JP5600064B2 - 筋障害を相殺するための手段と方法 - Google Patents

Description

本発明は、分子生物学及び医薬の分野に関する。

筋障害とは、通常、個人の生命に重大な影響を及ぼす疾患である。筋障害は、遺伝的原因を有することも、非遺伝的原因を有することもある。遺伝的原因を有する筋肉疾患の重要なグループは、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これらの疾患は、筋肉タンパク質の遺伝子の欠損により引き起こされる。

ベッカー型筋ジストロフィー及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーは、発生率が比較的高い遺伝性筋ジストロフィーである。デュシェンヌ型筋ジストロフィーもベッカー型筋ジストロフィーも、筋肉タンパク質ジストロフィンが冒される。デュシェンヌ型ではジストロフィンが欠失しており、ベッカー型では一部分のジストロフィンは存在しているが、その産生はほとんどの場合十分ではない及び／又は存在するジストロフィンは異常に形成されている。両疾患は劣性Ｘ連鎖遺伝に関連している。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子のフレームシフト突然変異に起因する。ＤＭＤ遺伝子のフレームシフトにより、切断型非機能性ジストロフィンタンパク質が産生され、進行性の筋消耗及び筋力低下が起こる。突然変異が起きてもＤＭＤ遺伝子にフレームシフトを引き起こさないときにはＢＭＤが起こる。ジストロフィンが欠失しているＤＭＤとは対照的に、ＢＭＤでは一部分のジストロフィンが存在するので、ＢＭＤはＤＭＤほど症状が重症ではない。ＤＭＤの発症はＢＭＤよりも早い。ＤＭＤは通常、初期小児期に現れ、ＢＭＤは十代に又は初期成人期に現れる。ＢＭＤの進行はＤＭＤよりも遅く、予想しにくい。ＢＭＤ患者は中期から後期成人期まで生存することができる。ＤＭＤ患者は３０代過ぎまで生存することはまれである。

ジストロフィンは筋線維において重要な構造的役割を果たしており、細胞外マトリックスと細胞骨格を繋いでいる。Ｎ末端領域はアクチンと結合し、Ｃ末端はジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の一部分であり、この複合体は筋細胞膜に広がっている。ジストロフィンが欠失していると、機械的ストレスにより筋細胞膜断裂が起こり、筋線維内部へのカルシウムの制御されない流入が引き起こされ、それによってカルシウム活性化プロテアーゼ及び線維壊死が誘発される。

大半の遺伝性筋ジストロフィーでは、臨床的に適用可能な効果的治療法で、現在利用可能なものはない。エキソンスキッピング技法は、遺伝性筋ジストロフィーと闘うために現在調査されている。ｍｄｘマウス及びＤＭＤ患者由来の細胞においてジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のリーディングフレームを修復することを目標とする遺伝子治療に関する有望な報告が、我々及び他の者により最近報告されている^１−１１。特定のエキソンの標的スキッピングにより、ＤＭＤ表現型（ジストロフィンの欠損）は、より軽度のＢＭＤ表現型に（部分的におおむね機能性のジストロフィンに）転換される。エキソンのスキッピングは、好ましくは、スプライス部位のうちの１つ若しくは両方、又はエキソン内部配列のいずれかを標的するアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮ）の結合により誘導される。両スプライス部位がスプライソソーム複合体により認識されるときのみ、エキソンはｍＲＮＡ中に包含されることになるので、スプライス部位はＡＯＮの明らかな標的である。代わりに、又はさらに、１つ又は複数のエキソン配列の少なくとも一部分に特異的な１つ又は複数のＡＯＮが使用される。エキソン４６配列に特異的なエキソン内部ＡＯＮを使用して、我々は以前、エキソン４５欠失の２人の異なるＤＭＤ患者由来の培養筋管においてスプライシングパターンを調節することができた^１１。ＡＯＮ処置に続いて、エキソン４６がスキップされ、その結果リーディングフレームが修復され、細胞の少なくとも７５％においてジストロフィン合成が誘導された。エキソン内部ＡＯＮを使用して、３９の異なるＤＭＤエキソンに対してヒト対照及び患者筋細胞においてもエキソンスキッピングを効率的に誘導することができることを、我々は最近明らかにした^{１，２，１１−１５}。

したがって、ジストロフィン遺伝子に適用されるエキソンスキッピング技法により、ＤＭＤ患者において、短くはなるが、少なくとも部分的に機能性のジストロフィンタンパク質が産生される。ＤＭＤは機能障害性ジストロフィンタンパク質によって引き起こされるので、ＤＭＤ患者が機能性ジストロフィンタンパク質を与えられた後では、ＤＭＤの症状は十分に軽減されると予想されるであろう。しかし、本発明は、エキソンスキッピング技法がジストロフィン合成を誘導することができるとしても、炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物をＤＭＤ患者に投与することにより、ＤＭＤ症状（単数又は複数）はさらに軽減されるという洞察を提供する。本発明によれば、ＤＭＤ患者においてジストロフィンタンパク質欠損が修復されたときでも、組織炎症及び損傷筋細胞の存在はそれでもＤＭＤの症状の一因となり続ける。したがって、ＤＭＤの原因、すなわち、機能障害性ジストロフィンタンパク質が軽減されるとしても、本発明に従った補助治療をさらに使用することにより、ＤＭＤの治療はさらに改善される。さらに、本発明は、炎症が抑えられたからといって筋細胞によるＡＯＮの取込みが著しく減少するわけではないという洞察を提供する。一般に炎症は細胞、血液及び他の化合物の輸送を増強するので、これは驚くべきことである。その結果、ＡＯＮ取込み／送達も炎症中は増強される。したがって、本発明の以前には、炎症を相殺する補助治療は、ＡＯＮ治療にマイナスの影響を与える危険を伴うと予想されたであろう。しかし、実際はそうではないように思われる。

したがって、本発明は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、
前記個人に（少なくとも部分的に）機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を前記個人に投与することと、
炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物を前記個人に投与することと
を含む方法を提供する。

別の好ましい実施形態では、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法は、炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物を前記個人に投与することを含む。

驚くべきことに、エキソンに、又は前記エキソンの１つ若しくは両方のスプライス部位に向けられたオリゴヌクレオチドを使用すると、前記ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞に、炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物を与える場合、前記エキソンを含むＭＲＮＡ前駆体からのジストロフィンエキソンのスキッピング頻度が増強されることが見出されている。増強されたスキッピング頻度は、ＤＭＤ又はＢＭＤの個人の筋細胞において産生される機能性ジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。

本発明は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体を発現している細胞において前記ｍＲＮＡ前駆体からのエキソンのスキッピングを増強するための方法であって、
前記細胞内の前記ｍＲＮＡ前駆体を前記エキソンをスキップするためのオリゴヌクレオチドに接触させることと、
前記細胞を、炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物に、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物に接触させることと
を含む前記方法をさらに提供する。

デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィーは筋細胞において明白な表現型を有するので、前記細胞は筋細胞であることが好ましい。好ましくは、前記細胞は、突然変異ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、前記細胞はＤＭＤ又はＢＭＤに罹っている個人の細胞である。

本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーに罹っている個人における、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体を発現している細胞内でジストロフィンｍＲＮＡ前駆体からのエキソンのスキッピングを増強するための方法であって、
前記個人に（少なくとも部分的に）機能性のジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を前記個人に投与することと、
炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物を前記個人に投与することと
を含む方法をさらに提供する。

個人は、種々の形で機能性ジストロフィンタンパク質を与えられる。一実施形態では、エキソンスキッピング技法が適用される。しかし、たとえば、ゲンタマイシン又はＰＴＣ１２４^{１６，１７}（３−（５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）安息香酸としても知られる）による終止コドン抑制、及び／又は機能性ミニ若しくはミクロジストロフィン遺伝子のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子送達^{１８〜２０}などの別の方法が利用可能である。ＰＴＣ１２４（商標）は、ＰＴＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙの登録商標である。

本明細書に定義されるように、機能性ジストロフィンは、好ましくは、配列番号１に同定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ジストロフィンである。機能性ジストロフィンは、好ましくは、ジストロフィンであって、そのＮ末端部分（Ｎ末端の最初の２４０アミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１から３６８５まで）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５アミノ酸）にアクチン結合ドメインを有し、これらのドメインはそれぞれが当業者に既知の野生型ジストロフィンに存在している。本明細書に示されるアミノ酸は、配列番号１により表されている野生型ジストロフィンのアミノ酸に対応する。言い換えると、機能性ジストロフィンは、少なくともある程度は野生型ジストロフィンの活性を示すジストロフィンである。「少なくともある程度は」とは、好ましくは、野生型機能性ジストロフィンの対応する活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％を意味する。この文脈では、機能性ジストロフィンの活性は、好ましくは、アクチンに及びジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）に結合することである^５６。当業者には既知であるように、アクチンへの及びＤＧＣへのジストロフィンの結合は、ジストロフィーであると疑われる筋肉の生検から、全タンパク質抽出物を使った免疫共沈降法、又は横断面の免疫蛍光解析のいずれかにより可視化してもよい。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹っている個人は、典型的には、完全タンパク質の合成を妨げているジストロフィンをコードする遺伝子の突然変異を有しており、すなわち、中途終止がＣ末端の合成を妨げている。ベッカー型筋ジストロフィーでは、ジストロフィン遺伝子は、野生型と比べると突然変異も含むが、その突然変異は典型的には、中途終止を含まず、Ｃ末端は典型的に合成される。その結果、少なくとも野生型タンパク質と同種の活性を有する機能性ジストロフィンタンパク質が合成されるが、必ずしも同量の活性ではない。ＢＭＤ個人のゲノムは典型的には、Ｎ末端部分（Ｎ末端での最初の２４０アミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１から３６８５まで）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端での最後の３２５アミノ酸）を含むジストロフィンタンパク質をコードしているが、その中央部桿状ドメインは野生型ジストロフィンのものより短いことがある^５６。ＤＭＤの治療のためのエキソンスキッピングは、典型的には、桿ドメイン形ドメインのエキソンをスキップして、リーディングフレームを訂正してＣ末端を含むジストロフィンタンパク質の残りを合成させることにより、ｍＲＮＡ前駆体における中途終止を克服することに向けられているが、桿ドメインが小さくなった結果、タンパク質がいくらか小さくなる。好ましい実施形態では、ＤＭＤを有し本明細書に定義する方法で治療を受けている個人は、少なくともある程度は野生型ジストロフィンの活性を示すジストロフィンを与えられることになる。さらに好ましくは、前記個人がデュシェンヌ型患者である、又はデュシェンヌ型患者であると疑われている場合、機能性ジストロフィンはＢＭＤを有する個人のジストロフィンであり、すなわち、典型的には、前記ジストロフィンはアクチンともＤＧＣとも相互作用をすることができるが、その中央部桿状ドメインは野生型ジストロフィンのものよりも短くなることがある（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、（２００６、ｒｅｆ５６））。野生型ジストロフィンの中央部桿状ドメインは２４スペクトリン様反復を含む^５６。たとえば、本明細書に提供されるジストロフィンの中央部桿状ドメインは、それがアクチンに及びＤＧＣ結合することができる限り、５〜２３、１０〜２２又は１２〜１８スペクトリン様反復を含んでいてもよい。

本発明の方法において個人におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減することは、以下のアッセイ法、すなわち、歩行の喪失までの時間の延長、筋力の改善、重りを持ち上げる能力の改善、床から立ち上がる所要時間の改善、９メートル歩行時間の改善、４階段を上る所要時間の改善、脚機能等級の改善、肺機能の改善、心機能の改善、生活の質の改善のどれによって評価してもよい。これらのアッセイ法はそれぞれが当業者には既知である。例として、Ｍａｎｚｕｒらの論文（２００８、ｒｅｆ５８）は、これらのアッセイ法それぞれについて詳細な説明をしている。これらのアッセイ法それぞれで、アッセイ法において測定されるパラメータの検出可能な改善又は延長が見出されたらすぐに、好ましくは、本発明の方法を使用して個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状が軽減されたことを意味することになる。検出可能な改善又は延長は、好ましくは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（２００６、ｒｅｆ５７）に記載されている統計的に有意な改善又は延長である。代わりに、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状の軽減は、本明細書において後に定義される筋線維機能、完全性及び／又は生存の改善を測定することにより評価してもよい。

炎症を抑えるための補助化合物は、炎症を、好ましくは、損傷筋細胞により引き起こされる炎症を少なくとも部分的に抑えることができるどんな治療も含む。前記補助化合物は、最も好ましくは、筋組織炎症を抑えることができる。炎症は、好ましくは、ジストロフィーと疑われる筋組織における好中球及び／又は肥満細胞及び／又は樹状細胞及び／又はリンパ細胞などの浸潤性免疫細胞の数の増加を検出することにより評価される。この評価は、好ましくは、上で同定される免疫細胞を特異的に染色した後に、ジストロフィーと疑われる筋組織の生検^５７の横断面において実施される。定量化は、好ましくは、顕微鏡下で実施される。したがって、炎症を抑えることは、好ましくは、ジストロフィーと疑われる筋組織の横断面において免疫細胞の数の減少を検出することにより評価される。減少を検出することは、好ましくは、上で同定される少なくとも１種類の免疫細胞の数が、治療前の同一個人の対応する免疫細胞の数と比べて、少なくとも１％、２％、３％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少していることを意味する。最も好ましくは、前記生検の横断面において浸潤性免疫細胞はまったく検出されない。

筋線維機能、完全性及び／又は生存を改善するための補助化合物は、前記補助化合物が存在しないが他の点では類似する状況と比べて、筋線維機能、完全性及び／又は生存を測定可能な程度に増強することができるどんな治療も含む。筋線維機能、完全性及び／又は生存の改善は、以下のアッセイ法、すなわち、血液中のクレアチンキナーゼの検出可能な減少、ジストロフィーと疑われる筋肉の生検横断面における筋線維の壊死の検出可能な減少、及び／又はジストロフィーと疑われる筋肉の生検横断面における筋線維の径の均一性の検出可能な増加のうちの少なくとも１つを使用して評価してもよい。これらのアッセイ法はそれぞれが当業者には既知である。

クレアチンキナーゼは、５７に記載される通りに血液中で検出してもよい。クレアチンキナーゼの検出可能な減少とは、治療前の同一個人のクレアチンキナーゼ濃度と比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を意味してもよい。

筋線維の壊死の検出可能な減少は、好ましくは、筋生検において、さらに好ましくは、生検横断面を使用した５７に記載される通りに評価される。壊死の検出可能な減少とは、生検横断面を使用して壊死が同定されている領域の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少でもよい。減少は、治療前の同一個人において評価される壊死と比べることにより測定される。

筋線維の径の均一性の検出可能な増加は、好ましくは、筋生検横断面において、さらに好ましくは、５７に記載される通りに評価される。

本発明に従った方法における治療は、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月、少なくとも約数カ月、少なくとも約１年、少なくとも約２、３、４、５、６年以上である。

一実施形態では、損傷筋細胞の代謝回転を増加させるための補助化合物が使用される。損傷筋細胞の代謝回転を増加させるための補助化合物は、損傷筋細胞の代謝回転を少なくとも部分的に誘導する且つ／又は増加させることができるどんな治療も含む。損傷筋細胞は、健常な無傷の筋細胞よりも臨床的に測定可能な機能性が有意に少ない筋細胞である。ジストロフィンが欠失していると、機械的ストレスにより筋細胞膜断裂が起こり、筋線維内部へのカルシウムの制御されない流入が引き起こされ、それによってカルシウム活性化プロテアーゼ及び線維壊死が誘発され、損傷筋細胞が生じる。損傷筋細胞の代謝回転を増加させることは、損傷筋細胞の代謝回転が増加していない状況と比べて、損傷筋細胞が速く分解される且つ／又は取り除かれることを意味する。損傷筋細胞の代謝回転は、好ましくは、筋生検において、さらに好ましくは、生検の横断面を使用した５７に記載される通りに評価される。代謝回転の検出可能な増加は、生検横断面を使用して代謝回転が同定されている領域の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の増加であってもよい。増加は、治療前の同一個人において評価される代謝回転と比べることにより測定される。

