ES2534760T3 - Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8 - Google Patents

Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8 Download PDF

Info

Publication number
ES2534760T3
ES2534760T3 ES06801434.9T ES06801434T ES2534760T3 ES 2534760 T3 ES2534760 T3 ES 2534760T3 ES 06801434 T ES06801434 T ES 06801434T ES 2534760 T3 ES2534760 T3 ES 2534760T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gdf
antibody
seq
antibodies
cdr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES06801434.9T
Other languages
English (en)
Inventor
Frank S. Walsh
Margaret M. Zaleska
David S. Howland
Erika L.F. Holzbaur-Howland
Lioudmila Tchistiakova
Riyez Karim
Pamela Kelley
Xiang-Yang Tan
Seung Poon Kwak
Karen Wallace
Nicholas Weber
Menelas N. Pangalos
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth LLC
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
Wyeth LLC
University of Pennsylvania Penn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth LLC, University of Pennsylvania Penn filed Critical Wyeth LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2534760T3 publication Critical patent/ES2534760T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

Un anticuerpo humanizado que se une específicamente y antagoniza GDF-8, que comprende: una región pesada variable (VH) de anticuerpo que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR), y una región ligera variable (VL) de anticuerpo que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR); en el que: dicho anticuerpo se une a GDF-8 con una Kd de 10-11 M o afinidad más elevada; y en el que: la primera CDR de una región de VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10, la segunda CDR de una región de VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 11, la tercera CDR de una región de VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 12, la primera CDR de una región de VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 13, la segunda CDR de una región de VL (L2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14, y la tercera CDR de una región de VL (L3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15; o en el que: la primera CDR de una región de VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 20, la segunda CDR de una región de VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 21, la tercera CDR de una región de VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 22, la primera CDR de una región de VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 23, la segunda CDR de una región de VL (L2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 24, y la tercera CDR de una región de VL (L3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 25.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E06801434
10-04-2015
El antagonista de GDF-8, por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF-8, se puede derivatizar o unir a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento de Fab). Por ejemplo, una proteína de fusión o un anticuerpo, o parte de unión a antígeno, se puede unir funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una de otras entidades moleculares más, tales como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o uno multiespecífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, entre otros.
Un aspecto adicional de la invención proporciona como antagonistas de GDF-8 polinucleótidos purificados y aislados que codifican los anticuerpos anti-GDF-8 de la invención. En una realización, la invención proporciona polinucleótidos formados por una secuencia que codifica una VH (SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 7), VL (SEC ID Nº: 5 o SEC ID Nº: 9), y/o CDR (SEC ID Nºs: 10-15 y 20-25) tal como se enumera en la Tabla 1. En el presente documento también se proporcionan polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a ácidos nucleicos que codifican una VH, VL, o CDR (SEC ID Nºs: 3, 5, 7, 9, 10-15, o 20-25) tal como se enumera en la Tabla 1. También se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden las SEC ID Nºs: 2, 4, 6, o 8 o fragmentos de las SEC ID Nºs: 2, 4, 6,
o 8. También se proporcionan polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a las SEC ID Nºs: 2, 4, 6 o 8, Otro aspecto de la invención proporciona células huésped y vectores que comprenden los polinucleótidos de la invención como antagonistas de GDF-8.
Los anticuerpos de la invención poseen una serie de propiedades útiles. En primer lugar, los anticuerpos son capaces de unirse a GDF-8 maduro con alta afinidad. En segundo lugar, los anticuerpos desvelados inhiben la actividad de GDF-8 in vitro e in vivo. En tercer lugar, los anticuerpos desvelados inhiben la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa del músculo esquelético y densidad ósea. En cuarto lugar, los anticuerpos que se desvelan son un tratamiento eficaz para trastornos musculares, en particular ELA. Estos anticuerpos tienen muchos usos adicionales, que incluyen diagnóstico, pronóstico, control, identificación sistemática, tratamiento, mejora, y/o prevención de trastornos asociados con GDF-8, por ejemplo, trastornos musculares y/o asociados a hueso.
Otros aspectos de la invención proporcionan composiciones formadas por un anticuerpo anti-GDF-8 de la invención, y el uso de tales composiciones en la inhibición o neutralización de GDF-8 en animales, en particular en seres humanos u otros animales con trastornos musculares tales como ELA. Los anticuerpos de la invención también se pueden usar en un trastorno asociado con GDF-8, por ejemplo, en un trastorno en el que se desea aumentar el tejido muscular o la densidad ósea. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GDF-8 se pueden usar en terapias y composiciones para reparar el músculo dañado, por ejemplo, miocardio, diafragma, etc. Los trastornos y enfermedades asociados con GDF-8 a modo de ejemplo tratados con los procedimientos y composiciones que se desvelan incluyen trastornos musculares y neuromusculares tales como distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrófica; atrofia muscular; atrofia de órganos; debilidad; síndrome del túnel; enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (EPOC); sarcopenia, caquexia, y otros síndromes de debilitamiento muscular; trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad); diabetes de tipo 2; tolerancia alterada a la glucosa; síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X); resistencia a la insulina (incluyendo resistencia inducida por traumatismos, por ejemplo, quemaduras o desequilibrio de nitrógeno), y enfermedades degenerativas del hueso (por ejemplo, osteoartritis y osteoporosis). En una realización preferente, pero no limitante, de la invención, una composición que contiene un anticuerpo anti-GDF-8 es para buscar un procedimiento para tratar, de reducir, o mejorar la ELA.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un anticuerpo anti-GDF-8 que se reivindica en el presente documento. En una realización, las composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, comprende una combinación de dos o más de los anticuerpos anti-GDF-8 mencionados anteriormente. Además, dentro del ámbito de la invención se encuentran combinaciones del anticuerpo anti-GDF-8 con un agente terapéutico, por ejemplo, inhibidores del factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, agentes antiinflamatorios sistémicos), inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos, y/o agentes citotóxicos o citostáticos.
En otra realización más, el anticuerpo anti-GDF-8, o una composición farmacéutica del mismo, se administra solo o en terapia de combinación, es decir, combinado con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para el tratamiento de trastornos asociados con GDF-8.
Además del uso en el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos, se pueden usar anticuerpos anti-GDF-8 como herramientas de diagnóstico para detectar de forma cuantitativa o cualitativa proteína o fragmentos de proteína GDF-8 en una muestra biológica. La presencia o cantidad de proteína GDF-8 detectadas se puede correlacionar con una o más de las aplicaciones médicas que se enumeran en el presente documento. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para diagnosticar, pronosticar, controlar, y/o identificar sistemáticamente trastornos asociados con GDF-8.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para detectar la presencia de GDF-8 en una muestra in vitro (por ejemplo, una muestra biológica, tal como suero, plasma, tejido, biopsia). El procedimiento objeto se puede usar para diagnosticar un trastorno asociado con GDF-8, por ejemplo, un trastorno óseo, muscular, adiposo o asociado con el metabolismo de la glucosa. El procedimiento incluye: (i) poner en contacto la muestra o
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E06801434
10-04-2015
una muestra de control con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-GDF-8, y la muestra o la muestra de control, en la que un cambio básicamente significativo en la formación del complejo en la muestra con respecto a la muestra de control es indicativo de la presencia de GDF-8 en la muestra.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un procedimiento para detectar la presencia de GDF-8 in vivo en un sujeto (por ejemplo, formación de imágenes in vivo en un sujeto). El procedimiento objeto se puede usar para diagnosticar un trastorno asociado con GDF-8, por ejemplo, ELA. El procedimiento incluye: (i) administrar un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento a un sujeto o un sujeto de control en condiciones que permitan la unión del anticuerpo a GDF-8; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y GDF-8, en el que una diferencia básicamente significativa en la formación del complejo en el sujeto con respecto al sujeto de control proporciona una indicación relacionada con la presencia de GDF-8.
Otras realizaciones de la divulgación proporcionan un procedimiento para diagnosticar o detectar si un paciente está padeciendo un trastorno asociado con GDF-8 (por ejemplo, trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo metabólico o inducido, trastorno adiposo, trastorno del metabolismo de la glucosa,
o trastorno relacionado con la insulina) que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de un paciente de interés; (b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (c) determinar el nivel de GDF-8 presente en la muestra del paciente; y (d) comparar el nivel de GDF-8 en la muestra del paciente con el nivel de GDF-8 en una muestra de control, en el que un aumento básico, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la muestra del paciente en comparación con el nivel de GDF-8 en la muestra de control indica si el paciente está padeciendo un trastorno asociado con GDF-8.
Otra realización adicional de la divulgación es un procedimiento para diagnosticar o detectar si un paciente está padeciendo un trastorno asociado con GDF-8 que se describe en el presente documento comprende las etapas de:
(a)
obtener una primera muestra tomada del paciente de interés; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (c) determinar el nivel de un GDF-8 en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra de un individuo afectado con el trastorno asociado con GDF-8;
(e)
poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en el que un aumento básico, disminución, o similitud en el nivel de la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica si el paciente está padeciendo un trastorno asociado con GDF-8 causado (en parte o en su totalidad) por la sobreexpresión de GDF-8. Por ejemplo, un aumento en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra puede indicar que el paciente está padeciendo el trastorno asociado con GDF-8. Por el contrario, una disminución o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra puede indicar que el paciente no está padeciendo el trastorno asociado con GDF-8.
Los anticuerpos de la invención también son útiles en procedimientos para pronosticar la probabilidad de que un paciente desarrolle un trastorno asociado con GDF-8, por ejemplo, un trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo metabólico o inducido, trastorno adiposo, trastorno del metabolismo de la glucosa, o trastorno relacionado con la insulina. En una realización preferente, pero no limitante, de la divulgación, el procedimiento comprende las etapas de: (a) obtener una primera muestra del paciente de interés; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (c) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra de un individuo no afectado con el trastorno asociado con GDF-8; (e) poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en el que un aumento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica la probabilidad de que el paciente desarrolle el trastorno asociado con GDF-8. Por ejemplo, para un trastorno asociado con GDF-8 causado (en parte o en su totalidad) por la sobreexpresión de GDF-8, es probable que el paciente desarrolle el trastorno asociado con GDF-8 si la primera muestra presenta un aumento del nivel de GDF-8 en comparación con la segunda muestra. Por el contrario, para un trastorno asociado con GDF-8 causado (en parte o en su totalidad) por la sobreexpresión de GDF-8, es improbable que el paciente desarrolle el trastorno asociado con GDF-8 si la primera muestra tiene un nivel disminuido o similar de GDF-8 en comparación con la segunda muestra.
Los anticuerpos de la invención también son útiles en procedimientos para controlar la gravedad de un trastorno asociado con GDF-8, por ejemplo, trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo metabólico o inducido, trastorno adiposo, trastorno del metabolismo de la glucosa, o trastorno relacionado con la insulina. En una realización preferente, pero no limitante, de la divulgación, el procedimiento comprende las etapas de: (a) obtener una primera muestra tomada de un paciente de interés en un primer punto temporal; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (c) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra tomada del paciente en un segundo punto temporal; (e) poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en el que un aumento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra indica si ha cambiado la gravedad del trastorno asociado con
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
GDF-8. En una realización de la divulgación, un procedimiento para el control de la invención se usa para controlar la ELA, y una disminución en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra indica que la gravedad de la ELA ha disminuido.
Un procedimiento adicional para controlar un trastorno tal como se describe en el presente documento comprende las etapas de: (a) obtener una primera muestra del paciente de interés; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (c) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra de un individuo no afectado con a trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo metabólico o inducido, trastorno adiposo, trastorno del metabolismo de la glucosa, o trastorno relacionado con la insulina; (e) poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 tal como se describe en el presente documento; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en el que un aumento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica la gravedad del trastorno de GDF-8 en ese punto. En una realización de la divulgación, un procedimiento para el control de la invención se usa para controlar ELA, y una disminución o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica que la ELA tiene una gravedad baja.
Preferentemente, el anticuerpo se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos.
En el presente documento también se desvelan procedimientos para administrar o dirigir un antagonista de la invención, por ejemplo, un anticuerpo, a una célula que expresa GDF-8 in vivo.
En el presente documento también se describen kits que comprenden los antagonistas de GDF-8, por ejemplo, los anticuerpos anti-GDF-8, de la invención para usos terapéuticos y diagnósticos.
Los objetos adicionales de la invención se establecerán en la siguiente descripción. Diversos objetos, aspectos, y ventajas de la invención se observarán y conseguirán por medio de los elementos y combinaciones señalados en particular en las reivindicaciones.
