CN101802011A - Mdl-1应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于用MDL-1拮抗剂治疗骨再吸收疾病的方法。

Description

MDL-1应用

发明领域

本发明涉及通过调节MDL-1活性来治疗骨骼病和免疫病的方法。

发明背景

骨组织主要由3种细胞类型(成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)和矿化胞间骨基质组成，所述矿化胞间骨基质包含聚合物(主要是胶原蛋白纤维)和由骨细胞(主要是成骨细胞)合成的其它有机物质(主要由诸如硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖组成的基质)。骨细胞产生骨基质有机分子，也调节其矿化。成骨细胞位于骨组织表面，并合成骨基质的有机组分。骨细胞是成熟的成骨细胞，参与维持骨基质。破骨细胞参与骨质侵蚀和再吸收。

成骨细胞和破骨细胞分化之间的平衡是骨稳态的关键。这种平衡的调节异常可导致过多的破骨细胞活化及骨吸收病(例如骨质疏松症和骨关节炎)。激活TRAF6、c-Fos和NFATc1转录因子的NF-kB配体受体激活剂(RANKL)是重要的提供破骨细胞发育和功能的主要信号的调控细胞因子。源自含有基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的分子的另外的信号对于体内破骨细胞形成也是不必可少的。

DAP12(DNAX Activating Protein，DNAX激活蛋白)是二硫键连接的同型二聚体I型跨膜糖蛋白，其含有位于细胞内结构域的基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)(Lanier等(1998)Nature391：703-707；WO 99/06557；Campbell和Colonna(1999)Int.J.Biochem.Cell Biol.31：631-636；Lanier和Bakker(2000)Immunol.Today 21：611-614)。DAP12的重要性依赖于ITAM结构域(Gingras等(2001)Mol.Immun.38：817-824)。因为Ig超家族受体的细胞内结构域(Bouchon等(2000)J.Immunol.164：4991-4995；Dietrich等(2000)J.Immunol.164：9-12)及与DAP12非共价缔合的C-型凝集素超家族(Bakker等(1999)PNAS U.S.A.96：9792-9796)太短，以致不能与其它分子相互作用，所以DAP12细胞质结构域组成这些受体复合体的信号转导亚单位。受体配体-结合亚单位一旦衔接(engagement)，DAP12细胞质ITAM就被Src激酶磷酸化。然后DAP12的ITAM与Syk细胞质酪氨酸激酶相互作用，启动导致激活的事件级联(Lanier等，见上述；Campbell和Colonna，见上述；Lanier和Bakker，见上述)。

DAP12在单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞、粒细胞、树突细胞和肥大细胞中表达，其中它为至少8种不同的受体提供了信号转导功能(Gingras等(2001)Mol.Immun.38：817-824；Lanier和Bakker，(2000)Immunol.Today 21：611-614)。与DAP12缔合的C-型凝集素超家族的骨髓受体为骨髓DAP12缔合凝集素-1(Myeloid DAP12-associating Lectin-1，MDL-1)，它是II型跨膜蛋白(MDL-1也称为CLEC5a)。MDL-1是第一个被鉴定和克隆的缔合DAP12的分子(Bakker等(1999)PNAS USA 96(17)：9792-9796)。它在单核细胞和巨噬细胞(Bakker等(1999)PNAS U.S.A.96：9792-9796)以及其它类型的骨髓细胞(例如嗜中性粒细胞和树突细胞)中专一表达。在DAP12跨膜结构域中带负电荷的残基的存在阻碍DAP12在缺乏配偶体受体(例如MDL-1)时在细胞表面的表达，所述配偶体受体在其跨膜结构域具有带正电荷的残基。然而，仅仅DAP12还不足以在细胞表面进行其表达及发挥功能。因此，与DAP12缔合的分子(例如MDL-1)与DAP12的组合可引起由DAP12传送特定的生理信号(Nochi等(2003)Am.J.ofPathology 162：1191-1201)。

最近的研究表明，对于破骨细胞发育需要由DAP12-ITAM信号转导途径介导的共刺激信号(参见例如Koga等(2004)Nature428：758-763)；Dap12-/-小鼠具有破骨细胞发育缺陷(参见例如Humphrey等(2004)J Bone Miner Res 19：224-234)；DAP-12失活可导致腕骨和踝骨囊肿及痴呆(参见例如Paloneva等(2002)NatureGenetics 25：357-361；和Paloneva等(2001)Neurology56：1552-1558)。

业已显示由引起登革热的病毒与MDL-1衔接可诱导DAP-12磷酸化，并刺激促炎细胞因子的释放(参见Chen等(2008)Nature，online publication doi：10.1038/nature07013：1-7)。有意思的是，由于登革热能引发与活性病毒感染相关的四肢疼痛，因而其还被称为“裂骨热(Break-bone fever)”(参见，例如Clarke(2002)Nature416：672-674).

炎症通常是响应创伤或微生物入侵的局部保护性反应，这种反应可摧毁、弱化或抵挡病原体及受损组织。在急性形式中其特征在于出现如下典型症状：疼痛、发热、发红、肿胀及丧失功能。在显微镜下，它涉及一系列的复杂事件，包括伴有渗透性及血流增加的小动脉、毛细血管和小静脉扩张；流液(包括血浆蛋白)渗出；和白细胞迁移到炎症区域。

人们越来越明白仅制止炎症对于治疗被引起的骨代谢失调可能是不够的。因此，治疗策略需要同时结合抗骨再吸收活性和抗炎活性二者。本发明通过提供以下药物和方法来满足该需要，所述药物和方法用于通过靶向MDL-1活性来调节骨密度异常，以逆转骨再吸收并同时抑制炎症。

附图简述

图1显示MDL-1激活增加了LPS诱导的炎性介质的释放。

图2显示给予MDL-1激动剂抗体DX163使CIA恶化。

图3显示MDL-1拮抗剂MDL-1-Ig融合蛋白对CAIA的抑制作用。

图4显示在MDL-1KO小鼠中CAIA临床分数较低。

图5确证用激动剂MDL-1抗体DX163激动(agonizing)MDL-1的活性可使自体免疫关节炎的进展恶化。

图6显示用MDL-1-Ig融合蛋白对CAIA的抑制。

图7显示用GE探测CT扫描仪扫描的B10RIII小鼠的脚掌。

图8显示：在用抗MDL-1激动剂治疗后，在脚掌中与骨破坏有关的基因(例如RANKL、基质金属蛋白酶9(MMP9)和TRAP)的mRNA表达水平被上调；而在用MDL-1-Ig融合体治疗后，所述表达水平被下调。

图9显示用RANK-L与抗MDL-1激动剂抗体联合治疗提高破骨细胞的“首要转录调节子”NFATc1的表达。

发明简述

本发明基于拮抗MDL-1的活性能够抑制骨质侵蚀和炎症的发现。本发明提供了调节受治疗者骨再吸收的方法，所述方法包括给予受治疗者有效量的特异性结合MDL-1的抗体或其抗体片段。在某些实施方案中，抗体为人源化抗体、全人抗体或嵌合抗体。抗体片段为Fab、Fab2或Fv抗体片段。抗体或其抗体片段可与另一包括聚乙二醇(PEG)在内的化学部分缀合。抗体或抗体片段抑制骨再吸收，包括由炎症引起的骨再吸收。抗体或抗体片段进一步抑制破骨细胞形成或活化。

本发明还提供了调节受治疗者骨再吸收的方法，所述方法包括给予受治疗者有效量的可溶性MDL-1蛋白。在某些实施方案中，可溶性MDL-1蛋白与包括PEG在内的化学部分缀合。在另外的实施方案中，可溶性MDL-1蛋白与包括抗体分子的Fc部分在内的异源蛋白融合。可溶性MDL-1蛋白抑制骨再吸收，包括由炎症引起的骨再吸收。可溶性MDL-1蛋白进一步抑制破骨细胞形成或活化。

定义

本文所用术语“白血细胞”指不含有血红蛋白的血细胞。白血细胞也称为白细胞。白血细胞包括淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞。

本文所用术语“表达状况(expression status)”用于泛指基因及其产物的表达、功能和调节中涉及的多种要素，例如mRNA表达水平、表达的基因产物(例如核酸序列和氨基酸序列)的完整性和对这些分子的转录及翻译修饰。

本文所用术语“抗体分子”是指全抗体(例如IgG，优选IgG1或IgG4)及其片段，优选抗原结合片段。抗体片段包括Fab抗体片段、F(ab)2抗体片段、Fv抗体片段、单链Fv抗体片段和dsFv抗体片段。

本文所用术语“受治疗者”或“患者”或“宿主”是指任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、母牛、狗、猫、母牛、黑猩猩、大猩猩)，最优选人。

本文所用术语“对照”包括没有免疫病的患者、来自没有免疫病的患者的样品、来自患有免疫病的患者的无病样品。

当将本文所用术语“给药”和“治疗”施用给动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指让外源药物、治疗剂、诊断剂、化合物或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给药”和“治疗”还意指体外、体内和离体治疗。

本文所用术语治疗剂的“治疗有效量”定义为药物制剂的各活性组分的量，所述量足以显示有意义的对患者的益处(即减轻、防止或改善待治疗的病症的症状)。当药物制剂包括诊断剂时，“治疗有效量”定义为足以产生信号、图象或其它诊断参数的量。药物制剂的有效量将根据如下因素而变化：例如个体的易感程度、个体的年龄、性别和体重及个体的特应性反应，参见例如美国专利第5,888,530号。

本文所用术语“外源的”是指视情况而定的在生物体、细胞或人体之外产生的物质。本文所用术语“内源的”是指视情况而定的在细胞、生物体或人体内产生的物质。

本文所用术语“重组”是指两个或更多个并非天然邻接但彼此融合的核酸或蛋白。该术语还可指业已通过人为干预而改变(例如翻译后修饰或突变)的核酸或蛋白。例如，野生型密码子可被编码相同氨基酸残基或保守取代的丰余密码子置换，而同时引入或除去核酸序列识别位点。同样地，可融合编码所需功能的核酸区段，以产生编码所需的非天然共存的功能组合的单个遗传实体。尽管限制酶识别位点通常是这些人工操作的对象，但可通过设计掺入其它位点特异性对象，例如启动子、DNA复制位点、调节序列、调控序列或其它有用特征。如下所述，还可掺入编码用于检测或纯化的表位标签的序列。

本文所用术语“多核苷酸”、“核酸“或“核酸分子”是指呈单链形式、双链形式或其它形式的核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或其任何磷酯类似物，例如硫代磷酸酯及硫酯。

本文所用术语“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是指核酸(例如DNA或RNA)中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并意指任何两个或多个核苷酸的链。

提及表达产物(例如RNA、多肽、蛋白质或酶)的本文所用术语“编码序列”或序列“编码”，是指在表达时导致所述产物产生的核苷酸序列。

本文所用术语“基因”意指编码或对应于特定的核糖核苷酸序列或氨基酸序列(包括一个或多个RNA分子、蛋白质或酶的全部或部分)的DNA序列，并可包括或不包括调控DNA序列，例如启动子序列，其决定例如基因表达所处于的条件。基因可由DNA转录为RNA，后者可翻译或不翻译为氨基酸序列。

本文所用术语DNA“扩增”是指应用聚合酶链式反应(PCR)来增加DNA序列混合物内特定DNA序列的浓度。对于PCR的说明参见Saiki等，Science(1988)239：487。

本文所用术语“寡核苷酸”是指含以下核苷酸数的核酸：通常至少10个(例如10、11、12、13或14个)，优选至少15个(例如15、16、17、18或19个)和更优选至少20个核苷酸(例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)，优选不超过100个核苷酸(例如40、50、60、70、80或90个)，所述核酸可与编码基因、mRNA、cDNA或其它目标核酸的基因组DNA分子、cDNA分子或mRNA分子杂交。可例如通过掺入³²P-核苷酸、³H-核苷酸、¹⁴C-核苷酸、³⁵S-核苷酸或业已与标记例如生物素共价缀合的核苷酸来标记寡核苷酸。在一个实施方案中，可将标记的寡核苷酸用作探针以检测核酸的存在情况。在另一个实施方案中，可将寡核苷酸(其中之一或两者被标记)用作PCR引物，以克隆全长基因或基因片段，或以检测核酸的存在情况。通常人工制备寡核苷酸，优选在核酸合成仪上制备。

本文所用术语“启动子”或“启动子序列”是指能够与细胞中的RNA聚合酶(例如直接或通过其它启动子结合蛋白或物质)结合并启动编码序列转录的DNA调控区。一般而言，启动子序列在其3′末端处与转录起始位点连接，并上游延伸(5′方向)至涵盖以任何水平启动转录所必需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内可存在转录起始位点(例如通过用核酸酶S1作图可方便地确定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有性序列)。启动子可以与其它表达调控序列(包括增强子序列和阻遏物序列)或与本发明核酸可操作地连接。

本文所用术语“表达(express和expression)”意指致使或导致基因、RNA或DNA序列中的信息得以表现；例如，通过激活参与相应基因的转录和翻译的细胞功能来产生蛋白质。DNA序列在细胞中或通过细胞表达成“表达产物”，例如RNA(例如mRNA)或蛋白质(例如抗体或其片段)。也可描述为表达产物本身由所述细胞“表达”。

