F8-D399X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成(图37(A))。图37(B)显示了在20μg/mL抗体浓度时相对于阳性对照(黑色柱形)的双特异性结合。暗灰色柱形表示IgG4对照(IgG4-7D8 x IgG4-2F8)和阴性对照(IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgG1-2F8-D399X突变体和IgG1-7D8-K409R之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
图38：使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA测定2-MEA诱导的指定IgG1-2F8-T366X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成(图38(A))。图38(B)显示了在20μg/mL抗体浓度时相对于阳性对照(黑色柱形)的双特异性结合。暗灰色柱形表示IgG4对照(IgG4-7D8 x IgG4-2F8)和阴性对照(IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgG1-2F8-T366X突变体和IgG1-7D8-K409R之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
图39：于15℃在0、30、60、105和200分钟温育后四种不同IgG1突变体组合(如指定)之间的2-MEA诱导的Fab-臂交换，如通过三明治式ELISA测定的。
图40:于15℃抗体温育90分钟后不同IgG1突变体组合之间的2-MEA诱导的Fab-臂交换，如通过三明治式ELISA测定的。
图41:通过分析CIEX分析双特异性抗体，并且如下计算不同缓冲液(如图注中指定)中随时间形成的异二聚体的百分比：异二聚体(％)＝100％-[峰面积％IgG1-2F8-F405L+峰面积％IgG1-7D8-K409R]。
图42：在于0℃、O/N(A,B)或于4℃贮存6天(C,D)后通过非还原性(A,C)和还原性(B,D)条件下的SDS-PAGE分析用含有10mg/mL每种抗体的混合物生成的40mL双特异性抗体批次。每块凝胶的第1道含有MW标志物，第2道含有IgG1内部测定对照。A,B：第3道：用含有10mg/mL每种抗体的混合物生成的40mL双特异性抗体批次；C,D：第4道：用含有10mg/mL每种抗体的混合物生成的40mL批次。
对于非还原性条件，指定重链(H)和轻链(L)的不同组合：148kDa(LHHL),125kDa(HHL),99kDa(HH),67kDa(HL),51kDa(H)和25kDa(L)。
图43：在IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和。使用氧化还原探头和溶解氧(DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
图44：抗CD38抗体的还原和氧化期间的HP-SEC分析。通过HP-SEC分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。样品2(S0002)：在从配制缓冲液进行缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；样品3至8：还原阶段(温育时间：1、2、3、4、41/2、5小时)期间的抗CD38抗体；样品9至12：渗滤过程期间的抗CD38抗体(1、2、3、4小时时的样品)；样品13；O/N温育后的抗CD38抗体；样品14：将CuSO4添加至溶液后的抗CD38抗体。为了比较，单独的2-MEA和与2-碘乙酰胺(IAA)一起的2-MEA的HP-SEC谱以粗线显示。7.715和9.193的峰代表二聚体和单体IgG1。11.073的峰的性质是未知的。
图45：抗CD38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第8道：还原阶段期间(图上方指定的温育时间)的抗CD38抗体；第9道到第12道：渗滤过程期间的抗CD38抗体；第13道：O/N温育后的抗CD38抗体；第14道：将CuSO4添加到溶液后的抗CD38抗体。
图46：抗CD38抗体的还原和氧化期间的ESI-MS分析。将抗CD38抗体的还原和再氧化期间采集的样品淬灭，并通过ESI-MS分析来分析。样品1(S0001)：配制缓冲液中的抗CD38抗体；样品2：缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第8道：还原阶段期间(温育时间：1、2、3、4、41/2、5h)的抗CD38抗体；第9道到第12道：渗滤过程期间(1、2、3、4h时的样品)的抗CD38抗体；第13道：O/N温育后的抗CD38抗体；第14道：将CuSO4添加到溶液后的抗CD38抗体。应当注意到，LC-MS通过LC***中的还原剂除去或者在电喷射过程期间将样品暴露于空气(即氧气)而促进再氧化过程。样品可能损失在淬灭步骤过程中尚未被IAA加帽的共价附接的还原剂分子。因此，与SDS-PAGE相比，ESI-MS过高评估共价再氧化的完整IgG。标示重链(H)和轻链(L)的不同组合：LHHL,HHL,HH,HL,H和L。在图中仅对轻链(L)给出质量详情；+2-MEA＝+75Da；+2-碘乙酰胺＝+57Da。
图47：IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和–更快速的渗滤和第二渗滤步骤。使用氧化还原探头和溶解氧(DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
图48：抗CD38抗体的还原和氧化期间的HP-SEC分析–更快速的渗滤和第二渗滤步骤。通过HP-SEC分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。样品1(S0001)：配制缓冲液中的抗CD38抗体；样品2：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第9道：还原阶段期间(温育时间5、10、15、30和60分钟和2和3小时)的抗CD38抗体；第10道到第15道：渗滤过程期间(10、20、30、40、50和60分钟后的样品)的抗CD38抗体；第16道到第18道：渗滤后1、2和25小时的抗CD38抗体；第19道：第二次渗滤后1小时的抗CD38抗体。
图49：抗CD38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析–更快速的渗滤和第二渗滤步骤。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第9道：还原阶段期间(温育时间5、10、15、30和60分钟和2和3小时)的抗CD38抗体；第10道到第15道：渗滤过程期间(10、20、30、40、50和60分钟后的样品)的抗CD38抗体；第16道到第18道：渗滤后1、2和25小时的抗CD38抗体；第19道：第二次渗滤后1小时的抗CD38抗体。
图50：IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和–更快速的渗滤和较低的2-MEA浓度。使用氧化还原探头和溶解氧(DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
图51：抗CD38抗体的还原和氧化期间的HP-SEC分析–更快速的渗滤和较低的2-MEA浓度。通过HP-SEC分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。样品1(S0001)：配制缓冲液中的抗CD38抗体；样品2：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第6道：还原阶段期间(温育时间:20和60分钟和3和4小时)的抗CD38抗体；第7道到第10道：渗滤过程期间(10、20、40和60分钟后的样品)的抗CD38抗体；第11道到第14道：渗滤停止后1、2、3和24小时的抗CD38抗体。
图52：抗CD38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析–更快速的渗滤和较低的2-MEA浓度。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第6道：还原阶段期间(温育时间:20和60分钟和3和4小时)的抗CD38抗体；第7道到第10道：渗滤过程期间(10、20、40和60分钟后的样品)的抗CD38抗体；第11道到第14道：渗滤停止后1、2、3和24小时的抗CD38抗体。
图53：IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和–更快速的渗滤和还原阶段期间的EDTA存在。(A)使用氧化还原探头和溶解氧(DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
(B)在存在和缺乏EDTA(从实施例46[没有EDTA]和47[具有EDTA]采集)的情况中DO下降的比较。
图54：抗CD38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析–更快速的渗滤和还原阶段期间的EDTA存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第7道：还原阶段期间(温育时间：10分钟和1、2、3和4小时)的抗CD38抗体；第8道到第11道：渗滤过程期间(开始渗滤后10、30、40和60分钟的样品)的抗CD38抗体；第12道到第14道：渗滤停止后1和24小时和6天的抗CD38抗体。
图55：IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和–更快速的渗滤和还原阶段后的N2存在。使用氧化还原探头和溶解氧(DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
图56：抗CD38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析–更快速的渗滤和还原阶段后的N2存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第7道：还原阶段期间(温育时间：10分钟和1、2、3和4小时)的抗CD38抗体；第8道到10道：渗滤过程期间(开始渗滤后10、30、和60分钟的样品)的抗CD38抗体；第11道：停止渗滤后24小时的抗CD38抗体；第12道和第13道：在停止用氮气通风并开始用氧气通风后1和24小时的抗CD38抗体。
图57：IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和–更快速的渗滤和还原阶段后的EDTA存在。使用氧化还原探头和溶解氧(DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
图58：抗CD38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析–更快速的渗滤和还原阶段后的EDTA存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第6道：还原阶段期间(温育时间：10分钟和2、3和4小时)的抗CD38抗体；第7道到9道：渗滤过程期间(开始渗滤后10、30、和60分钟的样品)的抗CD38抗体；第10道：停止渗滤后24小时的抗CD38抗体；第11道：添加硫酸铜后30分钟的抗CD38抗体。
图59：IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和–更快速的渗滤和还原阶段后的硫酸铜存在。使用氧化还原探头和溶解氧(DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
图60：抗CD38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析–更快速的渗滤和还原阶段后的硫酸铜存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第3道到第7道：还原阶段期间(温育时间：10分钟和1、2、3和4小时)的抗CD38抗体；第8道到9道：渗滤过程期间(开始渗滤后10和60分钟的样品)的抗CD38抗体；第10道：停止渗滤后24小时的抗CD38抗体；第M道：MW标志物。
图61：再氧化过程期间的SDS-PAGE分析。在含有EDTA或Cu2+的PBS中在不同温育时间后采集样品，并通过非还原性(A,C)和还原性(B,D)条件下的SDS-PAGE分析。第1道：IgG1，内部测定对照，第2道：0h样品；第3道：1h样品，第4道：2h样品，第5道：3h样品，第6道：4h样品，第7道：24h样品，第8道：MW标志物。
图62：在存在Cu2+的情况中在不同温育时间后的重链-轻链组合的相对量。通过自SDS-PAGE凝胶的密度测定法量化个别的分子种类。所有扫描条带的总强度设置为100％。
图63：反应器流径、材料清单和方法。使用0.2N NaOH对流径消毒，并用WFI漂洗。更换反应的早晨，从缓冲剂袋将合适量的PBS添加至***。通过重力补料添加同二聚体，并且以7LPM循环***以混合内容物。通过重力添加2-MEA储备溶液启动反应。将渗透阀关闭，并且补料泵设置为30RPM(7LPM)，以进行还原过程。在5小时后，将渗透阀打开，并将泵速提高以满足渗滤的目标补料压力70kPa。对于1g/L条件，泵设置为165RPM(31LPM)。对于20g/L条件，泵设置为140RPM(26LPM)。将PBS添加路径打开，并且控制渗滤泵速以保持反应器袋中的恒定重量。此程序产生250L/h(对于1g/L条件)和125L/h(对于20g/L条件)的渗滤速率。在500L废物袋中收集目标渗滤体积后，将渗透阀关闭，并停止渗滤泵。在氧化时间期间将补料泵返回到30RPM(7LPM)循环。在O/N温育后，实施第二次渗滤(对于1g/L条件为3个渗滤体积(diavolume)，且对于20g/L条件为4个渗滤体积)。在周围温度(22-25℃)实施所有过程。直接从袋中或从阀1中取出样品(图1)。
材料清单
1)1/2”零静态三通隔膜阀(zero-static tee diaphragm valve),SED,316L SS
2)50L袋，Sartoruis Stedim，FFB207004型，在50L Wave混合器上，EHT rev A型
3)Twin杠杆秤，Intercomp，TB830型
4)1/2”ID管道，铂固化硅酮(platinum cured silicone)，Masterflex96410-82
5)3/8”ID管道，铂固化硅酮，Tygon 3350
6)管道弹簧夹(Tubing pinch clamp)
7)1"ID高压软管，强化铂固化硅酮，316L SS TC末端，Page International，SWPV型
8)0-30psig压强表，Anderson，EM066010041025A型
9)1"三通器(gauge tee)，316L SS
10)1/2’三通器，316L SS
11)1/2”x1"TC减速器(reducer)，316L SS
12)补料蠕动泵(Feed peristaltic pump)，Watson Marlow，720DUN/RE型，Stapure管道元件，960.0254.PFT型，0-33LPM
13)溶解氧传感器和发送器，Metter-Toledo，4100e和Inpro 6800/12/120(传感器)型
14)氧化还原传感器和发送器，Mettler Toledo，2100e和3250SG(传感器)型
15)1"Wedgewood流动池，316L SS
16)1/2”三通管，Kynar，Cole-Parmer EW-30703-78型
17)1/2”隔膜阀，SED，316L SS
18)具有Pall一次性聚丙烯***物的Millipore UF膜固定器(holder)，和PallOmega30kD PES膜，OS030F26型
19)Male Kleenpak HT连接器，Pall，KPCHT02M6型
20)Female Kleenpak HT连接器，Pall，KPCHT02F6型
21)渗滤滤器(Diafilter)蠕动泵，Watson Marlow,620型Di/R，Stapure管道元件，960.0170.PFT型，0-9LPM
22)0.2micron滤器，Pall，KA3NFP1型
23)500L袋，Sartoruis Stedim，FXB211905型
24)200L袋，Sartoruis Stedim，PDL200LWS型
25)20L袋，Sartoruis Stedim，FFB208721型
26)5L袋，Sartoruis Stedim，FFB208723型
*所有TC垫圈均为铂固化硅酮。
*所有5/20/50L Sartorius Stedim袋使用具有EVA(乙烯乙酸乙烯酯)产物接触和EVOH(乙烯乙烯醇)气体屏障层的多层膜。
*所有200/500L Sartorius Stedim袋使用具有ULDPE(超低密度聚乙烯)产物接触接触和EVOH气体屏障层的多层膜。
图64：来自三种不同条件的初始和最终产物的CIEX谱。
图65：初始和最终产物的还原性(左侧)和非还原性(右侧)SDS-PAGE分析。第1道：IgG1-b12测定对照。第2道：初始IgG1-F405L-2F8。第3道：初始IgG1-K409R-7D8。第4道：以1g/L运行的最终25-L。第5道：以20g/L运行的最终25-L。
图66：还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探头追踪IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。水平虚线显示了DO和氧化还原两者的初始数值。2-MEA的添加(以箭头标示)在运行开始时与DO和氧化还原的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图67：还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头测量IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显示初始的pH值。2-MEA的添加(以箭头标示)与运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图68：还原阶段期间的氧消耗率(OCR[mM/h])、消耗的总O2(mM)和DO(％)。计算氧消耗率和消耗的总O2，测量DO。垂直点线代表还原的开始和结束。
图69：还原和再氧化期间的SDS-PAGE(非还原性)分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。M：MW标志物；C：IgG1对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和O/N温育。在左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以H(重链)和/或L(轻链)及其组合标示。
图70：还原和再氧化期间的CIEX谱。在指定的时间点时在IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间将样品采集并快速冷冻，并通过分析CIEX分析。
图71：O/N温育后终样品的HP-SEC分析。通过HP-SEC分析渗滤后在O/N温育后采集的样品。7.599和10.792的峰分别标示二聚体和单体IgG。
图72：还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探头追踪在存在2mM EDTA的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。水平虚线显示了DO和氧化还原两者的初始数值。2-MEA的添加在运行开始时与DO和氧化还原的大幅下降一致(以箭头标示)。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。运行晚期(t＝24h)的氧化还原增加和DO下降与CuSO4的添加一致。
图73：还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪在存在2mM EDTA的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显示初始的pH值。2-MEA的添加(以箭头标示)与运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图74：还原和再氧化期间的SDS-PAGE分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析在存在2mM EDTA的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。M：MW标志物；C：IgG1对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和O/N温育；第13道：添加CuSO4后10分钟。在左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以H(重链)和/或L(轻链)及其组合标示。
图75：还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析在存在2mMEDTA的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
图76：还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探头追踪IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。2-MEA的添加(以箭头标示)在运行开始时与DO和氧化还原的大幅下降一致。水平虚线显示氧化还原和DO两者的初始数值。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图77：还原和再氧化期间的搅动速率。2-MEA的添加(以箭头标示)与接近运行开始的搅动速率的大幅升高一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图78：还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的pH。2-MEA的添加(以箭头标示)与运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图79：还原和再氧化期间的SDS-PAGE(非还原性)分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。M：MW标志物；C：IgG1对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和O/N温育。在左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以H(重链)和/或L(轻链)及其组合标示。
图80：还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
图81：还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探头追踪IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。水平虚线显示了redox和DO两者的初始数值。2-MEA的添加(以箭头标示)在运行开始时与DO和氧化还原的大幅下降一致。水平虚线显示氧化还原和DO两者的初始数值。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图82：还原和再氧化期间的搅动速率。2-MEA的添加(以箭头标示)与接近运行开始的搅动速率的大幅升高一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图83：还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显示初始数值。2-MEA的添加(以箭头标示)与运行开始时pH的大幅下降一致。水平虚线显示初始pH值。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图84：还原和再氧化期间的SDS-PAGE(非还原性)分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。M：MW标志物；C：IgG1对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和O/N温育。在左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以H(重链)和/或L(轻链)及其组合标示。
图85：还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
图86：还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探头追踪在存在氮气的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。时间0时的2-MEA添加与运行开始时氧化还原的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始、渗滤的结束、渗滤后1小时样品点、和渗滤后3小时样品点。在渗滤结束时用空气冲刷顶部空间。
图87：还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪在存在氮气的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和氧化期间的pH。水平虚线显示初始pH值。时间0时的2-MEA的添加与运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
图88：还原和再氧化期间的SDS-PAGE(非还原性)分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析在存在氮气的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。M：MW标志物；C：IgG1对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1和3小时；第13道：渗滤后O/N温育。在左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以H(重链)和/或L(轻链)及其组合标示。
图89：还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析在存在氮气的情况中IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
图90：引入空气后的氧消耗。图显示了在添加空气后更好在渗滤后的数值。实际DO是***测量的DO。DO(无消耗)是假设没有氧消耗的计算值。消耗的O2是使用先前测定的kla并假设***中的氧饱和是0.2mM计算的消耗氧量。
图91：还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探头追踪IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。水平虚线显示了氧化还原和DO的初始数值。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。2-MEA的添加与运行开始时DO和氧化还原的大幅下降一致。刚好在渗前，将pH调节至5.0。在O/N温育后，将pH调回到7.4。
图92：还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头测量IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显示初始数值。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。2-MEA的添加与运行开始时pH下降一致。刚好在针对pH 5.0缓冲液渗滤前，将pH调节至5.0。在O/N温育后将pH再调节至7.4。
图93：还原和再氧化期间的SDS-PAGE(非还原性)分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。M：MW标志物；C：IgG1对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和O/N温育；第13道、第14道和第15道：Tris添加后立即和1和2小时。在左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以H(重链)和/或L(轻链)及其组合标示。
图94：还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R(1:1混合物)的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
图95：胱胺(cystamine)添加后的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探头追踪对IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R1:1混合物添加胱胺后的氧饱和和氧化还原电势。
图96：胱胺添加后的CIEX谱。通过分析CIEX分析对IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R添加胱胺后采集的样品。在指定的时间点时采集样品。
图97：使用10mM半胱氨酸的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
图98：在25mM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
图99：在50mM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
图100：在75mM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
图101：在100mM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
图102：使用半胱氨酸还原，除去半胱氨酸，并温育后的CIEX谱。显示了在50mM半胱氨酸中于30℃还原385分钟，接着使用脱盐柱除去半胱氨酸，随后温育2小时和18小时后的CIEX谱。
图103：从固定化的还原剂柱洗脱后剩余的同二聚体和新形成的双特异性抗体的CIEX谱。将同二聚体IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的混合物添加至固定化的还原剂柱，温育并洗脱。通过分析CIEX分析双特异性抗体的形成。
图104：用于检测双特异性抗体的同种异型ELISA。将IgG1m(f)-K409R-CD20和IgG1m(za)-F405L-EGFR的混合物与25mM2-MEA于37℃一起温育90分钟。在三明治式ELISA中测量双特异性抗体的形成。将405nm的光密度在Y轴上绘制，作为双特异性IgG1m(f,za)-CD20xEGFR抗体形成的测量。包括IgG1m(fa)抗体作为阳性对照。
图105：SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后实施CIEX分析，其中过量添加IgG1-7D8-AAA-K409R。量化显示了交换反应后存在11.4％IgG1-7D8-AAA-K409R(*)、88.5％双特异性抗体和仅0.1％IgG1-2F8-F405L(+)同二聚体。
图106：SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后实施CIEX分析，其中过量添加IgG1-2F8-F405R。量化显示了交换反应后存在0.4％
IgG1-7D8-K409R(*)、88.4％双特异性抗体、和11.2％IgG1-2F8-F405L(+)。
图107：SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后实施CIEX分析，其中使用过量的IgG1-7D8-AAA-K409R。量化指示交换反应后存在25.5％IgG1-7D8-AAA-K409R(*)、73.3％双特异性抗体和1.2％of IgG1-2F8-F405L(+)。注意到IgG1-2F8-F405L同二聚体的百分比在最佳的交换条件下是进一步降低的(图105)。
图108：蛋白A快速蛋白液相层析(FPLC)谱。使用50％过量的IgG1-7D8-AAA-K409R同二聚体在交换后产生双特异性抗体的蛋白A FPLC谱。在左轴上，显示了以mAU计的A280信号(黑色迹线迹线)，在右轴上显示了pH(灰色迹线)。两个明显峰之间的尖峰代表分级开始时的气泡。
图109：流过级分(在图108中用*标示的峰)的CIEX分析。既没有检测到双特异性抗体(保留时间约16.4分钟)也没有检测到IgG1-2F8-F405L(保留时间约19.2分钟)；13.6分钟的峰对应于(非结合)IgG1-7D8-AAA-K409R同二聚体。
图110：洗脱产物(在图108中用+标示的峰)的CIEX分析。16.4分钟的峰对应于双特异性抗体，在13.6分钟(IgG1-7D8-AAA-K409R)没有检出峰，并且检出(1.4％)19.2分钟(IgG1-2F8-F405L)的小峰。这证明了与蛋白A抛光(polishing)组合的SNEEP可以用于除去残留的同二聚体。
图111：蛋白A共同纯化的IgG1-b12-F405L和IgG1-058-K409R的FPLC层析谱。迹线显示了A280信号。以约5mL后A280信号升高观察到加载。清洗和洗脱步骤的开始用箭头标记。在第一低pH再生步骤期间观察到100mL的洗脱后峰。此峰没有进行分析，但是指示次要蛋白杂质。
图112：蛋白A共同纯化的IgG1-058-K409R(*)和IgG1-b12-F405L(+)的CIEX谱。
图113：从蛋白A共同纯化的IgG1-b12-F405L和IgG1-058-K409R生成的双特异性抗体的HP-SEC谱。7.5分钟的峰(*)对应于二聚体种类，9.0分钟的峰对应于单体种类(+)。
图114：从蛋白A共同纯化的IgG1-b12-F405L和IgG1-058-K409R生成的双特异性抗体的CIEX谱。26分钟的峰(*)对应于双特异性抗体；36分钟的峰对应于IgG-b12-F405L同二聚体(+)。没有检出IgG1-058-K409R。
图115：双特异性抗体和同二聚体的1:1:1混合物的FPLC谱。在近等度条件下在WCIEX柱上分开的IgG1-7D8-K409R(*)、双特异性抗体(+)、和IgG1-2F8-F405L(#)的1:1:1混合物的FPLC谱(较浅的梯度仅略微加速IgG1-2F8-F405L的洗脱)。
图116：计算的解析。对柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液显示了计算的解析(R，使用等式5计算)。对20mM柠檬酸盐pH 6.4发现最佳的解析。认为1.75-2.00的解析对于满意的分离是可接受的(John W.Dolan,Peak Tailing and Resolution,LC Resources Inc.,WalnutCreek,California,USA)。
图117：FPLC谱。在pH 6.4，20mM柠檬酸时掺有10％IgG1-2F8-F405L同二聚体(+)的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R(*)双特异性抗体的FPLC谱。加载是4.4mg/mL树脂。
图118：IgG1-2F8-F405L x IgG17D8-K409R双特异性抗体的CIEX谱。显示了在图117中以星号(*)标示的IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R的CIEX谱。IgG1-7D8-K409R同二聚体(*)、双特异性抗体、和IgG1-2F8-F405L同二聚体(+)的百分比是4.3、94.8、和0.9。IgG1-7D8-K409R同二聚体是来自掺有IgG1-2F8-F405L的初始批次的残留同二聚体。
图119：FPLC层析图。A)在具有75mM2-MEA的PBS中20mg双特异性抗体的蛋白A洗脱谱(总体积3mL)。实线是A254信号(左轴)，虚线是A280(左轴)信号，长虚点线是pH(数值未显示，pH在约65mL时从7.4下降至3.0，并且指示仅用于参照)。B)蛋白A上加载的具有75mM2-MEA的PBS(总体积3mL)。实线是A254信号(左轴)，虚线是A280(左轴)信号，长虚点线是pH(数值未显示，pH在约65mL时从7.4下降至3.0，并且指示仅用于参照)。
图120：穿透(breakthrough)测定的点。A)在蛋白A柱暴露于2-MEA之前(左侧小图)和之后(右侧小图)测定穿透点(在图中用箭头标示)。使用停留时间1分钟加载IgG1-7D8-K409R(5mg/mL)。在对75mM2-MEA暴露之前和之后，穿透点是约15mL，指示柱性能不受2-MEA的存在强烈影响。显示的数据是A280数值(mAU)。B)A)的图象放大，两条迹线重叠。
图121：2-MEA除去后洗脱蛋白质的还原性SDS-PAGE分析。泳道含有标志物、对照抗体(IgG1-b12)、在存在2-MEA的情况中在柱加载前的双特异性反应混合物、和2-MEA除去后的终产物。没有检出蛋白A，指示柱保持完整。重链和轻链以箭头标示，蛋白A的预期分子量(45kDa)以星号(*)标示。
图122：双特异性lambda-kappa抗体的CIEX谱。预期含有λ轻链的BMA031-K409R抗体的地方以加号(+)标示，并且没有检出峰，具有κ轻链的IgG12F8-F405L抗体用星号(*)标示。双特异性抗体在中间。BMA031-K409R、双特异性抗体、和IgG12F8-F405L的百分比分别为11.2、88.8和0。
图123：于不同温育贮存不同时间段的双特异性抗体(黑色)、IgG1-7D8-K409R(灰色)和IgG1-2F8-F405L(白色)的A280数据。在Nanodrop上实施A280测量，并且结果在1mm径长以A280(AU)给出。
图124：于2-8℃和于25℃在t＝0和t＝12个月时双特异性抗体(D)、IgG1-7D8-K409R(1)和IgG1-2F8-F405L(2)的非还原性SDS-PAGE。C＝内部IgG1测定对照。
图125：于2-8℃和于25℃在t＝0和t＝12个月时双特异性抗体(D)、IgG1-7D8-K409R(1)和IgG1-2F8-F405L(2)的还原性SDS-PAGE。C＝内部IgG1测定对照。
图126：于40℃在t＝0和t＝3个月时双特异性(D)、IgG1-7D8-K409R(1)和IgG1-2F8-F405L(2)的非还原性SDS-PAGE。C＝内部IgG1测定对照。
图127：于40℃在t＝0和t＝3个月时双特异性(D)、IgG1-7D8-K409R(1)和IgG1-2F8-F405L(2)的还原性SDS-PAGE。C＝内部IgG1测定对照.
图128：双特异性抗体(实心)、IgG1-7D8-K409R(有条纹)和IgG1-2F8-F405L(有点)的HP-SEC层析图。贮存条件是A:t＝0；B：于2-8℃t＝12个月；C：于25℃，t＝12个月，和于40℃，D:t＝3个月。
图129：双特异性抗体(实心)、IgG1-7D8-K409R(有条纹)和IgG1-2F8-F405L(有点)的CIEX层析图。贮存条件是A:t＝0；B：于2-8℃t＝12个月；C：于25℃，t＝12个月，和于40℃，D:t＝3个月。(注意：与t＝12个月相比t＝0时材料的保留时间的差异可以是由于缓冲液组成的小变化和/或使用不同柱批次所致。在每次运行中内部IgG1对照的分析也显示了与t＝0相比t＝12个月时+1.64分钟的转变，数据未显示)。
发明详述
定义
术语“免疫球蛋白”指一类结构上相关的糖蛋白，由两对多肽链，即一对轻(L)的低分子量链和一对重(H)链构成，所有四条链都通过二硫键互联。已充分表征免疫球蛋白的结构。见例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.编,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区通常由三个域CH1、CH2和CH3构成。重链在所谓“铰链区”中经由二硫键互联。每条轻链通常由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区通常由一个域CL构成。通常，根据EU索引对恒定区的氨基酸残基编号，所述EU索引如描述于Kabat等,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991)。图16给出了抗体2F8的不同同种型形式的EU和Kabat编号(WO02/100348)。可将VH和VL区进一步细分为高可变性的区(或者在结构上限定的环的序列和/或形式上高变的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，其散布在称为框架区(FR)的更保守的区中。每个VH和VL通常由以下列顺序从氨基端排列至羧基端的三个CDR和四个FR构成：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4(还可见Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196,901917(1987))。
当用于本文时，术语“Fab臂”指抗体的一个重链-轻链对。
当用于本文时，术语“Fc区”或“Fc域”指至少包含铰链区、CH2域和CH3域的抗体区(参见例如Kabat EA,于US Department of Health and Human Services,NIHpublication n°91-3242,Edn.第5版662,680,689(1991)。可以如下生成Fc区，即用木瓜蛋白酶消化抗体，其中Fc区是由此获得的片段，其包括免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和铰链区。抗体重链的恒定域限定抗体同种型，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE。Fc域与称作Fc受体的细胞表面受体和补体***的蛋白质一起介导抗体的效应器功能。
如本文中使用的，术语“CH2区”或“CH2域”意图指免疫球蛋白的CH2区。如此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于依照EU编号***的氨基酸228-340。然而，CH2区也可以是如本文中描述的任何其它抗体同种型。
如本文中使用的，术语“CH3区”或“CH3域”意图指免疫球蛋白的CH3区。如此，例如人IgG1抗体的CH3区对应于依照EU编号***的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是如本文中描述的任何其它抗体同种型。
术语“抗体”(Ab)在本发明上下文中指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子片段或其任一种的衍生物，它们具有在典型生理条件下与抗原特异性结合的能力，具有显著时间段的半衰期，诸如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更久，约48小时或更久，约3、4、5、6、7或更多天等，或者任何其它相关功能限定的时间段(诸如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原关联的生理反应的时间和/或抗体足以募集效应器活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(比如效应细胞)和补体***的组分比如Clq，补体活化经典途径的第一组分。抗体也可以是双特异性抗体、双抗体(diabody)或类似分子。术语“双特异性抗体”指对至少两种不同表位、通常是非重叠表位具有特异性的抗体或含有两种独特抗原结合位点的抗体。如上所示，除非另外声明或者与上下文明确矛盾，否则本文的术语抗体包括保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。此类片段可通过任何已知的技术提供，比如酶促切割、肽合成和重组表达技术。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段例如Fab或F(ab')2片段实施。还应理解除非另外指定，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，比如嵌合抗体和人源化抗体。如此产生的抗体可具备任何同种型。
术语“全长抗体”当用于本文时，指含有正常见于该同种型抗体的所有重链和轻链恒定域和可变域的抗体。
如本文中使用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM)。
如本文使用的，术语“人抗体”旨在包括具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，如本文使用的，术语“人抗体”并不旨在包括其中从另一哺乳动物物种比如小鼠种系衍生的CDR序列已移植在人框架序列上的抗体。
当用于本文时，术语“重链抗体”指只由重链组成且缺乏通常见于抗体的轻链的抗体。重链抗体，自然存在于例如骆驼(camelid)，可结合抗原，尽管只具有VH域。
术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由表面集合的分子(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特性。构象性和非构象性表位的区别在于在变性溶剂存在时，与前者的结合而非与后者的结合丧失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸如被抗原结合肽有效封闭的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基位于抗原结合肽的覆盖区(footprint)内)。
