ES2564563T3 - Medios y métodos para contrarrestar trastornos del músculo - Google Patents

Medios y métodos para contrarrestar trastornos del músculo

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ES2564563T3
ES2564563T3 ES08842559.0T ES08842559T ES2564563T3 ES 2564563 T3 ES2564563 T3 ES 2564563T3 ES 08842559 T ES08842559 T ES 08842559T ES 2564563 T3 ES2564563 T3 ES 2564563T3
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Josephus Johannes De Kimpe
Gerardus Johannes Platenburg
Judith Christina Theodora Van Deutekom
Annemieke Aartsma-Rus
Garrit-Jan Boudewijn Van Ommen
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Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Biomarin Technologies BV
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Abstract

Combinación de: - un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte de exón 51 de pre-ARNm de distrofina humana y dicho oligonucleótido se representa por SEC ID n.º: 204 y - un compuesto complementario para reducir la inflamación, donde este compuesto comprende un esteroide, donde dicha combinación es para su uso como un medicamento, para aliviar uno o varios síntomas de distrofia muscular de Duchenne en dicho individuo.

Description

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Medios y metodos para contrarresta trastornos del musculo
[0001] Un trastorno muscular es una enfermedad que normalmente tiene un impacto significativo en la vida de un individuo.
Un trastorno muscular puede tener bien una causa genetica o una causa no genetica.
Un grupo importante de enfermedades musculares con una causa genetica son distrofia muscular de Becker (BMD) y distrofia muscular de Duchenne (DMD).
Estos trastornos son causados por defectos en un gen de una protefna muscular.
[0002] Distrofia muscular de Becker y distrofia muscular de Duchenne son distrofias musculares geneticas con una incidencia relativamente alta.
En tanto distrofia muscular de Duchenne como de Becker la protefna muscular distrofina es afectada.
En Duchenne la distrofina es ausente, mientras que en Becker alguna distrofina esta presente pero su produccion es muy a menudo insuficiente y/o la distrofina presente esta formada anormalmente.
Ambas enfermedades se asocian con herencia recesiva ligada al cromosoma X.
DMD resulta de una mutacion de desplazamiento del marco de lectura en el gen DMD.
El desplazamiento del marco de lectura en el gen DMD causa la produccion de una protefna de distrofina no funcional truncada, dando como resultado atrofia muscular progresiva y debilidad.
BMD ocurre como una mutacion que no causa un desplazamiento de marco en el gen DMD.
Como en BMD alguna distrofina esta presente, a diferencia de en DMD donde la distrofina esta ausente, BMD tiene sfntomas menos severos que DMD.
La aparicion de DMD es anterior a BMD.
DMD normalmente se manifiesta en la infancia temprana, BMD en los adolescentes o en la edad adulta temprana.
La progresion de BMD es mas lenta y menos previsible que DMD.
Pacientes con BMD pueden sobrevivir hasta mediados o final de la edad adulta.
Pacientes con DMD raramente sobreviven mas alla de la treintena.
[0003] Distrofina juega un papel estructural importante en la fibra de musculo, que conecta la matriz extracelular y el citoesqueleto.
La region N-terminal enlaza actina, mientras que el extremo C-terminal es parte del complejo de glicoprotefna de distrofina (DGC), que abarca el sarcolema.
En ausencia de distrofina, tension mecanica lleva a rupturas de sarcolema, causa un flujo descontrolado de calcio en la fibra muscular interior, activando asf proteasas activadas por calcio y necrosis de fibra.
[0004] Para distrofias musculares mas geneticas ninguna terapia clfnicamente aplicable y eficaz esta actualmente disponible.
Tecnicas de omision de exon son hoy en dfa exploradas para combatir distrofias musculares geneticas.
Resultados prometedores han sido recientemente proporcionados por nosotros y otros sobre una terapia genetica dirigida a restaurar marco de lectura del pre-ARNm de distrofina en celulas de raton mdx y pacientes de DMD 1-11.
