JP2020537497A - エクソンスキッピングを誘発する核酸ポリペプチド組成物と方法 - Google Patents

エクソンスキッピングを誘発する核酸ポリペプチド組成物と方法 Download PDF

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Abstract

エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘導するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物における挿入、欠失、複製、あるいは変化を引き起こす分子および医薬組成物が本明細書で開示される。エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘導するために誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物における挿入、欠失、複製、あるいは変化を引き起こす分子あるいは医薬組成物を含む、疾患または障害を処置する方法が本明細書でさらに記載される。【選択図】図３

Description

相互参照
本出願は、２０１７年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，９３９号と、２０１８年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６９６，７６６号の利益を主張するものであり、これらは各々、その全体における引用により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ機能の調節は治療的関心を集める発展途上の領域である。アンチセンスオリゴヌクレオチドと低分子干渉ＲＮＡのようにｍＲＮＡ安定性に影響を与える薬物は、ＲＮＡ機能を調節する一つの方法である。オリゴヌクレオチドの別の群は、最終的な遺伝子産物：コードされたタンパク質からｍＲＮＡ前駆体の特定の領域を包含または除外するために、ｍＲＮＡ前駆体の処理を変更することにより、ＲＮＡ機能を調節することができる。したがって、オリゴヌクレオチド治療薬は、疾患状態におけるタンパク質発現を調節する手段を表し、したがって、治療薬としての有用性を有している。
本明細書では、特定の実施形態において、ＲＮＡプロセシングを調節するための分子および医薬組成物が開示される。いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーの処置のための分子と医薬組成物も本明細書で開示される。
本明細書では、ある実施形態において、被験体の誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物によって引き起こされた疾患または障害を処置する方法が開示され、該方法は、被験体にポリ核酸分子抱合体を投与する工程を含み、ここで、ポリ核酸分子抱合体は細胞標的結合部分に結合され、ここで、ポリヌクレオチドは随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、ここで、ポリ核酸分子抱合体は、完全に処理されたｍＲＮＡ転写産物を生成するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物中のエクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するべく、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発し、および、ここで、完全に処理されたｍＲＮＡ転写産物は、機能性タンパク質をコードし、それによって、被験体の疾患または障害を処置する。いくつかの実施形態において、疾患または障害はさらに、ｍＲＮＡ中の１つ以上の突然変異を特徴とする。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む。いくつかの実施形態において、疾患または障害は筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または、５５のものである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングはＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のものである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）であり、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；および、
Ｘは単結合または第１のリンカーである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）であり、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；および、
Ｙは単結合または第２のリンカーである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）であり：
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；および、
Ｙは単結合または第２のリンカーである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、約２０から約２２ヌクレオチド長さの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は二本以上の鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である。いくつかの実施形態において、Ｘは単結合である。いくつかの実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘは、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に結合された、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、Ｙはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、Ｃは約５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役され、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役される。いくつかの実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役され、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役される。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ、Ｙ−Ｃ、またはその組み合わせは、ヌクレオチド間結合群に共役される。いくつかの実施形態では、上記方法はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣあるいはＡに共役される。いくつかの実施形態において、Ｄは、式（ＩＶ）に係る式（ＩＩ）の分子抱合体に結合され、
（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃｃ）−Ｌ−Ｄ
式ＩＶ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；
Ｙは単結合または第２のリンカーであり；
Ｌは単結合または第３のリンカーであり；
Ｄはエンドソーム溶解部分であり；および、
ｃは０と１の間の整数であり；
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、またはＣのいかなる場所に共役している。
いくつかの実施形態では、ＤはＩＮＦ７またはメリチンである。いくつかの実施形態では、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、上記方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分Ａは、Ａ、Ｂ、またはＣに共役される。
いくつかの実施形態において、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物中のエクソンスキッピングあるいはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、複製、または変化を誘発する方法が本明細書で開示され、前記方法は：標的細胞をポリ核酸分子抱合体に接触させる工程であって、ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む、工程と；エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、複製あるいは変化を誘発するべく、標的細胞内の誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物へポリ核酸分子抱合体をハイブリダイズする工程であって、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物がタンパク質の機能形態をコードすることができる、工程と；前の工程の完全に処理されたｍＲＮＡ転写産物のタンパク質の機能形態を翻訳する工程を、含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は被験体の標的細胞である。いくつかの実施形態において、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物はさらに疾患または障害を誘発する。いくつかの実施形態において、疾患または障害はさらに、ｍＲＮＡ中の１つ以上の突然変異を特徴とする。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む。いくつかの実施形態において、疾患または障害は筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または、５５のものである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングはＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のものである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）であり、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；および、
Ｘは単結合または第１のリンカーである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）であり、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；および、
Ｙは単結合または第２のリンカーである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）であり：
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；および、
Ｙは単結合または第２のリンカーである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つである：約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、約２０から約２２ヌクレオチド長さの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は二本以上の鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である。いくつかの実施形態において、Ｘは単結合である。いくつかの実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘは、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に結合された、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、Ｙはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、Ｃは約５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役され、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役される。いくつかの実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役され、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役される。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ、Ｙ−Ｃ、またはその組み合わせは、ヌクレオチド間結合群に共役される。いくつかの実施形態では、上記方法はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣあるいはＡに共役される。いくつかの実施形態において、Ｄは、式（ＩＶ）に係る式（ＩＩ）の分子抱合体に結合され、
（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃｃ）−Ｌ−Ｄ
式ＩＶ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；
Ｙは単結合または第２のリンカーであり；
Ｌは単結合または第３のリンカーであり；
Ｄはエンドソーム溶解部分であり；および、
ｃは０と１の間の整数であり；
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、またはＣのいかなる場所に共役している。
いくつかの実施形態では、ＤはＩＮＦ７またはメリチンである。いくつかの実施形態では、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、上記方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分Ａは、Ａ、Ｂ、またはＣに共役される。いくつかの実施形態において、方法はインビボの方法である。いくつかの実施形態において、方法はインビトロの方法である。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって得られた分子と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。いくつかの実施形態において、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口投与、経口投与、鼻腔内投与、バッカル投与、直腸投与、または経皮投与のために製剤される。
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体を含む組成物が本明細書で開示され、ここで、ポリ核酸分子抱合体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５−９６３に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含んでいる。ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体を含む組成物が本明細書で開示され、ここで、ポリ核酸分子抱合体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５−９６３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含んでいる。特定の実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）であり：
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；および、
Ｘは単結合または第１のリンカーである。
特定の実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）であり：
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；および、
Ｙは単結合または第２のリンカーである。
特定の実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）であり：
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分であり；
Ｂはポリヌクレオチドであり；
Ｃは高分子であり；
Ｘは単結合または第１のリンカーであり；および、
Ｙは単結合または第２のリンカーである。
ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドはモルホリノを含む。
ある実施形態において、ＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的領域にハイブリダイズする少なくとも１つのポリ核酸分子と結合する標的細胞結合部分を含む、ポリ核酸抱合体が本明細書に開示され、ここで、少なくとも１つのポリ核酸分子は、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物を生成するためにｍＲＮＡ前駆体転写産物からエクソンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態において、機能性ジストロフィンタンパク質は、ジストロフィンタンパク質からの切断された形態である。いくつかの実施形態において、標的領域はエクソン−イントロン接合部にあり、ここで、エクソンは、スプライシングアウトされることになっているエクソンである。いくつかの実施形態において、エクソンは、エクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５である。いくつかの実施形態において、エクソン−イントロン接合部は、スプライシングアウトされることになっているエクソンの５’に位置する。いくつかの実施形態において、標的領域はエクソン−イントロン接合部の上流のイントロン領域である。いくつかの実施形態において、標的領域は、エクソン−イントロン接合部の約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、あるいは１０ヌクレオチド上流である。いくつかの実施形態において、エクソン−イントロン接合部は、スプライシングアウトされることになっているエクソンの３’に位置する。いくつかの実施形態において、標的領域はエクソン−イントロン接合部の下流のイントロン領域である。いくつかの実施形態において、標的領域は、エクソン−イントロン接合部の約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、あるいは１０ヌクレオチド下流である。いくつかの実施形態において、標的細胞結合部分は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、あるいは８以上のポリ核酸分子に結合する。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５から選択された配列に対して、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はさらに、１、２、３、あるいは４つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４、１１４７−１１６２、または、１１７３−１２１１から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの実施形態では、結合部分は抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、抗トランスフェリン抗体を含む。いくつかの実施形態において、結合部分は血漿タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸抱合体は、Ａ−（Ｘ１−Ｂ）ｎ；式（∨）を含み、式中、Ａは結合部分を含み；Ｂはポリ核酸分子からなり；Ｘ１は単結合あるいは第１の非高分子リンカーからなり；および、ｎは１−１２から選択された平均値である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖とを含む。いくつかの実施形態において、ガイド鎖は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、少なくとも１つの逆脱塩基部分、少なくとも１つの５’−ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ガイド鎖は、約２、３、４、５、６、７、８、あるいは９つのホスホロチオエート修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ガイド鎖は、１つのホスホロチオエート修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ホスホロチオエート修飾された非天然のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド間結合に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの５’−ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチドは、ガイド鎖の５’末端から、約１、２、３、４、あるいは５つの塩基離れて位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの５’−ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチドは、２’−位置でさらに修飾される。いくつかの実施形態において、２’−修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、１００％ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖はガイド鎖よりも長さが短く、それによって、５’オーバーハング、３’オーバーハング、あるいはこれらの組み合わせを生成する。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖はガイド鎖と長さが等しく、それによって、ポリ核酸分子の各末端で平滑末端を生成する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー／ＲＮＡヘテロ二本鎖である。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、１００％ペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖はガイド鎖よりも長さが短く、それによって、５’オーバーハング、３’オーバーハング、あるいはこれらの組み合わせを生成する。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖はガイド鎖と長さが等しく、それによって、ポリ核酸分子の各末端で平滑末端を生成する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はペプチド核酸／ＲＮＡヘテロ二本鎖である。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖はＡ−Ｘ１に共役する。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の５’末端に共役する。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の３’末端に共役する。いくつかの実施形態において、Ｘ１は単結合である。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に結合された、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸抱合体はさらにＣを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ＣはＸ２を介してＢに直接共役する。いくつかの実施形態において、Ｘ２は単結合あるいは第２の非高分子リンカーからなる。いくつかの実施形態において、Ｘ２は単結合である。いくつかの実施形態において、Ｘ２はＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に結合された、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖はＡ−Ｘ１とＸ２−Ｃに共役する。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の５’末端に結合され、Ｘ２−Ｃはパッセンジャー鎖の３’末端へ共役する。いくつかの実施形態において、Ｘ２−Ｃはパッセンジャー鎖の５’末端に結合され、Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の３’末端へ共役する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸抱合体はＡ−Ｘ１−（Ｂ−Ｘ２−Ｃ）ｎ；式（ＶＩ）を含み；式中、Ａは結合部分を含み；Ｂはポリ核酸分子からなり；Ｃはポリマーからなり；Ｘ１は単結合あるいは第１の非高分子リンカーからなり；Ｘ２は単結合あるいは第２の非高分子リンカーからなり；および、ｎは１−１２から選択された平均値である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸抱合体はさらにＤを含む。いくつかの実施形態において、Ｄはエンドソーム溶解部分である。
特定の実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８あるいは１０８７−１０８９から選択された塩基配列の少なくとも２３の隣接する塩基を含むポリ核酸分子が本明細書に開示され、ここで、ポリ核酸分子は５０以下のヌクレオチド長さを含む。
特定の実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８を含むポリ核酸分子が本明細書に開示され、ここで、ポリ核酸分子は５０以下のヌクレオチド長さを含む。
特定の実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９を含むポリ核酸分子が本明細書に開示され、ここで、ポリ核酸分子は５０以下のヌクレオチド長さを含む。
ある実施形態において、医薬組成物が本明細書に開示され、上記医薬組成物は、本明細書に記載されるポリ核酸抱合体、あるいは本明細書に記載されるポリ核酸分子；および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は全身送達のために製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は非経口投与のために製剤化される。
ある実施形態において、被験体の欠損ｍＲＮＡを特徴とする疾患または疾病を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、機能性タンパク質をコードするプロセシングされたｍＲＮＡを生成するために欠損ｍＲＮＡを引き起こすエクソンのスキッピングを誘導するべく、本明細書に記載されるポリ核酸抱合体あるいは本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程であって、それによって、被験体の疾患または疾病を処置する、工程を含む。いくつかの実施形態において、疾患または疾病は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患である。いくつかの実施形態において、神経筋疾患は筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
本明細書には、特定の実施形態において、被験体の筋ジストロフィーを処置する方法が開示され、上記方法は、本明細書に記載されるポリ核酸抱合体あるいは本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程であって、それによって、被験体の筋ジストロフィーを処置する、工程を含む。いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸抱合体、あるいは本明細書に記載されるポリ核酸分子を含むキットが本明細書で開示される。
ある実施形態において、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって得られた分子を含むキットが本明細書で開示される。
末端ヌクレオチドを拡張したホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）配列を描く。 末端ヌクレオチドを拡張したホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）配列を描く。 十分に拡張されたホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）配列を描く。 Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを使用して、全ＲＮＡにおけるスキッピングされたＤＭＤ ｍＲＮＡを定量化するために使用される方法を描く。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２で生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ反応混合物のクロマトグラムを描く。 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂのクロマトグラムを描く。 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１，２のクロマトグラムを描く。 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞２のクロマトグラムを描く。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂのクロマトグラムを描く。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２を使用して生成された精製された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１，２抱合体のクロマトグラムを描く。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２を使用して生成された精製された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞２抱合体のクロマトグラムを描く。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法３を使用して、抗ＣＤ７１Ｆａｂ−ＰＭＯの高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）精製のクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂのクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。 ＨＩＣ方法４を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂのクロマトグラムを描く。 ＨＩＣ方法４を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。 ＨＩＣ方法４を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。 ＨＩＣ方法４を使用して生成された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＡＸ方法２を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ反応混合物のクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂのクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＥＣ方法１を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＡＸ方法２を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＡＸ方法２を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。 ＳＡＸ方法２を使用して生成された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。 ＰＭＯおよび抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体を使用して、分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲからのアガロースゲルを描く。 ＰＭＯ、抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ、および抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体を使用して、分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲからのアガロースゲルを描く。 ＰＭＯ、ＡＳＯ、ＤＡＲ１（「ＡＳＣ−ＤＡＲ１」）の共役した抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＡＳＯ、ＤＡＲ２（「ＡＳＣ−ＤＡＲ２」）の共役した抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＡＳＯ、および、ＤＡＲ３（「ＡＳＣ−ＤＡＲ３」）の共役した抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＡＳＯを使用して、分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲからのアガロースゲルを描く。 抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体の単回静脈内注射を投与された野生型のマウスの腓腹筋においてエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲからのアガロースゲルを描く。 腓腹筋からのＰＣＲ産物の定量化のグラフである。 野生型のマウスからの腓腹筋のＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲを使用する、インビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。 単回静脈内注射後に野生型のマウスの心臓筋においてエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲからのアガロースゲルを描く。 心臓筋からのＰＣＲ産物の定量化のグラフである。 スキッピングと野生型のＰＣＲ産物からのＤＮＡ断片の配列決定データを描く。 トランスフェクトされた初代ヒト骨格筋細胞におけるヒトＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体中のエクソン４５を標的とする様々な長さのエクソンスキッピングＰＭＯのエクソンスキッピング活性を例証する。 インビトロでヒトトランスフェリン受容体に対するｈＴｆＲ１．ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体の結合を例証する。 初代ヒト骨格筋細胞中のｈＴｆＲ１．ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のエクソンスキッピング活性を例証する。 初代の不死化されたヒト骨格筋細胞の筋管におけるｈＴｆＲ１．ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のエクソンスキッピング活性を例証する。
核酸（例えば、ＲＮＡｉ）治療は高い選択率と特異性を誇る標的療法である。しかしながら、いくつかの例では、核酸治療も、脆弱な細胞内取り込み、標的細胞の不十分な細胞内濃度、および低い有効性によって妨げられる。こうした諸問題に対応するために、核酸組成物の様々な修飾、例えば、より優れた安定化および／またはより低い毒性のための新規なリンカー、増加した標的特異性および／または標的送達用の結合部分の最適化、ならびに、安定性の増加および／または的外れの効果の減少のための核酸ポリマー修飾などが探求されている。
いくつかの例では、オリゴヌクレオチドが使用されるそのような１つの領域は、筋ジストロフィーを処置するためのものである。筋ジストロフィーは、筋肉に影響を与える複数の疾患を包含する。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは筋ジストロフィーの重症の形態であり、ＤＭＤ遺伝子中の突然変異によって引き起こされる。いくつかの例では、ＤＭＤ遺伝子中の突然変異は、翻訳のリーディングフレームを破壊し、非機能的なジストロフィンタンパク質をもたらす。
ある実施形態において、翻訳のリーディングフレームを回復させるために使用される、エクソンスキッピングあるいはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発するための核酸療法に関連する方法と組成物が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を特徴とする疾患または障害を処置するための方法と組成物も本明細書で記載され、エクソンの除去の後、ｍＲＮＡは機能性タンパク質をコードすることができ、それによって疾患または障害を処置する。さらなる実施形態において、上記の疾患または障害を処置するための医薬組成物とキットが本明細書に記載される。
ＲＮＡプロセシング
ＲＮＡは遺伝子発現と細胞生理の調節において中心的な役割を有する。ＲＮＡの適切なプロセシングは機能性タンパク質の翻訳のために重要である。ＲＮＡの誤ったスプライシングの結果などのＲＮＡプロセシングの変化は疾患をもたらす可能性がある。例えば、スプライス部位の突然変異は、早熟な終止コドンの曝露、エクソンの喪失、あるいはイントロンのインクルージョンを引き起こす。いくつかの例では、ＲＮＡプロセシングの変化は、挿入、欠失、あるいは複製をもたらす。いくつかの例では、ＲＮＡプロセシングの変化は、エクソンの挿入、欠失、あるいは複製をもたらす。ＲＮＡプロセシングの変化は、場合によっては、イントロンの挿入、欠失、あるいは複製をもたらす。
エクソンスキッピング
エクソンスキッピングはＲＮＡスプライシングの形態である。場合によっては、エクソンがプロセシングされたｍＲＮＡでスキッピングされるか、プロセシングされたｍＲＮＡからスプライシングされるときに、エクソンスキッピングが生じる。エクソンスキッピングの結果、プロセシングされたｍＲＮＡはスキッピングされたエクソンを含まない。いくつかの例では、エクソンスキッピングは変化された生成物の発現をもたらす。
いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）はエクソンスキッピングを誘発するために使用される。いくつかの例では、ＡＯＮは、特定のｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡ前駆体配列と結合する短い核酸配列である。例えば、ＡＯＮはスプライス部位あるいはエクソンエンハンサーに結合する。いくつかの例では、特定のｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡ前駆体配列にＡＯＮを結合することにより、二本鎖領域が生成される。いくつかの例では、二本鎖領域の形成は、スプライソソームまたはスプライソソームに関連するタンパク質が通常結合することになる場所で生じ、エクソンをスキッピングさせる。いくつかの例では、エクソンのスキッピングは転写産物リーディングフレームの回復を引き起こし、部分的に機能的なタンパク質の産生を可能にする。
