JP3950480B2 - 脊髄小脳変性症2型の原因遺伝子の検出方法及びそのためのプライマー - Google Patents
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Description
本発明は、脊髄小脳変性症2型(以下、「SCA2」ということがある)の原因遺伝子の検出方法及びそのためのプライマーに関する。
背景技術
SCA2は、小脳及び中枢神経系の他の領域に影響を与える、常染色体性優性神経変性症である。
最近、歯状赤核小脳委縮(dentatorubral-pallidoluysian atrophy(DRPLA))等5種類の神経変性疾患において、原因遺伝子にはCAGから成るトリプレットの反復数が正常な遺伝子よりも多く含まれていることが明らかになった。すなわち、これらの神経変性疾患患者の原因遺伝子では、CAGの反復数が37〜100回であるのに対し、正常な遺伝子では35未満である。
SCA2についても、原因遺伝子ではCAGの反復数が増大していることが示唆されている(Trottier, Y. et al. Nature, 378, 403-406(1995))。しかしながら、SCA2の原因遺伝子は同定されておらず、その塩基配列も明らかではないので、SCA2を遺伝子検査により診断することはできない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、SCA2の原因遺伝子を検出する方法及びそのためのプライマーを提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、CAG反復単位を55個含む、32Pで標識された一本鎖DNAプローブ(以下、このプローブを「(CAG)55プローブ」ということがある)を用い、SCA2患者及び健常人のゲノミックDNAを各種制限酵素で切断してサザンブロットを行った結果、SCA2患者においてのみ、2.5kbのTspEI断片が検出されることがわかった。なお、(CAG)55プローブは、ハイブリダイゼーションの条件を適正に設定することにより、CAG反覆単位を約35個以上有するDNA領域とのみ選択的に部分的にハイブリダイズする。上記2.5kbのTspEI断片をクローニングしてその部分塩基配列を決定した。一方、クローニングされたDNA断片をプローブとして用いて健常人のゲノミックDNAをサザン分析することにより、正常な遺伝子が得られ、その塩基配列を決定した。SCA2患者の遺伝子と正常遺伝子を比較したところ、CAG反復単位の数が異なっており、かつその他はほとんど同一であった。CAG反復を挟むようにプライマーを設定してPCRを行い、PCR産物のサイズを測定することにより、PCR産物中のCAG反復単位の数を決定した。SCA2染色体34種及び正常染色体286種についてCAG反復単位の数を測定したところ、SCA2遺伝子ではCAG反復単位の数が全て35個以上であったのに対し、正常遺伝子では15〜24個であった。従って、このCAG反復単位の数を測定することにより、SCA2の遺伝子診断が可能である。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号1に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする15〜50塩基サイズの第1のプライマーと、配列表の配列番号2に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする15〜50塩基のサイズの第2のプライマーとを用いて、ヒトから採取した被検DNAを鋳型としてPCRを行い、増幅されたPCR産物中のCAGの反復数を調べることから成る、脊髄小脳変性症2型の原因遺伝子の検出方法を提供する。また、本発明は、上記方法に用いられる、上記第1のプライマー及び第2のプライマーも提供する。
本発明により、SCA2の遺伝子診断が初めて可能になった。従って、本発明はSCA2の診断に大いに貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
図1は、SCA2の原因となる遺伝子の塩基配列を示す図である。
図2は、実施例に用いたゲノミックDNAの提供者であるSCA2患者の人達の家系図である。
図3は、正常な対立遺伝子に由来するゲノミックDNA断片であるTsp-2の制限酵素地図を示す図である。
図4は、同じくTsp-2の塩基配列を、各プライマーのハイブリダイズ領域とともに示す図である。
図5は、正常遺伝子及びSCA2遺伝子中のCAG反復領域及びその直後の塩基配列を示す図である。
図6は、本発明の方法により測定された、正常遺伝子及びSCA2遺伝子中のCAG反復単位の数の分布を示す図である。
図7は、CAG反復単位の数とSCA2の発病年令の相関関係を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