Por la omision dirigida de un exon especffico, un fenotipo DMD (carente de distrofina) se convierte en un mas suave fenotipo BMD (parcialmente para distrofina en gran medida funcional).
La omision de un exon es preferiblemente inducida por la union de oligorribonucleotidos antisentido (AON) dirigidos a uno o ambos de los sitios de empalme, o secuencias internas de exon.
Ya que un exon solo sera incluido en el ARNm cuando los sitios de empalme son reconocidos por el complejo de espliceosoma, sitios de empalme son objetivos obvios para AON.
Alternativamente, o adicionalmente, se usan uno o varios AON que son especfficos para al menos parte de una o varias secuencias exonicas.
Utilizando AON internos de exon especfficos para una secuencia de exon 46, fueron previamente capaces de modular el modelo de empalme en miotubos cultivados de dos pacientes DMD diferentes con una supresion0005 * * * * * 11 * de exon 45.
Despues del tratamiento AON, exon 46 fue omitido, lo que resulto en un marco de lectura restaurado y la induccion de sfntesis de distrofina en al menos 75% de las celulas.
Hemos recientemente mostrado que omision de exon puede tambien ser inducida eficazmente en celulas de control
1 1 12 1115
humano y de musculo de paciente para 39 exones DMD diferentes que usan AON internos de exon , , " .
[0005] Por lo tanto, tecnicas de omision de exon aplicadas en el gen de distrofina suponen la generacion de protefna
de distrofina al menos parcialmente funcional, sin bien mas corta, en pacientes de DMD.
Ya que DMD esta causada por una protefna de distrofina disfuncional, serfa previsto que los sfntomas de DMD sean
suficientemente aliviados una vez un paciente de DMD ha sido provisto de protefna de distrofina funcional.
Sin embargo, la presente invencion proporciona la comprension de que, aunque tecnicas de omision de exon son
capaces de inducir sfntesis de distrofina, sfntomas dMd es/son todavfa mas aliviados por administracion a un
paciente con DMD de un compuesto complementario para reducir inflamacion, preferiblemente para reducir inflamacion de tejido de musculo, y/o un compuesto complementario para mejorar la funcion, integridad y/o
supervivencia de fibra muscular.
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Segun la presente invencion, incluso cuando una deficiencia de protefna distrofina ha sido restaurada en un paciente de DMD, la presencia de inflamacion de tejido y celulas musculares danadas todavfa continua contribuyendo a los sfntomas de DMD.
Por lo tanto, aunque la causa de DMD (es decir una protefna distrofina disfuncional) es aliviada, tratamiento de DMD sigue siendo aun mejorado al utilizar adicionalmente una terapia complementaria segun la presente invencion. Ademas, la presente invencion proporciona la comprension de que una reduccion de inflamacion no supone reduccion significativa de absorcion de AON por celulas musculares.
Esto es sorprendente porque, en general, inflamacion mejora el trafico de celulas, sangre y otros compuestos.
Como resultado, recepcion/entrega de AON es tambien mejorada durante inflamacion.
Por lo tanto, antes de la presente invencion serfa previsto que una terapia complementaria de contrarrestacion de inflamacion implicara el riesgo de influir negativamente en terapia AON.
Este, sin embargo, parece no ser el caso.
[0006] La presente divulgacion por lo tanto proporciona un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en un individuo, donde el metodo comprende:
- administracion a dicho individuo de un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina (al menos parcialmente) funcional, y
- administracion a dicho individuo de un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular.
[0007] El metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en un individuo comprende administracion a dicho individuo de un compuesto complementario para reducir inflamacion preferiblemente para reducir inflamacion de tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular.
[0008] La presente invencion se refiere a una combinacion de:
- un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte de exon de pre-ARNm de distrofina humana 51 y dicho oligonucleotido se representa por SEC ID NO:204, y
- un compuesto complementario para reducir la inflamacion, donde este compuesto comprende un esteroide, dicha combinacion siendo para uso como un medicamento, para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en dicho individuo, segun la reivindicacion 1.