本文所用术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指媒介物(例如质粒)，通过该媒介物DNA或RNA序列得以引入到宿主细胞中，以实现对该宿主的转化，并任选地促进所引入的序列的表达和/或复制。

本文所用术语“转染”或“转化”意指将核酸引入到细胞中。被引入的基因或序列可称为“克隆”。接受了所引入的DNA或RNA的宿主细胞被“转化”，并为“转化体”或“克隆”。被引入宿主细胞的DNA或RNA可来自任何来源，包括与宿主细胞同一属或同一种的细胞或不同属或不同种的细胞。

本文所用术语“宿主细胞”意指任何生物体的任何细胞，所述细胞以任何方式被挑选、修饰、转染、转化、培养或使用或操作用于由该细胞产生物质，例如由所述细胞表达或复制基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。

本文所用术语“表达***”意指宿主细胞和相容的载体，其在合适的条件下可表达载体所携带的并引入到宿主细胞中的蛋白质或核酸。常见表达***包括大肠杆菌(E.coli)宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体、及哺乳动物宿主细胞和载体。合适的细胞包括CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、海拉(HeLa)细胞和NIH 3T3细胞和NSO细胞(非产Ig鼠骨髓瘤细胞系)。编码本发明抗体或抗原结合片段的核酸可在大肠杆菌/T7表达***中以高水平表达，所述表达***公开在以下文献中：美国专利第4,952,496号；第5,693,489号和第5,869,320号和Davanloo等，(1984)Pr ℃.Natl.Acad.Sci.USA 81：2035-2039；Studier等，(1986)J.Mol.Biol.189：113-130；Rosenberg等，(1987)Gene 56：125-135；和Dunn等，(1988)Gene 68：259，它们在此引作参考。

本文所用术语“保守取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等，Molecular Biologyof the Gene(基因的分子生物学)，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第四版，1987))。所述例示性取代优选依照以下表1所示的取代来进行：

表1

原来的残基    保守取代

Ala(A)        Gly；Ser

Arg(R)        Lys

Asn(N)        Gln；His

Cys(C)        Ser

Gln(Q)        Asn

Glu(E)        Asp

Gly(G)        Ala；Pro

His(H)        Asn；Gln

Ile(I)        Leu；Val

Leu(L)        Ile；Val

Lys(K)        Arg；Gln；Glu

Met(M)        Leu；Tyr；Ile

Phe(F)        Met；Leu；Tyr

Ser(S)        Thr

Thr(T)        Ser

原来的残基      保守取代

Trp(W)          Tyr

Tyr(Y)          Trp；Phe

Val(V)          Ile；Leu

也允许进行其它取代，可根据经验或按照已知的保守取代确定。

本文所用术语“分离的核酸”或“分离的多肽”可分别指以下的核酸(例如RNA或DNA分子或混合的多聚体)或多肽，所述核酸或多肽与通常存在于细胞或重组DNA表达***中的其它组分部分或完全地分开。这些组分包括但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清组分和位于侧翼的基因组序列。因此，该术语包括离开其天然存在环境的核酸，可包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源***生物合成的类似物。分离的核酸或多肽优选基本上由均一的分子组成，但可含有某些异质。

本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括所有所述修饰，尤其是存在于通过表达宿主细胞中的多核苷酸而合成的多肽中的修饰。

本文所用术语“反义”是指含有与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列的任何组合物。术语“反义链”是指与“有义”链互补的核酸链。反义分子包括肽、核酸，可通过包括合成或转录在内的任何方法产生。一旦将互补核苷酸引入到细胞中，该互补核苷酸将与由所述细胞产生的天然序列结合，形成双链体并阻断转录或翻译。反义链有时称为“负义链”，有义链有时称为“正义链”。

本文所用术语“抗原决定簇”是指可使与特定抗体接触的分子片段(即表位)。当将蛋白或蛋白片段用于免疫接种宿主动物时，该蛋白的多个区域可诱导产生与蛋白上的特定区域或三维结构特异性结合的抗体；这些区域或结构被称为抗原决定簇。抗原决定簇可与完整抗原(即用于引发免疫应答的免疫原)竞争结合抗体。

本文所用术语“抗体分子”包括但不限于抗体和片段，优选其抗原结合片段。该术语包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、Fab抗体片段、F(ab)₂抗体片段、Fv抗体片段(例如V_H或V_L)、单链Fv抗体片段(scFv)和dsFv抗体片段。此外，本发明抗体分子可为全人抗体或嵌合抗体。

本文所用术语“K_off”是指抗体从抗体/抗原复合体解离的解离速率常数。

本文所用术语“K_on”是指抗体与抗原缔合的速率。

本文所用术语“K_d”是指特定抗体/抗原相互作用的解离常数。K_d＝K_off/K_on。

本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然存在的突变体外，构成所述群的各个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，即针对单个的抗原位点。单克隆抗体是有利的，因其可由杂交瘤培养物合成，并且基本上不受其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示基本上均一的抗体群中的抗体的特性，不能理解为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。如上所述，根据本发明使用的单克隆抗体可由首先阐述于Kohler等，(1975)Nature 256：495中的杂交瘤方法来制备。

本文所用术语“多克隆抗体”是指在一种或多种其它的不同抗体中或在其存在下产生的抗体。一般而言，多克隆抗体在若干产生不同抗体的其它B淋巴细胞存在下由B淋巴细胞产生。通常直接从免疫接种的动物获得多克隆抗体。

本文所用术语“双特异性抗体”是指具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可由多种方法产生，其中包括杂交瘤融合或Fab′片段连接，参见例如Songsivilai等，(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等，(1992)J Immunol.148：1547-1553。另外，可将双特异性抗体形成为“双抗体”(Holliger等，(1993)PNAS USA 90：6444-6448)或形成为“Janusins”(Traunecker等，(1991)EMBO J.10：3655-3659和Traunecker等，(1992)Int.J.Cancer Suppl.7：51-52)。

本文所用“双功能抗体”或“免疫细胞因子”为抗体-细胞因子融合蛋白，其在氨基末端到羧基末端方向上包含：(i)抗体结合位点(其包含能够结合预选的细胞类型上的细胞表面抗原的免疫球蛋白可变区)、免疫球蛋白CH1结构域、免疫球蛋白CH2结构域(任选的CH3结构域)；和(ii)细胞因子。制备所述双功能免疫细胞因子的方法在以下文献中阐述：Gillies等(1992)Proc.Nat’l.Acad.Sci.89：1428-1432；Gillies等(1998)J.Immunol.160：6195-6203；和美国专利第5,650,150号。

本文所用术语“抗独特型抗体”或”抗独特型”是指针对另一抗体分子的抗原结合区或可变区(称为独特型)的抗体。如Jerne等(Jerne，N.K.，(1974)Ann.Immunol.(Paris)125c：373和Jerne，N.K.等，(1982)EMBO 1：234)所述，用表达针对既定抗原(例如MDL-1肽)的抗原互补位(抗原结合位点)的抗体分子免疫接种，将产生一组抗抗体，其中某些抗抗体与抗原共有对抗原互补位的互补结构。用抗独特型抗体亚群进行的免疫接种，进而将产生与最初抗原反应的抗体亚群或免疫细胞子集。

本文所用术语“全人抗体”是指只包含人免疫球蛋白蛋白序列的抗体。如果在小鼠细胞或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生全人抗体，则其可含有鼠糖链。同样地，“小鼠抗体”是指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。

“人源化”抗MDL-1肽抗体也落入本发明范围内。本文所用术语“人源化”或“全人源化”是指抗体含有被移植到人抗体构架的来自母本抗体(例如小鼠抗体)的6个互补决定区(CDR)的氨基酸序列。非人(例如鼠或鸡)抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白，其含有最少量的源自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区的残基被诸如小鼠、鸡、大鼠或兔等非人物种(供者抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力的互补决定区的残基取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基也被相应的非人残基取代。

本文所用术语“部分人源化”抗体或“嵌合”抗体意指含有连接到人重链和轻链恒定区的例如鼠源重链和轻链可变区的抗体。

人源化的备选方法是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或在转基因小鼠中含有的人抗体文库，参见例如Vaughan等(1996)Nat.Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)Nature Med.1：837-839；de Haard等(1999)J.Biol.Chem.274：18218-18230；McCafferty等(1990)Nature 348：552-554；Clackson等(1991)Nature 352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；Mendez等(1997)NatureGenet.15：146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today21：371-377；Barbas等(2001)Phage Display：A Laboratory Manual(噬菌体展示：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Kay等(1996)Phage Display ofPeptides and Proteins：A Laboratory Manual(肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册)，Academic Press，San Diego，CA；de Bruin等(1999)Nat.Biotechnol.17：397-399。

本文所用术语“人”是指含有具有100％人源的氨基酸序列的抗体，其中所述抗体可在例如人、动物、昆虫、真菌、植物、细菌或病毒宿主中表达(Baca等(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Clark(2000)Immunol.Today 21：397-402)。

本发明包括“嵌合抗体”，其意指包含与来自另一非人物种(例如小鼠、马、兔、狗、母牛、鸡)的抗体区(例如恒定区)融合或嵌合的本发明可变区的抗体。这些抗体可用于在非人物种中调节MDL-1的表达或活性。

本文所用术语“人/小鼠嵌合抗体”是指包含与人恒定区融合的小鼠可变区(V_H和V_L)的抗体。

本文所用术语“单链Fv”或“sFv”抗体片段意指具有抗体的V_H和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常sFv多肽另外包含在V_H和V_L结构域之间的多肽接头，使得sFv能形成用于抗原结合所需的结构。文献中所述用于制备单链抗体的技术(美国专利第5,476,786号、第5,132,405号和第4,946,778号)适用于制备抗MDL-1特异性单链抗体。关于sFv的综述，参见Pluckthun(1994)，载于THE PHARMACOLOGY OFMONOCLONAL ANTIBODIES(单克隆抗体药理学)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，N.Y.，第269-315页(1994)。

以下文献阐述了单链抗体、单结构域抗体和双特异性抗体，例如Malecki等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：213-218；Conrath等(2001)J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等(2001)J.Biol.Chem.276：26285-26290；Kostelney等(1992)J.Immunol.148：1547-1553；美国专利第5,932,448号、第5,532,210号、第6,129,914号、第6,133,426号、第4,946,778号。

本文所用术语“二硫键稳定的Fv片段”和“dsFv”是指包含由二硫键桥连接的可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)的抗体分子。

本发明组合物的“有效量”可为改善一种或多种熟知的参数的量，所述参数表征由MDL-1受体或其功能片段引起或介导的医学病症。“有效量”还意指与靶抗原结合以减轻或防止炎症、自身免疫或再灌注损伤(reperfusion injury)所需的抗体量或浓度，所述靶抗原例如MDL-1在浸润性白细胞上表达。

本文所用“炎症”或“炎性疾病”为针对损伤或病原体的免疫学应答，例如白细胞迁移，所述免疫学应答不仅破坏病原体而且破坏周围组织。炎症可例如在消化***、呼吸***、生殖***、分泌***、肌骨骼***和神经***中发生。炎性疾病的实例包括但不限于：炎症性肠病、克罗恩病(Crohn’s disease)、肺高反应性、肾炎、关节炎(例如骨关节炎)、皮炎(例如牛皮癣、特应性皮炎)等等。

“自身免疫”或“自体免疫病”是特征在于对身体自身的组织构成(自体抗原或自身抗原)起特异性体液介导(B细胞)或细胞介导(T细胞)的免疫应答的病症。自身免疫实例包括但不限于***性红斑狼疮、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病、格雷夫斯病(Graves disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis)、阿狄森病(Addison disease)、类风湿性关节炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture syndrome)、硬皮病、重症肌无力、恶性贫血等等。

本文所用术语“骨病”是指特征在于骨丢失(bone loss)的疾病，即具有骨量(bone mass)或骨密度降低的症状或病理的疾病、病症、病况或综合症。特征在于骨丢失的疾病实例包括但不限于骨质溶解(包括骨转移、假肢松动)、牙周炎、骨质疏松症、佩吉特病(paget’s disease)、转移性骨病和类风湿性关节炎。所述骨病包括与诸如狼疮和类风湿性关节炎等自体免疫病有关的骨病。业已发现不管先前使用皮质类固醇的情况怎样，患有SLE的妇女比无提高的SLE病损伤的妇女具有显著低的骨矿质密度T分值。所述骨病还包括与低骨量有关的病症，包括其中骨量水平低于由世界卫生组织规定的标准中特定年龄正常的骨量的病症。“Assessment ofFracture Risk and its Application to Screening for PostmenopausalOsteoporosis(骨折风险评估及其用于筛查绝经后骨质疏松症的应用)(1994).世界卫生组织研究小组的报告。世界卫生组织技术丛书843”。在与低骨量有关的病症中包括原发性和继发性骨质疏松症。