Debe apreciarse que tanto la descripción general anterior y la siguiente descripción detallada son solamente a modo de ejemplo y explicación, and no son restrictivas de la invención tal como se reivindica.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1. Caracterización del anticuerpo anti-GDF-8 de RK35. A. Unión directa del anticuerpo RK35 a GDF-8, tal como se mide con un ensayo de ELISA con GDF-8 biotinilado. Se determinó que la afinidad de unión del anticuerpo RK35 (círculos) hacia GDF-8 era 4 nM. La IgG de control no muestra unión apreciable (cuadrados). B. Efecto del anticuerpo RK35 en la unión de GDF-8 a su receptor de alta afinidad. En un ELISA de competición usando el receptor de GDF-8 de afinidad elevada, se usó ActRIIB para medir la actividad inhibidora de GDF-8 de RK35. La unión de GDF-8 biotinilado a la proteína ActRIIB quimérica humana inmovilizada fusionada con la región constante de IgG humana (Fc) se evaluó en ausencia (diamantes) o presencia de diversas concentraciones de mAb de RK35, ActRIIB soluble o IgG de control. Como controles positivo y negativo se usaron receptor de ActRIIB-Fc soluble (cuadrados) e IgG de ratón irrelevante (triángulos), respectivamente. RK35 (círculos) bloqueó la unión de GDF-8 biotinilado a ActRIIB inmovilizado con una CI50 ~ 2,5 nM. C. Inhibición de la destrucción de señal inducida por GDF
8. Células de rabdomiosarcoma que expresan gen de fusión de promotor de TGF-β-luciferasa se trataron con 10 ng/ml de GDF-8 en ausencia (cuadrados) o presencia (círculos) de concentraciones variables de anticuerpo RK35. RK35 redujo la inducción de GDF-8 de la actividad de luciferasa de una manera de respuesta a la dosis, con una CI50 de 0,2 nM. La señal de fondo (diamantes) se midió sin GDF-8 añadido.
FIG. 2. La inhibición de miostatina conduce a un aumento del peso corporal y un aumento de la masa muscular tanto en ratones como en ratas SODG93A. A. Pesos corporales de ratones SODG93A transgénicos tratados con RK35 (cuadrados) (n = 11) y tratados con PBS (diamantes) (n = 11) y ratones de control de la camada tratados con PBS (tipo silvestre) (triángulos) (n = 9). B. Pesos corporales de ratas SODG93A transgénicas macho (círculos) y hembra (triángulos) tratadas con RK35 y macho (cuadrados) y hembra (diamantes) tratados con PBS (n = 10 por grupo). C. Masa muscular de SODG93A tratados con RK35 y tratados con PBS y ratones de control de la camada tratados con PBS (n = 9-12) durante el estadio inicial de la enfermedad. Los pesos en húmedo se determinaron para los músculos gastrocnemio (gastroc), tibial craneal (tibial), cuádriceps (cuad) y diafragma (diafragma) de ratones de tipo silvestre de 88 días de edad tratados con PBS (barras de color negro), ratones SODG93A tratados con PBS (barras de color blanco), y ratones SODG93A tratados con RK35 (barras de color gris). D. Masa muscular de ratas SODG93A, tratadas con PBS (barras de color blanco) o RK35 (barras de color gris), en el estadio inicial de la enfermedad (~95 días) (n = 7 por grupo). E. Masa muscular de ratones de tipo silvestre tratados con PBS (barras de color negro), ratones SODG93A tratados con PBS (barras de color blanco), y ratones SODG93A tratados con RK35 (barras de color gris) en el estadio tardío de la enfermedad (~134 días). F. Masa muscular de ratas SODG93A, tratadas con PBS (barras de color blanco) o RK35 (barras de color gris) en el estadio tardío de la enfermedad (~128 días). Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre los grupos indicados.
15
25
35
45
55
E06801434
10-04-2015
FIG. 3. La inhibición de la miostatina aumenta la resistencia muscular en ratones y ratas SODG93A. A. Resistencia de la tensión de agarre en ratones de tipo silvestre tratados con PBS (triángulos), y ratones SODG93A tratados con cualquiera de PBS (diamantes) o RK35 (cuadrados) como una función de la edad. La resistencia de agarre de las extremidades posteriores se expresa como compresión en kilogramos (kg). B. Resistencia de agarre de las extremidades delanteras en ratones de tipo silvestre tratados con PBS (triángulos), y ratones SODG93A tratados con cualquiera de PBS (diamantes) o RK35 (cuadrados) como una función de la edad. C. Resistencia de agarre de las extremidades delanteras en ratas de tipo silvestre tratadas con PBS (WT + PBS), o ratas SODG93A tratadas con PBS (SOD + PBS) o RK35 (SOD + RK35). Para ratas, se tomaron medidas durante un intervalo de 4 semanas correspondiente a una fase inicial de la enfermedad, entre 95-110 días de edad. La resistencia de agarre de las extremidades delanteras se expresa como tensión en kilogramos (kg). Los asteriscos (*) indican una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,0001) entre los grupos indicados.
FIG. 4. Efectos de la inhibición de la miostatina en la estructura muscular y función en roedores SODG93A. La tinción con hematoxilina y eosina del músculo gastrocnemio medio de ratones a los 88 días indica atrofia significativa en (B) ratones SODG93A tratados con PBS, en comparación con cualquiera de (A) ratones SODG93A de tipo silvestre o (C) tratados con RK35. La tinción con hematoxilina y eosina del músculo gastrocnemio medio de ratones SODG93A tanto (E) tratados con PBS como (F) tratados con RK35 en el estadio terminal indica tanto atrofia muscular significativa como núcleos colocados centralmente (puntas de flecha) en comparación con (D) gastrocnemio de ratón de tipo silvestre. Tinción con hematoxilina y eosina de diafragma de (G) ratones de tipo silvestre tratados con PBS y ratones SODG93A (H) tratados con PBS o (I) tratados con RK35, respectivamente, en el estadio terminal. Los ejemplos de miofibras atróficas se marcan ("a"). El asterisco en el panel H representa división de fibras. Las barras mostradas indican 50 µm en escala en los paneles A-F y 25 µm en los paneles G-I. Panel J: Patrón de interferencia de EMG que muestra estallidos de inspiración, registrados de los músculos del diafragma de ratas de tipo silvestre tratadas con PBS (WT + PBS) o ratas SODG93A tratadas con PBS (SOD + PBS)
o RK35 (SOD + RK35). Panel K: Tasas de pico de estallido de EMG (en Hz) de los músculos del diafragma de ratas de tipo silvestre (n = 4), y de ratas SODG93A tratadas con vehículo (PBS, n = 9) o RK35 (n = 8). Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre los grupos indicados.
FIG. 5. El tratamiento con RK35 muestra la disminución del diámetro de la fibra muscular en músculo gastrocnemio a través de enfermedad en estadio inicial en ratones SODG93A, y en diafragma a través de enfermedad en el estadio terminal. Los diámetros de las fibras se midieron por morfometría en el músculo gastrocnemio de ratones SODG93A tratados con PBS (A) y tratados con RK35 (B) y ratones de tipo silvestre tratados con PBS (C) a 88 días. Las medidas eran equitativamente diferentes por ANOVA (p < 0,0001); las comparaciones por pares mediante ensayo posterior de comparación múltiple de Tukey también eran significativas (p < 0,001). Hacia el estadio terminal, no se observaron diferencias significativas en la distribución de las fibras en el músculo gastrocnemio de ratones SODG93A tratados con PBS y tratados con RK35 (no se muestran los datos). D. Análisis de diámetros de fibras de músculo del diafragma de ratones SODG93A tratados con PBS y tratados con RK35 en estadio terminal en comparación con ratones de control de tipo silvestre emparejados por edad. El músculo del diafragma de ratones SODG93A tratados con RK35 muestra una distribución del diámetro de la fibra intermedia entre ratones SODG93A tratados con PBS y ratones de control de tipo silvestre en el estadio terminal. Las medias eran significativamente diferentes por ANOVA (p < 0,0001); las comparaciones por pares mediante ensayo posterior de comparación múltiple de Tukey también eran significativas (p < 0,01). Se analizaron tres músculos por grupo; se tomaron medidas lineales del diámetro máximo del eje menor de al menos doscientas fibras, usando software Axiovision de Zeiss. Los diámetros de las fibras se combinaron en intervalos de 20 µm, y se generaron histogramas de frecuencia para cada grupo muscular.
FIG. 6. Efecto del tratamiento anti-miostatina en pérdida de neuronas motoras en el asta ventral de la médula espinal. Se muestran análisis estereológicos de neuronas motoras grandes (área superior a 300 (µm2) de las regiones L3-5 del asta ventral de ratones SODG93A tratados con cualquiera de PBS (SOD + PBS) o RK35 (SOD + RK35) en el estadio inicial (A) y el estadio terminal (C) de la enfermedad en comparación con ratones de tipo silvestre emparejados por edad (WT + PBS). El tratamiento con RK35 mostró una tendencia hacia la inversión de la pérdida de neuronas motoras (p = 0,08) en el estadio inicial de la enfermedad (A). Se realizaron recuentos individuales de neuronas motoras sanas grandes con nucleolos visibles en secciones de L3-5 teñidas con NISSL de ratones SODG93A tratados con cualquiera de PBS o RK35 en (B) el estadio inicial y (D) el estadio terminal de la enfermedad en comparación con ratones de tipo silvestre emparejados por edad. Para cada sección, se hizo recuento de ambas astas ventrales (total de 20 astas ventrales por animal) y los datos se representan como número medio de neuronas motoras grandes por asta ventral. Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas (P < 0,001) entre los grupos indicados. Las imágenes representativas de secciones de asta ventral teñidas con NISSL (aumento de 20x) se muestran para (E y H) ratones de tipo silvestre tratados con PBS, (F y I) ratones SODG93A tratados con PBS, y (G y J) ratones SODG93A tratados con RK35 se analizaron en el estadio inicial (88 días) (E-G) y en el estado terminal de la enfermedad (134 días; H-J). La barra representa una escala de 200 µm.
FIG. 7. Formación de mapas de epítopos de GDF-8 para el anticuerpo RK35. Los sitios de unión en GDF-8 para RK35 se identificaron usando solapamiento de 13 aminoácidos de péptidos de GDF-8 humano. Los sitios de contacto de RK35 con GDF-8 se presentan en negrita.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
FIG. 8. Alineación de las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de RK35 (VL y VH, respectivamente) con los armazones de línea germinal humana DPK9 y DP-47, respectivamente. Los aminoácidos de las cadenas variables de RK35 murino (MRK35) que se cambian en las regiones de RK35 humanizado (HuRK35) se indican con un asterisco (*) y se presentan en negrita; las regiones que determinan la complementariedad de RK35 se presentan en la tabla y subrayadas.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
"Anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una inmunoglobulina o una parte de la misma, e incluye cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno independientemente de la fuente, especies de origen, procedimiento de producción, y características. Para los fines de la presente invención, también incluye, a menos que se indique de otro modo, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, Fd, dAb, diacuerpos, y otros fragmentos de anticuerpo que mantienen la función de unión a antígeno. Se pueden preparar anticuerpos, por ejemplo, a través de técnicas tradicionales de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, o técnicas de presentación de fagos usando bibliotecas de anticuerpos. Para otras diversas técnicas de producción de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow y col., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
La expresión "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende el área que se une de forma específica o que es complementaria con una parte o todo un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo solamente se puede unir a una parte en particular del antígeno. El "epítopo" o "determinante antigénico" es una parte de una molécula de antígeno que es responsable de interacciones con el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno con uno o más dominios variables de anticuerpo (por ejemplo, un denominado fragmento de anticuerpo de Fd que consiste en un dominio de VH). Un dominio de unión a antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH).
El término "GDF-8" se refiere a un factor 8 de crecimiento y diferenciación específico, pero no a otros factores que se relacionan estructural o funcionalmente con GDF-8, por ejemplo, BMP-11 y otros factores que pertenecen a la superfamilia de TGF-β. El término se refiere a la forma precursora sin procesar de longitud completa de GDF-8 así como a las formas madura y propéptido que resultan de la escisión después de la traducción. El término también se refiere a cualquier fragmento y variante de GDF-8 que mantiene al menos alguna de las actividades biológicas asociadas con el GDF-8 maduro, tal como se analiza en el presente documento, incluyendo secuencias que se han modificado. La secuencia de aminoácidos del GDF-8 humano maduro se proporciona en la SEC ID Nº: 1. La presente invención se refiere a GDF-8 de todas las especies de vertebrados, que incluyen, pero no se limitan a, ser humano, bovino, pollo, ratón, rata, porcino, ovino, pavo, babuino, y pescado (para información de secuencias, véase, por ejemplo, McPherron y col., mencionado anteriormente).
La expresión "actividad de GDF-8" se refiere a una o más actividades fisiológicamente reguladoras del crecimiento o morfogenéticas asociadas con la proteína GDF-8 activa. Por ejemplo, GDF-8 activo es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético. El GDF-8 activo también puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina quinasa), estimular la proliferación de mioblastos, y modular la diferenciación de preadipocitos en adipocitos. En los Ejemplos se exponen procedimientos a modo de ejemplo para medir la actividad de GDF-8 in vivo e in vitro.
La expresión "antagonista de GDF-8" o "inhibidor de GDF-8 " incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de GDF-8. Tales inhibidores incluyen macromoléculas y moléculas pequeñas, por ejemplo, proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ARNsi, ribozimas, oligonucleótidos antisentido, ARN bicatenario, y otras moléculas pequeñas, que inhiben GDF-8. Un antagonista de GDF-8 incluye, además de los anticuerpos que se proporcionan en el presente documento, un anticuerpo que inhibe de forma eficaz GDF-8, incluyendo anticuerpos con especificidad elevada para unirse a GDF-8 (por ejemplo, anticuerpos con una afinidad baja hacia otros miembros de la superfamilia de TGF-β (por ejemplo, BMP-11)). En los procedimientos para diagnosticar, pronosticar, controlar, tratar, mejorar, y prevenir de la invención se contemplan variantes, que incluyen variantes humanizadas, de estos anticuerpos. Se dice que tales inhibidores "inhiben”, "disminuyen”, o "reducen" la actividad biológica de GDF-8.