理論に拘泥するものではないが、筋細胞の代謝回転が増加するのは、これにより炎症応答が減少するので好ましいと考えられる。

本発明に従えば、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための治療と、個人において炎症を抑えるための、好ましくは筋組織炎症を抑えるための補助治療を一緒に組み合わせるのは、薬物としての使用に特に適している。そのような組合せは、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための単独治療と比べて、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状をはるかによく軽減することができる。本実施形態は、エキソンに、又は前記エキソンの１つの若しくは両方のスプライス部位に向けられたオリゴヌクレオチドを使用するとき、前記エキソンを含むＭＲＮＡ前駆体からのジストロフィンエキソンのスキッピング頻度も増強する。増強されたスキッピング頻度は、ＤＭＤ又はＢＭＤ個人の筋細胞において産生される機能性ジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。

したがって、薬物としての使用のための、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物と、前記個人において炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物との組合せがさらに提供される。前記組合せはＤＭＤを相殺するのに特に適しているので、本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物、及び前記個人において炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物の使用も提供する。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。

炎症を抑えるための好ましい補助化合物には、ステロイド、ＴＮＦα阻害剤、ｍＩＧＦ−１の供給源及び／又は抗酸化剤が挙げられる。しかし、本明細書に定義される炎症を抑えることができる他のどんな化合物も、本発明内に包含される。これらの化合物はそれぞれが、後で広範囲に示される。広範囲に示される化合物はそれぞれが、別々に、又は互いに組み合わせて並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するために使用される１つ若しくは複数の補助化合物と組み合わせて使用してもよい。

さらに、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための治療と、個人において筋線維機能、完全性及び／又は生存を改善するための補助治療と一緒の組合せは、薬物としての使用に特に適している。そのような組合せは、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための単独治療と比べると、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状をはるかによく軽減することができる。

したがって、薬物としての使用のための、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物と、前記個人において筋線維機能、完全性及び／又は生存を改善するための補助化合物との組合せがさらに提供される。この組合せは、ＤＭＤを相殺するのにも特に適している。したがって、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物、並びに前記個人において筋線維機能、完全性及び／又は生存を改善するための補助化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。

筋線維機能、完全性及び／又は生存を改善するための好ましい補助化合物には、イオンチャネル阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、Ｌアルギニン及び／又はアンジオテンシン１型受容体遮断剤が挙げられる。しかし、本明細書に定義する筋線維機能、完全性及び／又は生存を改善することができる他のどんな化合物も本発明内に包含される。これらの化合物はそれぞれが、後で広範囲に示される。広範囲に示される化合物はそれぞれが、別々に、又は互いに組み合わせて並びに／又は炎症を抑えるために使用される１つ若しくは複数の補助化合物と組み合わせて使用してもよい。

一実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物と、本発明に従った補助化合物とを一緒に含む上記組合せのうちの少なくとも１つを含む医薬製剤が作製される。したがって、
個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物と、
前記個人において炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は前記個人において筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物と、
薬剤的に許容可能な担体、アジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤とを
含む医薬製剤がさらに提供される。適切な担体及びアジュバントの例は当技術分野では既知であり、たとえば、生理食塩水を含む。本発明に従った医薬製剤中で使用される化合物の用量範囲は、厳格なプロトコル必要条件が存在する臨床試験における漸増用量試験に基づいて設計される。

特に好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物はステロイドと組み合わされる。実施例において示されるように、そのような組合せによりＤＭＤ症状が著しく軽減される。したがって、本発明の好ましい実施形態は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、前記個人にステロイドと、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を投与することを含む方法を提供する。薬物として使用するための、ステロイドと個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、ステロイド及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。本実施形態は、エキソンに、又は前記エキソンの１つの若しくは両方のスプライス部位に向けられるオリゴヌクレオチドを使用する場合には、前記エキソンを含むＭＲＮＡ前駆体からのジストロフィンエキソンのスキッピング頻度も増強する。増強されたスキッピング頻度は、ＤＭＤ又はＢＭＤ個人の筋細胞において産生される機能性ジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。

一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。

ステロイドは、４つの縮合環が一般に６−６−６−５の形で配置された炭素骨格により特徴づけられるテルペノイド脂質である。ステロイド類は、これらの環に結合する官能基及び環の酸化状態により異なる。ステロイド類には、たとえば、プレドニゾン、デキサメタゾン及びビタミンＤなどの通常は腫脹及び炎症を軽減するのに使用されるホルモン及び薬物が挙げられる。

本発明に従えば、ＤＭＤ患者における補助ステロイド治療の付加的効果には、組織炎症の減少、細胞障害性細胞の抑制、及び改善されたカルシウム恒常性が挙げられる。大半のプラス結果は、低年齢の男子で得られる。好ましくは、ステロイドは副腎皮質ステロイド（グルココルチコステロイド）である。好ましくは、本発明に従った方法において（プレドニゾン、プレドニゾロン又はデフラザコートなどの）プレドニゾンステロイドが使用される^２１。本明細書に記載される治療的適用において使用される（グルココルチコ）ステロイドの用量範囲は、厳格なプロトコル必要条件が存在する臨床試験における漸増用量試験に基づいて設計される。常用量は、プレドニゾン及びプレドニゾロンでは約０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約０．７５ｍｇ／ｋｇ／日、デフラザコートでは約０．４〜１．４ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約０．９ｍｇ／ｋｇ／日である。

一実施形態では、ステロイドは、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を投与するのに先立って前記個人に投与される。本実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を投与する少なくとも１日、さらに好ましくは少なくとも１週間、さらに好ましくは少なくとも２週間、さらに好ましくは少なくとも３週間前に前記ステロイドが投与されるのが好ましい。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害剤と組み合わされる。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、炎症応答を刺激する炎症促進性サイトカインである。中和抗体インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）を使用したＴＮＦα活性の薬理学的遮断は、炎症性疾患の症状を抑えるのに臨床的に極めて効果的である。ｍｄｘマウスでは、インフリキシマブもエタネルセプトも、ジストロフィー筋の壊死を遅延させて抑え^{２４，２５}、筋力、塩素チャネル機能及び減少したＣＫレベルに対する追加の生理学的効果が長期間治療を受ける運動成体ｍｄｘマウスにおいて実証されている^２６。他の臨床状態において使用するために設計されたそのような高度に特異的抗炎症薬は、ＤＭＤへのステロイドの使用に対する魅力的な代替法である。一実施形態では、ＴＮＦα阻害剤の使用は、筋損傷及び悪化が特に明白な男子の集中的筋成長の時期に限定されている。

したがって、本発明の一態様は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、前記個人にＴＮＦα阻害剤及び、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を投与することを含む方法を提供する。薬物として使用するための、ＴＮＦα阻害剤と個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、ＴＮＦα阻害剤及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。好ましいＴＮＦα阻害剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結しているＴＮＦαのヒトｐ７５受容体の細胞外リガンド結合ドメインからなる二量体融合タンパク質である。さらに好ましいＴＮＦα阻害剤はエタネルセプト（Ａｍｇｅｎ、Ａｍｅｒｉｃａ）である^２６。エタネルセプトの常用量は、週２回の約０．２ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇである。投与は好ましくは皮下である。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物は、ｍＩＧＦ−１の供給源と組み合わされる。本明細書に定義するように、ＩＧＦ−１の供給源は、好ましくは、ｍＩＧＦ−１自体、ｍＩＧＦ−１発現及び／又は活性を増強することができる化合物を包含する。増強するは、本明細書では、増加させると同義である。ｍＩＧＦ−１の発現はｍＩＧＦ−１の量と同義である。ｍＩＧＦ−１は、サテライト細胞活性の増加を通じて筋肉の再生を促進し、炎症及び線維症を抑える^２７。筋肉の局所損傷により、ｍＩＧＦ−１発現が増加する。余分なＩＧＦ−１遺伝子を有するトランスジェニックマウスでは、筋肉肥大及び肥大筋線維が観察される^２７。同様に、トランスジェニックｍｄｘマウスは、減少した筋線維変性を示す^２８。したがって、ｍＩＧＦ−１遺伝子の上方調節及び／又は余分な量のｍＩＧＦ−１タンパク質若しくはその機能性同等物（特にｍＩＧＦ−１ Ｅａアイソフォーム［２７に記載されている、ヒト相同体ＩＧＦ−１アイソフォーム４：配列番号２］）の投与により、アンチセンス誘導エキソンスキッピングを含むＤＭＤに対する他の、好ましくは遺伝的治療の効果が促進される。上記トランスジェニックマウスにおける追加のｍＩＧＦ−１レベルは、心臓障害を誘導することはなく、癌も促進せず、病的副作用もない。したがって、本発明の一態様は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与え、且つ前記個人にｍＩＧＦ−１の供給源、好ましくは、ｍＩＧＦ−１自体を与えるための化合物、ｍＩＧＦ−１発現及び／又は活性を増加させることができる化合物を前記個人に投与することを含む方法を提供する。前述のように、たとえば、ｍＩＧＦ−１遺伝子の発現を増強することにより、並びに／又はｍＩＧＦ−１タンパク質及び／若しくはその機能性同等物（特にｍＩＧＦ−１ Ｅａアイソフォーム［２７に記載されている、ヒト相同体ＩＧＦ−１アイソフォーム４：配列番号２］）を投与することにより、ｍＩＧＦ−１の量は増加される。薬物として使用するための、ｍＩＧＦ−１、又はｍＩＧＦ−１発現若しくはｍＩＧＦ−１活性を増強することができる化合物と、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、ｍＩＧＦ−１、又はｍＩＧＦ−１発現若しくはｍＩＧＦ−１活性を増強することができる化合物、及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、そのような組合せは使用される。

本発明の文脈内で、ＩＧＦ−１遺伝子の遺伝子発現レベルを増加させることにより、対応するＩＧＦ−１タンパク質の量を増加させることにより、及び／又はＩＧＦ−１タンパク質の活性を増加させることにより、ｍＩＧＦ−１の増加した量又は活性を実現してもよい。好ましいｍＩＧＦ−１タンパク質は本明細書において以前に定義済みである。前記タンパク質の活性の増加は、治療を受けたことがない個人の前記活性又は定常状態と比べて、前記タンパク質により発揮される生物活性又は前記タンパク質の定常状態レベルのどんな検出可能な変化をも意味すると、本明細書では理解されている。ｍＩＧＦ−１の増加した量又は活性は、好ましくは、筋肉肥大バイオマーカーＧＡＴＡ−２の増加した発現の検出により評価される（２７に記載されている）。

遺伝子発現レベルは、好ましくは、（リアルタイム）ＰＣＲ、アレイ又はノーザン解析などの古典的分子生物学的技法を使用して評価される。タンパク質の定常状態レベルは、タンパク質の量を定量化することにより直接決定される。タンパク質量の定量化は、ウエスタンブロッティング又はタンパク質に対して産生される抗体を使用した免疫アッセイ法などのどんな既知の技法により実施してもよい。二者択一的に、又は遺伝子発現レベル及び／若しくは対応するタンパク質の定量化と組み合わせて、対応するタンパク質の基質又は対応するタンパク質の機能若しくは活性に関連することが分かっている任意の化合物の定量化、或いは特定のアッセイ法を使用した対応するタンパク質の前記機能又は活性の定量化を使用して、タンパク質の活性又は定常状態レベルの変化を評価してもよいことは、当業者であれば理解するであろう。

本発明の方法では、前記タンパク質の活性又は定常状態レベルは、たとえば、外来供給源由来の細胞にタンパク質を与えることにより、タンパク質自体のレベルで改変してもよい。

好ましくは、前記遺伝子の発現レベルの増加又は上方調節は、アレイを使用して前記遺伝子の発現レベルの少なくとも５％の増加を意味する。さらに好ましくは、前記遺伝子の発現レベルの増加は、少なくとも１０％、さらに好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％以上の増加を意味する。別の好ましい実施形態では、前記タンパク質の発現レベルの増加は、ウエスタンブロッティングを使用して、且つ／又はＥＬＩＳＡ若しくは適切なアッセイ法を使用して、前記タンパク質の発現レベルの少なくとも５％の増加を意味する。さらに好ましくは、タンパク質の発現レベルの増加は、少なくとも１０％、さらに好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％以上の増加を意味する。

別の好ましい実施形態では、ポリペプチド活性の増加は、適切なアッセイ法を使ってポリペプチド活性の少なくとも５％の増加を意味する。さらに好ましくは、ポリペプチド活性の増加は、少なくとも１０％、さらに好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％以上の増加を意味する。増加は、好ましくは、治療前の個人における対応する活性と比べることにより評価される。

ｍＩＧＦ−１の供給源を提供する好ましい方法は、ｍＩＧＦ−１を、好ましくは、ｍＩＧＦ−１ Ｅａアイソフォーム（２７に記載されている、ヒト相同体ＩＧＦ−１アイソフォーム４：配列番号２）を、さらに好ましくは、本明細書において後に定義されるＡＡＶベクターにおいてコードする導入遺伝子を導入することである。ｍＩＧＦ−１のそのような供給源は、２７におけるマウスにおいて記載される筋組織で特異的に発現される。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物は抗酸化剤と組み合わされる。酸化ストレスはＤＭＤの進行において重要な要因であり、慢性炎症及び線維症を促進する^２９。酸化ストレスの最も蔓延する産物、すなわち過酸化脂質は、デュシェンヌ型の男子では平均で３５％増加する。酵素スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼのレベルが増加すれば、これらの効果を引き起こす過量のフリーラジカルを抑える。実際、栄養補助食品のＰｒｏｔａｎｄｉｍ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｖａｎｔａｇｅ）は臨床的試験をされ、スーパーオキシドジスムターゼ（最大３０％）及びカタラーゼ（最大５４％）のレベルを増加させることが見出され、これにより実際に２９人の健常者において脂質の過酸化が著しく阻害された^３０。したがって、酸化ストレスのそのような効果的管理により筋質が保存され、したがって、ＤＭＤ治療のプラス効果が促進される。イデベノンは、天然補酵素Ｑ１０由来の化学構造を有するもう一つの強力な抗酸化剤である。イデベノンは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が酸化的リン酸化により生成されるミトコンドリアを保護する。ＤＭＤにおいてジストロフィンが欠失すると、心臓での、及びおそらく骨格筋でもこのプロセスにマイナスの影響を及ぼす。イデベノンは、最近、米国及び欧州において臨床試験に適用され、フリードライヒ運動失調症の神経学的側面に対する有効性を実証した^３１。年齢が８〜１６歳の２１人のデュシェンヌ型の男子を含む、イデベノンを使用した第ＩＩａ相二重盲検プラセボ対照無作為臨床試験が最近ベルギーで開始された。この研究の第１目的は、心筋機能に対するイデベノンの効果を判定することである。さらに、患者における筋力に対するその考えられる機能的利点を検出するために、いくつかの異なる試験が実施されることになっている。効果的である場合には、イデベノンは、特に心臓において、ＤＭＤ治療の治療効果を増強するために、本発明に従った方法において使用するための好ましい補助化合物である。したがって、本発明の一態様は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、抗酸化剤と前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物とを前記個人に投与することを含む方法を提供する。薬物として使用するための、抗酸化剤と前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、抗酸化剤及び前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。抗酸化剤の種類に応じて、当業者であればどの量が好ましく使用されるかが分かるであろう。抗酸化剤には、バコシド、シリマリン、クルクミン、ポリフェノール、好ましくは、エピガロカテキン−３−没食子酸（ＥＧＣＧ）が含まれていてもよい。好ましくは、抗酸化剤は、栄養補助食品のＰｒｏｔａｎｄｉｕｍ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｖａｎｔａｇｅ）のような抗酸化剤の混合物である。６７５ｍｇのＰｒｏｔａｎｄｉｕｍ（登録商標）の１日量カプセルには、１５０ｍｇのバコパモニエラ（Ｂ．ｍｏｎｎｉｅｒａ）（４５％バコサイド）、２２５ｍｇのオオアザミ（Ｓ．ｍａｒｉａｎｕｍ）（７０〜８０％シリマリン）、１５０ｍｇのウィザニアソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）粉末、７５ｍｇの緑茶（４５％ＥＧＣＧの９８％ポリフェノール）及び７５ｍｇのウコン（９５％クルクミン）が含まれる。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物はイオンチャネル阻害剤と組み合わされる。ＤＭＤにおいて損傷筋膜が存在すると、筋線維へのカルシウムイオンの通過が妨げられ、そのためにカルシウム恒常性が乱れて、追加の損傷及び筋壊死を引き起こす多くの酵素、たとえば、プロテアーゼが活性化される。ジストロフィー筋中においてカルシウムの病的蓄積の直接の一因となるイオンチャネルは、ＤＭＤを治療するための補助化合物の潜在的標的である。ペントキシフィリンなどの一部分の薬剤は運動感受性カルシウムチャネルを遮断し^３２、伸展活性化チャネルを遮断する抗生物質はｍｄｘマウスにおいて筋線維壊死を、ＤＭＤ男子においてＣＫレベルを抑えるという証拠が存在する^３３。したがって、一実施形態は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、イオンチャネル阻害剤と前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物とを前記個人に投与することを含む方法を提供する。薬物として使用するための、イオンチャネル阻害剤と個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、イオンチャネル阻害剤及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。