还包括的疾病有牙周病、牙槽骨丢失、截骨术后骨丢失及儿童特发性骨丢失以及骨质疏松症的长期并发症，例如脊柱弯曲、身高缩短和修复性手术(prosthetic surgery)。所述骨病可侵袭骨量低的对象，例如脊椎动物，例如哺乳动物，已知这样的对象具有比平均几率显著高的几率发展上述疾病，包括骨质疏松症(例如绝经后妇女，年龄超过50岁的男性)。可用增加或提高骨量的方法治疗上述疾病，所述方法包括骨恢复(bone restoration)、提高骨折愈合速率、完全取代骨移植手术、在面部再造(facialreconstruction)、上颌骨再造或下颌骨再造后骨愈合、修复性向内生长物(prosthetic ingrowth)、椎骨骨性结合或长骨延伸。本领域技术人员应认识到术语骨量实际上指每单位面积的骨量，有时(尽管在严格说来不恰当)被称为骨矿质密度(bone mineral density)。

本文骨病实例包括：骨质疏松症，例如原发性或继发性骨质疏松症，并包括糖皮质激素诱导的骨质疏松症；局部骨质侵蚀(focal bone erosion)或例如来自类风湿性关节炎的疾病，包括边际关节侵蚀(marginal joint erosion)和软骨下骨质侵蚀(骨髓)；佩吉特病，即骨更新异常地增加的骨质缺损；牙周病；牙缺失；假体周围骨质溶解(periprosthetic osteolysis)；成骨不全；转移性骨病；恶性高钙血症；儿童期特发性骨丢失(childhood idiopathic bone loss)；牙槽骨丢失；骨折；骨质减少，例如关节旁的骨质减少；在多发性骨髓瘤及相关病症中的骨病，例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstroms′macroglobulinemia)和/或单克隆γ球蛋白病。本文优选骨病为在多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症和单克隆γ球蛋白病和骨质疏松症中的骨病，更优选继发性骨质疏松症，还更优选炎症期间的骨丢失。与癌症无关的骨病也属于本发明范围内。

脊椎动物例如哺乳动物(包括人类)中的“继发性骨质疏松症”包括：炎症期间的骨丢失、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、甲状腺机能亢进诱导的骨质疏松症、固定诱导的骨质疏松症、肝素诱导的骨质疏松症和免疫抑制诱导的骨质疏松症。本文所用术语“骨再吸收”是指至少部分由破骨细胞活性引起的不合乎需要的骨丢失。

“骨质溶解”是指灾祸性骨丢失，或疾病谱的脆弱性病理学结果，包括类风湿性关节炎、骨转移、假肢松动和牙周炎。类风湿性关节炎(RA)为慢性炎症病，其经常导致长期残疾不全和死亡率增加。

“骨原细胞”是指源自骨基质细胞的分化的骨前体细胞。

“齿骨原细胞(Odontoprogenitor)”是指源自牙周膜的分化的骨前体细胞。

发明详述

术语“MDL-1”、“骨髓DAP12缔合的凝集素-1”、“缔合骨髓DAP12的凝集素-1”、“DAP-12”、“DAP12”、“DNAX激活蛋白，12kD”在本领域众所周知。在WO 99/06557中公开了人和小鼠DAP12和MDL-1核苷酸序列和多肽序列。人MDL-1核苷酸序列和氨基酸序列分别由WO 99/06557中的SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12确定。还可得到人MDL-1核酸序列(AR217548)和小鼠MDL-1核酸序列和氨基酸序列(分别为AR217549和AAN21593)的

保藏。

MDL-1的可溶性形式(即可溶性MDL-1多肽或可溶性MDL-1蛋白)也落入本发明范围内。MDL-1蛋白的结构特点在于细胞外结构域，其由人MDL-1蛋白的SEQ ID NO：2的26-188位的氨基酸残基和小鼠MDL-1蛋白的SEQ ID NO：4的26-190位的氨基酸残基来限定。可溶性MDL-1蛋白可与异源蛋白(例如抗体的Fc部分)融合，或与化学部分(例如PEG)缀合。

可溶性MDL-1多肽可用作与MDL-1抗体或其抗原结合片段的用途相似的治疗剂或诊断剂。细胞表面表达MDL-1表明该分子为用于基于抗体的治疗策略的有吸引力的靶标。可将MDL-1抗体引入患者中以使所述抗体结合MDL-1。

本发明基于以下发现：MDL-1使炎性骨破坏恶化，而MDL-1拮抗剂则防止该类型的组织破坏。

分子生物学

根据本发明，可使用本领域技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。文献中充分阐述了这些技术。参见例如Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(本文简称为“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach(DNA克隆：实践方法)，第I和II卷(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985))；Transcription And Translation(转录和翻译)(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984))；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney编辑(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(固定化细胞和酶)(IRL Press，(1986))；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(分子克隆实践指南)(1984)；F.M.Ausubel等(编辑.)，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学实验方案)，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。

本发明包括本发明MDL-1抗体或抗原结合片段的重组形式。

在特定的实施方案中，本发明包括编码以下物质的核酸：MDL-1、可溶性MDL-1、抗MDL-1抗体、抗MDL-1抗体重链或轻链、抗MDL-1抗体重链或轻链可变区、抗MDL-1抗体重链或轻链恒定区或抗MDL-1抗体CDR(例如CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3)，它们可通过PCR扩增。

可通过本领域已知任何方法(例如化学测序或酶测序)来测定任何核酸序列(例如编码MDL-1基因的核酸或编码抗MDL-1抗体或其片段或部分的核酸)。DNA的“化学测序”可指例如Maxam和Gilbert(1977)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：560)的方法，其中用单个碱基特异性反应将DNA随机切割。DNA的“酶测序”可指例如Sanger(Sanger等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)的方法。

本文核酸可位于天然调控(表达控制)序列的侧翼，或可与异源序列缔合，所述异源序列包括：启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、阻遏物、信号序列、聚腺苷化序列、内含子、5′-和3′-非编码区等等。

可用于调控基因表达的启动子包括但不限于：巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利第5,385,839号和第5,168,062号)、SV40早期启动子区(Benoist等，(1981)Nature 290：304-310)、包含在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复中的启动子(Yamamoto等，(1980)Cell22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)、金属硫蛋白基因调控序列(Brinster等，(1982)Nature 296：39-42)；原核表达载体，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)；还参见Scientific American(1980)242：74-94中的“Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白)”；和来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如Gal 4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。

当序列指导RNA聚合酶介导的编码序列转录为RNA(优选mRNA)，转录后的RNA可随后被反式RNA剪接(若其含有内含子的话)，并任选地翻译为由所述编码序列编码的蛋白质时，所述编码序列在细胞中表现为“在转录和翻译调控序列的调控下”、“功能上与转录和翻译调控序列联合”或“与转录和翻译调控序列可操作地连接”。

本发明涵盖对与蛋白质(例如本发明MDL-1)对应的氨基酸或核苷酸序列的修饰，尤其是轻微的或少量修饰。具体而言，本发明涵盖编码本发明人MDL-1和小鼠MDL-1的核酸的序列保守变体。

本发明包括MDL-1，其由表1所述核酸以及与其杂交的核酸编码。优选所述核酸在低严格性条件下、更优选在中等严格性条件下和最优选在高严格性条件杂交，并优选表现MDL-1活性。

当在合适的温度和溶液离子强度的条件下，单链形式的核酸分子可与其它核酸分子退火时，该核酸分子与另一核酸分子“可杂交”，所述另一核酸分子例如为eDNA、基因组DNA或RNA(参见Sambrook等，见上述)。温度和离子强度条件决定杂交的“严格性”。典型的低严格性杂交条件可为55℃、5X SSC、0.1％SDS、0.25％牛奶和不含甲酰胺；或30％甲酰胺、5X SSC、0.5％SDS。典型的中等严格性杂交条件除了杂交在40％甲酰胺和5X或6XSSC中进行外与低严格性条件相似。高严格性杂交条件除了杂交条件在50％甲酰胺、5X或6X SSC和任选地在较高温度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)中进行外，与低严格性条件相似。一般而言，SSC为0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠。杂交需要两个核酸含有互补序列，但根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。核酸杂交的适当的严格性视核酸长度和互补程度而定，变量在本领域众所周知。在两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，核酸可在其中杂交的严格性条件就越高。对于长度超过100个核苷酸的杂交体而言，已经推论出用于计算解链温度的方程式(参见Sambrook等，见上述，9.50-9.51)。对于较短的核酸(即寡核苷酸)杂交而言，错配的位置更加重要，寡核苷酸长度决定其特异性(参见Sambrook等，见上述，11.7-11.8)。

本发明中还包括包含以下核苷酸序列的核酸和包含以下氨基酸序列的多肽：当用BLAST算法进行比较时，与表1中的参考核苷酸和氨基酸序列具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性(例如91％、92％、93％、94％)和至少95％同一性(例如95％、96％、97％、98％、99％、100％)，其中选定算法的参数以得到相应序列与全长的相应参考序列之间的最大匹配。本发明还包括包含以下氨基酸序列的多肽：当用BLAST算法进行比较时，与表1中的参考氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2和4)具有至少70％相似性、至少80％相似性、至少90％相似性(例如91％、92％、93％、94％)和至少95％相似性(例如95％、96％、97％、98％、99％、100％)，其中选定算法的参数以得到相应序列与全长相应参考序列之间的最大匹配。

序列同一性是指作比较的两个序列的核苷酸或氨基酸之间的精确匹配。序列相似性是指作比较的两个多肽的氨基酸之间的精确匹配，以及在生物化学上相关的不同的氨基酸之间的匹配。上文已阐述了共有相似性质并可互换的生物化学上相关的氨基酸。

关于BLAST算法的以下参考文献在此用作参考：BLAST算法：Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish等，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden等，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul等，(1997)Nucleic Res.25：3389-3402；Zhang等，(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton等，(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock等，(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS：Dayhoff等，“Amodel of evolutionary change in proteins(蛋白质进化变化模型)”，载于Atlas of Protein Sequence and Structure，(1978)，第5卷，增刊3，M.O.Dayhoff(编辑)，第345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Schwartz等，“Matrices for detectingdistant relationships(用于检测远源关系的矩阵).”载于Atlas ofProtein Sequence and Structure，(1978)，第5卷，增刊3，M.O.Dayhoff(编辑)，第345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Altschul(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States等，(1991)Methods 3：66-70；Henikoff等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；Altschul等，(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；ALIGNMENT STATISTICS：Karlin等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877；Dembo等，(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；和Altschul，S.F.“Evaluating the statisticalsignificance of multiple distinct local alignments(评估多个不同的局部比对的统计学意义).”，载于Theoretical and ComputationalMethods in Genome Research(基因组研究的理论和计算方法)(S.Suhai编辑)，(1997)第1-14页，Plenum，New York。

本发明还包括MDL-1或其片段的可溶性形式的重组形式。可溶性MDL-1蛋白包含MDL-1的胞外结构域。此外，胞外结构域片段也提供MDL-1蛋白的可溶性形式。可用已知技术制备片段以分离胞外区域的所需部分。

可使用常规分子生物学技术制备具有融合异源酶学失活的多肽(例如IgG的溶胞或非溶胞Fc区)的MDL-1的嵌合蛋白。众多多肽适合用作本发明的酶学失活的蛋白质。优选所述蛋白质具有以下特性：至少10kD的分子量；在pH 6.8下净中性电荷；球状三级结构；和人来源。当酶学失活的多肽为IgG时，优选该IgG部分被糖基化。若有需要，酶学失活的多肽可包括被安置的IgG铰链区，以使嵌合蛋白具有与IgG铰链区连接的MDL-1，而该铰链区连接增加寿命的多肽。因此，铰链区可用作细胞因子与增加寿命的多肽之间的间隔物。分子生物学技术人员可易于从分泌IgG2a的杂交瘤(例如HB129)或其它真核细胞或杆状病毒***制备所述分子。作为使用IgG铰链区的备选方案，可使用本文所定义的柔性多肽间隔物。用常规分子生物学技术，可将所述多肽***到MDL-1与增加寿命的多肽之间。

当异源蛋白包括Fc区时，若有需要可将所述Fc区突变，以抑制其固定补体和以高亲和力结合Fc受体的能力。对于鼠IgG Fc而言，Glu 318、Lys 320和Lys 322取代为Ala残基使得所述蛋白不能指导ADCC。Leu 235取代为Glu抑制所述蛋白以高亲和力结合Fc受体的能力。关于人IgG的合适的突变也是已知的(参见例如Morrison等，1994，The Immunologist 2：119-124和Brekke等，1994，The Immunologist 2：125)。其它突变也可用于抑制蛋白的这些活性，可将本领域认知的方法用于测定蛋白固定补体或结合Fc受体的能力。其它有用的异源多肽包括：白蛋白(例如人血清白蛋白)；铁传递蛋白；酶，例如经过突变而失活的t-PA；和在人体中循环半衰期长并且无酶活性的其它蛋白。

优选的是，用于产生嵌合蛋白(例如IgG Fc)的酶学失活的多肽本身具有比细胞因子(例如IL-10)更长的体内循环半衰期。更优选的是，嵌合蛋白的半衰期为单独的细胞因子的至少2倍。最优选的是，嵌合蛋白的半衰期为单独的细胞因子的至少10倍。可在取自用嵌合蛋白治疗的患者的血清样品的ELISA中测量嵌合蛋白的循环半衰期。在所述ELISA中，可将针对细胞因子的抗体用作捕获抗体，可将针对酶学失活的蛋白的抗体用作检测抗体，使得能够单独检测样品中的嵌合蛋白。可使用用于实施ELISA的常规方法，本文提供了所述ELISA的详细实例。