在抗体与预定抗原结合的情况下，本文所用术语“结合”通常是这样的结合，即在使用抗原作为配体，抗体作为分析物，通过例如表面等离振子共振(SPR)技术在BIAcore3000仪器中测定时，其亲和力相当于约10-6M或更小，例如10-7M或更小，诸如约10-8M或更小，诸如约10-9M或更小，约10-10M或更小，或约10-11M或甚至更小的KD，且其中抗体以对应于如下KD的亲和力结合所述预定抗原，所述KD比其对与预定抗原或紧密相关抗原不同的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少10倍，诸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，诸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力较低的量取决于抗体的KD，使得在抗体的KD非常低(即抗体是高特异性的)时，则对抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。如本文中使用的，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
当用于本文时，术语“第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用”指第一CH3/第二CH3异二聚体蛋白中第一CH3区与第二CH3区之间的相互作用。
当用于本文时，术语“第一和第二CH3区的同二聚体相互作用”指第一CH3/第一CH3同二聚体蛋白中第一CH3区与另一个第一CH3区之间的相互作用和第二CH3/第二CH3同二聚体蛋白中第二CH3区与另一个第二CH3区之间的相互作用。
如本文中使用的，“分离的抗体”表示材料已脱离其原来环境(例如如果它是自然存在的则是自然环境或者如果它是重组表达的则是宿主细胞)。还有利的是，抗体呈纯化形式。术语“纯化的”并不需要绝对纯度；相反，它旨在作为相对定义，表示与起始材料相比相对于组合物中污染物的浓度的抗体浓度增加。
如本文中使用的，术语“宿主细胞”旨在指其中已引入表达载体如编码本发明抗体的表达载体的细胞。重组宿主细胞包括例如转染瘤，比如CHO细胞、HEK293细胞、NS/0细胞和淋巴细胞。
当用于本文时，术语两种或更多种核酸构建体的“共表达”，指两种构建体在单个宿主细胞中表达。
如本文中使用的，术语“肿瘤细胞蛋白”指位于肿瘤细胞的细胞表面上的蛋白。
如本文中使用的，术语“效应细胞”指参与与免疫应答的识别期和活化期相对的免疫应答效应期的免疫细胞。示例性免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(比如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞比如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特异性Fc受体和执行特异性免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)，比如自然杀伤细胞。在一些实施方案中，效应细胞可吞噬靶抗原或靶细胞。
术语“还原性条件”或“还原性环境”指足以容许抗体铰链区中的链间二硫键还原的条件。
除非上下文矛盾，本发明中提及氨基酸位置依照EU索引，如Kabat等,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中描述的。
术语“rpm”或“RPM”指每分钟的旋转，并且在本发明的上下文中可以以rpm或RPM指示。
本发明的方法
本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
a)在还原性条件下将第一同二聚体蛋白与第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原性条件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且
其中所述第一同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第一CH3区，且所述第二同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，且其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，
b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
或者，本发明的步骤a)可以包括下列步骤：
z)提供编码包含第一免疫球蛋白的Fc区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第一Fc区包含第一CH3区，
y)提供编码包含第二免疫球蛋白的Fc区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第二Fc区包含第一CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，且
其中所述第一同二聚体蛋白具有位置409处除了Lys、Leu或Met外的氨基酸，且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405和407，
和/或
其中所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个所述CH3区的同二聚体相互作用的解离常数介于0.01和10微摩尔，诸如介于0.05和10微摩尔之间，更优选介于0.01和5之间，诸如介于0.05和5微摩尔之间，甚至更优选介于0.01和1微摩尔之间，诸如介于0.05和1微摩尔之间，介于0.01和0.5之间或介于0.01和0.1之间，
z)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体。
在又一个实施方案中，步骤z)进一步包括在所述宿主细胞中共表达一种或多种编码轻链的核酸构建体。
本发明的方法在生产较大体积的异二聚体蛋白时是特别合适的。
因此，在一个具体的实施方案中，步骤b)可以包括：
b)使至少10mL从步骤a)中获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋白中半胱氨酸氧化成链间二硫键。
在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括获得异二聚体蛋白的步骤，例如本发明的方法可以包括步骤c)：
c)获得异二聚体蛋白。
在又一个实施方案中，本发明的步骤a)可以包括下列步骤：
i)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第一同二聚体蛋白，所述Fc区包含第一CH3区，
ii)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第二同二聚体蛋白，所述Fc区包含第二CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，
iii)在还原性条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起温育，所述还原性条件足以容许所述铰链区中链间二硫键的还原。
可以一起或分开生成和/或纯化第一和第二同二聚体蛋白。例如，若通过在宿主细胞中表达生成第一和第二同二聚体蛋白，则第一和第二同二聚体蛋白可以在同一反应容器，例如同一生物反应器中生产。若在同一反应容器中生产第一和第二同二聚体蛋白，则所述第一和第二同二聚体蛋白可以在相同宿主细胞中或者由不同宿主细胞生成。或者，第一和第二同二聚体蛋白可以在两个分开的反应容器中，例如在两个分开的生物反应器中生产。若第一和第二同二聚体蛋白由不同宿主细胞生成，则此类宿主细胞可以源自相同或不同细胞类型。同一反应容器中的生产对于成本或时机考虑或者利用氧化还原酶诸如胞质溶胶硫氧还蛋白1和2(TXN1和TXN2)可以是有利的，所述氧化还原酶由表达第一和/或第二同二聚体蛋白的宿主细胞释放，其可以在某些条件下例如通过裂解大量活细胞，使得释放还原需要的酶和辅因子，这与非常低的氧浓度组合，从而催化第一和第二同二聚体蛋白的铰链区中的链间二硫键还原，由此促进在生物反应器中或在随后的收获步骤中发生重链交换(Kao等,2010,Biotechnol.Bioeng 107；622-632)。如此，在又一个实施方案中，本发明的步骤a)可以与第一和/或第二同二聚体蛋白的生产在同一反应容器中实施。在又一个实施方案中，步骤b)也可以与步骤a)在同一反应容器中实施，或者与步骤a)和第一和/或第二同二聚体蛋白的生产两者在同一反应容器中实施。在此情况中，已经存在于反应中的氧和二价金属离子也可以刺激步骤b)的再氧化过程。
用于生产第一和/或第二同二聚体蛋白的其它条件包括关于步骤a)描述的那些条件中的任一种。以不同批次生产第一和第二同二聚体蛋白从控制的观点(更容易再现和/或测定每种同二聚体的品质)看或者在使用同二聚体中的一种通过将其与多种不同其它同二聚体组合创建多种不同双特异性抗体时可能是有利的。
在又一个实施方案中，可以在步骤a)中的温育前纯化第一和/或第二同二聚体蛋白。用于纯化同二聚体的方法包括但不限于蛋白A和蛋白G层析(或亲和层析的其它方式)、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和层析、离子交换、疏水性相互作用、kappa或lambda选择、硫亲和力(thioaffinity)、和羟磷灰石层析和其它混合模式树脂。其它纯化方法包括但不限于用例如盐或聚乙二醇沉淀以获得纯化的蛋白质。还涵盖不同纯化方法的组合。
若分开生产第一和第二同二聚体蛋白，则也可以分开纯化第一和第二同二聚体蛋白。
在备选实施方案中，若分开生产第一和第二同二聚体蛋白，它们可以通过例如蛋白A纯化一起纯化。将第一和第二同二聚体蛋白一起纯化可以提供一些操作和/或经济效益。
若将第一和第二同二聚体蛋白一起生产，则也可以通过例如蛋白A纯化将第一和第二同二聚体蛋白一起纯化。
通过在步骤a)前纯化第一和/或第二同二聚体蛋白，有可能除去如下的组分，所述组分可以影响方法的一个或多个步骤的速率或程度；诸如步骤a)的还原和/或交换过程和/或步骤b)的氧化过程，或者其可以进一步或备选影响异二聚体蛋白的品质。如上文描述的，可以将第一和第二同二聚体蛋白分开或一起生产。如此，若将第一和第二同二聚体蛋白一起生产，则特别地，可以将所述第一和第二同二聚体蛋白一起纯化。若将第一和第二同二聚体蛋白分开生产，则可以将第一和/或第二同二聚体蛋白分开或一起纯化，例如通过组合第一和第二同二聚体蛋白，随后将它们纯化。
在又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白可以存在于溶液或缓冲液中。若例如此缓冲液对于步骤a)中发生的还原和交换过程的实施不是最佳的，则可以用另一种溶液或缓冲剂替换缓冲液。如此，在又一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括在步骤a)前将其中有第一和/或第二同二聚体蛋白的溶液或缓冲液替换为另一种溶液或缓冲液的步骤。
在又一个实施方案中，可以纯化异二聚体蛋白。用于纯化异二聚体蛋白的方法可以包括但不限于本文中描述的那些方法中的任一种。用于纯化异二聚体蛋白的相关方法包括但不限于蛋白A和蛋白G层析(或亲和层析的其它方式)、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和层析、离子交换、疏水性相互作用、kappa或lambda选择、硫亲和力、和羟磷灰石层析和其它混合模式树脂。其它纯化方法使用用例如盐或聚乙二醇沉淀而不是层析来获得纯化的蛋白质。
因此，本发明的方法可以进一步包括纯化异二聚体蛋白的步骤。通过纯化异二聚体蛋白，有可能除去过量的试剂，诸如还原剂，和杂质。纯化异二聚体蛋白还可以包括除去残留的第一和/或第二同二聚体蛋白。如下文描述的，可以在步骤a)中使用过量的第一或第二同二聚体蛋白以促进残留第一和/或第二同二聚体蛋白的除去。
纯化异二聚体蛋白的步骤可以介于步骤a)和b)之间，但是就大多数目的而言，它通常可以在步骤b)后。
若第一或第二同二聚体蛋白已经经过修饰，例如第一或第二CH3区已经经过修饰，以降低或消除蛋白A或蛋白G结合，则特别地，可以通过蛋白A或蛋白G层析纯化本发明的异二聚体蛋白。也可以例如与蛋白A和/或蛋白G层析组合使用其它纯化方法，此类其它方法包括但不限于，或者亲和层析的其它方式、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和层析、kappa或lambda选择、硫亲和力、离子交换、疏水性相互作用、羟磷灰石层析和其它混合模式树脂。其它方法使用用例如盐或聚乙二醇沉淀而不是层析来获得纯化的蛋白质。
在纯化时或在纯化后，可以将异二聚体蛋白配制为适合于贮存异二聚体蛋白，例如确保异二聚体蛋白稳定性的条件。对异二聚体抗体，此类配制剂通常可以是溶液或缓冲液。或者，可以将异二聚体蛋白冷冻干燥。
适合于本发明方法的过程的设备是本领域技术人员公知的。宿主细胞表达同二聚体抗体可以例如通常在反应容器，诸如生物反应器中实施。如上文描述的，还原和氧化步骤a)和b)可以与第一和/或第二同二聚体蛋白的表达在同一生物反应器中发生或者它可以在分开的生物反应器容器中发生。类似地，还原和氧化步骤a)和b)也可以在同一反应容器中发生，或者它们可以在分开的反应器容器中实施。若还原和氧化步骤a)和b)在同一反应容器中发生，则可以将条件从步骤a)改变为步骤b)，如本文中描述的。反应容器和支持过程管道可以是一次性的或者可再用的，并且由标准材料(塑料、玻璃、不锈钢，等等制成。可以给反应容器装备混合、喷射、顶部空间除气、温度控制和/或用用于测量温度、重量/体积、pH、溶解氧(DO)、和氧化还原电势的探头监测。所有此类技术在制造厂的标准单元操作内是常见的并且是本领域技术人员公知的。
可以如本文中描述的那样实施本发明的方法的单个步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法是胞外方法。如上文描述的，可以通过在宿主细胞中表达适当地实施第一和第二同二聚体蛋白的生产。因此，在一个具体的实施方案中，可以在胞外实施步骤a)、b)和c)。在又一个实施方案中，步骤a)、步骤b)、步骤c)、和步骤a)、b)和c)中任一之间的任何步骤及任何随后步骤可以在胞外实施。
第一和第二同二聚体蛋白
可以以多种方式使用本发明的方法以生成异二聚体蛋白的期望组合，并且其特别适合于大规模生产双特异性抗体。除了能够组合靶向不同抗原的抗体以获得选择性结合外，它可用于通过组合两种靶向相同抗原的不同抗体来改变期望的性质，例如增加CDC。另外，它可用于通过用无关(无活性)抗体制备其双非对称抗体来除去拮抗性抗体的部分激动活性或者将激动性抗体转化为拮抗性抗体。
在一个实施方案中，同二聚体蛋白选自(i)Fc区，(ii)抗体，(iii)包含Fc区的融合蛋白，诸如与受体、细胞因子或激素融合的Fc区区，和(iv)与前药、肽、药物或毒素缀合的Fc区。
在一些实施方案中，除了Fc区外，所述第一和/或第二同二聚体蛋白还包含抗体的一个或多个或所有其它区，即CH1区、VH区、CL区和/或VL区。因此，在一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白是全长抗体。在另一个实施方案中，所述第二同二聚体蛋白是全长抗体。
在一个重要的实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白都是抗体，优选全长抗体，并结合不同的表位。在此类实施方案中，产生的异二聚体蛋白是双特异性抗体。所述表位可位于不同抗原或相同抗原上。
然而，在其它实施方案中，只有一种同二聚体蛋白是全长抗体，另一种同二聚体蛋白不是全长抗体，而是例如Fc区，其连同另一种蛋白质或肽序列如受体、细胞因子或激素一起表达，或者与前药、肽、药物或毒素缀合。若第一和/或第二同二聚体蛋白是抗体，例如全长抗体，则在一个实施方案中，它可以与前药、肽、药物或毒素缀合或者含有其接受基团。在又一个实施方案中，同二聚体蛋白都不是全长抗体。例如，两种同二聚体蛋白可以是与另一种蛋白质或肽序列如受体、细胞因子或激素融合或者与前药、肽、药物或毒素缀合的Fc区。例如，这可以用于生成与两种不同化合物，例如前药、肽、药物或毒素缀合的异二聚体蛋白，其通过在本发明的方法中使用与两种不同化合物，例如前药、肽、药物或毒素缀合的第一和第二同二聚体蛋白进行。这在添加药物的过程或化学与添加另一种药物不相容的情况中也可以是相关的，那样对第一和第二同二聚体蛋白分别添加两种药物中每种的过程可以分开且在本发明的方法前实施。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白的Fc区与源自选自下组的同种型或选自下组的同种型的Fc区相似或相同：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(至少具有本文中指示的突变例外)，且第二同二聚体蛋白的Fc区与源自选自下组的同种型或选自下组的同种型的Fc区相似或相同：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(至少具有本文中指示的突变例外)。在一个优选的实施方案中，所述第一和所述第二同二聚体蛋白两者的Fc区与源自IgG1同种型(至少具有本文中指示的突变例外)或该IgG1同种型的Fc区相似或相同。在另一个优选的实施方案中，所述同二聚体蛋白的Fc区之一与源自IgG1同种型或该IgG1同种型的Fc区相似或相同，而另一个与源自IgG4同种型(至少具有本文中指示的突变例外)或该IgG4同种型的Fc区相似或相同。在后一种实施方案中，所得的异二聚体蛋白包含IgG1的Fc区和IgG4的Fc区，并且如此就效应器功能的活化而言可以具有令人感兴趣的中间特性。若所述第一和/或所述第二同二聚体蛋白包含消除Asn连接的糖基化的接受位点的突变或者以其它方式操作为改变糖基化特性，则可以获得相似的产物。
在又一个实施方案中，通过例如按US2009317869所述或按van Berkel等(2010)Biotechnol.Bioeng.105:350所述，在同二聚体蛋白，例如抗体产生期间向培养基中加入化合物，或者例如按Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol.Bioeng87:614所述，使用FUT8敲除细胞，对同二聚体蛋白中的一种或两种进行糖改造以减少岩藻糖，因此提高ADCC。可采用
Figure BDA0000528413460000351
等(1999)Nature Biotechnol17:176所述方法，备选地使ADCC最优化。或者，可以在不添加岩藻糖的宿主细胞例如Biowa/KHK中表达第一和/或第二同二聚体蛋白。
在又一个实施方案中，例如按照Natsume等(2009)Cancer Sci.100:2411所述工程化改造或修饰同二聚体蛋白中的一种或两种以增强补体活化。
在又一个实施方案中，已工程化改造同二聚体蛋白中的一种或两种以减少或增加对新生儿Fc受体(FcRn)的结合以便操纵异二聚体蛋白的血清半衰期。
在又一个实施方案中，已将同二聚体起始蛋白中的一种工程化改造或修饰为不结合蛋白A或蛋白G，或蛋白A和蛋白G的组合，从而允许通过使产物穿过蛋白A或蛋白G柱让异二聚体蛋白与所述同二聚体起始蛋白分离。对于其中相对于作为原料的另一同二聚体蛋白使用过量的一种同二聚体蛋白的实施方案这可能特别有用。在此类实施方案中，可能有用的是，工程化改造或修饰会过量使用的同二聚体蛋白的蛋白A或蛋白G结合位点，从而破坏其结合此类树脂的能力。此类修饰包括但不限于CH3域中的修饰，其在WO 2010/151792(通过提及将其收入本文)中披露。如此，本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含WO 2010/151792中描述的CH3域中的一处或多处修饰，其降低或消除IgG对蛋白A的结合。如此，在一个具体的实施方案中，本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含但不限于选自下组的修饰：a)435R和b)435R和436F。在另一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白可以包含下列突变：I253A、H310A、和H435A(AAA)，其还消除对蛋白A的结合。在异二聚体化反应后，异二聚体蛋白然后可通过在蛋白A柱上通过与过剩的未互换同二聚体蛋白分离。若使用蛋白G纯化异二聚体蛋白，则本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含但不限于选自下组的修饰：I253、S254、H433和N434(Sloan,D.,等,Prot.Sci.1999；8:1643-1648；Sauer-Eriksson,E.,等,Structure1995；3:265-278)。在异二聚体化反应后，异二聚体蛋白然后可通过在蛋白G柱上通过与过剩的未互换同二聚体蛋白分离。其它纯化方法包括本文中描述的那些方法中的任一种。因此，在一个实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白可以包含不同轻链，诸如kappa和lambda轻链，或者第一和第二同二聚体蛋白可以是不同同种异型的，诸如本文中描述的。
在又一个实施方案中，同二聚体蛋白之一是(1)Fc区或(2)识别无关表位的全长抗体。
待用作本发明同二聚体起始材料的可变区可以例如通过由Kohler等,Nature256,495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备。可变区也可从噬菌体抗体文库用描述于例如Clackson等,Nature352,624628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222,581597(1991)的技术分离。可变区可从任何合适来源获得。因此，例如，可变区可以自杂交瘤的单克隆抗体获得，所述杂交瘤从自用目标抗原(其例如呈在表面上表达该抗原的细胞或者编码目标抗原的核酸形式)免疫的小鼠获得的鼠脾脏B细胞制备。可变区还可以自杂交瘤的单克隆抗体获得，所述杂交瘤从自经免疫的人或非人哺乳动物诸如大鼠、犬、灵长类等的抗体表达细胞衍生。
第一和/或第二同二聚体蛋白可以是例如嵌合或人源化抗体。在另一个实施方案中，同二聚体起始蛋白中的一种或两种除了任何指定突变以外是人抗体。人单克隆抗体可用转基因或转染色体小鼠如HuMAb小鼠或TC小鼠(其携带编码人重链和轻链全集的全部或部分的微型染色体)产生。HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)，其编码非重排人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列以及灭活内源性μ和κ链基因座的靶定突变(Lonberg,N.等,Nature368,856859(1994))。因此，小鼠展现出降低的小鼠IgM或κ轻链表达，且在响应免疫时，所引入的人重链和轻链转基因进行类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG,κ单克隆抗体((Lonberg,N.等(1994),见上文；综述见Lonberg,N.Handbookof Experimental Pharmacology113,49 101(1994),Lonberg,N.and Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.Vol.13 65 93(1995)及Harding,F.and Lonberg,N.Ann.N.Y.Acad.Sci 764 536 546(1995))。HuMAb小鼠的制备详细记载于Taylor,L.等,Nucleic Acids Research20,6287 6295(1992),Chen,J.等,International Immunology5,647656(1993),Tuaillon等,J.Immunol.152,29122920(1994),Taylor,L.等,International Immunology 6,579 591(1994),Fishwild,D.等,Nature Biotechnology14,845 851(1996)。还可见US 5,545,806,US 5,569,825,US 5,625,126,US 5,633,425,US5,789,650,US 5,877,397,US 5,661,016,US 5,814,318,US 5,874,299,US 5,770,429,US5,545,807,WO 98/24884,WO 94/25585,WO 93/1227,WO 92/22645,WO 92/03918和WO 01/09187。这些转基因小鼠的脾细胞可用于按照熟知的技术产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。
此外，可使用本领域公知的技术通过直接克隆或展示型技术，包括但不限于噬菌体克隆或展示、逆转录病毒展示、核糖体展示、哺乳动物展示及其它技术鉴定本发明的人抗体或者来自其它物种的本发明抗体，并且所得分子可进行另外的成熟，诸如亲和力成熟，因为此类技术在本领域众所周知。
在本发明又一个实施方案中，抗体或其部分如一个更多个CDR源自骆驼科(Camelidae)物种(见WO2010001251)，或者源自软骨鱼物种诸如铰口鲨，或者是重链抗体或域抗体。
在本发明方法的一个实施方案中，步骤a)中的或步骤a)中提供的所述第一和第二同二聚体蛋白是纯化的。用于纯化同二聚体的方法可以是本文中描述的那些方法中的任一种，例如下文描述的那些方法中的任一种。
在一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白与药物、前药或毒素缀合或者含有药物、前药或毒素的接受基团。此类接受基团可以是例如非天然氨基酸。在一个具体的实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白可以与不同化合物缀合，或者含有不同修饰，由此导致生成包含两种化合物或修饰的异二聚体蛋白。
如上所述，同二聚体起始蛋白的第一CH3区与第二CH3区的序列不同，并使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用。
在一个实施方案中，与各种同二聚体相互作用相比异二聚体相互作用的强度增加，是因为CH3修饰，而非因为引入共价键、半胱氨酸残基或荷电残基。
在大多数实施方案中，本发明的产物异二聚体蛋白是高度稳定的，在体外的温和还原条件下或者重要地对人或动物施用后在体内，不经历Fab臂互换。因此，在一个实施方案中，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在描述于实施例13的条件下在0.5mM GSH下不能发生Fab臂互换。
在另一个实施方案中，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在描述于实施例14的条件下在小鼠体内不发生Fab臂互换。
在另一个实施方案中，例如在按实施例30所述确定时，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用强度为两种同二聚体相互作用中的最强相互作用强度的大于2倍，诸如大于3倍，如大于5倍。
在又一个实施方案中，所述所述第一和第二CH3区的序列使得所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用的解离常数低于0.05微摩尔(μM)，如按实施例30描述测定时。
在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列使得如按实施例21描述测定时，两种同二聚体相互作用的解离常数高于0.01μM，诸如高于0.05μM，优选0.01-10μM，诸如0.05-10μM，更优选0.01-5μM，诸如0.05-5μM，甚至更优选0.01-1μM，诸如0.05-1μM，0.01-0.5μM或者0.01-0.1μM。其中同二聚体起始蛋白相对稳定的实施方案可具有更容易制备大量起始蛋白和例如避免聚集或错折叠的优点。
在一些实施方案中，可基于两种在CH3区只含有少数相当保守的不对称突变的同二聚体起始蛋白，利用本发明的方法以高收率获得稳定的异二聚体蛋白。
因此，在一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列在不相同的位置含有氨基酸取代。
氨基酸取代基可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。非天然氨基酸的例子例如公开于Xie J and Schultz P.G.,Current Opinion in Chemical Biology(2005),9:548–554,及Wang Q.等,Chemistry & Biology(2009),16:323-336。
在一个实施方案中，氨基酸是天然氨基酸。
在一个实施方案中，相对于野生型(例如人IgG，诸如人IgG1)CH3区，所述第一同二聚体蛋白在CH3区具有不超过1个氨基酸取代，而第二同二聚体蛋白在CH3区具有不超过1个氨基酸取代。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，370，399，405，407和409，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，370，399，405，407和409，且其中不在相同位置取代所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置366处具有氨基酸取代，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：368，370，399，405，407和409。在一个实施方案中，位置366处的氨基酸选自Arg，Lys，Asn，Gln，Tyr，Glu和Gly。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置368处具有氨基酸取代，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，370，399，405，407和409。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置370处具有氨基酸取代，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，399，405，407和409。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置399处具有氨基酸取代，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，370，405，407和409。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置405处具有氨基酸取代，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，370，399，407和409。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置407处具有氨基酸取代，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，370，399，405和409。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置409处具有氨基酸取代，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，370，399，405和407。
因而，在一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列含有不对称突变，即在两个CH3区的不同位置的突变，如在一个CH3区的405位的突变而另一个CH3区的409位的突变。
在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置409处具有与Lys、Leu或Met不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Phe，Gly，His，Ile，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp和Tyr。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨基酸：Arg，Gly，His，Val和Ile。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨基酸：Arg，His，Ile和Val。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置409处具有Arg。
在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置405处具有与Phe不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe，Arg或Gly不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置405处具有选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp和Tyr。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置405处具有Leu。
在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置366处具有与Lys，Arg，Ser，Thr或Trp不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置366处具有与Phe，Gly，Ile，Lys，Leu，Met，Arg，Ser，Thr，Trp或Tyr不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置366处具有选自下组的氨基酸：Ile和Val。
在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置368处具有与Phe，Leu或Met不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置368处具有与Phe，Leu，Lys或Met不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置368处具有选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val和Trp。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置368处具有选自下组的氨基酸：Asp和Glu。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置409处具有与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366，368，370，399，405和407。
在一个此类实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe不同的氨基酸。在本文的又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe，Arg或Gly不同的氨基酸。在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Phe，Gly，His，Ile，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp和Tyr，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp和Tyr。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨基酸：Arg，Gly，His，Val和Ile，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有Leu。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨基酸：Arg，His，Ile和Val，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有Leu。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有Arg，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有Leu。
在另一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置366处具有与Lys，Arg，Ser，Thr或Trp不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置366处具有与Phe，Gly，Ile，Lys，Leu，Met，Arg，Ser，Thr，Trp或Tyr不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe，Arg或Gly不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置366处具有选自下组的氨基酸：Ile和Val，而第二同二聚体蛋白在位置405处具有选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp和Tyr。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置366处具有选自下组的氨基酸：Ile和Val，而第二同二聚体蛋白在位置405处具有Leu。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处与Phe不同的氨基酸和位置409处的Lys。在本文的又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处与Phe，Arg或Gly不同的氨基酸和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。在本文的又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处与Phe，Arg或Gly不同的氨基酸和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。
在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置350处的Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe、和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置350处的Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe、和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置350处的Ile、位置370处的Thr、位置405处的Leu和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处与Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr不同的氨基酸。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处与Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr不同的氨基酸和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处与Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr不同的氨基酸和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和位置409处的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置366处与Lys，Arg，Ser，Thr或Trp不同的氨基酸。在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而第二同二聚体蛋白具有位置366处与Phe，Gly，Ile，Lys，Leu，Met，Arg，Ser，Thr，Trp或Tyr不同的氨基酸。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而第二同二聚体蛋白具有位置368处与Phe，Leu或Met不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而第二同二聚体蛋白具有位置368处与Phe，Leu，Lys或Met不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Phe，Gly，His，Ile，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp和Tyr，而所述第二同二聚体蛋白具有位置368处选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val和Trp。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处选自下组的氨基酸：Arg，Gly，His，Val和Ile，而所述第二同二聚体蛋白具有位置368处选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val和Trp。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处选自下组的氨基酸：Arg，His，Val和Ile，而所述第二同二聚体蛋白具有位置368处选自下组的氨基酸：Asp和Glu。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置368处选自下组的氨基酸：Asp和Glu。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而第二同二聚体蛋白具有
(i)位置368处与Phe，Leu和Met不同的氨基酸，或
(ii)位置370处的Trp，或
(iii)位置399处与Asp，Cys，Pro，Glu或Gln不同的氨基酸。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处的Arg，Ala，His或Gly，而第二同二聚体蛋白具有
(i)位置368处的Lys，Gln，Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Asn，Arg，Ser，Thr，Val或Trp，或
(ii)位置370处的Trp，或
(iii)位置399处的Ala，Gly，Ile，Leu，Met，Asn，Ser，Thr，Trp，Phe，His，Lys，Arg或Tyr。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处的Arg，而第二同二聚体蛋白具有
(i)位置368处的Asp，Glu，Gly，Asn，Arg，Ser，Thr，Val，或Trp，或
(ii)位置370处的Trp，或
(iii)位置399处的Phe，His，Lys，Arg或Tyr。
除了上文规定的氨基酸取代以外，所述第一和第二同二聚体蛋白可含有相对于野生型(例如人IgG)Fc序列的其它氨基酸取代、缺失或***。
在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区除了包含规定的突变以外，还包含在SEQ ID NO:1(IgG1m(a))列出的序列:
SEQ ID NO:1:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区除了包含规定的突变以外，还包含在SEQ ID NO:2(IgG1m(f))列出的序列：
SEQ ID NO:2:
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区除了包含规定的突变以外，还包含在SEQ ID NO:3(IgG1m(ax))列出的序列：
SEQ ID NO:3:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
通过本发明生产异二聚体蛋白包括使得第一和第二同二聚体蛋白的CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区之间各自的同二聚体相互作用。如上文描述的，此效应特别可以用第一和/或第二同二聚体蛋白的CH3修饰的上文提及的例子获得。然而，预见到包含与本文中描述的突变不同的突变的第一和/或第二同二聚体蛋白也可以在本发明的方法中使用。例如，第一和第二同二聚体蛋白可以是大鼠抗体和小鼠抗体(如Lindhofer等(1995)J Immunol155:219(见上文)描述的)，或者所谓进入隆突-进入-空穴(knob-in-hole)变体抗体(如描述于美国专利5,731,168(见上文))。如此，在本发明的一个实施方案中，本发明的第一和第二同二聚体蛋白可以包含US 5,731,168中描述的隆突-进入-空穴单一或双重修饰。
本发明的方法也可以用于生成如WO2011/143545中描述的双特异性抗体。
可用于本发明的第一和第二同二聚体蛋白的另一个合适的例子包括那些基于第一和第二同二聚体蛋白的CH3区之间的静电相互作用的，如那些披露于WO 2009/089004的。此技术又可以称为静电操纵。
然而，在一些情况中，后一种同二聚体起始蛋白可能更难生成，因为同二聚体CH3-CH3相互作用太弱。因此，可以优选本文中描述的在位置366，368，370，399，405，407和409中的一个或多个具有突变的变体。可以优选本文中描述的在位置350，370，405和409中的一个或多个具有突变的变体。
