ES2639852T3 - Medios y métodos para contrarrestar los trastornos musculares - Google Patents

Medios y métodos para contrarrestar los trastornos musculares Download PDF

Info

Publication number
ES2639852T3
ES2639852T3 ES13160310.2T ES13160310T ES2639852T3 ES 2639852 T3 ES2639852 T3 ES 2639852T3 ES 13160310 T ES13160310 T ES 13160310T ES 2639852 T3 ES2639852 T3 ES 2639852T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
leu
glu
lys
exon
gln
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13160310.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Josephus Johannes De Kimpe
Gerardus Johannes Platenburg
Judith Christina Theodora Van Deutekom
Annemieke Aartsma-Rus
Garrit-Jan Boudewijn Van Ommen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Biomarin Technologies BV
Original Assignee
Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Biomarin Technologies BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39045623&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2639852(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Leids Universitair Medisch Centrum LUMC, Biomarin Technologies BV filed Critical Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Application granted granted Critical
Publication of ES2639852T3 publication Critical patent/ES2639852T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1719—Muscle proteins, e.g. myosin or actin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Combinación de: - un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 44 de pre-mRNA de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEQ ID NO:10 o - un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 45 de pre-mRNA de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEQ ID NO:60 y - un compuesto complementario para mejorar la función de fibra muscular, integridad y/o supervivencia de fibra muscular donde dicho compuesto complementario comprende una xantina, dicha combinación estando destinada para el uso como un medicamento, para el alivio de uno o más síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en dicho individuo.