Los términos "neutralizar”, "que neutraliza”, y sus similares se refieren a una reducción o derogación drástica de la actividad de GDF-8 con respecto a la actividad de GDF-8 en ausencia del mismo inhibidor. Por ejemplo, se puede decir que una reducción de la actividad en un 75-100 % "neutraliza" la actividad de GDF-8.
El término "tratamiento" se usa de forma indistinta en el presente documento con la expresión "procedimiento terapéutico" y se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas/ preventivas. Los individuos con necesidad de tratamiento pueden incluir individuos que ya padecen un trastorno médico en particular así como los que pueden adquirir el trastorno en última instancia (es decir, los que necesitan medidas preventivas).
El término "aislado" se refiere a una molécula que se separa básicamente de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada es una que se separa básicamente de la fuente celular o tisular de la que se deriva.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
El término "purificada" se refiere a una molécula que está básicamente libre de otro material que se asocia con la molécula en su entorno natural. Por ejemplo, una proteína purificada está básicamente libre del material celular u otras proteínas de la célula o tejido de las que se derivan. El término se refiere a preparaciones en las que la proteína aislada es lo suficientemente pura como para administrarse en forma de composición terapéutica, o pura al menos de un 70 % a un 80 % (p/p), más preferentemente, pura en al menos un 80 %-90 % (p/p), incluso más preferentemente, pura en un 90-95 %; y, lo más preferentemente, pura en al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, o un 100 % (p/p).
La expresión "dosis eficaz”, "dosis terapéuticamente eficaz”, "cantidad eficaz”, o similares se refiere a la cantidad de del compuesto que dar como resultado la mejora de los síntomas en un paciente o un resultado biológico deseado (por ejemplo, aumento de la masa del músculo esquelético y/o densidad ósea). Tal cantidad sería suficiente para reducir la actividad de GDF-8 asociará con la regulación negativa de la masa del músculo esquelético y la densidad ósea o con la homeostasis de la glucosa y metabolismo adiposo. La cantidad eficaz se puede determinar tal como se describe en el presente documento.
Un "trastorno asociado con la actividad de GDF-8”, "trastorno asociado con GDF-8”, "trastorno asociado con GDF-8"
o similares se refiere a trastornos que pueden ser causados, totalmente buen parte, por la desregulación (por ejemplo, aumento o disminución de forma anómala) de GDF-8 (y/o actividad de GDF-8), y/o trastornos que se pueden tratar, mejorar, prevenir, diagnosticar, pronosticar, o controlar mediante la regulación y/o control de GDF-8 (y/o actividad de GDF-8). Trastornos asociados con GDF-8 incluyen trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos óseos, trastornos óseos metabólicos o inducidos, trastornos adiposos, trastornos del metabolismo de la glucosa o trastornos relacionados con la insulina. Un trastorno asociado con GDF-8 de la invención preferente es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
La expresión "molécula pequeña" se refiere a compuestos que no son macromoléculas (véase, por ejemplo, Karp (2000) Bioinformatics Ontology 16: 269-85; Verkman (2004) AJP-Cell Physiol. 286: 465-74). Por lo tanto, a menudo se consideran moléculas pequeñas los compuestos que tienen menos de mil daltons (por ejemplo, Voet y Voet, Biochemistry, 2ª ed., ed. N. Rose, Wiley and Sons, Nueva York, 14 (1995)). Por ejemplo, Davis y col. ((2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 5981-86) usan la expresión molécula pequeña para indicar folatos, metotrexato, y neuropéptidos, mientras que Halpin y Harbury ((2004) PLos Biology 2: 1022-30) usan la expresión para indicar productos genéticos de molécula pequeña, por ejemplo, ADN, ARN y péptidos. Ejemplos de moléculas pequeñas naturales incluyen, pero no se limitan a, colesteroles, neurotransmisores, y ARNsi; las moléculas pequeñas sintetizadas incluyen, pero no se limitan a, diversos agentes químicos enumerados en numerosas bases de datos de moléculas pequeñas disponibles en el mercado, por ejemplo, FCD (Base de datos de Fine Chemicals), SMID (Bases de datos de Interacción de Moléculas Pequeñas), ChEBI (Entidades Químicas de Interés Biológico), y CSD (Base de datos de Estructuras de Cambridge) (véase, por ejemplo, Alfarano y col. (2005) Nuc. Acids Res. Database Issue
33: D416-24).
II.
Anticuerpos Contra GDF-8 y Fragmentos de Anticuerpo
A.
Anticuerpo de Ratón y Humanizado RK35
La presente divulgación proporciona nuevos anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos) que se unen de forma eficaz a GDF-8. Una realización ilustrativa no limitante de tal anticuerpo se denomina RK35. Esta realización a modo de ejemplo se proporciona en forma de anticuerpos de ratón y humanizados, y fragmentos de anticuerpos de los mismos.
El anticuerpo a modo de ejemplo de la divulgación, denominado en el presente documento "RK35”, posee características únicas y beneficiosas. En primer lugar, este anticuerpo y fragmentos de anticuerpos son capaces de unirse a GDF-8 maduro con afinidad elevada. En segundo lugar, el anticuerpo y fragmentos de anticuerpos de la invención inhiben la actividad de GDF-8 in vitro e in vivo tal como se demuestra, por ejemplo, mediante la inhibición de la unión de ActRIIB y ensayos de gen indicador. En tercer lugar, el anticuerpo y fragmentos de anticuerpos desvelados son útiles para tratar síntomas asociados con un trastorno asociado con GDF-8, por ejemplo, trastornos musculares, en particular ELA, tal como se demuestra, por ejemplo, mediante el aumento de la masa muscular en ratones SOD mutantes tratados.
En una realización a modo de ejemplo, los antagonistas de GDF-8 son anticuerpos que se unen de forma eficaz a GDF-8 e inhiben una o más actividades asociadas con GDF-8. Un experto habitual en la materia reconocerá que los anticuerpos de la invención se pueden usar para detectar, medir, e inhibir proteínas GDF derivadas de diversas especies, por ejemplo, las que se describen en la presente memoria descriptiva. El porcentaje de identidad se determina mediante algoritmos convencionales de alineación tales como, por ejemplo, Herramienta de Búsqueda de Alineaciones Locales Básicas (BLAST) que se describe en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, el algoritmo de Needleman y col. (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-53, o el algoritmo de Meyers y col. (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17. En general, el anticuerpo y fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden usar con cualquier proteína que mantenga actividad biológica básica de GDF-8 y comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, o superior a cualquier secuencia de al menos 100, 80, 60, 40, 20, o 15 aminoácidos contiguos de la forma madura de GDF-8 que se expone en la SEC ID
imagen6
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E06801434
10-04-2015
Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona nuevas CDR. La estructura para llevar una CDR por lo general será un polipéptido, por ejemplo, una secuencia de cadena pesada o ligera del anticuerpo o una porción básica de la misma, en la que la CDR está colocada en una posición que corresponde a la CDR de regiones VH y VL de origen natural. Las estructuras y posiciones de dominios variables de inmunoglobulinas se pueden determinar tal como se describe, por ejemplo, en Kabat y col., mencionado anteriormente y Al-Lazikani y col., mencionado anteriormente.
Las moléculas de anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) de la presente divulgación, es decir, moléculas de anticuerpos que antagonizan GDF-8, incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo RK35 monoclonal de murino y sus variantes, específicamente la variante humanizada. Los antagonistas de GDF-8 de la invención incluyen, además de RK35, otros anticuerpos que se unen de forma eficaz a GDF-8, incluyendo anticuerpos con especificidad elevada para la unión a GDF-8 (por ejemplo, anticuerpos con una afinidad más baja para otros miembros de la superfamilia de TGF-β (por ejemplo, BMP-11)). En los procedimientos para diagnosticar, pronosticar, controlar, tratar, mejorar, y prevenir de la invención se contemplan variantes, incluyendo variantes humanizadas, de estos anticuerpos. Estas moléculas de anticuerpos deben ser útiles en la prevención o tratamiento de un trastorno asociado con GDF-8, por ejemplo, patologías relacionadas con los huesos, músculo, adiposas y del metabolismo de la glucosa. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera RK35 de murino y humanizado se establecen en las SEC ID Nºs: 5 y 9, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de RK35 murino y humanizado se establecen en las SEC ID Nºs: 3 y 7, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las tres regiones que determinan la complementariedad (CDR) en las cadenas ligeras variables de RK35 murino y humanizado se establecen en las SEC ID Nºs: 13, 14, 15, 23, 24, y 25. Las secuencias de aminoácidos de las tres CDR en las cadenas pesadas variables de RK35 murino y humanizado se establecen en las SEC ID Nºs: 10, 11, 12, 20, 21, y 22.
Como se ha descrito anteriormente, las CDR contienen la mayor parte de los restos responsables de interacciones con un antígeno, y están contenidas dentro de los dominios de VH y VL, es decir, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, respectivamente. En consecuencia, con la condición de que un anticuerpo comprenda al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos que se establecen en las SEC ID Nºs: 10-15 y 20-25, o un fragmento de anticuerpo activo del mismo, es un anticuerpo de la presente divulgación, es decir, uno que se une a GDF-8 e interfiere con la señalización de GDF-8. Por lo tanto, una realización de la divulgación incluye polipéptidos, por ejemplo, anticuerpos, que contienen una o más CDR que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos que se establecen en las SEC ID Nºs: 10-15 y 20-25, o un fragmento activo de las mismas. En consecuencia, un experto en la materia reconocerá que los anticuerpos de la invención incluyen un anticuerpo en el que las CDR de la cadena de VL son las que se establecen en las SEC ID Nºs: 13-15 y 23-25, o las CDR de la cadena de VH son las que se establecen en las SEC ID Nºs: 10-12 y 20-22.
Un fragmento de unión a antígeno puede ser un fragmento de Fv, que consiste en dominios de VH y VL. Por lo tanto, un fragmento de Fv de RK35 puede constituir un anticuerpo, con la condición de que se una a GDF-8 e interfiera con la señalización de GDF-8. Un experto en la materia reconocerá que cualquier fragmento de anticuerpo que contiene un fragmento de Fv, por ejemplo, de RK35, también puede ser un anticuerpo de la divulgación. Además, cualquier fragmento de Fv, fragmento de scFv, fragmento de Fab, o fragmento de F(ab’)2, que contiene una o más CDR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos que se establecen en las SEC ID Nºs: 10-15 y 20-25, también puede ser un anticuerpo de la divulgación.
Tales moléculas de anticuerpos se pueden producir con procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales con generación de hibridomas de acuerdo con procedimientos conocidos. A continuación, los hibridomas formados de esta manera se identifican sistemáticamente usando procedimientos convencionales, tales como ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) y análisis de Biacore, para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se unía GDF-8, interfiere con la señalización de GDF-8, y neutraliza o inhibe una o más actividades asociadas con GDF-8. Como el inmunógeno se puede usar GDF-8 recombinante, GDF-8 de origen natural, cualquier variante de los mismos, y fragmentos de péptidos antigénicos de GDF-8. Un fragmento de péptido antigénico de GDF-8 comprende al menos siete restos de aminoácidos continuos e incluye un epítopo de modo que un anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo con GDF-8. Preferentemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 restos de aminoácidos, más preferentemente al menos 15 restos de aminoácidos, incluso más preferentemente al menos 20 restos de aminoácidos, y lo más preferentemente al menos 30 restos de aminoácidos. Además, es preferente que el fragmento de péptido antigénico de GDF-8 comprenda el sitio de unión al receptor de GDF-8.
Se pueden producir sueros y anticuerpos policlonales de la invención por inmunización de un sujeto adecuado con GDF-8, sus variantes, y/o partes del mismo. El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede controlar en el tiempo con técnicas convencionales, tales como un ELISA, o mediante el uso de GDF-8 inmovilizado otras proteínas marcadoras (por ejemplo, FLAG). Si se desea, las moléculas de anticuerpo de la presente invención se pueden aislar del sujeto o unos medios de cultivo y purificar adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A, para obtener una fracción de IgG.
Ciertas realizaciones de la divulgación comprenden el dominio de VH y/o VL del fragmento de Fv de RK35. Se
E06801434
10-04-2015
pueden producir fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación, por ejemplo, fragmentos de Fab, F(ab’)2, Fd, y dAb, por escisión de los anticuerpos de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos de Fab y F(ab’)2 inmunológicamente activos por tratamiento de los anticuerpos con una enzima tal como papaína y pepsina.
5 Las realizaciones adicionales de la divulgación comprenden una o más CDR de cualquiera de los dominios de VH y VL, tal como se establece en las SEC ID Nºs: 10-15 y 20-25. Una realización comprende un fragmento de H3 del dominio de VH de RK35 tal como se establece en la SEC ID Nº: 12.
Las secuencias de ADN y de aminoácidos (AA) de dominios de VH y VL, y las CDR de los anticuerpos que se desvelan por la presente se enumeran tal como se enumeran en la Tabla 1. Por conveniencia, las posiciones 10 aproximadas de cada CDR dentro de los dominios de VH y VL se enumeran en la Tabla 2.