同二聚体起始蛋白铰链区的序列可变化。但是，如果铰链区不是IgG4样的，优选为IgGl样的，所得异二聚体蛋白在一些情况下可能更稳定。
如此，在一个实施方案中，所述第一或所述第二同二聚体蛋白在(核心)铰链区都不包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。
在又一个实施方案中，所述第一和所述第二同二聚体蛋白两者在(核心)铰链区都包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
在其中第一和所述第二同二聚体蛋白是抗体的许多实施方案中，所述抗体还包含轻链。如上文所解释的，所述轻链可能不同，即序列不同且各自只与一条重链形成功能性抗原结合域。但是，在另一个实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白是重链抗体，其不需要轻链用于抗原结合，见例如Hamers-Casterman(1993)Nature 363:446。
步骤a)
如上文描述的，本发明的方法的步骤a)包括在还原性条件下将所述第一同二聚体蛋白与所述第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原性条件足以容许铰链区中链间二硫键的还原。术语“足以”在“足以容许铰链区中链间二硫键的还原的还原性条件”的上下文中可以特别是根据容许发生Fab-臂交换反应。如此，在一个具体的实施方案中，“足以容许铰链区中链间二硫键的还原的还原性条件”是导致生成超过50％异二聚体蛋白，诸如超过60％异二聚体蛋白，或超过70％异二聚体蛋白，或超过80％异二聚体蛋白，或超过90％异二聚体蛋白，或超过95％异二聚体蛋白，或超过99％异二聚体蛋白，或超过99.5％异二聚体蛋白，诸如100％异二聚体蛋白的条件。异二聚体蛋白的百分比在此上下文中相对于第一同二聚体蛋白、第二同二聚体蛋白和异二聚体蛋白的总量而言。例如，可以通过CIEX测量异二聚体蛋白的量或百分比，如本文中例子中描述的。
在本发明的上下文中，提及“步骤a)的还原性条件”意图指“足以容许铰链区中链间二硫键的还原的还原性条件”。本文中给出了合适条件的例子。铰链区中链间二硫键还原的最低需要可以随同二聚体起始蛋白，特别随铰链区的精确序列而不同。不限于任何理论，铰链区中的半胱氨酸残基可以在还原二硫键后例如与还原剂，诸如2-MEA结合，或者形成链内二硫键或者与未结合的半胱氨酸残基起反应。
步骤a)中的异二聚体蛋白形成基于第一和第二同二聚体蛋白铰链区中二硫键的还原和所述第一和第二同二聚体蛋白Fc区中的交换。
因此，此外，步骤a)的还原性条件可以实现第一和第二同二聚体蛋白的Fc区的交换，由此生成异二聚体蛋白。也可以在步骤a)中发生两个第一或两个第二同二聚体蛋白的Fc区的交换，这会导致第一或第二同二聚体蛋白的形成。第一和第二同二聚体蛋白的CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述CH3区各自的同二聚体相互作用。不限于任何理论，与第一和第二同二聚体蛋白的Fc区的交换相比，异二聚体蛋白的Fc区的交换由此可以是不利的。如此，步骤a)一般可以导致比第一和第二同二聚体蛋白之任一更多的异二聚体蛋白的生成。因此，一般地，本发明的方法导致获得产物，即第一和第二同二聚体蛋白和异二聚体蛋白的总量的超过50％，诸如超过60％，或超过70％，或超过80％，或超过90％，或超过95％，或超过99％是异二聚体蛋白。
可以将第一和第二同二聚体蛋白一起或分开生成，如也在上文描述的。若将第一和第二同二聚体蛋白一起生成，步骤a)与第一和第二同二聚体蛋白的生成可以在同一容器，例如生物反应器中发生。用于生成第一和第二同二聚体蛋白，诸如抗体的方法是本领域技术人员公知的。
步骤a)中的第一同二聚体和第二同二聚体蛋白的浓度不必须是相同的。原则上，就第一和第二同二聚体蛋白的浓度而言没有限制，但是出于大多数实际目的，步骤a)中第一和第二同二聚体蛋白各自的浓度通常可以在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中，诸如在0.5-100mg/mL的范围中，或在1-75mg/mL的范围中，或在1-50mg/mL的范围中。步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白的终浓度可以是至少0.25mg/mL。所述上限主要是因为，浓度高于200mg/mL的蛋白质会是如此粘滞，以致于它们难以处理，可以达到溶解度的限度，或者蛋白质聚集率太高。因此，步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白的总浓度通常可以在0.2mg/mL至200mg/mL的范围中，诸如在0.5-100mg/mL的范围中，或在1-50mg/mL的范围中。
在本发明的一个实施方案中，可以在方法的步骤a)中使用过量的第一或第二同二聚体蛋白。若例如第一同二聚体蛋白对产物安全性或功效具有较强的影响或者比第二同二聚体蛋白更难以与异二聚体蛋白分开，或者反之亦然或者为了简化或易于纯化通过方法生成的异二聚体蛋白，则这可以特别相关。使用过量的一种同二聚体蛋白；即第一或第二同二聚体蛋白可以易于如本文中描述的异二聚体蛋白的后续纯化，因为就不够丰富的蛋白质而言，它会驱动步骤a)中的交换过程更接近完成。如此，随着第一或第二同二聚体蛋白成为限制，其大部分会在步骤a)中使用，并且随后的纯化然后主要会在于将异二聚体蛋白与过量使用的同二聚体蛋白，而不是第一和第二同二聚体蛋白两者分开。因此，在步骤a)中使用过量的第一或第二同二聚体蛋白特别地可以与使用包含促进纯化的差异的第一和第二同二聚体蛋白组合。此类差异包括本文中描述的差异，例如不结合蛋白A或蛋白G、不同的轻链和/或不同的同种异型。使用非等摩尔量的第一和第二同二聚体蛋白可以称为操纵的非等摩尔交换方法(steered non-equimolar exchange process，SNEEP)，并且可以例如如本文中实施例64中描述的那样实施。
如此，在一个实施方案中，步骤a)中的第一与第二同二聚体蛋白的比率可以不同于1:1，例如第一与第二同二聚体蛋白的比率可以具有范围为1:1.03至1:2；诸如范围为1:1.05至1:1.5，或范围为1:1.1至1:1.5，或范围为1:1.1至1:1.4；或范围为1:1.15至1:1.35，或范围为1:1.2至1:1.3的比率。
因此，在一个实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白在步骤a)中可以以过量5％-60％的第一或第二同二聚体蛋白，诸如过量15％-55％的第一或第二同二聚体蛋白，例如过量20％-55％的第一或第二同二聚体蛋白，或过量30-50％的第一或第二同二聚体蛋白，或特别是过量15％-35％的第一或第二同二聚体蛋白，诸如过量20％-30％的第一或第二同二聚体蛋白使用。
特别地，步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白可以存在于溶液中，诸如在缓冲液中。如此，在一个实施方案中，在溶液中，诸如在缓冲液中实施步骤a)。特别地，溶液可以是水溶液。合适的缓冲液可以是支持还原和交换过程，并且未不利影响第一和第二同二聚体蛋白或异二聚体的缓冲液，例如第一和第二同二聚体蛋白和异二聚体蛋白在其中稳定的缓冲液。步骤a)中使用的缓冲液可以与由于先前的加工步骤而存在第一和/或第二同二聚体蛋白的缓冲液相同，以使方法操作最少化。或者，它可以是不同缓冲液以实现标准化条件或最佳的还原。例如，可以已经在步骤a)前纯化第一和/或第二同二聚体蛋白，并且可以已经在纯化过程中改变缓冲液或溶液。
用于步骤a)的合适缓冲液的例子包括但不限于PBS(磷酸盐缓冲盐水)、DPBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)、PBS Braun(实施例44)、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。此类缓冲液的具体例子包括那些在本发明的例子中描述的。如实施例43中也显示的，缓冲液的选择可以影响异二聚体蛋白形成的动力学。如此，在一个具体的实施方案中，可以在本发明的步骤a)中使用Tris或磷酸盐缓冲液。步骤a)中使用的缓冲液可以例如是本文中实施例43中描述的磷酸盐或Tris缓冲液，或者它可以是本文中实施例53中描述的PBS缓冲液。
在一个实施方案中，步骤a)中的缓冲液可以包含范围为1-100mM的缓冲液，诸如1-50mM缓冲液或范围为1-25mM，或范围为5-20mM。
在一个实施方案中，步骤a)中的缓冲液可以包含范围为1-100mM的磷酸盐，诸如1-50mM磷酸盐或范围为1-25mM，或范围为5-20mM。
步骤a)的还原性条件的pH可以在pH 3-10，诸如pH 4-9的范围中，或者在pH 4.5-8.5的范围中。如从实施例43看出的，pH值可以影响异二聚体蛋白形成的动力学。如此，在一个具体的实施方案中，步骤a)中的还原性条件的pH可以在pH 5-8的范围中，诸如pH 6-8，或pH 6.5-7.5，例如pH特别可以为大约5.5，或6，或6.5，或7，或7.5，或7.8或8。
合适缓冲液的例子包括实施例43的那些缓冲液，特别是选自下组的缓冲液：1)1xDulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)：8.1mM磷酸钠(Na2HPO4-7H2O)、1.5mM磷酸钾(KH2PO4)、138mM氯化钠(NaCl)、2.7mM氯化钾(KCl)pH 5.0；2)1x DPBS pH 7.0；3)20mM Tris-HCl,pH7.8。
在一个备选实施方案中，步骤a)中的缓冲液可以选自下组，但不限于：a)10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、137mM NaCl,pH 5.0；b)10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、137mM NaCl,pH 7.0；c)20mM柠檬酸钠，pH 4.9；d)20mM柠檬酸钠，pH 6.0；和e)20mM Tris-HCl,20mM NaCl,pH 7.8。
在一个实施方案中，步骤a)中的还原性条件包括还原剂，例如硫氢基还原剂。术语“还原剂”和“还原试剂”在本发明的上下文中可互换使用。通常，步骤a)中的还原性条件包括添加还原剂，例如硫氢基还原剂。还原剂可以例如选自下组，但不限于：2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸、D-半胱氨酸和β-巯基-乙醇及其化学衍生物，优选选自下组的还原剂:2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、L-半胱氨酸,D-半胱氨酸和二(2-羧乙基)膦。如此，在一个实施方案中，还原剂可以选自下组：2-巯基乙胺(2-MEA)、2-巯基乙胺的化学衍生物(2-MEA)、L-半胱氨酸、和D-半胱氨酸。更特别地，还原剂是2-巯基乙胺(2-MEA)、或L-半胱氨酸、或D-半胱氨酸。还原剂2-巯基乙胺具有其它化学名称，诸如2-MEA，和半胱胺，并且此类术语在本发明的上下文中可互换使用。术语2-MEA也用于描述2-巯基乙胺-HCl，其例如在本发明的实施例中使用。
步骤a)的还原剂、其浓度和温育时间的选择应当使得铰链区中的链间二硫键被还原，并且第一和第二同二聚体蛋白的Fc区的交换是可能的。然而，同时避免使用太严格的条件，诸如太高的还原剂浓度或太长的温育时间可能是有利的，例如因为它可能是不必要的且太严格的条件，可能损害第一和/或第二同二聚体蛋白或异二聚体蛋白。最佳条件可以受到不同参数，诸如温度、pH、溶解氧浓度、同二聚体浓度、缓冲液的选择、痕量金属和螯合剂、和还原剂的选择和浓度影响。
还原剂的合适浓度可以在0.1mM至1M的范围中。若还原剂是2-MEA，则浓度可以通常在10-500mM的范围中，诸如在25-500mM的范围中，或在40-350mM的范围中，或在10-100mM的范围中，例如在25-100mM的范围中，或在10-75mM的范围中，例如在25-75mM的范围中，或在10-60mM的范围中，例如在25-60mM的范围中，或在10-50mM的范围中，例如在25-50mM的范围中，诸如10mM左右，或25mM左右，或30mM左右，或40mM左右，或50mM左右。若还原剂是L-半胱氨酸或D-半胱氨酸，则浓度通常可以在10-500mM的范围中，诸如在10-400mM的范围中，或在10-300mM的范围中，或在10-200mM的范围中，或在20-150mM的范围中，或在20-125mM的范围中，或在25-100mM的范围中，诸如25mM左右，或50mM左右，或75mM左右或100mM左右。
在又一个实施方案中，步骤a)包括温育至少15分钟，诸如至少20分钟或至少30分钟，或至少60分钟或至少90分钟，诸如15分钟至10小时，或15分钟至6小时，或15分钟至5小时，或15分钟至4.5小时，或15分钟至4小时，或30分钟至10小时，或30分钟至6小时，或30分钟至5小时，或30分钟至4.5小时，或320分钟至4小时，或90分钟至10小时，或90分钟至6小时，或90分钟至5小时，或90分钟至4.5小时，或90分钟至4小时，诸如2-5小时，或2-4.5小时，或2-4小时，或3-5小时，或3-4.5小时，或3-4小时，或3.5-5小时，或3.5-4.5小时，例如约2小时，3小时，4小时或5小时。如实施例45和实施例53中显示的，铰链区中链间二硫键的还原，和第一和第二同二聚体蛋白的Fc区交换以生成异二聚体蛋白在给定条件下在4小时内完成。
步骤a)的最佳温度可以取决于还原剂的选择。通常，温度可以在2-45℃的范围中，诸如在2-10℃的范围中，或在15-45℃的范围中，或在20-40℃的范围中，或在20-30℃的范围中，或在30-40℃的范围中，或在22-39℃的范围中，诸如在21-26℃的范围中，或在22-25℃的范围中，诸如25℃左右或37℃左右。在一个实施方案中，步骤a)包括在存在至少25mM选自下组的还原剂的情况中于至少20℃的温度温育至少30分钟：2-巯基乙胺、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。在一个实施方案中，实现受控的Fab-臂交换的还原性条件，即第一和第二同二聚体蛋白的铰链区中的链间二硫键还原及随后第一和第二同二聚体蛋白的Fc区交换就需要的氧化还原电势而言进行描述。三肽谷胱甘肽(GSH)是在细胞中的主要低分子量硫醇，并控制硫醇-二硫化物氧化还原状态，其为体内正常氧化还原信号传导必需。通过维持还原型GSH及其氧化形式GSSG的硫醇-至-二硫化物状态来实现细胞氧化还原平衡的动力学。可测量还原电位的数值，如Rost and Rapoport,Nature201:185(1964)及Aslund等,J.Biol.Chem.272:30780-30786(1997)中的。将每个GSSG氧化两个GSH的化学计量加以考虑的氧化还原电势Eh为对氧化还原状态的定量衡量。通过能斯特方程式计算Eh：(方程1):Eh＝E0+(RT/nF)ln([GSSG(氧化型)]/[GSH(还原型)]2)。E0是在限定pH下氧化还原对的标准电位，R是气体常数，T是绝对温度，F是法拉第常数，n是转移的电子数。GSH/GSSG对的Eh的体内估测值在-260至-200mV的范围中(Aw,T.,News Physiol.Sci.18:201-204(2003))。因此终末分化的细胞维持-200mV等级的Eh，而活跃增殖的细胞维持约-260mV的更为还原的Eh。
DTT的标准氧化还原电势是-330mV(Cleland等Biochemistry 3:480-482(1964))。TCEP已显示在溶液中还原DTT，因此具有比DTT更负的氧化还原电位。然而，精确数值尚未报道。因此可以根据需要的氧化还原电势Eh描述适合于本发明的步骤a)的还原条件，所述需要的氧化还原电势Eh最好低于在体内在正常血浆条件下获得的数值，并且高于还原位于铰链区中且参与链间二硫键形成或参与轻链和重链之间的二硫键的抗体二硫键外部的抗体二硫键的氧化还原电势。
因此，在一个或又一个实施方案中，步骤a)在具有范围低于-50mV，诸如低于-150mV，优选-150和-600mV之间，诸如-200和-500mV之间，更优选-250和-450mV之间，诸如-250和-400mV之间，甚至更优选-350至-450mV之间的氧化还原电势的还原条件下进行。
在一个或又一个实施方案中，步骤a)包括在至少25mM2-巯基乙胺存在下或者至少0.5mM二硫苏糖醇存在下或至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20℃温度温育至少30分钟，例如90分钟。
在一个或又一个实施方案中，步骤a)包括在至少25mM2-巯基乙胺存在下或者至少0.5mM二硫苏糖醇存在下或至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20℃温度于5至8的pH，诸如pH 7.0或pH 7.4温育至少30分钟，例如90分钟。
在另一个或又一个实施方案中，步骤a)包括在至少25mM2-巯基乙胺存在下，或在至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20℃温度温育至少30分钟，例如90分钟。可以于6至8的pH，诸如pH 7-8实施温育。
在又一个实施方案中，步骤a)包括在25-75mM2-巯基乙胺存在下，或在25-100mML-或D-半胱氨酸存在下在20-30℃温度温育4-6小时。可以于6至8的pH，诸如pH 7-8实施温育。
在甚至又一个实施方案中，步骤a)包括在50mM2-巯基乙胺存在下，或在25-100mML-或D-半胱氨酸存在下在25℃温度温育5小时。可以于6至8的pH，诸如pH 7-8实施温育。
在一个或又一个实施方案中，步骤a)包括添加金属螯合剂，诸如EDTA、EGTA或柠檬酸。本发明的发明人已经显示了在本发明的步骤a)中使用2-MEA作为还原剂时，步骤a)中添加或包含EDTA降低此步骤中的2-MEA自身氧化速率，如通过较低的氧化率观察到的(参见例如实施例47和54)。不限于任何理论，这可以是由于步骤a)中存在的金属离子被EDTA螯合，然后，这可以降低通过金属离子进行的2-MEA自身氧化。一般地，还原剂的自身氧化消耗还原剂，导致有效降低的还原剂浓度。如此，通过添加金属螯合剂，可以提高铰链区中链间二硫键的还原速率和/或为了还原铰链区中的链间二硫键可以需要更少的还原剂。金属离子可以例如存在于反应中使用的溶液或缓冲液中和/或它们可以从用于反应的设备中浸出。
可以在步骤a)中添加或包括的合适金属螯合剂的例子包括但不限于EDTA、EGTA和柠檬酸。
金属螯合剂的浓度取决于步骤a)中组合物中的金属离子浓度，其可以例如受到步骤a)中使用的组分影响。然而，EDTA或EGTA的相关浓度可以在0.01mM至10mM的范围中，诸如在0.1mM至10mM的范围中，诸如在0.5mM至5mM的范围中，或在1mM至5mM的范围中，诸如1mM左右，或2mM左右，或3mM左右，或4mM左右或5mM左右。
步骤a)中的氧(例如溶解氧)浓度也可以影响链间二硫键的还原和/或第一和第二同二聚体蛋白的Fc区的交换。如此，在又一个实施方案中，步骤a)中的还原性条件包括降低步骤a)中存在的氧(例如溶解氧)的量，例如溶解于步骤a)的组合物中的氧量。
步骤a)中的组合物中的氧存在或氧(例如溶解氧或氧化剂)量可以受到多种因素影响，诸如不同化合物的存在或可以降低或提高氧气从空气转移到溶液中的机械效应。如此，在又一个实施方案中，本发明的步骤a)包括限制混合速率，限制氧喷射，使氧气至顶部空间的转移最小化或那些的任何组合。在一个实施方案中，混合率可以例如是50-200rpm，诸如75-150rpm，或75-125rpm，例如100rpm左右。顶部空间充气的速率可以例如在5-25mL/min的范围中，例如在10-20mL/min的范围中，例如15mL/min左右。
可以用以下等式2测定传氧速率:
OTR＝kla x ln(DO*-DO)x s,
其中：
OTR＝传氧速率(mM/hr)
kla＝传氧系数(1/小时)
DO*＝平衡DO浓度(氮气＝0％，空气＝100％，氮气＝500％)
DO＝实际溶解氧浓度
s＝氧溶解度(约0.2mM/100％)
氧传递范围的最佳范围取决于还原剂的类型和浓度。
在实施例57中，使用氮气作为气体，并且在交换反应前使***DO恢复至0％。用DO*＝0和DO＝0依照等式2，OTR＝0mM/hr。此条件导致合适的交换。
在实施例53中，在气相中使用空气，因此DO*＝100％。实施例53(以100RPM搅动)的kla是0.76/hr。***的DO从100％的饱和数值下降到0.2％的稳态数值。那么，依照等式2的此条件的传氧速率是0.15mM/hr。此条件导致合适的交换。
在实施例55中，在气相中使用空气，因此DO*＝100％。实施例55(以400RPM搅动)的kla是4.0/hr。***的DO从100％的饱和数值下降到3％的稳态数值。那么，依照等式2的此条件的传氧速率是0.78mM/hr。此条件导致不完全还原和异二聚体产物的低转化。
这些结果证明了在使用50mM2-MEA作为还原剂时，0-0.15mM/hr的OTR提供合适的结果，而0.78mM/hr或更高的OTR提供亚最佳的结果。
若使用空气传递氧，则步骤a)中的传氧系数(kla)可以小于例如3/小时，诸如小于2/小时，或小于1/小时，或小于0.90/小时，或小于0.80/小时，例如小于0.76/小时，诸如0.76/小时左右。
限制或清除步骤a)中的组合物中溶解的氧量的另一种方式包括添加惰性气体，诸如氮气至步骤a)以从组合物中置换氧。
如此，在又一个实施方案中，步骤a)中的还原性条件包括用惰性气体，例如氮气置换、消除或替换步骤a)中的组合物中溶解的氧。这可以例如经由用氮气进行顶部空间充气和/或用足够的搅拌喷射实现。
可以通过监测氧化还原电势和/或通过监测溶解氧的浓度追踪第一和第二同二聚体蛋白的铰链区中的二硫键的还原进展。用于此类监测的手段是本领域技术人员已知的，并且包括例如不同类型的探头，诸如本文中描述或使用的任何探头。
在一个备选实施方案中，可以通过使第一和第二异二聚体蛋白在包含还原剂的材料上通过实施步骤a)。此类方法的例子可以是包含还原剂的柱，例如包含例如本文中描述的还原剂的固定化反应剂柱，诸如实施例61中描述的柱。
然后可以从所述材料获得异二聚体蛋白，例如将其从柱中洗脱。通过此方法获得的异二聚体蛋白可以不包含或仅包含痕量的还原剂，因为这与材料(例如在柱中)结合。温度、溶解氧的浓度、第一和第二同二聚体蛋白的浓度、氧化还原电势和pH可以与上文描述的那些相似。
步骤b)
本发明的方法进一步包括下列步骤：
b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，该氧化条件足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键。
在一个具体的实施方案中，本发明的步骤b)包括：
b)使至少10mL从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键。
步骤a)的还原性条件引起第一和第二同二聚体蛋白的铰链区中链间二硫键的还原。除了铰链区中的链间二硫键外，第一和/或第二同二聚体蛋白中也可以有其它二硫键，诸如抗体的重链和轻链之间的二硫键或链内二硫键。步骤a)的还原性条件还可以引起第一和/或第二同二聚体蛋白中此类其它链间或链内二硫键的还原。
在步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白的Fc区交换后，若再形成异二聚体蛋白的第一和第二Fc区之间的铰链区中的二硫键及任选地其它二硫键，则这可以是有利的。由此导致生成异二聚体蛋白，其至少包含铰链区中的二硫键，以及任选地还有在与第一和/或第二同二聚体蛋白中的位置相似的位置处的其它二硫键。此类二硫键的存在提高异二聚体蛋白的稳定性。
实施例41显示了在依照本发明的步骤a)生成的双特异性抗体的缓冲液更换后，仅将双特异性抗体部分再氧化。因此，实施例41指示所述实施例中的步骤a)的条件对于双特异性抗体的铰链区中的二硫键再氧化不是充分的。此外，实施例48和实施例57也显示了在通过添加氮气将其置换来降低溶解氧浓度时，抗体中半胱氨酸至二硫键的再氧化受到抑制。为了将半胱氨酸氧化成二硫键，两个半胱氨酸应当彼此足够紧密接近。本发明的方法一般导致异二聚体蛋白的天然再装配。如此，例如通过本方法生成的双特异性抗体中的半胱氨酸一般可以定位为在第一和第二抗体(第一和第二同二聚体蛋白)中，使得抗体中存在的二硫键也在双特异性抗体中形成。在本发明的上下文中，提及“步骤b)的氧化条件”意图指“足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件”。在又一个实施方案中，步骤b)中的氧化条件足以形成异二聚体蛋白中的所有相关二硫键；例如链间和链内二硫键两者。
在本发明的上下文中，足以容许将异二聚体蛋白中半胱氨酸氧化为链间二硫键的条件意指形成至少80％、诸如至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或100％链间二硫键。如本文中别处描述的，异二聚体蛋白可以包含能够形成链间和链内二硫键两者的半胱氨酸残基。将半胱氨酸氧化成二硫键的相关时间范围取决于例如制造条件，并且通常可以在48小时内，诸如24小时内，或15小时内，或10小时内，或5小时内，或4小时内，或3小时内，或2小时内。
出于产业生产的目的，在没有不利影响产物的情况中提高生产速度一般认为是一个优点。实施例55和56指示提高氧量提高二硫键再氧化的速率。这对于较大体积的异二聚体蛋白的生产可以是特别相关的。如此，本发明的方法包括步骤b)使至少10mL从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，该氧化条件足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键。
在又一个实施方案中，步骤b)中使用的从步骤a)获得的组合物的体积可以是至少15mL、诸如至少20mL、或至少25mL、或至少30mL、或至少40mL、或至少50mL、或至少75mL、或至少100mL、或至少125mL、或至少150mL、或至少200mL、或至少250mL、或至少300mL、或至少350mL、或至少400mL、或至少450mL、或至少500mL、或至少550mL、或至少600mL、或至少650mL、或至少700mL、或至少750mL、或至少800mL、或至少850mL、或至少900mL、或至少950mL、或至少1L、或至少2L、或至少3L、或至少4L、或至少5L、或至少10L。原则上，没有上限，若过程以连续过程运行，则尤其没有。然而，对于许多过程条件，适合于此类生产的反应器容器可以为1L至10,000L的大小。
在一个或又一个实施方案中，从步骤a)获得的组合物中的异二聚体蛋白的浓度(例如其用于步骤b))可以是至少0.1mg/mL、诸如至少0.2mg/mL、或至少0.3mg/mL、或至少0.4mg/mL、或至少0.5mg/mL、或至少0.75mg/mL、或至少1mg/mL、或至少1.5mg/mL、或至少2mg/mL、或至少3mg/mL、或至少4mg/mL、或至少5mg/mL、或至少10mg/mL、或至少15mg/mL、或至少16mg/mL、或至少20mg/mL。异二聚体蛋白浓度的上限可以是100-200mg/mL，诸如100mg/mL左右，或150mg/mL左右，或200mg/mL左右。因此，在一个实施方案中，从步骤a)获得的组合物中的异二聚体蛋白浓度可以在0.1-200g/L的范围中，诸如在1-100g/L的范围中。本发明不限于异二聚体蛋白的特定浓度，然而，在蛋白质的浓度(无论它是第一或第二同二聚体蛋白还是异二聚体蛋白)太高时，组合物可能变得不稳定或者太粘，使得难以一起运行和/或可形成蛋白质聚集体。比较而言，太低的异二聚体蛋白浓度可能不是经济上可行的。
获得足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件必需的氧量(例如通过将其在步骤b)中供应)取决于不同因素。此类因素包括例如从步骤a)获得的组合物的体积、异二聚体蛋白的浓度、需要氧化的二硫键数目和从步骤a)获得的组合物中的氧浓度，其可以取决于例如缓冲液中的氧溶解度，该氧溶解度可以取决于特定的溶液或缓冲液、pH、离子强度、温度、压力和周围氧浓度。使从步骤a)获得的组合物经受本发明的步骤b)的氧化条件可以提高将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的速率。一般地，步骤b)中对于将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键足够或必需的氧量可以是或者大约是每摩尔二硫键0.5摩尔氧气(O2)，例如在每摩尔二硫键0.25-0.75摩尔氧气(O2)，诸如每摩尔二硫键0.3-0.7摩尔氧气(O2)的范围中。这对应于每2摩尔半胱氨酸1摩尔氧气(O2)，诸如在每2摩尔半胱氨酸0.6-1.4摩尔氧气(O2)的范围中。如此，在一个实施方案中，步骤b)中的“氧化条件”包括每摩尔二硫键0.3-0.7摩尔氧气，诸如每摩尔二硫键存在0.5摩尔氧气，或在每2摩尔半胱氨酸0.6-1.4摩尔氧气的范围中，例如每2摩尔半胱氨酸1摩尔氧气。
因此，获得氧气与二硫键或半胱氨酸的此类比率的相关氧浓度取决于从步骤a)获得的组合物中的异二聚体蛋白的浓度。
在一个实施方案中，步骤b)中的氧化条件可以包括至少0.05mM氧气、诸如至少0.075mM氧气、或至少0.1mM氧气、或至少0.125mM氧气、或至少0.15mM氧气、或至少0.175mM氧气、或至少0.2mM氧气的浓度。
氧气的分子溶解度在海水中于1atm，25℃是0.206mM。然而，在本方法的条件(例如缓冲液，温度等)，从步骤a)获得的组合物中的氧浓度可以小于0.2mM。
由于氧溶解度依赖于气相中氧气的部分压力，增加的氧传递可以通过提高***中的空气压力获得。例如，压力升高2倍导致平衡溶解氧浓度的2倍增加和增加的传氧速率。或者，气相中的氧气的部分压力可以通过使用氧气代替空气提高。由于空气含有约21％氧气，纯氧气的使用提供高约5倍的平衡溶解氧浓度和增加的传氧速率。可以组合压力和纯氧气以进一步提高氧溶解度和传递率。
在一个实施方案中，步骤b)中的氧化条件包括用氧气饱和从步骤a)获得的组合物。
从步骤a)获得的组合物一般包含少量的氧，以确保铰链区中的链间二硫键的正确还原。如此，可能有必要在本发明的方法的步骤b)中供应氧气。
在一个实施方案中，如上文描述的，第一和第二同二聚体蛋白可以存在于溶液，诸如缓冲液中。如此，在一个具体的实施方案中，从步骤a)获得的组合物可以是溶液，例如缓冲液。在此实施方案中，它是溶解于溶液中的氧量，即溶解氧浓度，其对于异二聚体蛋白中半胱氨酸的氧化是重要的。
如此，在一个实施方案中，“步骤b)的氧化条件”指控制溶解氧的水平，其可以例如包括增加从步骤a)获得的组合物中的溶解氧的量或浓度。
用于获得或产生步骤b)的氧化条件的不同手段可以在本发明的方法中使用，并且包括但不限于本文中描述的那些手段。
在一个实施方案中，本发明的步骤b)的氧化条件包括添加氧气。术语“添加氧气”在本发明的上下文中应当理解为在从步骤a)获得的组合物中提高氧量，例如溶解氧，使得它足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键。添加氧气的手段或方法包括但不限于机械手段、将从步骤a)获得的组合的溶液或缓冲液改变为包含较高氧量的溶液或缓冲液，诸如用于本文中描述的渗滤的缓冲液之一，用包含足够氧的溶液或缓冲液稀释从步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液，添加能够生成氧气的化合物，提高压力或者通过直接添加或包括氧，例如氧气。也可以使用此类方法的组合。
可以例如连续测量步骤b)中氧的量或浓度，从而确保步骤b)期间的所有时间有足够的氧。用于测量氧的方法或设备是本领域技术人员公知的，并且可以例如包括本文中描述的那些方法或设备中的任一种，诸如实施例44中描述的探头。
例如通过用氧气或空气喷射或提高压力对步骤b)添加氧气。另一种方法可以是提高提高氧气从环境(例如空气)的传递。这可以例如通过机械手段，例如通过搅拌、搅动、提高压力或产生流进行。例如，若步骤b)中的组合物存在于容器(诸如器皿)中，例如，可以将氧气从例如顶部空间传递到步骤b)的组合物中，或者可以应用用于搅动或搅拌步骤b)的组合物的手段。通过控制搅动或搅拌步骤b)中的组合物的速率，可以控制自环境中的传氧率，即搅动或搅拌速率或流动越高，可以对从步骤a)获得的组合物中传递越多的氧。也可以应用用于提高压力的手段。对步骤b)添加氧气也可以通过不同手段的组合实施，例如，搅动和/或搅拌可以与喷射和/或用氧气或空气提高步骤b)中的组合物的压力组合。
在另一个实施方案中，本发明的步骤b)中的氧化条件包括氧化剂。优选地，氧化剂是能够确保异二聚体蛋白中链间二硫键的氧化，但是同时避免氧化异二聚体蛋白中已知对氧化敏感的其它部分，诸如如甲硫氨酸和色氨酸等氨基酸的氧化剂。合适的氧化剂的例子是脱氢抗坏血酸(dhAA)。若使用dhAA氧化步骤a)中存在的还原剂，则dhAA的典型浓度可以在还原剂浓度的1-2倍的范围中，例如在50-100mM的范围中。若在添加dhAA前除去步骤a)中存在的还原剂，则足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化剂量可以较低，诸如在0.01-1mM，例如0.1-1mM的范围中。若在本发明的步骤b)中添加氧化剂，诸如dhAA，则随后可以使用标准过滤和/或层析技术将其除去。
可以组合使用用于在步骤b)中添加或增加氧的不同手段或方法。
例如，不依赖于例如如何通过用氧气喷射、搅拌、搅动或产生流添加氧气，在一个实施方案中，它可以与添加氧化剂组合。
在本发明的一个实施方案中，步骤a)的还原性条件包含还原剂，其也可以存在于从步骤a)获得的组合物中，因此经受步骤b)的氧化条件。步骤b)中的还原剂存在对于步骤b)的氧化条件可以是有害的。如此，在一个实施方案中，可以将异二聚体蛋白与还原剂分开。如下文描述的，本发明的发明人已经发现了用于将还原剂与异二聚体蛋白分开的某些方法导致或产生足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件。
根据方法，除去还原剂或将异二聚体蛋白与还原剂分开可能不一定足以容许将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键，在步骤a)中生成大量异二聚体蛋白，即高浓度和/或高体积的异二聚体蛋白时，尤其不行(参见例如实施例41、52和53)。然而，出于其它原因可能有利的是，将异二聚体蛋白与还原剂分开，并且因此，本发明的方法可以进一步包括将异二聚体蛋白与还原剂分开的步骤。下文进一步描述将还原剂与异二聚体蛋白分开的实施方案。
用于减少从步骤a)获得的组合物中的还原剂量的另一种方法是增加所述组合物的体积，由此降低从步骤a)获得的组合物中还原剂的浓度。因此，在又一个实施方案中，可以例如通过添加与从步骤a)获得的组合物的缓冲液相同的缓冲液(只是它不含步骤a)的还原剂)或者通过添加与从步骤a)获得的组合物的缓冲液不同的缓冲剂(它不含步骤a)的还原剂)增加从步骤a)获得的组合物的体积。增加从步骤a)获得的组合物的体积可以与本文中描述的其它实施方案(包括用于分开还原剂和异二聚体蛋白的方法)组合使用。
如上文描述的那样对步骤b)中的组合物添加氧气和/或氧化剂可以足以容许将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。此外，若步骤a)包括还原剂，则这些条件也足以氧化还原剂，从而其不能进一步还原异二聚体蛋白的链间二硫键。如此，在又一个实施方案中，步骤b)的氧化条件足以容许氧化步骤a)的还原剂。例如，若在步骤a)中使用2-MEA作为还原剂，则步骤b)的氧化条件可以使得2-MEA自身氧化，从而它不能还原任何二硫键(参见例如实施例59)。不依赖于还原剂被氧化与否，随后将异二聚体蛋白与还原剂分开可以是相关的。因此，在又一个实施方案中，本发明的方法还可以包括分开异二聚体蛋白和还原剂。用于将异二聚体蛋白与还原剂分开的方法包括本文(例如下文)中描述的那些方法中的任一种。异二聚体蛋白和还原剂的分开可以是步骤b)的一部分或者可以是一个分开的步骤。
如此，在一个实施方案中，步骤b)包括添加氧气或氧化剂，任选地随后分开异二聚体蛋白与还原剂。也可以在步骤b)后以分开的步骤实施分开异二聚体蛋白与还原剂。
在步骤b)中添加氧气和/或氧化剂也可以导致还原剂的氧化，而没有将异二聚体蛋白中的半胱氨酸完全氧化成二硫键。在此情况中，可以将异二聚体蛋白与还原剂分开，然后随后可以将异二聚体蛋白的半胱氨酸氧化成链间二硫键，这通过例如如上文描述的，添加氧气和/或氧化剂进行。如此，在一个实施方案中，步骤b)可以包括使从步骤a)获得的组合物经受足以氧化还原剂的氧化条件，分开异二聚体蛋白与还原剂，并使异二聚体蛋白经受足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的条件。例如，可以与上文所述类似地通过添加氧气和/或氧化剂进行或实施还原剂和异二聚体蛋白中的半胱氨酸至链间二硫键的氧化。然而，就用于还原剂氧化和异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键的需要的氧量、温育时间等而言，可以有一些差异。用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法包括但不限于下文描述的任何方法，例如透析、沉淀、层析或过滤。因此，在一个实施方案中，步骤b)可以包括使从步骤a)获得的组合物经受层析，例如柱层析，或过滤，例如渗滤，诸如切向流过滤或正常流过滤。用于实施层析或过滤的方法包括但不限于下文描述的任何方法。
在另一个实施方案中，步骤b)的氧化条件可以使得与分开异二聚体蛋白和还原剂同时将异二聚体蛋白的半胱氨酸氧化成链间二硫键。在此情况中，本发明的步骤b)可以包括与分开异二聚体蛋白和还原剂同时添加氧气和/或氧化剂，如上文描述的。因此，在一个实施方案中，用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法或条件可以导致或容许将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。如此，在一个实施方案中，步骤b)可以包括分开异二聚体蛋白和还原剂。用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法包括但不限于下文描述的任何方法，例如透析、沉淀、层析或过滤。因此，在一个实施方案中，步骤b)可以包括使从步骤a)获得的组合物经受层析，例如柱层析，或过滤，例如渗滤，诸如切向流过滤或正常流过滤。用于实施层析或过滤的方法包括但不限于下文描述的任何方法。
在又一个实施方案中，本发明的方法可以包括分开异二聚体蛋白与还原剂，随后使异二聚体蛋白经受足以容许在异二聚体蛋白中将半胱氨酸氧化成链间二硫键的氧化条件。在此实施方案中，分开异二聚体蛋白与还原剂的步骤可以视为步骤b)前的分开的步骤或者其可以视为步骤b)的一部分。用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法包括但不限于下文描述的任何方法，例如透析、沉淀、层析或过滤。可以如上文描述的那样获得足以容许在异二聚体蛋白中将半胱氨酸氧化成链间二硫键的氧化条件，通过例如对包含异二聚体蛋白的组合物添加氧气和/或氧化剂进行。
用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法在原则上可以是任何导致或能够分开两者而不损害异二聚体蛋白的方法。此类方法包括但不限于透析、沉淀、层析或过滤。分开异二聚体蛋白和还原剂可以作为连续过程实施或者其可以作为分批过程实施。
包含异二聚体蛋白的从步骤a)获得的组合物可以特别是溶液，诸如缓冲液。可以通过用没有还原剂的另一种缓冲液或溶液更换从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液完成异二聚体蛋白与还原剂的分开。除非存在还原剂，可以将缓冲液或溶液更换为与从步骤a)获得的组合物相同的缓冲液或溶液，或者可以将其更换为另一种缓冲液或溶液，诸如适合于随后的步骤或异二聚体蛋白的最终配制剂的缓冲液或溶液。在一个实施方案中，将从步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液更换的溶液或缓冲液也可以包含氧，例如溶解氧，或氧化剂。因此，在步骤b)中更换或稀释从步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液可以产生“足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件”。如上文描述的，步骤b)的氧化条件可以通过不同手段获得；例如添加氧气或氧化剂，通过除去还原剂(分开异二聚体蛋白和还原剂)、机械手段，例如层析或过滤方法，和/或通过将从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液更换成包含较高的氧量或氧化剂的缓冲液或溶液。“较高的氧量”在此上下文中应当理解为与从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液中存在的氧量相比。从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液的更换可以例如通过层析或过滤实施。如此，在一个实施方案中，本发明的方法包括通过层析或过滤更换从步骤a)获得的组合物的溶液(例如缓冲液)的步骤。
从步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液的更换可以例如用至少3(三)个体积的没有还原剂的缓冲液或溶液完成。原则上，可以更换的体积数没有上限，但是对于大多数实际目的，可以更换3-12个体积的缓冲液或溶液，诸如范围为4-11个体积，或范围为4-10个体积，或范围为5-10个体积，例如5，6，7，8，9或10个体积可以足以充分降低还原剂的浓度，或者从从步骤a)获得的组合物除去还原剂。
通过层析或过滤分开异二聚体蛋白和还原剂可以牵涉溶液或缓冲液的更换，即如上文描述的缓冲液或溶液更换。
在一个具体的实施方案中，用于分开异二聚体蛋白和还原剂的层析方法的合适例子可以是基于结合和洗脱的层析方法。术语“结合和洗脱”基于还原剂或异二聚体蛋白对层析材料的结合，而其它组分不结合。可以在流过和清洗步骤中收集不结合层析材料的组分，而可以在改变缓冲液条件后分开收集结合的材料，从而从柱中洗脱组分。存在不同层析方法，并且最合适的方法取决于还原剂的选择和异二聚体蛋白。合适的例子包括但不限于蛋白A和蛋白G层析(或亲和层析的其它方式)、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和层析、kappa或lambda选择、阳离子交换层析、混合模式层析(例如羟磷灰石)、离子交换、疏水性相互作用、固定化金属亲和层析和亲硫性吸附层析。
在一个实施方案中，层析可以是柱层析。如上文描述的，层析可以牵涉用没有还原剂的另一种缓冲液或溶液更换从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液。这可以例如牵涉范围3-12个体积的缓冲液或溶液更换。层析方法经常以分批过程实施，如此若通过层析分开异二聚体蛋白和还原剂，则它在一个实施方案中可以以分批过程实施。
如上文描述的，也可以通过过滤分开异二聚体蛋白和还原剂。过滤方法的合适例子是渗滤。本发明的发明人已经发现了渗滤的条件可以足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键，即使在使用大体积的从步骤a)获得的组合物时(参见例如实施例41)。如此，可以与将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键同时进行通过渗滤分开异二聚体蛋白和还原剂。如此，在一个具体的实施方案中，本发明的步骤b)可以包括从步骤a)获得的组合物的渗滤。渗滤可以牵涉至少三个体积的缓冲液或溶液更换，如上文描述的。渗滤的方法包括切向流过滤(TFF)和正常流过滤(NFF)，两者都可以用于本发明的方法。TFF和NFF两者可以作为连续过程或作为分批过程实施。如此，在一个实施方案中，本发明的步骤b)包括使从步骤a)获得的组合物经受下列方法之一：连续TFF、分批TFF、连续NFF或分批NFF。
不同的渗滤方法是本领域技术人员已知的。出于本发明的目的，例如可以用具有范围为10-50kDa，例如20-40kDa，诸如30kDa左右的截留值的膜实施渗滤。膜可以例如由材料诸如聚醚砜(PES)、改良型聚醚砜(mPES)、再生纤维素(RC)、三乙酸纤维素(CTA)、亲水化聚偏氟乙烯(PVDF)、硝酸纤维素或尼龙制成。膜的构造可以例如是中空纤维、平片材或螺旋缠绕的(spirally wound)。
在一个实施方案中，可以使用中空筒，诸如纤维筒进行渗滤。中空筒的表面积影响渗滤率，即表面积越大，渗滤率越高。渗滤率可以例如以L/小时测量。表面积可以在0.05-1m2的范围中，例如在0.05-0.5m2的范围中，诸如0.1m2左右，或0.16m2左右或0.4m2左右。
筒入口压力可以在10-40psig(70-280kPa)的范围中，优选在20-30psig(140-210kPa)的范围中。
术语“psig”指高于大气压的每平方英寸的磅数，并且与单位Pa(帕斯卡)的关联是101,325Pa＝14.7psig。
术语“PSI”指每平方英寸的磅数。
可以将渗滤实施一段时间，该时间段对于实施相关数目的体积的缓冲液/溶液更换是必需的。合适的时间段取决于例如膜的表面积、膜的类型、异二聚体蛋白的浓度、***压力、循环速率、滤器筒的几何学、温度、溶液的粘性、要过滤的体积、渗滤过程中由溶液引起的滤器污垢量。通常，可以将渗滤实施30分钟至20小时。
在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过中空纤维筒实施所述渗滤，直到发生了1至7个，诸如3至7个，或5至7个或7个体积的缓冲液更换，所述中空纤维筒包含范围为10-50kDa的截留值，且具有范围为0.05-1m2的表面积，具有范围为70-280kPa的筒入口压力。
在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过30kDa改良型聚醚砜中空纤维筒实施所述渗滤，直至发生了5至7，诸如七(7)个体积的缓冲液更换，所述30kDa改良型聚醚砜中空纤维筒具有0.1m2的表面积及25PSI(170kPa)的筒入口压力，导致25mL/min的渗透率。
在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过30kDa改良型聚醚砜中空纤维筒实施所述渗滤，直至发生了5至7，诸如七(7)个体积的缓冲液更换，所述30kDa改良型聚醚砜中空纤维筒具有0.4m2的表面积及25PSI(170kPa)的筒入口压力，导致100mL/min的渗透率。