可使用用重组DNA技术表达蛋白的常规方法来合成(例如在哺乳动物细胞中)嵌合蛋白。因为先前业已纯化了很多用于产生嵌合蛋白的多肽，因此很多先前所述的蛋白纯化方法连同用于纯化本发明嵌合蛋白的其它常规方法应该有用。若有需要，可用针对细胞因子的抗体按照标准方案来亲和纯化嵌合蛋白。针对酶学失活的蛋白的抗体也用于通过常规免疫亲和技术来纯化嵌合蛋白。若有需要，可用通常用于测定单独的蛋白活性的方法测定嵌合蛋白活性。嵌合蛋白活性不一定要与单独的蛋白活性相同。

本发明还包括融合体，所述融合体包括本发明多肽和多核苷酸与第二多肽或多核苷酸部分(其可被称为“标签”)。可方便地构建本发明融合的多肽，例如如上所述通过将本发明多核苷酸或其片段***表达载体。本发明融合体可包括有助于纯化或检测的标签。所述标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、六聚组氨酸(His6)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、血细胞凝集素(HA)标签、纤维素结合蛋白(CBP)标签和myc标签。可检测标记或标签例如³²P、³⁵S、¹⁴C、³H、⁹⁹mTc、¹¹¹In、⁶⁸Ga、¹⁸F、¹²⁵I、¹³¹I、^113mIn、⁷⁶Br、⁶⁷Ga、^99mTc、¹²³I、¹¹¹In和⁶⁸Ga也可用于标记本发明多肽。用于构建和使用所述融合体的方法很常见并在本领域众所周知。

发生在多肽中的修饰(例如翻译后修饰)通常取决于该肽是如何产生的。例如，对于通过在宿主中表达克隆的基因而产生的多肽，修饰的种类和程度在很大程度上将由宿主细胞的翻译后修饰的能力和在多肽氨基酸序列中存在的修饰信号决定。例如，众所周知，在细菌宿主例如大肠杆菌中通常不发生糖基化。因此，当需要糖基化时，可在能进行糖基化的宿主中表达多肽，这样的宿主通常为真核细胞。昆虫细胞通常能进行与哺乳动物细胞相似的翻译后糖基化。为此，业已开发了昆虫细胞表达***以有效表达具有天然糖基化形式的哺乳动物蛋白。或者，可使用去糖基化酶以去除在真核表达***中产生期间连接的糖类。

可用以下方法来制备本发明MDL-1肽类似物：通过化学合成；或通过用定点诱变，Gillman等，(1979)Gene 8：81；Roberts等，(1987)Nature，328：731或Innis(编辑)，1990，PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications(PCR方案：方法及应用指南)，Academic Press，New York，NY；或聚合酶链式反应方法PCR，Saiki等，(1988)Science 239：487，其由Daugherty等，(1991)(Nucleic Res.19：2471)例证可修饰编码肽的核酸。加入表位标签用于纯化或检测重组产物是预想的。

还可使用本领域已知可用于通过反应性侧基交联蛋白的试剂来制备其它类似物。与交联剂反应的优选衍生位点为游离氨基或羧基、糖部分和半胱氨酸残基。

蛋白纯化

通常可通过在培养基(例如液体培养基，例如LB培养基)中生长的宿主细胞中表达编码多肽的核酸来制备本发明肽。例如，核酸可为存在于宿主细胞中的载体(例如质粒)的部分。表达后，可将本发明肽从培养的细胞中分离。可通过包括但不限于如下的标准方法纯化本发明肽：盐或乙醇沉淀、亲和色谱(例如与上述纯化标记的肽联用)、制备型圆盘凝胶电泳、等电点聚焦、高压液相色谱(HPLC)、反相HPLC、凝胶过滤、阳离子和阴离子交换和分配色谱和逆流分配法。所述纯化方法在本领域众所周知，公开于例如“Guide to Protein Purification(蛋白纯化指南)”，Methods inEnzymology，第182卷，M.Deutscher编辑，1990，Academic Press，New York，NY中。

抗体结构

一般而言，已知基本的抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一个“轻链”(约25kDa)和一个“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分可包含主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分可确定主要负责效应子功能的恒定区。通常人轻链分为κ和λ轻链。此外，人重链通常分为μ、δ、γ、α或ε，并确定了抗体的同种型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连在一起，且重链还包括约10个另外氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental Immunology(基础免疫学)第7章(Paul，W.编辑，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))(为所有目的以其整体在此引作参考)。

每对轻链/重链的可变区可形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整IgG抗体具有两个结合位点。一般而言，除了在双功能或双特异性抗体中之外，这两个结合位点是相同的。

通常，所有链都表现出相同的一般结构，即由三个超变区连接的相对保守的构架区(FR)，前者也称为互补决定区或CDR。来自每对链的两条链的CDR通常通过构架区排列好，从而能够结合特异性表位。一般而言，轻链和重链两者都从N-末端到C-末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常，按照如下文献中的定义来将氨基酸分配至每一结构域：Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白序列)；National Institutes of Health，Bethesda，Md.，第5版；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等，(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等，(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等，(1989)Nature342：878-883。

抗体分子

本发明抗MDL-1抗体分子优选识别人MDL-1；例如由包含SEQ ID NO：1多核苷酸序列的基因表达的多肽；例如由人MDL-1蛋白SEQ ID NO：2的26-188位的氨基酸残基所限定的可溶性MDL-1多肽。然而，本发明包括识别小鼠MDL-1和来自其它物种的MDL-1的抗体分子，所述其它物种优选哺乳动物(例如大鼠、兔、绵羊或狗)；例如包含SEQ ID NO：3多核苷酸序列的基因所表达的多肽；例如由鼠MDL-1蛋白SEQ ID NO：4的26-190位的氨基酸残基所限定的可溶性MDL-1多肽。本发明还包括以下抗MDL-1抗体或其片段，所述抗MDL-1抗体或其片段与MDL-1或其任何片段或与在细胞表面表达MDL-1或其任何部分或片段的任何细胞形成复合体。可通过让抗体或抗体片段与MDL-1或MDL-1片段接触来制备所述复合体。

在一个实施方案中，用携带部分不同于小鼠***的人免疫***的转基因小鼠产生针对MDL-1的全人单克隆抗体。这些在本文中可称为“HuMAb”小鼠的转基因小鼠含有人免疫球蛋白基因微基因座(miniloci)以及被靶向的突变，所述基因微基因座编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，所述被靶向的突变使内源μ和κ链基因座失活(Lonberg，N.等，(1994)Nature368(6474)：856-859)。这些抗体也被称为全人抗体。因此，所述小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且在对免疫接种产生应答时，被引入的人重链和轻链转基因经过类别转换和体细胞突变，从而产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等，(1994)，见上述；在Lonberg，N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology(实验药理学手册)113：49-101中综述；Lonberg等，(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93和Harding等，(1995)Ann.N.YAcad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠的制备在本领域众所周知，阐述于以下文献中：例如Taylor等，(1992)Nucleic Research20：6287-6295；Chen等，(1993)International Immunology5：647-656；Tuaillon等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90：3720-3724；Choi等，(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen等，(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等，(1994)J Immunol.152：2912-2920；Lonberg等，(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology(实验药理学手册)113：49-101；Taylor等，(1994)InternationalImmunology 6：579-591；Lonberg等，(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding等，(1995)Ann.N.YAcad.Sci 764：536-546；Fishwild等，(1996)Nature Biotechnology 14：845-851和Harding等，(1995)Annals NY Acad.Sci.764：536-546；以上文献的内容都在此以其整体引作参考。还参见：美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；第5,770,429号和第5,545,807号；和国际专利申请公开号WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/22645和WO 92/03918，它们所有的内容都以其整体在此引作参考。

为了制备针对MDL-1的全人单克隆抗体，可用抗原性MDL-1多肽免疫接种HuMab小鼠，参见Lonberg等，(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild等，(1996)Nature Biotechnology14：845-851和WO 98/24884。优选小鼠在第一次免疫接种时为6-16周龄。例如，可用MDL-1的纯化的制备物经腹膜内免疫接种HuMab小鼠。也可使用用MDL-1基因稳定转化或转染的完整细胞来免疫接种小鼠。

一般而言，当用含抗原的完全弗氏佐剂经腹膜内(IP)初次免疫接种HuMAb转基因小鼠，接着每隔一周用含抗原的不完全弗氏佐剂IP免疫接种(通常总次数至多6次)时，所述HuMAb转基因小鼠的应答良好。也可在初次用表达MDL-1的细胞然后用MDL-1可溶性片段免疫接种小鼠，并继续用这两种抗原进行交替免疫接种。在免疫接种方案过程中，可用通过眼框后放血而获得的血浆样品来监测免疫应答情况。可例如通过ELISA筛查血浆中抗MDL-1抗体的存在情况，具有足量免疫球蛋白滴度的小鼠可用于融合。可在用抗原经静脉内对小鼠加强免疫接种后3天处死小鼠并移走脾脏。预期对每种抗原可能需要进行2-3次融合。对于每种抗原可免疫若干只小鼠。例如，可免疫总共12只HC07和HC012品系的HuMAb小鼠。

可通过本领域众所周知的方法来制备产生单克隆抗MDL-1抗体的杂交瘤细胞。这些方法包括但不限于由Kohler等，(1975)(Nature 256：495-497)首先开发的杂交瘤技术以及三源杂交瘤(trioma)技术(Hering等，(1988)Biomed.Biochim.Acta.47：211-216和Hagiwara等，(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4：15)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，(1983)Immunology Today 4：72和Cote等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80：2026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等，载于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症疗法)，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页，1985)。优选对小鼠脾细胞进行分离，并根据标准方案用PEG将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后可针对抗原特异性抗体的产生情况对得到的杂交瘤进行筛选。例如，可使用50％PEG，将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单一悬浮细胞与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)进行融合。可将细胞以大约2x10⁵个细胞/mL铺在平底微滴板中，接着在含有以下物质的培养基中孵育2周：20％胎儿克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺，1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素(penicillin)、50mg/ml链霉素(streptomycin)、50mg/ml庆大霉素(gentamycin)和1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)。2周后，可让细胞在其中用HT代替HAT的培养基中培养。然后可通过ELISA筛选各个孔的人抗MDL-1单克隆IgG抗体。可通常在10-14天后杂交瘤出现广泛生长时，观察培养基。可对分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，若仍然是人IgG阳性，则可通过有限稀释将抗MDL-1单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可让合适的亚克隆在体外培养以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

还可重组制备本发明抗MDL-1抗体分子(例如在上述大肠杆菌/T7表达***中)。在该实施方案中，可将编码本发明抗体分子(例如V_H或V_L)的核酸***到基于pET的质粒中，并在大肠杆菌/T7***中表达。有若干方法可用于制备本领域已知的重组抗体。用于重组制备抗体的方法的一个实例公开于美国专利第4,816,567号中，其在此用作参考。可通过用于将多核苷酸掺入到宿主细胞中的任何已知方法实施转化。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞的方法在本领域众所周知，包括右旋糖苷介导的转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮-十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中一种或多种多核苷酸包囊法、生物射弹注射和将DNA直接微注射到细胞核。另外，可通过病毒载体将核酸分子引入到哺乳动物细胞中。转化细胞的方法在本领域众所周知。参见例如美国专利第4,399,216号；第4,912,040号；第4,740,461号和第4,959,455号。

可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域众所周知，包括很多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些细胞尤其包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、海拉细胞、仓鼠婴肾细胞(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定具有高表达水平的细胞系来选择特定偏好的细胞系。可使用的其它细胞系为昆虫细胞系，例如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞时，通过让宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间来产生抗体，或更优选地，5种抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中。

可用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。此外，用多种已知技术可提高产生细胞系对本发明抗体(或来自所述抗体的其它部分)的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达***(GS***)是用于在某些条件下提高表达的常用方法。GS***在以下文献中有完整或部分论述：欧洲专利第0216846号、第0256055号和第0323997号和欧洲专利申请第89303964.4号中论述。

可能出现的情况是，由不同的细胞系表达或在不同转基因动物中表达的抗体彼此之间会有不同的糖基化作用。然而，所有由本文提供的核酸分子编码的抗体，或包含本文提供的氨基酸序列的抗体都是本发明的一部分，与所述抗体的糖基化情况无关。

属于本发明范围内的抗体片段、优选抗原结合抗体片段还包括F(ab)₂片段，该片段可通过酶裂解IgG产生，例如通过胃蛋白酶。Fab片段可通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)₂产生。Fab片段为通过二硫桥连接于V_H-C_H1链的V_L-C_L链。反过来说，F(ab)₂片段为由两个二硫桥连接的两个Fab片段。F(ab)₂分子的Fab部分包含二硫桥所处位置之间的F_c区的一部分。