Tabla 1: Secuencias de ADN y Aminoácidos de VH, VL, CH, CL y CDR en RK35
RATÓN
sec. de ADN de VH SEC ID Nº: 2
sec. de AA de VH
SEC ID Nº: 3
sec. de ADN de VL
SEC ID Nº: 4
sec. de AA de VL
SEC ID Nº: 5
HUMANIZADO
sec. de ADN de VH SEC ID Nº: 6
sec. de AA de VH
SEC ID Nº: 7
sec. de ADN de VL
SEC ID Nº: 8
sec. de AA de VL
SEC ID Nº: 9
CDR EN BASE A DEFINICIONES DEKABAT O AbM (itál)
secuencia de AA de H1 SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 20
secuencia de AA de H2
SEC ID Nº: 11 o SEC ID Nº: 21
secuencia de AA de H3
SEC ID Nº: 12 o SEC ID Nº: 22
secuencia de AA de LI
SEC ID Nº: 13 o SEC ID Nº: 23
secuencia de AA de L2
SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 24
secuencia de AA de L3
SEC ID Nº: 15 o SEC ID Nº: 25
sec. de ADN de CL
SEC ID Nº: 16
sec. de AA de CL
SEC ID Nº: 17
sec. de ADN de CH
SEC ID Nº: 18
sec. de AA de CH
SEC ID Nº: 19
Tabla 2: Posición aproximada de CDR de acuerdo con definiciones de Kabat (no itál.) o AbM (itál.) dentro de regiones variables de anticuerpos de ratón y humanizados de RK35 15
CDR
SEC ID Nº: 3 de RK35 SEC ID Nº: 7 de RK35
H1
31-35 o 26-35 31-35 o 26-35
H2
50-66 o 50-59 50-66 o 50-59
H3
99-105 o 99-105 99-105 o 99-105
SEC ID Nº: 5
SEC ID Nº: 9
L1
24-34 o 24-34 24-34 o 24-34
L2
50-56 o 50-56 50-56 o 50-56
L3
89-95 o 89-95 89-95 o 89-95
25
35
45
55
E06801434
10-04-2015
Los anticuerpos anti-GDF-8 pueden comprender adicionalmente regiones constantes de un anticuerpo o partes del mismo. Por ejemplo, un dominio de VL de la invención puede estar unido en su extremo C-terminal a un dominio constante de cadena ligera del anticuerpo, por ejemplo, una cadena Cκ o Cλ humana, preferentemente una cadena Cλ. De forma análoga, un fragmento de unión a antígeno en base a un dominio de VH puede estar unido en su extremo C-terminal a toda o una parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, e IgM, y cualquiera de las subclases de isotipos, en particular IgG1 e IgG4. En realizaciones a modo de ejemplo, los anticuerpos comprenden fragmentos C-terminales de cadenas pesadas y ligeras de IgG1λ humana. En las SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 17, respectivamente, se establecen secuencias de ADN y de aminoácidos preferentes para el fragmento constante C-terminal de la cadena λ ligera. En las SEC ID Nº: 18 y SEC ID Nº: 19, respectivamente, se establecen secuencias de ADN y de aminoácidos preferentes para el fragmento constante C-terminal de la cadena pesada de IgG1. Se entiende que, debido a la degeneración del código genético, las secuencias de ADN que se enumeran en la Tabla 1 son simplemente representativas de los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos, péptidos, y anticuerpos de interés, y no se pretende que sean limitantes.
Determinadas realizaciones de la divulgación comprenden el dominio de VH y/o VL del fragmento de Fv de RK35. Realizaciones adicionales comprenden una o más regiones que determinan la complementariedad (CDR) de cualquiera de estos dominios de VH y VL. Una realización comprende un fragmento H3 del dominio de VH de RK35. Los dominios de VH y VL de la invención, en determinadas realizaciones, son de línea germinal, es decir, las regiones de marco conservado (FR) de estos dominios se cambian usando técnicas convencionales de biología molecular para emparejar las secuencias de aminoácidos consenso de productos genéticos de línea germinal humana. Esto también se conoce como anticuerpo humanizado o de línea germinal. En otras realizaciones, las secuencias de marco conservado permanecen separadas de la línea germinal. Se pueden producir anticuerpos humanizados usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina endógena, pero son capaces de expresar genes humanos de cadena pesada y ligera.
C. Anticuerpos Modificados y Sus Fragmentos
Un aspecto adicional de la invención proporciona procedimientos para obtener un dominio de unión a antígeno de anticuerpo dirigido contra GDF-8. El experto en la materia observará que los anticuerpos que se describen o se reivindican en el presente documento no están limitados a las secuencias específicas de VH y VL tal como se enumera en la Tabla 1 sino que también incluyen variantes de estas secuencias que mantienen la capacidad de unión a antígeno. Tales variantes se pueden derivar de las secuencias proporcionadas usando técnicas conocidas en la técnica. Se pueden preparar sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos en cualquiera de las FR o en las CDR. Aunque normalmente se diseñan cambios en las regiones de marco conservado para mejorar la estabilidad y reducir la inmunogenicidad del anticuerpo, normalmente se diseñan cambios en las CDR para aumentar la afinidad del anticuerpo hacia su diana. Tales cambios que aumentan la afinidad por lo general se determina de forma empírica alterando la CDR y sometiendo al ensayo el anticuerpo. Tales alteraciones se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos que se describen en, por ejemplo, Antibody Engineering, 2ª. ed., Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995.
Por lo tanto, los anticuerpos de la invención también incluyen los que se unen a GDF-8, interfieren con la señalización de GDF-8, y tienen mutaciones en las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera. En ocasiones es deseable mutar e inactivar determinados fragmentos de la región constante. Por ejemplo, en ocasiones son deseables mutaciones en la región constante pesada para producir anticuerpos con unión reducida al receptor y/o complemento de Fc (FcR); tales mutaciones o bien conoce en la técnica. Un experto en la materia también reconocerá que la determinación de qué fragmentos activos de las subunidades CL y CH son necesarios dependerá de la aplicación a la que se aplica un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, los fragmentos activos de las subunidades CL y CH que están implicados con su enlace covalente entre sí será importante para la generación de un anticuerpo intacto.
El procedimiento para preparar un dominio de VH que es una variante de secuencia de aminoácidos de un dominio de VH establecido en el presente documento comprenden etapa de adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio de VH que se desvela por la presente, opcionalmente por combinación del dominio de VH proporcionado de este modo con uno o más dominios de VL, y sometiendo a ensayo el dominio de VH o combinación o combinaciones de VH/VL para la unión a GDF-8, y (preferentemente) sometiendo a ensayo la capacidad de tal dominio de unión a antígeno para modular una o más actividades asociadas con GDF-8. El dominio de VL puede tener una secuencia de aminoácidos que es básicamente tal como se establece en el presente documento. Se puede usar un procedimiento análogo en el que una o más variantes de secuencias de un dominio de VL que se desvelan el presente documento se combinan con uno o más dominios de VH.
Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para preparar un fragmento de unión a antígeno que interactúa con GDF-8. El procedimiento comprende:
(a) proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio de VH que además incluye una CDR, por ejemplo, CDR3, a sustituir o un dominio de VH que carece de una región que codifica una CDR, por ejemplo, CDR3;
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
(b)
combinar el repertorio con un ácido nucleico dador que codifica una CDR dadora que comprende un fragmento activo de la SEC ID Nº: 2 o 6, por ejemplo, un ácido nucleico dador que codifica la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC ID Nº: 3 o 7, de modo que el ácido nucleico dador se inserta en la región de CDR, por ejemplo, CDR3, en el repertorio con el fin de proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio de VH;
(c)
expresar los ácidos nucleicos del repertorio de producto;
(d)
seleccionar un fragmento de unión a antígeno que interactúa con GDF-8; y
(e)
recuperar el fragmento de unión a antígeno o ácido nucleico seleccionado que lo codifica.
De nuevo, se podría usar un procedimiento análogo en el que una CDR3 de VL (por ejemplo, L3) de la invención se combina con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio de VL, el cual o bien incluye una CDR a sustituir o carece de una región que codifique la CDR.
Una secuencia de codificación de una CDR de la divulgación (por ejemplo, CDR3) se puede introducir en un repertorio de dominios variables que carecen de una CDR (por ejemplo, CDR3), usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks y col. (1992) Bio/Technology 10: 779-83, describen procedimientos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que se usan cebadores consenso dirigidos o adyacentes al extremo en la posición 5’ del área del dominio variable en conjunto con cebadores consenso para la tercera región de marco conservado de genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables de VH que carecen de una CDR3. El repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo en particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente divulgación se pueden barajar con repertorios de dominios de VH o VL que carecen de una CDR3, y los dominios completos de VH o VL barajados se combina con un dominio de VL o VH similar para proporcionar fragmentos de unión a antígeno. A continuación, el repertorio se puede presentar en un sistema huésped adecuado, tal como sistema de presentación de fagos, por ejemplo, del documento WO 92/01047, de modo que se pueden seleccionar fragmentos adecuados de unión a antígeno.
También se desvelan técnicas análogas de barajado o de combinación en Stemmer (1994) Nature 370: 389-91, que describe una técnica con relación a un gen de β-lactamasa y además observa que el enfoque se puede usar para la generación de anticuerpos.
Una alternativa adicional es generar nuevas regiones de VH o VL que portan una secuencia derivada de CDR de la invención usando mutagénesis aleatoria de uno o más genes seleccionados de VH y/o VL para generar mutaciones dentro de todo el dominio variable. Tal técnica se describe en Gram y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 3576-80 mediante el uso de PCR propensa a error.
Otro procedimiento que se puede usar para generar nuevos anticuerpos o fragmentos de los mismos es dirigir mutagénesis a las CDR de genes de VH o VL. Tales técnicas se desvelan en Barbas y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3809-13 y Schier y col. (1996) J. Mol. Biol. 263: 551-67.
De forma análoga, una, dos, o las tres CDR, se pueden injertar en un repertorio de dominios de VH o VL que a continuación se identifican sistemáticamente para un asociado de unión o fragmentos de unión para GDF-8.
Una parte básica de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá al menos las CDR y, opcionalmente, sus regiones de marco conservado de intervención de los fragmentos de anticuerpos tal como se establece en el presente documento. La parte también incluirá al menos un 50 % de cualquiera o ambas de FR1 y FR4, siendo un 50 % el 50 % C-terminal de FR1 y el 50 % N-terminal de FR4. Pueden ser restos adicionales en el extremo Nterminal o C-terminal de la parte básica del dominio variable los que no se asocian normalmente con regiones de dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la construcción de fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación preparada mediante técnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de restos N-o C-terminales codificados mediante engarces introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de encajes para unir dominios variables de la divulgación secuencias de proteínas adicionales que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulinas, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o marcas de proteína tal como se analiza con más detalles a continuación.
Aunque las realizaciones ilustradas en los Ejemplos comprenden un par de "emparejamiento" de dominios de VH y VL, la divulgación también incluye fragmentos de unión que contienen un solo dominio variable, por ejemplo, un fragmento de dAb, derivado de cualquiera de las secuencias de dominio de VH o VL, especialmente dominios de VH. En el caso de cualquiera de los dominios de unión de una sola cadena, estos dominios se pueden usar para identificar sistemáticamente dominios de complementariedad capaces de formar un dominio de unión a antígeno de dos dominios capaz de unirse a GDF-8. Esto se puede conseguir mediante procedimientos de identificación sistemática de presentación de fagos usando el denominado doble enfoque combinatorio jerárquico tal como se desvela, por ejemplo, en el documento WO 92/01047. En esta técnica, se usa una colonia individual que contiene cualquiera de un clon de cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el dominio de unión a antígeno de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de presentación de fagos, tales como las que se describen en esa referencia. Esta técnica también se desvela en Marks y col., mencionado anteriormente.
imagen7
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
ligera humanas en el genoma del huésped. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humanos requeridos. A continuación, se obtiene un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas como progenie mediante cruce de animales transgénicos intermedios que contienen menos del complemento total de las modificaciones. Una realización de tal animal o humano es un ratón, y se denomina XENOMOUSE™ tal como se desvela en las publicaciones PCT del documento WO 96/33735 y el documento WO 96/34096. Este animal produce linfocitos B que segregan inmunoglobulinas totalmente humanas. Los anticuerpos se pueden obtener directamente del animal después de la inmunización con un inmunógeno de interés, por ejemplo, como una preparación de un anticuerpo policlonal, o como alternativa a partir de linfocitos B inmortalizados derivados del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Además, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas se pueden recuperar y expresar para obtener los anticuerpos directamente, o se pueden modificar adicionalmente para obtener análogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moléculas de Fv de una sola cadena.
En consecuencia, el término anticuerpo tal como se usa en el presente documento incluye anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos de Fab, F(ab’)2 Fd, dAb y scFv, y anticuerpos y fragmentos intactos cualquiera de los que se ha mutado en sus regiones constantes y/o variables (por ejemplo, mutaciones para producir anticuerpos quiméricos, parcialmente humanizados, o totalmente humanizados, así como para producir anticuerpos con un rasgo deseado, por ejemplo, aumento de la unión a GDF-8 y/o reducción de la unión FcR).