在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过30kDa改良型聚醚砜中空纤维筒实施所述渗滤，直至发生了5至7，诸如七(7)个体积的缓冲液更换，所述30kDa改良型聚醚砜中空纤维筒具有0.16m2的表面积及25PSI(170kPa)的筒入口压力，导致100mL/min的渗透率。
以连续过程实施过滤一般包括以与除去渗透物相同的速率对***添加缓冲液或溶液，由此使***中溶液/缓冲液的量保持恒定。如此，在本发明的上下文中，这会意味着在步骤b)中，以与除去渗透物相同的速率对从步骤a)获得的组合物添加缓冲液/溶液。可以从保留物中收集异二聚体蛋白。另一方面，在本发明的方法中以分批过程实施层析或过滤通常可以牵涉浓缩从步骤a)获得的组合物中存在的异二聚体蛋白，而除去从步骤a)获得的组合物的溶液。或者，可以将包含异二聚体蛋白的从步骤a)获得的组合物稀释，随后通过层析或过滤浓缩。若将该过程实施超过一次，则随后可以将浓缩的异二聚体蛋白在缓冲液或溶液中再次稀释，之后重复层析或过滤步骤。
在一个实施方案中，可以在分开还原剂和异二聚体蛋白前稀释从步骤a)获得的组合物。
在一个实施方案中，可以将通过层析或过滤，例如渗滤分开异二聚体蛋白和还原剂实施一次。
在一些实施方案中，可以将通过层析或过滤分开异二聚体蛋白和还原剂重复两次或更多次，例如以之间的不同步骤。如此，在一个实施方案中，本发明的方法可以包括步骤I)-III)。在一个具体的实施方案中，本发明的步骤b)可以包括步骤I)-III)：
I)分开从步骤a)获得的组合物的异二聚体蛋白和还原剂，
II)温育包含异二聚体蛋白的自步骤I)获得的组合物，
III)分开自步骤II)获得的组合物的异二聚体蛋白和还原剂。
异二聚体蛋白和还原剂的分开在步骤I)中可能不是完全的，从而自步骤I)获得的包含异二聚体蛋白的组合物仍然可以包含还原剂。
可以通过本文中描述(诸如上文描述)的方法实施分开步骤I)中的异二聚体蛋白和还原剂。特别地，它可以通过渗滤实施。上文描述的层析和过滤的条件也适用于步骤I)和III)。可以将步骤II)中温育自步骤I)获得的异二聚体蛋白于范围为10-45℃，例如范围为15-40℃，或范围为15-35℃，或范围为20-40℃，或范围为20-35℃的温度进行例如1小时至10天的时段，或1小时至5天，或1小时至3天，或1小时至48小时，诸如5-24小时，或8-18小时的时段。在又一个实施方案中，可以将步骤II)中温育自步骤I)获得的异二聚体蛋白于范围为15-40℃的温度实施1至24小时的时段。
在又一个实施方案中，步骤I)可以包括从步骤a)获得的组合物的渗滤。如此，在又一个实施方案中，步骤I)、II)和III)可以包括：
I)渗滤从步骤a)获得的组合物
II)温育自步骤I)获得的渗余物
III)渗滤自步骤II)获得的组合物。
在又一个实施方案中，步骤I)和/或III)中的渗滤可以包括缓冲液更换，诸如范围为3-12个体积的缓冲液更换。
在甚至又一个实施方案中，步骤II)包括在范围为15-35℃的温度温育12-48小时的时段。
如实施例45中显示的，对于一些条件(例如取决于步骤a)的还原性条件)可以重复异二聚体蛋白和还原剂的分开，这有助于确保异二聚体蛋白中的半胱氨酸完全再氧化成链间二硫键和/或使包含异二聚体蛋白的组合物中的还原剂量进一步最小化。
此外，本发明的发明人已经发现了EDTA(一种金属螯合剂)的存在(参见实施例49)导致同二聚体蛋白中半胱氨酸至链间二硫键的氧化率降低，其中同二聚体蛋白用作异二聚体蛋白的例子。对异二聚体蛋白看到类似的观察结果(实施例54)。这指示步骤b)中的存在金属离子，至少与不存在金属离子的情况相比，提高异二聚体蛋白中半胱氨酸至链间二硫键的氧化率。如此，在又一个实施方案中，步骤b)，例如步骤b)中的氧化条件可以包含金属离子。可以在步骤b)中将金属离子添加至从步骤a)获得的组合物，或者它可以存在于从步骤a)获得的组合物中，例如通过选择步骤a)中的缓冲液或溶液。因此，在一个实施方案中，步骤b)中的氧化条件包括添加金属离子。即使金属离子已经存在于从步骤a)获得的组合物中，进一步的金属离子可以添加或在步骤b)期间添加，尤其若金属离子的浓度如此之低，以致于它可能限制异二聚体蛋白中的半胱氨酸至链间二硫键的氧化速率，或若存在金属螯合剂。特别地，合适的金属离子的例子是二价过渡金属离子，诸如铜，例如以硫酸铜形式，锰、铁、镍、镁和钴。适当地，金属离子可以以范围为0.01-100ppm，或0.1-100μM的浓度存在或者添加。可以将铜以例如硫酸铜添加至步骤b)。
若金属螯合剂存在于方法的步骤a)中，则特别可以添加二价过渡金属，例如铜(例如为硫酸铜形式)的添加。硫酸铜可以发挥用氧进行氧化的催化剂的功能。
本发明的发明人还已经发现了步骤b)中的氧化还原电势特别影响异二聚体蛋白中半胱氨酸至链间二硫键的再氧化的速率，而且还在一定程度上影响产率。本发明的发明人已经发现了重链间的链间二硫键的再氧化在约-350mV开始，而重链和轻链之间的链间键的再氧化在约-280mV开始。异二聚体蛋白中所有二硫键的完全形成一般在氧化还原电势高于-50mV时发生，而对于最佳的过程鲁棒性(robustness)，氧化还原电势应当优选是至少50mV。因此，在又一个实施方案中，步骤b)中的氧化还原电势可以高于-300mV，诸如高于-280mV，或高于-75mV，或高于-50mV、或高于0mV、或高于25mV、或高于50mV。为了将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成二硫键，其是相关的氧化还原电势的下限。步骤b)中氧化还原电势的上限可以是100-300mV左右，例如100-200mV，诸如100mV左右、或200mV左右或250mV左右、或300mV左右。因此，步骤b)的氧化还原电势可以在-300mV至300mV、或-300mV至200mV的范围中、或在-280mV至300mV、或-280mV至200mV的范围中、或在-75mV至300mV、或-75mV至200mV的范围中、或在-50mV至300mV、或-50mV至200mV的范围中、或在0mV至300mV、或0mV至200mV的范围中、或在25mV至300mV、或25mV至200mV的范围中，或在50mV至300mV、或50mV至200mV的范围中。
此外，本发明的发明人已经发现了在从步骤a)获得的组合物为溶液的实施方案中，步骤b)中的pH也影响异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成二硫键。因此，在又一个实施方案中，步骤b)中的pH在一个具体的实施方案中可以在pH 6-8.5的范围中，诸如pH 6.5-8的范围，或在pH 6.5-8.5的范围中，或在pH 6-8的范围中，或pH 6.5-7.5的范围，或pH 7-7.5的范围，例如pH 7.4左右。
确保步骤b)中的组合物的pH在某些范围内，例如pH 6-8.5可以例如通过选择具有合适pH的步骤a)中的溶液或缓冲液，或者通过对步骤b)中的组合物添加能够调节pH的组分，例如浓缩的pH调节溶液来进行。确保步骤b)中的组合物的pH在特定范围内也可以通过使用包含缓冲液更换的上文描述的方法之一进行，从而更换的缓冲液或溶液包含相关范围内的pH。
步骤b)中的缓冲液或溶液(例如用其改变从步骤a)获得的组合物，例如通过渗滤)可以包括但不限于本文中描述的任何缓冲液或溶液，诸如实施例中描述的任何缓冲液或溶液。此类缓冲液的例子包括例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)，PBS,pH 7.4。
可以通过监测氧化还原电势和/或通过监测溶解氧浓度追踪第一和第二同二聚体蛋白的铰链区中链间二硫键的还原的进展。用于此类监测的手段是本领域技术人员公知的，并且包括例如使用不同类型的探头，例如实施例44中描述的探头之一。
在一些实施方案中，本发明的方法产生抗体产物，其中超过80％,诸如超过90％、例如超过95％、诸如超过99％抗体分子是期望的双特异性抗体。
与基于共表达的方法相比，本文中描述的后生产(post-production)方法更灵活且更容易控制。
纯化
虽然本发明的方法经常产生较高的异二聚体蛋白产率，但是残留量的第一和/或第二同二聚体蛋白也存在于通过本发明的方法获得的产物或组合物中。
此外，通过本发明的方法获得的产物还可以包含方法过程中存在的还原剂和/或其它组分诸如缓冲液或盐。在某些情况中，可以优选除去此类组分，从而它们不存在于终产物中。
如上文描述的，在一些实施方案中，可以在本发明的步骤b)中除去还原剂、缓冲液组分、或盐。这些组分的除去可以作为本方法的分开的方法实施或者与还原剂的除去同时实施，例如通过上文描述的任何方法，诸如牵涉从步骤a)获得的组合物的缓冲液更换的任何方法进行。
因此，在又一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括异二聚体蛋白的纯化步骤。异二聚体蛋白的纯化可以视为步骤c)获得异二聚体蛋白。因此，在一个实施方案中，步骤c)包括使自步骤b)获得的组合物经受纯化方法。
合适的纯化方法的例子包括但不限于选自下组的方法：蛋白A和蛋白G层析(或亲和层析的其它方式)、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和层析、离子交换、疏水性相互作用层析、kappa或lambda选择、硫亲和力、混合模式层析(例如羟磷灰石)、固定化金属亲和层析和亲硫性吸附层析。其它纯化方法包括但不限于用例如盐或聚乙二醇沉淀以获得纯化的蛋白质。还涵盖不同纯化方法的组合。
使异二聚体蛋白经受纯化步骤，或纯化方法指异二聚体蛋白的任何种类的纯化；诸如分开异二聚体蛋白与残留量的第一和/或第二同二聚体蛋白，或分开异二聚体蛋白与其它组分，例如还原剂、盐或缓冲液或其它产物或方法相关杂质。
自残留量的第一和/或第二同二聚体蛋白纯化或分开异二聚体蛋白可以由于异二聚体蛋白非常类似于第一和第二同二聚体蛋白而变得复杂。如此，异二聚体蛋白与残留量的第一和/或第二同二聚体蛋白的分开可以比异二聚体蛋白与存在的其它组分，例如还原剂、缓冲剂或盐的分开更困难。
如本文中别处描述的，可以实施本发明的方法，从而相对于异二聚体蛋白的形成，第一或第二同二聚体蛋白的量是有限的。此类方法的一个例子称为操纵非等摩尔交换方法(SNEEP)。如此，第一或第二同二聚体蛋白在步骤a)中可以超过另一种同二聚体蛋白存在。特别地，可以通过相对于另一种包含过量或有限量的一种同二聚体蛋白调节步骤a)中第一和第二同二聚体蛋白的比率，从而导致有限的同二聚体蛋白在步骤a)中完全使用。这导致生成组合物，即从步骤a)获得的组合物，其包含异二聚体蛋白及残留量的仅第一和第二同二聚体蛋白之一，而不是第一和第二同二聚体蛋白两者。随后从残留同二聚体蛋白纯化异二聚体蛋白由此变得更简单，因为异二聚体蛋白仅必须与第一或第二同二聚体蛋白而不是它们两者分开。
因此，在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在步骤a)中超过第二同二聚体蛋白存在，或反之亦然。特别地，第一与第二同二聚体蛋白的比率可以是如本文中描述的。
在又一个实施方案中，用过量的第一或第二同二聚体蛋白实施方法与等度洗脱的纯化步骤组合。
在一个实施方案中，用过量的第一或第二同二聚体蛋白实施方法与纯化步骤组合，所述纯化步骤基于过量使用的同二聚体的抗原结合或抗独特型抗体结合。
在一个实施方案中，可以通过基于第一和第二同二聚体蛋白的差异的方法实施自第一和/或第二同二聚体蛋白纯化或分开异二聚体蛋白。此类方法可以促进第一和第二同二聚体蛋白彼此分开，且根据方法，还促进同二聚体蛋白与异二聚体蛋白的分开。基于第一和第二同二聚体蛋白的差异的此类纯化或分离方法的例子包括但不限于如下的方法，其中第一或第二同二聚体蛋白不结合蛋白A或蛋白G，或其中第一和第二同二聚体蛋白包含不同轻链，例如kappa和lambda轻链，或其中第一和第二同二聚体蛋白的Fc区包含不同同种异型。此类方法可以促进第一或第二同二聚体蛋白与异二聚体蛋白的分开。在又一个实施方案中，这可以与等度洗脱的纯化步骤组合。
在一个实施方案中，基于第一和第二同二聚体蛋白的差异的此类纯化或分离方法可以与如上文所述使用过量的第一或第二同二聚体蛋白组合。然后，随后自残留的同二聚体纯化或分开异二聚体蛋白可以利用第一和第二同二聚体蛋白的差异，因为异二聚体蛋白与残留的同二聚体差别为包含以限制量使用的同二聚体的Fc区。
在一个实施方案中，可以已经将第一或第二同二聚体蛋白工程化改造或修饰为使得它不结合蛋白A或蛋白G，或蛋白A和G的组合。然后，自第一和第二同二聚体蛋白中至少一种纯化或分开异二聚体蛋白可以通过将其在蛋白A或蛋白G柱(仅异二聚体蛋白和尚未在蛋白A或蛋白G结合方面修饰的同二聚体蛋白会与其结合)上通过实施。这促进不结合蛋白A或蛋白G的同二聚体蛋白与异二聚体蛋白的分开。若第一同二聚体蛋白不结合蛋白A而第二同二聚体蛋白不结合蛋白G，或反之亦然，则可以将异二聚体蛋白与第一和第二同二聚体蛋白分开，这通过将包含异二聚体蛋白的组合物在蛋白A和蛋白G材料上通过进行。第一和第二同二聚体蛋白可以已经修饰为不结合蛋白A和/或蛋白G，如本文中描述的。这也可以用于分开还原剂与异二聚体蛋白。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
使用步骤a)中已经修饰为使得不结合蛋白A、或蛋白G，或蛋白A和蛋白G的第一或第二同二聚体蛋白可以特别用于如下的实施方案，其中过量的第一或第二同二聚体蛋白在步骤a)中相对于另一种同二聚体蛋白使用。在此类实施方案中，可能有用的是工程化改造或修饰会过量使用的同二聚体蛋白的蛋白A或蛋白G结合位点，使得其结合此类树脂的能力被破坏。此类修饰包括但不限于CH3域中的修饰，其披露于WO2010/151792，通过提及将其收入本文。如此，本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含WO2010/151792中描述的CH3域中的一处或多处修饰，其降低或消除IgG对蛋白A的结合。如此，在一个具体的实施方案中，本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含选自下组但不限于此的修饰：a)435R及b)435R和436F。或者，第一或第二同二聚体蛋白可以包括下列突变：I253A、H310A、和H435A，其消除对蛋白A的结合。然后，可以通过在蛋白A柱上通过将异二聚体蛋白与过剩的未交换的同二聚体蛋白分开。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
在第一和第二同二聚体蛋白包含轻链的另一个实施方案中，步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白的轻链可以是不同的。例如，第一同二聚体蛋白可以包含kappa轻链，而第二同二聚体蛋白可以包含lambda轻链，或反之亦然。适合于仅与kappa或lambda轻链结合的柱层析的材料或树脂能够结合，然后可以用于自第一和/或第二同二聚体蛋白纯化或分开异二聚体蛋白。此类材料或树脂的例子包括例如来自GE Healthcare Life Sciences的称为KappaSelect和LambdaFabSelect的亲和介质。使用包含不同轻链，例如kappa和lambda轻链的第一和第二同二聚体蛋白可以与步骤a)中过量使用同二聚体蛋白之一组合。例如，可以用包含kappa轻链的第一同二聚体蛋白和包含lambda轻链的第二同二聚体蛋白且在第一同二聚体蛋白超过第二同二聚体蛋白存在的情况中，或者就其是否是过量使用的包含kappa或lambda轻链的同二聚体蛋白而言反之亦然实施步骤a)。然后，步骤c)可以包括使异二聚体蛋白在仅能够与lambda轻链结合的柱上通过。然后，步骤c)导致异二聚体蛋白与包含kappa轻链的残留第一同二聚体蛋白分开。类似地，步骤c)可以包括使异二聚体蛋白在仅与kappa轻链结合的柱上通过，若它是步骤a)中过量使用的包含lambda轻链的同二聚体。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
或者，也可以在不过量使用同二聚体蛋白之一的情况中实施异二聚体蛋白的纯化或分开，其基于kappa或lambda轻链对不同材料的结合差异。在此实施方案中，在此实施方案中，步骤c)可以包括使异二聚体蛋白在与kappa轻链结合的材料上，随后在与lambda轻链上通过，或者反之亦然。由于异二聚体蛋白包含kappa和lambda轻链两者，而第一和第二同二聚体蛋白包含kappa或lambda轻链，由此可以将异二聚体蛋白与第一和第二同二聚体蛋白分开。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
通过其中第一和第二同二聚体蛋白包含不同轻链(例如kappa和lambda轻链)，且其中同二聚体蛋白之一过量使用的方法生成的异二聚体蛋白的通过将其在与非过量使用的同二聚体蛋白的轻链结合的材料上通过的纯化也可以适用于与本发明不同的生成异二聚体蛋白的方法。例如基于在宿主细胞中共表达重链和轻链的方法或其它方法。
在另一个实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白的恒定区可以是不同同种异型的。同种异型是通常在群体内找到的氨基酸序列的变异。例如，人IgG1重链的不同同种异型是已知的，G1m(f)[又称作G1m(3)]、G1m(z)[又称作G1m(17)],G1m(a)[又称作G1m(1)]andG1m(x)[又称作G1m(2)](Jefferis,R.,mAbs2009；1:4,1-7)。如此，在本发明的一个实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白的恒定区可以是不同同种异型；例如它们可以是IgG1同种型，而第一同二聚体蛋白的恒定区可以是例如IgG1m(za)[＝IgG1m(1,17)]或IgG1m(zax)[＝IgG1m(1,2,17)]同种异型，而第二同二聚体蛋白的恒定区可以是例如IgG1m(f)[＝IgG1m(3)]或IgG1m(fa)[＝IgG1m(1,3)]同种异型。类似地，与使用kappa和lambda轻链的上文描述的实施方案一样，使用包含不同同种异型的恒定区的第一和第二同二聚体蛋白可以与步骤a)中过量使用第一或第二同二聚体蛋白组合。在此实施方案中，步骤c)然后可以包括使异二聚体蛋白在材料，例如用同种异型特异性抗体(与不过量使用的同二聚体蛋白中存在的同种异型结合)包被的珠上通过。由此，可以自步骤a)中过量使用的同二聚体蛋白纯化异二聚体蛋白。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
在一个备选实施方案中，不在步骤a)中调节第一或第二同二聚体蛋白的比率，如此步骤a)中第一或第二同二聚体蛋白均未完全使用，导致包含异二聚体蛋白、第一和第二同二聚体蛋白的组合物的生成。在此实施方案中，步骤c)可以包括使异二聚体蛋白在与同种异型之一结合的材料上，随后在与另一种同种异型结合的另一种材料上通过。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
与异二聚体蛋白与同二聚体蛋白的分开组合的包含不同同种异型Fc区的第一和第二同二聚体蛋白的使用也可以适用于与本发明的方法不同的生成异二聚体蛋白的方法。此类方法可以进一步包括使用过量的第一或第二同二聚体蛋白。此类方法的例子包括那些基于在同一宿主细胞中共表达第一和第二同二聚体蛋白的方法。
C端赖氨酸
通过羧肽酶从重链除去C端赖氨酸是抗体在哺乳动物细胞中重组表达后，及人血清中在体内通常观察到的抗体修饰(Cai等(2010)Biotechnol.Bioeng.Sep9)。除去经常是部分的，导致具有0(K0)、1(K1)或2(K2)个C端赖氨酸的抗体的混合群体。特别地，B细胞杂交瘤生成K0、K1和K2分子的混合物(Dick等(2008)Biotech.Bioeng.100:1132)。
在一个实施方案中，可以将异二聚体蛋白，例如通过本发明的方法生成的双特异性抗体的C端赖氨酸除去。术语“C端赖氨酸残基”指CH3区的C端，例如抗体重链的C端(其是IgG1中的位置447)的赖氨酸残基。
除了C端赖氨酸可以具有的各种效应外，C端赖氨酸的除去生成异二聚体蛋白，例如包含超过一种异二聚体蛋白分子的组合物或群体，其就C端赖氨酸的存在而言是更同质的。
如此，在又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白不含C端赖氨酸。
可以通过将第一和/或第二同二聚体蛋白工程化改造为不含C端赖氨酸，或者通过从第一和/或第二同二聚体蛋白除去(例如通过酶催化)C端赖氨酸或者通过从异二聚体蛋白除去(诸如通过酶催化)C端赖氨酸除去C端赖氨酸。
因此，在又一个实施方案中，将第一和/或第二同二聚体蛋白遗传修饰为不含C端赖氨酸(例如在重链中)。
在另一个实施方案中，本发明的方法进一步包括例如通过与羧肽酶一起温育例如从重链除去c端赖氨酸的步骤。
若第一和/或第二同二聚体蛋白工程化改造为不含C端赖氨酸，则可以如下生成第一和/或第二同二聚体蛋白：
i)提供编码免疫球蛋白的Fc区的核苷酸构建体，所述Fc区包含第一CH3区和/或包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，其中所述构建体不编码所述第一和/或第二CH3区C端的赖氨酸残基，
ii)在宿主细胞中表达所述核苷酸构建体，和
iii)从所述宿主细胞的细胞培养物回收所述第一和/或第二同二聚体蛋白。
在一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白可以是抗体，其在大多数实施方案中还可以包含轻链，如此，所述宿主细胞可以进一步表达在相同或不同载体上的轻链编码构建体。
用于制备核苷酸构建体的方法是本领域技术人员公知的。
类似地，用于在宿主细胞中表达核苷酸构建体的方法也是本领域技术人员公知的。
在本发明的上述方法的又一个实施方案中，从/基于具有C端赖氨酸残基密码子的初始重链序列衍生或设计步骤i)中提供的核苷酸构建体。如此，与所述初始重链序列相比，所述核苷酸构建体可以包含C端赖氨酸残基密码子的缺失。
在另一个实施方案中，可以从第一和/或第二同二聚体蛋白除去C端赖氨酸残基，例如通过酶促切割进行。如此，可以在生成第一和/或第二同二聚体蛋白后自其除去C端赖氨酸。用于酶促除去C端赖氨酸的方法包括但不限于使第一和/或第二同二聚体蛋白经受与羧肽酶的温育。因此，可以在步骤a)前实施例如从重链除去C端赖氨酸的步骤。如此，在一个实施方案中，本发明的方法可以包括在步骤a)前使第一和/或第二同二聚体蛋白经受羧肽酶的进一步步骤。
类似地，可以从异二聚体蛋白除去C端赖氨酸。如此，在一个实施方案中，本发明的方法可以在步骤a)后包括使异二聚体蛋白经受羧肽酶的进一步步骤。此步骤可以在步骤a)和步骤b)之间或者它可以在步骤b)后。如此，在一个实施方案中，可以在步骤a)后实施(例如从重链)除去C端赖氨酸的步骤。在另一个实施方案中，可以在步骤b)后实施(例如从重链)除去C端赖氨酸的步骤。原则上，本发明的方法可以包括使第一和/或第二同二聚体蛋白和异二聚体蛋白两者经受羧肽酶。然而，对于大多数目的，包括上文提及的步骤之一应当足以除去C端赖氨酸。合适的羧肽酶的例子包括但不限于羧肽酶B或羧肽酶N(Cai等Biotechnol.Bioeng.Sep9(2010)见上文)。适合于用羧肽酶处理的条件是本领域技术人员公知的。除去C端赖氨酸的另一种方法应当是在表达羧肽酶的宿主细胞中表达第一和/或第二同二聚体蛋白。将第一和/或第二同二聚体蛋白在羧肽酶有活性的温度留在宿主细胞培养基中达足够的时间量也会导致C端赖氨酸的除去(Luo JL,Ahang J,Ren D,Tsai W-L,LiF(2102)Probing of C-Terminal Lysine Variation in a Recombinant MonoclonalAntibody Production Using Chinese Hamster Ovary Cells with Chemically DefinedMedia.Biotechnol.Bioeng.109:2306-2315)。
核酸序列
在又一个方面，本发明还涉及编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的核酸序列，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。第一和第二同二聚体蛋白可以是与本发明相关的上文描述的任一种第一和第二同二聚体蛋白。
在又一方面，本发明还涉及编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的表达载体，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
在甚至又一个实施方案中，本发明还涉及包含编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的表达载体的宿主细胞，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
在本发明的上下文中，表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非染色体、和合成核酸载体(包含合适的一组表达控制元件的核酸序列)。此类载体的例子包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，核酸序列可以包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(如记载于例如Sykes和Johnston,Nat Biotech17,355-59(1997))、紧密核酸载体(compacted nucleic acid vector)(如记载于例如US 6,077,835和/或WO00/70087)、质粒载体诸如pBR322、pUC19/18、或pUC 118/119、“蠓(midge)”最小尺寸核酸载体(如记载于例如Schakowski等,Mol Ther3,793-800(2001))、或者作为沉淀的核酸载体构建体，诸如CaP04沉淀的构建体(如记载于例如WO 00/46147,Benvenisty and Reshef,PNASUSA 83,9551-55(1986),Wigler等,Cell 14,725(1978),及Coraro and Pearson,SomaticCell Genetics 7,603(1981))，所述核酸序列编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的Fc区，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。此类核酸载体及其用法是本领域中公知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一个实施方案中，载体适合于在细菌细胞中表达。此类载体的例子包括表达载体，诸如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke和Schuster,J Biol Chem 264,5503-5509(1989)、pET载体(Novagen,Madison WI)等)。
表达载体也可以或备选是适合于在酵母***中表达的载体。可以采用适合于在酵母***中表达的任何载体。合适的载体包括例如包含组成性或诱导型启动子，诸如alpha因子、醇氧化酶和PGH的载体(综述见：F.Ausubel等编Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987),及Grant等,Methods in Enzymol 153,516-544(1987))。
表达载体也可以或备选是适合于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如包含谷氨酰胺合成酶作为选择标志物的载体，诸如Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175中描述的载体。
核酸和/或载体也可以包含编码分泌/定位序列(其可以将多肽，诸如新生多肽链靶向至周质空间或靶向入细胞培养基中)的核酸序列。此类序列是本领域中已知的，并且包括分泌前导或信号肽。
在本发明的表达载体中，核酸序列可以包含任何合适的启动子、增强子、和其它表达促进元件或者与任何合适的启动子、增强子、和其它表达促进元件联合，所述核酸序列编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。此类元件的例子包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子及RSV、SV40、SL3-3、MMTV、和HIV LTR启动子)、有效的多聚(A)终止序列、大肠杆菌(E.coli)中的质粒产物的复制起点、抗生素抗性基因如选择标志物、和/或方便的克隆位点(例如多接头)。核酸还可以包含诱导型启动子，其与组成性启动子诸如CMV IE形成对比。
在一个实施方案中，可以经由病毒载体将表达载体定位于和/或投递至宿主细胞或宿主动物。
在甚至又一个方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞，诸如转染瘤(transfectoma)，其生成本发明的第一或第二同二聚体蛋白，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸，如本文中定义的。宿主细胞的例子包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，诸如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施方案中，本发明提供了包含稳定整合到细胞基因组中的核酸的细胞，所述核酸包含编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白Fc区的表达的序列，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供包含非整合型核酸的细胞，所述非整合型核酸诸如质粒、粘粒、噬菌粒、或线性表达元件，其包含编码本发明第一或第二同二聚体蛋白表达的序列，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
在又一个方面，本发明涉及杂交瘤，其生成本发明的第一或第二同二聚体蛋白，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。在甚至又一个方面，本发明涉及转基因非人动物或植物，其包含编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的核酸，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸，其中所述动物或植物生成本发明的第一或第二同二聚体蛋白，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
异二聚体蛋白
本发明还涉及通过本发明的方法获得的异二聚体蛋白。
本发明的方法能够形成不对称分子，在每条Fab臂或者每个CH3域上具有不同特征的分子或者在整个分子内具有不同修饰的分子，例如具有用于缀合的非天然氨基酸取代的分子。此类不对称分子可以任何合适的组合产生。这在下文通过一些非限制性例子进一步说明。
双特异性抗体可用于将成像或免疫治疗剂投递至感兴趣的靶细胞，包括但不限于肿瘤细胞。
在本发明方法的一个实施方案中，双特异性分子的第一Fab臂结合肿瘤细胞，诸如肿瘤细胞表面蛋白或者肿瘤细胞表面的糖，诸如本文列出的肿瘤细胞表面蛋白中的一种，而第二Fab臂识别放射活性效应分子，包括但不限于与肽或半抗原偶联或连接(经由螯合剂)的放射性标记物。此类放射性标记肽的例子是铟标记的二乙烯三胺五乙酸(抗DTPA(In)van Schaijk等Clin.Cancer Res.2005；11:7230s-7126s)。另一种例子是使用携带放射性核素诸如例如锝-99的半抗原标记的胶粒诸如脂质体、聚合物胶束的纳米颗粒(Jestin等QJ Nucl Med Mol Imaging2007；51:51-60)。
在另一个实施方案中，使用半抗原偶联的备选细胞抑制分子诸如毒素作为由第二Fab臂识别的效应分子。
在本发明方法的又一个实施方案中，将双特异性分子的第一Fab臂在N297位置(EU编号)糖基化，并将双特异性分子的第二Fab臂无糖基化(aglycosylated)(非糖基化，例如通过将N297突变为Q或A或E突变(Bolt S等,Eur J Immunol1993,23:403-411))。在Fc区的不对称糖基化影响与Fcγ-受体的相互作用，并且影响抗体的抗体依赖性细胞的细胞毒性效应(Ha等,Glycobiology2011,21(8):1087-1096)以及与其它效应器功能分子诸如Clq的相互作用。
在本发明方法的另一个实施方案中，双特异性分子的第一Fab臂与FcRn(新生儿Fe受体)相互作用(Roopenian DC,等Nat.Rev.Immunol.2007,7:715-725)，并且通过使分子上FcRn相互作用位点突变例如通过产生H435A突变来妨碍第二Fab臂与FcRn结合(Shields,R.L.等,J Biol Chem,2001,Firan,M.等,Int Immunol,2001)。
在另一个实施方案中，在双特异性分子的两条Fab臂中的一条上改善或减少与C1q的结合。
在另一个实施方案中，已将蛋白质工程化改造为在分子的两条Fab臂中的一条或两条上增强补体活化。
在另一个实施方案中，存在于双特异性分子中的每条Fab臂从不同的IgG亚类衍生。
在另一个实施方案中，存在于双特异性分子中的每条Fab臂携带不同的同种异型突变(Jefferis和Lefranc,2009,MABs1:332-8)。
在另一个实施方案中，另一类不对称免疫治疗分子通过用免疫活性、免疫刺激性或免疫抑制性细胞因子置换双特异性分子的一条Fab臂的Fab产生。此类细胞因子的非限制性例子是IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-4、IL-6、IL-13。或者，在分子中包括(生长)因子或激素刺激剂或抑制剂。
在另一个实施方案中，一条Fab臂的Fab被裂解肽置换，裂解肽即能够裂解肿瘤细胞、细菌、真菌等的肽，包括但不限于抗微生物肽如爪蟾抗菌肽(magainin)、蜂毒肽(mellitin)、杀菌肽(cecropin)、KLAKKLAK及其变体(Schweizer等Eur.J.Pharmacology2009；625:190-194,Javadpour,J.Med.Chem.,1996,39:3107–3113,Marks等,CancerRes2005；65:2373-2377,Rege等,Cancer Res.2007；67:6368-6375)或阳离子裂解肽(CLYP技术，US2009/0269341)。
在另一个实施方案中，Fab臂上的Fab中之一或两者被细胞因子和/或生长因子的受体置换，产生所谓的诱饵受体，其中靶向TNF-α的
Figure BDA0000528413460000791
(依那西普)和靶向VEGF的VEGF-trap是众所周知的例子。将这两种诱饵受体组合成一个分子显示优于单一诱饵受体的活性(Jung,J.Biol.Chem.2011；286:14410-14418)。
在另一个实施方案中，另一类不对称免疫治疗分子通过将免疫活性细胞因子、免疫刺激性细胞因子或免疫抑制性细胞因子与存在于双特异性分子中的Fab臂中的一条或两条的N-端或C-端融合而产生。这可对双特异性分子的抗肿瘤活性产生积极影响。此类分子的例子是(但不限于下文列表)IL-2(Fournier等,2011,Int.J.Oncology,doi:10.3892/ijo.2011.976)、IFN-α、IFN-β或IFN-γ(Huan等,2007；J.Immunol.179:6881-6888,Rossie等,2009；Blood114:3864-3871)、TNF-α。或者，细胞因子比如例如G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-4、IL-6或IL-13的N-端或C-端融合可积极地影响双特异性抗体分子效应器功能。或者将生长因子或激素刺激剂或抑制剂在N-端或C-端包括在分子中。
在另一个实施方案中，裂解肽比如例如抗微生物肽如爪蟾抗菌肽、蜂毒肽、杀菌肽、KLAKKLAK及其变体(Schweizer等Eur.J.Pharmacology 2009；625:190-194,Javadpour,J.Med.Chem.,1996,39:3107–3113,Marks等,Cancer Res 2005；65:2373-2377,Rege等,Cancer Res.2007；67:6368-6375)或阳离子裂解肽(CLYP技术，US2009/0269341)在一条或两条Fab臂上的N-端或C-端融合可增强分子的活性。
在另一个实施方案中，另一类别的不对称免疫治疗分子是单价抗体，该分子以一条Fab臂与选择的靶标相互作用。在此类分子中，存在于双特异性分子中的一条Fab臂针对选择的靶分子，分子的第二条Fab臂不携带Fab或者具有非结合/非功能性Fab比如对MetMab所述的(Genentech；WO 96/38557)。或者，可产生单体的Fc融合蛋白诸如对因子VIII和IX所述的那些(Peters等,Blood2010；115:2057-2064)。
或者，可通过本发明方法产生任何上述不对称分子的组合。
通过本发明的方法生成的异二聚体蛋白可以含有包含第一免疫球蛋白的Fc区的第一多肽和包含第二免疫球蛋白的Fc区的第二多肽，所述第一Fc区包含第一CH3区，所述第二Fc区包含第二CH3区，其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，且
其中所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366，368，370，399，405和407，
和/或
其中所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，诸如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，诸如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，诸如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或0.01-0.1。
在一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区具有位置405处与Phe不同的氨基酸，
和/或
所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，诸如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，诸如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，诸如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或0.01-0.1。
在异二聚体蛋白的又一个实施方案中，
所述第一CH3区具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区具有位置405处与Phe不同的氨基酸，诸如位置405处与Phe、Arg或Gly不同的氨基酸，
或
所述第一CH3区具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区具有位置407处与Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr不同的氨基酸。
在其它实施方案中，依照本发明的异二聚体蛋白包含上文关于生产方法描述的任何其它特征。
如此，在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽是抗体(优选人抗体)的全长重链。
在本发明异二聚体蛋白的另一个实施方案中，所述第二多肽是抗体(优选人抗体)的全长重链。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一和第二多肽都是两种抗体(优选结合不同表位的两种人抗体)的全长重链，因此所得异二聚体蛋白是双特异性抗体。这种双特异性抗体可以是重链抗体，或者是除了重链以外还包含两条全长轻链(其可相同或不同)的抗体。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，第一多肽的Fc区与源自选自下组的同种型的Fc区相似或相同：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(除了规定突变以外)，且第二多肽的Fc区是选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的(除了规定突变以外)。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置405处的Phe和位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区包含位置405处与Phe不同的氨基酸和位置409处的Lys。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置405处的Phe和位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置405处的Phe和位置409处的Arg，且所述第二CH3区包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置409处的Arg，且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置350处的Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg，且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置350处的Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg，且所述第二CH3区包含位置350处的Ile、位置370处的Thr、位置405处的Leu和位置409处的Lys。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一和所述第二多肽在铰链区中都不包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一和所述第二多肽在铰链区中都包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽和/或所述第二多肽包含除去用于Asn-连接的糖基化的受***点的突变。
靶抗原
如上文所解释的，在本发明的一个重要实施方案中，异二聚体蛋白是包含两个在结合特异性(即结合不同表位)上不同的可变区的双特异性抗体。
原则上，任何特异性组合都是可能的。如上文提到，双特异性抗体可以潜在用于进一步提高单克隆抗体疗法的效力和功效。单特异性抗体一种可能的局限性是缺乏对期望的靶细胞的特异性，这是因为靶抗原表达在对其不期望抗体结合的其它细胞类型上。例如，在肿瘤细胞上过表达的靶抗原也可在健康组织中表达，这可导致在用针对该抗原的抗体治疗后产生不期望的副作用。对只在靶细胞类型上表达的蛋白具有进一步特异性的双特异性抗体可以潜在改善与肿瘤细胞的特异性结合。
因此，在一个实施方案中，同二聚体蛋白都是抗体，其中第一抗体和第二抗体结合同一肿瘤细胞上的不同表位。
在另一个实施方案中，同二聚体蛋白都是抗体，其中第一抗体结合肿瘤细胞上的表位，而另一种抗体是对于意图的应用没有任何相关体内结合活性的无关或无活性抗体。
如此，在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二表位位于同一细胞，例如肿瘤细胞上。肿瘤细胞上的合适靶物包括但不限于下列各项：erbB1(EGFR)、erbB2(HER2)、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-包膜蛋白、骨膜蛋白(periostin)、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFRvIII、L1-CAM、AXL、组织因子(TF)、CD74、EpCAM和MRP3。肿瘤细胞靶物的可能组合包括但不限于：erbB1+erbB2、erbB2+erbB3、erbB1+erbB3、CD19+CD20、CD38+CD34、CD4+CXCR5、CD38+RANKL、CD38+CXCR4、CD20+CXCR4、CD20+CCR7、CD20+CXCR5、CD20+RANKL、erbB2+AXL、erbB1+cMet、erbB2+c-Met、erbB2+EpCAM、c-Met+AXL、c-Met+TF、CD38+CD20、CD38+CD138。
在又一个实施方案中，所述第一和第二表位可位于同一靶抗原上，其中两个表位在靶抗原上的位置使得抗体与一个表位的结合不干扰抗体与另一表位的结合。在本文又一个实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白是结合位于同一靶抗原上两个不同表位，但对于靶细胞例如肿瘤细胞具有不同的杀伤作用模式的抗体。例如，在一个实施方案中，靶抗原是erbB2(HER2)，且双特异性抗体组合培妥珠单抗(pertuzumab)和曲妥珠单抗(trastuzumab)抗原结合位点。在另一个实施方案中，靶抗原是erbB1(EGFr)，且双特异性抗体组合扎鲁木单抗(zalutumumab)和尼妥珠单抗(nimotuzumab)抗原结合位点。
双特异性抗体还可作为介质用于将效应机制再靶向疾病相关组织,例如肿瘤。因此，在又一个实施方案中，所述第一表位或所述第二表位位于肿瘤细胞诸如肿瘤细胞蛋白或肿瘤细胞糖上，而另一表位位于效应细胞上。
在一个实施方案中，效应细胞是T细胞。
效应细胞上的可能靶标包括下列各项：FcγRI(CD64)：在单核细胞和巨噬细胞和活化的嗜中性粒细胞上表达；FcγRIII(CD16)：在自然杀伤细胞和巨噬细胞上表达；CD3：在循环T细胞上表达；CD89：在PMN(多形核嗜中性粒细胞)、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达；CD32a：在巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞上表达；在嗜碱性粒细胞和肥大细胞上表达的FcεRI。在一个实施方案中表位位于在T细胞上表达的CD3。
在另一个实施方案中，第一抗体对病原性微生物具有结合特异性，而第二抗体对效应细胞蛋白(诸如CD3，CD4，CD8，CD40，CD25，CD28，CD16，CD89，CD32，CD64，FcεRI或CD1)具有结合特异性。