エクソンインクルージョン
いくつかの例では、ＲＮＡ中の突然変異はエクソンスキッピングを引き起こす。場合によっては、突然変異は、スプライス部位、スプライス部位の近く、およびスプライス部位から距離をおいた場所の少なくとも１つである。いくつかの例では、突然変異は、スプライス部位の不活性化または脆弱化、エクソンスプライスエンハンサーあるいはイントロンスプライスエンハンサーの破壊、およびエクソンスプライスサイレンサーまたはイントロンスプライスエンハンサーの作成の少なくとも１つをもたらす。いくつかの例において、突然変異はＲＮＡ二次構造を変質する。場合によっては、突然変異はＲＮＡ二次構造を変質し、エクソン認識にとって重要なシグナルのアクセシビリティーの破壊を引き起こす。
いくつかの例では、ＡＯＮの使用はスキッピングされたエクソンのインクルージョンを引き起こす。いくつかの例では、ＡＯＮは、スプライス部位、スプライス部位の近くの部位、スプライス部位から離れた部位の少なくとも１つに結合する。場合によっては、ＡＯＮは、エクソンスプライスエンハンサーあるいはイントロンスプライスエンハンサーの破壊を防ぐために、ＲＮＡのある部位で結合する。場合によっては、ＡＯＮは、エクソンスプライスサイレンサーあるいはイントロンスプライスサイレンサーの生成を防ぐために、ＲＮＡのある部位で結合する。
指標
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、欠損したｍＲＮＡを特徴とする疾患または障害の処置に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘導することによって疾患または障害の処置に使用される。
ヒトのタンパク質コード遺伝子の大部分が代替的にスプライシングされる。いくつかの例では、突然変異は不適切にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡを引き起こす。例えば、突然変異は、タンパク質コード遺伝子、サイレンサーまたはエンハンサー配列、エクソン配列、あるいはイントロン配列中のスプライス部位の少なくとも１つにある。いくつかの例では、突然変異は遺伝子機能障害を引き起こす。いくつかの例では、突然変異は疾患または障害を引き起こす。
いくつかの例では、不適切にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡに起因する疾患または障害としては、限定されないが、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患が挙げられる。
いくつかの例では、遺伝病または遺伝障害は、常染色体優性障害、常染色体劣性障害、Ｘ連鎖優性障害、Ｘ連鎖劣性障害、Ｙ連鎖障害、ミトコンドリア遺伝病、あるいは多因子または多遺伝子障害を含む。
いくつかの例では、高コレステロール血症などの心血管疾患は、不適切にスプライシングされたか、あるいは、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡに起因する。高コレステロール血症において、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）のエクソン１２中の一塩基多型がエクソンスキッピングを促進することが示されてきた。
いくつかの例では、不適切にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、癌を引き起こす。例えば、不適切にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、限定されないが、増殖、運動、および薬物応答を含む、癌に関与する細胞のプロセスに影響を与える。いくつかの例では、固形癌あるいは血液の癌がある。いくつかの例では、癌は、膀胱癌、肺癌、脳癌、黒色腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、子宮頚癌、卵巣癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、白血病、甲状腺癌、肝臓癌、または子宮癌である。
いくつかの例では、不適切にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは神経筋疾患または障害を引き起こす。例示的な神経筋疾患としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーなどの筋ジストロフィーが挙げられる、いくつかの例では、筋ジストロフィーは遺伝的である。いくつかの例では、筋ジストロフィーは自然突然変異によって引き起こされる。ベッカー型筋ジストロフィーとデュシェンヌ型筋ジストロフィーは、タンパク質ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子中の突然変異に関与していることが示されてきた。顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーは二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子中の突然変異に関与していることが示されている。
いくつかの例では、不適切にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こす。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは重度の筋衰弱を引き起こし、機能的なジストロフィンの産生を消失させるＤＭＤ遺伝子中の突然変異によって引き起こされる。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソンの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン１、２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６ ７７、７８、および７９の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および６３の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、および５５の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、多くのエクソンが突然変異する。例えば、エクソン４８−５０の突然変異はデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において一般的である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーはエクソン５１の突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーはエクソン２３の突然変異の結果である。いくつかの例では、突然変異は、１以上の複数のエクソンの欠失を含む。いくつかの例では、突然変異は、１以上の複数の複製を含む。いくつかの例では、突然変異はエクソンを点突然変異に関与している。例えば、患者の中にはＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のナンセンス点突然変異を抱えているものもいることが示されている。
いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、筋ジストロフィーの処置に使用される。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィーあるいは筋緊張性ジストロフィーの処置に使用される。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される。
ポリ核酸分子
いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発するポリ核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの例では、ポリ核酸分子は翻訳のリーディングフレームを回復させる。いくつかの例では、ポリ核酸分子は機能的かつ切断されたタンパク質をもたらす。
いくつかの例では、ポリ核酸分子はｍＲＮＡ配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はスプライス部位を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はシス調節因子を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はトランス調節因子を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンスプライスエンハンサーあるいはイントロンスプライスエンハンサーを標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンスプライスサイレンサーあるいはイントロンスプライスサイレンサーを標的とする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、イントロンまたはエクソンで見られる配列を標的とする。例えば、ポリ核酸分子は、前記エクソンのスプライシングを媒介するエクソン中で見られる配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソン認識配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンの上流の配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンの下流の配列を標的とする。
上に記載されたように、ポリ核酸分子は、限定されないが、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患などの疾患または障害をもたらす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。場合によっては、ポリ核酸分子は、神経筋疾患または障害を引き起こす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。場合によっては、神経筋疾患または障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーである。場合によっては、ポリ核酸分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーを引き起こす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。場合によっては、ポリ核酸分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こすＤＭＤ遺伝子中で突然変異するエクソンを標的とする。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こすＤＭＤ遺伝子中で突然変異する例示的なエクソンとしては、限定されないが、エクソン、２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８が挙げられる。いくつかの例では、ポリ核酸分子は突然変異したエクソンに隣接する配列を標的とする。例えば、エクソン５０の欠失がある場合、エクソン５１がスキッピングされるように、ポリ核酸分子はエクソン５１中の配列を標的とする。別の例では、エクソン２３に突然変異がある場合、エクソン２３がスキッピングされるように、ポリ核酸分子はエクソン２２中の配列を標的とする。
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６３のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５のエクソン−イントロン接合部にある領域を標的とする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８の少なくとも１つの５’イントロン−エクソン接合部あるいは３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの５’イントロン−エクソン接合部あるいは３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の５’イントロン−エクソン接合部あるいは３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。
場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８の少なくとも１つの５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする（例えば、エクソン３の５’イントロン−エクソン接合部は、イントロン２−エクソン３の接合部である）。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする（例えば、エクソン３の５’イントロン−エクソン接合部は、イントロン２−エクソン３の接合部である）。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の５’イントロン−エクソン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。
場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８の少なくとも１つの３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする（例えば、エクソン３の３’エクソン−イントロン接合部は、エクソン３−イントロン３の接合部である）。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子の３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする（例えば、エクソン３の３’−イントロン接合部は、エクソン３−イントロン３の接合部である）。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の３’エクソン−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８のスプライス部位を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６３のスプライス部位を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５のスプライス部位を標的とする。本明細書で使用されるように、スプライス部位は、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発することができる、基準スプライス部位、隠れたスプライス部位、あるいは代替的なスプライス部位を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または、６３などのデュシェンヌ型筋ジストロフィーに関与する追加のエクソンを含む部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を標的とする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン−イントロン接合部に近位の領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、または７８の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、または５ｎｔ上流（あるいは、５’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、あるいは６３の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’から）にある領域を標的とする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８の少なくとも１つの上流（あるいは５’）にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの上流（または５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１つの上流（または５’）にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、または７８の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、または５ｎｔ下流（あるいは、３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、あるいは６３の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’から）の領域を標的とする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８の少なくとも１つの下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの下流（または３’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、あるいは７８内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５内の内部領域を標的とする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８の少なくとも１つの標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの内部にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１つの内部にある標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４を含む部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４４に対して上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４４の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４４に対して下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４４の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４内にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、５’イントロン−エクソン４４接合部あるいは３’エクソン４４−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５を含む部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４５に対して上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４５の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４５に対して下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン４５の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５内にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、５’イントロン−エクソン４５接合部あるいは３’エクソン４５−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１を含む部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１に対して上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１に対して下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１内にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、５’イントロン−エクソン５１接合部あるいは３’エクソン５１−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３を含む部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５３に対して上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５３の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５３に対して下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５３の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）の標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３内にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、５’イントロン−エクソン５３接合部あるいは３’エクソン５３−イントロン接合部にある標的領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は対象の標的配列からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４、１１４７−１１６２、または、１１７３−１２１１から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む。場合によっては、ポリ核酸分子はさらに、１、２、３、あるいは４つのミスマッチを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はガイド鎖とパッセンジャー鎖を含む。いくつかの例では、ガイド鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ガイド鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によっては、ポリ核酸分子はＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）を含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｓｈＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｔＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｒＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｈｎＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はｓｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。
いくつかの実施形態では、核酸ポリマーは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約３０、約１８から約２５， ｆｏｒｍ 約１８から約２４、約１９から約２３、約１９から約３０、約１９から約２５、約１９から約２４、約１９から約２３、約２０から約３０、約２０から約２５、約２０から約２４、約２０から約２３、または約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１９から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１９から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２０から約２５ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、あるいは５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、あるいは３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも２１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも２２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも２３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも２４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は少なくとも３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドはセンス鎖またはパッセンジャー鎖である。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドはアンチセンス鎖またはガイド鎖である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、約１９から約３０、約１９から約２５、約１９から約２４、約１９から約２３、約２０から約３０、約２０から約２５、約２０から約２４、約２０から約２３、または約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、約１９から約３０、約１９から約２５、約１９から約２４、約１９から約２３、約２０から約３０、約２０から約２５、約２０から約２４、約２０から約２３、または約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はさらに平滑末端、オーバーハングあるいはその組み合わせを含む。いくつかの例では、平滑末端は、５’平滑末端、３’平滑末端、あるいはその両方である。場合によっては、オーバーハングは５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方である。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、あるいは６の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、あるいは４の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは２つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは３つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは４つの非塩基対ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載された標的配列に対して、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは９９．５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも５０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも６０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも７０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも８０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９９％相補的である。いくつかの例では、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に１００％相補的である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して５つ以下のミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して４つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して３つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して２つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して１つ以下のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子の特異性は、標的配列に対するポリ核酸分子の９５％、９８％、９９％、９９．５％、あるいは１００％の配列相補性である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションは高いストリンジェントなハイブリダイゼーション状態である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はオフターゲット効果を減少させた。いくつかの例において、「オフターゲット」あるいは「オフターゲット効果」とは、所定の標的に対するポリ核酸ポリマーが、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、あるいは細胞タンパク質またはその他の部分を直接的あるいは間接的に相互作用することによって意図しない効果を引き起こすあらゆる例を指す。いくつかの例では、その他の転写産物とポリ核酸分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖との間の部分的な相同性あるいは相補性によって他の転写産物の同時の分解がある場合に、「オフターゲット効果」が生じる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は天然または合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはヌクレオチドアナログの組み合わせを含む。いくつかの例では、合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基は、リボース部分、リン酸塩部分、ヌクレオシド部分、あるいはその組み合わせの１つ以上で修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログあるいは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’水酸基に修飾を有する核酸を含む。いくつかの例では、修飾はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、あるいはＣＮを含み、ここで、Ｒはアルキル部分である。例示的なアルキル部分としては、限定されないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が挙げられる。いくつかの例では、アルキル部分はさらに修飾を含む。いくつかの例では、修飾はアゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、ニトリル基、複素環（例えば、イミダゾール、ヒドラジノ、あるいはヒドロキシルアミノ）基、イソシアネートまたはシアナート基、あるいは硫黄含有基（例えば、スルホキシド、スルホン、スルフィド、あるいはジスルフィド）を含む。いくつかの例では、アルキル部分はさらにヘテロ置換を含む。いくつかの例では、複素環基の炭素は窒素、酸素、あるいは硫黄によって置換される。いくつかの例では、複素環式置換は、限定されないが、モルホリノ、イミダゾール、および、ピロリジノを含む。
いくつかの事例では、２’ヒドロキシル基の修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾である。場合によっては、２’−Ｏ−メチル修飾は、メチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加え、一方で２’Ｏ−メトキシエチル修飾は、メトキシエチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加える。アデノシン分子の２’−Ｏ−メチル修飾およびウリジンの２’Ｏ−メトキシエチル修飾の典型的な化学構造が、以下に例証される。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は、プロピルリンカーを含む伸長したアミン基がアミン基を２’酸素に結合する２’−Ｏ−アミノプロピル修飾である。いくつかの例では、この修飾は、１糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その双性イオン特性による細胞取り込み特性を改善する。２’−Ｏ−アミノプロピルヌクレオシドホスホラミダイトの典型的な化学構造が、以下に例証される。
いくつかの例では、２’水酸基の修飾はロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）であり、ここで、２’炭素で結合された酸素分子はメチレン基によって４’炭素に結合され、したがって、２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシ−メチレン結合二環式リボヌクレオチド単量体を形成する。ＬＮＡの化学構造の代表例が以下に例証される。左に示される代表例は、ＬＮＡ単量体の化学結合性を強調している。右に示される代表例は、ＬＮＡ単量体のフラノース環のロックド３’−ｅｎｄｏ（３Ｅ）構造を強調している。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での修飾は、糖構造を３’−ｅｎｄｏ糖のパッカリング構造（ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へとロックする、例えば２’−４’−エチレン架橋した核酸などの、エチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。ＥＮＡは、ＬＮＡも含む修飾された核酸の架橋された核酸クラスの一部である。ＥＮＡおよび架橋された核酸の典型的な化学構造は、以下に例証される。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での追加の修飾は、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、限定されないが、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、および、５位置に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メトキシウリジン、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチド、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２−チオウリジンと４−チオウリジン、および２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、Ｏ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン、５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−置換されたウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、および、アルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドなどの修飾塩基を含む。修飾されたヌクレオチドはさらに、リボシルではない糖あるいはそのアナログを有するヌクレオチドと同様に、糖部に対して修飾されるヌクレオチドを含む。例えば、場合によっては、糖部は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および、その他の糖類、複素環、あるいは炭素環であるか、または、これらがベースである。ヌクレオチドとの用語はさらに、普遍的な塩基として当技術分野で知られているものを含む。一例として、普遍的な塩基は、限定されないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、またはネブラリンを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはそれらの組み合わせをさらに含む。モルホリノまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は合成分子を含み、その構造は、正常な糖およびリン酸塩構造からの偏差（ｄｅｖｉａｔｅｓ）によって天然の核酸構造を模倣している。いくつかの例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有している６員のモルホリノ環で置換される。いくつかの場合では、リボース単量体は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合される。場合によっては、骨格の変質は、荷電オリゴヌクレオチドによって使用されるような細胞送達剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ）の助けを借りることなく細胞膜を横断することができるモルホリノ中性分子を作るすべての正および負の電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖骨格環もリン酸塩結合を含まず、塩基は結合し、オリゴグリシンのような分子によって適切に間隔を置かれ、ゆえに、骨格電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾が随意にヌクレオチド間結合で生じる。いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、５’−メチルホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、三フッ化ホウ素（ｂｏｒｏｎｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄａｔｅｓ）、３’−５’結合あるいは２’−５’結合のボラノリン酸エステルおよびセレノホスフェート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホネート結合、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホロチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カルボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルジメチルヒドラゾ、ホルムアセタル、チオホルムアセタル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミデート、リボアセチル基との結合、アミノエチルグリシン、シリル、あるいはシロキサン結合、例えば、飽和または不飽和の、および／または、置換されたおよび／またはヘテロ原子を含む１〜１０の炭素のヘテロ原子を含むまたは含まないアルキルあるいはシクロアルキル結合、モルホリノ構造との結合、アミド、塩基が骨格のアザ窒素に直接的あるいは間接的に結合したポリアミド、またはこれらの組み合わせを含む。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）は、ホスホロチオエート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例示的なＰＳ ＡＳＯが以下に説明される。
