KR20110047255A

KR20110047255A - 이중특이적 항-ｅｇｆｒ／항-ｉｇｆ-１ｒ 항체

Info

Publication number: KR20110047255A
Application number: KR1020117006890A
Authority: KR
Inventors: 울리히 브린크만; 레베카 크로스데일; 빌마 라우; 크리스티안 게르데스; 아이케 호프만; 크리슈티안 클라인; 클라우스-페터 퀸켈레; 볼프강 셰퍼; 얀 올라프 슈트라케; 파블로 우마나
Original assignee: 로슈 글리카트 아게
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-21
Publication date: 2011-05-06
Also published as: MA32713B1; JP2012503612A; CN102643345A; AR073664A1; IL211675A0; ECSP11010913A; PE20110926A1; US20100081796A1; CO6362023A2; MX2011003133A; AU2009296297A1; CN102164960A; TW201019960A; WO2010034441A1; CA2736408A1; BRPI0919382A2; US20120149879A1; RU2011116112A; EP2342231A1

Abstract

EGFR 및 IGF-1R 에 대한 이중특이적 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그의 용도.

Description

이중특이적 항-ＥＧＦＲ／항-ＩＧＦ-１Ｒ 항체{BISPECIFIC ANTI-EGFR/ANTI-IGF-1R ANTIBODIES}

본 발명은 EGFR 및 IGF-1R 에 대한 이중특이적 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

EGFR 및 항- EGFR 항체

인간 상피 성장 인자 수용체 (HER-1 또는 Erb-B1 로도 공지됨, 본원에서는 "EGFR" 로 언급) 는 c-erbB 프로토-옹코진 (proto-oncogene) 에 의해 인코딩되는 170 kDa 트랜스멤브레인 수용체이고, 내재적 타이로신 키나아제 활성을 나타낸다 (Modjtahedi, H., 등, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611). SwissProt 데이터베이스 엔트리 P00533 는 EGFR 의 서열을 제공한다. 이에 제한되지 않으나, Swissprot 데이터베이스 엔트리 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3 및 P00533-4 으로 식별되는 것을 포함하는 EGFR 의 이소형 및 변이체 (예를 들어, 대안적 RNA 전사물, 절단된 버젼, 다형질상체 등) 도 있다. EGFR 은 상피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자-α (TGf-α), 앰피레굴린 (amphiregulin), 헤파린-결합 EGF (hb-EGF), 베타셀룰린 및 에피레굴린을 포함하는 리간드에 결합하는 것으로 공지되어 있다 (Herbst, R.S., 및 Shin, D. M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J., and Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565). EGFR 은 이에 제한되지 않으나, 세포 증식, 분화, 세포 생존, 아폽토시스, 혈관형성, 유사분열 및 전이를 제어하는 신호 전달 경로의 활성화를 토함하는 타이로신-키나아제 매개 신호 전달 경로를 통해 수많은 세포 프로세스를 조절한다 (Atalay, G., 등, Br. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S., 및 Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., 등, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235).

EGFR 의 과발현은, 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장, 전립선 및 신장의 암을 포함하는 다수의 인간 악성 상태에서 보고된 바 있다 (Atalay, G., 등, Br. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611 ; Modjtahedi, H., 등, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235). 이들 상태 다수에서, EGFR 의 과발현은 환자의 열악한 예후와 상관성이 있거나 연합되어 있었다 (Herbst R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611 ; Modjtahedi, H., 등, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235). EGFR 은 또한, 악성 세포에서보다 낮은 수준이기는 하지만, 정상 조직의 세포, 특히 피부, 간 및 위장관의 상피 세포에서 발현된다 (Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611).

컨쥬게이션되지 않은 모노클로날 항체 (mAbs) 는, 진행된 유방암 치료를 위한 Trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc,) (Grillo-Lopez, AJ., 등, Semin. Oncol. 26 (1999) 66-73; Goldenberg, M.M., Clin. Ther. 21 (1999) 309-18), CD20 양성 B-세포, 낮은 등급 또는 여포 비호지킨 (Non-Hodgkin's) 림프종 치료를 위한 Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, 및 Genentech Inc., San Francisco, CA), 재발한 급성 골수성 백혈병 치료를 위한 Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst), 및 B-세포 만성 림프성 백혈병 치료를 위한 Alemtuzumab (CAMP ATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) 의 미국 식약청의 승인으로 증명된 바와 같이, 암 치료를 위한 유용한 의약일 수 있다. 상기 제품들의 성공은 그들의 효능 뿐만 아니라, 그의 탁월한 안전성 프로파일에 의한 것이다 (Grillo-Lopez, A.J., 등, Semin. Oncol. 26 (1999) 66-73; Goidenberg, M.M., Clin. Ther. 21 (1999) 309-18). 상기 약물의 성과에도 불구하고, 컨쥬게이션되지 않은 mAb 치료요법으로 일반적으로 제공되는 것보다 더 높은 특이적 항체 활성을 수득하는 것에 현재 큰 관심이 몰려 있다.

수많은 연구 결과들은 Fc-수용체-의존적 메커니즘이 종양에 대한 세포독성 항체의 작용에 실질적으로 기여한다는 점을 시사하고, 종양에 대한 최적의 항체는 활성화 Fc 수용체에 우선적으로 결합하며, 억제 파트너 FcγRIIB 에는 최소한으로만 결합한다는 것을 나타낸다. (Clynes, R.A., 등, Nature Medicine 6(4) (2000) 443-446; Kalergis, A.M., 및 Ravetch, J.V., J. Exp. Med. 195(12) (2002) 1653-1659. 예를 들어, 하나 이상의 연구 결과가 FcγRIIIa 수용체의 다형질상성이 특히 항체 치료요법의 효능과 강력하게 연관되어 있음을 시사한다 (Cartron, G., 등, Blood 99 (3) (2002) 754-758). 그러한 연구는 FcγRIIIa 에 대해 동형접합성인 환자는 이형접합성인 환자보다 Rituximab 에 대해 더 나은 응답성을 갖는다는 점을 보여준다. 저자들은 월등한 응답성은 생체내 FcγRIIIa 에 대한 항체의 더 나은 결합으로 인한 것이며, 이는 림프종 세포에 대한 더 나은 ADCC 활성을 결과로서 제공한다는 결론을 내렸다 (Cartron, G., 등, Blood 99(3) (2002) 754-758).

EGFR 를 표적으로 하고, EGFR 신호전달 경로를 차단하는 다양한 전략들이 보고된 바 있다. 게피티닙 (gefitinib), 엘로티닙 (erlotinib) 및 CI-1033 과 같은 소분자 타이로신 키나아제 억제제는 세포내 타이로신 키나아제 영역에서의 EGFR 의 자가인산화를 차단함으로써, 하류방향 신호전달 사건들을 억제한다 (Tsao, A.S., 및 Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9). 한편, 모노클로날 항체는 EGFR 의 세포외 부분을 표적으로 하여, 리간드 결합 차단을 초래하며, 이로써 세포 증식과 같은 하류방향 사건을 억제한다 (Tsao, A.S., 및 Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9).

시험관내에서 그러한 차단을 달성하고 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장에 영향을 미치는 그의 능력을 평가한 몇가지 쥐과동물 모노클로날 항체가 제조된 바 있다 (Masui, H., 등, Cancer Res. 46 (1986) 5592-5598; Masui, H., 등, Cancer Res. 44 (1984) 1002-1007; Goldstein, N., 등, Clin. Cancer Res. 1 (1995) 1311-1318). 예를 들어, EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals) 는 인간 표피 암종 세포주 A431 에 대해 만들어내고, 후두 또는 하인두의 진행된 편평상피암종이 있는 환자의 임상 연구에서 시험한 쥐과동물 항-EGFR 모노클로날 항체이다 (Bier, H., 등, Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252 (1995) 433-9). 추가로, 래트 모노클로날 항체 ICRl 6, ICR62 및 ICR80 는, EGFR 의 세포외 도메인에 결합하는데, EGF 및 TGF-α 수용체의 결합을 억제함에 있어 유효한 것을 나타났다. (Modjtahedi, H., 등, Int. J. Cancer 75 (1998) 310-316). 쥐과동물 모노클로날 항체 425 는 인간 A431 암종 세포주에 대해 만들어낸 또다른 MAb 인데, 인간 상피 성장 인자 수용체의 외부 도메인 상의 폴리펩티드 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다. (Murthy, U., 등, Arch. BioChem. Biophys. 252(2) (1987) 549-560. 치료 처리에서의 쥐과동물 항체의 이용에 있어서의 잠재적인 문제점은 비-인간 모노클로날 항체가 인간 숙주에 의해 외래 단백질로서 인식될 수 있어; 상기 외래 항체의 반복적인 주입은 해로운 과민감성 반응을 유도하는 면역 응답성의 유도를 이끌어낼 수 있다는 점이다. 쥐과동물-기재 모노클로날 항체에 대해, 이를 종종 인간 항-마우스 항체 응답성 또는 "HAMA" 응답성, 또는 인간 항-래트 항체 또는 "HARA" 응답성으로 지칭한다. 추가로, 이러한 "외래" 항체들은 그들의 표적 부위에 도달하기 전에 실제적으로 중화되도록 숙주의 면역 시스템에 의해 공격당할 수 있다. 더욱이, 비-인간 모노클로날 항체 (예를 들어, 쥐과동물 모노클로날 항체) 는 일반적으로 인간 효과기 기능성이 결핍되어 있는데, 즉 이들은 특히 보체 의존성 용균작용을 매개하는 것 또는 항체 의존성 세포 독성 또는 Fc-수용체 매개성 식세포작용을 통해 인간 표적 세포를 용해시키는 것을 할 수 없다.

2 개 이상의 상이한 종 (예를 들어, 마우스 및 인간) 으로부터의 항체의 부분들을 포함하는 키메라성 항체는 "콘쥬게이션된" 항체에 대한 대안으로 개발된 바 있다. 예를 들어, US 5,891,996 (Mateo de Acosta del Rio, CM., 등) 는 EGFR 에 대한 마우스/인간 키메라 항체, R3 를 논의하고, US 5,558,864 는 쥐과동물 항-EGFR MAb 425 의 키메라성 또는 인간화된 형태의 생성을 논의한다. 또한, IMC-C225 (Erbitux®; ImClone) 는 각종 인간 이종이식 모델에서 항종양 효능을 증명하는 것으로 보고된 키메라성 마우스/인간 항-EGFR 모노클로날 항체 (마우스 M225 모노클로날 항체를 근간으로 함, 인간 임상 시도에서 HAMA 응답성을 결과로서 제공함) 이다 (Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611). IMC-C225 의 효능은 EGFR 신호전달 경로에 의해 조절되고, 증가된 항체-의존적 세포 독성 (ADCC) 활성에 의해서도 조절될 가능성이 있는 세포 사건의 억제를 포함하는, 몇가지 메커니즘에 기인한다 (Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611). IMC-C225 는 또한 방사요법 및 화학요법과의 병용을 포함하는, 임상 시도에 시용되었다 (Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611). 최근, Abgenix, InC. (Fremont, CA) 는 암 치료법을 위해 ABX-EGF 를 개발했다. ABX-EGF 는 완전히 인간 항-EGFR 모노클로날 항체이다. (Yang, X.D., 등, Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38 (2001) 17-23).

WO 2006/082515 는 암 치료법을 위해 래트 모노클로날 항체 ICR62 로부터 유도된 인간화된 항-EGFR 모노클로날 항체 및 그의 당조작된 형태를 언급한다.

IGF -1R 및 항- IGF -1R 항체

인슐린형 성장 인자 I 수용체 (IGF-1R, IGF-1R, CD 221 항원) 는 트랜스멤브레인 단백질 타이로신 키나아제의 패밀리에 속한다 (LeRoith, D., 등, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; 및 Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093). IGF-1R 는 높은 친화성으로 IGF-I 에 결합하고, 생체내에서의 상기 리간드에 대한 생리학적 응답성을 개시한다. IGF-1R 은 또한 IGF-II 에도 결합하나, 약간 더 낮은 친화성으로 결합한다. IGF-1R 과발현은 세포의 신생물 형질변환을 촉진하고, IGF-1R 이 세포의 악성 형질변환에 수반된다는 증거가 있어, 암 치료를 위한 치료제 개발을 위해 유용한 표적이다 (Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093).

IGF-1R 에 대한 항체는 당업계에 널리 공지되어 있고, 시험관내 및 생체내 그의 항종양 효과에 대해 연구되었다 (Benini, S., 등, Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., 등, Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., 등, Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A., 등, BioChem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218; Prigent, S. A., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. ImmunoTher. 49 (2000) 243-252; Pessino, A., 등, BioChem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K.H., 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos, M.A., 등, J. Biol. Chem. 267 (1992) 12955-12963; Soos, M.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221; O'Brien, R.M., 등, EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R., 등, BioChem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A., 등, BioChem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S. L., 등, BioChem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P., 등, J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659- 1673; KuIl, F.C., Jr., 등, J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D.O., 및 Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J.R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E.M., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., 및 Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A., 등, FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A., 등, J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q.T., 등, BioChem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281; 및 Kalebic, T., 등, Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093; Dricu, A., 등, Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn, L., 등, Melanoma Res. 8 (1998) 389-397; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. ImmunoTher. 49 (2000) 243-252). IGF-1R 에 대한 항체는 또한 수많은 추가 발행물들, 예를 들어, [Arteaga, C. L., 등, Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106; 및 Hailey, J., 등, Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353] 에 기재되어 있다.

특히, αIR3 로 지칭되는, IGF-1R 에 대한 모노클로날 항체는 IGF-1R 매개성 프로세스 및 IGF-I 매개성 질환, 예컨대 암 연구의 조사에서 널리 이용된다. 알파-IR-3 는 [KuIl, F. C, J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566] 에 기재된 바 있다. 그 동안에, 단독으로 또는 독소루비신 및 빈크리스틴과 같은 세포증식 억제제와 함께 αIR3 의 그의 항종양 효과와 관련된 연구 및 치료 용도를 다룬 약 백여개의 출판물이 출판되었다. αIR3 은 IGF 수용체에 결합하는 IGF-I 는 억제하나, IGF-1R 에 결합하는 IGF-II 는 억제하지 않는 것으로 공지된 쥐과동물 모노클로날 항체이다. αIR3 는 높은 농도에서는 종양 세포 증식 및 IGF-1R 인산화를 자극한다 (Bergmann, U., 등, Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H., 등, J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661). IGF-I 결합보다 더욱 강력하게 IGF-1R 에 결합하는 IGF-II 를 억제하는 여타 항체도 존재한다 (예를 들어, 1H7, Li, S., L., 등, Cancer Immunol. ImmunoTher. 49 (2000) 243-252). 항체 및 그의 특성 및 특징의 당업계에서의 개요는 [Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093] 에 기재되어 있다.

당업계에 기재된 대부분의 항체들은 마우스 기원의 것이다. 상기 항체들은, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 키메라화 또는 인간화와 같은 추가 변경없이는 인간 환자의 치료요법용으로는 유용하지 않다. 이러한 단점을 근거로, 인간 항체는 인간 환자의 치료에서 치료제로서 분명히 바람직하다. 인간 항체는 당업계에서 널리 공지되어 있다 (van Dijk, M. A., 및 van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). 그러한 기법을 근거로, 매우 다양한 표적에 대한 인간 항체가 제조될 수 있다. IGF-1R 에 대한 인간 항체의 예시는 WO 02/053596 에 기재되어 있다.

WO 2005/005635 는 인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 또는 <IGF-1R> HUMAB Clone 22 (DSM ACC 2594) 및 암 치료요법에서의 그의 용도를 언급한다.

이중특이적 항체

다양한 재조합 이중특이적 항체 형태, 예를 들어 IgG 항체 형태 및 단일 사슬 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 지난 최근 개발되었다 (예를 들어 Coloma, M.J., 등, Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; WO　2001077342; 및 Morrison, S., L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234 참조).

또한, 항체 코어 구조 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 가 더 이상 유지되지 않는 여러 기타 새로운 형태, 예컨대 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 디아-, 트리아- 또는 테트라바디, 미니바디, 여러 단일 사슬 형태 (scFv, Bis-scFv)가 개발되어 왔다 (Holliger, P., 등, Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., 등, Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., 등, Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297).

모든 이러한 형태는 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 추가의 결합 단백질 (예를 들어, scFv)에 융합시키거나, 예를 들어, 2개의 Fab 절편 또는 scFv에 융합시키기 위한 링커를 사용한다 (Fischer N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). 자연 발생적 항체에 대해 고도의 유사성을 유지함으로써, Fc 부분을 통해 매개되는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 작용을 유지하기를 원할 수 있다는 점을 유념해야 한다.

WO 2007/024715 에는 조작된 다가 다중특이적 결합 단백질로서의 이중 가변 도메인 면역글로불린이 보고되어 있다. 생물학적으로 활성인 항체 이량체의 제조 프로세스는 US 6,897,044 에 보고되어 있다. 펩티드 링커를 통해 각각 연결되어 있는 4 개 이상의 가변 도면인이 있는 다가 Fv 항체 구축물은 US 7,129,330 에 보고되어 있다. 이량체성 및 다량체성 항원 결합 구축물은 US 2005/0079170 에 보고되어 있다. 서로 연결 구조에 의해 공유적으로 결합되어 있는 3 또는 4 개의 Fab 절편을 포함하는 3 가- 또는 4 가 단일특이적 항원-결합 단백질은, 천연 면역글로빈이 아닌데, US 6,511,663 에 보고되어 있다. WO 2006/020258 에는 원핵 및 진핵 세포에서 효율적으로 발현될 수 있고, 치료 및 진단 방법에 유용한 4 가 이중특이적 항체가 보고되어 있다. 2 가지 유형의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 혼합물로부터 1 개 이상의 사슬간 디설파이드 연결을 통해 연결되어 있는 않은 이량체로부터 하나 이상의 사슬간 디설파이드 연결을 통해 연결된 이량체를 분리하거나 또는 바람직하게는 합성하는 방법이 US 2005/0163782 에 보고되어 있다. 이중특이적 4 가 수용체는 US 5,959,083 에 보고되어 있다. 3 개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체가 WO 2001/077342 에 보고되어 있다.

다중특이적 다가 항원-결합 폴리펩티드가 WO 1997/001580 에 보고되어 있다. WO 1992/004053 은, 동일한 항원 결정자에 결합하는 IgG 의 모노클로날 항체로부터 제조되는 단독콘쥬게이트가 합성 가교로 공유결합되어 있음을 보고한다. 항원에 대한 높은 친화성을 가진 올리고머성 모노클로날 항체는 WO 1991/06305 에 보고되어 있는데, 일반적으로 IgG 클래스의 것인, 2 개 이상의 면역글로불린 단량체가 함께 회합되어 있는 올리고머가 분비되어 4 가 또는 6 가 IgG 분자를 형성한다. 인터페론 감마 활성이 병원성인 질환 치료에 이용될 수 있는, 양에서 유도된 항체 및 조작된 항체 구축물이 US 6,350,860 에 보고되어 있다. US 2005/0100543 에는, 이중특이적 항체의 다가 담체인 표적화가능한 구축물, 즉 각각의 표적화가능한 구축물의 분자가 2 개 이상의 이중특이적 항체의 담체로서 제공될 수 있는 것이 보고되어 있다. 유전자적으로 조작된 이중특이적 4 가 항체는 WO 1995/009917 에 보고되어 있다. WO 2007/109254 에서는 안정화된 scFv 로 이루어지거나 또는 그것을 포함하는 안정화된 결합 분자가 보고되어 있다.

EGFR 및 IGF-1R 에 대한 이중특이적 항체는 Lu, D., 등, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 및 J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72 로부터 공지되어 있다. 그러나, 이들 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체는 부모 단일특이적 항체의 조합에 비해 명백하게 감소된 종양 성장 억제를 나타낸다 (특히, EGFR 및 IGF-1R 두가지의 동등한 (높은) 발현 수준이 있는 종양 세포에서).

발명의 개요

본 발명자들은 놀랍게도, 부모 단일특이적 항체의 조합에 비해 (오직 감소된 양의 이중특이적 항체을 이용) (특히 GFR 및 IGF-1R 두가지의 동등한(높은) 발현 수준이 있는 종양 세포에서) 적어도 유사한 종양 성장 억제를 나타내는 신규한 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체를 발견했다.

본 발명의 첫번째 국면은, EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위를 포함하는, EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체로서,

i) 상기 항원-결합 부위들 각각이 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 한 쌍이고;

ii) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 1 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 2 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 3 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 4 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 5 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 6 의 CDR1 영역을 포함하고;

iii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 11 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 12 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 13 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 14 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 15 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 16 의 CDR1 영역을 포함하거나;

또는 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 17 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 18 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 19 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 20 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 21 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 22 의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.

본 발명의 한 구현예에서, 이중특이적 항체는,

i) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 7 또는 서열 식별 번호: 8 를 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 9 또는 서열 식별 번호: 10 을 포함하고,

ii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 23 또는 서열 식별 번호: 24 를 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 25 또는 서열 식별 번호: 26 을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 한 구현예에서, 이중특이적 항체는,

i) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 8 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 10 을 포함하고,

ii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 23 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 25 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 이중특이적 항체는 2 가 이상이고, 3 가, 4 가 또는 다가일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2 가, 3 가 또는 4 가이다.

본 발명의 추가 국면은 상기 이중특이적 항체의 사슬을 인코딩하는 핵산 분자이다.

본 발명의 또다른 국면은, 상기 이중특이적 항체를 함유하는 약제학적 조성물, 암 치료를 위한 상기 조성물, 암 치료용 의약 제조를 위한 상기 이중특이적 항체의 용도, 상기 이중특이적 항체의 암 치료가 필요한 환자에 대한 투여에 의한 암을 앓는 환자의 치료 방법이다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체는 EGFR 및 IGF-1R 표적화 치료요법이 필요한 환자에게 이득을 나타낸다. 본 발명에 따른 항체는 상기 질환, 특히 암을 앓는 환자에게 이득을 가져다주는 신규한 특성을 갖는다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 한 구현예는, EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위를 포함하는, EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체로서,

iii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 11 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 12 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 13 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 14 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 15 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 16 의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.

본 발명의 또다른 구현예는, EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위를 포함하는 EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체로서,

i) 상기 항원-결합 부위가 각각 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 한 쌍이고;

iii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 17 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 18 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 19 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 20 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 21 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 22 의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.

본 발명의 또다른 구현예는, EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위를 포함하는, EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체로서,

ii) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 7 또는 서열 식별 번호: 8 를 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 9 또는 서열 식별 번호: 10 을 포함하고,

iii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 23 또는 서열 식별 번호: 24 를 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 25 또는 서열 식별 번호: 26 을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.

ii) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 7 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 10 을 포함하고,

iii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 23 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 25 를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.

ii) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 8 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 10 을 포함하고,

iii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 24 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 26 를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.

본원에 사용된 바와 같이, "항체" 는 항원-결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "결합 부위" 또는 "항원-결합 부위" 는 리간드가 실제로 결합하는 항체 분자의 영역(들)을 지칭한다. 본 발명에 따른 항체 내 결합 부위는 각각 2 개 가변 도메인, 즉 1 개 중쇄 가변 도메인 및 1 개 경쇄 가변 도메인의 한 쌍으로 형성될 수 있다. 항체 내 최소 결합 부위 결정자는 중쇄 CDR3 영역이다. 본 발명의 한 구현예에서, 각각의 결합 부위는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하고, 바람직하게는 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 으로 이루어진 한 쌍으로 형성된다.

항체 특이성은 항원의 특별한 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다. 본 발명에 따른 "이중특이적 항체" 는 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 가진 항체이다. 항체가 1 개를 초과하는 특이성을 갖는 경우, 인식되는 에피토프는 단일 항원 또는 1 개를 초과하는 항원과 회합될 수 있다. 본 발명의 항체는 2 개의 상이한 항원, 즉 제 1 항원으로서의 EGFR 및 제 2 항원으로서의 IGF-1R 에 특이적이다.

본원에 사용된 용어 "단일특이적" 항체는, 각각 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 가진 항체를 지칭한다.

본 출원에서 사용된 용어 "가 (valent)" 는 항체 분자 내 특정화된 갯수의 결합 부위의 존재성을 지칭한다. 이와 같이, 용어 "2 가", "4 가", 및 "6 가" 는 각각 항체 분자 내 2 개 결합 부위, 4 개 결합 부위 및 6 개 결합 부위가 존재함을 지칭한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 "2 가" 이상이고, "3 가" 또는 "다가" (예를 들어 ("4 가" 또는 "6 가") 일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2 가, 3 가 또는 4 가이다. 한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 2 가이다. 한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 3 가이다. 한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 4 가이다.