Description

Medios y métodos para contrarrestar los trastornos musculares
5 [0001) La invención se refiere a los campos de biología molecular y medicina.
[0002) Un trastorno muscular es una enfermedad que normalmente tiene un impacto significativo en la vida de un individuo. Un trastorno muscular puede bien tener una causa genética o una causa no genética. Un grupo importante de enfermedades musculares con una causa genética son distrofia muscular de Becker (BMD) Y distrofia muscular de Duchenne (DMD). Estos trastornos son provocados por defectos en un gen para una proteina muscular.
[0003) Distrofia muscular de Becker y distrofia muscular de Duchenne son distrofias musculares genéticas con una incidencia relativamente alta. En ambas distrofias musculares de Duchenne y de Becker, se ve 15 afectada la proteína muscular distrofina. En Duchenne, la distrofina está ausente, mientras que en Becker alguna distrofina está presente pero su producción muy a menudo no es suficiente y/o la distrofina presente se forma de forma anorma1. Ambas enfermedades se asocian con la herencia recesiva ligada al cromosoma
x. DMD resulta de una mutación de desplazamiento del marco de lectura en el gen DMD. El desplazamiento del marco de lectura en el gen DMD resulta en la producción de una proteína distrofina no funcional truncada, dando como resultado atrofia muscular progresiva y debilidad. BMD ocurre ya que una mutación no causa un desplazamiento del marco en el gen DMD. Como en BMD alguna distrofina está presente a diferencia de DMD donde distrofina está ausente, BMD tiene síntomas menos severos que DMD. La aparición de DMD es anterior que BMD. DMD normalmente se manifiesta en la infancia temprana, BMD en los adolescentes o en la edad adulta temprana. La progresión de BMD es más lenta y menos previsible que DMD. Pacientes con
25 BMO pueden sobrevivir en la edad adulta media a tardía. Pacientes con DMD raramente sobreviven más altá de su treintena.
[0004) La distrofina juega un papel estructural importante en la fibra muscular, que conecta la matriz extracelular y el citoesqueleto. La región N-terminal se enlaza a la actina, mientras que el extremo C-terminal es parte del complejo distrofina-glicoproteína (DGC), que abarca el sarcolema. En ausencia de distrofina, el estrés mecánico lleva a rupturas del sarcolema, causando un flujo descontrolado de calcio en la fibra muscular interior, activando así las proteasas activadas por calcio y la necrosis de fibras.
[0005) Para la mayoría de distrofias musculares genéticas ninguna terapia aplicable clínicamente y eficaz
35 está disponible actualmente. Técnicas de sallo de exón se investigan hoy en día para combatir distrofias musculares genéticas. Resultados prometedores han sido recientemente proporcionados por nosostros y otros en una terapia genética diri~ida a la restauración del marco de lectura del pre-mRNA de disttofina en células del ratón mdx y pacientes ·11 de DMD. Por el salto dirigido de un exón específico, un fenotipo DMD (carente de distrofina) se convierte en un fenotipo de BMD más leve (distrofina parcial a ampliamente funcional). El salto de un exón es preferiblemente inducido por la unión de oligorribonucleótidos antisentido (AON) dirigidos bien a uno o a ambos sitios de empalme, o secuencias intemas del exón. Ya que un exón solo será incluido en el mRNA cuando los sitios de empalme se reconocen por el complejo de espliceosoma, sitios de empalme son objetivos obvios para AON. Alternativamente, o adicionalmente, uno o más AON se usan que son específicos para al menos parte de una o más secuencias exónicas. El uso de AON internos de
45 exones específicos para una secuencia del exón 46, fueron previamente capaces de modular el modelo de empalme en miotubos cullivados de dos pacientes de DMD diferentes con una deleción11 del exón 45. DespuéS del tratamiento de AON, el exón 46 fue saltado, que resultó en un marco de lectura restaurado y la inducción de síntesis de distrofina en al menos 75% de las células. Hemos demostrado recientemente que el sallo del exón puede también ser inducido eficazmente en el control humano y células musculares del paciente para 39 exones de DMD diferentes usando AONs 1. 2.11-15 internos del exón .
[0006) Por lo tanto, técnicas de salto de exón aplicadas en el gen de distrofina suponen la generación de proteina distrofina al menos parcialmente funcional -sin embargo más corta -en pacientes de DMD. Ya que DMD es causada por una proteína distrofina disfuncional, se esperaría que los síntomas de DMD fueran 55 suficientemente aliviados una vez que un paciente de DMD ha sido provisto de una proteina distrofina funcional. Sin embargo, la presente invención proporciona el conocimiento de que, aunque las técnicas de sallo de exón son capaces de inducir la síntesis de distrofina, elllos síntoma(s) de DMD es/son aún más aliviadofs por la administración a un paciente de OMD de un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supervivencia de la fibra muscular. Según la presente invención, incluso cuando una deficiencia de la proleína dislrofina ha sido restaurada en un paciente de DMD, la presencia de inflamación del tejido y células musculares dañadas todavía sigue contribuyendo a los síntomas de DMD. Por lo tanto, incluso aunque la causa de DMD -es decir una proteína distrofina disfuncional -es aliviada, ellratamiento de DMD sigue siendo además mejorado usando adicionalmente una 65 terapia complementaria según la presente invención. Además, la presente invención proporciona el conocimiento de que una reducción de la inflamación no supone una reducción significativa de absorción de
AON por células musculares. Esto es sorprendente porque, en general, la inflamación mejora el trafico de células, sangre y otros compuestos. Como resultado, la recepción/entrega de AON es mejorada también durante la inflamación. Por lo tanto, antes de la presente invención estaria previsto que una terapia complementaria para contrarrestar la inflamación implicaria el riesgo de influir negativamente en la terapia de
5 AON. Sin embargo, este resulta no ser el caso.
[0007) Se describe un método para el alivio de uno o más sintoma(s) de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en un individuo, el método comprendiendo:
• administración a dicho individuo de un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteina distrofina 10 (al menos parcialmente) funcional, y
• administración a dicho individuo de un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supelVivencia de la fibra muscular.
15 [0008) En otra forma de realización preferida de la divulgación el método para el alivio de uno o mas síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en un individuo comprende administración a dicho individuo de un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular, yfo un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supelVivencia de la fibra muscular.
[0009) La presente invención proporciona una combinación de:
* un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 44 de pre-mRNA de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEQ ID NO:10 o
* un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 25 45 de pre-mRNA de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEQ ID NO:60 y
* un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supelVivencia de la fibra muscular donde dicho compuesto complementario comprende un inhibidor de xantina, Dicha combinación siendo para el uso como un medicamento, para el alivio de uno o más síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en dicho individuo.
30 [0010) Se ha descubierto sorprendentemente que la frecuencia de sallo de un exón de dislrofina a partir de un pre-mRNA que comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido al exón o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exón, es mejorado si las células que expresan dicho pre-mRNA son también provistas de un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la
35 inflamación de tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supelVivencia de la fibra muscular. La frecuencia de salto mejorada también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producida en una célula muscular de un individuo de DMD o BMD.
[0011 ) También se describe un método para aumentar el salto de un exón a partir de un pre-mRNA de 40 distrofina en células que expresan dicho pre-mRNA, dicho método comprendiendo
*
contactar dicho pre-mRNA en dichas células con un oligonucleótido para el salto de dicho exón y,
*
contactar dichas células con un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad yfo supervivencia de la fibra muscular.
45 [0012) Como la distrofia muscular de Duchenne y de Becker tienen un fenotipo pronunciado en células musculares, se prefiere que dichas células sean células musculares. Preferiblemente dichas células comprenden un gen que codifica una proteína distrofina mutante. Preferiblemente dichas células son las células de un ind ividuo que sufre de OMD o BMO.
50 [0013) También se describe un método para aumentar el salto de un exón a partir de un pre-mRNA de distrofina en células que expresan dicho pre-mRNA en un individuo que sufre de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker, el método comprendiendo:
* administración a dicho individuo de un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina 55 (al menos parcialmente) funcional, y
* administración a dicho individuo de un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supervivencia de la fibra muscular.
60 [0014] Un individuo es provisto de una proteína distrofina funcional en varias maneras. En una forma de realización, se aplica una técnica de salto de exÓn. Sin embargo, métodos alternativos estan disponibles según la divulgación, tal como por ejemplo supresión de codón de parada por gentamicina o PTC12416•17 (conocido también como ácido 3-(5-(2-fluorofenil)-1 ,!o4-oxadiazol-3-il)benzoico), yfo entrega de genes mediada por virus adeno-asociado (AAV) de un genIa. de mini o micro-distrofina funcional. PTC124""" es
65 una marca registrada de PTC Therapeutics, Inc. South Plainfield, New Jersey.
[0015) Tal y como se define aquí, una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina tipo salvaje que corresponde con una proteína con la secuencía de aminoácidos se9ún se identifica en SEQ ID N.o: 1. Una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina, que tiene un dominio de unión de actina en su parte N terminal (primeros 240 aminoácidos en el término N), un dominio rico en cisteína (aminoácido 3361 hasta 5 3685) Y un dominio C terminal (últimos 325 aminoácidos en el término C) cada uno de estos dominios estando presente en una distrofina tipo salvaje como se conoce por la persona experta. Los aminoácidos indicados aquí corresponden a aminoácidos de la distrofina tipo salvaje que se representan por SEQ ID NO:1. En otras palabras, una distrofina funcional es una distrofina Que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina tipo salvaje. "Hasta cierto punto" significa preferiblemente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de una actividad correspondiente de una distrofina funcional tipo salvaje. En este contexto, una actividad de una distrofina funcional es preferiblemente la unión a la actina y al complejo de glicoproteína (DGC )56 asociado a la distrofina. La unión de distrofina a actina y al complejo DGC se puede visualizar bien por co-inmunoprecipitación usando extractos de proteína totales o analisis de inmunofluorescencia de secciones transversales, a partir de una biopsia de un músculo sospechado
15 distrófico, como sabe la persona experta.
[0016) Individuos que sufren distrofia muscular de Duchenne tipicamente tienen una mutación en el gen que codifica la distrofina que previene la síntesis de la proteína completa, es decir de una parada prematura previene la síntesis del término C. En la distrofia muscular de Becker el gen de distrofina también comprende una mutación en comparación con el tipo salvaje pero la mutación tipicamente no incluye un tope prematuro y el término C es sintetizado típicamente. Como resultado una proteína distrofina funcional se sintetiza que tiene al menos la misma actividad en especie que la proteína tipo salvaje, aunque no necesariamente la misma cantidad de actividad. El genoma de un individuo con BMD codifica típicamente una proteína distrofina que comprende la parte N terminal (primeros 240 aminoácidos en el término N), un dominio rico en cisteína 25 (aminoácido 3361 hasta 3685) y un dominio C terminal (últimos 325 aminoácidos en el término C) pero su dominio con forma de barra central puede ser mas corto que el de una distrofina56 de tipo salvaje. El salto de exón para el tratamiento de DMD está típicamente dirigido para superar una parada prematura en el premRNA saltando un exón en el dominio formado del dominio de barra para corregir el marco de lectura y permitir la síntesis del resto de la proteína distrofina con el término C, aunque la proteína es algo mas pequeña como resultado de un dominio de barra menor. En una forma de realización preferida, a un individuo con DMD y tratado por un método tal y como se define aquí se le proporcionará una distrofina Que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina tipo salvaje. Más preferiblemente, si dicho individuo es un paciente de Duchenne o se sospecha que sea un paciente de Duchenne, una distrofina funcional es una distrofina de un individuo con BMD: típicamente dicha distrofina es capaz de interactuar tanto con actina
35 como con DGC, pero su dominio con forma de barra central puede ser mas corto que el de una distrofina tipo salvaje (Aartsma-Rus et al (2006, ref 56). El dominio de barra central de distrofina tipo salvaje comprende 24 repeticiones56 tipo espectrina. Por ejemplo, un dominio con forma de barra central de una distrofina como se proporciona aquí puede comprender 5 a 23, 10 a 22 o 12 a 18 repeticiones tipo espectrina en la medida que puede enlazarse con actina y con DGC.
[0017) El alivio de uno o más síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en un individuo en un método de la divulgación se puede evaluar por cualquiera de los ensayos siguientes: prolongación del tiempo hasta dejar de caminar, mejora de la fuerza muscular, mejora de la capacidad para levantar peso, mejora del tiempo tomado para levantarse del suelo, mejora en el tiempo para caminar nueve 45 metros, mejora en el tiempo tomado para subir cuatro escaleras, mejora de la calidad de la función de la pierna, mejora de la función pulmonar, mejora de la función cardíaca, mejora de la calidad de vida. Cada uno de estos ensayos se conoce por la persona experta. Como un ejemplo, la publicación de Manzur et al (2008, ref 58) da una explicación extensa de cada uno de estos ensayos. Para cada uno de estos ensayos, tan pronto como una mejora detectable o prolongación de un parámetro medido en un ensayo ha sido descubierta, preferiblemente significara Que uno o mas síntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker ha sido aliviada en un individuo usando un método de la divulgación. Mejora o prolongación detectable es preferiblemente una mejora o prolongación estadísticamente significativa como se describe en Hodgetts et al (2006, ref 57). Altemativamente, el alivio de uno o más síntoma{s) de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker se puede evaluar por la medición de una mejora de
55 una función de fibra muscular, integridad ylo supervivencia como se define más tarde aquí.
[0018) En la presente descripción, un compuesto complementario para reducir la inflamación comprende cualquier terapia que es capaz de al menos reducir en parte la inflamación, preferiblemente inflamación provocada por células musculares dañadas. Dicho compuesto complementario es más preferiblemente capaz de reducir la inflamación de tejido muscular. La inflamación es preferiblemente evaluada por la detección de un aumento en el número de las células inmunes infiltrantes tales como neutrófilos ylo mastocitos ylo células dendríticas yfo linfocitos en el tejido muscular que se sospecha ~e sea distrófico. Esta evaluac ión es preferiblemente realizada en secciones transversales de una biopsia 7 de tejido muscular que se sospecha que sea distrófico después de tener células inmunes específicamente teñidas según se identifica arriba. La 65 cuantificación es preferiblemente realizada bajo el microscopio. La reducción de la inflamación es por lo tanto preferiblemente evaluada por la detección de una reducción en el número de células inmunes en una sección
transversal de tejido muscular que se sospecha que sea distrófico. La detección de una reducción preferiblemente significa que el número de al menos una clase de células inmunes según se identifica arriba se reduce de al menos 1 '%, 2'%, 3'%, 5'%, 7'%, 10%, 12'%, 15%, 17'%, 20%, 30%, 40'%, 50%, 60'%, 70%, 80'%, 900!o o más en comparación con el número de una célula inmune correspondiente en un mismo individuo
5 antes del tratamiento. De la forma más preferible, ninguna célula inmune infiltrante se detecta en secciones transversales de dicha biopsia.
[0019) Un compuesto complementario para mejorar la función, integridad yfo supervivencia de la fibra muscular comprende cualquier terapia que es capaz de aumentar hasta cierto grado la función, integridad yfo 10 supervivencia de la fibra muscular en comparación con una situación similar diferente donde dicho compuesto complementario no está presente. La mejora de la función, integridad yfo supervivencia de la fibra muscular se puede evaluar utilizando al menos uno de los siguientes ensayos: una reducción detectable de creatina-cinasa en sangre, una reducción detectable de necrosis de fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que sea distrófico, yfo un aumento detectable de la
15 homogeneidad del diámetro de fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que sea distrófico. Cada uno de estos ensayos se conoce por la persona experta.
[0020) La creatina-cinasa se puede detectar en sangre como se describe en 57. Una reducción detectable en la creatina-cinasa puede significar una reducción de 5%,10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%,80%,90% o 20 más en comparación con la concentración de creatina-cinasa en un mismo individuo antes del tratamiento.
[0021) Una reducción detectable de necrosis de fibras musculares es preferiblemente evaluada en una biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en 57 usando secciones transversales de biopsia. Una reducción detectable de necrosis puede ser una reducción de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,
25 70%, 80%, 90% o más del área donde se ha identificado la necrosis usando secciones transversales de biopsia. La reducción se mide por comparación a la necrosis como se evalúa en un mismo individuo antes del tratamiento.
[0022) Un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de una fibra muscular es preferiblemente 30 evaluada en una sección transversal de biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en 57.
[0023) Un tratamiento es de aproximadamente al menos una semana, aproximadamente de al menos un mes, aproximadamente de al menos varios meses, aproximadamente de al menos un año, aproximadamente de al menos 2, 3, 4, 5, 6 años o más.
[0024) En una forma de realización de la divulgación se usa un compuesto complementario para aumentar la producción de células musculares dañadas. Un compuesto complementario para aumentar la producción de células musculares dañadas comprende cualquier terapia que es capaz de al menos inducir en parte yfo producir renovación de células musculares dañadas. Células musculares dañadas son células musculares 40 que tienen funcionalidad significativamente menos cuantificable clínicamente que una célula muscular sana intacta. En ausencia de distrofina, el estrés mecánico lleva a rupturas del sarcolema, causando un flujO descontrolado de calcio en la fibra muscular interior, asi activando las proteasas activadas por calcio y la necrosis de fibras, dando como resultado células musculares dañadas. El aumento de la renovación de células musculares dañadas significa que las células musculares dañadas son descompuestas más 45 rápidamente yfo quitadas en comparación con una situación donde la producción de células musculares dañadas no es aumentada. La renovación de células musculares dañadas es preferiblemente evaluada en una biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en 57 usando una sección transversal de una biopsia. Un aumento detectable de producción puede ser un aumento de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más del area donde la renovación ha sido identificada utilizando una sección
50 transversal de biopsia. El aumento se mide por comparación a la producción como se evalúa en un mismo individuo antes del tratamiento.
[0025) Sin deseo de limitarse a la teoria, se cree que el aumento de la renovación de células musculares es preferido porque reduce las respuestas inflamatorias.
55 [0026) Según la presente descripción, una combinación de una terapia para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional, junto con una terapia complementaria para la reducción de la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular en un individuo, es particularmente adecuada para uso como un medicamento. Tal combinación es aún más capaz de aliviar uno o más síntoma(s) de
60 distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en comparación con una terapia única para suministrar un individuo con una proteina distrofina funcional. Esta forma de realización también mejora la frecuencia de salto de un exón de distrofina a partir de un pre-mRNA que comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido hacia el exón o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exón. La frecuencia de salto mejorado también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producida en una célula muscular
65 de un individuo con DMD o BMD.
[0027] También se proporciona por lo tanto una combinación de un compuesto para suministrar a un individuo una proteina distrofina funcional, y un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inHamación de tejido muscular en dicho individuo, para uso como un medicamento. Ya que dicha combinación es particularmente adecuada para contrarrestar DMD, la
5 divulgación también proporciona un uso de un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional, y un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular en dicho individuo, para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o mas síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o mas síntoma(s) de una forma severa de BMD donde una proteina distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
[0028) En la divulgación, compuestos complementarios preferidos para reducir la inflamación incluyen un esteroide, un TNF, un inhibitor, una fuente de mIGF-1 ylo un antioxidante. Sin embargo, cualquier otro compuesto capaz de reducir la inflamación tal y como se define aquí esta comprendido también en la
15 presente descripción. Cada uno de estos compuestos se presenta de forma más extensa mas adelante. Cada uno de los compuestos presentado de forma más extensa se pueden utilizar separadamente o en combinación entre si ylo en combinación con uno o mas de los compuestos complementarios usados para mejorar la función, integridad ylo supervivencia de la fibra muscular.
[0029) Ademas, una combinación de una terapia para suministrar a un individuo una proteina distrofina funcional, junto con una terapia complementaria para mejorar la función, integridad ylo supervivencia de fibra muscular en un individuo es particularmente adecuada para el uso como un medicamento. Tal combinación es aún mas capaz de aliviar uno o más síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne en comparación con una terapia única para suministrar a un individuo una proteina distrofina funcional.
25 [0030) También se proporciona por lo tanto una combinación de un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional, y un compuesto complementario para mejorar la función, integridad ylo supervivencia de la fibra muscular en dicho individuo, para el uso como un medicamento. Esta combinación es también especialmente adecuada para contrarrestar DMD. Un uso de un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional, y un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o super.;ivencia de la fibra muscular en dicho individuo, para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o más síntoma{s) de distrofia muscular de Duchenne es por lo tanto también proporcionado. En una forma de realización, dicha combinación se usa para aliviar uno o más síntoma(s) de una forma severa de BMD donde se forma una proteína distrofina muy corta que no es
35 suficientemente funcional.
[0031) En la divulgación, compuestos complementarios preferidos para mejorar la función de la fibra muscular, integ ridad ylo supervivencia incluyen un inhibidor de canal iónico, un inhibidor de proteasa, Larginina ylo un bloqueador del receptor tipo 1 de angiotensina 11. Sin embargo, cualquier otro compuesto capaz de mejorar la función, integridad ylo supervivencia de la fibra muscular tal y como se define aquí esta comprendido también en la presente descripción. Un inhibidor de xantina es un compuesto complementario según la invención. Cada uno de estos compuestos es mas adelante presentado de forma extensa. Cada uno de los compuestos presentado de forma extensa se puede utilizar separadamente o en combinación entre sí ylo en combinación con uno o mas de los compuestos complementarios usados para reducir la inflamación.
45 [0032) En una forma de realización de la divulgación, se prepara un producto farmacéutico que comprende al menos una de las combinaciones anteriormente mencionadas que comprende un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional junto con un compuesto complementario según la invención. Se proporciona ademas por lo tanto un producto farmacéutico que comprende:
•
un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional, y
•
un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular en dicho individuo, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad yfo supervivencia de la fibra muscular en dicho individuo, y
•
un porlador farmacéutica mente aceptable, adyuvante, diluyente y/o excipiente.
[0033) En una forma de realización de la invención se proporciona un producto farmacéutico que comprende:
•
una combinación según la invención; y
•
un porlador farmacéutica mente aceptable, adyuvante, diluyente y/o excipiente.
[0034) Ejemplos de soporles adecuados y adyuvantes se conocen bien en la técnica y por ejemplo comprenden una solución de solución salina. Rangos de dosis de compuestos usados en un producto farmacéutico son diseñados basándose en estudios de dosis en aumento en pruebas clín icas para los cuales existen requisitos rigurosos de protocolo.
65 [0035) En una forma de realización preferida particularmente de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional se combina con un esteroide. Como se muestra en los ejemplos de referencia, tal combinación produce alivio significativo de síntomas de DMD. Una forma de realización preferida de la presente descripción por lo tanto proporciona un método para el alivio de uno o mas síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administrar a dicho individuo un esteroide y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina
5 funcional. Una combinación de un esteroide y un compuesto para suministrar a un individuo una proteina distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionado en la divulgación, al igual que un uso de un esteroide y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o mas síntoma(s) de DMD. Esta forma de realización de la divulgación también mejora la frecuencia de salto de un exón de distrofina a partir de un premRNA que comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido hacia el exón o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exón. La frecuencia de salto mejorado también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producido en una célula muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0036) En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o mas 15 sínloma(s) de una forma severa de BMD donde una proteína dislrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
[0037) Un esteroide es un lípido terpenoide caracterizado por un esqueleto de carbono con cuatro anillos fusionados, generalmente dispuestos en una forma 6-6-6-5. Los esteroides varían por los grupos funcionales fijados a estos anillos y el estado de oxidación de los anillos. Los esteroides incluyen hormonas y farmacos que se usan normalmente para aliviar la hinchazón e innamación, tal como por ejemplo prednisona, dexametasona y vitam ina D.
[0038) Según la presente descripción, efectos adicionales de terapia de esteroide complementaria en
25 pacientes de DMD incluyen reducción de inflamación de tejido, supresión de células citotóxicas, y homeostasis de calcio mejorada. Muchos resultados pOSitivos se obtienen en niños mas jóvenes. Preferiblemente el esteroide es un corticoesteroide (glucocorticoesteroide). Preferiblemente, esteroides de prednisona (tal como prednisona, prednisolona o deflazacort) se usan en un método según la divulgación21 . Rangos de dosis de (glucocortico}esteroides para ser usados en las aplicaciones terapéuticos como se describe en este caso se diseñan basandose en estudios de dosis en aumento en pruebas clínicas para las cuales existen requisitos de protocolo rigurosos. l as dosis usuales -1.0 aproximadamente 0.5 -1.0 mgfkgldia, preferiblemente aproximadamente 0,75 mg/kg/dia para prednisona y prednisolo na, y aproximadamente 0,4 -1.4 mg/kg/dia , preferiblemente aproximadamente 0,9 mg/kg/dia para denazacort.
35 [0039) En una forma de realización de la divulgación, un esteroide se administra a dicho individuo antes de administrar un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional. En esta forma de realización de la divulgación, se prefiere que dicho esteroide se administre al menos un dia, mas preferido al menos una semana, mas preferido al menos dos semanas, más preferido al menos tres semanas antes de administrar un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional.
[0040) En otra forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo una proteina distrofina funcional se combina con un inhibidor del factor alfa de necrosis tumoral (TNFa). Factor alfa de necrosis tumoral (TNFu) es una citocina proinflamatoria que estimula la respuesta inflamatoria. El bloqueo farmacológico de la actividad de TNFa con el anticuerpo inHiximab neutralizante (Remicade) es 45 altamente eficaz clínicamente para reducir los síntomas de enfermedades innamatorias. En ratones mdx,
tanto inHiximab como etanercept retrasan y reducen la necrosis del músculo distrófic024 . , con beneficios fisiológicos adicionales en la fuerza muscular, función del canal de cloruro y redujo los niveles de CK que se demuestran en ratones mdx adultos ejercitados tratados de manera crónicaU. Tales farmacos antiinnamatorios específicos altamente diseñados para usar en otras condiciones clínicas, son alternativas atractivas para el uso de esteroides para DMD. En una forma de realización, el uso de un inhibidor de TNFo. se limita a periodos de crecimiento muscular intensivo en niños cuando el daño y el deterioro muscular son especialmente pronunciados.
[0041) Un aspecto de la presente descripción asi proporciona un método para el alivio de uno o más
55 síntoma{s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administrar a dicho individuo un inhibidor de TNFa y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional. Una combinación de un inhibidor de TNFa y un compuesto para suministrar a individuo una proteína distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionado en la divulgación, al igual que un uso de un inhibidor de TNFa y un compuesto para proporcionar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o mas síntoma(s) de DMD. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o más síntoma{s) de una forma severa de BMD donde una proteína distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Un inhibidor de TNFu preferido según la divulgación es una proteína de fusión dimérica que consiste en el dominio de enlace de ligandos extracelulares del receptor p75 humano de TNFa enlazado a la
65 porCión de Fc de IgGl humano. Un inhibidor de TNFo. más preferido es etanercept {Amgen, America)26. Las dosis usuales de etanercept es aproximadamente 0,2 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 0,5 mgfkg dos veces por semana. La administración es preferiblemente subcutánea.
[0042) En otra forma de realización preferida según la divulgación, un compuesto para suministrar a un
5 índividuo una proteína distrofina funcional se combina con una fuente de mIGF-1. Tal y como se define aqu í, una fuente de IGF-1 preferiblemente abarca mIGF-1 misma, un compuesto capaz de aumentar la expresión y/o actividad de mIGF-1. Mejora es aquí sinónimo de aumento. Expresión de mIGF-1 es sinónimo de cantidad de mIGF-1 . mIGF-1 promueve la regeneración de músculos a través del aumento en la actividad de la célula satelital, y reduce la inflamación y fibrosis27. Herida Local de músculo resulta en la expresión de mlGF-l
10 aumentada. En ratones tran~énicos con genes IGF-l extra, hipertrofia muscular y fibras musculares aumentadas son observadas27. De forma similar, ratones mdx transgénicos muestran degeneración28 de fibra muscular reducida. La regulación del gen mlGF-l y{o administración de cantidades extra de proteína mlGF-l
o un equivalente funcional de la misma (especialmente la isoforma Ea de mIGF-1 [como se describe en 27, isoforma 4 de IGF-1 de homólogo humano: SEQ ID N.O: 2)) así promueve el efecto de otras terapias para 15 DMD, preferiblemente genéticas, incluyendo el salto de exón inducido por antisentido. Los niveles de mlGF-l adicionales en los ratones transgénicos anteriormente mencionados no inducen problemas cardíacos ni promueven cáncer, y no tienen efectos secundarios patológicos. Un aspecto de la presente descripción así proporciona un método para el alivio de uno o más síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administrar a dicho individuo un compuesto para suministrar a dicho
20 índividuo una proteína distrofina funcional, y suministrar a dicho individuo una fuente de mIGF-1 , preferiblemente mIGF-1 mismo, un compuesto capaz de aumentar la expresión y/o actividad de mIGF-1. Como se ha declarado antes, la cantidad de mIGF-1 es por ejemplo aumentada por la expresión de aumento del gen mIGF-1 y/o por administración de proteína de mIGF-1 y{o un equivalente funcional de la misma (especialmente la isoforma Ea de mIGF-1 [como se describe en 27 , isoforma 4 de IGF-1 de homólogo
25 humano: SEQ ID N.O: 2)). Una combinación de mIGF-1, o un compuesto capaz de aumentar la expresión mIGF-1 o una actividad de mIGF-1, y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para uso como un medicamento es también proporcionado en la divulgación, al igual que un uso de mIGF-1 , o un compuesto capaz de aumentar la expresión de mIGF-1 o actividad de mIGF-1 , y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para
30 el alivio de uno o más síntoma(s) de DMD. En una forma de realización, tal combinación se usa para aliviar uno o más síntoma(s) de una forma severa de BMD donde se forma una proteína distrofina muy corta que no es suficientemente funcional.
[0043) En el contexto de la divulgación, una cantidad aumentada o actividad de mIGF-1 se puede alcanzar
35 mediante el aumento del nivel de expresión génica de un gen IGF-1 , aumentando la cantidad de una proteína de IGF-1 correspondiente y{o aumentando una actividad de una proteína de IGF1. Una proteína de mIGF-1 ha sido definida anteriormente aqui. Un aumento de una actividad de dicha proteína pretende aquí significar cualquier cambio detectable en una actividad biológíca ejercida por dicha proteína o en el nivel estable de dicha proteína en comparación con dicha actividad o estado estable en un individuo que no ha sido tratado.
40 Cantidad o actividad aumentada de mIGF-1 es preferiblemente evaluada por detección de expresión aumentada de biomarcador GATA-2 de hipertrofia muscular (como se describe en 27).
[0044) El nivel de expresión génica es preferiblemente evaluado usando técnicas de biología molecular tradicionales tales como PCR (tiempo real), matrices o análisis de Northern. Un nivel estable de una proteína 45 se determina directamente por la cuantificación de la cantidad de una proteína. La cuantificación de una cantidad de proteína se puede realizar por cualquier técnica conocida tal como método de Western blot o inmunoensayo usando un anticuerpo dirigido contra una proteína. Un experto entenderá que alternativamente
o en combinación con la cuantificación de un nivel de expresión génica y{o una proteína correspondiente, la cuantificación de un sustrato de una proteína correspondiente o de cualquier compuesto conocido por estar
50 asociado con una función o actividad de una proteína correspondiente o la cuantificación de dicha función o actividad de una proteína correspondiente usando un ensayo específico se puede utilizar para valorar la alteración de un nivel de actividad o estado estable de una proteína.
[0045) En un método de la divulgación, una actividad o nivel de estado estable de dicha proteína se puede 55 alterar a nivel de la proteína misma, por ejemplo suministrando una proteína a una célula a partir de una fuente exógena.
[0046) Preferiblemente, en la divulgación, un aumento o una regulación del nivel de expresión de dicho gen significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresión de dicho gen que usa matrices. Mas 60 preferiblemente, un aumento del nivel de expresión de dicho gen significa un aumento de al menos 10%, aún más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o más. En otra forma de realización preferida de la divulgación, un aumento del nivel de expresión de dicha proteína significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresión de dicha proteína usando el método de Western blol y{o usando ELlSA o un ensayo adecuado. Mas preferiblemente, un 65 aumento del nivel de expresión de una proteína significa un aumento de al menos 10%, aún más
preferiblemente al menos 20%, al menos 300!o, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o más.
[0047] En otra forma de realización preferida de la divulgación, un aumento de una actividad de polipéptido
5 significa un aumento de al menos 5% de una actividad de polipéptido utilizando un ensayo adecuado. Más preferiblemente, un aumento de una actividad de polipéptido significa un aumento de al menos 10%, aún más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o más. El aumento es preferiblemente evaluado por comparación con la actividad correspondiente en el individuo antes del tratamiento.
[0048) Una vía preferida de proporcionar una fuente de mlGF1 según la divulgación es introducir un transgen que codifica mIGF1, preferiblemente una isoforma Ea de mIGF-1 (como se describe en 27, isoforma 4 de IGF-1 del homólogo humano: SEQ ID N.O: 2), más preferiblemente en un vector AAV como se define más adelante en la presente. Tal fuente de mlGF1 es especificamente expresada en el tejido muscular como se
15 describe en ratones en 27.
[0049) En otra forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional se combina con un antioxidante. El estrés oxidativo es un factor importante en la progresión de DMD y promueve la inflamación crónica y fibrosisZ9. Los productos más predominantes del estrés oxidativo, los lipidos peroxidados, se aumentan por un promedio de 35% en niños de Duchenne. Niveles aumentados de las enzimas superóxido-dismutasa y catalasa reducen la cantidad excesiva de radicales libres causando estos efectos. De hecho, un suplemento dietético Protandim® (LifeVantage) fue evaluado clínicamente y se encontró que aumentaba los niveles de superóxido-dismutasa (hasta 30%) y catalasa (hasta 54%), que de hecho inhibió significativamente la peroxidación de Ifpidos en 29 personas 25 sanas30. Tal gestión eficaz de estrés oxidativo asi preserva la calidad muscular y asi promueve el efecto pOSitivo de la terapia de DMD. Idebenona es otro antioxidante potente con una estructura quimica derivada de la coenzima natural Q10. Protege las mitocondrias donde se genera adenosina trifosfato, ATP, por fosforilación oxidativa. La ausencia de distrofina en DMo afecta negativamente este proceso en el corazón, y probablemente también en el músculo esquelético. Idebenona fue recientemente aplicada en pruebas clinicas en EEUU y Europa demostrando la eficacia en aspectos neurológicos de Ataxia de Friedreich31 . Un ensayo clinico aleatorizado controlado por placebo, doble ciego, de fase lIa con Idebenona ha sido recientemente comenzado en Bélgica, incluyendo 21 niños con Duchenne de 8 a 16 años de edad. El objetivo primario de este estudio es determinar el efecto de Idebenona en la función del músculo cardiaco. Además diferentes pruebas serán realizadas para detectar el beneficio funcional posible en la fuerza muscular en los pacientes. 35 Cuando es eficaz, Idebenona es un compuesto complementario preferido para usar en un método según la presente descripción para mejorar el efecto terapéutico de la terapia de DMD, especialmente en el corazón. Un aspecto de la presente descripción así proporciona un método para el alivio de uno o más sintoma{s) de distrofia muscular de ouchenne en un individuo, el método comprendiendo la administración a dicho individuo de un antioxidante y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteina distrofina funcional. Una combinación de un antioxidante y un compuesto para suministrar a un individuo una proteina distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionado en la divulgación, al igual que un uso de un antioxidante y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o más sintoma{s) de DMD. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o más sintoma(s) de una forma severa de BMD
45 donde una proteina distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Dependiendo de la identidad del antioxidante, la persona experta conocerá qué cantidades son preferiblemente usadas. Un antioxidante puede incluir bacósido, silimarina, curcumina, un polifenol, preferiblemente epigalocatequina-3galato (EGCG). Preferiblemente, un antioxidante es una mezcla de antioxidantes como el suplemento dietético Protandim® (LifeVantage). Una cápsula diaria de 675mg de Protandim® comprende 150 mg de B. monniera (45% bacósidos), 225mg de S. marianum (70-80% silimarina), 150 mg de pOlvo de W. somnifera, 75mg de té verde (98% polifenoles donde 45% EGCG) y 75mg cúrcuma (95% curcumina).
[0050) En otra forma de realización preferida, un compuesto para suministrar a un individuo una proteina distrofina funcional se combina con un inhibidor de canal iónico. La presencia de membranas musculares 55 dañadas en DMD altera el pasaje de iones de calcio en las miofibras, y la homeostasis de calcio interrumpida en consecuencia activa muchas enzimas, por ejemplo proteasas, que causan daño adicional y necrosis muscular. Canales iónicos que contribuyen directamente a la acumulación patológica de calcio en el músculo distrófico son objetivos potenciales para compuestos complementarios lfIra tratar DMD. Existen pruebas de que algunos fármacos, tal como pentoxifllina, bloquean los canales de calcio sensibles al ejercicio y antibióticos que bloquean canales activados extendidos reducen la necrosis de miofibra en ratones mdx y niveles de CK en chicos con DM033. Una forma de realización asi proporciona un método para el alivio de uno o más sintoma(s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administración a dicho individuo de un inhibidor de canal iónico y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteina distrofina funcional. Una combinación de un inhibidor de canal iónico y un compuesto 65 para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionado, al igual que un uso de un inhibidor de canal iónico y un compuesto para suministrar a
un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o más síntoma(s) de DMD. En una forma de realización, dicha combinación se usa para aliviar uno o más síntoma(s) de una forma severa de BMD donde una proteína distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
[0051) En la invencíón, se usan inhibidores de canal iónico de la clase de xantínas. Más preferiblemente, dichas xantinas son los derivados de metilxantinas, y de la forma más preferible, dichos derivados de metilxantina son elegidos del grupo que consiste en pentoxifilina, furafilina, isofilina, propentofilina, pentifilina, teofilina, torbafilina, albifilina, enprofilina y derivados de las mismas. El más preferido es el uso de pentoxifilina. Inhibidores de canal iónico de la clase de xantínas mejoran la frecuencia de salto de un exón de distrofina a partir de un pre-mRNA que comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido al exón o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exón. La frecuencia de sallo mejorado también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producido en una célula muscular de un individuo con DMD o BMD.
15 [0052) Dependiendo de la identidad del inhibidor de canal iónico, la persona experta conocerá qué cantidades son preferiblemente usadas. Dosificaciones adecuadas de pentoxifilina están entre aproximadamente 1 mgfkgfdía a aproximadamente 100 mgfkgfdía, dosificaciones preferidas están entre aproximadamente 10 mgfkgldía a 50 m9/kg/día. Dosificaciones típicas usadas en seres humanos son 20 mg/kg/día .
[0053) En una forma de realización, un inhibidor de canal iónico se administra a dicho índividuo antes de administrar un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional. En esta forma de realización, se prefiere que dicho inhibidor de canal iónico se administre al menos un día, más preferido al menos una semana, más preferido al menos dos semanas, más preferido al menos tres semanas antes de administrar un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional.
25 [0054) En otra forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional se combina con un inhibidor de proteasa. Calpaínas son proteasas activadas por calcio que aumentan en el músculo distrófico y Justifican la degeneración de miofibras. Inhibidores de calpaína tal como calpastatina, leupeptina34, calpeptina, inhibidor de calpaína 111, o PD150606 son por lo tanto aplicados para reducir el proceso de degeneración. Un compuesto nuevo, BN 82270 (Ipsen) que tiene acción doble ya que tanto un inhibidor de calpaína como un antioxidante aumentaron la fuerza muscular, disminuyeron el suero CK y redujeron la fibrosis del diafragma de mdx, indicando un efecto terapéutico con este nuevo compuest035. Otro compuesto de Leupeptina/Carnitina (Myodur) ha sido propuesto recientemente para pruebas clínicas en pacientes de DMD.
35 [0055) MG132 es otro inhibidor proteasómico que ha mostrado que reduce el daño de membrana muscular, y mejora las señales histopatológicas de distrofia muscular36. MG-132 (CBZ-Ieucil-Ieucil-Ieucinal) es un ínhibidor proteasómico permeable a las células (Ki=4nM), que inhibe la activación de NFkappaB evitando la degradación IkappaS (ICSO = 3 j.JM). Además, es un péptido aldehído que inhibe la proteólisis mediada por ubiquitina por la unión a y la inactivación de proteasomas 20S y 26S. MG-132 ha mostrado que inhibe la degradación proteasómica de proteínas asociadas a la distrofina en el modelo de ratón mdx distrófico36. Este compuesto es así también adecuado para el uso como un compuesto farmacológico complementario para DMD. Además se proporciona en la divulgación por lo tanto un método para el alivio de uno o más síntoma{s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administrar a dicho individuo
45 un inhibidor de proteasa y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteina distrofina funcional. Una combinación de un inhibidor de proteasa y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionada en la divulgación, al igual que un uso de un inhibidor de proleasa y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o más síntoma(s) de DMD. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o más síntoma(s) de una forma severa de BMD donde una proteína distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Dependiendo de la identidad del inhibidor de proteasa, la persona experta sabrá qué cantidades son preferiblemente usadas.
55 [0056) En otra forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional se combina con L-arginina. La falta de distrofina se une con la pérdida del complejo DGC en las membranas de fibra, incluyendo sintasa de óxido nítrico neuronal (nNOS). La expresión de un transgén de nNOS en ratones de mdx redujo enormemente el daño de la membrana muscular. De forma similar, la administración de L-arginina (el sustrato para sintasa de óxido nítrico) aumentó la producción de NO y la expresión de utrofina sobrerregulada en ratones mdx. Seis semanas de tratamiento con L-arginina mejoraron la patología muscular y redujeron CK del suero en ratones37 mdx. El uso de L-argin ina como una terapia complementaria en combinación con un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional no ha sido descrito.
65 [0057) Se proporciona además en la divulgación por lo tanto un método para el alivio de uno o más síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo la administración a dicho individuo de L-arginina y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional. Una combinación de L-ar9inina y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionada en la divulgación, al igual que un uso de L-arginina y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional
5 para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o mas síntoma{s) de DMD. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o más síntoma{s) de una forma severa de BMD donde una proteína distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
[0058) En otra forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional se combina con un bloqueador Losartan del receptor tipo 1 de angiotensina 11 que normaliza la arquitectura, reparación y función muscular, como se muestra en el model023 de ratón mdx deficiente de distrofina. Un aspecto de la presente descripción así proporciona un método para el alivio de uno o mas síntoma{s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administrar a dicho individuo el bloqueador Losartan del receptor de tipo 1 de angiotensina 11, y un compuesto
15 para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional. Una combinación de bloqueador Losartan del receptor de tipo 1 de angiotensina 11 y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionada en la divulgación, al igual que un uso del bloqueador Losartan del receptor de tipo 1 de angiotensina 11 y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o más síntoma{s) de DMD. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o mas síntoma{s) de una forma severa de BMD donde se forma una proteína distrofina muy corta que no es suficientemente funcional. Dependiendo de la identidad del bloqueador receptor de tipo 1 de angiotensina 11, la persona experta conocerá qué cantidades son preferiblemente usadas.
25 [0059) En otra forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional se combina con un inhibidor de enzima de conversión de angiotensina (ECA), preferiblemente perindoprilo. Inhibidores de ACE son capaces de reducir la presión sanguínea. La iniciación temprana del tratamiento con perindoprilo se asocia con una mortalidad inferior en pacientes22 de DMD. Un aspecto de la presente descripción así proporciona un método para el alivio de uno o mas síntoma{s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administración a dicho individuo un inhibidor ECA, preferiblemente perindoprilo, y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional. Una combinación de un inhibidor ECA, preferiblemente perindoprilo, y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionado en la divulgación, al igual que un uso de un inhibidor ECA,
35 preferiblemente perindoprilo, y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un medicamento para el alivio de uno o mas síntoma{s) de DMD. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o más síntoma{s) de una forma severa de BMD donde una proteína distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Las dosis usuales de un inhibidor de ECA, preferiblemente perindoprilo son aproximadamente 2 a 4 mg/día 22 .
[0060) En una forma de realización mas preferida de la divulgación, un inhibidor de ECA se combina con al menos uno de los compuestos complementarios identificados previamente.
[0061 ) En otra forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto para suministrar a un individuo
45 una proteína distrofina funcional se combina con un compuesto que es capaz de mejorar el salto de exón ylo inhibir el ensamblaje ylo empalme del espliceosoma. Compuestos químicos pequeños, tales como por ejemplo derivados de indol especificas, han sido mostrados para inhibir selectivamente el ensamblaje de esplíceosoma y el empalme38, por ejemplo por la interferencia con la unión de proteínas ricas en serina y arginina (SR) con sus potenciadores de empalme de cognado (ISE o ESE) ylo por la interferencia con la unión de los represores del empalme con secuencias silenciadoras (ESS o ISS). Estos compuestos son por lo tanto adecuados para aplicarse como compuestos complementarios que mejoran el salto de exón.
[0062) La divulgación proporciona además por lo tanto un método para el alivio de uno o más síntoma{s) de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el método comprendiendo administrar a dicho individuo un 55 compuesto para mejorar el salto de exón ylo inhibir el ensamblaje ylo empalme del espliceosoma, y un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional. Una combinación de un compuesto para mejorar el salto de exón ylo inhibir el ensamblaje ylo empalme del espliceosoma y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para el uso como un medicamento es también proporcionada en la divulgación, al igual que un uso de un compuesto para mejorar el salto de exón ylo inhibir el ensamblaje ylo empalme del espliceosoma y un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional para la preparación de un med icamento para el alivio de uno o más síntoma{s) de DMD. En una forma de realización de la divulgación, dicha combinación se usa para aliviar uno o mas síntoma{s) de una forma severa de BMD donde una proteína distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Dependiendo de la identidad del compuesto que es capaz de mejorar el 65 salto de exón ylo inhibir el ensamblaje ylo empa lme del espliceosoma , la persona experta sabra qué cantidades son preferiblemente usadas. En una forma de realización más preferida de la divulgación, un
compuesto para mejorar el salto de exón y/o inhibir el ensamblaje y/o empalme del espliceosoma se combina con un inhibidor de ECA y/o con cualquier compuesto complementario como se ha identificado aquí anteriormente.
5 [0063) Un producto farmacéutico que comprende un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional, cualquiera de los compuestos complementarios anteriormente mencionados, y un portador farmacéuticamente aceptable, reneno, conservante, adyuvante, solubilizador, diluyente y/o excipiente es también proporcionado. Tal portador farmacéuticamente aceptable, reneno, conservante, adyuvante, solubilizador, diluyente y{o excipiente puede por ejemplo encontrarse en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edición. Baltimore, MD: Lippincotl Williams & Wilkins, 2000.