下記実施例において詳述するように、本発明によりSCA2の原因遺伝子の部分塩基配列が決定された。さらに、健常人の対応する遺伝子の部分塩基配列も決定された。これらを比較すると、SCA2原因遺伝子と正常な遺伝子とでは、その中に含まれるCAGトリプレットの反復回数が異なっていることが判明した。すなわち、下記実施例に詳述するように、多数のSCA2患者遺伝子及び健常人遺伝子について調査した結果、SCA2遺伝子ではCAG反復単位の数が35個ないし55個であったのに対し、健常人では15個ないし24個であり、94.4%の人は22個であった。従って、このCAG反覆単位の数を調べることにより、SCA2の診断を行なうことができることが明らかになった。
本発明により決定されたSCA2の発病に関与する遺伝子の塩基配列は図1に示されている。図1中、(CAG)nで示される部分がCAGトリプレットの反覆部分を示す。また、(CCG CCG CAG)の部分はSCA2遺伝子中に含まれる場合も含まれない場合もあり、また、正常遺伝子中には含まれない配列である。塩基が大文字で記載されている部分がデノミックDNA及びcDNAの両方から決定された塩基配列の部分であり、小文字で記載されている部分がゲノミックDNAから決定された塩基配列の部分である。なお、ゲノミックDNAとcDNAで配列が異なっている部位の塩基配列は上下2段に示し、上側にcDNAから決定された配列が記載されている。
下記実施例で詳細に述べるように、細かい相違点は他にもあるものの、SCA2遺伝子と正常な遺伝子との主な相違点は図1中、(CAG)nで示されるCAG反覆単位の数である。従って、このCAG反覆単位の数を調べることにより、SCA2の診断を行なうことができる。
本発明の方法では、このCAG反覆単位の数を調べるために、図1中のCAG反覆領域を挟む部分をPCRで増幅する。このためには、CAG反覆領域の上流及び下流にそれぞれプライマーを設定し、PCRを行なえばよい。
CAG反覆領域の上流部分の塩基配列が配列表の配列番号1に、下流部分の塩基配列が配列番号2に記載されている。これらの領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部分にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行なう。プライマーは、これらの領域中のどの領域とハイブリダイズするものであってもよい。プライマーのサイズは特に限定されないが、通常15〜50塩基、好ましくは18〜25塩基程度である。
これらのプライマーを用い、検体DNAを鋳型として用いてPCRを行なう。検体DNAとしては、SCA2か否かを診断しようとする人から採取したDNAであり、これは末梢血などから常法により容易に調製することができる。また、図1中のCAG反覆領域の上流及び下流域であって、塩基配列が大文字で記載されている部分にプライマーを設定した場合には、ゲノミックDNAのみならず、cDNAも鋳型として用いることができる。PCRの方法自体はこの分野において周知であり、そのためのキットも市販されているから容易に行なうことができる。下記実施例にもPCRの詳細が記載されている。
次いで、増幅されたPCR産物中のCAG反覆単位の数を調べる。これは、例えば、PCR産物の塩基配列を決定することにより行なうことができる。あるいは、適当なマーカーとともにゲル電気泳動を行ない、PCR産物のサイズを決定することにより行なうこともできる。後述の実施例では、CAG反覆単位の数が少しずつ異なるSCA2遺伝子を作製し、これらをサイズマーカーとして用いてゲル電気泳動を行なうことによりPCR産物のサイズを決定し、ひいてはその中に含まれるCAG反覆単位の数を測定した。なお、PCR産物中のCAG反覆単位の数を調べる方法はこれらに限定されるものではなく、CAG反覆単位の数を測定することができる方法であればどのような方法を用いてもよい。さらに、CAG反覆単位の数が約35個以上か否かを識別するだけの方法でもよい。このような方法も本発明でいう「CAG反覆単位の数を調べる」方法に包含される。例えば、上記した(CAG)55プローブのようなプローブを用い、該プローブが約35個以上のCAG反覆単位を有するDNAとのみ部分的にハイブリダイズする条件でPCR産物とハイブリダイズさせることもできる。
実施例
以下、実施例に基づき本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、下記実施例は例示のためにのみ記載するものであり、如何なる意味においても限定的に解釈されてはならない。
参考例1 (CAG)55プローブの調製