본 발명의 항체는 2 개 이상의 결합 부위를 갖고, 이중특이적이다. 즉, 상기 항체는 2 개 이상의 결합 부위가 있는 경우 (즉, 항체가 3 가 또는 다가인 경우) 라도 이중특이적일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체에는, 예를 들어 다가 단일쇄 항체, 디아바디 (diabodies) 및 트리아바디 (triabodies) 뿐만 아니라, 추가 항원-결합 부위 (예를 들어, 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, 또는 (Fab)2) 가 1 개 이상의 펩티드-링커를 통해 연결되어 있는 전장 항체의 불변 도메인 구조를 가진 항체가 포함된다. 항체는 단일 종 유래의 전장일 수 있거나 또는 키메라화되거나 또는 인간화된 것일 수 있다. 2 개 초과의 항원 결합 부위를 가진 항체로서, 일부 결합 부위는 해당 단백질이 2 개의 상이한 항원에 대해 결합 부위를 갖는 한, 동일할 수 있다. 즉, 제 1 결합 부위가 EGFR 에 특이적일 때, 제 2 결합 부위는 IGF-1R 에 특이적이다.

천연 항체와 마찬가지로, 본 발명의 항체의 항원 결합 부위는 일반적으로 항원에 대한 결합 부위의 친화성에 대한 다양한 정도를 부여하는 6 개의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 포함한다. 3 개의 중쇄 가변 도메인 CDR (CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3 개의 경쇄 가변 도메인 CDR (CDRL1, CDRL2 및 CDRL3) 이 있다. CDR 및 프레임워크 영역 (FR) 의 범위는, 서열들 사이에서의 가변성에 따라 정의된 아미노산 서열의 편집된 데이터베이스와의 비교에 의해 결정된다. 본 발명의 범위에는 또한 더 적은 CDR (즉, 결합 특이성이 3, 4 또는 5 개의 CDR 에 의해 결정되는 것) 을 포함하여 이루어지는 기능적 항원 결합 부위의 것도 포함된다. 예를 들어, 6 개 미만의 CDR 로 이루어진 온전한 셋트가 결합에 충분할 수 있다. 일부 경우, VH 또는 VL 도메인으로 충분할 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 추가로 하나 이상의 면역글로불린 클래스의 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 면역글로불린 클래스는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 이소타입을 포함하며, IgG 및 IgA 의 경우 그의 서브타입도 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG 타입 항체의 불변 도메인 구조를 갖지만, 4 개의 항원 결합 부위를 갖는다. 이는, EGFR 에 특이적으로 결합하는 2 개의 완전 항원 결합 부위 (예를 들어, 단일쇄 Fv) 를 IGF-1R 에 특이적으로 결합하는 전체 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단에 연결함으로써 달성된다. 4 개의 항원-결합 부위는 바람직하게는 2 개의 상이한 결합 특이성의 각각 2 개의 결합 부위를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제조물을 나타낸다.

용어 "키메라 항체"는 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는, 하나의 원천 또는 종으로부터의 가변 부위, 즉 결합 부위, 및 상이한 원천 또는 종 유래의 불변 부위의 적어도 일부를 포함하는 항체를 나타낸다. 쥐과 가변 부위 및 인간 불변 부위를 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체"의 기타 바람직한 형태는 불변 부위가 본래 항체의 불변 부위로부터 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 형태들이다. 이러한 키메라 항체는 또한 "클래스-전환 항체"로서 언급된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 부위를 인코딩하는 DNA 조각 및 면역글로불린 불변 부위를 인코딩하는 DNA 조각을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체의 생성 방법에는 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술이 포함되고, 이는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [Morrison, S.L., 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; US 5,202,238 호 및 US 5,204,244 호를 참조한다.

용어 "인간화 항체"는 골격 또는 "상보성 결정 부위" (CDR) 가 부모 면역글로불린의 것과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 개질된 항체를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 쥐과 CDR을 인간 항체의 골격 부위 내에 그래프트시켜 "인간화 항체"를 생성시킨다. 예를 들어, [Riechmann, L., 등., Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., 등., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조한다. 특히 바람직한 CDR은 키메라 항체에 대해 상기 주목된 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것에 상응한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체"의 기타 형태는 불변 부위가 본래 항체의 불변 부위로부터 추가적으로 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 형태들이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 항체"는, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 부위를 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 당업계에 널리 공지되어 있다 (van Dijk, M.A., 및 van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한 면역화 시, 내생 면역글로불린 생성 부재시에도 인간 항체의 전체 목록 또는 선정물을 생성할 수 있는 유전자 도입 동물 (예를 들어 마우스)에서 생성될 수 있다. 이러한 생식선 돌연변이체 마우스에서의 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 접종시 인간 항체의 생성을 야기할 것이다 (예를 들어 Jakobovits, A., 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., 등., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., 등., Year Immunol. 7 (1993) 33-40 참조). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성될 수 있다 (Hoogenboom, H.R., 및 Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., 등., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). [Cole 등, 및 Boerner 등.] 의 기술은 또한 인간 단클론 항체의 생성에 이용가능하다 (Cole, S.P.C., 등, 모노클로날 항체 and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., New York (1986), pp.77-96; 및 Boerner, P., 등, J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메라 및 인간화 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 항체"는 또한 불변 부위에 개질이 일어나, 예를 들어 "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이 (예를 들어 IgG1에서 IgG4 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이로)에 의해, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 그러한 항체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 생성되고, 발현되고, 제작되거나 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터, 또는 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대해 유전자 도입된 동물 (예를 들어 마우스) 로부터 단리된 항체가 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 및 불변 부위를 재배열된 형태로 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내 체세포 과돌연변이 (hypermutation) 된다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 서열인 반면, 생체 내 인간 항체 생식선 목록 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 도메인" (경쇄 (VL)의 가변 도메인, 중쇄 (VH)의 가변 부위)은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반적 구조를 가지며, 각각의 도메인은 3개의 "과가변 부위" (또는 상보성 결정 부위, CDR)에 의해 연결된, 그 서열이 광범위하게 보존되는 4개의 골격 (FR) 부위를 포함한다. 골격 부위는 β-시트 형태를 취하며, CDR은 β-시트 구조와 연결되는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 내의 CDR은 골격 부위에 의해 그들의 3차원 구조를 유지하며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항원 결합 위치를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 부위는 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 추가적인 목적을 제공한다.

본원에서 사용되는 경우 용어 "과가변 부위" 또는 "항체의 항원-결합 부분"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변 부위는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 부위는 본원에 정의된 바와 같은 과가변 부위 잔기 이외의 가변 도메인 부위이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 에서 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. 각각의 사슬 상의 CDR은 이러한 프레임워크 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하는 부위이다. CDR 및 FR 부위는 [Kabat 등., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의에 따라 결정된다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체는 추가로, "보존적 서열 개질" 을 가진 항체 (이는 이중특이적 항체의 "변이체" 를 의미함) 를 포함한다. 이는 본 발명에 따른 항체의 상기 언급한 특징에 영향을 주거나 변경을 주지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 개질을 의미한다. 개질은 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개성 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기법으로 도입될 수 있다. 보존성 아미노산 치환에는, 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환한 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지쇄를 가진 아미노산 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 을 포함한다. 따라서 이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체 내 예측된 불필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 따라서, 본원에서 "변이체" 이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체는, "부모" 이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체 아미노산 서열로부터, 10 개 이하, 바람직하게는 약 2 내지 약 5 개 상이한 아미노산 서열이, 부모 항체의 하나 이상의 가변 영역 또는 불변 영역에서 부가, 결실 및/또는 치환된 분자를 지칭한다. 아미노산 치환은 Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327 및 Queen, C, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033 에 의해 기재된 분자 모델링을 근간으로 하여 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다.

서열에 대한 동일성 또는 상동성은 본원에서, 필요한 경우 최대 백분율 서열 일치를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭 (gap) 을 삽입한 후, 부모 서열과 일치하는 후보자 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 항체 서열로의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결실 또는 삽입 중 그 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로 간주되지 않는다. 변이체는 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R 에 결합하는 능력을 보유한다.

본원에 사용된 용어 "결합" 또는 "특이적으로 결합" 은 시험관내 검정에서, 바람직하게는 야생형 항원을 발현하는 CHO 세포를 이용한 세포-기재 ELISA 에서 항체의 항원의 에피토프에 대한 결합을 지칭한다. 결합은 10^-8 M 이하, 바람직하게는 10^-13 M 내지 10^-9 M 의 결합 친화성 (K_D) 를 의미한다. 항원 또는 FcγRIII 에 대한 항체의 결합은 BIAcore 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 으로 조사할 수 있다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터 항체의 회합에 대한 속도 상수), k_D (해리 상수), 및 K_D (ko/ka) 에 의해 정의된다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정자를 포함한다. 특정 구현예에서는, 에피토프 결정자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 분류를 포함하며, 특정 구현예에서는 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 부위이다. 특정 구현예에서는, 바람직하게는 단백질 및/또는 거대분자의 복합적 혼합물에서의 표적 항원을 인지하는 경우 상기 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다.

인간 상피 성장 인자 수용체 (HER-1 또는 Erb-B1 로도 공지됨, 본원에서는 "EGFR" 로 언급) 는 c-erbB 프로토-옹코진에 의해 인코딩되는 170 kDa 트랜스멤브레인 수용체이고, 내재적 타이로신 키나아제 활성을 나타낸다 (Modjtahedi, H., 등, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-161 1). SwissProt 데이터베이스 진입 P00533 는 EGFR 의 서열을 제공한다. 이에 제한되지 않으나, Swissprot 데이터베이스 진입 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3 및 P00533-4 로 식별되는 것을 포함하는 EGFR 의 이소형 및 변이체도 있다 (예를 들어, 대안적 RNA 전사물, 절단된 버젼, 다형질상체 등). EGFR 은 상피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자-α (TGfα), 앰피레굴린, 헤파린-결합 EGF (hb-EGF), 베타셀룰린 및 에피레굴린 을 포함하는 리간드에 결합하는 것으로 공지되어 있다 (Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J., 및 Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565). EGFR 은 이에 제한되지 않으나, 세포 증식, 분화, 세포 생존, 아폽토시스, 혈관형성, 유사분열 및 전이를 제어하는 신호전달 경로의 활성화를 포함하는, 타이로신-키나아제 매개성 신호전달 경로를 통해 수많은 세포 프로세스를 조절한다 (Atalay, G., 등, Br. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S., 및 Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S., 및 Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611 ; Modjtahedi, H., 등, Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235).

인슐린형 성장 인자 I 수용체 (IGF-1R, CD 221 항원) 는 트랜스멤브레인 단백질 타이로신 키나아제의 패밀리에 속한다 (LeRoith, D., 등, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; 및 Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). SwissProt 데이터베이스 진입 P08069 는 IGF-1R 의 서열을 제공한다. IGF-1R 는 높은 친화성으로 IGF-I 에 결합하며, 생체내에서 상기 리간드에 대한 생리학적 응답을 개시한다. IGF-1R 도 또한 IGF-II 에 결합하나, 약간 더 낮은 친화성을 갖는다. IGF-1R 과발현은 세포의 신생물형성 형질전환을 촉진하고, 세포의 악성 형질변환에 IGF-1R 이 수반된다는 증거가 있어, 암 치료용 치료제 개발에 유용한 표적이다 (Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063).

본 발명의 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 전장 부모 항체를 스캐폴드 ( scaffold) 로서 포함한다.

용어 "전장 항체" 는 2 개의 "전장 항체 중쇄" 및 2 개의 "전장 항체 경쇄" 로 이루어진 항체를 의미한다 (CH4 도메인이 없는 "전장 항체" 의 도식적인 구조에 대해서는 도 10 참고. 또한, 단일쇄 Fv 결합 (XGFR) 및 단일쇄 Fab 결합 (scFab-XGFR) 이 있는 4 가 이중특이적 포맷의 전장 부분에 대해서는 도 1 및 12 참고). "전장 항체 중쇄" 는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역 (HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2 (CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3 (CH3) 으로 이루어진, VH-CH1-HR-CH2-CH3 로 간략하게 표기하는 폴리펩티드이고; 선택적으로는 서브클래스 IgE 의 항체인 경우 항체 중쇄 불변 도메인 4 (CH4) 을 포함하여 이루어진다. 바람직하게는, "전장 항체 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단의 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3 로 이루어진 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄" 는 N-말단에서 C-말단의 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어진, VL-CL 로 간략하게 표기되는 폴리펩티드이다. 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 은 κ (카파) 또는 λ (람다) 일 수 있다. 2 개의 전장 항체 사슬은 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이에서, 그리고 전장 항체 중쇄들의 힌지 영역들 사이에서 폴리펩티드간 디설파이드 결합을 통해 함께 연결되어 있다. 전형적인 전장 항체의 예시는 천연 항체, 예컨대 IgG (예를 들어 IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD, 및 IgE 이다. 본 발명에 따른 전장 항체는 단일 종, 예를 들어 인간 유래의 것일 수 있거나, 또는 키메라화되거나 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 VH 및 VL 의 쌍으로 각각 형성된 2 개이 항원 결합 부위를 포함하며, 이는 전부 동일한 항원에 대해 특이적으로 결합한다. 따라서, 제 1 항원-결합 부위를 포함하며, 2 개의 항체 경쇄 및 2 개의 항체 중쇄로 이루어진 단일특이적 2 가 (= 전장) 항체는 전장 항체이다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단의 최후의 아미노산을 지칭한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 최후의 아미노산을 지칭한다.

한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는, 예를 들어 a) WO 2009/080251, WO 2009/080252 또는 WO 2009/080253 (도메인 교환된 항체- 실시예 14 참고) 에서, 또는 b) 1 개의 단일쇄 Fab 절편이 EGFR 에 특이적이고, 나머지가 IGF-1R 에 특이적인 scFab-Fc 융합 항체 (실시예 17 참고) 를 근거로, 또는 c) EP 출원 번호 07024867.9 (WO 2009/080251), Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; WO 96/027011; Merchant A.M, 등, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., 등, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35 및 EP 1870459A1 에서 기재된 포맷을 이용하여 2 가이다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열 식별 번호: 30, 서열 식별 번호: 31, 서열 식별 번호: 32 및 서열 식별 번호: 33 의 아미노산 서열 도는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열 식별 번호: 34, 서열 식별 번호: 35, 서열 식별 번호: 36 및 서열 식별 번호: 37 의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열 식별 번호: 38, 및 서열 식별 번호: 39 의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열 식별 번호: 38, 및 서열 식별 번호: 39 의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열 식별 번호: 40, 및 서열 식별 번호: 41 의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열 식별 번호: 42, 및 서열 식별 번호: 43 의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이들 아미노산 서열은 EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (인간화된 <EGFR>ICR62 로부터 유도됨), 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 23 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 25 의 경쇄 가변 도메인 (인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 로부터 유도됨) 을 근간으로 한다.

한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는, 예를 들어 2 개의 수용체 EGFR 또는 IGF-1R 중 하나에 특이적으로 결합하는 전장 항체를 근간으로 하며, 여기서 2 개의 수용체 EGFR 또는 IGF-1R 중 나머지 하나에 특이적으로 결합하는 1 개 중쇄의 1 개 C-말단에서만 scFab 절편이 융합되어 있고, 예를 들어 EP 출원 번호 09004909.9 에 기재된 바와 같은 놉-인투-홀 (knob-into-hole) 기법을 포함하는 포맷 또는 예를 들어 2 개의 수용체 EGFR 또는 IGF-1R 중 하나에 특이적으로 결합하는 전장 항체를 근간으로 하며, 여기서 2 개의 수용체 EGFR 또는 IGF-1R 중 나머지 하나에 특이적으로 결합하는 1 개 중쇄의 1 개 c-말단에서의 VH 또는 VH-CH1 절편 및 제 2 중쇄의 나머지 C-말단에서의 VL 또는 VL-CL 절편이 융합되어 있고, 예를 들어 EP 출원 09005108.7 에 기재되어 있는 놉-인투 홀 기법을 포함하는 포맷에서 3 가이다. 놉 인투 홀 기법 및 그의 변형에 대해서는, 또한 [Ridgway, J. B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; WO 96/027011, Merchant A.M, 등, Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell, S., 등, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35; 및 EP 1870459A1] 참고. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 3 가 항체는 서열 식별 번호: 44, 서열 식별 번호: 45, 및 서열 식별 번호: 46 의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 3 가 항체는 서열 식별 번호: 47, 서열 식별 번호: 48, 및 서열 식별 번호: 49 의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이들 아미노산 서열은 EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (인간화된 <EGFR>ICR62 로부터 유도됨) 및, IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 23 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 25 의 경쇄 가변 도메인 (인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 로부터 유도됨) 을 근간으로 한다.

한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 예를 들어 WO 2007/024715, 또는 WO 2007/109254 또는 EP 출원번호 09004909.9 (나머지 항원에 결합하는 2 개의 scFab 절편이 융합되어 있는, 제 1 항원에 결합하는 전장 항체) (예를 들어 실시예 1 또는 9 참고) 에 기재된 포맷을 이용하여 4 가이다.

한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기로 이루어진 4 가이다:

a) 상기 제 1 항원-결합 부위를 포함하고, 2 개의 항체 경쇄 및 2 개의 항체 중쇄로 이루어진 단일특이적 2 가 항체, 각 사슬이 오직 1 개의 가변 도메인만을 포함함,

b) 2 개의 펩티드-링커, 및

c) 상기 제 2 항원-결합 부위를 포함하는 2 개의 1 가 단일특이적 단일쇄 항체 (단일특이적 1 가 단일쇄 Fv), 각각은 경쇄 가변 도메인, 중쇄 가변 도메인, 및 상기 경쇄 가변 도메인 및 상기 중쇄 가변 도메인 사이의 단일쇄 링커로 이루어짐;

여기서, 상기 단일쇄 항체 (상기 단일쇄 Fv) 는 단일특이적 2 가 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 동일한 말단에 연결됨.

또다른 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기로 이루어진 4 가이다:

a) 상기 제 2 항원-결합 부위를 포함하며, 2 개의 항체 경쇄 및 2 개의 항체 중쇄로 이루어진 단일특이적 2 가 항체, 각 사슬이 오직 1 개의 가변 도메인을 포함함,

b) 2 개의 펩티드-링커, 및

c) 상기 제 1 항원-결합 부위를 포함하며, 각각 경쇄 가변 도메인, 중쇄 가변 도메인, 및 상기 경쇄 가변 도메인 및 상기 중쇄 가변 도메인 사이의 단일쇄 링커로 이루어진 2 개의 1 가 단일특이적 단일쇄 항체 (단일특이적 1 가 단일쇄 Fv);

여기서, 상기 단일쇄 항체 (상기 단일쇄 Fv) 는 단일특이적 2 가 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 동일한 말단에 연결되어 있음.

a) 상기 항원-결합 부위를 포함하고, 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체; 및

b) 상기 제 2 항원-결합 부위를 포함하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편,

여기서, b) 하의 상기 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서의 펩티드 커넥터를 통해 a) 하의 상기 전장 항체에 융함됨.

a) 상기 제 2 항원-결합 부위를 포함하고, 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체; 및

b) 상기 제 1 항원-결합 부위를 포함하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편,

여기서, 상기 b) 하의 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 a) 하의 상기 전장 항체에 융합되어 있음.

바람직하게는, b) 하의 상기 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드-커넥터를 통해 a) 하의 상기 전장 항체에 연결되어 있다.

한 구현예에서, 제 2 항원에 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편은 각각의 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 상기 전장 항체에 융합되어 있다.

한 구현예에서, 제 2 항원에 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 각 중쇄의 C-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 상기 전장 항체에 융합되어 있다.

한 구현예에서, 제 2 항원에 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 각 경쇄의 C-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 상기 전장 항체에 융합되어 있다.

추가 구현예에서, 하기 특징을 가진 상기 4 가 이중특이적 항체:

- 하기로 이루어지고:

a) 2 개의 전장 항체 중쇄 및 2 개의 전장 항체 경쇄로 이루어져, 각 사슬이 오직 2 개의 가변 도메인을 포함하는 단일특이적 2 가 부모 (전장) 항체,

b) 2 개의 펩티드-링커,

c) 각각 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 및 상기 항체 중쇄 가변 도메인 및 상기 항체 경쇄 가변 도메인 사이의 단일쇄 링커로 이루어진, 2 개의 단일특이적 1 가 단일쇄 항체 (단일특이적 1 가 단일쇄 Fv);

그리고, 바람직하게는 상기 단일쇄 항체 (상기 단일쇄 Fv) 는 단일특이적 2 가 항체 중쇄의 동일한 말단 (C- 밀 N-말단) 또는, 대안적으로는 단일특이적 2 가 항체 경쇄의 동일한 말단 (바람직하게는 C-말단) 에, 더욱 바람직하게는 단일특이적 2 가 항체 중쇄의 동일한 말단 (C- 및 N-말단) 에 연결되어 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "펩티드-링커" 는 바람직하게는 합성 기원인 아미노산 서열을 가진 펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따른 상기 펩티드-링커는 결국 상이한 항원-결합 부위 (예를 들어 단일쇄 Fv, 전장 항체, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, (Fab)₂, Fc part) 를 포함하는 상이한 항원-결합 부위 및.또는 항체 절편을 연결하여 함께 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 형성하는데 이용된다. 펩티드-링커는 표 1 에 열거한 하기의 하나 이상의 아미노산 서열 및 추가로 무작위로 선택되는 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 펩티드-링커는, 5 개 이상, 바람직하게는 10 개 이상, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 개의 아미노산의 길이를 가진 아미노산의 펩티드이다. 바람직하게는, b) 하의 상기 펩티드 링커는 10 개 이상의 아미노산 길이를 가진 아미노산 서열의 펩티드이다. 한 구현예에서, 상기 펩티드-링커는 (GxS)n 이고, 여기서 G = 글리신, S = 세린, (x = 3, 그리고 n= 3, 4, 5 또는 6) 이거나 또는 (x = 4, 그리고 n= 2, 3, 4 또는 5), 바람직하게는 x = 4, 그리고 n= 2 또는 3, 더욱 바람직하게는 x = 4, 그리고 n= 2 ((G₄S)₂) 이다. 상기 (GxS)n 펩티드-링커에 또한, 추가적인 G = 글리신, 예를 들어 GG, 또는 GGG 가 부가될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단일쇄-링커" 는 바람직하게는 합성 기원인 아미노산 서열의 펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따른 상기 단일쇄-링커는 VH 및 VL 도메인을 연결하여 단일쇄 Fv 를 형성하는데 이용된다. 바람직하게는, c) 하의 상기 단일쇄-링커는 15 개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 20 개 이상의 아미노산의 아미노산 서열의 펩티드이다. 한 구현예에서, 상기 단일쇄-링커는 (GxS)n 이며, 여기서 G = 글리신, S = 세린, (x = 3, 그리고 n= 4, 5 또는 6) 이거나 또는 (x = 4, 그리고 n= 3, 4 또는 5), 바람직하게는 x = 4, n= 4 또는 5, 더욱 바람직하게는 x = 4, n= 4 이다.

나아가, 상기 단일쇄 (단일쇄 Fv) 항체는 바람직하게는 디설파이드 안정화되어 있다. 단일쇄 항체의 상기 추가적인 디설파이드 안정화는 단일쇄 항체의 가변 도메인들 사이에 디설파이드 결합의 도입으로 달성되며, 예를 들어 [WO 94/029350, Rajagopal, V., 등, Prot. Engin. 10 (12) (1997) 1453-59; Kobayashi, H., 등, Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393; or Schmidt, M., 등, Oncogene 18 (1999) 1711-1721] 에 기재되어 있다.

디설파이드 안정화된 단일쇄 (단일쇄 Fv) 항체의 한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 내에 포함된 단일쇄 항체의 가변 도메인들 사이의 디설파이드 결합은 하기로부터 선택되는 각각의 단일쇄 항체에 대해 독립적이다:

i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 에서 경쇄 가변 도메인 위치 100 로,

ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 에서 경쇄 가변 도메인 위치 43 로, 또는

iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 에서 경쇄 가변 도메인 위치 100 로.

한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체에 포함된 단일쇄 항체의 가변 도메인들 사이의 디설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 44 및 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이에 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체에 포함된 단일쇄 항체의 가변 도메인들 사이의 디설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 105 및 경쇄 가변 도메인 위치 43 사이에 있다.

