MX2007012687A - Variantes de cadena beta de hgf. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona moduladores de HGF/Met que comprenden HGF que tienen mutaciones en regiones que afectan la funcion de HGF y antagonistas que apuntan las regiones. La invencion proporciona ademas metodos para identificar, fabricar y usar estos moduladores.

Description

VARIANTES DE CADENA BETA DE HGF CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con los campos de biología molecular y regulación del factor de crecimiento. Mas específicamente, la invención es concerniente con moduladores de la ruta de señalización de HGF/c-met y usos de tales moduladores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de crecimiento de hepatocito (HGF) , también conocido como factor de dispersión (SF), es el ligando para Met (Bottaro et al., 1991), una cinasa de tirosina receptora codificada por el protooncogeno c-met (Cooper et al., 1984a &b) . El enlace de HGF a Met induce la fosforilación del dominio de cinasa intracelular dando como resultado la activación de un conjunto complejo de rutas mtracelulares que conducen al crecimiento, diferenciación y migración celular en una variedad de tipos de células; varias revisiones publicadas recientemente proporcionan una vista general extensa (Birchmeier et al., 2003; Trusolmo and Comoglio, 2002; Maulik et al., 2002). Además de su importancia fundamental en el desarrollo embrionico y regeneración de tejido, la ruta de señalización de HGF/Met también ha sido implicada en el crecimiento de tumor invasivo y metástasis y como tal representa un objetivo terapéutico interesante (Birchmeier et al., 2003; Trusolino and Comoglio, 2002; Damlkovitch Miagkova y Zbar, 2002; Ma et al., 2003) . El HGF pertenece a la familia del factor del crecimiento relacionado con plasminogeno y comprende una cadena alfa de 69 KDa que contiene el dominio de dedo N-terminal (N) y cuatro dominios de Kringle (K1-K4) y una cadena beta de 34 KDa que tiene fuerte similandad a dominios de proteasa de las proteasas de serina semejantes a quimiotripsma del Clan PA(S) /FamilySl (Nakamura et al., 1989; Dónate et al., 1994; Rawlmgs et al., 2002). Como el plasminogeno y otros cimogenos de proteasa de serina, el HGF es secretado como una forma precursora de una sola cadena (scHGF). El scHGF se enlaza a proteoglicanas de sulfato heparana, tal como s?nd?can-1 (Derksen et al., 2002) sobre superficies de células o en la matriz extracelular. Las proteoglicanas de sulfato heparana se enlazan al dominio N (Hartmann et al., 1998), que también contribuye a la alta afinidad de enlace de Met junto con aminoácidos localizados en Kl (Lokker et al., 1994) . Aunque scHGF es apto de enlazarse a Met con alta afinidad, no puede activar el receptor (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992). La adquisición de la actividad de señalización de HGF es eventual después de la escisión proteolitica (activación) de scHGF en Arg494Val495 dando como resultado la formación de HGF maduro, un heterodimero alfa/beta disulfuro-enlazado (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992; Naldini et al., 1992). El dominio semejante a proteasa de HGF (cadena beta de HGF) está desprovisto de actividad catalítica puesto que carece de la triada catalítica de Asp [cl02 ] -His [c57 ] -Ser [cl95 ] (numeración de quimiotppsmogeno estándar en corchetes) encontrada en todas las proteasas de serina Gln534[c57] y Tyr673 [cl95] . Debido a su importancia en la regulación de la actividad HGF, este proceso debe ser fuertemente controlado mediante enzimas de conversión HGF y sus inhibidores fisiológicos correspondientes. La activación de scHGF es moderada m vi tro por proteasas de serina semejantes a quimiotripsma que incluyen el activador del factor de crecimiento de hepatocito (HGFA) (Miyazawa et al., 1993), ?t . /MT-SP1 (Takeuchi et al. 1999; Lin et al., 1999), el activador de plasminogeno tipo urosmasa (Naldini et al., 1992), factor Xlla (Shimomura et al., 1995), factor Xla (Peek et al., 2002) y calicreina de plasma (Peek et al., 2002). Similar al scHGF estas proteasas son producidas como precursores inactivos; sus actividades enzimáticas también están fuertemente reguladas por otras proteasas activadoras y tanto inhibidores tipo Kunitz como inhibidores tipo serpina. Las proteasas de sepna y su proceso de activación han sido descritos (Dónate et al., 1994) . En las proteasas de serina, la escisión de activación del cimógeno efectúa un reacomodo conformacional del llamado "dominio de activación" dando surgimiento a un sitio activo formado apropiadamente y la región de interacción de sustrato/inhibidor. El dominio de activación constituye tres bucles expuestos en la superficie designados como los bucles [cl40]-, [cl80]- y [c220]- y la inserción del término N recién formado a una cavidad hidrofóbica (Huber and Bode, 1978). En la proteína estimuladora de macrófago del par de ligando/receptor homologa (MSP) /Ron, la cadena beta de MSP semejante a proteasa de serina proporciona la energía principal para el enlace del receptor (Wang et al., 1997; Millar y Leonard, 1998) . Esto es invertido del sistema HGF/Met en donde el sitio de enlace del receptor de alta afinidad para Met reside en la cadena alfa de HGF (Lokker et al., 1994; Okigaki et al., 1992). La importancia del eje de señalización de HGF/Met en la función celular normal y en la etiología de alteraciones químicas sugiere la necesidad de desarrollar medios terapéuticos altamente efectivos en base a la modulación de este eje. Sin embargo, la complejidad de esta ruta, particularmente a la luz de mecanismos menos bien entendidos de HGF-HGF e interacciones HGF-Met, ha disminuido el avance en este frente y destacado la necesidad de desarrollar procedimientos que estén basados en el mejor entendimiento del mecanismo de la acción de las interacciones de HGF-HGF y HGF/Met. La invención revelada posteriormente en la presente satisface esta necesidad y proporciona otros beneficios.

Todas las referencias citadas en la presente, en las que se incluyen solicitudes de patente y publicaciones de patente, son incorporadas por referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El factor del crecimiento de hepatocito (HGF) , un factor de crecimiento relacionado con plasminogeno, se enlaza a su cinasa tirosina receptora Met (también denominada en la presente como C-Met c-Met c-met), que esta implicada en el desarrollo, regeneración de tejido y crecimiento de tumor invasivo. La cadena beta de HGF semejante a proteasa de serina se enlaza por si misma a Met. A diferencia del enlace a Met, no es claro que regiones y residuos específicos en la cadena beta de HGF son necesarios para efectuar la señalización apropiada por medio de la ruta HGF/Met. Se predice que ciertas regiones/posiciones en la cadena beta hacen contribuciones importantes a la actividad funcional de HGF apropiada, en donde estas contribuciones pueden o pueden no involucrar el enlace de la cadena beta de HGF a su receptor cognato. Los resultados descritos en la presente proporcionan evidencias que mutaciones en la región terminal N y/o región de dimerización de la cadena beta de HGF puede alterar la función biológica de HGF/Met con o sin deteriorar sustanclalmente el enlace de HGF (en particular cadena beta de HGF) a C-Met. En general, aunque no necesariamente, estas mutaciones no implican posiciones aunque comprenden el "dominio de activación" o "región del sitio activo" de HGF t po silvestre. Los análisis de mutación descritos en la presente proporcionan una base para el diseño de una multitud de mutantes de HGF capaces de inhibir las interacciones de HGF/HGF y HGF/c-met tipo silvestre a través de un espectro de potencias. Ejemplos de tales mutantes son descritos en la presente. Estos mutantes son capaces de competir con HGF tipo silvestre para el enlace a c-met, todavía exhiben capacidad reducida para afectar las funciones biológicas asociadas con c-met . Esto es particularmente ventajoso en donde la inhibición completa o sustancial del e e de HGF/c-met es indeseable; esto es de preocupación particular debido a que HGF y c-met son expresados ubicuamente en células y tejidos normales. Estos mutantes pueden también ser usados como agentes terapéuticos ventajosos para el tratamiento de condiciones patológicas en donde es deseable la ausencia reducida pero no completa de la actividad biológica de HGF/c-met. Los métodos y composiciones de la invención están basados por lo menos en parte en estos hallazgos, que son descritos en mayor detalle posteriormente en la presente. En un aspecto, la invención proporciona una molécula antagonista de HGF/C-Met que comprende un mutante de HGF que comprende una mutación en la región N-terminal de cadena beta de HGF y/o región de dimerizacion de cadena beta de HGF.

Una mutación en la región N-terminal de cadena beta de HGF puede ser cualquiera que deteriora la inserción del término N de cadena beta de HGF a una cavidad del enlace de HGF. En una modalidad, el mutante de cadena beta de HGF resultante se enlaza a C-Met con afinidad de enlace reducida en comparación con la cadena beta de HGF tipo silvestre. En una modalidad, el mutante de cadena beta de HGF resultante se enlaza a C-Met con afinidad sustanclalmente equivalente como la cadena beta de HGF tipo silvestre. En una modalidad, el HGF de plena longitud resultante que contiene una cadena beta de HGF mutada se enlaza a C-Met con afinidad de enlace reducida en comparación con HGF tipo silvestre de plena longitud. En una modalidad, el HGF de plena longitud resultante que contiene una cadena beta de HGF mutada se enlaza a C-Met con afinidad sustanclalmente equivalente como HGF tipo silvestre de plena longitud. En una modalidad, una mutación está en o adyacente a la posición Pl' (esto es, 495 [cl6] ) , en donde la mutación da como resultado un mutante HGF escindible y en donde el término N de la cadena beta de HGF no se inserta a un sitio activo/cavidad de enlace. Ejemplos por la incapacidad para insertarse a un sitio activo/cavidad de enlace incluyen, pero no están limitados a configuraciones en donde el mutante es defectuoso ya sea en uno u otro o ambos de (i) interacciones hidrofób cas y (n) formación de puente de sal que involucra el término N a Asp672 [c]194, por ejemplo, en donde un término N lleva una mutación, por ejemplo, un residuo de aminoácido sustituido o insertado cargado positivamente. En una modalidad, la señalización vía este mutante es deteriorada. En una modalidad, una mutación esta en o adyacente a una o más posiciones Pl' , P2', P3' y P4'. Una mutación en el dominio de dimerización de cadena beta de HGF puede ser cualquiera que se esperaría que deteriore el contacto entre dos cadenas beta de HGF, de tal manera que la dimerización de las dos cadenas (y así dos moléculas de HGF) sea deteriorada. Tales mutaciones serían evidentes de la estructura de aminoácido de complejos de HGF, por ejemplo como se describe en Kirchhofer et al., J Biol Chem. (2004), 279 (38 ): 39915-24. Posiciones de aminoácidos relevantes incluyen, pero no están limitadas a, aquéllas descritas en la presente. En una modalidad, el mutante de HGF resultante tiene habilidad reducida para dimerizar con otra cadena beta de HGF. En una modalidad, una mutación en la región de dimerización de cadena beta de HGF no deteriora sustanclalmente el enlace del mutante HGF resultante a C-Met. El dominio de dimerización se refiere a una región de una cadena beta de HGF que mteractúa con otra cadena beta de HGF para formar un dímero (por ejemplo, en un complejo de activación de HGF/Met). Después de la escisión del proHGF, la cadena beta de HGF sufre un cambio conformacional . El residuo 95N-term?nal de cadena beta de HGF forma un puente de sal con el residuo Asp 672. En algunas modalidades, la región de dimepzacion de un beta HGF comprende, consiste esencialmente de o consiste de por lo menos un residuo de aminoácido (hasta todos los residuos de aminoácido) correspondientes a los residuos de beta HGF de aproximadamente 495 a 502, los aminoácidos [cl40 loop] en los que se incluyen Y619, T620, G621, los aminoácidos de bucle [cl80] en los que se incluyen 662 a 665 o mezclas de los mismos. En una modalidad, el domino de dimerizacion incluye posiciones localizadas cercanas/adyacentes a una o mas de las posiciones enlistadas anteriormente y asi se predice que influencian una o mas posiciones. Por ejemplo, en esta modalidad, el dominio de dimepzacion puede incluir ademas posiciones 622 y 626. En un aspecto, una molécula antagonista de HGF/Met de la invención comprende una mutación en la región N-terminal de cadena beta de HGF, en donde la mutación esta en posición V495, G498, R502 T503 y/o D672. Una mutación puede estar en cualquier forma que altera la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la región N-terminal de la cadena beta de HGF. Por ejemplo, en una modalidad, una mutación en la región N-terminal de cadena beta de HGF es una sustitución, inserción y/o cancelación, tal como V495G, V495A, G498I, G498P, G498V, R502del plus T503del o D672N. En otra modalidad, una mutación en la región N-terminal de cadena beta de HGF es una cancelación de V495. Una mutación que altera la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la región terminal N de la cadena beta de HGF puede también estar en una posición de aminoácido que no está en la región N-terminal de cadena beta de HGF misma. Por ejemplo, una mutación de D672 que remueve la formación de puente de sal (por ejemplo D672N) con el término N de cadena beta de HGF también se esperaría que altere la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la región terminal N de cadena beta de HGF. Así, las mutaciones de la región terminal N de cadena beta de HGF y la región de dimerización de cadena beta de HGF no son de manera necesaria mutuamente exclusivas. Por ejemplo, como se describe en la presente y se ejemplifica en la figura 1, se puede esperar que la mutación en ciertas posiciones afecte tanto los dominios N-terminal y de dimerización de la cadena beta de HGF. En un aspecto, una molécula antagonista de HGF/Met de la invención comprende una mutación en el dominio de dimerización de cadena beta de HGF, en donde la mutación está en posición N497, G498, P500, en o adyacente a T501 y R502, o R502. Una mutación puede estar en cualquier forma que altere la estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la región de dimerización de la cadena beta de HGF. Ejemplos de mutaciones que alterarían la estructura de la región de dimerización de la cadena beta de HGF incluyen mutaciones que introducen un residuo que está cargado o tiene una cadena lateral grande (por ejemplo, voluminosa) a la secuencia tipo silvestre, mediante el cual un residuo cargado puede dar como resultado interacciones repulsivas y una cadena lateral grande puede dar como resultado interacciones esféricas adversas. Además, mutaciones de cisteína (por ejemplo L622C, I664C, P500C y N497C) pueden también ser introducidas que están disponibles para modificación mediante reactivos alquilantes de tiol específicos tales como aquellos que contienen grupos maleimida y haloacetilo. En una modalidad, una mutación en la región de dimerización de cadena beta de HGF es una sustitución, inserción y/o cancelación tal como N497R o K; G498A o S; P500W, H o E; inserción entre T501 y R502 (por ejemplo, una inserción de R y/o S); o R502del. En una modalidad, una mutación en posición N497 no es N497F, A o E. En una modalidad, una mutación está en una o mas posiciones 495 a 503, en donde tal mutación podría alterar una dimepzación de cadena beta de HGF y/o enlace al receptor. En otras modalidades, mutaciones que afectan el dominio de dimenzación pueden ser combinadas con mutación en una o más posiciones fuera del dominio de dimenzación, por ejemplo, una mutación en o adyacente al sitio de escisión 494-495. Por ejemplo, en un mutante que se esperaría que sea no escindible (por ejemplo mutante doble R494E:V495G) y que también contiene una mutación en el dominio de dimerización, tal mutante no obstante exhibiría función biológica deteriorada aún si no es escindido ín vivo.