众所周知，Fv是含有完整的抗原识别和结合位点的最小的抗体片段，其由非共价缔合的一条重链和一条轻链的可变结构域(V_H-V_L)的二聚体组成。在这种与天然抗体中存在的构象相对应的构象中，每个可变结构域的3个互补决定区(CDR)互相作用，从而限定了V_H-V_L二聚体表面的抗原结合位点。6个CDR共同为抗体赋予抗原结合特异性。在人和小鼠这样的不同物种中，CDR侧翼的构架(FR)具有在各种天然免疫球蛋白中的基本上保守的三级结构。这些FR起着以适当的方位保持CDR的作用。结合功能不需要恒定结构域，但恒定结构域有助于稳定V_H-V_L的相互作用。虽然单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的3个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，但结合亲和力通常比完整的结合位点低(Painter，Biochem.11(1972)，1327-1337)。因此，如本发明所定义和阐述的抗体构建体的结合位点的所述结构域可为不同免疫球蛋白的V_H-V_L、V_H-V_H或V_L-V_L结构域对。在多肽链内V_H和V_L结构域次序对于本发明并不是决定性的，可将上文所述的结构域次序颠倒而通常没有任何功能损失。然而，重要的是安排V_H和V_L结构域以使抗原结合位点可适当地折叠。F_V片段为V_L或VH区。

根据免疫球蛋白重链恒定结构域的氨基酸序列，可将其指定为不同的类别。有至少5种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类别中有些可进一步分为各个亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。

也可让本发明抗MDL-1抗体分子或MDL-1可溶性蛋白与化学部分缀合。化学部分尤其可为聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。优选化学部分为提高受治疗者体内抗体分子的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等，(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等，(2001)(Bioconi.Chem.12：545-553)公开了用PEG缀合来抗体，其中PEG与放射性金属螯合剂(二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))连接。

还可让本发明抗体和抗体片段或MDL-1可溶性蛋白或其片段与例如以下标记物缀合：⁹⁹Tc、⁹⁰Y、¹¹¹In、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹¹C、¹⁵O、¹³N、¹⁸F、³⁵S、⁵¹Cr、⁵⁷To、²²⁶Ra、⁶⁰Co、⁵⁹Fe、⁵⁷Se、¹⁵²Eu、⁶⁷CU、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd、²³⁴Th和⁴⁰K、¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、⁵²Tr和⁵⁶Fe。

还可让本发明抗体和抗体片段、MDL-1可溶性蛋白、MDL-1融合蛋白或其片段与包括荧光团在内的以下荧光标记或化学发光标记缀合：例如稀土螯合剂、荧光素及其衍生物、罗丹明和其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝素、邻苯二醛、荧光胺、¹⁵²Eu、丹磺酰、伞形酮、虫荧光素、鲁米那(luminal)标记物、异鲁米那标记、芳香吖啶酯标记物、咪唑标记物、吖啶盐标记物、草酸酯标记物、水母发光蛋白标记物、2，3-二氢邻苯二氮杂萘二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物和合适的自由基。

还可让抗体分子或可溶性MDL-1蛋白与以下细胞毒性因子缀合：例如白喉毒素、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白A链、帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白和化合物(例如脂肪酸)、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(saponaria officinalis)抑制剂、丝林霉素、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)和伊诺霉素(enomycin)。

可采用用于让本发明抗体分子或蛋白分子与各种部分缀合的本领域任何已知方法，包括在如下文献中所述的方法：Hunter等，(1962)Nature 144：945；David等，(1974)Biochemistry13：1014；Pain等，(1981)J.Immunol.Meth.40：219；和Nygren，J.，(1982)Histochem.和Cytochem.30：407。用于缀合抗体和蛋白的方法为常规方法并在本领域众所周知。

本发明MDL-1肽抗原(即免疫原)片段也属于本发明范围内。可让抗原片段与其它物质连接(例如与多肽融合或共价连接)以用作免疫原。抗原肽可用于制备识别MDL-1或其任何片段的抗体分子。抗原及其片段可与多种免疫原融合或共价连接，所述免疫原例如钥孔傶血兰蛋白、牛血清白蛋白或卵清蛋白(Coligan等(1994)Current Protocols in Immunol(当前免疫学实验方案)，第2卷，9.3-9.4，John Wiley和Sons，New York，NY)。可用算法从多肽靶标选择合适的抗原性肽，参见例如Parker等(1986)Biochemistry25：5425-5432；Jameson和Wolf(1988)Cabios 4：181-186；Hopp和Woods(1983)Mol.Immunol.20：483-489。

当在有免疫能力的宿主中将MDL-1肽用作抗原以引起抗体产生时，尽管并不是总需要，但优选首先通过交联或串联(concatenation)，或通过偶联免疫原载体分子(即具有在宿主动物中独立引发免疫应答的性质的大分子，例如白喉毒素或破伤风毒素)，赋予较小的抗原片段更多免疫原性。因为小多肽片段有时起半抗原(能够特异性结合抗体但不能够引发抗体产生的分子，即它们不是免疫原)的作用，所以可能需要与载体分子交联或缀合。所述片段与免疫原载体分子的缀合通过众所周知的“载体效应”赋予它们更大的免疫原性。

载体分子包括例如蛋白和天然或合成的聚合化合物，例如多肽、多糖、脂多糖等等。蛋白载体分子尤其优选，其包括但不限于：钥孔傶血兰蛋白和哺乳动物血清蛋白，例如人或牛γ球蛋白、人、牛或兔血清白蛋白或所述蛋白的甲基化衍生物或其它衍生物。其它蛋白载体对本领域技术人员显而易见。优选蛋白载体对于宿主动物而言为外源蛋白，在所述宿主动物中针对所述片段的抗体被引发。

可用在本领域众所周知的方法完成与载体分子的共价偶联；由所用载体分子的特性来正确选择方法。当免疫原载体分子为蛋白时，可例如用水溶性碳二亚胺(例如二环己基碳二亚胺)或戊二醛来偶联本发明片段。

诸如上述的偶联剂还可用于使片段与其本身交联而不使用单独的载体分子。这样交联成聚集物也可提高免疫原性。单独使用或与偶联或聚集联用已知的佐剂也可提高免疫原性。

用于免疫接种动物的佐剂包括但不限于：佐剂65(含有花生油、二缩甘露醇一油酸酯(mannide monooleate)和单硬脂酸铝)；完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂；矿物凝胶，例如氢氧化铝、磷酸铝和明矾；表面活性剂，例如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基二(十八烷基)铵、N，N-二(十八烷基)-N′，N′-双(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基丙三醇和聚氧丙烯多元醇(pluronicpolyol)；聚阴离子，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚肌胞苷酸、聚丙烯酸和卡波普(carbopol)；肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬肽；和油乳剂。还可将多肽掺入到脂质体或其它微载体后给予。

关于佐剂和免疫测定的各个方面的信息公开于例如P.Tiissen的Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(酶免疫测定的实践和理论)丛书，第三版，1987，Elsevier，New York中。涉及用于制备多克隆抗血清的方法的其它有用参考文献包括：Microbiology(微生物学)，1969，Hoeber Medical Division，Harper和Row；L和steiner，Specificity of Serological Reactions(血清学反应的特异性)，1962，Dover Publications，New York和Williams等，Methods in Immunology and Immunochemistry(免疫学和免疫化学方法)，第1卷，1，1967，Academic Press，New York。

本发明抗MDL-1“抗体分子”包括但不限于抗MDL-1抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体和抗独特型抗体)及其片段，优选其抗原结合片段，例如Fab抗体片段、F(ab)₂抗体片段、Fv抗体片段(例如V_H或V_L)、单链Fv抗体片段和dsFv抗体片段。此外，本发明抗体分子可为全人抗体、小鼠抗体、兔抗体、鸡抗体、人/小鼠嵌合抗体或人源化抗体。

本发明抗MDL-1抗体分子优选识别本发明人或小鼠MDL-1肽；然而，本发明包括识别来自不同物种的MDL-1肽的抗体分子，所述不同物种优选哺乳动物(例如猪、大鼠、兔、绵羊或狗)。

本发明还包括包含本发明MDL-1肽和一种或多种抗体分子(例如双功能抗体)的复合体。所述复合体可通过简单地让抗体分子与其关联肽接触来制备。

各种方法可用于制备本发明抗体分子。在优选实施方案中，由与在以下文献中公开的方法相似的方法制备本发明抗体：美国专利第5,625,126号；第5,877,397号；第6,255,458号；第6,023,010号和第5,874,299号。然后可通过本领域众所周知的方法制备产生单克隆、全人抗MDL-1肽抗体的杂交瘤细胞。这些方法包括但不限于：由Kohler等，(1975)(Nature 256：495-497)首先开发的杂交瘤技术以及三源杂交瘤技术(Hering等，(1988)Biomed.Biochim.Acta.47：211-216和Hagiwara等，(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4：15)、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，(1983)Immunology Today 4：72和Cote等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80：2026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等，载于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症疗法)，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页，1985)。此外，ELISA可用于确定杂交瘤细胞是否表达抗MDL-1肽抗体。

对于制备抗体而言纯化抗原不是必需的。可通过DNA载体免疫接种法实施免疫接种，参见例如Wang等(1997)Virology228：278-284。或者，可用荷有目的抗原的细胞免疫动物。随后可从免疫的动物分离脾细胞，该脾细胞可与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(Meyaard等(1997)Immunity 7：283-290；Wright等(2000)Immunity 13：233-242；Preston等(1997)Eur.J.Immunol.27：1911-1918)。可通过功能测定或生物学测定(也就是不依赖于是否有纯化的抗原的测定)筛选出产生所需抗体的得到的杂交瘤。经证明，在产生抗体方面，细胞免疫接种法可比纯化抗原免疫接种法更优越(Kaithamana等(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。

可通过如下方法测量抗体与抗原及配体与受体的结合特性：例如表面等离子共振技术(Karlsson等(1991)J.Immunol.Methods145：229-240；Neri等(1997)Nat.Biotechnol.15：1271-1275；Jonsson等(1991)Biotechnologys 11：620-627)或通过竞争ELISA(Friguet等(1985)J.Immunol.Methods 77：305-319；Hubble(1997)Immunol.Today 18：305-306)。可将抗体用于亲和纯化以分离抗体的靶抗原及相关结合蛋白，参见例如Wilchek等(1984)Meth.Enzymol.104：3-55。

特异性结合MDL-1变体的抗体在所涵盖的方法的定义内，其中所述变体具有以下核酸和氨基酸序列：与本文所述的那些核酸和氨基酸序列基本相同，但具有基本上不影响核酸或氨基酸序列的功能方面的取代，。具有基本上不改变这些核酸和多肽的生物学功能的截短、缺失、添加及取代区域的变体在所涵盖的方法的定义内。

双特异性抗体为具有针对至少两个不同表位的结合特异性的抗体。例示性双特异性抗体可结合MDL-1的两个不同的表位。或者，双特异性MDL-1抗体可结合另一抗原，例如DC-SIGN、CD20、RANK-L等等。

用于制备双特异性抗体的方法为本领域已知。全长双特异性抗体的传统的制备基于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达(Millstein等Nature，305：537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链是随机分配的，所以这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常由亲和色谱步骤进行的正确分子的纯化相当繁琐，且产物的产率很低。相似的方法公开于WO93/08829和Traunecker等EMBO J，10：3655-3659(1991)中。

根据不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，该结构域包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区。优选具有第一重链恒定区(CH1)，其含有与轻链结合所需的位点，其存在于融合体中的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合体和(若有需要)免疫球蛋白轻链的DNA***到分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体。当构建中所使用的不同比例的3个多肽链提供最佳产率，这为在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例提供很大的弹性。然而，当以相等比例表达至少2个多肽链导致高产率时，或当比例没有特别意义时，可能将2个或所有3个多肽链的编码序列***到一个表达载体中。

在该方法优选实施方案中，双特异性抗体由在一条臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构促使所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合分开，因为免疫球蛋白轻链仅在双特异性分子的一半中存在提供了容易的分离方法。这种方法公开于WO 94/04690中。产生双特异性抗体的更详细的资料参见例如Suresh等Methods inEnzymology(酶学方法)，121：210(1986)。

根据在美国专利第5,731,168号中阐述的另一方法，可工程改造抗体分子对之间的界面(interface)以使从重组细胞培养物回收的异型二聚体的百分比最大化。优选界面包含至少一部分抗体恒定结构域的C_H3结构域。在该方法中，可用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链。可通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面产生与一条或多条大侧链大小相同或相似的补偿性“空穴”。这提供了提高异型二聚体高于其它不需要的终产物(例如同型二聚体)的产率的机制。

双特异性抗体包括交联的或“异源缀合”的抗体。例如，异源缀合物中的一个抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一个抗体与生物素偶联。业已提出这样的抗体例如使免疫***细胞靶向有害细胞(美国专利第4,676,980号)并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可用任何合适的交联方法来制备异源缀合抗体。合适的交联剂连同多种交联技术在本领域众所周知，并且公开于美国专利第4,676,980号中。

用于由抗体片段产生双特异性抗体的技术业已在文献中阐述。例如，可用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等Science，229：81(1985)阐述了其中将完整抗体蛋白水解切割以产生F(ab′)₂片段的方法。这些片段在二巯基络合剂***存在下被还原，从而稳定邻近的二巯基并防止分子内形成二硫键。然后将产生的Fab′片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后再通过用巯基乙胺还原将Fab′-TNB衍生物之一恢复为Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一Fab′-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。