CAG反覆単位を50個含むDRPLA遺伝子(Koide, R. et al., Nature Genet., 6, 9-13(1994))をDRPLA患者のゲノミックDNAから増幅し、プラスミドベクターpT7Blue T(p-2093)にサブクローニングした。p-2093は、(CAG)55及びその両端のフランキング配列を含む。すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA(CAG)55 CAT CAC GGA AAC TCT GGG CC-3'で表される配列を含む。一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA CA-3'及び5'-ビオチン-GGC CCA GAG TTT CCG TGA TG-3'を用いてPCRを行なった。PCRは、10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2M N,N,N-トリメチルグリシン、0.1mM TTP, 0.1Mm dCTP, 0.1mM dGTP, 9.25MBqの[α-32P]dATP(222TBq/mmol),0.5mMずつの各プライマー、0.3ngのプラスミドDNA(p-2093)及び2.0UのTaq DNAポリメラーゼ(日本国京都府の宝酒造社製)を含む全量16μlの溶液を用いて行った。最初に94℃で2分間変性を行った後、94℃、1分の変性、54℃、1分のアニーリング、72℃、3分の伸長を30サイクル行い、最後に72℃で10分間伸長を行った。
ストレプトアビジンを被覆した磁化ビーズ(Dynabeads M-280, Streptavidin;Dynal AS, Oslo, Norway)を用いて一本鎖(CAG)55プローブを調製した。すなわち、PCR産物をストレプトアビジン被覆磁化ビーズに吸着させた後、5mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5mM EDTA及び1M NaClを含む40μlの溶液でビーズを洗浄した。次いで50μlの0.1M NaOH溶液中で10分間インキュベートすることにより、放射標識された非ビオチン化鎖をビオチン化鎖から分離した。得られた上清をプローブ液としてそのまま下記ハイブリダイゼーションに用いた。
なお、上記のようにして調製した一本鎖(CAG)55プローブを用いて、CAG反復単位数が9、22、43、51であるアンドロゲンレセプター遺伝子についてサザン分析を行ったところ、(CAG)55プローブはCAG反復単位が43及び51個の遺伝子とは強くハイブリダイズしたが、22個の遺伝子とはほとんどハイブリダイズせず、9個の遺伝子とは全くハイブリダイズしなかった(K. Sanpei et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications, Vo1.212, No.2, 1995, pp.341-346)。すなわち、このプローブを用いれば、ハイブリダイゼーション条件を適正に設定することにより、CAG反復単位を多数(例えば35個以上)含むDNAとのみ特異的にハイブリダイズさせることが可能である。
実施例1 SCA2遺伝子の塩基配列決定
図2には、SCA2患者の家系図を示す。この家系図において、男性が四角、女性が丸で示されており、患者は黒く塗りつぶされており、健常人は白抜きで示されている。
これらのSCA2患者及び健常人から常法により採取した高分子量ゲノミックDNA(各15μg)を100UのTspEI(日本国大阪府の東洋紡績社製)で消化し、1.0%アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、該膜を上記(CAG)55プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、2.75 x SSPE(1 x SSPE=150mM NaCl, 10mM NaH2PO4, 1mM EDTA), 50%ホルムアミド、5xデンハルツ液、100ng/ml剪断サケ***DNA及び(CAG)55プローブ(6 x 106cpm/ml)を含む溶液中で62℃で18時間行った。ハイブリダイゼーション後、0.5% SDSを含む1 x SSC(150mM NaCl, 15mMクエン酸ナトリウム)で膜を65℃で0.5時間洗浄した。次いで、MS増感スクリーンを用い、Kodak Bio Max MSフィルムに16時間−70℃でオートラジオグラフィーにかけた。
その結果、全てのSCA2患者についてのみ、プローブとハイブリダイズした2.5kbpのTspEI断片が検出された。
そこで、一人のSCA2患者(図2中の7)からゲノミックDNAを常法により抽出し、その270μgをTspEIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけた。上記した2.5kbのTspEI断片を包含するデノミックDNA断片を、EcoRIで開裂したλZAPIIベクターにクローニングした。得られたゲノミックライブラリーを上記(CAG)55プローブを用い、上述したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせることによりスクリーニングした。増大したCAG反復を含むゲノミッククローンTsp-1が単離された。
