CN112004533A - 治疗运动障碍的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于治疗运动障碍的方法和组合物，该运动障碍包括神经肌肉疾病、肌肉损伤和痉挛相关病症。治疗方法包括减少骨骼肌收缩以通过抑制骨骼肌肌球蛋白II来减少肌肉受损。

Description

治疗运动障碍的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年2月20日提交的美国临时申请序列号62/632,957和于2018年11月6日提交的美国临时申请序列号62/756,513的权益，这些申请通过引用并入本文。
背景技术
骨骼肌是人体最大的器官***，主要有两个作用。第一个是力量产生以使肌肉收缩、运动和保持姿势；第二个是葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代谢。在日常活动和锻炼期间，骨骼肌的收缩自然与肌肉压力、分解和重塑有关，这对肌肉适应至关重要。在患有神经肌肉疾病例如Duchenne型肌营养不良症(DMD)的个体中，肌肉收缩会导致身体难以修复的连续几轮放大的肌肉分解。最终，随着患者年龄的增长，出现了一种病理生理过程，在肌肉中导致过度的炎症、纤维化以及脂肪堆积，预示着身体机能的急剧下降以及死亡率的增加。
DMD是一种影响骨骼肌的遗传疾病，其特征是进行性肌肉变性和无力。仍然需要减少患有神经肌肉疾病例如DMD的患者的肌肉分解的治疗。
发明内容
在一些方面，本文描述了治疗神经肌肉疾病的方法。该方法可以包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂。骨骼肌收缩抑制剂的施用量可以少于将骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前骨骼肌收缩能力减少90％所需的量。
在一些方面，治疗神经肌肉疾病的方法可以包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂。骨骼肌收缩抑制剂可以以将骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前骨骼肌收缩能力减少5％至75％的量施用。
在一些方面，所述骨骼肌收缩抑制剂可以以将肌酐激酶相对于所述受试者的治疗前肌酐激酶水平调节5-90％的量施用。
在一些方面，所述骨骼肌收缩抑制剂可以以调节炎性标志物的量施用。所述炎性标志物可以选自IL-1、IL-6和TNF-α或可使用磁共振成像测量的病症，例如水肿，所述炎性标志物相对于所述受试者的治疗前值为5％至90％。
在一些方面，所述骨骼肌收缩抑制剂在离体测定中将骨骼肌收缩减少5％至90％。在所述离体测定中，(a)可以将从mdx小鼠解剖的趾长伸肌安装在电磁牵引器上，并可以将所述肌肉浸泡在含氧Kreb溶液中以维持肌肉功能；(b)可以将测试化合物施加于所述肌肉；(c)可以执行等长收缩步骤，其中可以用一系列的五到六个电脉冲刺激所述肌肉；(d)可以执行离心收缩步骤，其中所述肌肉可以在80-125Hz下电刺激0.35-0.7秒，并被拉伸到比其在80-125Hz下电刺激0.35-0.7秒的静止长度大10％至20％，并且在每个脉冲之后，可以测量由肌肉收缩产生的力；(e)在步骤(d)中从所述第一脉冲到所述第五脉冲至所述第六脉冲由所述肌肉收缩产生的力的变化可以计算为测试力下降，并与在没有暴露于所述测试化合物的对照样品中从所述第一脉冲到所述第六脉冲由所述肌肉收缩产生的力变化(对照力下降)进行比较。也可以在等长收缩或离心收缩后，通过将肌肉在活性橙中温育来测量肌膜受损。活性橙是一种被带有膜损伤的肌肉纤维吸收的荧光染料。然后通过组织学定量染料阳性纤维的数量或比例。当测试力下降和/或染料阳性纤维的比例比对照力下降和/或染料吸收少至少20％时，可以选择测试化合物作为骨骼肌收缩的抑制剂。
在一些方面，所述骨骼肌收缩抑制剂在测定中抑制ATP酶活性。在对照容器和测试容器中可以将肌球蛋白S1片段与聚合的肌动蛋白温育。可以将测试化合物和MgATP添加到所述测试容器中的混合物中，并可以将MgATP添加到所述对照容器中。可以将所述测试容器中在限定的时间段内的ATP消耗量与所述对照容器中的ATP消耗量进行比较。所述限定的时间段可以是5分钟到20分钟。ATP消耗可能与NAD+的产生相关。在一些情况下，如果与所述对照容器相比，所述测试容器中的ATP消耗减少至少20％，则可以选择所述测试化合物作为骨骼肌收缩的抑制剂。
在一些方面，治疗神经肌肉疾病的方法可以包括测量受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力。可以向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂。可以在施用所述骨骼肌收缩抑制剂后，测量所述受试者的心肌收缩或所述心肌收缩的力。所述受试者中的心肌收缩可以与相对于治疗前能力的所述心肌收缩相差10％以内。
在一些实施方案中，所述神经肌肉疾病可以选自Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、肌强直性营养不良症1、肌强直性营养不良症2、面肩肱型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、肌腱炎、腕管综合征。
在一些实施方案中，所述肌肉收缩抑制剂可以选自肌球蛋白抑制剂。在一些实施方案中，所述肌球蛋白抑制剂可以是骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。
在一些方面，治疗运动障碍的方法可以包括向有此需要的受试者施用骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。在一些实施方案中，所述运动障碍包括肌肉痉挛。在一些实施方案中，所述肌肉痉挛可以选自与多发性硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病，或脑瘫，或损伤，或创伤性事件诸如中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、低氧、脑膜炎、脑炎、苯丙酮尿症或肌萎缩侧索硬化相关的痉挛。
在一些实施方案中，可以以足以使不随意肌收缩减少90％的量施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。在一些实施方案中，可以以足以使不随意肌收缩减少25-75％的量施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。
在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可能不影响日常生活活动(ADL)或习惯性体力活动。在一些实施方案中，所述骨骼肌收缩抑制剂可能不影响日常生活活动(ADL)或习惯性体力活动。
在一些实施方案中，所述方法还包括在向所述受试者施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的骨骼肌收缩或来自所述骨骼肌收缩的力。
在一些实施方案中，所述受试者在所述施用之前的所述骨骼肌收缩可以与在向所述受试者的所述施用之后的所述骨骼肌收缩相差20％以内。在一些实施方案中，所述受试者在所述施用之前的所述骨骼肌收缩可以与在向所述受试者的所述施用之后的所述肌肉收缩相差10％以内。
在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可能不明显抑制所述受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力。在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可能不明显抑制所述受试者的肺中的潮气量。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力。在一些情况下，所述受试者在所述施用之前的所述心肌收缩可以与在向所述受试者的所述施用之后的所述心肌收缩相差10％以内。