[0064) La divulgación asi proporciona un método, combinación, uso o producto farmacéutico según la invención, donde dicho compuesto complementario comprende un esteroide, un inhibidor de ECA (preferiblemente perindoprilo), bloqueador Losartan del receptor tipo 1 de angiotensina 11, un inhibidor del
15 factor alfa de necrosis tumoral (TNFa), una fuente de mIGF-1, preferiblemente mIGF-1, un compuesto para la mejora de la expresión de mIGF-1 , un compuesto para la mejora de la actividad de mIGF-1, un antioxidante, un inhibidor de canal iónico, un inhibidor de proteasa, L-arginina ylo un compuesto para mejorar el salto de exón ylo inhibir el ensamblaje y/o empalme del espliceosoma. La invención así proporciona una combinación para uso, o un producto farmacéutico según la invención, donde dicho compuesto complementario comprende un inhibidor de canal iónico que es un inhibidor de xantina. Como se describe en la divulgación antes, un individuo dispone de una proteína distrofina funcional de varias maneras, por ejemplo por supresión del codón de parada por gentamicina o PTC124 16. 17, o por administración de gen mediada por virus adenoasociado (MV) de un gen de mini-o micro-disttofina funcionall 8-20.
25 [0065) Preferiblemente, sin embargo, dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional comprende un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, para al menos en parte disminuir la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho individuo. La disminución de la producción de un mRNA de distrofina aberrante, o proteína distrofina aberrante, preferiblemente significa que 900!o, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos de la cantidad inicial de mRNA de distrofina aberrante, o proteína distrofina aberrante, sigue siendo detectable por RT PCR (mRNA) o inmunofluorescencia o análisis de Western blot (proteína). Un mRNA de distrofina aberrante o proteína es también denominado en este caso un mRNA o proteína distrofina no funcional. Una proteína distrofina no funcional es preferiblemente una proteína distrofina que no es capaz de enlazar actina y/o elementos del complejo de proteína DGC. Una proteína distrofina no funcional o mRNA de distrofina típicamente no liene, o
35 no codifica una proteína distrofina con un término C intacto de la proteína. Dicho oligonucleótido preferiblemente comprende un oligorribonucleótido antisentido. En una forma de realización preferida una técnica de salto de exón es aplicada. Salto de exón interfiere con los procesos de empalme natural que ocurren dentro de una célula eucariota. En eucariotas más grandes la información genética para proteínas en el DNA de la célula se codifica en exones que son separados entre sí por secuencias intrónicas. Estos intrones son en algunos casos muy largos. La maquinaria de transcripción de eucariotas genera un premRNA que contiene tanto exones como intrones, mientras la maquinaria de empalme, frecuentemente ya durante la producción del pre-mRNA, genera la región de codificación real para la proteína empalmando entre sí los exones presentes en el pre-mRNA.
45 [0066) El salto de exón produce mRNA maduro que carece de al menos un exón saltado. Así, cuando dicho exón codifica para aminoácidos, salto de exón lleva a la expresión de un producto alterado. Tecnología para el salto de exón se dirige actualmente hacia el uso de oligonucleótidos antisentido (AON). Gran parte de este trabajo se hace en el modelo de ratón mdx para distrofia muscular de Duchenne. El ratón mdx, que lleva una mutación sin sentido en el exón 23 del gen de disttofina, ha sido usado como un modelo animal de DMD. A pesar de la mutación de mdx, que debería excluir la síntesis de una proteína distrofina funcional, fibras positivas de distrofina raras de origen natural han sido observadas en el tejido muscular de mdx. Estas fibras positivas de distrofina se considera que han surgido a partir de un mecanismo de salto de exón aparentemente de origen natural, bien debido a mutaciones somáticas o a través del empalme alternativo. AON dirigidos a, respectivamente, los sitios de empalme 3' y/o 5' de los intrones 22 y 23 en el pre-mRNA de
55 distrofina, han mostrado que ínterfieren con factores normalmente ímplicados en la elimínación del ínlrón 23 de modo que también el exón 23 fue quitado del mRNA3. 5. 6. 39. 40.
[0067) Por el salto previsto de un exón específico, un fenotipo DMD se convierte en un fenotipo de BMD más moderado. El salto de un exón es preferiblemente inducido por la unión de AON dirigido bien a uno o a ambos sitios de empalme, o secuencias internas del exÓn. Un oligonucleótido dirigido a una secuencia interna del exón típicamente no muestra ningún recubrimiento con secuencias sin exón. Preferiblemente no se superpone con los sitios de empalme al menos no en la medida en que estos están presentes en el intrón. Un oligonucleótido dirigido a una secuencia interna del exón preferiblemente no contiene una secuencia complementaria para un intrón adyacente. Se proporciona además por tanto un método, combinación, uso o 65 producto farmacéutico según la invención, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional comprende un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, para inhibir
la inclusión de un exón de un pre-mRNA de distrofina en el mRNA producido del empalme de dicho premRNA. Una técnica de salto de exón es preferiblemente aplicada de manera que la ausencia de un exón de mRNA producido de pre-mRNA de distrofina genera una región de codificación para una proteína distrofina funcional -sin embargo mas corta . En este contexto , la in hibición de la inclusión de un exón preferiblemente
5 si9nifica que la detección del mRNA de distrofina aberrante ori9inal, es disminuido de al menos aproximadamente 10% como evaluado por RT-PCR o que una proteína distrofina aberrante correspondiente es disminuida de al menos aproximadamente 10% como evaluado por inmunofluorescencia o analisis de electrotransferencia. La reducción es preferiblemente de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 900!o o 100%.
[0068) Una vez que un paciente de DMD es provisto con una proteína distrofina funcional, la causa de DMD se elimina. Por lo tanto, luego se esperaría que los síntomas de DMD fueran suficientemente aliviados. Sin embargo, como ya se ha descrito antes, la presente invención proporciona el conocimiento de que, aunque técnicas de salto de exón son capaces de proporcionar una proteína distrofina funcional, un síntoma de DMD
15 sigue siendo aliviado administrando a un paciente de DMD un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular, ylo un compuesto complementario para mejorar la función, integridad ylo supervivencia de la fibra muscular. Además, la presente invención proporciona el conocimiento de que una terapia complementaria que contrarreste la inflamación no influenciara negativamente la terapia de AON. La presente invención ademas proporciona el conocimiento de que la frecuencia de salto de un exón de distrofina a partir de un pre-mRNA que comprende dicho exón es mejorado, cuando se usa un oligonucleótido dirigido hacia el exón o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exón. La frecuencia de salto mejorada también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producido en una célula muscular de un individuo con DMD o BMD.
25 [0069) Ya que un exón de un pre-mRNA de distrofina solo sera incluido en el mRNA resultante cuando los sitios de empalme se reconozcan por el complejo de espliceosoma, los sitios de empalme son objetivos obvios para AON. Una forma de realización de la divulgación por lo tanto proporciona un método, combinación, uso o producto farmacéutico según la divulgación, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional comprende un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria de una región sin exón de una distrofina premRNA. En una forma de realización se usa un AON Que es complementario solamente a una reg ión sin exón de una distrofina pre-mRNA. Esto sin embargo no es necesario: es posible también usar un AON que comprende una secuencia específica de intrón al igual que secuencia específica de exón. Tal AON comprende una secuencia que es complementaria de una región sin exón de una distrofina pre-mRNA, al
35 igual que una secuencia que es complementaria de una región de exón de una distrofina pre-mRNA. Por supuesto, un AON no es complementario necesariamente a la secuencia entera de un exón o intrón de distrofina. AON que son complementarios a una parte de tal exón o intrón son preferidos. Un AON es preferiblemente complementario a al menos parte de un exón ylo intrón de distrofina, dicha parte teniendo al menos 13 nucleótidos.
[0070) El empalme de un pre-mRNA de distrofina ocurre por medio de dos reacciones de transesterificación secuencial. Primero, el 2'OH de un nucleótido del punto de ramificación específico en el intrón que se define durante el ensamblaje del espliceosoma ejecuta un ataque nucleofílico en el primer nucleótido del intrón en el sitio de empalme 5' que forma el intermediario de lazo. Segundo, el 3'OH del exón 5' liberado luego ejecuta
45 un ataque nucleofílico en el nucleótido último del inlrón en el sitio de empalme 3' así uniendo los exones y liberando el lazo del intrón. El punto de derivación y sitios de empalme de un intrón están así implicados en un evento de empalme. Por lo tanto, un oligonucleótido que comprende una secuencia que es complementaria para tal punto de derivación ylo sitio de empalme es preferiblemente usado para el salto del exón. Se proporciona ademas por lo tanto un método, combinación, uso o producto farmacéutico según la divulgación, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional comprende un oligonucle6tido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de empalme yfo punto de derivación de una distrofina pre-mRNA.
[0071) Ya que los sitios de empalme contienen secuencias de consenso, el uso de un oligonucleótido o un 55 equivalente funcional del mismo (aquí también llamado un AON) que comprende una secuencia que es complementaria de un sitio de empalme implica el riesgo de hibridación promiscua. La hibridación de AON a otros sitios de empalme distintos de los sitios del exón a saltar podrían fácilmente interferir con la exactitud del proceso de empalme. Para superar estos y otros problemas potenciales relacionados con el uso de AON que son complementarios de una secuencia de intrón, una forma de realización preferida de la divulgación proporciona un método, combinación, uso o producto farmacéutico según la invención, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional comprende un oligonucleótido,
o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria de un exón de pre-mRNA de distrofina. Una forma de realización preferida de la invención proporciona una combinación para uso según la invención, o un producto farmacéutico según la invención, donde el AON comprende una
65 secuencia que es complementaria de un exón de pre-mRNA de distrofina. Preferiblemente, dicho AON es capaz de inh ibir específicamente una señal de inclusión de exón de al menos un exón en dicho pre-mRNA de distrofina. La interferencia con una señal de inclusión de exón (EIS) tiene la ventaja de que tales elementos se sitúan en el exón. Proporcionando un AON en el interior del exón que se debe sallar, es posible interferir con la señal de inclusión de exón así eficazmente enmascarando el exón desde el equipo de empalme. El fano del equipo de empalme para reconocer el exón que se debe saltar así neva a la exclusión del exón
5 desde el mRNA final. Esta forma de realización no interfiere directamente con el proceso enzimático de la maquinaria de empalme (la unión de los exones). Se piensa que esto permite que el método sea más especifico ylo fiable. Se piensa que una EIS es una estructura particular de un exón que permite al aceptor y donor de empalme asumir una conformación espacial particular. En este concepto la conformación espacial particular es la que permite que la maquinaria de empalme reconozca al exón. Sin embargo, la invención ciertamente no está limitada a este modelo. Se ha descubierto que agentes capaces de unirse a un exón son capaces de inhibir una EIS. Un AON puede específicamente contactar dicho exón en cualquier punto y todavía ser capaz de inhibir específicamente dicha EIS.
[0072) Usando AON internos de exón específicos para una secuencia de exón 46, pudimos modular
15 previamente el modelo de empalme en miotubos cultivados de dos pacientes de DMD diferentes con una deleción 11 del exón 45. Después del tratamiento de AON, el exón 46 fue saltado, lo que resultó en un marco de lectura restaurado y la inducción de síntesis de distrofina en al menos el 75% de las células. Recientemente hemos demostrado que el salto de exón puede también ser eficazmente inducido en el control humano y series de pacientes con mutaciones diferentes, incluyendo deleciones, duplicaciones y mutaciones puntuales, para 39 exones de DMD diferentes usando AON1.2·1 -lS internos del exÓn.
[0073) Un equivalente funcional de un oligonucleótido preferiblemente se refiere a un oligonucleótido tal y como se define aquí donde uno o más nucleótidos han sido sustituidos y donde una actividad de dicho equivalente funcional se retiene hasta al menos alguna extensión. Preferiblemente, una actividad de dicho
25 equivalente funcional está proporcionando una proteína distrofina funcional. Dicha actividad de dicho equivalente funcional es por lo tanto preferiblemente evaluada por la cuantificación de la cantidad de una proteína distrofina funcional. Una distrofina funcional es definida aquí preferiblemente como siendo una distrofina capaz de enlazar actina y miembros del complejO de proteína DGC. La evaluación de dicha actividad de un oligonucleótido es preferiblemente hecha por RT-PCR o por inmunofluorescencia o análisis de Western blol. Dicha actividad es preferiblemente retenida hasta al menos alguna extensión cuando representa al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70% o al menos BO% o al menos 90% o al menos 95% o más de actividad correspondiente de dicho oligonucleótido del cual deriva el equivalente funcional. En toda esta solicitud, cuando la palabra oligonucleótido se usa se puede sustituir por un equivalente funcional del mismo tal y como se define aquí.
35 [0074) Por lo tanto, el uso de un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de un exón de pre-mRNA de distrofina proporciona buenos resultados anti-DMD. En una forma de realización preferida de la divulgación un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, se usa que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria a al menos parte del exón de pre-mRNA de distrofina 2, 8, 9, 17, 19, 29,40-46,48-53,55 o 59, dicha parte teniendo al menos 13 nucleótidos. Si n embargo, dicha parte también puede tener al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos.
[0075) De la forma más preferible un AON se usa que comprende o consiste en una secuencia que es
45 complementaria a al menos parte del exón de pre-mRNA de distrofina 51, 44, 45, 53, 46, 43, 2, 8,50 ylo 52, dicha parte teniendo al menos 13 nucleótidos. Sin embargo, dicha parte también puede tener al menos 14, 15, 16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26, 27,28,29, 30 nucleótidos. Muchos oligonucleótidos preteridos se identifican por cada una de las siguientes secuencias SEO ID NO: 3 a SEO ID N.O: 284. Por consiguiente, un oligonucleótido más preferido como se utiliza en este caso se representa por una secuencia de SEO ID NO:3 a SEO ID NO:284. Un oligonudeótido más preferido como se utiliza en este caso es seleccionado del grupo consistente en SEO ID NO:3 a N0:284. El oligonucleótido antisentido de la invención bien comprende una secuencia que es complementaria a una parte de exón 45 de pre-mRNA de disltofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEO ID N.O: 60, o comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 44 de pre-mRNA de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEO ID N.O:
55 10.
[0076) Dichos exones se enumeran en orden decreciente de aplicabilidad a la población de pacientes. Por lo tanto, el uso de un AON que comprende una secuencia que es complementaria a al menos parte del exón 51 del pre-mRNA de distrofina es adecuada para el uso en una parte más grande de la población de pacientes de DMD en comparación con un AON que comprende una secuencia que es complementaria al exón 44 de pre-mRNA de distrofina, etcétera.
[0077) En una forma de realización preferida, un oligonucleótido de la invención que comprende una secuencia que es complementaria a parte del pre-mRNA de distrofina es tal que la parte complementaria es 65 al menos 50% de la longitud del oligonucleótido de la invención, más preferiblemente al menos 60%, aún más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos
90°/0 o aún mas preferiblemente al menos 95%, o aún más preferiblemente 98% o más. En una forma de realización mas preferida, el oligonucleótido de la invención consiste en una secuencia que es complementaria a parte del pre-mRNA de distrofina tal y como se define aqui. Por ejemplo, un oligonucleótido puede comprender una secuencia que es complementaria a parte del pre-mRNA de distrofina tal y como se
5 define aquí y secuencias f1anqueantes adicionales. En una forma de realización mas preferida, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleótido es de al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleótidos. Preferiblemente, en la divulgación, secuencias f1anqueantes adicionales se utilizan para modificar la unión de una proteína al oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinámica del oligonucleótido, más preferiblemente para modificar la afinidad de enlace de RNA objetivo.
[0078) Una forma de realización preferida de la divulgación proporciona un método, combinación, uso o producto farmacéutico según la divulgación, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional comprende un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que
15 comprende:
*
una secuencia que es complementaria de una región de un exón de pre-mRNA de distrofina que se hibrida a otra parte de un exón de pre-mRNA de distrofina (estructura cerrada), y
*
una secuencia que es complementaria de una región de un exón de pre-mRNA de dislrofina que no es hibridada en dicho pre-mRNA de distrofina (estructura abierta).
[0079) Una forma de realización preferida de la invención proporciona una combinación para uso según la invención, o producto farmacéutico según la invención, donde el AON, o un equivalente funcional del mismo, comprende:
* una secuencia que es complementaria de una región de un exón de pre-mRNA de distrofina que se hibrida 25 a otra parte de un exón de pre-mRNA de distrofina (estructura cerrada), y
* una secuencia que es complementaria de una reg ión de un exón de pre-mRNA de distrofina que no es hibridada en dicho pre-mRNA de distrofina (estructura abierta).
[0080) Para esta forma de realización, se hace referencia a nuestra solicitud de patente WO 2004f083432. Moléculas de RNA presentan estructuras secundarias fuertes, en su mayoría debido al apareamiento de bases de tramos complementarios o parcialmente complementarios en el mismo RNA. Se ha considerado durante mucho tiempo que estructu ras en el RNA juegan un papel en la función del RNA. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la estructura secundaria del RNA de un exón juega un papel en la estructuración del proceso de empalme. A través de su estructura, un exón es reconocido como una parte 35 que necesita ser incluida en el mRNA. Aquí esta función de señalización es referida como una señal de inclusión de exón. Un oligonucleótido complementario de esta forma de realización es capaz de interferir con la estructura del exón y por lo tanto es capaz de interferir con la señal de inclusión de exón del exón. Se ha descubierto que muchos oligonucleótidos complementarios de hecho comprenden esta capacidad, algo más eficaz que otros. Los oligonucleótidos de esta forma de realización preferida, es decir aquellos con dicho recubrimiento dirigido hacia estructuras abiertas y cerradas en el RNA del exón nativo, son una selección de todos los oligonucleótidos posibles. La selección abarca oligonucleótidos que pueden interferir eficazmente con una señal de inclusión del exÓn. Sin pretender imponer ninguna teoría se considera que el recubrimiento con una estructura abierta mejora la eficiencia de invasión del oligonucleótido (es decir aumenta la eficiencia con la cual el oligonucleótido puede entrar en la estructura), mientras que el recubrimiento con la estructura 45 cerrada aumenta posteriormente la eficiencia de interferir con la estructura secundaria del RNA del exón, y por lo tanto de interferir con la señal de inclusión del exón. Se ha descubierto que la longitud de la complementariedad parcial para la estructura cerrada y abierta no está extremadamente restringida. Hemos observado altos rendimientos con oligonucleótidos con longitudes variables de complementariedad en cada estructura. El término complementariedad se utiliza en este caso para referirse a una extensión de acidos nucleicos que pueden hibridarse a otra extensión de ácidos nucleicos bajo condiciones fisiológicas. No es absolutamente requerido por tanto que todas las bases en la reg ión de complementariedad sean capaces de aparearse con bases en la cadena opuesta. Por ejemplo, cuando se diseña el oligonucleótido uno puede querer incorporar por ejemplo un residuo que no forme par de bases con la base en la cadena complementaria. Malapareamientos pueden hasta cierto punto ser permitidos, si dadas las circunstancias en 55 la célula, la extensión de nucleólidos es capaz de hibridar a la parle complementaria. En una forma de realización preferida una parte complementaria (bien en dicha estructura abierta o en dicha estructura cerrada) comprende al menos 3, y mas preferiblemente al menos 4 nucleótidos consecutivos. Las regiones complementarias son preferiblemente diseñadas de manera que, cuando se combinan, son especificos para el exón en el pre-mRNA. Tal especificidad se puede crear con varias longitudes de regiones complementarias ya que esto depende de las secuencias reales en otro (pre-)mRNA en el sistema. El riesgo de que también uno u otros más pre-mRNA serán capaces de hibridar al oligonucleótido se reduce al aumentar el tamaño del oligonucleótido. Está claro que oligonucleótidos que comprenden malapareamientos en la región de complementariedad pero que retienen la capacidad para hibridar a la(s) región(es} prevista(s) en el premRNA, se pueden usar en la presente invención. Sin embargo, preferiblemente al menos las partes
65 complementarias no comprenden tales malapareamientos ya que típicamente tienen una eficiencia más alta y una especificidad mas alta, estos oligonucleótidos teniendo tales malapareamientos en una o más regiones complementarias. Se piensa que fuerzas de hibridación mas altas, (es decir el aumento del número de interacciones con la cadena opuesta) son favorables para aumentar la eficiencia del proceso de interferir con la maquinaria de empalme del sistema. Preferiblemente, la complementariedad es entre 90 y 100'%. En general esta permite aproximadamente 1 o 2 malapareamiento(s) en un oligonucleólido de alrededor de 20
5 nucleótidos
[0081 ) La estructura secundaria es mejor analizada en el contexto del pre-mRNA donde el exón reside. Tal estructura se puede analizar en el RNA real. Sin embargo, es actualmente posible predecir la estructura secundaria de una molécula de RNA (a costes mínimos de energía) bastante bíen usando programas de modelado de estructura. Un ejemplo no limitativo de un programa adecuado es el servidor41 RNA mfold versión 3.1. Un experto en la técnica sera capaz de predecir, con reproducibilidad adecuada, una estructura posible del exón, dada la secuencia de nucleótidos. Mejores predicciones se obtienen cuando se provee tales programas de modelación con ambas secuencias del exón e intrón flanqueantes. Típicamente no es necesario modelar la estructura del pre-mRNA entero.
[0082) La estructura abierta y cerrada a la que se dirige el oligonucleótido, son preferiblemente adyacentes entre si. Se piensa que de esta manera el apareamiento del oligonucleótido con la estructura abierta induce la abertura de la estructura cerrada a partir de lo cual el apareamiento progresa en esta estructura cerrada. A través de esta acción la estructura cerrada previamente asume una conformación diferente. La conformación diferente produce la interrupción de la señal de inclusión del exón. Sin embargo, cuando las secuencias del aceptar yfo donar de empalme (críptico) potencial estan presentes en el exón previsto, ocasionalmente una señal de inclusión de exón nueva es generada definiendo un (neo) exón diferente, es decir con un extremo 5' diferente, un extremo 3' diferente, o ambos. Este tipo de actividad esta dentro del campo de la presente invención ya que el exón previsto esta excluido del mRNA. La presencia de un exón nuevo, que contiene
25 parte del exón previsto, en el mRNA no altera el hecho de que el exón previsto, como tal, sea excluido. La inclusión de un neoexón puede verse como un efecto secundario que ocurre solo ocasionalmente. Hay dos posibilidades cuando el salto de exón se utiliza para restaurar (parte de) un marco de lectura abierto de distrofina que es interrumpida como resultado de una mutación. Una es que el neoexón sea funcional en la restauración del marco de lectura, mientras que en el otro caso el marco de lectura no es restaurado. Al seleccionar los oligonucleótidos para restaurar los marcos de lectura de distrofina mediante salto de exón es por supuesto claro que bajo estas condiciones solo aquellos oligonudeótidos se seleccionan que de hecho resultan en el salto de exón que restaura el marco de lectura abierto de distrofina, con o sin un neoexÓn.
[0083) Se proporciona ademas un método, combinación, uso o producto farmacéutico según la divulgación,
35 donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína dístrofina funcional comprende un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de unión para una proteína serina-arginina (SR) en el RNA de un exón de un pre-mRNA de distrofina. Una forma de realización preferida de la invención proporciona una combinación para uso según la invención, o un producto farmacéutico según la invención, donde el AON comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de unión para una proteína serina-arginina (SR) en el RNA de un exón de un premRNA de distrofina . En nuestra solicitud de patente WO 2006/112705 hemos descrito la presencia de una correlación entre la efectividad de un oligonucle6tido antisentido (AON) intemo del exón para inducir el salto de exón y la presencia de un sitio de unión SR predicho (por ejemplo por ESEfinder) en el sitio de pre-mRNA objetivo de dicho AON. Por lo tanto, en una forma de realización un oligonucleótido es generado que
45 comprende la determinación de un sitio de unión (putativo) para una proteína SR (Ser-Arg) en el RNA de un exón de distrofina y la producción de un oligonucle6tido que es complementaria a dicho RNA y que al menos se superpone parcialmente a dicho sitio de unión (putativo). El término "superpone al menos parcialmente" se define aquí como que comprende un recubrimiento de solo un nucleótido único de un sitio de unión SR al igual que nucleótidos múltiples de dicho sitio de unión al igual que un recubrimiento completo de dicho sitio de unión. Esta forma de realización preferiblemente comprende ademas determinar a partir de una estructura secundaria de dicho RNA, una región que se hibrida a otra parte de dicho RNA (estructura cerrada) y una región que no se hibrida en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente genera un oligonucleótido que al menos se superpone parcialmente a dicho sitio de un ión (putativo) y que se superpone al menos a parte de dicha estructura cerrada y se superpone al menos a parte de dicha estructura abierta. De esta
55 manera aumentamos la oportunidad de obtener un oligonucleólido que es capaz de interferir con la inclusión del exón desde el pre-mRNA en el mRNA. Es posible que una primera región de enlace SR seleccionada no tenga la estructura cerrada y abierta requerida en cuyo caso otro (segundo) sitio de unión a proteínas SR se selecciona que es luego posteriormente evaluado para la presencia de una estructura cerrada y abierta. Este proceso es continuado hasta que una secuencia se identifica que contiene un sitio de unión a proteínas SR al igual que una estructura cerrada y abierta (parcialmente superpuesta). Esta secuencia es luego usada para diseñar un oligonucleótido que es complementario a dicha secuencia.
[0084) Tal método para generar un oligonucleótido es también realizado por la inversión del orden descrito, es decir generando primero un oligonucleótido que comprende determinar, a partir de una estructura 65 secundaria de RNA a partir de un exón de distrofina, una región que asume una estructura que se hibrida a otra parte de dicho RNA (estructura cerrada) y una región que no se hibrida en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente generar un oligonucleótido, del cual al menos una parte de dicho oligonucleótido es complementaria a dicha estructura cerrada y del cual al menos otra parte de dicho 0li90nucleótido es complementaria a dicha estructura abierta. Esto es luego seguido de la determinación de si un sitio de unión a proteinas SR se superpone al menos con dicha estructura abierta/cerrada. De esta manera el método de 5 WO 2004/083432 es mejorado. En otra forma de realización las selecciones son realizadas simultanea mente.
[0085) Sin desear quedar limitado por ninguna teoria se considera actualmente que el uso de un oligonucleótido dirigido a un sitio de unión a proteínas SR resulta (como mínimo parcialmente) en perjudicar la unión de una proteína SR al sitio de unión de una proteína SR que resulta en el empalme interrumpido o
10 perjudicado.
[0086) Preferiblemente, una estructura abierta/cerrada y un sitio de unión a proteinas SR parcialmente recubre e incluso mas preferido una estructura abiertafcerrada se superpone completamente a un sitio de unión a proteínas SR o un sitio de unión a proteínas SR se superpone completamente a una estructura
15 abierta/cerrada. Esto permite una interrupción mejorada de inclusión del exÓn.
[0087) Ademas de secuencias de sitios de empalme de consenso, muchos exones (si no todos) contienen secuencias reguladoras del empalme tales como secuencias intensificadoras de em~alme exónico (ESE) para facilitar el reconocimiento de sitios de empalme genuinos por el espliceosoma4 . 43. Un subgrupo de 20 factores de empalme, llamado las proteínas SR, pueden enlazarse con estos ESE y reclutar otros factores de empalme, tal como U1 y U2AF para sitios de empalme (definidos débilmente). Los sitios de unión de las cuatro proteinas SR mas abundantes (SF2/ASF, SC35; SRp40 y SRp55) han sido analizados en detalle y estos resultados se implementan en ESEfinder, una fuente de red Que predice sitios de unión potenciales para estas proteínas SR 42, 43. Hay una correlación entre la eficacia de un AON y la presencia/ausencia de
25 un sitio de unión SF2/ASF, SC35 y SRp40. En una forma de realización preferida, la divulgación asi proporciona un método, combinación, uso o producto farmacéutico como se ha descrito anteriormente, donde dicha proteína SR es SF2/ASF o SC35 o SRp40. En una forma de realización preferida, la invención asi proporciona una combinación para uso según la invención, o un producto farmacéutico según la invención, donde dicha proteína SR es SF2/ASF o SC35 o SRp40.
[008B) En una forma de realización se prevé un paciente de DMD con una proteína distrofina funcional que usa un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que es capaz de unirse específicamente a una secuencia de RNA reguladora que se requiere para el empalme correcto de un exón de distrofina en un transcrito. Diferentes secuencias de RNA que actúan en cis se requieren para el empa lme correcto de exones 35 en un transcrito. En particular, elementos suplementarios tales como potenciadores de empalme intrónico o exónico (ISE y ESE) o silenciadores (ISS y ESE) se identifican por regular el empalme especifico y eficaz de exones constitutivos y alternativos. El uso de oligonucleótidos antisentido específicos de secuencia (AON) que se enlazan con los elementos, su función reguladora es interrumpida de modo Que el exón es saltado, como se muestra para DMD. Por lo tanto, en una forma de realización preferida un oligonucle6tido o 40 equivalente funcional del mismo se usa que es complementario a un intensificador del empalme intrónico (ISE), un intensificador del empalme exónico (ESE), un silenciador del empalme intrónico (ISS) yfo un silenciador del empalme exónico (ESS). Como ya descrito aquí antes, un exón de dislrofina es en una forma de realización preferida saltado por un agente capaz de inhibir especificamente una señal de inclusión de exón de dicho exón, de modo que dicho exón no se reconoce por la maquinaria de empalme como una parte
45 que necesita ser incluida en el mRNA. Como resultado, un mRNA sin dicho exón es formado.
[0089) Un AON usado en una combinación para usar en un método de la invención o en un producto farmacéutico es preferiblemente complementario a una parte consecutiva de entre 13 y 50 nucleótidos de RNA de exón de distrofina o RNA de intrón de distrofina. En una forma de realización tal AON es
50 complementario a una parte consecutiva de entre 16 y 50 nucleótidos de un RNA de exón de distrofina o RNA de intrón de distrofina. Preferiblemente, dicho AON es complementario a una parte consecutiva de entre 15 y 25 nucleótidos de dicho RNA de exÓn. Mas preferiblemente, un AON se usa que comprende una secuencia que es complementaria a una parte consecutiva de entre 20 y 25 nucleótidos de un RNA de exón de distrofina o un RNA de intrón de distrofina.
55 [0090) Diferentes tipos de acido nucleico se pueden utilizar para generar el oligonucleótido. Preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende RNA, como híbridos de RNAlRNA son muy estables. Ya que uno de los objetivos de la técnica de salto de exón es dirigir el empalme en sujetos se prefiere que el RNA oligonucleótido comprenda una modificación que proporcione al RNA una propiedad adicional, por ejemplo
60 resistencia a endonucleasas y RNaseH, fuerza de hibridación adicional, estabilidad aumentada (por ejemplo en un fluido corporal), flexibilidad aumentada o disminuida, toxicidad reducida, transporte intracelular aumentado, especificidad de tejido, etc. Preferiblemente dicha modificación comprende una modificación del oligorribonucleótido 2'-O-metil-fosforotioato. Preferiblemente dicha modificación comprende una modificación del oligodesoxirribonucleótido 2'-O-metil-fosforotioato. Una forma de realización proporciona así un método,
65 combinación, uso o preparado farmacéutico según la invención, donde un oligonucleótido se usa que comprende RNA que contiene una modificación, preferiblemente una ribosa modificada por 2'-Q-metilo (RNA)
o modificación de desoxirribosa (ONA).
[0091 ) En una forma de realización la invención proporciona una combinación para uso según la invención, o
5 un producto farmacéutico según la invención, que comprende un oligonucle6tido hibrido comprendiendo un oligonucleótido que comprende una modificación de oligo(desoxi)ribonucleótido de 2'-O-metil-fosforotioato y ácido nucleico bloqueado. Esta combinación particular comprende mejor especificidad de secuencia en comparación con un equivalente consistente en ácido nucleico bloqueado, y comprende efectividad mejorada cuando se compara con un oligonucle6tido consistente en una modificación de oligo(desoxi)ribonucleótido 2'O-metil-fosforotioato.
[0092) Con el descubrimiento de tecnología de imitación de ácidos nucleicos se ha vuelto posible generar moléculas que tienen características de hibridación similares, preferiblemente las mismas en especie no necesariamente en cantidad que el ácido nucleico mismo. Tales equivalentes funcionales son por supuesto
15 también adecuados para la invención. Ejemplos preferidos de equivalentes funcionales de un oligonucleótido son ácido nucleico de péptido y/o ácido nucleico bloqueado. De la forma más preferible, se usa un fosforodiamidato de morfolino. Ejemplos adecuados pero no limitativos de equivalentes de oligonucleótidos de la invención pueden encontrarse en 44-50. Híbridos entre uno o más de los equivalentes entre sí yfo junto con ácido nucleico son por supuesto adecuados también. En una forma de realización preferida ácido nucleico bloqueado se usa como un equivalente funcional de un oligonucleótido, como ácido nucleico bloqueado muestra una afinidad objetivo más alta y toxicidad reducida y por lo tanto muestra una eficiencia más alta de salto de exón .
[0093) En una forma de realización de la divulgación un oligonucleótido, o un equivalente funcional del
25 mismo, que es capaz de inhibir la inclusión de un exón de distrofina en el mRNA de distrofina se combina con al menos otro Oligonucle6tido, o equivalente funcional del mismo, que es capaz de inhibir la inclusión de otro exón de distrofina en el mRNA de distrofina. De esta manera, se evita la inclusión de dos o más exones de un pre-mRNA de distrofina en el mRNA producido de este pre-mRNA. Esta forma de realización de la divulgación es posteriormente referida como salto doble o mulli-exón 2, 15. En la mayoría de los casos el salto de exón doble produce la exclusión de solo dos exones previstos desde el pre-mRNA de distrofina. Sin embargo, en otros casos se ha observado que los exones previstos y la región entera entremedias de dichos exones en dicho pre-mRNA no estaban presentes en el mRNA producido aún cuando otros exones (exones intervinientes) estaban presentes en tal región. Este multi-salto fue sobre todo así para la combinación de oligonucleótidos derivados del gen DMD, donde un oligonucleótido para exón 45 y un oligonucleótido para
35 exón 51 se añadió a una célula que transcribe el gen DMD. Tal configuración resultó en el mRNA siendo producido que no contenía los exones 45 a 51 . Aparentemente, la estructura del pre-mRNA en presencia de los oligonucle6tidos mencionados fue tal que la maquinaria de empalme fue estimulada para conectar los exones 44 y 52 entre si.
[0094) También se proporciona por lo tanto un método, combinación, uso o preparado farmacéutico según la divulgación, donde una secuencia de nucleótidos se usa que comprende al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un primer exón de un pre-mRNA de disltofina y donde se usa una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un segundo exón de dicho pre-mRNA de distrofina.
45 [0095) En una forma de realización preferida de la divulgación dicho primer y dicho segundo exón se separan en dicho pre-mRNA de distrofina por al menos un exón al que dicho 01 igonucle6tido no es complementario.
[0096) Según la divulgación, es posible específicamente promover el salto de también los exones intervinientes mediante una conexión entre los dos oligonucleótidos complementarios. Por lo tanto, en una forma de realización extensiones de nucleótidos complementarios a al menos dos exones de distrofina se separan por una fracción de conexión. Al menos dos extensiones de nucleótidos son así enlazados en esta forma de realización para formar una molécula única. Además proporcionado es por lo tanto un método, combinación, uso o preparado farmacéutico según la divulgación donde dicho oligonucleótido, o equivalente 55 funcional del mismo, para suministrar a dicho individuo una proteína distrofína funcional es complementario a al menos dos exones en un pre-mRNA de distrofina, dicho equivalente de oligonucleótido o funcional que comprende al menos dos partes donde una primera parte comprende un oligonucleótido que tiene al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un primer de dichos al menos dos exones y donde una segunda parte comprende un oligonucleótido ten iendo al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un segundo exón en dicho pre-mRNA de distrofina. Según la divulgación, la conexión puede ser a través de cualquier medio pero es preferiblemente realizada a través de una conexión de nucleótido. En este último caso el número de nucleótidos que no contienen un recubrimiento entre uno u otro exón complementario puede ser cero , pero es preferiblemente entre 4 a 40 nucleótidos. La fracción de conexión puede ser cualquier tipo de fracción capaz 65 de conectar oligonucleótidos. Preferiblemente, en la divulgación dicha fracción de conexión comprende al menos 4 nucleótidos de uracilo. Actualmente, muchos compuestos diferentes están disponibles que imitan
características de hibridación de oligonucleótidos. Tal compuesto, llamado aquí un equivalente funcional de un oligonucleótido, es también adecuado para la presente divulgación si tal equivalente comprende características de hibridación similares en especie no necesariamente en la cantidad. Equivalentes funcionales adecuados son mencionados anteriormente en esta descripción. Tal y como se menciona,
5 oligonucleótidos comprendidos en una combinación para usar la invención, o en un preparado farmacéutico de la invención no consisten en solo oligonucle6tidos que contribuyen para la hibridación al exón previsto. Puede haber material yfo nucleótidosadicionales añadidos.
[0097] El gen DMD es un gen grande, con muchos exones diferentes. Considerando que el gen se localiza en el cromosoma X, en su mayoria son niños los que son afectados, aunque niñas también pueden ser afectadas por la enfermedad, ya que pueden recibir un progenitor malo del gen de ambos padres, o están sufriendo a partir de una inactivación diagonal particularmente del alelo funcional debido a una inactivación del cromosoma X particularmente sesgado en sus células musculares. La proteína se codifica por una pluralidad de exones (79) sobre un rango de al menos 2,6 Mb. Defectos puede ocurrir en cualquier parte del 15 gen DMD. El salto de un exón particular o exones particulares pueden, muy a menudo, resultar en un mRNA reestructurado que codifica una proteína distrofina más corta de lo normal al menos parcialmente funcional . Un problema práctico en el desarrollo de un medicamento basado en la tecnologia de salto de exón es la pluralidad de mutaciones que pueden resultar en una deficiencia en la proteina distrofina funcional en la célula. A pesar del hecho de que ya varias mutaciones se pueden corregir por el salto de un exón único, esta pluralidad de mutaciones, requiere la generación de un gran número de diferentes fármacos dado que para mutaciones diferentes se necesita saltar exones diferentes. Una ventaja de un compuesto capaz de inducir el salto de dos o más exones, es que más de un exón se puede saltar con un fármaco único. Esta propiedad es muy útil no solo prácticamente ya que se necesita generar solo un número limitado de fármacos para tratar muchos DMD diferentes o mutaciones de BMD severas particulares. Otra opCión ahora abierta para el
25 experto en la técnica es seleccionar proteínas de distrofina reestructuradas particularmente funcionales y producir compuestos capaces de generar estas proteínas de distrofina preferidas. Tales resultados finales preferidos son además referidos como distrofinas de fenotipo moderado.
[0098) Cada compuesto, un oligonucle6tido yfo un compuesto complementario tal y como se define aquí para el uso como un componente de una combinación para uso según la invención o de un producto farmacéutico según la invención se puede adecuar para administración directa a una célula, tejido yfo un órgano in vivo de individuos afectados por o en riesgo de desarrollar DMD o BMD, y se puede administrar directamente in vivo, ex vivo o in vitro.
35 [0099) Alternativamente, medios adecuados para suministrar células con un oligonucleótido o equivalente de las mismas están presentes en la técnica. Un oligonucleótido o equivalente funcional del mismo puede por ejemplo ser proporcionado a una célula en forma de un vector de expresión donde el vector de expresión codifica una transcripción que comprende dicho oligonucleótido. El vector de expresión es preferiblemente introducido en la célula por medio de un vehiculo de administración de genes. Un vehículo de administración preferido es un vector vírico tal como un vector de virus adeno-asociado (AAV), o un vector retrovirico tal como un vector de lentivirus 4, 51, 52 Y similares. También plásmidos, cromosomas artificiales, plásmidos adecuados para recombinación homóloga prevista e integración en el genoma humano de células pueden ser adecuadamente aplicados para administración de un oligonucleótido tal y como se define aquí. Preferidos para la divulgación corriente son aquellos vectores donde transcripción es conducida por promotores PolIlI,
45 yfo donde los transcritos están en forma de fusiones con los transcritos Ul o U7, que producen resultados buenos entregando transcritos pequeños. Es en la habilidad del artesano diseñar tránscritos adecuados. Preferidos son los transcritos conducidos por PolIll. Preferiblemente en forma de un transcrito de fusión con un transcrtio UI o U7 4, 51 , 52. Tales fusiones se pueden generar como se describe 53, 54. El oligonucleótido se puede entregar como está. Sin embargo, el oligonucleótido también se puede codificar por el vector virico. Típicamente esto está en forma de un transcrito de RNA que comprende la secuencia del oligonucleólido en una parte del transcrito.
[0100) Mejoras en medios para suministrar células con un oligonucleótido o equivalente del mismo, son anticipadas considerando el progreso que ya ha sido conseguido. Tales mejoras futuras pueden por supuesto 55 ser incorporadas para conseguir el efecto mencionado en la reestructuración de mRNA usando un método de la divulgación. El oligonucleótido o equivalente del mismo se puede entregar como esté a las células. Cuando se administra el oligonucleótido o equivalente del mismo a un individuo, se prefiere que el oligonucle6tido se disuelva en una solución que es compatible con el método de administración. Para, administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica. Particularmente preferido para un método de la divulgación es el uso de un excipiente que ayudará en la administración de un compuesto tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario a una célula y en una célula, preferiblemente una célula muscular. Preferidos son excipientes capaces de formar complejos, vesiculas yfo liposomas que entregan tal compuesto tal y como se define aqui, preferiblemente un oligonucleótido y 65 opcionalmente junto con un compuesto complementario en complejo o retenido en una vesícula o liposoma a través de una membrana celular. Muchos de estos excipientes se conocen en la técnica. Excipientes adecuados comprenden polietilenimina (PEI), o polímeros catiónicos similares, incluyendo polipropilenimina o copolímeros de polietilenimina (PECs) y derivados, ExGen 500, anfifilos sintéticos (SAINT-18), lipofectinTM, DOTAP ylo proteinas cápsidas víricas que son capaces de auto ensamblarse en partículas que pueden entregar tales compuestos, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto 5 complementario tal y como se define aquí a una célula, preferiblemente una célula muscular. Tales excipientes han mostrado que entregan eficazmente ácidos nucleicos (oligonucleótido tal como antisentido) a una amplia variedad de células cultivadas, incluyendo células musculares. Su alto potencial de transfección se combina con una toxicidad exceptuada baja a moderada en cuanto a supervivencia celular en general. La facilidad de modificación estructural puede utilizarse para permitir otras modificaciones y el análisis de sus
10 otras características de transferencia de ácidos nucleicos (in vivo) y toxicidad.
[0101 ) Lipofectina representa un ejemplo de un agente de transfección liposómica. Consiste en dos componentes lipídicos, un lipido catiónico de cloruro de N-[1-(2,3 dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) (cp. DOTAP que es la sal de metilsulfato) y una dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) de lípido
15 neutro. El componente neutro media la liberación intracelular. Olro grupo de sistemas de administración son nanopartículas poliméricas.
[0102) Policationes tales como dietilaminoetilaminoetilo (DEAE)-dextrano, que son bien conocidos como reactivo de transfección de DNA se pueden combinar con butilcianoacrilato (PBCA) y hexilcianoacrilato
20 (PHCA) para formular nanopartículas catiónicas que pueden entregar un compuesto tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario a través de membranas celulares en células.
[0103) Además de estos materiales de nanopartículas comunes, la protamina de péptido catiónico ofrece un
25 método alternativo para formular un compuesto tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario como coloides. Este sistema de nanopartículas coloidales puede formar los así llamados proticles, que se pueden preparar por un proceso de autoensamblaJe simple para envolver y mediar la liberación intracelular de un compuesto tal y como se define aqu í, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario. La
30 persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera de los anteriores u otros excipientes alternativos disponibles comercialmente y sistemas de administración para envolver y administrar un compuesto tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario para uso para entregar dicho compuesto para el tratamiento de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en seres humanos.
35 [0104) Además, un compuesto tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario podría ser de manera covalente o de manera no covalente enlazado a un ligando objetivo específicamente diseñado para facilitar la absorción en la célula, citoplasma ylo su núcleo. Tal ligando podría comprender (i) un compuesto (que incluye pero no se limita a estructuras tipo
40 péptido) que reconoce la célula, tejido o elementos específicos de órganos que facilitan la absorción ylo (ii) un compuesto químico capaz de facilitar la absorción en células ylo la liberación intracelular de un compuesto tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario de vesículas, por ejemplo endosomas o lisosomas.
45 [0105) Por lo tanto, en una forma de realización preferida de la divulgación, un compuesto tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido y opcionalmente junto con un compuesto complementario se formulan en un medicamento que está provisto de al menos un excipiente ylo un ligando objetivo para administración ylo un dispositivo de administración de dicho compuesto a una célula ylo aumentando su administración intracelular. En una forma de realización preferida de la invención una combinación para uso
50 según la invención, o una combinación farmacéutica según la invención se formulan en un medicamento que está provisto de al menos un excipiente ylo un ligando objetivo para la administración ylo un dispositivo de administración de dicha combinación para el uso o composición a una célula ylo mejorando su admin istración intracelular. Por consiguiente, la invención también comprende una composición farmacéutica mente aceptable que incluye un oligonucleótido y un compuesto complementario y además que comprende al
55 menos un excipiente ylo un ligando objetivo para administración ylo un dispositivo de administración de dicho oligonucleótido a una célula ylo que mejora su administración intracelular.
[0106) Debe entenderse que un oligonucleótido y un compuesto complementario no se puede formular en una composición o preparación única. Dependiendo de su identidad, la persona experta conocerá qué tipo de
60 formulación es el más apropiado para cada compuesto.
[0107) En una forma de realización preferida la divulgación proporciona un equipo de partes que comprende un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional y un compuesto complementario para reducir la innamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular,
65 ylo un compuesto complementario para mejorar la función, integ ridad ylo supervivencia de la fibra muscular.
[0108) En una forma de realización preferida, se usa una concentración de un oligonucleótido tal y como se define aquí, que oscila entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 1 IJM. Más preferiblemente, la concentración usada oscila entre aproximadamente 0,3 a aproximadamente 400 nM, aún más preferiblemente entre aproximadamente 1 a aproximadamente 200 nM. Si se usan diferentes 5 oligonucleótidos, esta concentración puede referirse a la concentración total de oligonucleótidos o la concentración de cada oligonucleótido añadido. Las gamas de concentración de oligonucleótido(s) como se dan arriba son concentraciones preferidas para usos in vitro o ex vivo. La persona experta entenderá que dependiendo del(los) oligonucleótido(s) usado(s), la célula objetivo que se debe tratar, el gen objetivo y sus niveles de expresión, el medio usado y las condiciones de transfección e incubación, la concentración de
10 oligonucleótido(s) puede variar adicionalmente y puede necesitar ser optimizada algo más.
[0109) Más preferiblemente, un compuesto preferiblemente un oligonucleótido y un compuesto complementario para usarse en la invención para prevenir, tratar DMD o BMD se prOducen sintéticamente y se administran directamente a una célula, un tejido, un órgano ylo pacientes en la forma formulada en una
15 composición o preparación farmacéuticamente aceptable. La administración de una composición farmacéutica al sujeto es preferiblemente realizada por una o más inyecciones parenterales, por ejemplo administraciones intravenosas ylo subcutáneas ylo intramusculares ylo intratecales ylo intraventriculares, preferiblemente inyecciones, en uno o en varios sitios en el cuerpo humano.
20 [0110) Además del salto de exón, la presente descripción proporciona el conocimiento de que también es posible proporcionar a un paciente de DMD una proteina distrofina funcional con una terapia basada en lectura completa de codones de parada . Compuestos capaces de suprimir los codones de parada son especialmente adecuados para un subgrupo de pacientes de DMO que es afectado por mutaciones sin sentido (-7%) dando como resultado la formación de un codón de parada dentro de su gen de distrofina. En
25 una forma de realización de la divulgación dicho compuesto capaz de suprimir codones de parada comprende la gentamicina antibiótica. En un estudio reciente en ratones mdx, el tratamiento de gentamicina indujo la expresión de distrofinas nuevas hasta 20% del nivel normal, sin embargo con variabilidad entre animales. Pruebas humanas con gentamicina han sido sin embargo no concluyentes55. PTC124 pertenece a una clase nueva de moléculas pequeñas que imita a concentraciones inferiores la actividad de lectura
30 completa de gentamicina. La administración de PTC124 resultó en la producción en toda su longitud y distrofina funcionalmente activa tanto in vitro como en ratones mdxH3 . Ensayos de Fase 1111 con PTC124 están en curso actualmente, no solo para aplicación en DMD sino también para fibrosis cística16, 17. Las referencias 16 y 17 también describen dosificaciones preferidas del compuesto PCT124 para usar en la presente descripción. Se proporciona además por lo tanto un método, combinación, uso o preparado farmacéutico
35 según la divulgación, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional comprende un compuesto para suprimir los codones de parada. Dicho compuesto para suprimir los codones de parada preferiblemente comprende gentamicina, PTC124 o un equivalente funcional del mismo. De la forma más preferible, dicho compuesto comprende PTC124.