いくつかの例では、修飾は、メチルホスホネートあるいはチオールホスホネート修飾などのメチルまたはチオール修飾である。典型的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）およびメチルホスホネートヌクレオチド（右）が、以下に例証される。
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示される２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトを含む：
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示されるヘキシトール核酸（あるいは、１’、５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））を含む：
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログあるいは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の５’水酸基における修飾を有する５’−ビニルホスホネート修飾ヌクレオチド核酸を含む。いくつかの実施形態において、５’−ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドは、以下から提供されたヌクレオチドから選択され、式中、ＸはＯまたはＳであり；および、Ｂは複素環式塩基部分である。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は、プロピルリンカーを含む伸長したアミン基がアミン基を２’酸素に結合する、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾である。いくつかの例では、この修飾は、１糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その双性イオン特性による細胞取り込み特性を改善する。
いくつかの例では、５’−ビニルホスホネートはロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）でさらに修飾され、ここで、２’炭素で結合された酸素分子はメチレン基によって４’炭素に結合され、したがって、２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシ−メチレン結合二環式リボヌクレオチド単量体を形成する。５’−ビニルホスホネート修飾されたＬＮＡの化学構造の例示的な表現が以下に例示され、式中、ＸはＯまたはＳであり；Ｂは複素環式塩基部分であり；および、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での追加の修飾は、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、修飾塩基、例えば、限定されないが、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、および、５位置に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メトキシウリジン、デアザヌクレオチド（７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、あるいは６−アゾチミジンなど）、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基（２−チオウリジン、４−チオウリジン、および２−チオシチジンなど）、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、Ｏ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン、５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−置換されたウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、および、アルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドを含む。５’−ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドはさらに、リボシルではない糖あるいはそのアナログを有する５’−ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドと同様に、糖部に対して修飾されるこれらヌクレオチドを含む。例えば、場合によっては、糖部は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および、その他の糖類、複素環、あるいは炭素環であるか、または、これらがベースである。ヌクレオチドとの用語はさらに、普遍的な塩基として当技術分野で知られているものを含む。一例として、普遍的な塩基は、限定されないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、またはネブラリンを含む。
いくつかの実施形態において、５’−ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドアナログはさらに、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’ホスホラミダイト、あるいは１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）を含む。モルホリノまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は合成分子を含み、その構造は、天然の核酸構造を模倣しているが、正常な糖とリン酸塩の構造からは逸脱している。いくつかの例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有している６員のモルホリノ環で置換される。いくつかの場合では、リボース単量体は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合される。そのような場合には、骨格の変質は、荷電オリゴヌクレオチドによって使用されるような細胞送達剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ）の助けを借りることなく細胞膜を横断することができるモルホリノ中性分子を作るすべての正および負の電荷を除去する。５’−ビニルホスホネート修飾されたモルホリノオリゴヌクレオチドの非限定的な例が例示され、式中、ＸはＯまたはＳであり；および、Ｂは複素環式塩基部分である。
いくつかの実施形態において、上に記載された５’−ビニルホスホネート修飾されたモルホリノまたはＰＭＯは、正電荷またはカチオン電荷を含むＰＭＯである。いくつかの例では、ＰＭＯはＰＭＯｐｌｕｓ（Ｓａｒｅｐｔａ）である。ＰＭＯｐｌｕｓは、任意の数の（１−ピペラジノ）ホスフィニリデンデオキシ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｙｌｉｄｅｎｅｏｘｙ）、１−（４−（オメガ−グアニジノ−アルカノイル））−ピペラジノ）ホスフィニリデンデオキシ結合（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００８／０３６１２７に記載されるものなど）を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。いくつかの例では、ＰＭＯは、米国特許第７９４３７６２号に記載されるＰＭＯである。
いくつかの実施形態において、上に記載されたモルホリノまたはＰＭＯはＰＭＯ−Ｘ（Ｓａｒｅｐｔａ）である。場合によっては、ＰＭＯ−Ｘは、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１１／１５０４０８と米国公報２０１２／００６５１６９号に記載されるものなどの、開示された末端修飾の少なくとも１つの結合あるいは少なくとも１つを含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。
いくつかの実施形態において、上に記載されたモルホリノまたはＰＭＯは、米国公開公報２０１４／０２９６３２１号の表５に記載されるようなＰＭＯである。
５’−ビニルホスホネート修飾された核酸の化学構造の例示的な表現が以下に例示され、式中、ＸはＯまたはＳであり；
Ｂは複素環式塩基部分であり；および、Ｊはヌクレオチド間結合である。
いくつかの実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖骨格環もリン酸塩結合を含まず、塩基は結合し、オリゴグリシン様分子によって適切に間隔を置かれ、ゆえに、骨格電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、５’−ビニルホスホネート修飾されたオリゴヌクレオチドの１つ以上の修飾は、ヌクレオチド間結合で随意に生じる。いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されないが、ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；メチルホスホネート；５’−アルキレンホスホネート；５’−メチルホスホネート；３’−アルキレンホスホネート；三フッ化ホウ素；３’−５’結合あるいは２’−５’結合のボラノリン酸エステルとセレノホスフェート；ホスホトリエステル；チオノアルキルホスホトリエステル；水素ホスホネート結合；アルキルホスホネート；アルキルホスホノチオエート；アリールホスホノチオエート；ホスホロセレノアート；ホスホロジセレノアート；ホスフィネート；ホスホルアミデート；３’−アルキルホスホルアミデート；アミノアルキルホスホルアミデート；チオノホスホルアミデート；ホスホロピペラジデート；ホスホロアニロチオエート；ホスホロアニリデート；ケトン；スルホン；スルホンアミド；炭酸塩；カルバマート；メチレンヒドラゾ；メチレンジメチルジメチルヒドラゾ；ホルムアセタル；チオホルムアセタル；オキシム；メチレンイミノ；メチレンメチルイミノ；チオアミデート；リボアセチル基との結合；アミノエチルグリシン；シリルあるいはシロキサン結合；例えば、飽和または不飽和の、および／または、置換されたおよび／またはヘテロ原子を含む１〜１０の炭素のヘテロ原子を含むまたは含まないアルキルあるいはシクロアルキル結合；モルホリノ構造との結合、アミド、塩基が骨格のアザ窒素に直接的あるいは間接的に結合したポリアミド、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの例では、修飾は、メチルホスホネートあるいはチオールホスホネート修飾などのメチルまたはチオール修飾である。典型的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）、ホスホロジチオエート（中）、およびメチルホスホネートヌクレオチド（右）が、以下に例証される。
いくつかの例では、５’−ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下として例示されるホスホラミダイトを含む。
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合はホスホロジアミデート結合である。モルホリノ系を用いるホスホロジアミデート結合の非限定的な例が以下に示される。
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合はメチルホスホネート結合である。メチルホスホネート結合の非限定的な例が以下に示される。
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合はアミド結合である。アミド結合の非限定的な例が以下に示される。
いくつかの例では、５’−ビニルホスホネート修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下に例示される修飾された核酸を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、修飾が中性または無荷電の骨格を生成する、修飾されたホスフェート骨格を含む。いくつかの例では、ホスフェート骨格は、無荷電または中性のホスフェート骨格を生成するアルキル化によって修飾される。本明細書で使用されるように、アルキル化は、メチル化、エチル化、およびプロピル化を含む。場合によっては、アルキル基は、アルキル化の文脈において本明細書で使用されるように、１〜６の炭素原子を含有している直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基を指す。いくつかの例では、例示的なアルキル基としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３．３−ジメチルブチル、および２−エチルブチルの基が挙げられる。場合によっては、修飾されたホスフェートは、米国特許第９４８１９０５号に記載されるホスフェート基である。
いくつかの実施形態において、追加の修飾されたホスフェート骨格は、メチルホスホネート、エチルホスホネート、メチルチオホスホネート、あるいはメトキシホスホネートを含む。場合によっては、修飾されたホスフェートはメチルホスホネートである。場合によっては、修飾されたホスフェートはエチルホスホネートである。場合によっては、修飾されたホスフェートはメチルチオホスホネートである。場合によっては、修飾されたホスフェートはメトキシホスホネートである。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾はさらに、リボース部分、ホスフェート骨格、およびヌクレオシドの修飾、あるいは３’または５’末端のヌクレオチドアナログ修飾を含む。例えば、３’末端は随意に３’カチオン基を含み、あるいは、３’−３’結合を含む３’−末端でヌクレオシドを反転させる。別の代替物では、３’−末端は随意に、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴと共役される。追加の代替物では、３’−末端は随意に、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と共役される。いくつかの例では、５’−末端は、アミノアルキル基、例えば、５’−Ｏ−アミノアルキル置換基と共役される。場合によっては、５’−末端は、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と共役される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上のチオールホスホネートヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、複数のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーあるいは複数のペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを含み、および、少なくとも１つの逆脱塩基部分を随意に含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、１００％ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、１００％ペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、各ヌクレオチドアナログが立体化学的に異性型である１つ以上のヌクレオチドアナログを含む。そのような例では、ポリ核酸分子はキラル分子である。場合によっては、ヌクレオチドアナログは骨格立体化学を含む。さらなる場合には、ヌクレオチドアナログは、米国特許９，９８２，２５７、９，６９５，２１１、あるいは９，６０５，０１９に記載されるようなキラルアナログを含む。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。
場合によっては、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。
さらなる場合には、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。
いくつかの例では、約５から約１００％のポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９６％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９７％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９８％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９９％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１００％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１〜約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は２つの別個のポリヌクレオチドから組み立てられ、ここで、１つのポリヌクレオチドはセンス鎖を含み、第２のポリヌクレオチドはポリ核酸分子のアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、センス鎖はリンカー分子によってアンチセンス鎖に接続され、これは、いくつかの例では、ポリヌクレオチドリンカーあるいは非ヌクレオチドリンカーである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、センス鎖の５’−末端、３’−末端、あるいは５’と３’の末端の両方でキャップ部分を含む。他の実施形態では、末端のキャップ部分は反転デオキシ脱塩基部分である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にリン酸塩骨格修飾を含む。いくつかの例では、ホスフェート骨格修飾は、ホスホロチオエートである。場合によっては、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖よりも多くのホスホロチオエート修飾を含む。他の場合では、ガイド鎖は、パッセンジャー鎖よりも多くのホスホロチオエート修飾を含む。追加の場合には、パッセンジャー鎖は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエート修飾を含む。追加の場合には、ガイド鎖は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエート修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にグリセリル修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のに関するおよび／または、普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、あるいは１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、約１〜約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約２５以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、約１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９あるいは１０以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約５、例えば、約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、以下の特性の１つ以上を用いる二本鎖ポリ核酸分子である：高い肝細胞安定性、全体的な電荷の減少、肝細胞の取り込みの減少、あるいは薬物動態の拡張。いくつかの実施形態において、二本鎖ポリ核酸分子は、複数の修飾を含むパッセンジャー鎖（例えば、センス鎖）とガイド鎖（例えば、アンチセンス鎖）を含む。
いくつかの実施形態において、二本鎖ポリ核酸分子は、上に記載された修飾の１つ以上を有するガイド鎖（例えば、アンチセンス鎖）、および複数のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーあるいは複数のペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを有するパッセンジャー鎖（例えば、センス鎖）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の各鎖において、約１〜約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾された短干渉核酸分子である。
別の実施形態では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は２’−５’ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例では、２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の配列鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−末端と５’−末端の両方にある。追加の例では、２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方あるいは両方の配列鎖内の様々な他の位置に存在し、例えば、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含み、あるいは、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中にプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、細胞中のＲＮＡｉ活性を媒介するか、インビトロ系で再構成された単鎖ポリ核酸分子であり、ここで、ポリ核酸分子は、標的核酸配列に対する相補性を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み、および、ポリ核酸中に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、ここで、ピリミジンヌクレオチドはすべて２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、あるいは、代替的に、複数のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、および、ポリ核酸中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、すべてのプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは代替的に、複数のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである）、および、末端のキャップ修飾は、アンチセンス配列の３’−末端、５’−末端、あるいは３’と５’−末端の両方で随意に存在する。ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の３’末端に約１〜約４（例えば約１、２、３、あるいは４）の末端２’−デオキシリボヌクレオチドを随意にさらに含み、ここで、末端のヌクレオチドはさらに、１つ以上（例えば、１、２、３、あるいは４）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、および、ポリ核酸分子は随意に５’−末端リン酸基などの末端リン酸基をさらに含む。
場合によっては、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、天然のポリ核酸分子と比較して、例えば、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’−３’エキソヌクレアーゼや３’−５’エキソヌクレアーゼのようなエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例では、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいは、これらの組み合わせを含む人工ヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’−３’エキソヌクレアーゼや３’−５’エキソヌクレアーゼのようなエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例では、２’−Ｏメチル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−デオキシ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、Ｔ−デオキシ−２’−Ｏ−フルオロ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、モルホリノは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性を有する（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）。いくつかの例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、本明細書に記載された５’抱合体は５’−３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。いくつかの例では、本明細書に記載された３’抱合体は３’−５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、または２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含む人工ヌクレオチドアナログの１つ以上を含むポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−メチル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−デオキシ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、モルホリノ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。場合によっては、増加した親和性は、低Ｋｄ、高融解温度（Ｔｍ）、あるいはその組み合わせで例証される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、キラル純粋（あるいはステレオ純粋）なポリ核酸分子、あるいは単一のエナンチオマーを含むポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＬ−ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＤ−ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子組成物は、その鏡像異性体の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。場合によっては、ポリ核酸分子組成物は、ラセミ混合物の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第：２０１４／１９４６１０号と２０１５／２１１００６号；ＷＯ２０１５１０７４２５に記載されるポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、アプタマー共役部分を含めるようにさらに修飾される。いくつかの例では、アプタマー共役部分はＤＮＡアプタマー共役部分である。いくつかの例では、アプタマー共役部分は、Ａｌｐｈａｍｅｒ（Ｃｅｎｔａｕｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）であり、これは、特定細胞表面標的と、循環抗体に結合するための特定のエピトープを示す部分とを認識するアプタマー部分を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、米国特許第８，６０４，１８４号、８，５９１，９１０号、および、７，８５０，９７５号に記載されるようなアプタマー共役部分を含めるようにさらに修飾される：
追加の実施形態では、本明細書に記載されたポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾される。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、その安定性を増大させるために上に記載された修飾の１つ以上によって修飾されている。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾、あるいは、ロックドまたは架橋リボース構造（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）によるなどして、２ヒドロキシル位置で修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−Ｏ−メトキシエチルリボースによって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子はさらに、その安定性を増大させるために、モルホリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、および／または２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はキラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子である。いくつかの例では、キラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾されている。送達の安定性を増大させるためのＲＮＡの適切な修飾は当業者には明らかである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、限定されないが、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡなどの筋ジストロフィーに関与する遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の鎖の１つは、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡ、または、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つによってコードされたＲＮＡ、またはその一部の少なくとも１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここで、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の鎖の第２の鎖は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つ、または、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つによってコードされたＲＮＡ、またはその一部のヌクレオチド配列に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は、約１５〜２５、１８〜２４、あるいは１９〜約２３のヌクレオチドを含み、および、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１４、１７、あるいは１９のヌクレオチドを含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は約１９〜約２３のヌクレオチドを含み、および、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ＲＮＡｉ活性は細胞内で生じる。他の例では、ＲＮＡｉ活性は再構成されたインビトロ系で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子はＤＭＤの発現をダウンレギュレートする単鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、単鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＤＭＤ、または、ＤＭＤによってコードされたＲＮＡ、またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子はＤＭＤの発現をダウンレギュレートする単鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜２５、１８〜２４、あるいは１９〜約２３のヌクレオチドを含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子はＤＭＤの発現をダウンレギュレートする単鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は約１９〜約２３のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ＲＮＡｉ活性は細胞内で生じる。他の例では、ＲＮＡｉ活性は再構成されたインビトロ系で生じる。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む、二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は２つの別々のポリヌクレオチドから組み立てられ、１つの鎖はセンス鎖であり、もう一つの鎖はアンチセンス鎖であり、ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的であり（例えば、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；アンチセンス鎖とセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成する場合など。例えば、二本鎖領域は約１９、２０、２１、２２、２３、またはそれ以上の塩基対である）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。代替的に、ポリ核酸分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ポリ核酸分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合される。
場合によっては、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有する、二重の、非対称的で二重の、ヘアピン型の、または非対称的なヘアピン型の二次構造を有するポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。他の場合には、ポリ核酸分子は、２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む基部とを有する、環状の単鎖ポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することが可能な活性なポリ核酸分子を生成するためにインビボまたはインビトロで処理される。さらなる場合には、ポリ核酸分子はさらに、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み（例えば、そのようなポリ核酸分子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列のポリ核酸分子内に存在することを必要としない）、単鎖ポリヌクレオチドはさらに、５’−リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｃｅｌｌ．， １１０， ５６３−５７４と、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， １０， ５３７−５６８を参照）あるいは５’，３’−二リン酸塩などの末端のリン酸基を含む。
いくつかの例では、アンチセンス領域と、ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドを含むループ部分と、センス領域とを含む、直鎖のポリ核酸分子が非対称的であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなすとともにループを有する二本鎖を形成するのに十分な相補的なヌクレオチドを有する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有し、かつ、および約４〜約８のヌクレオチドを含むループ領域を有するアンチセンス領域（例えば約１９〜約２２ヌクレオチド）と、アンチセンス領域に相補的な約３〜約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。場合によっては、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子はさらに、化学修飾された５’末端のリン酸基を含む。さらなる場合には、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、あるいは抱合体分子を含む。
いくつかの実施形態において、非対称的な二重鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別々の鎖を有するポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなすのに十分な相補的なヌクレオチドを有し、かつ、二重鎖を形成する程度で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的な二重のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば約１９約２２のヌクレオチド）、および、アンチセンス領域に相補的な約３〜約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。
場合によっては、普遍的な塩基とは、ほとんど識別されない天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と塩基対を形成するヌクレオチド塩基アナログを指す。普遍的な塩基の非限定的な例は、従来技術で知られているようなＣ−フェニル、Ｃ−ナフチル、および他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含む（例えば、Ｌｏａｋｅｓ， ２００１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９， ２４３７−２４４７を参照）。
ポリ核酸分子合成