한 구현예에서, 단일쇄 항체 (단일쇄 Fv) 의 가변 도메인 VH 및 VL 사이에 상기 선택적인 디설파이드 안정화가 없는 상기 단일쇄 (단일쇄 Fv) 항체가 바람직하다.

추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 다음을 특징으로 한다:

- 2 개의 항원-결합 부위는 단일특이적 2 가 부모 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 2 개쌍에 의해 각각 형성되고, 두가지 모두 동일한 에피토프에 결합함,

- 추가적인 2 개의 항원-결합 부위가 1 개 단일쇄 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 의해 각각 형성됨,

- 단일쇄 항체가 펩티드-링커를 통해 1 개 중쇄 또는 1 개 경쇄에 각각 연결됨으로써, 각각의 항체 사슬 말단이 단일쇄 항체에만 연결됨.

추가 구현예에서, 상기 4 가 이중특이적 항체는, a) 하의 상기 단일특이적 2 가 (전장) 항체가 EGFR 에 결합하고, c) 하의 상기 2 개의 1 가 단일특이적 단일쇄 항체가 IGF-IR 에 결합하는 것을 특징으로 한다.

추가 구현예에서, 상기 4 가 이중특이적 항체는, a) 하의 상기 단일특이적 2 가 (전장) 항체가 IGF-1R 에 결합하고, c) 하의 상기 2 개 1 가 단일특이적 단일쇄 항체가 EGFR 에 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체의 상기 첫번째 4 가 구현예의 구조에서, 항원 A 또는 B 중 하나가 EGFR 이고, 나머지 하나가 IGF-1R 이다. 상기 구조는 항원 A 에 결합하는 전장 항체를 근간으로 하는데, 여기서 2 개의 (선택적으로는 디설파이드-안정화된) 단일쇄 Fv 가 항원 B 에 결합하고 있고, 펩티드-링커를 통해 연결되어 있는 구조가 도 1 및 2 의 도면에 예시되어 있다.

두번째 4 가 구현예에서, 4 가 이중특이적 항체는 하기를 포함한다:

a) 상기 제 1 항원 (2 개 항원 EGFR 또는 IGF-1R 중 하나) 에 특이적으로 결합하고, 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체; 및

b) 상기 제 2 항원 (2 개 항원 EGFR 또는 IGF-1R 중 나머지 하나) 에 특이적으로 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편,

여기서, b) 하의 상기 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 a) 하의 상기 전장 항체에 융합됨.

한 구현예에서, 제 2 항원에 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 각각의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 상기 전장 항체에 융합되어 있다.

한 구현예에서, 제 2 항원에 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 각각의 중쇄의 C-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 상기 전장 항체에 융합되어 있다.

한 구현예에서, 제 2 항원에 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편은 상기 전장 항체의 각각의 경쇄의 C-말단에서 펩티드 커넥터를 통해 상기 전장 항체에 융합되어 있다.

"단일쇄 Fab 절편" (도 11 참고) 은, 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서들 중 하나를 갖는다: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL; 또한, 여기서 상기 링커는, 30 개 이상 바람직하게는 32 내지 50 개의 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일쇄 Fab 절편들 a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL- 링커-VL-CH1 및 d) VL-CH1-링커-VH-CL 은, CL 도메인 및 CH1 도메인 사이의 자연적 디설파이드 결합을 통해 안정화된다. 용어 "N-말단" 은 N-말단의 최후의 아미노산을 지칭하다. 용어 "C-말단" 은 C-말단의 최후의 아미노산을 지칭한다.

바람직한 구현예에서, 상기 단일쇄 Fab 절편 내 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 것 중 하나를 갖고: a) VH-CH1-링커-VL-CL, 또는 b) VL-CL-링커-VH-CH1, 더욱 바람직하게는 VL-CL-링커-VH-CH1 이다.

또다른 바람직한 구현예에서, 상기 단일쇄 Fab 절편 내 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 것 중 하나를 갖는다: a) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 b) VL-CH1-링커- VH-CL.

본 발명에 사용된 용어 "펩티드 커넥터" 는, 바람직하게는 합성 기원의 것인 아미노산 서열을 가진 펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따른 상기 펩티드 커넥터는 단일쇄 Fab 절편을 전장 항체의 C- 또는 N-말단에 융합시켜, 본 발명에 따른 다가특이적 항체를 형성하기 위해 이용된다. 바람직하게는, b) 하의 상기 펩티드 커넥터는 5 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 100 개, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 개의 아미노산의 길이를 가진 아미노산 서열의 펩티드이다. 한 구현예에서, 상기 펩티드 커넥터는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm 인데, 여기서 G = 글리신, S = 세린이고, (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3) 이거나 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n= 2 또는 3, 더욱 바람직하게는 x = 4, n= 2 이다. 한 구현예에서, 상기 펩티드 커넥터는 (G₄S)₂ 이다.

본원에 사용된 용어 "링커" 는, 바람직하게는 합성 기원인 아미노산 서열을 가진 펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따른 상기 펩티드는, a) VH-CH1 를 VL-CL 에, b) VL-CL 를 VH-CH1 에, c) VH-CL 를 VL-CH1 에, 또는 d) VL-CH1 를 VH-CL 에 연결하여, 본 발명에 따른 하기의 단일쇄 Fab 절편을 형성하기 위해 이용된다: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커- VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL. 단일쇄 Fab 절편 내 상기 링커는 30 개 이상의 아미노산의 길이, 바람직하게는 32 내지 50 개의 아미노산 길이를 가진 아미노산 서열을 가진 펩티드이다. 한 구현예에서, 상기 링커는 (GxS)n 이고, 여기서 G = 글리신, S = 세린, (x =3, n= 8, 9 또는 10, 그리고 m = 0, 1, 2 또는 3) 이거나 또는 (x = 4, 그리고 n = 6, 7 또는 8, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4, n= 6 또는 7, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3, 더욱 바람직하게는 x = 4, n= 7, 그리고 m= 2 이다. 한 구현예에서, 상기 링커는 (G₄S)₆G₂ 이다.

상기 단일쇄 Fab 절편에서 선택적으로는, CL-도메인 및 CH1 도메인 사이의 자연 디설파이드 결합에 추가하여, 또한 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 은 하기 위치들 사이의 디설파이드 결합의 도입으로 디설파이드 안정화된다:

i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 와 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이,

ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 와 경쇄 가변 도메인 위치 43 사이, 또는

iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 과 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이 (번호매김은 언제나 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).

단일쇄 Fab 절편의 상기 추가적인 디설파이드 안정화는 단일쇄 Fab 절편의 가변 도메인 VH 및 VL 사이의 디설파이드 결합의 도입으로 달성된다. 단일쇄 Fv 에 대한 안정화를 위한 비자연 디설파이드 브릿지의 도입을 위한 기법은, 예를 들어 [WO 94/029350, Rajagopal, V., et al, Prot. Engin. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al; Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393; 또는 Schmidt, M., et al , Oncogene (1999) 18, 1711-1721] 에 기재되어 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체에 포함된 단일쇄 Fab 절편의 가변 도메인들 사이의 선택적인 디설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 44 및 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이에 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체에 포함된 단일쇄 Fab 절편의 가변 도메인들 사이의 선택적인 디설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 105 및 경쇄 가변 도메인 위치 43 사이에 있다 (번호매김은 언제나 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).

한 구현예에서, 단일쇄 Fab 절편의 가변 도메인 VH 및 VL 사이의 상기 선택적인 디설파이드 안정화가 없는 단일쇄 Fab 절편이 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 4 가 이중특이적 항체의 상기 제 2 구현예는 a) 하의 상기 전장 항체의 2 개의 중쇄의 2 개의 C-말단 또는 2 개의 경쇄의 2 개의 C-말단에 모두 융합되어 있는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 절편 (바람직하게는 VL-CL-링커-VH-CH1) 을 포함한다. 상기 융합은, i) 전장 항체의 경쇄 또는 중쇄가 함께 발현되는 2 개의 동일한 융합 펩티드 (i) 중쇄 및 단일쇄 Fab 절편 또는 ii) 경쇄 및 단일쇄 Fab 절편) 을 제공하여, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 제공한다 (도 12, 13 및 14 참고).

추가 구현예에서, 상기 4 가 이중특이적 항체는, a) 하의 상기 전장 항체 부분이 EGFR 에 결합하고, b) 하의 상기 2 개의 단일쇄 Fab 절편이 IGF-1R 에 결합하는 것을 특징으로 한다.

추가 구현예에서, 상기 4 가 이중특이적 항체는 a) 하의 상기 전장 항체 부분이 IGF-1R 에 결합하고, b) 하의 상기 2 개의 단일쇄 Fab 절편이 EGFR 에 결합하는 것을 특징으로 한다.

추가 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 불변 영역이 인간 기원으로부터 유도된 것을 특징으로 한다.

추가 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역이 인간 IgG1 서브클래스의 것이거나, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A 가 있는 인간 IgG1 서브클래스의 것임을 특징으로 한다.

추가 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역이 인간 IgG2 서브클래스의 것임을 특징으로 한다.

추가 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역이 인간 IgG3 서브클래스의 것임을 특징으로 한다.

추가 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역이 인간 IgG4 서브클래스의 것이거나 또는 추가적인 돌연변이 S228P 가 있는 IgG4 서브클래스의 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체가 개선된 특징을 가졌음을 알게 되었다. 이들은 두 개별 항체의 단 1 개 또는 2 개 조합 적용시 또는 [Lu, D., 등, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 및 J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72] 의 이중특이적 항체의 적용시에 비해 시험관내 및 생체내 항종양 활성/효능에 있어서 적어도 동일하거나 또는 증가되어 있음을 나타냈다. 이들은 [Lu, D., 등, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 및 J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72] 의 이중특이적 항체에 비해 생체내에서 개선된 약동학적 안정성을 나타낸다. 나아가, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 두 개별 항체 중 오직 하나 또는 이들의 조합의 적용에 비해 조절된 수용체 하향조절/내재화 (internalization) 를 나타낸다. 나아가, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 투여량 감소 및/또는 투여 빈도 감소 및 동시에 비용 절감과 같은 이익을 제공할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "불변 영역" 은 가변 영역 이외의 항체의 도메인의 합을 나타낸다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접 관여하지 않으나, 각종 효과기 기능을 나타낸다. 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 좌우되어, 항체들은 하기의 클래스로 분류되고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 일부는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2 과 같은 서브클래스로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 클래스에 해당하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 지칭된다. 모든 5 개 항체 클래스에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역은 K (카파) 및 λ (람다) 로 지칭된다.

본 출원에 사용된 용어 "인간 기원으로부터 유도된 불변 영역" 은 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 인간 항체의 불변 중쇄 영역 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 지칭한다. 상기 불변 영역은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 Kabat, E.A. 가 기재한 바 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Johnson, G. 및 Wu, T.T., Nucleic acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785- 2788). IgG4 서브클래스의 항체가 감소된 Fc 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 나타낸 반면, 기타 IgG 서브클래스의 항체는 강력한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 카르보히드레이트의 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435 는, 변경되는 경우 감소된 Fc 수용체 결합을 제공하는 잔기들이다 (Shields, R., L., 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., 등, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG1 항체에 비해 감소된 FcR 결합을 갖는데, 그런 면에서 단일특이적 2 가 (전장) 부모 항체는 IgG4 서브클래스 또는 S228, L234, L235 및/또는 D265 에 돌연변이가 있는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 FcR 결합이고/이거나 PVA236 돌연변이를 포함한다. 한 구현예에서, 단일특이적 2 가 (전장) 부모 항체에서의 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236 이다. 또다른 구현예에서, 단일특이적 2 가 (전장) 부모 항체에서의 돌연변이는 IgG4 S228P 에 있고, IgG1 L234A 및 L235A 에 있다. 불변 중쇄 영역은 서열 식별 번호: 27 및 28 에 나타낸다. 한 구현예에서, 단일특이적 2 가 (전장) 부모 항체의 불변 중쇄 영역은, 돌연변이 L234A 및 L235A 가 있는 서열 식별 번호: 27 의 것이다. 또다른 구현예에서, 단일특이적 2 가 (전장) 부모 항체의 불변 중쇄 영역은 돌연변이 S228P 가 있는 서열 식별 번호: 28 의 것이다. 또다른 구현예에서, 단일특이적 2 가 (전장) 부모 항체의 불변 경쇄 영역은 서열 식별 번호: 29 의 것이다.

항체의 불변 영역은 ADCC (항체-의존적 세포-매개성 세포독성) 및 CDC (보체-의존적 세포독성) 에 직접 관여된다. 보체 활성화 (CDC) 는 보체 인자 CIq 의 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 불변 영역에 대한 결합으로 개시된다. CIq 의 항체에 대한 결합은 소위 결합 부위에서의 정해진 단백질-단백질 상호작용에 의해 초래된다. 상기 불변 영역 결합 부위는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 [Lukas, T.J., 등, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., 및 Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., 등, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., 등, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., 등, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., 등, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434] 에 기재되어 있다. 상기 불변 영역 결합 부위는 예를 들어 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 을 특징으로 한다 (번호매김은 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).

용어 "항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)" 는 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 표적 세포의 용해를 지칭한다. ADCC 는 바람직하게는 효과기 세포, 예컨대 새롭게 분리된 PBMC 또는 단구체 또는 자연 킬러 (NK) 세포와 같은 버피 코우트 (buffy coat) 로부터 정제된 효과기 세포 또는 영구 성장 NK 세포주의 존재 하에 본 발명에 따른 항체를 이용한 IgF-1R 및 EGFR 발현 세포의 제제의 처리에 의해 측정된다.

용어 "보체-의존적 세포독성 (CDC)" 는 보체 인자 CIq 의 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부분에 대한 결합에 의해 개시되는 프로세스를 지칭한다. CIq 의 항체에 대한 결합은 소위 결합 부위에서의 정해진 단백질-단백질 상호작용에 의해 초래된다. 상기 Fc 부분 결합 부위는 당업계에 공지되어 있다 (상기 참고). 상기 Fc 부분 결합 부위는 예를 들어, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 을 특징으로 한다 (번호매김은 Kabat 의 EU 인덱스에 따름). 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 일반적으로 CIq 및 C3 결합을 포함하는 보체 활성화를 나타내며, IgG4 는 보체 시스템을 활성화하지 않으며, CIq 및/또는 C3 에 결합하지 않는다.

모노클로날 항체의 세포-매개성 효과기 기능은 [Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 및 US 6,602,684] 에 기재된 그들의 올리고당 구성원 조작에 의해 증강될 수 있다. IgGl 타입 항체들은, 치료 항체에 가장 널리 이용되는데, 각각의 CH2 도메인에 Asn297 에서 보존성 N-연결 글리코실화 부위를 가진 당단백질이다. Asn297 에 결합되어 있는 2 개의 복합체 바이안테너리 (biantennary) 올리고당은 CH2 도메인들 사이에 묻혀 있으며, 폴리펩티드 백본과 광범위한 접촉을 형성하며, 그들의 존재는 항체로 하여금 항체 의존적 세포 독성 (ADCC) 와 같은 효과기 기능을 매개하는데 있어 필수적이다 (Lifely, M. R., 등, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., 등, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., 및 Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). [Umana, P., 등 Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 및 WO 99/54342] 는, 이등분 올리고당의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라아제인 β(l,4)-N-다세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 III ("GnTIII") 의 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 과발현이 항체의 시험관내 ADCC 활성을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여줬다. Asn297 탄수화물 조성의 변경 또는 그의 제거는 또한 FcγR 및 CIq 에 대한 결합에 영향을 준다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., 등, Biotechnol. BioEng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., 등, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).

모노클로날 항체의 세포-매개성 효과기 기능을 증강시키는 방법은, 예를 들어 WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO2007/031875, Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/01 1735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 및 WO 2000/061739 에, 또는 예를 들어 [Niwa, R., 등, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 및 US2005/0249722] 에 보고되어 있다.

따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 Asn297 에서 당 사슬에 의해 글리코실화되어 (IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스의 Fc 부분을 포함하는 경우, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3 서브클래스에서), 상기 당 사슬 내 퓨코오스의 양이 65% 이하이다 (번호매김은 Kabat 에 따름). 또다른 구현예에서, 상기 당 사슬 내 퓨코오스의 양은 5% 내지 65%, 바람직하게는 20% 내지 40% 이다. 본 발명에 따른 "Asn297" 은 Fc 영역 내 대략 위치 297 에 위치하는 아미노산 아스파라긴을 의미한다. 항체의 미미한 서열 변경을 근거로, Asn297 는 또한 위치 297 의 상류 또는 하류에, 즉 위치 294 내지 300 사이에 위치하는 일부 아미노산 (일반적으로 +3 아미노산을 초과하지 않음) 일 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 글리코실화 항체에서, IgG 서브클래스는 인간 IgG1 서브클래스의 것, 돌연변이 L234A 및 L235A 이 있는 인간 IgG1 서브클래스의 것, 또는 IgG3 서브클래스의 것이다. 추가 구현예에서, 상기 당 사슬 내에서 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA) 의 양은 1% 이하이고/이거나 N-말단 알파-1,3-갈락토오스의 양은 1 % 이하이다. 당 사슬은 바람직하게는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체의 Asn297 에 결합된 N-연결 글리칸의 특징을 나타낸다.

용어, "당 사슬이 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체의 Asn297 에 결합된 N-연결 글리칸의 특징을 나타낸다" 는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역의 Asn297 에서의 당 사슬이, 예를 들어 WO 2006/103100 에서 보고된 바와 같이 비개질 CHO 세포에서 발현되는 동일한 항체의 것과 같은 퓨코오스 잔시에 대한 것을 제외하고, 동일한 구조 및 당 잔기 서열을 갖는다는 점을 의미한다.

본 출원에 사용된 용어 "NGNA" 는 당 잔기 N-글리콜릴뉴라민산을 나타낸다.

인간 IgG1 또는 IgG3 의 글리코실화는 2 개 이하의 Gal 잔기로 종결된 코어 퓨코실화 바이안테너리 복합체 올리고당 글리실화로서 Asn297 에서 일어난다. IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 인간 불변 중쇄 영역은 [Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991) 및 by Br?ggemann, M., 등, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., 등, Methods EnzyMol. 178 (1989) 515-527] 에 상세하게 보고되었다. 상기 구조들은 말단 Gal 잔기의 양에 따라 GO, G1 (α-1,6- 또는 α-1,3-), 또는 G2 글리칸 잔기로 정해졌다 (Raju, T. S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 타입 글리코실화는 예를 들어 [Routier, F. H., Glycocoηjugate J. 14 (1997) 201-207] 에 기재되어 있다. 비-당개질 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체는 일반적으로 85% 이상의 양으로 Asn297 에서 퓨코실화되어 있다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역의 개질된 올리고당은 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 바람직하게는, 이등분된, 환원된/퓨코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드이다. 또다른 구현예에서, 이등분된, 환원된/퓨코실화되지 않은 올리고당은 복합체이다.

본 발명에 따르면, "퓨코오스의 양" 은 MALDI-TOF 질량 분광계로 측정하고, 평균 값으로 계산하여, Asn297 에 결합된 모든 당구조체 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고급 만노오스 구조체) 의 합에 대한 Asn297 에서의 당 사슬 내 상기 당의 양을 의미한다. 퓨코오스의 상대적인 양은 MALDI-TOF 에 의한, N-글리코시다아제 F 처리된 시료 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고급 만노오스 구조체) 내에서 밝혀낸 모든 당구조체에 대한 퓨코오스-포함 구조체의 백분율이다.

본 발명에 따른 모든 이중특이적 항체에 대해, "GE" 는 당조작화되었음을 의미한다.

본 발명에 따른 한가지 추가 국면에서, 이중특이적 항체는 ADCC 및/또는 CDC 가 있고, Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 CIq 에 결합하는, 인간 기원의 IgGl 또는 IgG3 (바람직하게는 IgG1) 서브클래스의 불변 영역을 가진 항체이다. Fc 수용체 및/또는 보체 인자 CIq 에 결합하는 상기 상체는 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 독립적 세포독성 (CDC) 을 이끌어낸다.

본 발명에 따른 항체는 재조합적 수단에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 한 국면은 본 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산이고, 추가 국면은 본 발명에 따른 항체를 인코딩하는 상기 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합적 제조를 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현을 포함하며, 항체의 분리 및 일반적으로 약제학적으로 허용되는 순도까지의 정제가 후속한다. 숙주 세포에서의 상기 언급한 항체의 발현을 위해, 각각의 개질된 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산은 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 발현은 CHO 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 대장균 (E.coli) 세포와 같은 적당한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행되고, 항체는 상기 세포로부터 (상청액 또는 용해 후 세포) 회수된다. 항체의 재조합적 제조를 위한 일반적인 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., 등, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880] 의 리뷰 문헌에 기재되어 있다.

이중특이적 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로오스 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리된다. 모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA 및 RNA 는 쉽게 분리되며, 통상적인 과정을 이용해 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA 의 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, DNA 는 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 이는 이어서 HEK 293 세포, CHO 세포 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 미엘로마 세포와 같은 숙주 세포에 트랜스펙션되어, 숙주 세포에서 재조합 모노클로날 항체의 합성을 수득한다.

이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체 (또는 돌연변이) 는 적당한 뉴클레오티드 변화를 항체 DNA 에 삽입하거나, 뉴클레오티드 합성에 의해 제조된다. 그러나, 상기 개질은 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 오직 매우 제한된 범위에서만 수행될 수 있다. 예를 들어, 개질은 상기 언급한 항체 특징, 예컨대 IgG 이소타입 및 항원 결합을 변경하지 않고, 다만 재조합체 제조 수율, 단백질 안정성을 개선하거나 또는 정제를 용이하게 할 수 있다.

본 발명에 따른 EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체는 EGFR 를 하향조절한다. 한 구현예에서, A549 세포에서의 EGFR 의 하향조절은 적어도 약 30% 이고, 또다른 구현예에서, 적어도 약 35% 이고, 또다른 구현예에서 적어도 약 40% 이다.

본 발명에 따른 EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체는 IGF-1R 를 하향조절한다. 한 구현예에서, 이중특이적 Cross-Mab (VH/VL) 또는 Cross-Mab (CH/CL) 에 의한 IGF-1R 의 하향조절은 H322M 세포에서 (75μg 단백질/mL 로) 약 15% 이하이고, 또다른 구현예에서, 약 20% 이하이고, 또다른 구현예에서 약 40% 이하이다.

본 출원에 사용된 용어 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 항체를 생산하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 한 구현예에서, HEK293 세포 및 CHO 세포가 숙주 세포로서 이용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양" 은 호환되어 사용되며, 상기 모든 정의는 자손까지도 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 는 1 차적인 대상체 세포 및 계대 횟수와 상관없이 그로부터 유도된 배양물을 포함한다. 모든 자손들이 의도적 또는 비의도적 돌연변이로 인해, DNA 내용물에 있어서 정확하게 일치하지 않을 수도 있음이 이해될 것이다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 변이체 자손들이 포함된다.

NSO 세포에서의 발현은, 예를 들어, [Barnes, L.M., 등, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., 등, Biotech. BioEng. 73 (2001) 261-270] 에 기재되어 있다. 일시적 발현은, 예를 들어, [Durocher, Y., 등, Nucl. Acids. Res. 30 E9 (2002)] 에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 [Orlandi, R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Norderhaug, L., 등, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87] 에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 은 [Schlaeger, E.-J., 및 Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 및 Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199] 에 기재되어 있다.

원핵생물에 적합한 컨트롤 서열은 예를 들어 프로모터, 선택적으로는 조작자 서열, 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 시그널을 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓여 있을 때 "작동적으로 연결" 되어 있다. 예를 들어, 예비서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (secretory leader) 에 대한 DNA 는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비단백질 (pre-protein) 로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA 와 작동적으로 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되고; 또는 리보좀 결합 서열은 위치하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 번역을 촉진한다. 일반적으로, "작동적으로 연결된" 이란 연결될 DNA 서열이 연속적인 것이며, 분비 리더인 경우 연속적인 것이며 리딩 프레임 (reading frame) 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 반드시 연속적인 것은 아니다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 그런 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적 실시에 따라 이용된다.