[0009] Se ha descubierto sorprendentemente que la frecuencia de omision de un exon de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exon, cuando se usa un oligonucleotido dirigido hacia el exon o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exon, mejora si las celulas que expresan dicho pre-ARNm estan tambien provistas de un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular.
La frecuencia de omision mejorada tambien aumenta el nivel de protefna distrofina funcional producida en una celula muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0010] La presente divulgacion proporciona ademas un metodo para aumentar omision de un exon de un pre-ARNm de distrofina en las celulas que expresan dicho pre-ARNm, donde dicho metodo comprende
- contactar dicho pre-ARNm en dichas celulas con un oligonucleotido para la omision de dicho exon y,
- contactar dichas celulas con un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular.
[0011] Como distrofia muscular de Duchenne y de Becker tienen un fenotipo pronunciado en celulas musculares, se prefiere que dichas celulas sean celulas musculares.
Preferiblemente dichas celulas comprenden un gen que codifica una protefna distrofina mutante.
Preferiblemente dichas celulas son las celulas de un individuo que padece de DMD o BMD.
[0012] La presente invencion ademas proporciona un metodo para aumentar omision de un exon de un pre-ARNm de distrofina en las celulas que expresan dicho pre-ARNm en un individuo que padece de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker, donde el metodo comprende:
- administracion a dicho individuo de un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina (al menos parcialmente) funcional, y
- administracion a dicho individuo de un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular. 0013 * * *
[0013] A un individuo se le proporciona una protefna distrofina funcional de varias maneras.
En una forma de realizacion una tecnica de omision de exon es aplicada.
Sin embargo, metodos alternativos estan disponibles segun la divulgacion, tales como por ejemplo supresion de
codon de terminacion por gentamicina o PTC12416,17 (tambien conocido como acido 3-(5-(2-fluorofenil)-1,2,4-
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oxadiazol-3-il)benzoico), y/o entrega de gen adeno-asociado mediado de virus (AAV) de un gen mini o micro- distrofina funcional 0017 18 *"20
PTC124™ es una marca registrada de PTC Therapeutics, Inc. South Plainfield, Nueva Jersey.
[0014] Tal y como se define aquf, una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina de tipo salvaje que corresponde con una protefna que tiene la secuencia de aminoacidos segun se identifica en SEC ID n.°: 1.
Una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina que tiene un dominio de union de actina en su parte N terminal (primeros 240 aminoacidos en el N terminal), un dominio rico en cistefna (aminoacidos 3361 hasta 3685) y un dominio terminal C (ultimo aminoacidos 325 en el C terminal) donde cada uno de estos dominios estan presentes en una distrofina de tipo salvaje como conocido por la persona experta.
Los aminoacidos indicados aquf corresponden a aminoacidos de la distrofina de tipo salvaje siendo representados por SEC ID NO:1.
En otras palabras, una distrofina funcional es una distrofina que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje. " al menos hasta cierto punto" significa preferiblemente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de una actividad correspondiente de una distrofina funcional de tipo salvaje.
En este contexto, una actividad de una distrofina funcional es preferiblemente enlazarse a actina y al complejo de glicoprotefna asociada a la distrofina (DGC)56.
Union de distrofina a actina y al complejo DGC se puede visualizar por co-inmunoprecipitacion usando extractos de protefna total o analisis de inmunofluorescencia de secciones transversales, de una biopsia de un musculo sospechoso de ser distrofico, como conocido por la persona experta.
[0015] Individuos que padecen de distrofia muscular de Duchenne tfpicamente tienen una mutacion en el gen que codifica la distrofina que previene sfntesis de la protefna completa, es decir de una parada prematura previene la sfntesis de la C-terminal
En la distrofia muscular de Becker, el gen de distrofina tambien comprende una mutacion en comparacion con el tipo salvaje pero la mutacion tfpicamente no incluyen una parada prematura y la C-terminal es tfpicamente sintetizado. Como resultado se sintetiza una protefna distrofina funcional que tiene al menos la misma actividad en especie que la protefna de tipo salvaje, aunque no necesariamente la misma cantidad de actividad.