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、当該技術分野で知られている手順を用いて、化学合成および／または酵素ライゲーション反応を用いて構築される。例えば、ポリ核酸分子は、自然発生のヌクレオチドを使用して、あるいは、分子の生体安定性を増大させるために、または、ポリ核酸分子と標的核酸との間で形成された二重鎖の物理安定度を増大させるために設計されたさまざまな修飾ヌクレオチドを用いて、化学合成される。例示的な方法は、米国特許第５，１４２，０４７号；第５，１８５，４４４号；第５，８８９，１３６号；第６，００８，４００号；および、第６，１１１，０８６号；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００９０９９９４２号；あるいは、欧州公開公報第１５７９０１５号に記載されるものを含む。追加の例示的な方法は、以下に記載されるものを含む：Ｇｒｉｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．， “２’−Ｏ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ａ ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，” Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９（２６）：５１００−５１０９ （１９９７））； Ｏｂｉｋａ， ｅｔ ａｌ． “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ −ｃｙｔｉｄｉｎｅ． Ｎｏｖｅｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｆｉｘｅｄ Ｃ３， −ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ”． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８ （５０）： ８７３５ （１９９７）； Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． “ＥＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８ （２）： １４４−１４９ （２００６）； ａｎｄ Ａｂｒａｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．， “Ｎｏｖｅｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，” Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８Ｂ：１７２１−１７２６ （２００９）。代替的に、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子がアンチセンス配向にサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に生成される（つまり、挿入されたポリ核酸分子の転写されたＲＮＡは所望の標的ポリ核酸分子に対してアンチセンス配向になる）。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はタンデム合成方法によって合成され、ここで、両方の鎖は切断リンカーによって分離された単一の隣接するオリゴヌクレオチドフラグメントあるいは鎖として合成され、これはその後切断されることで、二重鎖をハイブリダイズして二重鎖の精製を可能にする別々のフラグメントまたは鎖をもたらす。
いくつかの例では、ポリ核酸分子も２つの特徴的な核酸鎖あるいはフラグメントから組み立てられ、ここで、１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントは分子のアンチセンス領域を含む。
例えば、糖、塩基、およびホスフェート修飾を組み込むためのさらなる修飾方法は、以下を含む：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＴ Ｎｏ． ＷＯ ９２／０７０６５； Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９０， ３４４， ５６５−５６８； Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５３， ３１４−３１７； Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １９９２， １７， ３３４−３３９； Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＴ Ｎｏ． ＷＯ ９３／１５１８７； Ｓｐｒｏａｔ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，３３４，７１１ ａｎｄ Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２５７０２； Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９７／２６２７０； Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７１６，８２４； Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，６２７，０５３； Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９８／１３５２６； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｓｅｒ． Ｎｏ． ６０／０８２，４０４ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｆｉｌｅｄ ｏｎ Ａｐｒ． ２０， １９９８； Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３９， １１３１； Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ， １９９８， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）， ４８， ３９−５５； Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， １９９８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６７， ９９−１３４；および、Ｂｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５， １９９９−２０１０．上記公報は、触媒作用を調節することなく、核酸分子へ糖、塩基、および／またはリン酸塩修飾を取り込むための位置を決定するための方法や戦術を記載している。
いくつかの例では、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／または５’−メチルホスホネート結合とのポリ核酸分子のヌクレオチド間結合の化学修飾が安定性を改善する一方で、過度の修飾はしばしば毒性または活性の減少を引き起こす。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間結合の量は場合によっては最小限に抑えられる。そのような場合、これらの結合の濃度の減少は、これらの分子の毒性を低下させ、有効性と高い特異性を増加させる。
核酸ポリペプチド抱合体
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はさらに、所望の部位へ送達されるポリペプチドＡに共役される。場合によっては、ポリ核酸分子はポリペプチドＡと随意にポリマー部分に共役される。
いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢに共役される。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、Ａ−Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに共役される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＡは、Ｂの５’末端、Ｂの３’末端、Ｂの内部部位、あるいはその任意の組み合わせに共役される。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも２つのＢに共役される。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、あるいはそれ以上のＢに共役される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で共役し、その一方で、少なくとも１つのＣは、Ａ−Ｂ−Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢの反対側の末端で共役される。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で共役し、その一方で、Ｃの少なくとも１つは少なくとも１つのＢの内部部位で共役される。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＣに直接共役される。いくつかの例では、少なくとも１つのＢは、Ａ−Ｃ−Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＣを介して少なくとも１つのポリペプチドＡに間接的に共役される。
いくつかの例では、少なくとも１つのＢおよび／または少なくとも１つのＣ、ならびに随意に少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに共役される。いくつかの例では、少なくとも１つのＢは、少なくとも１つのポリペプチドＡに末端（例えば、５’末端あるいは３’末端）で共役され、あるいは少なくとも１つのポリペプチドＡに内部部位を介して共役される。場合によっては、少なくとも１つのＣは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、あるいは少なくとも１つのＢによって間接的に共役される。間接的に、少なくとも１つのＢによって、少なくとも１つのＣは、Ｂ上の少なくとも１つのポリペプチドＡと同じ末端で、少なくとも１つのポリペプチドＡからの対抗する末端で、あるいは、独立して内部部位で共役される。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のポリペプチドＡはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに共役される。さらなる例では、少なくとも１つのＤは随意に、少なくとも１つのポリペプチドＡ、少なくとも１つのＢ、あるいは少なくとも１つのＣに、直接的あるいは間接的に共役される。直接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに共役される場合、少なくとも１つのＤもＡ−Ｄ−Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに随意に共役され、あるいは、Ａ−Ｄ−Ｂ−Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に共役される。いくつかの例では、Ｄ−Ａ−Ｂ−Ｃ抱合体を形成するために、少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、および少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに間接的に共役される。間接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに共役される場合、少なくとも１つのＤもＡ−Ｂ−Ｄ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに随意に共役され、あるいは、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に共役される。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のＤはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに共役される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
は、例示目的のために過ぎず、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいは、ラクダ抗体またはその結合フラグメントを包含する。
結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分Ａはポリペプチドである。いくつかの例では、ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントである。場合によっては、フラグメントは結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。
いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体である。いくつかの例では、Ａはヒト化抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはマウス抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはキメラ抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはモノクローナル抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは一価Ｆａｂ’である。いくつかの例では、Ａは二価Ｆａｂ２である。いくつかの例では、Ａは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
いくつかの実施形態では、結合部分Ａは、二重特異性抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、二重特異性抗体は三機能性抗体あるいは二重特異性ミニ抗体である。場合によっては、二重特異性抗体は三機能性抗体である。いくつかの例では、三機能性抗体は、２つの異なる抗原のための結合部位を含む完全長のモノクローナル抗体である。
場合によっては、二重特異性抗体は二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例では、二重特異性ミニ抗体は、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、あるいは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、２つのｓｃＦｖｓが２つの異なる抗原のエピトープを標的とする２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例では、Ａは二重特異性Ｆａｂ２である。いくつかの例では、Ａは二重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは二重特異性ビス−ｓｃＦｖである。場合によっては、Ａは二重特異性（ｓｃＦｖ）であるいくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ダイアボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ミニボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性の三重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性の四重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性のＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは三重特異性抗体である。いくつかの例では、三重特異性抗体はＦ（ａｂ）’３フラグメントあるいは三重特異性抗体を含む。いくつかの例では、Ａは三重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは三重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｄｉｍａｓ、ｅｔ ａｌ．、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，” Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１２（９）： ３４９０−３５０１（２０１５）に記載されるような三重特異性抗体である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、結合部分Ａは、筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。抗体またはその結合フラグメントによって認識される例示的な細胞表面タンパク質は、限定されないが、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４、Ｍｙｏ−Ｄ、ミオゲニン、ＭＲＦ４、ＮＣＡＭ、ＣＤ４３、およびＣＤ９５（Ｆａｓ）を含む。
いくつかの例では、細胞表面タンパク質は、分化（ＣＤ）細胞表面マーカーのクラスタを含む。例示的なＣＤ細胞表面マーカーは限定されないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ （Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７９ （例えば、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、ＣＤ９０、ＣＤ９５ （Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１２５ （ＩＬ５ＲＡ）、ＣＤ１３４ （ＯＸ４０）、ＣＤ１３７ （４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２ （ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２２１、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９ （ＰＤ−１）、ＣＤ３１９ （ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３２６ （ＥｐＣＡＭ）などを含む。
いくつかの例では、結合部分Ａは、ＣＤ細胞表面マーカーを認識する、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、結合部分Ａは、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ （Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７９ （例えば、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、ＣＤ９０、ＣＤ９５ （Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１２５ （ＩＬ５ＲＡ）、ＣＤ１３４ （ＯＸ４０）、ＣＤ１３７ （４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２ （ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２２１、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９ （ＰＤ−１）、ＣＤ３１９ （ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３２６ （ＥｐＣＡＭ）、またはこれらの組み合わせを認識する、抗体またはその結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、抗ミオシン抗体、抗トランスフェリン抗体、および、筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）を認識する抗体である。
いくつかの例では、結合部分Ａは抗ミオシン抗体である。場合によっては、抗ミオシン抗体はヒト化抗体である。他の場合では、抗ミオシン抗体はキメラ抗体である。さらなる場合には、抗ミオシン抗体は、一価、二価、あるいは多価の抗体である。
いくつかの例では、結合部分Ａは抗トランスフェリン（抗ＣＤ７１）抗体である。場合によっては、抗トランスフェリン抗体はヒト化抗体である。他の場合には、抗トランスフェリン抗体はキメラ抗体である。さらなる場合には、抗トランスフェリン抗体は、一価、二価、あるいは多価の抗体である。いくつかの実施形態において、例示的な抗トランスフェリン抗体は、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＭＡＢ５７４６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＡＨＰ８５８、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．のＡ８０−１２８Ａ、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａのＴ２０２７を含む。
いくつかの例では、結合部分ＡはＭｕＳＫを認識する抗体である。場合によっては、抗ＭｕＳＫ抗体はヒト化抗体である。他の場合には、抗ＭｕＳＫ抗体はキメラ抗体である。さらなる場合には、抗ＭｕＳＫ抗体は、一価、二価、あるいは多価の抗体である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、ポリ核酸分子（Ｂ）に非特異的に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基またはシステイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。場合によっては、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、システイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、ポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基、システイン残基を介して、５’−末端で、３’−末端で、非天然アミノ酸、あるいは酵素修飾または酵素触媒された残留物で、ポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、システイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、５’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、３’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、非天然アミノ酸を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で酵素修飾または酵素触媒された残留物を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役される。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリ核酸分子（Ｂ）は結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のポリ核酸分子は、１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約７のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約８のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約９のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１０のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。いくつかの例では、約１６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役される。場合によっては、１つ以上のポリ核酸分子が同じである。他の例では、１つ以上のポリ核酸分子が異なる。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａに共役したポリ核酸分子（Ｂ）の数は、ある比率を形成する。いくつかの例では、比率はＤＡＲ（薬物対抗体の）比率と呼ばれ、本明細書で言及されるような薬物はポリ核酸分子（Ｂ）である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２以上である。
いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１６である。
いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１２である。
いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体は、活性を改善させた。いくつかの例では、改善された活性は、生物学的に関連する機能の増強、例えば、疾患状態の処置または予防における安定性、親和性、結合、機能的な活性、および有効性の改善をもたらす。いくつかの例では、疾患状態は、遺伝子の１つ以上の突然変異エクソンの結果である。いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体は、１つ以上の突然変異したエクソンのエクソンスキッピングの増加をもたらす。いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、エクソンスキッピングは、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体において、少なくともまたは約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは、９５％以上増加する。
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、単独であるいは組み合わせて、当該技術分野で知られている従来の技術を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、追加を用いることによって、および／または、組換え、ならびに／あるいは、当該技術分野で知られている他の修飾（例えば、グリコシル化とリン酸化などの翻訳後および化学的な修飾）によって、さらに修飾される。いくつかの例では、修飾は、Ｆｃ受容体との相互作用を調節するための修飾をさらに含む。いくつかの例では、１つ以上の修飾は、例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１に記載されるものを含み、当該文献はＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するアミノ酸残基を開示している。抗体またはその結合フラグメントのアミノ酸配列の基礎となる核酸配列にそのような修飾を導入する方法は、当業者に周知である。
いくつかの例では、抗体結合フラグメントはさらにその誘導体を包含し、少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチド配列を含んでいる。
いくつかの例では、本明細書に記載されるような「単鎖」との用語は、二重特異性の単鎖構築物の第１と第２のドメインが、好ましくは、単一核酸分子によってコードすることができる共線形アミノ酸配列の形態で共有結合されるということを意味する。
いくつかの例では、二重特異性単鎖抗体構築物は、２つの抗体由来の結合ドメインを含む構築物に関する。そのような実施形態では、二重特異性の単鎖抗体構築物はタンデムｂｉ−ｓｃＦｖあるいはダイアボディである。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって接続されたＶＨとＶＬのドメインを含む。いくつかの例では、リンカーは、第１と第２のドメインのそれぞれが、互いから独立して、その差次的な結合特異性を保持することができる十分な長さと配列である。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるように、〜との結合または〜による相互作用とは、互いに少なくとも２つの抗原相互作用部位の結合／相互作用を定義する。いくつかの例では、抗原相互作用部位は、特異性抗原または抗原の特異的な群との特定の相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。場合によっては、結合／相互作用は特定の認識を定義するとも理解される。そのような場合、特定の認識は、抗体あるいはその結合フラグメントが、標的分子の各々の少なくとも２つのアミノ酸に特異的に相互作用および／または結合することができるということを指す。例えば、特定の認識は、抗体分子の特異性、あるいは標的分子の特定の範囲を区別するその能力に関する。追加の例では、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、例えば、抗原の立体配座の変化、抗原のオリゴマー化などの誘導による、シグナルの開始をもたらす。さらなる実施形態では、結合は「鍵と鍵穴の原則（ｋｅｙ−ｌｏｃｋ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」の特異性によって例証される。したがって、いくつかの例では、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフは、上記構造の第２の修飾の結果と同様に、その１次、２次、または３次構造の結果として互いに結合する。そのような場合、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、その部位の抗原への簡単な結合をもたらす。
いくつかの例では、特異的な相互作用はさらに、抗体またはその結合フラグメントの減少した交差反応性、あるいは減少したオフターゲット効果を指す。例えば、所望のポリペプチド／タンパク質に結合するが、他のポリペプチドのいずれにも本質的には結合しない抗体あるいはその結合フラグメントは、所望のポリペプチド／タンパク質に対して特異的であるとみなされる。抗原相互作用部位の特異性抗原との特定の相互作用の例は、リガンドのその受容体との特異性、例えば、抗原決定基群（エピトープ）の、抗体の抗原結合部位との相互作用を含む。
追加の結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分は血漿タンパク質である。いくつかの例では、血漿タンパク質はアルブミンを含む。いくつかの例では、結合部分Ａはアルブミンである。いくつかの例では、アルブミンは、本明細書に記載される結合化学の１つ以上によって、ポリ核酸分子に結合される。いくつかの例では、アルブミンは、天然のライゲーション化学によってポリ核酸分子に結合される。いくつかの例では、アルブミンは、リジン結合によってポリ核酸分子に結合される。
いくつかの例では、結合部分はステロイドである。例示的なステロイドは、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（飽和、不飽和であり、置換を含む）、あるいはそれらの組み合わせである。いくつかの例では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの例では、結合部分はコレステロールである。いくつかの例では、コレステロールは、本明細書に記載される結合化学の１つ以上によってポリ核酸分子に結合される。いくつかの例では、コレステロールは、天然のライゲーション化学によってポリ核酸分子に結合される。いくつかの例では、コレステロールは、リジン結合によってポリ核酸分子に結合される。
いくつかの例では、結合部分は、限定されないが、細胞上の特定の表面マーカーに結合するポリ核酸分子アプタマーを含むポリマーである。この例では、結合部分は、標的遺伝子またはｍＲＮＡにハイブリダイズしないが、その代りに、細胞表面マーカーのその特定のエピトープに結合する抗体と同様に、細胞表面マーカーに選択的に結合することができるポリ核酸である。
場合によっては、結合部分はペプチドである。場合によっては、ペプチドは約１〜約３ｋＤａを含む。場合によっては、ペプチドは、約１．２〜約２．８ｋＤａ、約１．５〜約２．５ｋＤａ、あるいは約１．５〜約２ｋＤａを含む。幾つかの例では、ペプチドは二環式ペプチドである。場合によっては、二環式ペプチドはコンストレインド二環式ペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）である。いくつかの例では、ペプチド部分は二環式ペプチド（例えば、Ｂｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのｂｉｃｙｃｌｅｓ）である。
さらなる場合では、結合部分は小分子である。いくつかの例では、小分子は抗体動員小分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。場合によっては、抗体動員小分子は、標的結合末端および抗体結合末端を含み、標的結合末端はそれで細胞表面受容体を認識して、相互作用することができる。例えば、いくつかの例では、グルタミン酸塩尿素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｕｒｅａ）化合物を含む標的結合末端は、ＰＳＭＡとの相互作用を可能にし、それにより、ＰＳＭＡを発現する細胞との抗体相互作用を増強する。いくつかの例では、結合部分は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｒｅｍｏｔｅ ａｒｅｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． １３２（３６）： １２７１１−１２７１６ （２０１０）；あるいは、ＭｃＥｎａｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ，” ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ７（７）： １１３９−１１５１ （２０１２）に記載される小分子である。
結合化学
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは結合部分に結合される。いくつかの例では、結合部分は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、炭水化物、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールなどのポリマー、ならびに、これらのクラスの物質のすべてのアナログあるいは誘導体を含む。結合部分の追加の例はさらに、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（例えば、飽和、不飽和、または、置換を含む）、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類などのステロイドを含む。いくつかの例では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、ポリ核酸分子はさらにポリマーに結合され、随意にエンドソーム溶解性部分に結合される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、化学的なライゲーションプロセスによって結合部分に結合される。いくつかの例では、ポリ核酸分子は天然のライゲーションによって結合部分に結合される。いくつかの例において、結合は以下に記載される通りである：Ｄａｗｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４， ２６６， ７７６−７７９； Ｄａｗｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９７， １１９， ４３２５−４３２９； Ｈａｃｋｅｎｇ， ｅｔ ａｌ． “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９， ９６， １００６８−１００７３；あるいは、Ｗｕ， ｅｔ ａｌ． “Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，” Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００６， ４５， ４１１６−４１２５。いくつかの例では、結合は米国特許第８，９３６，９１０号に記載されるとおりである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、天然のライゲーション化学を介して、結合部分に部位特異的あるいは非特異的に結合される。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、「トレースレス（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」カップリング技術（ＰｈｉｌｏＣｈｅｍ）を利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合される。いくつかの例では、「トレースレス」カップリング技術は、アルデヒド基を含むポリ核酸分子とその後結合される結合部分のＮ末端 １，２−アミノチオール基を利用する。（ｓｅｅ Ｃａｓｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ＪＡＣＳ １３４（１３）： ５８８７−５８９２ （２０１２）を参照）
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、結合部分に組み込まれた非天然のアミノ酸を利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合される。いくつかの例では、非天然アミノ酸はｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。いくつかの例では、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、オキシム結合を形成するために、アルコキシ−アミン由来の結合部分に選択的に結合される。（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，” ＰＮＡＳ １０９（４０）： １６１０１−１６１０６ （２０１２））を参照）。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、酵素触媒プロセスを利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合される。いくつかの例では、部位指定的な方法はＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｒｅｄｗｏｏｄ）を利用する。いくつかの例では、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセスを介するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残留物の生成、および、ヒドラジノ−Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ（ＨＩＰＳ）ライゲーションを介するアルキルヒドラジン機能化ポリ核酸分子へのＦＧｌｙのその後の結合を含む。（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｔａｇ，” ＰＮＡＳ １０６（９）： ３０００−３００５ （２００９）； Ａｇａｒｗａｌ， ｅｔ ａｌ．， ”Ａ Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” ＰＮＡＳ １１０（１）： ４６−５１ （２０１３）を参照）
いくつかの例では、酵素触媒プロセスは、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、微生物トランスグルタミナーゼ触媒プロセスを用いて結合部分に結合される。いくつかの例では、ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と機能化されたポリ核酸分子の一級アミンとの間の共有結合の形成を触媒する。いくつかの例では、ｍＴＧはストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）から産生される。（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｔｔｅｒｓ： ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２） １６１−１６７ （２０１３）を参照）
