DE69830901T2

DE69830901T2 - ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen

Info

Publication number: DE69830901T2
Application number: DE69830901T
Authority: DE
Inventors: Robert Arathoon; J. Paul Carter; M. Anne MERCHANT; G. Leonard PRESTA
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-05-02
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: CA2288600C; ATE299938T1; JP4324231B2; US8642745B2; US20070178552A1; DE69830901D1; ES2246069T3; US20140322756A1; AU751659B2; IL132560A0; EP0979281B1; WO1998050431A3; AU7270998A; JP2001523971A; WO1998050431A2; US9409989B2; DK0979281T3; JP4213224B2; CA2288600A1; EP0979281A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von multispezifischen Antikörpern, die heteromultimere Schwerketten-Komponenten und gemeinsame Leichtketten-Komponenten aufweisen, wie z.B. bispezifische Antikörper, bispezifische Immunadhäsine, sowie Antikörper-Immunadhäsin-Chimären und die unter Verwendung des Verfahrens hergestellten heteromultimeren Polypeptide.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper (bsAk), die Bindespezifitäten für zumindest zwei unterschiedliche Antigene aufweisen, haben in zahlreichen klinischen Anwendungen als Targeting-Mittel für In-vitro- und In-vivo-Immundiagnose und -therapie sowie für diagnostische Immuntests großes Potential.
Im diagnostischen Bereich sind bispezifische Antikörper von großem Nutzen zur Sondierung der funktionellen Eigenschaften von Zelloberflächenmolekülen und zur Definition der Fähigkeit unterschiedlicher Fc-Rezeptoren, Zytotoxizität zu vermitteln (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 101–124 (1992)). Nolan et al., Biochem. Biophys. Acta 1040, 1–11 (1990), beschreiben andere diagnostische Anwendungsmöglichkeiten für bsAk. Genauer gesagt können bsAk so konstruiert werden, dass sie Enzyme zur Verwendung in Enzymimmuntests immobilisieren. Um dies zu erreichen, kann ein Arm der bsAk so aufgebaut werden, dass er an ein spezifisches Epitop auf dem Enzym bindet, sodass die Bindung keine Enzymhemmung verursacht, wobei der andere Arm der bsAk an die immobilisierende Matrix bindet, um eine hohe Enzymdichte an der gewünschten Stelle sicherzustellen. Beispiele für solche diagnostischen bsAk umfassen den Kaninchen-Anti-IgG/Antiferritin-bsAk, der von Hammerling et al., J. Exp. Med. 128, 1461–1473 (1968), beschrieben wurde und zur Lokalisation von Oberflächenantigenen verwendet wurde. BsAk mit Bindespezifitäten für Meerrettichperoxidase (HRP) sowie ein Hormon wurden ebenfalls entwickelt. Eine weitere mögliche immunchemische Anwendung für bsAk betrifft ihre Verwendung in Zweistellen-Immuntests. Beispielsweise werden zwei bsAk hergestellt, die zwei verschiedene Epitope an das Analytprotein binden – ein bsAk bindet den Komplex an eine unlösliche Matrix, der andere bindet ein Indikatorenzym (siehe Nolan et al., w.o.).
Bispezifische Antikörper können auch für In-vitro- oder In-vivo-Immundiagnosen von verschiedenen Krankheiten, wie z.B. Krebs, verwendet werden (Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79, 315 (1990)). Um diese diagnostische Verwendung von bsAk zu vereinfachen, kann ein Arm des bsAk ein tumorassoziiertes Antigen binden, und der andere Arm kann einen detektierbaren Marker, wie z.B. einen Chelatbildner, binden, der eng an ein Radionuklid bindet. Unter Verwendung dieses Ansatzes stellten Le Doussal et al. bsAk her, die zur Radioimmundetektion von kolorektalen und Schilddrüsenkarzinomen geeignet waren, wobei ein Arm ein carcinoembryogenes Antigen (CEA) und der andere Arm Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA) bindet. Siehe Le Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl. 7, 58–62 (1992), und Le Doussal et al., J. Nucl. Med. 34, 1662–1671 (1993). Stickney et al. beschreiben eine ähnliche Strategie zur Detektion von kolorektalem Krebs, der CEA exprimiert, unter Verwendung von Radioimmundetektion. Diese Forscher beschreiben einen bsAk, der CEA sowie Hydroxyethylthioharnstoffbenzyl-EDTA (EOTUBE) bindet. Siehe Stickney et al., Cancer Res. 51, 6650–6655 (1991).
Bispezifische Antikörper können auch in der Humantherapie von umgeleiteter Zytotoxizität eingesetzt werden, indem ein Arm bereitgestellt wird, der ein Target (z.B. ein Pathogen oder eine Tumorzelle) bindet, und ein weiterer Arm, der ein zytotoxisches Auslösermolekül, wie z.B. den T-Zellen-Rezeptor oder den Fcγ-Rezeptor, bindet. Demgemäß können bispezifische Antikörper verwendet werden, um die zellulären Immunabwehrmechanismen eines Patienten spezifisch auf die Tumorzelle oder das infektiöse Agens zu richten. Unter Verwendung dieser Strategie wurde gezeigt, dass bispezifische Antikörper, die an FcγRIII (d.h. CD16) binden, Tumorzellabtötung durch natürliche Killer- (NK-) Zellen/große granuläre Lymphozyten- (LGL-) Zellen in vitro vermitteln können und effektiv zur Verhinderung von Tumorwachstum in vivo einge setzt werden können. Segal et al., Chem. Immunol. 47, 179 (1989), und Segal et al. Biologic Therapy of Cancer 2(4), S. 1, DeVita et al., Hrsg., J.B. Lippincott, Philadelphia, USA (1992). Auf ähnliche Weise wurde ein bispezifischer Antikörper mit einem Arm, der FcγRIII bindet, und einem weiteren Arm, der an den HER2-Rezeptor bindet, zur Therapie von Eierstock- und Brusttumoren entwickelt, die das HER2-Antigen überexprimieren (Hseih-Ma et al., Cancer Research 52, 6832–6839 (1992), und Weiner et al., Cancer Research 53, 94–100 (1993)). Bispezifische Antikörper können auch Tötung durch T-Zellen vermitteln. Normalerweise binden die bispezifischen Antikörper den CD3-Komplex auf T-Zellen an ein tumorassoziiertes Antigen. Ein vollständig humanisierter F(ab')₂-bsAk, bestehend aus an Anti-p185^HER2 gebundenem Anti-CD3, wurde verwendet, um auf T-Zellen zu zielen, um Tumorzellen abzutöten, welche den HER2-Rezeptor überexprimieren. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175(1), 217 (1992). Bispezifische Antikörper wurden in mehreren frühen klinischen Tests mit ermutigenden Ergebnissen getestet. In einem Test wurden 12 Patienten mit Lungen, Eierstock- oder Brustkrebs mit Infusionen von aktivierten T-Lymphozyten behandelt, auf die mit einem bispezifischen Anti-CD3-/Antitumor- (MOC31-) Antikörper gezielt wurde. DeLeij et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, S. 249, Romet-Lemonne, Fanger und Segal, Hrsg., Lienhart (1991). Die gerichteten Zellen induzierten eine bedeutende lokale Lyse von Tumorzellen, eine schwache Entzündungsreaktion, aber keine toxischen Nebenwirkungen oder Anti-Maus-Antikörper-Reaktionen. In einer sehr frühen Studie eines bispezifischen Anti-CD3/Anti-CD19-Antikörpers in einem Patienten mit B-Zellen-Malignität wurde außerdem eine signifikante Verringerung der Anzahl an peripheren Tumorzellen-Counts erreicht. Clark et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, S. 243, Romet-Lemonne, Fanger und Segal, Hrsg., Lienhart (1991). Siehe auch Kroesen et al., Cancer Immunol. Immunother. 37, 400–407 (1993), Kroesen et al., Br. J. Cancer 70, 652–661 (1994), und Weiner et al., J. Immunol. 152, 2385 (1994), zu therapeutischen Anwendungen von bsAk.
Bispezifische Antikörper können auch als fibrinolytische Mittel oder Vakzineadjuvantien verwendet werden. Außerdem können diese Antikörper bei der Behandlung von infektiösen Krankheiten (z.B. zum Targeting von Effektorzellen auf viral infizierte Zel len wie beispielsweise HIV oder Influenzavirus oder Protozoen, wie z.B. Toxoplasma gondii), zur Verabreichung von Immuntoxinen an Tumorzellen oder zur Ausrichtung von Immunkomplexen auf Zelloberflächenrezeptoren verwendet werden (siehe Fanger et al., w.o.).
Der Einsatz von bsAk wurde jedoch durch das Problem, dass bsAk nicht leicht in ausreichender Menge und Reinheit erhalten werden konnten, verhindert. Traditionellerweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung der Hybrid-Hybridomtechnik hergestellt (Millstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der zufälligen Sortierung der leichten und schweren Immunglobulinketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch aus 10 unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist (siehe 1A). Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch affinitätschromatographische Schritte erfolgt, ist sehr aufwendig, und die Produktausbeute ist gering. Siehe beispielsweise W. Smith et al., Hybridoma 4, 87–98 (1992), und Y.S. Massimo et al., J. Immunol. Methods 201, 57–66 (1997). Folglich wurden Verfahren zur Herstellung größerer Ausbeuten von bsAk entwickelt. Um eine chemische Kupplung von Antikörperfragmenten zu erreichen, entwickelten Brennan et al., Science 229, 81 (1985), ein Verfahren, bei dem intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu erhalten. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiolkomplexbildners Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und eine intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann in Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivate übergeführt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin wieder in das Fab'-Thiol übergeführt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um die bsAk zu bilden. Die produzierten bsAk könne als Mittel zur selektiven Immobilisation von Enzymen verwendet werden.
Neuere Fortschritte haben die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli vereinfacht, die chemisch gekuppelt werden können, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Herstellung eines vollkommen humanisierten bsAk-F(ab')₂-Moleküls mit einem Arm, der p185^HER2 bindet, und einem zweiten Arm, der CD3 bindet. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und in vitro einer direkten chemischen Kupplung unterzogen, um die bsAk zu bilden. Die so gebildeten bsAk waren zur Bindung an Zellen, die den HER2-Rezeptor überexprimierten, und an normale menschliche T-Zellen fähig und konnten die lytische Aktivität von menschlichen zytotoxischen Lymphozyten gegen menschliche Brusttumorziele auslösen. Siehe auch Rodrigues et al., Int. J. Cancers (Suppl.) 7, 45–50 (1992).
Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolierung von bsAk-Fragmenten direkt aus rekombinanten Zellkulturen wurden ebenfalls beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische F(ab')₂-Heterodimere unter Verwendung von Leucin-Zippern hergestellt (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992)). Die Leucin-Zipper-Peptide von den Fos- und Jun-Proteinen wurden durch Genfusion an die Fab'-Abschnitte von Anti-CD3- und Anti-Interleukin-2-Rezeptor- (IL-2R-) Antikörpern gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurde an der Gelenk-Region reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere herzustellen. Die bsAk erwiesen sich als äußerst effektiv bei der Rekrutierung von zytotoxischen T-Zellen zur Lyse von HuT-102-Zellen in vitro. Das Auftreten der "Diabody"-Technolgie, die von Hollinger et al., PNAS (USA) 90, 6444–6448 (1993), beschrieben wurde, stellte einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von bsAk-Fragmenten bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), die über einen Linker, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen zwei Domänen auf derselben Kette zu ermöglichen, an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) gebunden ist. Demgemäß sind die V_H- und V_L-Domäne eines Fragments dazu gezwungen, mit den komplementären V_H- und V_L-Domänen eines anderen Fragments Paare zu bilden, wodurch zwei antigenbindende Stellen gebildet werden. Eine weitere Strategie zur Herstellung von bsAk-Fragmenten unter Verwendung von Einketten-Fv- (sFv-) Dimeren wurde ebenfalls beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994). Diese Forscher entwarfen einen Antikörper, der die V_H- und V_L-Domäne eines gegen den T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörpers und einen 25 Aminosäuren umfassenden Linker an die V_H- und V_L-Domäne eines Antifluoresceinantikörpers umfasste. Das rückgefaltete Molekül band an Fluorescein und den T-Zell-Rezeptor und leitete die Lyse von menschlichen Tumorzellen um, die Fluorescein kovalent an ihre Oberfläche gebunden hatten.
Wie oben ersichtlich wurden verschiedene Strategien zur Herstellung von bispezifischen Antikörperfragmenten beschrieben, die direkt aus einer rekombinanten Zellkultur gewonnen werden können. BsAk voller Länge sind bsAk-Fragmenten aber in klinischen Anwendungen aufgrund ihrer längeren Serumhalbwertszeit und möglicher Effektorfunktionen eventuell vorzuziehen.
Immunadhäsine
Immunadhäsine (Ia) sind antikörperähnliche Moleküle, welche die Bindungsdomäne eines Proteins, wie z.B. einen Zelloberflächenrezeptor oder einen Liganden (ein "Adhäsin") mit den Effektorfunktionen einer konstanten Immunglobulin-Domäne kombinieren. Immunadhäsine können viele der wertvollen chemischen und biologischen Eigenschaften von menschlichen Antikörpern aufweisen. Da Immunadhäsine aus einer menschlichen Proteinsequenz mit einer gewünschten Spezifität, gebunden an einen geeigneten menschlichen Immunglobulin-Gelenk-Sequenz und die Sequenz einer konstanten Domäne (Fc), hergestellt werden können, kann die Bindespezifität von Interesse unter Verwendung von vollkommen menschlichen Komponenten erreicht werden. Solche Immunadhäsine sind für den Patienten minimal immunogen und auch bei chronischer oder wiederholter Anwendung sicher.
Immunadhäsine, die in der Literatur beschrieben sind, umfassen Fusionen von T-Zell-Rezeptoren (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin oder homing-Rezeptoren (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptoren (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); Inteferon-γ-Rezeptoren (Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267, 9354–9360 (1992)); 4-1BB (Chalupny et al., PNAS (USA) 89, 10360–10364 (1992)) und IgE-Rezeptoren α (Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol., Bd. 115, Abstract Nr. 1448 (1991)).
Beispiele für Immunadhäsine, die in Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen beschrieben wurden, umfassen das CD4-IgG-Immunadhäsin, um die Bindung von HIV and Zelloberflächen-CD4 zu blockieren. Daten von klinischen Studien der Phase I, bei denen CD4-IgG kurz vor der Geburt an schwangere Frauen verabreicht wurde, lassen vermuten, dass dieses Immunadhäsin die Übertragung von HIV von der Mutter auf das Kind verhindern kann. Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 219–227 (1993). Ein Immunadhäsin, das den Tumornekrosefaktor (TNF) bindet, wurde ebenfalls entwickelt. TNF ist ein proinflammatorisches Zytokin, das erwiesenerweise ein Hauptvermittler von septischen Schocks ist. In einem Mäusemodell eines septischen Schocks erwies sich TNF-Rezeptor-Immunadhäsin als viel versprechender Kandidat für die klinische Verwendung bei der Behandlung von septischen Schocks (Ashkenazi et al., w.o.). Immunadhäsine haben aber auch nichttherapeutische Verwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise wurde das L-Selectin-Rezeptor-Immunadhäsin als Reagens zur histochemischen Färbung von peripheren hohen Lymphknoten-Endothelvenülen (HEV) verwendet. Dieses Reagens wurde außerdem eingesetzt, um den L-Selectin-Liganden zu isolieren und charakterisieren (Ashkenazi et al., w.o.). Wenn die beiden Arme der Immunadhäsin-Struktur unterschiedliche Spezifitäten aufweisen, wird das Immunadhäsin analog zu bispezifischen Antikörpern als "bispezifisches Immunadhäsin" bezeichnet. Dietsch et al., J. Immunol. Methods. 162, 123 (1993), beschrieben solch ein bispezifisches Immunadhäsin, das die extrazellulären Domänen der Adhäsionsmoleküle E-Selectin und P-Selectin kombiniert. Bindungsstudien zeigten, dass das so gebildete bispezifische Immunglobulin- Fusionsprotein eine bessere Bindungsfähigkeit an eine Knochenmarkszelle aufwies als die monospezifischen Immunadhäsine, von denen es abgeleitet war.
Antikörper-Immunadhäsin-Chimären
Antikörper-Immunadhäsin- (Ak/Ia-) Chimären wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben. Diese Moleküle kombinieren die Bindungsregion eines Immunadhäsins mit der Bindedomäne eines Antikörpers.
Berg et al., PNAS (USA) 88, 4723, 4727 (1991), stellten bispezifische Antikörper-Immunadhäsin-Chimären her, die von Mäuse-CD4-IgG abgeleitet waren. Diese Forscher konstruierten ein tetrameres Molekül mit zwei Armen. Ein Arm bestand aus CD4, das mit einer konstanten Antikörper-Schwerkettendomäne fusioniert war, und einer CD4-Fusion mit einer konstanten Antikörper-Leichtkettendomäne. Der andere Arm bestand aus einer kompletten Schwerkette eines Anti-CD3-Antikörpers und einer kompletten Leichtkette des gleichen Antikörpers. Aufgrund des CD4-IgG-Arms bindet dieses bispezifische Molekül an CD3 auf der Oberfläche von zytotoxischen T-Zellen. Die Nebeneinanderstellung der zytotoxischen Zellen und HIV-infizierten Zellen führt zu einer spezifischen Abtötung der Letzteren.
Obwohl Berg et al., w.o., ein bispezifisches Molekül beschreibt, das eine tetramere Struktur aufweist, war es möglich, ein trimeres Hybridmolekül herzustellen, das nur eine CD4-IgG-Fusion enthält. Siehe Chamow et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994). Der erste Arm dieses Konstrukts besteht aus einer humanisierten Anti-CD3-κ-Leichtkette und einer humanisierten Anti-CD3-γ-Schwerkette. Der zweite Arm ist ein CD4-IgG-Immunadhäsin, das einen Teil der extrazellulären Domäne von CD4, der für die gp120-Bindung verantwortlich ist, mit der Fc-Domäne von IgG kombiniert. Die resultierende Ak/Ia-Chimäre vermittelte die Abtötung von HIV-infizierten Zellen, wobei entweder reine zytotoxische T-Zell-Präparate oder ganze Fraktionen von Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL-Fraktionen) verwendet wurden, die außerdem Fc-Rezeptoren tragende, große granuläre Lymphozyten-Effektorzellen umfassten.
Bei der Herstellung der multispezifischen Antikörper-Heteromultimere ist es wünschenswert, die Ausbeute des gewünschten Heteromultimers höher zu machen als die des/der Homomultimer(e). Das derzeitige Verfahren der Wahl zur Herstellung von Fc-hältigen bsAk ist immer noch das Hybrid-Hybridomverfahren, bei dem zwei Antikörper gemeinsam exprimiert werden (Milstein und Cuello, Nature 305, 537–540 (1983)).
In Hybrid-Hybridomen bilden schwere (H-) Ketten typischerweise Homodimere sowie die gewünschten Heterodimere. Außerdem bilden leichte (L-) Ketten oft Fehlpaarungen mit nichtverwandten schweren Ketten. Somit kann die gemeinsame Expression von zwei Antikörpern bis zu zehn Paarungen aus schweren und leichten Ketten ergeben (M.R. Suresh et al., Methods Enzymol. 121, 210–228 (1986)). Diese ungewünschten Kettenpaarungen beeinträchtigen die Ausbeute der bsAk und stellen zwangsläufig hohe, manchmal unüberwindbare, Anforderungen an die Reinigung (Smith et al., w.o. (1992); und Massimo et al., w.o. (1997)).
Antikörper-Schwerketten wurden früher hergestellt, um die Heterodimerisation durch die Einführung von sterisch komplementären Mutationen in Multimerisationsdomänen an der C_H3-Domänen-Schnittstelle (Ridgway et al., Protein Eng. 9, 617–621 (1996)) und Optimierung durch Phagendisplay zu fördern, wie hierin beschrieben. Ketten, welche die modifizierten C_H3-Domänen enthalten, ergeben bis zu etwa 90 % Heterodimere, wie durch die Bildung eines Antikörper/Immunadhäsin-Hybrids (Ab/Ia) belegt wurde. Heterodimerisierte Schwerketten können immer noch Fehlpaarungen mit den nichtverwandten Leichtketten bilden, wodurch die Gewinnung der bsAk von Interesse beeinträchtigt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Anmeldung beschreibt eine Strategie, die zur Förderung der Bildung eines gewünschten heteromultimeren bispezifischen Antikörpers aus einem Monomer-Gemisch dient, indem eine Schnittstelle zwischen einem ersten und einem zweiten Polypeptid zur Heterooligomerisation geschaffen wird und indem eine gemeinsame variable Leichtkette bereitgestellt wird, die mit jeder der heteromeren variablen Schwerkettenregionen des bispezifischen Antikörpers wechselwirkt. Es gibt drei mögliche Hetero- und Homomultimere, die sich aus einem ersten und zweiten Polypeptid bilden können und jeweils mit einer ersten bzw. zweiten Leichtkette assoziiert sind. Das ermöglicht insgesamt zehn verschiedene Kettenpaarungen (1A). Ein Verfahren zur Förderung der Bildung des gewünschten Heteromultimers kann die Ausbeute im Vergleich zu ungewünschten Heteromultimeren und Homomultimeren stark erhöhen.
Die bevorzugte Schnittstelle zwischen einem ersten und einem zweiten Polypeptid des heteromultimeren Antikörpers umfasst zumindest einen Teil der C_H3-Domäne einer konstanten Antikörper-Domäne. Die Domäne des ersten und zweiten Polypeptids, die an der Schnittstelle wechselwirkt, wird als Multimerisations-Domäne bezeichnet. Vorzugsweise fördert die Multimerisations-Domäne die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen ersten Polypeptid und einem zweiten Polypeptid, wodurch die Ausbeute des gewünschten Heteromultimers erhöht wird (1B). Die Wechselwirkung kann an der Schnittstelle durch die Bildung von komplementären Protuberanz-in-Hohlraum-Regionen; die Bildung von nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindungen; einen Leucin-Zipper; hydrophobe Regionen; und hydrophile Regionen gefördert werden. "Protuberanzen" werden durch den Ersatz von kleinen Aminosäure-Seitenketten an der Schnittstelle des ersten Polypeptids durch größere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) hergestellt. Gegebenenfalls können "Kompensationshohlräume", die gleich groß oder ähnlich groß sind wie die Protuberanzen, an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids gebildet werden, indem große Aminosäure-Seitenketten durch kleinere ersetzt werden (z.B. Alanin oder Threonin). Ist an der Schnittstelle des ersten oder zweiten Polypeptids eine Protuberanz oder ein Hohlraum mit geeigneter Position und Größe vorhanden, muss nur ein entsprechender Hohlraum bzw. eine entsprechende Protuberanz an der benachbarten Schnittstelle gebildet werden. Nicht natürlich vorkommende Disulfidbindungen werden hergestellt, indem auf dem ersten Polypeptid eine natürlich vorkommende Aminosäure durch einen freies Thiol enthaltenden Rest, wie z.B. Cystein, ersetzt wird, sodass das freie Thiol mit einem anderen, freies Thiol enthaltenden Rest auf dem zweiten Polypeptid wechselwirkt, sodass eine Disulfidbindung zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid gebildet wird (siehe 1B).
Einketten-Fv-Fragmente aus einer großen, nichtimmunisierten Phasendisplay-Bibliothek (T.J. Vaughan et al., Nature Biotechnology 14, 309–314 (1996), in seiner Gesamtheit durch Verweis hierin aufgenommen) zeigte eine V-Gen-Verwendung auf, bei der V_H- und V_L-Sequenzen von bestimmten Keimbahn-V-Gen-Segmenten überwogen. Familien überwogen im Repertoire. Beispiele für Kettenpromiskuität wurden im Repertoire gefunden, bei denen eine bestimmte schwere oder leichte Kette in Kombination mit unterschiedlichen Partnerketten auftraten (T.J. Vaughan et al., w.o. (1996)).
Hierin ist offenbart, dass die Herstellung eines gewünschten heteromultimeren multispezifischen Antikörpers unterstützt wird, wenn eine gemeinsame Leichtkette bereitgestellt wird, die mit jeder der variablen Schwerketten des multispezifischen Antikörpers Paare bilden kann. Die Verwendung einer gemeinsamen variablen Leichtkette verringert die Anzahl an Monomeren, die korrekte Paare bilden müssen, um die Antikörper-Bindedomänen zu bilden, indem die Anzahl an Leichtketten von zwei oder mehr Leichtketten (in einem bispezifischen bzw. multispezifischen Antikörper, vor der Offenbarung der vorliegenden Erfindung) auf eine Leichtkette (in einem multispezifischen Antikörper der Erfindung, siehe 1C) verringert wird.
Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heteromultimeren multispezifischen Antikörpers, wobei der Antikörper Folgendes umfasst: 1) ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid (und weitere Polypeptide gemäß der Multiplizität des Antikörpers), die an einer Schnittstelle zusammenkommen, worin das erste und weitere Polypeptide (d.h. ein erstes und ein zweites Polypeptid) jeweils eine Multimerisations-Domäne umfassen, die eine Schnittstelle zwischen dem ersten und zweiten (oder zumindest einem weiteren) Polypeptid bildet, und die Multimerisations-Domänen eine stabile Wechselwirkung zwischen dem ersten und weiteren Polypeptiden fördern, und 2) in dem ersten und zumindest einem weiteren Polypeptid (d.h. einem zweiten Polypeptid) jeweils eine Bindedomäne, wobei jede Bindedomäne eine variable Schwerkette und eine variable Leichtkette umfasst, worin die variable Leichtkette des ersten Polypeptids und die variable Leichtkette des zweiten Polypeptids eine gemeinsame Aminosäuresequenz aufweisen, wobei die gemeinsame Sequenz eine Aminosäuresequenz-Identität mit einer ursprünglichen Leichtkette der einzelnen Polypeptide von zumindest 80 %, vorzugsweise zumindest 90 %, noch bevorzugter zumindest 95 %, insbesondere zumindest 100 %, aufweist. Das Verfahren umfasst folgende Schritte:

(i) das Kultivieren einer Wirtszelle, die Nucleinsäure umfasst, die für das erste Polypeptid, das zweite Polypeptid und die gemeinsame Leichtkette kodiert, worin das Kultivieren so erfolgt, dass die Nucleinsäure exprimiert wird; und
(ii) die Gewinnung des multispezifischen Antikörpers aus der Wirtszellkultur.