好ましくは、キサンチンの種類のイオンチャネル阻害剤が使用される。さらに好ましくは、前記キサンチンはメチルキサンチンの誘導体であり、最も好ましくは、前記メチルキサンチン誘導体は、ペントキシフィリン、フラフィリン、リソフィリン、プロペントフィリン、ペンチフィリン、テオフィリン、トルバフィリン、アルビフィリン、エンプロフィリン及びその誘導体からなるグループから選択される。ペントキシフィリンの使用が最も好ましい。キサンチンの種類のイオンチャネル阻害剤は、エキソンに、又は前記エキソンの１つの若しくは両方のスプライス部位に向けられたオリゴヌクレオチドを使用する場合、前記エキソンを含むＭＲＮＡ前駆体からのジストロフィンエキソンのスキッピング頻度を増強する。増強されたスキッピング頻度は、ＤＭＤ又はＢＭＤ個人の筋細胞において産生される機能性ジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。

イオンチャネル阻害剤の種類に応じて、当業者であれば、どの量であれば好ましく使用されるかが分かるであろう。ペントキシフィリンの適切な用量は、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の間であり、好ましい用量は約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。ヒトに使用される典型的用量は、２０ｍｇ／ｋｇ／日である。

一実施形態では、イオンチャネル阻害剤は、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を投与するのに先立って、前記個人に投与される。本実施形態では、前記イオンチャネル阻害剤は、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を投与する少なくとも１日、さらに好ましくは少なくとも１週間、さらに好ましくは少なくとも２週間、さらに好ましくは少なくとも３週間前に投与される。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物はプロテアーゼ阻害剤と組み合わされる。カルパインは、ジストロフィー筋中において増加するカルシウム活性化プロテアーゼであり、筋線維変性の原因である。したがって、カルパスタチン、ロイペプチン^３４、カルペプチン、カルパイン阻害剤ＩＩＩ、又はＰＤ１５０６０６などのカルパイン阻害剤が変性プロセスを抑えるために適用される。カルパイン阻害剤及び抗酸化剤の両方として二重作用を有する新しい化合物であるＢＮ８２２７０（Ｉｐｓｅｎ）は、筋力を増加させ、血清ＣＫを減少させ、ｍｄｘ横隔膜の線維症を抑え、この新しい化合物を使用した治療効果を示した^３５。別の化合物のＬｅｕｐｅｐｔｉｎ／Ｃａｒｎｉｔｉｔｅ（Ｍｙｏｄｕｒ）は最近、ＤＭＤ患者での臨床試験に提案された。

ＭＧ１３２は、筋膜損傷を抑え、筋ジストロフィーの病理組織学的徴候を寛解させることを示したもう一つのプロテアソーム阻害剤である^３６。ＭＧ１３２（ＣＢＺ−ロイシル−ロイシル−ロイシナール）は、細胞透過性プロテアソーム阻害剤（Ｋｉ＝４ｎＭ）であり、これはＩκＢ分解を妨げることによりＮＦκＢ活性化を阻害する（ＩＣ５０＝３μＭ）。さらに、ＭＧ１３２は、２０Ｓ及び２６Ｓプロテアソームに結合して不活化することにより、ユビキチン依存性タンパク質分解を阻害するペプチドアルデヒドである。ＭＧ１３２は、ジストロフィーｍｄｘマウスモデルにおいてジストロフィン関連タンパク質のプロテアソーム分解を阻害することを示している^３６。したがって、この化合物も、ＤＭＤに対する補助薬理学的化合物として使用するのに適している。したがって、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、プロテアーゼ阻害剤と前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質とを与えるための化合物を前記個人に投与することを含む方法がさらに提供される。薬物として使用するための、プロテアーゼ阻害剤と個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、プロテアーゼ阻害剤及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。プロテアーゼ阻害剤の種類に応じて、当業者であれば、どの量であれば好ましく使用されるかが分かるであろう。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物はＬ−アルギニンと組み合わされる。ジストロフィン欠損は、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）を含む、線維膜でのＤＧＣ複合体の喪失と関連している。ｍｄｘマウスでｎＮＯＳ導入遺伝子が発現されると、筋膜損傷が大いに抑えられた。同様に、Ｌ−アルギニン（一酸化窒素合成酵素の基質）を投与すると、ｍｄｘマウスでのＮＯ産生が増加し、ユートロフィン発現が上方調節された。６週間のＬ−アルギニン処置により、ｍｄｘマウスでは筋病理が改善され、血清ＣＫが減少した^３７。個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物と組み合わせた補助治療としてのＬ−アルギニンの使用はまだ開示されたことがない。

したがって、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、Ｌ−アルギニンと前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物とを前記個人に投与することを含む方法がさらに提供される。薬物として使用するための、Ｌ−アルギニンと個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、Ｌ−アルギニン及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物は、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスモデルにおいて示されるように^２３、筋構築、修復及び機能を正常化するアンジオテンシン１型受容体遮断剤Ｌｏｓａｒｔａｎと組み合わされる。したがって、本発明の一態様は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、アンジオテンシン１型受容体遮断剤Ｌｏｓａｒｔａｎと前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物とを前記個人に投与することを含む方法をさらに提供する。薬物として使用するための、アンジオテンシン１型受容体遮断剤Ｌｏｓａｒｔａｎと個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、アンジオテンシン１型受容体遮断剤Ｌｏｓａｒｔａｎ及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。アンジオテンシン１型受容体遮断剤の種類に応じて、当業者であれば、どの量であれば好ましく使用されるかが分かるであろう。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、好ましくは、ペリンドプリルと組み合わされる。ＡＣＥ阻害剤は血圧を下げることができる。ペリンドプリルを使用した治療の早期開始は、ＤＭＤ患者の死亡率の低下と関連している^２２。したがって、本発明の一態様は、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、ＡＣＥ阻害剤、好ましくは、ペリンドプリルと前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物とを前記個人に投与することを含む方法を提供する。薬物として使用するための、ＡＣＥ阻害剤、好ましくは、ペリンドプリルと個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、ＡＣＥ阻害剤、好ましくは、ペリンドプリル及び個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。ＡＣＥ阻害剤、好ましくは、ペリンドプリルの常用量は、約２〜４ｍｇ／日である^２２。さらに好ましい実施形態では、ＡＣＥ阻害剤は、以前に同定された補助化合物の少なくとも１つと組み合わされる。

別の好ましい実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物は、エキソンスキッピングを増強し且つ／又はスプライソソーム構築及び／若しくはスプライシングを阻害することができる化合物と組み合わされる。たとえば、特定のインドール誘導体などの小化合物は、たとえば、セリン及びアルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質がその認識スプライシングエンハンサー（ＩＳＥ若しくはＥＳＥ）に結合するのを妨げることにより、並びに／又はスプライシングリプレッサーがサイレンサー配列（ＥＳＳ若しくはＩＳＳ）に結合するのを妨げることにより、スプライソソーム構築及びスプライシングを選択的に阻害する^３８ことが明らかにされている。したがって、これらの化合物は、エキソンスキッピングを増強する補助化合物としての適用に適している。

したがって、個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための方法であって、エキソンスキッピングを増強し且つ／又はスプライソソーム構築及び／若しくはスプライシングを阻害するための化合物と前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物とを前記個人に投与することを含む方法がさらに提供される。薬物として使用するための、エキソンスキッピングを増強し且つ／又はスプライソソーム構築及び／若しくはスプライシングを阻害するための化合物と個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物との組合せのほかにも、ＤＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、エキソンスキッピングを増強し且つ／又はスプライソソーム構築及び／若しくはスプライシングを阻害するための化合物並びに個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の使用も提供される。一実施形態では、十分に機能性ではない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症型のＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減するために、前記組合せは使用される。エキソンスキッピングを増強し且つ／又はスプライソソーム構築及び／若しくはスプライシングを阻害することができる化合物の種類に応じて、当業者であれば、どの量であれば好ましく使用されるかが分かるであろう。さらに好ましい実施形態では、エキソンスキッピングを増強し且つ／又はスプライソソーム構築及び／若しくはスプライシングを阻害するための化合物は、ＡＣＥ阻害剤と及び／又は本明細書で前に同定されたどんな補助化合物とでも組み合わされる。

個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物、上記の補助化合物のうちのいずれか、並びに薬剤的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、アジュバンド、可溶化剤、希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬製剤も提供される。そのような薬剤的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、アジュバンド、可溶化剤、希釈剤及び／又は賦形剤は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００に見出せる。

したがって、本発明は、前記補助化合物が、ステロイド、ＡＣＥ阻害剤（好ましくは、ペリンドプリル）、アンジオテンシン１型受容体遮断剤Ｌｏｓａｒｔａｎ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害剤、ｍＩＧＦ−１の供給源、好ましくはｍＩＧＦ−１、ｍＩＧＦ−１発現を増強するための化合物、ｍＩＧＦ−１活性を増強するための化合物、抗酸化剤、イオンチャネル阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン並びに／或いはエキソンスキッピングを増強し且つ／又はスプライソソーム構築及び／若しくはスプライシングを阻害するための化合物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤を提供する。本明細書において以前記載したように、種々の形で、たとえば、ゲンタマイシン若しくはＰＴＣ１２４^{１６，１７}による終止コドン抑制により、又は機能性ミニ若しくはミクロジストロフィン遺伝子のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子送達により^{１８〜２０}、個人には機能性ジストロフィンタンパク質が与えられる。

しかし、好ましくは、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物は、前記個人において異常なジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるためのオリゴヌクレオチド、又はその機能性同等物を含む。異常なジストロフィンｍＲＮＡ、又は異常なジストロフィンタンパク質の産生を減少させるとは、好ましくは、ＲＴ ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）又は免疫蛍光若しくはウエスタンブロット解析（タンパク質）により、異常なジストロフィンｍＲＮＡ、又は異常なジストロフィンタンパク質の初期量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下がまだ検出可能であることを意味する。異常なジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質は、本明細書では非機能性ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質とも呼ばれる。非機能性ジストロフィンタンパク質は、好ましくは、アクチン及び／又はＤＧＣタンパク質複合体のメンバーに結合することができないジストロフィンタンパク質である。非機能性ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンｍＲＮＡは典型的には、タンパク質の無傷のＣ末端を有するジストロフィンタンパク質を有していない、又はコードしていない。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンスオリゴリボヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、エキソンスキッピング技法が適用される。エキソンスキッピングは、真核細胞内で起きている天然のスプライシングプロセスを妨げる。高等真核生物では、細胞のＤＮＡ中のタンパク質の遺伝情報は、イントロン配列により互いに分離されているエキソンにコードされている。これらのイントロンは場合によっては非常に長い。真核生物の転写機構は、エキソンもイントロンも含有するｍＲＮＡ前駆体を産生するが、スプライシング機構は、多くの場合すでにｍＲＮＡ前駆体の産生中に、ｍＲＮＡ前駆体中に存在するエキソンを継ぎ合わせることによりタンパク質の実際のコード領域を産生している。

エキソンスキッピングにより、少なくとも１つのスキップされたエキソンを欠く成熟ｍＲＮＡが生じる。したがって、前記エキソンがアミノ酸をコードする場合、エキソンスキッピングにより改変産物が発現される。エキソンスキッピング技術は最近、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用に向けられている。この研究の多くは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルで行われている。ｍｄｘマウスは、そのジストロフィン遺伝子のエキソン２３にナンセンス突然変異体を担っているが、ＤＭＤの動物モデルとして使用されてきた。機能性ジストロフィンタンパク質の合成を妨げるはずのｍｄｘ突然変異にもかかわらず、ｍｄｘ筋組織にはまれな天然に存在するジストロフィン陽性線維が観察されている。これらのジストロフィン陽性線維は、体細胞突然変異のせいで、又は選択的スプライシングを通じて、見かけ上天然に存在するエキソンスキッピング機構から生じたと考えられる。それぞれジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のイントロン２２及び２３の３’及び／又は５’スプライス部位に向けられたＡＯＮは、通常はイントロン２３の除去に関与している因子を妨害し、そのためにエキソン２３もｍＲＮＡから除去されたことが明らかにされている^{３，５，６，３９，４０}。

特定のエキソンの標的スキッピングにより、ＤＭＤ表現型はより軽度のＢＭＤ表現型に変換される。エキソンのスキッピングは、好ましくは、スプライス部位のうちの１つ若しくは両方、又はエキソン内部配列のいずれかを標的するＡＯＮの結合により誘導される。エキソン内部配列に向けられるオリゴヌクレオチドは典型的には、非エキソン配列との重複を示さない。このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくともこれらのスプライス部位がイントロン中に存在しない限り、スプライス部位と重複することはない。エキソン内部配列に向けられるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、隣接イントロンに相補的な配列を含有していない。したがって、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンを、前記ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングから産生されるｍＲＮＡに包含することを阻害するためのオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤がさらに提供される。好ましくは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体から産生されるｍＲＮＡにエキソンが欠失していることにより、短くはなるが、機能性のジストロフィンタンパク質のコード領域が生み出されるように、エキソンスキッピング技法は適用される。この文脈では、エキソンの包含を阻害することは、好ましくは、最初の異常なジストロフィンｍＲＮＡの検出が、ＲＴ−ＰＣＲにより評価されると少なくとも約１０％減少すること、又は対応する異常なジストロフィンタンパク質が、免疫蛍光若しくはウエスタンブロット解析により評価されると少なくとも約１０％減少することを意味する。減少は、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％である。

ＤＭＤ患者に機能性ジストロフィンタンパク質が与えられると、ＤＭＤの原因が取り除かれる。したがって、次に、ＤＭＤの症状は十分に軽減されると予想されるであろう。しかし、すでに前に記載したように、本発明は、エキソンスキッピング技法が機能性ジストロフィンタンパク質を与えることができるとしても、炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は筋線維機能、完全性、及び／若しくは生存を改善するための補助化合物をＤＭＤ患者に投与することにより、ＤＭＤの症状はさらに軽減されるという洞察を提供する。さらに、本発明は、炎症を相殺する補助治療はＡＯＮ治療にマイナスの影響を与えないという洞察を提供する。本発明は、エキソンに又は前記エキソンの１つの若しくは両方のスプライス部位に向けられたオリゴヌクレオチドを使用する場合は、前記エキソンを含むＭＲＮＡ前駆体からのジストロフィンエキソンのスキッピング頻度は増強されるという洞察をさらに提供する。増強されたスキッピング頻度は、ＤＭＤ又はＢＭＤ個人の筋細胞で産生される機能性ジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。

ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンは、両スプライス部位がスプライソソーム複合体により認識される場合のみ、こうして得られるｍＲＮＡ中に含まれることになるために、スプライス部位はＡＯＮの明白な標的である。したがって、一実施形態は、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤を提供する。一実施形態では、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域にのみ相補的であるＡＯＮが使用される。しかし、これは必須ではなく、イントロン特異的配列のほかにもエキソン特異的配列を含むＡＯＮを使用することも可能である。そのようなＡＯＮは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域に相補的である配列のほかにもジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソン領域に相補的である配列も含む。当然のことながら、ＡＯＮは必ずしもジストロフィンエキソン又はイントロンの全配列に相補的ではない。そのようなエキソン又はイントロンの一部分に相補的なＡＯＮが好ましい。ＡＯＮは、好ましくは、ジストロフィンエキソン及び／又はイントロンの少なくとも一部分に相補的であり、前記部分は少なくとも１３ヌクレオチドを有する。

ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングは、２つの連続的エステル転移反応を介して起こる。先ず、スプライソソーム構築中に定義されるイントロン内の特定の分枝部位ヌクレオチドの２’ＯＨが、イントロンの最初のヌクレオチドに５’スプライス部位で求核攻撃を行い、ラリアット中間体を形成する。第２に、次に、放出された５’エキソンの３’ＯＨが、イントロンの最後のヌクレオチドに３’スプライス部位で求核攻撃を行い、したがってエキソン同士を結合させイントロンラリアットを放出する。このように、イントロンの分枝部位とスプライス部位はスプライシング事象に関与している。したがって、そのような分枝部位及び／又はスプライス部位に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、好ましくは、エキソンスキッピングのために使用される。したがって、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライス部位及び／若しくは分枝部位に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤がさらに提供される。

スプライス部位はコンセンサス配列を含有するので、スプライス部位に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物（本明細書ではＡＯＮとも呼ばれる）の使用は乱雑なハイブリダイゼーションの危険を伴う。スキップされることになるエキソンの部位以外のスプライス部位へのＡＯＮのハイブリダイゼーションは、スプライシングプロセスの正確さを容易に妨げるおそれがある。イントロン配列に相補的なＡＯＮの使用に関連するこれら及び他の潜在的問題を克服するために、好ましい実施形態は、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンに相補的である配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤を提供する。好ましくは、前記ＡＯＮは、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中の少なくとも１つのエキソンのエキソン包含シグナルを特異的に阻害することができる。エキソン包含シグナル（ＥＩＳ）の妨害は、そのようなエレメントがエキソン内に位置しているという利点がある。スキップされることになるエキソンの内部に対するＡＯＮを与えることにより、エキソン包含シグナルを妨害し、それによりスプライシング装置から効果的にエキソンをマスクすることが可能である。したがって、スプライシング装置がスキップされることになるエキソンを認識できないと、エキソンが最終ｍＲＮＡから排除される。本実施形態は、スプライシング機構の酵素的プロセス（エキソン同士の結合）を直接に妨害しない。このせいで、方法はより特異的で及び／又は信頼性のあるものになると考えられる。ＥＩＳは、スプライス受容部位及び供与部位が特定の空間的立体構造を帯びることを可能にするエキソンの特定の構造であると考えられる。この概念では、スプライス機構がエキソンを認識するのを可能にするのは特定の空間的立体構造である。しかし、本発明は確かにこのモデルに限定されるものではない。エキソンに結合できる薬剤は、ＥＩＳを阻害することができることが見出されている。ＡＯＮは、どの時点でも前記エキソンに特異的に接触する可能性があり、それでも前記ＥＩＳを特異的に阻害することができる。

エキソン４６配列に特異的なエキソン内部ＡＯＮを使用して、我々は以前、エキソン４５欠損を有する２人の異なるＤＭＤ患者由来の培養筋管においてスプライシングパターンを調節することができた。ＡＯＮ処置に続いて、エキソン４６がスキップされ、そのためにリーディングフレームが修復され、少なくとも７５％の細胞においてジストロフィン合成が誘導された。エキソンスキッピングは、ヒト対照並びにエキソン内部ＡＯＮを使用した３９の異なるＤＭＤエキソンに対して、欠損、重複及び点突然変異を含む異なる突然変異体を有する一連の患者にも効率的に誘導することができることを、我々は最近明らかにした^{１、２、１１〜１５}。

本発明の文脈内で、オリゴヌクレオチドの機能性同等物とは、好ましくは、１つ又は複数のヌクレオチドが置換されており、前記機能性同等物の活性が少なくともある程度は保持されている本明細書において定義されるオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、前記機能性同等物の活性とは、機能性ジストロフィンタンパク質を与えることである。したがって、前記機能性同等物の前記活性は、好ましくは、機能性ジストロフィンタンパク質の量を定量化することにより評価される。機能性ジストロフィンとは、本明細書において好ましくは、アクチン及びＤＧＣタンパク質複合体のメンバーに結合することができるジストロフィンであると定義される。オリゴヌクレオチドの前記活性の評価は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲにより、又は免疫蛍光若しくはウエスタンブロット解析により行われる。前記活性は、好ましくは、それが機能性同等物が由来する前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％以上を表している場合には、少なくともある程度は保持されている。本出願全体で、用語オリゴヌクレオチドが使用される場合、それは本明細書において定義されるその機能性同等物で置き換えてもよい。

したがって、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンに相補的である配列を含む若しくはからなるオリゴヌクレオチド、又はその機能性同等物の使用は、良好な抗ＤＭＤ結果を与える。好ましい実施形態では、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの２、８、９、１７、１９、２９、４０〜４６、４８〜５３、５５若しくは５９の少なくとも一部分であって、前記部分が少なくとも１３ヌクレオチドを有する部分に相補的である配列を含む若しくは上記配列からなるオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物が使用される。しかし、前記部分は、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドを有してもよい。

最も好ましくは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソン５１、４４、４５、５３、４６、４３、２、８、５０及び／若しくは５２の少なくとも一部分であって、少なくとも１３ヌクレオチドを有する部分に相補的である配列を含む若しくは上記配列からなるＡＯＮが使用される。しかし、前記部分は、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドを有してもよい。最も好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列、すなわち配列番号３から配列番号２８４までのそれぞれにより同定される。したがって、本明細書で使用される非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号３から配列番号２８４までの配列によって表される。本明細書で使用する非常に好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号３から配列番号２８４までからなるグループから選択される。

前記エキソンは、患者集団適用性の減少する順序で収載されている。したがって、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソン４４その他に相補的な配列を含むＡＯＮと比べると、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソン５１の少なくとも一部分に相補的である配列を含むＡＯＮの使用が、ＤＭＤ患者集団の大部分での使用に適している。

好ましい実施形態では、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の一部分に相補的である配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、その相補的部分が本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、又はさらに好ましくは少なくとも９５％、又はさらに好ましくは少なくとも９８％以上であるようなものである。非常に好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の一部分に相補的である配列からなる。たとえば、オリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の一部分に相補的である配列及び追加の隣接配列を含んでいてもよい。さらに好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの前記相補的部分の長さは、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドである。好ましくは、追加の隣接配列を使用して、オリゴヌクレオチドへのタンパク質の結合を改変する、又はオリゴヌクレオチドの熱力学的特性を改変する、さらに好ましくは、標的ＲＮＡ結合親和性を改変する。

好ましい実施形態は、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物が、
ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの別の部分にハイブリダイズしているジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの領域（閉鎖構造）に相補的である配列と、
前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体においてハイブリダイズしていないジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの領域（開放構造）に相補的である配列と
を含むオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤を提供する。

本実施形態では、我々のＷＯ２００４／０８３４３２特許公開を参照する。ＲＮＡ分子は、大部分が同一ＲＮＡ内の相補的又は部分的に相補的ストレッチの塩基対形成のせいで強固な二次構造を示している。ＲＮＡにおける構造がＲＮＡの機能に役割を果たしているとずっと以前から考えられてきた。理論に拘泥するものではないが、エキソンのＲＮＡの二次構造がスプライシングプロセスを構築するのに役割を果たしていると考えられる。その構造を通じて、エキソンはｍＲＮＡに含める必要がある部分として認識される。本明細書では、このシグナル伝達機能は、エキソン包含シグナルと呼ばれている。本実施形態の相補的オリゴヌクレオチドは、エキソンの構造を妨害することができ、それによってエキソンのエキソン包含シグナルを妨害することができる。多くの相補的オリゴヌクレオチドが実際にこの能力を備えており、効率にはオリゴヌクレオチドにより差があることが見出されている。この好ましい実施形態のオリゴヌクレオチド、すなわち、前記重複が天然エキソンＲＮＡの開放及び閉鎖構造に向けられたオリゴヌクレオチドは、あらゆる考えられるオリゴヌクレオチドから選ばれたものである。選ばれたものは、エキソン包含シグナルを効率的に妨害することができるオリゴヌクレオチドを包含する。理論に拘泥するものではないが、開放構造との重複はオリゴヌクレオチドの侵入効率を改善し（すなわち、オリゴヌクレオチドがその構造に入ることができる効率を増加させる）、閉鎖構造との重複は、続いてエキソンのＲＮＡの二次構造を妨害する効率を増加させ、それによってエキソン包含シグナルを妨害すると考えられる。閉鎖及び開放構造の両方に対する部分的相補性の長さは極端に制限されることはないことが見出されている。どちらかの構造における相補性の長さが可変であるオリゴヌクレオチドを使用して高効率を我々は観察している。相補性という用語は、生理的条件下で核酸の別のストレッチにハイブリダイズすることができる核酸のストレッチに言及するために本明細書では使用される。したがって、相補性の領域のすべての塩基が反対鎖の塩基と対形成することができることが絶対的に要求されるわけではない。たとえば、オリゴヌクレオチドを設計する際に、たとえば、相補鎖上の塩基と塩基対形成をしない残基を組み入れたいことがある。細胞内の状況下で、ヌクレオチドのストレッチが相補的部分とハイブリダイズすることができれば、ミスマッチはある程度は許されてよい。好ましい実施形態では、（前記開放又は前記閉鎖構造のどちらかに対して）相補的部分は、少なくとも３、さらに好ましくは少なくとも４連続ヌクレオチドを含む。相補的領域は、好ましくは、結合したときに、その領域がｍＲＮＡ前駆体のエキソンに特異的であるように設計される。そのような特異性は、これは系内の他のｍＲＮＡ（前駆体）の実際の配列に依存するために、種々の長さの相補的領域を使用して生み出してもよい。１つ又は複数の他のｍＲＮＡ前駆体もオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができることになる危険は、オリゴヌクレオチドの大きさが増加するに従って減少する。相補性の領域にミスマッチを含むが、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域（単数又は複数）にハイブリダイズする能力を保持しているオリゴヌクレオチドは、本発明において使用することができることは明らかである。しかし、好ましくは、少なくとも相補的部分は、これらの部分が典型的には、１つ又は複数の相補的領域にそのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも高い効率及び高い特異性を有するために、そのようなミスマッチを含まない。ハイブリダイゼーション強度が高いほど（すなわち、反対鎖との相互作用の数が増加する）系のスプライシング機構を妨害するプロセスの効率を増加させるのに有利であると考えられる。好ましくは、相補性は９０と１００％の間である。一般に、これは、約２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中にほぼ１又は２ミスマッチを許す。

二次構造は、エキソンが存在するｍＲＮＡ前駆体という状況で分析されるのが最もよい。そのような構造は実際のＲＮＡで分析してもよい。しかし、構造モデリングプログラムを使用して、極めてよく（最も低いエネルギーコストで）ＲＮＡ分子の二次構造を予測することが現在可能である。適切なプログラムの非限定的例は、ＲＮＡｍｆｏｌｄバージョン３．１サーバーである^４１。当業者であれば、ヌクレオチド配列が与えられたら、適切な再現性でエキソンの可能性の高い構造を予測することができるであろう。そのようなモデリングプログラムにエキソン及び隣接イントロン配列の両方を与えた場合には、最良の予測が得られる。典型的に、全ｍＲＮＡ前駆体の構造のモデルを作る必要はない。

オリゴヌクレオチドが向けられる開放及び閉鎖構造は、好ましくは、互いに隣接している。このような形で、開放構造へのオリゴヌクレオチドのアニーリングにより、アニーリングがこの閉鎖構造の中にまで進むとすぐに閉鎖構造の開口が誘導される。この作用を通じて、以前閉鎖していた構造は異なる立体構造を帯びる。異なる立体構造のせいで、エキソン包含シグナルが乱される。しかし、潜在的（隠れた）スプライス受容部位及び／又は供与部位配列が標的エキソン内に存在する場合は、時折新しいエキソン包含シグナルが生み出されて、異なる（ネオ）エキソン、すなわち、異なる５’末端、異なる３’末端、又は両方を有するエキソンを定義する。標的エキソンはｍＲＮＡから排除されるために、この種の活性は本発明の範囲内である。ｍＲＮＡ中に標的エキソンの部分を含有する新しいエキソンが存在しても、標的エキソンそれ自体が排除されるという事実は変わらない。ネオエキソンの包含は、時折しか起こらない副作用と見なすことができる。エキソンスキッピングを使用して、突然変異の結果として乱されるジストロフィンのオープンリーディングフレーム（の一部分）を修復する場合には、２つの可能性が存在する。１つは、ネオエキソンがリーディングフレームの修復において機能性であり、他方の場合は、リーディングフレームは修復されない。エキソンスキッピングを用いてジストロフィンリーディングフレームを修復するためのオリゴヌクレオチドを選択する際、当然のことながら、これらの条件下では、ネオエキソンがあってもなくても、ジストロフィンオープンリーディングフレームを修復するエキソンスキッピングを実際に生じるオリゴヌクレオチドのみが選択されることは明らかである。

前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンのＲＮＡ中のセリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質に対する結合部位に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤がさらに提供される。我々の特許出願ＷＯ２００６／１１２７０５において、エキソンスキッピングを誘導する際のエキソン内部アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の有効性と前記ＡＯＮの標的ｍＲＮＡ前駆体部位における（たとえばＥＳＥｆｉｎｄｅｒにより）予想されるＳＲ結合部位の存在との間に相関関係が存在することを我々はすでに開示した。したがって、一実施形態では、ジストロフィンエキソンのＲＮＡにおけるＳＲ（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）タンパク質に対する（推定）結合部位を決定すること及び前記ＲＮＡに相補的であり、前記（推定）結合部位に少なくとも部分的に重複しているオリゴヌクレオチドを作製することを含めて、オリゴヌクレオチドが作製される。用語「少なくとも部分的に重複している」は、ＳＲ結合部位のわずか１個のヌクレオチドのほかにも前記結合部位の複数のヌクレオチドの重複のほかにも前記結合部位の完全な重複を含むこととして本明細書では定義されている。本実施形態は、好ましくは、前記ＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分にハイブリダイズしている領域（閉鎖構造）及び前記構造中でハイブリダイズしていない領域（開放構造）を決定し、続いて、前記（推定）結合部位に少なくとも部分的に重複し、前記閉鎖構造の少なくとも一部分に重複し且つ前記開放構造の少なくとも一部分に重複するオリゴヌクレオチドを作製することをさらに含む。このような形で、我々は、ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡへのエキソン包含を妨害することができるオリゴヌクレオチドを得る機会を増加させる。最初に選択されたＳＲ結合領域には要求される開放−閉鎖構造がないことがあり得るが、その場合には別の（第２の）ＳＲタンパク質結合部位が選択され、次に、続いて開放−閉鎖構造の存在について試験される。ＳＲタンパク質結合部位のほかにも（部分的に重複している）開放−閉鎖構造を含有する配列が同定されるまで、このプロセスは続けられる。次に、この配列を使用して、前記配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを設計する。

オリゴヌクレオチドを作製するためのそのような方法は、記載の順序、すなわち、ジストロフィンエキソン由来のＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分にハイブリダイズしている構造を帯びる領域（閉鎖構造）及び前記構造中でハイブリダイズしていない領域（開放構造）を決定し、続いて、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が前記閉鎖構造に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも別の一部分が前記開放構造に相補的であるオリゴヌクレオチドを作製することを含めて、先ずオリゴヌクレオチドを作製することを逆転させることによっても実施される。次に、これに続いて、ＳＲタンパク質結合部位が前記開放／閉鎖構造と少なくとも重複しているかどうかを判定する。このような形で、ＷＯ２００４／０８３４３２の方法は改善される。さらに別の実施形態では、選択は同時に実施される。

どんな理論にも拘泥するものでもないが、ＳＲタンパク質結合部位に向けられたオリゴヌクレオチドを使用すれば、ＳＲタンパク質の結合部位へのＳＲタンパク質の結合が（少なくとも部分的に）損なわれ、スプライシングが乱される又は損なわれると現在考えられる。

好ましくは、開放／閉鎖構造とＳＲタンパク質結合部位は部分的に重複しており、さらに好ましくは、開放／閉鎖構造はＳＲタンパク質結合部位と完全に重複しており、又はＳＲタンパク質結合部位は開放／閉鎖構造と完全に重複している。これにより、エキソン包含を乱すことの改善が可能になる。