在一些实施方案中，骨骼肌纤维中所述收缩引起的损伤可能来自不随意骨骼肌收缩。在一些实施方案中，所述不随意骨骼肌收缩可能与神经肌肉疾病或痉挛相关疾病相关。在一些实施方案中，所述神经肌肉疾病可能是Duchenne型肌营养不良症。
在一些实施方案中，骨骼肌纤维中所述收缩引起的损伤可能来自随意骨骼肌收缩。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力。在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可能不明显抑制平滑肌收缩。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的平滑肌收缩或来自所述平滑肌收缩的力。在一些实施方案中，所述受试者在所述施用之前的所述平滑肌收缩可以与在所述施用之后的所述平滑肌收缩相差10％以内。
在一些实施方案中，在体外测定中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂抑制ATP酶活性，但可不抑制心肌肌球蛋白S1 ATP酶。在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可以是磺酰胺、羟基香豆素、哒嗪酮或吡咯烷酮。
在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可以是磺酰胺。在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可以是任选地取代的N-苄基-对甲苯基-磺酰胺。在一些实施方案中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂是哒嗪酮。
在一些实施方案中，所述骨骼肌收缩可以通过隔离肢体测定(isolated limbassay)、握力或腿推举测定或心率监测器或活动监测器来测量。在一些实施方案中，所述骨骼肌收缩抑制剂的所述施用可能不明显抑制心肌肌钙蛋白或骨骼肌慢肌肌钙蛋白的释放。
通过以下在其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。应当理解，本公开内容能够具有其他不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。因此，附图和说明书本质上将被认为是说明性的而非限制性的。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(在本文中也称为“图”)，将会获得对本发明特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1：正常肌肉与DMD肌肉在暴露于增加的钙浓度时的比较。
图2：DMD斑马鱼模型的胚胎中对照肌肉与BTS处理的肌肉之间的比较。
具体实施方式
在某些方面，本公开内容提供了通过选择性抑制骨骼肌快肌纤维肌球蛋白来治疗神经肌肉疾病的方法。特别地，本公开内容的方法可以用于治疗DMD和其他神经肌肉疾病。
骨骼肌主要由两种类型的纤维组成，慢缩肌纤维(即I型)和快缩肌纤维(即II型)。在每条肌肉中，两种类型的纤维以镶嵌状排列，在不同的肌肉中以及在生长和发育的不同点的纤维类型组成有所不同。慢缩肌纤维具有出色的有氧能量产生能力。慢缩肌纤维收缩率低，但对疲劳的耐受性高。慢缩肌纤维通常比快缩肌纤维具有更高的线粒体和肌红蛋白浓度，并且相比于快缩肌纤维，被更多的毛细血管包围。由于肌球蛋白ATP酶活性较低，慢缩肌纤维的收缩速度较慢，并且与快缩肌纤维相比，产生的能量较小，但它们能够在较长时间内保持收缩功能，例如在稳定、姿势控制和耐力锻炼中。
根据其表达的特定骨骼肌快肌肌球蛋白，人类的快缩肌纤维可进一步分为两种主要的纤维类型(IIa型、IIx/d型)。第三类快肌纤维(IIb型)存在于其他哺乳动物中，但在人类肌肉中很少被发现。快缩肌纤维具有出色的厌氧能量产生能力，并且能够在短时间内产生大量的张力。通常，与慢缩肌纤维相比，快缩肌纤维具有较低的线粒体、肌红蛋白和毛细血管浓度，因此可更快地疲劳。快缩肌纤维产生力量和抵抗活动所需的更快的力。
I型和II型的比例在不同的个体中可有所不同。例如，非运动型个体的每种肌纤维类型可各占近50％。力量型运动员可具有较高比例的快缩肌纤维，例如，在短跑运动员中有70-75％的II型。耐力型运动员可具有较高比例的慢缩肌纤维，例如，长跑运动员的慢缩肌纤维比例为70-80％。I型和II型纤维的比例也可根据个体的年龄而变化。II型纤维(尤其是IIx型)的比例可随着个体年龄的增长而下降，导致瘦肌肉质量的损失。
骨骼肌的收缩作用导致患有神经肌肉疾病(例如DMD)的受试者的肌肉受损，这种受损在快肌纤维中似乎更为普遍。已经注意到，在营养不良的小鼠模型中，主要为快II型纤维肌(即EDL)的模型的拉伤后急性力下降大于主要为慢I型纤维肌肉(即比目鱼肌)的模型。还已经证明在营养不良的小鼠模型中，急性力下降和组织学受损的程度与拉伤期间的峰值力发展成正比。图1显示了过度收缩引起的损伤，该损伤发生在晚期DMD病理所特有的炎症和不可逆纤维化之前。[图改编自：Claflin和Brooks,Am J Brooks,Physiol Cell,2008]。通过限制II型纤维的峰值力产生并可能地增加对更健康的I型纤维的依赖性，可以减少这些患者中的收缩引起的肌肉受损。N-苄基-对-甲苯基磺酰胺(BTS)是一种骨骼肌快肌纤维肌球蛋白的抑制剂，如图2所示，在来自DMD斑马鱼模型的胚胎中，已显示出保护肌肉免于病理性肌肉紊乱。[来源：Li和Arner,PLoSONE,2015]。
对II型纤维没有选择性的骨骼肌肌球蛋白抑制剂可能导致骨骼肌收缩的过度抑制，包括损害呼吸功能和心脏活动，因为心脏与I型骨骼肌纤维共享多个结构成分(例如I型肌球蛋白)。由于II型纤维的收缩被认为会驱动病理性且不可逆的肌肉受损，因此本公开内容提供了骨骼肌快肌纤维肌球蛋白的选择性抑制剂，以作为DMD和其他神经肌肉疾病的治疗选择。靶向抑制II型骨骼肌肌球蛋白可以减少骨骼肌收缩，同时将对受试者的日常活动的影响降到最低。
本文讨论的方法可以用于治疗神经肌肉疾病和运动障碍。神经肌肉疾病的实例包括但不限于Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、肌强直性营养不良症1、肌强直性营养不良症2、面肩肱型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、肌腱炎和腕管综合征。运动障碍的实例包括但不限于肌肉痉挛性障碍，与多发性硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病或脑瘫相关的痉挛。本公开内容的方法可用于治疗由于损伤或创伤事件而引起的运动障碍，该损伤或创伤事件是例如中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、低氧、脑膜炎、脑炎、苯丙酮尿症或肌萎缩侧索硬化。还包括可能对骨骼肌肌球蛋白II、骨骼肌肌钙蛋白C、骨骼肌肌钙蛋白I、骨骼原肌球蛋白、骨骼肌肌钙蛋白T、骨骼肌调节轻链、骨骼肌肌球蛋白结合蛋白C或骨骼肌肌动蛋白的抑制有反应的其他疾病。
本文提出了通过减少骨骼肌收缩来治疗神经肌肉和运动障碍的方法。用选择性骨骼肌快肌(II型)肌球蛋白抑制剂治疗患有神经肌肉和运动障碍的受试者可以通过防止过度的不协调的肌肉收缩来减少肌肉分解，从而减少肌肉受损。此外，本公开内容的方法可以减少肌肉受损，同时最小化对受试者的身体功能的影响。功能的保持既可以通过限制II型纤维中所产生的有破坏性的力的水平来实现，也可以通过增加对更健康的I型纤维的依赖来实现。通过抑制骨骼肌肌球蛋白II，可减少骨骼肌收缩或不协调的肌肉挛缩。在某些实施方案中，骨骼肌肌球蛋白II的抑制剂是磺酰胺、羟基香豆素或吡咯烷酮。骨骼肌肌球蛋白II抑制剂可以是N-苄基-对甲苯基-磺酰胺(BTS)的类似物。
在某些实施方案中，骨骼肌肌球蛋白II抑制剂是哒嗪酮。如本文所用，哒嗪酮是指由其结构
Figure BDA0002733970710000081
表示的化合物及其取代形式。例如，哒嗪酮可以在一个或多个位置被取代，例如在哒嗪酮的2-、4-、5-或6-位被取代。在某些实施方案中，哒嗪酮在2-位和6-位均被取代。哒嗪酮上的取代基选自任选取代的烷基基团、任选取代的碳环(例如环烷基和芳基环)以及任选取代的杂环、杂环烷基和杂芳基环。在某些实施方案中，哒嗪酮选自PCT公开号WO2016/023877中描述的化合物或其盐，其内容通过引用并入本文。