In einer damit in Zusammenhang stehenden Ausführungsform der Erfindung wurden die Nucleinsäure, die für das erste Polypeptid kodiert, oder die Nucleinsäure, die für das zweite Polypeptid kodiert, oder beide in Bezug auf die ursprüngliche Nucleinsäure so geändert, dass sie für die Schnittstelle oder einen Teil davon kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens umfasst die Schnittstelle des ersten Polypeptids einen freies Thiol enthaltenden Rest, der so positioniert ist, dass er mit einem freies Thiol enthaltenden Rest der Schnittstelle des zweites Polypeptids wechselwirkt, sodass eine Disulfidbindung zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid gebildet wird. Gemäß der Erfindung wurde die Nucleinsäure, die für das erste Polypeptid kodiert, in Bezug auf die ursprüngliche Nucleinsäure so geändert, dass sie für den freies Thiol enthaltenden Rest kodiert, oder die Nucleinsäure, die für das zweite Polypeptid kodiert, wurde in Bezug auf die ursprüngliche Nucleinsäure so geändert, dass sie für den freies Thiol enthaltenden Rest kodiert, oder beides.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden die Nucleinsäuren, die für das erste und zumindest ein weiteres Polypeptid (d.h. ein zweites Polypeptid) kodieren, so geändert, dass sie für die Protuberanz bzw. den Hohlraum kodieren. Vorzugsweise umfassen das erste und zweite Polypeptid jeweils eine konstante Antikörper-Domäne, wie z.B. die C_H3-Domäne eines menschlichen IgG₁.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Heteromultimer (wie beispielsweise einen bispezifischen Antikörper, ein bispezifisches Immunadhäsin oder Antikörper/Immunadhäsin-Chimäre) bereit, das ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfasst, die an einer Schnittstelle zusammenkommen. Die Schnittstelle des ersten Polypeptids umfasst eine Multimerisations-Domäne, die so positioniert ist, dass sie mit einer Multimerisations-Domäne auf dem zumindest einen weiteren Polypeptid (d.h. einem zweiten Polypeptid) wechselwirkt, um eine Schnittstelle zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid zu bilden. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Multimerisations-Domänen so geändert, dass sie die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen ersten Polypeptid und einem spezifischen zweiten Polypeptid fördern, wobei die Änderungen die Bildung einer Protuberanz oder eines Hohlraums oder beides; die Bildung einer nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindung; die Bildung von komplementären hydrophoben Regionen; und die Bildung von komplementären hydrophilen Regionen umfassen, nicht jedoch auf diese eingeschränkt sind. Der heteromultimere multispezifische Antikörper kann in Form einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, die außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Wirtszelle, die Nucleinsäure umfasst, die für den heteromultimeren multispezifischen Antikörper des vorigen Absatzes kodiert, worin die Nucleinsäure, die für das erste Polypeptid und zumindest ein weiteres Polypeptid (d.h. ein zweites Polypeptid) kodiert, in einem einzelnen Vektor oder in separaten Vektoren vorhanden ist. Die Wirtszelle kann in einem Verfahren zur Herstellung eines heteromultimeren multispezifischen Antikörpers verwendet werden, welches das Kultivieren der Wirtszelle, sodass die Nucleinsäure exprimiert wird, und die Gewinnung des heteromultimeren Antikörpers aus der Zellkultur umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heteromultimeren multispezifischen Antikörpers bereit, das Folgendes umfasst:

(a) das Auswählen einer ersten Nucleinsäure, die für ein erstes Polypeptid kodiert, das einen Aminosäurerest an der Schnittstelle des ersten Polypeptids umfasst, der so positioniert ist, dass er mit dem Aminosäurerest der Schnittstelle zumindest eines weiteren Polypeptids wechselwirkt. In einer Ausführungsform ist die Nucleinsäure im Vergleich zu ursprünglichen so geändert, dass sie für die wechselwirkenden Aminosäurereste kodiert. In einer weiteren Ausführungsform ist die erste Nucleinsäure so geändert, dass sie für einen Aminosäurerest mit einem größeren Seitenkettenvolumen kodiert, wodurch eine Protuberanz auf dem ersten Polypeptid erzeugt wird;
(b) das Ändern einer zweiten Nucleinsäure, die für ein zweites Polypeptid kodiert, sodass ein Aminosäurerest an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids durch einen Aminosäurerest mit einem geringeren Seitenkettenvolumen ersetzt wird, wodurch ein Hohlraum im zweiten Polypeptid erzeugt wird, worin die Protuberanz so positioniert ist, dass sie mit dem Hohlraum wechselwirkt;
(c) das Einführen der ersten und zweiten Nucleinsäure in eine Wirtszelle und das Kultivieren der Wirtszelle, sodass die erste und zweite Nucleinsäure exprimiert werden; und
(d) die Gewinnung des heteromultimeren Antikörpers aus der Zellkultur.