En algunas modalidades de una molécula antagonista de HGF/Met de la invención, la molécula comprende aminoácidos tipo silvestre en posición 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 y/o 702. En algunas modalidades de antagonistas de HGF/Met de la invención, los antagonistas comprenden mutaciones en posición L622 (por ejemplo, L622C o K) ; 1623 (por ejemplo, I623C) ; D626 (por ejemplo, D626K) ; L622 más D626 (por ejemplo, L622K más D626K); K663 (por ejemplo, K663C); 1664 (por ejemplo, I664C); R502 (por ejemplo, 502C); P500 (por ejemplo, P500C) ; N497 (por ejemplo, N497C); R494 mas 1623 (por ejemplo, R494E más I623C); N497 más G498 (por ejemplo, N497R más G498A, o N497K mas G498A); N497 mas P500 (por ejemplo, N497R más P500H, o N497K mas P500H) ; G498 mas P500 (por ejemplo, G498A más P500H) ; N497 más G498 mas P500 (por ejemplo, N497R más G498A más P500H o N497K mas G498A mas P500H) ; N497 más L622 (por ejemplo, N497R más L622K, o N497K más L622K) ; N497 más D626 (por ejemplo, N497R mas D626K o N497K más D626K) ; N497 más L622 más D626 (por ejemplo, N497R mas L622K más D626K o N497K más L622K mas D626K) . En una modalidad, una molécula antagonista de HGF/Met de la invención comprende una mutación en el sitio activo de HGF solo o en combinación con una o más de las mutaciones descritas en la presente. Mutaciones del sitio activo incluyen mutaciones en posición 667 y/o 704. Mutaciones apropiadas incluyen sustitución de una o ambas de estas posiciones con un C o un W. En general, una molécula antagonista HGF/Met de la invención comprende una molécula de HGF que tiene una mutación en la cadena beta de HGF que reduce una o mas de las características biológicas normalmente asociadas con HGF tipo silvestre. Por ejemplo, en una modalidad, la molécula tiene capacidad de señalización de C-Met reducida (por ejemplo, Met fosforilación) en comparación con HGF tipo silvestre. En otra modalidad, la molécula tiene habilidad reducida para estimular la migración celular en comparación con HGF tipo silvestre. En otra modalidad, la molécula tiene habilidad reducida para estimular la proliferación celular en comparación con HGF tipo silvestre. En otra modalidad, la molécula tiene habilidad reducida para estimular la angiogenesis en comparación con HGF tipo silvestre. Una molécula antagonista de HGF/Met de la invención comprende en general por lo menos una porción de la cadena a HGF que esta involucrada en el enlace a Met, enlazada a una cadena beta de HGF como se describe en la presente. Como se muestra por el análisis mutacional descrito en la presente, ciertas regiones y posiciones de aminoácido especificas, en la cadena beta de HGF juegan papeles importantes en modular funciones biológicas de HGF. Asi, en un aspecto, la invención también proporciona moduladores de HGF/Met que apuntan específicamente a estas regiones. Tales moduladores incluyen ácidos nucleicos tales como aptamero y polipeptidos tales como peptidos de enlace y anticuerpos. Como se usa en la presente, la letra antes de un número indica el aminoácido tipo silvestre correspondiente encontrado en la posición de aminoácido denotada por aquel número en un polipeptido de HGF humano tipo silvestre y la(s) letra (s) (si esta(n) presente (s)) después del numero indica el tipo de mutación/aminoácido (por ejemplo, aminoácido de sustitución, cancelación (del) o inserción (ins)). En un aspecto, la invención proporciona un mutante de HGF que tiene actividad moduladora de HGF/c-met, por ejemplo un antagonista de la actividad de HGF/c-met o una variante de HGF que exhibe una reducción, pero no una ausencia de actividad biológica de HGF (por ejemplo, actividad estimuladora de crecimiento celular) . En una modalidad, un antagonista de la invención es capaz de inhibir la actividad biológica de HGF tipo silvestre ín vivo o m vi tro (tal actividad biológica incluye pero no esta limitada a fosforilación del receptor, estimulación de proliferación celular, mejora de sobrevivencia celular, promoción de angiogénesis, inducción/promoción de migración celular) . En una modalidad, un mutante de HGF proporciona actividad promotora de crecimiento de célula reducida (por ejemplo, proliferación celular, sobrevivencia celular, angiogénico, migración celular) .