最近的研究进展促进从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，可化学偶联所述片段以形成双特异性抗体。Shalaby等(1992)J.Exp.Med.，175：217-225阐述了全人源化双特异性抗体F(ab′)₂分子的产生。让大肠杆菌单独分泌每种Fab′片段，并在体外进行直接化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发针对人乳腺肿瘤靶标的人细胞毒性淋巴细胞的溶胞活性。

业已阐述用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，业已用亮氨酸拉链制备出双特异性抗体。Kostelny等(1992)J.Immunol.，148(5)：1547-1553。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接到两个不同抗体的Fab′部分。抗体同型二聚体在铰链区被还原形成单体，然后重新氧化成抗体异型二聚体。该方法还可用来制备抗体同型二聚体。由Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448所述的“双抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的备选机制。所述片段包含通过接头与轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)，所述接头长度较短致使同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一个片段的互补V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了用于通过用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等(1994)J.Immunol.，152：5368。

还涵盖了多于2价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等(1991)J.Immunol.147：60。

抗体结合测定

可通过本领域任何已知方法测定本发明抗体的免疫特异性结合情况。可使用的免疫测定包括但不限于使用以下技术的竞争性和非竞争性测定***：例如蛋白印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射分析、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，还有很多这里就不一一列举了。所述测定为常规测定，在本领域众所周知(参见例如Ausubel等编辑，1994，Current Protocols inMolecular Biology(当前分子生物学实验方案)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York，所述文献以其整体在此引作参考)。下文简述了例示性的免疫测定(但并非意欲通过举例限制)。

免疫沉淀实验方案通常包含在裂解缓冲液中裂解一群细胞，所述缓冲液例如为补充了蛋白磷酸酯酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑蛋白酶肽、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、pH7.2的0.01M磷酸钠、1％斯特乐(Trasylol))，将目标抗体加入到细胞裂解物中，在4℃孵育一段时间(例如1-4小时)，将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠加入到细胞裂解物中，在4℃下孵育约1小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤所述珠，将所述珠重新悬浮在SDS/样品缓冲液中。可通过例如蛋白印迹分析来评估目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员应了解可进行修改以增加抗体与抗原结合并降低背景的参数(例如用琼脂糖珠预先澄清细胞裂解物)。关于有关免疫沉淀实验方案的进一步论述，参见例如Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学实验方案)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，NewYork于10.16.1。

蛋白印迹分析通常包含以下步骤：制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如8％-20％SDS-PAGE，视抗原的分子量而定)中电泳蛋白样品；将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜(例如硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜)；在封闭液(例如含3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜；在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween 20)中洗涤膜；用在封闭缓冲液中稀释的第一抗体(所述目标抗体)封闭膜；在洗涤缓冲液中洗涤膜；用在封闭缓冲液中稀释的已缀合酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶)或放射性分子(例如32P或125I)的第二抗体(识别所述第一抗体，例如抗人抗体)封闭膜；在洗涤缓冲液中洗涤膜；以及检测抗原的存在情况。本领域技术人员应了解可对参数进行修改，以提高检测信号并降低背景。为了进一步讨论有关免疫印迹的实验方案，参见例如Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学实验方案)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York于10.8.1。

ELISA包括：制备抗原；用抗原包被96孔微滴板的孔；将与可检测化合物例如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶)缀合的目标抗体加入到孔中并孵育一段时间；以及检测抗原的存在情况。在ELISA中，目标抗体不一定要缀合可检测化合物；取而代之，可将缀合可检测化合物的第二抗体(识别目标抗体)加入到孔中。另外，可用抗体包被孔，来代替用抗原包被孔。在该情况下，可在将目标抗原加入到被包被的孔中，随后加入已缀合可检测化合物的第二抗体。本领域技术人员应了解的是，可对参数进行修改，以提高检测信号以及本领域已知的其它ELISA变量。关于有关ELISA的进一步论述，参见例如Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学实验方案)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York于11.2.1。

可通过竞争性结合测定法来测定抗体与抗原的结合亲和力和抗体-抗原相互作用解离率。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在增加未标记的抗原量存在下，用目标抗体孵育标记的抗原(例如3H或125I)；以及检测与标记的抗原结合的抗体。可从由Scatchard图分析的数据测定目标抗体对特定抗原的亲和力和结合解离率。还可用放射性免疫测定法来测定与第二抗体的竞争。在该情况下，在增加未标记的第二抗体量存在下，让抗原与缀合标记的化合物(例如3H或125I)的目标抗体孵育。

可用任何本领域已知的方法测定抗体与一种抗原相对于另一种抗原优先并特异性结合的能力。作为非限制性实例，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的解离常数(K_D)的K_D结合第一抗原，则可认为该抗体优先结合所述第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的亲和力(即K_D)至少一个数量级的K_D结合第一抗原，则可认为该抗体优先结合所述第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的亲和力(即K_D)至少两个数量级的K_D结合第一抗原，则可认为该抗体优先结合所述第一抗原。

在另一个非限制性实施方案中，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的解离率(K_off)的K_off结合第一抗原，则可认为该抗体优先结合所述第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的K_off至少一个数量级的K_off结合第一抗原，则可认为该抗体优先结合所述第一抗原。另一非限制性实施方案中，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的K_off至少两个数量级的K_off结合第一抗原，则可认为该抗体优先结合所述第一抗原。

还可就其交叉反应性来阐述或限定本发明抗体。本发明包括不结合本发明多肽的任何其它类似物、直向同源物或同源物的抗体。本发明还包括结合与本发明多肽具有以下同一性的多肽的抗体：至少100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％和至少50％同一性(用本领域已知并在本文中阐述的方法计算)。

本发明还包括不结合与本发明多肽具有以下同一性的多肽的抗体：小于100％、小于99％、小于98％、小于97％、小于96％、小于95％、小于94％、小于93％、小于92％、小于91％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％和小于50％同一性(用本领域已知并在本文中阐述的方法计算)。本发明还包括结合由在严格性杂交条件下(如本文所述)与本发明多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽的抗体。还可就其与本发明多肽的结合亲和力阐述或限定本发明抗体。

治疗应用

本发明提供用于诊断和治疗骨病的方法。所述方法可包括使用对MDL-1多肽或核酸具有特异性的结合组合物，例如抗体或其抗原结合片段或可溶性MDL-1蛋白或核酸探针或引物。还提供对照结合组合物，例如对照抗体，参见例如Lacey等(2003)Arthritis Rheum(风湿性关节炎).48：103-109；Choy和Panayi(2001)New Engl.J.Med.344：907-916；Greaves和Weinstein(1995)NewEngl.J.Med.332：581-588；Robert和Kupper(1999)New Engl.J.Med.341：1817-1828；Lebwohl(2003)Lancet 361：1197-1204。

在某些实施方案中，使用MDL-1拮抗剂(包括针对MDL-1蛋白或可溶性MDL-1蛋白或多肽的抗体)来抑制骨再吸收，包括抑制破骨细胞形成和激活。还可将MDL-1拮抗剂给予受治疗者以诱导骨形成，包括激活成骨细胞。为了诱导骨形成，可单独或与如下所述的另外的护理疗法标准联合给予MDL-1拮抗剂。

用于与第二治疗剂(例如细胞因子、化疗剂、抗生素或辐射)共同给予或治疗的方法在本领域众所周知(Hardman等(编辑)(2001)Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics(治疗剂的药理学基础)，第10版，McGraw-Hill，NewYork，NY；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics forAdvanced Practice；A Practical Approach(药物治疗学的最新实行：实践方法)，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA；Chabner和Longo(编辑)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy(癌症化疗和生物疗法)，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA)。

所述另外的治疗剂的实例包括：治疗与破骨细胞有关的疾病的药物；化疗剂；干扰素类的药物，例如干扰素-α(例如来自Amarillo Biosciences，Inc.)、IFN-β-1a(

和)或IFN-β-1b

寡肽，例如醋酸格拉默(glatirameracetate)

封闭CD40-CD40配体的药物；细胞毒剂或免疫抑制药物(例如米托蒽醌(mitoxantrone)

甲氨蝶呤(methotrexate)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、来氟米特(leflunomide)和硫唑嘌呤(azathioprine))；静脉内免疫球蛋白(γ球蛋白)；淋巴细胞耗竭疗法(lymphocyte-depleting therapy)(例如米托蒽醌、环磷酰胺、

抗体、抗CD4、克拉屈滨(cladribine)、全身辐照、骨髓移植、整联蛋白(integrin)拮抗剂或抗体(例如LFA-1抗体例如购自Genentech的依法珠单抗(efalizumab)/或α4整联蛋白抗体例如购自Biogen Idec的那他珠单抗(natalizumab)/

或上述其它药剂)；类固醇，例如皮质类固醇(例如甲泼尼龙(methylprednisolone)(例如注射用琥钠甲泼尼龙

***(prednisone)(例如低剂量***)、***(dexamethasone)或糖皮质激素(例如经由关节注射，包括全身皮质类固醇疗法))；非淋巴细胞耗竭免疫抑制疗法(例如MMF或环孢霉素(cyclosporine))；“他汀(statin)”类降胆固醇药物(包括西立伐他汀(cerivastatin)氟伐他汀(fluvastatin)

阿托伐他汀(atorvastatin)洛伐他汀(lovastatin)

普伐他丁(pravastatin)

和辛伐他汀(simvastatin)

)；***、睾酮(任选地以高剂量；Stuve等Neurology 8：290-301(2002))；雄激素；激素替代疗法；TNF抑制剂，例如针对TNF-α的抗体；改善病情的抗风湿药(DMARD)；非类固醇抗炎药(NSAID)；血浆去除术或血浆交换法；甲氧苄啶-磺胺甲噁唑复方(trimethoprim-sulfamethoxazole)

麦考酚酸酯((mycophenolate mofetil)；H2-阻滞剂或质子泵抑制剂(在使用潜在引起溃疡的免疫抑制疗法期间使用)；左甲状腺素(levothyroxine)、环孢霉素A(例如

生长抑素(somatastatin)类似物；细胞因子；抗代谢物；免疫抑制剂；康复外科；放射性碘；甲状腺切除术；BAFF拮抗剂，例如BAFF或BR3抗体或免疫粘附素(adhesin)；抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)；抗IL-6受体拮抗剂/抗体；B-细胞表面拮抗剂或抗体例如人源化抗体或人CD20抗体；IL-17和/或IL-23抗体等等。还包括使用双膦酸盐(例如阿仑膦酸盐(alendronate)、伊班膦酸盐(Ibandronate)、利塞膦酸盐(risedronate)、含碳酸钙的利塞膦酸盐、唑来膦酸(zoledronic acid))和组织蛋白酶K抑制剂的组合疗法。

有效量的治疗剂将减轻症状的往往至少10％、通常至少20％、优选至少30％、更优选至少40％和最优选至少50％。

可通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存的治疗剂制剂，所述制剂呈例如冻干粉、浆液、水溶液或混悬液形式，参见例如Hardman等(2001)Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗剂药理学基础)，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(雷明顿：药物科学与实践)，Lippincott，Williams和Wilkins，New York，NY；Avis等(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications(药物剂型：胃肠外药物)，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets(药物剂型：片剂)，MarcelDekker，NY；Lieberman等(编辑)(1990)Pharmaceutical DosageForms：Disperse Systems(药物剂型：分散***)，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety(赋形剂的毒性与安全性)，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY。

由临床医生例如用本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来确定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何负面副作用达到所需要的或最佳的作用效果。重要的诊断量度包括例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平的诊断量度。优选将被使用的生物学药品源自与治疗所靶向的动物相同的物种，藉此使对试剂的体液应答最小化。

用于特定患者的有效量可视以下因素而变化：例如待治疗的病症、患者的总体健康状况、给药方法途径和给药剂量和副作用的严重程度。当组合时，有效量为各组分组合的比例，效果不限于单用单独的组分。可利用治疗和诊断方法指南(Maynard等(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice(良好临床实践SOP手册)，Interpharm Press，Boca Raton，FL；Dent(2001)GoodLaboratory and Good Clinical Practice(良好实验室实践和良好临床实践)，Urch Publ.，London，UK)。

本发明还提供：包含细胞和分隔室(compartment)的药盒，包含细胞和试剂的药盒；包含细胞和使用或处理说明的药盒；以及包含细胞、分隔室和试剂的药盒。

药物组合物

可优选为治疗目的将本发明抗体分子、可溶性MDL-1蛋白或MDL-1融合蛋白(优选包含在药物组合物中)给予受治疗者。优选药物组合物包含可药用载体。可治疗性使用抗体分子(例如包含在药物组合物中)以靶向MDL-1受体，并藉此治疗任何由该受体引起或介导的医学病症。可治疗性使用可溶性MDL-1蛋白(例如包含在药物组合物中)以靶向MDL-1受体配体，并藉此治疗任何由该受体引起或介导的医学病症。