此外，双特异性抗体可用于使化疗剂更特异性地靶向该化疗剂应对其发挥作用的细胞。因此，在一个实施方案中，同二聚体蛋白中的一种是识别小分子或肽的抗体，或者能够例如根据描述于Rader等,(2003)PNAS 100:5396的原理与此类分子形成共价键。在本发明方法的又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞表面蛋白(诸如erbB1，erbB2，erbB3，erbB4，EGFR3vIII，CEA，MUC-1，CD19，CD20，CD4，CD38，EpCAM，c-Met，AXL，L1-CAM，组织因子，CD74或CXCR5)具有结合特异性(即结合所述肿瘤细胞或肿瘤细胞表面蛋白上的表位)，而第二抗体对可以任选与肽或半抗原偶联或连接的化疗剂诸如毒素(包括放射性标记肽)、放射性同位素、药物或前药具有结合特异性。
双特异性抗体还可用于靶向囊泡，如电子致密囊泡，或者含有针对肿瘤的毒素、药物或前药的小细胞。参见例如MacDiarmid等(2009)Nature Biotech27:643。小细胞是非染色体细胞，其是不含有染色体DNA的异常细胞***产物。因此，在另一个实施方案中，所述第一或所述第二表位位于肿瘤细胞，诸如肿瘤细胞蛋白或肿瘤细胞糖上，而另一表位位于电子致密囊泡或小细胞上。
另外，通过将对血清蛋白的结合特异性包括在双特异性抗体中可改变抗体的血清半衰期。例如，通过将对血清白蛋白的结合特异性包括在双特异性抗体中可延长血清半衰期。因此，在本发明方法又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白诸如erbB1(EGFR)，erbB2(HER2)，erbB3，erbB4，MUC-1，CD19，CD20，CD4，CD38，CD138，CXCR5，c-Met，HERV-包膜蛋白、骨膜蛋白、Bigh3，SPARC，BCR，CD79，CD37，EGFRvIII，L1-CAM，AXL，组织因子(TF)，CD74，EpCAM或MRP3，CEA具有结合特异性，而第二抗体对血液蛋白诸如血清白蛋白具有结合特异性。第二结合特异性还可用于使抗体靶向特定组织，诸如中枢神经***或脑(跨越血脑屏障)。因此，在本发明方法又一个实施方案中，第一抗体对脑特异性靶标具有结合特异性，脑特异性靶标诸如淀粉样蛋白-β(例如用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease))、Her-2(例如用于治疗乳腺癌脑转移)、EGFR(例如用于治疗原发性脑癌)、Nogo A(例如用于治疗脑损伤)、TRAIL(例如用于治疗HIV)、alpha-突触核蛋白(synuclein)(例如用于治疗帕金森病)、Htt(例如用于治疗亨廷顿病(Huntington))、朊病毒(例如用于治疗疯牛病)、西尼罗病毒蛋白；第二抗体对血脑屏障蛋白具有结合特异性，血脑屏障蛋白诸如转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、黑素转铁蛋白受体(MTfR)、乳铁蛋白受体(LfR)、载脂蛋白E受体2(ApoER2)、LDL受体相关蛋白1和2(LRP1和LRP2)、高级糖基化终产物的受体(RAGE)、白喉毒素受体＝肝素结合表皮生长因子样生长因子(DTR＝HB-EGF)、gp190(Abbott等,Neurobiology of Disease37(2010)13-25)。
对血脑屏障蛋白的结合特异性还可用于使另一种非抗体分子靶向特定组织，诸如中枢神经***或脑(跨越血脑屏障)。因此，在又一个实施方案中，同二聚体蛋白之一是对血脑屏障蛋白(诸如TfR，胰岛素受体，MTfR，LfR，ApoER2，LRP1，LRP2，RAGE，DTR(＝HB-EGF)或gp190)具有结合特异性的全长抗体，而另一种同二聚体蛋白是在N-或C-端连接另一种蛋白的Fc区，所述另一种蛋白诸如细胞因子、可溶性受体或者其它蛋白，如VIP(血管活性肠肽)、BDNF(脑衍生的神经营养因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、多种FGF、EGF(表皮生长因子)、PNA(肽核酸)、NGF(神经生长因子)、神经营养蛋白(NT)-3、NT-4/5、胶质细胞衍生的神经营养因子、睫状神经营养因子、神养蛋白(neurturin)、神经调节蛋白、白介素、转化生长因子(TGF)-α、TGF-β、***、肝细胞生长因子、血小板衍生的生长因子、artemin、persephin、导蛋白、心肌营养蛋白-1、干细胞因子、中期因子、多效营养因子、骨形态发生蛋白、脑信号蛋白、脑信号蛋白(semaphorin)、白细胞抑制因子、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰基-半乳糖胺-6-硫酸酯酶、芳香基硫酸酯酶B、酸性α-葡萄糖苷酶或者鞘憐脂酶(Pardridge,靶向脑的生物药物(Pardridge,Bioparmaceutical drugtargeting to the brain,Journal of Drug Targeting 2010,1-11；Pardridge,Re-engineering Biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojanhorses.Bioconjugate Chemistry2008,19:1327-1338)
在本发明方法的又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白诸如erbB1，erbB2，erbB3，erbB4，MUC-1，CD19，CD20，CD4或CXCR5具有结合特异性，而第二抗体对参与凝血的蛋白诸如组织因子具有结合特异性。
其它特别引入关注的结合特异性组合包括：CD3+HER2，CD3+CD20，IL-12+IL18，IL-1a+IL-1b，VEGF+EGFR，EpCAM+CD3，GD2+CD3，GD3+CD3，HER2+CD64，EGFR+CD64，CD30+CD16，NG2+CD28，HER2+HER3，CD20+CD28，HER2+CD16，Bcl2+CD3，CD19+CD3，CEA+CD3，EGFR+CD3，IgE+CD3，EphA2+CD3，CD33+CD3，MCSP+CD3，PSMA+CD3，TF+CD3，CD19+CD16，CD19+CD16a，CD30+CD16a，CEA+HSG，CD20+HSG，MUC1+HSG，CD20+CD22，HLA-DR+CD79，PDGFR+VEGF，IL17a+IL23，CD32b+CD25，CD20+CD38，HER2+AXL，CD89+HLA II类，CD38+CD138，TF+c-Met，Her2+EpCAM，HER2+HER2，EGFR+EGFR，EGFR+c-Met，c-Met+非结合臂以及G-蛋白偶联受体的组合。
在又一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗体可基本按照Taylor等J.Immunol.158:842-850(1997)及Taylor和Ferguson,J.Hematother.4:357-362,1995所述，通过靶向红细胞而用于清除病原体、病原性自身抗体或者有害化合物诸如来自循环的毒液和毒素。所述第一表位位于红细胞(红血球)蛋白(包括但不限于红细胞补体受体1)上，所述第二表位位于待靶定清除的化合物或生物体上。
在又一个实施方案中，第二Fab臂包含代表自身抗原或者连接自身抗原的缀合位点诸如dsDNA的融合蛋白。因此通过本发明的双特异性抗体靶向病原体、自身抗体或有害化合物以及接着的红细胞介导的清除，可在各种疾病和综合征的治疗中具有治疗效用。
缀合
在本发明的其它实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至选自下列的化合物：毒素(包括放射性同位素)、前药或药物。此类化合物可例如在癌症疗法中更有效地杀伤靶细胞。因此所得异二聚体蛋白是免疫缀合物。或者化合物可与所得异二聚体蛋白偶联，即在已发生Fab臂交换之后。
因此，在又一个实施方案中，本发明的方法进一步包括将第一和/或第二同二聚体蛋白与另一种化合物；例如毒素、前药或药物连接或缀合的步骤。
或者，本发明的方法进一步包括将异二聚体蛋白与另一种化合物；例如毒素、前药或药物连接或缀合的步骤。
如本文中别处描述的，可以将第一和第二同二聚体蛋白与不同化合物缀合，由此导致生成与两种不同化合物(例如毒素、前药和/或药物)缀合的异二聚体蛋白。若用于缀合第一化合物的方法与用于缀合第二化合物的方法不相容，则这可以是特别有用的。例如，不同化合物可以是两种不同毒素，或两种不同前药，或两种不同药物，或者一种化合物可以是毒素，而另一种是前药或药物，或一种化合物可以是前药，而另一种是药物。可以使用任何合适的组合。
或者，本发明的方法包括使用还原-氧化组合异二聚体蛋白的形成与毒素的缀合。
用于形成本发明免疫缀合物的合适化合物包括泰素(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、tenoposide、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙素(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、***(propranolol)和嘌罗霉素(puromycin)、抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨(fludarabin)、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine)、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨(gemcitabine)、克拉屈滨(cladribine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)、洛莫司汀(lomustine,CCNU)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链唑菌素(streptozotocin)、达卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素C(mitomycin C)、顺铂(cisplatin)和其它铂衍生物，诸如卡铂(carboplatin))、抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)(旧称放线菌素(actinomycin))、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)(旧称道诺霉素(daunomycin))、多柔比星(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普卡霉素(plicamycin)、安曲霉素(anthramycin,AMC))、白喉毒素和相关分子(例如白喉A链和其活性片段和杂合分子)、蓖麻毒蛋白毒素(例如蓖麻毒蛋白A或去糖基化蓖麻毒蛋白A链毒素)、霍乱毒素、志贺样毒素(SLT-I,SLT-II,SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素、alorin、肥阜草蛋白(saporin)、蒴莲根毒素(modeccin)、gelanin、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)和依诺霉素(enomycin)毒素。其它合适的缀合分子包括核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌内毒素、美登木素生物喊、Auristatins(MMAE,MMAF)、刺抱霉素(Calicheamicins)和Duocarmycin类似物(Ducry and Stump,Bioconjugate Chem.2010,21:5-13)、Dolostatin-10、Dolostatin-15、伊立替康(Irinotecan)或其活性代谢物SN38、吡咯并苯并二氮杂(PBD)。
在本发明又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至α发射体，包括但不限于钍-227、镭-223、铋-212和锕-225。
在本发明又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至β发射放射性核素，包括但不限于碘-313、钇-90、氟-18、铼-186、镓-68、锝-99、铟-111和镥-177。
在另一个实施方案中，待缀合化合物包括核酸或核酸相关分子。在本发明一个这样的方面，缀合的核酸是细胞毒性核糖核酸酶、反义核酸、抑制性RNA分子(如siRNA分子)或免疫刺激性核酸(如免疫刺激性含CpG基序的DNA分子)。
可采用本领域已知用于缀合的任何方法，包括Hunter等,Nature 144,945(1962),David等,Biochemistry 13,1014(1974),Pain等,J.Immunol.Meth.40,219(1981)及Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30,407(1982)描述的方法。可通过使其它部分与蛋白的N-端侧C-端侧在化学上缀合制备缀合物(参见例如Antibody Engineering Handbook,Osamu Kanemitsu编,Chijin Shokan(1994)出版)。在适当的情况下，还可通过在内部残基或糖处缀合产生此类缀合的抗体衍生物。药剂可直接或间接与本发明的蛋白偶联。第二药剂的间接偶联的一个例子是通过间隔物部分偶联。用于药物缀合物的连接技术最近已概括于Ducry and Stump(2010)Bioconjugate Chem.21:5。
组合物和用途
通过本发明的方法生成的异二聚体蛋白可以在具有药学可接受载体的药物组合物中使用。
可按照常规技术配制药物组合物，所述常规技术例如公开于下述文献中的常规技术：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,Gennaro编,MackPublishing Co.,Easton,PA,1995。本发明的药物组合物可包含例如稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去污剂(例如非离子型去污剂，例如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如不含糖或蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适于纳入药物组合物中的其它物质。
药学上可接受的载体包括与本发明的化合物在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂、抗氧化剂和吸收延缓剂等。可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的例子包括水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇)。药学可接受载体包括无菌水性溶液剂或分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂。可通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。
本发明的药物组合物还可包含药学可接受抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可在组合物中包含等张剂，诸如糖、多元醇，诸如甘露醇、山梨糖醇、甘油或氯化钠。
本发明的药物组合物还可含有适于所选给药途径的可提高药物组合物的保存期限或有效性的一种或多种辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂。可将本发明的化合物与可防止化合物快速释放的载体一起制备，诸如受控释放配制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送***。这类载体可包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、生物可降解的生物相容性聚合物诸如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和单独的或与蜡一起的聚乳酸，或者本领域众所周知的其它物质。用于制备这类配制剂的方法一般为本领域技术人员所知。
可根据需要通过将所需量的活性化合物与例如上文列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，接着灭菌微量过滤，来制备无菌注射用溶液剂。
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于特定患者、组合物和给药方式有效实现所需治疗反应而又对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多个药动学因素，包括所用的本发明具体组合物的活性、给药途径、给药时间、所用具体化合物的***率、治疗持续时间、与所用具体组合物联用的其它药物、化合物和/或物质、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等医学领域众所周知的因素。
可通过任何合适的途径和方式施用药物组合物。在一个实施方案中，胃肠外施用本发明的药物组合物。本文所用“胃肠外施用”意指非肠内和局部给药的施用方式，通常通过注射施用，包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，通过静脉内或皮下注射或输注施用药物组合物。
在一个主要方面，本发明涉及用作药物的依照本发明的异二聚体蛋白诸如本发明的双特异性抗体。本发明的异二聚体蛋白可用于多种目的。具体来讲，如上文解释的，本发明的异二聚体蛋白可用于治疗各种形式的癌症，包括转移癌和难治性癌。
因此，一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，其包括对有需要的个体施用如本文描述的本发明异二聚体蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白用于治疗免疫疾病和自身免疫疾病、炎性疾病、感染性疾病、心血管疾病、CNS和肌肉骨骼疾病。
调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。例如，可施用单次推注，可随时间施用若干分剂量，或可按治疗情况危急程度所示，按比例减少或增加剂量。
异二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况，并且可由本领域技术人员决定。本发明双特异性抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围为约0.1-100mg/kg，诸如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，诸如约0.1-10mg/kg,例如约0.5，约诸如0.3，约1、约3、约5或者约8mg/kgο
具有本领域普通技能的医生或兽医可容易决定和规定有效量的所需药物组合物。例如，医生或兽医可以以低于达到所需治疗效果需要的水平开始给予用于药物组合物中的异二聚体蛋白的剂量，逐渐增加剂量直到达到所需效果。一般而言，本发明组合物的合适剂量会是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用可以是例如胃肠外，例如静脉内、肌内或皮下。
本发明的异二聚体蛋白还可预防性给药以减小发生疾病诸如癌症的危险，在疾病进展中延迟事件出现的发作，和/或当疾病诸如癌症缓解时减小复发的危险。
本发明的异二聚体蛋白诸如双特异性抗体还可在组合疗法中给药，即与其它与待治疗疾病或状况有关的治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含异二聚体蛋白的药物与一种或多种其它治疗剂诸如细胞毒剂、化疗剂或抗血管生成剂组合。此类组合给药可以同时、单独或序贯给予。在又一个实施方案中，本发明提供治疗疾病诸如癌症的方法，该方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的与放射疗法和/或手术组合的异二聚体蛋白，诸如本发明的双特异性抗体。
本发明的异二聚体蛋白诸如双特异性抗体还可用于诊断目的。
实施例
实施例1：用于表达人IgG1-2F8和IgG1-7D8的表达载体
将HuMab 2F8(WO 02/100348)和HuMab 7D8(WO 04/035607)的VH和VL编码区克隆在表达载体pConG1f(含有人IgG1m(f)同种异型恒定区的基因组序列(Lonza Biologics))中用于制备人IgGl重链及克隆在pConKappa(含有人κ轻链恒定区，Lonza Biologics)中用于制备κ轻链。对于IgG4抗体，将VH区***pTomG4载体(含有在pEE12.4载体(LonzaBiologics)中的人IgG4恒定区的基因组序列)中。或者，在随后的构建体中，使用含有在pEE12.4载体中的重链(IgG1或IgG4)的完全密码子优化编码区或者在pEE6.4载体(LonzaBiologics)中的HuMab 2F8或HuMab 7D8的人κ轻链的载体。此外，将HuMab-2F8的密码子优化的VH编码区以及含有F405L突变的人IgG1m(za)同种异型恒定区的密码子优化的序列在pcDNA3.3载体(Invitrogen)中克隆，产生表达载体p33G1za-2F8-F405L。
实施例2：用于表达铰链缺失的IgG1-2F8和含有特定突变的人IgG1和IgG4 CH2-CH3片段的表达载体
为了在抗体重链的铰链和CH3区中引入突变，根据制造商的推荐使用Quickchange定向诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)。或者，完全合成构建体或将VH区在已含有编码取代的特定氨基酸的载体中克隆。
通过PCR或者合成构建完全密码子优化的编码CH2和CH3片段的构建体。这些构建体具有N-端信号肽和6个氨基酸的His标签，含有人IgG1/4恒定区的341-447位氨基酸。将构建体在PEE12.4中克隆。
为了构建铰链缺失的IgG1(Uni-G1)分子，制备编码具有EGFR特异性的人IgGl同种型的Uni-G1形式的合成DNA构建体。在该构建体中，将天然铰链区(如由铰链外显子所限定的)缺失。在IgG1构建体中在158位产生额外的Ser至Cys突变以补救此同种型中HC和LC链之间的Cys键。下文显示了蛋白序列(SEQ ID NO:4)。将构建体***到pEE6.4载体中，称为pHG1-2F8。
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
实施例3:用于表达猕猴IgG4-2F8和IgG4-7D8的表达载体
合成含有中国猕猴IgG4重链和κ轻链的编码区和Humab2F8和7D8的VH和VL区的载体，将其完全密码子优化并插在PEE12.4(重链)和pEE6.4(轻链)中。所用重链恒定区序列(基于由Scinicariello等,Immunology 111:66-74,2004描述的序列)如下(与人序列比对):
人IgG4
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH猕猴(Ch)IgG4
-STKGPSVFPLASCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
人IgG4
TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
猕猴(Ch)IgG4
TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYVCNVVHEPSNTKVDKRVEFT--
人IgG4
PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
猕猴(Ch)IgG4
PPCPACPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
人IgG4
QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
猕猴(Ch)IgG4
QFNWYVDGAEVHHAQTKPRERQFNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCKV
人IgG4
SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY
猕猴(Ch)IgG4
SNKGLPAPIEKTISKAKGQPREPQVYILPPPQEELTKNQVSLTCLVTGFY
人IgG4
PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF猕猴(Ch)IgG4
PSDIAVEWESNGQPENTYKTTPPVLDSDGSYLLYSKLTVNKSRWQPGNIF
人IgG4 SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:5)
猕猴(Ch)IgG4 TCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID NO:6)
使用的猕猴轻链恒定区(CL)序列是：
AVAAPSVFIFPPSEDQVKSGTVSVVCLLNNFYPREASVKWKVDGVLKTGNSQESVTEQDSKDNTYSLSSTLTLSSTDYQSHNVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:7)
实施例4：通过在HEK-293F细胞中瞬时表达生成抗体
按照制造商说明书，使用293fectin(Invitrogen)，通过在HEK-293F细胞(Invitrogen)中共转染相关的重链和轻链表达载体，在无血清条件下生成抗体。
实施例5：IgG1和IgG4抗体的纯化
通过蛋白A亲和层析纯化IgG1和IgG4抗体。将细胞培养上清液用0.20μM死端式滤器过滤，接着在5mL蛋白A柱(rProtein A FF,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上上样，用0.1M柠檬酸-NaOH，pH 3洗脱IgG。将洗脱液立即用2MTris-HCl,pH 9中和，并针对12.6mM磷酸钠，140mM NaCl,pH 7.4(B.Braun,Oss,The Netherlands)透析过夜。在透析后，将样品用0.20μM死端式滤器无菌过滤。通过比浊法和280nm处的吸光度确定纯化的IgG的浓度。将纯化的蛋白用SDS-PAGE、IEF、质谱法和糖分析法(glycoanalysis)分析。
实施例6：CH2-CH3片段的纯化
将有His标签的CH2-CH3蛋白通过固定化金属离子(Ni2+)亲和层析(Macherey-Nagel GmbH,Düren,Germany)纯化，用PBS平衡的PD-10柱(GE Healthcare)脱盐，用0.2μM死端式滤器无菌过滤。通过280nm处的吸光度测定纯化的蛋白质的浓度。通过SDS-PAGE分析了纯化蛋白的质量。
实施例7：通过人与猕猴IgG4抗体之间GSH诱导的Fab臂互换产生双特异性抗体
为了测试人与猕猴IgG4抗体之间的Fab臂交换，用人IgG4-2F8(抗EGFR)、IgG4-7D8(抗CD20)、猕猴IgG4-2F8和猕猴IgG4-7D8制备两种抗体所有可能的组合。对于体外Fab臂交换，将抗体混合物(在0.5mL PBS中以4μg/mL终浓度含有各种抗体)与0.5mM还原型谷胱甘肽(GSH)在37℃温育24小时。为终止还原反应，将.5mL PBS/0.05％Tween20(PBST)加至反应混合物。
用夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)通过测定双特异性结合测试双特异性抗体的存在情况。将ELISA板(Greiner bio-one,Frickenhausen,Germany)用2μg/mL(100μL/孔)重组EGFR胞外域在PBS中在4℃包被过夜。将板用PBST清洗一次。将系列稀释的抗体样品(0-1μg/mL，在3倍稀释液中)在PBST/0.2％BSA(PBSTB)中转移至包被的ELISA板(100μL/孔)，在室温(RT)在平板振荡器(300rpm)上温育60分钟。弃去样品，将板用PBS/0.05％Tween 20(PBST)清洗一次。接着，将板在平板振荡器(300rpm)上与含2μg/mL小鼠抗独特型单克隆抗体2F2 SAB1.1(针对7D8；Genmab)的PBTB(100μL/孔)温育60分钟。将板用PBS/0.05％Tween20(PBST)清洗一次。接着，将板在平板振荡器(300rpm)上与PBSTB(100μL/孔)中缀合有HRP的山羊抗小鼠IgG(15G；Jackson ImmunoResearch Laboratories,Westgrove,PA,USA；1:5.000)在RT一起温育60分钟。将板用PBS/0.05％Tween 20(PBST)清洗一次。加入ABTS(PBS中50mg/mL；Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)(100μL/孔)，并在RT避光温育30分钟。用2％草酸(100μL/孔；Riedel de Haen Seelze,Germany)终止反应。在RT10分钟后，在ELISA读板器中测量405nm处的吸光度。
图1显示人和猕猴IgG4的组合与相同物种的IgG4分子的各个组合相比产生更大的双特异性结合(更高的OD 405nm)。这些数据显示Fab臂互换发生在人IgG4与猕猴IgG4之间。而且，更高的双特异性结合提示人IgG4半分子显示优先与猕猴IgG4半分子二聚体化(异二聚体化)，导致Fab臂交换反应的平衡转向双特异性异二聚体而不是转向50％异二聚体和50％同二聚体的随机互换。
实施例8：人和猕猴IgG4的序列分析
为了尝试阐明与相同物种的IgG4分子之间的Fab臂交换相比的人与猕猴IgG4之间的Fab臂交换增加，分析了人和猕猴抗体的核心铰链和CH3-CH3界面氨基酸(关于人CH3-CH3界面残基的综述参见例如Dall’Acqua,等(1998)Biochemistry 37:9266)。图2显示中国猕猴IgG4的核心铰链序列是226-CPAC-229，并且CH3域含有在409位的赖氨酸(K)。此外，序列比对显示猕猴IgG4的特征在于与人IgG4相比在CH3-CH3界面的额外的三个氨基酸取代：在350位猕猴为异亮氨酸(I)对比人的苏氨酸(T)；在370位猕猴为苏氨酸(T)对比人的赖氨酸(K)；和在405位猕猴为亮氨酸(L)对比人的苯丙氨酸(F)。
实施例9：用人IgG4与含有猕猴IgG4CH3序列的人IgGl之间GSH诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体
基于实施例7所述人与猕猴IgG4之间的Fab臂交换，分析了中国猕猴IgG4CH3序列是否可参与人IgGl的Fab臂交换。因此，除了产生铰链序列CPSC的P228S突变外，将三重突变T350I-K370T-F405L(下文称为ITL)引入人IgGl_2F8中。将人IgG1-2F8突变体与人IgG4-7D8组合用于体外GSH诱导的Fab臂交换。将含有在0.5mL具有0.5mM GSH的PBS中4μg/mL终浓度的每种抗体的抗体混合物在37℃温育0-3-6-24小时。为了终止还原反应，将0.5mLPBS/0.05％Tween20(PBST)加至反应混合物。按照实施例7所述在ELISA中进行双特异性结合的测量。
图3证实与人IgG4-7D8组合时，单独引入CPSC铰链不使人IgG1-2F8参与GSH诱导的Fab臂交换。而且，将猕猴IgG4特异性CH3界面氨基酸(ITL)引入人IgG1-2F8中并同时保留野生型IgG1铰链，在这些条件下与人IgG4-7D8组合时也不导致参加Fab臂交换。相反，具有在铰链中的CPSC序列和猕猴IgG4特异性CH3界面氨基酸(ITL)的变体人IgGl-2F8主链序列，在与人IgG4-7D8发生GSH诱导的Fab臂交换后，显示比两种人IgG4抗体增加的双特异性结合。这些数据显示含CPSC的铰链与在350、370和405位分别含有I、T和L的CH3域组合，足以使人IgG1参加GSH诱导的Fab臂交换，并且与人IgG4组合时，交换反应的平衡向经交换的双特异性产物移动。
实施例10：通过人IgG4与IgG1或IgG4突变体之间的体内Fab臂交换产生双特异性抗体
为了进一步鉴定参与Fab臂交换需要的特征，体内分析了人IgG4和IgG1变体。对每组4只雌性SCID小鼠(Charles River,Maastricht,The Netherlands)i.v.注射抗体混合物，其在300μL总体积中含有600μg抗体(500μg 7D8+100μg2F8)。在注射后3、24、48和72小时从隐静脉抽取血液样品。将血液收集在含肝素的瓶中，以10,000g离心5分钟使细胞与血浆分离。产生双特异性抗体，接着按实施例7所述用在PBSTB中系列稀释的血浆样品在ELISA中评估CD20和EGFR双特异性反应性。用体外经交换的抗体混合物作为参考物，通过非线性回归曲线拟合(GraphPad Software,San Diego,CA)将血浆样品中的双特异性抗体量化。
图4显示其中铰链或CH3序列转化为相应的人IgG1序列(分别是CPPC或R409K)的人IgG4-2F8不再参加体内Fab臂交换。反之亦然，其中铰链区和CH3界面序列两者转化为相应的人IgG4序列(CPSC和K409R)人IgG1能够参与体内Fab臂交换。这些数据显示含CPSC的铰链(在228位的S)与在409位含精氨酸(R)的CH3域组合，足以使通过人IgG1和人IgG4在体内的Fab臂交换能够进行。
实施例11：通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体：稳定化铰链的绕开/破坏
2-巯基乙胺·HCl(2-MEA)是温和的还原剂，已被描述为选择性裂解抗体铰链区的二硫键，同时保留重链与轻链之间的二硫键。测试一系列浓度的2-MEA通过两种含有CPSC或CPPC铰链区的抗体之间的Fab臂交换诱导双特异性抗体产生的能力。将抗体混合物(含有各种0.5mg/mL终浓度的抗体)与一系列浓度的2-MEA(0，0.5，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0，15.0，25.0和40.0mM)以100μL Tris-EDTA(TE)总体积中于37℃温育90分钟。为了终止还原反应，按照制造商推荐用离心柱(Microcon离心过滤器，30k,Millipore)通过使样品脱盐除去还原剂2-MEA。按照实施例7所述在ELISA中测量双特异性结合。
对组合IgG4-2F8 x IgG4-7D8(其含有CPSC铰链区且已知参与GSH诱导的Fab臂交换)和组合IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC(其因为稳定的铰链区而不参与GSH诱导的Fab臂交换(描述于实施例9，图3))测试2-MEA诱导的Fab臂交换。令人惊奇地，如通过非还原性SDS-PAGE所确定的，发现2-MEA诱导轻链与重链分离(数据未显示)。但是，如图5所示产生功能性双特异性抗体。在2.0mM2-MEA浓度下达到在野生型人IgG4-2F8与IgG4-7D8之间的Fab臂交换后双特异性结合的最大水平，其与实施例9所述的用0.5mM GSH所达到的水平(图3)相当。但是，2-MEA能够以剂量依赖性方式诱导人抗体IgG1-2F8-1TL与IgG4-7D8-CPPC(具有稳定的铰链区)之间的Fab臂交换。虽然在低2-MEA浓度形成很少或不形成双特异性抗体(这可能是因为两种抗体的铰链区都存在CPPC序列所致)，但在更高浓度的2-MEA下非常有效地产生双特异性抗体。在25mM2-MEA达到最大的双特异性结合，其超过在两种野生型IgG4抗体之间的Fab臂交换后的最大结合。这些最大结合水平与实施例9(图3)关于对含有CPSC铰链的相应抗体(IgG1-2F8-CPSC-ITL)的GSH处理所述的最大结合水平相当。因为IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC两者都含有CPPC铰链，所以这些数据提示2-MEA可绕过体外Fab臂交换对CPSC铰链的需要。
实施例12：在通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体后的质谱法
通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体描述于实施例11，其中双特异性结合通过ELISA显示(图5)。为了证实形成双特异性抗体，通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析样品以确定分子量。首先，通过将200μg抗体与0.005U N-聚糖酶(产品目录号GKE-5006D；Prozyme)在180μL PBS中在37℃温育过夜使样品去糖基化。将样品在具有BEH300C18,1.7μm,2.1x50mm柱的Aquity UPLCTM(Waters,Milford,USA)上60℃脱盐，用含0.05％甲酸(FlukaRiedel-de
Figure BDA0000528413460000981
Buchs,Germany)的LC-MS级乙腈(洗脱剂B)(Biosolve,Valkenswaard,TheNetherlands)和MQ水(洗脱剂A)的混合物梯度洗脱。在以正离子模式操作的micrOTOFTM质谱仪(Bruker,Bremen,Germany)上在线记录飞行时间电喷雾电离质谱。在分析前，用ES调谐混合物(tuning mix)(Agilent Technologies,Santa Clara,USA)校准500-4000m/z标度。通过用由DataAnalysisTM软件3.4版本(Bruker,Bremen,Germany)提供的Maximal Entropy对质谱解卷积。基于在本实验用于Fab臂交换的抗体分子量，可将双特异性抗体与原来的抗体区别开来(还描述于实施例15，对于IgG1-2F8-ITLxIgG4-7D8-CPPC，见图9C)。对于双特异性抗体的峰，确定曲线下面积，并除以曲线下总面积以计算每个样品中的双特异性抗体百分数。
图6A显示用0mM2-MEA(对应于亲本抗体的两个峰)、7mM2-MEA(对应于亲本和双特异性抗体的三个峰)和40mM2-MEA(对应于双特异性抗体的一个峰)进行的IgG1-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的Fab臂交换反应的***性质谱曲线。双特异性产物的均匀峰提示不发生轻链错配(这会导致再分的峰)。定量数据在图6B中呈现，显示IgG1-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的Fab臂交换产生接近100％双特异性抗体。相反，野生型IgG4抗体之间的Fab臂交换产生少于50％双特异性产物。这些数据证实描述于实施例11的双特异性结合ELISA的结果(图5)。
实施例13：通过2-MEA诱导Fab臂交换产生的双特异性抗体的稳定性
测试通过2-MEA诱导的体外Fab臂交换产生的双特异性抗体的稳定性。因此，将2μg用7.0mM2-MEA从IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC产生的双特异性样品(如实施例11所述，图5)在一系列浓度(0、2、20、100μg)的无关IgG4(针对乙酰胆碱受体的IgG4-MG)的存在下用于GSH诱导的Fab臂交换反应，所述一系列浓度代表与2μg双特异性测试样品相比0，1，10，50倍过量的IgG4-MG。在该反应中的Fab臂交换会导致双特异性EGFR/CD20结合的丧失。GSH还原反应的条件与实施例7所述相同(在37℃在0.5mLPBS/0.5mM GSH中24小时)。为了终止还原反应，将0.5mL PBSTB加至反应混合物。按照实施例7所述在ELISA中测量双特异性结合。将GSH还原反应后的双特异性结合相对于在起始材料(对照)中测量的双特异性结合(其设置为100％)表示。
图7A显示对于IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC衍生的双特异性样品，在无关IgG4的存在下GSH诱导的Fab臂交换后的EGFR/CD20双特异性结合无明显改变。这指示双特异性产物稳定，即不参与GSH诱导的Fab臂交换。作为对照，图7B显示IgG4-2F8 x IgG4-7D8衍生的样品显示在无关IgG4的存在下GSH诱导的Fab臂交换后减少的EGFR/CD20双特异性结合，指示该产物不稳定。这些数据显示由在CH3域含有三重突变T350I-K370T-F405L的人IgGl重链和含有产生稳定化铰链(CPPC)的S228P取代的人IgG4重链组成的异二聚体是稳定的。
实施例14：通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体的药动学和稳定性的体内分析
将通过IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC之间体外2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体(实施例11，图5，7mM2-MEA)注射在SCID小鼠中以分析其与亲本抗体IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC比较的稳定性(体内Fab臂交换)和药动学性质(血浆清除率)。对三组小鼠(每组3只小鼠)尾静脉内静脉内注射200μL纯化抗体：(1)100μg双特异性抗体；(2)100μg双特异性抗体+1,000μg无关IgG4(那他珠单抗，抗-α4-整联蛋白)；(3)50μg IgG1-2F8-ITL+50μg IgG4-7D8-CPPC。在抗体施用后以预定时间间隔(10分钟、3小时、1、2、7、14、21天)通过颊穿刺收集血液样品(50-100μL)。将血液收集在含肝素的小瓶内，以14,000g离心10分钟。在进一步分析以前将血浆贮存于-20℃。
通过ELISA测定血浆样品中的总IgG浓度。后续步骤的测定条件与实施例7所述ELISA的相同。用于总IgG测量的具体化合物如下：用2μg/mL小鼠抗人IgG(克隆MH16-1；CLB；产品目录号M1268)包被；血清样品稀释液(对于第1和3组为1:500和1:2,500)和(对于第2组为1:2,500和1:10,000)；缀合物：缀合有HRP的山羊抗人IgG(克隆11H；Jackson；产品目录号109-035-098；1:10,000)。测定血浆样品中双特异性抗体的存在，并通过如实施例10所述在ELISA中的CD20和EGFR双特异性反应性来量化。
图8A显示总抗体血浆浓度。血浆清除曲线的形状在所有组中是相同的，指示在分析时间间隔里双特异性抗体的血浆清除与亲本抗体IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC相同。图8B显示随着时间推移双特异性抗体的血浆浓度。将10倍过量的无关IgG4加至双特异性抗体不影响双特异性抗体浓度，指示不发生体内Fab臂交换。在注射亲本抗体(IgG1-2F8-ITL+IgG4-7D8-CPPC)后，血浆中检测不到双特异性抗体，证实这些抗体不参与体内Fab臂交换。这些数据提示通过IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC之间的体外2-MEA诱导Fab臂交换产生的双特异性抗体产物，在体内稳定(无Fab臂交换)并显示与亲本单价抗体相当的药代动力学性质(血浆清除率)。
实施例15：通过两种抗体之间2-MEA诱导Fab臂交换产生的双特异性抗体的纯度
将通过人IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC之间2-MEA诱导Fab臂交换产生的双特异性抗体批次，在PD-10脱盐柱(产品目录号17-0851-01；GEHealthcare)上纯化。接着，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效大小排阻层析(HP-SEC)和质谱法分析双特异性产物的纯度。通过在ELISA中的双特异性结合(数据未显示)证实了产生的双特异性抗体的功能性。
用改良的Laemmli法(Laemmli1970Nature227(5259):680-5)在4-12％NuPAGEBis-Tris凝胶(Invitrogen,Breda,The Netherlands)上在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE，其中在中性pH运行样品。将SDS-PAGE凝胶用考马斯染色，并用GeneGenius(Synoptics,Cambridge,UK)数字成像。图9A显示在Fab臂交换后的抗体样品由完整IgG和在非还原凝胶上可检测到的痕量半分子(H1L1)构成(图9A-b)。
用连接TSK HP-SEC柱(G3000SWxl；Toso Biosciences,via Omnilabo,Breda,TheNetherlands)和Waters2487双重λ吸光度检测器(Waters)的Waters Alliance2695分离单元(Waters,Etten-Leur,The Netherlands)进行HP-SEC分级。使样品以1mL/min运行。将结果用2002版Empower软件处理,并将每个峰表示为总峰高的百分数。图9B显示>98％的样品由完整IgG构成，实际上不形成聚集物。
按照实施例12所述进行质谱法。图9C显示起始材料IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC以及通过IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC之间的Fab臂交换产生的双特异性产物的质谱概貌。在Fab臂交换的样品中的产物是145,901kDa，其与从IgG1-2F8-ITL(146,259.5/2＝73,130)+IgG4-7D8-CPPC(145,542.0/2＝72,771)衍生的双特异性产物完全相配。此外，双特异性抗体产物显示均匀的峰，提示不发生会导致产生再分的峰的轻链错配。这些数据显示Fab臂交换产生100％双特异性抗体。除了IgG4-7D8-CPPC和双特异性样品的主峰(K0)以外所检测到的小峰可归因于抗体重链中存在一个(K1)或两个(K2)C-端赖氨酸。