プローブを除去した後、ランダムプライム法により標識したTsp-1をプローブとして用いて上記ゲノミックライブラリーを再度スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは5 x SSC, 1 x デンハルツ液、10%硫酸デキストラン、20mMリン酸ナトリウム、400μg/mlのヒト胎盤DNA及びTsp-1プローブを含む溶液中で42℃で18時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.1 x SSC-0.1% SDS中で52℃で0.5時間洗浄した。MS増感スクリーンを用い、膜をKodak Bio Max MSフィルムに−70℃で24時間オートラジオグラフィにかけた。その結果、正常な対立遺伝子由来のゲノミッククローンであるTsp-2が単離された。
Tsp-2の制限酵素地図を図3に示す。CAG反復(白抜きボックス)は推定的な第1エクソン(黒塗りボックス)中にある。
また、Tsp-2のSmaI-ApaI断片(630bp)の塩基配列を決定した。これを図4及び配列表の配列番号3に示す。図4中、塩基が大文字で記載されている部分がゲノミックDNA及びcDNA(後述)の両方から決定された塩基配列の部分であり、小文字で記載されている部分がゲノミックDNAから決定された塩基配列の部分である。なお、ゲノミックDNAとcDNAで配列が異なっている部位の塩基配列は上下2段に示し、上側にcDNAから決定された配列が記載されている。推定アミノ酸配列が塩基配列の下に記載されている。翻訳は、推定的第1エクソンの最も長いオープンリーディングフレーム中のATGコドンから始まった。
ヒト大脳皮質cDNAライブラリー(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)をオリゴヌクレオチドF−1及びR−1をプローブとして用いてスクリーニングした。F−1及びR−1がハイブリダイズする部位は図4に示すように、CAG反復領域を挟むように設定されている。ハイブリダイゼーションは、6 x SSC, 10 x デンハルツ液、0.5% SDS, 0.05%ピロリン酸ナトリウム、100ng/ml剪断サケ***DNA及び末端標識オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液中で55℃で18時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.5% SDS及び0.05%ピロリン酸ナトリウムを含む6 x SSC中で55℃で0.5時間洗浄した。両方のプローブとハイブリダイズするクローンFc-1が得られた。このcDNAの5’末端を同定するために、5'-RACE-Ready cDNA(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)を用いて5'-RACEを行った。プライマーR−1を第1のPCRに用い、プライマーR−2(図4参照)を第2のPCRに用いた。なお、forward側のプライマーとしてはいずれの場合もF−1(図4参照)を用いた。350bpの5'-RACE産物をpT7Blue Tベクターにサブクローニングした(5'-RACE-1)。5'-RACE-1の同一性は、Fc-1,Tsp-1及びTsp-2の塩基配列とのオーバーラップにより確認した。塩基配列は二本鎖プラスミドDNAを用いたジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により決定した。
さらに、SCA2患者及び健常人からのゲノミックDNAから得られたF−1(forward側)及びR−1(reverse側)をプライマーとして用いたPCRにより得られたPCR産物を、プラスミドベクターpT7Blueにクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果を図5に示す。
図5に示されるように、健常人ではCAG反復領域の中に1個又は2個のCAAが含まれているが、SCA2患者ではこれが存在しない。また、SCA2患者では、CAG反復領域の直後にCCG CCG CAGが挿入されている場合がある。
実施例2 検体中のCAG反復単位数の測定
プライマーF−1及びR−1を用いて得られたPCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、CAG反復単位の数を測定した。PCRは、10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 2.0mM MgCl2, 1.7M N,N,N-トリメチルグリシン、111KBqの[α-32P]dCTP(111Tbq/mmo1), 30μM dCTP,各200μMのdATP, dGTP及びTTP,各0.25μMの上記2種類のプライマー、200ngのゲノミックDNA並びに1.25UのTaq DNAポリメラーゼを含む全量10μlの溶液中で行った。まず、95℃、2分間変性を行った後、95℃、1分間の変性、60℃、1分間のアニーリング及び72℃、1分間の伸長からなるサイクルを32回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長を行った。SCA2遺伝子のクローン化されたゲノミック領域を用いて得られた、種々のサイズのCAG反復単位を含む配列ラダー(sequence ladder)をサイズマーカーとして用いた。CAG反復領域中にCAAを含む正常な対立遺伝子の場合には、これらのCAA単位はCAG反復サイズに含めた。CAG領域が増大しているSCA2対立遺伝子の場合、CAG領域直後の上記挿入配列はCAG領域のサイズには含めなかった。