El genoma de un individuo BMD codifica tfpicamente una protefna distrofina que comprende la parte N terminal (primeros 240 aminoacidos en el N terminal), un dominio rico en cistefna (aminoacidos 3361 hasta 3685) y un dominio C terminal (ultimos aminoacidos 325 en el C terminal) pero su dominio con forma de varilla central puede ser mas corto que el primero de una distrofina tipo salvaje 56
Omision de exon para el tratamiento de DMD es tfpicamente dirigido a superar una parada prematura en el pre- ARNm por omision de un exon en el dominio en forma de rodillo de varilla para corregir el marco de lectura y permite la sfntesis del resto de la protefna distrofina con la C-terminal, aunque la protefna es un poco mas pequena como resultado de un dominio de varilla menor.
En una forma de realizacion preferida, a un individuo con DMD y tratado con un metodo tal y como se define aquf se le proporcionara una distrofina que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje.
Mas preferiblemente, si dicho individuo es un paciente de Duchenne o se sospecha que pueda paciente de Duchenne, una distrofina funcional es una distrofina de un individuo con BMD: tfpicamente dicha distrofina es capaz de interactuar tanto con actina como con el DGC, pero su dominio con forma de varilla central puede ser mas corto que el de una distrofina de tipo salvaje (Aartsma-Rus et al (2006, ref 56).
El dominio de varilla central de distrofina de tipo salvaje comprende 24 repetidores tipo espectrina 56
Por ejemplo, un dominio con forma de varilla central de una distrofina como proporcionada aquf puede comprender
de 5 a 23, 10 a 22 o 12 a 18 repetidores tipo espectrina siempre y cuando pueda enlazar con actina y DGC.
[0016] El alivio en uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en un individuo se puede evaluar por cualquiera de los siguientes ensayos: prolongacion del tiempo hasta la perdida del anda, mejora de la fuerza muscular, mejora de la capacidad de levantar peso, mejora del tiempo necesario para levantarse del suelo, mejora en el tiempo que se tarda en andar nueve metros, mejora en el tiempo que se tarda en subir 4 escaleras, mejora del grado de funcion de la pierna, mejora de la funcion pulmonar, mejora de la funcion cardfaca, mejora de la calidad de vida.
Cada uno de estos ensayos es conocido por la persona experta.
A modo de ejemplo, la publicacion de Manzur et al (2008, ref 58) da una explicacion extensa de cada uno de estos ensayos.
Para cada uno de estos ensayos, tan pronto como una mejora o prolongacion detectable de un parametro medido en un ensayo ha sido descubierto, preferiblemente significara que uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker han sido aliviados en un individuo.
[0017] Mejora o prolongacion detectable es preferiblemente una mejora o prolongacion estadfsticamente significativa
como se describe en Hodgetts et al (2006, ref 57).
Alternativamente, el alivio de uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker se puede evaluar por medicion de una mejora de una funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular,
como mas tarde definido aquf.
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[0018] Un compuesto complementario para reducir la inflamacion comprende cualquier terapia que sea capaz de al menos reducir la inflamacion en parte, preferiblemente inflamacion provocada por celulas de musculo danadas.
Dicho compuesto complementario es mas preferiblemente capaz de reducir inflamacion de tejido muscular. Inflamacion es preferiblemente evaluada por deteccion de un aumento en el numero de celulas inmunes de infiltracion tales como neutrofilos y/o mastocitos y/o celulas dendrfticas y/o linfocitos en el tejido muscular que se sospecha es distrofico.
Esta evaluacion es preferiblemente realizada en secciones transversales de una biopsia 57 de tejido muscular que se sospecha es distrofico despues de tener celulas inmunes especfficamente marcadas segun se identifica mas arriba. La cuantificacion es preferiblemente realizada bajo el microscopio.
La reduccion de inflamacion es por lo tanto preferiblemente evaluada por deteccion de una reduccion en el numero de celulas inmunes en una seccion transversal de tejido muscular que se sospecha es distrofica.