术语“取代的”是指在化合物的一个或多个碳或可取代杂原子(例如，NH或NH2)上具有取代氢的取代基的部分，例如哒嗪酮。应当理解，“取代”或“用…取代”包括隐含的条件，即该取代是根据被取代原子和取代基的可能的化合价，并且该取代产生稳定的化合物，即，不会自发地经历诸如重排、环化、消除等转化的化合物。在某些实施方案中，取代是指在相同碳原子上有两个氢原子被取代基取代的部分，例如用氧代、亚氨基或硫代基团取代单个碳上的两个氢原子。如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有允许的取代基。在一个广义的方面，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。对于合适的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个，并且可以相同或不同。
在一些实施方案中，取代基可以包括本文所述的任何取代基，例如：卤素、羟基、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氰基(-CN)、硝基(-NO2)、亚氨基(＝N-H)、肟基(＝N-OH)、肼(＝N-NH2)、-Rb-ORa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-OC(O)-ORa、-Rb-OC(O)-N(Ra)2、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORa、-Rb-N(Ra)C(O)Ra、-Rb-N(Ra)S(O)tRa(其中t为1或2)、-Rb-S(O)tRa(其中t为1或2)、-Rb-S(O)tORa(其中t为1或2)和-Rb-S(O)tN(Ra)2(其中t为1或2)；和烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基和杂芳基烷基，它们中的任何一个均可以任选地被烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氰基(-CN)、硝基(-NO2)、亚氨基(＝N-H)、肟基(＝N-OH)、肼(＝N-NH2)、-Rb-ORa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-OC(O)-ORa、-Rb-OC(O)-N(Ra)2、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORa、-Rb-N(Ra)C(O)Ra、-Rb-N(Ra)S(O)tRa(其中t为1或2)、-Rb-S(O)tRa(其中t为1或2)、-Rb-S(O)tORa(其中t为1或2)和-Rb-S(O)tN(Ra)2(其中t为1或2)取代；其中每个Ra独立地选自氢、烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，其中每个Ra在化合价允许的情况下可以任选地被烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氰基(-CN)、硝基(-NO2)、亚氨基(＝N-H)、肟基(＝N-OH)、肼(＝N-NH2)、-Rb-ORa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-OC(O)-ORa、-Rb-OC(O)-N(Ra)2、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORa、-Rb-N(Ra)C(O)Ra、-Rb-N(Ra)S(O)tRa(其中t为1或2)、-Rb-S(O)tRa(其中t为1或2)、-Rb-S(O)tORa(其中t为1或2)和-Rb-S(O)tN(Ra)2(其中t为1或2)取代；并且其中每个Rb独立地选自直接键，或直链或支链的亚烷基、亚烯基或亚炔基链，并且每个Rc是直链或支链的亚烷基、亚烯基或亚炔基链。
在用骨骼肌收缩抑制剂治疗之前和之后，可以监测受试者的日常生活活动(ADL)或习惯性体力活动。ADL或习惯性体力活动取决于受试者，并且根据受试者的能力和日常，其范围可能为从简单的步行到广泛的锻炼。本文讨论的骨骼肌收缩抑制剂的治疗选择和剂量可以针对受试者进行个性化，使得ADL和习惯性体力活动保持不变。
在一些方面，治疗神经肌肉疾病或运动障碍的方法可以包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂。骨骼肌收缩抑制剂的给药量可以是相对于使骨骼肌收缩减少50％所需的量。骨骼肌收缩抑制剂的施用量可以少于将骨骼肌收缩相对于受试者的治疗前骨骼肌收缩能力减少50％所需的量。骨骼肌收缩抑制剂可以以将骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前骨骼肌收缩能力减少5％至45％的量施用。在一些情况下，相对于所述受试者的治疗前骨骼肌收缩能力，抑制剂的施用量可使骨骼肌收缩减少少于10％、少于15％、少于20％、少于25％、少于30％、少于35％、少于40％、少于45％或甚至少于50％。在某些实施方案中，抑制剂可以以将骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前骨骼肌收缩能力减少1％至50％的量施用。
在一些方面，治疗神经肌肉疾病或运动障碍的方法可以包括向有此需要的受试者施用I型骨骼肌收缩抑制剂。I型骨骼肌收缩抑制剂的给药量可以是相对于使I型骨骼肌收缩减少20％所需的量。I型骨骼肌收缩抑制剂的施用量可以少于将I型骨骼肌收缩相对于受试者的治疗前I型骨骼肌收缩能力减少20％所需的量。I型骨骼肌收缩抑制剂可以以将I型骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前I型骨骼肌收缩能力减少0.01％至20％，例如1％至15％、例如1％至10％的量施用。在一些情况下，相对于所述受试者的治疗前I型骨骼肌收缩能力，抑制剂的施用量可使I型骨骼肌收缩减少少于0.01％、少于0.1％、少于0.5％、少于1％、少于5％、少于10％、少于15％或少于20％。在某些实施方案中，抑制剂可以以将I型骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前I型骨骼肌收缩能力减少0.01％至20％的量施用。
在一些方面，治疗神经肌肉疾病或运动障碍的方法可以包括向有此需要的受试者施用II型骨骼肌收缩抑制剂。II型骨骼肌收缩抑制剂的给药量可以是相对于使II型骨骼肌收缩减少90％所需的量。II型骨骼肌收缩抑制剂的施用量可以少于将II型骨骼肌收缩相对于受试者的治疗前II型骨骼肌收缩能力减少90％所需的量。II型骨骼肌收缩抑制剂可以以将II型骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前II型骨骼肌收缩能力减少5％至90％，例如5％至80％、例如5％至75％、例如5％至70％的量施用。在一些情况下，相对于所述受试者的治疗前的II型骨骼肌收缩能力，抑制剂的施用量可使II型骨骼肌收缩减少10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多或甚至90％或更多。在某些实施方案中，抑制剂可以以将II型骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前II型骨骼肌收缩能力减少1％至50％的量施用。
在一些方面，治疗骨骼肌纤维中的收缩引起的损伤的方法可以包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩和/或骨骼肌肌球蛋白II的抑制剂。在某些实施方案中，抑制剂不明显抑制心肌收缩。
在某些实施方案中，骨骼肌纤维中收缩引起的损伤来自不随意骨骼肌收缩。不随意骨骼肌收缩可能与神经肌肉疾病或痉挛相关疾病相关。在某些实施方案中，骨骼肌纤维中收缩引起的损伤可能来自随意骨骼肌收缩，例如体育运动。