Otras moléculas de unión a proteínas también se pueden usar para modular la actividad de GDF-8. Tales moléculas de unión a proteínas incluyen fármacos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP™) (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA). Los SMIP son polipéptidos de una sola cadena formados por un dominio de unión para una estructura similar tal como un antígeno, un contrarreceptor o similar, un polipéptido de región bisagra que tiene uno o ningún resto de cisteína, y dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina (véase también www.trubion.com). Los SMIP y sus usos y aplicaciones se desvelan, por ejemplo, en las Sols. de Patente Publicadas de Estados Unidos Nº 2003/0118592, Nº 2003/0133939, Nº 2004/0058445, Nº 2005/0136049, Nº 2005/0175614, Nº 2005/0180970, Nº 2005/0186216, Nº 2005/0202012, Nº 2005/0202023, Nº 2005/0202028, Nº 2005/0202534, y Nº 2005/0238646, y miembros relacionados de la familia de patentes de los mismos.
La capacidad de unión de un anticuerpo de la invención se puede medir con los siguientes procedimientos: análisis de Biacore, ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA), cristalografía de rayos X, análisis de secuencias y mutagénesis de exploración tal como se describe en los Ejemplos que siguen a continuación, y otros procedimientos que son bien conocidos en la técnica. La capacidad de un anticuerpo de la invención para neutralizar y/o inhibir una
o más actividades asociadas con GDF-8 se puede medir mediante la siguiente lista no limitante de procedimientos: ensayos para medir la proliferación de una línea celular dependiente de GDF-8; ensayos para medir la expresión de polipéptidos mediados por GDF-8; ensayos para medir la actividad de moléculas de señalización cadena abajo; ensayos para someter a ensayo la eficacia de un anticuerpo de la invención para prevenir trastornos musculares en un modelo animal relevante; ensayos como se describen en los Ejemplos que siguen a continuación; y otros ensayos que se conocen bien en la técnica.
Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para seleccionar anticuerpos capaces de unirse a GDF-8 y neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas con GDF-8. el procedimiento comprende:
a) poner en contacto una pluralidad de anticuerpos con GDF-8;
b) elegir anticuerpos que se unan a GDF-8;
c) someter a ensayo la capacidad de anticuerpos elegidos para evitar que GDF-8 segura al receptor de GDF-8; y
d) seleccionar anticuerpos capaces de evitar que GDF-8 se una a su receptor.
Los anticuerpos anti-GDF-8 de la invención también son útiles para aislar, purificar, y/o detectar GDF-8 en sobrenadantes, lisados celulares, o en una superficie celular. Los anticuerpos que se desvelan en la presente invención se pueden usar como forma de diagnóstico para controlar los niveles de proteína GDF-8 como parte de un procedimiento de ensayo clínico. Además, los anticuerpos de la invención se puede usar en tratamientos que requieren la neutralización y/o inhibición de una o más actividades asociadas con GDF-8, por ejemplo, tratamientos para ELA y otras patologías relacionadas con el músculo. La presente invención también proporciona nuevos polinucleótidos y polipéptidos aislados y purificados relacionados con nuevos anticuerpos dirigidos contra GDF-8 humano. Los genes, polinucleótidos, proteínas, y polipéptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de murino y humanizados para GDF-8 (por ejemplo, RK35) y variantes de los mismos.
D. Ácidos Nucleicos, Clonación, y Sistemas de Expresión
La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados y purificados que codifican anticuerpos de la presente invención. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender ADN o ARN y pueden ser tan total o parcialmente sintéticos. Las referencias a secuencias de nucleótidos tal como se establece en el presente documento incluyen moléculas de ADN con las secuencias o equivalentes genómicos especificados, así como moléculas de ARN con las secuencias especificadas en las que U se sustituye por T, a menos que el contexto lo requiera de otro modo.
imagen8
E06801434
10-04-2015
al 50 %
(continuación)
Condición
Híbrido Longitud del Híbrido (pb)1 Temperatura de Hibridación y Tampón2 Temperatura de Lavado y Tampón2
B
ADN:ADN < 50 TB*; 1X SSC TB*; 1X SSC
C
ADN:ARN > 50 67 ºC; 1X SSC -o -45 ºC; 1X SSC, formamida al 50 % 67 ºC; 0,3X SSC
D
ADN:ARN < 50 TD*; 1X SSC TD*; 1X SSC
E
ARN:ARN > 50 70 ºC; 1X SSC -o -50 ºC; 1X SSC, formamida al 50 % 70 ºC; 0,3X SSC
F
ARN:ARN < 50 TF*; 1X SSC TF*; 1X SSC
G
ADN:ADN > 50 65 ºC; 4X SSC -o -42 ºC; 4X SSC, formamida al 50 % 65 ºC; 1X SSC
H
ADN:ADN < 50 TH*; 4X SSC TH*; 4X SSC
I
ADN:ARN > 50 67 ºC; 4X SSC -o -45 ºC; 4X SSC, formamida al 50 % 67 ºC; 1X SSC
J
ADN:ARN < 50 TJ*;4XSSC TJ*;4XSSC
K
ARN:ARN > 50 70 ºC; 4X SSC -o -50 ºC; 4X SSC, formamida al 50 % 67 ºC; 1X SSC
L
ARN:ARN < 50 TL*; 2X SSC TL*; 2X SSC
M
ADN:ADN > 50 50 ºC; 4X SSC -o -40 ºC; 6X SSC, formamida al 50 % 50 ºC; 2X SSC
N
ADN:ADN < 50 TN*; 6X SSC TN*; 6X SSC
O
ADN:ARN > 50 55 ºC; 4X SSC -o -42 ºC; 6X SSC, formamida al 50 % 55 ºC; 2X SSC
P
ADN:ARN < 50 TP*; 6X SSC TP*; 6X SSC
Q
ARN:ARN > 50 60 ºC; 4X SSC -o -45 ºC; 6X SSC, formamida al 50 % 60 ºC; 2X SSC
R
ARN:ARN < 50 TR*; 4X SSC TR*; 4X SSC
1La longitud del híbrido es la que se anticipa para la región por regiones hibridadas de los polinucleótidos de hibridación. Cuando se hibrida un polinucleótido a un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es la del polinucleótido de hibridación. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida, la longitud del híbrido se puede determinar por alineación de las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencias óptima.2SSPE (1xSSPE es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) se puede sustituir por SSC (1xSSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM) en los hampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después de completar la hibridación. TB* -TR*: La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipa que tienen menos de 50 pares de bases de longitud debería ser de 5-10 ºC inferior a la temperatura de fusión (Tf) del híbrido, en la que la Tf se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos con una longitud de menos de 18 pares de bases, Tf (ºC) = 2(Nº de bases A + T) + 4(Nº de bases G + C). Para híbridos con una longitud entre 18 y 49 pares de bases, Tf (ºC) = 81,5 + 16,6(log10Na+) + 0,41 (% de G+ C) -(600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido, y Na+ es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación (Na+ para 1X SSC = 0,165 M). Ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para hibridación de polinucleótidos se proporcionan en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Capítulos 9 y 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Secciones 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995), que se incorporan en el presente documento por referencia.
Los polinucleótidos aislados de la presente invención se pueden usar como sondas y cebadores de hibridación para identificar y aislar ADN que tienen secuencias que codifican variantes alélicas de los polinucleótidos que se desvelan. Las variantes alélicas son formas alternativas de origen natural de los polinucleótidos que se desvelan que
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
codifican polipéptidos que son idénticos o que tienen similitud significativa con los polipéptidos codificados por los nucleótidos que se desvelan. Preferentemente, las variantes alélicas tienen al menos una identidad de secuencia de un 90 % (más preferentemente, una identidad de al menos un 95 %; lo más preferentemente, una identidad de al menos un 99 %) con los polinucleótidos desvelados.
Los polinucleótidos aislados de la presente invención también se prevén usar como sondas y cebadores de hibridación para identificar y aislar ADN que tienen secuencias que codifican polipéptidos homólogos a los polinucleótidos que se desvelan. Estos homólogos son polinucleótidos y polipéptidos aislados de una especie diferente a la de los polipéptidos y polinucleótidos que se desvelan, o dentro de la misma especie, pero con una similitud de secuencia significativa para los polinucleótidos y polipéptidos que se desvelan. Preferentemente, los homólogos de polinucleótidos tienen una identidad de secuencia de al menos un 50 % (más preferentemente, una identidad de al menos un 75 %; lo más preferentemente, una identidad de al menos un 90 %) con los polinucleótidos que se desvelan, mientras que los homólogos de polipéptidos tienen una identidad de secuencia de al menos un 30 % (más preferentemente, una identidad de al menos un 45 %; lo más preferentemente, una identidad de al menos un 60 %) con los anticuerpos/polipéptidos que se desvelan. Preferentemente, los homólogos de los polinucleótidos y polipéptidos que se desvelan son los que se aíslan de especies de mamíferos.
Los polinucleótidos aislados de la presente invención también se pueden usar como sondas y cebadores de hibridación al identificar células y tejidos que expresan los anticuerpos de la presente invención y las condiciones en las que se expresan.
Además, los polinucleótidos aislados de la presente invención se pueden usar para alterar (es decir, aumentar, reducir, o modificar) la expresión de los genes que corresponden a los polinucleótidos de la presente invención en una célula u organismo. Estos "genes correspondientes" son las secuencias de ADN genómicas de la presente invención que se transcriben para producir los ARNm a partir de los cuales se derivan los polinucleótidos de la presente invención.
La presente invención también proporciona constructos en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención tal como se ha mencionado anteriormente.
Los polinucleótidos aislados de la presente invención se pueden unir de forma operativa a una secuencia de control de la expresión para producción recombinante de los polipéptidos de la presente invención. Además, un experto en la materia reconocerá que los polinucleótidos de la invención se pueden unir de forma operativa a secuencias de nucleótidos bien conocidas que codifican la región constante de diversos isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención que codifica una región o regiones variables de cadena ligera de la invención (por ejemplo, la secuencia que se establece en la SEC ID Nº: 8) se puede unir de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante (o derivados de la misma) de cualquiera de una cadena ligera κ o cadena ligera λ, de modo que la expresión de los nucleótidos unidos dará como resultado una cadena ligera completa kappa o lambda con una región variable que se une de forma específica y neutraliza GDF-8. De forma análoga, un polinucleótido de la invención que codifica una región variable de cadena pesada de la invención (por ejemplo, la secuencia establecida en la SEC ID Nº: 6) se puede unir de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de un isotipo de cadena pesada (o derivados de los mismos), por ejemplo, IgM, IgD, IgE, IgG e IgA. En la técnica se conocen bien procedimientos generales para expresar proteína recombinantes. Tales proteínas recombinantes se pueden expresar en forma soluble para su uso en el tratamiento de trastornos relacionados con la actividad de GDF-8, por ejemplo, trastornos degenerativos musculares y óseos.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación), secuencias de marca tales como histidina, y genes marcadores que se pueden seleccionar. El gen marcador que se puede seleccionar facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector. Por ejemplo, por lo general el gen marcador que se puede seleccionar confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores que se pueden seleccionar preferentes incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped dhfrcon selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).
Se pueden elegir o construir vectores adecuados, que contienen secuencias de regulación apropiadas, incluyen secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadas, genes marcadores y otras secuencias que sean apropiadas. Los vectores pueden ser plásmidos o virales, por ejemplo, fago, o fagémido, si fuera apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª ed., Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Muchas técnicas y protocolos conocidos para manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, para preparación de constructos de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN de células y expresión genética, y análisis de proteínas, se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, 2ª ed., Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1992.
La presente invención también proporciona una célula huésped que comprende uno o más constructos tal como se mencionó anteriormente. Un ácido nucleico que codifica cualquier dominio de CDR (H1, H2, H3, L1, L2, o L3), VH o
imagen9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E06801434
10-04-2015
genética. Tales condiciones son bien conocidas en la técnica.
III. Procedimientos para Tratar, Mejorar, Prevenir, e Inhibir el Progreso de Trastornos Óseos, Adiposos, Metabolismo de Glucosa, Insulina y Musculares
La implicación de GDF-8 en ELA, y el descubrimiento de los nuevos anticuerpos de la invención, permite procedimientos para tratar, aliviar, y mejorar trastornos asociados con GDF-8, por ejemplo, trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos óseos, trastornos óseos metabólicos o inducidos, trastornos del metabolismo de la glucosa, trastornos adiposos, y trastornos relacionados con la insulina. Además, los anticuerpos permiten diagnosticar, pronosticar y controlar el progreso de trastornos óseos, musculares, adiposos o de insulina midiendo el nivel de GDF-8 en una muestra biológica. En particular, los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar un individuo con ELA u otro trastorno muscular, o en un procedimiento para distinguir si un paciente está padeciendo ELA u otro trastorno muscular.