Detectar una reduccion preferiblemente significa que el numero de al menos un tipo de celulas inmunes segun se identifica arriba es disminuido en al menos 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 17%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mas en comparacion con el numero de una celula inmune correspondiente en un mismo individuo antes del tratamiento.
De la forma mas preferible, ninguna celula inmune infiltrada se detecta en secciones transversales de dicha biopsia.
[0019] En la presente divulgacion, un compuesto complementario para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular comprende cualquier terapia que sea capaz de hasta cierto grado aumentar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular en comparacion con una situacion de otro modo similar donde dicho compuesto complementario no esta presente.
La mejora de funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular se puede evaluar utilizando al menos uno de los siguientes ensayos: reduccion detectable de creatina-cinasa en sangre, reduccion detectable de necrosis de fibras muscular en una seccion transversal de biopsia de un musculo sospechoso de ser distrofico, y/o aumento detectable de la homogeneidad del diametro de fibras muscular en una seccion transversal de biopsia de un musculo sospechoso de ser distrofico.
Cada uno de estos ensayos es conocido por la persona experta.
[0020] Creatina-cinasa se puede detectar en sangre como se describe en 57.
Una reduccion detectable en la creatina-cinasa puede significar una reduccion de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mas en comparacion con la concentracion de creatina-cinasa en un mismo individuo antes del tratamiento.
[0021] Una reduccion detectable de necrosis de fibra muscular es preferiblemente evaluada en una biopsia muscular, mas preferiblemente como se describe en 57 usando secciones transversales de biopsia.
Una reduccion detectable de necrosis puede ser una reduccion de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mas del area donde necrosis ha sido identificada usando secciones transversales de biopsia.
La reduccion se mide por comparacion a la necrosis como evaluada en un mismo individuo antes del tratamiento.
[0022] Un aumento detectable de la homogeneidad del diametro de una fibra muscular es preferiblemente evaluada en una seccion transversal de biopsia muscular, mas preferiblemente como se describe en 57.
[0023] Un tratamiento dura alrededor de al menos una semana, alrededor de al menos un mes, alrededor de al menos varios meses, alrededor de al menos un ano, alrededor de al menos 2, 3, 4, 5, 6 anos o mas.
[0024] En una forma de realizacion de la divulgacion se usa un compuesto complementario para aumentar produccion de celulas musculares danadas.
Un compuesto complementario para aumento de produccion de celulas musculares danadas comprende cualquier terapia que sea capaz de al menos en parte inducir y/o aumentar la produccion de celulas musculares danadas. Celulas musculares danadas son celulas musculares que tienen significativamente menos funcionalidad que se puede medir clfnicamente que un celula muscular saludable intacta.
En ausencia de distrofina, tension mecanica lleva a rupturas de sarcolema, causa un flujo descontrolado de calcio en la fibra muscular interior, activando asf proteasas activadas por calcio y necrosis de fibra, dando como resultado celulas muscular danadas.
Aumentar produccion de celulas musculares danadas significa que celulas musculares danadas son mas rapidamente descompuestas y/o quitadas en comparacion con una situacion donde la produccion de celulas musculares danadas no es aumentada.
Produccion de celulas musculares danadas es preferiblemente evaluada en una biopsia muscular, mas preferiblemente como se describe en 57 usando una seccion transversal de una biopsia.
Un aumento detectable de produccion puede ser un aumento de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mas del area donde produccion ha sido identificada utilizando una seccion transversal de biopsia.
El aumento se mide por comparacion a la produccion evaluada en un mismo individuo antes del tratamiento.
[0025] Sin querer ser limitados por la teorfa, se cree que aumento de produccion de celulas musculares es preferido porque reduce respuestas inflamatorias.
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[0026] Segun la presente divulgacion, una combinacion de una terapia para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional, junto con una terapia complementaria para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir inflamacion de tejido muscular en un individuo, es especialmente adecuada para uso como un medicamento.
Tal combinacion es capaz de aliviar aun mejor uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en comparacion con una terapia unica para suministrar un individuo con una protefna distrofina funcional.