在某些实施方案中，向受试者施用骨骼肌收缩抑制剂调节与肌肉收缩相关的一种或多种生物标志物。生物标志物的实例包括但不限于肌酐激酶(CK)、肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌红蛋白、TnI的亚型(例如，心肌、骨骼肌慢肌、骨骼肌快肌的TnI)和炎性标志物(IL1、IL6、IL4、TNF-α)。生物标志物还可以包括肌肉炎症的量度，例如水肿。相对于生物标志物的治疗前水平，施用抑制剂后，本文所述的生物标志物的水平可增加。或者，相对于生物标志物的治疗前水平，施用抑制剂后，生物标志物的水平可降低。用本文所述的抑制剂对一种或多种生物标志物的调节可指示对神经肌肉疾病例如本文所述的那些神经肌肉疾病的治疗。
与受试者非活动时(例如，睡眠)相比，受试者在活动时的CK水平增加，因此CK是用于评估由骨骼肌收缩引起的骨骼肌分解的潜在度量。在某些实施方案中，可以在轻度、中度或剧烈活动之前向受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，以减少或防止骨骼肌因活动而分解。中度到剧烈的活动可能取决于受试者的能力，并且可能包括相对于受试者的静息心率，可使心率增加至少20％或更多，例如大约50％或更多的体育运动。中度到剧烈的活动的实例包括行走、跑步、举重、骑自行车、游泳、远足等。
在某些实施方案中，在中度或剧烈活动之前、期间或之后施用骨骼肌收缩抑制剂，以降低或防止骨骼肌因活动而分解。相对于进行相同活动的未治疗受试者，骨骼肌收缩抑制剂可降低受试者的CK水平。在活动期间或之后，可以在受试者的外周血中测量CK水平。相对于进行相同活动的未治疗受试者，本文所述的抑制剂的施用可使活性受试者的CK水平减少5％至90％，例如5％至80％，例如10％至75％，从而降低或防止骨骼肌因活动而分解。相对于进行相同活动的未治疗受试者，本文所述的抑制剂的施用可将CK水平调节约5％至约90％，从而降低或防止骨骼肌因活动而分解。相对于进行相同活动的未治疗受试者，本文所述的抑制剂的施用可使CK水平减少至少约5％，从而降低或防止骨骼肌因活动而分解。相对于进行相同活动的未治疗受试者，本文所述的抑制剂的施用可将CK水平调节90％或更少。相对于进行相同活动的未治疗受试者，本文所述的抑制剂的施用可将CK水平减少约5％至约15％、约5％至约25％、约5％至约35％、约5％至约45％、约5％至约55％、约5％至约65％、约5％至约75％、约5％至约85％、约5％至约90％、约15％至约25％、约15％至约35％、约15％至约45％、约15％至约55％、约15％至约65％、约15％至约75％、约15％至约85％、约15％至约90％、约25％至约35％、约25％至约45％、约25％至约55％、约25％至约65％、约25％至约75％、约25％至约85％、约25％至约90％、约35％至约45％、约35％至约55％、约35％至约65％、约35％至约75％、约35％至约85％、约35％至约90％、约45％至约55％、约45％至约65％、约45％至约75％、约45％至约85％、约45％至约90％、约55％至约65％、约55％至约75％、约55％至约85％、约55％至约90％、约65％至约75％、约65％至约85％、约65％至约90％、约75％至约85％、约75％至约90％或约85％至约90％，从而降低或防止骨骼肌因活动而分解。相对于进行相同活动的未治疗受试者，本文所述的抑制剂的施用可将CK水平调节约5％、约15％、约25％、约35％、约45％、约55％、约65％、约75％、约85％或约90％，从而降低或防止骨骼肌因活动而分解。
向受试者施用骨骼肌收缩抑制剂可调节炎性标志物的水平，例如，相对于未治疗的受试者或治疗前的受试者，减少一种或多种炎性标志物的水平。可以在受试者的外周血中测量炎性标志物的水平。炎性标志物的实例可以包括但不限于IL-1、IL-6和TNF-α。炎性标志物也可以是病症诸如水肿的形式，其可以使用磁共振成像来测量。相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，施用抑制剂后外周血中的炎性标志物的水平可增加。或者，相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，施用抑制剂后外周血中的炎性标志物的水平可降低。相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，本文所述的抑制剂的施用可将炎性标志物的水平调节5％至90％。在一些情况下，相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，可将炎性标志物的水平调节约5％至约90％。在一些情况下，相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，可将炎性标志物的水平调节至少约5％。在一些情况下，相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，可将炎性标志物的水平调节至多约90％。在一些情况下，相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，可将炎性标志物的水平调节约5％至约15％、约5％至约25％、约5％至约35％、约5％至约45％、约5％至约55％、约5％至约65％、约5％至约75％、约5％至约85％、约5％至约90％、约15％至约25％、约15％至约35％、约15％至约45％、约15％至约55％、约15％至约65％、约15％至约75％、约15％至约85％、约15％至约90％、约25％至约35％、约25％至约45％、约25％至约55％、约25％至约65％、约25％至约75％、约25％至约85％、约25％至约90％、约35％至约45％、约35％至约55％、约35％至约65％、约35％至约75％、约35％至约85％、约35％至约90％、约45％至约55％、约45％至约65％、约45％至约75％、约45％至约85％、约45％至约90％、约55％至约65％、约55％至约75％、约55％至约85％、约55％至约90％、约65％至约75％、约65％至约85％、约65％至约90％、约75％至约85％、约75％至约90％或约85％至约90％。在一些情况下，相对于受试者的炎性标志物的治疗前水平，可将炎性标志物的水平调节约5％、约15％、约25％、约35％、约45％、约55％、约65％、约75％、约85％或约90％。
向受试者施用骨骼肌收缩抑制剂可调节循环骨骼肌快肌肌钙蛋白I(fS-TnI)的水平。可以在外周血中测量fS-TnI的水平。相对于受试者的fS-TnI的治疗前水平，施用抑制剂后外周血中的fS-TnI的水平可增加。备选地，相对于受试者的fS-TnI的治疗前水平，施用抑制剂后外周血中的fS-TnI的水平可降低。相对于受试者的fS-TnI的治疗前水平，本文所述的抑制剂的施用可将fS-TnI的水平调节5％至90％。在一些情况下，相对于受试者的fS-TnI的治疗前水平，可将fS-TnI的水平调节至少约5％。在一些情况下，相对于受试者的fS-TnI的治疗前水平，可将fS-TnI的水平调节至多约90％。在一些情况下，相对于受试者的fS-TnI的治疗前水平，可将fS-TnI的水平调节约5％至约15％、约5％至约25％、约5％至约35％、约5％至约45％、约5％至约55％、约5％至约65％、约5％至约75％、约5％至约85％、约5％至约90％、约15％至约25％、约15％至约35％、约15％至约45％、约15％至约55％、约15％至约65％、约15％至约75％、约15％至约85％、约15％至约90％、约25％至约35％、约25％至约45％、约25％至约55％、约25％至约65％、约25％至约75％、约25％至约85％、约25％至约90％、约35％至约45％、约35％至约55％、约35％至约65％、约35％至约75％、约35％至约85％、约35％至约90％、约45％至约55％、约45％至约65％、约45％至约75％、约45％至约85％、约45％至约90％、约55％至约65％、约55％至约75％、约55％至约85％、约55％至约90％、约65％至约75％、约65％至约85％、约65％至约90％、约75％至约85％、约75％至约90％或约85％至约90％。在一些情况下，相对于受试者的fS-TnI的治疗前水平，可将fS-TnI的水平调节约5％、约15％、约25％、约35％、约45％、约55％、约65％、约75％、约85％或约90％。