퓨코오스의 양이 감소된 본 발명에 따른 항체는, Fc 영역 내 올리고당을 본 발명에 따라 퓨코실화 하는 양으로 GnTIII 활성을 가진 폴리펩티드 및 ManII 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 당개질된 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 한 구현예에서, GnTIII 활성을 가진 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 대안적으로, 숙주 세포의 6-퓨코실트랜스퍼라아제 활성이 US 6,946,292 에 따라 감소 또는 제거되어 당개질화 숙주 세포를 생성할 수 있다. 항체 퓨코실화 양은 예를 들어 발효 조건에 의해 또는 상이한 퓨코실화 양으로 2 가지 이상의 항체를 조합하여 미리 정해질 수 있다.

퓨코오스의 양이 감소된 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함하는 방법으로 숙주 세포에서 제조될 수 있다: (a) GnTIII 활성 및/또는 ManII 활성을 가진 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를, 상기 항체의 제조를 허용하고 상기 항체의 Fc 영역 상에 존재하는 올리고당의 퓨코실화를 본 발명에 따른 양으로 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 항체를 분리하는 단계. 한 구현예에서, GnTIII 활성을 가진 폴리펩티드는, 바람직하게는 GnTIII 의 촉매 도메인 및 만노시다아제 II 의 국소화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 I ("GnTI") 의 국소화 도메인, 마르모시다아제 I 의 국소화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코시마닐트랜스퍼라아제 II ("GnTII") 의 국소화 도메인, 및 α-1,6 코어 퓨코실트랜스퍼라아제의 국소화 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종성 골지 상주 폴리펩티드의 골지 국소화 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 골지 국소화 도메인은 만노오시다아제 II 또는 GnT 유래이다.

본원에 사용된 바와 같이, "GnTIII 활성을 가진 폴리펩티드" 는 N-아세틸글루코사민 (GIcNAc) 잔기의 β-1,4 연결에서의 N-연결된 올리고당의 트리만노실 코어의 β-연결 만노시드로의 첨가를 촉매할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 여기에는, 투여량에 의존하거나 또는 그렇지 않은 특별한 생물학적 검정법에서 측정된 바와 같은, Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) 에 따라 β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사미닐-트랜스퍼라아제 (EC 2.4.1.144) 로도 공지된 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 III 의 활성과 유사하나, 반드시 동일하지만은 않은 효소 활성을 나타내는 융합 폴리펩티드가 포함된다. 투여량 의존성이 존재하는 경우, GnTIII 의 것과 동일할 필요는 없으나, GnTIII 에 비해 주어진 활성에서 투여량-의존성과 실질적으로 유사하다 (즉, 후보물질 폴리펩티드는 GnTIII 에 비해 더 큰 활성을 나타내지만, 약 25-배를 초과하지 않고, 바람직하게는 10 배를 초과하지 않고, 가장 바람직하게는 약 3 배를 초과하지 않음). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "골지 국소화 도메인" 은 골지체 내 위치에 폴리펩티드를 고정하는 역할을 담당하고 있는 골지 상주 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 국소화 도메인은 효소의 아미노산 말단 "꼬리 (tails)" 를 포함한다.

퓨코오스의 양이 감량된 본 발명에 따른 항체 제조를 위해, 마찬가지로 개질된 당형태가 있는 항체의 제조를 가능케 하고, 그렇게 조작된 숙주 세포가 이용될 수 있다. 그러한 숙주 세포는 추가로 GnTIII 활성이 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 증가된 수준으로 발현하도록 취급된다. CHO 세포는 숙주 세포로서 바람직하다. US 6,946,292 에서 보고된 ADCC 가 증가된 항체 조성물을 생산하는 세포도 마찬가지이다.

항체의 정제는 세포 구성요소 또는 기타 오염물, 예를 들어 기타 세포 핵산 또는 단백질을, 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 널리 공지된 것을 포함하는 표준 기법에 의해 제거하여 수행된다. 참고문헌은, [Ausubel, F., 등, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]. 상이한 방법들이 확립되어 있고, 단백질 정제를 위해 널리 이용되고 있으며, 예컨대 마이크로 단백질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환 이용), 티오필릭 흡수 (예를 들어 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드 이용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡수 크로마토그래피 (예를 들어, 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 수지 또는 m-아미노페닐보론산 이용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 이용), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법 (예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동) (Vijayalakshmi, M., A., Appl. BioChem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 이 있다.

본 발명의 한 국면은 본 발명에 따른 항체를 함유하는 약제학적 조성물이다. 본 발명의 또다른 국면은 약제학적 조성물 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 추가 국면은 본 발명에 따른 항체를 함유하는 약제학적 조성물의 제조 방법이다. 추가 국면에서, 본 발명은 약제학적 담체와 함께 제형화된, 본 발명에 따른 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물을 제공한다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 EGRR 및 IGF-1R 에 대한 이중특이적 항체가, 단일특이적 부모 항-EGFR 항체 및 항-IGF-1R 항체와 비교시 또는 [Lu, D., 등, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; 및 J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72] 로부터 공지된 EGFR 및 IGF-1R 에 대한 이중특이적 항체 (이들 이중특이적 항체는 각각의 부모 항체의 조합에 비해 EGFR/IGF-1R 를 발현하는 종양 세포에서 감소된 효능을 나타낼 뿐임) 와 비교시, 암 세포에 대해 개선된 항-증식 특성을 갖는다는 점을 발견했다.

본 발명의 또다른 국면은 암 치료를 위한 상기 약제학적 조성물이다.

본 발명의 또다른 국면은 암 치료용 의약 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명의 또다른 국면은 암 치료가 필요한 환자에 대한 본 발명에 따른 항체의 투여에 의한 암을 앓는 환자의 치료 방법이다.

본원에 사용된 바와 같이, "약제학적 담체" 에는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산매, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들어 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 장관외, 척수내 또는 상피 투여에 적합하다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 각종 방법으로 투여될 수 있다. 당업자가 알 수 있듯, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 좌우되어 변경될 수 있다. 특정 투여 경로로 본 발명의 화합물을 투여하고자 할 때, 상기 화합물은 그의 불활성화를 방지할 물질로 코팅되어야 하거나 또는 그와 함께 공동투여해야할 수도 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 적당한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제 내에서 대상체에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제에는 식염수 및 수성 완충 용액이 포함된다. 약제학적 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약제학적으로 활성인 물질을 위한 상기 매질 또는 약제의 이용은 당업계에 공지되어 있다.

본원에 사용된 어구 "장관외 투여" 및 "장관외로 투여함" 은 일반적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 이에 제한되지 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 피하내, 관절강내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.

본원에 사용된 용어 암은, 증식형 질환, 예컨대 림프종, 림프구성 백혈명, 폐암, 비 소 세포 폐 (NSCL) 암, 기관지 폐포암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 및 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 위장관 암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 내막 암종, 자궁경부암, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨 (Hodgkin's) 질환, 식도암, 소장암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연부육종, 요도암, 음경의 암, 전립선암, 방광의 암, 신장 또는 요도의 암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계 (CNS) 의 신생물, 척추 종양, 뇌간 종양, 다형성교아세포종, 성상세포종, 신경초종, 에펜디모나스 (ependymonas), 수모세포종, 수막종, 편평상피암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종 (Ewing's sarcoma), 및 임의의 상기 암의 불응성 버젼 또는 상기 암의 하나 이상의 조합을 포함하여, 지칭한다.

상기 조성물은 또한 아쥬반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 에멀전화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기에서와 같은 멸균 과정에 의해, 그리고 각종 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 중에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 주사가능한 약제학적 형태의 지연성 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약제의 포함에 의해 수득될 수 있다.

선택한 투여 경로와는 상관없이, 본 발명의 적합한 수화된 형태 및/또는 약제학적 조성물로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화된다.

본 발명의 약제학적 조성물에서의 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아닌, 특별한 환자의 원하는 투여 응답성, 조성 및 투여 방식을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 수득하기 위해 변경될 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 채용된 본 발명의 특별한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 채용될 특별한 화합물의 청소율, 투여 기간, 채용될 특별한 조성물과 병용될 여타 약물, 화합물 및/또는 물질, 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력 및 의약 분야에 널리 공지된 기타 요인을 포함하는 각종 약동학적 요인에 좌우될 것이다.

조성물은 반드시 멸균이어야 하며, 조성물이 주사기에 의해 전달가능할 정도의 유체여야 한다. 물에 추가하여, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수 용액이다.

적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅물의 이용으로, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지로, 계면활성제의 이용으로 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함하는 것이 바람직하다.

본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 은 호환가능하며, 상기 모든 정의는 후손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환 세포" 는 그의 1 차적인 대상체 세포 및 계대수와 상관없이 그로부터 유도된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 후손들은, 의도적이든 또는 비의도적이든 돌연변이로 인해 DNA 함량에 있어서 정확하게 일치하지 않을 수 있음이 이해될 것이다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 변이체 후손들이 포함된다. 구별되는 명칭이 의도된 곳이라면, 그것은 문맥으로부터 명백할 것이다.

본원에 사용된 용어 "형질전환" 은 벡터/핵산의 숙주 세포로의 이동 프로세스를 지칭한다. 가공할 세포벽 배리어가 없는 세포가 숙주 세포로 이용된 경우, 트랜스펙션은, 예를 들어 [Graham, F. L., 및 Van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467] 에 기재된 바와 같은 인산칼슘 침전법에 의해 수행된다. 그러나, 핵 주입법 또는 프로토블라스트 융합과 같은, DNA 를 세포로 도입하는 여타 방법이 또한 이용될 수 있다. 실질적인 세포벽 구축물을 포함하는 원핵 세포 또는 세포들은, 예를 들어 한가지 트랙스펙션 방법은 Cohen, S.N., 등, PNAS. 69 (1972) 2110-2114 에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리이다.

본원에 사용된, "발현" 은 핵산이 mRNA 로 전사되는 프로세스 및/또는 전사된 mRNA (전사물로도 지칭함) 를 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하는 프로세스를 지칭한다. 전사물 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 유전자 생성물로 지칭된다 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 로부터 유도된 경우, 진핵 세포에서의 발현은 mRNA 의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

"벡터" 는 숙주 세포 내 및/또는 사이에서 삽입된 핵산 분자를 수송하는 핵산 분자, 특히 자가-복제물을 지칭한다. 상기 용어는 1 차적으로 DNA 또는 RNA 를 세포로 삽입하고 (예를 들어, 염색체 통합), 1 차적으로 DNA 또는 RNA 의 복제를 위해 기능하는 벡터 및 DNA 또는 RNA 의 전사 및/또는 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 또한, 기재한 바와 같은 기능들 중 하나 이상을 제공하는 벡터도 포함된다.

"발현 벡터" 는 적당한 숙주 세포로 도입시 전사될 수 있고, 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템" 은 일반적으로 원하는 발현 생성물을 제공하도록 기능할 수 있는 발현 벡터를 포함하여 이루어진 적합한 숙주 세포를 지칭한다.

아미노산 서열의 설명

서열 식별 번호: 1 중쇄 CDR3, 인간화된 <EGFR>ICR62

서열 식별 번호: 2 중쇄 CDR2, 인간화된 <EGFR>ICR62

서열 식별 번호: 3 중쇄 CDR1, 인간화된 <EGFR>ICR62

서열 식별 번호: 4 경쇄 CDR3, 인간화된 <EGFR>ICR62

서열 식별 번호: 5 경쇄 CDR2, 인간화된 <EGFR>ICR62

서열 식별 번호: 6 경쇄 CDR1, 인간화된 <EGFR>ICR62

서열 식별 번호: 7 중쇄 가변 도메인, 인간화된 <EGFR>ICR62-I-HHB

서열 식별 번호: 8 중쇄 가변 도메인, 인간화된 <EGFR>ICR62-I-HHD

서열 식별 번호: 9 경쇄 가변 도메인, 인간화된 <EGFR>ICR62 -I-KA

서열 식별 번호: 10 경쇄 가변 도메인, 인간화된 <EGFR>ICR62 -I-KC

서열 식별 번호: 11 중쇄 CDR3, <IGF-1 R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 12 중쇄 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 13 중쇄 CDR1, <IGF-1 R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 14 경쇄 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 15 경쇄 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 16 경쇄 CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 17 중쇄 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 18 중쇄 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 19 중쇄 CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 20 경쇄 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 21 경쇄 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 22 경쇄 CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 23 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 24 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 25 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18

서열 식별 번호: 26 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22

서열 식별 번호: 27 IgG1 로부터 유도된 인간 중쇄 불변 영역

서열 식별 번호: 28 IgG4 로부터 유도된 인간 중쇄 불변 영역

서열 식별 번호: 29 카파 경쇄 불변 영역

서열 식별 번호: 30 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (VH/VL) 의 중쇄 1

서열 식별 번호: 31 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (VH/VL) 의 중쇄 2

서열 식별 번호: 32 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (VH/VL) 의 경쇄 1

서열 식별 번호: 33 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (VH/VL) 의 경쇄 2

서열 식별 번호: 34 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (CH/CL) 의 중쇄 1

서열 식별 번호: 35 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (CH/CL) 의 중쇄 2

서열 식별 번호: 36 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (CH/CL) 의 경쇄 1

서열 식별 번호: 37 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: Cross-Mab (CH/CL) 의 경쇄 2

서열 식별 번호: 38 이중특이적, 2 가 scFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: scFab-Fc 의 중쇄 1

서열 식별 번호: 39 이중특이적, 2 가 scFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: scFab-Fc 의 중쇄 2

서열 식별 번호: 40 이중특이적, 2 가 scFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: N-scFabSS-Salt-bridge-s3 의 중쇄 1

서열 식별 번호: 41 이중특이적, 2 가 scFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: N-scFabSS-Salt-bridge-s3 의 중쇄 2

서열 식별 번호: 42 이중특이적, 2 가 scFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: N-scFabSS-Salt-bridge- w3C 의 중쇄 1

서열 식별 번호: 43 이중특이적, 2 가 scFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: N-scFabSS-Salt-bridge-w3C 의 중쇄 2

서열 식별 번호: 44 이중특이적, 3 가 scFab-IgG 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: KiH-C-scFab-1 의 중쇄 1

서열 식별 번호: 45 이중특이적, 3 가 scFab-IgG 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: KiH-C-scFab-1 의 중쇄 2

서열 식별 번호: 46 이중특이적, 3 가 scFab-IgG 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: KiH-C-scFab-1 의 경쇄

서열 식별 번호: 47 이중특이적, 3 가 scFab-IgG 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: KiH-C-scFab-2 의 중쇄 1

서열 식별 번호: 48 이중특이적, 3 가 scFab-IgG 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: KiH-C-scFab-2 의 중쇄 2

서열 식별 번호: 49 이중특이적, 3 가 scFab-IgG 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자: KiH-C-scFab-2 의 경쇄

하기의 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되며, 그의 진정한 범위는 첨부되는 특허청구범위에 제공된다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않고 과정에서 개질이 행해질 수 있음이 이해될 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1: 본 발명에 따른 EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체의 일개 4 가 구현예의 도식적인 구조로서, 항원 A 또는 B 중 하나는 EGFR 이고, 나머지 하나는 IGF-1R 임. 상기 구조는 항원 A 에 결합하는 전장 항체를 근간으로 하며, 여기서 2 개의 (선택적으로는 디설파이드-안정화된) 단일쇄 Fv 는 항원 B 에 결합하고 있으며, 펩티드-링커에 의해 연결되어 있다.

도 2: 본 발명에 따른 EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체의 4 가지 가능한 4 가 구현예 A 내지 D 의 도식적인 구조로서, 항원 A 또는 B 중 하나는 EGFR 이고, 나머지 하나는 IGF-1R 임. 상기 구조는 항원 A 에 결합하는 전장 항체를 근간으로 하며, 여기서 2 개의 (선택적으로는 디설파이드 안정화된) 단일쇄 Fv 는 항원 B 에 결합하고 있으며, 하기 위치에서 펩티드-링커를 통해 연결되어 있다:

A: 전장 항체 중쇄의 C-말단

B: 전장 항체 중쇄의 N-말단

C: 전장 항체 경쇄의 C-말단

D: 전장 항체 경쇄의 C-말단

도 3: 3a: 정제된 이중특이적 항체 XGFR1-2421 의 SDS-PAGE

3b: 정제된 이중특이적 항체 XGFR 1-2421 (3 mg/ml) 의 HP-크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 분석

3c: 정제된 이중특이적 항체 XGFR 1-2421 (1 mg/ml) 의 HP-크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 분석

도 4: 4a: 이중특이적 항체 XGFR1-2320 (디설파이드 안정화 없음) 의 HP-크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 정제 (8.7 % 응집함)

4b: 이중특이적 항체 XGFR1-2321 (디설파이드 안정화됨) 의 HP-크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 정제 (0 % 응집함)

도 5: 고정화된 XGFR1-2320 를 이용한 Biacore 검정에서의 EGFR 및 IGF1R 에 대한 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체 (XGFR1-2320) 의 동시적인 결합

도 6: 이중특이적 항체에 의한 A549 NSCLC 세포주에서의 IGFR (6a) 및 EGFR (6b) 의 하향조절

도 7: 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체 분자 (XGFR) 에 의한 H322M NSCLC 종양 세포주에서의 IGF-1R 인산화 (7a) 및 EGFR 인산화 (7b) 의 억제

7a: Phospho-IGF-1R - H322M NSCLC 종양 세포에서의 각종 이중특이적 항체 XGFR 분자 및 그의 부모 항체를 이용한 억제 후 ELISA, 항체 농도는 IGF1/EGF 항체로 자극시 농도가 원래 농도의 절반으로 희석된 인큐베이션을 지칭함.

7b: Phospho-EGF-R - H322M NSCLC 종양세포에서의 각종 이중특이적 항체 XGFR 분자 및 그의 부모 항체를 이용한 억제 후 ELISA, 항체 농도는 IGF1/EGF 항체로 자극시 농도가 원래 농도의 절반으로 희석된 인큐베이션을 지칭함.

도 8: EGFR- 및 IGF-1R-발현 H322M NSCLC 종양 세포의 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체 분자 (XGFR) 및 그의 부모 항체에 의한 항-종양 성장 억제

도 9: 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체 분자 (XGFR) 의 시험관내 ADCC 활성

도 10: 가변 및 불변 도메인을 전형적인 순서로 포함하는 중쇄 및 경쇄의 2 개쌍이 있고, EGFR 또는 IGF1-R 에 대해 특이적으로 결합하고, CH4 도메인이 없는 전장 항체의 도식적인 구조.

도 11: 예를 들어 EGFR 또는 IGF1-R 에 특이적으로 결합하는 4 가지 가능한 단일쇄 Fab 절편의 도식적인 구조

도 12: 2 개의 항원들 EGFR 또는 IGF1-R 중 하나에 특이적으로 결합하는 전장 항체 및 항원들 EGFR 또는 IGF1-R (scFab-XGFR 분자) 중 나머지 하나에 특이적으로 결합하는 2 개의 단일쇄 Fab 를 포함하는 본 발명에 따른 4 가 이중특이적 항체의 도식적인 구조.

도 13: IGF-1R 에 특이적으로 결합하는 전장 항체 및 EGFR - ScFab - XGFR1 분자 A, B, C 및 D 에 특이적으로 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체 및 정체 후 발현 수준

A: 중쇄의 C-말단에 융합된 scFab (VH-CH1-링커-VL-CL)

B: 중쇄의 C-말단에 대한 scFab (추가적인 VH44-VLlOO 디설파이드 가교가 융합되어 있는 VH-CH1-링커-VL-CL)

C: 경쇄의 C-말단에 융합되어 있는 scFab (VH-CH1-링커-VL-CL)

D: 경쇄의 C-말단에 대한 scFab (추가적인 VH44-VL100 디설파이드 가교가 융합되어 있는 VH-CH1-링커-VL-CL)

도 14: EGFR 에 특이적으로 결합하는 전장 항체 및 IGF-1R-ScFab - XGFR2 분자 A, B, C 및 D 에 특이적으로 결합하는 2 개의 동일한 단일쇄 Fab 를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체

A: 중쇄의 C-말단에 융합되어 있는 scFab (VH-CH1-링커-VL-CL)

C: 경쇄의 C-말단에 융합되어 있는 scFab (VH-CH1-링커-VL-CL)

D: 경쇄의 C-말단에 대한 scFab (추가적인 VH44-VLlOO 디설파이드 가교가 융합되어 있는 VH-CH1-링커-VL-CL)

도 15: 이중특이적 항체 유도체 scFab-XGFR1 를 포함하는 단일쇄 Fab 의 SDS-PAGE 분석

1 : scFab-XGFR1_4720 (환원되지 않음)

2: scFab-XGFR1_4721 (환원되지 않음)

3: scFab-XGFR1_4720 (환원됨)

4: scFab-XGFR1_4721 (환원됨)

도 16: 이중특이적 항체 유도체 scFab-XGFR1 를 포함하는 scFab 의 HP-SEC 분석

도 16a: scFab-XGFR 1-4720; 7.7 %, 응집됨 (박스 내에 표기)

도 16b: scFab-XGFR 1-4721; 3.5 %, 응집됨 (박스 내에 표기)

도 17: scFab-XGFR1 및 scFab-XGFR2 의 EGFR 및 IGFlR 에 대한 결합

도 17a: Biacore 다이어그램- scFab-XGFR1_2720 의 EGFR 에 대한 결합, KD = 2 nM

도 17b: Biacore 다이어그램- scFab-XGFR1_2720 의 IGF-1R 에 대한 결합, KD = 2 nM

도 17c: Biacore 다이어그램- scFab-XGFR2_2720 의 EGFR 에 대한 결합, KD = 0.5 nM

도 17d: Biacore 다이어그램- scFab-XGFR2_2720 의 IGF-1R5 에 대한 결합, KD = 11 nM

도 18: 반응식 - 하기의 일반적인 과정으로, FACS 경쟁 검정에 의해 분석된, scFab-XGFR 의 세포에 대한 결합:

- Alexa647 (1 μg/mL) 로 표지된 <IGF1R> Mab + 표지되지 않은 scFab-XGFR (100 μg/mL - 0,001 μg/mL) 를 동시에 첨가함

- 45 분간 얼음에서 인큐베이션하고, 결합되지 않은 항체를 세척 및 제거함

- 1% HCHO 고정 후, FACS

도 19: FACS 경쟁 검정으로 분석한, scFab-XGFR_2721 및 부모 <IGF1R> Clone18 의 세포에 대한 결합

도 19a: <IGF-1R>Clone18 (0,18 μg/ml) 및 scFab-XGFR_2721 (0,15 μg/ml) 의 IC50 값 비교

도 19b: <IGF-1R> Clone18 의 결합 곡선 (터닝 포인트 0,11 μg/ml) - y-축 = RLU ; x-축 항체 농도 (μg/ml)

도 19c: scFab-XGFR_2721 의 결합 곡선 (터닝 포인트 0,10 μg/ml) - y-축 = RLU ; x-축 항체 농도 (μg/ml)

도 20 상이한 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체 분자 (scFab-XGFR; 10O nM) 와 24 h 인큐베이션 후 H322M-세포에 대한 IGFl-R 의 하향조절

도 21 상이한 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체 분자 (scFab-XGFR; 10O nM) 와 24 h 인큐베이션 후 H322M-세포에 대한 EGFR 의 하향조절

도 22 상이한 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체 분자 (scFab- XGFR; 10O nM) 를 이용한 H322M-세포로부터 증식의 억제

실험 과정

실시예

이중특이적 < EGFR - IGF -1R > 항체의 예시 디자인

본 발명에 따라 EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체는 EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위를 포함한다. EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위로서, 인간화된 래트 항-EGFR 항체 ICR62 로부터 유도된, 서열 식별 번호: 7 또는 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인, 및 서열 식별 번호: 9 또는 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (WO 2006/082515 에 상세하게 기재되어 있음) 이 사용될 수 있다.

IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위로서, 인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 또는 <IGF-1R> HUMAB Clone 22 (DSM ACC 2594) (두가지 모두 WO 2005/005635 에 상세하게 기재되어 있음) 로부터 유도된, 서열 식별 번호: 23 또는 서열 식별 번호: 24 의 중쇄 가변 도메인, 및 서열 식별 번호: 25 또는 서열 식별 번호: 26 의 경쇄 가변 도메인이 사용될 수 있다.

하기의 모든 실시예 1 내지 20 에서, 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체는 EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (인간화된 <EGFR>ICR62 로부터 유도됨) 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 23 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 25 의 경쇄 가변 도메인 (인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 으로부터 유도됨) 을 근간으로 한다.