Los anticuerpos de la presente invención son útiles para prevenir, diagnosticar, o tratar diversos trastornos médicos en seres humanos o animales. Los anticuerpos se pueden usar para inhibir o reducir una o más actividades asociadas con GDF-8. Más preferentemente, los anticuerpos inhiben o reducen una más de las actividades de GDF8 con respecto a actividades de GDF-8 sin unir. En determinadas realizaciones, la actividad de GDF-8, cuando se une con uno o más anticuerpos anti-GDF-8 se inhibe al menos en un 50 %, preferentemente al menos en un 60, un 62, un 64, un 66, un 68, un 70, un72, un 72, un 76, un 78, un 80, un 82, un84, un 86, o un 88%, más preferentemente al menos un 90, un 91, un 92, un 93, o un 94 %, e incluso más preferentemente al menos de un 95 % a un 100 % con respecto a una proteína GDF-8 madura que no está unida con uno o más dedos anticuerpos anti-GDF-8. La inhibición en la neutralización de la actividad de GDF-8 se puede medir, por ejemplo, en ensayos de genes indicadores (RGA) de pGL3(CA-GA)12 tal como se describe en Thies y col., mencionado anteriormente, y en ensayos de receptor ActRIIB tal como se ilustra en los Ejemplos.
Los trastornos médicos diagnosticados, pronosticados, controlados, tratados como mejorados o prevenidos con anticuerpos GDF-8 son trastornos asociados con GDF-8, por ejemplo, trastornos musculares o neuromusculares que incluyen, por ejemplo, distrofia muscular (DM; incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular, atrofia de órganos, debilidad, síndrome del túnel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, y otros síndromes de debilidad muscular (por ejemplo, causados por otras enfermedades y afecciones). Además, otros trastornos médicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, controlar, tratar, mejorar o prevenir con los anticuerpos GDF-8 son del trastornos tejido adiposo tales como obesidad, diabetes de tipo 2, tolerancia alterada a la glucosa, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por traumatismos (tales como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno), o enfermedades degenerativas óseas (por ejemplo, osteoartritis, osteoporosis, etc.). En realizaciones preferentes, los trastornos que se diagnostican, pronostican, controlan, tratan, mejoran o previenen con anticuerpos GDF-8 son trastornos musculares o neuromusculares. En una realización más preferente, el trastorno muscular o neuromuscular que se diagnostica, pronostica, controla, trata, mejora o previene con anticuerpos anti-GDF-8 es cualquiera de DM o ELA. En la realización más preferente de la invención, el trastorno muscular o neuromuscular que se diagnostica, pronostica, controla, trata, mejora o previene con antagonistas de GDF-8 de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos que inhiben la actividad de GDF-8, es ELA.
Otros trastornos médicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, controlar, tratar, mejorar o prevenir con antagonistas de GDF-8 son los asociados con una pérdida de hueso, que incluyen osteoporosis, especialmente en las mujeres de mayor edad y/o postmenopáusicas, osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteopenia, osteoartritis, y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Otras enfermedades y trastornos óseos metabólicos diana incluyen masa ósea reducida debido a terapia crónica con glucocorticoides, insuficiencia de gónadas prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa. Los anticuerpos se usan preferentemente para diagnosticar, pronosticar, controlar, tratar, mejorar
o prevenir tales trastornos en mamíferos, en particular en seres humanos.
Los anticuerpos de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con la edad, condición, y sexo del sujeto, así como con la gravedad de la afección médica en el sujeto. La dosificación la puede determinar un médico y la puede ajustar, si fuera necesario, para que se adapte a los efectos observados del tratamiento. La toxicidad de eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares
o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéutica mente eficaz en un 50 % de una población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos, es decir, la DL50/DE50, es el índice terapéutico, y son preferentes los anticuerpos que presentan índices terapéuticos elevados.
Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos permanece preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación y la vía de administración. Para cualquier anticuerpo usado en la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
estimar inicialmente a partir de ensayos en cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI50 (por ejemplo, la concentración del anticuerpo de ensayo que consigue una inhibición máxima media de síntomas o una inhibición máxima media de inhibición de la actividad biológica) tal como se determina en cultivo celular. Se pueden medir niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Los efectos de cualquier dosificación en particular se pueden controlar mediante un bioensayo adecuado. Los ejemplos de bioensayos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ensayos de replicación del ADN, ensayos basados en transcripción, ensayos de unión a proteína/receptor de GDF-8, ensayos de creatina quinasa, ensayos en base a la diferenciación de preadipocitos, ensayos en base a la absorción de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunológicos.
Generalmente, las composiciones se administran de modo que los anticuerpos o sus fragmentos de unión se proporcionan a una dosis de 1 µg/kg a 150 mg/kg, de 1 µg/kg a 100 mg/kg, de 1 µg/kg a 50 mg/kg, de 1 µg/kg a 20 mg/kg, de 1 µg/kg a 10 mg/kg, de 1 µg/kg a 1 mg/kg, de 10 µg/kg a 1 mg/kg, de 10 µg/kg a 100 µg/kg, de 100 µg/kg a 1 mg/kg, y de 500 µg/kg a 1 mg/kg. Preferentemente, los anticuerpos se proporcionan como una dosis de bolo para maximizar los niveles en circulación de anticuerpos para el período de tiempo más elevado después de la dosis. También se puede usar infusión continua antes, después, o en lugar de la dosis de bolo.
IV. Procedimientos para Identificar Agentes Terapéuticos
Además, otro aspecto de la divulgación proporciona un procedimiento para identificar agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del músculo, por ejemplo, trastornos de metabolismo de la glucosa, adiposos, y óseos. En la técnica se conocen ensayos de identificación sistemática apropiados, por ejemplo, ensayos basados en ELISA. En tal ensayo de identificación sistemática, se forma una primera mezcla de unión por combinación de un anticuerpo de la invención y su ligando, GDF-8, y se mide la cantidad de unión entre el ligando y el anticuerpo en la primera mezcla de unión (M0). También se forma una segunda mezcla de unión por combinación del anticuerpo, el ligando, y un compuesto o agente a identificar sistemáticamente, y se mide la cantidad de unión entre el ligando y el anticuerpo en la segunda mezcla de unión (M1). Las cantidades de unión en la primera y segunda mezclas de unión se comparan a continuación, por ejemplo, calculando la relación M1/M0. Se considera que el compuesto o agente es capaz de inhibir la actividad de GDF-8 si se observa una disminución de la unión en la segunda mezcla de unión en comparación con la primera mezcla de unión (es decir, M1/M0 < 1). La formulación y optimización de las mezclas de unión está dentro del nivel de experiencia en la materia; tales mezclas de unión también pueden contener tampones y sales necesarias para aumentar o para optimizar la unión, y se pueden incluir ensayos de control adicionales en el ensayo de identificación sistemática de la divulgación.
De este modo se pueden identificar compuestos que se encuentra que reducen la unión de anticuerpo-ligando en al menos aproximadamente un 10 % (es decir, M1/M0 < 0,9), preferentemente superior a aproximadamente un 30 %, y a continuación, si se desea, identificar sistemáticamente de forma secundaria la capacidad para inhibir la actividad de GDF-8 en otros ensayos tales como el ensayos de unión a ActRIIB, u otros ensayos basados en células e in vivo tal como se describe en dos Ejemplos o se conocen bien en la técnica.
V. Moléculas Pequeñas
También se puede conseguir la inhibición de la actividad de GDF-8 en un organismo (o sujeto) afectado con (o con riesgo de) un trastorno asociado con GDF-8, o en una célula de tal organismo implicado en tales trastornos, a través del uso de moléculas pequeñas antagonistas (normalmente moléculas pequeñas orgánicas) que antagonizan, es decir, inhiben la actividad de, GDF-8. Se pueden identificar nuevas moléculas pequeñas antagonistas mediante los procedimientos de identificación sistemática que se han descrito anteriormente y se pueden usar en los procedimientos de tratamiento que se describen en el presente documento.
A la inversa, el aumento de la actividad de GDF-8 en un organismo (o sujeto) afectado con (o en riesgo de) un trastorno relacionado con la disminución de la expresión y/o actividad de GDF-8 o un trastorno relacionado con la disminución de los niveles de GDF-8 también se puede conseguir a través del uso de moléculas pequeñas (normalmente moléculas pequeñas orgánicas) que antagonizan, es decir, aumentan la actividad de, GDF-8. Se pueden identificar nuevas moléculas pequeñas antagonistas mediante los procedimientos de identificación sistemática que se han descrito anteriormente y se pueden usar en los procedimientos de tratamiento que se describen en el presente documento.
VI. Procedimientos para Diagnosticar, Pronosticar, y Controlar el Progreso de Trastornos Óseos, Adiposos, de Metabolismo de Glucosa, y Musculares
Además de tratar, por ejemplo, trastornos musculares, óseos, de metabolismo de glucosa, y adiposos, la presente divulgación proporciona procedimientos para diagnosticar tales trastornos mediante la detección de la disminución o aumento de GDF-8 en una muestra biológica, por ejemplo, suero, plasma, fluido de lavado broncoalveolar, esputo, biopsias (por ejemplo, de músculo), etc. "Diagnóstico" o "diagnosticar" se refieren a identificar la presencia o ausencia de una afección patológica. Los procedimientos de diagnóstico implican la detección de la presencia de GDF-8, por ejemplo, mediante la determinación de una cantidad de ensayo de polipéptido GDF-8 en una muestra biológica de un sujeto (mamífero humano o no humano), y comparar la cantidad de ensayo con una cantidad o
imagen10
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
E06801434
10-04-2015
La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un liposoma en el que se combina un anticuerpo de la invención, además de otros vehículos farmacéuticamente aceptable, con agentes anfipáticos tales como lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, o capas lamelares mientras están en solución acuosa. Los líquidos adecuados para formulación de liposomas incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales esta dentro del nivel de experiencia en la materia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o procedimiento que es suficiente para mostrar un beneficio significativo en el paciente, por ejemplo, mejora de síntomas de, curación de, o aumento de la tasa de curación de tales afecciones. Cuando se aplica a un principio activo individual, se administra sola, la expresión se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado del efecto terapéutico, tanto si se administran en combinación, en serie o de forma simultánea.
En la práctica del uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente eficaz, por ejemplo, de un anticuerpo que se une a GDF-8 e interfiere con la señalización de GDF-8 se administra a un sujeto, por ejemplo, mamífero (por ejemplo, un ser humano). Un anticuerpo de la invención se puede administrar de acuerdo con el procedimiento de la invención solo o en combinación con otras terapias tales como agentes antiinflamatorios. Cuando se coadministra con uno o más agentes, un anticuerpo de la invención se puede administrar de forma simultánea con el segundo agente, o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el médico que atiende al paciente decidirá la secuencia apropiada de administración de un anticuerpo de la invención en combinación con otros agentes.
En una realización, los anticuerpos de la invención, por ejemplo, composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran en terapia de combinación, es decir, se combinan con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos óseos, trastornos óseos metabólicos o inducidos, trastornos adiposos, trastornos del metabolismo de la glucosa o trastornos relacionados con la insulina, por ejemplo, así como trastornos alérgicos y inflamatorios. La expresión "en combinación" en este contexto se refiere a que los agentes se proporcionan básicamente de forma contemporánea, ya sea de forma simultánea o secuencial. Si se proporcionan de forma secuencial, en el inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos todavía se puede detectar preferentemente a concentraciones eficaces en el sitio de tratamiento o en el sujeto.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Los procedimientos para conseguir la administración son conocidos por los expertos habituales en la materia. También puede ser posible obtener composiciones que se deben administrar por vía tópica o por vía oral, o que pueden ser capaces de transmisión a través de membranas mucosas. La administración de un anticuerpo de la invención usado en una composición farmacéutica para poner en práctica el procedimiento de la presente invención se puede realizar en una diversidad de vías convencionales, tales como ingestión oral, inhalación, inyección cutánea, subcutánea, o intravenosa.
Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación intradérmica o subcutánea por lo general incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiamintetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. Tales preparaciones se pueden incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis fabricados con vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor™ EL (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida hasta el punto en el que exista una fácil capacidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de preparación y almacenamiento y se debe conservar frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, y cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
15
25
35
45
55
E06801434
10-04-2015
Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención se administra, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de unión estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones de proteínas parenteralmente aceptables, teniendo en cuenta el pH, isotonicidad, estabilidad, y similares, está dentro de la experiencia en la materia. Una composición farmacéutica preferente para inyección intravenosa, cutánea, o subcutánea debería contener, además de agentes de unión, un vehículo isotónico tal como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro sódico, inyección de Ringer lactada, u otro vehículo tal como se conoce en la técnica. La composición o composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes, otros aditivos conocidos por los expertos en la materia.
La cantidad de un anticuerpo de la invención (u otro antagonista de la invención) en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección que se está tratando, y de la naturaleza de los tratamientos anteriores experimentados por el paciente. Por último, el médico que atiende decidirá la cantidad de anticuerpo con la que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, un médico que atiende administrar dosis bajas de anticuerpo y observa la respuesta del paciente. Se pueden administrar dosis más elevadas de anticuerpo hasta que se obtiene el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto la dosificación por lo general no se aumenta adicionalmente. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el procedimiento de la presente invención deberían contener de aproximadamente 0,1 :g a 50 mg de anticuerpo por kg de peso corporal.
La duración de la terapia que usa la composición farmacéutica de la presente invención variara, dependiendo de la gravedad de la enfermedad que se está tratando y la afección y la respuesta idiosincrática potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de anticuerpo será a través, por ejemplo, de la vía subcutánea y, por ejemplo, en el intervalo de una vez a la semana. Por último, el médico que atiende decidirá la duración apropiada de la terapia que usa la composición farmacéutica de la presente invención.