Es mag auch wünschenswert sein, einen multispezifischen Antikörper (wie z.B. einen bispezifischen Antikörper) herzustellen, der einen oben identifizierten Antikörper umfasst. Unter diesen Umständen ist es wünschenswert, eine schwere Kette zu identifizieren, die beim Paaren mit der ursprünglichen leichten Kette spezifisch an ein zweites Antigen von Interesse bindet. Die Verfahren von Figini et al. (M. Figini et al., J. Mol. Biol. 239, 68–78 (1994)) können zur Identifikation solch einer schweren Kette verwendet werden. Zuerst wird eine Phagenbibliothek mit Guanidinhydrochlorid behandelt, um die ursprüngliche leichte Kette aufzuspalten. Als Nächstes werden die schweren Ketten, die auf einem Phagen exprimiert sind, mit der leichten Kette von Interesse wiederhergestellt, indem das Denaturierungsmittel entfernt wird (etwa durch Dialyse). Dann wird Panning gegen das zweite Antigen von Interesse durchgeführt, um die gewünschte schwere Kette zu identifizieren. Die Erfindung stellt außerdem einen multispezifischen Antikörper, der mithilfe dieses Verfahrens des Auswählens einer schweren Kette zum Paaren mit einer ausgewählten leichten Kette hergestellt wird, Nucleinsäure, die für den Antikörper kodiert, und eine Wirtszelle, welche die Nucleinsäure umfasst, bereit.
Ferner stellt die Erfindung einen Mechanismus zur Erhöhung der Ausbeute des Heteromultimers im Vergleich zu anderen ungewünschten Endprodukten, wie z.B. ungewünschten Heteromultimeren und/oder Homomultimeren, bereit (siehe 1A–1C). Vorzugsweise ist die Ausbeute des gewünschten Heteromultimers, das aus der rekombinanten Zellkultur gewonnen wird, im Vergleich zu dem als Nebenprodukt gebildeten Heterodimere oder den Homomultimeren zumindest größer als 80 Gew.-% und vorzugsweise größer als 90 Gew.-%.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A–1C. 1A ist eine graphische Darstellung der Bildung von Fc-hältigen bispezifischen Antikörpern, wenn keine Bearbeitung durchgeführt wird, um die Heteromultimerisation gegenüber der Homomultimerisation zu fördern. 1B ist eine graphische Darstellung, welche die Paarung zeigt, die stattfindet, wenn schwere (H-) Ketten so bearbeitet werden, dass die gewünschte Heteromultimerisation der ungewünschten Heteromultimerisation oder Homomultimerisation vorgezogen wird. 1C ist eine graphische Darstellung, welche die Paarung zeigt, die auftritt, wenn Antikörper ausgewählt werden, welche die gleiche leichte (L-) Kette aufweisen, um das Problem zu umgehen, dass leichte Ketten Paare mit nichtverwandten schweren Ketten bilden.
2A–2C. 2A zeigt ein Selektionsschema für ein C_H3-Heterodimer unter Verwendung des Phagendisplay-Vektors pRA2. Phagen, die stabile C_H3-Heterodimere exprimieren, werden unter Verwendung eines Antikörpers eingefangen, der gegen das gD-Flag gerichtet ist. 2B zeigt ein dicistronisches Operon, worin von einem synthetischen Gen exprimiertes C_H3 gemeinsam mit einer zweiten Kopie von C_H3, die vom natürlichen Gen exprimiert wird, sekretiert wird (Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10, 4071–4079 (1982)), und zwar als Fusionsprotein mit einem M13-Gen-III-Protein. Dem synthetischen C_H3-Gen geht eine Sequenz, für die ein Peptid kodiert, das vom Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein D stammt (gD-Flag, L.A. Lasky und D.J. Bowbenko, DNA 3, 23–29 (1984); P.W. Bergman et al., Science 227, 1490–1492 (1985)) und eine Spalt- (G-) Stelle für die ortsspezifische Protease Genenase I (P. Carter et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 6, 240–248 (1989)) voraus. 2C zeigt die Nucleinsäuresequenz des dicistronischen Operons (Seq.-ID Nr. 1) aus 2B, worin die Reste der translatierten C_H3-Gene gemäß dem Eu-System von Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Bd. 1, S. 688–696, NIH, Bethesda, MD, USA (1991), nummeriert sind. Die Protuberanzenmutation T366W ist ebenso dargestellt wie die Reste, die im natürlichen C_H3-Gen Ziel einer Randomisierung sind (366, 368 und 407).
3A–3C. 3A und 3B sind Balkendiagramme der Ergebnisse einer densitometrischen Scanning-Analyse eines SDS-PAGE von Protein-A-gereinigten Produkten der Cotransfektion der schweren und leichten Kette eines Antikörper (ab) mit Immunadhäsin (Ia). Die angeführten Daten zeigten das Mittel aus zwei unabhängigen Versuchen. Die x-Achse gibt das Verhältnis der eingeführten DNA in Bezug auf die Masse (Ia:H:L) an, und die y-Achse gibt den Prozentsatz der einzelnen Produkt-Multimertypen in Bezug auf das gesamte Produktprotein an. 3C ist eine Darstellung der möglichen Produktmultimere.
4 ist ein Vergleich zwischen den V_L-Sequenzen von acht verschiedenen Antikörpern mit Spezifitäten für AxI, Rse, IgER, Ob-R und VEGF. Die Position der antigenbindenden CDR-Reste gemäß der Sequenzdefinition (Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (C. Chothia und A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) sind durch Unterstreichungen bzw. # hervorgehoben. Reste, die sich von der AxI. 78-Sequenz unterscheiden, sind doppelt unterstrichen.
5 ist ein Vergleich zwischen den schweren und leichten Ketten von ausgewählten Anti-Ob-R- und Anti-HER3-Klonen. Dargestellt sind die V_H- und die gemeinsamen V_L-Sequenzen des Anti-Ob-R-Klons 26 und des Anti-HER3-Klons 18, die zur Herstellung eines bispezifischen Antikörpers verwendet wurden.
6. Sandwich-ELISA zur Detektion einer gleichzeitigen Bindung an MpI-IgG und HER3-IgG. Getestet wurden die Antikörper Anti-MpI × Anti-HER3-BsIgG, welche die Mutationen Y349C:T366S:L368A:Y407V/T366'W:S354'C zusammen mit dem ent sprechenden parentalen Anti-MpI- oder Anti-HER3-IgG mit mutierten Fc-Regionen enthielten.
7 ist ein Balkendiagramm der Ergebnisse einer antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts- (ADCC-) Studie. Die ADCC wurde durch huMAb4D5-5 vermittelt (P. Carter et al., PNAS USA 89, 4285–4289 (1992)), das entweder ein mutiertes (S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368'A:Y407'V) oder Wildtyp-Fc oder einen mit dem Isotyp übereinstimmenden Kontrollantikörper (E25, L.G. Presta et al., J. Immunol. 151, 2623–2632 (1993)) enthielt. Die Antikörper (125 ng/ml) wurden mit mononuklearen Effektorzellen aus menschlichem peripherem Blut und SK-BR-3-Target-Zellen in den angegebenen Verhältnissen inkubiert. Die angeführten Daten sind das Mittel aus dreifachen Messungen und repräsentativ für drei separate Versuche.
8 ist eine Matrix, welche die Aminosäuresequenz-Identität zwischen den leichten Ketten von Antikörpern zu HER3 und den leichten Ketten von Antikörpern zu Ob-R zeigt. Antikörper mit leichten Ketten mit 100 % Sequenzidentität sind in schwarz hinterlegten Kästen dargestellt. Antikörper mit leichten Ketten mit 98–99 % Sequenzidentität sind in weißen Kästen dargestellt. Die Antikörperklonidentität ist unter der Matrix angeführt.
I. Definitionen
Im Allgemeinen weisen die nachstehenden Worte oder Phrasen bei Verwendung in der Beschreibung, in den Beispielen und in den Ansprüchen die angeführte Definition auf.
Ein "Heteromultimer", "heteromultimeres Polypeptid" oder "heteromultimerer multispezifischer Antikörper" ist ein Molekül, das zumindest ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfasst, worin sich das zweite Polypeptid in der Aminosäuresequenz um zumindest einen Aminosäurerest vom ersten Polypeptid unterscheidet. Vorzugsweise weist das Heteromultimer Bindespezifität für zumindest zwei unterschiedliche Liganden oder Bindestellen auf. Das Heteromultimer kann ein "Hetero dimer" umfassen, das aus dem ersten und zweiten Polypeptid besteht, oder kann tertiäre Strukturen höherer Ordnung bilden, wenn neben dem ersten und zweiten Polypeptid weitere Polypeptide vorhanden sind. Beispiele für Strukturen des Heteromultimers umfassen Heterodimere (z.B. das von Dietsch et al., w.o., beschriebene bispezifische Immunadhäsin), Heterotrimere (z.B. die von Chamow et al., w.o., beschriebenen Ak/Ia-Chimären), Heterotetramere (z.B. einen bispezifischen Antikörper) und weitere oligomere Strukturen.
Der Begriff "Multimerisations-Domäne" bezieht sich hierin auf eine Region, die in allen Polypeptiden des Heteromultimers vorhanden ist. Die "Multimerisations-Domäne" fördert eine stabile Wechselwirkung der chimären Moleküle innerhalb des heteromultimeren Komplexes. Vorzugsweise fördert die Multimerisations-Domäne die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen ersten Polypeptid und einem spezifischen zweiten Polypeptid, wodurch die Bildung des gewünschten Heteromultimers gefördert und die Wahrscheinlichkeit der Bildung von ungewünschten Heteromultimeren oder Homomultimeren stark verringert wird. Die Multimerisations-Domänen können über eine Immunglobulinsequenz, einen Leucin-Zipper, eine hydrophobe Region, eine hydrophile Region oder ein freies Thiol wechselwirken, die eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen den chimären Molekülen des chimären Heteromultimers bildet. Das freie Thiol kann in die Schnittstelle von einem oder mehreren wechselwirkenden Polypeptiden eingeführt werden, indem ein natürlich vorkommender Rest des Polypeptids durch beispielsweise ein Cystein ersetzt wird, und zwar an einer Position, welche die Bildung einer Disulfidbindung zwischen den Polypeptiden ermöglicht. Die Multimerisations-Domäne kann eine konstante Immunglobulin-Region umfassen. Eine mögliche Multimerisations-Domäne, die in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ist in der PCT/US90/106849 offenbar, in der Hybridimmunglobuline beschrieben sind. Außerdem kann eine Multimerisations-Region hergestellt werden, sodass sterische Wechselkwirkungen nicht nur eine stabile Wechselwirkung fördern, sondern auch die Bildung von Heterodimeren im Gegensatz zu Homodimeren aus einem Monomer-Gemisch fördern. Siehe beispielsweise PCT/US96/01598, worin eine "Protuberanz-in-Hohlraum"-Strategie für eine Schnittstelle zwischen einem ersten und einem zweiten Polypeptid zur Heterooligomerisation offenbart ist. "Protuberan zen" werden hergestellt, indem kleine Aminosäure-Seitenketten an der Schnittstelle des ersten Polypeptids durch größere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt werden. "Kompensationshohlräume" mit der gleichen oder einer ähnlichen Größe wie die Protuberanzen können gegebenenfalls an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids gebildet werden, indem große Aminosäure-Seitenketten durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden. Die Immunglobulin-Sequenz ist vorzugsweise, nicht aber notwendigerweise, eine konstante Immunglobulin-Domäne. Die Immunglobulin-Gruppierung in den Chimären der vorliegenden Erfindung kann von IgG₁-, IgG₂-, IgG₃- oder IgG₄-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, aber vorzugsweise von IgG₁, IgG₂, IgG₃ oder IgG₄, stammen.
Mit "freies Thiol enthaltende Verbindung" ist eine Verbindung gemeint, die in eine Aminosäure einer Polypeptid-Schnittstelle gemäß der Erfindung inkorporiert oder mit dieser umgesetzt werden kann, sodass die freie Thiolgruppierung der Verbindung so positioniert ist, dass sie mit einem freien Thiol einer Gruppierung an der Schnittstelle eines weiteren Polypeptids gemäß der Erfindung wechselwirken kann, um eine Disulfidbindung zu bilden. Vorzugsweise ist die freies Thiol enthaltende Verbindung Cystein.
Der Begriff "epitopmarkiert" bezieht sich hierin auf ein chimäres Polypeptid, das das gesamte chimäre Heteroadhäsin oder ein Fragment davon an ein "Markierungspolypeptid" fusioniert enthält. Das Markierungspolypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist aber kurz genug, sodass es die Aktivität des chimären Heteroadhäsins nicht stört. Das Markierungspolypeptid ist ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper dagegen im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und normalerweise zwischen etwa 8–50 Aminosäureresten (vorzugsweise zwischen etwa 9–30 Aminosäureresten) auf. Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst ein chimäres Heteroadhäsin, das an eine Epitopmarkierung gebunden ist, wobei die Markierung zur Detektion des Adhäsins in einer Probe oder zur Gewinnung des Adhäsins aus einer Probe verwendet wird.
Der Begriff "gemeinsame leichte Kette bzw. Leichtkette" oder "gemeinsame Aminosäuresequenz der leichten Kette bzw. Leichtkette" bezieht sich hierin auf die Aminosäuresequenz der leichten Kette im multispezifischen Antikörper der Erfindung. Panels von Antikörpern gegen zumindest zwei unterschiedliche Antigene wurde erzeugt, indem eine Phagendisplay-Bibliothek einem Panning unterzogen wurde, wie es von Vaughan et al., w.o. (1996), beschrieben wurde. Die Leichtkettensequenzen wurden mit den variablen Leichtketten-Aminosäuresequenzen vergleichen. Nützliche Leichtketten aus den verglichenen Panels sind solche, die eine Aminosäuresequenz-Identität von zumindest 80 %, vorzugsweise zumindest 90 %, noch bevorzugter zumindest 95 %, insbesondere 100 %, aufweisen. Eine gemeinsame Leichtkettensequenz ist eine Sequenz, die eine Approximation der beiden verglichenen Leichtkettensequenz darstellt. Wenn die verglichenen Leichtketten auf Aminosäureebene 100 % Sequenzidentität aufweisen, ist die gemeinsame Leichtkette mit den Leichtketten von den ausgewählten Bibliotheksklonen identisch, obwohl die Leichtkettenfunktionen in einer anderen Bindedomäne des multispezifischen Antikörpers wirkt. Wenn die verglichenen Leichtketten sich wie oben beschrieben unterscheiden, kann sich die gemeinsame Leichtkette von der einen oder anderen oder von beiden verglichenen Leichtketten von den Bibliotheksklonen unterscheiden. Unterscheidet sich die Leichtkette von der einen oder anderen oder von beiden von den Bibliotheksklonen, treten die unterschiedlichen Reste vorzugsweise außerhalb der antigenbindenden CDR-Reste der Antikörper-Leichtkette auf. Die Position der antigenbindenden CDR-Reste kann beispielsweise gemäß der Sequenzdefinition (Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) bestimmt werden.
Der Begriff "Aminosäuresequenz-Identität" bezieht sich auf den Prozentsatz an Aminosäuren einer Sequenz, die gleich sind wie die Aminosäuren einer zweiten Aminosäuresequenz. 100 % Sequenzidentität zwischen Polypeptidketten bedeutet, dass die Ketten identisch sind.
Der Begriff "Polypeptid" bezieht sich hierin im Allgemeinen auf Peptide und Proteine mit mehr als etwa zehn Aminosäuren. Vorzugsweise werden Säugetier-Polypeptide (Polypeptide, die ursprünglich von einem Säugetier-Organismus stammen) verwendet, noch bevorzugter solche, die direkt in das Medium sekretiert werden. Beispiele für bakterielle Polypeptide umfassen alkalische Phosphatase und β-Lactamase. Beispiele für Säugetier-Polypeptide umfassen Moleküle, wie beispielsweise Renin, Wachstumshormone, wie z.B. menschliches Wachstumshormon; Rinderwachstumshormon; Somatoliberin; Parathormon; thyreoidstimulierendes Hormon; Lipoproteine; α-1-Antitrypsin; Insulin-A-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; follikelstimulierendes Hormon; Calcitonin; luteinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren, wie z.B. Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebethromboplastin und von-Willebrand-Faktor; Antigerinnungsfaktoren, wie z.B. Protein C; atrialer natriuretischer Faktor; Lungentensid; einen Plasminogenaktivator, wie z.B. Urokinase oder menschliches Urin oder Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA); Bombesin; Thrombin; hämopoetischer Wachstumsfaktor; Tumor-Nekrose-Faktor-α und -β; Enkephalinase; RANTES (regulated on activation, normally T-cell expressed and secreted); menschliches Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP-1-α); Serumalbumin, wie z.B. menschliches Serumalbumin; Anti-Müller-Hormon; Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; gonadotropinassoziiertes Mäuse-Peptid; mikrobielles Protein, wie z.B. Betalactamase; DNase; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; einen neurotrophen Faktor, wie z.B. neurotrophen Knochenfaktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6), oder einen Nervenwachstumsfaktor, wie z.B. NGF-β; Blutplättchenaktivierungsfaktor (PDGF); Fibroblastenwachstumsfaktor, wie z.B. aFGF und bFGF; epidermalen Wachstumsfaktor (EGF); transformierenden Wachstumsfaktor (TGF), wie z.B. TGF-α und TGF-β; einschließlich TFG-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5; insulinähnlichen Wachstumsfaktor I und II (IGF-I und IGF-II); Des(1-3)-IGF-1 (Hirn-IGF-1), IGF-Bindeproteine; CD-Proteine, wie z.B. CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immuntoxine; Knochen-Morphogenese-Protein (BMP); ein Interferon, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSF), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (IL), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; Zerfall beschleunigender Faktor; virales Antigen, wie z.B. ein Teil des AIDS-Envelopes; Transportproteine; homing-Rezeptoren; Adressine; Regulatorproteine; Antikörper; und Fragmente der oben angeführten Polypeptide.
Das "erste Polypeptid" ist ein beliebiges Polypeptid, das mit einem zweiten Polypeptid verbunden werden soll. Das erste und das zweite Polypeptid kommen an einer "Schnittstelle" (unten definiert) zusammen. Neben der Schnittstelle kann das erste Polypeptid eine oder mehrere zusätzliche Domänen umfassen, wie z.B. "Bindedomänen" (z.B. eine variable Antikörper-Domäne, Rezeptor-Bindedomäne, Liganden-Bindedomäne oder enzymatische Domäne) oder konstante Antikörper-Domänen (oder Teile davon), einschließlich C_H2-, C_H1- und C_L-Domänen. Normalerweise umfasst das erste Polypeptid zumindest eine Domäne, die von einem Antikörper stammt. Diese Domäne ist am besten eine konstante Domäne, wie z.B. die C_H3-Domäne eines Antikörpers, und kann die Schnittstelle des ersten Polypeptids bilden. Beispiele für erste Polypeptide umfassen Antikörper-Schwerketten-Polypeptide, Chimären, die eine konstante Antikörper-Domäne mit einer Bindedomäne eines heterologen Polypeptids kombinieren (d.h. Immunadhäsine, siehe Definition unten), Rezeptor-Polypeptide (insbesondere solche, die Dimere mit einem anderen Rezeptor-Polypeptid bilden, wie z.B. Interleukin-8-Rezeptoren (IL-8R) und Integrin-Heterodimere (z.B. LFA-1 oder GPIIIb/IIIa)), Liganden-Polypeptide (z.B. Nervenwachstumsfaktor (NGF), Neurotrophin-3 (NT-3) und neurotropher Gehirnfaktor (BDNF) – siehe Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269(45), 27833–27839 (1994), und Radziejewski et al., Biochem. 32(48), 1350 (1993)) und Antikörper-Polypeptide mit variablen Domänen (z.B. Diabodies). Das bevorzugte erste Polypeptid ist eine Antikörper-Schwerkette, die an eine konstante Domäne eines Immunglobulins fusioniert ist, worin die konstante Domäne an der Schnittstelle so geändert wurde, dass sie eine präferentielle Wechselwirkung mit einem zweiten Polypeptid der Erfindung fördert.
Das "zweite Polypeptid" ist ein beliebiges Polypeptid, das mit dem ersten Polypeptid über eine "Schnittstelle" verbunden ist. Neben der Schnittstelle kann das zweite Polypeptid zusätzliche Domänen, wie z.B. eine "Bindedomäne" (z.B. eine variable Anti körper-Domäne, Rezeptor-Bindedomäne, Liganden-Bindedomäne oder enzymatische Domäne) oder konstante Antikörper-Domänen (oder Teile davon), einschließlich C_H2-, C_H1- und C_L-Domänen, umfassen. Normalerweise umfasst das zweite Polypeptid zumindest eine Domäne, die von einem Antikörper stammt. Diese Domäne ist am besten eine konstante Region, wie z.B. die C_H3-Domäne eines Antikörpers, und kann die Schnittstelle des zweiten Polypeptids bilden. Beispiele für zweite Polypeptide umfassen Antikörper-Schwerketten-Polypeptide, Chimären, die eine konstante Antikörper-Domäne mit einer Bindedomäne eines heterologen Polypeptids kombinieren (d.h. Immunadhäsine, siehe Definition unten), Rezeptor-Polypeptide (insbesondere solche, die Dimere mit einem anderen Rezeptor-Polypeptid bilden, wie z.B. Interleukin-8-Rezeptoren (IL-8R) und Integrin-Heterodimere (z.B. LFA-1 oder GPIIIb/IIIa)), Liganden-Polypeptide (z.B. Nervenwachstumsfaktor (NGF), Neurotrophin-3 (NT-3) und neurotropher Gehirnfaktor (BDNF) – siehe Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269(45), 27833–27839 (1994), und Radziejewski et al., Biochem. 32(48), 1350 (1993)) und Antikörper-Polypeptide mit variablen Domänen (z.B. Diabodies). Das bevorzugte zweite Polypeptid ist eine Antikörper-Schwerkette, die an eine konstante Domäne eines Immunglobulins fusioniert ist, worin die konstante Domäne an der Schnittstelle so geändert wurde, dass sie eine präferentielle Wechselwirkung mit einem ersten Polypeptid der Erfindung fördert.
Eine "Bindedomäne" umfasst eine beliebige Region eines Polypeptids, die für die selektive Bindung an ein Molekül von Interesse (z.B. Antigen, Ligand, Rezeptor, Substrat oder Inhibitor) verantwortlich ist. Beispiele für Bindedomänen umfassen eine variable Antikörper-Domäne, eine Rezeptor-Bindedomäne, eine Liganden-Bindedomäne und eine enzymatische Domäne. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bindedomäne eine schwere und eine leichte Immunglobulinkette. Gemäß den bispezifischen Antikörpern der Erfindung und dem Verfahren zu ihrer Herstellung ist die leichte Kette für jede Bindedomäne des bispezifischen Antikörpers eine gemeinsame leichte Kette, wodurch die Bildung von ungewünschten Heteromultimeren verhindert wird, worin Fehlpaarungen von schweren und leichten Ketten auftreten.
Der Begriff "Antikörper" bezieht sich im Zusammenhang der Erfindung auf ein Polypeptid, das eine oder mehrere Domänen enthält, die an ein Epitop auf einem Antigen von Interesse binden, wobei solche Domänen von der variablen Region eines Antikörpers stammen oder Sequenzidentität damit aufweisen. Beispiele für Antikörper umfassen Antikörper voller Länge, Antikörperfragmente, Einketten-Moleküle, bispezifische oder bifunktionelle Moleküle, Diabodies, chimäre Antikörper (z.B. humanisierte und PRIMATIZED^TM Antikörper) und Immunadhäsine. "Antikörperfragmente" umfassen Fv-, Fv'-, Fab-, Fab'- und F(ab')₂-Fragmente.
"Humanisierte" Formen von nichtmenschlichen Antikörpern (z.B. von Nagetieren oder Primaten) sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon, die eine minimale Sequenz von einem nichtmenschlichen Immunglobulin aufweisen. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), in denen Reste von einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste von einer CDR von einer nichtmenschlichen Spezies (Donorantikörper) wie z.B. einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen oder einem Primaten mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden die Fv-Gerüstregion- (FR-) Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nichtmenschliche Reste ersetzt. Außerdem kann der humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in der importieren CDR oder den importierten Gerüstsequenzen vorkommen. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Antikörperleistung weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen umfasst ein humanisierter Antikörper im Wesentlichen zumindest eine, typischerweise zwei, variable Domänen ganz, worin alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen von einer menschlichen Immunglobulin-Sequenz stammen. Der humanisierte Antikörper umfasst vorzugsweise außerdem zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise von einem menschlichen Immunglobulin. Der humanisierte Antikörper umfasst auch einen PRIMATIZED^TM Antikörper, worin die antigenbindende Region des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der durch Immunisierung von Makaken mit dem Antigen von Interesse hergestellt wird.
Ein "multispezifischer Antikörper" ist ein Molekül mit Bindespezifitäten für zumindest zwei unterschiedliche Antigene. Obwohl solche Molekül normalerweise nur an zwei Antigene binden (d.h. bispezifische Antikörper, bsAk), umfasst der Begriff hierin auch Antikörper mit weiteren Spezifitäten, wie z.B. trispezifische Antikörper. Beispiele für bsAk umfassen solche mit einem Arm, der gegen ein Tumorzellenantigen gerichtet ist, und einem weiteren Arm, der gegen ein zytotoxisches Trigger-Molekül gerichtet ist, wie z.B. Anti-FcγRI/Anti-CD15, Anti-185^HER2/FcγRIII (CD16), Anti-CD3/Antimaligne-B-Zelle (1D10), Anti-CD3/Anti-p185^HER2, Anti-CD3/Anti-p97, Anti-CD3/Anti-Nierenzellkarzinom, Anti-CD3/Anti-OVCAR-3, Anti-CD3/L-D1 (Anti-Kolonkarzinom), Anti-CD3/Anti-Melanozytenstimulations-Hormon-Analogon, Anti-EGF-Rezeptor/Anti-CD3, Anti-CD3/Anti-CAMA1, Anti-CD3/Anti-CD19, Anti-CD3/MoV18, Anti-Nervenzellen-Adhäsionsmolekül (NCAM)/Anti-CD3, Anti-Folatbindeprotein (FBP)/Anti-CD3, Anti-Pankarzinom-assoziiertes Antigen (AMOC)/Anti-CD3; bsAk mit einem Arm, der spezifisch an ein Tumorantigen bindet, und einem Arm, der an ein Toxin bindet, wie z.B. Anti-Saporin/Anti-Id-1, Anti-CD22/Anti-Saporin, Anti-CD7/Anti-Saporin, Anti-CD38/Anti-Saporin, Anti-CEA/Anti-Ricin-A-Kette, Anti-Interferon-α (IFN-α)/Anti-Hybridom-Idiotyp, Anti-CEA/Anti-Vinca-Alkaloid; bsAk zur Überführung von enzymaktivierten Prodrugs, wie z.B. Anti-CD30/Anti-alkalische-Phosphatase (welches die Überführung eines Mitomycin-Phosphat-Prodrugs in Mitomycin-Alkohol katalysiert); bsAk, die als Fibrinolytika verwendet werden können, wie z.B. Anti-Fibrin/Anti-Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA), Anti-Fibrin/Anti-Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA); bsAk zum Targeting von Immunkomplexen auf Zelloberflächenrezeptoren, wie z.B. Anti-LDL (Lipoproteine niedriger Dichte)/Anti-Fc-Rezeptor (z.B. FcγRI, FcγRII oder FcγRIII); bsAk zur Verwendung in der Therapie von infektiösen Krankheiten, wie z.B. Anti-CD3/Anti-Herpex-simplex-Virus (HSV), Anti-T-Zell-Rezeptor:CD3-Komplex/Anti-Influenza, Anti-FcγR/Anti-HIV; bsAk zur Tumordetektion in vitro oder in vivo, wie z.B. Anti-CEA/Anti-EOTUBE, Anti-CEA/Anti-DPTA, Anti-p185^HER2/Anti-Hapten; bsAk als Vakzineadjuvantien (siehe Fanger et al., w.o.); und bsAk als diagnostische Werkzeuge, wie z.B. Anti-Kaninchen-IgG/Anti-Ferritin, Anti-Meerrettichperoxidase (HRP)/Anti-Hormon, Anti-Somatostatin/Anti-Substanz-P, Anti-HRP/Anti-FITC, Anti-CEA/Anti-β-Galactosidase (siehe Nolan et al., w.o.). Beispiele für trispezifische Antikörper umfassen Anti-CD3/Anti-CD4/Anti-CD37, Anti-CD3/Anti-CD5/Anti-CD37 und Anti-CD3/Anti-CD8/Anti-CD37.
Der Begriff "Immunadhäsin" bezeichnet hierin antikörperähnliche Moleküle, welche die "Bindedomäne" eines heterologen Proteins (ein "Adhäsin", z.B. ein Rezeptor, Ligand oder Enzym) mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulin-Domänen kombiniert. Strukturell gesehen umfassen die Immunadhäsine eine Fusion der Adhäsin-Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindespezifität, die eine andere ist als die Antigen-Erkennungs- und Bindestelle (Antigen-Kombinierungsstelle) eines Antikörpers (d.h. "heterolog" ist), und einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunadhäsin kann von jedem beliebigen Immunglobulin erhalten werden, wie z.B. IgG₁-, IgG₂-, IgG₃- oder IgG₄-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM.
Der Begriff "Liganden-Bindedomäne" bezieht sich hierin auf einen beliebigen nativen Zelloberflächenrezeptor oder eine beliebige Region oder ein beliebiges Derivat davon, das zumindest eine qualitative Liganden-Bindefähigkeit, vorzugsweise die biologische Aktivität eines entsprechenden nativen Rezeptors, beibehält. In einer spezifischen Ausführungsform stammt der Rezeptor von einem Zelloberflächenpolypeptid mit einer extrazellulären Domäne, die homolog zu einem Mitglied der Immunglobulin-Supergenfamilie ist. Andere typische Rezeptoren, die zwar nicht Mitglieder der Immunglobulin-Supergenfamilie sind, aber trotzdem in diese Definition eingeschlossen sind, sind Rezeptoren für Cytokine, insbesondere Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität (Rezeptortyrosinkinase), Mitglieder der Hämatopoietin- und Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor-Superfamilien und Zelladhäsionsmoleküle, z.B. (E-, L- und P-) Selectine.
Der Begriff "Rezeptor-Bindedomäne" wird verwendet, um beliebige native Liganden für einen Rezeptor, einschließlich Zelladhäsionsmoleküle, oder eine beliebige Region oder ein beliebiges Derivat davon, das zumindest eine qualitative Rezeptor-Bindefähigkeit, vorzugsweise die biologische Aktivität eines entsprechenden nativen Rezeptors, beibehält. Diese Definition umfasst unter anderem Bindesequenzen von Liganden für die oben genannten Rezeptoren.
Der Begriff "multispezifisches Immunadhäsin" bezeichnet hierin Immunadhäsine (wie sie hierin weiter oben definiert sind) mit zumindest zwei Bindespezifitäten (d.h. eine Kombination aus zwei oder mehr Adhäsin-Bindedomänen). Multispezifische Immunadhäsine können als Heterodimere, Heterotrimere oder Heterotetramere zusammengesetzt werden, im Wesentlichen gemäß der Offenbarung in WO 89/02922 (veröffentlicht am 6. April 1989), EP 314.317 (veröffentlicht am 3. Mai 1989) und US-Patent Nr. 5.116.964, ausgegeben am 2. Mai 1992. Bevorzugte multispezifische Immunadhäsine sind bispezifisch. Beispiele für bispezifische Immunadhäsine umfassen CD4-IgG/TNF-Rezeptor-IgG und CD4-IgG/L-Selectin-IgG. Das letztgenannte Molekül kombiniert die Lymphknoten-Bindefunktion des Lymphozyten-homing-Rezeptors (LHR, L-Selectin) und die HIV-Bindefunktion von CD4 und findet möglicherweise Anwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung von HIV-Infektionen und verwandten Leiden oder in der Diagnostik.
Eine "Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre (Ak/Ia-Chimäre)" umfasst ein Molekül, das zumindest eine Bindedomäne eines Antikörpers (wie hierin definiert) mit zumindest einem Immunadhäsin (wie in dieser Anmeldung definiert) kombiniert. Beispiele für Ak/Ia-Chimären sind die bispezifischen CD4-IgG-Chimären, die von Berg et al., w.o., und Chamow et al., w.o., beschrieben wurden.
Die "Schnittstelle" umfasst jene "Kontakt"-Aminosäurereste (oder anderen Nicht-Aminosäuregruppen, wie z.B. Kohlenhydratgruppen, NADH, Biotin, FAD oder Hämgruppen) im ersten Polypeptid, die mit einem oder mehreren "Kontakt"-Aminosäureresten (oder anderen Nicht-Aminosäuregruppen) an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids wechselwirken. Die bevorzugte Schnittstelle ist eine Domäne ei nes Immunglobulins, wie z.B. eine variable Domäne oder eine konstante Domäne (oder Regionen davon), aber dieser Begriff umfasst auch eine Schnittstelle zwischen den Polypeptiden, die einen heteromultimeren Rezeptor bilden, oder eine Schnittstelle zwischen zwei oder mehr Liganden, wie z.B. NGF, NT-3 und BDNF. Die bevorzugte Schnittstelle umfasst die C_H3-Domäne eines Immunglobulins, die vorzugsweise von einem IgG-Antikörper, insbesondere von einem menschlichen IgG₁-Antikörper, stammt.
Ein "ursprünglicher" Aminosäurerest ist einer, der durch einen "Importrest" ersetzt ist, der ein kleineres oder größeres Seitenkettenvolumen aufweisen kann als der ursprüngliche Rest. Der Importaminosäurerest kann ein natürlich vorkommender oder ein nicht natürlich vorkommender Aminosäurerest sein, ist aber vorzugsweise Ersteres. "Natürlich vorkommende" Aminosäurereste sind solche Reste, für die der genetische Code kodiert und die in Tabelle 1 der PCT/US96/91598 zusammengefasst sind. "Nicht natürlich vorkommende" Aminosäurereste sind Reste, für die nicht der genetische Code kodiert, die aber zur kovalenten Bindung neben einem oder mehreren Aminosäureresten in der Polypeptidkette fähig sind. Beispiele für nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste sind Norleucin, Ornithin, Norvalin, Homoserin und andere Aminosäurerestanaloga, wie sie etwa in Ellman et al., Meth. Enzym. 202, 301–336 (1991), beschrieben sind. Um solche nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste herzustellen, können die Verfahren gemäß Noren et al., Science 244, 182 (1989), und Ellman et al., w.o., verwendet werden. Kurz zusammengefasst umfasst dies die chemische Aktivierung einer Suppressor-tRNA mit einem nicht natürlich vorkommenden Aminosäurerest, gefolgt von einer In-vitro-Transkription und Translation der RNA. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst das Ersetzen von zumindest einem ursprünglichen Aminosäurerest, wobei aber auch mehr als ein ursprünglicher Rest ersetzt werden kann. Normalerweise umfassen nicht mehr als alle Reste an der Schnittstelle des ersten oder zweiten Polypeptids ursprüngliche Aminosäurereste, die ersetzt werden. Die bevorzugten ursprünglichen Reste zum Ersetzen sind "vergraben". "Vergraben" bedeutet, dass der Rest für ein Lösungsmittel im Wesentlichen unzugänglich ist. Der bevorzugte Importrest ist nicht Cystein, um eine mögliche Oxidation oder Fehlpaarung von Disulfidbindungen zu verhindern.
Mit "ursprünglicher Nucleinsäure" ist die Nucleinsäure gemeint, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert und geändert werden kann, um innerhalb der Multimerisations-Domäne für Aminosäuren zu kodieren, deren Seitenketten an der Schnittstelle zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid wechselwirken und stabile Wechselwirkungen zwischen den Polypeptiden fördern. Solche Änderungen können ohne Einschränkung stabile Wechselwirkungen, wie z.B. Protuberanz-in-Hohlraum-Wechselwirkungen, nicht natürlich vorkommende Disulfidbindungen, Leucin-Zipper, hydrophobe Wechselwirkungen und hydrophile Wechselwirkungen, erzeugen. Vorzugsweise ist eine Änderung gewählt, die eine spezifische Wechselwirkung zwischen einem ersten und einem zweiten Polypeptid von Interesse fördert und Wechselwirkungen, die zu ungewünschter Heteromer-Paarung oder zur Bildung von Homomeren führen, effektiv ausschließt. Die ursprüngliche oder Ausgangs-Nucleinsäure kann eine natürlich vorkommende Nucleinsäure sein oder eine Nucleinsäure umfassen, die vorher einer Änderung unterzogen wurde (z.B. ein humanisiertes Antikörper-Fragment). Mit "Änderung" der Nucleinsäure ist gemeint, dass die ursprüngliche Nucleinsäure gentechnisch verändert oder mutiert wird, indem zumindest ein Codon, das für einen Aminosäurerest von Interesse kodiert, insertiert, deletiert oder ersetzt wird. Normalerweise wird ein Codon, das für einen ursprünglichen Rest kodiert, durch ein Codon ersetzt, das für einen Importrest kodiert. Verfahren zur gentechnischen Modifikation einer DNA auf diese Weise wurden in M.J. McPherson, Hrsg., Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, GB (1991), zusammengefasst und umfassen beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese, Kassettenmutagenese und Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Mutagenese.
Die Protuberanz, der Hohlraum oder das freie Thiol (wie z.B. ein Cysteinrest zur Bildung einer Disulfidbindung) kann auf synthetische Weise, z.B. durch Rekombinationsverfahren, In-vitro-Peptidsynthese, die oben beschriebenen Verfahren zur Einführung nicht natürlich vorkommender Aminosäurereste, durch enzymatische oder chemische Kupplung von Peptiden oder eine Kombination dieser Verfahren, in die Schnittstelle des ersten oder zweiten Polypeptids "eingeführt" werden. Demgemäß ist die Protuberanz, der Hohlraum oder das freie Thiol, die "eingeführt" werden, "nicht natürlich vorkommend" oder "nicht nativ", was bedeutet, dass sie in der Natur oder im ursprünglichen Polypeptid (z.B. einem humanisierten monoklonalen Antikörper) nicht vorkommen.
Vorzugsweise weist der Importaminosäurerest zur Bildung der Protuberanz eine relativ kleine Anzahl an "Rotameren" (z.B. etwa 3–6) auf. Ein "Rotamer" ist eine energetisch vorteilhafte Konformation einer Aminosäure-Seitenkette. Die Anzahl an Rotameren in verschiedenen Aminosäureresten ist in Ponders und Richards, J. Mol. Biol. 193, 775–791 (1987), zusammengefasst.
Ein "isoliertes" Heteromultimer ist ein Heteromultimer, das identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Zellkulturumgebung abgetrennt und/oder aus dieser gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, welche die diagnostische oder therapeutische Verwendung des Heteromultimers beeinträchtigen würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nichtproteinische Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Heteromultimer (1) zu mehr als 95 Gew.-% des Proteins, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, insbesondere mehr als 99 Gew.-%, (2) in einem Grad, der ausreicht, um mithilfe eines Zentrifugenröhrchen-Sequenzierers zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (3) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen und unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt.
Die Heteromultimere der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen im Wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt. Die Begriffe "im Wesentlichen homogen", "im Wesentlichen homogene Form" und "im Wesentlichen bis zur Homogenität" bedeuten, dass das Produkt im Wesentlichen frei von Nebenprodukten ist, die auf ungewünschte Polypeptidkombinationen (z.B. Homomultimere) zurückzuführen sind. In Bezug auf die Reinheit bedeutet im Wesentlichen homogen, dass die Menge an Nebenprodukten nicht über 10 %, vorzugsweise unter 5 %, noch bevorzugter unter 1 %, insbesondere unter 0,5 %, liegt, worin die Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomen-Bindungsstelle und möglicherweise andere, bisher noch unzureichend untersuchte Sequenzen. Eukaryotische Zellen verwenden bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer andere Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptid teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation vereinfacht. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Falle des sekretorischen Leaders, zusammenhängend sind und in der Lesephase vorliegen. Enhancer müssen jedoch nicht benachbart sein. Die Bindung wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen erreicht. Wenn keine solchen Stellen vorhanden sind, werden synthetische Oligonucleotid-Adapter oder -Linker gemäß herkömmlichen Verfahren verwendet.
II. Herstellung des Heteromultimers
1. Herstellung des Ausgangsmaterials
Im ersten Schritt werden das erste und zweite Polypeptid (und weitere Polypeptide, welche das Heteromultimer bilden) ausgewählt. Normalerweise muss die Nucleinsäure, die für diese Polypeptide kodiert, isoliert werden, sodass sie geändert werden kann, um für die Protuberanz oder den Hohlraum oder beides zu kodieren, wie sie hierin definiert sind. Die Mutationen können jedoch unter Verwendung von syntheti schen Mitteln eingeführt werden, z.B. unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts. Für den Fall, dass es sich beim Importrest um einen nicht natürlich vorkommenden Rest handelt, kann auch das Verfahren nach Noren et al., w.o., verwendet werden, um Polypeptid mit solchen Substitutionen herzustellen. Außerdem kann ein Teil des Heteromultimers geeigneterweise rekombinant in einer Zellkultur hergestellt werden, und ein oder mehrere andere Teile des Moleküls werden durch die oben genannten Verfahren hergestellt.
Verfahren zur Isolation von Antikörpern und zur Herstellung von Immunadhäsinen folgen. Es gilt jedoch anzumerken, dass das Heteromultimer unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren aus anderen Polypeptiden hergestellt werden oder diese inkorporieren kann. Beispielsweise kann Nucleinsäure, die für ein Polypeptid von Interesse (z.B. einen Liganden, einen Rezeptor oder ein Enzym) kodiert, aus einer cDNA-Bibliothek isoliert werden, die aus Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, dass es die Polypeptid-mRNA aufweist und sie in detektierbarem Ausmaß exprimiert. Bibliotheken werden mit Sonden (wie z.B. Antikörpern oder Oligonucleotiden aus etwa 20–80 Basen) gescreent, die darauf ausgerichtet sind, Gene von Interesse oder das Protein, für das sie kodieren, zu identifizieren. Das Screenen der cDNA- oder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die in den Kapiteln 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben sind.
(I) Antikörper-Herstellung
Für die Herstellung von Antikörpern wurden verschiedene Verfahren beschrieben, wozu das herkömmliche Hybridom-Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, Rekombinationsverfahren zur Herstellung von Antikörpern (einschließlich chimärer Antikörper, z.B. humanisierter Antikörper), Antikörper-Produktion in transgenen Tieren und die vor kurzem erst beschriebene Phagendisplay-Technologie zur Herstellung von "vollkommen menschlichen" Antikörpern gehören. Diese Verfahren werden nachstehend kurz erläutert.
Polyklonale Antikörper für das Antigen von Interesse können im Allgemeinen durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des Antigens und eines Adjuvans in Tieren hervorgerufen werden. Es mag von Nutzen sein, das Antigen (oder ein Fragment, das die gewünschte Aminosäuresequenz enthält) an ein Protein, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, zu konjugieren, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecke-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, und zwar unter Verwendung eines bifunktionellen oder Derivatisierungsmittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R^IN=C=NR, worin R und R^I unterschiedliche Alkylgruppen sind. Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg 1 μg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Komplettem Freundschem Adjuvans kombiniert werden und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere durch subkutane Injektion an mehreren Stellen von 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge Konjugat in Kompletten Freundschem Adjuvans geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Antikörpertiter untersucht. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer nicht mehr steigt. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat vom gleichen Antigen geboostet, aber an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes Vernetzungsmittel konjugiert. Konjugate können auch als Proteinfusionen in rekombinanten Zellkulturen hergestellt werden. Außerdem werden Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, verwendet, um die Immunantwort zu verstärken.
Monoklonale Antikörper werden unter Verwendung des zum ersten Mal von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Hybridom-Verfahrens aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren (Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567) hergestellt werden. Beim Hybridom-Verfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z.B. ein Hamster, wie oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten zu erhalten, die Antikörper produzieren oder produzieren können, welche spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. In diesem Fall werden Lymphozyten zuerst unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103, Academic Press (1986)). Die so erzeugten Hybridomzellen werden in einem geeigneten Kulturmedium ausgesät und gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, welche das Wachstum oder Überleben der unfusionierten, parentalen Myelomzellen hemmen. Wenn den parentalen Myelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGRPT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), Substanzen, welche das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern. Bevorzugte Myelomzellen sind solche, die effizient fusionieren, eine stabile und starke Antikörper-Expression durch die gewählten Antikörper-produzierenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium, wie z.B. HAT-Medium, empfindlich sind. Davon sind bevorzugte Myelomzelllinien Mäuse-Myelomzelllinien, wie z.B. jene von MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren stammende, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, und SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelomzelllinien und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden ebenfalls für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern verwendet (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); und Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)). Siehe auch Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991), und WO 91117769, veröffentlicht am 28. November 1991, über Verfahren zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern. Das Kulturmedium, in dem Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf die Produktion von monoklonalen Antikörpern untersucht, die gegen das Antigen von Interesse gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindespezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch Hybridomzellen erzeugt werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. einen Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Die Bindeaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse nach Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden. Nachdem die Hybridomzellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–104, Academic Press (1986). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RPMI-1640-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo in Form von Aszites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden. Die durch diese Subklone sekretierten monoklonalen Antikörper werden durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, auf geeignete Weise vom Kulturmedium, von der Aszites-Flüssigkeit oder vom Serum getrennt.
Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) herzustellen, die bei einer Immunisierung fähig sind, in Abwesenheit einer endogenen Immunglobulinproduktion eine volles Repertoire an menschlichen Antikörpern herzustellen. So wurde beispielsweise beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion- (J_H-) Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen zur vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion führt. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Gen-Anordnung in solche keimbahnmutierten Mäuse führt bei Antigen-Provokation zur Produktion von menschlichen Antikörpern. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); D.M. Fishwild et al., Nat. Biotech. 14, 845–851 (1996); und M.J. Mendez, Nat. Genetics 15, 146–156 (1997).
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente aus Antikörper-Phagenbibliotheken isoliert werden, die unter Verwendung des Verfahrens nach McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), hergestellt wurden, wobei das Antigen von Interesse verwendet wird, um einen geeigneten Antikörper oder ein geeignetes Antikörperfragment zu selektieren. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolie rung von Mäuse- bzw. menschlichen Antikörpern unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Spätere Publikationen beschreiben die Produktion von menschlichen Antikörpern mit hoher Affinität (nM-Bereich) durch Ketten-Shuffling (Mark et al., Bio/Technol. 10, 779–783 (1992)) sowie die kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion von sehr großen Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993); A.D. Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245–3260 (1994); und Vaughan et al., w.o. (1996)). Diese Verfahren stellen somit mögliche Alternativen zu herkömmlichen Hybridom-Verfahren mit monoklonalen Antikörpern dar, um "monoklonale" Antikörper (insbesondere menschliche Antikörper) zu isolieren, die zur vorliegenden Erfindung gehören.
DNA, die für die Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren isoliert und sequenziert werden (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für schwere und leichte Ketten von Mäuseantikörpern kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte DNA-Quelle. Nach der Isolation kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Affen-COS-Zellen, Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) oder Myelomzellen, die sonst kein Immunglobulin-Protein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise indem die für menschliche konstante Schwerketten- und Leichtketten-Domänen kodierende Sequenz anstelle der homologen Mäusesequenzen eingefügt wird. Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984). Auf diese Weise werden "chimäre" Antikörper hergestellt, welche die Bindespezifität eines hierin definierten monoklonalen Anti-Antigen-Antikörpers aufweisen.
Verfahren zur Humanisierung von nichtmenschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer nichtmenschlichen Quelle stammen. Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren nach Winter und Mitarbeiter durchgeführt werden (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 322, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), indem Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers eingefügt werden. Demgemäß sind solche "humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, w.o.), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz von einer nichtmenschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste, und möglicherweise einige FR-Reste, durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt sind. Wichtig ist, dass diese Antikörper so humanisiert werden, dass die hohe Affinität für das Antigen und andere vorteilhafte biologische Eigenschaften erhalten bleiben. Um dies zu erreichen, werden humanisierte Antikörper gemäß einem bevorzugten Verfahren durch ein Verfahren hergestellt, bei dem parentale Sequenzen und verschiedene konzeptuelle humanisierte Produkte unter Verwendung von dreidimensionalen Modellen der parentalen und humanisierten Sequenz analysiert werden. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Computer-Programme, welche wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen von ausgewählten Kandidaten-Immunglobulinsequenzen illustrieren und anzeigen, sind verfügbar. Durch Ansicht dieser Anzeigen kann die wahrscheinliche Rolle der Reste bei der Funktion der Kandidaten-Immunglobulinsequenz analysiert werden, d.h. die Analyse von Resten wird möglich, welche die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins beeinflussen, an sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste von der Consensus- und Importsequenz ausgewählt und kombiniert werden, sodass die gewünschten Antikörper-Eigenschaften, wie z.B. erhöhte Affinität für das/die Target-Antigen(e), erreicht werden. Für weitere Details siehe WO 92/22653, veröffentlicht am 23. Dezember 1992.
(ii) Immunadhäsin-Herstellung
Immunglobuline (Ig) und bestimmte Varianten davon sind bekannt, und viele wurden in einer rekombinanten Zellkultur hergestellt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.745.055; EP 256.654 ; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); EP 120.694 ; EP 125.023 ; Morrison, J. Immun. 123, 793 (1979); Köhler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984); EP 255.694 ; EP 266.663 und WO 88/03559. Neu geordnete Immunglobulin-Ketten sind ebenfalls bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.44.878; WO 88/03565; und EP 68.763 und darin zitierte Literatur.
Chimären, die aus Adhäsin-Bindedomänen-Sequenzen konstruiert sind, die an eine geeignete Sequenz einer konstanten Immunglobulin-Domäne gebunden sind (Immunadhäsine), sind ebenfalls auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. In der Literatur genannte Immunadhäsine umfassen Fusionen von T-Zell-Rezeptor (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin (homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell Biol. 110, 2221–2229 (1990); und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); und IgE-Rezeptor α (Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol., Bd. 115, Abstract Nr. 1448 (1991)).
Das einfachste und direkteste Immunadhäsin-Design kombiniert die Bindedomäne(n) des Adhäsins (z.B. die extrazelluläre Domäne (ECD) eines Rezeptors) mit den Gelenk- und Fc-Regionen einer Immunglobulin-Schwerkette. Normalerweise wird, wenn die Immunadhäsine der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, Nucleinsäure, die für die Bindedomäne des Adhäsins kodiert, C-terminal an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer Sequenz einer konstanten Immunglobulin-Domäne kodiert, aber auch N-terminale Fusionen sind möglich.
Typischerweise behält in solchen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest funktionelle aktive Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen werden auch am C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder direkt N-terminal zu C_H1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette vorgenommen. Die genaue Stelle, an der die Fusion stattfindet, ist nicht entscheidend; mögliche Stelle sind bekannt und können so ausgewählt werden, dass die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindeeigenschaften des Ia optimiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Adhäsin-Sequenz an den N-Terminus der Fc-Domäne eines Immunglobulins G₁ (IgG) fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Schwerketten-Region an die Adhäsin-Sequenz zu fusionieren. Noch bevorzugter werden jedoch eine Sequenz, die in der Gelenk-Region gleich stromauf von der Papain-Spaltstelle beginnt, welche IgG-Fc chemisch definiert (d.h. Rest 216, wobei der erste Rest der konstanten Schwerketten-Region bei 114 festgesetzt wird), oder analoge Stellen von anderen Immunglobulinen bei der Fusion verwendet. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform wird die Adhäsin-Aminosäuresequenz an (a) die Gelenk-Region und C_H2 und C_H3 oder (b) die C_H1-, Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen einer IgG₁-, IgG₂- oder IgG₃-Schwerkette fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion stattfindet, ist nicht entscheidend, und die optimale Stelle kann durch herkömmliches Experimentieren bestimmt werden.
Für bispezifische Immunadhäsine werden die Immunadhäsine als Multimere, genauer gesagt als Heterodimere oder Heterotetramere, angeordnet. Im Allgemeinen weisen die so angeordneten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen auf. Eine grundlegende Vierketten-Struktureinheit ist die Form, in der IgG, IgD und IgE vorkommen. Eine Vierketten-Einheit wird in den Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt; IgM kommt im Allgemeinen als Pentamer aus vier Grundeinheiten vor, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin, und gelegentlich IgG-Globulin, können ebenfalls in Multimerform im Serum vorkommen. Im Falle eines Multimers können die vier Einheiten gleich oder unterschiedlich sein.
Nachstehend sind verschiedene Beispiele für angeordnete Immunadhäsine angeführt, die innerhalb des Schutzumfangs hierin liegen:

(a) AC_L-AC_L;
(b) AC_H-[AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H];
(c) AC_L-AC_H-[AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H oder V_LC_L-V_HC_H];
(d) AC_L-V_HC_H-[AC_H oder AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H];
(e) V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H]; und
(f) [A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H]2,

_L

_H

_L

_H

Um die Erläuterungen kurz zu halten, zeigen die oben genannten Strukturen lediglich Schlüsselmerkmale; es sind weder verbindende (J-) oder andere Domänen der Immunglobuline noch Disulfidbindungen dargestellt. Wenn solche Domänen jedoch für die Bindeaktivität erforderlich sind, sind sie so zu konstruieren, dass sie an den üblichen Stellen vorhanden sind, die sie in den Immunglobulin-Molekülen einnehmen.
Alternativ dazu können die Adhäsin-Sequenzen zwischen Schwerketten- und Leichtketten-Sequenzen eines Immunglobulins insertiert werden, sodass ein Immunglobulin mit einer chimären Schwerketten erhalten wird. In dieser Ausführungsform werden die Adhäsin-Sequenzen an jedem Arm eines Immunglobulins an das 3'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette fusioniert, entweder zwischen der Gelenk- und der C_H2-Domäne oder zwischen der C_H2- und der C_H3-Domäne. Ähnliche Konstrukte wurden von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991), beschrieben.
Eine Immunglobulin-Leichtkette kann entweder kovalent an ein Adhäsin-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionspolypeptid gebunden oder direkt an das Adhä sin fusioniert vorliegen. Im ersten Fall wird DNA, die für eine Immunglobulin-Leichtkette kodiert, typischerweise mit der DNA coexprimiert, die für das Adhäsin-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionsprotein kodiert. Bei der Sekretion werden die Hybrid-Schwerkette und die Leichtkette kovalent verbunden, um eine immunglobulinähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei durch Disulfid verbundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Verfahren, die zur Herstellung solcher Strukturen geeignet sind, sind beispielsweise im US-Patent 4.816.567 offenbart, das am 28. März 1989 ausgegeben wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Immunglobulin-Sequenzen, die zur Herstellung der Immunadhäsine der vorliegenden Erfindung verwendet werden, von einer konstanten Domäne einer IgG-Immunglobulin-Schwerkette. Bei menschlichen Immunadhäsinen ist die Verwendung von menschlichen IgG₁- und IgG₃-Immunglobulin-Sequenzen bevorzugt. Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von IgG ist, dass IgG-Immunadhäsine effizient auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert die Reinigung von IgG₃ Protein G, ein deutlich weniger vielseitiges Medium. Aber auch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen sollten bedacht werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Immunadhäsin-Konstruktion gewählt wird. Das IgG₃-Gelenk ist beispielsweise länger und flexibler, sodass es längere "Adhäsin"-Domänen aufnehmen kann, die sich nicht richtig falten oder funktionieren, wenn sie an IgG fusioniert sind. Eine weitere Überlegung wäre die Wertigkeit; IgG-Immunadhäsine sind zweiwertige Homodimere, während Ig-Subtypen, wie IgA und IgM, dimere bzw. pentamere Strukturen aus der grundlegenden Ig-Homodimereinheit bilden können. Für Immunadhäsine, die auf eine In-vivo-Anwendung ausgerichtet sind, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die in der Fc-Region spezifiziert werden, von Bedeutung. Obwohl IgG, IgG und IgG alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen, ist ihre relative Wirksamkeit in Bezug auf die Aktivierung des Komplementsystems unterschiedlich. IgG₄ aktiviert kein Komplement, und IgG ist deutlich schwächer bei der Komplementaktivierung als IgG. Außerdem bindet IgG₂, anders als IgG, nicht an Fc-Rezeptoren auf mononuklearen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG optimal zu Komplementak tivierung ist, beträgt seine In-vivo-Halbwertszeit nur etwa ein Drittel der von anderen IgG-Isotypen. Eine weitere wichtige Überlegung in Bezug auf Immunadhäsine, die als Therapeutika an Menschen eingesetzt werden sollen, ist die Anzahl an allotypischen Varianten des jeweiligen Isotyps. Im Allgemeinen sind IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. IgG weist beispielsweise nur vier serologisch definierte allotypische Stellen auf, von denen zwei (G1m und 2) in der Fc-Region liegen; und eine dieser Stellen, G1m1, ist nicht immunogen. Im Gegensatz dazu gibt es in IgG₃ 12 serologisch definierte Allotypen, die alle in der Fc-Region liegen; nur drei von diesen Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen Allotyp auf, der nicht immunogen ist. Somit ist die potenzielle Immunogenität von γ3-Immunadhäsin größer als die von γ1-Immunadhäsin.
Immunadhäsine werden am besten hergestellt, indem die cDNA-Sequenz, die für den Adhäsin-Abschnitt kodiert, im Leseraster an eine Ig-cDNA-Sequenz fusioniert wird. Eine Fusion an genomische Ig-Fragmente kann aber ebenfalls verwendet werden (siehe z.B. Gascoigne et al., w.o.; Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Die letztere Fusionsart erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen für die Expression. cDNA, die für konstante IgG-Schwerketten-Regionen kodiert, kann ausgehend von veröffentlichten Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden, die von der Milz oder Lymphozyten des peripheren Bluts stammen, und zwar durch Hybridisierungs- oder durch Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Verfahren. Die cDNA, die für das "Adhäsin" und die Ig-Teile des Immunadhäsins kodiert, wird tandemartig in einen Plasmidvektor insertiert, der eine effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen steuert.
2. Herstellung einer Protuberanz und/oder eines Hohlraums
In einem ersten Schritt bei der Auswahl von ursprünglichen Resten zur Bildung der Protuberanz und/oder des Hohlraums wird die dreidimensionale Struktur des Heteromultimers unter Verwendung von Verfahren erhalten, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, wie z.B. Röntgenkristallstrukturanalyse oder NMR.
Ausgehend von der dreidimensionalen Struktur können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung die Schnittstellen-Reste identifizieren.
Die bevorzugte Schnittstelle ist die C_H3-Domäne einer konstanten Immunglobulin-Domäne. Die Schnittstellen-Reste der C_H3-Domänen von IgG, IgA, IgD, IgE und IgM wurden identifiziert (siehe z.B. PCT/US96/01598) und umfassen jene, die optimal durch Importreste ersetzt werden können; wie beispielsweise die Schnittstellen-Reste verschiedener IgG-Subtypen und "vergrabene" Reste. Die Basis zur Herstellung der C_H3-Schnittstelle ist, dass die Röntgenkristallstrukturanalyse gezeigt hat, dass die intermolekulare Assoziation zwischen menschlichen IgG₁-Schwerketten in der Fc-Region extensive Protein/Protein-Wechselwirkungen zwischen C_H3-Domänen umfasst, während die glykosylierten C_H2-Domänen über ihr Kohlenhydrat wechselwirken (Deisenhofer, Biochem. 20, 2361–2370 (1981)). Außerdem gibt es zwei Disulfidbindungen zwischen Schwerketten, die während einer Antikörper-Expression in Säugetieren effizient gebildet werden, solange die Schwerkette nicht trunkiert wird, um die C_H2- und C_H3-Domäne zu entfernen (King et al., Biochem. J. 281, 317 (1992)). Somit scheint eine Schwerkettenzusammenstellung die Bildung einer Disulfidbindung zu fördern, und nicht umgekehrt. Zusammen gesehen führten diese strukturellen und funktionellen Daten zur Hypothese, dass eine Antikörper-Schwerketten-Assoziation durch die C_H3-Domänen gesteuert wird. Außerdem wurde angenommen, dass die Schnittstelle zwischen C_H3-Domänen vielleicht so ausgebildet werden kann, dass die Bildung von Heteromultimeren mit unterschiedlichen Schwerketten gefördert und die Zusammenstellung von entsprechenden Homomultimeren verhindert werden kann. Die hierin beschriebenen Experimente zeigten, dass es möglich war, unter Verwendung dieses Ansatzes die Bildung von Heteromultimeren gegenüber von Homomultimeren zu fördern. Somit ist es möglich, eine Polypeptid-Fusion zu erzeugen, die ein Polypeptid von Interesse und die C_H3-Domäne eines Antikörper umfasst, um ein erstes oder zweites Polypeptid zu bilden. Die bevorzugte C_H3-Domäne stammt von einem IgG-Antikörper, wie z.B. menschlichen IgG₁.
Jene Schnittstellen-Reste, die möglicherweise Kandidaten zur Bildung der Protuberanz oder des Hohlraums darstellen, werden identifiziert. Vorzugsweise werden "vergrabene" Reste ausgewählt, die ersetzt werden sollen. Um zu bestimmen, ob ein Rest vergraben ist, kann das Oberflächen-Zugänglichkeitsprogramm von Lee et al., J. Mol. Biol. 55, 379–400 (1971), verwendet werden, um die Lösungsmittelzugänglichkeit (LZ) von Resten in der Schnittstelle zu bestimmen. Dann kann die LZ für die Reste des ersten und zweiten Polypeptids separat berechnet werden, nachdem das andere Polypeptid entfernt wurde. Der Unterschied in der LZ der Reste zwischen den Monomer- und den Dimer-Formen der Schnittstelle kann dann mithilfe der folgenden Gleichung berechnet werden: LZ (Dimer) – LZ (Monomer). Dies ergibt eine Liste von Resten, die bei der Bildung des Dimers LZ verlieren. Die LZ der einzelnen Reste im Dimer wird mit der theoretischen LZ der gleichen Aminosäure im Tripeptid Gly-X-Gly verglichen, worin X die Aminosäure von Interesse ist (Rose et al., Science 229, 834–838 (1985)). Reste, die (a) im Dimer im Vergleich zum Monomer LZ verloren hatten und (b) eine LZ von weniger als 26 % der des entsprechenden Tripeptids aufwiesen, werden als Schnittstellen-Reste betrachtet. Zwei Kategorien können unterschieden werden: solche, die im Vergleich zu ihrem entsprechenden Tripeptid eine LZ < 10 % aufweisen (d.h. "vergraben"), und solche, die im Vergleich zu ihrem entsprechenden Tripeptid 25 % > LZ > 10 % aufweisen (d.h. "teilweise vergraben") (siehe Tabelle 1). TABELLE 1

^✝ Nummerierung der Reste wie in der IgG-Kristallstruktur (Deisenhofer, Biochemistry 20, 2361–2370 (1981)).