这些数据显示约100％功能性双特异性抗体样品是通过IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC之间的2-MEA诱导Fab臂交换产生的。
实施例16：阐明人IgG1进行Fab臂交换对T350I、K370T和F405L取代的需要
为了进一步鉴定IgG1参与Fab臂交换所需要的在IgGl CH3域中的决定簇(determinant)，将含有三重突变T350I-K370T-F405L(ITL)的IgG1与双重突变体T350I-K370T(IT)，T350I-F405L(IL)和K370T-F405L(TL)比较。还测试单突变体405L(L)。用2-MEA作为还原剂以诱导体外Fab臂交换(50μg每种抗体在100μL PBS/25mM2-MEA中在37℃达90分钟)。对于单突变体F405L抗体，在使用Amicon Ultra离心装置(30k,Millipore,产品目录号UFC803096)将缓冲液更换为PBS后使用来自瞬时转染上清液的未纯化抗体。为了终止还原反应，按照实施例11所述使用离心柱通过使样品脱盐除去还原剂2-MEA。通过在按照实施例7所述的ELISA中测量的双特异性结合来确定双特异性抗体的产生。
将三重突变(ITL)、双重突变(IT、IL和TL)和单突变(L)引入IgG1-2F8中。将这些突变体与含有CPSC铰链(野生型)或稳定化铰链(IgG4-7D8-CPPC)的IgG4-7D8组合，在37℃用25mM2-MEA进行Fab臂交换90分钟。图10A-B显示IgG1-2F8-IL和-TL突变体显示与三重突变体ITL相同水平的Fab臂交换，这与组合的IgG4-7D8(CPSC或CPPC铰链)无关。相比之下，对于与IgG1-2F8-IT突变体的组合未发现双特异性结合。图10C显示IgG1-2F8-F405L突变体也显示Fab臂交换，这与组合的IgG4-7D8(CPSC或CPPC铰链)无关。这些数据指示在上述条件下F405L突变足以使人IgGl参与Fab臂交换。
实施例17：在不同温度下通过2-MEA诱导Fab臂交换产生双特异性抗体
在不同温度下测试2-MEA诱导通过两种不同抗体之间的Fab臂交换产生双特异性抗体的能力。通过在0℃、20℃(RT)或37℃在320μl PBS/25mM2-MEA中将160μg人IgG1-2F8-ITL与160μg IgG4-7D8-CPPC(每种抗体终浓度为0.5mg/mL)一起温育开始Fab臂交换反应。从这些反应中，在不同时间点(0、2.5、5、10、15、30、45、60、75、90、120、150、180和240分钟)取出20μL样品。将20μL PBS加至每个样品，之后按照制造商的推荐，用Zeba96孔离心脱盐板(7k,产品目录号89808Thermo Fisher Scientific)通过使样品脱盐，除去还原剂2-MEA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Isogen Life Science,Maarssen,The Netherlands)通过测量280nm波长的吸光度确定总抗体浓度。按照实施例7所述在ELISA中使用系列稀释的抗体样品(总体浓度0-20μg/mL，在25倍稀释液中)测量双特异性结合。
图11显示发现通过人IgG1-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体在37℃最有效，45分钟后达到最大双特异性结合。在室温，双特异性抗体的产生更慢，240分钟后达到最大双特异性结合。在0℃，在分析时间过程期间观察不到双特异性结合的产生。
实施例18：对不同还原剂分析其诱导通过体外Fab臂交换产生双特异性抗体的能力
上文已显示0.5mM GSH可在体外诱导人IgG4与IgG1-CPSC-ITL之间而不是人IgG4与含有稳定铰链的IgG1-ITL之间的Fab臂交换(图3)。此外，发现2-MEA能够诱导具有稳定化铰链区的抗体诸如IgG1-ITL x IgG4-CPPC之间的Fab臂交换(图5)。为了测试是否其它浓度的GSH或2-MEA或者其它还原剂能够体外诱导两种不同抗体之间的Fab臂交换，测试一系列浓度的2-MEA、GSH和DTT(二硫苏糖醇)。因此，将20μl PBS中10μg人IgG1-2F8-ITL和10μgIgG4-7D8-CPPC(每种抗体终浓度为0.5mg/mL)的组合与一系列浓度的不同还原剂(0.0，0.04，0.1，0.2，0.5，1.0，2.5，5.0，12.5，25.0和50.0mM)在37℃温育。90分钟后，将20μL PBS加至每种样品，并按照实施例17所述用离心脱盐板通过使样品脱盐除去还原剂。按照实施例17所述确定总抗体浓度。按照实施例7所述在ELISA中使用抗体样品的系列稀释液(总抗体浓度0-20μg/mL，3倍稀释)测量双特异性结合。
图12证实2-MEA在25mM2-MEA浓度下诱导最大双特异性结合。发现DTT非常有效地产生双特异性抗体，在2.5mM DTT下达到最大双特异性结合。在0-5mM范围的GSH浓度不能诱导通过IgG1-ITL与IgG4-CPPC抗体(两者都含有稳定化铰链区)之间的Fab臂交换产生双特异性抗体。更高的GSH浓度(12.5-50mM)导致形成抗体聚集物，如通过非还原性SDS-PAGE(数据未显示)所确定的。因此，从分析中排除这些样品。这些数据显示不同还原剂可诱导通过两种不同抗体之间的Fab臂交换产生双特异性抗体。
实施例19：用于与IgG1-ITL组合参加2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1409位的决定簇
2-MEA可诱导人IgG1-ITL和IgG4-CPPC之间的Fab臂交换，如实施例11所述(图5)。人IgG1与IgG4的CH3界面残基区别只在于409位：IgG1为赖氨酸(K)和IgG4为精氨酸(R)(描述于实施例8，图2)。因此，测试在409位用精氨酸或任何其它氨基酸取代赖氨酸(K409X)，是否可使IgG1能够参加2-MEA诱导的与IgG1-ITL的Fab臂交换。将20μl PBS/25mM2-MEA中10μg人IgG1-2F8-ITL和10μg IgG1-7D8-K409X的组合(每种抗体终浓度为0.5mg/mL)在37℃温育90分钟。在用Amicon Ultra离心单元(30k,Millipore,产品目录号UFC803096)将缓冲液更换为PBS后，使用来自瞬时转染上清液的未纯化抗体。在Fab臂交换反应后，将20μL PBS加至每种样品，按照实施例17所述使用离心脱盐板通过使样品脱盐除去还原剂。按照实施例7所述在ELISA中使用抗体样品的系列稀释液(总抗体浓度0-20μg/mL，在3倍稀释液中)测量双特异性结合。
图13A显示在IgG1-2F8-ITL x IgG1-7D8-K409X之间2-MEA诱导的Fab臂交换后双特异性结合的结果。在图13B中，将交换表示为相对于纯化批次的双特异性抗体(将其设为100％)的双特异性结合，所述双特异性抗体从IgG1-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的2-MEA诱导的Fab臂交换衍生。如表I表示，还将这些数据评分为(-)无Fab臂交换、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。当IgG1-7D8的409位是K(＝野生型IgG1)、L或M时发现无Fab臂交换(-)。发现Fab臂交换当IgG1-7D8的409位是F、I、N或Y时是中度(+)，当IgG1-7D8的409位是A、D、E、G、H、Q、R、S、T、V或W时为高度(++)。
表1：2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL和IgG1-7D8-K409X突变体之间的Fab臂交换。通过夹心ELISA确定2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL和IgG1-7D8-K409X突变体之间的体外Fab臂交换后双特异性抗体的产生。(-)无，(+/-)低度，(+)中度，(++)高度Fab臂交换。
Fab-臂交换
IgG1-7D8-K409X X IgG1-2F8-ITL
A ++
D ++
E ++
F +
G ++
H ++
I +
K -
L -
M -
N +
Q ++
R ++
S ++
T ++
V ++
W ++
Y +
实施例20:抗体去糖基化不影响通过2-MEA诱导Fab臂交换产生双特异性抗体
通过在180μL PBS中将200μg抗体与0.005U N-聚糖酶(Glycanase)(产品目录号GKE-5006D；Prozyme)在37℃温育过夜使IgG4-7D8和IgG4-7D8-CPPC样品去糖基化。这些样品直接用于Fab臂交换反应。通过将100μl PBS/25mM2-MEA中的50μg每种抗体(每种抗体终浓度为0.5mg/mL)中在37℃温育90分钟进行Fab臂交换。按照实施例11所述用离心柱通过使样品脱盐来除去还原剂2-MEA。按照实施例7所述在三明治式ELISA中用抗体样品的系列稀释液(总抗体浓度0-20μg/mL，3倍稀释)测量双特异性结合。
质谱法分析显示去糖基化反应产生100％去糖基化抗体产物(数据未显示)。图14显示涉及去糖基化抗体的Fab臂交换与用相应糖基化抗体的Fab臂交换无区别(IgG4-2F8xIgG4-7D8-去糖基化的对比IgG4-2F8x IgG4-7D8和IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC-去糖基化的对比IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC)。这些数据提示去糖基化不影响通过2-MEA诱导Fab臂交换产生双特异性抗体。
实施例21:非共价CH3-CH3相互作用的量化
在CH3界面的相互作用的强度应当使得亲本抗体的两条重链在Fab臂交换反应中都有可能解离并且它们随后有可能在异二聚体化反应中结合。因此，分析了参与Fab臂交换的能力与非共价CH3-CH3相互作用强度(解离常数，KD)之间的相关性。对于下列人抗体组合按照实施例9所述(在37℃0.5mMGSH)进行GSH诱导的Fab臂交换：
IgG1-2F8x IgG1-7D8
IgG1-2F8-CPSC x IgG1-7D8-CPSC
IgG1-2F8-CPSC-T350I x IgG1-CPSC-7D8-T350I
IgG1-2F8-CPSC-K370T x IgG1-7D8-CPSC-K370T
IgG1-2F8-CPSC-ITL x IgG1-7D8-CPSC-ITL
IgG1-2F8-CPSC-K409R x IgG1-7D8-CPSC-K409R
IgG4-2F8x IgG4-7D8
IgG4-2F8-R409K x IgG4-7D8-R409K
IgG4-2F8-R409A x IgG4-7D8-R409A
IgG4-2F8-R409L x IgG4-7D8-R409L
IgG4-2F8-R409M x IgG4-7D8-R409M
IgG4-2F8-R409T x IgG4-7D8-R409T
IgG4-2F8-R409W x IgG4-7D8-R409W
IgG4-2F8-F405A x IgG4-7D8-F405A
IgG4-2F8-F405L x IgG4-7D8-F405L
IgG4-2F8-Y349D x IgG4-7D8-Y349D
IgG4-2F8-L351K x IgG4-7D8-L351K
IgG4-2F8-E357T x IgG4-7D8-E357T
IgG4-2F8-S364D x IgG4-7D8-S364D
IgG4-2F8-K370Q x IgG4-7D8-K370Q
IgG4-2F8-K370E x IgG4-7D8-K370E
通过按照实施例7所述在夹心ELISA中确定双特异性结合，来测量双特异性抗体的产生。图15A/B/C显示Fab臂交换反应后双特异性结合的结果。
为了测量上文提及的CH3突变对CH3-CH3相互作用强度的影响，生成只由CH2-CH3域组成的片段。在这些片段中铰链区的缺乏防止共价的重链间二硫键。通过天然质谱法分析片段。使用10kDa MWCO旋转过滤柱将样品缓冲液更换为100mM乙酸铵pH 7。将系列稀释的样品(20μM-25nM；单体当量)的等分试样(约1μL)加载到镀金硼硅酸盐毛细管中用于在LCT质谱仪(Waters)上分析。将单体信号Ms定义为单体峰面积占谱中所有峰面积的分数(Ms/(Ms+Ds)，其中Ds＝二聚体信号)。将平衡时的单体浓度[M]eq定义为Ms.[M]0，其中[M]0是就单体而言的总蛋白浓度。将平衡时的二聚体浓度[D]eq定义为([M]0-[M]eq)/2。然后从[D]eq对比[M]eq 2的曲线的斜率求出KD。表2呈现非共价CH3-CH3相互作用的KD。
分析参与Fab臂交换的能力与非共价CH3-CH3相互作用强度之间的关系。图15D/E显示针对相应CH2-CH3片段的测量KD作图的在Fab臂交换后的双特异性结合百分数(图15D关于IgG1；图15E关于IgG4)。这些数据提示在测试条件下有允许有效Fab臂交换的CH3-CH3相互作用的表观KD值的具体范围。
表1：非共价CH3-CH3相互作用的KD
Figure BDA0000528413460001061
Figure BDA0000528413460001071
*与野生型IgG1或IgG4的相应CH2-CH3片段相比
实施例22：分析不同还原剂(reductantia)诱导通过IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间体外Fab臂交换产生双特异性抗体的能力
发现2-MEA和DTT诱导人IgG1-ITL和IgG4-CPPC之间的体外Fab臂交换(图12)。测试这些还原剂是否也可诱导人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab臂交换。测试了一系列浓度的2-MEA、DTT、GSH和TCEP(三(2-羧乙基)膦)。按照实施例18所述进行Fab臂交换。不同还原剂的测试浓度系列如下：0.0，0.04，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，25.0，50.0mM2-MEA，GSH，DTT或TCEP。
图17证实2-MEA在25mM2-MEA的浓度下诱导最大Fab臂交换，在50.0mM2-MEA的更高浓度下持续。发现DTT非常有效地产生双特异性抗体，在0.5mM DDT下达到最大Fab臂交换，在更高浓度的DTT(1.0-50.0mM)也持续。发现TCEP也非常有效地产生双特异性抗体，在0.5mM下达到最大Fab臂交换。在≥25.0mM的浓度，通过TCEP的Fab臂交换受到干扰。0.0-5.0mM范围的GSH浓度不能诱导通过Fab臂交换产生双特异性抗体。更高的GSH浓度(25.0-50.0mM)导致抗体聚集物形成(数据未显示)。因此，从分析中排除这些样品。这些数据显示不同还原剂可诱导通过两种不同抗体之间的Fab臂交换产生双特异性抗体。
实施例23：通过IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体
为了证实通过人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换形成双特异性抗体，通过ESI-MS确定来自用一系列浓度的2-MEA进行的Fab臂交换反应的样品的分子量。测试的浓度系列如下：0.0，0.5，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0，15.0，25.0和40.0mM2-MEA。按照实施例11所述进行Fab臂交换(在PBS中)和夹心ELISA。按照实施例12所述进行ESI-MS。
图18A显示2-MEA以剂量依赖性方式诱导IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换，有效地导致产生双特异性抗体，在15.0mM2-MEA浓度下达到最大水平的双特异性结合。图18B呈现量化的ESI-MS数据，显示IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换产生接近100％双特异性抗体，证实双特异性结合ELISA的结果。
实施例24：通过人IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体的纯度
用PD-10脱盐柱(产品目录号17-0851-01；GE Healthcare)纯化通过人IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体批次。接着，按照实施例12所述通过质谱法分析双特异性产物的纯度。
图19显示起始材料IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R以及通过IgG1-2F8-F405Lx IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换产生的双特异性产物的质谱概貌。Fab臂交换的样品中的产物是146,160.7kDa,其与从IgG1-2F8-F405L(146,606.8/2＝73,303.3)x IgG1-7D8-K409R(146,312.2/2＝73,156.1)＝146,459.4kDa衍生的双特异性产物相配。而且，双特异性抗体产物显示均匀的峰，指示不发生会导致再分的峰的轻链错配。这些数据显示Fab臂交换产生大约100％双特异性抗体。
实施例25：通过2-MEA诱导的Fab臂交换从IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R产生的双特异性抗体的稳定性和药动学的体内分析
按照实施例14所述将通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的体外2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体在SCID小鼠中注射以分析其稳定性(体内Fab臂交换)和药动学性质。分析两组小鼠(每组3只小鼠):(1)100μg双特异性抗体；(2)100μg双特异性抗体+1,000μg无关IgG4(IgG4-637，描述于W02007068255)。按照实施例14所述通过ELISA测定血浆样品中的总IgG浓度，但在本实施例中，用缀合有HRP的山羊抗人IgG(Jackson,产品目录号109-035-098,1/10,000)作为缀合物用于检测。通过在按照实施例14所述的夹心ELISA中的CD20和EGFR双特异性反应性来测定和量化血浆样品中双特异性抗体的存在。
图20A显示随时间推移的总抗体血浆浓度。两组的血浆清除曲线形状完全相同。图20B显示随时间推移双特异性抗体的血浆浓度。将10倍过量的无关IgG4加至双特异性抗体不影响双特异性抗体浓度，指示体内不发生Fab臂交换。这些数据提示通过IgG1-2F8-F405Lx IgG1-7D8-K409R之间的体外2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体产物在体内是稳定的(无Fab臂交换)。
实施例26：通过人IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体的CDC介导的细胞杀伤
CD20抗体IgG1-7D8可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)有效地杀伤CD20表达细胞。相反，EGFR抗体IgG1-2F8对表达EGFR的靶细胞不介导CDC。测试突变体IgG1-7D8-K409R和通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体是否仍然能够对CD20表达细胞诱导CDC。将105个Daudi或Raji细胞与一系列浓度的抗体在80μL补充有0.1％BSA的RPMI培养基中在振荡器上在室温预温育15分钟。加入20μL正常人血清(NHS)作为补体来源(20％NHS终浓度)，在37℃温育45分钟。加入30μL补充有0.1％BSA的冰冷RPMI培养基以终止CDC反应。通过加入10μL 10Pg/mL碘化丙锭(PI)(1μg/mL终浓度)和FACS分析区分死细胞和活细胞。
图21显示IgG1-7D8对表达CD20的Daudi(图21A)和Raji(图21B)细胞的CDC介导的细胞杀伤不受引入K409R突变的影响。Daudi和Raji细胞两者都不表达EGFR，导致通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体的单价结合。但是，双特异性抗体仍然诱导CD20表达细胞的CDC介导的细胞杀伤。这些数据指示在双特异性形式中保留亲本抗体的CDC能力。
实施例27：通过人IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体的ADCC介导的细胞杀伤
EGFR抗体IgG1-2F8可通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)杀伤EGFR表达细胞，比如A431。A431细胞不表达CD20，因此CD20抗体IgG1-7D8不对这些细胞诱导ADCC。测试突变体IgG1-2F8-F405L和通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体是否仍然能够对A431细胞诱导ADCC。对于效应细胞分离，按照制造商推荐用
Figure BDA0000528413460001101
管(Greiner Bio-one,产品目录编号227290)从健康供体的全血分离外周血单核细胞(PBMC)。通过在1mL补充0.1％BSA的RPMI培养基中将100μCi51Cr加至5x106个A431细胞中，并在37℃振荡水浴中温育60分钟，来标记靶细胞。将标记的细胞清洗，重悬于补充有0.1％BSA的RPMI中。将在补充有0.1％BSA的RPMI中的5x104个标记靶细胞与一系列浓度的抗体(在ADCC测定中终浓度范围为0-10μg/mL，3倍稀释)以100μL在室温下预温育15分钟。通过以E:T比率100:1加入50μL效应细胞(5x106个细胞)开始ADCC测定。在37℃4小时后，按照每分钟计数(cpm)在闪烁计数器中测量一式三份实验的51Cr释放。用以下公式计算细胞毒性的百分比：比裂解(specific lysis)的百分比＝(实验cpm-基础cpm)/(最大cpm-基础cpm)X 100。通过将50μL5％Triton X-100加至50μL靶细胞(5x104个细胞)确定最大51Cr释放，在不存在致敏抗体和效应细胞的情况下测量基础释放。
图22显示CD20特异性抗体IgG1-7D8不对CD20阴性A431细胞诱导ADCC。IgG1-2F8和突变体IgG1-2F8-F405L两者都能够对A431细胞诱导ADCC，指示在IgG1-2F8中引入F405L突变不影响其ADCC效应器功能。从IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R衍生的双特异性抗体也以剂量依赖性方式对A431细胞诱导ADCC，指示在双特异性形式中保留ADCC效应器功能。
实施例28：用于与IgG1-K409R组合参加2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1405位的决定簇
在实施例16中描述了当与IgG4-7D8组合时，F405L突变足以使人IgG1能够参加Fab臂交换。为了进一步测试与人IgG1-K409R组合参加2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1405位的决定簇，将所有可能的IgG1-2F8-F405X突变体(除了C和P以外)与IgG1-7D8-K409R组合。按照实施例19所述用纯化的抗体进行操作。
图23显示在IgG1-2F8-F405X和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换后双特异性结合的结果。如表3所呈现的，还将这些数据评分为(-)无Fab臂交换、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。当IgG1-2F8的405位是F(＝野生型IgG1)时发现无Fab臂交换(-)。发现当IgG1-2F8的405位是G或R时Fab臂交换是低度的(+/-)。发现当IgG1-2F8的405位是A、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y时Fab臂交换是高度的(++)。这些数据指示当与IgG1-K409R组合时，在IgG1405位的特定突变允许IgG1参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表3：在IgG1-2F8-F405X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂互换。通过夹心ELISA确定在IgG1-2F8-F405X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。(-)无，(+/-)低度，(+)中度，(++)高度Fab臂互换。
实施例29：用于与IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂互换的在IgG1 407位的决定簇
在实施例28中，描述了当与IgG1-K409R组合时，在F405位的某些单突变足以使人IgG1能够参与Fab臂互换。为了测试其它涉及CH3域中的Fc:Fc界面位置的决定簇是否也可介导Fab臂互换机制，进行了IgG1 407位的诱变，并对突变体测试与人IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂互换。将所有可能的IgG1-2F8-Y407X突变体(除了C和P以外)与IgG1-7D8-K409R组合。按照实施例19所述用纯化的抗体进行操作。
图24显示在IgG1-2F8-Y407X x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂互换后双特异性结合的结果。如表4所呈现，也将这些数据评分为(-)无Fab臂互换、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂互换。发现当IgG1-2F8的407位是Y(＝野生型IgG1)、E、K、Q或R时无Fab臂互换(-)。发现Fab臂互换当IgG1-2F8的407位是D、F、I、S或T时为低度的(+/-)，当IgG1-2F8的407位是A、H、N或V时为中度的(+)，当IgG1-2F8的407位是G、L、M或W时为高度的(++)。这些数据指示当与IgG1-K409R组合时在IgG1407位的特定单突变允许IgGl参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表4：在IgG1-2F8-Y407X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换。
通过夹心ELISA确定在IgG1-2F8-Y407X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的体外Fab臂交换后双特异性抗体的产生。(-)无，(+/-)低度，(+)中度，(++)高度Fab臂交换。
Figure BDA0000528413460001121
实施例30：在IgG1异二聚体中非共价CH3-CH3相互作用的量化
在实施例21中描述了有允许有效的Fab臂交换的CH3-CH3同二聚体相互作用强度的具体范围。在CH3界面的相互作用的强度应当使得有可能的是亲本抗体(同二聚体)中两条重链在Fab臂交换反应都解离并且它们随后在异二聚体反应中结合。为了产生稳定的异二聚体，异二聚体相互作用的强度应当大于同二聚体相互作用的强度，使得相对于同二聚体化而言利于异二聚体化。为了证实这点，测量异二聚体中CH3-CH3相互作用的强度并与同二聚体的强度比较。按照实施例21所述测量从IgG1-K409R、IgG1-F405L和IgG1-ITL同二聚体衍生的CH2-CH3片段的KD。对于异二聚体中KD的测定，将CH2-CH3域片段(G1-F405L和G1-ITL)和含有除铰链外的所有抗体域的IgG1-7D8-K409R的IgG1Δ铰链片段混合。在两条片段中都缺乏铰链区防止共价的重链间二硫键。将片段混合，24小时后如实施例21所述通过天然质谱法分析。表5中呈现在所示CH2-CH3片段或者CH2-CH3片段与IgG1Δ铰链混合物中非共价CH3-CH3相互作用的KD值。这些数据提示在测试条件下，异二聚体相互作用的强度大于(更低KD)相应的同二聚体相互作用。
表2
Figure BDA0000528413460001141
实施例31：通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体的生物化学分析
在PD-10脱盐柱(产品目录号17-0851-01；GE Healthcare)上纯化通过人IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体批次。接着，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效大小排阻层析(HP-SEC)、质谱法、HPLC阳离子交换层析(HPLC-CIEX)、毛细管等电聚焦(cIEF)分析双特异性产物的纯度。
按照实施例15所述在非还原(图25A)和还原(图25B)条件下进行SDS-PAGE。图25A显示在2-MEA诱导的Fab臂交换后的抗体样品由完整IgG和在非还原凝胶上可检测到的痕量半分子(H1L1)组成。
按照实施例15所述进行HP-SEC。图26(B)和图26(A)分别显示起始材料IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的HP-SEC概貌。图26C和图26D中分别显示两种抗体的混合物(1:1)和通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导Fab臂交换产生的双特异性产物。此外，图26D显示>99％样品由完整IgG组成，几乎不形成聚集物。
按照实施例12所述进行质谱法(ESI-MS)。图27(B)和图27(A)分别显示起始材料IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的质谱概貌。图27C和图27D中分别显示两种抗体的混合物(1:1)和通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性产物。在2-MEA诱导Fab臂交换的样品中的产物是146,159.7kDa，其与从IgG1-2F8-F405L(146,289.0/2＝73,145)x IgG1-7D8-K409R(146,028.0/2＝73,014)衍生的双特异性产物完全相配。此外，双特异性抗体产物显示均匀的峰，指示不发生会导致产生再分的峰的轻链错配。这些数据显示2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性IgG。用(*)表示的小峰源自分析前的不完全去糖基化。这些数据显示通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体样品。
用iCE280Analyzer(Convergent Biosciences)进行毛细管等电聚焦(cIEF)。图28A和图28B分别显示起始材料IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的cIEF谱。图28C和图28D中分别显示两种抗体的混合物(1:1)以及通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换产生的双特异性产物。使用之前将所有样品脱盐。测定混合物的终浓度是0.3mg/mL IgG(0.35％甲基纤维素；2％Carrier Ampholytes3-10；6％Carrier Ampholytes8-10.5；0.5％pI标志物7.65和0.5％pI标志物10.10)。在3000V进行聚焦7分钟，通过电荷偶联的装置照相机获取全毛细管吸收图像。在校正峰谱后，通过EZChrom软件分析数据。将Pl标志物用(*)表示。这些数据显示通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体样品。
另一种研究单克隆抗体荷电同种型的技术是高压液相层析阳离子交换(HPLC-CIEX)。图29A和图29B分别显示起始材料IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的HPLC-CIEX概貌。图29C和图29D中分别显示两种抗体的混合物(1:1)以及通过IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性产物。将样品在流动相A(10mMNaP04,pH 7.0)中稀释至1mg/mL用于注入HPLC上。将不同荷电的IgG分子用
Figure BDA0000528413460001151
WCX-10,4mm x250mm，分析柱分离，流速为1mL/min。用流动相A至流动相B(10mM NaPO4,pH 7.0，0.25M NaCl)的梯度进行洗脱，在280nm进行检测。这些数据显示通过IgG1-2F8-F405L xIgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导Fab臂交换产生双特异性抗体样品。还显示阳离子交换是从异二聚体中分离残留同二聚体的有力工具。因此，阳离子交换层析的另一种应用是精炼双特异性异二聚体，即纯化掉交换后的任何残留的同二聚体。
实施例32：通过使用HPLC-CIEX监测2-MEA诱导的Fab臂交换的动力学和量化交换后的残留同二聚体
按照实施例11所述通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体。在本实施例中，通过在交换反应期间的各个时间点进行高压液相层析阳离子交换(HPLC-CIEX；如实施例31描述)监测交换反应。
将各自浓度为1mg/mL的同二聚体IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R以1:1摩尔比混合。在加入25mM2-MEA后，将样品置于HPLC的自动采样机中，在25℃预加温。图30A至30H分别显示在加入2-MEA后从t＝0分钟至t＝450分钟通过HPLC-CIEX获得的以不同时间间隔的八次连续注射。数据显示相当迅速地形成双特异性IgG，在135分钟后交换大部分同二聚体。在45分钟后出现的非同质异二聚体峰在约180分钟后分辨为更同质的峰，提示交换以不同阶段发生。另外，图31A显示用CIEX法检测到约3％残留同二聚体(箭头所示)。如所示，这种方法适合量化残余的同二聚体含量(同二聚体的洗脱显示于图31B)，当交换反应几乎完成时)。
实施例33：在各种2-MEA浓度、温度和温育时间在高抗体浓度下通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体
在高IgG浓度进行2-MEA诱导的Fab臂交换。研究2-MEA浓度、温育温度和时间对交换量的影响。
用IgG1-7D8-K409R x IgG1-2F8-F405L组合进行交换过程。将两种材料都用蛋白A亲和层析纯化。在将材料浓缩至大于20mg/mL后，用HiPrep Q FF 16/10(GE Health Care,#28-9365-43)进行连续的阴离子交换步骤(以流过的方式)。将最终的纯化材料缓冲液交换为PBS。
在PBS中以20mg/mL(各种同二聚体终浓度为10mg/mL)和10mg/mL(各种同二聚体终浓度为5mg/mL)的终IgG浓度研究双特异***换。对两种IgG浓度(包括终浓度为10、25、50和100mM的2-MEA在内)制备分开的混合物。将混合物在eppendorf管中分成100μL等分试样，贮存于15、25和37℃。分开的管用于在各种温度温育90分钟、5小时和24小时的不同时间。
对于两种IgG浓度还制备不含2-MEA的混合物，贮存于4℃作为未处理对照。在适当的温育时间后，将90分钟和5小时样品收集用于脱盐以除去2-MEA(将90分钟样品最初放在冰上以终止交换反应)。用Zeba96孔脱盐板(7k，产品目录号89808，ThermoFisherScientific)使样品脱盐。在温育24小时后使24小时样品分开脱盐。
按照实施例7所述在夹心ELISA中用抗体样品的系列稀释液(对于90分钟和5小时样品，3倍稀释的总抗体浓度10-0.123μg/mL；对于24小时样品，3倍稀释的10-0.041μg/mL)测量双特异性结合。对于每个板，将对照包括为从IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC之间2-MEA诱导的Fab臂交换衍生的双特异性抗体纯化批次(如描述于实施例15)。图32(A)-(F)显示在各自的ELISA板中测量的双特异性结合结果。最高的OD405值(如在ELISA中对10μg/mL浓度所确定的)用于计算与对照(将其任意设定为100％)相比的双特异性结合。这得到与对照相比受控Fab臂交换的百分数(％cFAE)，如关于每种2-MEA浓度的图34(A)-(D)中所示。
数据显示在所有温度-时间条件下对于两种IgG浓度都在100mM 2-MEA浓度达到最大水平的双特异性结合(与对照相比为89-109％)。在50mM2-MEA，最大结合(88-107％)在25℃和37℃实现，在15℃温育24小时后也实现。对于25mM和10mM 2-MEA的更低浓度，交换在更高温度更有效，随着温育时间延长而增加，在25mM 2-MEA在37℃温育24小时后导致最大交换。在10mM 2-MEA下测试的条件不产生100％双特异性产物。与20mg/mL总IgG相比10mg/mL的IgG浓度的交换过程略快。
为了证实形成双特异性抗体和更详细地研究双特异性产物，用阳离子交换(HPLC-CIEX)分析对样品进行分析。按照实施例31所述对5小时和24小时温育后的使用20mg/mLIgG浓度和所有2-MEA浓度的样品进行HPLC-CIEX分析。
图34(A)-(D)的CIEX层析图显示最高收率的双特异性产物在50和100mM2-MEA下获得，证实双特异性ELISA的结果。然而，在50和100mM2-MEA下仍然检测到少量残留同二聚体(对于在25℃和37℃温育的样品为2-3.5％每种同二聚体)。在更高温度、更长(24小时)温育时间和渐增的2-MEA浓度的交换导致在CIEX谱中在22-24分钟出现额外的峰。
当交换在5小时内结束时获得最少量的额外峰。为了鉴定这些峰的性质，进行SDS-PAGE分析和HP-SEC分析。HP-SEC显示对于所有条件，聚集物的量低于1％，提示额外峰不代表聚集物。然而，非还原性SDS-PAGE指示额外的峰可代表缺乏一条或两条轻链的异二聚体。还检测到少量半分子。
实验显示交换反应在高同二聚体浓度下发生(这使该方法对于商业规模具有吸引力)，以及双特异性抗体的收率取决于2-MEA浓度、温度和孵育时间。
实施例34：用于与IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1368位的决定簇
实施例28和29显示当与IgG1-K409R组合时在F405和Y407位的某些单突变足以使人IgG1能够参与Fab臂交换。如本实施例说明，其它涉及CH3域中的Fc:Fc界面位置的决定簇也可介导Fab臂交换机制。为此目的，进行了IgG1368位的诱变，并对突变体测试与人IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂交换。将所有可能的IgG1-2F8-L368X突变体(除了C和P以外)与IgG1-7D8-K409R组合。按照实施例19所述用纯化的抗体进行操作。
图35显示在IgG1-2F8-L368X x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换后双特异性结合的结果。如表8所呈现，还将这些数据评分为(-)无Fab臂交换、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。发现当IgG1-2F8的368位是L(＝野生型IgG1)、F或M时无Fab臂交换㈠。发现Fab臂交换当IgG1-2F8的368位是Y时为低度的(+/-)。发现Fab臂交换当IgG1-2F8的368位是K时为中度的(+)，当IgG1-2F8的368位是A、D、E、G、H、I、N、Q、R、S、T、V、或W时为高度的(++)。这些数据指示当与IgG1-K409R组合时在IgG1368位的特定突变允许IgG1参加2-MEA诱导的Fab臂交换。
表6：IgG1-2F8-L368X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换
通过夹心ELISA确定IgG1-2F8-L368X突变体与IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换后双特异性抗体的产生。(-)无、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。
Figure BDA0000528413460001181
实施例35：用于与IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1370位的决定簇
实施例28、29和34显示当与IgG1-K409R组合时在F405、Y407或L368位的某些单突变足以使人IgG1能够参与Fab臂交换。如本实施例说明，其它涉及CH3域中的Fc:Fc界面位置的决定簇也可介导Fab臂交换机制。为此目的，进行了IgG1370位的诱变，并对突变体测试与人IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂交换。将所有可能的IgG1-2F8-K370X突变体(除了C和P以外)与IgG1-7D8-K409R组合。按照实施例19所述用纯化的抗体进行操作。
图36显示在IgG1-2F8-K370X x IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换后双特异性结合的结果。如表7所呈现，还将这些数据评分为(-)无Fab臂交换、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。发现当IgG1-2F8的370位是K(＝野生型IgG1)、A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y时无Fab臂交换(-)。只有K370被W取代导致中度Fab臂交换(+)。这些数据指示当与IgG1-K409R组合时在IgG1370位只有一种突变(K370W)允许IgG1参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表7：IgG1-2F8-K370X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换
通过夹心ELISA确定IgG1-2F8-K370X突变体与IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换后双特异性抗体的产生。(-)无、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。
Fab-臂交换
IgG1-2F8-K370X X IgG1-7D8-K409R
A -
D -
E -
F -
G -
H -
I -
K -
L -
M -
N -
Q -
R -
S -
T -
V -
W +
Y -
实施例36：用于与IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1399位的决定簇
实施例28、29、34和35显示当与IgG1-K409R组合时在F405、Y407、L368或K370位的某些单突变足以使人IgG1能够参与Fab臂交换。如本实施例说明，其它涉及CH3域的Fc:Fc界面位置的决定簇也可介导Fab臂交换机制。为此目的，进行了IgG1399位的诱变，并对突变体测试与人IgG1-K409R组合参加2-MEA诱导的Fab臂交换。将所有可能的IgG1-2F8-D399X突变体(除了C和P以外)与IgG1-7D8-K409R组合。按照实施例19所述用纯化的抗体进行操作。
图37显示在IgG1-2F8-D399X x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换后双特异性结合的结果。如表8所呈现，还将这些数据评分为(-)无、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。发现当IgG1-2F8的399位是D(＝野生型IgG1)、E和Q时无Fab臂交换(-)。发现Fab臂交换当IgG1-2F8的399位是V时为低度的(+/-)，当IgG1-2F8的399位是G、I、L、M、N、S、T或W时为中度的(+)。发现Fab臂交换当IgGl_2F8的399位是A、F、H、K、R或Y时为高度的(++)。这些数据提示当与IgG1-K409R组合时在IgG1 399位的特定突变允许IgG1参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表8：IgG1-2F8-D399X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换
通过夹心ELISA确定IgG1-2F8-D399X突变体与IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换后双特异性抗体的产生。(-)无、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。
Figure BDA0000528413460001211
实施例37：用于与IgG1-K409R组合参与2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1366位的决定簇
实施例28、29、34、35和36显示当与IgG1-K409R组合时在F405、Y407、L368、K370或D399位的某些单突变足以使人IgG1能够参与Fab臂交换。如本实施例说明，其它涉及CH3域的Fc:Fc界面位置的决定簇也可介导Fab臂交换机制。为此目的，进行了IgG1366位的诱变，并对突变体测试与人IgG1-7D8-K409R组合参加2-MEA诱导的Fab臂交换。将所有可能的IgG1-2F8-T366X突变体(除了C和P以外)与IgG1-7D8-K409R组合。按照实施例19所述用纯化的抗体进行操作。