Las composiciones orales incluyen por lo general un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerraren cápsulas de gelatina o formar comprimidos por compresión. Con el fin de administración terapéutica oral, el antagonista de GDF-8 (por ejemplo, anticuerpo, molécula pequeña, etc.) se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos o cápsulas. Como parte de la composición se pueden incluir agentes de unión y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar; un aglutinante tal como as celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel™, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes™; un agente de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa
o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o sabor a naranja.
Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, un anticuerpo que se une a GDF-8 e interfiere con la señalización de GDF-8, se administra por vía oral, el agente de unión estará en forma de un comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como una gelatina o un adyuvante. El comprimido, cápsula, y polvo contienen de aproximadamente un 5 a un 95 % de agente de unión, y preferentemente de aproximadamente un 25 a un 90 % de agente de unión. Cuando se administra en forma líquida, se puede añadir un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de semilla de soja, o aceite de sésamo, o aceites sintéticos (después de tener en cuenta las alergias del paciente individual y/o la mayoría de la población de individuos a tales vehículos líquidos). La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener adicionalmente solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente un 0,5 a un 90 % en peso del agente de unión, y preferentemente de aproximadamente un 1 a un 50 % del agente de unión.
Para administración por inhalación, un antagonista de GDF-8 se administra en forma de una pulverización en aerosol a partir de un envase o dosificador presurizado, que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. Por consiguiente, los compuestos que se describen en el presente documento se pueden administrar por inhalación al tejido pulmonar. La expresión "tejido pulmonar", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tejido del tracto respiratorio e incluye el tracto respiratorio tanto superior como inferior, excepto cuando se indica de otro modo. Se puede administrar uno o más anticuerpos de GDF-8 en combinación con una o más de las modalidades existentes para el tratamiento de enfermedades pulmonares.
En un ejemplo, el compuesto se formula para un nebulizador. En una realización, el compuesto se puede almacenar en una forma liofilizada (por ejemplo, a temperatura ambiente) y reconstituir en solución antes de la inhalación.
También es posible formular el compuesto para inhalación usando un dispositivo médico, por ejemplo, un inhalador (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.102.035 (un inhalador de polvo) y Nº 6.012.454 (un inhalador de polvo seco)). El inhalador puede incluir compartimentos separados para el compuesto activo fa un pH
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
adecuado para almacenamiento y otro compartimento para un tampón de neutralización, y un mecanismo para combinar el compuesto con un tampón de neutralización inmediatamente antes de la atomización. En una realización, el inhalador es un inhalador de dosis medida.
Aunque no es necesario, se pueden usar potenciales de la administración tales como tensioactivos para aumentar la administración pulmonar. Un "tensioactivo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que tiene restos hidrófilos y lipófilos que estimulan la absorción un fármaco por interacción con una superficie de contacto entre dos fases inmiscibles. Los tensioactivos son útiles con partículas secas por varias razones, por ejemplo, reducción de la aglomeración de partículas, reducción fagocitosis de macrófagos, etc. Cuando se acoplan con tensioactivo pulmonar, se puede conseguir una absorción más eficaz del compuesto porque los tensioactivos, tales como DPPC, facilitarán en gran medida la difusión del compuesto. Los tensioactivo son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitara, fosfoglicéridos, por ejemplo, fosfatidilcolinas, dipalmitoíl L-alfa-fosfatidilcolina (DPPC) y difosfatidil glicerol (DPPG); hexadecanol; ácidos grasos; polietilenglicol (PEG); polioxietileno-9-; éter laurílico; ácido palmítico; ácido oleico; trioleato de sorbitán (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxómero; éster de ácido graso de sorbitán; trioleato de sorbitán; tiloxapol; y fosfolípidos.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Por ejemplo, en el caso de anticuerpos que comprenden la parte de Fc, las composiciones pueden ser capaces de transmisión a través de membranas mucosas (por ejemplo, intestino, boca, o pulmones) a través de la ruta mediada por el receptor de FcRn (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 6.030.613). En general, la administración transmucosal se puede conseguir, por ejemplo, a través del uso de pastillas para chupar, pulverizaciones nasales, inhaladores, o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles, parches o cremas tal como se conoce por lo general en la técnica. Para administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se usan agentes penetrantes apropiados para la barrera a permear. Tales agentes penetrantes se conocen por lo general en la técnica, e incluyen, por ejemplo, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico.
Las composiciones farmacéuticas también pueden consistir en composiciones adecuadas para terapia genética, es decir, composiciones formadas por los polinucleótidos que se desvelan en el presente documento. en el caso de terapia genética, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir, por ejemplo, lípidos, esferas de colágeno, sistemas de emulsión catiónica, agua, tampones salinos, vectores virales, restos de quilomicrones, nanopartículas de polímero (por ejemplo, gelatina-ADN o quitosano-ADN), partículas de oro, complejos de polímeros, lipoplejos, poliplejos, etc. (véase, por ejemplo, Gardlik y col. (2005) Med. Sci. Monit. 11 (4): RA110-21).
Estabilización y Retención
En una realización, un anticuerpo de GDF-8 está asociado físicamente con un resto que mejora su estabilización y/o retención en circulación, por ejemplo, lavado en sangre, suero, linfa, broncopulmonar o broncoalveolar, u otros tejidos, por ejemplo, al menos 1,5, 2, 5, 10, o 50 veces.
Los antagonistas de la invención se pueden preparar con vehículos que protegerán frente a la rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Las suspensiones liposomales que contienen un antagonista de GDF-8, por ejemplo, uno o más anticuerpos anti-GDF-8, también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptable. Estas se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
Por ejemplo, un anticuerpo de GDF-8 se puede asociar con un polímero, por ejemplo, un polímero básicamente no antigénico, tal como óxidos de polialquileno u óxidos de polietileno. Los polímeros adecuados variarán básicamente en peso. Se pueden usar polímeros que tienen un peso molecular medio en número que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 (o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, o de aproximadamente
2.000 a aproximadamente 12.500).
Por ejemplo, un anticuerpo de GDF-8 se puede conjugar con un polímero hidrosoluble, por ejemplo, polímeros de polivinilo hidrófilos, por ejemplo, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de tales polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, con la condición de que se mantenga la solubilidad en agua de block copolímeros de bloque. Los polímeros útiles adicionales incluyen polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno, y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o sin ramificar, que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D-y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico, o ácido algínico), Dglucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, almidón de hidroxietilo, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad polisacárida de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E06801434
10-04-2015
alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol; heparina, etc.
Otros compuestos también se pueden unir al mismo polímero, por ejemplo, una citotoxina, una marca, u otro agente de direccionamiento, por ejemplo otro anticuerpo de GDF8 o un ligando no relacionado. Para la reticulación se pueden usar óxidos de polialquileno monoactivados terminados en alcoxi (PAO), por ejemplo, polietilenglicoles terminados en monometoxi (mPEG), polímeros terminados en alquilo C1-4 y óxidos de polietileno (glicoles) bisactivados (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.951.974).
En una realización, no es necesario que el polímero de antes de la reticulación con el ligando sea, pero preferentemente es, hidrosoluble. Generalmente, después de la reticulación, el producto es hidrosoluble, por ejemplo, muestra una solubilidad en agua de al menos aproximadamente 0,01 mg/ml, y más preferentemente de al menos 0,1 mg/ml, y aún más preferentemente de al menos aproximadamente 1 mg/ml. Además, el polímero no debería ser muy inmunogénico en la forma del conjugado, ni tampoco debería poseer viscosidad que sea incompatible con infusión intravenosa, aerosolización o inyección, si se pretende administrar el conjugado por dichas vías.
En una realización, el polímero contiene solamente un grupo sencillo que es reactivo. Esto ayuda a impedir la reticulación de moléculas de ligando entre sí. Sin embargo, está dentro del ámbito del presente documento maximizar las condiciones de reacción para reducir la reticulación entre moléculas de ligando, o para purificar los productos de reacción a través de filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar derivados básicamente homogéneos. En otras realizaciones, el polímero contiene dos o más grupos reactivos con el fin de unir múltiples ligandos a la estructura principal del polímero. De nuevo, se puede usar filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar el derivado deseado en forma básicamente homogénea.
El peso molecular del polímero puede variar hasta aproximadamente 500.000 D, y preferentemente es de al menos aproximadamente 20.000 D, o de al menos aproximadamente 30.000 D, o de al menos aproximadamente 40.000 D. El peso molecular elegido dependerá del tamaño eficaz del conjugado a conseguir, la naturaleza (por ejemplo, estructura, tal como lineal o ramificada) del polímero, y el grado de derivatización.
Se puede usar un enlace covalente para unir un anticuerpo de GDF8 a un polímero, por ejemplo, reticulación con el grupo amino N-terminal del ligando y grupos épsilon amino encontrados en restos de lisina del ligando, así como otros grupos amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo u otros grupos hidrófilos. El polímero se puede unir de forma covalente directamente al anticuerpo de GDF-8 sin el uso de un agente de recirculación multifuncional (normalmente bifuncional). La unión covalente a grupos amino se consigue por reacciones químicas conocidas basadas en cloruro cianúrico, carbonil diimidazol y grupos reactivos aldehído (alcóxido de PEG más dietil acetal de bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, o PEG cloruro más el fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, ésteres de succinimidilo activados, ditiocarbonato de PEG activado, PEG activado con 2,4,5-triclorofenilcloroformiato
o P-nitrofenilcloroformiato). Los grupos carboxilo se pueden derivatizar por acoplamiento de PEG-amina usando cabodiimida. Los grupos sulfhidrilo se pueden derivatizar por acoplamiento de PEG sustituido con maleimido (por ejemplo, alcoxi-PEG amina más 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato) de sulfosuccinimidilo (véase el documento WO 97/10847) o PEG-maleimida). Como alternativa, los grupos amino libres en el ligando (por ejemplo, grupos amino épsilon en restos de lisina) se pueden tiolar con 2-imino-tiolano (reactivo de Traut) y después acoplar con derivados que contengan maleimida de PEG, por ejemplo, tal como se describe en Pedley y col. (1994) Br. J. Cancer 70: 1126-30.
Están disponibles polímeros de PEG funcionalizados que se pueden unir a un anticuerpo de GDF8, por ejemplo, en Shearagua Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Tales derivados de PEG disponibles en el mercado incluyen, por ejemplo, amino-PEG, ésteres de aminoácido de PEG, PEG-hidrazida, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, PEGácido propiónico, aminoácidos de PEG, succinato de PEG y succinimidilo, propionato de PEG y succinimidilo, éster de succinimidilo de PEG carboximetilado, carbonato de succinimidilo de PEG, ésteres de succinimidilo de aminoácidos de PEG, PEG-oxicarbonilimidazol, PEG-carbonato de nitrofenilo, tresilato de PEG, PEG-éter glicidílico, PEG-aldehído, vinilsulfona de PEG, PEG-maleimida, PEG-disulfuro de ortopiridilo, PEG heterofuncionales, derivados de PEG vinilo, silanos de PEG, y fosfólidos de PEG. Las condiciones de reacción para el acoplamiento de estos derivados de PEG pueden variar dependiendo del anticuerpo de GDF-8, el grado deseado de PEGilación, y del derivado de PEG usado. Algunos factores implicados en la elección de derivados de PEG incluyen: el punto de unión deseado (tal como grupos R de lisina o cisteína), estabilidad hidrolítica y reactividad de los derivados, estabilidad, toxicidad y antigenicidad de la unión, idoneidad para el análisis, etc. Las instrucciones específicas para el uso de cualquier derivado en particular se encuentran disponibles a través del fabricante.
Los conjugados de un anticuerpo de GDF-8 y un polímero se pueden separar de los materiales de partida que no han reaccionado, por ejemplo, por filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico u otras formas de cromatografía, por ejemplo, HPLC. Las especies heterólogas de los conjugados se purifican entre sí de la misma manera. La resolución de diferentes especies (por ejemplo, que contienen uno o dos restos de PEG) también es posible debido a la diferencia en las propiedades iónicas de los aminoácidos que no han reaccionado (véase, por ejemplo, el documento WO 96/34015).