Die Wirkung des Ersetzens von Resten auf die Polypeptid-Kettenstruktur kann unter Verwendung eines graphischen Molekülmodellierungsprogramms, wie z.B. des Programms Insigt^TM (Biosym Technologies), untersucht werden. Mithilfe des Programms können beispielsweise jene vergrabenen Reste der Schnittstelle des ersten Polypeptids, die ein kleineres Seitenkettenvolumen aufweisen, durch Reste ersetzt werden, die ein größeres Seitenkettenvolumen aufweisen (d.h. eine Protuberanz). Dann werden die Reste in der Schnittstelle des zweiten Polypeptids, die in der Nähe der Pro tuberanz liegen, untersucht, um einen zur Bildung des Hohlraums geeigneten Rest zu finden. Normalerweise weist dieser Rest ein großes Seitenkettenvolumen auf und wird durch einen Rest mit einem kleineren Seitenkettenvolumen ersetzt. In bestimmten Ausführungsformen zeigt die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der Schnittstelle eine Protuberanz mit geeigneter Position und Größe an der Schnittstelle des ersten Polypeptids oder einen Hohlraum an der Schnittstelle des zweiten Polypeptids auf. In diesen Fällen muss nur eine einzige Mutante modelliert werden, d.h. eine mit einer synthetisch eingeführten Protuberanz oder einem solchen Hohlraum.
In Bezug auf die Auswahl möglicher ursprünglicher Reste zum Ersetzen, wobei das erste und zweite Polypeptid jeweils eine C_H3-Domäne umfassen, umfasst die C_H3/C_H3-Schnittstelle von menschlichen IgG₁ sechzehn Reste auf jeder Domäne, die auf vier antiparallelen β-Strängen positioniert sind und 1090 Å² von jeder Fläche vergräbt (Deisenhofer, w.o., und Miller, J. Mol. Biol. 216, 965 (1990)). Mutationen sind vorzugsweise auf Reste gerichtet, die auf zwei zentralen antiparallelen β-Strängen liegen. Das Ziel besteht darin, das Risiko zu minimieren, dass die erzeugten Protuberanzen durch Eindringen in das umliegende Lösungsmittel aufgenommen werden und nicht in Kompensationshohlräumen in der Partner-C_H3-Domäne untergebracht werden.
Sobald die bevorzugten ursprünglichen Reste/Import-Reste durch Molekülmodellierung identifiziert sind, werden die Aminosäure-Ersetzungen mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren in das Polypeptid eingeführt. Normalerweise wird die DNA, die für das Polypeptid kodiert, mithilfe der in Mutagenesis: A Practical Approach, w.o., beschriebenen Verfahren gentechnisch verändert.
Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutionsvarianten der DNA, die für das erste oder zweite Polypeptid kodiert. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und wurde von Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Kurz gesagt wird die DNA des ersten oder zweiten Polypeptids geändert, indem ein Oligonucleotid, das für die ge wünschte Mutation kodiert, an eine DNA-Matrize hybridisiert wird, worin die Matrize die einsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, das/der die ungeänderte oder native DNA-Sequenz eines Heteromultimers enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen gesamten zweiten komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren, der so den Oligonucleotid-Primer umfasst und für die gewählte Änderung in der Heteromultimer-DNA kodiert.
Kassettenmutagenese kann gemäß der Beschreibung von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), durchgeführt werden, wobei eine Region der DNA von Interesse durch ein synthetisches Mutantenfragment ersetzt wird, das durch Anellierung von komplementären Oligonucleotiden gebildet wurde. PCR-Mutagenese ist auch zur Herstellung von Varianten der DNA des ersten oder zweiten Polypeptids geeignet. Während sich die nachstehenden Erläuterungen auf DNA beziehen, versteht sich, dass das Verfahren auch auf RNA anwendbar ist. Das PCR-Verfahren betrifft im Allgemeinen das folgende Verfahren (siehe Ehrlich, Science 252, 1643–1650 (1991), Kapitel von R. Higuchi, S. 61–70).
Diese Erfindung umfasst neben den Protuberanzen- oder Hohlraummutationen außerdem Aminosäuresequenz-Varianten des Heteromultimers, die durch Einführung von geeigneten Nucleotidänderungen in die Heteromultimer-DNA oder durch Synthese des gewünschten Heteromultimer-Polypeptids hergestellt werden können. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenzen des ersten und zweiten Polypeptids, die das Heteromultimer bilden. Jede beliebige Kombination aus Deletion, Insertion und Substitution kann zur Herstellung des Endkonstrukts verwendet werden, solange das Endkonstrukt die gewünschten Antigen-Bindeeigenschaften aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationale Prozesse des Heteromultimers verändern, wie beispielsweise die Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen.
Ein zweckdienliches Verfahren zur Identifikation von bestimmten Resten oder Regionen der Heteromultimer-Polypeptide, die bevorzugte Stellen für eine Mutagenese darstellen, wird "Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt und wurde von Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989), beschrieben. Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Target-Resten identifiziert (beispielsweise geladene Reste, wie z.B. arg, asp, his, lys und glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit dem umliegenden wässrigen Umfeld in oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Jene Domänen, die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen aufweisen, werden dann durch Einführung weiterer oder anderer Varianten an den oder anstelle der Substitutionsstellen verfeinert. Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation also vorgegeben ist, muss die Art der Mutation selbst nicht vorbestimmt sein.
Normalerweise umfassen die Mutationen konservative Aminosäure-Ersetzungen in nichtfunktionellen Regionen des Heteromultimers. Beispiele für Mutationen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
TABELLE 2
Kovalente Modifikationen der Heteromultimer-Polypeptide liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Kovalente Modifikationen des Heteromultimers können durch Umsetzung von gewünschten Aminosäureresten des Heteromultimers oder von Fragmenten davon mit einem organischen Derivatisierungs mittel, das mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten reagieren kann, in das Molekül eingeführt werden. Eine weitere Art einer kovalenten Modifikation des Heteromultimer-Polypeptids, die innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt, umfasst eine Änderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Mit Änderung ist gemeint, dass eine oder mehrere Kohlenhydratgruppierungen, die im ursprünglichen Heteromultimer vorkommen, deletiert werden und/oder eine oder mehrere Glykosylierungsstellen, die nicht im ursprünglichen Heteromultimer vorkommen, hinzugefügt werden. Die Addition von Glykosylierungsstellen zum Heteromultimer-Polypeptid wird am besten erreicht, indem die Aminosäuresequenz so verändert wird, dass sie eine oder mehrere N-gebundene Glykosylierungsstellen aufweist. Die Änderung kann auch durch die Addition von oder Substitution von einem oder mehreren Serin- oder Threonin-Resten zur ursprünglichen Heteromultimer-Sequenz erfolgen (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Zur Vereinfachung wird die Heteromultimer-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Änderungen auf DNA-Ebene verändert, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das Heteromultimer-Polypeptid kodiert, an vorbestimmten Basen, sodass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatieren. Ein weiteres Mittel zur Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen auf dem Heteromultimer-Polypeptid ist eine chemische oder enzymatische Kupplung von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981), beschrieben. Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die auf dem Heteromultimer vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erfolgen.
Eine weitere Art einer kovalenten Modifikation eines Heteromultimers umfasst die Bindung des Heteromultimer-Polypeptids an eines von verschiedenen nichtproteinischen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, und zwar auf die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschriebene Weise.
Da es oft schwierig ist, die Eigenschaften einer Heteromultimer-Variante vorherzusagen, muss die gewonnene Variante natürlich gescreent werden, um die optimale Variante auszuwählen.
3. Expression eines Heteromultimers mit gemeinsamen Leichtketten
Nach der Mutation der DNA und der Selektion der gemeinsamen Leichtkette, wie es hierin offenbart ist, wird die DNA, die für die Moleküle kodiert, unter Verwendung von Rekombinationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, exprimiert. Das ausgewählte Expressionssystem wird häufig einen Säugetier-Expressionsvektor und einen Wirt umfassen, sodass das Heteromultimer passend glykosyliert wird (z.B. im Falle von Heteromultimeren, die glykosylierte Antikörper-Domänen umfassen). Die Moleküle können aber auch in nachstehend erläuterten prokaryotischen Expressionssystemen produziert werden. Normalerweise wird die Wirtszelle mit DNA transformiert, die für das erste Polypeptid, das zweite Polypeptid, das Polypeptid mit der gemeinsamen Leichtkette und andere Polypeptide, die zur Bildung des Heteromultimers erforderlich sind, kodiert, und zwar auf einem einzelnen Vektor oder auf unabhängigen Vektoren. Es ist aber auch möglich, das erste Polypeptid, das zweite Polypeptid und Polypeptid mit der gemeinsamen Leichtkette (die Heteromultimer-Komponenten) in unabhängigen Expressionssystemen zu exprimieren und die exprimierten Polypeptid in vitro aneinander zu kuppeln.
Die Nucleinsäure(n) (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für das Heteromultimer und die gemeinsame Leichtkette kodiert/kodieren, wird/werden für eine weitere Klonierung (Amplifizierung der DNA) oder für eine Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert. Zahlreiche Vektoren stehen zur Verfügung. Die Vektor-Komponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eines oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Verstärkerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Die Polypeptide der Heteromultimer-Komponenten können als Fusionspolypeptide mit einer Signalsequenz oder als anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids hergestellt werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann Teil der DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und bearbeitet (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Bei prokaryotischen Wirtszellen kann die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz ersetzt werden, die beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Bei Hefeexpression kann die native Signalsequenz durch beispielsweise den Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, Letzteres im US-Patent Nr. 5.010.182, ausgegeben am 23. April 1991, beschrieben) oder Säurephosphatase-Leader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 einer, veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal ersetzt werden. Bei Säugetierzellen-Expression ist die native Signalsequenz (z.B. die Antikörper- oder Adhäsin-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion dieser Moleküle aus menschlichen Zellen in vivo steuert) zufrieden stellend, obwohl auch andere Säugetier-Signalsequenzen sowie virale sekretorische Leader, wie beispielsweise das Herpex-simplex-gD-Signal, verwendet werden können. Die DNA für solch eine Vorläuferregion ist im Leseraster an DNA ligiert, die für die Polypeptide kodiert, welche das Heteromultimer bilden.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die den Vektor dazu befähigt, sich in einer oder in mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz eine solche, die den Vektor dazu befähigt, sich unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren, und Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen umfasst. Solche Sequenzen sind für eine Reihe von Bakterien, für Hefe und für Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt des Plasmids pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zur Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen geeignet. Im Allgemeinen ist für Säugetier-Expressionsvektoren die Replikationsstartpunkt-Komponente nicht erforderlich (der SV40-Startpunkt wird typischerweise nur verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel ausgleichen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die im Komplex-Medium nicht vorhanden sind, z.B. das Gen, das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodiert. Ein Beispiel für ein Selektionsschema basiert auf der Verwendung eines Arzneimittels zum Stoppen des Wachstums einer Wirtszelle. Diese Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert werden, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht und somit den Selektionsvorgang überlebt. Beispiele für solch eine dominante Selektion sind die Verwendung der Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 298, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985)). Die drei oben angeführten Beispiele nutzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegenüber dem geeigneten Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein weiteres Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind solche, die eine Identifikation von Zellen ermöglichen, welche die Heteromultimer-Nucleinsäure aufnehmen können, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetierzellen-Transformanten werden Selektionsdruck ausgesetzt, sodass nur die Transformanten auf einzigartige Weise so angepasst werden, dass sie überleben, weil sie den Marker aufgenommen haben. Der Selektionsdruck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium sukzessive geändert wird, was zu einer Amplifikati on von sowohl dem Selektionsgen als auch der DNA führt, die für ein Heteromultimer kodiert. Erhöhte Mengen eines Heteromultimers werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert. Weitere Beispiele für amplifizierbare Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosindesaminase, Ornithindecarboxylase usw.
Beispielsweise werden zuerst Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert wurden, durch Kultivierung aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR eingesetzt wird, ist die Ovarialzelllinie des Chinesischen Hamsters (CHO-Zelllinie), die keine DHFR-Aktivität aufweist und gemäß Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), hergestellt und vermehrt wird. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Methotrexatwerten ausgesetzt. Dies führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrerer Kopien anderer DNA, welche die Expressionsvektoren umfasst, wie z.B. der DNA, die für die Komponenten des Heteromultimers kodiert. Dieses Amplifikationsverfahren kann an jedem beliebigen sonstigen geeigneten Wirt eingesetzt werden, z.B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, trotz der Gegenwart von endogenem DHFR, wenn beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen verwendet wird, das äußerst resistent gegen Mtx ist ( EP 117.060 ).
Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogenes DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen transformiert oder cotransformiert werden, die für Heteromultimere, ein Wildtyp-DHFR-Protein und einen anderen selektierbaren Marker, wie z.B. Aminoglykosid-3'-phosphotransferase (APH), kodieren, durch Zellwachstum in einem Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie beispielsweise ein Aminoglykosidantibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält. Siehe US-Patent Nr. 4,965.199.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefe-Plasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1- Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Stamm von Hefe bereit, der in Tryptophan nicht wachsen kann, wie z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszell-Genom stellt dann ein effektives Umfeld zur Detektion einer Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. Auf ähnliche Weise werden Leu2-defiziente Hefe-Stämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide komplementiert, die das Leu2-Gen tragen.
Außerdem können Vektoren vom ringförmigen 1,6-μm-Plasmid pKD1 zur Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). Vor kurzem wurde über ein Expressionssystem zur großtechnischen Herstellung von rekombinantem Kälber-Chymosin für K. lactis berichtet. Van der Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Mehrkopien-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem rekombinantem menschlichem Serumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces wurden ebenfalls offenbart (Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)).
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel mit der Heteromultimer-Nucleinsäure verbunden ist. Viele Promotoren, die von verschiedenen möglichen Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Diese Promotoren sind operabel mit für ein Heteromultimer kodierender DNA verbunden, indem der Promotor durch Restriktionsenzymverdauung aus der Quellen-DNA entfernt wird und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird.
Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen β-Lactamase- und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotor-System (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), und EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Aber auch andere bekannte bakterielle Promotoren sind geeignet. Diese Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, sodass Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sie operabel an DNA binden können, die für das Heteromultimer kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), und zwar unter Verwendung von Linkern oder Adaptern zur Bereitstellung erforderlicher Restriktionsstellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz, die operabel an DNA gebunden ist, die für ein Heteromultimer kodiert.
Promotorsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle liegt, an der die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstartpunkt vieler Gene ist eine CXCAAT-Region, worin X jedes beliebige Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly(A)-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatgehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Weitere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil darstellen, dass die Transkription durch Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, degradative Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel zusammenhängen, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression sind in Hitzeman et al., EP 73.657A , genauer beschrieben. Hefe-Enhancer können ebenfalls gut mit Hefepromotoren eingesetzt werden.
Die Heteromultimer-Transkription durch Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren, die von den Genomen von Viren, wie z.B. dem Polyoma-Virus, dem Vogelpocken-Virus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), einem Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), dem Rinder-Papillomavirus, dem Vogel-Sarkomvirus, dem Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, dem Hepatitis-B-Virus und insbesondere dem Simian-Virus 40 (SV40), erhalten wurden, heterologe Säugetier-Promotoren, wie z.B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, oder Hitzeschockpromotoren gesteuert.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden am besten als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den SV40-Virus-Replikationsstartpunkt enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus wird am besten als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982), über die Expression von cDNA, die für ein Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), über die Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors vom Herpes-simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), über die Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Mäuse- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982), über die Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo fibroblasten, Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen und Mäuse-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus als Promotor.
Die Transkription von DNA, die für die Heteromultimerkomponenten kodiert, durch höhere Eukaryoten wird häufig durch die Insertion einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 (1983)) von der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der kodierenden Sequenz selbst gefunden (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)). Viele Enhancer-Sequenzen von Säugetiergenen sind nun bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird ein Enhancer von einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den Enhancer des frühen Promotors des Zytomegalie-Virus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), über die Verstärkung von Elementen zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' zur für das Heteromultimer kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich aber vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilzen, Insekten, Pflanzen, Tieren, Menschen oder kernhaltigen Zellen von anderen vielzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten außerdem Sequenzen, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind normalerweise von 5'-, manchmal auch von 3'-, untranslatierten Regionen von eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA verfügbar. Diese Regionen enthalten Nucleotid-Sequenzen, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Teil der mRNA transkribiert sind, die für das Heteromultimer kodiert.
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere der oben angeführten Komponenten enthalten, erfolgt durch herkömmliche Ligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und wieder in die erwünschte Form ligiert, um die erforderlichen Plasmide herzustellen.
Für die Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den hergestellten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um den E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) und erfolgreiche Transformanten, die, wenn angemessen, durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt wurden, zu transformieren. Plasmide von den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonucleasenverdauung analysiert und/oder durch das Verfahren nach Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder das Verfahren nach Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Insbesondere nützlich bei der Umsetzung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die eine vorübergehende Expression von für ein Heteromultimer kodierender DNA in Säugetierzellen ermöglichen. Im Allgemeinen umfasst eine vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der zur effizienten Replikation in einer Wirtszelle fähig ist, sodass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors ansammelt und wiederum eine große Zahl eines gewünschten Polypeptids synthetisiert, für das der Expressionsvektor kodiert. Sambrook et al., w.o., S. 16.17–16.22. Systeme zur vorübergehenden Expression, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen leicht eine positive Identifikation von Polypeptiden, für die klonierte DNA kodiert, sowie das rasche Screenen von Heteromultimeren mit gewünschten Bindespezifitäten/-affinitäten oder den gewünschten Gelwanderungseigenschaften in Bezug auf Heteromultimere oder Homomultimere, denen die nicht natürlichen Disulfidbindungen fehlen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Synthese des Heteromultimers in einer rekombinanten Wirbeltier-Zellkultur angepasst werden können, sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben. Ein insbesondere geeignetes Plasmid für Säugetierzellkultur-Expression des Heteromultimers ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSVI6B (PCT Veröff.-Nr. WO 91108291, veröffentlicht am 13. Juni 1991).
Die Wahl der Wirtszelllinie zur Expression des Heteromultimers hängt hauptsächlich vom Expressionsvektor ab. Eine weitere Überlegung betrifft die Proteinmenge, die erforderlich ist. Milligramm-Mengen können häufig durch vorübergehende Transfektionen hergestellt werden. Die Adenovirus-EIA-transformierte menschliche 293-Embryo-Nierenzelllinie kann beispielsweise mit auf pRK5 basierenden Vektoren durch eine Modifikation des Calciumphosphat-Verfahrens vorübergehend transfiziert werden, um eine effiziente Heteromultimer-Expression zu ermöglichen. Auf CDM8 basierende Vektoren können verwendet werden, um COS-Zellen durch das DEAE-Dextran-Verfahren zu transfizieren (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); und Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347–353 (1990)). Wenn größere Proteinmengen erwünscht sind, kann das Immunadhäsin nach einer stabilen Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert werden. Ein auf pRK5 basierender Vektor kann beispielsweise in Gegenwart eines weiteren Plasmids, das für Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert und Resistenz gegenüber G418 verleiht, in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) eingeführt werden. Klone, die gegen G418 resistent sind, können in einer Kultur ausgewählt werden. Diese Klone werden in Gegenwart von steigenden Mengen DHFR-Inhibitor-Methotrexat gezüchtet, und jene Klone, in denen die Zahl an Genkopien, die für das DHFR und Heteromultimer-Sequenzen kodiert, coamplifiziert wird, werden ausgewählt. Wenn das Immunadhäsin eine hydrophobe Leader-Sequenz am N-Terminus enthält, ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass es durch die transfizierten Zellen bearbeitet und sekretiert wird. Die Expression von Immunadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann eventuell speziell passende Wirtszellen erfordern. Komponenten, wie etwa eine leichte Kette oder eine J-Kette, können beispielsweise durch bestimmte Myleom- oder Hybridom-Wirtszellen bereitgestellt werden (Gascoigne et al., w.o.; und Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)).
Weitere zur Klonierung oder Expression der Vektoren hierin geeignete Wirtszellen sind Prokaryoten-, Hefe- oder andere oben beschriebene höhere Eukaryotenzellen. Zu diesem Zweck geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien wie gramnegative oder grampositive Organismen, wie beispielsweise Enterobakterien, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie beispielsweise B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl auch andere Stämme, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325), geeignet sind. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Der Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Wirt oder Elternwirt, weil es sich um einen herkömmlichen Wirtsstamm für Fermentationen von rekombinanten DNA-Produkten handelt. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen von proteolytischen Enzymen. Der Stamm W3110 kann beispielsweise so modifiziert werden, dass eine genetische Mutation in den Genen stattfindet, die für Proteine kodieren, wobei Beispiele für solche Wirte den E.-coli-W3110-Stamm 27C7 umfassen. Der gesamte Genotyp von 27C7 ist tonAΔ ptr 3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kan'. Der Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu auch ein E.-coli-Stamm verwendet werden, der mutierte periplasmatische Protease aufweist, wie sie im US-Patent Nr. 4.946.783 offenbart ist, das am 7. August 1990 veröffentlicht wurde. Alternativ dazu können die Klonierungsverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, eingesetzt werden.
Neben Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe, als Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren verwendet werden, die für ein Heteromultimer kodieren. Saccharomyces cerevisiae, oder herkömmliche Backhefe, ist der am meisten verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Aber eine ganze Reihe von anderen Genera, Spezies und Stäm men ist allgemein erhältlich und hierin einsetzbar, wie beispielsweise Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1995); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.493.529; Fleer et al., w.o.), wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)); K. fragilis (ATCC 12. 424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., w.o.), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie beispielsweise A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl: Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4; 475–479 (1985)).