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、配列に特異的なトランスペプチダーゼを利用する、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２０１４／１４０３１７号に記載される方法によって結合部分に結合される。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許公報第２０１５／０１０５５３９号および第２０１５／０１０５５４０号に記載される方法によって結合部分に結合される。
抗体あるいはその結合フラグメントの産生
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗体とその結合フラグメント）は、ポリペプチド（例えば抗体）の合成に有用な当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、特に化学合成によって、あるいは組換え発現によって生成され、および、好ましくは組換え体発現技術によって生成される。
いくつかの例では、抗体あるいはその結合フラグメントは組み換えで発現され、および、抗体またはその結合フラグメントをコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２に記載される）から組み立てられ、それは、抗体をコードする配列の部分を含有するオリゴヌクレオチドをオーバーラップする合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、その後の、ライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅に関与する。
代替的に、抗体をコードする核酸分子は、配列の３’と５’の末端へハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、あるいは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローンを作ることによって、適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、あるいは免疫グロブリンを発現する任意の組織あるいは細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリ）から随意に生成される。
いくつかの例では、抗体またはその結合は、ポリクローナル抗体を生成するためにウサギなどの動物を免疫化することにより、あるいは、より好ましくは、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７） によって記載される、あるいは、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）またはＣｏｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）によって記載されるようなモノクローナル抗体を生成することによって、随意に生成される。代替的に、少なくとも抗体のＦａｂ部分をコードするクローンは、特異性抗原に結合するＦＡｂフラグメントのクローンのためにＦａｂ発現ライブラリ（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１に記載される）をスクリーニングすることにより、あるいは抗体ライブラリ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４； Ｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４９３７を参照）をスクリーニングすることにより、随意に得られる。
いくつかの実施形態において、適切な生物学的活性のヒト抗体分子の遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８５１−８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）を生成するために開発された技術が使用される。キメラ抗体は、異なる部分が、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト化抗体）を有する動物種などの様々な動物種に由来する分子である。
いくつかの実施形態において、単鎖抗体（米国特許第４，６９４，７７８号； Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４）の生成のために記載される技術は、単鎖抗体を生成するのに適している。単鎖抗体は、アミノ酸ブリッジによってＦｖ領域の重鎖または軽鎖のフラグメントを結合することによって形成され、結果として単鎖ポリペプチドを生じさせる。大腸菌中の機能的なＦｖフラグメントの組み立てのための技術も随意に使用される（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１）。
いくつかの実施形態において、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターあるいは抗体のヌクレオチド配列は、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈澱反応）によって宿主細胞に導入され、その後、トランスフェクトされた細胞は、抗体を生成するために従来の技術によって培養される。特定の実施形態では、抗体の発現は、構成的、誘導可能、あるいは組織特異的なプロモーターによって調節される。
いくつかの実施形態において、様々な宿主発現ベクター系は、本明細書に記載される抗体またはその結合フラグメントを発現するために利用される。そのような宿主発現系は、抗体のコード配列が生成され、その後精製されるビヒクルを表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で変形されるか、あるいはトランスフェクトされるときに、抗体またはその結合フラグメントをインサイチュで発現する細胞も表す。これらは、限定されないが、組み換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいは抗体またはその結合フラグメントコード配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌と枯草菌）などの微生物；抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミケス・ピキア）；抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組替えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウィルス）；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、または、抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネイン・プロモーター）のゲノム、あるいは、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む、組換え発現構築物を保護する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）を含む。
組換え型タンパク質の長期的かつ高収率の生成のためには、安定した発現が好ましい。いくつかの例では、安定して抗体を発現する細胞株が随意に操作される。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換される。外来性ＤＮＡの導入後に、細胞を操作して栄養強化培地で１−２日間成長させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞が、プラスミドをその染色体に安定的に統合させ、成長し、クローン化されて細胞株へと拡張するフォーカスを形成するのを可能にする。この方法は、抗体またはその結合フラグメントを発現する細胞株を操作するために有利に使用することができる。
いくつかの例では、限定されないが、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、あるいはａｐｒｔ細胞で採用される単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ， １９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を含む、多くの選択系が使用される。同様に、代謝拮抗薬の耐性は、以下の遺伝子の選定基準として使用される：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５７； Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９９１， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７；Ｍａｙ， １９９３， ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）、ならびに、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａ ｌ．， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。使用可能な組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で知られている既知の方法は一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．， １９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； ａｎｄ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ．； Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）に記載される。
いくつかの例では、抗体の発現レベルはベクター増幅によって増大する（レビューのために、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌ． ３． （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７を参照）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが増大すると、標識遺伝子のコピーの数が増大する。増幅した領域が抗体のヌクレオチド配列に関連しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５７）。
いくつかの例では、抗体または抗体抱合体の精製あるいは分析のための当該技術分野で既知の任意の方法が使用され、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、とりわけ、プロテインＡの後の特異性抗原への親和性、および、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解性、あるいはタンパク質の精製のための他の標準的な技術による方法が使用される。例示的なクロマトグラフィー方法としては、限定されないが、強力な陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーが挙げられる。
ポリマー結合部分
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃは、本明細書に記載されるポリ核酸分子、本明細書に記載される結合部分、あるいはこれらの組み合わせにさらに結合される。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子に結合される。場合によっては、ポリマー部分Ｃは結合部分に結合される。他の場合には、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子結合部分分子に結合される。さらなる場合には、ポリマー部分Ｃは上で例証されるように結合される。
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは分枝したあるいは分枝していない単量体、および／または、二次元または三次元の単量体の架橋したネットワークの長鎖からなる、天然または合成のポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは多糖、リグニン、ゴム、あるいはポリアルキルエンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。いくつかの例では、少なくとも１つのポリマー部分Ｃとしては、限定されないが、アルファ−ジヒドロキシルポリエチレングリコール、オメガ−ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生物分解性ラクトンベースのポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、ポリエチレン・テレフタレート（ＰＥＴＥ）、ポリテトラメチレン・グリコール（ＰＴＧ）、あるいはポリウレタン、およびこれらの混合物が挙げられる。本明細書で使用されるように、混合物は、ブロックコポリマーに関連する場合と同様に、同じ化合物内の様々なポリマーの使用を指す。場合によっては、ブロックコポリマーは、ポリマーの少なくとも１つの部分が別のポリマーの単量体から構築されるポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの例では、ポリマー部分ＣはＰＥＧを含む。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリエチレン・イミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。
いくつかの例では、ＣはＰＥＧ部分である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の５’末端で結合されるが、結合部分はポリ核酸分子の３’末端で結合される。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の３’末端で結合されるが、結合部分はポリ核酸分子の５’末端で結合される。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の内部部位に結合される。いくつかの例では、ＰＥＧ部分、結合部分、あるいはその組み合わせは、ポリ核酸分子の内部部位に結合される。いくつかの例において、抱合体は直接抱合体である。いくつかの例では、結合は天然のライゲーションを介する。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は多分散または単分散の化合物である。いくつかの例では、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズおよび分散度を特徴とする、異なる分子量の材料の分散した分布を含む。いくつかの例では、単分散のＰＥＧは１つのサイズの分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃは多分散または単分散のポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、示された分子量は、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）分子の分子量の平均を表す。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、あるいは１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態において、Ｃはポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、あるいは１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＣはＰＥＧであり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、あるいは１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３３５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、分散ＰＥＧであり、分散ＰＥＧは、１以上の反復エチレンオキサイド単位を含む高分子ＰＥＧである。いくつかの例では、分散ＰＥＧ（ｄＰＥＧ）は、２〜６０、２〜５０、あるいは２〜４８の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４２、４８、５０、またはそれ以上を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約５以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約６以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約７以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約８以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約９以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１０以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１１以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１２以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１３以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１４以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１５以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１６以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１７以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１８以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約１９以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２０以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２２以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２４以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２６以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約２８以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３０以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約３５以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４０以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４２以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約４８以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは約５０以上の反復エチレンオキサイド単位を含む。場合によっては、ｄＰＥＧは、純粋な（例えば、約９５％、９８％、９９％、あるいは９９．５％）出発物質から単一の分子量化合物として段階的に合成される。場合によっては、ｄＰＥＧは平均分子量ではなく、特定の分子量を有する。場合によっては、本明細書に記載されるｄＰＥＧはＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ， ＬＭＤのｄＰＥＧである。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはカチオン性ムチン酸ベースのポリマー（ｃＭＡＰ）を含む。いくつかの例では、ｃＭＡＰは、少なくとも１つの反復サブユニットの１つ以上のサブユニットを含み、サブユニット構造は式（Ｖ）として表される：
式中、ｍは、各出現時、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは、４−６、あるいは５であり；および、ｎは、各出現時、独立して、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態において、ｍとｎは、例えば、約１０である。
いくつかの例では、ｃＭＡＰはＰＥＧ部分にさらに結合され、ｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーを生成する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は約５００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａの範囲である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ〜約１０００Ｄａ、１０００Ｄａより大きい〜約５０００Ｄａ、５０００Ｄａより大きい〜約１０，０００Ｄａ、１０，０００より大きい〜約２５，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａより大きい〜約５０，０００Ｄａ、あるいはこれらの範囲の２つ以上の任意の組み合わせである。
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは、ｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。場合によっては、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマーである。他の場合には、ポリマー部分ＣはｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマーである。さらなる場合には、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃは、上で例証されるように、ポリ核酸分子、結合部分、および、随意にエンドソーム溶解性部分に結合される。
エンドソーム溶解性部分
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子は追加の抱合部分をさらに含む。いくつかの例では、追加の結合部分はエンドソーム溶解性部分である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、細胞区画放出成分、例えば、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、あるいは細胞を有する他の小胞体などの、当該技術分野で知られている細胞の区分のいずれかから放出することができる化合物である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチド、エンドソーム溶解性ポリマー、エンドソーム溶解性脂質、あるいはエンドソーム溶解性小分子を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリペプチドを含む。他の場合では、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリマーを含む。
エンドソーム溶解性ポリペプチド
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃの分子はエンドソーム溶解性ポリペプチドとさらに結合される。いくつかの実施形態において、式（Ｖ）：Ａ−（Ｘ１−Ｂ）ｎあるいは式（ＩＩ）：Ａ−Ｘ１−（Ｂ−Ｘ２−Ｃ）ｎの分子は、エンドソーム溶解性ポリペプチドとさらに結合する。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドはｐＨ依存性膜活性ペプチドである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドは両親媒性ポリペプチドである。追加の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはペプチド模倣薬である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ、メリチン、ムチン（ｍｅｕｃｉｎ）、あるいはそのそれぞれの誘導体を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦまたはその誘導体を含む。他の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、メリチンまたはその誘導体を含む。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ムチンまたはその誘導体を含む。
いくつかの例では、ＩＮＦ７は２４残留物ポリペプチドであり、これらの配列は、ＣＧＩＦＧＥＩＥＥＬＩＥＥＧＬＥＮＬＩＤＷＧＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、あるいはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む。いくつかの例では、ＩＮＦ７またはその誘導体は、以下の配列を含む：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧＳＧＳＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ ＷＹＧ−（ＰＥＧ）６−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、または ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ−ＳＧＳＣ−Ｋ（ＧａｌＮＡｃ）２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）。
場合によっては、メリチンは２６残基ポリペプチドであり、この配列は、ＣＬＩＧＡＩＬＫＶＬＡＴＧＬＰＴＬＩＳＷＩＫＮＫＲＫＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、あるいはＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含む。いくつかの例では、メリチンは、米国特許第８，５０１，９３０号に記載されるポリペプチド配列を含む。
いくつかの例では、ムチンは、サソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）の毒液腺に由来する抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。いくつかの例では、ムチンはムチン−１３（これらの配列は、ＩＦＧＡＩＡＧＬＬＫＮＩＦ−ＮＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む）およびムチン−１８（これらの配列は、ＦＦＧＨＬＦＫＬＡＴＫＩＩＰＳＬＦＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を含む）から構成される。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、配列がＩＮＦ７あるいはその誘導体、メリチンあるいはその誘導体、または、ムチンあるいはその誘導体に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは９９％の配列同一性であるポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはムチンまたはその誘導体を含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−５を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−５からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はメリチンまたはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６または７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はムチンまたはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８または９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は以下の表１に示される配列を含む。
場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、Ｂｃｌ−２および／またはＢｃｌ−ｘＬなどの抑制遺伝子標的の拮抗を介してアポトーシスを誘発するＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ａｌｂａｒｒａｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ，” Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ７１： ２６１−２６５ （２０１１）に記載されるＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２０１３／１６６１５５号および第ＷＯ２０１５／０６９５８７．号に記載されるポリペプチド（例えば、細胞透過性ポリペプチド）を含む。
エンドソーム溶解性ポリマー
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）：Ａ−（Ｘ１−Ｂ）ｎあるいは式（ＶＩ）：Ａ−Ｘ１−（Ｂ−Ｘ２−Ｃ）ｎの分子は、エンドソーム溶解性ポリマーとさらに結合される。本明細書で使用される場合、エンドソーム溶解性ポリマーは、線状、分岐ネットワーク、星型、くし型、あるいは、はしご型のポリマーを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリマーは、２つ以上の異なる型の単量体を含むホモポリマーあるいはコポリマーである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリマーはポリカチオンポリマーである。他の場合において、エンドソーム溶解性ポリマーはポリアニオンポリマーである。
いくつかの例では、ポリカチオンポリマーは、正の電荷、中性の電荷、あるいは負の電荷であるモノマー単位を含み、正味の電荷は正である。他の場合において、ポリカチオンポリマーは、２つ以上の正電荷を含有する非ポリマー分子を含む。例示的なカチオンポリマーとしては、限定されないが、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ−アルギニン）（ＰＬＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、あるいはＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル メタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）が挙げられる。
場合によっては、ポリアニオンポリマーは、正の電荷、中性の電荷、あるいは負の電荷であるモノマー単位を含み、正味の電荷は負である。他の場合において、ポリアニオンポリマーは、２つ以上の負の荷電を含有する非ポリマー分子を含む。例示的なアニオンポリマーは、ｐ（アルキルアクリレート）（例えば、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ））、あるいはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）を含む。さらなる例は、ＰＰ７５、Ｋｈｏｒｍａｅｅ， ｅｔ ａｌ．， “Ｅｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３： ５６５−５７４ （２０１３）に記載されるＬ−フェニルアラニン−ポリ（Ｌ−リジン イソフタルアミド）ポリマーを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性ポリマーは、ｐＨ応答性のエンドソーム溶解性ポリマーである。ｐＨ応答性ポリマーは、環境のｐＨに応じてサイズを増大させる（膨潤させる）か、崩壊するポリマーを含む。ポリアクリル酸およびキトサンはｐＨ応答性ポリマーの例である。
いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、膜破壊的ポリマー（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）である。場合によっては、膜破壊的ポリマーは、カチオンポリマー、中性または疎水性ポリマー、あるいはアニオンポリマーを含む。幾つかの例では、膜破壊的ポリマーは親水性ポリマーである。
いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、ｐＨ応答性の膜破壊的ポリマーである。例示的なｐＨ応答性の膜破壊的ポリマーは、ｐ（アルキルアクリル酸）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）コポリマー、サクシニル化されたｐ（グリシドール）、およびｐ（β−リンゴ酸）ポリマーを含む。
いくつかの例では、ｐ（アルキルアクリル酸）は、ポリ（プロピルアクリル酸）（ポリＰＡＡ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（エチルアクリル酸（ＰＥＡＡ）、およびポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）を含む。いくつかの例では、ｐ（アルキルアクリル酸）は、Ｊｏｎｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ３７２： ６５−７５ （２００３）に記載されるｐ（アルキルアクリル酸）を含む。
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊的ポリマーは、ｐ（ブチルアクリレート−ｃｏ−メタクリル酸）を含む。（Ｂｕｌｍｕｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９３： １０５−１２０ （２００３）； ａｎｄ Ｙｅｓｓｉｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６１３： ２８−３８ （２００３）を参照）
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊的ポリマーは、ｐ（スチレン−ａｌｔ−無水マレイン酸）を含む。（Ｈｅｎｒｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ７： ２４０７−２４１４ （２００６）を参照）
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊的ポリマーは、ピリジル ジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）アクリレート（ＰＤＳＡ）ポリマー、例えば、ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＥＡＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、ポリ（ＥＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）、あるいはポリ（ＰＡＡ−ｃｏ−ＢＡ−ｃｏ−ＰＤＳＡ）ポリマーを含む。（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ， ｅｔ ａｌ．， “Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０４： ４１７−４２７ （２００５）；あるいはＦｌａｎａｒｙ ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ） ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＭＨＣ−１ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２０： ２４１−２４８ （２００９）を参照）
いくつかの実施形態において、ｐＨ応答性膜破壊的ポリマーは、下記の基本構造を含む細胞溶解性ポリマーを含む：
いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、追加の抱合体、例えば、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）あるいは修飾されたポリマー（例えば、コレステロールで修飾されたポリマー）にさらに結合される。
いくつかの例では、追加の抱合体は、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００）を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００）と結合されたポリマー（例えば、ポリ（アミドアミン））を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるエンドソーム溶解性部分は、ポリ（アミドアミン）−トリトンＸ−１００抱合体（Ｄｕｎｃａｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ： ａ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈｉｎ ａｃｉｄｉｃ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２： ３４１−３４７ （１９９４））を含む。
エンドソーム溶解性脂質
いくつかの実施形態において、エンドソーム溶解性部分は、脂質（例えば、融合性脂質）である。いくつかの実施形態において、式（Ｖ）：Ａ−（Ｘ１−Ｂ）ｎあるいは式（ＶＩ）：Ａ−Ｘ１−（Ｂ−Ｘ２−Ｃ）ｎの分子は、エンドソーム溶解性脂質（例えば、融合性脂質）とさらに結合する。例示的な融合性脂質は、１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ、３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６、９、２８、３１−テトラエン−１９−オール（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、およびＮ−メチル（２，２−ジ（９Ｚ、１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ）ならびにＮ−メチル−２−（２，２−ジ（９Ｚ、１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（ＸＴＣ）を含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ０９／１２６，９３３号に記載される脂質（例えば、融合性脂質）である。