可以在施用骨骼肌收缩抑制剂之前和之后在受试者中测量肌钙蛋白的亚型。抑制骨骼肌收缩可能不抑制肌钙蛋白的一些亚型，例如心肌肌钙蛋白I(cTnI)或骨骼肌慢肌肌钙蛋白I(ssTnI)。在一些情况下，抑制骨骼肌收缩可能不明显抑制cTnI或ssTnI。如本文所用，关于cTnI或ssTnI，词语不明显是指相对于在施用抑制剂之前的cTnI或ssTnI，cTnI或ssTnI的减少少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％、少于0.5％或甚至少于0.1％。
骨骼肌收缩抑制剂的施用可以减少不随意肌收缩。相对于抑制剂施用前的不随意肌收缩，不随意肌收缩可减少20％至90％。在一些情况下，相对于治疗前的不随意肌收缩，不随意肌收缩可减少至少约20％。在一些情况下，相对于治疗前的不随意肌收缩，不随意肌收缩可减少至多约90％。在一些情况下，相对于治疗前的不随意肌收缩，不随意肌收缩可减少约20％至约25％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约70％、约20％至约75％、约20％至约80％、约20％至约85％、约20％至约90％、约25％至约30％、约25％至约40％、约25％至约50％、约25％至约70％、约25％至约75％、约25％至约80％、约25％至约85％、约25％至约90％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约70％、约30％至约75％、约30％至约80％、约30％至约85％、约30％至约90％、约40％至约50％、约40％至约70％、约40％至约75％、约40％至约80％、约40％至约85％、约40％至约90％、约50％至约70％、约50％至约75％、约50％至约80％、约50％至约85％、约50％至约90％、约70％至约75％、约70％至约80％、约70％至约85％、约70％至约90％、约75％至约80％、约75％至约85％、约75％至约90％、约80％至约85％、约80％至约90％或约85％至约90％。在一些情况下，相对于治疗前不随意肌收缩，不随意肌收缩可以减少约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约70％、约75％、约80％、约85％或约90％。
骨骼肌收缩抑制剂可用于改善受试者的日常生活活动(ADL)或***或能力。抑制骨骼肌收缩可能不影响ADL或***减少少于20％、少于15％、少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％、少于0.5％或甚至少于0.1％。可以在施用骨骼肌收缩抑制剂之前和之后测量受试者中的骨骼肌收缩或力。可以进行这种测量以产生骨骼肌收缩抑制剂的剂量反应曲线。相对于减少II型骨骼肌收缩90％的剂量，骨骼肌收缩抑制剂的剂量可以调整约5％至50％。在一些情况下，相对于减少II型骨骼肌收缩90％的剂量，骨骼肌收缩抑制剂的剂量可以调整至少约5％。在一些情况下，相对于减少II型骨骼肌收缩90％的剂量，骨骼肌收缩抑制剂的剂量可以调整至多约50％。在一些情况下，相对于减少II型骨骼肌收缩90％的剂量，骨骼肌收缩抑制剂的剂量可以调整约5％至约10％、约5％至约15％、约5％至约20％、约5％至约25％、约5％至约30％、约5％至约35％、约5％至约40％、约5％至约50％、约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约35％、约10％至约40％、约10％至约50％、约15％至约20％、约15％至约25％、约15％至约30％、约15％至约35％、约15％至约40％、约15％至约50％、约20％至约25％、约20％至约30％、约20％至约35％、约20％至约40％、约20％至约50％、约25％至约30％、约25％至约35％、约25％至约40％、约25％至约50％、约30％至约35％、约30％至约40％、约30％至约50％、约35％至约40％、约35％至约50％或约40％至约50％。在一些情况下，相对于减少II型骨骼肌收缩90％的剂量，骨骼肌收缩抑制剂的剂量可以调整约10％、约12％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。可以在施用骨骼肌收缩抑制剂之前和之后，通过在神经刺激之后使用表面电极的肌肉力测试(例如，腿部腓骨神经刺激后的足底屈曲)、隔离肢体测定法、心率监测器或活动监测器或其等同方式来测量骨骼肌收缩。
可以在施用骨骼肌收缩抑制剂之前和之后测量受试者的心肌力或心肌收缩。抑制骨骼肌收缩可能不抑制心肌收缩或心肌力。在一些实施方案中，抑制骨骼肌收缩可能不明显抑制心肌收缩。在关于心肌收缩的某些实施方案中，词语不明显是指相对于施用抑制剂之前的心肌力，心肌力减少少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％、少于0.5％或甚至少于0.1％。施用骨骼肌收缩抑制剂后受试者的心肌力或心肌收缩可以与施用抑制剂之前的心肌收缩或心肌力相差0.1％至10％。可以使用超声心动图(部分缩短)或其他等效测试来测量心肌力或心肌收缩。
可以在施用骨骼肌收缩抑制剂之前和之后测量受试者的肺中的潮气量。抑制骨骼肌收缩可能不抑制肺中的潮气量。在一些情况下，抑制骨骼肌收缩可能不明显抑制肺中的潮气量。在关于肺中的潮气量的某些实施方案中，词语不明显是指相对于施用抑制剂之前的肺中的潮气量，肺中的潮气量减少少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％、少于0.5％或甚至少于0.1％。可以使用第一秒钟用力呼气容积测试(FEV1)或用力肺活量测试(FVC)或其等效方法来测量受试者肺部的潮气量。
可以在施用骨骼肌收缩抑制剂之前和之后测量受试者的平滑肌收缩。抑制骨骼肌收缩可能不抑制平滑肌收缩。在一些情况下，抑制骨骼肌收缩可能不明显抑制平滑肌收缩。如本文所用，关于平滑肌收缩，词语不明显是指相对于施用抑制剂之前的平滑肌收缩，平滑肌收缩减少少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％、少于0.5％或甚至少于0.1％。可以通过测量受试者的血压来评估受试者的平滑肌收缩。
可以在施用骨骼肌收缩抑制剂之前和之后测量受试者中的神经肌肉耦联。用本文所述的抑制剂抑制骨骼肌收缩可能不损害受试者骨骼肌的神经传导、神经递质释放或电去极化。在一些情况下，抑制骨骼肌收缩可能不明显损害受试者的神经肌肉耦联。如本文所用，关于神经肌肉耦联，词语不明显是指相对于施用抑制剂之前受试者中的神经肌肉耦联水平，受试者中神经肌肉耦联水平减少少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％。受试者的神经肌肉耦合可以通过测量骨骼肌的神经诱导的电去极化来评估，所述测量是通过使用表面或针电极，用肌电图(EMG)记录进行电刺激或随意刺激后骨骼肌产生的电活动来进行的。
在一些方面，治疗神经肌肉疾病或运动障碍的方法可以包括向受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中骨骼肌收缩抑制剂可抑制肌球蛋白ATP酶活性、天然骨骼肌肌原纤维ATP酶(钙调节)或具有肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白的重构S1。体外测定可用于测试测试化合物或抑制剂对肌球蛋白ATP酶活性的影响。可筛选测试化合物以评估其对肌肉收缩的抑制活性。可使用吸光度测定法测定抑制活性，以确定肌动蛋白激活的ATP酶活性。可将兔肌肉肌球蛋白亚片段1(S1)与聚合的肌动蛋白混合，并分散到无核苷酸的测定板孔中。然后可用针阵列将测试化合物添加到孔中。该反应可用MgATP引发。可以将测试容器中在限定时间段内的ATP消耗量与对照容器中的ATP消耗量进行比较。限定的时间段可以是5分钟到20分钟。ATP消耗量可通过直接或间接测定来确定。可重现并强烈抑制肌球蛋白S1ATP酶活性的测试化合物可在剂量反应测定中进一步评估，以确定该化合物在解剖的肌肉上的离体IC50。该测定可通过将肌球蛋白与丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶耦联来间接测量ATP酶活性，以提供基于由ADP积累驱动的NADH向NAD+的转化的在340nm处的吸光度检测方法。在一些情况下，其中如果所述测试容器中的ATP消耗比所述对照容器减少至少20％，则可以选择所述测试化合物作为骨骼肌收缩的抑制剂。在动力学测定中，当NAD+生成的抑制作用增强至少20％时，可以选择测试化合物。