40 [0111) En una forma de realización de la divulgación un individuo dispone de una proteína distrofina funcional que utiliza un vector, preferiblemente un vector vírico, que comprende un gen de micro-mini-distrofina. De la forma más preferible, se usa un vector virico adeno-asociado recombinante (rAAV). AAV es un parvovirus de DNA monocatenario que no es patógeno y muestra un ciclo de vida dependiente del auxiliar. A diferencia de otros virus (adenovirus, retrovirus, y virus herpes simplex), vectores rAAV han demostrado ser muy eficaces
45 en la transducción del músculo esquelético maduro. Aplicación de rAAVen estudios de "adición de genes" de DMD tradicionales ha sido obstaculizada por sus límites de embalaje restringidos « 5 kb). Por lo tanto, rAAV es preferiblemente aplicado para la administración eficaz de un gen mucho más pequeño de micro o minidistrofina. Administración de tal gen de micro o mini-distrolina produce la presencia de una proteína distrolina al menos parcialmente funcional. Se hace referencia a 18-20.
50 [0112) Un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional y al menos un compuesto complementario según la invención se puede administrar a un individuo en cualquier orden. En una forma de realización, dicho compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional y dicho al menos un compuesto complementario se administran simultáneamente (lo que significa que dichos
55 compuestos se administran dentro de 10 horas, preferiblemente dentro de una hora). Esto sin embargo no es necesario. En una forma de realización al menos un compuesto complementario se administra a un individuo en necesidad del mismo antes de administrar un compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional. También se describe por lo tanto un método, que comprende:
* administrar a un individuo en necesidad del mismo un compuesto complementario para reducir la
60 inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular, ylo administrar a dicho individuo un compuesto complementario para mejorar la función, integridad ylo supervivencia de la fibra muscular, y, posteriormente,
* administrar a dicho individuo un compuesto para suministrar a dicho individuo una proteína distrofina funcional.
[0113) En otra forma de realización, dicho compuesto para suministrar a un individuo una proteína distrofina funcional se administra antes de adm inistrar dicho al menos un compuesto complementario.
[0114) Se proporciona además un método de la divulgación para al menos en parte aumentar la producción
5 de una proteina distrofina funcional en una célula, dicha célula que comprende pre-mRNA de un gen de distrofina que codifica una proteina distrofina aberrante, el método comprende: proporcionar a dicha célula un compuesto para inhibir la inclusión de un exón en el mRNA producido del empalme de dicho pre-mRNA de distrofina, y proporcionar dicha célula con un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular, y/o suministrar a dicha célula un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supervivencia de la fibra muscular, el método que comprende además permitir la traducción de mRNA producido del empalme de dicho premRNA. En una forma de realización de la divulgación dicho método es realizado in vitro, por ejemplo utilizando un cultivo celular.
[0115) En este contexto, el aumento de la producción de una proteina distrofina funcional ha sido definido anteriormente aquí.
[0116) A menos que se ind ique lo contrario cada forma de realización como se describe en este caso se puede combinar con otra forma de realización como se describe en este caso.
[0117) En este documento y en sus reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus conjugaciones se usa en su sentido no limitativo para significar que aquellos articulas después de la palabra están incluidos, pero los articulas que no están específicamente mencionados no están excluidos. Además la palabra "consistir" se
25 puede sustituir por "consistir esencialmente en" lo que significa que un compuesto o compuesto complementario tal y como se define aquí puede comprender componente(s) adicional(es) a aquellos específicamente identificados, sin alterar dicho(s) componente(s) adicional(es) la caracteristica única de la invención.
[0118) Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "uno" no excluye la posibilidad de que más de uno del elemento está presente, a menos que el contexto requiera claramente que allí haya uno y solo uno de los elementos. El articulo indefinido "un" o "uno" asi normalmente significa "al menos uno".
[0119) La palabra "aproximadamente" o "sobre" cuando se usa en asociación con un valor numérico 35 (aproximadamente 10, aproximadamente 10) preferiblemente significa que el valor puede ser el valor dado de 10 más o menos del 1 % del valor.
[0120) La invención es posteriormente explicada en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el ámbito de la invención, sino que meramente sirven para clarificar la invención.
Breve descripción de los dibujas
[0121) Figura 1. Representación esquemática de salto de exÓn. En un paciente con distrofia muscular de Duchenne que tiene una deleción del exón 50, se genera un
45 transcrito fuera del marco en el que el exón 49 se empalma al exón 51 (Panel A). Como resultado, un codón de parada se genera en el exón 51, que aborta prematuramente la síntesis de distrofina. La unión específica de la secuencia del oligonucleótido antisentido interno del exón PR0051 intelfiere con la inclusión correcta del exón 51 durante el empalme de modo que el exón es en realidad saltado (Panel B). Esto restaura el marco de lectura abierto del transcrito y perm ite la sintesis de una distrofina similar a aquella en pacientes con distrofia muscular de Becker (BMD).
Figura 2 de ejemplo de referencia. Preselección de estudios de los cuatro pacientes. Imágenes de resonancia magnética de las piernas inferiores de los cuatro pacientes (la pierna izquierda del paciente 3 y piernas derechas de otros tres pacientes) muestran la condición adecuada del músculo anterior tibial (menos 55 del 50'% infiltración de grasa y fibrosis) (Panel A). El diagnóstico de distrofia muscular de Duchenne en estos pacientes fue confirmado por tinción con tetrahidrocloruro de diaminobenzidina de secciones transversales de muestras de biopsia obtenidas previamente del músculo cuádriceps (Panel B). Ninguna expresión de distrofina fue observada, con la excepción de una fibra positiva en distrofina, o revertiente, en el paciente 2 (flecha). El análisis de reacción de cadena transcriptasa-polimerasa inversa (RT -PCR) de la región de transcripción que flanquea las mutaciones del paciente y el exón 51 confirmaron las mutaciones del ind ividuo en miotubos no tratados (NT) y la respuesta pOSitiva para PR0051 (es decir, salto de exón 51 ) en miotubos tratados (T) en el nivel de RNA (Panel C). Los rendimientos de salto de exón fueron 49% para el paciente 1, 84(% para el paciente 2, 58% para el paciente 3, y 90% para el paciente 4. Un sitio de empalme secreto dentro del exón 51 se activa a veces por PR0051 en el cultivo celular, dando como resultado un producto de 65 empalme extra aberrante, como se ha visto en la muestra tratada del paciente 4. El carril M muestra un marcador de tamaño de 100-bp, y el carril e RNA de músculo de control sano. Análisis de secuencias de los
fragmentos de RT-PCR de miotubos tratados y no tratados identificaron el salto preciso de exón 51 para cada paciente (Panel D). Los nuevos tránscritos dentro del marco de lectu ra condujeron a la síntesis de distrofina sustancial, como se detectó por análisis de inmunofluorescencia de miotubos tratados con el uso de anticuerpo monoclonal NCL-DYS2 (Panel E). Ninguna distrofina fue detectada antes del tratamiento
Figura 3 del ejemplo de referencia. Análisis RT-PCR de RNA aislado de secciones en serie de muestras de biopsia de los pacientes. Después del tratamiento con PR0051 , análisis de reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT -PCR) muestra fragmentos nuevos, más cortos para cada paciente. Tanto el tamaño como la secuencia de estos fragmentos confirman el salto preciso del exón 51. Ninguna variante de empalme adicional fue observada. A los 28 días, transcritos de RNA dentro del marco de lectura todavía significativo fueron detectados, sugiriendo persistencia prolongada de PR0051 en el músculo. Debido a la pequeña cantidad de material de sección, condiciones de PCR de sensibilidad alta fueron usadas; este proceso excluyó la cuantificación precisa del salto de rendimientos y la correlación significativa entre niveles de RNA y proteína.
15 M denota marcador de tamaño, y C control.
Figura 4 del ejemplo de referencia. Efecto Restaurador de distrofina de una dosis Intramuscular única de PR0051 . Análisis de inmunofluorescencia con el uso del anticuerpo de distrofina MANDYS106 muestra claramente expresión de distrofina en las membranas de la mayoría de fibras en toda la muestra de biopsia obtenida de cada paciente (Panel A). Las áreas ind icadas por cuadrados se muestran en la ampliación más alta en el Panel S. Para comparación, una muestra de un paciente no tratado con distrofia muscular de Duchenne (DMD) y una muestra de control sana de músculo gastrocnemio (HC) se incluyen con las muestras de los pacientes. Fibras revertientes putativas se indican por flechas. El número total de fibras musculares que
25 contienen distrofina y laminina «2 fue contado manualmente y las proporciones de distrofina a la minina «2 fueron dispuestas en un gráfico (Panel C). Anál isis de Western blot de extractos de proteína totales aislados de las muestras de biopsias de pacientes con el uso del anticuerpo NCL-DYS1 muestran la expresión de distrofina restaurada en todos los pacientes (Panel E). Para cada paciente, 30 IJg (carril derecho) y 60 IJg (carril izquierdo) fueron cargados; para comparación, 3 IJg de proteína total a partir de una muestra de músculo gastrocnemio sano fue cargada también (para evitar sobreexposición). Debido a las deleciones relativamente pequeñas en el gen DMD de estos pacientes, ninguna diferencia fue observada en los tamaños de proteína. En el paciente 1, una irregularidad de transferencia perturbó la detección de señal en el carril 60IJg. Para corregir la densidad variable de fibras musculares en las secciones transversales diferentes, la señal de distrofina fluorescente total (porcentaje de área) en cada sección fue fijada como una proporCión al
35 porcentaje de área de laminina «2 (Panel D).
Figura 5 de ejemplo de referencia. Niveles de Salto de Exón 23 en el nivel de RNA en los grupos de músculos diferentes (O: músculo cuádriceps; TA: músculo anterior tibial; DIA: músculo de diafragma) en ratones mdx (dos ratones por grupo) tratados con PS49 solo (grupo 3) o con PS49 y prednisolona (grupo 4).
Figura 6A,S. en células musculares, los niveles de salto del exón 44 (A) o exón 45 (8) de gen de DMD se mejOf<ln con concentrOlciones en aumento de pentoxifllina (de Oa 0,5 mg/ml ). Figura 6e niveles de salto de exón 23 en el nivel de RNA en los grupos de músculos diferentes (O: músculo cuádriceps; TA: músculo anterior tibial; Tri: músculo tríceps; HRT: músculo cardíaco) en ratones mdx (dos ratones por grupo) tratados
45 con PS49 solo (grupo 3) o con PS49 y pentoxifilina (grupo 4).
Figura 7. Secuencia de aminoácidos de gen de Distrofina (DMD)
Figura 8 de ejemplo de referencia. Secuencia de aminoácidos de isoforma 4 de IGF humano.
Figura 9 de ejemplo de referencia. Varios oligonucleótidos dirigidos contra los exones indicados del gen de distrofina (DMD)
Ejemplos
Ejemplo 1 de referencia
[0122) En un estudio clinico reciente la seguridad local, tolerabilidad, y efecto restaurador de distrofina de compuesto antisentido PR0051 fue evaluado. El estudio clínico fue recientemente publicado. El contenido de la publicación es reproducido aquí bajo el ejemplo 1A. En resumen, PR0051 es una molécula de RNA sintética modificada con secuencia 5'-UCA AGG AAG AUG GCA UUU CU-3, y diseñada para específicamente inducir el salt059 del exón 51. Lleva fracciones de ribosa sustituidOl con 2'-O-metilo de longitud completa y enlaces de internucleótido de fosforotioato. Cuatro pacientes de DMD con deleciones del gen de DMD específico diferentes corregibles por salto de exón 51 fueron incluidos. En el día O, una serie de 65 parémetros de seguridad fue evaluada. La pierna del paciente (es decir músculo anterior tibial) fue fijada con un molde de plástico hecho a medida y su posición fue registrada cuidadosamente. Un anestésico tópico
(EMLA) fue usado para entumecer la piel. Cuatro inyecciones de PR0051 fueron dadas a lo largo de una línea de 1,5 cm entre dos tatuajes pequeños de la piel, utilizando una aguja electromiográfica de 2,5 cm (MyoJect Disposable Hypodermic Needle Electrode, TECA Accessories) para asegurar la administración intramuscular. Cada volumen de inyección fue 200 1-11, que contenía 200 IJg PR0051 , dispersado en partes 5 iguales a ángulos de aproximadamente 30 grados. En el dia 28, la misma serie de parámetros de seguridad fue evaluada nuevamente. La pierna fue posicionada utilizando el propio molde del paciente, y una biopsia de músculo semi-abierto fue tomada entre los tatuajes bajo anestesia local usando unos fórceps con dos mordazas afiladas (Blakesley Conchotoma, DK Instruments). La biopsia fue congelada rápidamente en 2metilbutano enfriado en nitrógeno líquido. Pacientes fueron tratados consecutivamente. En el momento del estudio, dos pacientes (nr. 1 y 2) estaban también con corticosteroides (prednisona o denazacort), uno justo terminó un tratamiento de esteroides (nrA) y un paciente nunca usó esteroides (nr.3) (véase tabla 1). Este último paciente fue también el que perdió la ambulación a la edad más joven cuando se compara con los otros tres pacientes. La biopsia fue analizada, para detección del salto de exón especifico a nivel de RNA (anélisis RT-PCR, no mostrado) y expresión nueva de distrofina a nivel de proteína (Inmunofluorescencia y 15 análisis de Western blot, resumidos en la tabla 1). Evaluación de la serie de parámetros de seguridad (parámetros rutinarios de plasma y de orina para la función renal y del hígado, niveles de electrolitos, cuentas de células sanguíneas, hemoglobina, aPTT, valores AP50 y CH50) antes y después del tratamiento, indicaron que el compuesto de PR0051 fue seguro localmente y bien tolerado. Para análisis de inmunofluorescencia, secciones transversales fijadas con acetona de la biopsia fueron incubadas durante 90 minutos con anticuerpos monoclonales contra el dominio de la barra central (MANOYS106, Dr. G. Morris, Reino Unido, 1:60), el dominio C-terminal (NCL-OYS2, Novocastra Laboratories LId., 1:30) o, como referencia, laminina-o.2 (Chemicon Intemational, Inc, 1:150), seguido de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra (H+L) Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Inc, 1 :250) durante una hora. Las secciones fueron montadas con Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories Inc.). Para el análisis cuantitativo de imágenes, el software ImageJ (W.
25 Rasband, NIH, EE.UU; http://rsb.info.nih.gov/ij) fue usado como se describe60· . Secciones transversales enteras fueron subdivididas en series de 6-10 imágenes adyacentes, dependiendo del tamaño de la sección. Para asegurar mediciones fiables, la tinción de las secciones y grabación de todas las imágenes se realizó en una sesión, usando ajustes de exposición fijos, y evitando la saturación de píxeles. El umbral de intensidad inferior fue establecido en los antecedentes de distrofia muscular de Duchenne, y la fluorescencia positiva fue cuantificada para cada sección (porcentaje de área), tanto para distrofina como laminina-a2. El análisis de eleclrotransferencia fue realizado como se describe1, usando homogenizados agrupados de conjuntos de cuatro series de secciones de 50 IJm en toda la biopsia. Para los pacientes 30 y 60 I-Ig de proteína total fue aplicada y para la muestra de control 3 IJg. La transferencia fue incubada durante toda la noche con anticuerpo monoclonal de distrofina NCL-DYS1 (Novocastra Laboratories, 1:125), seguido de IgG-HRP anti
35 ratón de cabra (Santa Cruz Biotechnology, 1:10.000) durante una hora. Bandas inmunoreactivas fueron visualizadas utilizando el ECL Plus Westem Blotting Oetection System (GE Healthcare) y Hyperfilm ECL (Amersham, Biosciences). Las intensidades de las señales fueron medidas utilizando ImageJ.
[0123) La expresión de proteína distrofina nueva en el sarcolema fue detectada en la mayoría de fibras musculares en el area tratada en los cuatro pacientes. Las fibras en cada sección fueron contadas manualmente después de teñir para laminina-o.2, una proteína de lámina basal no afectada por deficiencia de distrofina. Los números de individuos variaron, de acuerdo con el tamaño de la biopsia y la calidad de los músculos de los pacientes. En las secciones más grandes, el paciente 2 tuvo 726 fibras, de las cuales 620 fueron positivas en distrofina, mientras que el paciente 3 tuvo 120 fibras, de las cuales 117 fueron positivas 45 en distrofina. Las intensidades de distrofina fueron típicamente inferiores a aquell as en una biopsia de músculo sano. El análisis de electrotransferencia confirmó la presencia de distrofina en cantidades variables. Las señales de distrofina fueron escaneadas y correlacionadas al control (por IJg de proteína total). Las cantidades variaron del 3% en el paciente 3 con el músculo más distrófico, hasta 12°!o en el paciente 2 con el mejor músculo conservado. Ya que tal comparación basada en proteína total no corrige las cantidades variables de tejido fibrótico y adiposo en los pacientes de distrofia muscular de Duchenne, también cuantificamos la señal de fluorescencia de distrofina con respecto a aquella laminina-u2 situada de forma similar en cada sección, por análisis por ImageJ. Cuando esta proporción de distrofinallaminina-u2 fue establecida al 100% para la sección de control, los dos pacientes que fueron co-tratados con corticosteroides mostraron los porcentajes máximos de distrofina, 32% en el paciente 1 y 35% en el paciente 2 (tabla 1). El
55 porcentaje mínimo de distrofina fue detectado en el paciente 3, 17%. En el paciente 4 un porcentaje intermedio del 25% fue observado. Estos porcentajes correlacionados con la calidad relativa del músculo objetivo, que fue mejor en los pacientes nO 1 y 2, Ypeor en paciente nr.3.
Tabla 1.
Paciente 1
Pací ente 2 Paciente 3 Paciente 4
Edad años Edad en la pérdida de ambulación (años)
10 9 13 11 13 7 11 10
Tratamiento eon esteroides
Si Si Nunca Hasta Enero 2006
Pro oreión de Distrofína laminina-alfa2
32% 35% 17% 25%
[0124) Conclusión: el efecto del compuesto antisentido PR0051 fue más prominente en aquellos pacientes que fueron también sometidos a corticosteroides.
5 Ejemplo 1A
[0125) Reproducido por Van Deutekom JC et al, (2007) Antisense Oligonucleolide PR0051 Restares Local Dystrophin in DMD Patients. N Engl J Med ., 357(26): 2677-86.
Métodos
Pacientes y diseño de estudio
[0126) Pacientes con distrofia muscular de Duchenne que estaban entre las edades de 8 y 16 años fueron
15 elegibles para participar en el estudio. Todos los pacientes tuvieron deleciones que fueron corregibles por el salto del exon-51 y no obtuvieron pruebas de distrofina en la biopsia de músculo del diagnóstico precedente. Se permitió el tratamiento con glucocorticoides concurrente. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de los pacientes o sus padres, según lo apropiado. Durante el periodo de preselección (hasta 60 dias), cada estado mutacional del paciente y respuesta de salto de exón positivo para PR0051 in vitro fueron confirmados , y la cond ición del músculo anterior tibial fue determinada por imágenes ponderadas en T1 por resonancia magnética (MRI).62 Para pacientes que se deben incluir en el estudio, tejido fibrótico y adiposo podría componer no más de1500!o de su músculo objetivo.
[0127) Durante la visita inicial, las medidas de seguridad fueron evaluadas. En cada paciente, la pierna que
25 debía ser inyectada fue fijada con un molde de plástico hecho a medida y su posición fue registrada. Una mezcla eutéctica tópica de anestésicos locales (EMLA) fue usada para adormecer la piel. Cuatro inyecciones de PR0051 se administraron a lo largo de una línea que medía 1.5 cm situada entre dos tatuajes pequeños en la piel con el uso de una aguja electromiográfica de 2.5-cm (MyoJect Disposable Hypodermic Needle Electrode, TECA Accessories) para asegurar la administración intramuscular. El volumen de cada inyección fue 200 IJI conteniendo 200 IJg de PR0051 , que fue dispersado en partes iguales a ángulos de aproximadamente 30 grados.
[0128) En el dia 28, las medidas de seguridad fueron evaluadas nuevamente. La pierna que había sido inyectada fue posicionada con el uso del propio molde del paciente, y una biopsia de músculo semiabierto fue
35 realizada entre los tatuajes b~o anestesia local con unos fórceps con dos mordazas afiladas (Blakesley Conchotoma, DK Instruments). La muestra de biopsia fue congelada rápidamente en 2-metilbutano enfriado en nitrógeno líqu ido.
[0129) Los pacientes fueron tratados consecutivamente desde mayo de 2006 hasta marzo de 2007 y conforme a las directrices de Buenas Prácticas Clinicas y las disposiciones de la Declaración de Helsinki. El estud io fue aprobado por el Comité Central holandés de investigación en seres humanos y por la junta de revisión institucional local en el centro médico de la Universidad de Leiden. Todos los autores contribuyeron en el diseño del estudio, participaron en la colección y análisis de los datos, tuvieron acceso completo y libre a los datos, escribieron conjuntamente el manuscrito, y avalaron la integridad y exactitud de los datos y
45 análisis presentados.
Descripci6n de PR0051
[0130) PR0051 es una molécula de RNA modificada sintética con la secuencia 5'UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU-3,.12 Esta lleva en toda su longitud moléculas de ribosa sustituidas con 2'-0metilo y enlaces de internucle6tidos de fosforotioato. El fármaco fue proporcionado por Prosensa BV. en viales de 1 mg de material liofilizado sin excipiente. Se disolvió y administró en solución salina estéril sin conservantes (0.9% cloruro de sodio). PR0051 no se encontró que fuera mutagénico por análisis de Ames bacteriano. En los estudios de seguridad de Buenas Prácticas de Laboratorio, ratas que recibieron una
55 administración única de hasta 8 mg por kilogramo de peso corporal intramuscularmente y 50 mg por kilogramo por vía intravenosa no mostraron efectos adversos; monos que recibieron PR0051 durante 1 mes parecieron tolerar dosis hasta 16 mg por kilogramo por semana cuando el fármaco fue administrado por infusión intravenosa de 1 hora o por inyección subcutánea, sin efectos adversos clínicamente relevantes.
Preselección in vit ro
[0131 ) Un cultiv0 1 de mioblasto primario preexistente fue usado para la preselecci6n del paciente 4. Para los otros tres pacientes. los fibroblastos fueron convertidos en células miogénicas después de la infección con un vector adenoviral gue contiene el gen para el factor de transcripción miogénica (myoD) como se describe 65 previamente.1. 64.65 Cultivos en miotubos fueron transfectados con PR0051 (100 nM) y polietilenimina (2 IJI por microgramo de PR0051), según las instrucciones del fabricante para ExGen500 (MBI Fermentas). RNA
fue aislado después de 48 horas. Reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR~2 Inmunofluorescencia, y análisis de Western blot fueron realizados como se detalló anteriormente!. Fragmentos de la PCR fueron analizados con el uso del Bionalizador 2100 (Agilent) y se aislaron para la secuenciación por el Leiden Genome Technology Center.
Evaluación de seguridad
[0132) Al inicio y a las 2 horas, 1 día, y 28 días después de la inyección, todos los pacientes habían recibido un examen físico completo (incluida la medición de constantes vitales) y fueron sometidos a electrocardiografia. Además, plasma y orina fueron obtenidos para determinar la función renal y del hígado, niveles de electrolitos, cuentas de células completas, el tiempo de tromboplastina parcial activada, y valores de actividad de complemento en las vías tradicionales (CH50) y alternativas (AP50). El uso de medicamentos concomitantes fue registrado. Al inicio y en el día 28, la fuerza del músculo anterior tibial fue evaluada con el uso de la escala del consejo de investigación médica66 para evaluar si los procedimientos han afectado al
15 rendimiento muscular. (En esta escala, una puntuación de O no indica ningún movimiento y una puntuación de 5 indica fuerza de músculo normal.) Ya que solo un área pequeña del músculo fue tratada, no estaba previsto ningún beneficio clínico en cuanto al aumento de la fuerza muscular. En cada visita, eventos adversos fueron reg istrados.
Evaluación de RNA
[0133) Secciones en serie (50 IJm) de la muestra de biopsia de músculo congelada fueron homogeneizadas en la solución de RNA-Bee (Campro Scientific) y MagNA Lyser Green Beads (Rache Diagnostics). RNA total fue aislado y purificado según las instrucciones del fabricante. Para DNA complementario, síntesis fue 25 realizada con transcriptasa inversa Transcriptor (Rache Diagnostics) con el uso de 500 ng de RNA en una reacción de 20-1J1 a 55"C durante 30 minutos con cebadores inversos especificas del exón humano 53 o 54.
Análisis de PCR fueron realizados como se describe previamente.1• Los productos fueron analizados en geles de agarosa al 2% y secuenciados. Además, RT -PCR con el uso de un cebador establecido para la prueba6] de truncamiento de proteina fue usado para filtrar rápidamente eventos de empalme aberrante específicos en todo el gen de DMD.
Evaluación de nivel de proteína
[0134) Para análisis de inmunofluorescencia, secciones fijadas con acetona fueron incubadas durante 90
35 minutos con anticuerpos monoclonales contra el dominio de barra central (MANDYS106, Dr. G. Morris, Reino Unido) a una dilución de 1 :60, el dominio C-terminal (NCL-DYS2, Novocastra Laboratories) a una dilución de 1:30, o (como una referencia) la minina «2 (Chemicon International), una proteína de lámina basal no afectada por deficiencia de distrofina, en una dilución de 1:150, seguido de anticuerpo IgG antiratón de cabra (H+L) Alexa flúor 488 (Molecular Probes) a una dilución de 1:250 durante 1 hora. Secciones fueron montadas con Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories). El software ImageJ (W. Rasband, National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij) fue usado para análisis cuantitativo de imágenes como se describe
S1
previamente.ro. Secciones transversales enteras fueron subdivididas en la serie de 6 a 10 imágenes adyacentes, dependiendo del tamaño de la sección. Para asegurar mediciones fiables, la tinción de las secciones y grabación de todas las imágenes se realizó durante una sesión con el uso de ajustes de
45 exposición fijada y evitando la saturación de píxeles. El umbral de intensidad inferior fue establecido en los antecedentes para distrofia muscular de Duchenne, y la fluorescencia pOSitiva fue cuantificada para cada sección (porcentaje de área), tanto para distrofina como la minina «2.
[0135) Análisis de electrotransferencia fue realizado como se describe previamente1 con el uso de homogenizados agrupados de conjuntos de cuatro secciones de 50IJm en serie en toda la muestra de biopsia. Para cada paciente, dos cantidades de proteína total -30 IJg Y 60 IJg -fueron aplicadas, y para la muestra de control, 3 IJg. El Western blot fue incubado durante toda la noche con anticuerpo monoclonal de distrofina NCL-DYS1 (Novocastra Laboratories) a una dilución de 1 :125, seguido de IgG antirratón de cabra (Santa Cruz Biotechnology) marcado con peroxidasa de rábano picante a una dilución de 1:10,000 durante 1
55 hora. Bandas inmunoreactivas fueron visualizadas con el uso del sistema de detección del método de Western blot ECL Plus (GE Healthcare) e Hyperlilm ECL (Amersham Biosciences). Las intensidades de las señales fueron medidas usando el software ImageJ.
Resultados
Preselección de pacientes
[0136) El estudio fue planificado para incluir de cuatro a seis pacientes. Seis pacientes fueron invitados a participar, y uno declinó. Los cinco pacientes restantes fueron preseleccionados. Primero, la condición del 65 músculo anterior tibial fue evaluada en MRI. La condición muscular de cuatro pacientes fue considerada adecuada para el estudio (figura 2A), y la ausencia de distrofina fue confirmada en las muestras de biopsia
originales del paciente (figura 28). Segundo, el estado mutacional y respuesta del salto de exón positivo a PR0051 de estos cuatro pacientes fue confirmado en los cultivos de fibroblastos. El tratamiento de PR0051 generó un nuevo fragmento más corto de RNA mensajero para cada paciente, representando del 46% (en el paciente 4) al 90% (en el paciente 1) del producto RT-PCR total (figura 2C). El salto del exon-51 preciso fue
5 confirmado por la secuenciación (figura 2D). Ninguna otra región de transcripción fue encontrada alterada. Análisis de inmunofluorescencia mostraron una preponderancia de miotubos positivos de distrofina (figura 2E), un hallazgo que fue confirmado por análisis de Western blot (no mostrado). Así, los cuatro pacientes fueron juzgados aceptables para el tratamiento con PR0051. Sus características iniciales se muestran en la Tabla 2.
Seguridad y eventos adversos
[0137) Todos los pacientes tuvieron uno o más eventos adversos. Sin embargo, solo un paciente informó de un dolor local moderado en el sitio de inyección, que fue considerado un evento adverso relacionado con el 15 fármaco del estudio. Otros eventos incluyeron dolor leve a moderado después de la biopsia muscular. Dos pacientes tuvieron formación de ampollas bajo los vendajes usados para el cierre de la herida. En el periodo entre inyección y biopsia, dos pacientes informaron de unos pocos días de sintomas tipo gripe, y un paciente tuvo diarrea moderada durante 1 día. Al inicio, las puntuaciones de fuerza muscular del músculo anterior tibial tratado en los pacientes 1, 2, 3, Y 4 fueron 4, 2, 3, Y 4, respectivamente, en la escala del Consejo de Investigación Médica. Ninguno de los pacientes mostró cambios en la fuerza de este músculo durante el estudio o alteraciones significativas en las medidas estándares del laboratorio o aumento en las medidas de productos de degradación del complemento o tiempo de tromboplastina parcial activada. Ninguna respuesta inflamatoria local o tóxica fue detectada en las secciones del músculo de los pacientes (datos no mostrados). El paciente 3 fue sometido exitosamente a cirugia preplanificada para escol iosis en el mes después de que el
25 estudio fuese completado.
RNA Y nivel de proteína
[0138) En el día 28, una biopsia del área tratada fue realizada en cada paciente. RNA del músculo total fue aislado de secciones en serie en toda la muestra de biopsia. En todos los pacientes, RT-PCR identificó un nuevo fragmento más corto provocado por el salto del exon-51 , como confirmado por la secuenciación (figura 3). Otro análisis del transcrito no mostró otras alteraciones (datos no mostrados). Los análisis de inmunofluorescencia de secciones en toda la muestra de biopsia de cada paciente mostraron señales de distrofina de sarcolema claras en la mayoría de las fibras musculares (figura 4A y 48). Los anticuerpos de
35 distrofina proximal y distal a las deleciones que fueron usadas incluyeron MANDYS106 (figura 4A y 48) Y NCL-DYS2 (similares a MANDYS106, no mostrado). Las fibras en cada sección fueron contadas manualmente después de la Unción para laminina 0.2 .68 Los números de individuos variaron, de acuerdo con el tamaño de la muestra de biopsia y la calidad del músculo. En las secciones más grandes, el paciente 2 tuvo 726 fibras, de las cuales 620 fueron pOSitivas en distrofina, mientras que el paciente 3 tuvo 120 fibras, de las cuales 117 fueron positivas en distrofina (figura 4A y 4C). Las intensidades de distrofina fueron típicamente inferiores a aquellas en una muestra de biopsia de músculo sano (figura 48). Las fibras únicas con una señal de distrofina más intensa en los pacientes 2 y 3 podrían ser fibras revertientes (figura 48).
[0139) Análisis de Western blot confirmaron la presencia de distrofina en cantidades variables (figura 4E). Las
45 señales de distrofina fueron escaneadas y correlacionadas al control (por microgramo de proteína total). Las cantidades variaron del 3% en el paciente 3, que tuvo el músculo más distrófico, hasta el 12% en el paciente 2, que tuvo el músculo mejor conservado. Ya que tal comparación basándose en la proteína total no se corrige para las cantidades variables de tejido fibrótico y adiposo en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne, también cuantificamos la señal de fluorescencia de distrofina (figura 4A y 48) con respecto a aquella la minina 0.2 situada de forma similar en cada sección por análisis ImageJ. Cuando la proporción de distrofina a la minina 0.2 fue establecida en 100 para la sección de control, los pacientes 1, 2, 3, Y 4 tuvieron proporciones de 33, 35, 17, Y 25, respectivamente (figura 4D).
Discusión
55 [0140) Nuestro estudio mostró que la inyección intramuscular local de PR0051, un oligorribonucleótido antisentido de 20MeP complementario a una secuencia de 20 nucleótidos dentro del exón 51 , indujeron el salto del exon-51 , corrigieron el marco de lectura, y así introdujeron distrofina en el músculo en los cuatro pacientes con distrofia muscular de Duchenne Que recibieron terapia. Fibras positivas de distrofina fueron descubiertas en todas las muestras de biopsia del paciente, indicando la dispersión del compuesto en el área inyectada. Ya que ningún excipiente de mejora de administración fue usado, la absorción de PR0051 no pareció ser un factor limitativo potencialmente importante. No puede excluir Que la permeabilidad aumentada de la membrana de fibra distrófica tenga un efecto favorable. Los niveles producidos de pacientes de dislrofina Que fueron 3 a 12% del nivel en el músculo de conlrol sano, como se muestra en el análisis de
65 Western blot de proteína total. Ya que la presencia de fibrosis y grasa puede llevar a alguna subeslimación de distrofina en extractos de proteína totales, determinamos la proporción de distrofina a la minina 0.2 en las secciones transversales, que oscilaron de 17 a 35, como comparado con 100 en el músculo de control. El efecto restaurador de distrofina de PROOSl fue limitado al área tratada, y nin9una mejora de fuerza del músculo entero fue observada. El tratamiento sistémico futuro requerirá administración repetida para aumentar y mantener la expresión de distrofina a un nivel más allo y para obtener eficacia clínica.
[0141) Debido a re91amentos de ética médica con relación a intervenciones en menores, no pudimos obtener una muestra de biopsia de los músculos contralaterales de los pacientes que no fueron inyectados. Sin embargo, los pacientes mostraron menos del 1% de fibras revertientes en las muestras de biopsia de diagnóstico original obtenidas 5 a 9 años antes de la iniciación del estudio (tabla 2 y figura 2B). Consideramos muy posible que los efectos que observamos estuvieran relacionados con la naturaleza y secuencia del PROOSl reactivo antes que a un aumento marcado en fibras revertientes. De hecho, una única fibra posiblemente revertiente que tuvo una señal de distrofina aumentada fue observada tanto en el paciente 2 como en el paciente 3 (figura 4B). En resumen, nuestro estudio mostró que la administración local de PROOSl al músculo en cuatro pacientes con distrofia muscular de Duchenne restauró la distrofina a niveles
15 que varían de 3 a 12'% o 17 a 35%, dependiendo de la cuantificación con respecto a la proteína total o contenido de miofibra. De acuerdo con la naturaleza localizada claramente del tratamiento, no se observó mejora funcional. El resultado consistentemente más pobre en el paciente 3, que tenía la enfermedad más avanzada, sugiere la importancia de realizar pruebas clinicas en los pacientes a una edad relativamente joven, cuando el tejido muscular relativamente pequeño ha sido sustituido por tejido fibrótico y adiposo. Nuestras conclusiones proporcionan una indicación de que el sallo del exón mediado por antisentido puede ser un método potencial para restaurar la síntesis de distrofina en los músculos de pacientes con distrofia muscular de Ouchenne.
Ejemplo de referencia 2
25 [0142) En un estudio preclínico en ratones mdx (modelo animal para DMO) el efecto de prednisona del compuesto complementario en el sallo del exón inducido por AON fue evaluado. Ratones mdx (C57Blll0ScSn-mdxlJ) fueron obtenidos de Charles River Laboratories (The Netherlands). Estos ratones son deficientes en distrofina debido a una mutación sin sentido en el exón 23. El salto del exón inducido por AON 23 es terapéutico en ratones mdx eliminando la mutación sin sentido y corrección del marco de lectura abierto. Dos ratones mdx por grupo fueron inyectados subcutáneamente con: Grupo 1) sal fisiológica (semana 1-8), Grupo 2) prednisolona (Imgfkg , semana 1-8), Grupo 3) oligonucleótido antisentido PS49 especifico de ratón diseñado para inducir especificamente el salto del exón 23 (l00mglkg, semana 4 (5 veces), semana 5-8 (2 veces), Grupo 4) prednisolona (Img/kg , semana 1-8) + PS49 (100mgfkg, semana 4 (5
35 veces), semana 5-8 (2 veces). PS49 (5 GGCCAAACCUCGGCUUACCU 3') tiene un esqueleto de fosforotioato en toda su longitud y moléculas de ribosa modificadas por 2'O-metilo.
[0143) Todos los ratones fueron sacrificados 1 semana después de la última inyección. Grupos de músculos diferentes, incluyendo cuádriceps, músculo anterior tibial, y músculo del diafragma fueron aislados y congelados en 2-metilbutano enfriado con nitrógeno liquido. Para análisis RT-PCR, las muestras musculares fueron homogeneizadas en la solución de RNA-Bee (Campro Scientific, The Netherlands). RNA total fue aislado y purificado según las instrucciones del fabricante. Para síntesis de cONA con tranSCfiptasa inversa (Rache Diagnostics, The Netherlands), 300 ng de RNA fue usado en una reacción de 20 ¡JI a 55"C durante 30 min, cebado inverso con cebadores especificas de gen DMD de ratón. Primeras PCRs fueron realizadas con 45 conjuntos de cebador externo, para 20 ciclos de 94"C (40 seg), 60"C (40 seg), y 72"C (60 seg). Un ¡JI de esta reacción (diluida 1:10) fue luego reamplificada utilizando combinaciones de cebador anidado en los exones directamente flanqueando el exón 23, con 30 ciclos de 94"C (40 seg), 60"C (40 seg), y 72"C (60 seg). Productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2%. Rendimientos del salto fueron determinados por cuantificación de productos de PCR usando el DNA 1000 LabChip® Kit y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, The Netherlands). Ningún salto del exón 23 fue observado en los músculos de ratones tratados con sal fisiológica o prenisolona solo (grupos 1 y 2). Los niveles de sallo del exón 23 fueron detectados y por grupo muscular comparado entre ratones tratados con PS49 solo (grupo 3) y ratones tratados con PS49 y prednisolona de compuesto complementario (grupo 4). En el cuádriceps (a), músculo anterior tibial (TA), y diafragma (OlA), niveles de salto de exón 23 fueron típicamente más alias en el grupo 4
55 cuando se compara con el grupo 3 (figura 5). Esto indica que prednisolona de compuesto complementario de hecho mejora los niveles de sallo del exón 23 en ratones mdx tratados con PS49.
Ejemplo 3
[0144) A., B. Cultivos de células musculares diferenciados (miotubos) derivados de un individuo sano de control fueron transfectados con 250 nM PS188 ([5' UCAGCUUCUGUUAGCCACUG 3'; SEO ID NO:l0) un AON optimizado para sallar específicamente el exón 44) o 250 nM PS221 ([5' AUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUGC 3'; SEO ID N.o: 60) un AON optimizado para sallar específicamente el exón 45) en presencia de O a 0,5 mg/ml de pentoxifilina, utilizando el polímero reactivo de transfección 65 UNIFectylin (2,0 ¡JI UNIFectylin por IJg AON en 0,15M NaCI). UNIFectylin interactúa electrostáticamente con ácidos nucleicos, con la condición de que el ácido nucleico sea cargado negativamente (tal como AONs de 2'O-metil fosforotioato). Pentoxifllina (Sigma Aldrich) fue disuelta en el agua. RNA total fue aislado 24 hrs después de la transfección en la solución RNA-Bee (Campro Scientific, The Netherlands) según las instrucciones del fabricante. Para síntesis de cDNA con transcriptasa inversa (Rache Diagnostics, The Netherlands), 500 ng de RNA fue usado en una reacción de 20 ¡JI a 55Q C durante 30 min, cebado inverso con 5 cebadores especificas del gen de DMD. Las primeras PCR fueron realizadas con conjuntos de cebador externos, para 20 ciclos de 94Q C (40 seg), 60"C (40 seg), y 72Q C (60 seg). Un ¡JI de esta reacción (diluida 1:10) fue luego reamplificada utilizando combinaciones de cebador anidadas en los exones directamente flanqueando el exón 44 o 45, con 30 ciclos de 94Q C (40 seg), 60"C (40 seg), y 72"C (60 seg). Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2%. Los rendimientos de salto fueron determinados por
10 cuantificación de productos de PCR usando el DNA 1000 LabChip® Kit y el bioanalizador de Agilent 2100 (Agilent Technologies, The Netherlands). Tanto con PS188 como PS221 , los niveles en aumento de salto del exón 44 o 45 fueron obtenidos con concentraciones en aumento de la pentoxifilina del compuesto complementario cuando se compara con aquellos obtenidos en células que no eran cotratadas con pentoxifllina (ver figura 6). Estos resultados indican
15 que la pentoxifilina mejora los niveles de salto de exón en las células musculares.
C. En un estudio preclínico en ratones mdx (modelo animal para DMD) el efecto de pentoxifilina de compuesto complementario en el salto de exón inducido por AON fue evaluado. Ratones mdx (C5781f10ScSn-mdx/J) fueron obtenidos de Charles River Laboratories (The Netherlands). Estos ratones son deficientes en distrofina debido a una mutación sin sentido en el exón 23. Salto de exón inducido por AON 23 20 es terapéutico en ratones mdx eliminando la mutación sin sentido y corrección del marco de lectura abierto. Dos ratones mdx por grupo fueron inyectados subcutaneamente con: Grupo 1) pentoxifilina (50 mg/kg, semana 1-2), Grupo 2) oligonucle6tido antisentido PS49 especifico de ratón diseñado para inducir específicamente el salto del exón 23 (100mg/kg, semana 2 (2 veces), Grupo 3) pentoxifilina (50 mg/kg, semana 1-2) + PS49 (100mg/kg, semana 2 (2 veces ). PS49 (5' GGCCAAACCUCGGCUUACCU 3') tiene un
25 esqueleto de fosforotioato en toda su longitud y moléculas de ribosa modificadas por 2'O-metilo.
[0145) Todos los ratones fueron sacrificados 1 semana después de la última inyección. Grupos de músculos diferentes, incluyendo músculos cuádriceps, tibial anterior, tríceps y cardíacos fueron aislados y congelados en 2-metilbutano enfriado en nitrógeno líquido. Para análisis por RT -PCR, las muestras musculares fueron 30 homogeneizadas en la solución de RNA-Bee (Campro Scientific, The Netherlands). RNA total fue aislado y purificado según las instrucciones del fabricante. Para síntesis de cDNA con transcriptasa inversa (Rache Diagnostics, The Netherlands), 300 ng de RNA fueron usados en una reacción de 20 ¡JI a 55"C durante 30 min, cebado inverso con cebadores específicos de gen de DMD de ratón. Las primeras PCR fueron realizadas con conjuntos de cebadores extemos, para 20 ciclos de 94Q C (40 seg), 60" C (40 seg), y 72"C (60 35 seg). Un ¡JI de esta reacción (diluida 1:10) fue luego reamplificada utilizando combinaciones de cebador anidado en los exones directamente flanqueando el exón 23, con 30 ciclos de 94Q C (40 seg) , 60Q C (40 seg), y 72Q C (60 seg). Productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2%. Rendimientos de salto fueron determinados por cuantificación de productos de PCR usando el DNA 1000 LabChip® Kit y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, The Netherlands). Ningún salto del exón 23 fue observado 40 en los músculos de ratones tratados con pentoxifilina solo (grupos 1). Los niveles de salto del exón 23 fueron detectados y por grupo muscular comparados entre ratones tratados con PS49 solo (grupo 2) y ratones tratados con PS49 y pentoxifilina de compuesto complementario (grupo 3). En los músculos cuádriceps (O), tibial anterior (TA), tríceps (tri) y cardíaco (HRT), los niveles de salto de exón 23 fueron típicamente más altos en el grupo 3 cuando se compara con el grupo 2 (figura Be). Esto indica que pentoxifilina de compuesto
45 complementario de hecho mejora los niveles del salto del exón 23 en ratones mdx tratados con PS49.
Tabla 2. Características iniciales de los pacientes de DMD
Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Edad años} 10 13 13
Paciente 4 11
Deleción Exón 50 Exones 48Exones 49-50 50
Exón 52
Edad en r. pérdida de ambulación 9 11 7 laños)
10
Escoliosis No No Si
Si
Niveles de creatina-cinasa U/I 5823 2531 717
47 11
Tratamiento con esteroides Si Si Nunca
Hasta Enero 2006
Fue~)a der musculo TA (escala de 4 2 3 MRC
4
Est ado MRI músculo de TA Moderado Moderado Moderado
Moderado
% fibras revertientes N.o. <1 % N.O. Nivel normal: <200 UfI 2 Menos del 50% de infiltración de grasa yfo fibrosis IMercuri et al. , 2005)
Ref erencias
[01.6[
1.
Aarisma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, el al. Therapeulic antisense-induced exon skipping in cultured 5 muscle cel1s from six different DMD patients. Hum Mol Genet 2003;12(8):907-14.
2.
Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, et al. Antisense-induced multiexon skippin9 for Duchenne muscular dystrophy makes more sen se. Am J Hum Genet 2004;74(1 ):83-92.
3.
Alter J, lou F, Rabinowitz A, et al. Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology. Nal Med 2006;12(2):175-7.
4.
Goyenval1e A, Vulin A, Fougerousse F, et al. Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science 2004;306(5702):1796-9.
5.
Lu Ql, Mann CJ, Lou F, et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutaled exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med 2003;6:6.
6.
Lu Ql, Rabinowitz A, Chen YC, et al. Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin 15 expression in body-wide skeletal muscles. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(1): 198-203.
7.
McClorey G, Fall AM, Moullon HM, el al. Induced dystrophin exon skipping in human muscle explanls. Neuromuscul Disord 2006; 16{9-1 0):583-90.
8.
McClorey G, Moulton HM, Iversen Pl, et al. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restores dystrophin expression in vilro in a canine model of DMD. Gene Ther 2006;13(19):1373-81.
9.
Pramono ZA, Takeshima Y, Alimsardjono H, Ishii A, Takeda S, Matsuo M. Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in Iymphoblastoid cel1s by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary lo an exon recognition sequence. Biochem Biophys Res Commun 1996;226(2):445-9.
10.
Takeshima Y, Yagi M, Wada H, et al. Inlravenous infusion of an antisense oligonucleolide resulls in exon skipping in muscle dystrophin mRNA of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr Res 2006;59(5):690-4.
25 11. van Deulekom JC, Bremmer-Boul M, Janson AA, el al. Anlisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum Mol Genet 2001 ;10(15):1547-54.
12.
Aarisma-Rus A, Bremmer-Boul M, Janson A, den Dunnen J, van Ommen G, van Deulekom J. Targeled exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 2002;12 Suppl:S71-S77.
13.
Aarisma-Rus A, De Winler Cl, Janson AA, el al. Funclional analysis of 114 exon-inlemal AONs for largeled DMD exon skipping: indication for steric hindrance of SR protein binding siles. Oligonucleolides 2005; 15{4 ):284-97.
14.
Aartsma-Rus A, Janson AA, Heemskerk JA, Cl de Winter, GJ Van Ommen, JC Van Deutekom.
Therapeutic Modulation of DMD Splicing by Blocking Exonic Splicing Enhancer Sites with Antisense 35 Oligonucleolides. Annals of the New York Academy of Sciences 2006;1082:74-6.
15.
Aarisma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deulekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within ene or mulliple exons. Mol Ther 2006;14(3):401-7.
16.
Welch EM, Barion ER, Zhuo J, el al. PTC124 largels genelic disorders caused by nonsense mutalions. Nature 2007;447(7140):87-91 .
17.
Hirawat S, Welch EM, Elfring Gl, et al. Safety, tolerability, and pharmacokinetics of PTC124, a nonaminoglycoside nonsense mutation suppressor, foUowing single-and mulliple-dose administration to healthy male and female adull volunteers. Journal of clinical pharmacology 2007;47(4):430-44.
18. Wang B, li J, Xiao X. Adeno-associaled virus vector carrying human minidyslrophin genes effeclively 45 ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(25):13714-9.
19.
Fabb SA, Wells DJ, Serpenle P, Dickson G. Adeno-associaled virus veclor gene Iransfer and sarcolemmal expression of a 144 kDa micro-dystrophin effectively restores the dystrophin-associated protein complex and inhibits myofibre degeneration in nude/mdx mice. Hum Mol Genet 2002;11(7):733-41.
20.
Wang Z, Kuhr CS, Al1en JM, el al. Suslained AAV-medialed dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy with a brief course of immunosuppression. Mol Ther 2007;15(6):1160-6.
21.
Manzur AY, Kunlzer T, Pike M, Swan A. Glucocoriicoid corticosleroids for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst Rev 2004;2.
22.
Duboc D, Meune C, PieITe B, et al. Perindopril preventive treatment on mortality in Duchenne muscular dystrophy: 10 years' fol1ow-up. American heart joumal 2007;154(3):596-602.
55 23. Cohn RD, van Erp C, Habashi JP, el al. Angiolensin 11 Iype 1 receplor blockade atlenuales TGF-belainduced failure of muscle regeneration in multiple myopathic states. Nal Med 2007;13(2):204-10.
24.
Grounds MD, Torrisi J. Anti-TNFalpha (Remicade) therapy protecls dystrophic skeletal muscle from necrosis. Faseb J 2004;18(6):676-82 .
25.
Hodgetts S, Radley H, Davies M, Grounds MD. Reduced necrosis of dystrophic muscle by depletion of hos! neutrophils, or blocking TNFalpha function with Etanercept in mdx mice. Neuromuscul Disord 2006;16{910):591-602.
26.
Pierno S, Nico B, Burdi R, el al. Role of lumour necrosis faclor alpha, bul nol of cyclo-oxygenase-2derived eicosanoids, on funclional and morphological indices of dystrophic progression in mdx mice: a pharmacological approach. Neuropathology and applied neurobiology 2007;33(3):344-59.
65 27. Musaro A, McCul1agh K, Paul A, et al. Localized Igf-l transgene expression sustains hypertrophy and regeneralion in senescenl skelelal muscle. Nal Genel 2001 ;27(2):195-200.
28.
Barton ER, Morris L, Musaro A, Rosenthal N, Sweeney HL. Muscle-specific expression of insulin-like 9rowth factor I counters muscle decline in mdx mice. J Cell Biol 2002;157(1 ):137-48.
29.
Oisalnik MH, Ohawan J, Yu Y, et al. Evidence of oxidative stress in mdx mouse muscle: studies of the prenecrotic state. J Neurol Sci 1998;161 (1 ):77-84.
5 30. Nelson SK, Bose SK, Grunwald GK, Myhill P, McCord JM. The induction of human superoxide dismutase and catalase in vivo: a fundamentally new approach to antioxidant therapy. Free radical biology & medicine 2006;40(2):341-7.
31.
Hart PE, Lodi R, Rajagopalan B, et al. Antioxidant treatment of patients with Friedreich ataxia: four-year follow-up. Archives of neurology 2005;62(4):621-6.
32.
Rolland JF, Oe Luca A, Burdi R, Andreetta F, Confalonieri P, Conte Camerino o. Overactivity of exercisesensitive cation channels and Iheir impaired modulation by IGF-1 in mdx native muscle fibers: beneficial effect of pentoxifylline. Neurobiol Ois 2006;24(3):466-74.
33.
Whilehead NP, Streamer M, Lusambili LI, Sachs F, Allen OG. Slreptomycin reduces slretch-induced membrane permeability in muscles from mdx mice. Neuromuscul Oisord 2006;16(12):845-54.
15 34. Badalamente MA, Stracher A. Oelay of muscle degeneralion and necrosis in mdx mice by calpain inhibilion. Muscle Nerve 2000;23(1 ):106-11.
35.
Burdi R, Oidonna MP, Pignol B, et al. First evaluation of Ihe polential effectiveness in muscular dystrophy of a novel chimeric compound, BN 82270, acting as calpain-inhibitor and anti-oxidant. Neuromuscul Oisord 2006;16(4):237-48.
36.
Bonuccelli G, Sotgia F, Schubert W, el al. Proteasome inhibitor (MG-132) treatment of mdx mice rescues the expression and membrane localization of dystraphin and dystrophin-associated proteins. Am J Pathol 2003;163(4 ):1663-75.
37.
Voisin V, Sebrie C, Matecki S, et al. L-arginine improves dystrophic phenotype in mdx mice. Neurobiol Ois 2005;20(1 ): 123-30.
25 38. Soret J, Bakkour N, Maire S, et al. Selective modificalion of alternalive splicing by indole derivatives that targel serine-arginine-rich protein splicing factors. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(24):8764-9.
39.
Mann CJ, Honeyman K, McClorey G, Flelcher S, Wilton SO. Improved anlisense oligonucleotide induced exon skipping in Ihe mdx mouse model of muscular dyslrophy. J Gene Med 2002;4(6):644-54.
40.
Graham IR, HiII VJ, Manoharan M, Inamali GB, Dickson G. Towards a therapeutic inhibition of dystrophin exon 23 splicing in mdx mouse muscle induced by anlisense oligoribonucleolides (splicomers): larget sequence optimisation using oligonucleolide arrays. J Gene Med 2004:6(10):1149-58.
41.
Mathews OH, Sabina J, luker M, Turner DH. Expanded sequence dependence of Ihermodynamic paramelers improves prediction of RNA secondary struclure. J Mol BioI1999;288(5):911-40.
42.
Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Lislening lO silence and understanding nonsense: exonic mutations Ihat 35 affecl splicing. Nal Rev GeneI2002;3(4):285-98.
43.
Cartegni L, Wang J, lhu l, Zhang MQ, Krainer AR. ESEfinder: A web resource lo idenlify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res 2003;31(13):3568-71.
44.
Braasch DA, Carey OR. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning Ihe recognilion of DNA and RNA. Chem BioI 2001 ;8(1):1-7.
45.
Braasch DA, Corey OR. Novel antisense and peptide nucleic acid stralegies for controlling gene expression. Biochemistry 2002;41 (14):4503-10.
46.
Elayadi AN, Corey DR. Applicalion of PNA and LNA oligomers to chemolherapy. Curr Opin Investig Orugs 2001 ;2(4):558-61 .
47.
Larsen HJ, Benlin T, Nielsen PE. Anlisense properties of peptide nucleic acid. Biochim Biophys Acla 45 1999;1489(1 ): 159-66.
48.
Summerton J. Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independenl slruclural Iype. Biochim Biophys Acta 1999;1489(1 ):141-58.
49.
Summerton J, Weller O. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties. Antisense Nucleic Acid Orug Oev 1997;7(3):187-95.
50.
Wahlestedt C, Sal mi P, Good L, et al. Potenl and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(10):5633-8.
51 . De Angelis FG, Slhandier 0 , Berarducci B, el al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against Ihe splice junctions of exon 51 af Ihe dyslrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Oelta 48-50 DMO cells. Proc NaU Acad Sci U S A 2002;99(14):9456
55 61.
52.
Denli MA, Rosa A, D'Antona G, el al. Chimeric adeno-associated viruslantisense U1 small nuclear RNA effeclively rescues dyslrophin synthesis and muscle funclion by local trealmenl of mdx mice. Hum Gene Ther 2006;17(5):565-74.
53.
Gorman L, Suter O, Emerick V, Schumperli O, Kole R. Slable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(9):4929-34.
54.
Suler O, Tomasini R, Reber U, Gorman L, Kole R, Schumperli D. Oouble-targel antisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberranl exon in Ihree human beta-thalassemic mutations. Hum Mol Genet 1999;8(13):2415-23.
55. Wagner KR, Hamed S, Hadley OW, el al. Gentamicin trealment of Duchenne and Becker muscular 65 dystrophy due lO nonsense mutations. Ann Neurol 2001 ;49(6):706-11.