A) scFv 결합이 있는 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체의 디자인 ( scFv -XGFR 분자들을 지칭하는 XGFR1 및 XGFR2 명명법)

두 항체의 특징을 조합하는 약제를 만들기 위해, 각종 신규 4 가 이중특이적 항체-유도성 단백질 독립체를 구축했다. 상기 분자들에서, 1 개 항체의 재조합 단일쇄 결합 분자는 재조합 단백질 융합 기법에 의해, 전장 IgG1 의 포맷을 유지하고 있는 나머지 항체에 연결된다. 상기 제 2 항체는 원하는 2 차 결합 특이성을 보유한다.

인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 및 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (VL) 으로부터 유도된, EGFR 에 결합하는 단일쇄 Fv (scFv) 를 근간으로 디자인된 포맷의 개요를 도 1 에 도시하며, 표 1 및 2 에 열거한다.

유전자 합성 및 재조합 분자 생물학 기법에 의해, 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 글리신 세린 (G4S)n 단일쇄-링커에 의해 연결해, EGFR 에 결합하는 단일쇄 Fv (scFv) 를 수득했는데, 이는 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 경쇄 또는 중쇄의 N- 또는 C-말단에서의 다양한 위치에 결합된다. 추가로, 시스테인 잔기가, 선행기술 (예를 들어, WO 94/029350; Reiter, Y., 등, Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Young, N., M., 등, FEBS Letters Vol. 377 (1995) 135-139; 또는 Rajagopal, V., et al, Protein Engineering Vol. 10 1453-59 (1997)) 에 기재된 바와 같이 EGFR 에 결합하는 scFv 의 VH (Kabat 위치 44 포함) 및 VL (Kabat 위치 100 포함) 에서의 다양한 위치에 도입되었다. 후속하여, 단백질 발현 안정성 및 생물학적 활성을 평가했다. 추가로, <IGF1R> 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 및 EGFR 에 결합하는 scFv 사이의 (글리신4-세린)n-포함 펩티드-링커 길이를 다양하게 했다. 또한, EGFR 에 결합하는 단일쇄 Fv 모듈의 통합 부분인 글리신4-세린 (G₄S) 단일쇄-링커의 길이를 다양하게 했다. 이러한 모든 분자들은 재조합적으로 제조하고, 정제하고 특징분석했다. 4 가의 이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체를 만들기 위해 적용된 모든 이중특이적 항체 디자인의 개요는 표 1 및 2 에 제시한다. 이러한 연구를 위해, EGFR 및 IGF1R 를 동시에 인식하고, EGFR 또는 IGF1R 중 하나에 특이적으로 결합하는 전장 항체를 포함하고; 두 scFv 절편이 EGFR 또는 IGF1R 의 나머지 하나에 특이적으로 결합하는 각종 단백질 독립체 (entity) 를 기술하기 위해 용어 'XGFR' 를 이용했다.

표 1 - N- 및 C- 말단 scFv 결합이 있는 상이한 이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체 포맷들 및 해당하는 XGFR1-명명법 및 XGFR2-명명법.

XGFR1 포맷들에서는, a) 인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 및 b) 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 의 중쇄 (HC) 또는 경쇄 (LC) 의 동일한 말단 (C- 또는 N-말단) 에 연결되어 있는, 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (L) 으로부터 유도된 EGFR 에 결합하는 2 개의 단일쇄 Fv (scFv) 를 근간으로 한다.

XGFR2 포맷들에서는, a) 인간화된 래트 항-EGFR 항체 ICR62 의 가변 영역 VH (서열 식별 번호: 8) 및 VL (서열 식별 번호: 10) 및 b) 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 의 인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) VH (서열 식별 번호: 23) 및 VL (서열 식별 번호: 25) 에 결합하는 2 개의 단일쇄 Fv (scFv) 를 근간으로 한다.

표에서의 "-" 는 "존재하지 않음" 을 의미한다.

표 2 - 가변 단일쇄-링커 및 펩티드-링커 길이를 가진 XGFR1 이중특이적 항체. 표에서 "-" 는 "존재하지 않음" 을 의미한다.

실시예 1 내지 8 은 scFv 결합이 있는 4 가 XGFR1 및 XGFR2 분자에 관한 것이다.

B) 단일쇄 Fab ( scFab ) 결합이 있는 4 가, 이중특이적 < EGFR - IGF -1R> 항체의 디자인 ( scFab - XGFR1 및 scFab - XGFR2 명명법)

용어 scFab-XGFR 은 EGFR 및 IGF1R 을 동시에 인식하고, EGFR 또는 IGF1R 중 하나에 특이적으로 결합하는 전장 항체를 포함하고; EGFR 또는 IGF1R 중 나머지 하나에 특이적으로 결합하는 2 개의 scFab 분절을 포함하는 각종 단백질 독립체를 기술하기 위해 이용된다.

하기에서, 본 발명의 한 구현예로서 제 1 항체 (IGF-1R 또는 EGFR) 에 결합하는 전장 항체를, 펩티드 커넥터를 통해 연결된 제 2 의 상이한 항원 (IGF-1R 또는 EGFR 중 나머지 하나) 에 결합하는 2 개의 단일쇄 Fab 절편과 함께 (중쇄의 2 개 C-말단 또는 경쇄의 2 개 C-말단의 두 단일쇄 Fab 절편 모두) 포함하는 4 가 이중특이적 항체가 예시된다. 상기 단일쇄 Fab 절편 내 항체 도메인 및 링커는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 다음과 같이 나타낸다: VL-CL-링커-VH-CH1.

<IGF-1R> 항원 결합 부위에 대한 중쇄 가변 도메인 VH 로서, 서열 식별 번호: 23 이 사용되었다. <IGF-1R> 항원 결합 부위에 대한 경쇄 가변 도메인 VL 로서, 서열 식별 번호: 25 가 사용되었다.

<EGFR> 항원 결합 부위에 대한 중쇄 가변 도메인 VH 로서, 서열 식별 번호: 8 가 사용되었다. <EGFR> 항원 결합 부위에 대한 경쇄 가변 도메인 VL 로서, 서열 식별 번호: 10 이 사용되었다.

유전자 합성 및 재조합 분자 생물학 기법에 의해, 각각의 항원 결합 부위의 VH 및 VL 를 포함하는 VL-CL 및 VH-CH1 는 글리신 세린 (G4S)nGm 링커에 의해 연결되어, 단일쇄 Fab 절편 VL-CL-링커-VH-CH1 를 수득하는데, 이는 (G4S)n 펩티드 커넥터를 이용해 항체 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 결합되었다.

선택적으로는, 선행 기술 (예를 들어, WO 94/029350; Reiter, Y., 등, Nature biotechnology (1996) 1239-1245; Young, N.M., et al, FEBS Letters (1995) 135-139; 또는 Rajagopal, V., et al, Protein Engineering (1997) 1453- 59) 에 기재된 기법에 따라, 단일쇄 Fab 절편의 VH (Kabat 위치 44 포함) 및 VL (Kabat 위치 100 포함) 도메인 내에 시스테인 잔기가 도입된다.

모든 이들 분자들은 재조합적으로 제조되고, 정제되고 특징분석되었으며, 단백질 발현, 안정성 및 생물학적 활성을 평가했다.

이중특이적 scFab <EGFR-IGF-1R>, <IGF-1R-EGFR> 항체를 만들기 위해 적용된 항체 디자인의 개요가 표 3 에 제공된다. 상기 연구를 위해, 다양한 4 가 단백질 독립체를 기술하기 위한 용어 'scFab-Ab' 를 이용했다. 디자인된 포맷의 대표적인 것을 도 13 및 14 에 제시했으며, 표 3 에 열거했다.

표 3 - C- 말단 단일쇄 Fab 절편 결합이 있는 상이한 이중특이적 항-IGF1R 및 항-EGFR scFab-4 가 항체들 및 해당하는 scFab-Ab-명명법.

실시예 9 내지 13 은 단일쇄 Fab 결합이 있는 4 가 scFab-XGFR1 및 scFab-XGFR2 분자를 지칭한다.

재료 및 일반적 방법

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적 정보가 하기에 주어진다: Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,+ MD (1991). EU 번호매김 (EU numbering) 에 따라 항체 사슬의 아미노산에 번호가 매겨지고 지칭된다 (Edelman, G.M., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

재조합 DNA 기술

[Sambrook, J. 등, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재되는 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA 를 취급하였다. 제조사의 지시 사항에 따라 분자 생물학 시약을 사용하였다.

유전자 합성

바람직한 유전자 조각을 화학 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단수 제한 엔도뉴클레아제 분할 위치에 의해 플랭킹된 600~1800 bp 길이의 유전자 조각을, PCR 증폭을 비롯한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션에 의해 어셈블링한 후, 표시된 제한 위치, 예를 들어 BamHI/BstEII, BamHI/BsiWI, BstEII/NotI 또는 BstWI/NotI 을 통해 pUC 클로닝 벡터에 기초를 둔 pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 절편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 유전자 합성 절편은 Geneart (Regensburg, Germany)에서 제시된 설명서에 따라 주문하였다.

DNA 서열 결정

DNA 서열을 Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany)에서 수행된 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.

DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리

GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 Infomax's Vector NT1 Advance 슈트 버전 8.0을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 및 도시에 사용하였다.

세포 배양 기술

[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. 및 Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 기재되는 바와 같은 표준 세포 배양 기술을 사용하였다.

HEK293F 세포에서의 면역글로불린 변이체의 일시적 발현

이중특이적 항체는 제조사의 지시사항 (Invitrogen, USA) 에 따라 FreeStyle™ 293 Expression System 을 이용하여 인간 태아 신장 293-F 세포의 일시적 트랜스펙션으로 발현시켰다. 간략하게, 현탁액 FreeStyle™ 293-F 세포를 37℃/8 % CO₂ 에서 FreeStyle™ 293 발현 배지에서 배양하고, 트랜스펙션 당일 ml 당 1 내지 2 ×10⁶ 의 살아있는 세포의 밀도로 새로운 배지에 세포를 시딩했다. DNA-293fectin™ 복합체는, 250 ml 의 최종 트랜스펙션 부피에 대해 333 μl 의 293fectin™ (Invitrogen, Germany) 및 250 μg 의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1 몰비로 이용하여 Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen, USA) 에서 제조했다. 세포 배양 상청액을 포함하는 이중특이적 항체는 트랜스펙션 7 일 후, 14000 g 에서의 30 분 동안의 원심분리 및 멸균 필터 (0.22 μm) 를 통한 여과에 의해 정화했다. 상청액을 정제할 때까지 -20℃ 에서 저장했다.

단백질 측정

[Pace 등., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423] 에 따라 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 백그라운드 보정으로서 320 nm 에서 OD 를 측정함과 함께, 280 nm에서의 흡광도 (OD)를 측정함으로써, 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 측정하였다.

상청액 중의 항체 농도 측정

세포 배양 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 친화성 HPLC 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정하였다. 간략하게는, 단백질 A에 결합하는 항체 및 유도체를 함유하는 세포 배양 상청액을 200 mM KH₂PO₄, 100 mM 나트륨 시트레이트 (pH 7.4) 중의 Applied Biosystems Poros A/20 컬럼에 적용하고, UltiMate 30000 HPLC 시스템 (Dionex) 상의 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산 (pH 2.5)으로 매트릭스로부터 용출하였다. 용출된 단백질을 UV 흡수 및 피크 영역 적분에 의해 정량화하였다. 정제된 표준 IgG1 항체는 표준으로서 역할하였다.

단백질 정제

분비된 항체는 Protein A-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden) 를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피에 의해 2 개 단계에서 상청액으로부터 정제했다. 간략하게, 정화된 배양 상청액을 포함하는 이중특이적 및 삼중특이적 항체를 PBS 완충액 (10 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화된 HiTrap ProteinA HP (5 ml) 컬럼에 적용했다. 미결합 단백질을 평형화 완충액을 이용해 세척해냈다. 이중특이적 항체를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 2.8 를 이용해 용출하고, 분획을 포함하는 단백질을 0.1 ml 1 M Tris, pH 8.5 로 중화했다. 이어서, 용출된 단백질 분획을 모으고, Amicon Ultra 원심분리 필터 장치 (MWCO: 30 K, Millipore) 를 이용해 3 ml 의 부피로 농축하고, 2O mM Histidin, 140 mM NaCl, pH 6.0 로 평형화시킨 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 에 로오딩했다. 단량체성 항체 분획을 모으고, 급속냉동시키고, -80℃ 에서 저장했다. 시료들 중 일부는 후속 분석 및 특징분석을 위해 제공되었다.

정제된 단백질의 분석

정제된 단백질 시료의 단백질 농도는 아미노산 서열을 근거로 계산된 몰 흡광계수를 이용해, 280 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 를 측정해 결정했다. 이중특이적 항체의 순도는 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마씨 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 로 염색하여 SDS-PAGE 로 분석했다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 을 제조사의 지시에 따라 이용했다 (4 내지 20% 트리스-글리신 겔). 이중특이적 항체 시료의 응집물 함량은 200 mM KH₂PO₄, 250 mM KCl, pH 7.0 전개 완충액 중에서 25℃ 에서 Superdex 200 분석용 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 이용해 UltiMate 3000 HPLC system (Dionex) 상에서 고성능 SEC 에 의해 분석했다. 25 μg 단백질을 0.5 ml/분의 유속으로 컬럼에 주입하고, 50 분에 걸쳐 등용매용출했다. 안정성 분석을 위해, 농도 0.1 mg/ml, 1 mg/ml 및 3 mg/ml 의 정제된 단백질을 제조하고, 4℃, 37℃ 에서 7 일 동안 인큐베이션한 후, 고성능 SEC 로 평가했다. 환원된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 백본의 통합성은, Peptide-N-Glycosidase F (Roche Molecular Biochemicals) 를 이용한 효소 처리로 N-글리칸을 제거한 후 NanoElectrospray Q-TOF 질량 분광계로 밝혀냈다.

실시예 1

이중특이적 < EGFR - IGF1R > 항체 XGFR1 분자의 발현 및 정제

해당하는 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 원핵- 및 진핵성 선별 마커를 보유하는 발현 벡터에서 구축했다. 이들 플라스미드를 대장균 (E.coli) 에서 증폭시키고, 정제하고, 후속하여 HEK293F 세포 (Invitrogen 의 프리스타일 시스템 (freesyle system) 이용) 에서의 재조합 단백질의 일시적 발현을 위해 트랜스펙션했다. 7 일 후, HEK 293 세포 상청액을 수합하고, 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제했다. 모든 이중특이적 항체 구축물의 동질성을 비-환원 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE 로 확인했다. 환원 조건 하에 (도 2a), C- 및 N-말단 scFv 융합체를 보유하는 폴리펩티드 사슬은 SDS-PAGE 시, 계산한 분자량과 유사한 분명한 분자 크기를 나타냈다. 모든 구축물의 발현 수준은 단백질 A HPLC 로 분석했고, '표준' IgG 의 발현 수율과 유사하거나 또는 일부의 경우 약간 더 낮았다. 평균 단백질 수율은, 상기 비-최적화 일시적 발현 실험에서의 세포-배양 상청액 리터 당 1 내지 36 mg 의 정제된 단백질이었다 (도 3). 경쇄 (XGFR-4320) 또는 중쇄 (XGFR-2320) 에서 C-말단 융합된 scFvs 가 있는 비-디설파이드 안정화 구축물은, 단백질 A 정제 후, N-말단 결합된 scFvs (XGFR1-3320 및 XGFR1-5320) 보다도 더 많은 양의 원하는 크기의 회수된 단백질을 나타냈다.

정제된 단백질의 HP-크기 배제 크로마토그래피 분석 ('정상' IgG 와 비교) 에서, VH 및 VL 사이의 사슬내 디설파이드에 의해 안정화되지 않는 scFvs 를 포함하는 분자들에 대해 응집하는 약간의 경향성이 있었다. 상기 이중특이적 항체의 응집 문제를 다루기 위해, scFv 부분의 디설파이드-안정화를 적용했다. 이를 위해, 정해진 위치 (Kabat 번호매김 제도에 따른 위치 VH44/VL100) 에서 scFv 의 VH 및 VL 내 단일 시스테인 대체물을 도입했다. 이들 돌연변이는 VH 및 VL 사이의 안정한 사슬간 디설파이드의 형성을 가능케 하여, 이후 결과로서 수득되는 디설파이드-안정화 scFv 모듈을 안정화시킨다. Fv 의 N- 및 C-말단에서의 scFvs 으로의 VH44/VL100 디설파이드의 도입은 모든 구축물에 있어서 단백질 발현 수준의 개선을 유도한다 (도 4 참고).

이중특이적 항체는 제조사의 지시사항 (Invitrogen, USA) 에 따라 FreeStyle™ 293 Expression System 을 이용하여 인간 태아 신장 293-F 세포의 일시적 트랜스펙션으로 발현시켰다. 간략하게, 현탁액 FreeStyle™ 293-F 세포를 37℃/8 % CO₂ 에서 FreeStyle™ 293 발현 배지에서 배양하고, 트랜스펙션 당일 ml 당 1 내지 2 ×10⁶ 살아있는 세포의 밀도로 새로운 배지에 세포를 시딩했다. DNA-293fectin™ 복합체는, 250 ml 의 최종 트랜스펙션 부피에 대해 333 μl 의 293fectin™ (Invitrogen, Germany) 및 250 μg 의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1 몰비로 이용하여 Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen, USA) 에서 제조했다. 세포 배양 상청액을 포함하는 이중특이적 항체는 트랜스펙션 7 일 후, 14000 g 에서의 30 분 동안의 원심분리 및 멸균 필터 (0.22 μm) 를 통한 여과에 의해 정화했다. 상청액을 정제할 때까지 -20℃ 에서 저장했다.

정제 후, XGFR1-2320 는 최종 수율이 0.27 mg 였고, XGFR1-2321 는 최종 수율이 13.8 mg 였다.

이중특이적 항체의 예시 SDS-PAGE 및 HP-크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 정제 및 분석을 도 3 및 도 4 에 제시한다.

실시예 2

이중특이적 < EGFR - IGF1R > 항체 XGFR1 분자의 시험관내 안정성

HP-크기 배제 크로마토그래피 분석을 수행했다.

이중특이적 항체 시료의 응집물 함량은 200 mM KH₂PO₄, 250 mM KCl, pH 7.0 전개 완충액 중에서 25℃ 에서 Superdex 200 분석용 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 이용해 UltiMate 3000 HPLC system (Dionex) 상에서 고성능 SEC 에 의해 분석했다. 25 μg 단백질을 0.5 ml/분의 유속으로 컬럼에 주입하고, 50 분에 걸쳐 등용매용출했다. 안정성 분석을 위해, 농도 0.1 mg/ml, 1 mg/ml 및 5 mg/ml 의 정제된 단백질을 제조하고, 4℃, 37℃ 및 40℃ 에서 7 일 또는 28 일 동안 인큐베이션한 후, 고성능 SEC 로 평가했다. 환원된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 백본의 통합성은, Peptide-N-Glycosidase F (Roche Molecular Biochemicals) 를 이용한 효소 처리로 N-글리칸을 제거한 후 NanoElectrospray Q-TOF 질량 분광계로 밝혀냈다.

상이한 조건 (농도 및 시간을 달리 함) 하 정제된 단백질의 HP-크기 배제 크로마토그래피 분석은, scFvs 를 포함하는 분자들에 응집하려는 - 정상 IgG 에 비해- 크게 증대된 경향성을 나타냈다.

이러한 작업을 위해, 중쇄 및 경쇄의 2 개 헤테로다이머로 이루어진, 이들 중 하나에 연결된 scFvs 을 가진 원하는 "단량체성" 분자를 정의했다.

비개질 scFvs 를 포함한 독립체 (entity) 의 강항 응집 성향과는 대조적으로, VH44/VL100 디설파이드 안정화 구축물의 HP 크기 배제 분석은 응집에 대한 훨씬 덜한 경향성을 보여줬다.

이중특이적 항체의 예시 HP-크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 정제 및 분석은 도 4 에 제시된다.

실시예 3

RTK EGFR 및 IGF1R 에 대한 이중특이적 < EGFR - IGF1R > 항체 XGFR1 분자의 동시적인 결합

상이한 이중특이적 항체 포맷의 IgG-모듈 내 보유된 scFv 모듈 및 Fvs 의 결합을 결합 모듈 및 이중특이적 항체가 유도된 '야생형' IgG 의 결합과 비교했다. 상기 분석은 Surface Plasmon Resonance (Biacore) 및 세포-ELISA 를 적용하여 수행했다.

이중특이적 항-IGF-1R/항체-EGFR 항체의 결합 특성을 Biacore T1OO 기기 (Biacore AB, Uppsla) 를 이용한 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기법으로 분석했다. 상기 시스템은 분자 상호작용 연구용으로 확고하게 확립되어 있다. 이는 리간드/분석물 결합의 연속적인 실시간 모니터링을 가능케 하여, 각종 검정 설정에서의 회합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd), 및 평형 상수 (KD) 의 결정을 가능케 한다. SPR-기법은 금으로 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 대한 굴절률 측정값을 근거로 한다. 굴절률에서의 차이는 용액 내 고정된 리간드와 주입된 분석물의 상호작용에 의해 야기되는 표면 상의 질량 변화를 가리킨다. 분자들이 표면에 고정된 리간드와 결합하는 경우, 질량은 증가하고, 해리하는 경우 질량은 감소한다.

포획 항-인간 IgG 항체는 아민-커플링 화학을 이용해 CM5 바이오센서칩의 표면에 고정되었다. 유동 세포는 0.1 M N-히드록시숙신이미드 및 0.1 M 3-(N,N- 디메틸아미노)프로필-N-에틸카르보디이미드의 1:1 혼합물을 이용해 5 μl/분의 유속으로 활성화되었다. 항-인간 IgG 항체를 나트륨 아세테이트, pH 5.0 에 10 μg/ml 로 주입했고, 이는 약 12000 RU 의 표면 밀도를 결과로서 제공했다. 기준 대조군 유동 세포는, 포획 항체 대신 비히클 완충액을 사용한 것을 제외하고는, 동일하게 처리했다. 표면은 1 M 에탄올아민/HCl pH 8.5 의 주입으로 블로킹했다. 이중특이적 항체는 HBS-P 중에 희석하고, 유속 5 μl/분으로 주입했다. 접촉 시간 (회합기) 은, EGFR-ECD 결합에 대한 1 내지 5 nM 및, IGF-1R 상호작용에 대한 20 nM 사이의 농도에서 항체에 대해 1 분이었다. EGFR-ECD 는 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 nM 으로 농도를 증가시키면서 주입했고, IGF-1R 는 0.21, 0.62, 1.85, 5.6, 16.7 및 50 nM 의 농도로 주입했다. 두 분자에 대해 유속 30 μl/분에서 접촉 시간 (회합기) 은 3 분이었고, 해리 시간 (전개 완충액으로 세척) 은 5 분이었다. 모든 상호작용은 25℃ (표준 온도) 에서 수행했다. 3 M 마그네슘 클로라이드의 재생 용액을 60 s 동안 5 μl/분의 유속으로 주입하여, 각각의 결합 싸이클 후 임의의 비-공유적 결합 단백질을 제거했다. 시그널은 초 당 1 개 시그널의 속도로 검출되었다. 시료는 농도를 증가시키며 주입했다.

이중특이적 항체의 EGFR 및 IGF1R 에 대한 예시적인 동시 결합을 도 5 에 제시한다.

표 4 - EGFR 및 IGF-1R 에 대한 이중특이적 항체 (XGFR -명명법) 의 친화성 (KD)

실시예 4

이중특이적 < EGFR - IGF1R > 항체 XGFR1 분자에 의한 EGFR - 및 IGF1R - 의 하향 조절

인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 은 IGFR1-신호전달을 억제하고, 인간화된 래트 항체-EGFR 항체 <EGFR>ICR62 는 EGFR 에 의한 신호전달을 억제한다. 상이한 XGFR1 변이체들의 잠재적인 억제 활성을 평가하기 위해, 두가지로부터의 수용체의 하향조절 정도를 분석했다.

본 발명의 항체의 종양 세포 내 IGF-I 수용체 (IGF-1R) 의 양에 대한 유효성을 검출하기 위해, IGF-1R 및 EGFR 특이적 항체를 이용한 타임-코스 (time-course) 실험 및 후속 ELISA 분석을 수행했다.

1 개의 6 웰 플레이트에 1% PenStrep 를 보충한 RPMI-VM 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 중의 인간 종양 세포 (A549, 2 x 10⁵ 세포/ml) 를 준비하고, 각 실험에 대해 각각의 배지 내에 4 ml 세포를 접종하고, 24 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다.