エンドソーム溶解性小分子
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は小分子である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ−（Ｘ１−Ｂ）ｎあるいは式（ＩＩ）：Ａ−Ｘ１−（Ｂ−Ｘ２−Ｃ）ｎの分子は、エンドソーム溶解性小分子とさらに結合される。エンドソーム溶解性部分として適切な例示的な小分子としては、限定されないが、キニーネ、クロロキン、水酸化クロロキン、アモジアキン（ｃａｒｎｏｑｕｉｎｅｓ）、アモピロキン、プリマキン、メフロキン、ｎｉｖａｑｕｉｎｅｓ、ハロファントリン、キノンイミン、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、キノリンエンドソーム溶解性部分としては、限定されないが、７−クロロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン（クロロキン）；７−クロロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン（ヒドロキシクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン；４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−ジエチル−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン（デスメチルクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（４−ジエチル−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチル−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチル−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（４−エチル−（２−ヒドロキシ−エチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ−）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；ヒドロキシクロロキンホスフェート；７−クロロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル−１）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン（デスメチルヒドロキシクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ（キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；８−［（４−アミノペンチル）アミノ−６−メトキシジヒドロクロリドキノリン；１−アセチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン；８−［（４−アミノペンチル）アミノ］−６−メトキシキノリンジヒドロクロリド；１−ブチリル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン；３−クロロ−４−（４−ヒドロキシ−α，α’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン）（４−［（４−ジエチル−アミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシ−α，α’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン（４−［（４−ジエチルアミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；４−（４−ヒドロキシ−α、α’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン；４−［（４−ジエチルアミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；３，４−ジヒドロ−１−（２Ｈ）−キノリンカルボキシアルデヒド；１、１’−ペンタメチレンキノリニウムヨージド；８−硫酸キノリノールおよびアミノ、アルデヒド、カルボン酸、ヒドロキシル、ハロゲン、ケト、スルフヒドリル、ならびにビニル誘導体またはそのアナログが挙げられる。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ｎａｉｓｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ （１９９７， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８０：８８４−８９３）および米国特許第５，７３６，５５７号に記載される小分子である。いくつかの実施形態において、エンドソーム溶解性部分は、ニゲリシンあるいはその抱合体、例えば、葉酸−ニゲリシンのエステル抱合体、葉酸−ニゲリシンのアミド抱合体、または葉酸−ニゲリシンのカルバマート結合などである。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ｒａｎｇａｓａｍｙ， ｅｔ． ａｌ．， “Ｎｅｗ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｃｏｎｔｅｎｔｓ： ｏｓｍｏｔｉｃ ｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｋ＋／Ｈ＋ ｅｘｃｈａｎｇｅ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２９：１０４７−１０５９ （２０１８）に記載されるニゲリシンである。
リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーである。いくつかの例では、リンカーは切断可能なリンカーである。他の例では、リンカーは切断不可能なリンカーである。
場合によっては、リンカーは非ポリマーリンカーである。非ポリマーリンカーは、重合プロセスによって生成された単量体の反復単位を含まないリンカーを指す。例示的な非ポリマーリンカーとしては、限定されないが、Ｃ１−Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。場合によっては、非ポリマーリンカーは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせを含む。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは、２つを超える同じタイプのリンカー、例えば、２つを超えるホモ二機能性架橋リンカー、あるいは２つを超えるペプチドリンカーを含まない。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは随意に１つ以上の反応性官能基を含む。
いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、上に記載されたポリマーを包含しない。いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、ポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）を包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはＰＥＧを包含しない。
いくつかの例では、リンカーはホモ二機能性リンカーを含む。例示的なホモ二機能性リンカーとしては、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔの試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロプリオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデートピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３，３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、あるいは、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二機能性リンカーを含む。例示的なヘテロ二機能性リンカーとしては、限定されないが、アミン反応的およびスルフヒドリル架橋リンカー、例えば、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート，（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート，（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ−ＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノアート（スルホＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ｉｏｄｏａｃｔｅｙｌ）アミノベンゾエート（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド・エステル（ＧＭＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢ）、スクシンイミジル ６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノアート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル ６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノアート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル ４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル ６−（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサノアート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）などのカルボニル反応的およびスルフヒドリル反応的な架橋リンカー、アミン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノアート（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル ４−（ρ−アジドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル ２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル ７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニル・ジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミドカルボニル反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボン酸塩反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、および、アルギニン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）が挙げられる。
いくつかの例では、リンカーは反応性官能基を含む。場合によっては、反応性官能基は、結合部分に存在する求電子基に反応性の求核基を含む。例示的な求電子基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、ハロゲン化アシル、または酸無水物などのカルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、反応性官能基はアルデヒドである。例示的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーはマレイミド基を含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。いくつかの例では、マレイミド基はカプロン酸をさらに包含し、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成する。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例では、マレイミド基は、上に記載されたスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、あるいは、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
いくつかの実施形態において、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内の触媒作用をもたらすために、マレイミドに隣接する塩基性アミノ基を取り込むべくジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それによって、マレイミドがレトロマイケル反応による脱離反応を経験することのないようにする。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｌｆ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，” Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３２（１０）：１０５９−１０６２ （２０１４）に記載されるマレイミド基である。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドである。
いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド部分を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、少なくとも１、２、３、４、５、あるいは６より多くのアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、あるいは８のアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、約２、約３、約４、約５、あるいは約６アミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、切断可能なペプチド部分（例えば、酵素的または化学的に）である。いくつかの例では、ペプチド部分は切断不可能なペプチド部分である。いくつかの例では、ペプチド部分は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、あるいはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含む。いくつかの例では、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、あるいはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙなどのペプチド部分を含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ−Ｃｉｔを含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ−Ｃｉｔである。
いくつかの実施形態において、リンカーは安息香酸基あるいはその誘導体を含む。いくつかの例では、安息香酸基あるいはその誘導体はパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。いくつかの例では、安息香酸基あるいはその誘導体はγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、任意の組み合わせで、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。いくつかの例では、ペプチド基はｖａｌ−ｃｉｔである。いくつかの例では、安息香酸基はＰＡＢＡである。いくつかの例では、リンカーはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。場合によっては、リンカーはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合には、リンカーはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは自壊性リンカーあるいは自己排除リンカーである。場合によっては、リンカーは自壊性リンカーである。他の場合には、リンカーは自己排除リンカー（例えば、環化自己排除リンカー）である。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４号あるいはＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５０３８４２６に記載されるリンカーを含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは樹状型リンカーである。いくつかの例では、樹状型リンカーは分岐した多機能リンカー部分を含む。いくつかの例では、樹状型リンカーは、ポリヌクレオチドＢ対結合部分Ａのモル比を増加させるために使用される。いくつかの例では、樹状型リンカーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、トレースレスリンカーあるいは切断後にリンカー部分（例えば、原子あるいはリンカー基）を結合部分Ａ、ポリヌクレオチドＢ、ポリマーＣ、またはエンドソーム溶解性部分Ｄに残さないリンカーである。例示的なトレースレスリンカーとしては、限定されないが、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー（ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｌｉｎｋｅｒ）、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロムリンカー、あるいはフェニルヒドラジドリンカーが挙げられる。場合によっては、リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ａｒｙｌ−ｔｒｉａｚｅｎｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １１（１５）： ２４９３−２４９７ （２０１３）に記載されるトレースレスアリール−トリアゼンリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、Ｂｌａｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．， “Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０２： ２６０７−２０２４ （２００２）に記載されるトレースレスリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第６，８２１，７８３号に記載されるトレースレスリンカーである。
幾つかの実施形態では、リンカーは、米国特許第６，８８４，８６９号；第７，４９８，２９８号；第８，２８８，３５２号；第８，６０９，１０５号；あるいは、第８，６９７，６８８号；米国特許公開第２０１４／０１２７２３９号；第２０１３／０２８９１９号；第２０１４／２８６９７０号；第２０１３／０３０９２５６号；第２０１５／０３７３６０号；あるいは、第２０１４／０２９４８５１号；または、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５０５７６９９；ＷＯ２０１４０８０２５１；ＷＯ２０１４１９７８５４；ＷＯ２０１４１４５０９０；あるいは、ＷＯ２０１４１７７０４２に記載されるリンカーである。
いくつかの実施形態において、Ｘ、Ｙ、およびＬは独立して単結合またはリンカーである。いくつかの例では、Ｘ、Ｙ、およびＬは独立して単結合である。場合によっては、Ｘ、Ｙ、およびＬは独立してリンカーである。
いくつかの例では、Ｘは単結合またはリンカーである。いくつかの例では、Ｘは単結合である。いくつかの例では、Ｘはリンカーである。いくつかの例では、リンカーはＣ１−Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｘは、例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基などのＣ１−Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｃ１−Ｃ６アルキル基は非置換のＣ１−Ｃ６アルキル基である。リンカーの文脈において、とりわけ、Ｘの文脈において使用される場合、アルキルは、最大で６つの炭素原子を含む飽和した直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味する。いくつかの例では、Ｘは非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、Ｘは上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、ＸはｓＭＣＣを含む。他の例では、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に結合したヘテロ二機能性リンカーを含む。他の例では、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に結合したｓＭＣＣを含む。いくつかの追加の例では、Ｘは、上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含まない。
いくつかの例では、Ｙは単結合またはリンカーである。いくつかの例では、Ｙは単結合である。他の場合には、Ｙはリンカーである。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｙは上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは上に記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは上に記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは、上に記載されたマレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基、あるいは自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、ＹはＶａｌ−Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、ＹはＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｙは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。追加の例では、Ｙはｍｃ基を含む。追加の例では、Ｙはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。追加の例では、Ｙはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。追加の例では、Ｙはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの例では、Ｌは単結合またはリンカーである。場合によっては、Ｌは単結合である。場合によっては、Ｌはリンカーである。いくつかの実施形態では、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｌは上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは上に記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは上に記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは、上に記載されたマレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基、あるいは自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、ＬはＶａｌ−Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、ＬはＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｌは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。さらなる例では、Ｌはｍｃ基を含む。さらなる例では、Ｌはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。さらなる例では、Ｌはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。さらなる例では、Ｌはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの実施形態において、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して、単結合あるいは非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して単結合である。場合によっては、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して非ポリマーリンカーである。
いくつかの例では、Ｘ１は単結合または、非ポリマーリンカーを含む。いくつかの例では、Ｘ１は単結合である。いくつかの例では、Ｘ１は非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、リンカーはＣ１−Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｘ１は、例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基などのＣ１−Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｃ１−Ｃ６アルキル基は非置換のＣ１−Ｃ６アルキル基である。リンカーの文脈において、とりわけ、Ｘ１の文脈において使用される場合、アルキルは、最大で６つの炭素原子を含む飽和した直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味する。いくつかの例では、Ｘ１は上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ１はヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ１はｓＭＣＣを含む。他の例では、Ｘ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に結合したヘテロ二機能性リンカーを含む。他の例では、Ｘ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基に随意に結合したｓＭＣＣを含む。いくつかの追加例では、Ｘ１は、上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含まない。
いくつかの例では、Ｘ２は単結合またはリンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は単結合である。その他の場合において、Ｘ２はリンカーである。さらなる場合には、Ｘ２は非ポリマーリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｘ２は上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は上に記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は上に記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は、上に記載されたマレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基、あるいは自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、Ｘ２はＶａｌ−Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、Ｘ２はＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｘ２は、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
医薬製剤
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬製剤は、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内、頬側、直腸、または経皮の投与経路を含む、複数の投与経路によって被験体に投与される。いくつかの例では、本明細書に記載される医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、髄腔内、大脳内、脳室内、あるいは頭蓋内）投与のために製剤化される。他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は、経口投与のために製剤化される。また他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は、経鼻投与のために製剤化される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物としては、限定されないが、水性分散液、自己乳化分散液、固溶体、リポソーム分散液、エアロゾル、固形剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶製剤、錠剤、カプセル、丸剤、遅延放出製剤、拡張放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤（例えば、ナノ粒子製剤）、および、即時放出と制御放出の混合製剤が挙げられる。
いくつかの例では、医薬製剤は多粒子製剤を含む。いくつかの例では、医薬製剤はナノ粒子製剤を含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、ｃＭＡＰ、シクロデキストリン、あるいは脂質を含む。場合によっては、ナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、自己乳化ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、あるいはミセル溶液を含む。さらなる例示的なナノ粒子としては、限定されないが、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、および量子ドットが挙げられる。いくつかの例では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、シリコン、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、およびこれらの組み合わせ、その合金またはオキシドのナノ粒子である。
いくつかの例では、ナノ粒子は、コア、あるいは、コアシェルナノ粒子のようにコアとシェルを含む。
いくつかの例では、ナノ粒子は、機能要素の結合のために分子、例えば、本明細書に記載されるポリ核酸分子または結合部分の１つ以上でさらにコーティングされる。いくつかの例では、コーティングは、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（あるいはキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミン、またはデキストリンあるいはシクロデキストリンを含む。いくつかの例では、ナノ粒子はグラフェンコーティングされたナノ粒子を含む。
場合によっては、ナノ粒子は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、あるいは１００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法を有する。
いくつかの例では、ナノ粒子製剤は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、または量子ドットを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に結合される。いくつかの例では、本明細書に記載される少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、あるいは１００以上のポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に結合される。
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、送達ベクター、例えば、細胞中へのポリ核酸分子の送達のための組換えベクターを含む。いくつかの例では、組換えベクターはＤＮＡプラスミドである。他の例において、組換えベクターは、ウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、あるいはアルファウイルスに由来したベクターを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子を発現することができる組換えベクターは、標的細胞中での安定した発現をもたらす。さらなる例では、ポリ核酸分子の一時的発現をもたらすウイルスベクターが使用される。
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、本明細書に開示される組成物との適合性ならびに所望の剤形の放出プロフィール特性に基づいて選択された担体または担体材料を含む。例示的な担体物質としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、加湿剤、希釈剤などが含まれる。薬学的に適合可能な担体材料としては 限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロース抱合体、糖ステアロイル乳酸ナトリウム（ｓｕｇａｒｓ ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｏｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、α化デンプンなどが挙げられる。参照（例えばレミングトン）：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５）、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０、および、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）。
いくつかの例では、医薬製剤は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および、塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基、ならびに、クエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤を含む、ｐＨ調節剤または緩衝剤をさらに含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持するのに必要な量で含まれる。
いくつかの例では、医薬製剤は、組成物の浸透圧重量モル濃度を許容範囲にするのに必要な量の１以上の塩を含む。こうした塩は、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのカチオン、ならびに塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、または重亜硫酸塩のアニオンを含み、適切な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および、硫酸アンモニウムを含む。
いくつかの例では、希釈液がより安定した環境を提供することができるため、医薬製剤は、化合物を安定化させるために使用される希釈液をさらに含む。限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水を含む緩衝液中に溶解した塩（ｐＨの制御あるいは維持ももたらす）が、当該技術分野の希釈剤として利用される。特定の例において、希釈剤は、組成物の大きさを増大させて、圧縮を促進するか、またはカプセル充填のための均質な混合のために十分な大きさ（ｂｕｌｋ）を作り出す。そのような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；リン酸水素カルシウム、リン酸カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水乳糖、噴霧乾燥したラクトース；α化デンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮可能な糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセタート・ステアラート、スクロース系の希釈剤、粉砂糖；一塩基の硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストラート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）；加水分解したシリアル固形物、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
場合によっては、医薬製剤は、物質の分解または崩壊を促進する崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ ｏｒ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を含む。用語「分解する」は、胃腸液と接触した際の剤形の溶解および分散の両方を含む。崩壊剤の例は、デンプン、例えば、天然のデンプン、例えば、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン、α化デンプン、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ １５５１またはＡｍｉｊｅｌ（登録商標）、またはナトリウムデンプングリコラート、例えば、Ｐｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）またはＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）、セルロース、例えば、木製品、メチル結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、Ｅｍｃｏｃｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｎ Ｔｉａ（登録商標）、およびＳｏｌｋａ−ＦｌｏＣ（登録商標））、メチルセルロース、クロスカルメロース、または架橋セルロース、例えば、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））、架橋カルボキシメチルセルロース、または架橋クロスカルメロースの架橋デンプン、例えば、ナトリウムデンプングリコラート、クロスポビドンなどの架橋ポリマー、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、例えばアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸の塩、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）などの粘土、ゴム、例えば、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、またはトラガカント、ナトリウムデンプングリコラート、ベントナイト、天然のスポンジ、界面活性剤、陽イオン交換樹脂などの樹脂、柑橘類のパルプ、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプンを組み合わせたラウリル硫酸ナトリウムなど、を含む。