En una modalidad, una molécula antagonista de la invención compite con HGF tipo silvestre para el enlace a Met. En algunas de las modalidades, la molécula inhibe la multimerización del receptor c-met (por ejemplo, dimerización) . En algunas modalidades, la molécula comprende una cadena beta variante, (mutante) que tiene habilidad reducida para interactuar (por ejemplo, multimerizar/dimerizar ) con otra molécula de cadena beta. En algunas modalidades, la molécula inhibe la multimerización de cadena beta de HGF (por ejemplo, dimerización) . En algunas modalidades, la molécula se enlaza a c-met pero exhibe habilidad reducida para efectuar la activación de c-met (por ejemplo, como se indica por la fosforilación de c-met reducida, fosforilación de cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK) y/o migración celular dependiente de HGF/c-met reducida, proliferación celular, sobrevivencia celular, morfogénesis celular, angiogénesis, etc. ) . En cualquier molécula de la invención en donde una o más posiciones son mutadas en relación con la secuencia de contraparte tipo silvestre, la mutación puede ser de cualquier forma que altera el efecto funcional del residuo tipo silvestre correspondiente. Una mutación puede ser obtenida en cualquier forma apropiada conocida en el arte (y/o determinada empíricamente) por ejemplo, mediante sustitución, inserción, adición y/o cancelación. En algunas modalidades, una mutación comprende una sustitución no conservadora. Sustituciones ejemplares incluyen pero no están limitadas a aquéllas descritas en la presente (en particular en los ejemplos), por ejemplo con aminoácidos tales como alanina y sepna. En un aspecto, una molécula/sustancia (por ejemplo, moduladores de HGF/c-met como se describe en la presente) es enlazada a una toxina tal como un agente citotoxico. Estas moléculas/sustancias pueden ser formuladas o administradas en combinación con un aditivo/agente de mejora, tal como radiación y/o agente quimioterapeutico . La invención también proporciona métodos y composiciones útiles para modular estados de enfermedad asociados con la desregulacion del e e de señalización de HGF/c-met. Asi, en un aspecto, la invención proporciona un método para modular la activación de c-met en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una molécula antagonista de HGF/c-met de la invención, mediante el cual se modula la activación de c-met. En una modalidad, la molécula es un antagonista de HGF/c-met que inhibe la actividad de HGF/c-met. En una modalidad, el antagonista inhibe el enlace específico de beta HGF tipo silvestre a c-met. En un aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de una condición patológica asociada con la activación de c-met en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto un antagonista de c-met de la invención, mediante lo cual la activación de c-met es inhibida . La ruta de señalización de HGF/c-met está involucrada en múltiples funciones biológicas y fisiológicas en las que se incluye, por ejemplo estimulación de crecimiento celular (por ejemplo, proliferación celular, sobrevivencia celular, migración celular, morfogénesis celular) y angiogénesis . Así, en otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento celular activado por c-met (por ejemplo, proliferación y/o sobrevivencia) . El método comprende poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de la invención, mediante lo cual se inhibe la proliferación celular asociada con la activación de c-met. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis, el método comprende administrar a una célula, tejido y/o sujeto con una condición asociada con la angiogénesis anormal un antagonista de HGF/Met de la invención, mediante lo cual se inhibe la angiogénesis . En un aspecto, la invención proporciona el uso de un antagonista de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como cáncer, tumor, una alteración proliferativa celular, una alteración inmune (tal como autoinmune) y/o una alteración relacionada con angiogénesis . El antagonista puede ser de cualquier forma descrita en la presente, en las que se incluyen anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, polipeptido (por ejemplo, un oligopeptido, un mutante/variante de polipeptido de HGF) , acido nucleico (aptamero) o una combinación de los mismos. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un acido nucleico de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como cáncer, tumor, una alteración proliferativa celular, una alteración inmune (tal como autoinmune) y/o una alteración relacionada con angiogenesis . En un aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como cáncer, tumor, alteración proliferativa celular, una alteración inmune (tal como autoinmune) y/o una alteración relacionada con angiogenesis . En un aspecto, la invención proporciona el uso de una célula huésped de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como cáncer, tumor, una alteración proliferativa celular, una alteración inmune (tal como autoinmune) y/o una alteración relacionada con angiogenesis . En un aspecto, la invención proporciona el uso de un articulo de manufactura de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como cáncer, tumor, una alteración proliferativa celular, una alteración inmune (tal como autoinmune) y/o una alteración relacionada con angiogénesis . En un aspecto, la invención proporciona el uso de un equipo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como cáncer, tumor, una alteración proliferativa celular, una alteración inmune (tal como autoinmune) y/o una alteración relacionada con angiogénesis . En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la proliferación celular activada por c-met, el método comprende poner en contacto una célula o tejido con una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, mediante lo cual se inhibe la proliferación celular asociada con la activación de c-met. En un aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de una condición patológica asociada con la desregulacion de la activación de c-met en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, mediante lo cual la condición es tratada . En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocito o ambos, el método comprende poner en contacto la célula con un antagonista de c- met de la invención, provocando mediante esto una inhibición del crecimiento de la célula. En una modalidad, la célula es puesta en contacto con HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, por medio de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende una célula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocito o ambos, el método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, tratando mediante esto efectivamente el mamífero. En una modalidad, la célula es puesta en contacto por HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, por medio de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular asociada con la expresión o actividad incrementada de c-met o factor de crecimiento de hepatocito o ambos, el método comprende administrar al un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, tratando o impidiendo mediante esto efectivamente la alteración proliferativa celular. En una modalidad, la alteración proliferativa es cáncer. En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de la célula es dependiente por lo menos en parte de un efecto potenciador de crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocito o ambos, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, inhibiendo mediante esto el crecimiento de la célula. En una modalidad, la célula es puesta en contacto por HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, por medio de un efecto parácrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento terapéuticamente de un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor es dependiente por lo menos en parte de un efecto potenciador de crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocito o ambos, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un antagonista de la invención, tratando mediante esto efectivamente el tumor. En una modalidad, la célula es puesta en contacto por HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, por medio de un efecto parácrino) . Los métodos de la invención pueden ser usados para afectar cualquier estado patológico apropiado, por ejemplo, células y/o tejidos asociados con la desregulación de la ruta de señalización de HGF/c-met. En una modalidad, una célula que es apuntada en un método de la invención es una célula de cáncer. Por ejemplo, una célula de cáncer puede ser una seleccionada del grupo que consiste de una célula de cáncer de pecho, una célula de cáncer colorectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de carcinoma papilar (por ejemplo, de la glándula tiroides), una célula de cáncer de colón, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga, una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamosa de cabeza y cuello, una célula de melanoma, una célula de mieloma múltiple y una célula de leucemia. En una modalidad, una célula que es apuntada en un método de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica . En una modalidad, una célula que es apuntada en un método de la invención es una célula displásica. En todavía otra modalidad, una célula que es apuntada en un método de la invención es una célula metastatica. Los métodos de la invención pueden comprender etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una modalidad un método comprende además una etapa en donde una célula y/o tejido apuntado (por ejemplo, una célula de cáncer) es expuesta a tratamiento de radiación o un agente quimioterapéutico . En una modalidad, una molécula de antagonista de HGF/Met de la invención es administrada a un sujeto en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, por ejemplo erlotinib (TARCEVA®) , pemetrexed (ALIMTA®) , bevacizumab (AVASTIN®) , gefitimb (IRESSA®), trastuzumab (HERCEPTIN®) , y rituximab (RITUXAN®) . La administración de agentes terapéuticos en terapia de combinación puede ocurrir concurrente o secuencialmente . Como se describe en la presente, la activación de c-met es un proceso biológico importante, la desregulación del cual conduce a numerosas condiciones patológicas. Así, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula que es apuntada (por ejemplo, una célula de cáncer) es una en la cual la activación de c-met es mejorada, en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. En una modalidad, un método de la invención provoca la muerte de una célula apuntada. Por ejemplo, el contacto con un antagonista de la invención puede dar como resultado la incapacidad de la célula para señalar por medio de la ruta de c-met, que da como resultado la muerte celular. La desregulación de activación de c-met (y así señalización) puede resultar de un número de cambios celulares, en los que se incluyen, por ejemplo sobreexpresion de HGF (ligando cognato de c-met) y/o c-met mismo. Así, en algunas modalidades, un método de la invención comprende apuntamiento de una célula, en donde c-met o factor de crecimiento de hepatocito o ambos es expresado más abundantemente por la célula (por ejemplo, una célula de cáncer) en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. Una célula que expresa c-met puede ser regulada mediante HGF de una variedad de fuentes, por ejemplo, de una manera autocpna o parácrina. Por ejemplo, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula apuntada es puesta en contacto/enlazada por factor de crecimiento de hepatocito expresado en una célula diferente (por ejemplo, vía un efecto paracpno) . La célula diferente puede ser del mismo o de un origen de tejido diferente. En una modalidad, una célula apuntada es puesta en contacto/enlazada por HGF expresado por la célula apuntada misma (por ejemplo, vía un efecto/bucle autocrino) . En algunas modalidades, los antagonistas de HGF/Met de la invención comprenden mutantes de HGF que comprenden modificaciones que mejoran su efecto inhibidor y/o terapéutico (en los que se incluyen, por ejemplo afinidad mejorada, propiedades farmacocineticas mejoradas (tales como vida media, estabilidad, velocidad de despeje) toxicidad reducida al sujeto). Tales modificaciones incluyen, por ejemplo modificaciones que involucran glicosilacion, PEG-ilación, sustitución con aminoácidos que no se presentan de manera estable en la naturaleza pero funcionalmente equivalentes, grupos enlazantes, etc. Modificaciones apropiadas son bien conocidas en el arte y ademas pueden ser determinadas empíricamente como sea necesario. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o mas antagonistas de HGF/c-met de la invención y un portador. En una modalidad, el portador es aceptable farmacéuticamente. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un antagonista de HGF/c-met de la invención. En una modalidad, un acido nucleico de la invención codifica un antagonista de HGF/c-met que es o comprende un polipéptido (por ejemplo, un mutante/variante de HGF) . En una modalidad, un acido nucleico de la invención codifica un antagonista de HGF/c-met que es o comprende un anticuerpo o fragmento del mismo. En un aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un acido nucleico o un vector de la invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo un vector recombinante tal como un vector de expresión.

Cualquiera de una variedad de células huésped pueden ser usadas. En una modalidad, una célula huésped es una célula procarióntica, por ejemplo E . coli . En una modalidad, una célula huésped es una célula eucarióntica, por ejemplo una célula mamífera tal como célula de ovario de hámster chino (CHO) . En un aspecto, la invención proporciona métodos para la fabricación de un antagonista de HGF/c-met de la invención.

Por ejemplo, la invención proporciona un método de fabricación de un antagonista que es o comprende un anticuerpo (o fragmento del mismo) , el método comprende expresar en una célula huésped apropiada un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo (o fragmento del mismo) y recuperar el anticuerpo. En otro ejemplo, la invención proporciona un método de fabricación de un antagonista de HGF/c-met que es o comprende un polipeptido (tal como un mutante/variante de HGF), el método comprende expresar en una célula huésped apropiada un vector recombinante de la invención que codifica el polipeptido y recuperar el polipeptido. En un aspecto, la invención proporciona un articulo de manufactura que comprende un recipiente y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende uno o mas antagonistas de HGF/c-met de la invención. En una modalidad, la composición comprende un acido nucleico de la invención. En una modalidad, una composición que comprende un antagonista de HGF/c-met comprende ademas un portador, que en algunas modalidades es aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, un articulo de manufactura de la invención comprende ademas instrucciones para administrar la composición a un sujeto. En un aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o mas antagonistas de HGF/c-met de la invención y un segundo recipiente que comprende una solución reguladora del pH . En una modalidad, la solución reguladora del pH es aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, una composición que comprende un antagonista de HGF/c-met comprende ademas un portador, que en algunas modalidades es aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, un equipo comprende ademas instrucciones para administrar la composición a un sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 (A) ilustra la caracterización de varios mutantes de HGF. Se ejemplifica tanto la inserción N-terminal de cadena beta de HGF y los mutantes de dimepzacion de cadena beta de HGF. Los datos de "migración celular" son concernientes con la migración de células MDA-MB435 en presencia de HGF de plena longitud que contiene la(s) mutación (es) indicada (s), expresado como porcentaje de migración en presencia de HGF tipo silvestre. Los datos de "enlace de ß/MetlgG HGF" son concernientes con el enlace de la cadena beta de HGF (que contiene la(s) mutación (es) indicada (s)) a MetlgG, expresada como la proporción de IC50 (mutante) a IC50 (tipo silvestre) en un análisis de enlace de competencia. En estos datos WT se refiere al mutante C604S; los mutantes beta de HGF también contenían esta mutación. Nota : como referencia general, las mutaciones son indicadas en negritas si se espera que rompan las interacciones de cadena beta-cadena beta potenciales y las mutaciones son indicadas en cursivas y subrayadas (en negritas o sin negritas) si se espera que rompan la inserción del término N. Estas expectaciones están basadas en el efecto predominante observado o esperado para las mutaciones respectivas-esto es, efecto ya sea sobre interacciones de cadena beta-cadena beta o habilidad del término N de cadena beta para insertarse a un sitio activo/cavidad de enlace. A pesar de esto, el experimentado en el arte sería fácilmente apto de determinar si una mutación particular tendría uno o ambos efectos, ya sea indicados como tal o no en la figura ÍA. Por ejemplo, en algunas instancias, una mutación puede afectar tanto interacciones de cadena beta-cadena beta e inserción del término N o en algunas instancias una mutación indicada en la figura ÍA como se espera que afecte interacciones de cadena beta-cadena beta puede empíricamente ser mostrada para afectar la inserción del termino N. Similarmente, los valores de enlace de Met aparentemente "deteriorados" son indicados en cursivas y valores de enlace aparentemente "normales" son indicados en texto en negritas, aunque el grado de "deterioro" y "normalidad" es relativo. Figura 1 (B) Enlace de HGF de plena longitud que contiene la(s mutación (es) indicada (s) a Met, tal como es medida en un análisis de enlace de competencia. Los datos son expresados como una proporción de IC50 (mut) a IC50 (tipo silvestre) . Figura 1 (C) Inhibición de migración y proliferación celular mediante HGF de plena longitud que contiene la(s) mutación (es) indicada (s) . La cantidad de migración celular y actividad de proliferación respectivamente, en presencia de HGF mutante y HGF tipo silvestre (HGF tipo silvestre 1 nM para migración; HGF tipo silvestre 0.25 nM para proliferación) es expresada como un porcentaje de actividad observada en presencia de HGF tipo silvestre solo. Figura 2 (A) Inhibición de fosforilación de Met dependiente de HGF en células de carcinoma de pulmón A549 por mutantes HGF como se indica; R424A:R494E se refiere a HGF de una sola cadena. La cantidad de fosforilación de Met es indicada como porcentaje de control (que es la cantidad observada en presencia de HGF tipo silvestre 0.5 nM) . Figuras 3 (A) y (B) Fosforilación de Met en células A549 en presencia de HGF tipo silvestre y mutante. La cantidad de fosforilación de Met como se indica es un porcentaje de fosforilación máxima observada en presencia de HGF tipo silvestre a cada una de las respectivas concentraciones de HGF tipo silvestre. Figura . Actividad angiogenica en presencia de HGF mutante. La cantidad de angiogenesis es indicada como numero de brotes/perla en presencia de mutantes HGF como se indica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura para modular la ruta de señalización de HGF/c-met. Detalles de estos métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura son provistos en la presente. Técnicas generales La practica de la presente invención empleara, a no ser que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (en las que se incluyen técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad del arte. Tales técnicas son explicadas plenamente en la literatura, tales como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods ín Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols ín Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and pepodic updates); "PCR:The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988).