在体外测定中，所选的抑制剂或测试化合物可能不抑制心肌肌球蛋白S1 ATP酶。在一些情况下，当在体外测定中测试测试化合物或骨骼肌收缩抑制剂时，心肌肌球蛋白S1ATP酶或心肌原纤维或重构体系可被抑制少于10％、少于8％、少于5％、少于3％、少于2％、少于1％或少于0.5％。
可以在剥离的纤维上测试骨骼肌收缩的测试化合物。可以使用经过处理以去除膜并允许在钙施用后直接激活收缩的单个骨骼肌纤维。相对于治疗前的值或未治疗的对照单个骨骼肌，抑制剂可抑制单个骨骼肌的收缩约5％至约90％。相对于治疗前的值或未治疗的对照单个骨骼肌，抑制剂可抑制单个骨骼肌的收缩至少约5％。相对于治疗前的值或未治疗的对照单个骨骼肌，抑制剂可抑制单个骨骼肌的收缩至多约90％。相对于治疗前能力或未治疗的对照单个骨骼肌，抑制剂可抑制单个骨骼肌的收缩约5％至约10％、约5％至约20％、约5％至约30％、约5％至约40％、约5％至约50％、约5％至约60％、约5％至约70％、约5％至约80％、约5％至约90％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约70％、约30％至约80％、约30％至约90％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约40％至约90％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约70％至约80％、约70％至约90％或约80％至约90％。相对于治疗前能力或未治疗的对照单个骨骼肌，抑制剂可抑制单个骨骼肌的收缩约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。
可以评估测试化合物对慢I型骨骼肌纤维、心肌束或肺肌纤维的影响。可以选择测试化合物或抑制剂，使其不明显地调节慢I型骨骼肌纤维、心肌束或肺肌纤维的功能，并且对II型骨骼肌具有特异性。如本文所用，术语“不明显地调节”可指相对于抑制剂施用前的肌肉力/收缩，抑制剂施用后肌肉的收缩能力减少少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％、少于0.5％或甚至少于0.1％。
在一些方面，一种治疗神经肌肉疾病或运动障碍的方法可以包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中所述骨骼肌收缩抑制剂在离体测定中将骨骼肌收缩减少5％至90％。所用的离体测定可以是小鼠模型。所用的小鼠模型可以是营养不良的小鼠模型，例如mdx小鼠。mdx小鼠的肌养蛋白基因具有点突变，该点突变将编码谷氨酰胺的氨基酸改变为苏氨酸，从而生成无功能的肌养蛋白，导致肌肉受损和肌无力增加的DMD。可以从mdx小鼠中解剖趾长伸肌，并安装在杠杆臂上。肌肉可以浸泡在含氧的Kreb溶液中，以保持肌肉功能。可以将测试化合物或骨骼肌收缩抑制剂应用于肌肉。然后可以执行等长(固定长度)收缩步骤，其中用一系列电脉冲刺激肌肉。可以执行离心(拉长)收缩步骤，其中在放松或用电脉冲刺激时，将肌肉拉伸到比其静止长度大10％、15％、20％、25％或30％。可以重复4、5、6、7或8次以导致肌纤维损伤。电脉冲可以具有110Hz至150Hz的频率。电脉冲可以具有110、115、120、125、130、135、140、145或150Hz的频率。一系列电脉冲可以包括不同频率的单个脉冲。对于每个脉冲，一系列电脉冲中的每个脉冲的时间段可以在0.1秒至0.5秒之间。每个脉冲的时间可以是0.1、0.2、0.3、0.35、0.4或0.5秒。在等长收缩或离心收缩后，将肌肉在活性橙中温育也可以测量肌膜受损。活性橙是一种被带有膜损伤的肌肉纤维吸收的荧光染料。然后可通过组织学来定量染料阳性纤维的数量或比例。当测试力下降和/或染料阳性纤维的比例比对照力下降和/或染料吸收少至少20％时，可以选择测试化合物作为骨骼肌收缩的抑制剂。
在一组等长或离心的收缩中，可以测量肌肉产生的力。肌肉在一组等长或离心收缩前后产生的力的变化可计算为测试力下降，并与在没有暴露于测试化合物的对照样品中从第一脉冲到最后一个脉冲由肌肉收缩产生的力变化(对照力下降)进行比较。力下降可用作肌肉损伤的代表，并且当测试力下降至少比对照力下降少20％时，可以选择测试化合物或抑制剂。
实施例
可通过离体和体内测定，通过比较来自对照和营养不良小鼠的肌肉来确定测试化合物的功效。
实施例1：用于评估收缩特性的离体测定
可通过解剖对照(C57BL/10ScSn)和营养不良(mdx)小鼠来制备肌肉。可使用主要由快缩肌纤维组成的肌肉，例如膈肌条或完整的趾长伸肌(EDL)肢体肌肉。可从年轻或成年小鼠，30至110天大的小鼠中解剖肌肉。可将肌肉浸入25mM pH 7.4的Hepes缓冲生理溶液中。生理溶液可包含荧光的低分子量染料(林格溶液中的0.2％活性橙)。生理溶液可被连续地充氧并维持在室温或约23摄氏度。肌肉可水平或垂直地安装在肌肉浴中，通过其骨骼或肌腱***物连接到一端的固定柱上，另一端则连接在双模伺服电机***的杠杆上。该实验装置可进行力的测量以及以预定的速度和量改变肌肉的长度。可通过在肌肉两侧放置两个铂板电极来刺激肌肉。然后可将肌肉调整到最佳长度(L0)，以实现最大的抽搐力(twitchforce)。一旦确定了L0，就可使用精密卡尺测量肌肉纤维的长度。
可将测试化合物应用于对照和mdx肌肉，以评估其收缩特性，尤其是以由肌肉产生的力的方式衡量的肌肉强度。未处理或经媒介物(DMSO)处理的肌肉可用于比较。对照和mdx肌肉可经历以下程序之一：(a)离心收缩方案，其包括五个最大刺激队列(频率为80Hz，持续700ms)，在最后200ms内以0.5L0/s的速度将肌肉拉长10％L0的距离；(b)等长收缩方案，其包括五个最大刺激队列，其中肌肉保持在L0并且力-时间积分与离心方案相匹配；(c)无肌肉刺激的被动拉长，其拉长参数与离心收缩程序相匹配。每次刺激或被动拉长之间可有4分钟的恢复期，此时肌肉长度维持在L0。与程序(b)-(c)相比，程序(a)可产生更高的峰值应力。与其余程序相比，程序(b)可产生中等峰值应力，而程序(c)可产生低峰值应力，没有激活。在程序(a)和(c)中，可将肌肉拉长原始纤维长度(L0)的约10-20％。可在拉伸开始之前针对每次收缩测量等长收缩力。第一次和最后一次收缩之间的力下降可能与肌膜受损有关。较大的力下降可能与较大的肌膜受损有关。力下降百分比可使用以下公式计算：力下降＝100(第一次收缩时的力-最后一次收缩时的力)/第一次收缩时的力。与未处理的mdx或对照肌肉相比，使在经处理的mdx肌肉中具有较小或较低的急性力下降的测试化合物可进一步评估。
实施例2：用于评估肌膜完整性的离体测定
可制备来自对照和mdx小鼠的肌肉，并使它们经受实施例1中所述的程序，以评估测试化合物在维持肌膜完整性方面的功效。经处理的和未处理的对照以及mdx肌肉都可浸入含氧的0.2％活性橙/林格溶液中，总持续时间为90分钟。包含未刺激对侧对应物的内部对照也可使用并浸入溶液中。然后可在标准的林格溶液中冲洗肌肉两次，每次5分钟，然后速冻、固定和切片以用于组织学检查。膜受损的肌纤维可吸收染料，并且可被评定为染料阳性纤维。具有完整膜的肌纤维不能吸收染料，并且可被评定为染料阴性纤维。可通过使用荧光显微镜检查确定染料阳性纤维的百分比来评估肌肉的膜完整性。可将肌肉切片的边缘排除在评定之外，以避开可能由于肌肉解剖或切片伪影而受损的纤维。与未处理的mdx、对照肌肉或内部对照相比，在mdx肌肉中染料阴性纤维百分比更高的测试化合物可进一步评估。
实施例3：用于评估日常生活活动(ADL)或习惯性体力活动的体内测定
ADL评估可用于确定对照和营养不良受试者在被施用测试化合物之前和之后的肌肉强度。ADL包含自理任务，包括但不限于：洗澡和淋浴、个人卫生和仪容(包括刷牙/梳头/头发造型)、穿衣、厕所卫生(如厕、自我清洁和起立)、功能活动和自我进食(不包括烹饪或咀嚼和吞咽)。功能活动也可以称为“转移”，以步行、上床和下床以及坐下和站起的能力来衡量。可将测试化合物施用于对照和营养不良的个体，以评估测试化合物对执行ADL的功效。与治疗前的状况或对照受试者相比，使得营养不良受试者的ADL改善的测试化合物可进一步评估。