コンセンサススプライス部位配列に加えて、多くの（すべてではないにしても）エキソンは、スプライソソームによる本当のスプライス部位の認識を促進するエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列などのスプライシング調節配列を含有する^{４２，４３}。ＳＲタンパク質と呼ばれるスプライシング因子のサブグループは、これらのＥＳＥに結合して、Ｕ１及びＵ２ＡＦなどの他のスプライシング因子を（弱く定義される）スプライス部位へ動員することができる。４種の最も豊富なＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５）の結合部位は詳細に分析されており、これらの結果は、これらのＳＲタンパク質に対する潜在的結合部位を予想するウェブ情報源であるＥＳＥｆｉｎｄｅｒに組み入れられている^{４２，４３}。ＡＯＮの有効性とＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５及びＳＲｐ４０結合部位の有無の間には相関関係が存在する。好ましい実施形態では、したがって、本発明は、前記ＳＲタンパク質がＳＦ２／ＡＳＦ又はＳＣ３５又はＳＲｐ４０である、上記の方法、組合せ、使用又は医薬製剤を提供する。

一実施形態では、ＤＭＤ患者は、転写物中のジストロフィンエキソンの正確なスプライシングに必要な調節ＲＮＡ配列に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチド、又はその機能性同等物を使用することにより、機能性ジストロフィンタンパク質を与えられる。いくつかのシス作用性ＲＮＡ配列が、転写物中のエキソンの正確なスプライシングに必要である。特に、イントロン又はエキソンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ及びＥＳＥ）若しくはサイレンサー（ＩＳＳ及びＥＳＥ）などの補充エレメントが、構成的又は代替エキソンの特異的及び効率的スプライシングを調節するために同定される。エレメントに結合する配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、ＤＭＤで示されるように、その調節機能はエキソンがスキップされるように乱される。したがって、好ましい実施形態では、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、及び／又はエキソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に相補的であるオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物が使用される。本明細書で以前すでに記載したように、前記エキソンがｍＲＮＡに含まれる必要がある一部分としてスプライシング機構により認識されないように、前記エキソンのエキソン包含シグナルを特異的に阻害することができる薬剤によりジストロフィンエキソンは、好ましい実施形態では、スキップされる。そのために、前記エキソンのないｍＲＮＡが形成される。

本発明の方法で使用されるＡＯＮは、好ましくは、ジストロフィンエキソンＲＮＡ、又はジストロフィンイントロンＲＮＡの１３と５０ヌクレオチド間の連続する部分に相補的である。一実施形態では、本発明の方法で使用されるＡＯＮは、ジストロフィンエキソンＲＮＡ、又はジストロフィンイントロンＲＮＡの１６と５０ヌクレオチド間の連続する部分に相補的である。好ましくは、前記ＡＯＮは前記エキソンＲＮＡの１５から２５ヌクレオチドの間の連続する部分に相補的である。さらに好ましくは、ジストロフィンエキソンＲＮＡ、又はジストロフィンイントロンＲＮＡの２０から２５ヌクレオチドの間の連続する部分に相補的である配列を含むＡＯＮが使用される。

異なる種類の核酸を使用してオリゴヌクレオチドを作製してもよい。好ましくは、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは非常に安定なので、前記オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。エキソンスキッピング技法の目的の１つは被験者におけるスプライシングを方向づけることであるために、オリゴヌクレオチドＲＮＡは、ＲＮＡに追加の特性、たとえば、エンドヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼＨに対する耐性、追加のハイブリダイゼーション強度、増加した安定性（たとえば、体液中における）、増加した又は減少した柔軟性、低下した毒性、増加した細胞内輸送、組織特異性、などを与える修飾物を含むことが好ましい。好ましくは、前記修飾物は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド修飾物を含む。好ましくは、前記修飾物は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾物を含む。したがって、一実施形態は、修飾物、好ましくは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）又はデオキシリボース（ＤＮＡ）修飾物を含有するＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドが使用される、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤を提供する。

一実施形態では、本発明は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾物を含むオリゴヌクレオチド及びロックド核酸を含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。この特定の組合せは、ロックド核酸からなる同等物と比べて優れた配列特異性を有し、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾物からなるオリゴヌクレオチドと比べた場合には改善された有効性を有する。

核酸模倣技術の出現により、核酸それ自体と必ずしも量においては類似していないが種類において類似している、好ましくは同一のハイブリダイゼーション特徴を有する分子を作製することが可能になった。そのような機能性同等物は、当然のことながら、本発明の方法における使用にも適している。オリゴヌクレオチドの機能性同等物の好ましい例は、ペプチド核酸及び／又はロックド核酸である。最も好ましくは、モルフォリノホスホロジアミダートが使用される。本発明のオリゴヌクレオチドの同等物の適切であるが非限定的例は、４４〜５０に見出せる。１つ又は複数の同等物の互いの間及び／又は核酸との間のハイブリッドも、当然のことながら適切である。好ましい実施形態では、ロックド核酸はより高度な標的親和性及び低下した毒性を示し、したがって、エキソンスキッピングのより高度な効率を示すために、ロックド核酸はオリゴヌクレオチドの機能性同等物として使用される。

一実施形態では、ジストロフィンエキソンのジストロフィンｍＲＮＡへの包含を阻害することができるオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物は、別のジストロフィンエキソンのジストロフィンｍＲＮＡへの包含を阻害することができる少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチド又はその機能性同等物と組み合わされる。このような形で、このｍＲＮＡ前駆体から産生されるｍＲＮＡ中へのジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の２つ以上のエキソンの包含が妨げられる。この実施形態は、さらに二重又は多重エキソンスキッピングと呼ばれる^２，１５。大半の場合、二重エキソンスキッピングにより、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体から２つの標的エキソンのみが排除される。しかし、他の場合、標的エキソン及び前記ｍＲＮＡ前駆体中の前記エキソン同士の中間の領域全体が、他のエキソン（介在するエキソン）がそのような領域に存在する場合でも、産生されたｍＲＮＡ中に存在しないことが見出された。ＤＭＤ遺伝子を転写している細胞に、エキソン４５に対する１つのオリゴヌクレオチド及びエキソン５１に対する１つのオリゴヌクレオチドが添加される、ＤＭＤ遺伝子由来のオリゴヌクレオチドの組合せで、この多重スキッピングは顕著に上述の通りとなった。そのような設定では、エキソン４５から５１までを含有しないｍＲＮＡが産生された。明らかに、言及されたオリゴヌクレオチドの存在下でのｍＲＮＡ前駆体の構造は、スプライシング機構が刺激されてエキソン４４と５２を互いに連結するような構造であった。

したがって、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の第１エキソンに相補的である少なくとも８、好ましくは１６から８０の間の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が使用される、及び前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の第２エキソンに相補的である少なくとも８、好ましくは１６から８０の間の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が使用される、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤がさらに提供される。

好ましい実施形態では、前記第１及び前記第２エキソンは、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中で、前記オリゴヌクレオチドが相補的ではない少なくとも１つのエキソンにより分離されている。

２つの相補的オリゴヌクレオチド間に連鎖を与えることにより、介在するエキソンのスキッピングも特異的に促進することが可能である。したがって、一実施形態では、少なくとも２つのジストロフィンエキソンに相補的なヌクレオチドのストレッチは、連結部分により分離される。したがって、ヌクレオチドの少なくとも２つのストレッチは、単一分子を形成するように本実施形態では連結される。したがって、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記オリゴヌクレオチド、又はその機能性同等物がジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中の少なくとも２つのエキソンに相補的であり、前記オリゴヌクレオチド、又は機能性同等物が少なくとも２つの部分を含み、第１の部分が前記少なくとも２つのエキソンの第１に相補的である少なくとも８、好ましくは１６から８０の間の連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含み、第２の部分が前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中の第２のエキソンに相補的である少なくとも８、好ましくは１６から８０の間の連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤がさらに提供される。連鎖はどんな手段を通じてでもよいが、好ましくは、ヌクレオチド連鎖を通じて実現される。後者の場合、一方の相補的エキソンと他方の相補的エキソンとの間に重複を含有しないヌクレオチドの数はゼロであることが可能であるが、好ましくは、４〜４０ヌクレオチドの間である。連結部分は、オリゴヌクレオチドを連結することができるどんな種類の部分でも可能である。好ましくは、前記連結部分は少なくとも４ウラシルヌクレオチドを含む。現在、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特徴を模倣する多くの異なる化合物が入手可能である。そのような化合物は、本明細書ではオリゴヌクレオチドの機能性同等物と呼ばれるが、そのような同等物が、必ずしも量においてではないが種類において類似するハイブリダイゼーション特徴を有するならば、本発明にも適している。適切な機能性同等物は本記述において以前に言及されている。言及したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的エキソンへのハイブリダイゼーションに寄与するオリゴヌクレオチドのみからなる必要はない。追加の材料及び／又はヌクレオチドが加えられてもよい。

ＤＭＤ遺伝子は、多くの異なるエキソンがある大きな遺伝子である。この遺伝子がＸ染色体上に位置していることを考慮すると、女子も両親からこの遺伝子の不良なコピーを受け取ることがあるためにこの疾患に冒されることがあるが、冒されるのは、又はその筋細胞において特に偏ったＸ染色体不活化のせいで機能性対立遺伝子の特に偏った不活化を患っているのは大部分が男子である。このタンパク質は、少なくとも２，６Ｍｂの範囲にわたり複数のエキソン（７９）によりコードされている。ＤＭＤ遺伝子のどの部分でも欠損が起こる可能性がある。特定のエキソン（単数又は複数）のスキッピングにより、正常よりは短いが少なくとも部分的には機能性のジストロフィンタンパク質をコードする再構築されたｍＲＮＡが生じることが非常に多い。エキソンスキッピング技術に基づく薬物の開発における実際的問題は、細胞内の機能性ジストロフィンタンパク質の欠損を生じる可能性がある複数の突然変異である。単一エキソンのスキッピングによりすでに複数の異なる突然変異が補正できるという事実にもかかわらず、突然変異が異なれば異なるエキソンがスキップされる必要があるので、この複数の突然変異は多数の異なる医薬品を作製する必要がある。２つ以上のエキソンのスキッピングを誘導することができる化合物の利点は、単一の医薬品を使用して２つ以上のエキソンをスキップすることができることである。この特性は、多くの異なるＤＭＤ、又は特に、重症ＢＭＤ突然変異を治療するために限られた数の医薬品だけを作製すれば済むという点で実際的に非常に有用であるだけではない。現在当業者に開かれているもう１つの選択肢は、特に機能性の再構築ジストロフィンタンパク質を選択し、これらの好ましいジストロフィンタンパク質を産生することができる化合物を作製することである。そのような好ましい最終結果は、軽度表現型ジストロフィンとさらに呼ばれる。

本発明に従って使用するために本明細書に定義される各化合物、オリゴヌクレオチド及び／又は補助化合物は、ＤＭＤ若しくはＢＭＤに冒された又はＤＭＤ若しくはＢＭＤを発症する危険のある個人のインビボでの細胞、組織及び／又は器官への直接投与に適している可能性があり、インビボ、エクスビボ又はインビトロで直接投与してもよい。

代わりに、細胞にオリゴヌクレオチド又はその同等物を与えるための適切な手段は、当技術分野に存在している。オリゴヌクレオチド又はその機能性同等物は、たとえば、発現ベクターが前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形で細胞に与えてもよい。発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達媒体を介して細胞内に導入される。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター^{４、５１、５２}、等である。プラスミド、人工染色体、標的相同組換え及び細胞のヒトゲノムへの組込みに適したプラスミドも、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチドの送達に適宜適用してもよい。本発明に好ましいのは、転写がＰｏｌＩＩＩプロモーターから推進される、及び／又は転写物が小転写物の送達に良好な結果をもたらすＵ１若しくはＵ７転写物との融合物の形であるベクターである。適切な転写物を設計するのは技術者の技能の範囲内である。好ましいのは、ＰｏｌＩＩＩ推進転写物である。好ましいのは、Ｕ１又はＵ７転写物との融合転写物の形である^{４，５１，５２}。そのような融合物は記載の通りに作製してよい^{５３，５４}。オリゴヌクレオチドはそのままで送達してもよい。しかし、オリゴヌクレオチドはウイルスベクターにコードされていてもよい。典型的には、これは、転写物の一部にオリゴヌクレオチドの配列を含むＲＮＡ転写物の形においてである。

これまですでに達成された前進を考慮すると、細胞にオリゴヌクレオチド又はその同等物を与えるための手段の改良が期待される。そのような将来の改良は、当然のことながら、本発明の方法を使用してｍＲＮＡの再構築への言及される効果を実現するために組み込まれてもよい。オリゴヌクレオチド又はその同等物はそのままで細胞に送達することができる。オリゴヌクレオチド又はその同等物を個人に投与する場合、オリゴヌクレオチドは送達方法に適合する溶液中に溶解されるのが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内及び／又は脳室内投与では、溶液は生理食塩水であることが好ましい。本発明の方法のために特に好ましいのは、本明細書で定義される化合物の、好ましくは、オリゴヌクレオチドの、及び随意に補助化合物と一緒に、細胞への及び細胞内、好ましくは筋細胞内への送達に役立つことになる賦形剤の使用である。好ましいのは、本明細書で定義されるような化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、及び随意にベシクル又はリポソームと複合された又は閉じ込められた補助化合物と一緒に、細胞膜を通って送達する複合体、ベシクル及び／又はリポソームを形成することができる賦形剤である。これらの賦形剤の多くは当技術分野では既知である。適切な賦形剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミン共重合体（ＰＥＣ）及び誘導体、ＥｘＧｅｎ５００、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチンＴＭ、ＤＯＴＡＰを含む類似のカチオン重合体、並びに／或いはそのような化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、及び随意に本明細書に定義される補助化合物と一緒に、細胞に、好ましくは、筋細胞に送達することができる粒子に自己組織化できるウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、（アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド）核酸を、筋細胞を含む幅広い種類の培養細胞に効率的に送達することが明らかにされている。その高いトランスフェクションポテンシャルは、全体の細胞生存の観点から許容される低度から中程度の毒性と組み合わされる。構造改変の容易さを利用して、追加の改変並びにその追加の（インビボ）核酸移行特性及び毒性の分析を可能にすることができる。

リポフェクチンは、リポソーマルトランスフェクション薬剤の例を表す。リポフェクチンは、２つの脂質成分、すなわちカチオン脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．メチル硫酸塩であるＤＯＴＡＰ）及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性成分は細胞内放出を媒介する。別のグループの送達システムは重合体ナノ粒子である。

ＤＮＡトランスフェクション試薬としてよく知られているジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランなどのポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせて、本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、及び随意に補助化合物と一緒に、細胞膜を通って細胞内に送達することができるカチオンナノ粒子を処方することができる。

これらの一般的ナノ粒子材料に加えて、カチオンペプチドプロタミンは、本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、及び随意に補助化合物と一緒に、コロイドとして処方する別のアプローチを提供する。このコロイドナノ粒子システムは、本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドの、随意に補助化合物と一緒の細胞内放出をパッケージし媒介する単純自己組織化プロセスにより調製することができるいわゆるプロティクルを形成することができる。当業者であれば、上記の又は他の市販の代わりの賦形剤、並びに本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、及び随意にヒトにおけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療のための前記化合物を送達する本発明において使用するための補助化合物と一緒に、パッケージし送達する送達システムのどれでも選択し適用してもよい。

さらに、本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、及び随意に補助化合物と一緒に、細胞、細胞質及び／又はその核への取込みを促進するよう特異的に設計された標的リガンドに共有又は非共有結合させることもできると考えられる。そのようなリガンドは、（ｉ）細胞取込みを促進する細胞、組織、若しくは器官特異的エレメントを認識する（ペプチド（様）構造を含むがこれに限定されることはない）化合物、並びに／又は（ｉｉ）細胞への取込み及び／若しくは本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドの、及び随意に補助化合物と一緒の、ベシクル、たとえば、エンドソーム若しくはリソソームからの細胞内放出を促進することができる化合物を含むことができると考えられる。