Zur Expression von glykosylierten Heteromultimeren geeignete Wirtszellen stammen von vielzelligen Organismen. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip kann jede höhere eukaryotische Zellkultur verwendet werden, egal ob sie von einer Wirbeltier- oder einer Wirbellosenkultur stammt. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und -Varianten sowie entsprechende zugelassene Insekten-Wirtszellen von Wirten, wie beispielsweise Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, wurden identifiziert. Siehe beispielsweise Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, Setlow et al., Hrsg., Bd. 8, S. 277–279, Plenum Publishing (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Verschiedene virale Stämme zur Transfektion sind allgemein erhältlich, wie beispielsweise die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als Virus gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffeln, Sojabohnen, Petunien, Tomaten und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit verschiedenen Stämmen der Bakterie Agrobacterium tumefaciens transfiziert, die vorher verändert wurde, sodass sie die Heteromultimer-DNA enthält. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für ein Heteromultimer kodierende DNA zum Pflanzenzellwirt transferiert, sodass dieser transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die Heteromultimer-DNA exprimiert. Außerdem sind Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie beispielsweise der Nopalin-Synthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem sind DNA-Segmente, die aus der stromauf vom T-DNA-780-Gen gelegenen Region isoliert wurden, zur Aktivierung oder' Erhöhung der Transkription von durch Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe fähig. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Die bevorzugten Wirte sind Wirbeltierzellen, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973)). Beispiele für nützliche Säugetier-Zelllinien sind die mit SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651), die menschliche embryonale Nierenlinien (293 oder 293-Zellen, die zur Züchtung in einer Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratte-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (HEP G2, HB 8065); Mäuse-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung transfiziert und in einem herkömmliche Nährmedium kultiviert, das zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert wurde. Je nach verwendeter Wirtszelle wird die Transfektion nach Standardverfahren durchgeführt, die für die jeweilige Zelle geeignet sind. Im Allgemeinen werden für Prokaryoten oder andere Zellen, die starke Zell-Wand-Barrieren aufweisen, eine Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie sie in Abschnitt 1.82 in Sambrook et al., w.o., beschrieben ist, oder Elektroporation verwendet. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird verwendet, um bestimmte Pflanzenzellen zu transfizieren, wie in Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der WO 89105859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben ist. Außerdem können Pflanzen mithilfe einer Ultraschallbehandlung transfiziert werden, wie sie in der WO 91/00368, veröffentlicht am 10. Jänner 1991, beschrieben ist.
Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Calciumphosphat-Fällungsverfahren nach Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte der Transformation von Säugetierzell-Wirtssystemen wurden von Axel im US-Patent Nr. 4.399.216, ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren nach Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Aber auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen wie z.B. durch nukleäre Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin usw., können eingesetzt werden. Zu verschiedenen Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Prokaryotische Zellen, die zur Herstellung des Heteromultimer-Polypeptids dieser Erfindung verwendet werden, werden in einem geeigneten Medium kultiviert, wie es in Sambrook et al., w.o., allgemein erläutert ist.
Die Säugetier-Wirtszellen, die zur Herstellung des Heteromultimers dieser Erfindung verwendet werden, können in verschiedenen Medium kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma), sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann jedes der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patent Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; US Patent Re. 30.985, oder US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann je nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder einem Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. dem Arzneimittel Gentamycin^TM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die normalerweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Andere notwendige Ergänzungen können in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die Kultivierungsbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, entsprechen jenen, die vorher bei der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden, und sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich.
Allgemeine Erläuterungen zu den Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktischen Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Säugetier-Zellkulturen finden sich in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, Hrsg., IRL Press (1991).
Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstieres befinden.
4. Gewinnung des Heteromultimers
Das Heteromultimer wird vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen, obwohl es auch aus einem Wirtszelllysat gewonnen werden kann, wenn es direkt ohne Sekretionssignale erzeugt wird. Wenn das Heteromultimer membrangebunden ist, kann es unter Verwendung einer geeigneten Detergenslösung (z.B. Triton X-100) von der Membran gelöst werden.
Wenn das Heteromultimer in einer rekombinanten Zelle nichtmenschlichen Ursprungs produziert wird, ist es vollkommen frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch notwendig, das Heteromultimer von rekombinanten Zellproteinen oder -polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die in Bezug auf das Heteromultimer im Wesentlichen homogen sind. In einem ersten Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat normalerweise zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen.
Heterodimere mit konstanten Antikörper-Domänen werden am besten durch Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie gereinigt, wobei Affinitätschromatographie das bevorzugte Reinigungsverfahren ist. Wenn das Heteromultimer eine C_H3-Domäne umfasst, kann das Bakerbond-ABX^TM-Harz (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) zur Reinigung eingesetzt werden. Andere Verfahren zur Proteinreinigung, wie z.B. Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Silica, Chromatographie auf Heparin-Sepharose, Chromatographie auf einem Anionen- oder Kationenaustauschharz (wie z.B. einer Polyasparaginsäure-Säule), Chromatofokussierung, SDS-PAGE und Ammoniumsulfatfällung, stehen je nach Polypeptid, das gewonnen werden soll, ebenfalls zur Verfügung. Ob Protein A als Affinitätsligand geeignet ist, hängt von der Spezies und vom Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die in der Chimäre verwendet wird. Protein A kann zur Reinigung von Immunadhäsin verwendet werden, das auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten basiert (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Mäuse-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden wird, ist meistens Agarose, aber auch andere Matrizes sind verfügbar. Mechanisch stabile Matrizes, wie z.B. Glas mit definierter Porengröße oder Poly(styroldivinyl)benzol, ermöglichen höhere Strömungsgeschwindigkeiten und kürzere Bearbeitungszeiten als mit Agarose erreicht werden können. Die Bedingungen zur Bindung eines Immunadhäsins an die Protein-A- oder Protein-G-Affinitätssäule werden vollständig von den Eigenschaften der Fc-Domäne bestimmt; d.h. von ihrer Spezis und ihrem Isotyp. Im Allgemeinen findet, wenn der geeignete Ligand gewählt wird, eine effiziente Bindung direkt aus dem unkonditionierten Kulturfluid statt. Ein unterscheidendes Merkmal von Immunadhäsinen ist, dass die Bindungskapazität für Protein A bei menschlichen γ1-Molekülen etwas geringer ist als an einen Antikörper desselben Fc-Typs. Gebundenes Immunadhäsin kann entweder in einem Puffer mit saurem pH (3,0 oder darüber) oder neutralem pH, der ein leicht chaotropes Salz enthält, effizient eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann zu Bildung eines Heterodimers führen, das > 95 % rein ist.
5. Verwendungsmöglichkeiten für einen heteromultimeren Antikörper mit gemeinsamen Leichtketten
Verschiedenste therapeutische Anwendungsmöglichkeiten für das Heteromultimer werden erwogen. Beispielsweise kann das Heteromultimer für eine umgeleitete Zytotoxizität (z.B. zur Abtötung von Tumorzellen), als Vakzine-Adjuvans, zur Anlieferung von thrombolytischen Wirkstoffen zu Gerinnseln, zur Überführung von enzymaktivierten Prodrugs an einer Zielstelle (z.B. einem Tumor), zur Behandlung von Infektionserkrankungen, zum Targeting von Immunkomplexen zu Zelloberflächenrezeptoren oder zur Anlieferung von Immuntoxinen zu Tumorzellen verwendet werden. Tumorgefäße-Targeting wurde beispielsweise durch Targeting eines Modell-Endothelantigens, eines Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplexes, mit einem Antikörper-Ricin-Immuntoxin erreicht (F.J. Burrows und P.E. Thorpe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8996–9000 (1993)). Eine deutlich höhere Wirksamkeit wurde durch die Kombination des Anti-Endothel-Immuntoxins mit einem zweiten Immuntoxin erreicht, das gegen die Tumorzellen selbst gerichtet war (F.J. Burrows und P.E. Thorpe, w.o. (1993)). Vor kurzem wurde ein Gewebefaktor erfolgreich auf Tumorgefäße gerichtet, indem ein bispezifischer Antikörper verwendet wurde, der eine lokale Thrombose auslöste, die in einer signifikanten Anti-Tumor-Wirksamkeit resultierte (X. Huang et al., Science 275, 547–550 (1997)). Außerdem wurde bispezifische Diabodies erfolgreich zur Steuerung von zytotoxischen T-Zellen verwendet, um Target-Brust-Tumorzellen und B-Zell-Lymphomzellen in vitro abzutöten (Z. Zhu et al., Bio/Technology 14, 192–196 (1996); und P. Holliger et al., Protein Engin. 9, 299–305 (1996)).
Therapeutische Formulierungen des Heteromultimers werden für die Lagerung vorbereitet, indem das Heteromultimer mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren vermischt werden (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol, Hrsg. (1980)), und zwar in Form eines gefriergetrockneten Kuchens oder einer wässrigen Lösung. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind in den eingesetzten Konzentrationen nicht toxisch für den Rezipienten und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptid mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide oder andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Das Heteromultimer kann auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation (z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacrylat]mikrokapseln) hergestellt werden, in kolloidalen Arzneimittelverabreichungssystemen (z.B. Liposomen, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, w.o., offenbart.
Das Heteromultimer, das zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden soll, muss steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht werden, und zwar vor oder nach dem Gefriertrocknen und der Wiederherstellung. Das Heteromultimer wird normalerweise in gefriergetrockneter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Heteromultimer-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gegeben, beispielsweise in einen Beutel für intravenöse Lösungen oder in eine Phiole mit einem Stöpsel, der mithilfe einer Nadel für subkutane Injektionen durchstochen werden kann.
Das Heteromultimer wird auf herkömmlichem Wege verabreicht, beispielsweise durch Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg, oder durch Depotsysteme, wie sie nachstehend beschrieben sind. Das Heteromultimer wird kontinuierlich durch Infusion oder durch Bolusinjektion verabreicht.
Geeignete Beispiele für Depotpräparate umfassen halbdurchlässige Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, die das Protein enthalten, wobei die Matrizes in Form von Formteilen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Depotmatrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie sie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben wurden, oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere aus L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., w.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure- Copolymere, wie z.B. Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokugeln aus einem Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.998 ).
Während Polymere, wie beispielsweise Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen über 100 Tage lang ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über einen kürzeren Zeitraum frei. Wenn eingekapselte Proteine längere Zeit im Körper bleiben, können sie denaturieren oder aggregieren, da sie Feuchtigkeit bei 37°C ausgesetzt werden, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und zu möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Je nach beteiligtem Mechanismus können zweckmäßige Strategien zur Proteinstabilisierung entworfen werden. Wenn sich beispielsweise der Aggregationsmechanismus als Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thiodisulfid-Austausch herausstellt, kann eine Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Gefriertrocknung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung von geeigneten Additiven und Entwicklung von spezifischen Polymermatrix-Zusammensetzungen erreicht werden.
Depot-Heteromultimer-Zusammensetzungen umfassen außerdem liposomal eingeschlossenes Heteromultimer. Liposome, die ein Heteromultimer enthalten, werden durch allgemein bekannte Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; japanische Patentanmeldung 83–118008; US-Patent Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324 . Normalerweise sind die Liposome vom kleinen (etwa 200–800 Angström) einschichtigen Typ, worin der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der gewählte Anteil je nach optimaler Heteromultimer-Therapie angepasst wird.
Eine effektive Menge Heteromultimer, die therapeutisch eingesetzt werden kann, hängt beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab. Demgemäß muss der Therapeut die Dosierung titrie ren und den Verabreichungsweg so modifizieren, dass er die optimale therapeutische Wirkung erzielt. Eine typische Tagesdosis kann von etwa 1 μg/kg bis zu 10 mg/kg oder mehr betragen, je nachdem, wie die oben genannten Faktoren aussehen. Typischerweise verabreicht der Arzt das Heteromultimer solange, bis eine Dosis erreicht ist, die den gewünschten Effekt ergibt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mithilfe herkömmlicher Tests überwacht werden.
Die hierin beschriebenen Heteromultimere können auch in Enzymimmuntests verwendet werden. Um dies zu erreichen, kann ein Arm des Heteromultimers so aufgebaut sein, dass er an ein spezifisches Epitop auf dem Enzym bindet, sodass die Bindung keine Enzymhemmung verursacht, und der andere Arm des Heteromultimers kann so aufgebaut sein, dass er an die immobilisierende Matrix bindet; um eine hohe Enzymdichte an der gewünschten Stelle sicherzustellen. Beispiele für solche diagnostischen Heteromultimere umfassen jene mit einer Spezifität für IgG sowie Ferritin und solche, die beispielsweise Bindespezifitäten für Meerrettichperoxidase (HRP) sowie ein Hormon aufweisen.
Die Heteromultimere können zur Verwendung in Zwei-Stellen-Immuntests bestimmt sein. Beispielsweise werden zwei bispezifische Heteromultimere hergestellt, die an zwei separate Epitope auf dem Analyt-Protein binden – ein Heteromultimer bindet den Komplex an eine unlösliche Matrix, das andere bindet ein Indikatorenzym.
Heteromultimere können auch zur In-vitro- oder In-vivo-Immundiagnose von verschiedenen Krankheiten, wie z.B. Krebs, verwendet werden. Um diese diagnostische Verwendung zu vereinfachen, kann ein Arm des Heteromultimers so aufgebaut sein, dass er an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, und der andere Arm kann einen detektierbaren Marker (z.B. einen Chelatbildner, der ein Radionuclid bindet) binden. Ein Heteromultimer mit Spezifitäten für das tumorassoziierte Antigen CEA sowie ein zweiwertiges Hapten können beispielsweise zur Abbildung von kolorektalen und Thyroid-Karzinomen eingesetzt werden. Andere nichtspezifische diagnostische Verwendungen des Heteromultimers sind für Fachleute offensichtlich.
Bei diagnostischen Anwendungen wird typischerweise zumindest ein Arm des Heteromultimers direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Die detektierbare Gruppierung kann jede beliebige sein, die zur direkten oder indirekten Erzeugung eines detektierbaren Signals fähig ist. Die detektierbare Gruppierung kann beispielsweise ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I; eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase (HRP), sein.
Jedes auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zur separaten Konjugation des Heteromultimers an die detektierbare Gruppierung kann verwendet werden, einschließlich der von Hunter et al., Nature 144, 495 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 129 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cythochem. 30, 407 (1982), beschriebenen Verfahren.
Die Heteromultimere der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwich-Tests und Immunfällungstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC Press, Inc. (1987).
Kompetitive Bindungstests basieren auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Analyten der zu prüfenden Probe um die Bindung mit einer begrenzten Menge Heteromultimer zu konkurrieren. Die Analytenmenge in der Probe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an das Heteromultimer gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge des Standards, der gebunden wird, zu vereinfachen, sind die Heteromultimere im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenz nicht gelöst, sodass der Standard und der Analyt, die an die Heteromultimere gebunden werden, leicht von dem Standard und vom Analyten getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
Die Heteromultimere sind vor allem für Sandwich-Tests geeignet, welche die Verwendung von zwei Molekülen umfassen, die jeweils zur Bindung unterschiedlicher immunogener Abschnitte oder Epitope der zur detektierenden Probe fähig sind. In einem Sandwich-Test ist der Analyt der zu prüfenden Probe durch einen ersten Arm des Heteromultimers gebunden, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, wonach der zweite Arm des Heteromultimers an den Analyten bindet, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Arm des Heteromultimers kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden (direkter Sandwich-Test) oder unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwich-Test). Eine Art des Sandwich-Tests ist beispielsweise ein ELISA-Test, bei dem die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
Nachstehend sind Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung angeführt. Die Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und keineswegs der Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die hierin vor- und nachstehend zitiert sind, sind durch Verweis in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.
BEISPIELE
Eine Strategie zur Herstellung von Fc-hältigen bsAk wird präsentiert (1C). In dieser Strategie stellten die Erfinder durch Gentechnik die C_H3-Domäne von Antikörper-Schwerketten her, sodass sie heterodimerisierten, aber nicht homodimerisierten. Dies wurde erreicht, indem zwischen einzelnen Ketten Disulfidbindungen in der C_H3-Domäne gebildet wurden, und zwar zusammen mit sterisch komplementären Mutationen, die durch rationales Design (Ridgway et al., w.o. (1996)) und Phagendisplay-Selektion, wie sie hierin beschrieben ist, erhalten wurden. Die Verwendung einer einzelnen Leichtkette für beide Antigen-Bindespezifitäten umgeht das Problem von Leichtketten-Fehlpaarungen (1A–1C). Antikörper mit der gleichen Leichtkette konnten leicht durch Panning einer sehr großen menschlichen scFc-Bibliothek isoliert werden (T.J. Vaughan et al., w.o. (1996)).
Beispiel 1: Bildung von Protuberanz-in-Hohlraum-Heteromultimer-Immunadhäsinen
Die C_H3-Schnittstelle zwischen den humanisierten Anti-CD3/CD4-IgG-Chimären, die von Chamow et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994), früher beschrieben wurde, wurde gentechnisch hergestellt, um den Prozentsatz an Heteromultimeren zu maximieren, die gewonnen werden konnten. Protuberanz-in-Hohlraum-Wildtyp-C_H3-Varianten wurden aufgrund ihrer Fähigkeit verglichen, die Bildung einer humanisierten Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre (Ak/Ia) Anti-CD3/CD4-IgG zu steuern.
Somit wurden durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von fehlgepaarten Oligonucleotiden in der C_H3-Domäne der schweren Kette des humanisierten Anti-CD3-Antikörpers und in CD4-IgG Mutationen erzeugt (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367 (1987), und P. Carter, in Mutagenesis: A Practial Approach, S. 1–25, M.J. McPherson, Hrsg., IRL Press Oxford, GB (1991)) und durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung verifiziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)). Siehe Tabelle 3.
TABELLE 3
Der Rest T366 befindet sich in Wasserstoff-Bindedistanz von Rest Y407 auf der Partner-C_H3-Domäne. Tatsächlich besteht der wichtigste intermolekulare Kontakt vom Rest T366 zum Rest Y407 und umgekehrt. Ein Protuberanz-in-Hohlraum-Paar wurde geschaffen, indem diese Reste mit den reziproken Mutationen von T366Y in einer C_H3-Domäne und Y407T in der Partnerdomäne invertiert wurden, wodurch das Seitenkettenvolumen an der Schnittstelle beibehalten wurde. Mutationen werden durch den Wildtyp-Rest gefolgt von der Position gemäß dem Kabat-Nummerierungssystem (Kabat et al., w.o. (1991)) bezeichnet, worauf der Ersatzrest als Einbuchstabencode folgt. Multiple Mutationen werden durch Auflistung einzelner Komponentenmutationen bezeichnet, getrennt durch einen Doppelpunkt.
Phagemiden, die für Anti-CD3-Leicht- (L-) und -Schwer- (-H-) Ketten-Varianten kodieren (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217 (1992), und Rodrigues et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7, 45 (1992)) wurden zusammen mit einem für eine CD4-IgG-Variante kodierenden Phagemid (Byrn et al., Nature 344, 667 (1990)) wie oben beschrieben (Chamow et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994)) in menschliche embryonale Nierenzellen, 293S, contransfiziert. Die Gesamtmenge an transfizierter Phagemid- DNA wurde fixiert, während das Verhältnis zwischen unterschiedlichen DNAs variiert wurde, um die Ausbeute der Ak/Ia-Chimäre zu maximieren. Das Verhältnis (bezogen auf die Masse) von Ia:Schwerkette:Leichtketten-Input-DNA (insgesamt 15 μg) wurde wie folgt variiert: 8:1:3, 7:1:3, 6:1:3, 5:1:3, 4:1:3, 3:1:3, 1:0:0, 0:1:3.
Die Produkte wurden vor der Analyse durch SDS-Page unter Verwendung eines Staphylokokkus-Protein-A (ProSep A, BioProcessing Ltd., GB) affinitätsgereinigt, gefolgt von einer Scanning-LASER-Densitometrie. Überschüssige Leicht- oder Schwerketten-DNA wurde verwendet, um eine Einschränkung der Leichtkette zu vermeiden. Die Identität der Produkte wurde durch Elektroblotten auf eine PVDF-Membran verifiziert (Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, 10035 (1987)), gefolgt von einer aminoterminalen Sequenzierung.
Eine Cotransfektion von Phagemiden für eine Leichtkette zusammen mit jenen für eine Schwerkette und Ia, die Wildtyp-C_H3 inkorporierte, resultierte wie erwartet in einem Gemisch aus einer Ak/Ia-Chimäre, IgG und Ia-Homodimerprodukten (Chamow et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994)). Je größer der Anteil der Input-DNA, die für eine Antikörper-Schwer- und -Leichtkette oder Ia kodiert, desto größer der Anteil entsprechender Homodimere, der gewonnen wird. In Input-DNA-Verhältnis von 6:1:3 zwischen Ia:H:L ergab 54,5 % Ak/Ia-Chimäre mit ähnlichen Anteil eines Ia-Homodimers (22,5 %) und IgG (23,0 %). Diese Verhältnisse stimmen gut mit jenen überein, die aufgrund der äquimolaren Expression der einzelnen Ketten, gefolgt von einer zufälligen Sortierung von Schwerketten erwartet wurden, und zwar ohne Beeinflussung durch das Analyseverfahren: 50 % Ak/Ia-Chimäre, 25 % Ia-Homodimer und 25 % IgG.
Im Gegensatz zu Ketten, die Wildtyp-C_H3 enthalten, wurden Ak/Ia-Chimären in Ausbeuten von bis zu 92 % von Cotransfektionen gewonnen, worin die Anti-CD3-Schwerkette und das CD4-IgG-Ia die Y407T-Hohlraum- bzw. die T366Y-Protuberanzmutationen enthielten. Ähnliche Ausbeuten an Antikörper/Immunadhäsin-Chimären wurden erhalten, wenn diese reziproken Mutationen mit der Protuberanz auf der Schwerkette und dem Hohlraum im Ia eingebaut wur den. In beiden Fällen war in der Kette, welche die Protuberanz, nicht aber den Hohlraum enthielt, ein Monomer vorhanden. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beziehen, glauben die Erfinder, dass die T366Y-Protuberanz für die Homodimerbildung störender ist als der Y407T-Hohlraum. Der Anteil eines Ak/Ia-Hybrids wurde durch die Steigerung der Größe von sowohl Protuberanz als auch Hohlraum (Ak T366W, Ia Y407A) nicht wesentlich verändert. Eine zweites Protuberanz-Hohlraum-Paar (Ak F405A, Ia T394W) ergab bis zu 71 % Ak/Ia-Chimären, wobei ein kleiner Anteil Ia-Input-DNA verwendet wurde, um die unerwartete Neigung der Ia-T394W-Protuberanz-Variante, zu homodimerisieren, auszugleichen. Eine Kombination der beiden unabhängigen Protuberanz-in-Hohlraum-Mutantenpaare (Ak T366Y:F405A, Ia T394W:Y407T) verbesserte die Ausbeute des Ak/Ia-Hybrids im Vergleich zu dem Paar Ak T366Y und Ia Y407T nicht.
Der Anteil einer Ak/Ia-Chimäre, die mit dem T366Y- und Y407T-Mutantenpaar erhalten wurde, war im getesteten Bereich praktisch unabhängig von der Menge Input-DNA. Außerdem konnten die kontaminierenden Spezies leicht durch Ionenaustauschchromatographie (0–300 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) auf einer Mono-S-HR-5/5-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) aus der Ak/Ia-Chimäre entfernt werden. Das lässt vermuten, dass unter Verwendung von stabilen Zelllinien die Herstellung von größeren Mengen Ak/Ia-Chimären möglich ist, worin die relativen Expressionswerte von Ak und Ia nicht so leicht manipuliert werden können wie in den vorübergehenden Expressionsystemen.
Es wird vermutet, dass die identifizierten Protuberanz-in-Hohlraum-Mutationen die Anwendungsmöglichkeiten von Fc-hältigen bsAk erweitern, indem die Komplexität des Produktgemischs, das aus zehn möglichen Hauptspezies erhalten wird (Suresh et al., Methods Enzymol. 121, 210 (1990)), auf vier oder weniger reduziert wird (1A–1B). Es ist zu erwarten, dass das T366Y- und Y407T-Mutantenpaar zur Herstellung von Heteromultimeren nützlich ist, die keine menschlichen IgG-Isotypen aufweisen (wie z.B. IgG₂, IgG₃ oder IgG₄), das T366 und Y407 vollständig konserviert sind und andere Reste an der C_H3-Domänen-Schnittstelle von IgG₁ stark konserviert sind.
Beispiel 2: Herstellung von nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindungen in heteromultimeren Immunadhäsinen
A. Design von C_H3-Zwischenketten-Disulfidbindungen
Drei Kriterien wurden verwendet, um Paare von Resten zur gentechnischen Herstellung einer Disulfidbindung zwischen Partner-C_H3-Domänen zu identifizieren: i) Der Cα-Abstand ist vorzugsweise ähnlich wie der in natürlichen Disulfidbindungen (5,0 bis 6,8 A) (N. Srinivasan et al., Int. J. Peptides Protein Res. 36, 147–155 (1990)). Abstände von bis zu 7,6 Å waren erlaubt, um eine Hauptkettenbewegung zu ermöglichen und die Unsicherheit der Atomlage in der Kristallstruktur mit geringer Auflösung einzubeziehen (Deisenhofer, Biochemistry 20, 2361–2370 (1981)). ii) Die Cα-Atome sollten auf unterschiedlichen Resten auf den beiden C_H3-Domänen sein. iii) Die Reste sind so positioniert, dass sie eine Disulfidbindung erlauben (N. Srinivasan et al., w.o. (1990)).
B. Modellierung von Disulfidbindungen
Disulfidbindungen wurden wie für humAb4D5-Fv (Rodrigues et al., Cancer Res. 55, 63–70 (1995)) unter Verwendung von Insight II 95.0 (Biosym/MSI) in menschlichem IgG₁-Fc modelliert (Deisenhofer, w.o.).
C. Konstruktion von C_H3-Varianten
Mutationen wurden durch ortsgerichtete Mutagenese in die C_H3-Domäne einer humanisierten Anti-CD3-Schwerkette oder ein CD4-IgG eingeführt (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367–382 (1987)), wobei die folgenden synthetischen Oligonucleotid verwendet wurden:
Y349C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGCAGGGTGCACACCTGTGG 3' (SEQ.-ID NR: 1)
S354C, 5' CTCTTCCCGACATGGGGGCAG 3' (SEQ.-ID NR: 2)
E356C, 5' GGTCATCTCACACCGGGATGG 3' (SEQ.-ID NR: 3)
E357C, 5' CTTGGTCATACATTCACGGGATGG 3' (SEQ.-ID NR: 4)
L351C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGACAGGTGTACAC 3' (SEQ.-ID NR: 5)