Definiciones Como se usan en la presente, las referencias a nombres de aminoácidos pueden ser las designaciones aceptadas en el arte en una o mas de las siguientes formas, todas las cuales son usadas intercambiablemente en la presente: (i) nombre completo (por ejemplo, tpptofano, serina, glicina, etc.) (11) abreviaturas de 3 letras (por ejemplo Trp, Ser, Gly, etc.) y (m) designaciones de una letra (por ejemplo, W, S, G, etc. ) . "Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácido" con respecto a una secuencia de péptidos o polipéptidos es definido como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácido en la secuencia de péptidos o polipeptidos especifica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el por ciento máximo de identidad de secuencia y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación por propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede ser obtenida de varias maneras que están dentro de la habilidad en el arte, por ejemplo, utilizando elementos de programación de computadora disponibles públicamente tales como elementos de programación BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquéllos experimentados en el arte pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, en los que se incluyen cualesquier algoritmos necesarios para obtener la alineación máxima sobre la plena longitud de las secuencias que son comparadas. Sin embargo, por propósitos en la presente, los valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos son generados utilizando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2, como se describe en la Patente Estadounidense No. 6,828,146. Como se usa en la presente, los términos "péptido" y "polipéptido" son usados intercambiablemente, excepto que el término "péptido" se refiere en general a un polipéptido que comprende menos de 200 aminoácidos contiguos. El termino "péptido" se refiere en general a una secuencia contigua y relativamente corta de aminoácidos enlazados por enlaces de peptidilo. Comunmente pero no de manera necesaria, un peptido tiene una longitud de aproximadamente 2 a 50 aminoácidos, 4-40 aminoácidos o 10-30 aminoácidos. El termino "vector", como se usa en la presente, se propone referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vectores un "plasmido" que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular al cual segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped a la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden ser integrados al genoma de una célula huésped después de la introducción a la célula huésped y mediante estos son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales son enlazados operativamente. Tales vectores son denominados en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes") . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes están frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser usados intercambiablemente, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. "Polinucleotido" o "ácido nucleico", como se usan intercambiablemente en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoximbonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos o cualquier sustrato que puede ser incorporado a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura del nucleótido puede ser impartida antes o después del ensamble del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes que no son nucleotidos. Un polinucleotido puede ser modificado adicionalmente después de la síntesis, tal como mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo "coronas", sustitución de uno o más de los nucleotidos que se presentan de manera estable en la naturaleza con un análogo, modificaciones de internucleótido tales como, por ejemplo aquéllos con enlaces sin cargar (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbonatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, foforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquéllos que contienen porciones pendientes, tales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, pli-L-lisina, etc) , aquéllos con intercaladores (por ejemplo, acridma, psoralen, etc.), aquéllos que contienen agentes quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquéllos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), también como formas sin modificar del (los) polinucleótido (s ) . Ademas, cualquiera de los grupos de hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares pueden ser reemplazados, por ejemplo mediante grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o pueden ser conjugados a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o sustituido con aminas o porciones de grupo de coronación orgánicas de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidrox los pueden también ser derivados a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos pueden también contener formas análogas de ribosa o azúcares de desoxiribosa que son en general conocidos en el arte, en los que se incluyen, por ejemplo 2'-0-met?l-, 2'-0-al?l, 2' -fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares . alfa . -anoméricos , azúcares epimépcos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósido abásico tales como metil pboside. Uno o más enlaces de fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen, pero no están limitados a, modalidades en donde el fosfato es reemplazado por P (O) S ( "tioato" ) , P ( S) S ("ditioato") , " (0)NR.sub.2 ("amidato") , P(0)R, P(0)0R', CO o CH.sub.2 ("formoacetal" ) , en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquil (1-20C) sustituido o sin sustituir que contiene opcionalmente un enlace de éter (-0-), aplo, alquenllo, cicloalquilo, cicloalquenilo, o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente, en los que se incluyen ARN y ADN.