Esta forma de realizacion tambien mejora la frecuencia de omision de un exon de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exon, cuando se usa un oligonucleotido dirigido hacia el exon o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exon.
La frecuencia de omision mejorada tambien aumenta el nivel de protefna distrofina funcional producida en una celula muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0027] Se proporciona ademas por lo tanto una combinacion de un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional, y un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular en dicho individuo, para uso como un medicamento.
Ya que dicha combinacion es especialmente adecuada contrarrestando DMD, la presente divulgacion tambien proporciona un uso de un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional, y un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular en dicho individuo, para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne.
Dicha combinacion se puede utilizar para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde se forma una protefna distrofina muy corta que no es suficientemente funcional.
[0028] En la divulgacion, compuestos complementarios preferidos para reducir la inflamacion incluyen un esteroide, un TNFa inhibidor, una fuente de mIGF-1 y/o un antioxidante.
Sin embargo, cualquier otro compuesto capaz de reducir inflamacion tal y como se define aquf es tambien incluido en la presente divulgacion.
Cada uno de estos compuestos es extensivamente presentado mas adelante.
Cada uno de los compuestos extensivamente presentados se puede utilizar separadamente o en combinacion entre sf y/o en combinacion con uno o varios de los compuestos complementarios usados para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular.
Un compuesto complementario de la invencion comprende un esteroide.
[0029] Ademas esta divulgacion estipula que una combinacion de una terapia para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional, junto con una terapia complementaria para mejorar la funcion de fibra muscular, integridad y/o supervivencia en un individuo es especialmente adecuada para uso como un medicamento.
Tal combinacion es capaz de aliviar aun mejor uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en comparacion con una terapia unica para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional.
[0030] La divulgacion por lo tanto ademas proporciona una combinacion de un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional, y un compuesto complementario para mejorar funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular en dicho individuo, para uso como un medicamento.
Esta combinacion es tambien especialmente adecuada contrarrestando DMD.
Un uso de un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional, y un compuesto complementario para mejorar la funcion de fibra muscular, integridad y/o supervivencia de fibra muscular en dicho individuo para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne es por lo tanto tambien proporcionado en la divulgacion.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde se forma una protefna distrofina muy corta que no es suficientemente funcional.
[0031] En la divulgacion, compuestos complementario preferido para mejorar la funcion, la integridad y/o supervivencia de fibra muscular incluyen un inhibidor de canal ionico, un inhibidor de proteasa, L-arginina y/o un bloqueador de receptor de angiotensina II tipo I.
Sin embargo, cualquier otro compuesto capaz de mejorar la funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular tal y como se define aquf es tambien incluido en la presente divulgacion.
Cada uno de estos compuestos es extensivamente presentado mas adelante.
Cada uno de los compuestos extensivamente presentado se pueden utilizar separadamente o en combinacion entre sf y/o en combinacion con uno o varios de los compuestos complementarios usados para reducir la inflamacion.
[0032] Puede hacerse un producto farmaceutico que comprende al menos una de las combinaciones anteriormente mencionadas que comprenden un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional junto con un compuesto complementario segun la invencion.
Ademas proporcionado es por lo tanto un producto farmaceutico que comprende:
- un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional, y
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- un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular en dicho individuo, y/o un compuesto complementario para mejorar la funcion de fibra muscular, integridad y/o supervivencia de fibra muscular en dicho individuo, y
- un portador farmaceuticamente aceptable, adyuvante, diluyente y/o excipiente.
Ejemplos de portadores adecuados y adyuvantes se conocen bien en la tecnica y por ejemplo comprenden una solucion salina.
Rangos de dosis de compuestos usados en un producto farmaceutico son disenados basandose en estudios de dosis creciente en ensayos clfnicos para los que existen requisitos de protocolo rigurosos.
[0033] Un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con un esteroide. Como se muestra en los ejemplos, tal combinacion produce alivio significativo de sfntomas de DMD.