实施例4：用于评估肌肉强度的体内测定
在施用测试化合物之前和之后，可使用诸如握力和腿推举的自愿测定来评估对照和营养不良受试者的肌肉强度。握力强度可通过测量手绕测力计挤压可产生的静力大小来量化。该力最常见的是以千克和磅为单位测量的，但也以毫升汞柱和牛顿为单位。可使用手持测力计，例如Jamar、Dexter和Baseline。在一些情况下，与治疗前的状况或对照受试者相比，使得营养不良受试者的握力改善的测试化合物可进一步评估。
腿推举可以是倾斜或垂直的“滑板”腿推举或“线缆”型腿推举，或“坐式腿推举”型腿推举。配重盘(板)直接连接到安装在轨道上的滑板上。使用者坐在滑板下方，用脚将其向上推。这些机器通常包括可调节的安全支架，以防止使用者被配重压住。使用者坐直并用脚在板上向前推，该板通过长钢线缆连接到配重块上。
在施用测试化合物之前和之后，可使用诸如隔离肢体测定法的不随意测定来评估对照和营养不良受试者的肌肉强度。对测试化合物的药效学反应可通过测量由经皮电刺激腓深神经引起的胫骨前肌收缩的力-频率关系来确定。为了测量胫骨前肌的力，可使用可调节的刚性椅架，该椅架带有集成的踏板，该踏板带有力传感器。每个受试者都可安置在椅子上，并且可将右脚牢牢地绑在踏板上，小腿和膝盖保持固定。椅子的结构可使得在坐下时，受试者的膝盖弯曲大约60度，并且脚踝的角度固定为105(胫骨至脚底)。包含耦合到脚踏板底部的荷重元(MLP-75；Transducer Techniques，Temecula，California)的应变仪可用于测量背屈力。固定在腓骨头部正下方、大腿外侧的粘性表面电极(61-2510；ConMed，USA)可用作阴极，并将刺激脉冲经皮传递至腓深神经。阳极可放置在膝盖的内侧。为了确定最佳的阴极位置，使用手持的非粘性电极(通过该电极可传递低强度的刺激脉冲)来激活神经，而不刺激拮抗肌肉群(这通过触诊确定)。可通过在每个刺激脉冲期间缓慢增加电流，直到胫骨前肌抽搐力的大小和产生的肌电图(EMG)信号的大小不再增加来设定刺激强度。然后可将最终刺激电流设置为高约20％，以确保在整个施用期间最大程度地激活神经。可以在对照和营养不良受试者的4个给药周期的每一个中，在基线、给药后1、3、5和7小时对每个受试者的力-频率反应进行测量。每个刺激方案都可由脉冲宽度为0.5-ms、持续时间为800-ms的5-、7.5-、10-、12.5-、15-、17.5-、25-和50-Hz刺激队列组成。刺激频率可随机顺序传递，因此受试者无法用在每次刺激序列之前5s和之后5s传递的单个刺激脉冲来预期刺激强度，以引起抽搐反应。抽搐－队列－抽搐的序列可间隔30s。在每个评估时间点，可一式三份执行刺激方案，并可取相当的血样以测量测试化合物的血浆浓度。数据采集***可用于创建刺激脉冲队列，放大EMG以及测量应变仪输出，可进行定制设计。与处理前的状况或对照受试者相比，使得营养不良受试者的力频率反应降低的测试化合物可进一步评估。在这种不随意测试***中，测试化合物可能抑制高频力的产生。这种测定法可用于建立药物药代动力学和药效学。
其他体内测定可以包括活动监测器、心脏监测器等。
实施例5：使用血液生物标志物的体内测定
在施用测试化合物之前和之后，血液生物标志物可用于评估测试化合物在对照和营养不良受试者中的功效。血清肌酸激酶(CK)水平可与肌肉受损程度相关。CK水平可通过Hitachi Modular PT自动化临床化学分析仪(Roche，Germany)使用可商购获得的仪器确定。与治疗前的值相比，使得营养不良受试者的CK水平降低的测试化合物可进一步评估。
CK水平也可与肌钙蛋白(TnI)水平相关。除了CK水平之外或代替CK水平，可确定血清骨骼肌快肌肌钙蛋白I亚型(fsTnI)和骨骼肌慢肌肌钙蛋白I亚型(ssTnI)的浓度。TnI水平可通过使用酶联免疫吸附测定来确定。与对照受试者相比，使得营养不良受试者的fsTnI水平降低的测试化合物可进一步评估。
肌肉受损可引起炎性反应，导致炎性分子在血浆中释放。这些炎性分子的水平可用作确定肌肉受损的生物标志物。通过使用免疫吸附测定、RT-PCR或微阵列，可将细胞因子(例如TNFα、IL-1、IL-6和IL-4)用作肌肉受损的生物标志物。与对照受试者相比，使得营养不良受试者的炎性生物标志物水平降低的测试化合物可进一步评估。
实施例6：用于评估测试化合物的生物利用度的体内测定
生物利用度可指测试化合物进入体循环从而接近作用部位的程度和速率。生物利用度可根据施用方法而有所不同。静脉内施用的测试化合物可具有100％的生物利用度。相对于静脉内施用的测试化合物，通过其他途径(例如口服)施用的测试化合物可能具有降低的生物利用度。
生物利用度可以是绝对的或相对的。绝对的生物利用度可通过比较测试化合物在非静脉内施用(例如口服、眼用、直肠、透皮、皮下或舌下)后在体循环中的生物利用度与相同测试化合物在静脉内施用后的生物利用度来确定。可通过测量测试化合物与另一种测试化合物相比的生物利用度来确定相对生物利用度。
可通过在施用测试化合物后随时间确定血浆中测试化合物的浓度(血浆浓度)来评估生物利用度。通过确定血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)可测量生物利用度。测试化合物的血浆浓度可与测试化合物的吸收程度相关。测试化合物的血浆浓度可随吸收程度而增加。当药物消除率等于吸收率时，血浆浓度可达到最大值(峰值)。峰值时间(出现最大血浆药物浓度时)可用作吸收率的一般指标。峰值时间较晚可能与吸收较慢相关。
可通过测量单剂量后***的测试化合物的总量来估算生物利用度。可在7至10个消除半衰期内收集尿液，以使吸收的测试化合物在尿液中完全回收。在多次给药后，可通过测量在稳态条件下24-h时间段内从尿液中回收的未改变药物来估算生物利用度。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员容易理解的是，这样的实施方案只是以示例的方式提供的。本领域技术人员现在将会在不偏离本发明的情况下想到许多更改、改变和替代。应当理解，在实践本发明的过程中可以采用对本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求书旨在限定本发明的范围，并因此覆盖这些权利要求书范围内的方法和构造物及其等效项。
尽管本发明已经示出和描述了本发明的各个实施方案，但对于本领域技术人员容易理解的是，这样的实施方案只是以示例的方式提供的。本领域技术人员可以在不偏离本发明的情况下想到许多更改、改变和替代。应当理解，可以采用对本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案。

Claims (37)

1.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中所述骨骼肌收缩抑制剂的施用量少于将骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前骨骼肌收缩能力减少90％所需的量。
2.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中所述骨骼肌收缩抑制剂以将骨骼肌收缩相对于所述受试者的治疗前骨骼肌收缩能力减少5％至75％的量施用。
3.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中所述骨骼肌收缩抑制剂以将肌酐激酶相对于所述受试者的治疗前肌酐激酶水平调节5-90％的量施用。
4.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中所述骨骼肌收缩抑制剂以调节炎性标志物的量施用，其中所述炎性标志物选自IL-1、IL-6和TNF-α或可使用磁共振成像测量的病症，例如水肿，所述炎性标志物相对于所述受试者的治疗前值为5％至90％。
5.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中所述骨骼肌收缩抑制剂在离体测定中将骨骼肌收缩减少5％至75％，在所述离体测定中：