上記の方法により、健常人(286染色体)及び10家系のSCA2患者(34種のSCA2染色体)におけるCAG反復単位数を測定した。結果を図6に示す。図6中、白抜きの棒グラフが正常遺伝子についての結果を示し、黒塗りの棒グラフがSCA2遺伝子についての結果を示す。
図6から明らかなように、正常遺伝子ではCAG反復単位の数が全て24個以下であるのに対し、SCA2遺伝子では全て35個以上であった。よって、本発明の方法により、SCA2の遺伝子診断が可能であることが立証された。
さらに、上記で測定されたCAG反復単位数と、SCA2の発病年令の相関関係を図7に示す。その結果、統計学的に負の相関が認められた。このことから、CAG反復単位の数の増大がSCA2の発病と関係していることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明により、SCA2の遺伝子検査が初めて可能になった。従って、本発明はSCA2の診断に大いに貢献するものと期待される。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:355
配列の型:核酸
鎖の数:2
配列
配列番号:2
配列の長さ:205
配列の型:核酸
鎖の数:2
配列
配列番号:3
配列の長さ:623
配列の型:核酸
鎖の数:2
配列
配列番号:4
配列の長さ:213
配列の型:核酸
鎖の数:1
配列
配列番号:5
配列の長さ:20
配列の型:核酸
配列
配列番号:6
配列の長さ:20
配列の型:核酸
配列
配列番号:7
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配列の型:核酸
配列
配列番号:8
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配列
配列番号:9
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配列
配列番号:10
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配列
配列番号:11
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配列の型:核酸
配列
配列番号.:12
配列の長さ:78
配列の型:核酸
配列
Claims (10)
- 配列表の配列番号1に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする15〜50塩基のサイズの第1のプライマーと、配列表の配列番号2に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする15〜50塩基のサイズの第2のプライマーとを用いて、ヒトから採取した被検DNAを鋳型としてPCRを行い、増幅されたPCR産物中のCAGの反復数を調べることから成る、脊髄小脳変性症2型の原因遺伝子の検出方法。
- 前記プライマーのサイズが18〜25塩基である請求項1記載の方法。
- 前記PCR産物中のCAGの反復数は、該PCR産物のサイズを測定することにより行われる請求項1又は2記載の方法。
- 前記PCR産物中のCAGの反復数は、該PCR産物の塩基配列を決定することにより行われる請求項1又は2記載の方法。
- 被検DNAはゲノミックDNAである請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 被検DNAはcDNAである請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 配列表の配列番号1に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする核酸から成り、サイズが15〜50塩基である、請求項1ないし6の方法に用いられるプライマー。
- 前記サイズが18〜25塩基である請求項7記載のプライマー。
- 配列表の配列番号2に示される塩基配列の一部分とハイブリダイズする核酸から成り、サイズが15〜50塩基である、請求項1ないし6の方法に用いられるプライマー。
- 前記サイズが18〜25塩基である請求項9記載のプライマー。
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