したがって、好ましい実施形態では、本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドは、及び随意に補助化合物と一緒に、少なくとも賦形剤及び／又は送達のための標的リガンド及び／又は前記化合物の細胞への送達装置及び／又はその細胞内送達を増強することと一緒に与えられる薬物に処方される。したがって、本発明は、本明細書で定義される化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、及び随意に補助化合物と一緒に含み、少なくとも１つの賦形剤及び／又は送達のための標的リガンド及び／又は前記化合物の細胞への送達装置及び／又はその細胞内送達を増強することをさらに含む薬剤的に許容可能な組成物も包含する。オリゴヌクレオチド及び補助化合物は単一の組成物又は調製物に処方しなくてもよいことは理解されるべきである。その種類に応じて、当業者であれば、化合物ごとにどのような種類の処方が最も適切であるか分かるであろう。

好ましい実施形態では、本発明は、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物、並びに炎症を抑える、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物を含む部分のキットを提供する。

好ましい実施形態では、約０．１ｎＭと約１□Ｍ間の幅がある本明細書に定義されるオリゴヌクレオチドの濃度が使用される。さらに好ましくは、使用される濃度は、約０．３から約４００ｎＭの間の幅があり、さらに好ましくは、約１から約２００ｎＭの間の幅がある。いくつかのオリゴヌクレオチドが使用される場合、この濃度はオリゴヌクレオチドの総濃度又は添加される各オリゴヌクレオチドの濃度のことでよい。上に与えられるオリゴヌクレオチド（単数又は複数）の濃度範囲は、インビトロ又はエクスビボ使用に好ましい濃度である。当業者であれば、使用されるオリゴヌクレオチド（単数又は複数）、治療される標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベル、使用される培地、並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件に応じて、使用されるオリゴヌクレオチド（単数又は複数）の濃度はさらに変わってもよく、これ以上最適化される必要があってもよい。

さらに好ましくは、ＤＭＤ又はＢＭＤを予防する、治療をするための本発明で使用されることになる化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチド及び補助化合物は、合成的に作製され、薬剤的に許容可能な組成物又は調製物に処方された形で細胞、組織、器官及び／又は患者に直接投与される。医薬組成物の被験者への送達は、好ましくは、１つ又は複数の非経口注射、たとえば、静脈内及び／又は皮下及び／又は筋肉内及び／又はくも膜下腔内及び／又は脳室内投与により、好ましくは、注射により、人体の１つの部位に又は複数の部位に実施される。

エキソンスキッピングに加えて、終止コドンのリードスルーに基づく治療を使用して、ＤＭＤ患者に機能性ジストロフィンタンパク質を与えることも可能である。終止コドンを抑制することができる化合物は、ジストロフィン遺伝子内で終止コドンが形成されることになるナンセンス突然変異に冒されているＤＭＤ患者のサブグループ（約７％）に特に適している。一実施形態では、終止コドンを抑制することができる前記化合物は、抗生物質のゲンタマイシンを含む。ｍｄｘマウスでの最近の研究では、動物間で変動はあったが、ゲンタマイシン処置により正常レベルの２０％まで新規のジストロフィン発現が誘導された。しかし、ゲンタマイシンを使用した人体試験では、結論に達していない^５５。ＰＴＣ１２４は、ゲンタマイシンのリードスルー活性を比較的低濃度で模倣する新しい種類の小分子に属する。ＰＴＣ１２４を投与すると、インビトロでもｍｄｘマウスにおいても完全長の機能的に活性なジストロフィンが産生される^１６。ＰＴＣ１２４を使用した第Ｉ／ＩＩ相試験が、ＤＭＤでの適用のためだけではなく嚢胞性線維症に対しても現在進行中である^{１６，１７}。参考文献１６及び１７は、本発明において使用するためのＰＣＴ１２４化合物の好ましい用量も記載している。したがって、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物が終止コドンを抑制するための化合物を含む、本発明に従った方法、組合せ、使用又は医薬製剤がさらに提供される。終止コドンを抑制するための前記化合物は、好ましくは、ゲンタマイシン、ＰＴＣ１２４又はその機能性同等物を含む。最も好ましくは、前記化合物はＰＴＣ１２４を含む。

一実施形態では、個人は、ミクロ−ミニ−ジストロフィン遺伝子を含むベクター、好ましくは、ウイルスベクターを使用して、機能性ジストロフィンタンパク質を与えられる。最も好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが使用される。ＡＡＶは、非病原性でヘルパー依存性生活環を示す一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。他のウイルス（アデノウイルス、レトロウイルス、及び単純ヘルペスウイルス）とは対照的に、ｒＡＡＶベクターは、成熟骨格筋を形質導入するのに非常に効率的であることを実証している。古典的ＤＭＤ「遺伝子付加」研究におけるｒＡＡＶの適用は、その制限されたパッケージング限界（＜５ｋｂ）により妨げられてきた。したがって、ｒＡＡＶは、好ましくは、はるかに小さいミクロ又はミニジストロフィン遺伝子の効率的送達に適用される。そのようなミクロ又はミニジストロフィン遺伝子の投与により、少なくとも部分的に機能性のジストロフィンタンパク質が存在することになる。１８〜２０を参照されたい。

個人に機能性ジストロフィンタンパク質及び本発明に従った少なくとも１つの補助化合物を与えるための化合物は、どんな順番でも個人に投与することができる。一実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質及び前記少なくとも１つの補助化合物を与えるための前記化合物は、同時に投与される（すなわち、前記化合物は１０時間以内に、好ましくは、１時間以内に投与される）。しかし、これは必須というわけではない。一実施形態では、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物の投与前に、少なくとも１つの補助化合物はそれを必要とする個人に投与される。したがって、
炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物をそれを必要とする個人に投与すること、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物を前記個人に投与することと、続いて、
前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物を前記個人に投与することと
を含む、本発明に従った方法がさらに提供される。

さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つの補助化合物の投与前に、個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記化合物は投与される。

異常なジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を含む細胞内での機能性ジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に増加させるための方法であって、
前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングから産生されるｍＲＮＡへのエキソンの包含を阻害するための化合物を前記細胞に与えることと、
炎症を抑えるための、好ましくは、筋組織炎症を抑えるための補助化合物を前記細胞に与えること、並びに／又は筋線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物を前記細胞に与えることと
を含み、
前記ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングから産生されるｍＲＮＡを翻訳させることをさらに含む方法が、さらに提供される。一実施形態では、前記方法は、たとえば、細胞培養を使用して、インビトロで実施される。

この文脈では、機能性ジストロフィンタンパク質の産生を増加させることは、本明細書において以前にすでに定義済みである。

他の方法で示されることがなければ、本明細書に記載する各実施形態は、本明細書に記載する他の実施形態と組み合わせてもよい。

本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用は、非限定的な意味で使用されて、その用語の後に続く項目が含まれるが、具体的に言及されない項目は排除されないことを意味する。さらに、動詞「なる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書で定義される化合物又は補助化合物が、具体的に同定される成分以外の追加の成分（単数又は複数）であって、本発明の独自の特徴を変えない前記追加の成分（単数又は複数）を含んでもよいことを意味する「本質的にからなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」により置き換えられてもよい。

さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が唯一の要素が存在することを明確に要求しなければ、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。

用語「ほぼ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」又は「約（ａｂｏｕｔ）」は、数値に付随して使用される場合（ほぼ１０、約１０）、好ましくは、その値が、所与の値の１０の１％多い又は少ない値であってよいことを意味する。

本明細書に引用される特許及び参考文献はすべて、これによって参照によりその全体を組み込まれているものとする。

本発明は以下の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を明確にする助けとなるだけである。

エキソンスキッピングの略図である。 エキソン５０の欠失がありデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者では、エキソン４９がエキソン５１にスプライシングされるフレーム外転写産物が生成する（図Ａ）。結果として、ジストロフィン合成を時期尚早に中断する終始コドンが、エキソン５１において生成する。エキソン内アンチセンスオリゴヌクレオチドＰＲＯ０５１の配列特異的結合はスプライシング中のエキソン５１の正確な封入に干渉し、したがってエキソンは実際スキッピングされる（図Ｂ）。これは転写産物のオープンリーディングフレームを修復し、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を有する患者におけるそれと類似したジストロフィンの合成を可能にする。 ４人の患者のプレスクリーニング試験の図である。 ４人の患者の下肢（患者３の左脚及び他の３人の患者の右脚）の磁気共鳴影像は、前頸骨筋の適切な状態（５０％未満の脂肪浸潤及び線維症）を示す（図Ａ）。これらの患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの診断結果は、大腿四頭筋から事前に得た生検標本の横断切片のジアミノベンジジン四塩酸塩染色によって確認した（図Ｂ）。患者２における１つのジストロフィン陽性又は復帰突然変異体線維細胞以外、ジストロフィンの発現は観察されなかった（矢印）。患者の突然変異及びエキソン５１と隣接する転写産物領域の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によって、未治療筋管（ＮＴ）中の個々の突然変異と、ＲＮＡレベルでの治療筋管（Ｔ）中のＰＲＯ０５１に対する陽性応答（すなわち、エキソン５１スキッピング）との両方を確認した（図Ｃ）。エキソンスキッピングの有効性は、患者１に関して４９％、患者２に関して８４％、患者３に関して５８％、及び患者４に関して９０％であった。エキソン５１内の潜在的スプライス部位は細胞培養中にＰＲＯ０５１によって時折活性化され、患者４由来の治療サンプル中に見られるように、別の異常なスプライシング産物をもたらす。レーンＭは１００−ｂｐサイズのマーカーを示し、且つレーンＣは健常対照の筋肉由来のＲＮＡを示す。治療及び未治療筋管由来のＲＴ−ＰＣＲ断片の配列分析によって、それぞれの患者に関するエキソン５１の正確なスキッピングを同定した（図Ｄ）。モノクローナル抗体ＮＣＬ−ＤＹＳ２の使用による治療筋管の免疫蛍光分析により検出したように、新たなフレーム内転写産物は相当なジストロフィン合成をもたらした（図Ｅ）。 治療前にジストロフィンは検出しなかった。 患者由来の生検標本の連続切片から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。 ＰＲＯ０５１を用いた治療後、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析は、それぞれの患者に関する、新規な、短い転写産物断片を示す。これらの断片のサイズと配列の両方によって、エキソン５１の正確なスキッピングを確認する。追加的なスプライス変異体は観察しなかった。第２８日に、依然相当なフレーム内ＲＮＡ転写産物を検出し、筋肉中でのＰＲＯ０５１の長期の持続を示唆した。少量の切片材料のため、高感度ＰＣＲ条件を使用し、このプロセスはスキッピングの有効性、及びＲＮＡのレベルとタンパク質のレベルの間の有意な相関関係の正確な定量化を妨げた。Ｍはサイズマーカー、及びＣは対照を示す。 ＰＲＯ０５１の単回筋肉内投与ジストロフィン修復効果の図である。 ジストロフィン抗体ＭＡＮＤＹＳ１０６の使用による免疫蛍光分析は、それぞれの患者から得た生検標本中の大部分の線維細胞の膜におけるジストロフィン発現を明らかに示す（図Ａ）。四角形によって示す領域は、図Ｂ中に高倍率で示す。比較用に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する未治療患者由来のサンプル及びひ腹筋由来の健常対照サンプル（ＨＣ）を、これらの患者由来のサンプルと共に含める。推定復帰突然変異体線維細胞を矢印によって示す。ジストロフィン及びラミニンα２を含有していた筋線維の合計数を手作業で数え、ジストロフィンとラミニンα２の比をプロットした（図Ｃ）。ＮＣＬ−ＤＹＳ１抗体の使用によって患者の生検標本から単離した全タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、全患者における修復したジストロフィン発現を示す（図Ｅ）。それぞれの患者に関して、３０μｇ（右レーン）及び６０μｇ（左レーン）を充填し、比較用に、健常ひ腹筋サンプル由来の３μｇの全タンパク質も充填した（過剰曝露を避けるため）。これらの患者のＤＭＤ遺伝子における比較的小さな欠失のために、タンパク質サイズの差は観察しなかった。患者１では、移動の不規則性は６０μｇレーン中のシグナル検出を阻害した。異なる横断切片中の筋線維の様々な密度を補正するために、それぞれの横断切片中の全蛍光ジストロフィンシグナル（領域中の割合）を、ラミニンα２の領域中の割合との比としてプロットした（図Ｄ）。 ＰＳ４９単独（群３）又はＰＳ４９及びプレドニゾロン（群４）で治療したｍｄｘマウス（群当たり２匹のマウス）における、異なる筋肉群（Ｑ：大腿四頭筋、ＴＡ：前頸骨筋、ＤＩＡ：横隔膜筋）中のＲＮＡレベルでのエキソン２３スキッピングレベルの図である。 筋細胞において、ＤＭＤ遺伝子のエキソン４４（Ａ）又はエキソン４５（Ｂ）のスキッピングレベルが、高濃度のペントキシフィリン（０〜０．５ｍｇ／ｍｌ）で増大する図である。 筋細胞において、ＤＭＤ遺伝子のエキソン４４（Ａ）又はエキソン４５（Ｂ）のスキッピングレベルが、高濃度のペントキシフィリン（０〜０．５ｍｇ／ｍｌ）で増大する図である。 ＰＳ４９単独（群３）又はＰＳ４９及びペントキシフィリン（群４）で治療したｍｄｘマウス（群当たり２匹のマウス）における、異なる筋肉群（Ｑ：大腿四頭筋、ＴＡ：前頸骨筋、Ｔｒｉ：三頭筋、ＨＲＴ：心筋）中のＲＮＡレベルでのエキソン２３スキッピングレベルの図である。 ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のアミノ酸配列の図である。 ヒトＩＧＦ−１アイソフォーム４のアミノ酸配列の図である。 ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子の示したエキソンを対象とする様々なオリゴヌクレオチドの図である。

（例１）
近年の臨床試験において、アンチセンス化合物ＰＲＯ０５１の局所安全性、耐性、及びジストロフィン修復効果を評価した。この臨床試験は近年公開された。この刊行物の内容は、本明細書では例１Ａで再現する。簡潔に言うと、ＰＲＯ０５１は、配列５’−ＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ−３’を有する合成修飾ＲＮＡ分子であり、エキソン５１のスキッピングを特異的に誘導するように設計する^５９。それは完全長２’−Ｏ−メチル置換リボース部分及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。エキソン５１のスキッピングによって修正可能な異なる特定のＤＭＤ遺伝子の欠失を有する４人のＤＭＤ患者を含めた。第０日に、一連の安全性パラメータを評価した。患者の脚（すなわち、前頸骨筋）をオーダーメードのプラスチックモールドで固定し、その位置を注意深く記録した。局所麻酔薬（ＥＭＬＡ）を使用して皮膚を麻痺させた。２．５ｃｍの筋電図針（ＭｙｏＪｅｃｔ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ Ｎｅｅｄｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ、ＴＥＣＡ Ａｃｃｅｓｓｏｒｉｅｓ）を使用して、ＰＲＯ０５１の４回の注射を、２つの小さな皮膚のタトゥー間の１．５ｃｍの線に沿って与え、筋肉内送達を確実にした。それぞれの注射体積は２００μｌであり、２００μｇのＰＲＯ０５１を含有しており、これを約３０°の角度で同等の場所に分散させた。第２８日に、同じ一連の安全性パラメータを再度評価した。脚は患者の専用モールドを使用して位置を合わせ、２つの先の鋭い顎部分を有するかん子（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ Ｃｏｎｃｈｏｔｏｍａ、ＤＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、半開状態の筋生検を局所麻酔下でタトゥー間において得た。生検は液体窒素冷却２−メチルブタン中で瞬間凍結させた。患者は連続的に治療した。試験時に、２人の患者（番号１及び２）はさらにコルチコステロイドで（プレドニゾン又はデフラザコルト）治療中であり、１人の患者はステロイド治療をちょうど止めたところであり（番号４）、且つ１人の患者は決してステロイドを使用しなかった（番号３）（表１参照）。この後者の患者は、他の３人の患者と比較したとき、若い年齢で歩行機能を消失した患者でもあった。ＲＮＡレベルでの特異的エキソンスキッピング（ＲＴ−ＰＣＲ分析、示さず）、及びタンパク質レベルでのジストロフィンの新規な発現（免疫蛍光及びウエスタンブロット分析、表１中に要約）を検出するために、生検を分析した。治療前後の一連の安全性パラメータ（腎臓及び肝臓機能に関する通常の血漿及び尿パラメータ、電解質レベル、血球数、ヘモグロビン、ａＰＴＴ、ＡＰ５０及びＣＨ５０値）の評価は、ＰＲＯ０５１化合物は局所で安全であり十分耐性があったことを示した。免疫蛍光分析用に、アセトン固定した生検の横断切片を、中央部桿ドメイン（ＭＡＮＤＹＳ１０６、Ｄｒ．Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ、ＵＫ、１：６０）、Ｃ末端ドメイン（ＮＣＬ−ＤＹＳ２、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、１：３０）に対するモノクローナル抗体と共に９０分間、又は参照としてラミニン−α２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、１：１５０）、次にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、１：２５０）抗体と共に１時間インキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）で切片を封入した。定量的画像解析用に、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｗ．Ｒａｓｂａｎｄ、ＮＩＨ、ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を記載されたように使用した^{６０、６１}。切片の大きさに応じて、横断切片全体を一連の６〜１０の隣接画像に細分化した。信頼できる測定を確実にするため、一定の露出設定を使用し、且つピクセル飽和を避けながら、切片の染色及び全画像の記録は１セッションで実施した。低い強度閾値をデュシェンヌ型筋ジストロフィーのバックグラウンドで設定し、且つそれぞれの横断切片（領域中の割合）に関して、ジストロフィンとラミニン−α２の両方に関して、陽性蛍光を定量化した。生検中の４つの一連の５０μｍ切片組からプールしたホモジェネートを使用して、ウエスタンブロット分析を記載されたように実施した^１。患者用に３０及び６０μｇの全タンパク質、対照用にサンプル３μｇを施用した。ブロットはジストロフィンモノクローナル抗体ＮＣＬ−ＤＹＳ１（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：１２５）と共に一晩、次にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１０．０００）と共に１時間インキュベートした。免疫反応性バンドを、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して可視化した。シグナル強度はＩｍａｇｅＪを使用して測定した。