56. Aartsma-Rus A el al, (2006), Entries in Ihe leiden Ouchenne Muscular Oystrophy mulalion dalabase: an overview of mulalion Iypes and paradoxical cases Ihal confirm Ihe reading-frame rule, Musc!e Nerve, 34: 135
144.
57. Hodgetts S., el al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602.
58. Manzur AY el al, (2008), Glucocorticoid corticosleroids for Duchenne muscular dyslrophy (review), Wiley 5 publishers, The Cochrane collaboralion.
59.
Van Deulekom JC el al, (2007) Anlisense Oligonucleolide PR0051 Reslores Local Dyslrophin in DMD Palienls. N Engl J Med., 357(26): 2677-86.
60.
Yuan H, Takeuchi E, Taylor GA, McLaughlin M, Brown D, Salanl DJ. Nephrin dissociales from aClin, and ils expression is reduced in early experimenlal membranous nephropalhy. J Am Soc NephroI2002;13:946-56.
10 61. Koop K, Bakker RC, Eikmans M, el al. Differenlialion belween chronic rejeclion and chronic cyclosporine loxity by analysis of renal cortical mRNA. Kindney InI2004;66:2038-46.
62. Mercuri E, Bushby K, Ricci e., el al. Musc!e MRI findings in palienls wilh limb girdle muscular dyslrophy wilh calpain 3 deficiency (LGMD2A) and early conlraclures. Neuromuscul Disord 2005;15:164-71.
63. Dorph C, Nennesmo 1, Lundberg lE. Perculaneous conchotome muscle biopsy: a useful diagnostic and 15 assessment 1001. J Rheumalol 2001 ;28:1591-9.
64.
Havenga MJ, Lemckert AA, Ophorsl OJ, el al. Exploiting Ihe natural diversily in adenovirus Iropism for therapy and prevention of disease. J ViroI2002;76:4612-20.
65.
Roesl PA, van der Tuijn AC, Ginjaar HS, el al. Application of in vitra Myo-differentatian af non-muscle cens lo enhance gene expression and facililale analysis of musc!e proleins. Neuromuscul Disord 1996;6:195-202.
20 66. John J. Grading af muscular pawer: camparisan af MRC and analogue scales by physiotherapists. Int J Rehabil Res 1984;7:173-81.
67. Roesl PA, Roberts RG, van der Tuijn AC, Heikoop JC, van Ommen GJ, den Dunnen JT. Prolein lruncation test (PTT) lo rapidly screen the DMD gene for translation lerminating mulalions. Neuromuscul Disord 1993;3:391-4.
25 68. Cullen MJ, Walsh J, Roberds SL, Campbell KP. Ultraslruclurallocalizalion of adhalin, alpha-dyslroglycan and merosin in normal and dystrophic muscle. Neuropathol Appl NeurobioI1996;22:30-7.
LISTAOO DE SECUENCIAS
[0147[
<110> Academisch Ziekenhuis Leiden Prosensa technolog ies S.V. De Kimpe , Josephus J
35 Platenburg, Gerardus J van Deulekom, Judith C.T. Aartsma-Rus , Annemieke van Ommen, Gerrit-Jan S
<120> Med ios y métodos para conlrarreslar los Iraslomos musculares 40 <130> P81820PCOO
<140> PCTfNL2008/050673
<141 > 2008-10-27
<150> EP 07119351.0
<151> 2007-10-26 45 <150> US 61 /000, 670
<151> 2007-10-26
<160> 322
<170> Patentln version 3.3
50 <210> 1
<211> 3685
<212> PRT
<213> Hamo sapiens
55 <400> 1
Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val 1 5 la 15
Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe 20 25 30
Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser ASp Leu Gln ASp Gly Arg 35 40 45
Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys 50 55 60
Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala 65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser 85 90 e
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp 100 105 110
Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
115 120 125
Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp val 130 135 140
Arg Gln Ser Thr Arq Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr 145 150 155 160
Thr Ser Trp Ser ASp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His 165 170 175
Arq Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala 180 185 190
Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly 195 200 205
Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp 210 215 220
Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro 225 230 235 240
Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg 245 250 255
Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met
260 265 270
His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg 275 280 285
Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arq Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala 290 295 300
Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln 305 310 315 320
His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe G1y Ser Ser Leu Met Glu 325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Gl u Glu Val Leu 340 345 350
Ser Trp Leu Leu
Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile
355
360 365
34
Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly 370 375 380
Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arq Val Gly Asn Ile Leu 385 390 395 400
Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu 405 410 415
Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu 420 425 430
Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val 435 440 445
Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu 450 455 460
Thr Lys Thr Glu Glu Arq Thr Arq Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly 465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arq Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu 485 490 495
Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arq Val Asn Ser Leu Thr His 500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala 515 520 525
Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arq Trp Ala Asn Ile Cys 530 535 540
Arq Trp Thr Glu Asp Arq Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys 545 550 555 560
Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser 565 570 575
Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp 580 585 590
Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala 595 600 605
Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys 610 615 620
Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr 625 630 635 640
Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arq Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln 645 650 655
Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln rle Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr 660 665 670
Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val 675 680 685
Thr Thr Arg Glu Gln rle Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro 690 695 700
Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln rle Thr Val Asp Ser Glu rle 705 710 715 720
Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp rle Thr Glu Leu His Ser Trp rle Thr 725 730 735
Arq Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala rle Phe Arq Lys 740 745 750
Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala rle Glu Arq 755 760 765
Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala 770 775 780
Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser 785 790 795 800
rle Lys Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp rle Glu Phe Cys 805 810 815
Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn rle 820 825 830
rle Ala Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr 835 840 845
Ala Glu Asn Trp Leu Lys rle Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Pro Thr 850 855 860
Ala rle Lys Ser Gln Leu Lys rle Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu 865 870 875 880
Ser Gly Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Ile Ala 885 890 895
Le u Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe val 900 905 910
Ala Phe Thr Asn Rís Phe Lys G1n Val Phe Ser Asp Val Gln Ala Arq 915 920 925
Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arq Tyr 930 935 940
Gln Glu Thr Met Ser Ala Ile Arq Thr Trp Val Gln Gln Ser Glu Thr 945 950 955 960
Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Asp Tyr Glu Ile Met Glu 965 970 975
Gln Arq Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln 980 985 990
Gln Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu Ser Thr Thr Val Lys Glu Met Ser Lys 995 1000 1005
Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser Arq Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu 1010 1015 1020
Glu Ile Glu Gly Arq Trp Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu Val Glu 1025 1030 1035
Rís Cys Gln Lys Leu Glu Glu Gln Met Asn Lys Leu Arq Lys Ile 1040 1045 1050
Gln Asn Rís Ile Gln Thr Leu Lys Lys Trp Met Ala Glu Val Asp 1055 1060 1065
Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ser Glu Ile 1070 1075 1080
Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arq Leu Leu Val Ser ASp Ile 1085 1090 1095
Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Gly Gly Gln 1100 1105 1110
Lys Ile Lys Asn Glu Ala Glu Pro Glu Phe Ala Ser Arq Leu Glu 37
Thr Glu 1130
Gln Val 1145
Thr Val 1160
Thr Gln 1175
Thr Pro 1190
Lys Glu 1205
Glu Ser 1220
Glu Ala 1235
Trp Leu 1250
Val Trp 1265
Asn Lys 1280
Asn Ile 1295
Leu Glu 1310
Arg Ile 1325
Leu Ile 1340 1120
Leu Lys G1u Leu Asn 1135
Tyr Ala Arg Lys Glu 1150
Ser Leu Gln Lys ASp 1165
Ala Glu Glu Glu Tyr 1180
Asp Glu Leu Gl n Lys 1195
Glu Ala Gln Gln Lys 1210
Val Asn Ser Val Ile 1225
Leu Lys Lys Glu Leu 1240
Cys Thr Arg Leu Asn 1255
Al a Cys Trp His Glu 1270
Trp Leu Asn Glu Val 1285
Pro Gly Gly Ala Glu 1300
Asn Leu Met Arg His 1315
Leu Ala Gln Thr Leu 1330
Asn Glu Glu Leu Glu 1345
Thr G1n Trp Asp
Ala Leu Lys Gly
Leu Ser Glu Met
Leu Glu Arg Asp
Ala Val Gl u Glu
Glu Ala Lys val
Ala Gln Al a Pro
Glu Thr Leu Thr
Gly Lys Cys Lys
Leu Leu Ser Tyr
Glu Phe Lys Leu
Glu Ile Ser Glu
Ser Glu Asp Asn
Thr Asp Gly Gly
Thr Phe Asn Ser 1125
His 1140
Gly 1155
His 1170
Phe 1185
Met 1200
Lys 1215
Pro 1230
Thr 1245
Thr 1260
Leu 1275
Lys 1290
Val 1305
Pro 1320
Val 1335
Arg
l350
Met Cys G1n
Leu Glu Lys
Glu Trp Met
Glu Tyr Lys
Lys Arg Ala
Leu Leu Thr
Val Ala Gln
Asn Tyr Gln
Leu Glu Glu
Glu Lys Ala
Thr Thr Glu
Leu Asp Ser
Asn Gln Ile
Met Asp Glu
Trp Arg Glu
Leu His Glu Glu Ala Val Arg 1355 1360
Ile Gln Ser Ala Gln Glu Thr 1370 1 375
Gl u Ser Leu Thr Phe Ile Asp 1385 1390
Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln 1400 1 405
Gln Ser Asp Leu Thr Ser His 1415 1420
Lys His Asn Gln Gly Lys Glu 1430 1435
Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys 1445 1450
Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala 1460 1465
Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu 1 475 1480
Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln 1 490 1495
His Cys Val Aso Leu Tyr Lys 1505 1510
Val Gl u Het Val 1 le Lys Thr 1520 1 525
Gln Thr Glu Asn Pr o Lys Glu 1 535 1540
Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu 1 550 1 555
Gl n Gln Leu Glu Lys Cys Leu 1565 1 570
Glu Met Asn Val Leu Thr Glu 1580 1585
Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gl n Ser 1365
Glu Lys Ser Léu His Léu I1e Gln 1380
Lys Gln Leu Ala Ala Tyr 1le Ala 1395
Met Pro Gl n Glu Ala Gln Lys Ile 1410
Gl u Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys 1425
Ala Ala Gln Arg val Leu Ser Gln
Leu Gln Asp Val Ser Met Lys Phe 1455
Asn Phe Glu Gln Arg Leu Gln Glu 1470
Val Lys Met His Leu Pro Al a Leu 1485
Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn 1500
Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu 151 5
Gl y Arq Gln Ile Val Gln Lys Lys 1530
Leu ASp Glu Arg Val Thr Al a Leu 1545
Gl y Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys 1560
Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys 1575
Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Gl u 1590
Leu Thr 1595
Lys Arq Ser Ala Val 1600 Gl u Gly Met Pro Ser 1605 Aso Leu Asp
Ser Glu 1 610
Val Ala Trp Gly Lys 1 615 Ala Thr Gln Lys Glu 1620 Ile Glu Lys
Gl n
Lys Val 1 625 His Leu Lys Ser 1630 Ile Thr Gl u Val Gl y 1635 Gl u Al a Leu
Lys
Thr 1640 Val Leu Gly Lys Lys 1 645 Gl u Thr Leu Val Glu 1650 Asp Lys Leu
Ser Leu 1 655
Leu Asn Ser Asn Trp 1 660 I l e Ala Val Thr Ser 1665 Arg Al a Glu
Glu Trp 1 670
Leu Asn Leu Leu Leu 1675 Gl u Tyr Gl n Lys His 1680 Met Gl u Thr
Phe Asp 1 685
Gln Asn Val Asp His 1 690 I l e Thr Lys Trp Ile 1695 I le Gln Ala
Asp Thr 1700
Leu Leu Asp Glu Ser 1705 Gl u Lys Lys Lys Pro 1710 Gln Gl n Lys
Gl u
Asp 1715 Val Leu Lys Arq Leu 1 720 Lys Ala Glu Leu Asn 1725 Asp Ile Ar g
Pro
Lys 1730 Val Asp Ser Thr Arg 1735 Asp Gl n Ala Ala Asn 1740 Leu Met Ala
Asn
Arg 1745 Gl y Asp His Cys Arg 1750 Lys Leu Val Gl u Pro 1755 Gl n Ile Ser
Gl u
Leu 1760 Aso His Arg Phe Ala 1 765 Al a Ile Ser Bis Arg 1770 I le Lys Thr
Gly Lys 1775
Ala Ser I le Pro Leu 1780 Lys Glu Leu Glu Gln 1785 Phe Aso Ser
Asp
Ile 1790 Gln Lys Leu Leu Glu 1795 Pro Leu Gl u Ala Glu 1800 I le Gl n Gln
Gl y
Val Asn 1805 Leu Lys Glu Glu 1810 Asp Phe Asn Lys Asp 1815 Met Asn Glu
Asp Asn 1820
Gl u Gl y Thr Val Lys 1825 Gl u Leu Leu Gln Arg 1830 Gl y Asp Asn
Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys
1835
1840 1845
!le Lys 1850
Gln Gln Leu Leu Gln 1855 Thr Lys His Asn Ala 1860 Leu Lys Asp
Leu Arq 1865
Ser Gl n Arg Arg Lys 1870 Lys Ala Leu Glu !le 1875 Ser His Gln
Trp Tyr 1880
Gln Tyr Lys Arg Gln 1885 Ala Asp Asp Leu Leu 1890 Lys Cys Leu
Asp Asp 1895
Ile Gl u Lys Lys Leu 1900 Ala Ser Leu Pro Glu 1905 Pro Arg Asp
G1u Arq 1910
Lys Ile Lys Gl u !le 1915 Asp Arg Glu Leu G1n 1920 Lys Lys Lys
G1u Gl u 1925
Leu Aso Ala Val Arq 1930 Arg Gln Ala Glu Gly 1935 Leu Ser Glu
Asp Gly 1940
Ala Ala Met Ala Val 1945 Glu Pro Thr Gl n !le 1950 Gln Leu Ser
Lys Arq 1955
Trp Arg Glu Ile Glu 1960 Ser Lys Phe Ala Gln 1965 Phe Arg Arg
Leu Asn 1 970
Phe Ala Gln Ile His 1975 Thr Val Arg Glu Glu 1980 Thr Met Met
Val Met 1 985
Thr Glu Asp Met Pro 1990 Leu Glu Ile Ser Tyr 1995 Val Pro Ser
Thr Tyr 2000
Leu Thr Glu Ile Thr 2005 His Val Ser Gln Ala 2010 Leu Leu Glu
Val Glu 2015
Gln Leu Leu Aso Ala 2020 Pro Asp Leu Cys Ala 2025 Lys Asp Phe
Glu ASp 2030
Leu Phe Lys Gl n Glu 2035 Glu Ser Leu Lys Asn 2040 I l e Lys ASp
Ser Leu 2045
Gl n Gl n Ser Ser Gly 2050 Arq Ile Asp !le !le 2055 His Ser Lys
Lys
Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arq Val
Lys
2060 2065
Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln 2075 2080
Asn Lys Met Ty r Lys Asp Arg 2090 2095
Glu Lys Trp Arg Arg Phe His 2105 2110
Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln 2120 2 125
Glu Asn Trp Gl u His Ala Lys 21 35 2140
Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg 2150 2155
Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile 2165 21'10
Ser Ile Leu Gl n Glu Lys Leu 2180 2185
Glu Val Cys Lys Gl n Leu Ser 2 195 2200
Gln Lys Asn Il e Leu Ser Gl u 2210 2215
Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala 2225 2230
Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gl n 2240 2245
Lys Leu Leu Val Glu Gl u Leu 2255 2260
Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gl y 22'10 22'15
Ser Pro Glu Glu Gln Asp Lys 2285 2290
Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys val 2085
Gln Gl y Arg Phe Asp Arg Ser Val 2100
Tyr ASp Ile Lys Ile Phe Asn Gln 2 115
Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro 2130
Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu 2145
Gln Thr val val Arg Thr Leu Asn 2 160
Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala 2175
Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln 2 190
Asp Arg Lys Lys Ar g Leu Glu Glu 2205
Phe Gl n Arg ASp Leu Asn Glu Phe 2220
Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu 2235
Leu Lys Gl u Lys Leu Glu Gln Val 2250
Pro Leu Arq Gln Gly Ile Leu Lys 2265
Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile 2280
Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr 2295
Asn Leu Gln Trp lle Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln 2300 2305 2310
Gly Glu lle Glu Ala Gln ne Lys Asp Leu Gly Gln Léu Glu Lys 2315 2320 2325
Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Asn Bis Leu Leu Leu Trp 2330 2335 2340
Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn 2345 2350 2355
Gln Glu Gly Pro Phe Asp Val Gln Glu Thr Glu ne Ala Val Gln 2360 2365 2370
Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu Glu 1:1e Leu Ser Lys Gly Gln His 2375 2380 2385
Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr Gln Pro Val Lys Arq Lys Leu 2390 2395 2400
Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys Ala Val Asn Arg Leu Leu Gln 2405 2410 2415
Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr 2420 2425 2430
11e Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Pro 2435 2440 2445
Val Val Thr Lys Glu Thr Ala IIe Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser 2450 2455 2460
Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala 2465 2470 2475
Trp Thr Glu Leu Thr ASp Trp Leu Ser Leu Leu ASp Gln Val Ile 2480 2485 2490
Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu 2495 2500 2505
Met ne Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg 2510 2515 2520
Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu ne Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys 2525 2530 2535
Asn Lys 2540
Thr Ser Asn Gln Glu 2545 Al a Arg Thr Ile Ile 2550 Thr Asp Arg
Ile Glu 2555
Arg Ile Gln Asn Gln 2560 Trp Asp Glu Val Gln 2565 Glu His Léu
Gl n Asn 2570
Arg Arq Gl n Gln Leu 2575 Asn Gl u Met Leu Lys 2580 Asp Ser Thr
Gl n
Trp 2585 Leu Glu Ala Lys Glu 2590 Glu Ala Glu Gln Val 2595 Leu Gl y Gln
Al a
Ar g 2600 Ala Lys Leu Glu Ser 2605 Trp Lys Gl u Gly Pro 2610 Tyr Thr Val
Asp Ala 2615
¡ le Gln Lys Lys Ile 2620 Thr Glu Thr Lys Gln 262 5 Leu Al a Lys
Asp Leu 2630
Arq Gln Trp Gln Thr 2635 Asn Val Asp Val Ala 2640 Asn Asp Leu
Al a
Leu 2645 Lys Leu Leu Argo Asp 2650 Tyr Ser Al a Asp Asp 2655 Thr Arg Lys
Val
His 2660 Met r l e Thr Glu Asn 2665 I l e Asn Al a Ser Trp 2670 Arg Ser Ile
Hi s
Lys 2675 Arg Val Ser Gl u Arg 2680 Gl u Ala Ala Leu Gl u 2685 Gl u Thr His
Arg Leu 2690
Leu Gl n Gl n Phe Pro 2695 Leu Asp Leu Gl u Lys 2700 Phe Leu Al a
Trp Leu 2705
Thr Gl u Ala Glu Thr 2710 Thr Al a Asn Val Leu 2715 Gl n Asp Al a
Thr Arg 2720
Lys Glu Arg Leu Leu 2725 Glu ASp Ser Lys Gly 2730 Val Lys Glu
Leu Met 2735
Lys Gln Trp Gln Asp 2740 Leu Gln Gl y Glu Ile 274 5 Glu Al a His
Thr Asp 2750
Val Tyr His Asn Leu 2755 Asp Glu Asn Ser Gln 2760 Lys r l e Leu
Arg Ser 2765
Leu Gl u Gl y Ser Asp 2770 Asp Ala Val 44 Leu Leu 2775 Gl n Arg Arg
Leu Asp 2780
Asn Met Asn Phe Lys 2785 Trp Ser Glu Leu Arq 2790 Lys Lys Ser
Leu Aso 2795
Ile Arq Ser Ris Leu 2800 Glu Ala Ser Ser Asp 2805 Gln Trp Lys
Arq Leu 281 0
Ris Leu Ser Leu Glo 281 5 Glu Leu Leu Val Trp 2820 Le u Gln Leu
Lys Asp 2825
Asp Glu Leu Ser Arq 2830 Gln Al a Pr o l le Gl y 2835 Gl y Asp Phe
Pro Al a 2840
Val Gl n Lys Gl n Aso 2845 Asp Val Bis Arg Ala 2850 Phe L ys Arg
Gl u
Leu 2855 Lys Thr Lys Gl u Pro 2860 Val Ile Met Ser Thr 2865 Leu Gl u Thr
Val
Arq 2870 lle Phe Leu Thr Gl u 2875 Gln Pro Leu Glu Gly 2880 Leu Glu Lys
Leu
Tyr 2885 Gl n Glu Pro Arg Glu 2890 Leu Pro Pro Glu Gl u 2895 Arg Ala Gln
Aso Val 2900
Thr Arg Leu Leu Arq 2905 Lys Gln Ala Glu Gl u 2910 Val Asn Thr
Glu
Trp 2915 Gl u Lys Leu Asn Le u 292 0 Ris Ser Ala Asp Trp 2925 Gl n Arg Lys
Ile Asp 2930
Gl u Thr Leu Gl u Arq 2935 Leu Gln Glu Leu Gl o 2940 Gl u Al a Thr
Asp
Gl u 2945 Leu Asp Leu Ly s Le u 2950 Arg Gln Ala Glu Val 2955 !le Lys Gly
Ser
Trp 2960 Gl n Pro Val Gl y Asp 2965 Leu Leu Ile Asp Ser 2970 Leu Gln Asp
Ris
Leu 2975 Gl u Lys Val Ly s Ala 2980 Le u Arg Gly Glu Ile 2985 Ala Pro Leu
Lys
Gl u 2990 Asn Val Ser Hi s Val 2995 Asn Asp Leu Ala Arq 3000 Gl n Leu Thr
Thr Leu Gl y I l e Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu 45
3005 3010 3015
Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu G1n val Ala Val Glu Asp 3020 3025 3030
Arq Val Arg Gln Leu His Glu Ala Bis Arg Asp Phe Gly Pro Ala 3035 3040 3045
Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg 3050 3055 3060
Ala Ile Ser Pro Aso Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn Bis Glu Thr 3065 3070 3075
Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Glo 3080 3085 3090
Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr 3095 3100 3105
Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu 3110 3115 3120
Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys ASp Ala Leu ASp Gln His Asn Leu 3125 3130 3135
Lys Gln Aso Asp Gl o Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Aso Cys 3140 3145 3150
Leu Thr Thr Ile Tyr ASp Arq Leu Glu Gln Glu Bis Asn Asn Leu 3155 3160 3165
Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu 3170 3175 3180
Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arq Thr Gly Arg Ile Arq Val Leu Ser 3185 3190 3195
Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu Glu Asp 3200 3205 3210
Lys Tyr Arq Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe 3215 3220 3225
Cys Asp Gln Arq Arq Leu Gly Leu Leu Leu Bis Asp Ser Ile Gln 3230 3235 3240
lle Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn 3245 3250 3255
lle Glu Pro Ser Val Arq Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys 3260 3265 3270
Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu 3275 3280 3285
Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala 3290 3295 3300
Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn lle Cys Lys Glu 3305 3310 3315
Cys Pro lle rle Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn 3320 3325 3330
Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys 3335 3340 3345
Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr 3350 3355 3360
Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn 3365 3370 3375
Lys Phe Arg Thr Lys Arq Tyr Phe Ala Lys Bis Pro Arg Het Gly 3380 3385 3390
Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr 3395 3400 3405
Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala 3410 3415 3420
Ser Ser Pro Gln Leu Ser His ASp ASp Thr His Ser Arg Ile Glu 3425 3430 3435
Ris Tyr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser 3440 3445 3450
Tyr Leu Asn Asp Ser rle Ser Pro Asn Glu Ser lle Asp Asp Glu 3455 3460 3465
Ris Leu Leu rle Gln Bis Tyr Cya Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser 3470 3475 3480
Pro Leu Ser Gln Pro Arq Ser 3485 3490
Glu Ser Glu Glu Arq Gly Glu 3500 3505
Glu Glu Glu Asn Arq Asn Leu 3515 3520
Gln Gln His Glu His Lys Gly 3530 3535
Glu Met Met Pro Thr Ser Pro 3545 3550
He Ala Glu Ala Lys Leu Leu 3560 3565
Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu 3575 3580
Gln Leu His Arq Leu Arq Gln 3590 3595
Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr 3605 3610
Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln 3620 3625
Ser Gln Thr Ser Asp Ser Met 3635 3640
Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly 3650 3655
Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser 3665 3670
Pro Ala Gl.n 11e Leu 3495
Leu Glu Arq Ile Leu 3510
Gln Ala Gl.u Tyr Asp 3525
Leu Ser Pro Leu Pro 3540
Gln Ser Pro Arq Asp 3555
Arq Gln His Lys Gly 3570
Asp His Asn Lys Gln 3585
Leu Leu Glu Gln Pro 3600
Val Ser Ser Pro Ser 3615
Pro Met Leu Leu Arg 3630
Gly Glu Glu Asp Leu 3645
Leu Glu Gl.u Val Met 3660
Arg Gly Arg Asn Thr 3675
11e Ser Leu
Ala Asp Leu
Arq Leu Lys
Ser Pro Pro
Ala Glu Leu
Arq Leu Glu
Leu Glu Ser
Gln Ala Glu
Thr Ser Leu
Val Val Gly
Leu Ser Pro
Glu Gln Leu
Pro Gly Lys
Pro Met Arq Glu Asp Thr Met 3680 3685
<210> 2
<211> 153
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 2
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro 1 5
Cys ASp Phe Leu Lys Val Lys Met 20
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu 35 40
Thr Gl n Leu Phe Lys Cys Cys Phe 10 15
His Thr Met Ser Ser Ser His Leu 25 30
Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 50 55 60
Val Cys Gly Asp Arq Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arq Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115
Met
Pro Lys Thr Gln Lys 130
Ser Ala Gly Asn Lys Asn 145 150
10
<210> 3 <211 > 20 <2 12> DNA <213> Artificial
15
<220> <223> nucle6tido antisentido
20
<400> 3 cgaccugagc uuuguuguag
20
120 125
Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly 135 140 Tyr Arg Met
5
<210> 4 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 4 cgaccu9a9c uuuguuguag acuau
25
15
<210> 5 <211>23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 5 ccugagcuuu guuguagacu auc
23
25
<210> 6 <211 > 23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 6 cguugcacuu ugcaaugcug cug
23
35
<210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 7 cuguagcuuc acceuuucc
19
45
<210> 8 <211>24 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 8 gagagagcuu ccuguagcuu cace <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 24
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 9 guccuuguac auuuuguuaa cuuuuuc 27
5
<210>10 <211>20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 10 uca9cuucu9 uuagccacug
20
15
<210> 11 <211>20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 11 uucagcuucu guuagccacu
20
25
<210>12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 12 uucagcuucu guuagccacu 9
21
35
<210>13 <211>21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 13 ucagcuucug uuagccacug a
21
45
<210>14 <211>22 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 14 uucagcuucu guuagccacu ga <210>15 <211>21 <212> DNA <213> Artificial 22
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 15 ucagcuucug uuagccacug a 21
5
<210>16 <211>22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 16 uucagcuucu guuagccacu ga
22
15
<210>17 <211>22 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 17 ucagcuucug uuagccacug au
22
25
<210>18 <211>23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 18 uucagcuucu guuagccacu gau
23
35
<210>19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 19 ucagcuucug uuagccacug auu
23
45
<210> 20 <211>24 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 20 uucagcuucu guuagccacu gauu <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial 24
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 21 ucagcuucug uuagccacug auua 24
5
<210> 22 <211 > 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 22 uucagcuucu guuagccacu gaua
24
15
<210> 23 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 23 ucagcuucug uuagccacug auuaa
25
25
<210> 24 <211 > 26 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 24 uucagcuucu guuagccacu gauuaa
26
35
<210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 25 ucagcuucug uuagccacug auuaaa
26
45
<210> 26 <211>27 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 26 uucagcuucu guuagccacu gauuaaa <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial 27
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 27 cagcuucugu uagccacug 19
5
<210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 28 cagcuucugu uagccacuga u
21
15
<210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 29 agcuucuguu agccacugau u
21
25
<210> 30 <211>22 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 30 cagcuucugu uagccacuga uu
22
35
<210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 31 agcuucuguu agccacugau ua
22
45
<210> 32 <211>23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 32 cagcuucugu uagccacuga uua <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 23
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 33 agcuucuguu agccacugau uaa 23
5
<210> 34 <211>24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 34 cagcuucugu uagccacuga uuaa
24
15
<210> 35 <211>24 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 35 agcuucuguu agccacugau uaaa
24
25
<210> 36 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 36 cagcuucugu uagccacuga uuaaa
25
35
<210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 37 agcuucuguu agccacugau uaaa
24
45
<210> 38 <211>20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 38 agcuucuguu agccacugau <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial 20
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 39 gcuucuguua gccacugauu 20
5
<210> 40 <211 > 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 40 a9cuucuguu agccacugauu
21
15
<210>41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 41 gcuucuguua gccacugauu a
21
25
<210> 42 <211 > 22 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 42 agcuucuguu agccacugau ua
22
35
<210> 43 <211 > 22 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 43 gcuucuguua gccacugauu aa
22
45
<210> 44 <211>23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 44 agcuucuguu agccacugau uaa <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 23
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 45 gcuucuguua gccacugauu aaa 23
5
<210> 46 <211 > 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 46 a9cuucuguu agccacugau uaaa
24
15
<210> 47 <211>23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 47 gcuucuguua gccacugauu aaa
23
25
<210> 48 <211 > 23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 48 ccauuuguau uuagcauguu ccc
23
35
<210> 49 <211 > 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 49 agauaccauu uguauuuagc
20
45
<210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 50 gccauuucuc aacagaucu <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 19
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 51 gccauuucuc aacagaucug uca 23
5
<210> 52 <21 1> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 52 auucucagga auuugugucu uuc
23
15
<210> 53 <21 1> 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 53 ucucaggaau uugugucuuu c
21
25
<210> 54 <21 1> 18 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 54 guucagcuuc uguuagcc
18
35
<210> 55 <211 > 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 55 cugauuaaau aucuuuauau c
21
45
<210> 56 <21 1> 18 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 56 gccgccauuu cucaacag <210> 57 <21 1> 18 <212> DNA <213> Artificial 18
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 57 guauuuagca uguuccca 18
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 58 caggaauuug ugucuuuc 18
<210> 59 <211>25
<212> DNA 15 <213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 59 uuugccgcug cccaaugcca uccug 25
<210> 60
<211>25 25 <212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 60 auucaauguu cugacaacag uuugc 25
<210>61 35 <211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 61 ccaguugcau ucaauguucu gacaa 25
45 <210> 62 <211>22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 62
caguugcauu caauguucug ac 22 55
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 63 65 aguugcauuc aauguucuga 20
5
<210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 64 gauugcugaa uuauuucuuc c
21
15
<210> 65 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 65 gauugcugaa uuauuucuuc cccag
25
25
<210> 66 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 66 auugcugaau uauuucuucc ccagu
25
35
<210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 67 uugcugaauu auuucuuccc caguu
25
45
<210> 68 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 68 ugcugaauua uuucuucccc aguug <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 25
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 69 gcugaauuau uucuucccca guugc 25
5
<210> 70 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 70 cugaauuauu ucuuccccag uugca
25
15
<210> 71 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 71 ugaauuauuu cuuccccagu ugcau
25
25
<210> 72 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 72 gaauuauuuc uuccccaguu gcauu
25
35
<210> 73 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 73 aauuauuucu uccccaguug cauuc
25
45
<210> 74 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
55
<400> 74 auuauuucuu ccccaguugc auuca <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 25
<220> <223> nucleólido anlisenlido
65
<400> 75 uuauuucuuc cccaguugca uucaa 25
<210> 76 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 76 uauuucuucc ccaguugcau ucaau
25
<210> 77 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 77 auuucuuccc caguugcauu caaug
25
<210> 78 <21 1>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 78 uuucuucccc aguugcauuc aaugu
25
<210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 79 uucuucccca guugcauuca auguu
25
<210> 80 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 80 ucuuccccag uugcauucaa uguuc
25
<210>81 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 81 cuuccccagu ugcauucaau guucu
25
62
<210> 82 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 82 uuccccaguu gcauucaaug uucug
25
<210> 83 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 83 uccccaguug cauucaaugu ucuga
25
<210> 84 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 84 ccccaguugc auucaauguu cugac
25
<210> 85 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 85 cccaguugca uucaauguuc ugaca
25
<210> 86 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 86 ccaguugcau ucaauguucu gacaa
25
<210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 87 caguugcauu caauguucug acaac
25
63
<210> 88 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 88 aguugcauuc aauguucuga caaca
25
<210> 89 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 89 guugcauuca auguucugac aacag
25
<210> 90 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 90 uugcauucaa uguucugaca acagu
25
<210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 91 ugcauucaau guucugacaa caguu
25
<210> 92 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 92 gcauucaaug uucugacaac aguuu
25
<210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 93 cauucaaugu ucugacaaca guuug
25
64
<210> 94 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 94 auucaauguu cugacaacag uuugc
25
<210> 95 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 95 ucaauguucu gacaacaguu ugccg
25
<210> 96 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 96 caauguucug acaacaguuu gccgc
25
<210> 97 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 97 aauguucuga caacaguuug ccgcu
25
<210> 98 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 98 auguucugac aacaguuugc cgcug
25
<210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 99 uguucugaca acaguuugcc gcugc
25
65
<210>100 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 100 guucugacaa caguuugccg cugcc
25
<210>101 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 101 uucugacaac aguuugccgc ugccc
25
<210>102 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 102 ucugacaaca guuugccgcu gccca
25
<210>103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 103 cugacaacag uuugccgcug cccaa
25
<210>104 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 104 ugacaacagu uugccgcugc ccaau
25
<210>105 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 105 gacaacaguu ugccgcugcc caaug
25
66
<210>106 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 106 aeaacaguuu gcegcugecc aauge
25
<210>107 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nueleólido anlisenlido
<400> 107 caaeaguuug ecgcugceca augce
25
<210>108 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nueleólido anlisenlido
<400> 108 aacaguuugc egeugeceaa ugeca
25
<210>109 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nue!eólido anlisenlido
<400> 109 aeaguuugec gcugcecaau gceau
25
<210>110 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 110 caguuugccg cugcccaaug ccauc
25
<210>111 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 111 aguuugccgc ugeccaaugc cauce
25
67
<210> 112 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 112 guuugccgcu gcccaaugcc auccu
25
<210> 113 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 113 uuugccgcug cccaaugcca uccug
25
<210>114 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 114 uugccgcugc ccaaugccau ccugg
25
<210> 115 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 115 ugccgcugcc caaugccauc cugga
25
<210>116 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 116 gccgcugccc aaugccaucc uggag
25
<210>117 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 117 ccgcugccca augccauccu ggagu
25
68
<210> 118 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 118 cgcugcccaa ugccauccug gaguu
25
<210> 119 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 119 gcuuuucuuu uaguugcugc ucuuu
25
<210>120 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 120 cuuuucuuuu aguugcugcu cuuuu
25
<210>121 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 121 uuuucuuuua guugcugcuc uuuuc
25
<210>122 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 122 uuucuuuuag uugcugcucu uuucc
25
<210>123 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 123 uucuuuuagu ugcugcucuu uucca
25
69
<210>124 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 124 ucuuuuaguu gcugcucuuu uccag
25
<210>125 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 125 cuuuuaguug cugcucuuuu ccagg
25
<210>126 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 126 uuuuaguugc ugcucuuuuc caggu
25
<210> 127 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 127 uuuaguugcu gcucuuuucc agguu
25
<210> 128 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 128 uuaguugcug cucuuuucca gguuc
25
<210> 129 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 129 uaguugcugc ucuuuuccag guuca
25
70
<210>130 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 130 aguugcugcu cuuuuccagg uucaa
<210>131 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 131 guugcugcuc uuuuccaggu ucaag
<210>132 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 132 uugcugcucu uuuccagguu caagu
<210>133
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 133 ugcugcucuu uuccagguuc aagug
<210>134 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 134 gcugcucuuu uccagguuca agugg
<210>135
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 135 cugcucuuuu ccagguucaa guggg
25
<210>136 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 136 ugcucuuuuc cagguucaag uggga
<210>137 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 137 gcucuuuucc agguucaagu gggac
<210>138 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 138 cucuuuucca gguucaagug ggaua
<210>139
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 139 ucuuuuccag guucaagugg gauac
<210>140 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 140 cuuuuccagg uucaaguggg auacu
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 141 uuuuccaggu ucaaguggga uacua
25
<210>142 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 142 uuuccagguu caagugggau acuag
25
<210>143 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 143 uuccagguuc aagugggaua cuagc
25
<210>144 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 144 uccagguuca agugggauac uagca
25
<210>145 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 145 ccagguucaa gugggauacu agcaa
25
<210>146 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 146 cagguucaag ugggauacua gcaau
25
<210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 147 agguucaagu gggauacuag caaug
25
73
<210>148 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 148 gguucaagug ggauacuagc aaugu
25
<210>149 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 149 guucaagugg gauacuagca auguu
25
<210>150 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 150 uucaaguggg auacuagcaa uguua
25
<210>151 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 151 ucaaguggga uacuagcaau guuau
25
<210>152 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 152 caagugggau acuagcaaug uuauc
25
<210>153 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 153 aagugggaua cuagcaaugu uaucu
25
74
<210>154 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 154 agugggauac uagcaauguu aucug
25
<210>155 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 155 gugggauacu agcaauguua ucugc
25
<210>156 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 156 ugggauacua gcaauguuau cugcu
25
<210>157 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 157 gggauacuag caauguuauc ugcuu
25
<210>158 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 158 ggauacuagc aauguuaucu gcuuc
25
<210>159 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 159 gauacuagca auguuaucug cuucc
25
75
<210>160 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 160 auacuagcaa uguuaucugc uuccu
25
<210>161 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 161 uacuagcaau guuaucugcu uccuc
25
<210>162 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 162 acuagcaaug uuaucugcuu ccucc
25
<210>163 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 163 cuagcaaugu uaucugcuuc cucca
25
<210>164 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 164 uagcaauguu aucugcuucc uccaa
25
<210>165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 165 agcaauguua ucugcuuccu ccaac
25
76
<210>166 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 166 gcaauguuau cugcuuccuc caacc
<210>167 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 167 caauguuauc ugcuuccucc aacca
<210>168 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 16B aauguuaucu gcuuccucca accau
<210>169
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 169 auguuaucug cuuccuccaa ccaua
<210>170 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 170 uguuaucugc uuccuccaac cauaa
<210>171
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 171 guuaucugcu uccuccaacc auaaa
25
<210>172
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 172 gcugcucuuu uccagguuc
<210>173 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 173 ucuuuuccag guucaagugg
<210>174
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 174 agguucaagu gggauacua
<210>175
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 175 cucagcucuu gaaguaaacg
<210>176 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 176 ccucagcucu ugaaguaaac
<210>177 <211>21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 177 ccucagcucu ugaaguaaac 9
<210>178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 178 auagugguca guccaggagc u
21
<210>179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 179 caguccagga gcuaggucag 9
21
<210>180 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 180 uaguggucag uccaggagcu agguc
25
<210>181 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 181 agagcaggua ccuccaacau caagg
25
<210>182 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 182 gagcagguac cuccaacauc aagga
25
<210>183 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 183 agcagguacc uccaacauca aggaa
25
79
<210>184 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 184 gcagguaccu ccaacaucaa ggaag
25
<210>185 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 185 cagguaccuc caacaucaag gaaga
25
<210>186 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 186 agguaccucc aacaucaagg aagau
25
<210>187 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 187 gguaccucca acaucaagga agaug
25
<210>188 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 188 guaccuccaa caucaaggaa gaugg
25
<210>189 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 189 uaccuccaac aucaaggaag auggc
25
80
<210>190 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 190 accuccaaca ucaaggaaga uggca 25
<210>191 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 191 ccuccaacau caaggaagau ggcau 25
<210>192 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 192 cuccaacauc aaggaagaug gcauu 25
<210>193
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 193 cuccaacauc aaggaagaug gcauuucuag 30
<210>194 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 194 uccaacauca aggaagaugg cauuu 25
<210>195
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 195 ccaacaucaa ggaagauggc auuuc 25
<210>196 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 196 caacaucaag gaagauggca uuucu 25
<210>197 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 197 aacaucaagg aagauggcau uucua 25
<210>198 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 198 acaucaagga agauggcauu ucuag 25
<210>199
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 199 acaucaagga agauggcauu ucuaguuugg 30
<210> 200 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 200 acaucaagga agauggcauu ucuag 25
<210> 201
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 201 caucaaggaa gauggcauuu cuagu 25
<210> 202 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 202 aucaaggaag auggcauuuc uaguu
25
<210> 203 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 203 ucaaggaaga uggcauuucu aguuu
25
<210> 204 <211>20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 204 ucaaggaaga uggcauuucu
20
<210> 205 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 205 caaggaagau ggcauuucua guuug
25
<210> 206 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 206 aaggaagaug gcauuucuag uuugg
25
<210> 207 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 207 aggaagaugg cauuucuagu uugga
25
83
<210> 208 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 208 ggaagauggc auuucuaguu uggag
25
<210> 209 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 209 gaagauggca uuucuaguuu ggaga
25
<210> 210 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 210 aagauggcau uucuaguuug gagau
25
<210> 211 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 211 agauggcauu ucuaguuugg agaug
25
<210> 212 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 212 gauggcauuu cuaguuugga gaugg
25
<210> 213 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 213 auggcauuuc uaguuuggag auggc
25
84
<210> 214 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 214 uggcauuucu aguuuggaga uggca
25
<210> 215 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 215 ggcauuucua guuuggagau ggcag
25
<210> 216 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 216 gcauuucuag uuuggagaug gcagu
25
<210> 217 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 217 cauuucuagu uuggagaugg caguu
25
<210> 218 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 218 auuucuaguu uggagauggc aguuu
25
<210> 219 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 219 uuucuaguuu ggagauggca guuuc
25
85
<210> 220 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 220 uucuaguuug gagauggcag uuucc
25
<210> 221 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 221 ccucuugauu gcuggucuug uuuuu
25
<210> 222 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 222 cucuugauug cuggucuugu uuuuc
25
<210> 223 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 223 ucuugauugc uggucuuguu uuuca
25
<210> 224 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 224 cuugauugcu ggucuuguuu uucaa
25
<210> 225 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 225 uugauugcug gucuuguuuu ucaaa
25
86
<210> 226 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 226 ugauugcugg ucuuguuuuu caaau
25
<210> 227 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 227 gauugcuggu cuuguuuuuc aaauu
25
<210> 228 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 228 auugcugguc uuguuuuuca aauuu
25
<210> 229 <211 > 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 229 uugcuggucu uguuuuucaa auuuu
25
<210> 230 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 230 ugcuggucuu guuuuucaaa uuuug
25
<210> 231 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 231 gcuggucuug uuuuucaaau uuugg
25
87
<210> 232 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 232 cuggucuugu uuuucaaauu uuggg
<210> 233 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 233 uggucuuguu uuucaaauuu ugggc
<210> 234 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 234 ggucuuguuu uucaaauuuu gggca
<210> 235
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 235 gucuuguuuu ucaaauuuug ggcag
<210> 236 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 236 ucuuguuuuu caaauuuugg gcagc
<210> 237
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 237 cuuguuuuuc aaauuuuggg cagcg
25
<210> 238 <21 1>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 238 uuguuuuuca aauuuugggc agcgg
<210> 239 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 239 uguuuuucaa auuuugggca gcggu
<210> 240 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 240 guuuuucaaa uuuugggcag cggua
<210> 241
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 241 uuuuucaaau uuugggcagc gguaa
<210> 242 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 242 uuuucaaauu uugggcagcg guaau
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 243 uuucaaauuu ugggcagcgg uaaug
25
<210> 244 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 244 uucaaauuuu gggcagcggu aauga
25
<210> 245 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 245 ucaaauuuug ggcagcggua augag
25
<210> 246 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 246 caaauuuugg gcagcgguaa ugagu
25
<210> 247 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 247 aaauuuuggg cagcgguaau gaguu
25
<210> 248 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 248 aauuuugggc agcgguaaug aguuc
25
<210> 249 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 249 auuuugggca gcgguaauga guucu
25
90
<210> 250
<211 > 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 250 ccauuguguu gaauccuuua acauu 25
<210> 251 <211>22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 251 ccauuguguu gaauccuuua ac 22
<210> 252
<211 > 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 252 auuguguuga auccuuuaac 20
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 253 ccuguccuaa gaccugcuca 20
<210> 254 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 254 cuuuuggauu gcaucuacug uauag 25
<210> 255
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 255 cauucaacug uugccuccgg uucug 25
<210> 256
<211 > 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 256 cuguugccuc cgguucugaa ggug 24
<210> 257 <211>31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 257 cauucaacug uugceuccgg uucugaaggu 9 31
<210> 258
<211 > 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 258 cugaaggugu ucuuguacuu cauce 25
<210> 259
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 259 uguauaggga cccuceuuce augacuc 27
<210> 260 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 260 aucccacuga uucugaauuc 20
<210> 261
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 261 uuggcucugg ccuguccuaa ga 22
<210> 262 <211 > 35 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 262 aagaccugcu cagcuucuuc cuuagcuucc agcca
35
<210> 263 <211>20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 263 ggagagagcu uccuguagcu
20
<210> 264 <211 > 23 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 264 ucacccuuuc cacaggcguu gca
23
<210> 265 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 265 ugcacuuugc aaugcugcug ucuucuugcu au
32
<210> 266 <211>35 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 266 ucauaaugaa aacgccgcca uuucucaaca gaucu
35
<210> 267 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 267 uuugugucuu ucugagaaac
20
93
<210> 268
<211 > 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 268 uuuagcaugu ucccaauucu caggaauuug 30
<210> 269 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 269 uccuguagaa uacuggcauc 20
<210> 270
<211 > 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 270 ugcagaccuc cugccaccgc agauuca 27
<210> 271
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 271 uugcagaccu ccugccaccg cagauucagg cuuc 34
<210> 272 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 272 uguuuuugag gauugcugaa 20
<210> 273
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 273 uguucugaca acaguuugcc gcugcccaau gccauccugg 40
<210> 274
<211 > 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 274 cucuuuucca gguucaagug ggauacuagc
<210> 275 <211>31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 275 caagcuuuuc uuuuaguugc ugcucuuuuc e
<210> 276
<211 > 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 276 uauucuuuug uucuucuagc cuggagaaag
<210> 277
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 277 cugcuuccuc caaccauaaa acaaauuc
<210> 278 <211>29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 278 ccacucagag cucagaucuu cuaacuucc
<210> 279
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 279 cuuccacuca gagcucagau cuucuaa
<210> 280 <211>30 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 280 caguccagga gcuaggucag gcugcuuugc
30
<210> 281 <211>37 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 281 ucuugaagua aacgguuuac cgccuuccac ucagagc
37
<210> 282 <211>30 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 282 uccaacuggg gacgccucug uuccaaaucc
30
<210> 283 <211>21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 283 acuggggacg ccucuguucc a
21
<210> 284 <211>20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 284 ccguaaugau uguucuagcc
20
<210> 285 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 285 uuuugggcag cgguaaugag uucuu
25
96
<210> 286 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 286 uuugggcagc gguaaugagu ucuuc
25
<210> 287 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 287 uugggcagcg guaaugaguu cuucc
25
<210> 288 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 288 ugggcagcgg uaaugaguuc uucca
25
<210> 289 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 289 gggcagcggu aaugaguucu uccaa
25
<210> 290 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 290 ggcagcggua augaguucuu ccaac
25
<210> 291 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 291 gcagcgguaa ugaguucuuc caacu
25
97
<210> 292 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 292 cagcgguaau gaguucuucc aacug
<210> 293 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 293 agcgguaaug aguucuucca acugg
<210> 294 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 294 gcgguaauga guucuuccaa cuggg
<210> 295
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 295 cgguaaugag uucuuccaac ugggg
<210> 296 <211>25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 296 gguaaugagu ucuuccaacu gggga
<210> 297
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleólido anlisenlido
<400> 297 guaaugaguu cuuccaacug gggac
25
<210> 298 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 298 uaaugaguuc uuccaacugg ggacg
25
<210> 299 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 299 aaugaguucu uccaacuggg gacgc
25
<210> 300 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 300 augaguucuu ccaacugggg acgcc
25
<210> 301 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 301 ugaguucuuc caacugggga cgccu
25
<210> 302 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 302 gaguucuucc aacuggggac gccuc
25
<210> 303 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 303 aguucuucca acuggggacg ccucu
25
99
<210> 304 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 304 guucuuccaa cuggggacgc cucug
25
<210> 305 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 305 uucuuccaac uggggacgcc ucugu
25
<210> 306 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 306 ucuuccaacu ggggacgccu cuguu
25
<210> 307 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <:223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 307 cuuccaacug gggacgccuc uguuc
25
<210> 308 <211>25 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nuc!eólido anlisenlido
<400> 308 uuccaacugg ggacgccucu guucc
25
<210> 309 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> nucleólido anlisenlido
<400> 309 gauugcuggu cuuguuuuuc
20
100
<210> 310 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nuc!eótido antisentido
<400> 310 ccucuugauu gcuggucuug
<210> 311 <211>22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleótido antisentido
<400> 311 gguaaugagu ucuuccaacu gg
<210> 312 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleótido antisentido
<400> 312 acuggggacg ccucuguucc
<210> 313
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> PRO 51
<400> 313 ucaaggaaga uggcauuucu
<210> 314 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PS 49
<400> 314 ggccaaaccu cggcuuaccu
<210> 315
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> producto RT-PCR
<400> 315 gccagtgaag ctcctactca
<210> 316 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> produclo RT-PCR
<400> 316 gccaglgaag gcaacaalgc
<210> 317 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> produCIO RT-PCR
<400> 317 glggalaaag ctcclaclca
<210> 318
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> produCIO RT-PCR
<400> 318 glggalaaag gcaacaalg
<210> 319
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <:223> produclo RT-PCR
<400> 319 Igacgllaag clcclaclca
<210> 320 <211>20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> produclo RT-PCR
<400> 320 Igacgltaag gcaacaalgc
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> produclo RT-PCR
<400> 321 gaagcagaag IIgaaagaal
,.
<210> 322
<211>20
<212> DNA
<213> Artificial
5
<220>
<223> produclo RT-PCR
<400> 322
10
allggagcclllgaaagaal 20