배지를 조심스럽게 제거하고 RPMI-VM 배지에 희석시킨 2 ml 의 0.01 mg/ml XGFR 항체로 교체했다. 3 개의 대조군 웰에서, 배지는 항체가 없는 배지, 대조군 항체 (<IGF-1R> HUMAB Clone 18 및 <EGFR>ICR62 최종 농도 0.01 mg/ml) 가 있는 배지로 대체하고, 1 개의 웰은 오직 완충액만을 포함했다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양하고, 24 시간 후 개별 플레이트를 추가 프로세싱을 위해 취했다.

배지를 조심스럽게 흡출시켜 제거하고, 세포를 1 ml PBS 로 세척했다. 300 μl/웰의 차가운 MES-용해 완충액을 첨가했다 (MES, 10 mM Na₃VO₄, 및 Complete® 프로테아제 억제제). 세포를 세포 주걱 (Corning, Cat. No. 3010) 을 이용해 떼어내고, 웰 내용물을 에펜도르프 (Eppendorf) 시험관으로 옮겼다. 세포 절편들을 10 분 동안 13000 rpm 에서의 4℃ 에서의 원심분리로 제거했다.

EGFR 검출

96 웰 스트렙타비딘 마이크로플레이트 (MTP) 를 프로토콜 (인간 EGFR 를 위한 DuoSet ELISA, RnD systems Cat. No. DY231) 에 따라 준비했다. PBS 중의 인간 EGFR 염소 항체 144 μg/ml 를 PBS 로 1:180 로 희석하고, 100 μl/웰을 MTP 에 첨가했다. MTP 를 밤새 진탕하면서 4℃ 에서 인큐베이션했다. 플레이트를 0.1% Tween®20 를 보충한 PBS 로 3 회 세척하고, 300μl/웰의 PBS, 3% BSA 및 0.1% Tween®20 용액을 이용해 1 시간 동안 실온 (RT) 에서 진탕과 함께 블로킹시켰다. 플레이트를 0.1% Tween®20 를 보충한 PBS 를 이용해 3 회 세척했다.

세포 용해물 내 단백질의 양을 BCA Protein Assay 키트 (Pierce) 를 이용해 측정하고, 이어서 세포 용해물을 100 mM Na₃VO₄ 1:100 및 Complete® 프로테아제 억제제 1:20 를 보충한 MES-세포용해 완충액을 이용해 0.1 mg/ml 의 단백질 농도로 조정하고, 웰 당 100 μl 의 용해물을 미리 준비한 MTP 에 첨가했다.

두번째 세포 용해물 농축물은 0.05 mg/ml 로 사용했고, 상기 세포 용해물을 1:2 로 희석했고, 웰 당 100 μl 를 미리 준비한 MTP 에 첨가했다. MTP 는 2 시간 더 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션하고, 이어서 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 3 회 세척했다.

EGFR 에 대한 검출 항체는 PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 중에 1:180 로 희석한 농도 36 μg/ml 의 인간 EGFR 염소 바이오틴화된 항체였다. 웰 당 100 μl 를 첨가하고, RT 에서 2 시간 동안 진탕과 함께 인큐베이션했다. 이어서, MTP 를 웰 당 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 200 μl 로 세척했다. 이어서, PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 중에 1:200 로 희석한 2 차 항체 스트렙타비딘-HRP 를 웰 당 100 μl 씩 첨가하고, 진탕과 함께 20 분 동안 RT 에서 인큐베이션했다. 이어서, 플레이트를 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 6 회 세척했다. 웰 당 100 μl 의 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘 (Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581) 을 첨가하고, 20 분 동안 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션했다. 웰 당 25 μl 의 1 M H₂SO₄ 를 첨가하고 5 분 더 RT 에서 인큐베이션하여 컬러 반응을 중단시켰다. 흡광도를 450 nm 에서 측정했다.

IGF -1R 검출

스트렙타비딘-MTP (Roche ID. No.: 11965891001) 은, 웰 당 100 μl 의, PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 에 1:200 로 희석한 항체 AKla-Biotinylated (Genmab, Denmark) 를 첨가하여 제조했다. 스트렙타비딘-MTP 를 1 시간 동안 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션한 후, 웰 당 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 200 μl 로 3 회 세척했다.

세포 용해물 내 단백질의 양은 BCA Protein Assay kit (Pierce) 를 이용해 측정하고, 이어서 세포 용해물은 5O mM Tris pH 7.4, 100 mM Na₃VO₄ 1:100 및 Complete® 프로테아제 억제제 1 :20 를 이용해 0.04 mg/ml 의 단백질 농도로 조정하고, 웰 당 100 μl 의 세포 용해물을 미리 준비한 스트렙타비딘-MTP 에 첨가했다.

제 2 세포 용해물 농축물은 0.02 mg/ml 로 사용했고, 상기 용해물은 희석물이었고, 웰 당 100 μl 를 미리 준비한 스트렙타비딘-MTP 에 첨가했다. 비자극 세포를 포함하는 포지티브 대조군을 5OmM 트리스 pH 7.4, 100 mM Na₃VO₄ 1 :100 및 Complete® 프로테아제 억제제 1:20 를 보충한 세포용해 완충액에 1:4000 로 희석하고, 웰 당 100 μl 의 세포용해물을 미리 제조한 스트렙타비딘-MTP 에 첨가했다. 네거티브 대조군에 대해, 세포용해 완충액 100 μl 을 스트렙타비딘-MTP 중의 각 웰에 첨가했다.

MTP 를 1 시간 더 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션시킨 후, 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 3 회 세척했다.

IGF-1R 에 대한 검출 항체는 PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 중에 1:750 희석된 인간 IGF-1Rβ 토끼 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. sc-713) 였다. 웰 당 100 μl 를 첨가하고, RT 에서 1 시간 동안 진탕과 함께 인큐베이션했다. 이어서, MTP 를 웰 당 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 200 μl 로 3 회 세척했다. PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 중에 2 차 항체 토끼 IgG-POD (Cell signaling Cat. No. 7074) 를 1:4000 로 희석하고, 웰 당 100 μl 를 첨가하고, 진탕과 함께 1 시간 동안 RT 에서 인큐베이션했다. 이어서, 플레이트를 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 6 회 세척했다. 웰 당 100 μl 의 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘 (Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581) 을 첨가하고, 20 분 동안 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션했다. 웰 당 25 μl 의 1 M H₂SO₄ 를 첨가하고 5 분 더 RT 에서 인큐베이션하여 컬러 반응을 중단시켰다. 흡광도를 450 nm 에서 측정했다.

A549 세포에서 부모 단일특이적 항체 <EGFR>ICR62 및 <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 과 비교한 이중특이적 항체 XGFR 에 의한 수용체 하향조절 검출 결과를 도 12 에 나타냈다. 이중특이적 항체 XGFR 는 EGFR- 및 IGF1R 를 둘다 하향조절했다. 놀랍게도, 이중특이적 항체 XGFR 은, 부모 <EGFR>ICR62 항체에 비해 개선된 하향조절 EGFR 를 나타냈다.

실시예 5

이중특이적 < EGFR - IGF1R > 항체 XGFR1 분자에 의한 EGFR - 및 IGF1R -신호전달 경로의 억제

인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 은 IGFR1-신호전달을 억제하고, 인간화된 래트 항체-EGFR 항체 ICR62 는 EGFR 에 의한 신호전달을 억제한다. 상이한 XGFR1 변이체의 잠재적인 활성을 평가하기 위해, 두 경로 모두에 대한 신호전달의 억제 정도를 분석했다.

1 개의 6 웰 플레이트에서 1% PenStrep 를 보충한 RPMI 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 중의 인간 종양 세포 (H322M, 2 x 10⁵ 세포/ml) 를 준비하고, 각 실험에 대해 각각의 배지에 4 ml 세포를 접종하고, 24 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다.

배지를 조심스럽게 제거하고, RPMI-VM 배지에 희석시킨 2 ml 의 0.01 mg/ml XGFR 항체로 교체했다. 3 개의 대조군 웰에서, 배지는 항체가 없는 배지 또는 대조군 항체 (<IGF-1R> HUMAB Clone 18 및 <EGFR>ICR62 최종 농도 0.01 mg/ml) 가 있는배지로 대체하고, 1 개 웰은 오직 완충액만 포함하게 했다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 에서 인큐베이션하고, 개별 플레이트는 24 시간 후 추가 프로세싱을 위해 취했다.

EGFR 인산화 검출

DuoSet® IC Human phospho-EGF R, RnD systems Cat. No. DYC1095-5 을 이용했다. 플레이트는 Phospho EGF R 포획 항체 (Cat. No. 841402) 를 농도 0.8 μg/ml 로 희석하여 제조했다. 웰 당 100 μl 의 MTP 를 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밤새 RT 에서 인큐베이션했다.

이어서, 포획 항체를 흡출시키고, 깨끗한 종이 타월 위에 최종 워시 블롯 (wash blot) 후, 각 웰을 400 μl 세척 완충액 (PBS pH 7.2-7.4 중 0.05% Tween®20 Cat No. WA126) 으로 5 회 세척했다.

플레이트는 300 μl 의 블로킹 완충액 (PBS pH 7.2-7.4 중 1% BSA, 0.05% NaN₃) 을 첨가하고, RT 에서 2 시간 동안 인큐베이션하여 블로킹했다. 이어서, 용액을 흡출시키고, 깨끗한 종이 타월 위에 최종 워시 블롯 후, 각 웰을 400 μl 세척 완충액 (PBS pH 7.2-7.4 중 0.05% Tween®20 Cat No. WA126) 으로 5 회 세척했다.

세포를 PBS 에서 헹구고, 용해 완충액 9 (1% NP-40, 2OmM Tris pH8.0, 137mM NaCl, 10% Glycerol, 2mM EDTA, 1 mM 활성화된 나트륨 오르토바나데이트, 10 μg/ml Aprotinin 및 10 μg/ml Leupeptin) 을 이용해 세포 밀도 1 x10⁷ 세포/ml 로 용해시키고, 약한 진탕과 함께 4℃ 에서 30 분간 인큐베이션했다. 이어서, 시료를 14,00Og 에서 5 분간 원심분리했다. 이어서, 시료를 깨끗한 시험관으로 옮겼다.

세포 용해물 내 단백질의 양은 BCA Protein Assay 키트 (Pierce) 로 측정하고, 이어서 세포 용해물은 IC Diluent 12 (1% NP-40, 2OmM Tris pH8.0, 137 mM NaCl, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, 1 mM 활성화된 나트륨 오르토바나데이트) 를 이용해 단백질 농도 0.1 mg/ml 및 0.05 mg/ml 로 조정했다. 웰 당 100 μl 의 세포 용해물을 미리 준비한 MTP 에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 2 시간 동안 RT 에서 인큐베이션했다.

사용 직전, 검출 항체를 바이알에 써 있는 IC Diluent 14 (2O mM Tris, 137 mM NaCl, 0.05% Tween®20, 0.1% BSA, pH 7.2-7.4) 중 워킹 농도로 희석했다. 100 μl 의 검출 항체를 웰마다 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 RT 에서 2 시간 동안 암실에서 인큐베이션했다. 이어서, 검출 항체를 흡출시키고, 깨끗한 종이 타월 위에 최종 워시 블롯 (wash blot) 후, 각 웰을 400 μl 세척 완충액 (PBS pH 7.2-7.4 중 0.05% Tween®20 Cat No. WA126) 으로 5 회 세척했다.

100 μl 의 기질 용액 (Cat. No. DY999) 을 웰마다 첨가하고, 플레이트를 암실에서 20 분간 더 인큐베이션했다. 50 μl 의 정지 용액 2N H₂SO₄ (Cat No. DY994) 를 첨가하고, 완전히 혼합하여 반응을 중단시켰다.

450 nm 에서의 흡광도를 측정했다.

IGF -1R 인산화 검출

스트렙타비딘-MTP (Roche ID. No.: 11965891001) 은, PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 중에 1:200 로 희석한 항체 AKla-Biotinylated (Genmab, Denmark) 를 웰마다 100 μl 씩 첨가하여 제조했다. 상기 스트렙타비딘-MTP 를 1 시간 동안 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션한 후, 웰마다 0.1 % Tween®20 용액에 있는 PBS 200 μl 로 3 회 세척했다 .

세포 용해물 내 단백질의 양은 BCA Protein Assay 키트 (Pierce) 를 이용해 측정하고, 이어서 세포 용해물은 5OmM Tris pH 7.4, 100 mM Na₃VO₄ 1 :100 및 Complete® 프로테아제 억제제 1 :20 을 이용하여 단백질 농도 1 μM 로 조정하고, 웰 당 100 μl 의 용해물을 미리 제조한 스트렙타비딘-MTP 에 첨가했다.

비자극 세포를 포함하는 포지티브 대조군은 5O mM Tris pH 7.4, 100 mM Na₃VO₄ 1:100 및 Complete® 프로테아제 억제제 1:20 를 보충한 용해 완충액 중에 1:4000 으로 희석하고, 웰 당 100 μl 의 용해물을 미리 제조한 스트렙타비딘-MTP 에 첨가했다. 네거티브 대조군으로, 100 μl 용해 완충액을 스트렙타비딘-MTP 이 있는 웰에 첨가했다.

MTP 는 1 시간 더 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션한 후, 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 3 회 세척했다.

IGF-1R 에 대한 검출 항체는 PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 중에 1:500 으로 희석한 인간 IGF-1R (Tyrl 135/1136)/인슐린 수용체 베타 (Tyrl 150/1151)(19H7) 항체 (Cell signalling, Cat. No. 3024L) 였다. 웰 당 100 μl 를 첨가하고, RT 에서 1 시간 동안 진탕과 함께 인큐베이션했다. 이어서, MTP 를 웰 당 200 μl 의 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 3 회 세척했다. 이어서, 2 차 항체인, PBS, 3%BSA 및 0.2% Tween®20 중 1:4000 로 희석된 토끼 IgG-POD (Cell signalling Cat. No. 7074) 를 웰 당 100 μl 첨가하고, 진탕과 함께 1 시간 동안 RT 에서 인큐베이션했다. 이어서, 플레이트를 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 6 회 세척했다. 웰 당 100 μl 의 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘 (Roche, BM-Blue ID-No.: 11484581) 을 첨가하고, 20 분 동안 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션했다. 웰 당 25 μl 의 1 M H₂SO₄ 를 첨가하고 5 분 더 RT 에서 인큐베이션하여 컬러 반응을 중단시켰다. 흡광도를 450 nm 에서 측정했다.

도 7a 및 7b 은 <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 의 적용이 IGFR1-신호전달 검정에서 특이적인 인산화 시그널을 강력하게 감소시키나, EGFR-신호전달을 측정한 해당 검정에서는 영향력이 없었음을 보여준다. 역으로, <EGFR>ICR62 의 적용은 EGFR-신호전달 검정에서 특이적인 인산화 시그널을 감소시키나, IGF1R-신호전달을 측정했던 해당 검정에서는 영향력을 나타내지 않았다. XGFR1 변이체 # 2421, 3421 및 4421 는, 동일한 몰 농도로 동일한 검정에 적용시, 두 검정에서 모두 야생형 항체와 동일하거나 또는 더 나은 활성을 나타냈다. 따라서, XGFR1 분자는 두 신호전달 경로를 저해할 수 있다.

실시예 6

시험관내 종양 세포주의 XGFR1 - 매개성 성장 억제

인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 은 IGF1R 를 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제한다 (WO 2005/005635).

유사한 방식으로, 인간화된 래트 항체-EGFR 항체 <EGFR>ICR62 는 EGFR 를 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 나타났다 (WO 2006/082515). 종양 세포주의 성장 검정에서의 상이한 XGFR1 변이체의 잠재적인 억제 활성을 평가하기 위해, EGFR 및 IGF1R 를 발현하는 H322M 세포에서의 억제 정도를 분석했다.

플라스틱 표면에 대한 유착을 방지하기 위한 폴리-HEMA (폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트)) 코팅된 디쉬 상에서 0.5% FCS 배지를 보충한 RPMI 1640 에서 H322M 를 배양했다. 이러한 조건 하에, H322M 세포는 3 차원적으로 성장하는 밀집한 회전타원체 (고정-독립성 (anchorage independence) 으로 지칭하는 특성) 를 형성한다. 이러한 회전타원체는 고형 종양 원상태의 3 차원적 세포건축양식 및 조직화와 매우 닮았다. 회전타원체 배양물은 양을 50 또는 100 nM 로부터 증가시킨 항체의 존재 하에 5 일간 인큐베이션했다. 성장 억제 측정에는 WST 변환 검정을 이용했다. H322M 회전타원체 배양물을 <IGF-1R> HUMAB-Clone18 로 처리시, 성장에서의 억제가 관찰될 것이다.

도 8 은, 동일한 검정에서 50 nM <IGF-1R> HUM AB-Clone 18 의 적용이 세포 성장을 53% 감소시키고, 50 nM <EGFR>ICR62 의 적용이 세포 성장을 53% 감소시켰다는 것을 보여준다.

두 항체의 (동일한 농도에서의) 동시적인 적용은 세포 생활성에 있어서의 26% 의 추가적인 감소를 초래했다 (74% 억제). 이는, 두 RTK 경로와의 동시적인 개입이 1 개 경로만 단독으로 개입하는 것에 비해 종양 세포주에 더욱더 큰 영향력을 갖는다는 점을 알려준다.

몰 농도 50 nM 의 각종 XGFR1-변이체의 적용은, 50 nM 농도의 단일한 분자만으로 관찰되는 것보다 더욱 큰 성장 억제를 결과로서 제공한다.

사실, 항체 농도 50 nM 에서의 각종 XGFR1-변이체는, 100 nM 의 (50 nM <IGF-1R> HUMAB-Clone18 및 50 nM <EGFR>ICR62) 의 이중 항체 농도에서, 본래 <EGFR> 및 <IGF1R> 항체의 조합에 비해 개선된 항증식 활성을 나타냈다.

본 발명자는 XGFR1 분자는 EGFR 신호전달 또는 IGF1R 신호전달을 방해하는 IgG 에 비해 현저하게 증가된 성장 억제 활성을 갖는다고 결론지었다. 더욱이, XGFR1 분자의 활성을 <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 및 <EGFR>ICR62 항체의 혼합물의 활성과 비교하면, 상기 혼합물의 것보다 현저히 더 낮은 농도 (몰 농도 및 질량) 에서 동일하거나 또는 더 나은 활성이 달성될 수 있다.

표 5 - H322M 종양 세포에 대한 이중특이적 항체 (XGFR-명명법) 의 항증식 활성 (생존 및 억제).

실시예 7

XGFR1-2421, XGFR1-3421, XGFR1-4421 및 XGFR1-5421 의 당조작 유도체 (XGFR1-2421-GE, XGFR1-3421-GE, XGFR1-4421-GE 및 XGFR1-5421-GE) 의 제조

결과로서 수득한 전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을, MPSV 프로모터 및 합성 폴리 A 부위의 상류의 제어 하, 각각 EBV OriP 서열을 보유하고 있는 포유류 발현 벡터 (하나는 경쇄용, 하나는 중쇄용) 에 서브클로닝했다.

항체는 칼슘 포스페이트-트랜스펙션 접근법을 이용한 포유류 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 이용해 HEK293-EBNA 세포를 공동-트랜스펙션하여 제조했다. 지수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포는 칼슘 포스페이트 방법으로 트랜스펙션했다. 비개질 항체의 제조를 위해, 세포는 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터만으로 1:1 의 비율로 트랜스펙션했다. 당조작 항체의 제조를 위해, 세포는 4 가지 플라스미드를 4:4:1:1 의 비율로 각각 공동-트랜스펙션했는데, 2 가지는 항체 발현용이고, 1 가지는 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현용이고, 1 가지는 만노오시다아제 II 발현용이다. 세포는 10% FCS 를 보충한 DMEM 배양 배지를 이용해 T 플라스크에서 착생 단층 배양으로 배양시켰고, 50 내지 80% 컨플루언트일 때 트랜스펙션했다. T75 플라스크의 트랜스펙션을 위해, 트랜스펙션 24 시간 전에 8 백만개 세포를 FCS (최종적으로는 10% V/V), 250 μg/ml 네오마이신을 보충한 14 ml DMEM 배양 배지에 시딩하고, 세포를 5% CO₂ 분위기의 인큐베이터에서 밤새 37℃ 에 두었다. 트랜스펙션할 각각의 T75 플라스크에 대해, DNA, CaCl₂ 및 물의 용액은, 경쇄 및 중쇄 발현 벡터가 동등하게 있는 47 μg 의 전체 플라스미드 벡터 DNA, 235 μl 의 1 M CaCl₂ 용액을 혼합하고, 물을 첨가하여 최종 부피를 469 μl 로 맞춰 제조했다. 상기 용액에, 469 μl 의 5O mM HEPES, 280 raM NaCl, pH 7.05 인 1.5 mM Na₂HPO₄ 용액을 첨가하고, 즉시 10 초간 혼합하고, 실온에서 20 초간 정치시켰다. 상기 현탁액을 2% FCS 를 보충한 DMEM 12 ml 로 희석하고, 기존 배지 대신에 T75 에 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO₂ 에서 약 17 내지 20 시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 12 ml DMEM, 10% FCS 로 교체했다. 조건화된 배양 배지를 트랜스펙션 5 내지 7 일 후 수합하고, 5 분 동안 1200 rpm 에서 원심분리한 후, 10 분간 4000 rpm 에서 2 차 원심분리하고 4℃ 에서 유지했다.

분비된 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 크로마토그래피, 및 완충액을 포스페이트 완충 식염수로 교환하고 순수한 단량체성 IgG1 항체를 수집하는 Superdex 200 컬럼 (Amersham Pharmacia) 상의 최종적인 크기 배제 크로마토그래피 단계로 정제했다. 항체 농도는 280 nm 에서의 흡광도로부터 분광계를 이용하여 추산했다. 항체는 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 나트륨 클로라이드, pH 6.7 의 100 mM 글리신 용액 중에 제형화했다.

인간화된 항체의 당조작 변이체는 GnT-III 글리코실트랜스퍼라아제 발현 벡터와 함께 또는 GnT-III 발현 벡터 및 골지 (Golgi) 만노시다아제 II 발현 벡터와 함께 항체 발현 벡터를 공동-트랜스펙션하여 제조했다. 비-당조작 항체에 대해 상기 기재한 바와 같이 당조작 항체를 정제하고 제형화했다. 항체의 Fc 영역에 결합된 올리고당은 하기에 기재된 바와 같이 MALDI/TOF-MS 로 분석했다.

올리고당은 PNGaseF 소화에 의해 항체로부터 효소적으로 방출되어, 항체는 PVDF 멤브레인에 고정되어 있거나 또는 용액 중에 있었다.

결과로서 수득한, 방출된 올리고당을 포함하는 소화 용액은 MALDI/TOF-MS 분석용으로 직접 제조되거나 또는 MALDI/TOF-MS 분석용 시료 제조 전에 EndoH 글리코시다아제를 이용해 추가로 소화시켰다.

본 발명에 따른 모든 이중특이적 항체에 대해, GE 는 당조작을 의미한다.

실시예 8

XGFR1 분자의 FcgRIIIa 에 대한 결합 및 ADCC - 컴피턴스

비-당개질 인간화된 래트 항체-EGFR 항체 ICR62 (WO 2006/082515) 는 RTK-매개성 성장 자극 시그널을 방해할 뿐만 아니라, 종양 세포에 대한 ADCC 의 유도에 의해 생장할 정도로 그의 항-종양 활성을 매개한다. 유사한 방식으로, 여타 항체, 예컨대 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 은 또한 ADCC 를 유도할 수 있다. 주어진 항체에 의한 ADCC 매개 정도는 결합되어 있는 항원에 좌우될 뿐만 아니라, ADCC 반응을 촉발시키는 Rc 수용체로 공지되어 있는 FcgRIIIa 의 불변 영역의 친화성에 좌우되기도 한다.

ADCC 는 XGFR1 분자에 대한 바람직한 메커니즘이므로, 상기 분자들이 '정상적인' 항체와 동일한 방식으로 FcgRIIIa 에 결합할 수 있고, 상기 분자들이 우수한 ADCC 컴피턴스를 갖는다는 것은 중요하다. 각종 XGFR1 분자들의 bFcgRIIIa 에 대한 결합 분석을 위해, 선행기술에서 확립된 (참고문헌) Biacore 기법을 적용했다. 상기 기법에 의해, 재조합적으로 제조된 FcgRIIIa 도메인에 대한 XGFR1-분자들의 결합을 평가했다.