筋繊維鞘における新規なジストロフィンタンパク質の発現を、全４人の患者における治療部位内の大部分の筋繊維において検出した。それぞれの切片中の線維を、ラミニン−α２、ジストロフィン欠損によって影響を受けない基底膜タンパク質の染色後に手作業で数えた。生検の大きさ及び患者の筋肉の質と一致して、個々の数は変わった。最大切片中で、患者２は７２６の線維を有し、そのうち６２０がジストロフィン陽性であり、一方患者３は１２０の線維を有し、そのうち１１７がジストロフィン陽性であった。ジストロフィン強度は、健常者筋肉生検における強度より典型的には低かった。ウエスタンブロット分析によって、様々な量でジストロフィンの存在を確認した。ジストロフィンシグナルをスキャンし、対照に対して補正した（全タンパク質１μｇ当たり）。その量は、最もジストロフィー性の筋肉を有する患者３における３％から、保存状態が良い筋肉を有する患者２における１２％まで変化した。全タンパク質に基づくこのような比較は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者における様々な量の線維性及び脂肪組織を補正しないので、本発明者らは、ＩｍａｇｅＪ分析により、それぞれの切片中に同様に位置するラミニン−α２のシグナルに対するジストロフィン蛍光シグナルも定量化した。このジストロフィン／ラミニン−α２の割合を対照切片に関して１００％で設定したとき、コルチコステロイドで同時治療した２人の患者は、最高の割合のジストロフィン、すなわち、患者１では３２％及び患者２では３５％を示した（表１）。最小の割合のジストロフィンは、患者３で検出され、１７％であった。患者４では、中間の割合の２５％を観察した。これらの割合は標的筋肉の相対的性質に対して補正され、それは患者番号１及び２において最良であり、患者番号３において最悪であった。

結論：ＰＲＯ０５１アンチセンス化合物の影響は、コルチコステロイドも施された患者でより顕著であった。

（例１Ａ）
Ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ＪＣら、（２００７）アンチセンスオリゴヌクレオチドＰＲＯ０５１はＤＭＤ患者における局所ジストロフィンを修復する。（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＰＲＯ０５１ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｌｏｃａｌ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ＤＭＤ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、３５７（２６）：２６７７〜８６ページから再現した。

方法
患者及び試験設計
８歳と１６歳の間でありデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有していた患者が、この試験に参加するのに適任であった。すべての患者はエキソン５１のスキッピングによって修正可能であった欠失を有しており、以前の診断的筋生検上にジストロフィンの痕跡はなかった。併用グルココルチコイド療法が可能であった。文書化したインフォームドコンセントを、必要に応じて患者又は彼らの両親から得た。プレスクリーニング期間（最大６０日）中に、それぞれの患者の突然変異状態及びインビトロでのＰＲＯ０５１に対する陽性エキソンスキッピング応答を確認し、前頸骨筋の状態をＴ_１加重磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって決定した^６２。試験中に含めた患者に関して、線維性及び脂肪組織はそれらの標的筋肉のわずか５０％を構成し得る。

ベースラインビジット中に、安全対策を評価した。それぞれの患者において、注射した脚はオーダーメードのプラスチックモールドで固定し、その位置を記録した。局所麻酔薬（ＥＭＬＡ）の局所共晶混合物を使用して皮膚を麻痺させた。２．５ｃｍの筋電図針（ＭｙｏＪｅｃｔ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ Ｎｅｅｄｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ、ＴＥＣＡ Ａｃｃｅｓｓｏｒｉｅｓ）を使用して、ＰＲＯ０５１の４回の注射を２つの小さな皮膚タトゥー間の１．５ｃｍの線に沿って与え、筋肉内送達を確実にした。それぞれの注射体積は２００μｌであり、２００μｇのＰＲＯ０５１を含有しており、これを約３０°の角度で同等の場所に分散させた。

第２８日に、安全対策を再度評価した。注射した脚は患者の専用モールドを使用して位置を合わせ、２つの先の鋭い顎部分を有するかん子（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ Ｃｏｎｃｈｏｔｏｍａ、ＤＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、半開状態の筋生検を局所麻酔下でタトゥー間において実施した（６３）。生検標本は液体窒素冷却２−メチルブタン中で瞬間凍結させた。

患者は２００６年５月から２００７年３月まで連続的に治療し、Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅガイドライン及びＤｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉの規程に従った。この試験は、Ｄｕｔｃｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓによって、及びＬｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒにおいて現地の施設内治験審査委員会によって承認された。試験設計に貢献し、データの収集及び分析に参加したすべての著者が完全且つ自由にデータを利用することができ、共同で原稿を書き、示したデータ及び分析の完全性及び精度を裏付けた。

ＰＲＯ０５１の記載
ＰＲＯ０５１は、配列５’−ＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ−３’を有する合成修飾ＲＮＡ分子である^１２。それは完全長２’−Ｏ−メチル置換リボース分子及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。

この薬剤は賦形剤を含まない１ｍｇの凍結乾燥物質のバイアル中にＰｒｏｓｅｎｓａ Ｂ．Ｖ．によって与えられた。それを溶かし、滅菌済みの非保存生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）に施した。細菌のエイムズ試験によってＰＲＯ０５１が突然変異誘発性であることは分からなかった。規定された医薬品安全性試験実施基準の安全性試験において、筋肉内に体重１キログラム当たり最大８ｍｇ及び静脈内に１キログラム当たり５０ｍｇの一回投与を施したラットは悪影響を示さず、静脈内１時間注入又は皮下注射により薬剤を投与したとき、臨床上関連がある悪影響なしで、１カ月間ＰＲＯ０５１を施したサルは１週間で１キログラム当たり１６ｍｇまでの投与に耐性があるようであった。

インビトロプレスクリーニング
既存の一次筋芽細胞培養を患者４のプレスクリーニングに使用した^１。他の３人の患者に関しては、以前に記載されたように、筋原性転写因子（ＭｙｏＤ）の遺伝子を含有するアデノウイルスベクターの感染後に線維芽細胞は筋原細胞に変わった^{１、６４、６５}。筋管培養物を、ＥｘＧｅｎ５００に関する製造者の説明書に従い（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ＰＲＯ０５１（１００ｎＭ）及びポリエチレンイミン（１マイクログラムのＰＲＯ０５１当たり２μｌ）でトランスフェクトした。ＲＮＡは４８時間後に単離した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫蛍光、及びウエスタンブロット分析は以前に報告されたように実施した^１、１２。ＰＣＲ断片は２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）の使用によって分析し、Ｌｅｉｄｅｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒによる塩基配列決定用に単離した。

安全性評価
ベースライン、並びに注射後２時間、１日、及び２８日で、すべての患者に（生存兆候の測定を含めた）全身の診察を行い、心電図検査を実施した。さらに、血漿及び尿を得て、古典的（ＣＨ５０）及び代替（ＡＰ５０）経路において、腎臓及び肝臓機能、電解質レベル、全血球計算値、活性化部分トロンボプラスチン時間、及び補体活性値を決定した。併用薬の使用を記録した。ベースライン及び２８日で、前頸骨筋の強度を医学研究審議会の尺度の使用によって評価して^６６、手順が筋肉の性能に影響を与えたかどうかを評価した（この尺度では、０のスコアは運動がないことを示し、且つ５のスコアは正常な筋力を示す）。筋肉の小さな領域のみを治療したので、増大した筋力の観点での臨床的利点は予想できなかった。毎回の視察時に、有害事象を記録した。

ＲＮＡの評価
凍結した筋生検標本の連続切片（５０μｍ）を、ＲＮＡ−Ｂｅｅ溶液（Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中に均質化した。製造者の説明書に従い全ＲＮＡを単離及び精製した。相補的ＤＮＡに関しては、合成はＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、３０分間５５℃で２０μｌ反応混合物中に５００ｎｇのＲＮＡ及びヒトエキソン５３又は５４特異的逆方向プライマーを使用することによって実施した。ＰＣＲ分析は以前に記載されたように実施した^１、１２。生成物は２％アガロースゲル上で分析し、塩基配列決定した。さらに、タンパク質切断試験用のプライマーセットを使用することによるＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＤＭＤ遺伝子中の特異的で異常なスプライシング事象を迅速にスクリーニングした^６７。

タンパク質レベルの評価
免疫蛍光分析用に、アセトン固定した切片を、１：６０の希釈で中央部桿ドメイン（ＭＡＮＤＹＳ１０６、Ｄｒ．Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ、英国）、１：３０の希釈でＣ末端ドメイン（ＮＣＬ−ＤＹＳ２、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対するモノクローナル抗体と共に、又は１：１５０の希釈で、ジストロフィン欠損によって影響を受けない基底膜タンパク質、ラミニン−α２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ）（対照として）と共に９０分間、次に１：２５０の希釈でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に１時間インキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で切片を封入した。定量的画像解析用に、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｗ．Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ．ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を以前に記載されたように使用した^{６０、６１}。切片の大きさに応じて、横断切片全体を一連の６〜１０の隣接画像に細分化した。信頼できる測定を確実にするため、一定の露出設定を使用し、且つピクセル飽和を避けながら、切片の染色及び全画像の記録は１セッションで実施した。低い強度閾値をデュシェンヌ型筋ジストロフィーのバックグラウンドで設定し、且つそれぞれの切片（領域中の割合）に関して、ジストロフィンとラミニンα２の両方に関して、陽性蛍光を定量化した。

生検標本中の４つの一連の５０μｍ切片組からプールしたホモジェネートを使用して、ウエスタンブロット分析を以前に記載されたように実施した^１。それぞれの患者用に、２つの量の全タンパク質−３０μｇ及び６０μｇ−、対照用にサンプル３μｇを施用した。ウエスタンブロットは、１：１２５の希釈でジストロフィンモノクローナル抗体ＮＣＬ−ＤＹＳ１（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に一晩、次に１：１０，０００の希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に１時間インキュベートした。免疫反応性バンドを、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して可視化した。シグナル強度はＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。

結果
患者のプレスクリーニング
この試験は４〜６人の患者を含むように計画した。６人の患者に参加を促し、１人に拒否された。残りの５人の患者をプレスクリーニングした。最初に、前頸骨筋の状態をＭＲＩで評価した。４人の患者の筋肉の状態がこの試験に適していると考え（図２Ａ）、ジストロフィンの不在を患者の本来の生検標本において確認した（図２Ｂ）。第二に、これらの４人の患者の突然変異状態及びＰＲＯ０５１に対する陽性エキソンスキッピング応答を線維芽細胞培養において確認した。ＰＲＯ０５１処理によって、全ＲＴ−ＰＣＲ産物の４６％（患者４）〜９０％（患者１）を示す、それぞれの患者に関するメッセンジャーＲＮＡの新規な、短い断片が生成した（図２Ｃ）。正確なエキソン５１スキッピングを塩基配列決定によって確認した（図２Ｄ）。他の転写産物領域が変化したのは見られなかった。免疫蛍光分析によって、ジストロフィン陽性筋管の優勢を示し（図２Ｅ）、この結果はウエスタンブロット分析（示さず）により確認された。したがって、４人の患者はＰＲＯ０５１処理が適していたと判断した。患者らのベースライン特性は表２中に示す。

安全性及び有害事象
すべての患者が１つ又は複数の有害事象を有していた。しかしながら、ただ１人の患者が注射部位での軽度の局所の痛みを報告し、それは試験薬剤と関係がある有害事象であると考えた。他の事象には、筋生検後の軽度〜中程度の痛みがあった。２人の患者が、創縫合に使用した包帯の下で水泡形成があった。注射と生検との間の時間に、２人の患者が数日間のインフルエンザ様症状を報告し、且つ１人の患者は１日軽度の下痢があった。ベースラインで、患者１、２、３、及び４において治療した前頸骨筋の筋強度スコアは、医学研究審議会の尺度で、それぞれ４、２、３、及び４であった。１人の患者も、試験中にこの筋肉の強度の変化、又は補体分解産物若しくは活性化部分トロンボプラスチン時間の標準的な研究室測定値若しくは増大した測定値の有意な変化を示さなかった。患者の筋肉切片中で局所炎症又は毒性反応は検出しなかった（データ示さず）。試験終了後、患者３に予め計画した口内側わん症の手術を首尾よく施した。

ＲＮＡ及びタンパク質レベル
第２８日で、それぞれの患者における治療部位の生検を実施した。すべての筋肉のＲＮＡは、生検標本中の連続切片から単離した。すべての患者において、塩基配列決定によって確認したように、ＲＴ−ＰＣＲは、エキソン５１スキッピングによって引き起こされた、新規な、短い断片を同定した（図３）。さらなる転写産物の分析は、他の変化を示さなかった（データ示さず）。それぞれの患者の生検標本中の切片の免疫蛍光分析は、大部分の筋繊維における明らかな筋繊維鞘ジストロフィンシグナルを示した（図４Ａ及び４Ｂ）。使用した欠失と近位及び遠位のジストロフィン抗体には、ＭＡＮＤＹＳ１０６（図４Ａ及び４Ｂ）及びＮＣＬ−ＤＹＳ２（ＭＡＮＤＹＳ１０６と同様、示さず）があった。ラミニンα２の染色後それぞれの切片中の線維を手作業で数えた^６８。生検標本の大きさ及び筋肉の質と一致して、個々の数は変わった。最大切片中で、患者２は７２６の線維を有し、そのうち６２０がジストロフィン陽性であり、一方患者３は１２０の線維を有し、そのうち１１７がジストロフィン陽性であった（図４Ａ及び４Ｃ）。ジストロフィン強度は、健常者筋肉生検標本における強度より典型的には低かった（図４Ｂ）。患者２及び３における、より強力なジストロフィンシグナルを有する単線維は十分に復帰突然変異体線維であり得る（図４Ｂ）。

ウエスタンブロット分析によって、様々な量でジストロフィンの存在を確認した（図４Ｅ）。ジストロフィンシグナルをスキャンし、対照に対して補正した（全タンパク質１μｇ当たり）。その量は、最もジストロフィー性の筋肉を有する患者３における３％から、最も保存状態が良い筋肉を有する患者２における１２％まで変化した。全タンパク質に基づくこのような比較は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者における様々な量の線維性及び脂肪組織を補正しないので、本発明者らは、ＩｍａｇｅＪ分析により、それぞれの切片中に同様に位置するラミニンα２のシグナルに対するジストロフィン蛍光シグナルも定量化した（図４Ａ及び４Ｂ）。ジストロフィンとラミニンα２の割合を対照切片に関して１００で設定したとき、患者１、２、３、及び４はそれぞれ３３、３５、１７、及び２５の割合を有していた（図４Ｄ）。