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Combinación de: -un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 44 de pre-mRNA de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEO ID NO:10 o -un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 45 de pre-mRNA de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEQ ID NO:60 y -un compuesto complementario para mejorar la función de fibra muscular, integridad y/o supervivencia de fibra muscular donde dicho compuesto complementa rio comprende una xantina, dicha combinación estando destinada para el uso como un medicamento, para el alivio de uno o más síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en dicho individuo.
  2. 2.
    Combinación para el uso según la reivindicación 1, donde la ausencia de dicho exón de mRNA producida a partir de pre-mRNA de distrofina genera una región codificante para una proteína distrofina funcional.
  3. 3.
    Combinación para uso según la reivindicación 1 o 2, donde dicho oligonucleótido comprende RNA.
  4. 4.
    Combinación para uso según la reivindicación 3, donde dicho RNA contiene una ribosa (RNA) modificada por 2'-O-metilo.
  5. 5.
    Combinación para uso según la reivindicación 3 o 4, donde dicho oligonucleótido es un oligortibonucleótido de 2'-Q-metil fosforotioato .
  6. 6.
    Combinación para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho oligonucleótido es un ácido nucleico peplídico, ácido nucleico bloqueado yJo fosforodiamidato de morfolino, o una combinación de los mismos.
  7. 7.
    Combinación para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la xantina es una metilxantina.
  8. 8.
    Combinación para uso según la reivindicación 7. donde la melilxantina es un derivado de metilxantina elegido del grupo que consiste en pentoxifilina, furafilina, isofilina, propentofilina, pentifilina, teofilina, torbafilina, albifilina, enprofilina y derivados de la misma, preferiblemente donde la metilxantina es pentoxifilina.
  9. 9.
    Producto farmacéutico que comprende: -una combinación tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; y -un portador farmacéutica mente aceptable, adyuvante, diluyente yfo excipiente.
ES13160310.2T 2007-10-26 2008-10-27 Medios y métodos para contrarrestar los trastornos musculares Active ES2639852T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67007P 2007-10-26 2007-10-26
US670P 2007-10-26
EP07119351 2007-10-26
EP07119351 2007-10-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2639852T3 true ES2639852T3 (es) 2017-10-30