BIAcore 3000 기기 (GE Healthcare Biosciences AB, Sweden) 상에서 25℃ 에서 모든 표면 플라스몬 공명 측정을 수행했다. 전개 및 희석 완충액은 PBS (1 mM KH₂PO₄, 1O mM Na₂HPO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH6.0, 0.005 % (v/v) Tween20 였다. 가용성 인간 FcgRIIIa 은 10 mM 나트륨-아세테이트, pH 5.0 에 희석시키고, 표준 아민 커플링 키트 (GE Healthcare Biosciences AB, Sweden) 를 이용해 CM5 바이오센서 칩 상에 고정시켜 약 1000 RU 의 FcgRIIIa 표면 밀도를 수득했다. HBS-P (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% Surfactant P20; GE Healthcare Biosciences AB, Sweden) 를 고정 동안의 전개 완충액으로 이용했다. XGFR 이중특이적 항체는 PBS, 0.005%(v/v) Tween20, pH 6.0 를 이용해 농도 450 nM 로 희석하고, 3 분에 걸쳐 30μl/분의 유속으로 주입했다. 이어서, 센서 칩을 1 분간 PBS, pH8.0, 0.005% (v/v) Tween20 를 이용해 재생시켰다. 데이터 분석은 BIAevaluation software (BIAcore, Sweden) 를 이용해 수행했다.

상기 실험의 결과는 표 7 에 요약했다.

표 6 - FcγRIIIa 및 FcRn 에 대한 이중특이적 항체 (XGFR-명명법) 의 결합 친화성

상기 분석은 비-항원 결합 XGFR1 분자의 FcgRIIIa 대한 결합이 야생형 IgGl 분자의 결합과 구분불가하다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 상기 생화학적 검정은 ADCC-매개성 수용체 FcgRIIIa 를 결속시킬 비-항원 결합 XGFR1-2421 및 XGFR1-4421 의 완전한 컴피턴스를 나타낸다.

항원 존재 하 XGFR1 분자들을 이용하는 상기 실험들의 반복은 가용성 FcgRIIIa 의 결합 능력에 영향력이 없음을 밝혀냈다.

또다른 설정의 상기 Biacore 실험은, 선행기술에서 기재된 기법 (Umana, P., 등 Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 및 WO 99/54342) 에 의해 당개질된 (실시예 7 참고) XGFR1-분자를 이용해 수행했다. 상기 당개질은 Fc-영역의 FcgRIIIa 에 대한 친화성을 증가시킴으로써, 표적 세포 상의 ADCC 를 증가시켰다. 비-항원 결합 당개질 XGFR1-분자의 FcgRIIIa-결합 능력을 비-항원 결합 당개질 야생형 IgG 의 것과 비교하니, 비-항원 결합 당개질 XGFR1 분자는 야생형 항체에 비해 증가된 결합 친화성을 가짐을 나타냈다.

표 7 - 이중특이적 항체 (XGFR -명명법) 의 FcγRIIIa 및 FcRn 에 대한 결합 친화성

XGFR1-분자의 FcgRIIIa 에 대한 결합 컴피턴스가 또한 시험관내에서 종양 세포에 대한 ADCC 활성으로 얼마나 옮겨지는지 분석하기 위해, 세포 검정에서 ADCC 컴피턴스를 측정했다. 상기 검정을 위해, XGFR1-2421, XGFR1-3421, XGFR1-4421 및 XGFR1-5421 의 당개질 유도체 (XGFR1-2421-GE, XGFR1-3421-GE, XGFR1-4421-GE 및 XGFR1-5421-GE) 를 제조하고 (실시예 6 참고), 상기에 기재된 바 있는 BIAcore ADCC-컴피턴스 검정 포맷 및 하기에 기재되어 있는 시험관내 ADCC 검정에서 시험했다.

인간 말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 를 효과기 세포로 이용했으며, 본질적으로 제조사의 지시사항에 따라 Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA) 를 이용하여 제조했다. 간략하게, 건강한 자원자로부터 정맥혈을 헤파린 처리 주사기를 이용해 채취했다. 상기 혈액을 1:0.75 내지 1.3 로 PBS (Ca++ 또는 Mg++ 불포함) 로 희석하고, Histopaque-1077 에 적층시켰다. 구배물을 400 x g 로 30 분간 실온 (RT) 에서 중단없이 원심분리했다. PBMC 를 포함하는 인터페이스 (interphase) 를 수집하고, PBS (두 구배물로부터의 세포마다 50 ml) 로 세척하고, 300 x g 로 10 분간 RT 에서 원심분리하여 수합했다. 펠렛을 PBS 로 재현탁 후, PBMC 를 계수하고, 200 x g 로 10 분간의 RT 에서의 원심분리로 2 차 세척했다. 이어서, 세포를 후속 과정을 위해 적당한 배지에 재현탁시켰다.

ADCC 검정을 위해 이용되는 효과기 대 표적의 비율은 PBMC 에 대해 25:1 였다. 효과기 세포는 AIM-V 배지 중에, 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 50 μl 를 첨가하기에 적당한 농도로 제조했다. 표적 세포는 10% FCS 를 함유하는 DMEM 에서 배양한 인간 EGFR/IGFR 발현 세포 (예를 들어, H322M, A549 또는 MCF-7) 였다. 표적 세포를 PBS 에서 세척하고, 계수하고 AIM-V 에 ml 당 0.3 백만으로 재현탁시켜, 마이크로웰 당 100 μl 에 30,000 개의 세포를 첨가했다. 항체를 AIM-V 에 희석하고, 50 μl 로 미리 플레이팅한 표적 세포에 첨가하고, 10 분 동안 RT 에서 표적에 결합하도록 했다. 이어서, 효과기 세포를 첨가하고, 플레이트를 4 시간 동안 5% CO₂ 를 포함하는 가습 분위기 중의 37℃ 에서 인큐베이션했다. 표적 세포의 살상은 세포독성 검출 키트 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland) 를 이용해 손상된 세포로부터의 락테이트 디히드로게나아제 (LDH) 방출의 측정으로 평가했다. 4-시간 인큐베이션 후, 플레이트를 800 x g 에서 원심분리했다. 각 웰로부터의 100 μl 상청액을 새로운 편평 바닥 95 웰 플레이트에 옮겼다. 키트로부터의 100 μl 컬러 기질 완충액을 웰마다 첨가했다. 컬러 반응물의 V_max 값은 ELISA 검독기에서 490 nm 로 10 분 이상 SOFTmax PRO 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA) 를 이용하여 측정했다. 항체없이 표적 및 효과기 세포만을 포함하는 웰로부터 자발적인 LDH 방출을 측정했다. 최대 방출값은 표적 세포 및 1% Triton X-100 만을 포함하는 웰로부터 측정되었다. 특이적인 항체-매개성 살상의 백분율은 다음과 같이 계산했다: ((x - SR)/(MR - SR)* 100, 식 중, x 는 특이적 항체 농도에서의 V_max 의 평균이고, SR 은 자발적 방출의 V_max 의 평균이고, MR 은 최대 방출의 V_max 의 평균임.

상기 검정에서, ADCC 컴피턴스는 또한 당개질 야생형 항체의 것과 비교했다. 상기 검정의 결과는 당개질된 XGFR1-3421-GE/XGFR1-4421-GE/ XGFR1-5421-GE 의 탁월한 ADCC 컴피턴스를 나타냈다 (도 9 참고).

실시예 9

이중특이적 < EGFR - IGF1R > 항체 scFab - XGFR1 분자의 발현 및 정제

해당하는 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 원핵- 및 진핵성 선별 마커를 보유하는 발현 벡터 내에 구축했다. 상기 플라스미드는 대장균에서 증폭시키고, 정제하고, 후속하여 HEK293F 세포에서의 재조합 단백질의 일시적 발현을 위해 트랜스펙션했다 (Invitrogen 의 프리스타일 시스템 이용). 7 일 후, HEK 293 세포 상청액을 수합하고, 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제했다. 모든 이중특이적 항체 구축물의 동종성은 비환원 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE 로 확인했다. 환원 조건 하 (도 15), C- 및 N-말단 scFab 융합물을 보유하는 폴리펩티드 사슬은 SDS-PAGE 시 계산된 분자량과 유사한 명확한 분자 크기를 나타냈다. 모든 구축물의 발현 수준은 단백질 A HPLC 로 분석했고, '표준' IgG 의 발현 수율과 유사하거나, 또는 일부의 경우 약간 더 낮았다. 평균 단백질 수율은 그러한 비-최적화 일시적 발현 실험에서의 세포-배양 상청액의 리터 당 1.5 내지 10 mg 의 단백질이었다 (도 13 및 14).

정제된 단백질의 HP-크기 배제 크로마토그래피 분석은 재조합 분자들에 대한 약간의 응집하는 경향성을 보여줬다. 상기 이중특이적 항체의 응집 문제를 다루기 위해, 추가적인 결합 부분의 VH 및 VL 사이의 디설파이드-안정화를 적용했다. 이를 위해, 정해진 위치 (Kabat 번호매김 제도에 따른 위치 VH44/VL100) 에서 scFv 의 VH 및 VL 내 단일 시스테인 대체물을 도입했다. 이들 돌연변이는 VH 및 VL 사이의 안정한 사슬내 디설파이드의 형성을 가능케 하여, 이후 결과로서 수득되는 디설파이드-안정화 scFv 모듈을 안정화시킨다. scFabs 에서의 VH44/VL100 디설파이드의 도입은 단백질 발현 수준을 현저하게 방해하지 않았고, 일부의 경우 심지어는 발현 수준을 개선시키기도 했다 (도 13 및 14 참고).

이중특이적 항체는 제조사 (Invitrogen, USA) 의 지시사항에 따라 FreeStyle™ 293 Expression System 을 이용하여 인간 태아 신장 293-F 의 일시적 트랜스펙션으로 발현시켰다. 간략하게, 현탁액 FreeStyle™ 293-F 세포는 FreeStyle™ 293 발현 배지에서 37℃/8 % CO₂ 로 배양했고, 세포를 트랜스펙션 당일 1 내지 2 x 10⁶ 살아있는 세포/ml 의 밀도로 새로운 배지에 시딩했다. DNA-293fectin™ 복합체를 250 ml 인 최종 트랜스펙션 부피에 대해 Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen, USA) 중에 333 μl 의 293fectin™ (Invitrogen, Germany) 및 250 μg 의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1 몰비로 하여 제조했다. 세포 배양 상청액을 포함하는 재조합 항체 유도체는 트랜스펙션 7 일 후 14000 g 에서의 30 분간의 원심분리 및 멸균 필터 (0.22 μm) 를 통한 여과로 정화했다. 상청액을 정제 전까지 -20℃ 에서 저장했다.

분비된 항체 유도체를 Protein A-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden) 를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피로 2 단계에서 상청액으로부터 정제했다. 간략하게, 정화된 배양 상청액을 포함하는 이중특이적 및 삼중특이적 항체를 PBS 완충액 (10 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화시킨 HiTrap Protein A HP (5 ml) 컬럼 상에 적용했다. 미결합 단백질을 평형화 완충액으로 세척했다. 항체 유도체를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 2.8 으로 용출하고, 분획을 포함하는 단백질을 0.1 ml 1 M Tris, pH 8.5 로 중화했다. 이어서, 용출한 단백질 분획을 모으고, Amicon Ultra 원심분리 필터 장치 (MWCO: 30 K, Millipore) 를 이용해 부피 3 ml 로 농축하고, 2O mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 으로 평형화시킨 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 상에 로오딩했다. 단량체성 항체 분획을 모으고, 급속 냉동시키고, -80℃ 에서 저장했다. 시료 중 일부를 후속 단백질 분석 및 특징분석용으로 제공했다. 정제된 단백질의 예시 SDS-PAGE 분석 및 이중특이적 항체의 HP-크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 의 프로파일을 도 15 및 16 에 나타냈다.

도 13 및 14 는 일시적 발현 시스템에서 관찰되는 발현 수율을 열거한다: 모든 지정된 항체 유도체는 추가 분석을 위한 충분한 양으로 발현 및 정제될 수 있다. 상청액 리터 당 발현 수율은 1 mg 미만 내지 > 30 mg 의 범위이다. 예를 들어, scFab-XGFR1-2720 는 정제 후 1 mg 미만의 최종 수율을 갖는 반면, scFab-XGFR1-2721 는 13.8 mg 의 최종 수율을 갖는다. 상기 차이는 또한 일부 단백질에서 관찰된 발현 수율에 대한 VH44-VL100 디설파이드 안정화의 포지티브한 영향력을 보여준다.

실시예 10

시험관내 이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체 scFab-XGFR1 분자의 안정성

이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체 scFab 분자의 안정성 및 응집 경향성

HP-크기 배제 크로마토그래피 분석은 재조합 항체 유도체의 제제에 존재하는 응집물의 양 측정을 위해 수행했다. 이를 위해, 이중특이적 항체 시료를 Superdex 200 분석 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 이용한 UltiMate 3000 HPLC system (Dionex) 상에서의 고성능 SEC 에 의해 분석했다. 도 16 은 상기 분석의 예시를 보여준다. 응집물은 단량체성 항체 유도체를 포함하는 분획 전에 별도의 피크 (peak) 또는 쇼울더 (shoulder) 로서 나타난다. 이 작업을 위해, 중쇄 및 경쇄 중 하나에 scFab 가 연결되어 있는 중쇄 및 경쇄의 2 헤테로다이머로 이루어진 원하는 '단량체성' 분자를 정의한다. 감소된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄 및 융합 단백질의 아미노산 골격의 통합성은, 펩티드-N-글리코시다아제 F (Roche Molecular Biochemicals) 를 이용한 효소 처리로 N-글리칸 제거 후 NanoElectrospray Q-TOF 질량 분광계로 밝혀냈다. 상이한 조건 (농도 및 시간을 달리 함) 하 정제된 단백질의 HP-크기 배제 크로마토그래피 분석은, 정상 IgG 에 비해, scFab 를 포함하는 분자들에 대한 약간 증가된 응집 경향성을 나타냈다. 일부 분자들에 대해 관찰된 이러한 응집 경향성은 scFab 모듈 내 VH44/VL100 사슬간 디설파이드 결합의 도입에 의해 완화될 수 있다.

실시예 11

RTKs EGFR 및 IGF1R 에 대한 이중특이적 < EGFR - IGF1R > 항체 scFab -분자의 결합

상이한 이중특이적 항체 포맷 scFab-XGFR 의 전장 IgG-모듈에서의 scFab 모듈과 항원-결합 부위의 결합은, 결합 모듈 및 이중특이적 항체가 유도되는 '야생형' IgG 의 결합과 비교했다. 이들 분석은 Surface Plasmon Resonance (Biacore) 및 세포-ELISA 를 적용하여 수행되었다.

결합 특성 이중특이적 <IGF-1R-EGFR> 항체는 Biacore T1OO 기기 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala) 를 이용하는 표면 플라스몬 공명 (SRP) 기법으로 분석했다. 상기 시스템은 분자 상호작용 연구용으로 확고하게 확립되어 있다. 이는 리간드/분석물 결합의 연속적인 실시간 모니터링을 가능케 하여, 각종 검정 설정에서의 회합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd), 및 평형 상수 (KD) 의 결정을 가능케 한다. SPR-기법은 금으로 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 대한 굴절률 측정값을 근거로 한다. 굴절률에서의 차이는 용액 내 고정된 리간드와 주입된 분석물의 상호작용에 의해 야기되는 표면 상의 질량 변화를 가리킨다. 분자들이 표면에 고정된 리간드와 결합하는 경우, 질량은 증가하고, 해리하는 경우 질량은 감소한다.

포획 항-인간 IgG 항체는 아민-커플링 화학을 이용해 CM5 바이오센서칩의 표면에 고정되었다. 유동 세포는 0.1 M N-히드록시숙신이미드 및 0.1 M 3-(N,N- 디메틸아미노)프로필-N-에틸카르보디이미드의 1:1 혼합물을 이용해 5 μl/분의 유속으로 활성화되었다. 항-인간 IgG 항체를 나트륨 아세테이트, pH 5.0 에 10 μg/ml 로 주입했고, 이는 약 12000 RU 의 표면 밀도를 결과로서 제공했다. 기준 대조군 유동 세포는, 포획 항체 대신 비히클 완충액을 사용한 것을 제외하고는, 동일하게 처리했다. 표면은 1 M 에탄올아민/HCl pH 8.5 의 주입으로 블로킹했다. 이중특이적 항체는 HBS-P 중에서 희석하고, 유속 5 μl/분으로 주입했다. 접촉 시간 (회합기) 은, 1 내지 5 nM 의 농도의 항체에 대해서는 1 분이었다. EGFR-ECD 는 1.2, 3.7, 11.1, 33.3, 100 및 300 nM 으로 농도를 증가시키면서 주입했고, IGF-1R 는 0.37, 1.11, 3.33, 10, 30 및 90 nM 의 농도에서 주입했다. 두 분자에 대해 유속 30 μl/분에서 접촉 시간 (회합기) 은 3 분이었고, 해리 시간 (전개 완충액으로 세척) 은 5 분이었다. 모든 상호작용은 25℃ (표준 온도) 에서 수행했다. 0.85% 인산 및 5 mM 나트륨 히드록시드의 재생 용액을 60 s 동안 5 μl/분의 유속으로 주입하여, 각각의 결합 싸이클 후 임의의 비-공유적 결합 단백질을 제거했다. 시그널은 초 당 1 개 시그널의 속도로 검출되었다. 시료는 농도를 증가시키며 주입했다.

이중특이적 항체 <IGF-1R-EGFR> 항체의 EGFR 및 IGF1R 에 대한 예시 동시적 결합은 도 17a 내지 d 에 나타냈다.

표 8: 이중특이적 항체 (scFab-XGFR1_2720 및 scFab- XGFR2 2720) 의 EGFR 및 IGF-1R 에 대한 친화성 (KD)

배양된 세포에 대한 FACS-기재 결합 및 경쟁 분석은 또한 이중특이적 항체 유도체의, 세포 표면에 노출된 RTK 에 대한 결합 가능성을 평가하기 위해 적용될 수 있다. 도 18 은 이중특이적 XGFR 유도체를 포함하는 scFab 의 A549 암 세포에 대한 결합 능력을 시험하기 위해 이용한 실험 설정을 보여준다. 상기 세포 경쟁 검정을 위해, 항원 EGFR 및 IGF1R 을 발현하는 A549 세포를 떼어내 계수했다. 1.5x10e5 세포를 원뿔형 96-웰 플레이트의 웰마다 시딩했다. 세포를 스핀 다운 (1500 rpm, 4℃, 5 분) 시켰고, 1 μg/mL 의 Alexa647-표지된 IGFIR-특이적 항체를 포함하는, 2% FCS (우태아 혈청) 이 있는 PBS 중의 각각의 이중특이적 항체의 희석 연쇄물 50 μL 중에 얼음에서 45 분간 인큐베이션했다. 세포를 다시 스핀다운시키고, 2% FCS 를 포함하는 200 μL PBS 로 2 회 세척했다. 최종적으로, 세포를 BD CellFix 용액 (BD Biosciences) 에 재현탁시키고, 10 분 이상 얼음에서 인큐베이션했다. 세포의 평균 형광 강도 (mfi) 를 유세포분석 (FACS Canto) 으로 측정했다. Mfi 는 2 회의 독립적인 염색을 적어도 두번씩 측정했다. 유세포분석 스펙트럼은 FlowJo software (TreeStar) 를 이용해 추가로 프로세스했다. 최대 결합의 절반값 (Half-maximal binding) 은 XLFit 4.0 (IDBS) 및 투여량 응답성 원 사이트 모델 205 (dose response one site model 205) 를 이용하여 측정했다.

도 19a 내지 c 에 나타낸 상기 검정 결과들은 종양 세포의 표면에 대한 항체 유도체를 포함하는 이중특이적 scFab 의 결합 기능성을 증명한다. 예를 들어, 이중특이적 항체 유도체 scFab-XGFR1_2721 의 경쟁 실험에서의 IC₅₀ 은 0.11 μg/ml 인 반면, 단일특이적 항체의 IC₅₀ 은 50% (0.18 μg/ml) 이상 더 높았다. 부모 항체에 비해 이중특이적 scFab-XGFR_2721 유도체의 경쟁 검정에서의 이러한 증가된 활성은 이중특이적 분자가 단일특이적 항체에 비해 세포 표면에 더 잘 결합한다는 점을 시사한다.

실시예 12

이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 scFab-XGFR 분자에 의한 EGFR- 및 IGF-1R- 의 하향조절

인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 은 IGFR1-신호전달을 억제하고, 인간화된 래트 항체-EGFR 항체 <EGFR>ICR62 는 EGFR 에 의한 신호전달을 억제한다. 상이한 scFab-XGFR1 변이체들의 잠재적인 억제 활성을 평가하기 위해, 상기 두가지로부터의 수용체의 하향조절 정도를 분석했다.

종양 세포 내 IGF-I 수용체 (IGF-1R) 의 양에 대한 본 발명의 항체의 유효성을 검출하기 위해, 타임-코스 (time-course) 실험 및 후속 ELISA 분석을 수행했다.

배지를 조심스럽게 제거하고 RPMI-VM 배지에 희석시킨 2 ml 0.01 mg/ml XGFR 항체로 교체했다. 3 개의 대조군 웰에서, 배지는 항체가 없는 배지, 대조군 항체 (<IGF-1R> HUMAB Clone 18 및 <EGFR>ICR62 최종 농도 0.01 mg/ml) 를 포함하는 배지로 대체하고, 1 개의 웰은 오직 완충액만을 포함했다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 에서 배양하고, 24 시간 후 개별 플레이트를 추가 프로세싱을 위해 취했다.

배지를 조심스럽게 흡출시켜 제거하고, 세포를 1 ml PBS 로 세척했다. 300 μl/웰의 차가운 MES-분해 완충액을 첨가했다 (MES, 10 mM Na3VO4, 및 Complete® 프로테아제 억제제). 1 시간 후, 세포를 세포 주걱 (Corning, Cat. No. 3010) 을 이용해 얼음 상에서 떼어내고, 웰 내용물을 에펜도르프 (Eppendorf) 시험관으로 옮겼다. 세포 절편들을 10 분 동안 13000 rpm 에서의 4℃ 에서의 원심분리로 제거했다.

EGFR 검출

96 웰 스트렙타비딘 마이크로플레이트 (MTP) 를 프로토콜 (인간 EGFR 을 위한 DuoSet ELISA, RnD systems Cat. No. DY231) 에 따라 준비했다. PBS 중의 인간 EGFR 염소 항체 144 μg/ml 를 PBS 로 1:180 로 희석하고, 100 μl/웰을 MTP 에 첨가했다. MTP 를 밤새 진탕하면서 4℃ 에서 인큐베이션햇다. 플레이트를 0.1% Tween®20 를 보충한 PBS 로 3 회 세척하고, 300μl/웰의 PBS, 3% BSA 및 0.1% Tween®20 용액을 이용해 1 시간 동안 실온 (RT) 에서 진탕과 함께 블로킹시켰다. 플레이트를 0.1% Tween®20 를 보충한 PBS 를 이용해 3 회 세척했다.

세포 용해물 내 단백질의 양을 BCA Protein Assay 키트 (Pierce) 를 이용해 측정하고, 이어서 세포 용해물을 100 mM Na₃VO₄ 1:100 및 Complete® 프로테아제 억제제 1:20 를 보충한 MES-세포용해 완충액을 이용해 0.04 mg/ml 의 단백질 농도로 조정하고, 웰 당 100 μl 의 용해물을 미리 준비한 MTP 에 첨가했다. 백그라운드 측정을 위해 100 μl 의 용해 완충액을 웰에 MTP 중에 첨가했다.

두번째 세포 용해물 농축물은 0.025 mg/ml 로 사용했고, 상기 세포 용해물을 1:2 로 희석했고, 웰 당 100 μl 를 미리 준비한 MTP 에 첨가했다. MTP 는 2 시간 더 RT 에서 진탕과 함께 인큐베이션하고, 이어서 0.1% Tween®20 용액이 있는 PBS 로 3 회 세척했다.

IGF -1R 검출

제 2 세포 용해물 농축물은 0.02 mg/ml 로 사용했고, 상기 용해물은 희석물이었고, 웰 당 100 μl 를 미리 준비한 스트렙타비딘-MTP 에 첨가했다. 백그라운드 측정을 위해, 100 μl 용해 완충액을 웰에 스트렙타비딘-MTP 중에 첨가했다.