图38显示在IgG1-2F8-T366X和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换后双特异性结合的结果。如表X所呈现，还将这些数据评分为(-)无、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。发现当IgG1-2F8的366位是T(＝野生型IgG1)、K、R、S或W时无Fab臂交换(-)。发现Fab臂交换当IgG1-2F8的366位是F、G、I、L、M或Y时为低度的(+/-)，当IgG1-2F8的366位是A、D、E、H、N、V或Q时为中度的(+)。这些数据提示当与IgG1-K409R组合时在IgG1 366位的特定突变允许IgG1参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表9：IgG1-2F8-T366X突变体与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换
通过夹心ELISA确定IgG1-2F8-T366X突变体与IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换后双特异性抗体的产生。(-)无、(+/-)低度、(+)中度或(++)高度Fab臂交换。
Figure BDA0000528413460001221
Figure BDA0000528413460001231
实施例38：确定其中2-MEA诱导的Fab臂交换亚最佳地发生的条件范围以区分高度有效的IgG1突变体
当使用25mM2-MEA时在37℃有效地发生2-MEA诱导的Fab臂交换的过程。在这些条件下，大多数允许的IgG1突变体(如实施例19、28、29和34-37所述在366、368、370、399、405和407和/或409位具有某些单突变的IgG1)显示高水平的2-MEA诱导的Fab臂交换(80％-100％)。为了鉴定允许以最高效率区分IgG1突变体的实验条件，分别在15℃和20℃随时间推移研究四种不同的突变体组合(IgG1-2F8-F405S x IgG1-7D8-K409A,IgG1-2F8-D399R xIgG1-7D8-K409G,IgG1-2F8-L368R x IgG1-7D8-K409H和IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R)的2-MEA诱导的Fab臂。除温度、时间段和抗体稀释(20、2、0.2和0.02μg/mL)的改变以外，按照实施例19所述进行操作。
与最大交换(阳性对照)相比，在20℃四种突变体组合以不同速率发生2-MEA诱导的Fab臂交换。在温育105分钟后，IgG1-2F8-L368R x IgG1-7D8-K409H达到最大水平的交换，而在200分钟后IgG1-2F8-F405S x IgG1-7D8-K409A,IgG1-2F8-D399R x IgG1-7D8-K409G和IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R分别达到90％、85％和85％的最大值。
将不同IgG1突变体组合在15℃温育显示最明显的交换速率的差异(显示于图39)。在温育60和105分钟后，四种突变体组合之间2-MEA诱导的Fab臂交换的差异是最极端的。与阳性对照相比，在温育200分钟后Fab臂交换显示效率为100％(IgG1-2F8-L368R x IgG1-7D8-K409H)、85％(IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R和IgG1-2F8-D399R x IgG1-7D8-K409G)或65％(IgG1-2F8-F405S x IgG1-7D8-K409A)。
实施例39：分析在亚最佳条件下突变体的2-MEA诱导的Fab臂交换效率
当使用25mM2-MEA时在37℃有效地发生2-MEA诱导的Fab臂交换过程。在这些条件下，大多数允许的IgG1突变体(如实施例19、28、29和34-37所述在366、368、370、399、405和407和/或409位具有某些单突变的IgG1)显示高水平的2-MEA诱导的Fab臂交换(80-100％)。在实施例38中描述了在所谓亚最佳条件下温育后，即在15℃温育60至105分钟后，2-MEA诱导的Fab臂交换效率的差异最明显。选择总计24种显示与IgG1-7D8-K409R有>90％2-MEA诱导的Fab臂交换(实施例28、29和34-37)的在L368、D399、F405和Y407的IgG1-2F8突变体(见表11)，并将其与IgG1-7D8-K409A、G、H或R(基于实施例19显示的结果)进行Fab臂交换分析。为了将这些突变体组合根据其产生双特异性抗体的效率分类，在15℃将2-MEA诱导的Fab臂交换进行90分钟(亚最佳条件)。将在与IgG1-7D-K409R温育后显示弱2-MEA诱导的Fab臂交换的两种IgG1-2F8突变体(Y407Q)和(D399Q)(实施例29和36)，一起作为额外的阴性对照，用于研究与在K409位的另一种氨基酸(G、H或W)温育是否导致不同结果。除了改变温度和改变抗体稀释(20、2、0.2和0.02ug/mL)外，按照实施例19所述进行操作。
将所有不同IgG1突变体组合(表10中显示)在15℃温育90分钟显示一定范围的不同2-MEA诱导的Fab臂交换效率。在20μg/mL抗体浓度的双特异性结合结果显示于表10。将结果分为4类；无(-)、低度(+/-)、中度(+)和高度(++)双特异性结合效率，如在表10下方的说明所规定的。从这些结果看，清楚的是在亚最佳条件下IgG1分子中氨基酸突变的一些组合将有利于2-MEA诱导的Fab臂交换。
表10：在15℃达90分钟在允许的IgG1突变体(20μg/mL)之间的双特异性结合(相对于阳性对照的％)
Figure BDA0000528413460001241
Figure BDA0000528413460001261
表10的说明
无(0-3％)双特异性结合(-)
低度(4-39％)双特异性结合(+/-)
中度(40-69％)双特异性结合(+)
高度(70-100％)双特异性结合(++)
从测试的突变IgG1-2F8分子(表10)中，选择了六种进行第二次分析以证实之前获得的结果(表10)。针对它们的高度(IgG1-2F8-L368R)和中度(IgG1-2F8-L368W，IgG1-2F8-F405I、IgG1-2F8-F405L和IgG1-2F8-Y407W)2-MEA诱导的Fab臂交换的效率，选择了数种突变体。还第二次分析了IgG1-2F8-Y407Q，因为它与IgG1-7D8-K409H显示意想不到的阳性2-MEA诱导的Fab臂交换反应。大体上，这些结果(在图40中呈现)证实了初期的分析(表10)，显示突变IgG1-2F8分子与IgG1-7D8-K409H的2-MEA诱导的Fab臂交换反应具有最高效率。此外，在实施例28、29和34-37报道为阴性的突变IgG1-2F8分子与IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换反应仍然引人关注，因为潜在促进IgG12-MEA诱导的Fab臂交换。
实施例40：表达同二聚体蛋白的CHO细胞的生成
通过用编码IgG重链和轻链序列的谷氨酰胺合酶(GS)表达载体***(LonzaBiologics,Slough,UK)转染CHO-K1SV宿主细胞(Lonza Biologics,Slough,UK)生成表达IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的稳定CHO-K1SV细胞系。在无蛋白质化学成分确定培养基(CD-CHO；产品目录编号10743-029；Invitrogen,Life Sciences,Breda,TheNetherlands)中使用核转染(nucleofection)(Lonza Biologics,Slough,UK)转染细胞。将细胞在谷氨酰胺缺乏CD-CHO培养基中以0.1个细胞/孔分配。在选择对在谷氨酰胺缺乏培养基中生长有抗性的克隆细胞系后，使细胞适合于在CD-CHO中悬浮生长，并在冷冻小瓶中获得。没有将细胞经受基因扩增。为了生成IgG，将细胞在μ-24微反应器中在补充有0.7g/L L-酪氨酸二钠盐(产品目录编号T1145-500；Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,The Netherlands)和0.15g/L L-半胱氨酸(产品目录编号C7352；Sigma-Aldrich)的CD-CHO中以4.0×105个细胞/mL的浓度温育，并于37℃，pH 7.00，70rpm的初始搅拌速率，20slpm的气体流动速率，85％的最大氧流动率和30％的DO温育15天。在第3天开始补料，并且一直持续到第14天。补料由用化学成分确定培养基的CHO有效补料组成，对表达产生IgG-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的CHO-K1SV细胞系分别产生约1.3–3.4和0.1–3.5g/L的收获时水平。随后，将最好的生产细胞系用于运行2L生物反应器，其使用类似的补料-分批过程进行。使用蛋白A层析纯化IgG。在纯化后，将IgG在PBS中配制。
实施例41：通过人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换生成的双特异性抗体的形成
生成40mL批次的通过人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换生成的双特异性抗体。将含有终浓度10mg/mL的每种抗体(即总共20mg/mL)的抗体混合物在PBS中在存在50mM 2-MEA的情况中于25℃温育5小时。将抗体混合物在冰上(O/N)贮存。使用HiPrep 26/10脱盐柱(产品目录编号17-5087-01,GE Health Care)通过脱盐将该批次进行缓冲液更换，并在纯化后，或者在于4℃再贮存6天后通过SDS-PAGE分析。在还原性和非还原性条件下实施SDS-PAGE分析，如上文描述的。图42显示了在缓冲液更换后仅立即观察到部分再氧化(A，第3道)，如根据在完整的IgG条带(LHHL)外代表半分子(HL)的条带和代表其它组合的条带的存在例示的。于4℃贮存6天后的分析显示了再氧化是完全的(C，第4道)。还原性凝胶(B,D)显示了单一重链和轻链。
这指示再氧化在较大体积中相当慢地发生，并且在O/N温育后是不完全的。
实施例42：痕量金属在再氧化过程中的作用
为了调查痕量金属在再氧化过程中的作用，将抗CD38抗体在存在50mM2-MEA的情况中于25℃温育(15mg/mL；1mL)5小时。使用PD-10柱(GE Healthcare)使样品脱氧，并且将缓冲液更换成含有0.5mg/L Cu2+(CuSO4；产品目录编号451657-10G,Sigma Aldrich)的PBS或含有2mM EDTA的PBS。在于RT温育不同时间段后采集样品，用3μL1M2-碘乙酰胺(2-odoacetamide)(IAA；产品目录编号I-1149,Sigma Aldrich)淬灭，并在黑暗中于RT贮存30分钟。随后，将样品于5℃贮存，直至进一步分析。
在非还原性和还原性条件下实施SDS-PAGE分析，如上文描述的。
图61A显示了缓冲液更换成含有EDTA的PBS阻止再氧化。在存在EDTA的情况中(第2道到第7道)，在所有时间点存在游离的轻链(L)和重链(H)。另外，存在其它不完全再氧化的种类，诸如抗体半分子(HL)和缺少一条轻链(HHL)或两条轻链(HH)的抗体。缓冲液更换成含有Cu2+的PBS诱导再氧化(图61B，第2道到第7道，和图62)。虽然没有达到完全再氧化，但是在所有时间点时观察到抗体的显著再氧化和游离轻链和重链的完全缺乏。还原性凝胶(B,D)显示单一重链和轻链。
实施例43：在不同缓冲液条件下通过人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换生成的双特异性抗体的形成
在不同缓冲液条件下以0.5mL规模通过人IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂交换生成双特异性抗体的批次。将抗体在下列缓冲液中稀释至浓度5mg/mL：1)1x Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)：8.1mM磷酸钠(Na2HPO4-7H2O)、1.5mM磷酸钾(KH2PO4)、138mM氯化钠(NaCl)、2.7mM氯化钾(KCl)pH 5.0(从10x DPBS中稀释，产品目录编号14200,Invitrogen)；2)1x DPBS pH 7.03)20mM柠檬酸钠(产品目录编号0119-01,JTBaker),pH 4.9；4)20mM柠檬酸钠，pH 6.0；和5)20mM Tris-HCl(产品目录编号T6666和T6791,Sigma)、20mM NaCl(产品目录编号3624-01,JT Baker),pH 7.8。随后，将抗体(各为终浓度2mg/mL(即总抗体浓度4mg/mL))在存在45或60mM2-MEA的情况中于25℃温育2–5小时。从使用与抗体相同的缓冲液制备的300mM储备溶液添加2-MEA。在多个时间点，采集样品，并依照制造商的说明书使用illustra微旋转G-25柱(产品目录编号27-5325-01,GEHealthcare)将其脱盐至10mM磷酸钠(磷酸氢二钠(sodium phosphate dibasic),产品目录编号3828-01和磷酸二氢钠(sodium phosphate monobasic),产品目录编号3818-01,均为JT Baker),pH 7.0。接着，如上文描述的，通过分析CIEX分析样品以测定异二聚化的百分比。图41显示了最终的异二聚体水平在Tris和磷酸盐缓冲液中是相当的，但是异二聚体形成的动力学明显受到缓冲液的类型和pH影响。动力学在柠檬酸盐缓冲液，pH 4.9中比在磷酸盐缓冲液，pH 5.0中和在柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0中表现得更慢。与1x DPBS pH 7.0相比，动力学在1x DPBS pH 5.0中更慢。
实施例44：在人IgG1抗CD38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势、氧饱和和中间体的形成
使用人IgG1抗CD38抗体(005，记载于WO2006099875(Genmab))开发用于评估还原和再氧化过程的模型***。将抗CD38抗体(20g/L)用中空纤维筒，30kDa分子量截留(MWCO)，0.1m2(产品目录编号P-N1-030E-200-01N,J&MSeparations,Tilburg,The Netherlands)从配制缓冲液(25mM乙酸盐，60mM氯化钠[产品目录编号3624-01,JT Baker]，140mM甘露醇，0.006％聚山梨醇酯20,pH 5.5)渗滤到PBS(产品目录编号3623140,B.Braun,Oss,TheNetherlands)，pH 7.4，并在2-L反应器中在833mL总体积中浓缩至24g/L。将温度控制于25℃，并将搅动控制于100rpm。为了追踪反应，使用氧化还原探头(Applicon Biotech,Schiedam,The Netherlands)和溶解氧(DO)探头(Applicon Biotech)监测溶液。在实验开始时，溶液氧化还原是259.6mV，并且DO是100％(空气氧气饱和)。在时间0时，将还原剂2-MEA(2-巯基乙胺-HCl，半胱胺)以终浓度300mM添加至反应器，产生20g/L抗CD38抗体和300mM2-MEA的初始溶液。在添加2-MEA后，氧化还原电势立即下降至约-400mV(图43)。DO也在此时下降至初始100％空气氧气饱和的2.6％，指示2-MEA也自身氧化成二聚体形式胱胺。5小时后，经由用PBS,pH 7.4的渗滤除去过量的2-MEA(和胱胺)。为了实现这点，将反应器内容物循环通过30kDa改良型聚醚砜(mPES)中空纤维筒(产品目录编号P-N1-030E-200-01N,J& M Separations,Tilburg,The Netherlands)30kDa分子量截留(MWCO)，0.1m2。将筒入口压力控制于25 PSI(170kPa)，产生25mL/分钟的渗透物流动。将渗滤缓冲液(例如PBS)以与离开***的渗透物相同的速率添加至***。进行渗滤直到初始体积的7倍(7个渗滤体积；约7L)通过***，其花费41/2小时。在该点后，将***以活动温度和搅动控制，O/N温育。次日，DO和氧化还原值仍然基本上低于开始水平，提示了反应尚未完成。为了评估此假设，将硫酸铜添加至终浓度0.5mg/L(CuSO4；产品目录编号451657-10G,Sigma Aldrich)。二价金属离子(诸如Cu2+)是巯基氧化的催化剂。在添加硫酸铜后，发生DO立即的进一步下降，提示了氧气的立即消耗例如(再)氧化。贯穿整个实验，从反应器中采集14份样品，并且将其立即用2-碘乙酰胺(IAA，产品目录编号I-1149，Sigma)淬灭(将20μL1M2-碘乙酰胺添加至1mL反应器样品)。2-碘乙酰胺共价结合至半胱氨酸的硫醇基团，如此阻断任何还原性半胱氨酸再形成链间二硫键的能力。在此方式中，可以追踪通过2-MEA的还原和氧气对抗体的再氧化的动力学。通过HP-SEC(图44)、非还原性SDS-PAGE(图45)和液体层析电喷雾电离质谱法(LC-ESI-MS)(图46)分析样品。样品1和2是显示在从配制缓冲液转移到PBS中之前和之后的抗CD38抗体的对照。样品3到8显示了5小时还原阶段期间的产物。通过HP-SEC(以280nm监测)，抗体以完整的产物洗脱；后来洗脱的产物是胱胺(2-MEA在280nm不强烈吸收)。在SDS-PAGE上，产物在非还原性凝胶的变性条件下以重链和轻链的两条独立条带运行。总之，这些数据显示了产物在1小时内是完全还原性的(SDS-PAGE)，但是重链和轻链在天然条件下仍然通过非共价相互作用结合(HP-SEC)。在渗滤过程期间采集样品9-12。通过HP-SEC，产物在天然条件下保持完整；后期洗脱的胱胺峰逐渐消失，接着出现与2-MEA起反应的与2-碘乙酰胺对应的峰。这些结果提示了溶液中仍然有与2-碘乙酰胺起反应的过量2-MEA或者2-MEA在O/N或在添加2-碘乙酰胺后被结合至蛋白质并释放。通过SDS-PAGE，存在有从单一重链和单一轻链条带至未知组成的多个条带的转变；然而，到渗滤结束(样品13)，产物完全再氧化成天然形式，即使在添加硫酸铜前(样品14)。
为了监测抗体的还原和再氧化的过程，通过ESI-MS分析样品以测定分子量。谱中的不同峰代表过程期间形成的中间体，诸如半分子。在具有BEH300C18、1.7μm、2.1x50mm柱的Aquity UPLCTM(Waters,Milford,USA)上于60℃将样品脱盐，并用含有0.05％甲酸(FlukaRiedel-de
Figure BDA0000528413460001301
Buchs,Germany)的MQ水(洗脱液A)和LC-MS级乙腈(洗脱液B)(Biosolve,Valkenswaard,The Netherlands)的混合物梯度洗脱。在以阳离子模式运行的micrOTOFTM质谱仪(Bruker,Bremen,Germany)上在线记录飞行时间电喷射离子化质谱。在分析前，用ES调谐混合物(Agilent Technologies,Santa Clara,USA)校准500-4000m/z标度。通过用由DataAnalysisTM软件3.4版本(Bruker,Bremen,Germany)提供的最大熵对质谱解卷积。
图46显示了在抗CD38抗体的还原和再氧化期间的质谱术谱。在还原阶段期间采集的样品(样品3-8)显示了2-MEA与还原性轻链共价结合(质量差异为75Da)，这可能解释非还原性SDS-PAGE上的多个轻链条带(图45)。显然，质谱术规程诱导再氧化成全长IgG，因为通过还原阶段期间采集的样品的ESI-MS检测的全长IgG通过非还原性SDS-PAGE检测不到(图45)。在开始渗滤后，发生再氧化成全长抗体，其中HL(质量75kDa左右)和HHL片段(质量120kDa左右)为中间体。这些数据还显示在通过渗滤除去还原剂(例如2-MEA)期间，通过再形成抗体的天然共价半胱氨酸桥将其再氧化。
实施例45：更快的渗滤和第二次渗滤对再氧化过程的影响
以下列差异重复实施例44中的实验。第一，将还原步骤从5小时缩短至4小时，因为观察到还原已经在4小时内完成。第二，为了加速该过程，通过使用更大的中空纤维筒30kDa，0.4m2将渗滤时间缩短至1小时。每cm2的渗透物流动与在实施例44中相同，导致快4倍的渗滤步骤。第三，在O/N氧化期后，再使用7个渗滤体积实施第二次渗滤，因为第一项实验证明了O/N温育后2-MEA的出现。经2-碘乙酰胺处理的样品的氧化还原和DO迹线的趋势(图47)及HP-SEC(图48)和SDS-PAGE(图49)结果与实施例44中的结果一致，直到第二次渗滤的点(注意实施例44和本实施例中氧化还原电势和氧饱和的时间比例是不同的)。刚好在第二次渗滤前，产物与前一天渗滤结束相比表现为略有还原性(图49，第18道对第15道)。在第二次渗滤后(第19道)，产物回复回初始状态的，并且2-MEA-2-碘乙酰胺峰从HP-SEC谱消失。另外，在第二次渗滤后，氧化还原和DO探头值(图47)与来自实验开始的那些数值相似，提示了反应是完成的，且比实施例44中描述的实验中更完全地从***除去痕量的2-MEA和胱胺。此外，第二次渗滤后硫酸铜的添加不导致氧化还原或DO的变化，证明了可氧化硫氢基的可察觉水平的缺乏。这些结果指示第二次渗滤可用于除去任何过量的2-MEA，其或是留在溶液中或是在O/N温育后从蛋白质中释放。
实施例46：与更低的2-MEA浓度组合的更快的渗滤的影响
实施例44中在O/N温育后观察到的残留的2-MEA提示了2-MEA浓度太高。因此，重复实施例44中的实验，只是将2-MEA浓度从300mM降低至50mM，并且如实施例45中，将还原步骤缩短至4小时，并且将渗滤时间加速至1小时。在还原和渗滤后，DO和氧化还原探头返回到初始数值，提示了反应是完成的(图50)。铜的添加没有影响，进一步提示了反应是完全的。如实施例44和45中观察到的，产物在天然条件下在HP-SEC分析中保持完整(图51)；此外，后期洗脱的胱胺峰逐渐消失，接着出现与结合至2-MEA的2-碘乙酰胺对应的峰。然而，在此情况中，所有后来洗脱的峰在O/N温育后消失了。SDS-PAGE结果(图52)证明了还原阶段期间完整抗体的缺乏(第3道到第6道)，尽管在此情况中，分子没有完全还原成分开的重链和轻链。在渗滤后(第7道到第10道)，通过SDS-PAGE明显的是，抗体以初始显带方式再形成，并且保持所述方式到O/N温育(第11道到第14道)。
实施例47：更快的渗滤和还原阶段期间EDTA存在的影响
重复实施例46的实验，只是将抗CD38抗体从配制缓冲液更换成含有2mM EDTA的PBS。添加EDTA的目的是抑制还原阶段期间2-MEA的自身氧化，并且潜在限制2-MEA对游离的蛋白质硫氢基的结合。在添加2-MEA后，氧化还原电势立即下降(图53)，如实施例46中显示的(图50)。然而，DO下降的速率比实施例46中观察到的速率低得多(参见图53B)。添加金属螯合剂EDTA后的氧化速率降低提示了缓冲液试剂中的痕量金属杂质在还原阶段期间催化2-MEA的自身氧化。然而，EDTA不能完全抑制2-MEA的自身氧化，因为DO最终下降到接近0，提示了在实验条件下，氧传递最终对2-MEA的自身氧化是限速的。在渗滤至没有EDTA的PBS后，DO几乎返回到100％的起始点，提示了较低的氧消耗速率，而氧化还原电势仍然基本上低于起始点。在添加0.5mg/L硫酸铜后，形成少量的沉淀物，这可能是由于残留EDTA对铜离子的结合。另外，DO下降几乎10％，指示添加铜离子后升高的氧化。
SDS-PAGE结果(图54)与实施例46中观察到的结果相当，并且证明了在还原期间添加EDTA对抗体的总体还原没有清楚的影响(第3道到第7道)。此外，渗滤后的再氧化不受影响(第12道到第14道)。
实施例48：更快的渗滤和还原阶段后N2的存在的影响
在有一些变化的情况下重复实施例46的实验。在第一次渗滤期间，用氮气充气容器的顶部空间。这导致20％的溶解氧浓度。在还原期间，将50mL/分钟氮气的连续流送到容器。在还原后，进行对PBS的第二次渗滤，所述PBS用氮气100％饱和，以阻止额外氧气对***的任何添加。
DO浓度在添加2-MEA时是20％。2-MEA立即消耗所有氧(图55)。氧化还原电势在添加2-MEA后立即下降至-440mV。渗滤后的氧化还原电势比起始数值(+200mV)低(-250mV)，指示再氧化不是完全的。
在通过空气通风置换氮气后，氧化还原电势上升，指示已经再次开始再氧化。氧化还原电势上升回到起始数值，指示再氧化是完全的。
SDS-PAGE结果(图56)与实施例46中观察到的结果相当，直至还原阶段(第3道到第7道)。然而，氧气的缺乏明显抑制再氧化过程(第8道到第11道)。仅在通过空气流动置换氮气后，发生再氧化(第12道、第13道)。
实施例49：更快的渗滤和还原阶段后EDTA的存在的影响
重复实施例46的实验，只是通过用含有2mM EDTA的PBS，代替单独的PBS进行渗滤除去2-MEA。
在渗滤期间，氧化还原电势升高。这主要是由于影响氧化还原电势的氧气增加(图57)。还原阶段期间采集的样品的SDS-PAGE(图58)与实施例46中观察到的结果相当(第3道到第6道)。EDTA的存在通过捕捉导致更慢的再氧化速率的痕量元素而明显影响再氧化(第7道到第10道)。甚至在渗滤后24小时，不是所有抗体均已再氧化(第10道)。硫酸铜的添加诱导氧化还原电势的立即升高和DO的降低。SDS-PAGE结果确认再氧化仅在添加硫酸铜后(第11道)而不是在之前(第10道)是完全的。
实施例50：更快的渗滤和还原阶段后硫酸铜的存在的影响
重复实施例46的实验，只是通过用含有0.5mg/L硫酸铜的PBS，代替PBS进行渗滤除去2-MEA。
DO和氧化还原谱显示了再氧化快于上文描述的所有实施例中观察到的再氧化。在渗滤后，氧化还原电势为其开始数值，指示再氧化是完全的(图59)。
这在SDS-page上得到确认。SDS-PAGE结果(图60)与实施例46中描述的那些结果相当，直到渗滤步骤。再氧化阶段期间的样品的SDS-PAGE结果清楚显示了硫酸铜的存在提高抗体的再氧化速率。再氧化在渗滤后60分钟已经是几乎完全的(第9道)。
实施例51：缺乏C端赖氨酸的双特异性抗体的生成
通过本领域中已知的标准分子生物学技术创建用于表达单特异性抗体的哺乳动物表达载体，所述单特异性抗体在F405L或K409R突变外完全缺乏重链中的C端赖氨酸(通过缺失C端赖氨酸；delK)。这会产生表达载体pIgG1f-F405L-delK和pIgG1f-K409R-delK。会将与两种感兴趣的抗体对应的相关VH序列***两种重链载体中。另外，会通过本领域中已知的标准分子生物学技术创建轻链表达载体。会将与两种感兴趣的抗体对应的相关VL序列***这些轻链载体中。
通过使用293fectin(Invitrogen)依照制造商的说明书在HEK293F细胞(Invitrogen)中瞬时共转染相关重链和轻链表达载体，使用Freestyle培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)在无血清条件下生成这两种抗体突变体。会通过蛋白A亲和层析(MabSelect SuRe,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)纯化抗体，O/N透析至PBS，并且在0.2μM死端式滤器上过滤灭菌。会通过280nm吸光度测定纯化的IgG1变体的浓度。会依照本文中描述的方法使用纯化的抗体生成双特异性抗体。这些双特异性抗体会完全缺乏这两个C端赖氨酸。
实施例52：1000L规模的同二聚体生产和从60mg至0.5kg规模的异二聚体蛋白生产的放大
使用标准方法以1000L规模将两种同二聚体各自的一个批次生成并纯化(没有针对细胞系或针对指定的抗体特异性优化)。用于此方法的细胞系记载于实施例40。将细胞融化，并在17天中放大以接种到1000L反应器中，其经由5次传代步骤进行，包括500mL摇瓶(融化)、1L摇瓶、3L摇瓶(所有摇瓶形式Corning)、wave袋(Wave Biotech)、100L种子生物反应器，并且最终进入1000L生产生物反应器中。摇瓶和wave袋在以5％CO2和37℃控制的培养箱中。将种子生物反应器和生产生物反应器控制于pH 7.0(CO2和碳酸盐)、DO30％(空气/O2和搅动)和37℃温度(水套)。以500L接种生产生物反应器，每日补料添加在第3天开始，直到运行结束。如预期的，生产IgG1-7D8-K409R细胞系，并且在第11天在足够材料(即1.85g/L)的情况中停止运行。IgG1-2F8-F405L细胞系从初始存储至放大丧失生产性，并且在第15天在0.6g/L时停止运行。随后，在每种情况中，将生物反应器冷却至12℃，使用2M柠檬酸将pH降低至4.5，并通过离心收获产物。接着，应用深度过滤(Millipore)，并且实施0.2μm过滤(Sartorius)以除去细胞，并使用2M Tris中和pH。收获回收率是93％(对于IgG1-7D8-K409R)和80％(对于IgG1-2F8-F405L)。
将无细胞收获物加载到MabSelect SuRe蛋白A(GE Healthcare)层析柱上。使用流动相pH的步式变化从树脂释放结合的抗体。在此初始纯化步骤后，通过于环境温度在低pH温育60分钟实施病毒灭活。随后，通过滴定将pH提高到pH 7.8，用于随后的阴离子交换步骤。然后，将同二聚体加载到装满Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)的流过(非结合)阴离子交换(AEX)层析柱上。然后，以切向流模式使用30kDa截留Pall Omega膜将每种纯化的同二聚体缓冲液更换成磷酸盐缓冲盐水溶液(1.92mM NaH2PO4*H20、8.66mM Na2HPO4*7H2O、140.31mM NaCl；pH 7.4)，并且在一次性Flexboy袋(Sartorius Stedim)中于5℃贮存。最终，将材料通过0.2μm过滤级滤器进入1L PETG瓶(Nalgene)中，并于5℃贮存。IgG1-7D8-K409R的终浓度是26.0g/L，且IgG1-2F8-F405L的终浓度是28.2g/L。总体下游收率是86％(对于IgG1-7D8-K409R)和92％(对于IgG1-2F8-F405L)。如通过HP-SEC分析的单体水平分别是100％和99.9％。IgG1-7D8-K409R材料具有低于检测限0.078ng/mL的沥滤蛋白A的残留水平及0.57ppm的通过ELISA(Cygnus)测量的残留CHO宿主细胞蛋白水平(没有评估其它材料)。
在三种条件下从同二聚体生成双特异性抗体(表11)。第一种条件是标准的台式规模条件：10g/L每种同二聚体在含有50mM 2-MEA的聚丙烯管中于环境温度(22-25℃)持续5小时。接着，使用脱盐柱除去2-MEA，并且将溶液于环境温度，O/N温育。在总体积3mL中实施此交换，以生成60mg双特异性抗体。第二种条件是放大至25L，用0.5g/L每种同二聚体生成25g双特异性抗体。与在台式规模方法中一样，在50mM2-MEA中于环境温度实施还原阶段5小时。然而，在此情况中，将反应在袋中在摇摆器板上实施，并且使用PBS pH 7.4经由渗滤除去2-MEA(图63)。将材料于环境温度O/N保持，并且使用PBS pH 7.4再渗滤一次。使用额外的渗滤除去潜在的残留2-MEA。第三种条件与第二种条件相似，只是在25L中使用10g/L每种同二聚体，以生成0.5kg批次的双特异性抗体。
来自三次运行的最终产物的CIEX分析证明了相似的谱(图64)。同二聚体已经以高产率更换成双特异性抗体(表12)。方法不诱导显著的聚集或降解，如通过HP-SEC测定的，并且从***回收的终浓度接近预期结果(表12)。另外，SDS-PAGE结果证明了完全再氧化的、完整的产物(图65)。
表11：双特异性生产放大条件的汇总。
Figure BDA0000528413460001361
*Mfg指制造
表12：在不同条件下获得的终产物的质量结果。
ND：未测定
Degr.：降解产物
Aggr.：聚集
Bispec.：双特异性抗体
Mono.：单体
实施例53：以1L规模生成双特异性抗体(异二聚体蛋白)
基本上在以下变化的情况中重复实施例46的实验：第一，使用两种不同同二聚体替代一种(抗CD38抗体)；第二，还原时间从4小时缩短至3小时；第三，使用不同渗滤筒；最后，经将IAA添加至样品，用于SDS-PAGE分析。
将人IgG1-7D8-K409R(10g)和IgG1-2F8-F405L(10g)在2L工作体积生物反应器(Applikon)中在990mL PBS,pH 7.4中放置。PBS是用于配制同二聚体的内部制备溶液(1.92mM NaH2PO4*H20,8.66mM Na2HPO4*7H2O,140.31mM NaCl,pH 7.4)和B.Braun配制剂的混合物；这两种配制剂基本上等同。将温度控制于25℃，将搅动速率控制于100RPM，并将顶部空间通风控制于15mL/分钟空气。另外，反应器装备有DO、pH和氧化还原探头。通过将2-MEA添加至终浓度50mM(将10mL新鲜制备的5M盐酸半胱胺溶液添加至990mL含有同二聚体的PBS)启动交换反应。在3小时后，经由针对7L PBS,pH 7.4(B.Braun)的渗滤(DF)除去2-MEA。使用0.16m2,30kDa改良型聚醚砜(mPES)中空纤维筒(产品目录编号PN-S04-E030-05-N,J &M Separations,Tilburg,The Netherlands)实施DF。使用第一个300mL PBS将***体积提高1300mL以实施渗滤。将筒入口压力控制于25PSI(170kPa)。这通过使用最大泵速度1750mL/分钟和对***的渗余物流放置的阀(导致约52.5mL/分钟的渗余物流)使用蠕动泵实现。将双特异性产物保持O/N于25℃，100RPM搅动，和15mL/min顶部空间通风。刚好在添加2-MEA前在2-MEA添加后0.5、1、2、和3小时，在1、2、3、5和7L的渗滤缓冲液时，在完成渗滤后1小时及最后在次日采集样品(约5mL)。在每个取样点，将0.4mL样品部分添加至8μL 1M IAA储备溶液。使用液氮将所有样品立即快速冷冻，并且贮存于-80℃，直至分析。冷冻/融化规程不影响样品完整性(数据未显示)。通过CIEX分析没有IAA的样品以测定交换程度，并通过HP-SEC测定产物聚集。通过非还原性SDS-PAGE分析具有IAA的样品以测定链间二硫键形成的程度。
2-MEA的添加导致氧化还原电势从155mV立即下降至-290mV，这是由于2-MEA的低氧化还原电势。氧化还原在第一小时里更逐渐下降至-410mV，这可能是由于在此时间里DO从100％降低至0％(图66)。DO的降低是由于通过2-MEA的自身氧化的氧消耗所致。由于盐酸2-MEA的酸性，pH从7.4下降至6.7(图67)。氧化还原和DO在还原期期间相对稳定，而存在有pH的逐渐上升，这可能是由于由2-MEA自身氧化成胱胺引起的酸性降低所致。在渗滤后，DO在几小时内回到100％，而氧化还原升高至-20mV，并且逐渐升高到109mV，O/N。在渗滤期间，pH升高，并且接近7.4的开始数值就稳定；初始和最终pH之间的略微偏移是由于使用不同批次的PBS所致。数据的最可能的解读是渗滤后没有除去所有2-MEA，并且氧化还原O/N的缓慢上升指示最终接近将2-MEA完全自身氧化成胱胺。在此时间期间，与经由表面的氧传递相比，2-MEA自身氧化的氧消耗速率是足够慢的，使得DO仍然接近饱和值。在后来的实验中，发现了清洗规程不足以开启筒中的所有孔，这可能导致此运行期间低于预期的2-MEA除去。初始的清洗规程是用水漂洗三次，然后于环境温度与0.2M NaOH一起温育6小时，然后用水漂洗三次。此清洗规程在实施例53前及在实施例54前使用。因此，这两个实施例具有相同的问题。在实施例55前，将清洗规程修改为用水漂洗三次，然后在0.5M NaOH和250ppm次氯酸钠中于环境温度温育60分钟，最终用水漂洗三次。在那里(从实施例55起)使用更强的清洗规程，这解决所述问题(如通过渗滤后氧化还原电势回到正常值显示的)。
通过在还原阶段期间测定氧消耗率评估2-MEA自身氧化的速率和程度，假设1分子的O2氧化两分子的2-MEA。用等式3计算氧消耗(OC)(在1分钟时间间隔里)。假设溶液中氧气的空气饱和是0.2mM。先前测定了这些条件的kla是0.76/h，其使用动力学除气方法进行。
等式3：
OC＝kla×ln(DO*-DO)×s×(t2-t1)+(DO1-DO2)×s
OC＝在1分钟期里的氧消耗(mM)
kla＝传氧系数(1/小时)
DO*＝平衡DO浓度(100％)
DO＝时间1和时间2之间的平均DO浓度(％)
DO1＝初始DO浓度
DO2＝最终DO浓度
s＝氧溶解度(0.2mM/100％)
t2-t1＝经过的时间(小时)
通过合计每1分钟时间间隔期间消耗的氧气测定总氧消耗。
然后，用等式4计算每1分钟时间间隔的氧消耗率(OCR[mM/h])：
Figure BDA0000528413460001391
在添加2-MEA后，氧消耗率快速增加至约1.4mM/h(图68)。然而，随着DO下降至0％，此速率快速下降至接近0.15mM/h。这些结果证明了2-MEA自身氧化受限于氧气对容器的传递，因为传递的所有氧气立即被过程消耗。3小时还原期里消耗的总氧量是0.64mM/L。因此，估计存在的1.28mM2-MEA，或2.6％2-MEA在还原期期间被自身氧化。
SDS-PAGE分析(图69)证明了30分钟内链间二硫键的完全还原。在渗滤后，分子早在1个渗滤体积就开始再氧化，此时，氧化还原电势是-275mV。在渗滤期间，与重链和轻链的所有可能组合(L、H、HL、HHL、LHHL)的预期迁移对应的条带是明显的。分子在7个渗滤体积内完全再氧化，此时，氧化还原电势是-45mV。这些数据提示了链间二硫键的完全再氧化不需要回到初始氧化还原。
CIEX分析证明了将同二聚体有效交换成异二聚体产物(图70)；在还原的30分钟内已经发生了实质***换。终产物是93.6％双特异性的，5.8％7D8同二聚体，和0.4％2F8同二聚体。通过OD280测量测定开始和最终样品的浓度证明了几乎完全的回收率(98％)。对最终样品的HP-SEC分析证明了该过程不诱导产物聚集(>99％单体)(图71)。
实施例54：EDTA和铜离子对1L规模生成双特异性抗体的影响。
在如下变化的情况下重复实施例53的实验。将2mM EDTA(Fluka，产品目录编号03677；二钠二水合物)添加至还原和渗滤缓冲液两者，使用2MNaOH将pH再调节至7.4。EDTA结合金属，其可以抑制还原期期间金属催化的2-MEA自身氧化和渗滤/再氧化阶段期间异二聚体的再氧化。
如实施例53(没有EDTA)中观察到的，2-MEA的添加导致氧化还原电势随DO下降在第一小时里从162mV立即下降至-290MV然后至-416mV。与实施例53(没有EDTA)(其中DO在1小时内下降至0％)形成对比，在存在2mMEDTA的情况中，DO最初下降至10％，然后到三小时还原期结束逐渐至3％。氧消耗更少的此发现与如下的前提一致，即痕量金属离子加速2-MEA的自身氧化。EDTA的存在不影响运行的pH谱(图73，与图67相比)。
在渗滤后，DO在几小时内回到100％，而氧化还原升高至仅-115mV。如实施例53(没有EDTA)中的，氧化还原不回到开始数值的实情是由于在使用前使用无效的清洗规程，导致亚最佳的2-MEA除去。然而，在没有EDTA的情况下(实施例53)，氧化还原O/N存在有逐渐上升，而在存在EDTA的情况下，氧化还原保持基本上不变(图72)，指示对氧化的抑制。在此情况中，在O/N氧化后，将0.5mg/mL CuSO4(终浓度；Sigma，产品目录编号451657)添加至反应器。这导致DO的立即下降，其与氧化还原的上升偶联。此发现与如下的前提一致，即反应器中存在有残留的可氧化物质，且痕量金属离子加速再氧化过程。
测定还原阶段期间的2-MEA自身氧化的速率和程度，如实施例53中描述的。虽然EDTA抑制自身氧化，但是在存在EDTA的情况下消耗的氧量是0.60mM，其仅略微小于没有EDTA情况下(实施例)的0.64mM。最可能的解释是在实施例的条件下，氧消耗受限于氧气从顶部空间传递到溶液中的速率，因为在任一种情况中，DO小于10％。
如实施例53中的，SDS-PAGE分析(图74)证明了30分钟内链间二硫键的完全还原。然而，与没有EDTA的条件相比，渗滤期间的再氧化是延迟的(图69，实施例53)。在渗滤后，在1个渗滤体积后观察到重链链间键的少量再氧化，其中氧化还原电势是-326mV。在2L渗滤缓冲液后观察到抗体的所有预期形式(L、H、HL、HH、HHL、LHHL)，其中氧化还原电势是-282mV。与没有EDTA的条件形成对比，在完成渗滤的1小时内(氧化还原-115mV)或在O/N温育后(氧化还原-110mV)没有观察到完全的再氧化(图69)。在添加CuSO4后，观察到完全再氧化。这些结果证明了添加足够量的金属离子可以克服EDTA的影响。
CIEX分析证明了将同二聚体有效交换成异二聚体产物(图75)；在还原的30分钟内已经发生了实质***换。终产物是92.7％双特异性抗体，4.7％7D8同二聚体，和2.6％2F8同二聚体。通过OD280测量测定这些相同样品的浓度证明了几乎完全的回收率98％。对最终样品的HP-SEC分析证明了该过程不诱导产物聚集或降解；样品是>99％完整单体(数据未显示)。
实施例55：增加的搅动对1L规模生成双特异性抗体的影响。
重复实施例53的实验，只是DO控制设置点设置为50％DO，以测定增加的氧浓度和增加的传氧速率的影响。控制策略是维持100RPM的最小搅动，随后在2-MEA添加后自动增加搅动以维持50％DO设置点，以防DO下降到低于50％。最初，最大搅动速率设置为500RPM。
在添加2-MEA后，DO下降，并且搅动立即升高到500RPM(图76-77)。然而，由于观察到喷射，将最大搅动速率降低至400RPM，并且在整个还原时间里保持在那里。在此速率，不能将DO维持于50％；取而代之，它下降到接近3％。在400RPM仍然观察到空气到表面的一些夹带。
在100RPM的条件下(实施例53)，添加2-MEA导致氧化还原电势从151mV立即下降到-297mV，及在1小时内进一步下降到-416mV；然而，在增加的氧传递的条件下，氧化还原在1小时内仅下降到-366mV。pH从7.4下降到6.9，并且在还原阶段期间略微升高(图78)。
在渗滤期间，DO在除去2-MEA后且由于将更多氧气引入到渗滤缓冲液而增加。增加的DO导致降低的搅动速率。到渗滤结束，pH已经回到开始数值。DO和氧化还原值在渗滤后直接变得接近初始的开始数值，并且到O/N温育结束逐渐达到开始数值。
如实施例53中描述的，测定还原阶段期间2-MEA自身氧化的速率和程度。在增加的搅动速率400RPM时，kla值是4.0/h，导致还原阶段期间消耗2.31mM氧。与100RPM时2.6％还原剂相比，这对应于4.62mM2-MEA，或9.2％还原剂的自身氧化。
与100RPM的条件形成对比，400RPM的条件导致链间重链键的不完全还原，如通过SDS-PAGE分析评估的(图79)。这可能是因为这些条件下升高的氧化还原电势(接近-360mV，与100RPM条件下的–411相比)。在1L渗滤缓冲液后，氧化还原是-282mV，并且观察到抗体的所有预期形式(L、H、HL、HH、HHL、LHHL)。氧化的程度在5L渗滤缓冲液后是完全的，此时，氧化还原电势是-53mV。
与100RPM的实施例(实施例53)相似，目前运行的CIEX分析证明了在还原的30分钟内已经发生了实质***换(图80)。然而，与100RPM条件形成对比(图70)，在目前的运行期间，同二聚体峰在渗滤期间增加。因此，O/N样品含有仅79.8％异二聚体及9.2％残留的同二聚体IgG1-7D8K409R和11.0％残留的同二聚体IgG1-2F8-F405L。通过OD280测量测定这些相同样品的浓度证明了100％回收率。最终样品的HP-SEC证明了过程不诱导产物聚集或降解；样品是>99％完整单体(数据未显示)。
此实施例中对最终样品发现还原期间不完全链间二硫键键合(SDS-PAGE)和低交换百分比(CIEX)可以是由于还原阶段期间增加的剪切和/或增加的氧传递。
实施例56：增加的搅动和喷射对1L规模生成双特异性抗体的影响。
重复实施例53的实验，只是DO控制设置点设置为50％DO，以测定增加的氧浓度和增加的传氧速率的影响。控制策略是维持100RPM的最小搅动，且若DO下降得低于50％，则首先将气流喷射提高直至40mL/min，然后将搅动提高直至400RPM以维持此设置点。
在添加2-MEA后，DO下降，并且气流和搅动都立即增加至最大水平(图81-82)。然而，由于观察到喷射，将最大喷射速率降低至30mL/分钟。在此速率时，不能将DO维持于50％；取而代之，其下降到接近25％，然后到还原阶段结束增加到50％。在这些条件下仍然观察到空气到表面的一些夹带。
如100RPM的运行中观察到的(实施例53，图66)，添加2-MEA导致氧化还原电势从155mV立即下降至-285MV(图81)；然而，在增加的氧传递的情况中，氧化还原在1小时内仅进一步下降到-323mV，而在100RPM，氧化还原在1小时内进一步下降到-416mV。此外，氧化还原到3小时还原期结束已经升高到-261mV。在增加的搅动和喷射的情况下，pH从pH 7.4下降至6.9，在3小时还原期里上升到pH 7.0，据推测这是由于2-MEA氧化成酸性较小形式的胱胺(图83)。
在渗滤期间，DO在2-MEA除去后且由于将更多氧气引入到渗滤缓冲液而增加。增加的DO导致降低的搅动和喷射速率。到渗滤结束，pH已经回到开始数值。DO和氧化还原在渗滤后接近开始数值，并且到O/N温育结束逐渐达到开始数值。
如实施例53中描述的，测定还原阶段期间2-MEA自身氧化的速率和程度。在增加的搅动速率400RPM和30mL/分钟喷射，kla值是5.2/h，导致还原阶段期间1.94mM氧的消耗。这对应于3.88mM2-MEA，或7.8％还原剂的自身氧化，出乎意料地，其略低于对单独搅动测定的9.2％。此差异可以是由于过程条件(最值得注意的是接近叶轮顶部的液体高度)的略微变化，其可以改变kla，导致计算错误。无论如何，这两个数字比对100RPM和没有喷射的条件计算的2.6％高得相当多(实施例53)。
与100RPM的条件形成对比，增加的搅动和喷射导致还原期结束前出现链间重链键(在氧化还原-323mV)和重链和轻链间键(在氧化还原-261mV)，如通过SDS-PAGE评估的(图84)。这可能是由于这些条件下升高的氧化还原电势。经由渗滤过程，观察到抗体的所有预期形式(L、H、HL、HH、HHL、LHHL)。氧化的程度在5L渗滤缓冲液后是完全的，此时氧化还原电势是28mV。显带样式提示了存在有一些没有再形成的链间二硫键，其更可能是测定假象，因为这也存在于IgG1对照中。
通过OD280测量测定这些相同样品的浓度证明了完全回收率(103％)。最终样品的HP-SEC分析证明了过程不诱导产物聚集或降解；样品是>99％完整单体(数据未显示)。
此实施例中对最终样品发现低交换百分比可以是由于还原阶段期间增加的剪切和/或增加的氧传递。这些结果类似于在不喷射的情况中使用增加的搅动的实施例；没有喷射的实施例(实施例55)和本实施例之间的主要差异是在还原期里DO、pH和氧化还原的进一步增加，其对应于重/轻链间键的出现。