"Oligonucleotido", como se usa en la presente, se refiere en general a polinucleotidos cortos, en general de una sola hebra, en general sintéticos, que son en general pero no necesariamente, menores de aproximadamente 200 nucleotidos de longitud. Los términos "oligonucleotido" y "polmucleotido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para polinucleotidos es igual y plenamente aplicable a oligonucleotidos . El termino "factor de crecimiento de hepatocito" o "HGF", como se usa en la presente, se refiere, a no ser que se indique de otra manera específicamente, a cualquier polipeptido de HGF natural o variante (ya sea natural o sintético) que es capaz de activar la ruta de señalización de HGF/c-met bajo condiciones que permiten que tal proceso ocurra. El término "HGF tipo silvestre" se refiere en general a un polipeptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteina de HGF que se presenta de manera estable en la naturaleza. El termino "secuencia de HGF tipo silvestre" se refiere en general a una secuencia de aminoácidos encontrada en un HGF que se presenta de manera estable en la naturaleza. La frase "no deteriora sustanclalmente", "no reduce sustanclalmente", "son sustanclalmente similares" o "son sustanclalmente equivalentes" y variaciones de las mismas, como se usa en la presente, denotan un grado de similapdad suficientemente alto entre dos valores numéricos, de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores de poco o ningún significado biológico en el contexto de la característica biológica medida por los valores. La diferencia entre los dos valores es preferiblemente menor de alrededor de 50%, preferiblemente menor de alrededor de 40%, preferiblemente menor de alrededor de 30%, preferiblemente menor de alrededor de 20%, preferiblemente menor de alrededor de 10%. Ejemplos de "dos valores numéricos" incluyen un valor asociado con una proteina tipo silvestre y un valor asociado con una forma mutada de la proteina. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" son usados intercambiablemente en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monclonales de plena longitud o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos bisespecificos en tanto que exhiban la actividad biológica deseada) y pueden también incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe en mayor detalle en la presente) . Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado por afinidad. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden solo una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción retiene preferiblemente por lo menos una, preferiblemente la mayoría o todas las funciones normalmente asociadas con aquella porción cuando esta presente en un anticuerpo intacto. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo intacto y así retiene la habilidad para enlazar antígeno. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fc, retiene por lo menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región de Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como enlace de FcRn, modulación de vida media de anticuerpo, función de ADCC y enlace de complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal fragmento de anticuerpo puede comprender en el brazo de enlace de antígeno enlazado a una secuencia de Fc capaz de conferir esta habilidad in vivo al fragmento. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de manera estable en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo policlonales que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante sobre el antigeno. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Estadounidense No. 4,816,567; y Morpson et al . , Proc . Na tl . Acad . Sci USA 81: 6851-6855 (1984) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Por la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para reafirmar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustanclalmente todos de por lo menos uno y comunmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustanclalmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustanclalmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprendera opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), comunmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales véase Jones et al . , Na ture 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Na ture 332:323-329 (1988); y Presta, Curr . Op Struct . Biol . 2:593-596 (1992). Véanse también artículos de revistas y referencias citadas en la misma: Vaswam and Hamilton, Ann . Allergy, As thma & Immunol . 1:105-115 (1998); Hams, Biochem , Soc . Transa ctions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr Op Biotech . 5:428-433 (1994). Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha fabricado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos como se revela en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antigeno no humanos. Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o mas CDR del mismo, que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por antigeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee aquella (s) alteración (es ) . Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o aun picomolares por el antigeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en el arte. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante entremezcla de dominio de VH y VL . La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura es descrita por: Barbas et al . Proc Na t . Acad. Sci , USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al . Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al . J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . , J. Immunol . 154(7) :3310-9 (1995) ; y Hawkms et al , J. Mol . Biol . 226 :889-896 (1992). Un anticuerpo "bloqueador" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se enlaza. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos de antagonista preferidos inhiben sustanclalmente o por completo la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista", como se usa en la presente, es un anticuerpo que imita por lo menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés. Una "alteración" o "condición patológica" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Estas incluyen alteraciones o enfermedades crónicas y agudas en las que se incluyen aquéllas condiciones patológicas que predisponen el mamífero a la alteración en cuestión. Ejemplos no limitantes de alteraciones a ser tratadas en la presente incluyen tumores malignos y benignos o cánceres; malignidades sin leucemia y lmfoides; alteraciones neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicas y otras alteraciones glandulares, macrofagales, epiteliales, estomales y blastocólicas y alteraciones inflamatorias, inmunológicas, neurodegenerativas, alteraciones relacionadas con angiogénesis y alteraciones relacionadas con defectos mitocondpales o metabólicos. Los términos "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" se refieren a alteraciones que están asociadas con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es cáncer. "Tumor" como se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento y proliferación de célula neoplásica, ya sea maligna o benigna y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "alteración proliferativa celular", "alteración proliferativa" y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se hace referencia en la presente . Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está normalmente caracterizada por el crecimiento/proliferación de célula sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a, carcinoma, lmfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen mieloma múltiple, cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colón, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon (por ejemplo, carcinoma de célula renal), cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Como se usa en la presente, "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que es tratada y puede ser efectuado ya sea por profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables del tratamiento incluyen impedir la presencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevenir metástasis, disminuir la velocidad de avance de enfermedad, mejora o alivio del estado de enfermedad y remisión o prognosis mejorada. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son usados para retardar el desarrollo de una enfermedad o alteración. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la habilidad de la sustancia, molécula, agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualesquier efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula agonista o antagonista son sobrepasados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Comunmente pero no de manera necesaria, puesto que una dosis profiláctica es usada en sujetos antes de o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. El termino "agente citotoxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe la función de células y/o provoca destrucción de células. El término se propone incluir isótopos radiactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapeuticos por ejemplo metotrexate, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposide), doxorbicina, melfalana, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animal, en los que se incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas y los varios agentes de antitumor o anticáncer revelados posteriormente en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos posteriormente en la presente. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; azidirinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas en las que se incluyen altretamina, trietilenmelamma, trietilenfosforamida, trietilentiofos-foramida y tpmetilolomelanina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; una camtotecina (en los que se incluyen el análogo sintético topotecana) ; briostatma; calistatina; CC-1065 (en las que se incluyen sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptofícinas (particularmente cpptoficina 1 y criptoficma 8); dolastatina; duocarmicina (en los que se incluyen los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); eleuterrobma; pancratistatma; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafacma, colofosfamida, estramustina, ífosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalana, novembichma, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, nitrosureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemostma, lomustina y ranimnustina; antibióticos tale como los antibióticos de enedina (por ejemplo, calicheamicma, especialmente calicheamicma gamma II y calichamicina omegall (véase por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemisina en los que se incluyen dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; también como cromoforo de neocarcmostatina y cromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionados), aclacinomismas, actmomisina, autramisina, azaserina, bleomisinas, cactinomisina, carabisina, carminomicina, carzínofílina, cromomisina, dactmomisina, daunorubicina, detorubicina, 6-d?azo-5-oxo-L-norleuc?na, doxorubicina ADRIAMYCIN® (en los que se incluyen morfolina-doxorubicma , cianomorfolino-doxorubicina, 2-p?rol?no-doxorubicina y deoxidoxorubicma) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, oleomicinas, peplomicma, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicma, estreptonigrina, estreptosocina, tubersidina, ubenimex, zinostatina, zorbicina; anti-metabolitos tales como metotrexate y 5-fluororacilo (5-FU); análogos de acido folico tales como denoptepna, metotrexate, teropterina, tpmetrexate; análogos de pupna tales como fludarabina, 6-mercaptopur?na, tiamiprma, tiaguanina; análogos de pipmidina tales como ansitabina, azacitidina, 6-azaur?d?na, carmofur, citarabina, didesoxiupdina, doxiflupdina, enositabma, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epit ostanol, mep tiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de acido folico tales como acido frolmico; aceglatona; glicosido de aldofosfamida ; acido aminolevulmico; enilurasilo; amsacpna; bestrabusilo; bisantreno; edatraxate; defofamina; demecolsina; diasicuona; elfornitina; acetato de eliptinio, una epotilona; etiglusido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentman; lonidainina; maitansmoides tales como maitansina y ansamitosinas ; mitoguasona; mitoxantrona ; mopidanmol; nitraerina; pentostatma; fenamet; pirarubicina; losoxantrona ; acido podofílinico, 2-et?lh?dras?da ; procarbasina; complejo de polisacarido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; rasoxano; risoxina; sisofiran; espirogermanio; acido tenuasonico; tiasicuona; 2,2', 2 " -tpclorotrietilamina, tpcotesenos (especialmente toxina T-2, verracupna A, poridina A y anguidina) ; uretana; vindesina; dacarbasina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gasitosina; arabinoside ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Ppnceton, N.J.), ABRAXANE™ libre de cremofor, formulación de nanoparticulas diseñada por albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y doxetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulene Rorer, Antony, France); cloranbusilo; gemsitabma GEMZAR®; 6-t?oguan?na; mercaptopurina; metotrexate; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vmblastina; platino; etoposido (VP-16); ífofosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposide; edatrexato; daunomisma; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difloro etilornitma (DMFO); retinoides tales como acido retinoico; capecitabina y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores . También incluidos en la definición de "agente quimioterapeutico" anterior están los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre tumores tales como anti-estrogenos y moduladores de receptor de estrogenos selectivos (SERM), en los que se incluyen por ejemplo, tamoxifeno, (en los que se incluyen tamoxifeno NOLVADEX®) , raloxifeno, droloxifeno, 4-h?drox?tamox?feno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrogeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -ímidasoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestame, fadrosol, vorosol RIVISOR®, letrosol FEMARA®, y anastrosol ARIMIDEX® y anti-androgenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leprolulo y goserelina; también como troxasitabina (un análogo de 1, 3-d?oxolano nucleosido de citosina); oligonucleotidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en la proliferación de célula aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; ribosimas tales como un inhibidor de expresión VEGF (por ejemplo ribosima ANGIOZYME®) y un inhibidor de expresión de HER2, vacunas tales como vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN© inhibidor de topoisomerasa 1; ABARELIX® rmRH; y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores. Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula cuyo crecimiento es dependiente de la activación de HGF/c-met ya sea in vi tro o ín vivo . Asi, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células dependientes de HGF/c-met en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente a fase S) , tales como agentes que inducen la detención Gl y detención de fase M. Bloqueadores de fase M incluyen las vincas (vincristina y vmblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se derraman sobre la detención de fase S, por ejemplo, agentes de alquilacion de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbacina, mecloretamina, cisplatma, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del árbol de yew. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc, Rorer) , derivado del yew europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . El paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de microtúbulos a partir de dimeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al impedir la despolimerizacion, que da como resultado la inhibición de mitosis en células. "Doxorubicina" es un antibiótico de antraciclma . El nombre químico completo de doxorubicina es (8S-c?s) -10- [ (3-am?no-2, 3, 6-tr?d?sox?-alfa-L-lyxo-hexap?ranos?l)ox?]-7, 8, 9, 10-tetrah?dro-6, 8, ll-tph?drox?-8- (hidroxiacetil) -l-metox?-5, 12-naptasendiona . Antagonistas de HGF/Met-péptidos/polipéptidos (en los que se incluyen anticuerpos) Un aspecto de la invención es concerniente con péptidos/polipéptidos aislados y moduladores de anticuerpo de interacción de cadena beta-cadena beta de HGF e interacción de HGF-Met. En una modalidad, los moduladores (tales como péptidos/polipéptidos y anticuerpos) pueden ser aislados de fuentes de células o fuentes de tejido mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteína estándar. En otra modalidad, los moduladores son producidos mediante técnicas de ADN recombinantes . Como una alternativa a la expresión recombinante, los moduladores pueden ser sintetizados químicamente utilizando técnicas de síntesis de peptidos estándar. Las moléculas antagonistas de HGF/Met de la invención incluyen aquellas descritas en la figura 1. La invención también proporciona una proteina mutante o variante cualquiera de los cuales residuos pueden ser cambiados de los residuos correspondientes de estos peptidos/polipeptidos, en tanto que todavía codifica un peptido/polipeptido que mantiene la actividad moduladora. En una modalidad, una variante de un antagonista de peptido/polipeptido tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad de secuencia de aminoácido con la secuencia de un antagonista de peptido/polipeptido de referencia. En general, la variante exhibe sustanclalmente la misma o mayor afinidad de enlace que el antagonista de peptido/polipeptido enlazante de referencia, por ejemplo por lo menos 0.75X, 0.8X, 0.9X, l.OX, 1.25X o 1.5X la afinidad de enlace del peptido/polipeptido/ligando enlazante de referencia, en base a una unidad/métrica de cuantificacion de análisis de enlace aceptado en el arte, en tanto que retiene un grado deseable de actividad antagonista. En general, las variantes de la invención incluyen variantes en las cuales residuos en una porción particular en la secuencia han sido sustituidos por otros aminoácidos e incluye ademas la posibilidad de insertar un residuo o residuos adicionales entre dos residuos de la proteina/péptido original también como la posibilidad de cancelar uno o más residuos de la secuencia original o agregar uno o más residuos a la secuencia original. Cualquier sustitución, inserción o cancelación de aminoácidos es abarcada por la invención. En circunstancias favorables, la sustitución es una sustitución conservadora como se describe en la presente. Un peptido, polipeptido, proteína o fragmento biológicamente activo "aislado" o "purificado" es separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes incluyen materiales que interferirían comúnmente con los usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros materiales protináceos o no proteináceos. Las preparaciones que tienen de preferencia menos de 30% en peso seco de material contaminante no deseado (contaminantes), preferiblemente menor de 20%, 10% y preferiblemente menor de 5% de contaminantes son considerados sustanclalmente aislados. Un péptido/polipéptido producido recombinantemente, aislado o porción biológicamente activa del mismo está de preferencia sustanclalmente libre de medio de cultivo, esto es, el medio de cultivo representa de preferencia menos de 20%, preferiblemente menos de alrededor de 10% y preferiblemente menos de alrededor de 5% del volumen de una preparación de peptido/polipéptido . Ejemplos de contaminantes incluyen desechos celulares, medios de cultivo y sustancias usadas y producidas durante la síntesis in vi tro del péptido/polipéptido. Sustituciones conservadoras de péptido/polipéptido son mostradas en la tabla A bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces cambios más sustanciales denominadas "sustituciones ejemplares" en la tabla A o como se describe además posteriormente en la presente con referencia a clases de aminoácidos pueden ser introducidas y los productos seleccionados. Tabla A Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del peptido/polipéptido se efectúan al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura de la cadena fundamental del polipéptido en el área de sustitución; por ejemplo, como una conformación de ho a o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) la cadena lateral global. Los residuos que se presentan de manera estable en la naturaleza son divididos en grupos en base a propiedades de cadena lateral comunes: (l)h?drofób?cos:norleus?na,met,ala,val,leu,?le; (2 ) hidrofilieos neutros: cys, ser, thr; (3)ác?dos:asp,glu; (4)bás?cos:asn,gln,h?s,lys,arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena : gly, pro; y ( 6) aromáticos : trp, tyr, phe . Las sustituciones no conservadoras abarcarán intercambiar un miembro de una éstas clases por otra clase. Variantes de moduladores de anticuerpo pueden también ser fabricadas en base a información conocida en el arte, sin afectar sustanclalmente la actividad de anticuerpo. Por ejemplo, variantes de anticuerpo pueden tener por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Para anticuerpos, los sitios de mayor ínteres para mutagenesis sustitucional incluye en general las regiones hipervariables, pero alteraciones de región de estructura (FR) son también contempladas. Para anticuerpos, un tipo de variante sustitucional involucra sustituir uno o mas residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) vapante(s) resultante (s ) seleccionada ( s ) para desarrollo adicional tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original del cual son generadas. Una manera conveniente para generar tales variantes sustitucionales involucra maduración de afinidad usando despliegue de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervapable (por ejemplo, 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Los anticuerpos asi generados son desplegados sobre partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas por fago son luego seleccionadas en cuanto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se revela en la prsente. Con el fin de identificar sitios de región hipervapable candidatos para modificación, se puede efectuar mutagenesis de barrido de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace de antigeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a selección como se describe en la prseente y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes pueden ser seleccionados para desarrollo adicional. Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo son preparadas mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácido que se presentan de manera estable en la naturaleza) o preparación mediante mutagénesis moderada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo. Puede ser deseable introducir una o más modificaciones de aminoácido en una región Fc de los pol péptidos de inmunoglobulina de la invención, generando mediante esto una variante de la invención Fc . La variante de región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región IgGl , IgG2 , IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido que incluyen aquel de una cisteína de engozne. En una modalidad, la variante de región Fc puede exhibir afinidad de enlace de receptor Fc neonatal alterada (FcRn) . Tales regiones de Fc variantes pueden comprender una modificación de aminoácido en cualquiera o más de las posiciones de aminoácido 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 o 447 de la región de Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquélla del índice EU como en Kabat. Las variantes de región Fc con enlace reducido a un FcRn pueden comprender una modificación de aminoácido en cualquiera o más de posiciones de aminoácido 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 o 447 de la región Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquélla del índice EU como en Kabat. Las variantes de región de Fc mencionadas anteriormente pueden alternativamente exhibir enlace incrementado a FcRn y comprender una modificación de aminoácido en cualquiera o más de posiciones de aminoácido 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la región Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquélla del índice EU como en Kabat. La variante de región Fc con enlace reducido a un Fc(R puede comprender una modificación de aminoácido en cualquiera de una o más de posiciones de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439 de la región Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquélla del índice EU como en Kabat. Por ejemplo, la variante de región Fc puede exhibir enlace reducido a un Fc(RI y comprender una modificación de aminoácido en cualquiera de una o más de posiciones de aminoácido 238, 265, 269, 270, 327 o 329 de la región de Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquélla del índice EU como en Kabat. La variante de región Fc puede exhibir enlace reducido a un Fc(RII y comprender una modificación de aminoácido en cualquiera de una o más de posiciones de aminoácido 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 o 439 de la región de Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquélla del índice EU como en Kabat. La variante de región Fc de interés puede exhibir enlace reducido a un Fc(RII y comprender una modificación de aminoácido en una o mas de posiciones de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 416, 434, 435 o 437 de la región de Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquella del índice EU como en Kabat. Las variantes de región Fc con enlace Clq alterado (esto es mejorado o disminuido) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) son descritas en 099/51642. Tales variantes pueden comprender una sustitución de aminoácidos en una o mas de posiciones de aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 o 334 de la región Fc . Véase también, Duncan & Winter Nature 322:738-40(1988); Patente Estadounidense No. 5,648,260 ; Patente Estadounidense No. 5,624,821 y W094/29351 concernientes con variantes de región de Fc . Construcción de vector Secuencias de polmucleotidos que codifican los peptidos/polipeptidos descritos en la presente pueden ser obtenidas utilizando técnicas recombinantes estándar. Secuencias de polinucleotidos deseadas pueden ser aisladas y secuenciadas a partir de células fuente apropiadas. Las células fuentes para anticuerpo incluirían células que producen anticuerpo tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleotidos pueden ser sintetizados utilizando sintetizador de nucleotidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican las inmunoglobulinas son insertadas a un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleotidos heterologos en una célula huésped. Muchos vectores que están disponibles y conocidos en el arte pueden ser usados por el proposito de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos a ser insertados al vector y la célula huésped particular a ser transformada con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo o ambos) y su compatibilidad con la célula huésped particular en la cual reside. Los componentes de vector incluyen en general pero no están limitados a: un origen de replicación (en particular cuando el vector es insertado a una célula procarióntica) , un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de enlace de ribosoma (RBS), una secuencia de señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de transcripción. En general, vectores de plásmido que contienen replicón y secuencias de control que son derivadas de una especie compatible con la célula huésped son usados en relación con estos huéspedes. El vector porta ordinariamente un sitio de replicacion, también como secuencias de marcación que son capaces de proporcionar selección genotípica en células transformadas. Por ejemplo, E . coli es transformado comúnmente utilizando pBR322, un plasmido derivado de una especie de E . col i . Pbr322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y así proporciona un medio fácil para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados u otros plasmados microbianos o bacteriófago puede también contener o ser modificado para contener, promotores que pueden ser usados por el organismo microbiano para expresión de proteínas endógenas. Ademas, vectores de fago que contienen replicón y secuencias de control que son compatibles con el microorganismo huésped pueden ser usados como vectores de transformación en relación con estos huespedes. Por ejemplo, el bacteriófago tal como ?GEM.TM.-ll puede ser utilizado en la fabricación de un vector recombinante que puede ser usado para transformar células huésped susceptibles tales como E. coli LE392. Promotores ya sea constitutivos o inducibles pueden ser usados en la presente invención, de acuerdo con las necesidades de una situación particular, que serán indagadas por aquel de habilidad en el arte. Un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. El promotor seleccionado puede ser enlazado operativamente a ADN de cistrón que codifica un polipéptido descrito en la presente al remover el promotor del ADN fuente vía digestión de enzimas de restricción e inserción de la secuencia promotora aislada al vector de elección. Tanto la secuencia promotora nativa como núcleos promotores heterólogos pueden ser usados para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes objetivo. Sin embargo, los promotores heterólogos son preferidos, ya que permiten en general mayor transcripción y rendimientos más altos de gen objetivo expresado en comparación con el promotor de polipéptido objetivo natural. Promotores apropiados para uso con huésped procapónticos incluyen el promotor PhoA, los sistemas de promotor de beta-galactamasa y lactosa, un sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor ta c o el promotor trc . Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fago conocido) son apropiados también. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo mediante esto que el técnico experimentado los ligue operativamente a cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas objetivo (Siebenlist et al. (1980) Cell 20:269) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualesquier sitios de restricción requeridos. En algunas modalidades, cada cistrón dentro de un vector recombinante comprende un componente de secuencia de señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN de polipeptido objetivo que es insertado al vector. La secuencia de señal seleccionada por el proposito de esta invención debe ser una que es reconocida y procesada (esto es, escindida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procarionticas que no reconocen y procesan las secuencias de señal naturales a los polipeptidos heterologos, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariontica seleccionada por ejemplo del grupo que consiste de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp> o líderes de enterotoxina II estables térmicamente (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. Células huésped procarionticas apropiadas para expresar polipeptidos incluyen Arqueobacteria y Eubactepa, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo . Ejemplos de bacterias útiles incluyen Eschenchia (por ejemplo, E . coli ) , Bacilos (por ejemplo, B.subtilis), Enterobactenas, especie de Seudomonas (por ejemplo, P. aerugmosa), Salmonela tipimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus. Preferiblemente, se usan células gram-negativas . Preferiblemente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteoliticas e inhibidores de proteasa adicionales pueden deseablemente ser incorporados en el cultivo celular.