いくつかの例では、医薬製剤としては、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストラート、デキストラン、デンプン、α化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、などの充填剤が挙げられる。
材料の接着または摩擦を防ぎ、減少させ、あるいは阻害するために、潤滑剤および滑剤が本明細書に記載される医薬製剤に随意にさらに含まれる。典型的な潤滑剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ナトリウム・ステアリル・フマラート、鉱油などの炭化水素、水素添加大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの硬化植物油、高級脂肪酸、およびアルカリ金属とアルカリ土類金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００）またはメトキシポリエチレン・グリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベへン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイダルシリカ、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
可塑剤は、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化して、それらの脆性を低減するために使用される化合物を含む。適切な可塑剤は、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、およびＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、トリアセチンを含む。可塑剤は、分散剤または湿潤剤としても機能する。
可溶化剤は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクセートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｃｃｕｓａｔｅ）、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピル・シクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁酸塩、ポリエチレングリコール２００−６００、グリコフロール、トランスクトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、およびジメチル・イソソルビドなどの化合物を含む。
安定化剤は、任意の抗酸化剤、緩衝剤、酸、防腐剤などの混合物を含む。
懸濁化剤は、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０などのポリビニルピロリドン、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有する）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、グアーゴム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、セルロース化合物、例えばカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドンなどの化合物を含む。
サーファクタントは、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクセートナトリウム、またはＴｗｅｅｎ ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）、ポリソルベート、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒｓ）、胆汁酸塩、モノステアリン酸グリセリン、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。付加的な界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドおよび植物油（例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油）；および、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０などを含む。しばしば、界面活性剤は、物理的安定性を高めるために、または他の目的のために含まれる。
粘度増強剤は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組み合わせを含む。
湿潤剤は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ドクサートナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
治療レジメン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は治療用途のために投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１日に一回、１日に２回、１日に３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、毎日、１日おき、週５日、週１日、１週おき、月２週間、月３週間、月１回、月２回、月３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年、またはそれ以上の間投与される。
いくつかの実施形態では、１以上の医薬組成物は、同時に、連続して、またはある時間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、１以上の医薬組成物は同時に投与される。場合によっては、１つ以上の医薬組成物は連続して投与される。さらなる場合には、１以上の医薬組成物は、ある時間間隔で投与される（例えば、第１の医薬組成物の第１の投与は１日目であり、その後、少なくとも第２の医薬組成物の投与前に少なくとも１、２、３、４、５日またはそれ以上の間隔を空ける）。
いくつかの実施形態において、２つ以上の様々な医薬組成物は同時投与される。いくつかの例では、２以上の異なる医薬組成物が同時に投与される。場合によっては、２つ以上の異なる医薬組成物が、投与間の間隔なく連続して同時投与される。他の場合には、２つ以上の異なる医薬組成物が、投与間に約０．５時間、１時間、２時間、３時間、１２時間、１日、２日の間隔をおいて連続して投与される。
患者の状態が改善する場合、医者の判断で、組成物の投与は継続的に行われ；代替的に、投与されている組成物の用量は、一時的に減少されるか、または特定の期間の間一時的に中断される（つまり、「休薬期間」）。いくつかの例では、休薬期間の長さは、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む、２日〜１年の間で変わる。休薬日中の投与量の減少は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％を含む、１０％〜１００％である。
いったん患者の状態が改善すると、必要に応じて維持量が投与される。その後、投与量または投与頻度、あるいはその両方は、症状に応じて、改善された疾患、障害、または疾病が保持されるレベルにまで減少可能である。
いくつかの実施形態では、そのような量に相当する所定の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要としている被験体または宿主の性質（例えば、体重）などの要因に左右されるが、それにもかかわらず、例えば、投与されている特定の薬剤、投与経路、および処置されている被験体または宿主を含む、症例を取り巻く特定の環境に従って、当該技術分野で既知の方法で日常的に判定される。いくつかの例では、所望の投与量は一回量で、あるいは、同時に（または短時間にわたって）、あるいは適切な間隔を置いて投与された分割量、例えば、１日当たり２、３、あるいは４以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅｓ）として、都合よく提示される。
個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単なる示唆的なものに過ぎず、これらの推奨値からかなり逸脱することは珍しいことではない。そのような投与量は、限定されないが、使用される化合物の活性、処置される疾患または疾病、投与の様式、個々の被験体の必要条件、処置されている疾患または疾病の重症度、および医師の判断を含む、多くの変数に依存して変更される。
いくつかの実施形態では、こうした治療レジメンの毒性と治療の有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死投与量）と、ＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な投与量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される一連の投与量を製剤化するのに使用される。こうした化合物の投与量は、最小限の毒性を備えるＥＤ５０を含む一連の循環濃度内に位置するのが好ましい。投与量は、使用される剤形と利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わる。
キット／製品
ある実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の組成物および方法とともに使用されるキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装または容器を含み、各容器は、本明細書中に記載されている方法を使用するための別個の要素の１つを備える。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
本明細書で提供される製品は包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、および選択された製剤と意図した投与および処置のモードに適する任意の包装材料が挙げられる。
例えば、容器は、本明細書に記載される標的核酸分子を含む。そのようなキットは、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。
キットは典型的には、内容物および／または使用説明書を列挙するラベルと、使用説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。
一実施形態において、ラベルが容器上にあるか容器に付随する。一実施形態において、ラベルを形成する文字、数字または他の表示が、容器自体に貼り付けられるか、成形されるか、あるいは刻まれている場合は、ラベルは容器上に取付けられる。ラベルは、例えば、添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在するとき、容器に付随する。一実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために使用される。ラベルは、例えば、本明細書に記載の方法で、内容物の使用方法も示している。
ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される化合物を含む１以上の単位剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイスで提示される。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。一実施形態において、パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付してある。一実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を制御する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態についての、政府機関の承認を反映するものである。このような通知書は、例えば、処方薬または承認された添付文書に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。一実施形態において、適合する製薬担体で製剤化される本明細書で提供される化合物を含む組成物も調製され、適切な容器に入れられ、示された疾病の処置のためにラベル付けされる。
特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、主題が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は例示的かつ説明的なものに過ぎず、任意の主題に限定されるものではないことが理解されよう。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に他のことを定めていない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。
本明細書で使用される場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含んでいる。
本明細書に使用される段落の見出しは、組織化するためのものに過ぎず、記載される主題を制限するものと解釈されてはならない。
本明細書で使用される場合、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は、任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、あるいはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況に制限されない。
これらの実施例は説明目的のために提供されるにすぎず、請求項の範囲を制限するものではない。
実施例１。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列および合成
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を合成した。
ＰＭＯ配列は、５’ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ３’一級アミン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）であり、末端ヌクレオチドが拡張されて図１で見られる。ＰＭＯは、結合のために分子の３’末端にＣ３−ＮＨ２結合ハンドルを含む。ＰＭＯは、標準的な固相合成プロトコルを使用して固相上で完全に組み立てられ、ＨＰＬＣで精製された。
ＰＳ ＡＳＯ配列は、アミン−Ｃ６−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＵＣＧＧＣＵＵＡＣＣＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）であり、末端ヌクレオチドが拡張されて図２Ａ−２Ｂで見られる。ＰＳ ＡＳＯの構造は、１００％のホスホロチオエート結合であるリン酸塩骨格を含み、リボース糖類はすべて２’２’ＯＭｅ修飾を含んでいた。ＰＳ ＡＳＯは、結合のために分子の５’末端にＣ６−ＮＨ２結合ハンドルも含んでいた。ＰＭＯは、標準的な固相ホスホラミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てられ、ＨＰＬＣで精製された。
ＡＳＯは、標準的な固相ホスホラミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てられ、ＨＰＬＣで精製された。ＡＳＯは、結合のために分子の５’末端にＣ６−ＮＨ２結合ハンドルを含んでいた。
実施例２：ＤＭＤエクソンスキッピングの検出
分化したＣ１Ｃ１２細胞におけるＤＭＤエクソン２３スキッピングを判定するための方法
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞を、０．５ｍＬの１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ １６４０培地中の２４ウェルプレートに５０，０００−１００，０００／ウェルで蒔き、５％のＣＯ２を用いて３７°Ｃで夜通しインキュベートした。２日目に、細胞を分化培地（２％のウマ血清ＲＰＭＩ １６４０および１μＭインスリン）に移し、３−５日間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを加え、２４時間インキュベートした。サンプル処理の後、１ｍＬの新鮮な培地（化合物を含まない）をさらに２日間、毎日交換した。処置開始から７２時間後に、細胞を採取した。ＩｎｖｉＴｒａｐ ＲＮＡ細胞ＨＴＳ ９６キット（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＃７０６１３００４００）を用いてＲＮＡを単離して、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃４３６８８１３）を使用して逆転写した。ＤｒｅａｍＴａｑ（商標） ＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｋ１０７２）を使用してＰＣＲ反応を実施した。一次ＰＣＲは、エクソン２０（Ｅｘ２０Ｆ ５’−ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）およびエクソン２６（Ｅｘ２６Ｒ ５’−ＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＴＣＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）におけるプライマーを使用して、スキッピングされたおよびスキッピングされていない両方の分子を、表２のプロトコルを用いて増幅した。
ネステッドＰＣＲについては、一次ＰＣＲ反応を水で１００倍に希釈し、５μｌをネステッドＰＣＲ反応に使用した（５０μｌの総反応量）。ネステッドＰＣＲは、エクソン２０（Ｅｘ２０Ｆ２： ５’− ＡＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＴＡＴＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）およびエクソン２５（Ｅｘ２５Ｒ： ５’− ＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）におけるプライマーを使用して、スキッピングされたおよびスキッピングされていない両方の分子を、表３のプロトコルを用いて増幅した。
ＰＣＲ反応を４％のＴＡＥアガロースゲルを使用して分析した。野生型（ＷＴ）のＤＭＤ生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と、５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３とを有していた。
動物
ＵＳＤＡ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔで概説された規則を厳守する、Ｅｘｐｌｏｒａ ＢｉｏＬａｂｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）、ならびに“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ” （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， ８ｔｈ Ｅｄ．， ｒｅｖｉｓｅｄ ｉｎ ２０１１）”に基づくプロトコルに従って、動物研究を実施した。マウスはすべて、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのいずれかから入手した。
インビボのマウスモデル
指示されたアンチセンス抱合体（ＡＳＣ）および投与量を、静脈内（ｉｖ）注射によってＷＴ ＣＤ−１マウス（４−６週齢）に投与した。「ネイキッド」ＰＭＯあるいはＡＳＯを、指示された投与量で筋肉内注射によって投薬した。４、７、あるいは１４日後、心臓および腓腹筋の組織を採取して液体窒素で急速凍結した。ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ ａｎｄ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ９６ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， ＃７４１９２）で単離し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃４３６８８１３）を用いて逆転写した。ネステッドＰＣＲ反応を記載の通りに実施した。ＰＣＲ反応を４％のＴＡＥアガロースゲル中で分析し、デンシトメトリーによって定量化した。
処置されたマウスのエクソン２３スキッピングを確認するために、ＤＮＡフラグメントを４％のアガロースゲルから単離して配列決定した。
スキッピングされたＤＭＤ ｍＲＮＡのコピー数を定量的に決定するために、ｑＰＣＲプライマー／プローブセットを設計して、スキッピングされたおよびＷＴ ＤＭＤ ｍＲＮＡ（図３）を定量化した。表４で見られるような設計されたＰＣＲプライマーを使用し、ＰＣＲによって、ｑＰＣＲ定量化標準を設計および生成した。ＷＴおよびＤＭＤのためのｑＰＣＲ標準については、ＰＣＲ後に、７３３の塩基対フラグメントをアガロースゲルから単離した。スキッピングされたＤＭＡのｑＰＣＲ標準については、ネステッドプライマーを使用した。
ｑＰＣＲプライマー／プローブの増幅効率は、予想された効率の１０％以内であると判定された。ｑＰＣＲ反応を、メーカーの説明書に従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７およびＴａｑｍａｎ（商標）ＰＣＲ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ ＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃４４４００４１）で実施した。
実施例３：抱合体合成
分析および精製方法
分析および精製方法を表５−１１に従って実施した。
抗トランスフェリン受容体抗体
使用された抗マウストランスフェリン受容体抗体あるいは抗ＣＤ７１ ｍＡｂは、マウスＣＤ７１またはマウストランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）を結合するラットＩｇＧ２ａサブクラスモノクローナル抗体であった。抗体はＢｉｏＸｃｅｌｌによって産生され、市販で入手可能である（カタログ＃ ＢＥ０１７５）。
抗ＣＤ７１抗体モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド抱合体（抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ）
抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体
水中に４当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加えて、４時間３７°Ｃでインキュベートすることによって、ホウ酸塩緩衝液（２５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸、ｐＨ８．０）中の抗ＣＤ７１抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）を還元した。ＤＭＳＯ中の１０当量のＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いてＤＭＳＯ中のＰＭＯ（５０ｍｇ／ｍＬ）を１時間インキュベートすることにより、４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）の３’末端で一級アミンに結合させた。３ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過機ユニットを使用した限外濾過により、非結合ＳＭＣＣを除去した。ＰＭＯ−ＳＭＣＣを、緩衝酢酸溶液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０）で３回洗浄して、すぐに使用した。還元された抗体を、２．２５当量のＰＭＯ−ＳＭＣＣと混合し、４°Ｃで夜通しインキュベートした。その後、反応混合物のｐＨを７．５まで減らし、８当量のＮ−エチルマレイミドを室温で３０分間にわたって混合物に加えて、未反応のシステインをクエンチした。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２による反応混合物の分析は、未反応の抗体およびＰＭＯと共に、抗体−ＰＭＯ抱合体を示した（図４）。図４は、ＨＩＣ方法２で産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ反応混合物のクロマトグラムを示しており、遊離抗体ピーク（１）、遊離ＰＭＯ（２）、ＤＡＲ １（３）、ＤＡＲ ２（４）、ＤＡＲ ３（５）、ＤＡＲ＞３（６）を示している。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。括弧の中の数はクロマトグラムのピークを指す。
精製
ＨＩＣ方法１を使用して、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣで反応混合物を精製した。１（ＤＡＲ１）と２（ＤＡＲ２）の薬物対抗体比を有する抱合体を含む画分を組み合わせ、２を超えるＤＡＲを有する抱合体とは別に、５０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットで濃縮した。濃縮抱合体を、分析の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。
精製された抱合体の分析
単離させた抱合体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＨＩＣで特徴づけた。高分子量の凝集塊と非結合ＰＭＯが存在しないことを確認するために、ＳＥＣ方法１を使用した（図５Ａ−５Ｃ）。図５Ａは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂのクロマトグラムを示す。図５Ｂは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ １および２のクロマトグラムを示す。図５Ｃは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された２を超える抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲのクロマトグラムを示す。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。
ＨＩＣ方法２を使用して分析的ＨＰＬＣによって、抱合体の純度を評価した（図６Ａ−６Ｃ）。図６Ａは、ＨＩＣ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂのクロマトグラムを示す。図６Ｂは、ＨＩＣ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１および２抱合体のクロマトグラムを示す。図６Ｃは、ＨＩＣ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞２抱合体のクロマトグラムを示す。各サンプルの２６０／２８０ｎｍのＵＶ吸光度比率を、ＰＭＯと抗体の既知の比率の標準曲線と比較して、ＤＡＲを確認した。ＤＡＲ１および２のサンプルは〜１．６の平均ＤＡＲを有していたが、２を超えるＤＡＲのサンプルは〜３．７の平均ＤＡＲを有していた。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。
抗ＣＤ７１Ｆａｂモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド抱合体（抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ）
ペプシンによる抗体消化
２０ｍＭの緩衝酢酸溶液（ｐＨ４．０）中の抗ＣＤ７１抗体（５ｍｇ／ｍＬ）を、３７°Ｃで３時間、固定されたペプシンを用いてインキュベートした。樹脂を取り除き、反応混合物を、３０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。残留物を集めて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法２を使用して精製し、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを単離した。
抗ＣＤ７１（Ｆａｂ）−ＰＭＯ抱合体
水中に１０当量のＴＣＥＰを加えて、３７°Ｃで２時間インキュベートすることによって、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中のＦ（ａｂ’）２フラグメント（１５ｍｇ／ｍＬ）を還元した。ＤＭＳＯ中の１０当量のＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いてＤＭＳＯ中のＰＭＯ（５０ｍｇ／ｍＬ）を１時間インキュベートすることにより、ＳＭＣＣをＰＭＯの３’末端の一級アミンに加えた。３ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過機ユニットを使用した限外濾過により、非結合ＳＭＣＣを除去した。ＰＭＯ−ＳＭＣＣを、緩衝酢酸溶液（ｐＨ６．０）で３回洗浄してすぐに使用した。１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、還元されたＦ（ａｂ’）フラグメント（Ｆａｂ）をホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）へと緩衝液交換し、１．７５当量のＰＭＯ−ＳＭＣＣを加えて、４°Ｃで夜通しインキュベートした。その後、反応混合物のｐＨを７．５まで減らし、６当量のＮ−エチルマレイミドを室温で３０分間にわたって混合物に加えて、未反応のシステインをクエンチした。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法３による反応混合物の分析は、未反応のＦａｂとともに抗ＣＤ７１（Ｆａｂ）−ＰＭＯ抱合体を示した（図１４ａ）。図７Ａは、ＨＩＣ方法３を使用した抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯのＦＰＬＣ精製のクロマトグラムを示す。
精製
ＨＩＣ方法３を使用して、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣで反応混合物を精製した。１、２、および３のＤＡＲの抱合体を含む画分を組み合わせて、別々に濃縮した。濃縮抱合体を、分析の前に、１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。
精製された抱合体の分析
単離させた抱合体をＳＥＣとＨＩＣで特徴づけた。高分子量の凝集塊および未結合ＰＭＯが存在しないことを確認するために、ＳＥＣ方法１を使用した。図７Ｂ−図７Ｅを参照する。図７Ｂは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂのクロマトグラムを示す。図７Ｃは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｄは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｅは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。ＨＩＣ方法４を使用した分析的ＨＰＬＣによって、抱合体の純度を評価した。図７Ｆ−図７Ｉを参照。図７Ｆは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂのクロマトグラムを示す。図７Ｇは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｈは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｉは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。各サンプルの２６０／２８０ｎｍのＵＶ吸光度比率を、ＰＭＯとＦａｂの既知の比率の標準曲線と比較して、ＤＡＲを確認した。
抗ＣＤ７１抗体ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド抱合体（抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ）
抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ
水中に４当量のＴＣＥＰを加えて、４時間３７°Ｃでインキュベートすることにより、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中の抗ＣＤ７１（１０ｍｇ／ｍＬ）を還元した。ＤＭＳＯ中の１０当量のＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を有する２５０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．５）およびＤＭＳＯの１：１混合物においてＰＳ ＡＳＯ（５０ｍｇ／ｍＬ）を１時間インキュベートすることにより、４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を、ＰＳ−ＡＳＯの５’末端の一級アミンに加えた。３ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過機ユニットを使用した限外濾過により、非結合ＳＭＣＣを除去した。ＰＳ ＡＳＯ−ＳＭＣＣを、緩衝酢酸溶液（ｐＨ６．０）で３回洗浄してすぐに使用した。還元された抗体を、１．７当量のＰＳ ＡＳＯ−ＳＭＣＣと混合して、４°Ｃで夜通しインキュベートした。その後、反応混合物のｐＨを７．４まで減らし、８当量のＮ−エチルマレイミドを室温で３０分間にわたって混合物に加えて、未反応のシステインをクエンチした。強力な陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法２による反応混合物の分析は、未反応の抗体およびＡＳＯと共に抗体−ＰＳ ＡＳＯ抱合体を示した（図８Ａ）。図８Ａは、ＳＡＸ方法２で産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ反応混合物のクロマトグラムを示しており、遊離抗体ピーク（１）、遊離ＰＳ ＡＳＯ（５）、ＤＡＲ １（２）、ＤＡＲ ２（３）、ＤＡＲ＞２（４）を示している。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。括弧の中の数はピークを指す。
精製
ＳＡＸ方法１を使用して、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣで反応混合物を精製した。１、２、および３の薬物対抗体比（ＤＡＲ）の抱合体を含む画分を組み合わせて、別々に濃縮し、分析の前に、５０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液交換した。
精製された抱合体の分析
単離させた抱合体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＳＡＸで特徴づけた。高分子量の凝集塊と非結合ＡＳＯが存在しないことを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィー方法１を使用した。図８Ｂ−図８Ｅを参照する。図８Ｂは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂのクロマトグラムを示す。図８Ｃは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｄは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｅは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。抱合体の純度を、ＳＡＸ方法２を使用した分析的ＨＰＬＣによって評価した。図８Ｆ−図８Ｈを参照する。図８Ｆは、ＳＡＸ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｇは、ＳＡＸ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｈは、ＳＡＸ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。各サンプルの２６０／２８０ｎｍのＵＶ吸光度比率を、ＡＳＯと抗体の既知の比率の標準曲線と比較して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を確認した。
実施例４：抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビトロ活性
実施例３に記載されるように、抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体が作られ、特徴づけられた。実施例２と同様の方法を使用するネステッドＰＣＲを利用して、分化したＣ２Ｃ１２細胞においてインビトロのエクソンスキッピングを媒介する能力について抱合体を評価した。簡潔に言えば、「ネイキッド」モルホリノＡＳＯ（「ＰＭＯ」）の効能を、関連するビヒクル対照を用いて、複数の濃度の抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体と比較した。対照はビヒクル（「Ｖｅｈ」）、５０ｕＭのスクランブル・モルホリノ（「Ｓｃｒ５０」）を含んでおり、抗体（「Ｎｅｇ−Ａｂ」）は含んでいなかった。使用したＰＭＯの濃度は、５０ｕＭ、１ｕＭ、および０．０２ｕＭを含んでいた。使用した抗ＣＤ７１ ｍＡＢ−ＰＭＯ ＤＡＲ １および２の濃度は、２００ｎＭ、２０ｎＭ、および２ｎＭを含んでいた。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。
ｃＤＮＡ合成後に、２回のＰＣＲ増幅（一次ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲ）を使用して、エクソンスキッピングを検出した。ＰＣＲ反応を４％のＴＡＥアガロースゲル中で分析した（図９）。
図９を参照すると、抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は、分化したＣ２Ｃ１２細胞において、「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度の、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と、５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３とを有していた。