可药用载体为常规载体，在本领域众所周知。实例包括生理上可相容的水性和非水性载体、稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、包衣剂、抗微生物剂、缓冲剂、血清蛋白、渗透剂和延迟吸收剂等等。优选载体为适于注射到受治疗者体内的载体。通常，用于胃肠外给予所述药物的组合物众所周知；例如Remington′sPharmaceutical Science(雷明顿药物科学)，第17版(MackPublishing Company，Easton，PA，1990)。

可在本发明药物组合物中采用的合适的水性及非水性载体实例包括：水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料例如卵磷脂，通过维持分散剂情况下所需粒径和通过使用表面活性剂，可维持合适的流动性。

可与第二种药物组合物或物质联合给予本发明药物组合物。当使用联合疗法时，可两种组合物调配为单一组合物用于同时递送，或单独调配为两种或更多种组合物(例如药盒)。

止痛剂可包括：阿司匹林(aspirin)、乙酞氨基酚(acetominophen)、可待因(codein)、***(morphine)、阿扑***(aponorphine)、去甲***(normorphine)、羟戊甲***(etorphine)、丁丙诺啡(buprenorphine)、氢可酮(hydrocodone)、消旋啡烷(racemorphan)、左啡诺(levorphanol)、布托啡诺(butorphand)、***(methadone)、德美罗(demerol)、布洛芬(ibuprofen)或羟考酮(oxycodone)。

本发明药物组合物还可包含其它类型的物质，包括小有机分子和抑制性配体类似物，可用本文所述测定来鉴定它们。

制剂可合宜地以单位剂型来提供，并且可通过制药领域众所周知的任何方法来制备。参见例如Gilman等(编辑)(1990)，_ThePharmacological Bases of Therapeutics(治疗剂的药理学基础)，第8版，Pergamon Press；和Remington′s Pharmaceutical Science(雷明顿药物科学)，见上述，Easton，Penn.；Avis等(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications(药物剂型：胃肠外药物)，Marcel Dekker，New York；Lieberman等(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets(药物剂型：片剂)Dekker，New York；和Lieberman等(编辑)(1990)Pharmaceutical DosageForms Disperse Systems(药物剂型：分散***)，Dekker，NewYork。

本文另外的配制方法和递送方法涉及例如WO 2004/078140中所述制剂和方法，包括ENHANZE^TM药物递送技术(HalozymeInc.)。该技术基于重组人透明质酸酶(rHuPH20)。rHuPH20是被FDA批准的天然存在的人酶的重组形式，它可暂时性使诸如皮肤等组织基质空间清澈。也就是说，该酶具有降解透明质酸(HA)的能力，透明质酸是填充空间的“胶”状物质，是全身组织的主要组分。预期这种透明活性使得rHuPH20可通过增加治疗分子经由皮下空间的进入来改进药物递送和治疗剂的生物利用度。因此，当与某些注射药物组合或共同调配时，该技术可起“分子弯刀(molecular machete)”的作用，以通过暂时性打开皮肤下的流动通道来促进这些药物的渗透与分散。达200纳米的分子可自由通过被穿孔的胞外基质，在大约24小时内所述基质回复正常密度，这使得药物递送平台不会永久性地改变皮肤构造。

因此，本发明包括将本文MDL-1抗体或可溶性MDL-1蛋白递送到含有过量糖胺聚糖的组织的方法，所述方法包括将透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)(该蛋白包含中性有活性的可溶性透明质酸酶多肽和至少一个N-连接糖部分，其中N-连接糖部分共价连接多肽的天冬酰胺残基)给予组织，给药量足以充分降解糖胺聚糖以打开小于约500纳米直径的通道，并将抗体或可溶性蛋白给予包含降解的糖胺聚糖的组织。

在另一个实施方案中，本发明包括增加被给予受治疗者的本文抗体或可溶性蛋白扩散的方法，所述方法包括以足以打开或形成小于抗体直径的通道的量给予受治疗者sHASEGP多肽，并给予所述抗体，藉此增加治疗物质的扩散。可分开或同时在一个制剂中并以某种次序连续或在同一时间给予sHASEGP和抗体。

可由医师考虑可改变治疗物质作用的各种因素来确定在治疗应用中所涉及的剂量方案，这些因素例如患者的病症、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、给药时间和其它临床因素。

通常从低水平慢慢向上增加治疗剂量以使安全性和有效性最佳。可调整剂量以补偿较小的分子大小和给药后可能降低的半衰期(清除时间)。

用于治疗性给予所述物质的典型方案在本领域众所周知。例如，可通过胃肠外途径(例如静脉内注射、肌内注射、皮下注射、瘤内注射或通过输注)或通过非胃肠外途径(例如口服给药、肺给药或局部给药)给予本发明药物组合物。

可用本领域已知的医学装置给予组合物。例如，在优选实施方案中，可通过用皮下注射针注射给予本发明药物组合物。

还可用无针皮下注射装置给予本发明药物组合物；例如在以下专利中公开的装置：美国专利第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号或第4,596,556号。

用于本发明的熟知的植入物和模块(modules)实例包括：美国专利第4,487,603号公开的用于以可控速率分送药物的可植入式微量输液泵；美国专利第4,447,233号公开的用于以精准输液速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号公开的用于连续递送药物的可变流量植入式输液装置；美国专利第4,439,196号公开的具有多腔室的渗透性药物递送***。

反义分子

本发明还包括能够与编码本发明MDL-1肽的核酸(例如基因组DNA或mRNA)特异性杂交以防止所述核酸表达的反义寡核苷酸，优选所述肽具有由SEQ ID NO：2或4中任何一个所确定的氨基酸序列或其子序列。

本发明还提供药物组合物，所述药物组合物包含：(a)有效调节MDL-1受体活性的一定量的寡核苷酸，所述寡核苷酸通过通过穿过细胞膜，并在细胞中与编码本发明MDL-1肽的mRNA特异性结合以防止其翻译来实现所述调节；和(b)能够穿过细胞膜的可药用载体。在一个实施方案中，所述寡核苷酸与使mRNA失活的物质(例如核酶)偶联。

实施例

以下实施例对本发明进行了例述，不应该理解为限制本发明广泛范围。

I.通用方法

在以下文献中阐述或引用某些标准方法：例如Maniatis等(1982)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press；Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，(第二版)，第1-3卷，CSH Press，NY；Ausubel等，Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel等(1987及增刊)Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学实验方案)，Greene/Wiley，New York。蛋白纯化方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱色谱、电泳、离心、结晶等等方法。参见例如Ausubel等(1987和定期增刊)；Deutscher(1990)“Guideto Protein Purification(蛋白纯化指南)”，载于Meth.Enzymol.，第182卷和该丛书的其它卷；制造商关于使用蛋白纯化产品的文献，例如Pharmacia，Piscataway，N.J.或Bio-Rad，Richmond，CA。与重组技术联合使得可融合适当的区段，例如融合FLAG序列或可经由可被蛋白酶除掉的序列融合的等同物。参见例如Hochuli(1990)“Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent(使用金属螯合吸附剂重组蛋白的纯化)”，载于Setlow(编辑)Genetic Engineering，Principle and Methods(遗传工程原理和方法)12：87-98，Plenum Press，N.Y.；和Crowe等(1992)QIAexpress：The High Level Expression & Protein Purification System(QIAexpress：高水平表达和蛋白纯化***)，Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA。

例如用可用软件程序实施计算机序列分析，所述程序包括来自GCG(U.Wisconsin)和GenBank来源的程序。还可使用来自例如GenBank等的公共序列数据库。

II.拮抗剂和抗体

从用融合蛋白免疫接种的BALB/c小鼠制备抗小鼠MDL-1激动剂抗体(例如DX163，小鼠IgG1)，所述融合蛋白由与hIg的Fc结构域融合的人MDL-1基因的胞外结构域组成，其如前所述(参见例如Wright等(2003)J Immunol.171：3034-3046)。所述融合蛋白的胞外结构域含有C-型凝集素结构域，并对应于人MDL-1的26-187位氨基酸(GenBank登记号BC112099；SEQ ID NO：2)。

因为尚未确定MDL-1受体的配体，所以制备了能够结合内源性配体并抑制体内MDL-1活性的可溶性形式的MDL-1。该可溶性MDL-1拮抗剂由长形式的小鼠MDL-1的胞外(163个氨基酸)部分(GenBank登记号AA186015；SEQ ID NO：4)组成，所述胞外部分被连接到含有mIgG2a的Fc部分的pCMV1表达质粒中，所述Fc部分已经过突变(L到E；参见例如Duncan等(1988)Nature332：563-564)而具有低FcγRI结合特性。蛋白在293自由式细胞中表达。

III.细胞刺激

为了进行MDL-1激活，让悬浮在含10％胎牛血清的RPMI1640中的新鲜分离的嗜中性粒细胞(10⁷个细胞/ml)与抗MDL-1抗体(10μg/ml)或对照小鼠IgG1，在37℃和5％CO2于96孔板(Nunc，Denmark)中孵育1小时。用RPMI洗涤2次后，让与细胞结合的抗hMDL-1抗体与9μg/ml的F(ab’)₂片段山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体在37℃和5％CO₂中交联30分钟。然后洗涤细胞2次，用20μg/ml色谱纯(chrompure)的小鼠IgG抗体在4℃孵育20分钟，以封闭未交联的抗体。在某些实验中，测试了不同剂量的抗MDL-1抗体和m IgG1同种型对照(0.1ng/ml-20μg/ml)。在孵育MDL-1或mIgG1后，用0.2ng/mL LPS或培养基(medium)处理细胞22小时。

图1显示MDL-1的激活增加了LPS诱导的炎性介质的释放。

IV.胶原蛋白诱导的关节炎

在这些实验中，用100ug完全弗氏佐剂中的牛胶原蛋白在尾底免疫接种B10RIII小鼠。在第26天和第32天，经小鼠腹膜内注射50ug或500ug同种型对照抗体或DX163(大鼠抗小鼠MDL-1激动剂抗体)。然后监测小鼠，基于四点疾病记分量表(fourpoint disease score scale)对各个脚掌的关节炎进展记分。基于每只脚的脚掌肿胀情况进行临床记分。1分＝1个脚趾、2＝两个或更多个脚趾、3＝整个脚掌肿胀。每只小鼠的最高临床分数为12。

用MDL-1-Ig融合体治疗的小鼠与对照相比对两种CIA具有高度抗性，这与在抗MDL-1激动剂治疗的小鼠中观察到的疾病加重形成对照。图2显示给予MDL-1激动剂抗体、DX163时CIA的恶化。图3显示由MDL-1拮抗剂MDL-1-Ig融合蛋白对CAIA的抑制。

V.胶原蛋白抗体诱导的关节炎

将800ug的Chemicon的arthrogen CIA混合物静脉内给予B10RIII小鼠(每组n＝5)或MDL-1-/-KO小鼠，以在第0天诱导胶原蛋白抗体诱导的关节炎。随后给予小鼠单个0.5mg剂量的皮下注射的IgG1同种型对照抗体或DX163(大鼠抗小鼠MDL-1)。基于每只脚的脚掌肿胀情况进行临床记分。1分＝1个脚趾、2＝两个或多个脚趾、3＝整个脚掌肿胀。每只小鼠的最高临床分数为12。

在检查的所有参数中，用DX163治疗的小鼠分数提高。通过苏木精和曙红切片比较用IgG1同种型治疗的与用DX163治疗的首次用于实验的动物，结果显示在用DX163治疗的动物中嗜中性粒细胞侵润/侵入、骨质侵蚀和血管翳形成显著提高。图4显示在MDL-1KO小鼠中CAI分数较低。图5证实用DX163激动MDL-1活性可使自体免疫关节炎的进展恶化。

还将MDL-1Ig融合蛋白给予同一模型。将1000ug的Chemicon的arthrogen CIA混合物静脉内给予B10RIII小鼠(每组n＝5)，以在第0天诱导胶原蛋白抗体诱导的关节炎。在第0天和第2天给予小鼠0.5mg剂量皮下注射的IgG1同种型对照抗体、DX163(大鼠抗小鼠MDL-1)、Ig对照或MDL-1Ig融合蛋白。如上所述测量脚掌肿胀情况。图6显示用MDL-1-Ig融合蛋白对CAIA的抑制。

VI.组织病理学评估

取出脚掌，固定，在Cal-EX II(Fisher Scientific)中脱钙7天，包埋在石蜡中。随后制备脚掌切片，用苏木精和曙红染色，通过光学显微镜检查。作为盲试，对滑液、骨和软骨组织进行组织学分析。进行白细胞侵润记分，更具体地，检查滑膜和关节腔内侵润的PMN的百分比。评价血管翳形成和细胞募集情况。对骨和软骨组织进行软骨和皮质骨侵蚀破坏记分。严重程度评为0-4级。用双尾不配对t检验评估各组间的比较，且认为p值＜0.05为统计学显著。用统计学软件包GraphPad Prism 4(GraphPad Software，San Diego，CA)进行计算。

图7显示用GE探测CT扫描仪扫描的B10RIII小鼠的脚掌。比较首次用于实验的小鼠和用MDL-1Ig融合蛋白或DX163治疗的CAIA诱导的小鼠之间的关节。在实验的第12天采集骨样品。与Ig对照组的中度破坏比较，抗MDL-1激动剂治疗诱导相当大程度的皮质骨破坏。与此形成对比的是，用MDL-1-Ig融合体治疗的小鼠显示出比得上首次用于实验的小鼠的骨完整性和骨密度，证实了对MDL-1信号转导的阻断阻止了骨再吸收。