D399C, 5' GCCGTCGGAACACAGCACGGG 3' (SEQ.-ID NR: 6)
K392C, 5' CTGGGAGTCTAGAACGGGAGGCGTGGTACAGTAGTTGTT 3' (SEQ.-ID NR: 7)
T394C, 5' GTCGGAGTCTAGAACGGGAGGACAGGTCTTGTA 3' (SEQ.-ID NR: 8)
V397C, 5' GTCGGAGTCTAGACAGGGAGG 3' (SEQ.-ID NR: 9)
D399S, 5' GCCGTCGGAGCTCAGCACGGG 3' (SEQ.-ID NR: 10)
K392S, 5' GGGAGGCGTGGTGCTGTAGTTGTT 3' (SEQ.-ID NR: 11)
C231S:C234S 5' GTTCAGGTGCTGGGCTCGGTGGGCTTGTGTGAGTTTTG 3' (SEQ.-ID NR: 12)
Mutationen werden durch den Aminosäurerest und eine Zahl (Eu-Nummerierungsschema nach Kabat et al., w.o. (1991)), gefolgt von der Ersatzaminosäure bezeichnet. Multiple Mutationen werden durch die einzelnen Mutationen, getrennt durch einen Doppelpunkt bezeichnet. Mutanten wurden durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung unter Verwendung von Sequenase Version 2.0 (United States Biochemicals, Cleveland, OH, USA) verifiziert (Sauger et al., w.o. (1977)).
D. Zwischenketten-Disulfid fördert die Heterodimerbildung
Sechs Molekülpaare, die Zwischenketten-Disulfidbindungen in der C_H3-Domäne aufwiesen ("Disulfid-C_H3-Varianten"; v1-v6, Tabelle 4) wurden mit Elternmolekülen in Bezug auf ihre Fähigkeit verglichen, die Bildung eines Ak/Ia-Hybrids, Anti-CD3/CD4-IgG, zu steuern (Chamow et al., w.o. (1994)). Plasmide, die für CD4-IgG- und Anti-CD3-Schwerkettenvarianten kodierten, wurden in 293S-Zellen cotransfiziert, und zwar zusammen mit einem Überschuss an Plasmid, das für die Anti-CD3-Leichtkette kodierte. Die Heterodimer-Ausbeute wurde durch Transfektion mit verschiedenen Ia:H-Kette:L-Ketten-DNA-Verhältnissen optimiert. Die Ak/Ia-Heterodimer-, IgG- und Ia-Homodimer-Produkte wurden unter Verwendung von Staphylokokken-Protein-A affinitätsgereinigt und durch SDS-PAGE und Laser-Scanning-Densitometrie quantifiziert (Ridgway et al., w.o. (1996)).
Jedes Disulfid-C_H3-Paar ergab drei Hauptspezies, ähnlich den Elternmolekülen. Ein Ak/Ia-Heteromdimer von Disulfid-C_H3-Varianten wurden jedoch in seiner elektrophoretischen Mobilität verschoben, in Übereinstimmung mit der Bildung eines Zwischen ketten-Disulfids in der C_H3-Domäne. Weitere Beweise für die Bildung einer Disulfidbindung wurde durch die Zwischenketten-Disulfide im Gelenk bereitgestellt. Kovalent gebundene Ak/Ia-Hybride wurden durch SDS-Page für Disulfid-C_H3-Varianten nachgewiesen, nicht jedoch für Moleküle mit Wildtyp-C_H3-Domänen, worin die Gelenk-Cysteine zu Serin mutiert waren. Disulfid-C_H3-Varianten wurden hergestellt und als Y349C/S354'C, Y349C/E356'C, Y349C/E357'C, L351C/E354'C, T394C/E397'C und D399C/K392C bezeichnet. Nur eine Variante (D399C/K392'C) führte zu einer wesentlichen Erhöhung der Ausbeute an Ak/Ia-Hybriden im Vergleich zum Wildtyp (76 % bzw. 52 %), wie durch eine SDS-PAGE-Analyse der Varianten bestimmt wurde. Mutationen werden durch den Aminosäurerest und eine Zahl (Eu-Nummerierungsschema nach Kabat et al., w.o. (1991)), gefolgt von der Ersatzaminosäure bezeichnet. Mutationen in der ersten und zweiten Kopien von C_H3 kommen vor bzw. nach dem Schrägstrich. Reste in der zweiten Kopie von C_H3 werden mit einem Strich (') gekennzeichnet. Diese Verbesserung reflektiert anscheinend eher die Disulfidbindungsbildung, und nicht den Ersatz der Reste K392 und D399, da die Mutationen K392S/D399'S beide eine ähnliche Ak/Ia-Ausbeute und eine ähnliche elektrophoretische Ak/Ia-Mobilität in Bezug auf den Wildtyp ergaben. Homodimere wanderten ähnliche wie jene mit Wildtyp-Fc-Domänen, was die präferenzielle, gentechnisch erzeugte Zwischenketten-Disulfidbindungsbildung in der C_H3-Domäne von Heterodimeren belegt. Alle Disulfid-C_H3-Varianten wurden in 293S-Zellen im etwa gleichen Ausmaß exprimiert wie die Elternmoleküle.
E. Disulfide kombiniert mit Protuberanz-in-Hohlraum-Herstellung erhöht die Heterodimer-Ausbeute auf 95 %
Das beste Disulfidpaar erhöhte den Prozentsatz des Heterodimers auf 76 %, und die Protuberanz-in-Hohlraum-Strategie erhöhte den Prozentsatz des Heterodimers aus 87 % (Tabelle 4; siehe auch Ridgway et al., w.o. (1996)). Diese beiden Strategien basieren auf unterschiedlichen Prinzipien, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines Heterodimers zu erhöhen. Deshalb kombinierten die Erfinder die beiden Strategien und erwarteten eine weitere Erhöhung der Heterodimer-Ausbeute. Zwei der modellierten Disulfide, die L351C oder T392C enthielten, könnten möglicherweise Disulfid-gebundene Homodimere sowie Disulfid-gebundene Heterodimere bilden (L351C/S354'C und T394C/V397'C), wodurch ihre Nützlichkeit gesteigert wird. Die restlichen vier Disulfidpaare wurden in ein phagenselektiertes Heterodimer (Varianten v9-v16) eingebaut und auf die Heterodimer-Ausbeute untersucht (Tabelle 4). Ausbeuten von etwa 95 % Heterodimer wurden erhalten. Wiederum wies das Heterodimer eine elektrophoretische Mobilitätsverschiebung im Vergleich zum Wildtyp und v8-Varianten auf.
TABELLE 4 Ausbeute an Heterodimeren von C_H3-Varianten
Beispiel 3: Strukturgeleitete Phagendisplay-Selektion für komplementäre Mutationen, die eine Protein-Protein-Wechselwirkung in Heteromultimeren fördern
Die folgende Strategie ist für die Auswahl von komplementären Mutationen in Polypeptiden nützlich, die an einer Schnittfläche über eine Multimerisations-Domäne wechselwirken. Die Strategie wird nachstehend in ihrer Anwendung zur Auswahl von komplementären Protuberanz-in-Hohlraum-Mutationen erläutert. Das Beispiel dient jedoch nicht der Einschränkung, und die Strategie kann auch zur Auswahl von Mutationen verwendet werden, die zur Bildung von nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindungen, Leucin-Zipper-Motiven, hydrophoben Wechselwirkungen, hydrophilen Wechselwirkungen und dergleichen geeignet sind.
A. Phagendisplay-Selektion
Eine Phagendisplay-Strategie zur Auswahl von stabilen C_H3-Heterodimeren wurde entwickelt und ist in 2 schematisch dargestellt. Die Auswahl basiert auf der Verwendung einer Protuberanz-Mutante, T366W (Ridgway et al., w.o. (1996)), die an ein Peptid-Flag fusioniert ist (gD-Peptid-Flag, beispielsweise, L.A. Lasky und D.J. Dowbenko, DNA 3, 23–29 (1984); und P.W. Bergman et al., Science 227, 1490–1492 (1985)) und mit einer zweiten Kopie von C_H3 coexprimiert wird, die an ein M13-Gen-III-Protein fusioniert ist. Eine Bibliothek von Hohlraum-Mutanten wurde in dieser zweiten Kopie von C_H3 geschaffen, und zwar durch Randomisierung der Reste, die der Protuberanz auf der ersten C_H3-Domäne am nächsten lagen. Stabile Phagendisplay-C_H3-Heterodimere wurden dann unter Verwendung eines Anti-Flag-Ak eingefangen.
Eine C_H3-Phagendisplay-Bibliothek aus 1,1 × 10⁵ unabhängigen Klonen wurde durch Ersatz eines Segments des natürlichen C_H3-Gens mit einem PCR-Fragment erzeugt. Das Fragment wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Primern erhalten, um die Positionen 366, 368 und 407 unter Verwendung von Standardverfahren zu randomisieren.
Nach 2 bis 5 Selektionsdurchgängen betrug der Anteil aus Klonen voller Länge 90 %, 60 %, 50 % bzw. 10 %, wie durch eine Agarosegelelektrophorese einsträngiger DNA gezeigt wurde. Phagemide, die Klone voller Länge enthielten, wurden nach 5 Selektionsdurchgängen gelgereinigt. Zweitausend Transformanten wurden nach einer Retransformierung von XL1-BLUE^TM-Zellen (Strategene) erhalten.
Durchschnittlich > 10⁶ Kopien jedes Klons wurden pro Panning-Durchgang verwendet. So war die Wahrscheinlichkeit groß, dass zahlreiche Kopien jedes Klons in der Bibliothek zur Selektion zur Verfügung standen, obwohl einige Deletionsmutanten während des Pannings auftraten.
Nach 7 Panning-Durchgängen näherte sich die C_H3-Mutante einer Consensus-Aminosäuresequenz an den randomisierten Resten. Praktisch alle Klone wiesen Serin oder Threonin am Rest 366 auf, was auf eine sehr starke Präferenz für β-Hydroxyl an dieser Stelle hinweist. Eine starke Präferenz für hydrophobe Reste wurde bei den Resten 368 und 407 beobachtet, wobei Valin und Alanin vorherrschten. Sechs unterschiedliche Aminosäurekombinationen wurden zumindest zweimal gefunden, einschließlich der Dreichfachmutante T366S:L368A:Y407V, die elf Mal gefunden wurde. Keine dieser Phagenselektanden wies die gleiche Sequenz auf wie ein schon früher hergestelltes Heterodimer, T366W/Y407'A (J.B.B. Ridgway et al., w.o. (1996)). Die Phagenselektanden können weniger dicht gepackt sein als das Wildtyp-C_H3-Homodimer, wie durch eine Reduktion im gesamten Seitenkettenvolumen der Domänen-Schnittstellen-Reste um 40–80 Å³ gezeigt wurde.
C_H3-Varianten, für die das Expressionsplasmid pAK19 kodiert (Carter et al. (1992)), wurden in den E.-coli-Stamm 33B6 eingeführt, exprimiert und von E. coli sekretiert, das in einem Fermenter mit hoher Zelldichte gezüchtet worden war. Die durch DEAE-Sepharose-FF-, ABx- und Resource-S-Chromatographie gereinigte T366S:L368A:Y407V-Mutante ergab nach einer SDS-PAGE eine einzelne Hauptbande. Andere C_H3-Varianten wurden mit ähnlicher Reinheit erhalten. Die Molekularmasse von Wildtyp-C_H3 und T366S:L368A:Y407V-, T366W- und Y407A- Varianten, bestimmt durch hochauflösende Elektrospray-Massenspektrometrie, war wie erwartet.
B. Stabilität von phagenselektierten Heterodimeren
Die Stabilität von C_H3-Heterodimeren wurde zuerst durch Titrieren eines entsprechenden Phagen mit Guanidinhydrochlorid beurteilt, gefolgt von einer Verdünnung und Quantifizierung von restlichem Heterodimer durch enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA). Der Guanidinhydrochlorid-Denaturierungstest mit C_H3-Phage stellt ein Mittel zum raschen Screenen von Selektanden dar.
Ein Phage wurden nach 7 Selektionsdurchgängen aus einzelnen Klonen hergestellt, und auch aus dem Kontrollvektor pRA1. Kurz gesagt wurden Phagemiden in XL1-BLUE^TM verwendet, um 25 ml LB-Kulturlösung, die 50 μg/ml Carbenicillin und 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, in Gegenwart von 10⁹ pfu/ml M13K07 zu inokulieren, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (6.000 g, 10 min, 4°C) pelletiert. Der Phage wurde aus dem Überstand durch Fällung mit 5 ml 20 % (Gew./Vol.) PEG, 2,5 M NaCl, gefolgt von einer Zentrifugation (12.000 g, 10 min, 4°C) gewonnen und in 1 ml PBS resuspendiert. 180 μl 0–6 M Guanidinhydrochlorid in PBS wurden zu 20 μl Phagenpräparat zugesetzt und 5,0 min lang bei etwa 25°C inkubiert. Aliquoten (20 μl) jeder Phagenprobe wurden dann 10fach mit Wasser verdünnt. Die Gegenwart eines C_H3-Heterodimers wurde durch ELISA unter Verwendung von 5B6-beschichteten Platten bestimmt, und der Phage wurde mit einem polyklonalen Anti-M13-Ak detektiert, der an Meerrettichperoxidase konjugiert war, und zwar unter Verwendung von o-Phenylendiamin als Substrat. Die Reaktion wurden durch den Zusatz von 50 μl 2,5 M H₂SO₄ gequencht, und das Absorptionsvermögen wurde bei 492 nm gemessen. Die Absorptionsdaten wurden über die Guanidinhydrochlorid-Konzentration während des Schmelzens geplottet und durch die nichtlineare Methode der kleinsten Quadrate unter Verwendung von Kaleidagraph 3.0.5 (Synergy Software) in ein 4-Parameter-Modell eingepasst.
Das am häufigsten gefundene Heterodimer, T366W/T366'S:L368'A:Y407'V weist eine ähnliche Stabilität auf wie andere phagenselektierte Heterodimere. Dieses phagenselektierte Heterodimer ist deutlich stabiler als das entworfene Heterodimer T366W/Y407'A, aber weniger stabil als Wildtyp-C_H3. Alle C_H3-Varianten, sowohl einzeln als auch in Kombination, stellten sich in einer Größenausschlusschromatographie unter den Bedingungen, unter denen die gleichen Molekül durch Kalorimetrie untersucht wurden (1,75 mg/ml, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)), als Dimere heraus. Die einzige Ausnahme war die T366S:L368A:Y407V-Mutante alleine, die eine etwas kürzere Rückhaltezeit als C_H3-Dimere aufwies.
Ein 1:1-Gemisch aus den Mutanten T366W, Protuberanz, und T366S:L368A:y407V, Hohlraum, schmilzt mit einer einzigen Übergang bei 69,4°C, was im Einklang mit dem Untereinheitenaustausch und der Bildung eines stabilen Heterodimers steht. Im Gegensatz dazu ist das T366W-Protuberanz-Homodimer viel weniger stabil als das T366W/T366'S:L368'A:Y407'V-Protuberanz-in-Hohlraum-Heterodimer (ΔT_m = –15,0°C). Die T366S:L368A:Y407V-Hohlraummutante alleine neigt dazu, beim Erhitzen zu aggregieren, und durchläuft keinen glatten Schmelzübergang.
Die entworfene Hohlraum-Mutante Y407A schmilzt bei 58,8°C und 65,4°C, in Abwesenheit bzw. Gegenwart der T366W-Protuberanz-Mutante. Das steht im Einklang mit dem Untereinheitenaustausch und der Bildung eines T366W/Y407'A-Heterodimers, das stabiler ist als T366W- (ΔT_m = 11,0°C) oder Y407A- (ΔT_m = 6,6°C) Homodimere. Das phagenselektierte Heterodimer T366W/T366'S:L368'A:Y407'V ist stabiler als das entworfene Heterodimer T366W/Y407'A (ΔT_m = 4,0°C), aber weniger stabil als das Wildtyp-C_H3-Homodimer (ΔT_m = –11,0°C).
C. Multimerisation eines phagenselektierten Antikörper-Immunadhäsins (Ak/Ia) in vivo
Phagenselektierte und entworfene C_H3-Mutanten wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit verglichen, die Bildung eines Ak/Ia-Hybrids, Anti-CD3/CD4-IgG, in vivo zu steuern (Chamow et al., w.o. (1994)). Dies wurde durch Coexpression von humanisierten Anti-CD3-Leicht- (L-) und -Schwerketten zusammen mit CD4-IgG erreicht. Die Bildung von Heterodimeren und Homodimeren wurde durch Protein-A-Reinigung, gefolgt von einer SDS-PAGE und Laser-Scanning-Densitometrie beurteilt (Ridgway et al., w.o. (1996)). Vergleichbare Ausbeuten des Ak/Ia-Hybrids wurden durch Cotransfektionen erhalten, bei denen die Anti-CD3-Schwerkette die entworfene Protuberanz-Mutation, T366W, enthielt und das Ia entweder die phagenselektierten Mutationen, T366S:L368A:Y407V, oder entworfene Hohlraum-Mutationen, Y407A, enthielt (3).
Phagenselektierte und entworfene C_H3-Mutanten wurden dann auf ihre Neigung beurteilt, Homodimere zu bilden. Die Protuberanzen-Mutation, T366W, ist anscheinend sehr nachteilig für die Homodimerisierung, da eine Cotransfektion von entsprechenden Antikörper-Schwer- und -Leichtketten zu einem Überschuss an HL-Monomeren (können IgG ohne Disulfidbindung umfassen) im Vergleich zu IgG führt. Im Gegensatz dazu befinden sich im gleichen Antikörper mit Wildtyp-C_H3-Domänen IgG, aber keine HL-Monomere. Die Hohlraum-Mutationen T366S:L368A:Y407V wirken sich etwas negativ auf die Homodimerisierung aus, da eine Transfektion des entsprechenden Phagemids zu einem Gemisch aus hauptsächlich Ia-Dimeren mit einigen Ia-Monomeren führt. Die Hohlraum-Mutation Y407A wirkt sich nur minimal nachteilig auf die Homodimerisierung aus, wie durch die Gegenwart von Ia-Dimeren, aber keiner Ia-Monomere nach der Transfektion des entsprechenden Phagemids nachgewiesen wurde.
Die hierin beschriebene Phagendisplay-Selektionsstrategie ermöglicht eine Selektion zur Bevorzugung von C_H3-Mutanten, die stabile Heterodimere bilden, und zur Ausschließung von Mutanten, die stabile Homodimere bilden. Die Gegenselektion zur Ausschließung von Homodimeren findet statt, weil "freie" C_H3-Mutanten mit der Flag-C_H3-Knobmutante um die Bindung an ein verfügbares C_H3-Mutanten-Gen-III-Fusionsprotein konkurrieren. Die freien C_H3-Mutanten entstehen als Ergebnis der Amber-Mutation zwischen dem natürlichen C_H3-Gen und einem M13-Gen III. In einem Amber-Suppressor-Wirt, wie z.B. XL1-Blue, werden sowohl das C_H3-Gen-III-Fusionsprotein als auch entsprechendes freies C_H3 sekretiert.
Guanidinhydrochlorid-Denaturierung stellte sich als nützliches Werkzeug zum Vorscreenen der Stabilität von C_H3-Heterodimeren auf einem Phagen heraus. Ein Phage behält Infektiosität für E. coli auch bei, nachdem er 5 M Guanidinhydrochlorid ausgesetzt wurde (Figini et al., J. Mol. Biol. 239, 68–78 (1994)). Somit kann Guanidin auch zur Steigerung der Stringenz der Mutantenselektion nützlich sein.
Rationales Design und Screenen von Phagendisplay-Bibliotheken sind komplementäre Ansätze zur Ummodellierung einer Domänen-Schnittstelle eines Homodimers, um eine Heterodimerisierung zu fördern. Im Falle von C_H3-Domänen identifizierten entworfene Mutanten Domänen-Schnittstellen-Reste, die zur Förderung der Heterodimerisierung eingesetzt werden konnten. Phagendisplay wurde dann verwendet, um Permutationen aus 3 Resten zu suchen, die sich neben einer fixierten Protuberanz befanden, und zwar für Kombinationen, die am effizientesten Heterodimere bildeten. Phagenselektanden sind nützlich zur Förderung eines weiteren rationalen Redesigns der Domänen-Schnittstelle, während die hierin beschriebene Phagen-Selektionsstrategie ihre Nützlichkeit bei der Ummodellierung von Protein-Protein-Schnittflächen zeigt.
Beispiel 4: Herstellung und Anordnung von heteromultimeren Antikörpern oder Antikörper/Immunadhäsinen mit gemeinsamen Leichtketten
Das folgende Beispiel demonstriert die Herstellung eines heteromultimeren bispezifischen Antikörpers mit einer gemeinsamen Leichtkette gemäß der Erfindung und die Fähigkeit dieses Antikörper, seine Target-Antigene zu binden.
A. Identifikation von Antikörpern mit der gleichen Leichtkette: Vergleich von Antikörper-Bibliotheken gegen elf Antigene
Eine große menschliche Einketten-Fv- (scFv-) Antikörper-Bibltiothek (Vaughan et al., w.o. (1996)) wurde einem Panning für Antikörper unterzogen, die für elf Antigene spezifisch waren, einschließlich AxI (Human-Rezeptor-Tyrosinkinasen-ECD), GCSFR (Human-Granulozyten-Koloniestimulationsfaktor-ECD), IgE (Mäuse-IgE), IgE-R (Human-IgE-Rezeptor-α-Kette), MPL (Human-Thrombopoietin-Rezeptor-Tyrosinkinasen-ECD), MusK (Human-muskelspezifische-Rezeptor-Tyrosinkinasen-ECD), NpoR (Human-Orphan-Rezeptor-NpoR-ECD), Rse (Human-Rezeptor-Tyrosinkinase, Rse, ECD), HER3 (Human-Rezeptor-Tyrosinkinasen-HER3/c-erbB3ECD), Ob-R (Human-Leptin-Rezeptor-ECD) und VEGF (menschlicher Gefäßendothel-Wachstumsfaktor), worin ECD für die extrazelluläre Domäne steht. Die Nucleotid-Sequenz-Daten für scFv-Fragmente von Populationen von Antikörpern, die gegen jedes Antigen gebildet wurden, wurde translatiert, um entsprechende Proteinsequenzen abzuleiten. Die V_L-Sequenzen wurden dann mithilfe des Programms "align" mit dem Algorithmus nach Feng und Doolittle (1985, 1987, 1990) verglichen, um die prozentuelle Identität zwischen allen paarweisen Kombinationen von Ketten zu berechnen (D.F. Feng und R.F. Doolittle, J. Mol. Evol. 21, 112–123 (1985); D.F. Feng und R.F. Doolittle, J. Mol. Evol. 25, 351–360 (1987); und D.F. Feng und R.F. Doolittle, Methods Enzymol. 183, 375–387 (1990)). Die prozentuellen Sequenzidentitätsergebnisse der paarweisen Leichtketten-Aminosäure-Sequenzvergleiche wurden im Matrixformat angeordnet (siehe Anhang).
Bei den meisten paarweisen Vergleichen wurde zumindest eine gemeinsame Leichtketten-Sequenz gefunden. Tabelle 5 zeigt einen Vergleich zwischen den V_L-Ketten, der die Häufigkeiten von scFv zeigt, die identische Leichtketten (100 % Identität) aufweisen, wie durch eine Anordnung von 117 V_L-Aminosäuresequenzen bestimmt wurde. Der Eintrag 4/9 (HER3 × Ob-R, in einem schwarzen Kasten hervorgehoben) bedeutet beispielsweise, dass 4 HER3 bindende Klone gefunden wurden, die ihre V_L-Sequenz mit einem oder mehreren Anti-Ob-R-Klonen teilten, während 9 den Ob- R-Teil bindende Klone ihre V_L-Sequenz mit einem oder mehreren Anti-HER3-Klonen teilten. Die Einträge auf der Diagonalen stellen die Anzahl an Antikörperklonen innerhalb einer Population dar, die eine V_L-Sequenz mit einem oder mehreren Klonen in der Population teilen. Eine Untersuchung der MPL-Klone zeigte beispielsweise 5 Klone auf, die ihre V_L-Sequenz mit einem oder mehreren MPL-Klonen teilten. In den Fällen, in denen keine gemeinsame Leichtkettensequenz vorhanden war, wie beispielsweise bei (IgE × AxI) oder (NpoR × IgE-R), war die Anzahl an Fragmenten, die für zumindest eine gemeinsame Spezifität verglichen wurden, sehr gering (5 oder weniger). Angesichts der Anzahl an gefundenen gemeinsamen Leichtketten ist es wahrscheinlich, dass bei jedem V_L-Vergleich gemeinsame Leichtketten gefunden werden können, wenn eine ausreichende Zahl an Klonen verglichen wird.
Die Aminosäuresequenzen von Leichtketten wurden untersucht, um die Positionen von Unterschieden der Aminosäurereste zu bestimmen, wenn die Sequenzidentität in Bezug auf eine gewählte gemeinsame Leichtkette 98 % und 99 % betrug. 4 zeigt einen Vergleich der V_L-Sequenzen von acht verschiedenen Antikörpern mit Spezifitäten für AxI (Klon AxI.78), Rse (Klone Rse.23, Rse.04, Rse.20 und Rse.15), IgER (Klon IgER.MAT2C1G11), Ob-R (Klone obr.4) und VEGF (Klone vegf.5). Die Position der antigenbindenden CDR-Reste gemäß einer Sequenzdefinition (G.A. Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) sind durch Unterstreichungen bzw. # hervorgehoben. Leichtketten-Reste, die sich von der AxI.78-Sequenz unterscheiden, sind doppelt unterstrichen. Von den 9 verglichenen Leichtketten waren 6 identisch. Die Leichtketten von Rse.04 und obr.4 (etwa 99 % Sequenzidentität) unterscheiden sich durch einen Rest außerhalb der antigenbindenden CDRs. Die Leichtkette von Rse.20 (etwa 98 % Sequenzidentität) unterschiedet sich durch zwei Reste außerhalb der antigenbindenden CDRs. Die Aminosäurerest-Änderungen können sich leicht oder gar nicht auf die Antigenbindung auswirken. Somit macht die Sequenzähnlichkeit dieser Leichtketten sie zu Kandidaten für die gemeinsame Leichtkette der vorliegenden Erfindung. Alternativ dazu können gemäß der Erfindung solche Leichtketten mit 98–99 % Sequenzidentität mit der Leichtkette eines voraussichtlichen gepaarten scFv (AxI.78, beispielsweise) durch die gepaarte Leichtkette ersetzt werden und die Bindespezifität beibehalten.
B. Identifikation von Antikörpern mit der gleichen Leichtkette und Herstellung eines bispezifischen Antikörpers mit dieser Leichtkette: Anti-Ob-R/Anti-HER3
ScFv-Fragmente, die einen menschlichen Leptin-Rezeptor (Ob-R) oder die extrazelluläre Domäne des HER3/c-erbB3-Genprodukts (HER3) banden, wurden durch drei Panning-Durchgänge unter Verwendung einer großen menschlichen scFv-Phagen-Bibliothek erhalten (Vaughan et al., w.o. (1996)). Leptin-Rezeptor-IgG und HER3-IgG (10 μg in 1 ml PBS) wurden verwendet, um separate Immunotubes (Nunc; Maxisorp) über Nacht bei 4°C zu beschichten. Dann wurde Panning und Phagenrettung durchgeführt, wie sie von Vaughan et al, w.o. (1996), beschrieben wurden, und zwar mit den folgenden Modifikationen. Ein humanisierter Antikörper, huMAb5D5-8 (P. Carter et al., PNAS USA 89, 4285–4289 (1992)), oder humanisiertes Anti-IgE (L. Presta et al., J. Immunol. 151, 2623–2632 (1993)) in einer Konzentration von 1 mg/ml wurde bei jedem Panning-Schritt inkludiert, um einen Fc-bindenden Phagen zu absorbieren. Außerdem wurde auch Panning in Lösung (R.E. Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889–896 (1992)) verwendet, um einen scFv-bindenden Leptin-Rezeptor zu identifizieren. Der Leptin-Rezeptor wurde durch ortsspezifische Proteolyse vom Leptin-Rezeptor-IgG mit der gentechnisch hergestellten Protease, Genenase (P. Carter et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 6, 240–248 (1989)), gefolgt von Protein-A-Sepharose-Chromatographie, vom Fc getrennt. Der Leptin-Rezeptor wurde biotinyliert und im ersten, zweiten und dritten Panning-Durchgang in einer Konzentration von 100 nM, 25 nM bzw. 5 nM verwendet. Ein phagenbindendes biotinyliertes Antigen wurde unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Kugeln (Dynabeads, Dynal, Oslo, Norwegen) eingefangen.
Klone aus dem Panning-Durchgang 2 und 3 wurden jeweils durch Phagen- und scFv-ELISA gescreent, wobei das entsprechende Antigen und auch ein Kontroll-Immunadhäsin oder -Antikörper verwendet wurden. Die Diversität der Antigenpositiven Klone wurde durch PCR-Amplifikation des scFv-Inserts unter Verwendung der Primer, von fdtetseq und PUC-Reverse (Vaughan et al., w.o. (1996)) und durch Verdauung mit BstNI (Marks et al., w.o. (1991)) analysiert. Ein bis fünf Klone pro Bst-NI-Fingerprint wurden dann unter Verwendung von fluoreszierenden Didesoxy- Kettenterminatoren (Applied Biosystems) zyklisch sequenziert, wobei PCR-Schwerbindungs- und myc-seq-10-Primer verwendet wurden (Vaughan et al., w.o. (1996)). Die Proben wurden mithilfe eines Automated DNA Sequencer von Applied Biosystems analysiert, und die Sequenzen wurden mithilfe von SegEd analysiert. Es gilt auch anzumerken, dass die Guanidinhydrochlorid-Antikörper-Denaturierungs- und In-vitro-Ketten-Shuffling-Verfahren nach Figini zusammen mit einer Phagendisplay-Selektion ein nützliches Verfahren zur Selektion von Antikörpern mit der gleichen Leichtkette ist (M. Figini et al., w.o. (1994)).
Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens wurden elf unterschiedliche Anti-HER3-Klone und 18 Anti-Ob-R-Klone erhalten (11 vom Panning unter Verwendung eines beschichteten Antigens und 7 vom Panning mit einem biotinylierten Antigen). Die Klone wurde durch Standardverfahren sequenziert, um die Sequenzen der Leichtketten in Zusammenhang mit den einzelnen Bindedomänen zu bestimmen (5). Die Sequenzen sind die V_H- und die gemeinsamen V_L-Sequenzen des Anti-Ob-R-Klons 26 und des Anti-HER3-Klons 18, die zur Herstellung eines bispezifischen Antikörpers verwendet wurden (siehe unten). Die Reste sind gemäß E.A. Kabat et al., w.o. (1991), nummeriert. Die Position der antigenbindenden CDR-Reste gemäß der Sequenzdefinition (Kabat et al., w.o. (1991)) oder strukturellen Definition (C. Chothia und A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)) sind durch Unterstreichungen bzw. Strichen darüber hervorgehoben. Identität zwischen Resten in den V_H-Sequenzen ist durch * markiert.
Die Sequenzen der Leichtketten wurden für multiple Anti-HER3-Klone in Bezug auf multiple Anti-Ob-R-Klone verglichen (8 und Tabelle 5). Es zeigte sich, dass vier von elf Anti-HER3-Klonen mit einem oder mehreren Anti-Ob-R-Rezeptor-Klonen identische V_L aufweisen. Umgekehrt weisen neun von achtzehn Anti-Ob-R-Klonen die gleiche V_L auf wie eines der Anti-HER3-Klone (siehe Tabelle 5, schwarzer Kasten).
Die Konstruktion von Anti-Ob-R/Anti-HER3, einem bispezifischen Antikörper mit einer gemeinsamen Leichtkette, wurde wie folgt durchgeführt. Ein erstes und zweites Polypeptid mit geändertem C_H3 mit den komplementären Protuberanzen und Hohlräumen sowie den nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindungen zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid wurden bei der Konstruktion einer Fc-hältigen bispezifischen Antikörpers verwendet. Die V_L eines Anti-Ob-R-Klons Nr. 26 und eines Anti-HER3-Klons Nr. 18, wobei die beiden Klone die gleiche Leichtkette aufweisen, sowie die Schwerketten von jedem Antikörper wurden verwendet, um den bispezifischen Antikörper gemäß den hierin offenbarten Verfahren herzustellen.
Dieser Antikörper wies eine elektrophoretische Mobilitätsverschiebung im scheinbaren Molekulargewicht im Vergleich zu einem bispezifischen Antikörper auf, der sich nur dadurch unterschied, dass ihm Änderungen zur Bildung von nichtnatürlichen Disulfidbindungen fehlten. Ein 8-%-SDS-PAGE-Gel mit heterodimeren Antikörper-Varianten mit und ohne nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindungen zeigte eine Mobilitätsverschiebung von einem scheinbaren MG von etwa 230 für ein Wildtyp-Heterodimer zu einem scheinbaren MG von etwa 200 für eine Heterodimer mit einer nichtnatürlichen Disulfidbindung auf. Die MG-Verschiebung reichte aus, um den Prozentsatz jeder Variante zu bestimmen, die erfolgreich die nichtnatürliche Disulfidbindung bildete.
Die Bindespezifität des bispezifischen Antikörpers für sowohl Ob-R als auch HER3 wird durch herkömmliche ELISA-Verfahren getestet, wie etwa das folgende Verfahren. Ob-R-Bindung wird in einem ELISA-Test nachgewiesen, bei dem Ob-R als Ob-R-Ig-Fusionsprotein vorhanden ist. Das Ob-R-Ig-Fusionsprotein wird auf ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte aufgetragen, und der bispezifische Antikörper wird hinzugefügt.
Der Well wird mehrere Male gewaschen, um nichtspezifische Bindung an Ob-R-Ig zu eliminieren. Als zweite Komponente im gleichen Test wird ein biotinyliertes HER3-Ig-Fusionsprotein zugesetzt und mithilfe eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplexes detektiert, der an das biotinylierte HER3-Ig-Fusionsprotein band. Die Bindung wird durch die Entstehung einer Farbänderung beim Zusatz von Wasserstoffperoxid und einem TMB-Peroxidase-Substrat detektiert (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA).
Unter den eben beschriebenen Bedingungen zeigt sich die Bindung eines bispezifischen Antikörpers an sowohl Ob-R-Ig als auch HER3-Ig als detektierbare Markierung, die aufgrund der Bildung eines Komplexes, der immobilisiertes Ob-R-Ig/einen bispezifischen Antikörper/HER3-Ig-Biotin/detektierbar markiertes Streptavidin umfasst, auf der Oberfläche des Mikrotiter-Wells immobilisiert ist. Antikörper, die Ob-R-Ig, nicht aber HER3-Ig binden, bilden den oben genannten Komplex nicht, was zu einem negativen Ergebnis führt. Auf ähnliche Weise binden Antikörper, die HER3-Ig, nicht aber Ob-R-Ig binden, den oben genannten Komplex nicht und führen ebenfalls zu einem negativen Ergebnis. Im Gegensatz dazu bildet der bispezifische Antikörper, von dem erwartet wird, dass er an sowohl Ob-R-Ig als auch HER3-Ig bindet, den Komplex und führt zu einem positiven Ergebnis in dem Test, was zeigt, dass der bispezifische Antikörper mit einer gemeinsamen Leichtkette sowohl HER3 als auch Ob-R bindet.