实施例57：氮气对1L规模生成双特异性抗体的影响。
在以下变化的情况下重复实施例53的实验。从还原前至刚好在完成渗滤后的时间对***消除氧气。
将同二聚体在***中于25℃在200RPM搅动的情况下放置；以300mL/分钟用氮气给顶部空间充气，以及以15mL/分钟喷射氮气。将同二聚体混合物经由渗滤筒O/N缓慢循环，以对整个***清除氧气。贯穿还原和渗滤步骤维持这些参数，指示增加渗滤需要的循环速率。还以300mL/分钟用氮气喷射渗滤缓冲液。使用Pharmed masterflex管道***(SaintGobain)，并将其在parafilm中包裹以使空气交换最小化。将渗滤筒在袋中放置以在所述***周围提供氮气层。通过将样品从反应器吸到缺乏空气且已经含有IAA以使氧暴露最小化的注射器中采集具有IAA的样品。需要这些措施来防止氧气泄漏到***中，以证明再氧化过程的氧气需要。对于商业制造，可以使用此类条件，但是其它条件可足够，例如简单的氮气覆盖。在完成渗滤时，中断氮气充气(喷射和覆盖)，并且以500mL/分钟将空气覆盖启动5分钟，并且对于运行的剩余部分以15mL/分钟启动。
与实施例53中的156mV相比，此运行中的初始氧化还原电势是84mV。差异归因于本实施例中的初始DO0％对实施例53中100％的差异。在本实施例中，添加2-MEA导致氧化还原快速下降至-447mV和pH下降至7.4至7.0(图86-87)。pH和氧化还原值两者在三小时还原阶段里保持稳定；这些结果支持氧气的缺乏阻止2-MEA自身氧化，由此提高还原步骤的鲁棒性。
到渗滤结束，pH已经升高至接近7.4的最终数值，但是氧化还原已经升高至仅-268mV(图86-87)。低氧化还原值可能源自低DO组合仍然降低的蛋白质和潜在仍然降低的残留2-MEA的组合。在渗滤后，将空气引入顶部空间，并且DO和氧化还原快速上升，并且保持相对稳定达几小时，随后增加至102％DO和178mV(对于氧化还原)的新稳定值。
SDS-PAGE分析证明了30分钟内链间二硫键的完全还原(图88)。抗体在还原期的剩余部分期间及贯穿整个渗滤期保持为还原性的，尽管氧化还原电势(-268mV)在其它实施例(实施例53-56)中观察到部分氧化的范围中。这些结果确认需要氧气来再形成链间二硫键。链间二硫键形成在引入氧气后1小时内是明显的，但是再氧化在3小时后是不完全的，此时氧化还原电势是-83mV。在渗滤期间存在氧气的实施例(实施例53-56)期间发生更快的二硫键形成。这可能是由于那些实施例中渗滤期间较高的氧浓度和较高的氧化还原电势所致。O/N样品显示了升高的抗体氧化。残留的次要的低分子量条带可能是通过将材料经由筒连续循环引起的。在2-MEA添加前观察到溶液的一些浊度，指示过夜循环对产物具有影响。浊度在添加2-MEA后消失，但是在连续循环O/N后，在完成渗滤后再次出现。蛋白质回收率(96％)在此实施例中比在实施例55-56中略低。
CIEX分析证明了将同二聚体有效交换成异二聚体产物(图89)；在还原的30分钟内已经发生了实质***换。最终产物是94.8％双特异性，4.0％7D8同二聚体，和1.2％2F8同二聚体。最终样品的HP-SEC分析证明了该过程不诱导产物聚集(>99％完整单体)。
使用与实施例53中的数学规程相似的数学规程，分析数据以测定渗滤后计算的氧消耗(图90)。计算的消耗氧总量最初增加至0.33mM，然后降低并稳定于0.30mM。计算的消耗总氧的下降可以是由于氧气释放，或者更可能是实验误差所致。计算对计算中使用的kla是相当灵敏的，并且在PBS中在分开的实验中测定kla。另一个理论可能性是从过氧化物释放氧气，已经显示了该过氧化物从低还原剂浓度的硫氢基的金属催化的自身氧化形成(Fedorcsak等,Exp Cell Res108:331-339,1977；Jeitner and Lawrence,ToxicologicalSciences63:57-64,2001)。更可能地，除了评估的kla的误差外，可以有使解读变复杂的其它因素。例如，可能的是，反应器中的2L顶部空间在500mL/分钟空气清除5分钟，接着15mL/分钟空气覆盖的情况中没有立即从氮气转变成空气。还有可能的是，保持低水平的2-MEA，并且其有助于氧气消耗。最后，有可能的是分子中的其它半胱氨酸被还原，然后再氧化，尽管通常要还原的这些二硫化物需要在强溶液诸如6M尿素中的变性。
实施例58：低pH对1L规模再氧化双特异性抗体的影响。
重复实施例53的实验，直至还原期结束。在该点时，刚好在渗滤前，及刚好在采集3小时还原样品前，使用6.4mL2M乙酸将pH降低至5.0；在添加酸期间将搅动提高至200RPM，然后在渗滤前降低回到100RPM。通过添加2M乙酸调节至pH 5.0的PBS用作渗滤缓冲液。如实施例53中，将产物保持O/N(于25℃，100RPM，15ml/分钟顶部空间充气)。次日，采集样品，使用用HCl调节至pH 9的8.8mL2N Tris碱溶液将产物调节回到pH 7.4，并且刚好在pH调节后及然后在pH调节后1和2小时采集样品。
如预期的，还原期期间的氧化还原、DO、pH、SDS-PAGE、和CIEX谱(图91-94)类似于来自实施例53的(图66-67；69-70)。在3小时还原期结束时，随着将pH从6.99调节至5.03，氧化还原从-423mV增加至-144mV。在pH调节之前和之后，链间键保持完全还原的。在pH 7.4缓冲液中的其它实施例中(例如实施例53、55和56)，随着氧化还原接近约-360mV观察到重链间的二硫键，即使在除去2-MEA前，并且随着氧化还原接近-280mV，重链和轻链之间的二硫键是明显的。在pH 5.0的渗滤期间，氧化还原增加至28mV，并且所有预期的重链和轻链组合是明显的(L、H、HL、HH、HHL、LHHL)。然而，与在较高pH用渗滤的其它实施例形成对比，链间键的实质性部分仍然未形成。氧化还原在渗滤后1小时内进一步增加至51mV，然后在O/N温育后至53mV。到此时间，链间键形成已经略微增加。DO在渗滤期间从0％增加至83％，并且在渗滤后2小时稳定于80％。与初始DO值100％的偏移可以是由于pH对溶解氧的平衡值的影响，并且进一步可以受到乙酸挥发性影响，乙酸可以潜在穿过硅酮膜，并且影响探头校准。在中和至pH 7.4后，氧化还原由于pH调节而下降至-109mV。尽管氧化还原较低，增加的pH导致链间键形成的立即增加。氧消耗是明显的，因为DO在pH调节后下降。在pH增加后，氧化还原在接着的2小时内增加至-78mV，到该时间产物是几乎完全氧化的。在进一步温育后，DO回到80％，并且氧化还原稳定于135mV，可能指示产物氧化是完全的(没有分析样品)。初始和最终氧化还原之间的略微偏移可以是由于缓冲液组成的差异所致。
CIEX分析证明了将同二聚体有效交换成异二聚体产物(图94)；在还原的30分钟内已经发生了实质***换。最终产物是93.7％双特异性，4.8％IgG1-7D8-K409R同二聚体，和1.5％IgG1-2F8-F405L同二聚体。通过OD280测量测定这些相同样品的浓度证明了完全回收率103％。最终样品的HP-SEC分析证明了该过程不诱导产物聚集或降解；样品是>99％完整单体(数据未显示)。
这些结果证明了与pH 7.4相比，再氧化过程在pH 5时更慢且不太完全。pH可以影响过程的动力学和/或平衡。
实施例59：胱胺对交换过程的影响
胱胺是半胱胺(2-MEA)的氧化二聚体。
重复实施例53的实验，只是在含有PBS pH 7.4中10g/L人IgG1-7D8-K409R和10g/LIgG1-2F8-F405L及1mL5M胱胺(终浓度50mM胱胺)的较小体积99mL中实施交换5小时。在添加胱胺后，氧化还原从194mV下降至130mV，并且pH从7.41下降至7.07(图95)。在开始时及在胱胺中的同二聚体温育0.5、1、3、和5小时后采集样品，并且通过CIEX分析。没有观察到双特异性抗体的形成(图96)。这些结果确认胱胺不诱导IgG1 Fab-臂交换或者仅试剂的还原形式可以还原抗体的二硫键。
实施例60：使用半胱氨酸作为还原剂及使用离子交换除去还原剂
半胱氨酸是一种天然的、药典的、无毒性化合物，以适合于GMP生产的较大量容易得到；半胱氨酸也可以用作还原试剂/还原剂。测试了半胱氨酸作为还原剂的效力。在1L反应器***中比较半胱氨酸(Sigma C5360)的氧化还原电势与2-MEA的，如实施例53中描述的。将反应器充满990mL PBS pH 7.4(P.Braun)，并且使用氮气使DO恢复到0％。将5M2-MEA的储备溶液逐渐添加至反应器(多达45mM终浓度)，并记录pH、DO、和氧化还原。单独PBS的氧化还原是87.5mV(表13)。氧化还原最初在0.5mM 2-MEA时快速下降至-218.7mV，然后在45mM2-MEA时更逐渐下降至-345mV。在此点时，由于2-MEA的酸性，pH已经下降到6.92。
用0.5M半胱氨酸储备溶液代替2-MEA重复实验。在使用前用2M NaOH将半胱氨酸储液调节至pH 7.4，因为此溶液具有非常低的酸性。单独的PBS的氧化还原是102.5mV(表14)。氧化还原最初在1mM半胱氨酸时快速下降至-186.2mV，然后在45.9mM半胱氨酸时更逐渐下降至-309.6mV。
总之，在pH 7.4对45.9mM半胱氨酸观察到氧化还原的412mV总体下降，及在pH6.92对45.0mM2-MEA观察到氧化还原的433mV下降(表13-14)。基于如先前实施例中描述的那样使用2-MEA实施的1L交换实验中观察到的氧化还原电势，半胱氨酸应当支持同二聚体还原和交换成特异性抗体。
为了评估半胱氨酸支持交换的能力，使用不同浓度的半胱氨酸实施时间过程研究。将IgG1-7D8-K409R(1.8mg)和IgG1-2F8-F405L(1.8mg)在总体积1.0mL中在加有10-100mM半胱氨酸的阳离子交换(CIEX)缓冲液(10mM磷酸钠，pH 7.0)中温育。将反应混合物在HPLC室内于30℃放置，并且每55分钟直到385分钟为止将28.0μL混合物加载到柱上。在每次注射循环前，在CIEX缓冲液中平衡柱(Dionex ProPac WCX-10柱，4mm直径，250mm长度)。将柱的温度维持于30℃。在用CIEX缓冲液清洗3分钟后，将CIEX缓冲液中0至60mM NaCl的线性盐梯度以1.0mL/分钟的流速应用18.5分钟。用CIEX缓冲液中750mM NaCl将柱再生5分钟，接着在CIEX缓冲液中平衡18.5分钟，准备进行下一份样品的注射。在280nm的波长监测流出液的UV吸光度。
图97-101显示了10mM、25mM、50mM、75mM和100mM半胱氨酸的0-385分钟的CIEX迹线。基于没有蛋白质和空白缓冲液注射的半胱氨酸初步注射，将在每个迹线中接近1分钟洗脱的早期峰归入样品中半胱氨酸的存在和/或胱氨酸，即半胱氨酸的氧化二聚体形式。每幅图中标记的同二聚体和双特异性抗体晚得多地洗脱。这些结果证明了CIEX柱可以用于除去还原剂。
在10mM半胱氨酸(图97)，还原较慢，并且到385分钟尚未完全。比较而言，在25mM(图98)、50mM(图99)、和75mM(图100)半胱氨酸，交换较快，并且到385min是完全的。在100mM半胱氨酸，交换似乎甚至更快(图101)；然而，在385分钟，双特异性抗体峰是双峰。在较低半胱氨酸浓度在中间时间点时也观察到此双峰。在每种情况中，较高浓度的半胱氨酸导致更高初始比例的更具碱性的双峰(保留时间14.3分钟)；随着时间的过去，更具碱性的峰变换成更具酸性的峰(保留时间14.0分钟)，其是双特异性抗体的预期保留时间。最可能的解释是来自双峰的更具碱性的峰是中间形式，其中尚未发生链间二硫键的再形成。表15中显示了在385分钟时形成的双特异性抗体的最终量。在10mM半胱氨酸，仅存在有同二聚体对双特异性抗体的54.9％转化。在25mM，这升高至91.0％，且在50mM和75mM半胱氨酸进一步升高至93.5％和94.7％。100mM半胱氨酸的交换最高(95.1％)；然而，酸性和碱性双峰两者都称为双特异性抗体。
使用脱盐柱除去还原剂，进一步探索半胱氨酸作为还原剂的用途。对还原应用如上文描述的相同条件(CIEX缓冲液，1mL样品，30℃，3.6mg/mL总蛋白质)，其使用50mM半胱氨酸作为还原剂达385分钟进行。在使用大小排阻(来自GE Healthcare的G-25微旋转柱)除去半胱氨酸后，在CIEX平衡缓冲液中于RT再氧化双特异性抗体，于30℃持续2小时或于RT持续18小时。图102中显示了CIEX谱。表16显示了再氧化后的双特异性抗体和残留的同二聚体的百分比。结果显示了交换是有效的，且于30℃再氧化2小时等同于在RT再氧化18小时，尽管迹线指示存在残留的半胱氨酸/胱氨酸。
表13：在氮气下在PBS缓冲液中2-MEA和半胱氨酸的氧化还原电势。
表14：
Figure BDA0000528413460001482
Figure BDA0000528413460001491
表15：与不同浓度的半胱氨酸一起温育385分钟后双特异性抗体和同二聚体的百分比。
使用三种种类各自的主峰的峰面积测定百分比。
Figure BDA0000528413460001492
表16：使用50mM半胱氨酸于30℃再氧化2小时或于RT再氧化18小时后的双特异性抗体和同二聚体的百分比。
实施例61：使用固定化还原剂柱的异二聚体蛋白形成和纯化。
为了实现在一个步骤中形成双特异性抗体及自双特异性抗体除去还原剂，使用固定化还原剂柱。将同二聚体IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的混合物以摩尔比1:1以在PBS(P.Braun)中各为2.5mg/mL的浓度添加至依照制造商的说明书制备的固定化还原剂柱(Thermo Scientific/Pierce,Rockford,IL,USA；产品目录编号77701)，并于RT温育3小时。通过应用2mL PBS洗脱抗体，并将其收集。通过HPLC-CIEX分析样品。图103显示了起源性同二聚体间的双特异性抗体形成(25.3％双特异性，36.4％IgG1-2F8-F405L和38.3％IgG1-7D8-K409％)。
实施例62：使用同种异型差异评估双特异性IgG1。
为了在双特异性抗体制备中实现残留量同二聚体的除去，调查双特异性抗体是否可以自不同同种异型的两种同二聚体生成。
通过本领域中已知的方法制备IgG1m(f)同种异型主链(包含K409R突变)中抗CD20抗体7D8，和IgG1m(za)同种异型主链(包含F405L突变)中抗EGFR抗体2F8的表达载体(SEQID NO.:8和9，下文描述)。将蛋白质表达并纯化，如实施例1、2和5中描述的。将等摩尔量的所得IgG1m(f)-K409R-CD20和IgG1m(za)-F405L-EGFR蛋白在存在25mM2-MEA的情况中在总体积1mL中于37℃温育90分钟。总抗体的终浓度是1mg/mL。接着，使用PD-10脱盐柱(GEHealthcare Europe GmbH,Diegem,Belgium)通过缓冲液更换成PBS(B.Braun)从混合物除去2-MEA。在下文描述的ELISA中将连续稀释的双特异性抗体样品(范围为2.3–5,000ng/mL)与亲本抗体比较。包括具有含有两种同种异型的主链的抗体IgGm(fa)作为对照抗体。使用夹心ELISA测定双特异性抗体形成。对于此测定法，将ELISA板(Greiner bio-one,Frickenhausen,Germany)用PBS中1μg/mL(100μL/孔)小鼠抗人G1m(f)抗体5F10(Sanquin,Amsterdam,The Netherlands；Jefferis,R.等Immunol.Lett.199231:143-168；de Lange,G.G.,Exp.Clin.Immunogenet.19896:7-17)于4℃,O/N包被。将板用PBST清洗三次，并用PBST封闭，其通过在板摇动器(300RPM)上于RT温育60分钟进行。将板用PBST清洗三次，并将样品在PBST中稀释，并转移至ELISA板(100μL/孔)。于RT在板摇动器(300rpm)上温育60分钟后，将板用PBST清洗三次。接着，添加100μL经HRP标记的小鼠抗人G1m(a)抗体4E3(SouthernBiotech,Birmingham,Alabama,USA；产品目录编号9052-05；在PBST中以10,000倍稀释)，并在板摇动器(300rpm)上于RT温育60分钟。将板用PBST清洗三次。将50mg ABTS片(RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,Germany)在ABTS缓冲液(Roche)中溶解，并添加至ELISA板(100μL/孔)。将板在板摇动器(300rpm)上在黑暗中于RT温育30分钟(或更长，若想要的话)。每孔用100μL2％草酸(终浓度1％,Riedel de Haen Seelze,Germany)停止反应。将ELISA板于RT留置10分钟，之后在ELISA读板仪中读出405nm吸光度。图104显示了双特异性抗体的浓度依赖性检测，而没有检出两种亲本抗体。对照抗体IgG1m(fa)在ELISA中产生较高的信号，因为它在每个重链上含有两种同种异型决定簇。
SEQ ID NO.:8(IgG1m(za)-F405L)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.:9(IgG1m(f)-K409R)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
实施例63：通过同种异型特异性抗体纯化双特异性IgG1
通过本领域中已知的方法制备IgG1m(f)和IgG1m(za)同种异型主链中表达的抗体，其包含K409R和F405L突变。随后，将蛋白质表达并纯化，如实施例1、2和5中描述的。通过操纵非等摩尔交换生成双特异性抗体，如实施例64中描述的。这会产生反应混合物，其含有双特异性IgG1m(f,za)抗体和过量(SNEEP)添加的亲本抗体的剩余部分。
使用亲和层析特异性纯化双特异性IgG1m(f,za)抗体。因此，依照制造商的说明书将小鼠抗人G1m(f)抗体5F10(Sanquin)或小鼠抗人G1m(a)抗体4E3(Southern Biotech)与珠偶联。将含有双特异性IgG1m(f,za)抗体和过量添加的亲本抗体的剩余部分的反应混合物加载到含有合适珠(对存在于双特异性IgG1m(f,za)抗体上，而不在过量添加的亲本抗体上的同种异型决定簇特异性)的柱上。将柱彻底清洗以除去过量的亲本抗体，然后依照制造商的说明书从柱中洗脱双特异性IgG1m(f,za)抗体。
实施例64：操纵非等摩尔交换方法(SNEEP)与同二聚体之一中消除蛋白A结合位点的突变的组合。
调查交换产物中的一种同二聚体的存在是否可以通过在交换过程中使用过量的另一种同二聚体减少(操纵非等摩尔交换方法；SNEEP)。SNEEP(使用过量的IgG1-7D8-K409R(在蛋白A上纯化)以减少交换产物中IgG1-2F8-F405L(在蛋白A上纯化)同二聚体的存在)导致交换产物中仅0.1％IgG1-2F8-F405L同二聚体(图105)。使用的条件是7.2mg IgG1-7D8-K409R，6.0mg IgG1-2F8-F405L，3mL PBS中75mM2-MEA，于31℃温育5小时。使用过量的IgG1-2F8-F405L同二聚体，交换产物中IgG1-7D8-K409R的百分比仅是0.4％(图106)(相同条件，6mg IgG1-7D8-K409R和7.2mg IgG1-2F8-F405L)。
接着，调查高度纯的双特异性抗体是否可以使用突变为消除蛋白A结合位点的一种同二聚体(引入以下突变：I253A、H310A、和H435A(AAA突变体))，和仍能结合蛋白A的同二聚体使用SNEEP和蛋白A层析的组合生成。为了测试突变为缺乏蛋白A结合位点的同二聚体是否可以与含有蛋白A结合位点的同二聚体交换，将同二聚体IgG1-7D8-AAA-K409R和IgG1-2F8-F405L分别在蛋白G和蛋白A上纯化。对于SNEEP，使用下列条件：1mg IgG1-7D8-AAA-K409R和0.5mg IgG1-2F8-F405L，在1.2mL含有25mM2-MEA的PBS中，37℃，90分钟。使用此规程，交换产物中IgG1-2F8-F405L突变体的百分比是1.2％(图107)。使用1mL用PBS(B.Braun)预平衡的MabSelectSure柱纯化含有低百分比的IgG1-7D8-AAA-K409R同二聚体(其在交换反应中过量使用)的双特异性抗体。所得的CIEX层析图(图108)显示了流过级分中的峰(峰FT)和洗脱级分中的峰(峰E)，指示非结合和结合级分。非结合和结合级分的比率大致与SNEEP中过量使用的50％过量的IgG1-7D8-AAA-K409R同二聚体一致。
CIEX对峰FT的分析(图109)显示了此级分仅含有IgG1-7D8-AAA-K409R同二聚体，双特异性抗体和IgG1-2F8-F405L同二聚体的量低得检测不到。这指示具有单一蛋白A结合位点的双特异性抗体较好地结合至MabSelectSure，并且过量的IgG1-7D8-AAA-K409R同二聚体不结合柱，如预期的。SNEEP后留下的少量的IgG1-2F8-F405L在峰FT中检测不到，指示它结合至MabSelectSure。
通过CIEX分析洗脱的级分(峰E)(图110)。没有检出IgG1-7D8-AAA-K409R同二聚体。IgG1-2F8-F405L的量是2.0％，与中间产物中检出的1.2％一致性较好。
如此，SNEEP后的CIEX分析证明了不够丰富的同二聚体的量的有效还原。此外，经由亲和层析除去过度丰富的同二聚体(消除蛋白A结合位点)。在终产物中没有检出IgG1-7D8-AAA同二聚体。终产物含有98.0％IgG1-7D8-AAA-K409R x IgG1-2F8-F405L双特异性抗体，和2.0％IgG1-2F8-F405L同二聚体。总之，与突变为缺乏蛋白A结合位点的一种同二聚体组合的SNEEP可以用于生成高度纯的异二聚体蛋白(98％最终纯度)。
实施例65：蛋白A联合的同二聚体纯化及随后的交换
为了调查双特异性抗体是否可以使用单一蛋白A捕捉步骤从一起纯化的同二聚体生成，将17.5mL IgG1-b12-F405L(280μg/mL浓度)与66mLIgG1-058-K409R(75μg/mL浓度)混合。将组合的上清液(1:1混合物，基于总蛋白质)加载到1mL蛋白A柱上，所述蛋白A柱用20mM柠檬酸盐，150mMNaCl，pH 7.0平衡。使用标准规程清洗并洗脱结合的材料(用7个柱体积(CV)20mM柠檬酸盐，150mM NaCl，pH 7.0清洗；用3个CV20mM柠檬酸盐，pH 7.0预洗脱；用10mM柠檬酸盐，pH 3.5洗脱)。
IgG1-b12-F405L(一种针对gp120的抗体)和IgG1-058-K409R(一种针对c-MET受体的抗体)的联合纯化的快速蛋白质液体层析(FPLC)谱(在
Figure BDA0000528413460001531
FPLC***上测量)显示了在pH 3.5在洗脱后的单峰(图111)。这指示可以在不调节蛋白A纯化的标准方法的情况下共纯化同二聚体。对于此方法，回收率(基于上清液的OCTET测量和终产物的A280测量计算)>80％，其类似于没有突变的IgG1同二聚体的。
在Slide-a-lyzer(0.5-3mL,Thermo)中使用过夜透析将合并的级分缓冲液更换成PBS(P.Braun,pH 7.4)。次日，将样品转移至聚丙烯管，总体积是1.5mL。
对共纯化的同二聚体的CIEX分析显示两个峰，如预期的(图112)。第一个峰(rT＝14.9)对应于IgG1-058-K409R，第二个峰对应于IgG1-b12-F405L。考虑特定的消光系数，峰面积的量化显示了57％IgG是IgG1-b12-F405L，而43％是IgG1-058-K409R，这与上清液中的浓度测定的预期不准确度一致性良好。随后，添加0.165mL750mM2-MEA，于31℃将交换实施5小时。将终产物再次针对PBS(P.Braun,pH 7.4)透析。
如通过HP-SEC测定的终产物中多聚体的百分比(2.0％)(图113)与使用相同规程纯化的其它IgG1分子的多聚体的百分比相当(对于IgG1-b12-F405L为<1％且对于IgG1-058-K409R为1.8％)，即使与同二聚体相比，双特异性产物经受额外的蛋白A纯化步骤。这指示联合纯化的同二聚体的产物质量不受其相互存在影响。在终产物的CIEX谱中没有检出IgG1-058-K409R同二聚体，并且异二聚体蛋白和IgG1-b12-F405L同二聚体的百分比是86％和14％(图114)。
实施例66：与SNEEP组合的交换后精制CIEX
调查是否有可能使用SNEEP和等度模式的弱阳离子交换(WCIEX)层析的组合从双特异性产物除去两种同二聚体。使用对联合纯化描述的标准方法(实施例65)在蛋白A上成功纯化同二聚体。SNEEP记载于实施例64，并且显示了交换产物中存在的0.1％(IgG1-2F8-F405L；在与过量IgG1-7D8-K409R的交换反应中；图105)和0.4％(IgG1-7D8-K409R；在与过量IgG1-2F8-F405L的交换反应中；图106)同二聚体。虽然这在不同实验中显示，但是假设这些数字指示SNEEP的效力。
为了寻找SNEEP后同二聚体除去(精制)的最佳条件，对IgG1-7D8-K409R、IgG1-7D8-K409Rx2F8-F405L、和IgG1-2F8-F405L制备1:1:1混合物。因此，对三重混合物进行此优化以使其变得更加通用，而SNEEP生成二元混合物。然而，认为这些条件也代表具有三种组分中的两种的二元混合物的分开。将混合物加载到弱阳离子交换(WCIEX)柱(GEHealthcare)，最终加载0.4mg/mL树脂)上，并等度洗脱，其使用各种组分的低盐缓冲液(参见下文)进行。图115中显示了发现良好分离的条件下的层析图。左边的峰对应于IgG1-7D8-K409R，中间的峰对应于IgG1-7D8-K409Rx2F8-F405L，并且右边的峰对应于IgG1-2F8-F405L。使用以下等式5测定分开右边的峰和异二聚体蛋白的分辨力：
(等式5)
Figure BDA0000528413460001551
tb：IgG1-2F8-F405L同二聚体的保留时间
ta：双特异性抗体的保留时间
Wa：一半高度的异二聚体蛋白峰的宽度
Wb：一半高度的IgG1-2F8-F405L同二聚体峰的宽度。
在图116中，对于具有重叠pH区的具有不同离子强度的两种缓冲液(10和20mM柠檬酸盐，pH 6.0-6.8和10mM磷酸盐pH 6.8和7.2)，将使用等式5计算的分辨力作为pH的函数绘图。分辨力在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.4)中是最佳的。选择此条件进行等度模式的WCIEX。
对异二聚体蛋白掺入10％IgG1-2F8-F405L同二聚体，模拟使用SNEEP获得的异二聚体蛋白产物。用20mM柠檬酸盐，pH 6.4中的1.0mL混合物(每mL树脂4mg IgG)加载阳离子交换柱(2.5mL粗查柱(scouting column)，10cm床高度，其装有高效Sepharose CM(GEHealthcare))。
FPLC洗脱谱显示大峰，接着是小峰(图117)。在图118中，显示了大峰(S0002)的合并级分的分析CIEX谱。洗脱后IgG1-7D8-K409、IgG1-7D8-K409Rx2F8-F405L、和IgG1-2F8-F405L的百分比是4.3％、94.8％、和0.9％，证明了使用等度洗脱除去大部分IgG1-2F8-F405L突变体。如预期的，IgG1-7D8-K409R同二聚体和异二聚体蛋白之间的分辨力是不足的，如通过剩余的4.3％IgG1-7D8-K409R同二聚体显示的。然而，如上文所述，假设可以使用SNEEP减少IgG1-7D8-K409R同二聚体的量。
总之，与WCIEX柱上的等度洗脱组合的SNEEP用于生成高度纯的异二聚体蛋白。或者，SNEEP及随后的蛋白A层析组合消除蛋白A结合的AAA突变(I253A、H310A、和H435A，如实施例64中描述)可以用于将双特异性产物中每种同二聚体的量减少至低于1％。
实施例67：用于除去2-MEA的结合和洗脱层析
调查结合和洗脱层析(包括但不限于CIEX、亲和层析、HIC)是否可以用于从异二聚体蛋白制备物除去还原剂2-MEA。蛋白A亲和层析用作原则证明，通过测定穿透点(point ofbreakthrough)测试暴露于还原剂之前和之后的柱性能。
通过于31℃将3mL中的10mg IgG1-7D8-K409R和10mg IgG1-2F8-F405L与75mM2-MEA一起温育5小时制备异二聚体蛋白产物。将3mL蛋白质产物(总蛋白质浓度约20mg/mL)应用于5mL蛋白A柱，其使用PBS进行平衡和清洗步骤，以及20mM柠檬酸盐，pH 3.0进行洗脱。在AKTA上测量FPLC洗脱谱，其显示于图119A。在8mL，根据A254和A280的强升高，蛋白质的洗脱是明显的。在约65mL，根据A254的强升高，蛋白质的洗脱是明显的。A280信号的升高是由于双特异性抗体还原期间形成胱胺。使用具有75mM2-MEA而没有蛋白质的PBS实施对照运行(图119B)。在约8mL时的A254升高标记2-MEA的洗脱。注意到与图119A相比，A280信号仅勉强升高，这是由于缺乏胱胺。FT级分中相等强度的峰存在于两幅层析图中，指示2-MEA不结合柱，且蛋白质被洗脱。
为了测试柱完整性是否受到2-MEA存在影响，在除去2-MEA之前和之后测定蛋白A柱的穿透点(图120)。穿透点在暴露于2-MEA之前和之后是相似的，指示柱的性能不受2-MEA存在影响。
为了检查蛋白A在除去2-MEA期间是否渗漏出柱，对纯化的产物实施还原性SDS-PAGE分析(图121)。没有观察到与重链(50kDa)和轻链(25kDa)的预期条件不同的条带，指示在柱暴露于2-MEA后没有蛋白的显著损失。
总之，在75mM2-MEA的情况下异二聚体蛋白的FPLC层析图显示具有指示流过物中存在2-MEA的A280/A215比率的峰。蛋白A柱的穿透点在暴露于2-MEA之前和之后是相似的，指示性能不受2-MEA存在影响。还原性SDS-PAGE显示完整的IgG且没有蛋白A渗漏的迹象，指示柱对2-MEA有抗性。这指示从产物除去2-MEA。
实施例68：以含有一条κ轻链的和含有一条λ轻链的同二聚体开始的双特异性抗体的形成及使用LambdaFabSelect和KappaSelect的纯化。
为了实现在双特异性抗体制备中除去残留量的同二聚体，调查是否可以生成具有一条κ和一条λ轻链的双特异性抗体。在用那他珠单抗治疗的患者中在体内显示一个含有κ轻链的IgG4分子和另一个含有λ轻链的IgG4分子之间的Fab臂交换的可能性(Labrijn等2009Nature Biotechnology p767)。
为了显示含有κ轻链的IgG1分子和另一个含有λ轻链的IgG1分子之间的Fab臂交换是可能的，将IgG1同二聚体IgG1-2F8-F405L和BMA 031-N297Q-K409R(针对T细胞受体alpha链的IgG1/Lambda抗体(Shearman等1991J.Immunol.147(12):4366-4373)，其具有N297Q和K409R突变；N297Q突变敲除糖基化位点；这不影响交换过程)在150 L PBS中以各为0.5mg/mL的浓度以摩尔比1:1混合，并在存在75mM2-MEA的情况中于31℃温育5小时。接着，通过使用Amicon Ultra0.5(10,000MWCO,Millipore)针对PBS(B.Braun,pH 7.4)的渗滤从混合物除去2-MEA。图122显示了含有κ轻链的IgG1分子和另一个含有λ轻链的IgG1分子之间的Fab臂交换是可能的，如通过分析CIEX分析的。
为了自污染性同二聚体纯化双特异性抗体，在自蛋白A洗脱后使用Tris,pH 9.0实施中和。通过于4℃,O/N透析将缓冲液更换成PBS。为了除去非结合性含有κ轻链的同二聚体，每mL LambdaFabSelect树脂(1mL HiTrap柱，GE Healthcare Life Sciences,Uppsala,Sweden；产品目录编号17-5482)以加载流速0.1mL/分钟(4分钟停留时间)加载4mg双特异性抗体。在0.1M乙酸盐，pH 3.5中实施洗脱。使用Tris,pH 9.0实施中和。通过于4℃,O/N透析将缓冲液更换成PBS。为了除去非结合性含有λ轻链的同二聚体，每mL KappaSelect(1mLHiTrap柱，GE Healthcare Life Sciences；产品目录编号17-5458)以加载流速0.1mL/分钟(4分钟停留时间)加载4mg洗脱双特异性抗体。在0.1M甘氨酸,pH 2.7中实施洗脱，使用Tris,pH 9.0实施中和。通过于4℃,O/N透析将缓冲液更换成PBS。
对于SNEEP，对含有κ轻链的同二聚体或含有λ轻链的同二聚体使用30％摩尔过量。不够丰富的种类(即分别为含有λ轻链的和含有κ轻链的同二聚体)会分别结合至LambdaFabSelect或KappaSelect。以此方式，除去过量的含有κ轻链的同二聚体或含有λ轻链的同二聚体。使用如上文对同二聚体描述的清洗和洗脱条件会用于纯化双特异性抗体。
或者，若不实施SNEEP，则使用KappaSelect和LambdaFabSelect实施两个序贯的精制步骤以除去所有同二聚体。
实施例69：DuoBody和同二聚体在磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4中的实时和应激的稳定性。
与初始同二聚体相比，于2-8℃及于25℃贮存12个月后检查异二聚体蛋白在PBS缓冲液中的生物化学稳定性。还包括于升高的温度40℃贮存3个月。用异二聚体实施稳定性测试，所述异二聚体通过IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R与相应的同二聚体IgG1-2F8-F405L和IgG1-7D8-K409R的交换形成。将三种材料在PBS pH 7.4(B.Braun，产品目录编号3623140；8.7mM HPO4 2-,1.8mM H2PO4 -,163.9mM Na+,140.3mM Cl-,pH 7.4)中配制为5mg/mL。将各批次以300μL等分试样在1.0mL冷冻小瓶中无菌分配以用于在2-8℃温育及在有塞子且有帽的玻璃小瓶中无菌分配以用于在25和40℃温育。在Nanodrop(A280和A350)、SDS-PAGE、HP-SEC和CIEX上在0、1、2、3、6、9和12个月分析材料。
测量的A280值对于不同时间点和温度贮存的所有样品是相当的，如图123中显示的。还在相同样品中测量350nm的吸光度(A350)，提供样品浊度的指示。异二聚体蛋白和同二聚体的A350值在贮存后部增加，指示在这些条件下没有发生广泛的颗粒形成。
图124和125显示了研究开始时和于2-8℃和于25℃贮存12个月后材料的非还原性和还原性SDS-PAGE分析的结果。于2-8℃贮存后没有发生显著变化。于25℃贮存在非还原性SDS-PAGE上诱导少量片段化且在还原性SDS-PAGE上诱导71和113kDa的其它条带的形成，其对于异二聚体蛋白比对于同二聚体似乎略多。这些其它条带的性质可以通过贮存后IgG分子中不可还原性硫醚连接的形成(从二硫键损失硫)解释。40℃的应激条件加速片段化过程，并且确认于25℃温育的结果(图126和127)。
使用HP-SEC对材料分析片段化和多聚化，并且代表性层析图显示于图128。表17中的数据汇总显示了异二聚体蛋白和同二聚体在研究开始时及于2-8℃贮存12个月后是单体的(>99％单体)。在将材料于25℃贮存12个月时观察到一些片段化，而无多聚化。异二聚体蛋白的片段化程度(2.3％)介于两个相应的同二聚体IgG1-7D8-K409R(1.5％)和IgG1-2F8-F405L(6.3％)的数值之间，指示异二聚体蛋白不比同二聚体更不稳定。于40℃贮存诱导相当多的片段化(铰链片段化和损失Fab片段)，其对于异二聚体蛋白比对于同二聚体似乎略高(15.6％相比于3.5％和10.6％)。另一方面，峰分配和峰百分比的测定对于这些层析图是困难的，这是由于不充分的分辨力所致。
图129中显示了t＝0和t＝12个月时CIEX分析的结果(电荷谱)。异二聚体蛋白的峰谱相当于在相同条件下贮存的同二聚体的。于25℃贮存后，伴随中性峰面积降低的酸性峰增加对于所有材料是明显可见的。于升高的温度和pH的IgG酸化是IgG的常见现象，并且主要归因于Asn残基脱酰胺形成Asp。于25℃贮存的峰谱显示了异二聚体蛋白与同二聚体材料一样易于脱酰胺。
总之，基于A280、SDS-PAGE、HP-SEC和CIEX分析，稳定性数据显示了异二聚体蛋白于2-8℃在5mg/mL在PBS pH 7.4中贮存至少12个月后是生物化学稳定的。于升高的温度25℃和40℃，异二聚体蛋白的状态相当于同二聚体材料，但是片段化似乎略多。可以通过在具有较低pH(pH 6，数据未显示)的其它缓冲液中配制材料降低应激条件下异二聚体的片段化量。
表17：在所有时间点和温度的异二聚体蛋白、IgG1-7D8-K409R和IgG1-2F8-F405L的HP-SEC数据。单体、多聚体和降解的百分比以占总峰高度的百分比表示。对于在2-8℃和25℃贮存的所有材料，百分比多聚体是<1。对于在2-8℃贮存的所有材料，百分比片段化是<1。
Figure BDA0000528413460001601
Figure IDA0000528413500000011
Figure IDA0000528413500000021
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Figure IDA0000528413500000181

Claims (53)

1.一种用于生成全长双特异性抗体的体外方法，其包括下列步骤：
a)在还原性条件下将第一全长抗体与第二全长抗体一起温育，所述还原性条件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且
其中所述第一全长抗体包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第一CH3区，且所述第二全长抗体包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，其中所述第一全长抗体的第一CH3区中仅存在如下取代：K409R，且所述第二全长抗体的第二CH3区中仅存在如下取代：F405L，使得所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，其中氨基酸位置依照EU索引编号；
b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述全长双特异性抗体中的半胱氨酸氧化成链间二硫键；
c)获得所述全长双特异性抗体，其中所述方法产生全长双特异性抗体，其中超过80％的总产物是期望的全长双特异性抗体。
2.依照权利要求1的体外方法，其中步骤b)包括使至少10mL从步骤a)获得的组合物经受足以容许氧化的氧化条件。
3.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括添加还原剂。
4.依照权利要求3的体外方法，其中所述还原剂选自下组：2-巯基乙胺、2-巯基乙胺的化学衍生物、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。
5.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)包括添加金属螯合剂。
6.依照权利要求5的体外方法，其中所述金属螯合剂是EDTA、EGTA或柠檬酸。
7.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括减少步骤a)中的组合物中的氧量。
8.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中在还原性条件下实施步骤a)，所述还原性条件具有介于-150和-600mV之间的氧化还原电势。
9.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)包括在存在至少25mM选自下组的还原剂的情况中于至少20℃的温度温育至少30分钟：2-巯基乙胺、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。
10.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二全长抗体在缓冲液中。
11.依照权利要求10的体外方法，其中所述缓冲液包含范围为1-100mM的磷酸盐。
12.依照权利要求10-11中任一项的体外方法，其中所述缓冲液具有范围为4.5-8.5的pH。
13.依照权利要求10-12中任一项的体外方法，其中所述缓冲液选自下组：a)8.1mMNa2HPO4-7H2O、1.5mM KH2PO4、138mM NaCl、2.7mM KCl，pH 5.0；b)8.1mM Na2HPO4-7H2O、1.5mMKH2PO4、138mM NaCl、2.7mM KCl，pH 7.0；3)20mM Tris-HCl，pH 7.8。
14.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括范围为6-8.5的pH。
15.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括至少-300mV的氧化还原电势。
16.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括至少0.05mM氧气的存在。
17.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括添加氧气。
18.依照权利要求17的体外方法，其中以机械方式实施添加氧气。
19.依照权利要求18的体外方法，其中通过搅动、搅拌、提高压力或产生流动实施机械添加氧气。
20.依照权利要求17-19中任一项的体外方法，其中通过用氧气或空气喷射或者提高压力实施添加氧气。
21.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括氧化剂。
22.依照权利要求21的体外方法，其中所述氧化剂是脱氢抗坏血酸(dhAA)。
23.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括分开所述全长双特异性抗体和所述还原剂。
24.依照权利要求23的体外方法，其中步骤b)包括使从步骤a)获得的组合物经受层析或过滤。
25.依照权利要求24的体外方法，其中所述层析是柱层析。
26.依照权利要求24的体外方法，其中所述过滤是渗滤。
27.依照权利要求26的方法，其中所述渗滤是切向流过滤(TFF)或正常流过滤(NFF)。
28.依照权利要求27的体外方法，其中所述渗滤是TFF。
29.依照权利要求27的体外方法，其中通过使所述组合物循环通过中空纤维筒实施所述渗滤，直到发生了1至7个体积的缓冲液更换，所述中空纤维筒包含范围为10-50kDa的截留值，且具有范围为0.05-1m2的表面积，且具有范围为70-280kPa的筒入口压力。
30.依照权利要求23-29中任一项的体外方法，其中分开所述全长双特异性抗体和所述还原剂包括用不含所述还原剂的缓冲液或溶液更换从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液。
31.依照权利要求30的体外方法，其包括范围为3-12个体积的缓冲液或溶液更换。
32.依照权利要求24-30中任一项的体外方法，其中分开所述全长双特异性抗体和所述还原剂是连续过程。
33.依照权利要求24-30中任一项的体外方法，其中分开所述全长双特异性抗体和所述还原剂是分批过程。
34.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括下列步骤：
I)从步骤a)获得的组合物的渗滤，
II)从步骤I)获得的渗余物的温育，
III)从步骤II)获得的组合物的渗滤。
35.依照权利要求34的体外方法，其中步骤I)和/或III)中所述的渗滤包括范围为3-12个体积的缓冲液更换。
36.依照权利要求34-35中任一项的体外方法，其中步骤II)包括于范围为15-35℃的温度温育12-48小时的时段。
37.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中从步骤a)获得的所述组合物中的全长双特异性抗体浓度范围为1-100g/L。
38.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括添加金属离子。
39.依照权利要求38的体外方法，其中所述金属离子的浓度范围为0.1至100μM。
40.依照权利要求38-39中任一项的体外方法，其中所述金属离子选自下组：铜、锰、镁、铁、镍和钴。
41.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中第一与第二全长抗体的比率范围为1:1.01至1:2。
42.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一或第二全长抗体不能结合蛋白A和/或蛋白G。
43.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二全长抗体包含不同轻链。
44.依照权利要求43的体外方法，其中步骤c)包括通过将所述全长双特异性抗体在仅与轻链之一结合的材料上通过而将其与残留的第一和/或第二全长抗体分开。
45.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二全长抗体的Fc区是不同同种异型的。
46.依照权利要求43的体外方法，其中步骤c)包括通过将所述全长双特异性抗体在仅与所述同种异型之一结合的材料上通过而将其与残留的第一和/或第二全长抗体分开。
47.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括使从步骤b)获得的组合物经受纯化方法。
48.依照权利要求47的体外方法，其中所述纯化方法选自下组：蛋白A或蛋白G层析、基于抗原结合的亲和层析、基于抗独特型抗体的亲和层析、离子交换、疏水性相互作用层析、混合式层析、固定化金属亲和层析和亲硫性吸附层析。
49.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括使至少30mL从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述全长双特异性抗体中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
50.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的第一和第二全长抗体的终浓度是至少0.25mg/mL。
51.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和/或第二全长抗体不含c端赖氨酸。
52.依照权利要求51的体外方法，其中所述第一和/或第二全长抗体在遗传上修饰为在重链中缺乏c端赖氨酸。
53.依照权利要求51的体外方法，其中所述方法包括从所述重链除去c端赖氨酸的步骤。
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