考察
本発明者らの試験は、ＰＲＯ０５１、エキソン５１内の２０ヌクレオチド配列と相補的な２ＯＭｅＰＳアンチセンスオリゴリボヌクレオチドの局所筋肉内注射は、エキソン５１スキッピングを誘導し、リーディングフレームを修正し、したがって治療を施したデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する４人の患者すべてにおいて筋肉中にジストロフィンを導入したことを示した。ジストロフィン陽性線維は患者の生検標本全体で見られ、注射領域中の化合物の分散を示した。送達増強賦形剤は使用しなかったので、ＰＲＯ０５１の取込みは主な考えられる制限要因ではなかったようである。本発明者らは、ジストロフィー性線維膜の増大した透過性に好ましい影響があったことを無視することはできない。全タンパク質のウエスタンブロット分析で示したように、患者は健常対照筋肉中で３〜１２％のレベルであったレベルのジストロフィンを生成した。線維症及び脂肪の存在は全タンパク質抽出物中のジストロフィンについて幾らかの過小評価をもたらす可能性があるので、本発明者らは、横断切片中のジストロフィンとラミニンα２との比を決定し、それは対照筋肉中の１００と比較して１７〜３５の範囲であった。ＰＲＯ０５１のジストロフィン修復効果は治療部位に限られ、筋肉全体の強度改善は観察しなかった。今後の全身治療は、ジストロフィン発現を高レベルで増大及び維持するため、並びに臨床的有効性を得るために反復投与を必要とするはずである。

未成年者への介入に関する医療−倫理規定のため、本発明者らは、患者の注射しなかった対側筋から生検標本を得ることができなかった。しかしながら、試験の開始前５〜９年で得た元の診断的生検標本において、患者は１％未満の復帰突然変異体線維を示した（表２及び図２Ｂ）。本発明者らは、本発明者らが観察した影響は、復帰突然変異体線維の顕著な増大より、ＰＲＯ０５１試薬の性質及び配列と関係があった可能性が非常に高いと考える。実際、増大したジストロフィンシグナルを有していた、一種の、おそらく復帰突然変異体である線維を患者２と患者３の両方で観察した（図４Ｂ）。要約すると、本発明者らの試験は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する４人の患者における筋肉へのＰＲＯ０５１の局所投与は、全タンパク質又は筋線維含量に対する定量化に応じて、３〜１２％又は１７〜３５％の範囲のレベルまでジストロフィンを修復したことを示した。明らかに局在する治療の性質と一致して、機能的改善は観察しなかった。最も進行した疾患を有していた患者３における絶えず乏しい結果は、比較的少量の筋肉組織が線維性及び脂肪組織によって置換されている時期で、比較的若い年齢の患者において臨床試験を実施する重要性を示唆する。本発明者らの発見は、アンチセンス仲介型エキソンスキッピングは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者の筋肉中のジストロフィン合成を修復するための、将来性がある手法であり得る指標となる。

（例２）
ｍｄｘマウス（ＤＭＤの動物モデル）における前臨床試験において、ＡＯＮ誘導型エキソンスキッピングに対する補助化合物プレドニゾンの影響を評価した。Ｍｄｘマウス（Ｃ５７Ｂｌ／１０ＳｃＳｎ−ｍｄｘ／Ｊ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダ）から得た。エキソン２３におけるナンセンス突然変異のため、これらのマウスはジストロフィン欠損性である。ＡＯＮ誘導型エキソン２３スキッピングは、ナンセンス突然変異を除去すること及びオープンリーディングフレームを修正することによって、ｍｄｘマウスにおいて治療的である。一群当たり２匹のｍｄｘマウスに、群１）生理食塩（第１〜８週）、群２）プレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ、第１〜８週）、群３）エキソン２３スキッピングを特異的に誘導するように設計したマウス特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドＰＳ４９（１００ｍｇ／ｋｇ、第４週（５回）、第５〜８週（２回）、群４）プレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ、第１〜８週）＋ＰＳ４９（１００ｍｇ／ｋｇ、第４週（５回）、第５〜８週（２回）を皮下注射した。ＰＳ４９（５’ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＵＣＧＧＣＵＵＡＣＣＵ３’）は、完全長ホスホロチオエート骨格及び２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子を有する。

すべてのマウスは最後の注射後１週間で屠殺した。大腿四頭筋、前頸骨筋、及び横隔膜筋を含めた異なる筋肉群を単離し、液体窒素冷却２−メチルブタン中で凍結させた。ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、筋肉サンプルをＲＮＡ−Ｂｅｅ溶液（Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オランダ）中に均質化した。製造者の説明書に従い全ＲＮＡを単離及び精製した。逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、オランダ）を用いたｃＤＮＡ合成用に、３０分間５５℃で２０μｌ反応混合物において３００ｎｇのＲＮＡを使用し、マウスＤＭＤ遺伝子特異的プライマーで逆方向にプライマー処理した。最初のＰＣＲは、アウタープライマーセットを用いて９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）、及び７２℃（６０秒）の２０サイクルで実施した。次いで１μｌのこの反応混合物（１：１０に希釈）を、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）、及び７２℃（６０秒）の３０サイクルで、エキソン２３と直接隣接するエキソンにおけるネストプライマーの組合せを使用して再増幅した。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上で分析した。スキッピング効率は、ＤＮＡ１０００ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）を使用して、ＰＣＲ産物の定量化によって決定した。生理食塩又はプレドニゾロンのみ（群１及び２）で治療したマウス由来の筋肉において、エキソン２３スキッピングは観察しなかった。エキソン２３スキッピングのレベルを検出し、ＰＳ４９のみで治療したマウス（群３）とＰＳ４９及び補助化合物プレドニゾロンで治療したマウス（群４）との間で、筋肉群当たりで比較した。大腿四頭筋（Ｑ）、前頸骨筋（ＴＡ）、及び横隔膜（ＤＩＡ）筋において、エキソン２３のスキッピングレベルは、群３と比較すると、群４中で典型的には高かった（図５）。これは、補助化合物プレドニゾロンが、ＰＳ４９で治療したｍｄｘマウスにおいてエキソン２３のスキッピングレベルを実際に高めることを示す。

（例３）
Ａ．，Ｂ．健常対照個体由来の分化した筋肉細胞培養物（筋管）を、トランスフェクション試薬ポリマーＵＮＩＦｅｃｔｙｌｉｎを使用して（ＡＯＮ１μｇ当たり２，０μｌのＵＮＩＦｅｃｔｙｌｉｎ、０，１５ＭのＮａＣｌ）、０〜０．５ｍｇ／ｍｌのペントキシフィリンの存在下で、２５０ｎＭのＰＳ１８８（［５’ＵＣＡＧＣＵＵＣＵＧＵＵＡＧＣＣＡＣＵＧ３’；配列番号１０］エキソン４４）を特異的にスキップするように最適化したＡＯＮ、又は２５０ｎＭのＰＳ２２１（［５’ＡＵＵＣＡＡＵＧＵＵＣＵＧＡＣＡＡＣＡＧＵＵＵＧＣ３’；配列番号６０］エキソン４５）を特異的にスキップするように最適化したＡＯＮでトランスフェクトした。核酸が負に帯電しているという条件で（２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＡＯＮなど）、ＵＮＩＦｅｃｔｙｌｉｎは核酸と静電気的に相互作用する。ペントキシフィリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）は水に溶かした。製造者の説明書に従い、ＲＮＡ−Ｂｅｅ溶液（Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オランダ）中でのトランスフェクション後２４時間で全ＲＮＡを単離した。逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、オランダ）を用いたｃＤＮＡ合成用に、３０分間５５℃で２０μｌ反応混合物において５００ｎｇのＲＮＡを使用し、ＤＭＤ遺伝子特異的プライマーで逆方向にプライマー処理した。最初のＰＣＲは、アウタープライマーセットを用いて９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）、及び７２℃（６０秒）の２０サイクルで実施した。次いで１μｌのこの反応混合物（１：１０に希釈）を、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）、及び７２℃（６０秒）の３０サイクルで、エキソン４４又は４５と直接隣接するエキソンにおけるネストプライマーの組合せを使用して再増幅した。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上で分析した。スキッピング効率は、ＤＮＡ１０００ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）を使用して、ＰＣＲ産物の定量化によって決定した。

ＰＳ１８８とＰＳ２２１の両方で、エキソン４４又は４５スキッピングの増大したレベルを、ペントキシフィリンで同時治療しなかった細胞内で得た濃度と比較したとき増大した、補助化合物ペントキシフィリンの濃度と共に得た（図６参照）。これらの結果は、ペントキシフィリンが筋細胞内のエキソンスキッピングのレベルを高めることを示す。

Ｃ．
ｍｄｘマウス（ＤＭＤの動物モデル）における前臨床試験において、ＡＯＮ誘導型エキソンスキッピングに対する補助化合物ペントキシフィリンの影響を評価した。Ｍｄｘマウス（Ｃ５７Ｂｌ／１０ＳｃＳｎ−ｍｄｘ／Ｊ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダ）から得た。エキソン２３におけるナンセンス突然変異のため、これらのマウスはジストロフィン欠損性である。ＡＯＮ誘導型エキソン２３スキッピングは、ナンセンス突然変異を除去すること及びオープンリーディングフレームを修正することによって、ｍｄｘマウスにおいて治療的である。一群当たり２匹のｍｄｘマウスに、群１）ペントキシフィリン（５０ｍｇ／ｋｇ、第１〜２週）、群２）エキソン２３スキッピングを特異的に誘導するように設計したマウス特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドＰＳ４９（１００ｍｇ／ｋｇ、第２週（２回）、群３）ペントキシフィリン（５０ｍｇ／ｋｇ、第１〜２週）＋ＰＳ４９（１００ｍｇ／ｋｇ、第２週（２回）を皮下注射した。ＰＳ４９（５’ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＵＣＧＧＣＵＵＡＣＣＵ３’）は、完全長ホスホロチオエート骨格及び２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子を有する。

すべてのマウスは最後の注射後１週間で屠殺した。大腿四頭筋、前頸骨筋、三頭筋及び心筋を含めた異なる筋肉群を単離し、液体窒素冷却２−メチルブタン中で凍結させた。ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、筋肉サンプルをＲＮＡ−Ｂｅｅ溶液（Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オランダ）中に均質化した。製造者の説明書に従い全ＲＮＡを単離及び精製した。逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、オランダ）を用いたｃＤＮＡ合成用に、３０分間５５℃で２０μｌ反応混合物において３００ｎｇのＲＮＡを使用し、マウスＤＭＤ遺伝子特異的プライマーで逆方向にプライマー処理した。最初のＰＣＲは、アウタープライマーセットを用いて９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）、及び７２℃（６０秒）の２０サイクルで実施した。次いで１μｌのこの反応混合物（１：１０に希釈）を、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）、及び７２℃（６０秒）の３０サイクルで、エキソン２３と直接隣接するエキソンにおけるネストプライマーの組合せを使用して再増幅した。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上で分析した。スキッピング効率は、ＤＮＡ１０００ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）を使用して、ＰＣＲ産物の定量化によって決定した。ペントキシフィリンのみで治療したマウス（群１）由来の筋肉において、エキソン２３スキッピングは観察しなかった。エキソン２３スキッピングのレベルを検出し、ＰＳ４９のみで治療したマウス（群２）とＰＳ４９及び補助化合物ペントキシフィリンで治療したマウス（群３）との間で、筋肉群当たりで比較した。大腿四頭筋（Ｑ）、前頸骨筋（ＴＡ）、三頭筋（Ｔｒｉ）及び心臓（ＨＲＴ）筋において、エキソン２３のスキッピングレベルは、群２と比較すると、群３中で典型的には高かった（図６ｃ）。これは、補助化合物ペントキシフィリンが、ＰＳ４９で治療したｍｄｘマウスにおいてエキソン２３のスキッピングレベルを実際に高めることを示す。

Claims (19)

1. 個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための薬剤であって、
   ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの少なくとも一部分であって、少なくとも１３ヌクレオチドを有する前記一部分に相補的である配列を含む、少なくとも１３ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドと、
   プレドニゾン、プレドニゾロン又はデフラザコルトであるステロイド、
   を含む、上記薬剤。
2. ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの少なくとも一部分であって、少なくとも１３ヌクレオチドを有する前記一部分に相補的である配列を含む、少なくとも１３ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドと、
   プレドニゾン、プレドニゾロン又はデフラザコルト、を含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための組成物。
3. 個人においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための薬物の調製のための、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの少なくとも一部分であって、少なくとも１３ヌクレオチドを有する前記一部分に相補的である配列を含む、少なくとも１３ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含む、前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための化合物と、プレドニゾン、プレドニゾロン又はデフラザコルト、の使用。
4. ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体エキソンの少なくとも一部分であって、少なくとも１３ヌクレオチドを有する前記一部分に相補的である配列を含む、少なくとも１３ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドと、
   プレドニゾン、プレドニゾロン又はデフラザコルト、
   を含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減するための医薬製剤。
5. 前記ステロイドがプレドニゾンである、請求項１に記載の薬剤。
6. 前記オリゴヌクレオチドが、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの、前記ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングから産生されるｍＲＮＡへの包含を阻害するためのものである、請求項１又は請求項５のいずれか一項に記載の薬剤。
7. 前記エキソンの包含の阻害が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体から産生されるｍＲＮＡからの前記エキソンの欠失をもたらし、機能性ジストロフィンタンパク質のコード領域を生成する、請求項６に記載の薬剤。
8. 前記オリゴヌクレオチドが、終止コドンを抑制するための化合物を更に含む、請求項１又は請求項５から７までのいずれか一項に記載の薬剤。
9. 前記終止コドンを抑制するための化合物がゲンタマイシン、ＰＴＣ１２４を含む、請求項８に記載の薬剤。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、転写物中のジストロフィンエキソンの正確なスプライシングに必要な調節ＲＮＡ配列に特異的に結合する、請求項１及び５から９までのいずれか一項に記載の薬剤。
11. 前記オリゴヌクレオチドがイントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）及び／又はエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に相補的である、請求項１０に記載の薬剤。
12. 前記オリゴヌクレオチドが、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンのＲＮＡの１３と５０ヌクレオチドの間の連続する部分に相補的である配列を含む、請求項１及び５から１１までのいずれか一項に記載の薬剤。
13. 前記配列が１４と２５ヌクレオチドの間である、請求項１２に記載の薬剤。
14. 前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡを含み、該ＲＮＡが修飾物を含有しているか又は、前記オリゴヌクレオチドが、ペプチド核酸、ロックド核酸、モルフォリノホスホロジアミダート、若しくはその任意の組合せを含む、請求項１及び５から１３までのいずれか一項に記載の薬剤。
15. 前記ＲＮＡ修飾物が、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボース（ＤＮＡ）修飾物である、請求項１４に記載の薬剤。
16. 前記ジストロフィンエキソンがエキソン２，８，９，１７，１９，２９，４０−４６，４８−５３，５５又は５９を含む、請求項１及び５から１５までのいずれか一項に記載の薬剤。
17. 前記個人に機能性ジストロフィンタンパク質を与えるための前記オリゴヌクレオチドが、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中の少なくとも２つのエキソンに相補的であり、
    前記オリゴヌクレオチドが、
    第１の部分が前記少なくとも２つのエキソンの第１に相補的である少なくとも８の連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含み、
    第２の部分が前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中の第２のエキソンに相補的である少なくとも８の連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含む、
    少なくとも２つの部分を含む、請求項１及び５から１６までのいずれか一項に記載の薬剤。
18. 前記オリゴヌクレオチドの第１の部分及び／又は前記オリゴヌクレオチドの第２の部分が、１６から８０までのヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の薬剤。
19. 前記第１及び第２のエキソンが、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中で、前記オリゴヌクレオチドが相補的ではない少なくとも１つのエキソンにより分離されている、請求項１７又は１８に記載の薬剤。