Family

ID=39045623

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13160310.2T Active ES2639852T3 (es) 2007-10-26 2008-10-27 Medios y métodos para contrarrestar los trastornos musculares
ES08842559.0T Active ES2564563T3 (es) 2007-10-26 2008-10-27 Medios y métodos para contrarrestar trastornos del músculo
ES17171389T Active ES2914775T3 (es) 2007-10-26 2008-10-27 Medios y métodos para contrarresta trastornos del músculo
ES18180952T Active ES2936464T3 (es) 2007-10-26 2009-03-11 Métodos y medios para el salto eficaz de al menos el exón 52 del gen de distrofia muscular de Duchenne humana
ES09788170.0T Active ES2692886T3 (es) 2007-10-26 2009-03-11 Métodos y medios para el salto eficaz de al menos uno de los siguientes exones del gen de distrofia muscular de Duchenne humana: 43, 46, 50-53

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08842559.0T Active ES2564563T3 (es) 2007-10-26 2008-10-27 Medios y métodos para contrarrestar trastornos del músculo
ES17171389T Active ES2914775T3 (es) 2007-10-26 2008-10-27 Medios y métodos para contrarresta trastornos del músculo
ES18180952T Active ES2936464T3 (es) 2007-10-26 2009-03-11 Métodos y medios para el salto eficaz de al menos el exón 52 del gen de distrofia muscular de Duchenne humana
ES09788170.0T Active ES2692886T3 (es) 2007-10-26 2009-03-11 Métodos y medios para el salto eficaz de al menos uno de los siguientes exones del gen de distrofia muscular de Duchenne humana: 43, 46, 50-53

Country Status (17)

Country Link
US (18) US9243245B2 (es)
EP (4) EP2614827B1 (es)
JP (6) JP5600064B2 (es)
CN (5) CN105641700B (es)
AU (1) AU2008317566B2 (es)
CA (1) CA2704049A1 (es)
CY (2) CY1117286T1 (es)
DK (1) DK2203173T3 (es)
ES (5) ES2639852T3 (es)
HK (2) HK1185098A1 (es)
HR (1) HRP20160025T1 (es)
HU (2) HUE028662T2 (es)
IL (4) IL205322A (es)
NZ (2) NZ584793A (es)
PL (1) PL2203173T3 (es)
PT (1) PT2203173E (es)
WO (1) WO2009054725A2 (es)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1191097A1 (en) * 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
AU2003225410A1 (en) 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
SI2910551T1 (sl) 2003-04-11 2017-07-31 Ptc Therapeutics, Inc. Spojine 1,2,4-oksadiazol benzojske kisline in njihova uporaba za zatiranje nesmiselne ter zdravljenje bolezni
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
ES2361325T3 (es) 2004-06-28 2011-06-16 The University Of Western Australia Oligonucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y métodos de uso de los mismos.
AU2006213686A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Avi Bio Pharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
WO2008018795A1 (en) 2006-08-11 2008-02-14 Prosensa Technologies B.V. Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
NZ584793A (en) 2007-10-26 2012-05-25 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
EP2119783A1 (en) * 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
US8084601B2 (en) 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
EP4174178A1 (en) 2008-10-24 2023-05-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
ES2562658T3 (es) 2008-10-27 2016-03-07 Biomarin Technologies B.V. Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
JP2012524540A (ja) 2009-04-24 2012-10-18 プロセンサ テクノロジーズ ビー．ブイ． Ｄｍｄを処置するためのイノシンを含むオリゴヌクレオチド
US20120270930A1 (en) 2009-10-29 2012-10-25 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Methods and compositions for dysferlin exon-skipping
EP3431603A1 (en) 2009-11-12 2019-01-23 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
CA2807187C (en) * 2010-08-05 2019-06-11 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Antisense oligonucleotide directed removal of proteolytic cleavage sites from proteins.
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
CA2826836A1 (en) * 2011-02-08 2012-08-16 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Antisense oligonucleotides
CA2831827A1 (en) 2011-04-05 2012-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Compounds and methods for altering activin receptor-like kinase signalling
JP5850519B2 (ja) * 2011-05-09 2016-02-03 ネッパジーン株式会社 モルフォリノ搭載バブルリポソームを有効成分としてなる筋ジストロフィー治療薬
US9765398B2 (en) 2011-07-28 2017-09-19 The Regents Of The University Of California Exonic splicing enhancers and exonic splicing silencers
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
KR102071729B1 (ko) 2011-12-28 2020-01-31 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 안티센스 핵산
EP2806900B1 (en) * 2012-01-27 2021-12-15 BioMarin Technologies B.V. Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy
DE102012103041A1 (de) 2012-04-10 2013-10-10 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Behandlung der dilativen Kardiomyopathie mittels Antisense-Oligonucleotiden
EP3597741A1 (en) 2012-04-27 2020-01-22 Duke University Genetic correction of mutated genes
CN104603271B (zh) * 2012-07-03 2019-07-19 马林生物科技有限公司 用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸
ES2714290T3 (es) * 2013-03-14 2019-05-28 Sarepta Therapeutics Inc Composiciones de salto de exón para el tratamiento de la distrofia muscular
IL280443B (en) 2013-03-14 2022-07-01 Sarepta Therapeutics Inc Preparations that skip axon for the treatment of muscular dystrophy
EA201591792A1 (ru) 2013-03-15 2016-02-29 Сарепта Терапьютикс, Инк. Улучшенные композиции для лечения мышечной дистрофии
US9849066B2 (en) 2013-04-24 2017-12-26 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
KR20230136697A (ko) * 2013-06-05 2023-09-26 듀크 유니버시티 Rna-가이드 유전자 편집 및 유전자 조절
JP6946001B2 (ja) 2014-03-06 2021-10-06 ピーティーシー セラピューティクス， インコーポレイテッド 薬学的組成物、および１，２，４−オキサジアゾール安息香酸の塩
BR112016020618B1 (pt) * 2014-03-12 2023-04-04 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Oligômero antissentido, composição farmacêutica, e, uso de um oligômero antissentido
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
CA2951221A1 (en) * 2014-06-17 2015-12-23 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids
CA2959130A1 (en) * 2014-08-11 2016-02-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Prevention of muscular dystrophy by crispr/cas9-mediated gene editing
AU2015327836B2 (en) 2014-10-03 2021-07-01 Cold Spring Harbor Laboratory Targeted augmentation of nuclear gene output
JP6929791B2 (ja) 2015-02-09 2021-09-01 デューク ユニバーシティ エピゲノム編集のための組成物および方法
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
KR20180012255A (ko) * 2015-05-21 2018-02-05 프로큐알 테라퓨틱스 Ⅱ 비.브이. 이영양성 수포성 표피박리증 치료를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드
ES2764460T3 (es) * 2015-06-10 2020-06-03 Association Inst De Myologie Terapia combinada para la distrofia muscular de Duchenne
EP3325018A4 (en) 2015-07-22 2019-04-24 Duke University HIGH EFFICIENCY SCREENING OF REGULATORY ELEMENT FUNCTION USING EPIGENOUS EDITING TECHNOLOGIES
ES2929110T3 (es) 2015-08-25 2022-11-24 Univ Duke Composiciones y métodos para mejorar la especificidad en ingeniería genética usando endonucleasas guiadas por ARN
PT3351633T (pt) 2015-09-15 2020-07-29 Nippon Shinyaku Co Ltd Ácido nucleico antissentido
BR112018007066A2 (pt) 2015-10-09 2018-10-23 Sarepta Therapeutics Inc composições e métodos para tratamento da distrofia muscular de duchene e distúrbios relacionados
MA46427A (fr) * 2015-10-09 2018-08-15 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
KR20220105174A (ko) 2015-10-09 2022-07-26 유니버시티 오브 사우스앰톤 유전자 발현의 조절 및 탈조절된 단백질 발현의 스크리닝
US11970710B2 (en) 2015-10-13 2024-04-30 Duke University Genome engineering with Type I CRISPR systems in eukaryotic cells
BR112018008838A8 (pt) 2015-10-30 2019-02-26 Ptc Therapeutics Inc método para tratar, prevenir, melhorar ou administrar uma doença epiléptica
EP3933041B1 (en) 2015-12-14 2024-01-31 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant retardation
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
GB2574525B (en) * 2015-12-21 2020-09-02 Sutura Therapeutics Ltd Improved drug delivery by conjugating oligonucleotides to stitched/stapled peptides
GB2545898B (en) * 2015-12-21 2019-10-09 Sutura Therapeutics Ltd Improved drug delivery by conjugating oligonucleotides to stitched/stapled peptides
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
CN109121395B (zh) 2016-04-15 2022-08-09 全国儿童医院研究所 腺相关病毒载体递送β-肌聚糖和微RNA-29以及肌营养不良症的治疗
MA45290A (fr) * 2016-05-04 2019-03-13 Wave Life Sciences Ltd Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs
CA3025575A1 (en) * 2016-06-30 2018-01-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomers for muscular dystrophy
CN110636866A (zh) 2016-12-19 2019-12-31 萨勒普塔医疗公司 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物
JP7125940B2 (ja) 2016-12-19 2022-08-25 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
BR112019012647A2 (pt) 2016-12-19 2019-11-19 Sarepta Therapeutics Inc conjugados de oligômero de salto de éxon para distrofia muscular
SG11201906200WA (en) 2017-01-06 2019-08-27 Avidity Biosciences Llc Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
RS64299B1 (sr) * 2017-03-17 2023-07-31 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Isporuka adeno asociranog virusnog vektora mikrodistrofina specifičnog za mišiće za lečenje mišićne distrofije
CA3059321A1 (en) * 2017-04-20 2018-10-25 Synthena Ag Modified oligomeric compounds comprising tricyclo-dna nucleosides and uses thereof
GB201711809D0 (en) * 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EP3689863A1 (en) 2017-08-04 2020-08-05 Skyhawk Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating splicing
CN111278991B (zh) 2017-08-25 2022-04-01 斯托克制药公司 用于治疗病况和疾病的反义寡聚体
US20200282074A1 (en) * 2017-09-22 2020-09-10 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
US20210145852A1 (en) 2017-09-28 2021-05-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Combination Therapies for Treating Muscular Dystrophy
JP2020536060A (ja) 2017-09-28 2020-12-10 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーを処置するための併用療法
EP3687519A1 (en) 2017-09-28 2020-08-05 Sarepta Therapeutics, Inc. Combination therapies for treating muscular dystrophy
KR102443358B1 (ko) 2017-12-06 2022-09-14 어비디티 바이오사이언시스 인크. 근위축증 및 근긴장성 이영양증을 치료하는 조성물 및 방법
EP3755352A4 (en) * 2018-02-20 2021-12-22 Edgewise Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF MOTION DISEASES
KR20210005057A (ko) * 2018-04-12 2021-01-13 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 이용 방법
US10765760B2 (en) 2018-05-29 2020-09-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
TW202020153A (zh) * 2018-07-27 2020-06-01 美商薩羅塔治療公司 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物
AU2019316103A1 (en) 2018-08-02 2021-03-11 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3108282A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CN109486813B (zh) * 2018-10-10 2022-01-18 广州医科大学附属第二医院 一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用
AU2019392928A1 (en) * 2018-12-06 2021-06-17 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
WO2020163405A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 Skyhawk Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating splicing
KR20210135507A (ko) 2019-02-06 2021-11-15 스카이호크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 스플라이싱을 조절하는 방법 및 조성물
WO2020210432A1 (en) * 2019-04-10 2020-10-15 Ptc Therapeutics, Inc. Method for treating nonsense mutation mediated duchenne muscular dystrophy in pediatric patients
CN110288555B (zh) * 2019-07-02 2022-08-02 桂林电子科技大学 一种基于改进的胶囊网络的低照度增强方法
US20220282247A1 (en) * 2019-08-02 2022-09-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Exon 44-targeted nucleic acids and recombinant adeno-associated virus comprising said nucleic acids for treatment of dystrophin-based myopathies
JP2022549611A (ja) * 2019-09-19 2022-11-28 アルネー サイエンシズ、エルエルシー 遺伝子スプライシングを調節するために有用な化合物および方法
KR20220145865A (ko) 2020-02-28 2022-10-31 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 엑손 51의 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산
IL310900A (en) 2020-03-19 2024-04-01 Avidity Biosciences Inc Preparations and methods for the treatment of facial, back and arm muscle atrophy
CA3173647A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Isabel AZNAREZ Opa1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
EP4314016A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Entrada Therapeutics, Inc. Cyclic cell penetrating peptides
KR20240012425A (ko) 2021-05-10 2024-01-29 엔트라다 테라퓨틱스, 인크. 세포내 치료제를 위한 조성물 및 방법
EP4088722A1 (en) * 2021-05-12 2022-11-16 Justus-Liebig-Universität Gießen Pharmaceutical compositions, uses thereof and methods for treatment of genetic diseases caused by intronic splice-acceptor site mutations
KR20240038967A (ko) 2021-06-23 2024-03-26 엔트라다 테라퓨틱스, 인크. Cug 반복을 표적화하기 위한 안티센스 화합물 및 방법
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
EP4367247A2 (en) * 2021-07-09 2024-05-15 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
KR20240055874A (ko) 2021-09-16 2024-04-29 어비디티 바이오사이언시스 인크. 안면견갑상완 근이영양증을 치료하는 조성물 및 방법
EP4215614A1 (en) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Combination therapy for dystrophin-related diseases
WO2023168427A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Yale University Compositions and methods for delivering therapeutic polynucleotides for exon skipping
WO2024069229A2 (en) 2022-08-03 2024-04-04 Sutura Therapeutics Ltd Biologically active compounds