a.将从mdx小鼠解剖的趾长伸肌安装在电磁牵引器上，并将所述肌肉浸泡在含氧Kreb溶液中以维持肌肉功能；
b.将测试化合物施加于所述肌肉；
c.执行等长收缩步骤，其中用一系列六个电脉冲刺激所述肌肉；
d.执行离心收缩步骤，其中用一系列80到125Hz的五到六个电脉冲刺激所述肌肉0.35到0.7秒，并在所述刺激的最后0.15-0.2秒内拉伸到比其静止长度大10％到20％，其中在每个脉冲之后，测量由所述肌肉收缩产生的力；
e.在步骤d中从所述第一脉冲到所述第六脉冲由所述肌肉收缩产生的力的变化计算为测试力下降，并与在没有暴露于所述测试化合物的对照样品中从所述第一脉冲到所述第六脉冲由所述肌肉收缩产生的力变化(对照力下降)进行比较；
其中当所述测试力下降比所述对照力下降少至少20％时，所述测试化合物是骨骼肌收缩的抑制剂。
6.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用骨骼肌收缩抑制剂，其中所述骨骼肌收缩抑制剂在以下测定中抑制ATP酶活性：
a.在对照容器和测试容器中将肌球蛋白S1片段与聚合的肌动蛋白温育；
b.将测试化合物和MgATP添加到所述测试容器中的混合物中，并将MgATP添加到所述对照容器中；
c.温育所述对照容器和所述测试容器，直到所述对照容器中95％或更多的ATP水解；
将所述测试容器中的ATP消耗量与所述对照容器中的ATP消耗量进行比较，其中当所述测试容器中的ATP消耗量比所述对照容器少至少20％时，所述测试化合物是骨骼肌收缩的抑制剂。
7.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括：
a.测量受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力；
b.向有此需要的所述受试者施用骨骼肌收缩抑制剂；
c.在施用所述骨骼肌收缩抑制剂后，测量所述受试者的所述心肌收缩或来自所述心肌收缩的力；
其中步骤a的所述心肌收缩与步骤c的所述心肌收缩相差10％以内。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述神经肌肉疾病选自：Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、肌强直性营养不良症1、肌强直性营养不良症2、面肩肱型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、肌腱炎、腕管综合征。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌收缩抑制剂选自肌球蛋白抑制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肌球蛋白抑制剂是骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。
11.一种治疗运动障碍的方法，其包括向有此需要的受试者施用骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述运动障碍包括肌肉痉挛。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肌肉痉挛选自与多发性硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病，或脑瘫，或损伤，或创伤性事件诸如中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、低氧、脑膜炎、脑炎、苯丙酮尿症或肌萎缩侧索硬化相关的痉挛。
14.根据权利要求11所述的方法，其中以足以使不随意肌收缩减少90％的量施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。
15.根据权利要求11所述的方法，其中以足以使不随意肌收缩减少25-75％的量施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂不影响日常生活活动(ADL)或习惯性体力活动。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌收缩抑制剂不影响日常生活活动(ADL)或习惯性体力活动。
18.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在向所述受试者施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的骨骼肌收缩或来自所述骨骼肌收缩的力。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前的所述骨骼肌收缩与在向所述受试者的所述施用之后的所述骨骼肌收缩相差20％以内。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前的所述骨骼肌收缩与在向所述受试者的所述施用之后的所述肌肉收缩相差10％以内。
21.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂不明显抑制所述受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力。
22.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂不明显抑制所述受试者的肺中的潮气量。
23.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前的所述心肌收缩与在向所述受试者的所述施用之后的所述心肌收缩相差10％以内。
25.根据权利要求24所述的方法，其中骨骼肌纤维中所述收缩引起的损伤来自不随意骨骼肌收缩。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述不随意骨骼肌收缩与神经肌肉疾病或痉挛相关疾病相关。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述神经肌肉疾病是Duchenne型肌营养不良症。
28.根据权利要求23所述的方法，其中骨骼肌纤维中所述收缩引起的损伤来自随意骨骼肌收缩。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的心肌收缩或来自所述心肌收缩的力。
30.根据权利要求11-29中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂不明显抑制平滑肌收缩。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法还包括在施用所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂之前和之后，测量所述受试者的平滑肌收缩或来自所述平滑肌收缩的力。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前的所述平滑肌收缩与在所述施用之后的所述平滑肌收缩相差10％以内。
33.根据权利要求10-31中任一项所述的方法，其中在体外测定中，所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂抑制ATP酶活性，但不抑制心肌肌球蛋白S1 ATP酶。
34.根据权利要求10-33中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂是磺酰胺、羟基香豆素、哒嗪酮或吡咯烷酮。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂是磺酰胺。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂是任选地取代的N-苄基-对甲苯基-磺酰胺。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述骨骼肌肌球蛋白II抑制剂是哒嗪酮。
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