Se espera que los polinucleótidos y proteínas de la presente invención presente en uno o más de los usos o
imagen11
imagen12
imagen13
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
imagen18
imagen19
imagen20

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES06801434.9T 2005-08-19 2006-08-14 Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8 Active ES2534760T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70970405P 2005-08-19 2005-08-19
US709704P 2005-08-19
PCT/US2006/031651 WO2007024535A2 (en) 2005-08-19 2006-08-14 Antagonist antibodies against gdf-8 and uses in treatment of als and other gdf-8-associated disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2534760T3 true ES2534760T3 (es) 2015-04-28

Family

ID=37606840

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11161564.7T Active ES2659114T3 (es) 2005-08-19 2006-08-14 Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y usos en el tratamiento de ALS y otros trastornos asociados con GDF-8
ES06801434.9T Active ES2534760T3 (es) 2005-08-19 2006-08-14 Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11161564.7T Active ES2659114T3 (es) 2005-08-19 2006-08-14 Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y usos en el tratamiento de ALS y otros trastornos asociados con GDF-8

Country Status (16)

Country Link
US (7) US7888486B2 (es)
EP (3) EP1915397B1 (es)
JP (2) JP5415071B2 (es)
CN (2) CN103450359B (es)
AU (1) AU2006283725B2 (es)
BR (1) BRPI0614893A2 (es)
CA (1) CA2619491C (es)
DK (2) DK1915397T3 (es)
ES (2) ES2659114T3 (es)
HK (1) HK1119716A1 (es)
HU (2) HUE025240T2 (es)
MX (1) MX2008002367A (es)
PL (2) PL2407486T3 (es)
PT (2) PT1915397E (es)
SI (2) SI2407486T1 (es)
WO (1) WO2007024535A2 (es)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE496938T1 (de) 2002-12-20 2011-02-15 Amgen Inc Myostatin hemmende bindungsstoffe
US7962215B2 (en) 2004-07-23 2011-06-14 Synapse Biomedical, Inc. Ventilatory assist system and methods to improve respiratory function
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
CN103450359B (zh) 2005-08-19 2018-07-24 惠氏有限责任公司 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途
US9050005B2 (en) 2005-08-25 2015-06-09 Synapse Biomedical, Inc. Method and apparatus for transgastric neurostimulation
EP1951756B1 (en) 2005-10-06 2015-01-07 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
ES2568436T3 (es) 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
US20080097153A1 (en) * 2006-08-24 2008-04-24 Ignagni Anthony R Method and apparatus for grasping an abdominal wall
PT2066695E (pt) * 2006-09-05 2013-05-23 Lilly Co Eli Anticorpos anti-miostatina
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
WO2008098001A2 (en) * 2007-02-05 2008-08-14 Synapse Biomedical, Inc. Removable intramuscular electrode
WO2008144578A1 (en) * 2007-05-17 2008-11-27 Synapse Biomedical, Inc. Devices and methods for assessing motor point electromyogram as a biomarker
SG10201605394SA (en) 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
US8428726B2 (en) 2007-10-30 2013-04-23 Synapse Biomedical, Inc. Device and method of neuromodulation to effect a functionally restorative adaption of the neuromuscular system
WO2009059033A1 (en) * 2007-10-30 2009-05-07 Synapse Biomedical, Inc. Method of improving sleep disordered breathing
PE20091163A1 (es) * 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
CN101489288B (zh) 2008-01-16 2011-04-20 华为技术有限公司 演进分组网络中电路域业务的处理方法、***及相关设备
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
WO2009158025A2 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
AR074777A1 (es) * 2008-12-19 2011-02-09 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
SI2424895T1 (en) * 2009-04-27 2018-01-31 Novartis Ag Ingredients and procedures for increasing muscle growth
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
DK3789038T3 (da) * 2010-05-14 2022-10-17 Univ Leland Stanford Junior Humaniserede og kimære monoklonale antistoffer mod cd47
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
PL2576582T3 (pl) * 2010-05-26 2020-06-29 Corcept Therapeutics, Inc. Leczenie dystrofii mięśniowej
US8889132B2 (en) 2010-06-30 2014-11-18 Mount Sinai Hospital Antibodies against human HIF-1α
MY166429A (en) 2010-11-17 2018-06-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013074557A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing gdf8 and/or activin a
EP2861617A1 (en) * 2012-06-15 2015-04-22 Pfizer Inc. Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
TWI697501B (zh) 2012-08-24 2020-07-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
JP6774164B2 (ja) 2012-08-24 2020-10-21 中外製薬株式会社 マウスＦｃγＲＩＩ特異的Ｆｃ抗体
CN104768969B (zh) 2012-09-13 2021-04-16 百时美施贵宝公司 结合至肌生成抑制素的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白
RU2015115956A (ru) 2012-11-09 2017-01-10 Пфайзер Инк. Антитела, специфичные в отношении фактора роста тромбоцитов в, и их композиции и применения
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
EP4140497A1 (en) 2013-04-08 2023-03-01 President and Fellows of Harvard College Compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells
WO2014172448A2 (en) * 2013-04-17 2014-10-23 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against activin receptor type ii (actrii)
EP3816625A1 (en) 2013-05-06 2021-05-05 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
WO2015070076A2 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating neuromuscular junctions
US10010498B2 (en) 2014-06-04 2018-07-03 Acceleron Pharma Inc. Methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis with follistatin fusion proteins
MA51074A (fr) 2014-06-04 2020-10-14 Acceleron Pharma Inc Procédés et compositions pour traiter des troubles à l'aide de polypeptides de follistatine
EP3142413A4 (en) 2014-06-24 2017-06-21 Huawei Technologies Co. Ltd. Method, device and system for saving voice resource
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
JP6706617B2 (ja) 2014-11-06 2020-06-10 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 抗プロ／潜在型−ミオスタチン抗体およびその使用
SG11201607165YA (en) 2014-12-19 2016-09-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
TW202248212A (zh) 2015-02-05 2022-12-16 日商中外製藥股份有限公司 包含離子濃度依賴之抗原結合域的抗體、Fc區變體、IL-8結合抗體與其用途
TW202339800A (zh) 2015-02-27 2023-10-16 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3274457A4 (en) 2015-03-26 2018-08-08 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
EP3283519A1 (en) 2015-04-15 2018-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors
EA038146B1 (ru) 2015-09-15 2021-07-13 Сколар Рок, Инк. Антитела к про-/латентному миостатину и их применения
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
AU2016381992B2 (en) 2015-12-28 2024-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
IL301476A (en) 2016-01-06 2023-05-01 Harvard College Treatment with GDF11 prevents weight gain, improves glucose loading and reduces hepatosteatosis
JP2019504064A (ja) * 2016-01-08 2019-02-14 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体およびその使用方法
AU2017233658B2 (en) 2016-03-14 2023-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
EP3464347B1 (en) 2016-06-07 2023-05-31 Gliknik Inc. Cysteine-optimized stradomers
PT3368069T (pt) 2016-06-13 2020-11-11 Scholar Rock Inc Uso de inibidores da miostatina e terapias de combinação
MY193497A (en) 2016-06-17 2022-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies and methods of use
CA2971303A1 (en) 2016-06-21 2017-12-21 Bamboo Therapeutics, Inc. Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use
WO2018017864A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig-binding agents and uses thereof
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
ES2944357T3 (es) 2017-01-06 2023-06-20 Scholar Rock Inc Tratamiento de enfermedades metabólicas inhibiendo la activación de miostatina
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
MX2020008991A (es) 2018-03-01 2020-12-10 Regeneron Pharma Metodos para alterar la composicion corporal.
MX2021007394A (es) 2018-12-18 2021-07-15 Regeneron Pharma Composiciones y metodos para aumentar el peso corporal y la masa muscular magra mediante el uso de antagonistas contra el receptor de leptina, gdf8 y activina a.
US11471683B2 (en) 2019-01-29 2022-10-18 Synapse Biomedical, Inc. Systems and methods for treating sleep apnea using neuromodulation
EP3935581A4 (en) 2019-03-04 2022-11-30 Iocurrents, Inc. DATA COMPRESSION AND COMMUNICATION USING MACHINE LEARNING
CA3144864A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 Pfizer Inc. Methods of treating duchenne muscular dystrophy using aav mini-dystrophin gene therapy
RU2710267C1 (ru) * 2019-09-06 2019-12-25 Александр Александрович Яковенко Способ скрининга саркопении у пациента, получающего лечение программным гемодиализом
WO2024064842A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating obesity, diabetes, and liver dysfunction

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
WO1990013327A1 (en) 1989-04-28 1990-11-15 Riker Laboratories, Inc. Dry powder inhalation device
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US20030074680A1 (en) 1993-03-19 2003-04-17 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US6673534B1 (en) 1995-10-26 2004-01-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods for detection of mutations in myostatin variants
US6607884B1 (en) 1993-03-19 2003-08-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-8
EP1333035A3 (en) 1993-03-19 2004-07-07 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US7332575B2 (en) 1994-03-18 2008-02-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5695760A (en) 1995-04-24 1997-12-09 Boehringer Inglehiem Pharmaceuticals, Inc. Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
SE9502800D0 (sv) 1995-08-10 1995-08-10 Astra Ab Disposable inhaler
EP0869815A1 (en) 1995-09-21 1998-10-14 University Of Utah Research Foundation Targeting of conjugates of poly(ethylene glycol) and antibodies against glutamic acid decarboxylase to islet cells
AU6274298A (en) 1997-02-05 1998-08-25 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Growth differentiation factor-8
AU756620B2 (en) 1997-07-14 2003-01-16 University Of Liege Mutations in the myostation gene cause double-muscling in mammals
AU8666398A (en) 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
AU8921698A (en) 1997-08-29 1999-03-16 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
US6102454A (en) 1997-09-15 2000-08-15 Robert Bosch Gmbh Motor vehicle door lock arrangement
AU1390999A (en) 1997-11-10 1999-05-31 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods for detection of mutations in myostatin variants
CA2319703C (en) 1998-02-05 2005-09-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
EP1075272B1 (en) 1998-05-06 2009-07-15 Metamorphix, Inc. Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8
NZ513642A (en) 1999-01-21 2004-02-27 Metamorphix Inc Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
PL353855A1 (en) 1999-07-20 2003-12-01 Pharmexa A/Spharmexa A/S Method for down-regulating gdf-8 activity
US7037501B2 (en) 2001-01-04 2006-05-02 Regents Of The University Of Minnesota Myostatin immnoconjugate
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CU23007A1 (es) * 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US20040058445A1 (en) 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
WO2003072714A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Wyeth Follistatin domain containing proteins
JP4429729B2 (ja) 2002-02-21 2010-03-10 ワイス エルエルシー Ｇａｓｐ１；フォリスタチンドメイン含有タンパク質
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
EP1635870A2 (en) * 2003-06-02 2006-03-22 Wyeth Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
DE602004030341D1 (de) 2003-06-23 2011-01-13 Genetics Inst Llc Antikörper gegen interleukin-22 und verwendungen dafür
CA2601086A1 (en) 2005-03-23 2006-10-12 Wyeth Detection of an immune response to gdf-8 modulating agents
JP2008537488A (ja) 2005-03-23 2008-09-18 ワイス Ｇｄｆ−８モジュレート物質の検出
CN103450359B (zh) 2005-08-19 2018-07-24 惠氏有限责任公司 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP1915397A2 (en) 2008-04-30
DK2407486T3 (en) 2018-02-19
PT2407486T (pt) 2018-02-21
ES2659114T3 (es) 2018-03-13
US20090285827A1 (en) 2009-11-19
US8496934B2 (en) 2013-07-30
JP2009504185A (ja) 2009-02-05
HUE038324T2 (hu) 2018-10-29
EP2407486A1 (en) 2012-01-18
PL2407486T3 (pl) 2018-05-30
AU2006283725B2 (en) 2012-02-16
CA2619491A1 (en) 2007-03-01
WO2007024535A2 (en) 2007-03-01
US20070087000A1 (en) 2007-04-19
US20150152176A1 (en) 2015-06-04
DK1915397T3 (en) 2015-04-20
CN101379086A (zh) 2009-03-04
PL1915397T3 (pl) 2015-08-31
US7910107B2 (en) 2011-03-22
EP3327033A1 (en) 2018-05-30
AU2006283725A1 (en) 2007-03-01
US7888486B2 (en) 2011-02-15
BRPI0614893A2 (pt) 2010-03-30
CN103450359A (zh) 2013-12-18
US20120003212A1 (en) 2012-01-05
US20130156767A1 (en) 2013-06-20
EP1915397B1 (en) 2015-01-14
CN103450359B (zh) 2018-07-24
SI2407486T1 (en) 2018-04-30
JP5415071B2 (ja) 2014-02-12
US20120016106A1 (en) 2012-01-19
EP2407486B1 (en) 2017-11-22
US20140086920A1 (en) 2014-03-27
CA2619491C (en) 2016-05-10
US9926368B2 (en) 2018-03-27
HUE025240T2 (en) 2016-03-29
JP2012244998A (ja) 2012-12-13
US8956608B2 (en) 2015-02-17
CN101379086B (zh) 2013-07-17
WO2007024535A3 (en) 2007-04-19
SI1915397T1 (sl) 2015-05-29
MX2008002367A (es) 2008-03-18
US8372625B2 (en) 2013-02-12
HK1119716A1 (en) 2009-03-13
PT1915397E (pt) 2015-04-30
US8349327B2 (en) 2013-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2534760T3 (es) Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8
KR102596852B1 (ko) 항-프로/잠재성-미오스타틴 항체 및 그의 용도
KR101704893B1 (ko) Gdf-8에 대한 개선된 길항물질 항체 및 그의 용도
JP2023099088A (ja) 活性化可能抗ｐｄｌ１抗体、およびその使用方法
ES2535872T3 (es) Neutralización de anticuerpos contra GDF-8 y usos de los mismos
TWI516501B (zh) Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
ES2476892T3 (es) Anticuerpos que se unen a PAR-2
ES2764418T3 (es) Anticuerpo anti-FGFR4 humano
KR20170136536A (ko) 항-met 항체 및 그 사용 방법
WO2018067819A1 (en) Compositions and methods for treatment of cancers
JP2023534923A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的にする抗原結合分子
US20240124606A1 (en) Anti-cd73 monoclonal antibodies
TW202130364A (zh) 以介白素２４或介白素２０拮抗劑治療組織纖維化和／或損傷和／或器官衰竭