別の実験は、抗ＣＤ７１Ｆａｂ−ＰＭＯ抱合体と、陰性対照として抗ＥＧＦＲ（「Ｚ−ＰＭＯ」）で標的化されたＰＭＯを含んでいた（図１０）。使用したＰＭＯの濃度は、１０ｕＭと２ｕＭを含んでいた。使用した抗ＣＤ７１ｍＡｂ−ＰＭＯの濃度は、０．２ｕＭと０．０４ｕＭを含んでいた。抗ＣＤ７１ｍＡｂ−ＰＭＯは２のＤＡＲを有していた。Ｚ−ＰＭＯは０．２ｕＭの濃度で使用され、２のＤＡＲを有していた。抗ＣＤ７１Ｆａｂ−ＰＭＯの濃度は０．６ｕＭと０．１２ｕＭを含んでいた。０．６ｕＭおよび０．１２ｕＭの抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯの１、２、および、３のＤＡＲを分析した。
図１０を参照すると、トランスフェリン受容体、抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ、および抗ＣＤ７１ Ｆａｂ−ＰＭＯ抱合体を利用する受容体を媒介とする取り込みは、Ｃ２Ｃ１２細胞において、「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度の、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。抗ＣＤ７１抱合体からスキッピングをもたらした試験濃度において、Ｚ−ＰＭＯからの測定可能なエクソン２３スキッピングはなかった。
実施例５。抗−ＣＤ７１−ＡＳＯ ｍＡｂ ＰＳ抱合体のインビトロ活性
実施例３に記載されるように、抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ抱合体を作り、特徴づけた。実施例２に記載される方法と同様の方法を使用し、ネステッドＰＣＲを利用して、分化したＣ２Ｃ１２細胞においてインビトロのエクソンスキッピングを媒介する能力について抱合体を評価した。簡潔に言えば、「ネイキッド」ホスホロチオエートＡＳＯ（ＰＳ ＡＳＯ）の効能を、関連するビヒクル対照を用いて、複数の濃度の抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ抱合体と比較した。ｃＤＮＡ合成後に、２回のＰＣＲ増幅（一次ＰＣＲとネステッドＰＣＲ）を実施して、エクソンスキッピングを検出した。ＰＣＲ反応を４％のＴＡＥアガロースゲル中で分析した（図１１）。図１１は、ＰＭＯ、ＡＳＯ、ＤＡＲ１の結合した抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＡＳＯ（「ＡＳＣ−ＤＡＲ１」）、ＤＡＲ２の結合した抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＡＳＯ（「ＡＳＣ−ＤＡＲ２」）、および、ＤＡＲ３の結合した抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＡＳＯ（「ＡＳＣ−ＤＡＲ３」）のアガロースゲルを示す。「ＰＭＯ」および「ＡＳＯ」は、（抗体に結合していない）遊離ＰＭＯおよびＡＳＯを指す。「Ｖｅｈ」はビヒクルのみを指す。試験した濃度は、０．２、１、および５マイクロモル（μＭ）を含んでいた。
図１１を参照すると、抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＳ ＡＳＯ抱合体は、分化したＣ２Ｃ１２細胞において、「ネイキッド」ＰＳ ＡＳＯ対照よりも低い濃度の、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と、５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３とを有していた。
実施例６：抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビボ活性
実施例３に記載されるように、抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体を作り、特徴づけた。抱合体抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１、２および抗ＣＤ７１ ｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞２を、実施例２に記載される方法と同様の方法を用いて、野生型のＣＤ−１マウスにおけるインビボのエクソンスキッピングを媒介するその能力について評価した。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。
表１２で提供される投与量で、静脈内（ｉｖ）注射によって、ｍＡｂ、ビヒクル対照、およびアンチセンス抱合体（ＡＳＣ）をマウスに投与した。「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指す。「ネイキッド」ＰＭＯを、表１２に提供される投与量で、筋肉内注射によって腓腹筋へと投与した。４、７、あるいは１４日後、心臓および腓腹筋の組織を採取して液体窒素で急速凍結した。ＲＮＡを単離し、逆転写し、ネステッドＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応を４％のＴＡＥアガロースゲル中で分析し、デンシトメトリーによって定量化した。
図１２Ａは、４、７、あるいは１４日間の、抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ１、２、抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞２、抗ＣＤ７１のｍＡｂ、ＰＭＯ、およびビヒクルを投与されたマウスからの腓腹筋サンプルのゲル電気泳動を示す。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と、５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３とを有していた。抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ １、２、および抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞は、腓腹筋において、「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度の、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。ゲル上のバンドの強度（図１２Ａ）は、図１２Ｂで見られるデンシトメトリーによって定量化された。図１２Ｃは、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを使用した、野生型のマウス腓腹筋におけるインビボのエクソンスキッピングの定量化を示す。
図１３Ａは、４、７、あるいは１４日間の、抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ １、２、抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞２、抗ＣＤ７１のｍＡｂ、ＰＭＯ、およびビヒクルを投与されたマウスからの心臓サンプルのゲル電気泳動を示す。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と、５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３とを有していた。ゲル上のバンドの強度（図１３Ａ）は、図１３Ｂで見られるデンシトメトリーによって定量化された。腓腹筋サンプルを用いても同様の結果が得られた。抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ １、２、および抗ＣＤ７１のｍＡｂ−ＰＭＯ ＤＡＲ＞は、腓腹筋において、「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度の、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。
その後、ＤＮＡフラグメントを、４％のアガロースゲルから単離して配列決定した。配列決定データは、図１４で見られるスキッピングされた野生型の生成物における、適切な配列を確認した。
実施例７。配列
表１３は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＤＭＤ遺伝子の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発するための、例示的な標的配列を示す。表１４は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＤＭＤ遺伝子の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発するための、例示的なヌクレオチド配列を示す。表１５および表１６は、遺伝子の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発するための、いくつかの遺伝子における例示的な標的配列を示す。表１７は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、遺伝子の挿入、欠失、複製、あるいは変化を誘発するためのＤＭＤ遺伝子の配列を含む、例示的な配列を説明する。
工程１：マレイミド−ＰＥＧ−ＮＨＳ、その後のｓｉＲＮＡ−ＤＭＤ抱合体との抗体結合
抗ジストロフィン抗体を、１Ｘリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と交換して、最大で５ｍｇ／ｍｌの濃度にした。この溶液に、２当量のＳＭＣＣリンカーあるいはマレイミド−ＰＥＧｘｋＤａ−ＮＨＳ（ｘ＝１、５、１０、２０）を加えて、室温で４時間回転させた。未反応のマレイミド−ＰＥＧを、５０ｋＤａのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびＰＢＳ ｐＨ７．４を使用する回転濾過によって除去した。抗体−ＰＥＧＭａｌ抱合体を集めて、反応容器に移した。表１３−１７に示される配列を使用して、様々なｓｉＲＮＡ抱合体を合成する。ｓｉＲＮＡ−ＤＭＤ抱合体（２当量）をＰＢＳ中の抗体−ＰＥＧマレイミドに室温で加え、夜通し回転させた。反応混合物を分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析すると、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抱合体が見られる。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。抗体−ＰＥＧ−ＤＭＤ抱合体を含む画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。ＳＭＣＣリンカー、ＰＥＧ１ｋＤａ、ＰＥＧ５ｋＤａ、およびＰＥＧ１０ｋＤａを有する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を、ｓｉＲＮＡ負荷に基づいて分離する。
工程３：精製された抱合体の分析
単離した抱合体を、質量スペクトルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかによって特徴付けた。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、分析的ＨＰＬＣによって評価した。
実施例８。追加の配列
表１８は、本明細書に記載される追加のポリ核酸分子配列を示す。
実施例９：トランスフェクトされた初代ヒト骨格筋細胞におけるＤＭＤエクソン４４および４５のスキッピングＰＭＯ
初代のあらかじめ分化したヒト骨格筋細胞（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１１４４０）を、メーカーの説明書に従って、２％のウマ血清および１ｘＩＴＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１９３３２８６）で補充されたＤＭＥＭ中の、１型コラーゲンでコーティングされた２４ウェルプレート（Ｇｉｂｃｏ、＃１９７０７８８）に蒔いた。細胞を３７°Ｃ＋５％のＣＯ２で２日間成長させて、筋管を確立した。その後、これらの細胞を、水中の定義された濃度のＰＭＯおよび２ｕＭのＥｎｄｏポーター（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、＃ＥＰ６Ｐ１−１）で処置し、細胞へのＰＭＯ取り込みを促進した。培地を吸引し、その後、ウェル当たり３００ｕｌのＴＲＩＺＯＬを加えることによって、処置から４８時間後に細胞を収集した。Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ（商標）−９６ ＲＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃Ｒ２０５６）を使用してＲＮＡを調製する前に、細胞を−８０°Ｃで冷凍した。全ＲＮＡ濃度を分光学的で定量化した。１００−２００ｎｇの全ＲＮＡを、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３６８８１３）を使用して逆転写した。ＲＴ ＰＣＲ反応を、２５°Ｃで１０分間、３７°Ｃで１２０分間、８５°Ｃで５分間インキュベートし、その後、４°Ｃで保持した。反応物を水で１：１に希釈した。ゲル電気泳動をエクソンスキッピングの定量化については、全ｍＲＮＡ（スキッピングされた＋スキッピングされていない）およびスキッピングされたｍＲＮＡを表すＤＮＡ断片を、 Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４４４４５５８）および特定のプライマー対（表１９を参照）を使用して、ｑＰＣＲによって増幅した。ｑＰＣＲ反応物を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、９５°Ｃで２０秒間インキュベートし、その後、９５°Ｃで１秒間および６０°Ｃで２０秒間の３２サイクルでインキュベートした。ＰＣＲ産物をＴＡＥローディングバッファーで４：１に希釈し、ＧｅｌＧｒｅｅｎを含有している２４ウェルの４％ＴＡＥゲル（Ｅｍｂｉ Ｔｅｃ， ＃ＧＧ３８０７）に載せた。ＰＣＲ産物を電気泳動（２時間５０Ｖ）によって分離した。全ＤＭＤおよびスキッピングされたＤＭＤ産物に対応するバンドの強度を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用したデンシトメトリーによって定量化した。
Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブが表１９に示される。
全ｈＤＭＤＨｓ０１０４９４０１＿ｍ１、ヒト ＤＭＤ ＶＩＣ−ＭＧＢ， ３６０ ｒｘｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
表２０Ａは、トランスフェクトされた初代ヒト骨格筋細胞におけるＤＭＤエクソン４５を標的とするＰＭＯ（３０ｍｅｒ）のエクソンスキッピング活性を示す。
表２０Ｂは、トランスフェクトされた初代ヒト骨格筋細胞におけるＤＭＤエクソン４４を標的とするＰＭＯ（３０ｍｅｒ）のエクソンスキッピング活性を示す。
図１５は、トランスフェクトされた初代ヒト骨格筋細胞におけるｈＥｘ４５＿Ａｃ９ ＰＭＯの様々な長さのエクソンスキッピング活性を示す。
実施例１０：ヒトＴｆＲ１ ＰＭＯ抱合体の合成および精製
抗ヒトトランスフェリン受容体抗体を産生した。ＰＭＯ（２８−ｍｅｒ）をＧｅｎｅＴｏｏｌｓによって合成した。水中に４当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加えて、３７°Ｃで４時間インキュベートすることによって、ホウ酸塩緩衝液（２５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸、ｐＨ８．０）中のＣＤ７１抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）を還元した。ＤＭＳＯ中の１０当量のＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いてＤＭＳＯ中のＰＭＯ（５０ｍｇ／ｍＬ）を１時間インキュベートすることにより、４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を、ＰＭＯの３’末端で一級アミンに結合させた。３ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過機ユニットを使用した限外濾過により、非結合ＳＭＣＣを除去した。ＰＭＯ−ＳＭＣＣを、緩衝酢酸溶液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０）で３回洗浄して、すぐに使用した。還元された抗体を、２．２５当量のＰＭＯ−ＳＭＣＣと混合し、４°Ｃで夜通しインキュベートした。その後、反応混合物のｐＨを７．５まで減らし、８当量のＮ−エチルマレイミドを室温で３０分間にわたって混合物に加えて、未反応のシステインをクエンチした。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２による反応混合物の分析は、未反応の抗体およびＰＭＯと共に、抗体−ＰＭＯ抱合体を示した。
ＨＩＣ方法１を使用して、反応混合物をＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣで精製した。抱合体に基づいて、１（ＤＡＲ １）、２（ＤＡＲ ２）、および３（ＤＡＲ ３）の薬物対抗体比を有する抱合体のいずれかを含有する画分、あるいは３＋（ＤＡＲ ３＋）または４＋（ＤＡＲ ４＋）の薬物対抗体比を有する抱合体を含有する画分を組み合わせて、５０ｋＤａのＭＷＣＯを有するアミコンウルトラ１５遠心式フィルターユニットで濃縮した。濃縮抱合体を、分析の前に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法−１
１．カラム：ＧＥ、ＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ、４．７ｍｌ
２．溶媒Ａ：５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、０．７Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０；溶媒Ｂ：８０％の５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、２０％のＩＰＡ、ｐＨ７．０；流速：１．０ｍＬ／分
３．勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １
ｃ．７０ ３０ ２５
ｄ．０ １００ １
ｅ．０ １００ ２
ヒトトランスフェリン受容体へのｈＴｆＲ１．ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体の結合
抗体抱合体（ＡＯＣ）結合をＥＬＩＳＡによって測定した。組換えヒトトランスフェリン受容体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １１０２０−Ｈ０７Ｈ）を、高結合プレート （Ｃｏｓｔａｒ ３６９０） 上に、ＰＢＳ中の１ｎｇ／ｕＬで夜通しコーティングした。プレートを洗浄し、ＡＯＣまたはｍＡｂのサンプルを最大１０ｎＭの濃度で加えた。着色剤は、ＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ １０９−０３５−００６）および２Ｎ硫酸で止められたＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３４０２８）によって開発された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＫｄを決定した。
図１６は、ヒトトランスフェリン受容体へのｈＴｆＲ１．ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビトロでの結合を例証する。
初代ヒト骨格筋細胞におけるＴｆＲ１ ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体の活性
初代のあらかじめ分化したヒト骨格筋細胞（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１１４４０）を、メーカーの説明書に従って、２％のウマ血清および１ｘＩＴＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１９３３２８６）で補充されたＤＭＥＭに、１型コラーゲンでコーティングされた２４ウェルプレート（Ｇｉｂｃｏ、＃１９７０７８８）に蒔いた。細胞を３７°Ｃ＋５％のＣＯ２で２日間成長させ、筋管を確立した。健康なドナー（Ｍｙｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｒｉｓ）の不死化ヒト骨格筋細胞を、５％のＦＢＳで補充された骨格筋細胞増殖培地（Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｃ−２３１６０）中の１型コラーゲンでコーティングされた２４ウェルプレート（Ｇｉｂｃｏ、＃１９７０７８８）上で蒔いた。筋芽細胞が培養密度に達した後、ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７５０−０４５）およびインスリン（１０ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、９１０７７）で補充されたＤＭＥＭを含有する分化培地において筋管形成を誘発した。その後、それぞれの培地中の定義された濃度のＡＯＣで筋管を処置した。培地を吸引し、その後、ウェル当たり３００ｕｌのＴＲＩＺＯＬを加えることによって、処置から７２時間後に細胞を収集した。例９に記載されるように、ＤＭＤエクソンスキッピングのＲＮＡ単離および定量化を実施した。
図１７は、初代ヒト骨格筋細胞におけるｈＴｆＲ１．ｍＡｂ−ＰＭＯ（２８−ｍｅｒ）抱合体のエクソンスキッピング活性を示す。
図１８は、初代の不死化ヒト骨格筋細胞の筋管におけるｈＴｆＲ１．ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のエクソンスキッピング活性を示す。
本開示の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは、当業者に明らかであろう。多くの変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、ならびに、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造はそれによって包含されることが、意図されている。

Claims (75)

  1. ＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体転写産物の標的領域にハイブリダイズする少なくとも１つのポリ核酸分子と結合する標的細胞結合部分を含む、ポリ核酸抱合体であって、
    ここで、少なくとも１つのポリ核酸分子は、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物を生成するためにｍＲＮＡ前駆体転写産物からエクソンのスプライシングアウトを誘発する、ポリ核酸抱合体。
  2. 機能性ジストロフィンタンパク質は、ジストロフィンタンパク質からの切断された形態である、請求項１に記載のポリ核酸抱合体。
  3. 標的領域はエクソン−イントロン接合部にあり、エクソンは、スプライシングアウトされることになっているエクソンである、請求項１に記載のポリ核酸抱合体。
  4. エクソンは、エクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５である、請求項３に記載のポリ核酸抱合体。
  5. エクソン−イントロン接合部は、スプライシングアウトされることになっているエクソンの５’に位置する、請求項３に記載のポリ核酸抱合体。
  6. 標的領域はエクソン−イントロン接合部の上流のイントロン領域である、請求項５に記載のポリ核酸抱合体。
  7. 標的領域は、エクソン−イントロン接合部の約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、あるいは１０ヌクレオチド上流である、請求項５または６に記載のポリ核酸抱合体。
  8. エクソン−イントロン接合部は、スプライシングアウトされることになっているエクソンの３’に位置する、請求項３に記載のポリ核酸抱合体。
  9. 標的領域はエクソン−イントロン接合部の下流のイントロン領域である、請求項８に記載のポリ核酸抱合体。
  10. 標的領域は、エクソン−イントロン接合部の約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、あるいは１０ヌクレオチド下流である、請求項８または９に記載のポリ核酸抱合体。
  11. 標的細胞結合部分は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、あるいは８以上のポリ核酸分子に結合する、請求項１−１０のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  12. ポリ核酸分子は、約１０から約５０ヌクレオチド長さを含む、請求項１−１０のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  13. ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５から選択された配列に対して、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む、請求項１−１２のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  14. ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６４−１２８５から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む、請求項１−１３のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  15. ポリ核酸分子はさらに、１、２、３、あるいは４つのミスマッチを含む、請求項１−１４のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  16. ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０９４、１１４７−１１６２、または、１１７３−１２１１から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む、請求項１−１５のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  17. ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０７６から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む、請求項１６に記載のポリ核酸抱合体。
  18. ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７７−１０９４から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む、請求項１６に記載のポリ核酸抱合体。
  19. ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４７−１１６２から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む、請求項１６に記載のポリ核酸抱合体。
  20. ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７３−１２１１から選択された塩基配列の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、またはそれ以上の隣接する塩基を含む、請求項１６に記載のポリ核酸抱合体。
  21. 結合部分は抗体を含む、請求項１−１９のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  22. 抗体は抗トランスフェリン抗体を含む、請求項２１に記載のポリ核酸抱合体。
  23. 結合部分は血漿タンパク質を含む、請求項１−１９のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  24. ポリ核酸抱合体は、
    Ａ−（Ｘ１−Ｂ）ｎ
    式（∨）
    を含み、
    式中、
    Ａは結合部分を含み；
    Ｂはポリ核酸分子からなり；
    Ｘ１は単結合あるいは第１の非高分子リンカーからなり；および、
    ｎは１−１２から選択された平均値である、請求項１−２３のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  25. ポリ核酸分子は、パッセンジャー鎖とガイド鎖とを含む、請求項１−２４のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  26. ガイド鎖は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、少なくとも１つの逆脱塩基部分、少なくとも１つの５’−ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  27. ガイド鎖は、約２、３、４、５、６、７、８、あるいは９つのホスホロチオエート修飾された非天然のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  28. ガイド鎖は、１つのホスホロチオエート修飾された非天然のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  29. ホスホロチオエート修飾された非天然のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド間結合に位置する、請求項２６−２８のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  30. 少なくとも１つの５’−ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチドは、ガイド鎖の５’末端から、約１、２、３、４、あるいは５つの塩基離れて位置する、請求項２６に記載のポリ核酸抱合体。
  31. 少なくとも１つの５’−ビニルホスホネート修飾された非天然のヌクレオチドは、２’−位置でさらに修飾される、請求項２６または３０に記載のポリ核酸抱合体。
  32. ２’−修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾されたヌクレオチドから選択される、請求項３１に記載のポリ核酸抱合体。
  33. パッセンジャー鎖は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  34. パッセンジャー鎖は、１００％ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー修飾された非天然のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  35. パッセンジャー鎖はガイド鎖よりも長さが短く、それによって、５’オーバーハング、３’オーバーハング、あるいはこれらの組み合わせを生成する、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  36. パッセンジャー鎖はガイド鎖と長さが等しく、それによって、ポリ核酸分子の各末端で平滑末端を生成する、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  37. ポリ核酸分子はホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー／ＲＮＡヘテロ二本鎖である、請求項３５または３６に記載のポリ核酸抱合体。
  38. パッセンジャー鎖は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  39. パッセンジャー鎖は、１００％ペプチド核酸修飾された非天然のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  40. パッセンジャー鎖はガイド鎖よりも長さが短く、それによって、５’オーバーハング、３’オーバーハング、あるいはこれらの組み合わせを生成する、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  41. パッセンジャー鎖はガイド鎖と長さが等しく、それによって、ポリ核酸分子の各末端で平滑末端を生成する、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  42. ポリ核酸分子はペプチド核酸／ＲＮＡヘテロ二本鎖である、請求項４０または４１に記載のポリ核酸抱合体。
  43. パッセンジャー鎖はＡ−Ｘ１に結合される、請求項２５に記載のポリ核酸抱合体。
  44. Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の５’末端に結合される、請求項４３に記載のポリ核酸抱合体。
  45. Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の３’末端に結合される、請求項４３に記載のポリ核酸抱合体。
  46. Ｘ１は単結合である、請求項２４または４３−４５のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  47. Ｘ１はＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項２４または４３−４５のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  48. Ｘ１は、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に結合された、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである、請求項２４または４３−４５のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  49. さらにＣを含む、請求項１に記載のポリ核酸抱合体。
  50. Ｃはポリエチレングリコールである、請求項４９に記載のポリ核酸抱合体。
  51. ＣはＸ２を介して直接Ｂに結合される、請求項２４−５０のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  52. Ｘ２は単結合あるいは第２の非高分子リンカーからなる、請求項５１に記載のポリ核酸抱合体。
  53. Ｘ２は単結合である、請求項５２に記載のポリ核酸抱合体。
  54. Ｘ２はＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項５２に記載のポリ核酸抱合体。
  55. Ｘ２は、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に結合された、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである、請求項５２に記載のポリ核酸抱合体。
  56. パッセンジャー鎖はＡ−Ｘ１とＸ２−Ｃに結合される、請求項１−５５のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  57. Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の５’末端に結合され、Ｘ２−Ｃはパッセンジャー鎖の３’末端に結合される、請求項１−５６のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  58. Ｘ２−Ｃはパッセンジャー鎖の５’末端に結合され、Ａ−Ｘ１はパッセンジャー鎖の３’末端に結合される、請求項１−５６のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  59. ポリ核酸抱合体は、
    Ａ−Ｘ１−（Ｂ−Ｘ２−Ｃ）ｎ
    式（ＶＩ）
    を含み；
    式中、
    Ａは結合部分を含み；
    Ｂはポリ核酸分子からなり；
    Ｃはポリマーからなり；
    Ｘ１は単結合あるいは第１の非高分子リンカーからなり；
    Ｘ２は単結合あるいは第２の非高分子リンカーからなり；および、
    ｎは１−１２から選択された平均値である、請求項１−５８のいずれか１つに記載のポリ核酸抱合体。
  60. さらにＤを含む、請求項１に記載のポリ核酸抱合体。
  61. Ｄはエンドソーム溶解部分である、請求項６０に記載のポリ核酸抱合体。
  62. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８あるいは１０８７−１０８９から選択された塩基配列の少なくとも２３の隣接する塩基を含むポリ核酸分子であって、ここで、ポリ核酸分子は５０以下のヌクレオチド長さを含む、ポリ核酸分子。
  63. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５６−１０５８を含むポリ核酸分子であって、ここで、ポリ核酸分子は５０以下のヌクレオチド長さを含む、ポリ核酸分子。
  64. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８７−１０８９を含むポリ核酸分子であって、ここで、ポリ核酸分子は５０以下のヌクレオチド長さを含む、ポリ核酸分子。
  65. 請求項１−６１のポリ核酸抱合体、あるいは、請求項６２−６４のポリ核酸分子；および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
  66. 前記医薬組成物は全身送達のために製剤化される、請求項６５に記載の医薬組成物。
  67. 前記医薬組成物は非経口投与のために製剤化される、請求項６５または６６に記載の医薬組成物。
  68. 被験体の欠損ｍＲＮＡを特徴とする疾患または疾病を処置する方法であって、
    前記方法は、
    機能性タンパク質をコードするプロセシングされたｍＲＮＡを生成するために欠損ｍＲＮＡを引き起こすエクソンのスキッピングを誘導するべく、請求項１−６１のポリ核酸抱合体、あるいは、請求項６２−６４のポリ核酸分子を、被験体に投与する工程であって、それによって、被験体の疾患または疾病を処置する、工程、を含む、方法。
  69. 前記疾患または疾病が、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患である、請求項６８に記載の方法。
  70. 神経筋疾患が筋ジストロフィーである、請求項６９に記載の方法。
  71. 筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーである、請求項７０に記載の方法。
  72. 被験体の筋ジストロフィーを処置する方法であって、前記方法は：
    請求項１−６１のポリ核酸抱合体、あるいは、請求項６２−６４のポリ核酸分子を被験体に投与する工程であって、それによって、被験体の筋ジストロフィーを処置する、工程、を含む、方法。
  73. 筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項７２に記載の方法。
  74. 被験体はヒトである、請求項１−７３のいずれか１つに記載の方法。
  75. 請求項１−６１のポリ核酸抱合体あるいは請求項６２−６４のポリ核酸分子を含む、キット。
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