Family Cites Families (220)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2752581C2 (de) 1977-11-25 1979-12-13 Wolfgang 4044 Kaarst Keil Vorrichtung zur Vollentsalzung von Wasser
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
DE3834636A1 (de) 1988-10-11 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen
US5766847A (en) 1988-10-11 1998-06-16 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
WO1993001286A2 (en) 1991-06-28 1993-01-21 Massachusetts Institute Of Technology Localized oligonucleotide therapy
CA2082411A1 (en) 1991-06-28 1992-12-29 Robert D. Rosenberg Localized oligonucleotide therapy
US6200747B1 (en) 1992-01-28 2001-03-13 North Shore University Hospital Research Corp. Method and kits for detection of fragile X specific, GC-rich DNA sequences
US5869252A (en) 1992-03-31 1999-02-09 Abbott Laboratories Method of multiplex ligase chain reaction
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5418139A (en) 1993-02-10 1995-05-23 University Of Iowa Research Foundation Method for screening for cardiomyopathy
CA2116280A1 (en) 1993-03-05 1994-09-06 Marcy E. Macdonald Huntingtin dna, protein and uses thereof
EP1897942A1 (en) 1993-05-11 2008-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Antisense oligonucleotides which combat aberrant splicing and methods of using the same
US5695933A (en) 1993-05-28 1997-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Direct detection of expanded nucleotide repeats in the human genome
US5741645A (en) 1993-06-29 1998-04-21 Regents Of The University Of Minnesota Gene sequence for spinocerebellar ataxia type 1 and method for diagnosis
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5627263A (en) 1993-11-24 1997-05-06 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
DE4342605A1 (de) 1993-12-14 1995-06-22 Buna Gmbh Funktionalisierte Olefinhomo- und -copolymere
US5962332A (en) 1994-03-17 1999-10-05 University Of Massachusetts Detection of trinucleotide repeats by in situ hybridization
AU2360195A (en) 1994-05-05 1995-11-29 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide repeat arrays
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US5854223A (en) 1995-10-06 1998-12-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York S-DC28 as an antirestenosis agent after balloon injury
US20070173465A9 (en) 1995-10-11 2007-07-26 Monahan Sean D Expression of zeta negative and zeta positive nucleic acids using a dystrophin gene
US7034009B2 (en) 1995-10-26 2006-04-25 Sirna Therapeutics, Inc. Enzymatic nucleic acid-mediated treatment of ocular diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R)
US6300060B1 (en) 1995-11-09 2001-10-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for predicting the risk of prostate cancer morbidity and mortality
JP4293636B2 (ja) 1996-02-14 2009-07-08 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 糖修飾ギャップ付オリゴヌクレオチド
US6251589B1 (en) 1996-07-18 2001-06-26 Srl, Inc. Method for diagnosing spinocerebellar ataxia type 2 and primers therefor
EP0878543A1 (en) 1996-10-30 1998-11-18 Srl, Inc. cDNA FRAGMENTS OF GENE CAUSATIVE OF SPINOCEREBELLAR ATAXIA TYPE 2
US5853995A (en) 1997-01-07 1998-12-29 Research Development Foundation Large scale genotyping of diseases and a diagnostic test for spinocerebellar ataxia type 6
US20020137890A1 (en) 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU6591798A (en) 1997-03-31 1998-10-22 Yale University Nucleic acid catalysts
AU7265298A (en) 1997-04-29 1998-11-24 Trustees Of Boston University Methods and compositions for targeted dna differential display
US6329501B1 (en) 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
US6280938B1 (en) 1997-08-19 2001-08-28 Regents Of The University Of Minnesota SCA7 gene and method of use
US6514755B1 (en) 1998-08-18 2003-02-04 Regents Of The University Of Minnesota SCA7 gene and methods of use
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
EP1030913A2 (en) 1997-09-22 2000-08-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Nucleic acid catalysts with endonuclease activity
US6130207A (en) 1997-11-05 2000-10-10 South Alabama Medical Science Foundation Cell-specific molecule and method for importing DNA into a nucleus
JP3012923B2 (ja) 1998-01-26 2000-02-28 新潟大学長 Ｃａｇリピート病の治療薬
KR100280219B1 (ko) 1998-02-26 2001-04-02 이수빈 삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약
US6322978B1 (en) 1998-04-20 2001-11-27 Joslin Diabetes Center, Inc. Repeat polymorphism in the frataxin gene and uses therefore
CA2330574A1 (en) 1998-04-29 1999-11-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into ribozymes
ATE274923T1 (de) 1998-06-10 2004-09-15 Biognostik Ges Stimulierung des immunsystems
US20030096955A1 (en) 1998-09-01 2003-05-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2000018895A1 (en) 1998-09-25 2000-04-06 The Children's Medical Center Corporation Short peptides which selectively modulate the activity of protein kinases
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6172216B1 (en) 1998-10-07 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL-X expression
CA2347905C (en) * 1998-10-26 2009-12-15 Avi Biopharma, Inc. P53 antisense agent and method
US6399575B1 (en) 1998-11-10 2002-06-04 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to the central nervous system
US6133031A (en) 1999-08-19 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of focal adhesion kinase expression
US20040226056A1 (en) 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
US20020049173A1 (en) 1999-03-26 2002-04-25 Bennett C. Frank Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6379698B1 (en) 1999-04-06 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Fusogenic lipids and vesicles
AU777499B2 (en) 1999-04-08 2004-10-21 Gen-Probe Incorporated Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
US20030236214A1 (en) 1999-06-09 2003-12-25 Wolff Jon A. Charge reversal of polyion complexes and treatment of peripheral occlusive disease
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
AU5625500A (en) 1999-06-18 2001-01-09 Emory University Huntington disease cellular model: stably transfected pc12 cells expressing mutant huntingtin
EP1212416A2 (en) 1999-08-31 2002-06-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based modulators of gene expression
EP1218544B1 (en) 1999-10-04 2009-06-03 The University of Medicine and Dentistry of New Jersey TAR RNA binding peptides
US6165786A (en) 1999-11-03 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of nucleolin expression
AU3497701A (en) 2000-02-08 2001-08-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleozymes with endonuclease activity
EP1133993A1 (en) 2000-03-10 2001-09-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Substances for the treatment of spinal muscular atrophy
WO2001079283A1 (en) 2000-04-13 2001-10-25 University Of British Columbia Modulating cell survival by modulating huntingtin function
US6653467B1 (en) 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
CN100422320C (zh) 2000-04-28 2008-10-01 肖啸 编码抗肌萎缩蛋白小基因的dna序列及其使用方法
US7115579B2 (en) 2000-05-01 2006-10-03 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20020013287A1 (en) 2000-05-09 2002-01-31 Reliable Biopharmaceuticals, Inc. St Louis Missouri Polymeric compounds useful as prodrugs
JP2003535104A (ja) 2000-05-31 2003-11-25 ジェンセット 筋量および筋分化の増加を促進させるためのａｃｒｐ３０球状ヘッドの使用方法
CN1326990A (zh) 2000-06-07 2001-12-19 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人类dna cgg重复结合蛋白16.17和编码这种多肽的多核苷酸
US20030124523A1 (en) 2000-06-22 2003-07-03 Asselbergs Fredericus Alphonsus Maria Organic compounds
US6794192B2 (en) 2000-06-29 2004-09-21 Pfizer Inc. Target
RU2165149C1 (ru) 2000-07-03 2001-04-20 Шапошников Валерий Геннадьевич Система формования и упаковки изделий из сахарной ваты
US6727355B2 (en) * 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
JP4836366B2 (ja) 2000-08-25 2011-12-14 雅文 松尾 デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
AU3922802A (en) 2000-10-02 2002-05-27 Keck Graduate Inst Methods for identifying nucleotides at defined positions in target nucleic acidsusing fluorescence polarization
AU2001296600A1 (en) 2000-10-06 2002-04-15 Regents Of The University Of Michigan Mini-dystrophin nucleic acid and peptide sequences
US6623927B1 (en) 2000-11-08 2003-09-23 Council Of Scientific And Industrial Research Method of detection of allelic variants of SCA2 gene
CA2449412C (en) 2000-11-30 2013-04-02 Uab Research Foundation Receptor-mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor
US7001994B2 (en) 2001-01-18 2006-02-21 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose 6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins
TWI329129B (en) 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
KR100408053B1 (ko) 2001-02-13 2003-12-01 엘지전자 주식회사 에스알엠의 토크리플 저감방법
WO2002085308A2 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. Antisense and anti-inflammatory based compositions to treat respiratory disorders
CA2414782C (en) 2001-05-11 2012-10-09 Regents Of The University Of Minnesota Intron associated with myotonic dystrophy type 2 and methods of use
US20050277133A1 (en) 2001-05-18 2005-12-15 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050282188A1 (en) 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050014172A1 (en) 2002-02-20 2005-01-20 Ivan Richards RNA interference mediated inhibition of muscarinic cholinergic receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
CA2526831C (en) 2001-05-18 2012-07-31 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (sina)
IL143379A (en) 2001-05-24 2013-11-28 Yissum Res Dev Co Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses
WO2003002544A1 (en) 2001-06-26 2003-01-09 Bristol-Myers Squibb Company N-heterocyclic inhibitors of tnf-alpha expression
WO2003004511A2 (en) 2001-07-06 2003-01-16 Topigen Pharmaceutique Inc.. Methods for increasing in vivo efficacy of oligonucleotides and inhibiting inflammation in mammals
WO2003013437A2 (en) 2001-08-07 2003-02-20 University Of Delaware Compositions and methods for the prevention and treatment of huntington's disease
DE60230046D1 (de) 2001-08-10 2009-01-08 Novartis Ag Peptide, die atherosklerotische schädigungen binden
US20060074034A1 (en) 2001-09-17 2006-04-06 Collins Douglas A Cobalamin mediated delivery of nucleic acids, analogs and derivatives thereof
KR20030035047A (ko) 2001-10-29 2003-05-09 (주)바이오코돈 Bmp-4 유전자 발현을 이용한 편평태선 질환의 치료 및진단방법
US20030166004A1 (en) 2001-11-01 2003-09-04 Jeno Gyuris Endothelial-cell binding peptides for diagnosis and therapy
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
WO2003062258A1 (en) 2002-01-22 2003-07-31 The Cleveland Clinic Foundation Rnase l activator-antisense complexes
WO2003069330A1 (en) 2002-02-11 2003-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York System and method for identifying proteins involved in force-initiated signal transduction
US20050096284A1 (en) 2002-02-20 2005-05-05 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
NZ534719A (en) 2002-03-01 2008-02-29 Univ Tulane Conjugates of therapeutic or cytotoxic agents and biologically active peptides
US20040101852A1 (en) 2002-11-21 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of CGG triplet repeat binding protein 1 expression
ITRM20020253A1 (it) 2002-05-08 2003-11-10 Univ Roma Molecole chimeriche di snrna con sequenze antisenso per le giunzioni di splicing del gene della distrofina e applicazioni terapeutiche.
US20040102395A1 (en) 2002-11-22 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of IAP-like expression
EP1380644A1 (en) 2002-07-08 2004-01-14 Kylix B.V. The use of specified TCF target genes to identify drugs for the treatment of cancer, in particular colorectal cancer, in which TCF/beta-catenin/WNT signalling plays a central role
US7589059B2 (en) 2002-07-26 2009-09-15 Roche Madison Inc. Delivery of molecules and complexes to mammalian cells in vivo
US20050255086A1 (en) 2002-08-05 2005-11-17 Davidson Beverly L Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene
EP1529105B1 (en) 2002-08-12 2012-10-03 Société de commercialisation des produits de la recherche appliquée SOCPRA Sciences Santé et Humaines s.e.c. Methods to reprogram splice site selection in pre-messenger rnas
GB0219143D0 (en) 2002-08-16 2002-09-25 Univ Leicester Modified tailed oligonucleotides
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
DK1554305T3 (da) 2002-10-23 2007-04-23 Ct For Res And Technology Hell Prionprotein-bindende peptidsekvenser
US7892793B2 (en) 2002-11-04 2011-02-22 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
JP2006507841A (ja) 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
US7655785B1 (en) 2002-11-14 2010-02-02 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US7902160B2 (en) 2002-11-25 2011-03-08 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
GB0228079D0 (en) 2002-12-02 2003-01-08 Laxdale Ltd Huntington's Disease
ATE479752T1 (de) 2003-03-07 2010-09-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Therapeutische zusammensetzungen
AU2003225410A1 (en) 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
US7514551B2 (en) 2003-04-03 2009-04-07 Enzo Life Sciences, Inc. Multisignal labeling reagents, and processes and uses therefor
JP4179562B2 (ja) 2003-05-14 2008-11-12 独立行政法人科学技術振興機構 ハンチンチン遺伝子の発現抑制
US7785587B2 (en) 2003-06-02 2010-08-31 Wyeth Therapeutic methods for muscular or neuromuscular disorders
DK1495769T3 (da) 2003-07-11 2008-06-23 Lbr Medbiotech B V Mannose-6-phosphat-receptormedieret gentransfer til muskelceller
US20050048495A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Baker Brenda F. Isoform-specific targeting of splice variants
US20050054752A1 (en) 2003-09-08 2005-03-10 O'brien John P. Peptide-based diblock and triblock dispersants and diblock polymers
WO2005033134A2 (en) 2003-09-30 2005-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Secreted protein therapeutics and uses thereof
WO2005035550A2 (en) 2003-10-14 2005-04-21 Kernel Biopharma Inc. Dual phase-pna conjugates for the delivery of pna through the blood brain barrier
US20050191636A1 (en) 2004-03-01 2005-09-01 Biocept, Inc. Detection of STRP, such as fragile X syndrome
WO2005086768A2 (en) 2004-03-11 2005-09-22 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Enhanced production of functional proteins from defective genes
WO2005105995A2 (en) 2004-04-14 2005-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF POLYGLUTAMINE (POLYQ) REPEAT EXPANSION DISEASES USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
CN101052717A (zh) 2004-05-11 2007-10-10 α基因株式会社 诱发rna干扰的多核苷酸以及使用该多核苷酸的基因表达抑制方法
US20050288246A1 (en) 2004-05-24 2005-12-29 Iversen Patrick L Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method
US7316998B2 (en) 2004-05-27 2008-01-08 Acceleron Pharma Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
ES2361325T3 (es) 2004-06-28 2011-06-16 The University Of Western Australia Oligonucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y métodos de uso de los mismos.
US7361468B2 (en) 2004-07-02 2008-04-22 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping polymorphisms in humans
EP1618881A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-25 Santhera Pharmaceuticals (Schweiz) GmbH Use of non-glucocorticoid steroids for the treatment of muscular dystrophy
US20110046200A1 (en) 2004-08-03 2011-02-24 Michael T Howard Use of antisense oligonucleotides to effect translation modulation
US20060099612A1 (en) 2004-09-02 2006-05-11 Suntory Limited Method for analyzing genes of industrial yeasts
AU2005335216A1 (en) 2004-10-05 2007-02-15 Wyeth Probe arrays for detecting multiple strains of different species
ITRM20040568A1 (it) 2004-11-18 2005-02-18 Uni Degli Studi Di Roma Tor Vergata Uso della tecnica "phage display" per l'identificazione di peptidi con capacita' di legame a cellule staminali/progenitore, peptidi cosi' ottenuti e loro usi.
US7838657B2 (en) 2004-12-03 2010-11-23 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences
KR100663277B1 (ko) 2004-12-20 2007-01-02 삼성전자주식회사 휴대단말기의 시스템 관련 이벤트 처리 장치 및 방법
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
US20120122801A1 (en) 2005-01-05 2012-05-17 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
CA2596588C (en) 2005-01-31 2017-06-27 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid silencing of huntington's disease gene
EP1877099B1 (en) 2005-04-06 2012-09-19 Genzyme Corporation Therapeutic conjugates comprising a lysosomal enzyme, polysialic acid and a targeting moiety
JP2008538500A (ja) 2005-04-22 2008-10-30 アカデミス ツィーケンホイス ライデン ＳＲタンパク質の結合に対する干渉とＲＮＡ二次構造に対する干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節
EP1885854B1 (en) 2005-05-06 2012-10-17 Medtronic, Inc. Methods and sequences to suppress primate huntington gene expression
US7902352B2 (en) 2005-05-06 2011-03-08 Medtronic, Inc. Isolated nucleic acid duplex for reducing huntington gene expression
WO2006121277A1 (en) 2005-05-09 2006-11-16 Korea Research Institute Of Standards And Science Fret probes for fluorescent detection of the epsps gene
ES2545223T3 (es) 2005-06-23 2015-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composiciones y procedimientos para modular el corte y empalme de SMN2
EP2322657B1 (en) 2005-06-28 2014-11-05 Medtronic, Inc. Methods and sequences to preferentially suppress expression of mutated huntingtin gene.
ES2330884T3 (es) * 2005-07-01 2009-12-16 Index Pharmaceuticals Ab Modulacion de la respuesta a los esteroides.
CA2627025A1 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene
US7906617B2 (en) 2005-12-15 2011-03-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polyethylene binding peptides and methods of use
SI2161038T1 (sl) 2006-01-26 2014-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in njihove uporabe, usmerjeni proti huntingtinu
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
EP1857548A1 (en) 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
US7855053B2 (en) 2006-07-19 2010-12-21 The Regents Of The University Of California Methods for detecting the presence of expanded CGG repeats in the FMR1 gene 5′ untranslated region
WO2008018795A1 (en) 2006-08-11 2008-02-14 Prosensa Technologies B.V. Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
CN101501193B (zh) 2006-08-11 2013-07-03 普罗森那技术公司 用于治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病的方法和手段
AU2007300529A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Acylated piperidine derivatives as melanocortin-4 receptor modulators
CA2666185A1 (en) 2006-10-11 2008-04-17 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Influenza targets
EP2125032A4 (en) 2007-02-20 2011-02-23 Mayo Foundation TREATMENT OF CANCER USING VIRAL NUCLEIC ACID
PL381824A1 (pl) 2007-02-22 2008-09-01 Instytut Chemii Bioorganicznej Pan W Poznaniu Sekwencja siRNA, wektor, cel molekularny dla reagentów siRNA i wektorów wprowadzanych do komórek i tkanek, sposób oceny specyficzności wyciszania zmutowanego transkryptu, sposób badania oddziaływań enzymów szlaku interferencji RNA z transkryptami oraz zastosowanie sekwencji siRNA i wektora
ES2694726T3 (es) 2007-06-29 2018-12-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Conjugados peptídicos específicos de tejido y métodos
DK2167136T3 (en) 2007-07-12 2016-07-25 Biomarin Tech Bv Molecules for targeting compounds at different selected organs or tissues
EP2167135A2 (en) 2007-07-12 2010-03-31 Prosensa Technologies B.V. Molecules for targeting compounds to various selected organs, tissues or tumor cells
US9212205B2 (en) 2007-07-26 2015-12-15 University Of Rochester Nucleic acid binding compounds and methods of use
AU2008286771B2 (en) 2007-08-15 2013-08-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
NZ584793A (en) 2007-10-26 2012-05-25 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
NZ587178A (en) 2008-02-08 2011-11-25 Prosensa Holding Bv Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
WO2009101399A1 (en) 2008-02-12 2009-08-20 Isis Innovation Limited Treatment of muscular dystrophy using peptide nucleic acid ( pna)
EP2105145A1 (en) 2008-03-27 2009-09-30 ETH Zürich Method for muscle-specific delivery lipid-conjugated oligonucleotides
CA2726866A1 (en) 2008-05-09 2009-11-12 The University Of British Columbia Methods and compositions for the treatment of huntington's disease
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
WO2009144481A2 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Isis Innovation Limited Conjugates for delivery of biologically active compounds
WO2009151600A2 (en) 2008-06-10 2009-12-17 Tufts University Smad proteins control drosha-mediated mirna maturation
GB2457965B8 (en) 2008-07-01 2011-02-16 Renovo Ltd Methods and systems for determining efficacy of medicaments.
US20110218334A1 (en) 2008-07-11 2011-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PHOSPHOROTHIOATE OLIGONUCLEOTIDES AND NON-NUCLEOSIDIC PHOSPHOROTHIOATES AS DELIVERY AGENTS FOR iRNA AGENTS
JP2011529686A (ja) 2008-07-29 2011-12-15 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム ポリグルタミンタンパク質発現の選択的阻害
US8084601B2 (en) * 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
WO2010044894A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 4S3 Bioscience Inc. Methods and compositions for treatment of myotonic dystrophy
EP4174178A1 (en) * 2008-10-24 2023-05-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
ES2562658T3 (es) 2008-10-27 2016-03-07 Biomarin Technologies B.V. Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
CN102449171B (zh) 2009-03-24 2015-12-02 奥斯瑞根公司 对fmr1和fmr2基因5’非翻译区进行表征的pcr方法
US20100248239A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for detecting fragile x mutations
CA2758189C (en) 2009-04-10 2020-12-29 Association Institut De Myologie Tricyclo-dna antisense oligonucleotides, compositions, and methods for the treatment of disease
JP2012524540A (ja) 2009-04-24 2012-10-18 プロセンサ テクノロジーズ ビー．ブイ． Ｄｍｄを処置するためのイノシンを含むオリゴヌクレオチド
AU2010258875A1 (en) 2009-06-08 2012-01-19 Miragen Therapeutics Chemical modification motifs for miRNA inhibitors and mimetics
KR102175230B1 (ko) 2009-09-11 2020-11-06 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 헌팅틴 발현의 조절
EP3431603A1 (en) 2009-11-12 2019-01-23 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
US20110166081A1 (en) 2009-12-03 2011-07-07 University Of Iowa Research Foundation Alpha-dystroglycan as a Protein Therapeutic
WO2011078797A2 (en) 2009-12-22 2011-06-30 Singapore Health Services Pte. Ltd Antisense oligonucleotides and uses threreof
AU2010335039B2 (en) 2009-12-24 2015-03-26 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Molecule for treating an inflammatory disorder
WO2011097641A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful in treatment of diseases or conditions related to repeat expansion
WO2011097614A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mehods and compositions useful in diseases or conditions related to repeat expansion
CN106434648A (zh) 2010-07-19 2017-02-22 F·C·贝内特 肌强直性营养障碍蛋白激酶(dmpk)表达的调节
HUE029521T2 (en) 2010-08-20 2017-03-28 Replicor Inc Oligonucleotide chelate complexes
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
EP3467109A1 (en) 2011-02-08 2019-04-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
CA2826836A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Antisense oligonucleotides
EP2699269A1 (en) 2011-04-22 2014-02-26 Prosensa Technologies B.V. New compounds for treating, delaying and/or preventing a human genetic disorder such as myotonic dystrophy type 1 (dm1)
EP2704749A1 (en) 2011-05-05 2014-03-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
WO2012178122A2 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Cold Spring Harbor Laboratory Phenocopy model of disease
EP2785729B1 (en) 2011-11-30 2020-11-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for treating expanded repeat diseases
WO2013082578A1 (en) 2011-12-03 2013-06-06 Thomas Krupenkin Method and apparatus for mechanical energy harvesting using combined magnetic and microfluidic energy generation
JP2015502365A (ja) 2011-12-12 2015-01-22 オンコイミューニン，インコーポレイティド オリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達
KR102071729B1 (ko) 2011-12-28 2020-01-31 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 안티센스 핵산
EP2806900B1 (en) 2012-01-27 2021-12-15 BioMarin Technologies B.V. Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy
WO2013120003A1 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of rna by repeat targeting
SI2841578T1 (sl) 2012-04-23 2017-12-29 Biomarin Technologies B.V. Rna modulirajoči oligonukleotidi z izboljšanimi karakteristikami za zdravljenje nevromuskularnih motenj
AR091065A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Replicor Inc Una formulacion farmaceutica que comprende un quelato de oligonucleotidos antiviral para el tratamiento de una infeccion antiviral
CN104603271B (zh) 2012-07-03 2019-07-19 马林生物科技有限公司 用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸
ES2714290T3 (es) * 2013-03-14 2019-05-28 Sarepta Therapeutics Inc Composiciones de salto de exón para el tratamiento de la distrofia muscular

Also Published As

Publication number Publication date
US20110263682A1 (en) 2011-10-27
EP2203173B1 (en) 2015-12-23
JP7107622B2 (ja) 2022-07-27
EP2614827A2 (en) 2013-07-17
ES2914775T3 (es) 2022-06-16
US10876114B2 (en) 2020-12-29
US20170044534A1 (en) 2017-02-16
EP4183399A1 (en) 2023-05-24
IL261127A (en) 2018-10-31
US20170107512A1 (en) 2017-04-20
US20190112604A1 (en) 2019-04-18
US20150166996A1 (en) 2015-06-18
NZ592446A (en) 2012-03-30
US20140128592A1 (en) 2014-05-08
CN102256606A (zh) 2011-11-23
JP5879374B2 (ja) 2016-03-08
CN105641700A (zh) 2016-06-08
IL205322A (en) 2016-08-31
WO2009054725A3 (en) 2009-10-15
PT2203173E (pt) 2016-03-15
JP5600064B2 (ja) 2014-10-01
IL284321A (en) 2021-07-29
EP3238737B1 (en) 2022-04-06
CN102264903A (zh) 2011-11-30
JP2016033140A (ja) 2016-03-10
CN101896186A (zh) 2010-11-24
NZ584793A (en) 2012-05-25
US20190119679A1 (en) 2019-04-25
IL284321B (en) 2022-04-01
EP2203173A2 (en) 2010-07-07
DK2203173T3 (en) 2016-02-29
CN105647921A (zh) 2016-06-08
US20230151362A1 (en) 2023-05-18
JP2019142942A (ja) 2019-08-29
EP3238737A1 (en) 2017-11-01
HRP20160025T1 (hr) 2016-02-12
HK1185098A1 (zh) 2014-02-07
US9926557B2 (en) 2018-03-27
EP2614827B1 (en) 2017-06-28
IL205322A0 (en) 2010-12-30
US20140113955A1 (en) 2014-04-24
HK1245670A1 (zh) 2018-08-31
JP6579629B2 (ja) 2019-09-25
HUE028662T2 (en) 2016-12-28
US9499818B2 (en) 2016-11-22
PL2203173T3 (pl) 2016-06-30
IL261127B (en) 2020-07-30
US11427820B2 (en) 2022-08-30
US20190100754A1 (en) 2019-04-04
AU2008317566A1 (en) 2009-04-30
US20140221458A1 (en) 2014-08-07
IL241928A0 (en) 2015-11-30
JP2014111638A (ja) 2014-06-19
WO2009054725A2 (en) 2009-04-30
CN105641700B (zh) 2021-01-01
JP2017141296A (ja) 2017-08-17
JP2011502118A (ja) 2011-01-20
EP2614827A3 (en) 2013-09-25
US9528109B2 (en) 2016-12-27
CN102264903B (zh) 2015-01-07
ES2936464T3 (es) 2023-03-17
CA2704049A1 (en) 2009-04-30
JP6885620B2 (ja) 2021-06-16
CY1117286T1 (el) 2017-04-26
US20120022134A1 (en) 2012-01-26
CY1117454T1 (el) 2017-04-26
US20150073037A1 (en) 2015-03-12
US20200239886A1 (en) 2020-07-30
US20160304864A1 (en) 2016-10-20
US9243245B2 (en) 2016-01-26
HUE027124T2 (en) 2016-08-29
AU2008317566B2 (en) 2014-05-01
ES2564563T3 (es) 2016-03-23
IL241928B (en) 2018-08-30
US20210139904A1 (en) 2021-05-13
JP2021113229A (ja) 2021-08-05
US20110294753A1 (en) 2011-12-01
US20190177725A1 (en) 2019-06-13
ES2692886T3 (es) 2018-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2639852T3 (es) Medios y métodos para contrarrestar los trastornos musculares
ES2593836T3 (es) Oligonucleótido que comprende una inosina para tratar la DMD
ES2532634T3 (es) Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
US20210403910A1 (en) Antisense polynucleotides to induce exon skipping and method of treating dystrophies
USRE48468E1 (en) Means and methods for counteracting muscle disorders
JP2004536103A (ja) ヒトのアセチルコリンエステラーゼ（ａｃｈｅ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用
JP6791877B2 (ja) デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためのダイナミン２阻害剤
ES2559106B1 (es) Método de activación de la expresión del gen Pitx2 para promover la regeneración muscular
WO2023154729A2 (en) Compositions and methods for cardiac tissue regeneration
US20160220647A1 (en) Proteins for targeting neuronal nitric oxide synthase to muscle sarcolemma and related methods of use