VII.RT-PCR和Affymetrix微阵列分析

从脚掌提取RNA，如所述(Murphy，2002)制备互补DNA并用于进行RT-PCR和Affymetrix基因表达分析。对于RT-PCR，用GeneAmp 5700序列检测***(Sequcence Detection System)(Applied Biosystems)分析一系列基因的基因表达情况。用持家基因(泛素)来对分析标准化。对于Affymetrix分析，根据厂商使用说明，用一个循环靶标标记(one-cycle target labeling)和IVT标记(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)将DNA酶处理过的总RNA合成为生物素化的cRNA探针。让来自各样品的15μg生物素化的cRNA探针在鼠MOE430 2.0Affymetrix微阵列芯片上进行杂交。然后用Affymetrix GeneChip Fluidics 400station洗涤杂交过的芯片，按照厂商使用说明在Affymetrix GeneChip扫描仪3000(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)中进行扫描。扫描完成后，立即在基因芯片操作***(GeneChip Operating System)中对每一Affymetrix芯片进行cRNA探针合成质量和杂交有效性分析。然后用MAS 5对芯片数据进行标准化。

为了研究由MDL-1激活来调节的免疫途径，由定量RT-PCR测定评估促炎性细胞因子、趋化因子、细胞贴壁分子、骨髓细胞标记物的表达情况。由Affymetrix分析评估破骨细胞基因(ATP6VOD2和组织蛋白酶K(Cathepsin K))。在诱导CAIA后第4天，与Ig对照相比，在用抗MDL-1激动剂治疗的小鼠的所有关节炎脚掌中，促炎基因例如IL-1β、IL-6和TNFα丰富地表达。更重要的是，与骨破坏有关的基因，例如RANKL、基质金属蛋白酶9(MMP9)和TRAP，在经过抗MDL-1激动剂治疗后的脚掌中都上调，而在MDL-1-Ig融合体治疗中都下调(参见图8)。基因表达结果连同组织病理学发现提示，MDL-1在募集和激活炎性巨噬细胞和嗜中性粒细胞中起作用，其介导滑液组织损伤。另外，破骨细胞特异性基因的诱导和X射线微CT研究结果提示，MDL-1-DAP12途径还可能在骨代谢中起作用。

将表达结果转移到Spotfire DecisionSite(Spotfire，Somerville，MA)用于数据过滤和图表分析。如果探针组的信号强度小于20并在所有样品中检测呼叫(detection call)为“A”(不存在)，则将其淘汰。用倍数变化作为信号比率产生样品的比较列表。这些列表用于在Ingenuity System(Ingenuity System，Inc.，Redwood City，CA)中进行进一步的途径分析。

VIII.体外破骨细胞培养物

在含50ng/mL重组MSCF(R&D)的α-mem培养基(Gibco)中培养源自12周龄C57BL/6或B10RIII小鼠的骨髓细胞2天。然后将松散地贴壁的细胞以4-8x10E5/mL铺种在含或不含牛骨小块(Nordic Biosciences，NY)的组织培养板中。用一定剂量范围的RANK-L(0-100ng/mL)和MDL-1激动剂或对照抗体(0-50ug/mL)处理细胞。通过Luminex(Linco Inc.)、细胞培养物的RT-PCR分析、TRAP染色(碱性磷酸酶染色试剂盒，Sigma)和细胞核提取ELISA测定(TransAM NFATc1转录因子测定试剂盒，ActiveMotif)，来评估关于破骨细胞形成动力学及细胞培养物细胞因子谱(profile)的条件。

MCSF培养的骨髓细胞的TRAP染色表明RANK-L和MDL-1激动剂抗体治疗增加破骨细胞形成并提高骨再吸收。图9显示用RANK-L联合抗MDL-1激动剂抗体的治疗增加了破骨细胞“首要转录调节子”NFATc1的表达，NFATc1·调控DC STAMP、ATP6VOD2(细胞融合所需)、组织蛋白酶K、MMP9、ATP6I、CIC7(骨再吸收所需)的下游转录。

IX.统计学分析

用双尾不配对t检验评估各组间的比较。认为p值＜0.05为统计学显著。用统计学软件包GraphPad Prism 4(GraphPad Software，San Diego，CA)进行计算。

序列表

<110>先灵公司

M.E.比格勒

D.J.歘

B.乔伊斯-谢克

J.H.菲利普斯

 

<120>MDL-1应用

 

<130>BP06654

 

<150>60/947,314

<151>2007-06-29

 

<160>4

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>996

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>1

ggcttagcgt ggtcgcggcc gaggtggcaa aaggagcata ttctcaggag acggggcccc     60

tgcctgccac accaagcatt aggccaccag gaagaccccc atctgcaagc aagcctagcc    120

ttccagggag aaagaggcct ctgcagctcc ttcatcatga actggcacat gatcatctct    180

gggcttattg tggtagtgct taaagttgtt ggaatgacct tatttctact ttatttccca    240

cagattttta acaaaagtaa cgatggtttc accaccacca ggagctatgg aacagtctca    300

cagatttttg ggagcagttc cccaagtccc aacggcttca ttaccacaag gagctatgga    360

acagtctgcc ccaaagactg ggaattttat caagcaagat gttttttctt atccacttct    420

gaatcatctt ggaatgaaag cagggacttt tgcaaaggaa aaggatccac attggcaatt    480

gtcaacacgc cagagaaact gtttcttcag gacataactg atgctgagaa gtattttatt    540

ggcttaattt accatcgtga agagaaaagg tggcgttgga tcaacaactc tgtgttcaat    600

ggcaatgtta ccaatcagaa tcagaatttc aactgtgcga ccattggcct aacaaagacc    660

tttgatgctg catcatgtga catcagctac cgcaggatct gtgagaagaa tgccaaatga    720

tcacagttcc ctgtgacaag aactatactt gcaactcttt ttgaatccat aacaggtcgt    780

actggccaat gattactttt acttacctat ctgtactacc agtagcggtc cttgcccatt    840

tgggaaactg agcttctttc ttctgcactg ggggactgga tgctagccat ctccaggaga    900

caggatcagt tttacggaaa caactcagtt agtatagaga tgaggtccgc ttctgtagta    960

ccttccttca aataaagaaa tttggtacct gcccgg                              996

 

<210>2

<211>188

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>结构域

<222>(26)..(188)

<223>胞外域

 

<400>2

 

Met Asn Trp His Met Ile Ile Ser Gly Leu Ile Val Val Val Leu Lys

1               5                   10                  15

Val Val Gly Met Thr Leu Phe Leu Leu Tyr Phe Pro Gln Ile Phe Asn

            20                  25                  30

Lys Ser Asn Asp Gly Phe Thr Thr Thr Arg Ser Tyr Gly Thr Val Ser

        35                  40                  45

Gln Ile Phe Gly Ser Ser Ser Pro Ser Pro Asn Gly Phe Ile Thr Thr

    50                  55                  60

Arg Ser Tyr Gly Thr Val Cys Pro Lys Asp Trp Glu Phe Tyr Gln Ala

65                  70                  75                  80

Arg Cys Phe Phe Leu Ser Thr Ser Glu Ser Ser Trp Asn Glu Ser Arg

                85                  90                  95

Asp Phe Cys Lys Gly Lys Gly Ser Thr Leu Ala Ile Val Asn Thr Pro

            100                 105                 110

Glu Lys Leu Lys Phe Leu Gln Asp Ile Thr Asp Ala Glu Lys Tyr Phe

        115                 120                 125

Ile Gly Leu Ile Tyr His Arg Glu Glu Lys Arg Trp Arg Trp Ile Asn

    130                 135                 140

Asn Ser Val Phe Asn Gly Asn Val Thr Asn Gln Asn Gln Asn Phe Asn

145                 150                 155                 160

Cys Ala Thr Ile Gly Leu Thr Lys Thr Phe Asp Ala Ala Ser Cys Asp

                165                 170                 175

Ile Ser Tyr Arg Arg Ile Cys Glu Lys Asn Ala Lys

            180                 185

 

<210>3

<211>896

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

 

<400>3

aggacattac cgagcaggag catacatttc cagagcaagg agccctgctc gctgcaccga     60

atatcttatc aaaaagactc ctatctgtat gccaacccag acttcccaga agagatcaga    120

tccctgatcc cccatcatca tgaactggca catgatcatc tcggggctta tcgtagtagt    180

gatcaaagtt gttggaatga ccttttttct gctgtatttc ccacaggttt ttggcaaaag    240

taatgatggc ttcgtcccca cggagagcta cggaaccact agtgtgcaga atgtctcaca    300

gatctttggg agaaatgacg aaagtaccat gcctacaagg agctatggaa cagtctgtcc    360

cagaaactgg gattttcacc aaggaaaatg ctttttcttc tccttctccg aatcaccttg    420

gaaagacagc atggattatt gtgcaacaca aggatccaca ctggcaattg tcaacactcc    480

agagaaactg aagtatcttc aggacatagc tggtattgag aattacttta ttggtttggt    540

acgtcagcct ggagagaaaa agtggcgctg gatcaacaac tctgtgttca atggcaatgt    600

taccaatcag gaccagaact tcgactgtgt cactataggt ctgacgaaga catatgatgc    660

tgcatcatgt gaagtcagct atcgctggat ctgcgaaatg aatgccaaat gatcatagat    720

ctctacaaga gtgaattttt acagagctag caaaggagat tagttgtgac tgaaaccagc    780

ccaggaaaat atagagcatc aaagactgtg cccatcttca taggtgggag ttccctattg    840

aatcctcaaa gtcaattttg ttactccaca aacatcttac catagtaaaa ctccct        896

 

<210>4

<211>190

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

 

<220>

<221>结构域

<222>(26)..(190)

<223>胞外域

 

<400>4

 

Met Asn Trp His Met Ile Ile Ser Gly Leu Ile Val Val Val Ile Lys

1               5                   10                  15

Val Val Gly Met Thr Phe Phe Leu Leu Tyr Phe Pro Gln Val Phe Gly

            20                  25                  30

Lys Ser Asn Asp Gly Phe Val Pro Thr Glu Ser Tyr Gly Thr Thr Ser

        35                  40                  45

Val Gln Asn Val Ser Gln Ile Phe Gly Arg Asn Asp Glu Ser Thr Met

    50                  55                  60

Pro Thr Arg Ser Tyr Gly Thr Val Cys Pro Arg Asn Trp Asp Phe His

65                  70                  75                  80

Gln Gly Lys Cys Phe Phe Phe Ser Phe Ser Glu Ser Pro Trp Lys Asp

                85                  90                  95

Ser Met Asp Tyr Cys Ala Thr Gln Gly Ser Thr Leu Ala Ile Val Asn

            100                 105                 110

Thr Pro Glu Lys Leu Lys Tyr Leu Gln Asp Ile Ala Gly Ile Glu Asn

        115                 120                 125

Tyr Phe Ile Gly Leu Val Arg Gln Pro Gly Glu Lys Lys Trp Arg Trp

    130                 135                 140

Ile Asn Asn Ser Val Phe Asn Gly Asn Val Thr Asn Gln Asp Gln Asn

145                 150                 155                 160

Phe Asp Cys Val Thr Ile Gly Leu Thr Lys Thr Tyr Asp Ala Ala Ser

                165                 170                 175

Cys Glu Val Ser Tyr Arg Trp Ile Cys Glu Met Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Claims (18)

1.调节受治疗者中的骨再吸收的方法，所述方法包括给予所述受治疗者有效量的特异性结合MDL-1的抗体或其抗体片段(SEQ IDNO：2或4)。

2.权利要求1的方法，其中所述抗体为人源化抗体。

3.权利要求1的方法，其中所述抗体为全人抗体。

4.权利要求1的方法，其中所述抗体为嵌合抗体。

5.权利要求1的方法，其中所述抗体片段为Fab、Fab2或Fv抗体片段。

6.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗体片段与另一化学部分缀合。

7.权利要求6的方法，其中所述化学部分为聚乙二醇(PEG)。

8.权利要求1的方法，其中所述抗体抑制骨再吸收。

9.权利要求8的方法，其中骨再吸收由炎症引起。

10.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗体片段抑制破骨细胞形成或激活。

11.调节受治疗者中的骨再吸收的方法，所述方法包括给予所述受治疗者有效量的可溶性MDL-1蛋白(SEQ ID NO：2或4)。

12.权利要求11的方法，其中所述可溶性MDL-1蛋白与化学部分缀合。

13.权利要求12的方法，其中所述化学部分为PEG。

14.权利要求11的方法，其中所述可溶性MDL-1蛋白与异源蛋白融合。

15.权利要求14的方法，其中所述异源蛋白包含抗体分子的Fc部分。

16.权利要求10的方法，其中所述可溶性MDL-1蛋白抑制骨再吸收。

17.权利要求15的方法，其中所述骨再吸收由炎症引起。

18.权利要求11的方法，其中所述可溶性MDL-1蛋白抑制破骨细胞形成或激活。

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