Producción de péptido/polipéptido Las células huespedes son transformadas o transfectadas con los vectores de expresión descritos anteriormente y cultivados en medios nutrientes convencionales modificados como sea necesario para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. La transfeccion se refiere a la absorción de un vector de expresión por una célula huésped ya sea que cualesquier secuencias de codificación sean en efecto expresadas o no. Numerosos métodos de transfeccion son conocidos para el técnico de experiencia ordinaria, por ejemplo, precipitación de CaP04 y electroporacion . La transfeccion exitosa es en general reconocida cuando cualquier indicación de la operación de este vector ocurre dentro de la célula huésped. Transformación significa introducir ADN al huésped procariontico, de tal manera que el ADN es replicable, ya sea como un elemento cromosomal o mediante integrante cromosomal. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se hace utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio es en general usado para células bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro método para transformación emplea polietilen glicol/DMSO. Todavía otra técnica usada es electroporacion . Las células procaponticas usadas para producir los péptidos/polipeptidos son cultivadas en medios conocidos en el arte y apropiadas para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios apropiados incluyen caldo de nuria (LB) más los complementos de nutrientes necesarios. En modalidades preferidas, los medios también contienen un agente de selección, escogido en base a la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procanonticas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se agrega ampicilma a medios para el cultivo de células que expresan gen resistente a ampicilma. Cualesquier complementos necesarios ademas de carbono, nitrógeno y fuentes de fosfato inorgánicas pueden también ser incluidos a concentraciones apropiadas introducidos solos o como una mezcla con otro complemento o medio, tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamma, tioglicolato, ditioepetntol y ditiotreitol . Las células huésped procariónticas son cultivadas a temperaturas apropiadas. Para el cultivo de E. col i , por ejemplo, la temperatura preferida fluctúa de aproximadamente 20 grados centígrados a aproximadamente 39 grados centígrados, más preferiblemente de alrededor de 25 grados centígrados a alrededor de 37 grados centígrados, aun mas preferiblemente alrededor de 30 grados centígrados. El pH del medio puede ser cualquier pH que fluctúa de alrededor de 5 a alrededor de 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E. coli, el pH es preferiblemente de alrededor de 6.8 a alrededor de 7.4 y mas preferiblemente alrededor de 7.0. Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión, la expresión de proteína es inducida ba o condiciones apropiadas para la activación del promotor. Por ejemplo, si se usa un promotor de PhoA para controlar la transcripción, las células huésped transformadas pueden ser cultivadas en un medio limitante de fosfato para inducción. Una variedad de otros inductores pueden ser usados, de acuerdo con el concepto de vector empleado, como es conocido en el arte. El peptido/polipeptidos descritos en la presente expresados en un organismo pueden ser secretados a y recuperados del pepplasma de las células huésped. La recuperación de proteina involucra comúnmente romper el microorganismo, en general por medios tales como choque osmótico, sonificación o lisis. Una vez que la célula se rompe, los desechos celulares o células enteras pueden ser removidas mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden ser purificadas adicionalmente, por ejemplo mediante cromatografía de resina de afinidad. Alternativamente, las proteínas pueden ser transportadas al medio de cultivo y aisladas del mismo. Las células pueden ser removidas del cultivo y el sobrenatante del cultivo es filtrado y concentrado para purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden ser aislados adicionalmente e identificados utilizando métodos comúnmente conocidos, tales como fraccionamiento o inmunoafmidad o columnas de intercambio iónico; precipitación de etanol; (HPLC) de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio filtración de gel utilizando, por ejemplo Sephadex G-75 resinas de afinidad hidrofobicas, afinidad de ligando utilizando un antigeno apropiado inmovilizado sobre una matriz y análisis de Western blot. Además de células huésped procariónticas, sistemas de células huésped eucapónticas están también bien establecidos en el arte. Huespedes apropiados incluyen líneas celulares mamíferas tales como CHO y células de insecto tales como aquéllas descritas posteriormente en la presente.

Purificación de péptido/polipéptido Los péptidos/polipeptidos que son producidos pueden ser purificados para obtener preparaciones que son sustanclalmente homogéneas para análisis y usos adicionales. Métodos de purificación de proteína estándar conocidos en el arte pueden ser usados. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación apropiados: fraccionamiento sobre columnas de inmunoafínidad o columnas de intercambio iónico, precipitación de etanol, (HPLC) de fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio cationico tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio, filtración de gel utilizando, por ejemplo Sephadex G-75.

Métodos de la invención La invención proporciona varios métodos a base del hallazgo de que mutaciones en ciertas regiones de la cadena beta de HGF dan como resultado modificación de las actividades biológicas de la molécula, mediante lo cual tales moléculas mutantes exhiben efectos antagonistas en la modulación de la ruta HGF/Met. Varias sustancias o moléculas (en los que se incluyen péptidos/polipéptidos, etc.) pueden ser empleadas como agentes terapéuticos de acuerdo con los métodos de la invención. Estas sustancias o moléculas pueden ser formuladas de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante lo cual el producto del mismo es combinado en mezcla con un vehículo portador aceptable farmacéuticamente. Las formulaciones terapéuticas son preparadas para almacenamiento al mezclar el ingrediente activo que tiene el grado de pureza deseado con portadores aceptables fisiológicamente opcionales, excipientes o estabilizadores (Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol . A. Ed . (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o mmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivimlpirolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagma, arginina o lisma; monosacáridos, disacápdos y otros carbohidratos en los que se incluyen glucosa, mañosa o dextpnas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio y/o sulfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ O PEG. Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o enseguida de la liofílizacion y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas de la presente en general son colocadas en un recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La ruta de administración esta de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo inyección o infusión mediante rutas intravenosa, intraperitoneal, mtracerebral , intramuscular, infraocular, intraartepal o intralesional, administración tópica o mediante sistemas de liberación sostenida. Las dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular contemplado. La determinación de la dosificación o ruta de administración apropiada está dentro de la habilidad del médico ordinario. Los experimentos en animales proporcionan una guía confiable para la determinación de dosis efectivas para terapia humana. El escalado de mterespecie de dosis efectivas se puede efectuar siguiendo los principios resumidos por Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling ín toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drugs Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp.42-96. Cuando se emplea la administración m vivo de una sustancia o molécula de la invención, las cantidades de dosificación normales pueden variar de alrededor de 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal mamífero o más por día, preferiblemente alrededor de uno microgramo de/kg/día a 10 mg/kg/dia, dependiendo de la ruta de administración. Guia en cuanto a las dosificaciones particulares y métodos de administración se proporcionan en la literatura; véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 4 , 657 , 760; 5, 206, 344 ; o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamientos y diferentes alteraciones, que la administración apunta a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar administración de manera diferente de aquélla a otro órgano o tejido. Cuando se desea la administración de liberación sostenida de una sustancia o molécula en una formulación con características de liberación apropiadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o alteración que requiere administración de la sustancia o molécula, se contempla la microencapsulación de la sustancia o molécula. La microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida se ha efectuado exitosamente con hormona de crecimiento humana (rhGH) , interferon- ( rhIFN-) , ?nterleuc?na-2 y MN rgpl20. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", ín Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp . 439-462; WO97/03692, WO96/40072, WO96/07399; y Patente Estadounidense No. 5,654,010. Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas fueron desarrolladas utilizando polímero de acido poli-lactico-co-glicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio intervalo de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico, pueden ser despejados rápidamente en el cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ser ajustada de meses a años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled reléase of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", m: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drugs Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp.1-41. La identificación de regiones dentro de la cadena beta de HGF que son criticas para la función de HGF en la ruta de señalización de HGF/Met proporcionan sitios dentro de la cadena beta de HGF contra los cuales antagonistas pueden ser apuntados. Ejemplos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleotido (que puede ser un aptámero) que se enlaza a regiones N-terminal y/o de dimerización de la cadena beta de HGF y en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli-y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos anti-idiotípicos y versiones quiméricas y humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, también como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Los aptameros son moléculas de acido nucleico que son capaces de enlazarse a una molécula objetivo. La generación y uso terapéutico de aptameros están bien establecidos en el arte. Véanse, por ejemplo Patente Estadounidense No. 5,475,096, y la eficacia terapéutica de Macugen® (Eyetech, New York) para el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad. Como se describe en la presente, una sustancia/molécula antagonista de HGF/Met de la invención puede ser un peptido o polipeptido (en lo que se incluyen un anticuerpo) . Métodos para obtener tales peptidos y polipeptidos son bien conocidos en el arte e incluyen seleccionar bibliotecas de peptido y polipeptido en cuanto a enlazantes a un antigeno objetivo apropiado. En una modalidad, antigenos objetivo apropiados comprenderían cadena beta de HGF (o porción de la misma que comprende la región N-terminal y/o región de dimerizacion) , que es descrita en detalle en la presente. En una modalidad, antigenos objetivo apropiados comprenderían Met, por ejemplo el dominio extracelular de Met. Bibliotecas de peptidos y polipeptidos son bien conocidas en el arte y pueden también ser preparadas de acuerdo con métodos del arte. Véase, por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 6,121,416 expedida a Clark et al., y Patentes Estadounidenses Nos. 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717 y 5,658,727 expedidas a Garrard et al. Bibliotecas de peptidos y polipeptidos fusionados a un componente de proteina heterologo, tal como una proteina de recubrimiento de fago, son bien conocidas en el arte, por ejemplo, como se describe en Clark et al. y Garrard et al., supra . Variantes de un primer enlazador de peptido o polipeptido seleccionado pueden ser generadas al seleccionar mutantes del peptido o polipeptido para obtener las características de ínteres (por ejemplo, mejorar la afinidad de enlace objetivo, farmacocinetica mejorada, toxicidad reducida, índice terapéutico mejorado, etc.) . Por ejemplo, una característica de ínteres puede ser la habilidad para enlazarse a Met pero habilidad reducida para activar actividades biológicas HGF-relacionadas tales como proliferación celular, fosforilación de Met, migración celular y angiogenesis . Técnicas de mutagenesis son bien conocidas en el arte y regiones para mutación estarían dentro de la cadena beta de HGF, en particular posiciones asociadas con la inserción del termino N de cadena beta de HGF y/o dimerizacion de cadena beta-cadena beta como se describen en la presente. Ademas, técnicas de mutagenesis de exploración (tales como aquellas basadas en el barrido de alanina) pueden ser especialmente útiles para determinar la importancia estructural y/o funcional de residuos de aminoácido individuales dentro de un pept do o pol peptido .