A549 세포에서 부모 단일특이적 항체 <EGFR>ICR62 및 <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 과 비교한 이중특이적 항체 XGFR 에 의한 수용체 하향조절 검출 결과를 도 20 및 21 에 나타냈다. 이중특이적 항체 XGFR 는 EGFR- 및 IGF1R 를 둘다 하향조절했다. 이는 결합 모듈의 전체 기능성 (생물학적기능성) 및 표현형 중재가 유지된다는 것을 보여준다. 도 21 은 또한, 놀랍게도, 이중특이적 항체 scFab-XGFR-2720 은 부모 <EGFR>ICR62 항체에 비해 개선된 하향조절 EGFR 를 나타냈다는 것을 보여준다.

XGFR1 변이체를 포함하는 scFab 는 동일한 몰 농도로 동일한 검정에 적용시 야생형 항체와 동일하거나 또는 더 나은 활성을 나타낸다는 사실은 scFab-XGFR1 분자가 두 신호전달 경로에 개입할 수 있다는 점을 나타낸다.

실시예 13

시험관내에서의 종양 세포주의 scFab - XGFR1 및 scFab - XGFR2 -매개 성장 억제

인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 는 IGF1R 을 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제한다 (WO 2005/005635). 유사한 방식으로, 인간화된 래트 항체-EGFR 항체 <EGFR>ICR62 는 EGFR 을 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 나타났다 (WO 2006/082515). 종양 세포주의 성장에서 상이한 scFab-XGFR1 변이체의 잠재적인 억제 활성을 평가하기 위해, EGFR 및 IGF1R 을 발현하는 H322M 세포에서의 억제도를 분석했다.

플라스틱 표면에 대한 유착을 방지하기 위한 폴리-HEMA (폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트)) 코팅된 디쉬 상에서 0.5% FCS 를 보충한 RPMI 1640 배지에서 H322M 세포 (5000 세포/웰) 를 배양했다. 이러한 조건 하에, H322M 세포는 3 차원적으로 성장하는 밀집한 회전타원체 (고정-독립성 (anchorage independence) 으로 지칭하는 특성) 를 형성한다. 이러한 회전타원체는 고형 종양 원상태의 3 차원적 세포건축양식 및 조직화와 매우 닮았다. 회전타원체 배양물은 항체의 양을 50 또는 100 nM 로부터 증가시키면서 5 일간 인큐베이션했다. 성장 억제 측정에는 Celltuter Glow 발광 검정을 이용했다. H322M 회전타원체 배양물을 <IGF-1R> HUMAB-Clone18 로 처리시, 성장에서의 억제가 관찰될 것이다.

도 22 는 동일한 검정에서 10OnM <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 의 적용이 세포 성장을 72% 감소시키고, 10OnM <EGFR>ICR62 의 적용이 세포 성장을 77% 감소시킨다는 것을 보여준다. 두 항체 (둘다 동일한 농도 100 nM) 의 동시적인 적용은 세포 생활성의 완전한 감소 (100% 억제) 를 결과로서 제공했다. 이는 두 RTK 경로와의 동시적인 개입이 1 개 경로 단독의 개입보다 종양 세포주에 더 큰 영향을 준다는 점을 나타낸다. 10O nM 의 몰 농도에서의 각종 scFab-XGFR1-변이체의 적용은 단일한 분자 단독으로 관찰되는 것보다 더 큰 성장 억제를 결과로서 제공한다. 사실, 100 nM 의 항체 농도에서는, 각종 scFab-XGFR1-변이체는 세포 성장의 완전한 (100%) 억제를 나타낸 반면, 단일 모듈의 적용은 오직 부분적인 억제를 초래했다.

scFab-XGFR1 분자는 EGFR 신호전달 또는 IGF 1R 신호전달 하나에만 개입하는 IgG 에 비해 훨씬 더 증가된 성장 억제 활성을 갖는다고 결론지었다.

실시예 14

이중특이적 , 2 가 도메인 교환된 < EGFR - IGF1R > 항체 분자 Cross - Mab ( VH / VL ) (VH/VL 도메인 교환) 또는 Cross - Mab ( VH / VL ) ( VH / VL 도메인 교환) 의 발현 및 정제

실시예 1 및 9 에 기재된 과정과 유사하게, 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 Cross-Mab (VH/VL) (WO 2009/080252 에 기재된 바와 같은 VH/VL 교환) 및 Cross-Mab (VH/VL) (WO 2009/080253 에 기재된 바와 같은 VH/VL 교환) 을 발현시키고 정제했다. 두 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체는, EGFR 에 결합하는 첫번째 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (인간화된 <EGFR>ICR62 로부터 유도됨), 및 IGF-1R 에 결합하는 두번째 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 23 의 중쇄 가변 도메인, 및 서열 식별 번호: 25 의 경쇄 가변 도메인 (인간 항- IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 로부어 유도됨) 을 근간으로 했다.

단백질 A-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden) 을 이용한 친화성 크로마토그래피 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피 후 발현 수율은, Cross-Mab (VH/VL) 에 대해서는 29.6mg/L 였고, Cross-Mab (CH/CL) 에 대해서는 28.2mg/L 였다.

상응하는 이중특이적 항체의 상관있는 전체 (부분적으로 개질) 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은, Cross-Mab (VH/VL) 에 대해서는 서열 식별 번호: 30 내지 33 에, Cross-Mab (VH/VL) 에 대해서는 서열 식별 번호: 34 내지 37 에 제공했다.

실시예 15

이중특이적 , 2 가 도메인 교환된 < EGFR - IGF1R > 항체 분자 Cross - Mab ( VH / VL ) 또는 Cross - Mab ( VH / VL ) 에 의한 EGFR - 및 IGF -1R- 의 하향조절

실시예 12 와 유사하게, 실시예 14 의 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 Cross-Mab (VH/VL) (VH/VL 교환) 및 Cross-Mab (VH/VL) (VH/VL 교환) 에 의한 H322M 종양 세포에 대한 EGFR- 및 IGF-1R 의 하향조절을 측정했다.

두 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 Cross-Mab (VH/VL) 및 Cross-Mab (VH/VL) 의 EGFR 의 하향조절은, 단일특이적 <EGFR>ICR62 의 하향조절 (약 41%; 9.38 μg 단백질/ml 임) 에 비해, 같거나 (Cross-Mab (VH/VL) 약 41%) 약간 더 높다 (Cross-Mab (VH/VL) 약 49%).

놀랍게도, IGF-1R 의 두 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 Cross-Mab (VH/VL) 및 Cross-Mab (VH/VL) 의 하향조절은, 단일특이적 <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 의 하향조절 (약 85%; 75 μg Protein/ml 에서) 에 비해, 훨씬 더 낮다 (Cross-Mab (VH/VL) 약 17%) (Cross-Mab (VH/VL) 약 20%).

실시예 16

이중특이적 , 2 가 도메인 교환된 < EGFR - IGF1R > 항체 분자 Cross - Mab ( VH / VL ) 또는 Cross - Mab ( VH / VL ) 에 의한 시험관내 H332M 종양 세포주의 종양 성장 억제

실시예 13 과 유사하게, 실시예 14 의 이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 Cross-Mab (VH/VL) (VH/VL 교환) 및 Cross-Mab (CH/CL) (VH/VL 교환) 의 H322M 종양 세포의 종양 성장 억제를 측정했다.

100 nM 에서, 단일특이적 항체 <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 은 세포 성장을 75% 감소시키고, 10OnM <EGFR>ICR62 의 적용은 세포 성장을 89% 감소시켰다.

두 항체의 동시적인 적용 (둘다 동일한 농도 100 nM 로, 총 20O nM 항체 농도를 결과로 제공) 은 세포 생활성의 완전한 감소 (100% 이상 억제) 를 결과로 제공했다.

이중특이적, 2 가 도메인 교환된 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 Cross-Mab (VH/VL) 및 Cross-Mab (VH/VL) (오직 100 nM 의 농도) 는 또한 각각 따로 세포 성장의 완전한 억제 (100% 이상) 를 나타냈다.

이는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 상응하는 단일특이적 부모 항체의 조합보다 더 낮은 항체 농도에서 종양 세포 성장을 완전히 억제할 수 있는 반면, 단일특이적 부모 항체는 단독으로는 부분적인 억제만을 초래한다는 것을 나타낸다.

실시예 17

이중특이적 , 2 가 ScFab - Fc 융합 < EGFR - IGF1R > 항체 분자 scFab - Fc 의 발현 및 정제

실시예 1 및 9 에 기재된 과정와 유사하게, 이중특이적, 2 가 ScFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 scFab-Fc 를 발현시키고 정제했다. 상기 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체는 또한 EGFR 에 결합하는 첫번째 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (인간화된 <EGFR>ICR62 로부터 유도됨) 및, IGF-1R 에 결합하는 두번째 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 23 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 25 의 경쇄 가변 도메인 (인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 로부터 유도됨) 을 근간으로 한다.

Protein A-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden) 를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피에 의한 발현 수율은 scFab-Fc 에 대해서는 29.7 mg/L 였다.

표 10: 발현 및 정제 후 이중특이적, 2 가 ScFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 scFab-Fc 의 수율

이중특이적 항체 scFab-Fc 의 관련 전체 (개질) 중쇄 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 38 내지 39 에 제공된다

실시예 18

이중특이적 , 2 가 ScFab - Fc 융합 < EGFR - IGF1R > 항체 분자에 의한 EGFR - 및 IGF-1R- 의 하향조절

실시예 12 와 유사하게, 실시예 17 의 이중특이적, 2 가 ScFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체에 의해 초래되는 H322M 종양 세포의 EGFR- 및 IGF-1R 의 하향조절을 측정했다.

실시예 19

이중특이적 , 2 가 ScFab - Fc 융합 < EGFR - IGF1R > 항체 분자의 시험관내 종양 세포주의 종양 성장 억제

실시예 13 과 유사하게, 실시예 17 의 이중특이적, 2 가 ScFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체의 H322M 종양 세포의 종양 성장 억제를 측정했다.

실시예 20

오르토토픽 ( orthotopic ) A549 이종이식 모델에서의 생존 분석

세포 배양

A549 선암종 세포 (NSCLC) 를 본래 ATCC 로부터 입수하고, 증량 후 내부 세포 은행에 기탁했다. 종양 세포주는 10% 우태아 혈청 (Invitrogen, Switzerland) 및 2 mM L-글루타민 (GIBCO, Switzerland) 을 보충한 DMEM 배지 (GIBCO, Switzerland) 중에 37℃ 에서 물-포화 분위기에서 5% CO₂ 로 하여 통상적으로 배양했다. 배양 계대는 트립신/EDTA 1x (GIBCO, Switzerland) 를 이용해 3 일마다 분주하여 수행했다. 주입에는 10 번째 계대배양물을 이용했다.

동물

SCID 베이지 암컷 마우스; 실험 개시시 8 내지 9 주령 동물 (Charles River, Sulzfeld, Germany 에서 구입) 을 수임된 가이드라인 (GV-Solas; Felasa; TierschG) 에 따라 12 시간 명/12 시간 암의 1 일 싸이클의 무특이 병원체 조건 하에 유지했다. 실험 연구 프로토콜은 지방 자치체로부터 검수 및 승인받았다 (P 2005086). 도착 후, 동물들은 새로운 환경에 적응 및 관찰을 위해 1 주간 유지되었다. 계속적인 건강 모니터링을 정기적으로 수행했다.

종양 세포 주입

주입일에, A549 종양 세포를 배양 플라스크 (Greiner Bio-One) 로부터 트립신-EDTA (Gibco, Switzerland) 을 이용해 수합하고, 50 ml 배양 배지로 옮기고, 세척하고, AIM V (Gibco, Switzerland) 에 재현탁시켰다. AIM V 를 이용한 추가 세척 후, 세포 농도를 세포 계수기를 이용해 측정했다. A549 세포의 주입을 위해, 최종 역가를 5.0 x 10⁶ 세포/ml 로 조정했다. 후속하여, 200 μl 의 상기 혼합물을 1.0 ml 튜베르쿨린 주사기 (BD Biosciences, Germany) 를 이용해 마우스의 측면 꼬리 정맥에 주입했다.

처리

동물 처리는 군 당 10 마리씩 하여 종양 세포 접종 후 2 주째에 시작했다. 이중특이적 항체-EGFR/항-IGFIR 항체 XGFR1-4421 GE, XGFR1-2421 GE, XGFR1-3421 GE, <EGFR>ICR62 GE, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 및 해당하는 비히클을 표시된 투여량으로 매주 1 회 i.v. 투여했다. 매월 투여량은 실험 종료시까지 투여했다. 항체 희석물은 사용 전 원액으로부터 새롭게 제조했다.

표 11: 오르토토픽 A549 이종이식 모델에서의 생존 분석의 연구 디자인

모니터링

동물들은 임상적 징후 및 부작용, 즉 호흡 곤란, 운동 부전 및 털 벗겨짐 (scruffy fur) 의 검출에 대해 매일 제어했다. 동물들에 대한 연구 배제 기준은 해당하는 프로젝트 라이센스에서 기술 및 승인되었다.

확인/차등화

마우스는 차등화 시 무작위로 나누었다. 동물들을 M3 크기 우리에 가두었다.

부검

마우스를 종결 기준 (털 벗겨짐, 등이 휘어짐, 운동 부전) 에 따라 희생시켰다. 후속 세포병리학적 분석을 위해, 모든 동물로부터 폐 종양을 수합했다 (PFA, 냉동).

생존 분석

생존 데이터는 특이적인 사건 발생 때까지 견딘 시간을 포함하고, 종종 사건-대-사건 데이터로 언급한다. 사건은 예를 들어, 환자의 사망일 수 있다. 관찰을 위한 연구 종결 전에 사건이 발생하지 않거나 또는 연구 대상체가 사건 발생 전에 떠나버리는 경우, 그 관찰은 검열삭제되었다고 언급된다. 이어서, 정확한 생존 시간은 알 수 없지만, 특정 값보다는 더 크다는 것은 알려져 있다.

생존 데이터는 특정화된 방법으로 분석되어야 하는데, 이는 그것이 지수적 또는 와이불 (Weibull) 과 같이 특정화된 비정규적 분포를 갖기 때문이다. 나아가, 검열삭제된 관찰은 분석을 편향시키지 않고는 무시될 수 없다.

카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 곡선은 옳게 검열삭제된 데이터의 하나 이상의 군에 대한 생존 함수의 추정값을 제공한다.

표 12: 변위차 - 개요 중간값 생존

변위차 표는 생존시간 중간값을 보여준다. 표에서, Y 는 이중특이적 <EGFR-IGF1R> 항체 XGFR1-4421 GE, XGFR1-2421 GE, XGFR1-3421 GE 로 처리한 경과일수로 나타낸 생존 시간 중간값이 단일특이적 <EGFR>ICR62 GE 로 처리한 것에 비해 더 크거나 또는, <EGFR>ICR62 GE 및 <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 의 조합으로 처리한 것에 비해 적어도 동일한다는 것을 제시한다.

실시예 21

이중특이적 2 가 ScFab - Fc 융합 < EGFR - IGF1R > 항체 분자 N- scFabSS -salt-bridge-s3 및 N- scFabSS -salt-bridge- w3C 의 발현 및 정제, 시험관내 및 생체내 특성

실시예 17, 1 및 9 에 기재된 과정과 유사하게, 이중특이적, 2 가 ScFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 N-scFabSS-salt-bridge-s3 및 N-scFabSS-salt-bridge-w3C 를 발현시키고 정제했다. 상기 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체는 또한, EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (인간화된 <EGFR>ICR62 로부터 유도됨) 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 23 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 25 의 경쇄 가변 도메인 (인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 로부터 유도됨) 을 근간으로 한다.

N-scFabSS-salt-bridge-s3 의 이중특이적 항체 분자의 관련 전체 (개질된) 중쇄 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 40 내지 41 에, N-scFabSS-salt-bridge-w3C 의 것은 서열 식별 번호: 42 내지 43 에 제공한다.

이중특이적, 2 가 ScFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 N-scFabSS-salt-bridge-s3 및 N-scFabSS-salt-bridge-w3C 의 발현 수율, 순도, 시험관내 및 생체내 특성은 상기 기재된 실시예에 따라 측정했다.

실시예 22

이중특이적 , 3 가 ScFab - IgG 융합 < EGFR - IGF1R > 항체 분자 KiH -C- scFab -1 및 KiH-C-scFab-2 의 발현 및 정제, 시험관내 및 생체내 특성

실시예 1 및 9, 17 에 기재된 과정과 유사하게, 이중특이적, 3 가 ScFab-IgG 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 KiH-C-scFab-1 및 KiH-C-scFab-2 (놉-인투-홀 기법 (knobs-into-holes technology) 의 이용 하에 전장 EGFR 특이적 항체의 오직 1 개 중쇄의 C-말단에 대한 IGF1R 에 특이적인 scFab 의 융합 (또는 그 반대)) 를 발현시키고 정제했다. 상기 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체는 또한, EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위로서의 서열 식별 번호: 8 의 중쇄 가변 도메인 및 서열 식별 번호: 10 의 경쇄 가변 도메인 (인간화된 <EGFR>ICR62 로부터 유도됨), 및 서열 식별 번호: 23 의 중쇄 가변 도메인, 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원 결합 부위로서의 서열 식별 번호: 25 의 경쇄 가변 도메인 (인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 로부터 유도됨) 을 근간으로 한다.

이중특이적 항체 분자 N-scFabSS 의 관련 전체 (개질된) 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 44 내지 46 에, N-scFabSS-salt-bridge-s3 의 것은 서열 식별 번호: 47 내지 49 에 제공된다.

이중특이적, 2 가 ScFab-Fc 융합 <EGFR-IGF1R> 항체 분자 N-scFabSS, N-scFabSS-salt-bridge-s3 및 N-scFabSS-salt-bridge-w3C 의 발현 수율, 순도, 시험관내 및 생체내 특성은 상기 기재된 실시예에 따라 측정했다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific anti-EGFR/anti-IGF-1R antibodies <130> 25393 <150> EP 08016952.7 <151> 2008-09-26 <150> EP 09004908.1 <151> 2009-04-02 <160> 49 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, humanized <EGFR>ICR62 <400> 1 Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, humanized <EGFR>ICR62 <400> 2 Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, humanized <EGFR>ICR62 <400> 3 Asp Tyr Lys Ile His 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, humanized <EGFR>ICR62 <400> 4 Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, humanized <EGFR>ICR62 <400> 5 Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain 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Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, humanized <EGFR>ICR62 -I-KA <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro 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Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 13 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 14 Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 15 Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22 <400> 17 Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22 <400> 18 Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22 <400> 19 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22 <400> 20 Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22 <400> 21 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 22 <400> 22 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 20 25 30 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Ala 35 40 45 Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 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Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 30 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain 1 of bispecific, bivalent domain exchanged <EGFR-IGF1R> antibody molecule: Cross-Mab (VH/VL) <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 31 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain 2 of bispecific, bivalent domain exchanged <EGFR-IGF1R> antibody molecule: Cross-Mab (VH/VL) <400> 31 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 115 120 125 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 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Leu Val 385 390 395 400 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 32 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain 1 of bispecific, bivalent domain exchanged <EGFR-IGF1R> antibody molecule: Cross-Mab (VH/VL) <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val 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Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 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Heavy chain 2 of bispecific, bivalent domain exchanged <EGFR-IGF1R> antibody molecule: Cross-Mab (CH/CL) <400> 35 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 130 135 140 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 145 150 155 160 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 165 170 175 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 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385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 36 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain 1 of bispecific, bivalent domain exchanged <EGFR-IGF1R> antibody molecule: Cross-Mab (CH/CL) <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 37 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain 2 of bispecific, bivalent domain exchanged <EGFR-IGF1R> antibody molecule: Cross-Mab (CH/CL) <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val 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Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe 260 265 270 Thr Phe Thr Asp Tyr Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 275 280 285 Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr 290 295 300 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser 305 310 315 320 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 325 330 335 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met 340 345 350 Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 355 360 365 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 370 375 380 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 385 390 395 400 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 405 410 415 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 420 425 430 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 435 440 445 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 450 455 460 Pro Lys Ser Cys 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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 675 680 685 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 695 <210> 39 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain 2 of bispecific, bivalent scFab-Fc fusion <EGFR-IGF1R> antibody molecule: scFab-Fc <400> 39 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 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Ala Thr 465 470 475 480 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr 485 490 495 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser 500 505 510 Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 515 520 525 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 530 535 540 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly 545 550 555 560 Cys Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 565 570 575 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 580 585 590 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 595 600 605 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 610 615 620 Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 625 630 635 640 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 645 650 655 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 660 665 670 Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 675 680 685 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 690 695 700 Ser Gly Gly Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 705 710 715 720 Pro Gly Arg Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 725 730 735 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 740 745 750 Glu Trp Val Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala 755 760 765 Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 770 775 780 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 785 790 795 800 Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 805 810 815 Arg Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 820 825 830 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 835 840 845 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 850 855 860 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 865 870 875 880 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 885 890 895 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 900 905 910 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 915 920 925 Asp Lys Thr His 930 <210> 45 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain 2 of bispecific, trivalent scFab-IgG fusion <EGFR-IGF1R> antibody molecule: KiH-C-scFab-1 <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 46 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain of bispecific, trivalent scFab-IgG fusion <EGFR-IGF1R> antibody molecule: KiH-C-scFab-1 <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 47 <211> 930 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain 1 of bispecific, trivalent scFab-IgG fusion <EGFR-IGF1R> antibody molecule: KiH-C-scFab-2 <400> 47 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 450 455 460 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 465 470 475 480 Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Asn Leu 500 505 510 Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu 515 520 525 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 530 535 540 Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 545 550 555 560 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 565 570 575 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 580 585 590 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 595 600 605 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 610 615 620 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 625 630 635 640 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 645 650 655 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly 660 665 670 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 675 680 685 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln 690 695 700 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser 705 710 715 720 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Lys 725 730 735 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly 740 745 750 Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 755 760 765 Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 770 775 780 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly 805 810 815 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 820 825 830 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 835 840 845 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 850 855 860 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 865 870 875 880 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 885 890 895 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 900 905 910 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 915 920 925 Thr His 930 <210> 48 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain 2 of bispecific, trivalent scFab-IgG fusion <EGFR-IGF1R> antibody molecule: KiH-C-scFab-2 <400> 48 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 49 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain of bispecific, trivalent scFab-IgG fusion <EGFR-IGF1R> antibody molecule: KiH-C-scFab-2 <400> 49 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

EGFR 에 결합하는 제 1 항원-결합 부위 및 IGF-1R 에 결합하는 제 2 항원-결합 부위를 포함하는, EGFR 및 IGF-1R 에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 항원-결합 부위들 각각이 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 한 쌍이고;
ii) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 1 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 2 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 3 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 4 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 5 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 6 의 CDR1 영역을 포함하고;
iii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 11 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 12 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 13 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 14 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 15 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 16 의 CDR1 영역을 포함하거나;
또는 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 17 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 18 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 19 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 20 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 21 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 22 의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제 1 항에 있어서,
i) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 1 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 2 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 3 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 4 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 5 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 6 의 CDR1 영역을 포함하고;
ii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 11 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 12 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 13 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 14 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 15 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 16 의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제 1 항에 있어서,
i) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 1 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 2 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 3 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 4 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 5 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 6 의 CDR1 영역을 포함하고;
ii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 17 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 18 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 19 의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열 식별 번호: 20 의 CDR3 영역, 서열 식별 번호: 21 의 CDR2 영역 및 서열 식별 번호: 22 의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제 1 항에 있어서,
i) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 7 또는 서열 식별 번호: 8 를 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 9 또는 서열 식별 번호: 10 을 포함하고,
ii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 23 또는 서열 식별 번호: 24 를 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 25 또는 서열 식별 번호: 26 을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제 1 항에 있어서,
i) 상기 제 1 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 8 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 10 을 포함하고,
ii) 상기 제 2 항원-결합 부위는, 중쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 23 을 포함하고, 경쇄 가변 도메인으로서 서열 식별 번호: 25 를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 2 가, 3 가 또는 4 가인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화됨으로써, 상기 당 사슬 내 퓨코오스 양이 65% 이하인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 함유하는 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 암 치료를 위한 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료를 위한 이중특이적 항체.
암 치료용 의약 제조를 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 용도.
치료가 필요한 환자에 대한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 투여에 의한, 암을 앓는 환자의 치료 방법.