Die Expression und Reinigung des bispezifischen Anti-(Ob-R/HER3)-Antikörpers wurde wie folgt durchgeführt. Menschliche embryonale Nieren-293S-Zellen wurden mit drei Plasmid-DNAs transfiziert, die jeweils unabhängig voneinander für eine Anti-Ob-R-Schwerkette, eine Anti-HER3-Schwerkette oder die Leichtkette des Klons 26 oder 18, die in allen Antikörpern gleich war, kodierten, wie oben beschrieben ist. Bei jeder Transfektion betrug das Verhältnis zwischen für eine schwere Kette kodierender DNA und für eine leichte Kette kodierender DNA 1:3, sodass die leichte Kette nicht auf die Anordnung eines bispezifischen Anti-Ob-R/Anti-HER3-Antikörpers beschränkt ist. Beide Schwerketten wurden in einem 1:1-Verhältnis zueinander transfiziert. 12 μg Gesamtplasmid-DNA wurden dann in 293S-Zellen cotransfiziert, und zwar mithilfe von Calciumphosphat-Fällung (C. Gorman, DNA Cloning, Bd. II, S. 143, D.M. Glover, Hrsg., IRL Press, Oxford (1985)). Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, bevor Wachstumsmedium zugesetzt wurde, das die Proteinexpression fördern sollte. Fc-hältige Proteine wurden unter Verwendung eines immobilisierten Pro teins A (ProSep A, BioProcessing Ltd., UK) von Zellüberständen gereinigt und in PBS pufferausgetauscht. Iodacetamid wurde zu einer Endkonzentration von 50 mM zu den Proteinpräparaten zugesetzt, um ein erneutes Shuffling der Disulfidbindungen zu verhindern.
Als weiteres Beispiel wurde wie folgt eine Expression und Reinigung eines Anti-(CD3/CD4)-Antikörper/Immunadhäsins durchgeführt. Menschliche embryonale Nieren-293S-Zellen wurden mit drei Plasmid-DNAs transfiziert, wobei die Plasmide unabhängig voneinander für eine Anti-CD3-Leichtkette, eine Anti-CD3-IgG₁-Schwerkette oder ein Anti-CD4-IgG₁-Immunadhäsin kodierten. Bei jeder Transfektion betrug das Verhältnis zwischen für eine leichte Kette kodierender DNA und für eine schwere Kette kodierender DNA 3:1, sodass die leichte Kette nicht auf die Anordnung von Anti-CD3-IgG beschränkt ist. Außerdem wurde, da das Immunadhäsin schlecht exprimiert wurde, im Vergleich zum für eine Schwerkette kodierenden Plasmid ein Überschuss an für Immunadhäsin kodierendem Plasmid zugesetzt. Die getesteten Verhältnisse reichten von 3:1:3 bis 8:1:3 für Immunadhäsin:Schwerkette:Leichtketten-Phagemide. Insgesamt wurden dann 10 μg Plasmid-DNA in 293S-Zellen cotransfiziert, und zwar mithilfe von Calciumphosphat-Fällung (C. Gorman, w.o. (1985)), wobei die Zellen vor der Transfektion mit PBS gewaschen wurden. Fc-hältige Proteine wurden unter Verwendung eines immobilisierten Proteins A (ProSep A, BioProcessing Ltd., UK) von Zellüberständen gereinigt und in PBS pufferausgetauscht. Iodacetamid wurde zu einer Endkonzentration von 50 mM zu den Proteinpräparaten zugesetzt, um erneutes Shuffling der Disulfidbindungen zu verhindern.
In jedem der oben genannten Präparate wurden Proteinproben auf 8 % Polyacrylamid-Gelen (Novex) elektrophoresiert und durch Färbung mit Serva-Blau visualisiert. Die Gele wurden entfärbt, was einen matten Hintergrund bei dem Versuch ergab, geringe Verunreinigungen zu visualisieren und quantifizieren. Getrocknete Gele wurde mithilfe des Scanning-Densitometers (GS-670, BioRad) gescannt, und Proteinprodukte wurden mit der Software Molecular Analyst quantifiziert.
Hierin wurden nichtnatürliche (gentechnisch hergestellte) Disulfidbindungen offenbart, die in die C_H3-Domäne eingeführt wurden, um die Heterodimerbildung zu fördern. Ein Paar von Polypeptiden, K392C/D399'C, förderte die Heterodimerbildung, indem es bis zu 76 % Heterodimere bildete (Tabelle 4, Variante v6). Wenn die Gegenwart einer Zwischenketten-Disulfidbindung mit der Protuberanz-in-Hohlraum-Technik kombiniert wurde, wurden ungefähr 95 % Heterodimere erhalten (Tabelle 4, Varianten v11, v12 und v16). Somit erhöht das Verfahren der Erfindung zur Steigerung spezifischer Protein/Protein-Wechselwirkung zwischen einem ersten und zweiten Polypeptid eines bispezifischen Antikörpers die Ausbeute am gewünschten Heteromultimer und minimiert die Bildung von ungewünschten Heteromultimeren oder Homomultimeren.
Ferner ermöglicht das Verfahren zur Charakterisierung der Produkt-Heteromultimere durch elektrophoretische Mobilitätsanalyse die Bestimmung der relativen Menge an gewünschten Heteromultimeren im Vergleich zu ungewünschten Produkten.
Die Selektion einer gemeinsamen Leichtkette, wie sie hierin beschrieben ist, erhöht die Ausbeute des gewünschten Heteromultimers, indem die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass es zu Fehlpaarungen zwischen variablen Schwerketten und Leichtketten eines multispezifischen Antikörpers kommt.
C. Identifikation von Antikörpern mit der gleichen Leichtkette und Konstruktion eines bispezifischen Antikörpers mit dieser Leichtkette: Anti-MpI/Anti-HER3
Die Identifikation, Konstruktion und Expression eines weiteren bispezifischen Antikörpers gemäß der Erfindung wird hierin demonstriert. Die in Teil A und B dieses Beispiels beschriebenen Verfahren wurden auch zur Herstellung des bispezifischen Anti-MpI/Anti-HER3-Antikörpers verwendet.
Unter Verwendung der in Abschnitt A dieses Beispiels (Vergleich von Antikörper-Bibliotheken gegen elf Antigene) beschriebenen Verfahren wurden die V_H- und V_L-Aminosäuresequenzen des Anti-HER3-scFv mit 23 scFv verglichen, die an den menschlichen Thrombopoietin-Rezeptor c-MpI binden. Fünf der elf Anti-HER3-Klone wiesen die gleiche V_L-Aminosäuresequenz auf wie ein oder mehrere MpI-bindende Klone. Umgekehrt wiesen sieben von dreiundzwanzig Anti-MpI-scFv die gleiche V_L auf wie einer der Anti-HER3-Klone (siehe Tabelle 5, weißer Kasten). Im Gegensatz dazu waren die V_H-Aminosäuresequenzen viel unterschiedlicher, wobei der Identitätsgrad zwischen einem beliebigen Anti-MpI- und Anti-HER3-Klon bei 40 bis 99 % lag.
Das Anti-MpI-scFv 12B5 (Genbank-Zugangsnummer AF048775; Seq.-ID Nr. 27) und der Anti-HER3-scFv-Klon H6 (Genbank-Zugangsnummer AF048774; Seq.-ID Nr. 28) nutzen identische V_L-Sequenzen und stark unterschiedliche V_H-Sequenzen. Diese scFv-Fragmente wurden verwendet, um den bispezifischen Anti-MpI/Anti-HER3-IgG-Antikörper herzustellen, der aufgrund der gemeinsamen Leichtkette sowie aufgrund der Verwendung von Knob-in-Loch-Mutationen (hierin beschrieben) und einer gentechnisch hergestellten Disulfidbindung zwischen den C_H3-Domänen zu einer effizienten Heterodimerisierung fähig war. Antikörper mit der gleichen L-Kette wurden gewählt, um das Problem der Paarung von L-Ketten mit nicht verwandten H-Ketten zu umgehen. Zwei natürlich vorkommende Gelenk-Region-Disulfidbindungen waren ebenfalls vorhanden. Die gemeinsame L-Kette wurde mit den beiden H-Ketten cotransfiziert, welche die C_H3-Mutationen der Variante v11 enthielten. Die IgG-Produkte wurden durch Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt und durch SDS-PAGE unter Verwendung von Standardverfahren analysiert.
Das Präparat des bispezifischen IgG-Antikörpers (BsIgG) ergab eine einzelne Hauptbande, die größere Mobilität aufwies als IgG mit Wildtyp-C_H3-Domänen. Diese Steigerung der elektrophoretischen Mobilität stand im Einklang mit der Bildung der gentechnisch hergestellten Disulfidbindung im BsIgG, wodurch eine kompaktere Proteinspezies gebildet wurde.
Die Fähigkeit des gentechnisch hergestellten Anti-MpI/Anti-HER3-BsIgG-Antikörpers, sowohl MpI- als auch HER3-ECD-Antigene zu binden, wurde wie folgt mithilfe eines ELISA bestimmt. Unter Verwendung von PBS-Puffer in allen Schritten wurden ein zelne Wells einer 96-Well-Platte (Maxisorp, Nunc) über Nacht mit 5 μg/ml HER3-IgG oder MpI-IgG beschichtet, gewaschen und dann 1 h lang mit 0,5 % (Gew./Vol.) BSA blockiert. Die primären Antikörper waren Anti-MpI × Anti-HER3 BsIgG mit den Mutationen Y349C:T366S:L368A:Y407V/T366'W:S354'C und das entsprechende parentale Anti-MpI- oder Anti-HER3-IgG mit mutierten Fc-Regionen. Die primären Antikörper (1 μg/ml) wurden einzeln 2 h lang bei 23°C mit biotinyliertem HER3-IgG und einer 1:5000-Verdünnung eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugats (Boehringer Mannheim) inkubiert und dann zu den Wells zugesetzt und eine weitere Stunde bei 23°C inkubiert. Peroxidaseaktivität wurde laut den Anweisungen des Verkäufers (Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, USA) mit TMB-Reagenzien detektiert.
Wie erwartet band das Anti-MpI/Anti-HER3-BsIgG effizient und gleichzeitig an MpI- und HER3-ECD-Antigene einzeln als auch ein beide Antigene gleichzeitig. Im Gegensatz dazu banden das parentale Anti-MpI und das parentale Anti-HER3-IgG nur an ihr entsprechendes verwandtes Antigen (6).
D. Antikörper, die eine gentechnisch hergestellte Fc-Region enthalten sind zu einer effizienten Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität fähig
Um zu zeigen, dass die gentechnisch hergestellte Fc-Region (C_H3-Mutationen, w.o.), die bei der Herstellung der als Beispiele angeführten bispezifischen Antikörper der Erfindung verwendet wurde, zu einer effizienten Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) fähig ist, wurde der folgende Versuch durchgeführt.
Die C_H3-Mutationen behielten die Fähigkeit bei, eine effiziente Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) beizubehalten, wie durch das Verfahren nach G.D. Lewis et al (G.D. Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37, 255–263 (1993)) nachgewiesen wurde. Kurz gesagt wurden Zytotoxizitätstests mit ⁵¹Cr-markierten SK-BR-3- und HBL-100-Target-Zellen (ATCC-Zugangsnummern HTB-30 bzw. 45509) und menschlichen Lymphozyten des peripheren Bluts als Effektor- Zellen durchgeführt. Anders als bei Lewis et al. wurden die Lymphozyten jedoch nicht mit IL-2 aktiviert.
Die C_H3-Mutationen S354:T366W und Y349:T366S:L368A:Y407V wurden separat in die H-Kette des humanisierten Anti-HER2-Antikörpers, huMAbDS-5, hergestellt von Carter et al., eingeführt (P. Carter et al., PNAS USA 89, 4285–4289 (1992)). Antikörper, die umgeformte und Wildtyp-Fc-Regionen enthalten, wiesen eine ähnliche Wirksamkeit in ADCC auf wie die HER2-überexprimierende Brustkrebs-Zelllinie SK-BR-3 (7). Sowohl umgeformte als auch Wildtyp-Antikörper wiesen im. Vergleich zur normalen Brust-Epithel-Zelllinie geringe Toxizität auf. Die Wirkungen in der H-Kette sind unabhängig von den Bindedomänen, was vermuten lässt, dass diese BsIgGs in Antikörper-abhängiger zellvermittelter Zytotoxizität funktionieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines multispezifischen Antikörpers, umfassend zumindest zwei unterschiedliche Bindedomänen, worin eine erste Bindedomäne ein erstes Molekül bindet und eine zweite Bindedomäne ein zweites Molekül bindet, das sich vom ersten Molekül unterscheidet, wobei jede Bindedomäne (i) eine variable Schwerketten-Domäne, die Teil eines Polypeptids ist, das weiters eine Multimerisations-Domäne umfasst, und (ii) eine variable Leichtketten-Domäne umfasst, worin die erste Bindedomäne eine erste variable Schwerketten-Domäne eines ersten Polypeptids umfasst, die zweite Bindedomäne eine zweite variable Schwerketten-Domäne eines zweiten Polypeptids umfasst und sich die erste und die zweite variable Schwerketten-Domäne unterscheiden, und die Polypeptide durch Wechselwirkung der Multimerisations-Domänen multimerisieren, und worin entweder alle variablen Leichtketten-Domänen identisch sind, oder der multispezifische Antikörper eine erste variable Leichtketten-Domäne und eine zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst, worin sich die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 80 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen, und die erste Bindedomäne das erste Molekül bindet, unabhängig davon, ob die erste Bindedomäne die erste variable Leichtketten-Domäne oder die zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst, und die zweite Bindedomäne das zweite Molekül bindet, unabhängig davon, ob die zweite Bindedomäne die zweite variable Leichtketten-Domäne oder die erste variable Leichtketten-Domäne umfasst, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (i) das Kultivieren einer Wirtszelle, die Nucleinsäure umfasst, die für die Polypeptide und die Leichtkette oder Leichtketten kodiert, worin das Kultivieren so erfolgt, dass die Nucleinsäure exprimiert wird und die Polypeptide und die Leichtkette oder Leichtketten produziert werden; und (ii) die Gewinnung des multispezifischen Antikörpers aus der Wirtszellkultur.
Verfahren nach Anspruch 1, worin für die Multimerisations-Domäne des ersten Polypeptids kodierende Nucleinsäure oder für die Multimerisations-Domäne des zweiten Polypeptids kodierende Nucleinsäure oder beide durch Änderung von Nucleinsäure zur Änderung der kodierten Aminosäuresequenz bereitgestellt wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 2, worin Nucleinsäure, die für die Multimerisations-Domäne des ersten Polypeptids, des zweiten Polypeptids oder von beiden kodiert, so geändert wird, dass die Multimerisations-Domäne des ersten bzw. des zweiten Polypeptids jeweils einen freies Thiol enthaltenden Rest umfasst, der eine Disulfidbindung mit einem freies Thiol enthaltenden Rest der Multimerisations-Domäne des jeweils anderen, ersten oder zweiten, Polypeptids bildet.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Multimerisation des Polypeptids eine "Protuberanz-in-Hohlraum"- ("protuberance-in-cavity"-) Wechselwirkung umfasst, worin das Verfahren vor Schritt (i) weiters Folgendes umfasst: das Bereitstellen von für das erste Polypeptid kodierender Nucleinsäure durch Änderung von Nucleinsäure zur Erzeugung einer Protuberanz in der Multimerisations-Domäne des kodierten Polypeptids durch Ersetzen eines Aminosäurerests durch einen Importrest mit einem größeren Seitenkettenvolumen, und das Bereitstellen von für das zweite Polypeptid kodierender Nucleinsäure durch Änderung von Nucleinsäure zur Erzeugung eines Kompensationshohlraums in der Multimerisations-Domäne des kodierten Polypeptids durch Ersetzen eines Aminosäurerests durch einen Importrest mit einem kleineren Seitenkettenvolumen.
Verfahren nach Anspruch 4, worin Nucleinsäure, die für ein eine Multimerisations-Domäne mit einer Protuberanz umfassendes erstes Polypeptid, ein eine Multimerisations-Domäne mit einem Hohlraum umfassendes zweites Polypeptid, oder für ein eine Multimerisations-Domäne mit einer Protuberanz umfassendes erstes Polypeptid und ein eine Multimerisations-Domäne mit einem Hohlraum umfassendes zweites Polypeptid kodiert, mittels Phagendisplay-Selektion bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der Importrest mit einem größeren Seitenkettenvolumen aus der aus Arginin (R), Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W), Isoleucin (I) und Leucin (L) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der Importrest mit einem kleineren Seitenkettenvolumen aus der aus Glycin (G), Alanin (A), Serin (S), Threonin (T) und Valin (V) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das erste und das zweite Polypeptid jeweils eine konstante Antikörper-Domäne aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das erste und zweite Polypeptid jeweils eine konstante Antikörper-Domäne aufweisen, die aus der aus einer C_H3-Domäne und einer konstanten IgG-Domäne bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der multispezifische Antikörper ein Immunadhäsin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend einen Schritt vor Schritt (i), worin die Nucleinsäure in die Wirtszelle eingeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin alle variablen Leichtketten-Domänen identisch sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der multispezifische Antikörper eine erste variable Leichtketten-Domäne und eine zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst und sich die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 90 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 95 % Aminosäuresequenzidentität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 98 % Sequenzidentität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 99 % Sequenzidentität aufweisen.
Multispezifischer Antikörper, umfassend zumindest zwei unterschiedliche Bindedomänen, worin eine erste Bindedomäne ein erstes Molekül bindet und eine zweite Bindedomäne ein zweites Molekül bindet, das sich vom ersten Molekül unterscheidet, worin jede Bindedomäne (i) eine variable Schwerketten-Domäne, die Teil eines Polypeptids ist, das weiters eine Multimerisationsdomäne umfasst, und (ii) eine variable Leichtketten-Domäne umfasst, worin die erste Bindedomäne eine erste variable Schwerketten-Domäne eines ersten Polypeptids, die zweite Bindedomäne eine zweite variable Schwerketten-Domäne eines zweiten Polypeptids umfasst und sich die erste und die zweite variable Schwerketten-Domäne unterscheiden, und die Polypeptide durch Wechselwirkung der Multimerisations-Domänen multimerisieren, und worin entweder alle variablen Leichtketten-Domänen identisch sind, oder der multispezifische Antikörper eine erste variable Leichtketten-Domäne und eine zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst, worin sich die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 80 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen, und die erste Bindedomäne das erste Molekül bindet, unabhängig davon, ob die erste Bindedomäne die erste variable Leichtketten-Domäne oder die zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst, und die zweite Bindedomäne das zweite Molekül bindet, unabhängig davon, ob die zwei te Bindedomäne die zweite variable Leichtketten-Domäne oder die erste variable Leichtketten-Domäne umfasst.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 17, worin die Multimerisations-Domäne des ersten Polypeptids oder die Multimerisationsdomäne des zweiten Polypeptids oder beide durch Änderung einer Aminosäure bereitgestellt sind.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 18, worin die Multimerisations-Domäne des ersten bzw. des zweiten Polypeptids jeweils einen freies Thiol enthaltenden Rest umfasst, der mit einem freies Thiol enthaltenden Rest der Multimerisationsdomäne des jeweils anderen, ersten oder zweiten, Polypeptids eine Disulfidbindung bildet.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 18, worin Multimerisation der Polypeptide eine "Protuberanz-in-Hohlraum"- ("protuberance-in-cavity"-) Wechselwirkung umfasst und die Multimerisations-Domäne des ersten Polypeptids eine Protuberanz und die Multimerisations-Domäne des zweiten Polypeptids einen Kompensationshohlraum umfasst.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 20, worin die Protuberanz und der Hohlraum durch Änderungen erzeugt sind, bei denen natürlich vorkommende Aminosäuren in das erste und das zweite Polypeptid importiert sind.
Multispezifischer Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 21, worin alle variablen Leichtketten-Domänen identisch sind.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 17, worin der multispezifische Antikörper eine erste variable Leichtketten-Domäne und eine zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst, und sich die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 90 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 23, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 95 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 24, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 98 % Sequenzidentität aufweisen.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 25, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 99 % Sequenzidentität aufweisen.
Zusammensetzung, die einen multispezifischen Antikörper nach Anspruch 17 und einen Träger umfasst.
Wirtszelle, die Nucleinsäure umfasst, die für einen multispezifischen Antikörper nach Anspruch 17 kodiert.
Wirtszelle nach Anspruch 28, worin die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines multispezifischen Antikörpers, der eine erste Bindedomäne, die ein erstes Molekül bindet, und eine zweite Bindedomäne, die ein zweites Molekül bindet, das sich vom ersten Molekül unterscheidet, umfasst, worin das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Auswählen einer ersten Nucleinsäure, die für ein eine erste variable Schwerketten-Domäne und eine Multimerisations-Domäne umfassendes erstes Polypeptid kodiert, und Auswählen einer zweiten Nucleinsäure, die für ein eine zweite variable Schwerketten-Domäne und eine Multimerisations-Domäne umfassendes zweites Polypeptid kodiert, worin sich die erste und die zweite variable Schwerketten-Domäne unterscheiden und die Multimerisations-Domäne des ersten und des zweiten Polypeptids jeweils einen Aminosäurerest umfassen, der spezifisch mit einem Aminosäurerest in der Multimerisations-Domäne des jeweils anderen, ersten oder zweiten, Polypeptids wechselwirkt, wodurch eine stabile Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten Polypeptid erzeugt wird; (b) entweder (i) das Auswählen von Nucleinsäure, die für eine variable Leichtkette kodiert, worin die variable Leichtkette sowohl mit dem ersten als auch mit dem zweiten Polypeptid wechselwirkt, um die erste und zweite Bindedomäne zu bilden, oder (ii) das Auswählen von für die erste variable Leichtkette kodierender Nucleinsäure und von für die zweite variable Leichtkette kodierender Nucleinsäure, worin sich die erste und die zweite variable Leichtkette voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 80 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen, die erste und die zweiten variable Leichtkette jeweils mit einem von erstem und zweitem Polypeptid wechselwirken, um die erste und die zweite Bindedomäne zu bilden, und die erste Bindedomäne das erste Molekül bindet, unabhängig davon, ob die erste Bindedomäne durch Wechselwirkung des ersten Polypeptids mit der ersten variablen Leichtkette oder durch Wechselwirkung des ersten Polypeptids mit der zweiten variablen Leichtkette gebildet ist, und die zweite Bindedomäne das zweite Molekül bindet, unabhängig davon, ob die zweite Bindedomäne durch Wechselwirkung des zweiten Polypeptids mit der zweiten variablen Leichtkette oder durch Wechselwirkung des zweiten Polypeptids mit der ersten variablen Leichtkette gebildet ist; (c) das Einführen der für das erste und das zweite Polypeptid und die variable Leichtkette oder die variablen Leichtketten kodierendern Nucleinsäure in eine Wirtszelle und das Kultivieren der Zelle, sodass Expression der Nucleinsäure erfolgt und die kodierten Polypeptide und die variable Leichtkette oder die variablen Leichtketten produziert werden; (d) die Gewinnung des multispezifischen Antikörpers aus der Zellkultur.
Verfahren nach Anspruch 30, worin die erste, für das erste Polypeptid kodierende Nucleinsäure, die zweite, für das zweite Polypeptid kodierende Nucleinsäure oder beide aus Nucleinsäuren ausgewählt werden, die zur Änderung der kodierten Aminosäuresequenz geändert werden.
Verfahren nach Anspruch 31, worin das erste und das zweite Polypeptid durch eine "Protuberanz-in-Hohlraum"- ("protuberance-in-cavity"-) Wechselwirkung wechselwirken.
Verfahren nach Anspruch 31, worin Nucleinsäure zum Import eines freies Thiol enthaltenden Rests in die kodierte Aminosäuresequenz geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 30, worin das erste und das zweite Polypeptid jeweils eine konstante Antikörper-Domäne umfassen.
Verfahren nach Anspruch 34, worin die konstante Antikörper-Domäne eine C_H3-Domäne ist.
Verfahren nach Anspruch 34, worin die konstante Antikörper-Domäne von menschlichem IgG herrührt.
Verfahren nach Anspruch 30, worin Nucleinsäure gemäß (i) ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, worin Nucleinsäure gemäß (ii) ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 38, worin sich die erste und die zweite variable Leichtkette voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 90 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 39, worin die erste und die zweite variable Leichtkette zumindest 95 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 40, worin die erste und die zweite variable Leichtkette zumindest 98 % Sequenzidentität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 41, worin die erste und die zweite variable Leichtkette zumindest 99 % Sequenzidentität aufweisen.
Verfahren zum Messen der Bildung eines heteromultimeren multispezifischen Antikörpers aus einem Polypeptid-Gemisch, worin der multispezifische Antikörper zumindest zwei unterschiedliche Bindedomänen umfasst, worin eine erste Bindedomäne ein erstes Molekül bindet und eine zweite Bindedomäne ein zweites Molekül bindet, das sich vom ersten Molekül unterscheidet, jede Bindedomäne (i) eine variable Schwerketten-Domäne, die Teil eines Polypeptids ist, das weiters eine Multimerisations-Domäne umfasst, und (ii) eine variable Leichtketten-Domäne umfasst, worin die erste Bindedomäne eine erste variable Schwerketten-Domäne eines ersten Polypeptids, die zweite Bindedomäne eine zweite variable Schwerketten-Domäne eines zweiten Polypeptids umfasst und sich die erste und die zweite variable Schwerketten-Domäne unterscheiden, und die Polypeptide durch Wechselwirkung der Multimerisations-Domänen multimerisieren, worin die Multimerisationsdomäne des ersten oder des zweiten Polypeptids einen freies Thiol enthaltenden Rest umfasst, der mit einem freies Thiol enthaltenden Rest der Multimerisations-Domäne des jeweils anderen, ersten oder zweiten, Polypeptids eine Disulfidbindung bildet, und worin entweder alle variablen Leichtketten-Domänen identisch sind, oder der multispezifische Antikörper eine erste variable Leichtketten-Domäne und eine zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst, worin sich die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 80 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen, und die erste Bindedomäne das erste Molekül bindet, unabhängig davon, ob die erste Bindedomäne die erste variable Leichtketten-Domäne oder die zweite variable Leichtketten-Domäne umfasst, und die zweite Bindedomäne das zweite Molekül bindet, unabhängig davon, ob die zweite Bindedomäne die zweite variable Leichtketten-Domäne oder die erste variable Leichtketten-Domäne umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) das Auslösen von Migration beider multispezifischer Antikörper in eine Gelmatrix; und (b) das Bestimmen der relativen Menge einer Bande, die dem multispezifischen Antikörper mit einer nicht natürlich vorkommenden Disulfidbindung zwischen erstem und zweitem Polypeptid entspricht, und einer langsamer migrierenden Bande, die einem Heteromultimer ohne nicht natürlich vorkommende Disulfidbindung zwischen erstem und zweitem Polypeptid entspricht.
Verfahren nach Anspruch 43, worin Multimerisation der Polypeptide durch eine "Protuberanz-in-Hohlraum"- ("protuberance-in-cavity"-) Wechselwirkung zwischen den Multimerisations-Domänen unterstützt wird.
Verfahren nach Anspruch 43, worin alle variablen Leichtketten-Domänen identisch sind.
Verfahren nach Anspruch 43, worin sich die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne voneinander unterscheiden, jedoch zumindest 90 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 46, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 95 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 47, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 98 % Sequenzidentität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 48, worin die erste und die zweite variable Leichtketten-Domäne zumindest 99 % Aminosäuresequenz-Identität aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der multispezifische Antikörper aus der aus Anti-Human-Leptin-Rezeptor ECD (Ob-R)/Anti-Human-Rezeptor-Tyrosin-Kinase HER3 und Anti-Human-Thrombopoietin-Rezeptor-Tyrosin-Kinase (MpI)/Anti-Human-Rezeptor-Tyrosin-Kinase HER3 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Multispezifischer Antikörper nach Anspruch 17, der aus der aus Anti-Human-Leptin-Rezeptor ECD (Ob-R)/Anti-Human-Rezeptor-Tyrosin-Kinase HER3 und Anti-Human-Thrombopoietin-Rezeptor-Tyrosin-Kinase (MpI)/Anti-Human-Rezeptor-Tyrosin-Kinase HER3 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung, die einen multispezifischen Antikörper nach Anspruch 51 und einen Träger umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 28, worin der multispezifische Antikörper aus der aus Anti-Human-Leptin-Rezeptor ECD (Ob-R)/Anti-Human-Rezeptor-Tyrosin-Kinase HER3 und Anti-Human-Thrombopoietin-Rezeptor-Tyrosin-Kinase (MpI)/Anti-Human-Rezeptor-Tyrosin-Kinase HER3 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.