La determinación de la habilidad de una sustancia/molécula candidata de la invención para modular la señalización de HGF/c-met y/o actividades biológicas asociadas con la señalización puede ser efectuada al probar la capacidad moduladora de la sustancia/molécula en análisis m vi tro o ín vivo, que están bien establecidos en el arte, por ejemplo, como se describe en Okigaki et al., supra ; Matsumoto et al., supra ; Date et al., FEBS Let. (1997), 420:1-6; Lokker et al., supra ; Hartmann et al., supra ; Kirchhofer et al., J Biol. Chem. (2004), 279:39915-24; Stamos et al. (2004) EMBO J. 23:2325-35; Kirchhofer et al., FEBS Lett. (2005) 579:1945-50; y Nakatsu et al. (Microvasc.Res. 66:102,2003).

Anticuerpos de cadena beta de HGF La presente invención proporciona ademas métodos que comprenden el uso de anticuerpos. Anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, bisespec ficos y heteroconjugados. 1. Anticuerpos policlonales Los anticuerpos pueden comprender anticuerpos pol clonales . Métodos de preparación de anticuerpos policlonales son bien conocidos para el técnico experimentado.

Los anticuerpos policlonales pueden ser criados en un mamífero, por ejemplo, mediante una o mas inyecciones de un agente inmunizante y si se desea, un adyuvante. Comúnmente, el agente inmunizante y/o adyuvante sera inyectado en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o mtraperitoneales . El agente inmunizante puede incluir una cadena beta de HGF (o porción de la misma) o una proteina de fusión de la misma. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que es inmunizado. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen pero no están limitadas a hemosianina de lapa entallada, albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soya. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser usados incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante de MPL-TDM (monofosfopl lípido A, trialosa sintética dicornomicolato) . El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por el experimentado en el arte sin experimentación indebida. 2. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos pueden ser alternativamente anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando métodos de hibpdoma, tales como aquéllos descritos por Kohier and Milstem, Nature, 256:495 (1975). En un método hibpdoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, es inmunizado comunmente con un agente inmunizante para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se enlazaran específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los lmfocitos pueden ser inmunizados ín vi tro . El agente inmunizante incluirá comunmente la cadena beta de HGF (o porción de la misma) o protema de fusión de la misma. En general, se usan ya sea lmfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano o células de vaso o células de nodo linfático son usadas si se desean fuentes mamiferas no humanas. Luego los linfocitos son fusionados con una linea de célula inmortalizada utilizando un agente de fusión apropiado, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp . 59-103]. Las lineas celulares inmortalizadas son usualmente células mamíferas transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Usualmente, lineas de células de mieloma de rata o ratón son usadas. Las células de hibpdoma pueden ser cultivadas en un medio de cultivo apropiado que contiene preferiblemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células inmortalizadas sin fusionar. Por ejemplo, si las células parenterales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá comunmente hipoxantina, aminoptepna y timidita ("medio de HAT), tales sustancias impiden el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Las lineas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la expresión de alto nivel estable de anticuerpo por las células que producen anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio de HAT. Lineas de célula inmortalizada mas preferida son lineas de mieloma mupna, que pueden ser obtenidas, por ejemplo del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and The american Type Cultura Collection, Manassas, Virginia. Lineas de mieloma humano y lineas de célula de heteromieloma de raton-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp . 51-63]. El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma son cultivadas puede luego ser analizado en cuanto a la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la cadena beta de HGF. Preferiblemente, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma es determinada mediante mmunoprecipitacion o mediante un análisis de enlace m vi tro, tal como radioinmunoanalisis (RÍA) o análisis inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) . Tales técnicas y análisis son conocidos en el arte. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede ser determinado por ejemplo mediante el análisis de Scatchard anaylysis of Munson and Pollard, Anal . Biochem. , 107:220 (1980) . Después que las células de hibpdoma deseadas son identificadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilución limitante y cultivados mediante métodos estándar [Goding, supra] . Medios de cultivo apropiados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibpdoma pueden ser cultivadas in vivo como ascites en un mamífero. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser aislados o purificados del medio de cultivo o fluido de ascites mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como por ejemplo, proteina A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales pueden también ser fabricados mediante métodos de ADN recombinantes, tales como aquellos descritos en la Patente Estadounidense No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser aislado fácilmente y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleotidos que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que luego son transfectados a células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster de chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no produce proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . El ADN también puede ser modificado, por ejemplo al sustituir la secuencia de codificación por dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de la secuencias mupnas homologas [Patente Estadounidense No. 4,816,567; Morrison et al., supra] o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de ínmunoglobulma toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin mmunoglobulina . Tal polipéptido sin inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes.

Métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de cadena ligera de inmunoglobulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada es truncada en general en cualquier punto en la región Fc para impedir la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisterna relevante son sustituidos con otro residuo de aminoácido o son cancelados para impedir la reticulación. Métodos m vi tro son también apropiados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular, fragmentos de Fab, se pueden efectuar utilizando técnicas de rutina conocidas en el arte. Los anticuerpos pueden también ser generados al seleccionar bibliotecas de despliegue de fago en cuanto a anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se enlazan con afinidad apropiada/deseada a una cadena beta de HGF (o equivalente) . Tales técnicas son bien conocidas en el arte, por ejemplo, como se revela en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,750,373; 5,780,279: 5,821,047; 6,040,136; 5,427,908: 5,580,717, y referencias en las mismas. 3. Anticuerpos humanos y humanizados Los anticuerpos de cadena beta de HGF de la invención pueden comprender ademas anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace antigeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de mmunoglobulma no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región que determina lo complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de estructura de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que no son encontrados ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustanclalmente todos de por lo menos uno y comunmente dos dominios variables, en los cuales todas o sustanclalmente todas las regiones de CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustanclalmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprendera óptimamente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), comunmente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323,329 (1988); and Presta, Curr. Op . Struct . Biol . , 2:593-596 (1992)]. Métodos para inmunizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el arte. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoácido introducidos al mismo de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son frecuentemente denominados como residuos de "importación", que son tomados comunmente de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser efectuada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et. Al., Nature, 32JL: 522-525 ( 1986) ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239; 1534-1536 (1988)], al sustituir CDR de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Asi, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Estadounidense No. 4,816,567), en donde sustanclalmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En practica, los anticuerpos humanizados son comunmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Anticuerpos humanos pueden también ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte, en las que se incluyen bibliotecas de despliegue de fago [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol . , 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . , 222:581 (1991)]. Las técnicas de Colé et al. And Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos [Colé et at., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol . , 147(1) :86-95 (1991)]. Similarmente, anticuerpos humanos pueden ser fabricados al introducir sitios de inmunoglobulina humanos a animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos han sido parcial o completamente inactivados. Después del desafio, se observa la producción de anticuerpo humano, que se asemeja estrechamente a aquel visto en humanos en todos los aspectos, en los que se incluyen redisposicion genética, ensamble y repertorio de anticuerpo. Este procedimiento es descrito, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morpson, Nature 368,812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14,845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13 65-93 (1995) . Los anticuerpos pueden también ser madurados por afinidad utilizando métodos de selección y/o mutagénesis conocidos como se describe anteriormente. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tienen una afinidad que es 5 veces, mas preferiblemente 10 veces, aun mas preferiblemente 20 o 30 veces mayor que el anticuerpo de partida (en general munno, humanizado o humano) del cual el anticuerpo maduro es preparado . 4. Anticuerpos Bisespecíficos Los anticuerpos bisespecí fieos son monoclonales, preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados que tienen especificidades de enlace por al menos 2 antigenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de enlace es por la cadena beta de HGF, la otra es para cualquier otro antígeno y preferiblemente para una proteina de superficie celular o receptor o subunidad de receptor. Métodos para fabricar anticuerpos bisespecífieos son conocidos en el arte. Tradicionalmente, la producción recombmante de anticuerpos bisespecífieos está basada en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la distribución aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura bisespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta se efectúa usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares son revelados en WO 93/0882, publicado el 13 de Mayo de 1993 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). Dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antigenos ) pueden ser fusionados a secuencias de dominio constante de mmunoglobulina . La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de mmunoglobulma, que comprende por lo menos parte de las regiones de engozne CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de mmunoglobulina y si se desea la cadena ligera de mmunoglobulina, son insertados a vectores de expresión separados y son co-transfectados a un organismo huésped apropiado. Para detalles adicionales para generar anticuerpos bisespecificos, véase, por ejemplo Suresh et al., Methods ín Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en WO 96/27011, la intefase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodimeros que son recuperados del cultivo de células recombmante . La inferíase preferida comprende por lo menos una parte de la región de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la inferíase de la primera molécula de ant cuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grande (s) son creadas sobre la inferíase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácido grandes con más pequeñas (por ejemplo, alanina o trionina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero con respecto a otros productos finales indeseables tales como homodímeros. Los anticuerpos bisespecificos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos bisespecificos F(ab')2), Técnicas para generar anticuerpos bisespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos bisespecificos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Brennan et al . , Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos de F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente acomplejante de ditiol arseniato de sodio para estabilizar dit oles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular . Luego los fragmentos de Fab' son convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab'-TNB es luego reconvertido al Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo bisespecifico . Los anticuerpos bisespecificos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los fragmentos de Fab' pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar anticuerpos bisespecificos . Shalaby et al . , J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula de F(ab')2 plenamente humanizada. Cada fragmento de Fab' fue secretado separadamente de E . col i y sometido a acoplamiento químico directo m vi tro para formar el anticuerpo bisespecifico . El anticuerpo bisespecifico asi formado fue apto de enlazarse a células que sobreexpresan el receptor de ErbB2 y células T humanas normales, también como disparar la actividad litica de linfocitos citotoxicos humanos contra objetivos de tumor de pecho humano. Varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpo bisespecificos directamente a partir de cultivo de células recombinantes también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos bisespecificos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al . , J Immunol . 148 ( 5) : 1547-1553 (1992). Los peptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de engozne para formar monómeros y luego reoxidados para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este método puede también ser utiLizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al . , Proc . Nati. Acad. Sci . USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpo bisespecificos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Asi, los dominios VH y V de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios de VL y VH complementarios de otro fragmento, formando mediante esto dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpo bisespecí fieos mediante el uso de dímeros de Fv (sFv) de una sola cadena también se ha reportado. Véase, Gruber et al . , J. Immunol, 152:5368 (1994). Anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos tnsespecíficos . Tutt et al . , J. Immunol 147:60 (1991). Anticuerpos bisespecífieos ejemplares se pueden enlazar a dos epitopos diferentes sobre la cadena beta de HGF o a un epítopo sobre la cadena beta de HGF y un epítopo sobre otro polipeptido (por ejemplo, c-met o cadena alfa de HGF) . 5. Anticuerpos heterocon ungados Anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos por ejemplo, han sido propuestos para apuntar células del sistema inmune a células indeseables [Patente Estadounidense No. 4,676,980] y para tratamiento de infección de HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden ser preparados in vi tro utilizando métodos conocidos en química de proteina sintética, en los que se incluyen aquellos que involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, inmunotoxinas pueden ser construidas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace de tioeter. Ejemplos de reactivos apropiados para este proposito incluyen íminotiolato y met?l-4-mercaptobut?r?m?dato y aquellos revelados por ejemplo en la Patente Estadounidense No. 4,676,980. 6. Diseño de función efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar, por ejemplo la efectividad del anticuerpo en el tratamiento de cáncer. Por ejemplo, res?duo(s) de c?ste?na(s) puede(n) ser introducido ( s ) a la región de Fc, permitiendo mediante esto la formación de enlace de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimepco asi generado puede tener capacidad de internalizacion mejorada y/o exterminio de célula moderada por complemento incrementado y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo incrementada (ADCC) . Véase Carón et al . , J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, y_ Immunol . , 148 : 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada pueden también ser preparados utilizando agentes de reticulación heterobifuncionales como se describen en Wolff et al . Cáncer Research, 53 : 2560-2565 (1993) . Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y puede tener mediante esto capacidades de lisis de complemento y ADCC mejoradas. Véase Stevenson et al . , Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989). 7. Inmunoconjugados La invención también es concerniente con inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotoxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal de planta o animal o fragmentos de la misma) o un isótopo radiactivo (esto es, un radioconjugado) . Agentes quimioterapeuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente.

Toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser usados incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aerugmosa ) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modesina, alfa-sarcina, proteínas Aleup tes fordn , proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca ameri cana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonapa officinalis, gelonina, mitogelina, restrictosina, fenomisina, enomisina y los tpcotesenos . Una variedad de radionucl eidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212B?, 131I, 131In, 90Y y 185Re. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico son elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales, tales como propionato de N-sux?n?m?d?l-3- (2-piridilditiol ) (SPDP) , íminotiolano (IT), derivados bifuncionales de ímidoesteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), esteres activos (tales como suberato de disuxinimidilo) , aldeidos (tales como glutealdeido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados de bis-diasonio (tales como bis- (p-diasoniobenzoil ) -etilendiamina) , dnsocionatos (tales como 2, 6-d??soc?onato de tolileno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-d?fluoro-2 , 4-dinitrobenzeno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de risma puede ser preparada como se describe en Vitetta et al . , Science, 238 : 1098 (1987). El acido l-?sot?oc?anatobenz?l-3-met?ld?et?len-tiraminpentacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase WO94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en preapuntamiento de tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor es administrado al paciente seguido por la remoción del conjugado sin enlazar de la circulación utilizando un agente de despeje y luego administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleotido) . 8. Inmunoliposomas Los anticuerpos revelados en la presente pueden también ser formulados como inmunoliposomas . Liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein et al . , Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 8_2: 3688 (1985); Hwang et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980) y Patentes Estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Liposomas con tiempo de circulación mejorados son revelados en la Patente Estadounidense No. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lipido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanalamina (PEG-PE). Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos de Fab' del anticuerpo de la invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al . , J. Biol . Chem. , 257: 286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapeutico (tal como doxorubicina) está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase Gabizon et al . , J. National Cáncer Inst. 81(19): 1484 (1989). 9. Composiciones farmacéuticas de anticuerpos Los anticuerpos pueden ser administrados para el tratamiento de varias alteraciones en forma de composiciones farmacéuticas. Si se usan anticuerpos enteros como inhibidores, los anticuerpos de internalizacion son preferidos. Sin embargo, lipofecciones o liposomas pueden también ser usados para administrar anticuerpos de la invención a las células en donde se desee. En donde se usan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño es preferido. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, moléculas de peptido y polipeptido pueden ser diseñadas para retener la habilidad para enlazarse a la cadena beta de HGF y/o interferir con la interacción entre la cadena beta de HGF y c- met, interferir con la inserción del termino N de cadena beta de HGF y/o interferir con la interacción de cadena beta-cadena beta de HGF. Tales péptidos y polipeptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o producidos mediante tecnología de ADN recombmante . Véase, por ejemplo Marasco et al . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como por ejemplo un agente citotóxico, citosina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor de crecimiento. Tales moléculas están presentes apropiadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el proposito planeado.

Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de conservación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetaquelato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocapsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington' s Pharmaceutical Sciences, supra . Las formulaciones a ser usadas para administración m vivo deben ser estériles. Esto se efectúa fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofobicos solidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcapsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-h?drox?et?l-metacplato) o poli (alcoholvinílico) ) , polilacturos (Patente Estadounidense No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutamico y gama etil-L-glutamato, etileno-acetato de vmilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido o láctico-ácido glicólico y acetato de leuproluro) y ácido poli-D- (-) -3-h?drox?butípco . En tanto que polímeros tales como etileno-acetato de vmilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de molécula por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de exposición a humedad a 37 grados centígrados, dando como resultado una perdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es formación de enlace S-S intermolecular por medio de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede ser obtenida al modificar los residuos de sulfidrilo, liofílizacion de soluciones acidas, controlar el contenido de humedad, utilizar aditivos apropiados y desarrollar composiciones de matriz polimépca especificas. Los siguientes son ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. Se comprendera que varias otras modalidades se pueden llevar a la practica, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Ejemplos Materiales y métodos Los mutantes de HGF fueron generados esencialmente como se describe en Kirchhofer et al., J. Biol . Chem. (2004), 279:39915-24; Stamos et al. (2004) EMBO J. 23:2325-35. El enlace de Met y análisis de migración de célula de MDA-MB435 se efectuaron utilizando reactivos y métodos como se describe en Kirchhofer et al., supra y Stamos et al., supra . Los análisis de fosforilación de Met se llevaron a cabo utilizando células A549 esencialmente como se describe en Kirchhofer et al., supra . La inhibición de fosforilación de Met se llevo a cabo similarmente, excepto que mutantes HGF fueron agregados de manera dependiente de la dosis para inhibir la fosforilación utilizando 50 ng/ml de HGF. La inhibición de proliferación celular se llevo a cabo en análisis de BxPC3 esencialmente como se describe en Kirchhofer et al., FEBS Lett. (2005) 579: 1945-50. El análisis de angiogenesis m vitro se llevo a cabo esencialmente como se describe en Nakatsu et al. (Microvasc. Res. 66: 102, 2003) . Los mutantes de HGF fueron agregados al medio de cultivo a una concentración de 10 microgramos/ml un día si y un día no durante un experimento de 6 días. Al final del experimento, el numero de brotes por perla fue cuantificado y expresado como el promedio ± desviación estándar de cuatro experimentos independientes.

Resultados Los mutantes de cadena beta de HGF (como cadena beta sola y como HGF de plena longitud) , que tienen las mutaciones como se indican, fueron caracterizados en cuanto a habilidad para enlazarse a MetlgG, en comparación con la cadena beta de HGF tipo silvestre (cadena beta sola y HGF de plena longitud) utilizando un análisis de ELISA de competencia. Con el fin de minimizar cualquier formación de dimero enlazado a disulfuro potencial, los mutantes de beta HGF tipo silvestre y cadena beta de HGF se elaboraron en el fondo de C604S; así, beta HGF tipo silvestre es realmente HGF beta C604S. Además, mutantes de HGF de dos cadenas de plena longitud seleccionados fueron determinados en un análisis de migración celular para determinar los efectos, si los hay, sobre la función biológica, como resultado de las mutaciones en la cadena beta. Los resultados son ilustrados en las figuras ÍA, B, C. El mutante de HGF G498I inhibió la fosforilación dependiente de HGF de Met de manera dependiente de la dosis como se ilustra en la figura 2, también se muestran resultados para el mutante de HGF R424A:R494E (HGF de una sola cadena). Los mutantes de HGF G498I y G498P activan Met significativamente menos bien comparado con HGF tipo silvestre y en el análisis de fosforilación de Met como se ilustra en la figura 3; también se muestran resultados para el mutante de HGF R424A:R494E. La fosforilación dependiente de HGF de Met fue modulada de manera dependiente de la dosis. Los mutantes de HGF G498I y G498P también inhibieron la proliferación celular de BxPC3, que tiene 2.5% y 56% de la actividad de HGF tipo silvestre. Además, mutantes de HGF de plena longitud seleccionados a una concentración de 10 microgramos/ml (D672N, V495G, G498I, R424A:R494E) inhibieron la angiogénesis en un análisis ín vitro (figura 4), confirmando ademas así el significado de la cadena beta de HGF (y mutaciones seleccionadas de la misma) a la función biológica global de HGF.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula antagonista de HGF/C-Met caracterizado porque comprende un mutante de HGF que comprende una mutación en la región terminal N de cadena beta de HGF y/o región de dimepzacion de cadena beta de HGF. 2. La molécula antagonista de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación en la región terminal N de cadena beta de HGF deteriora la inserción del termino N de cadena beta de HGF a una cavidad de enlace de HGF y en donde el mutante de HGF resultante tiene función biológica sustanclalmente reducida en comparación con HGF tipo silvestre. 3. La molécula antagonista de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la función biológica es proliferación celular, migración celular, fosforilación de Met o angiogenesis . . La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la mutación en la región terminal N de cadena beta de HGF deteriora la inserción del termino N de cadena beta de HGF a una cavidad de enlace de HGF y en donde el mutante de HGF resultante se enlaza a C-Met con afinidad de enlace sustanclalmente reducida en comparación con HGF tipo silvestre. 5. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la mutación en la región terminal N de cadena beta de HGF deteriora la inserción del termino N de cadena beta de HGF a una cavidad de enlace de HGF y en donde el mutante de HGF resultante se enlaza a C-Met con afinidad sustanclalmente equivalente como HGF tipo silvestre. 6. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula comprende una mutación en la región de dimenzacion de cadena beta de HGF, en donde el mutante de HGF resultante tiene función biológica sustanclalmente reducida en comparación con HGF tipo silvestre. 7. La molécula antagonista de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la función biológica es proliferación celular, migración celular, fosforilación de Met o angiogenesis . 8. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula comprende una mutación en la región de dimepzacion de cadena beta de HGF, en donde el mutante de HGF resultante tiene habilidad reducida para dimepzarse con otra cadena beta de HGF. 9. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una mutación en la región de dimerizacion de cadena de HGF no deteriora sustanclalmente el enlace del mutante de HGF resultante a C-Met. 10. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una mutación en la región terminal N de cadena beta de HGF esta en posición V495, G498, R502 mas T503 o D672. 11. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una mutación en la región terminal N de cadena beta de HGF es V495G, V495A, G498I, G498P, G498V, R502del mas T503del o D672N. 12. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una mutación en la región de dimerizacion de cadena beta de HGF esta en posición N497, G498, P500, T501 mas R502 o R502. 13. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una mutación en la región de dimerizacion de cadena beta de HGF es N497R o K, G498A o S, P500W, H o E, inserción entre T501 y R502 (por ejemplo, una inserción de R y S),o R502del. 14. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una mutación en la posición N497 no es N497F, A o E. 15. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula comprende aminoácidos tipo silvestre en posiciones 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 y/o 702. 16. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula tiene capacidad de señalización de C-Met reducida en comparación con HGF tipo silvestre. 17. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula tiene habilidad reducida para estimular la migración celular en comparación con HGF tipo silvestre. 18. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula tiene habilidad reducida para estimular la proliferación celular en comparación con HGF tipo silvestre. 19. La molécula antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula tiene habilidad reducida para estimular la angiogenesis en comparación con HGF tipo silvestre. 20. Un método para modular la activación de c-met en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una molécula antagonista de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, mediante lo cual se modula la activación de c-met. 21. Un método para modular la proliferación de una célula en un sujeto, el método esta caracterizado porque comprende administrar al sujeto una molécula antagonista de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, mediante lo cual se modula la proliferación de la célula en el sujeto. 22. Un método para modular la migración de una célula en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende administrar al sujeto una molécula antagonista de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, mediante lo cual se modula la migración de la célula en el sujeto. 23. Un método para modular la actividad angiogénica de una célula en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende administrar al sujeto una molécula antagonista de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, mediante lo cual se modula la actividad angiogénica de la célula en el sujeto. 24. Un método para el tratamiento de una condición patológica asociada con la activación de c-met en un sujeto, el método está caracterizado porque comprende administrar al sujeto una molécula antagonista de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, mediante lo cual se trata la condición patológica. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la condición patológica es cáncer. 26. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica la molécula antagonista de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19. 27. Una célula huésped caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26. 28. Un artículo de manufactura caracterizado porque comprende un recipiente que comprende una o más moléculas antagonistas de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19. 29. Un método para la fabricación de la molécula antagonista de HGF/c-met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, el método está caracterizado porque comprende expresar en una célula huésped un ácido nucleico que codifica la molécula antagonista y recuperar la molécula antagonista de la célula.