La presente divulgacion por lo tanto proporciona un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion a dicho individuo de un esteroide y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
Una combinacion de un esteroide y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional para uso como un medicamento es tambien proporcionado, al igual que un uso de un esteroide y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
Esto tambien mejora la frecuencia de omision de un exon de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exon, cuando se usa un oligonucleotido dirigido hacia el exon o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exon.
La frecuencia de omision mejorada tambien aumenta el nivel de protefna distrofina funcional producida en una celula muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0034] Dicha combinacion se puede utilizar para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde se forma una protefna distrofina muy corta que no es suficientemente funcional.
[0035] Un esteroide es un lfpido terpenoide caracterizado por un esqueleto de carbono con cuatro anillos fusionados, generalmente colocados en una forma 6-6-6-5.
Esteroides varfan por los grupos funcionales fijados a estos anillos y el estado de oxidacion de los anillos.
Esteroides incluyen hormonas y farmacos que se usan normalmente para aliviar hinchazon e inflamacion, tal como por ejemplo prednisona, dexametasona y vitamina D.
[0036] Segun la presente divulgacion efectos adicionales de terapia de esteroide complementaria en pacientes DMD incluyen reduccion de inflamacion de tejido, supresion de celulas citotoxicas, y homeostasis de calcio mejorada. Muchos resultados positivos se obtienen en ninos mas jovenes.
Preferiblemente el esteroide es un corticoesteroide (glucocorticosteroide).
Preferiblemente, esteroides de prednisona (tal como prednisona, prednizolone o deflazacort) son usados21.
[0037] Rangos de dosis de (glucocortico)esteroides a ser usados en los usos terapeuticos como se describe en este caso son disenados basandose en estudios de dosis creciente en ensayos clfnicos para los que existen requisitos de protocolo rigurosos.
Las dosis usuales son aproximadamente 0,5 - 1,0 mg/kg/dfa, preferiblemente aproximadamente 0,75 mg/kg/dfa para prednisona y prednisolona, y aproximadamente 0,4 - 1,4 mg/kg/dfa, preferiblemente aproximadamente 0,9 mg/kg/dfa para deflazacort.
[0038] Un esteroide se puede administrar a dicho individuo antes de la administracion de un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional.
Se prefiere que dicho esteroide sea administrado al menos un dfa, mas preferido al menos una semana, mas preferido al menos dos semanas, mas preferido al menos tres semanas antes de la administracion de un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
[0039] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con un inhibidor factor alfa de necrosis de tumor (TNFa).
Factor alfa de necrosis de tumor (TNFa) es una citocina proinflamatoria que estimula la respuesta inflamatoria. Bloqueo farmacologico de actividad TNFa con el anticuerpo neutralizante infliximab (Remicade) es clfnicamente altamente eficaz en reducir sfntomas de enfermedades inflamatorias.
En ratones mdx, tanto infliximab como etanercept retrasan y reducen la necrosis de musculo distrofico24, 25, con beneficios fisiologicos adicionales en la fuerza muscular, funcion de canal de cloruro y niveles de creatina-cinasa reducida que se demuestran en raton mdx adulto ejercitado tratado de manera cronica26.
Tales farmacos anti-inflamatorios altamente especfficos disenados para usar en otras condiciones clfnicas son alternativas atractivas al uso de esteroides para DMD.
En una forma de realizacion, el uso de un inhibidor TNFa se limita a periodos de crecimiento muscular intensivo en ninos cuando el dano y deterioro muscular son especialmente pronunciados.
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[0040] Un aspecto de la presente divulgacion proporciona asf un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion a dicho individuo de un inhibidor TNFa y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
Una combinacion de un inhibidor TNFa y un compuesto para provision a un individuo de una protefna distrofina funcional para uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso de un inhibidor TNFa y un compuesto para provision a un individuo de una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde se forma una protefna distrofina muy corta que no es suficientemente funcional.
Un inhibidor TNFa preferido segun la divulgacion es una protefna de fusion dimerica que consiste en el dominio de Union de ligandos extracelular del receptor de TNFa humano p75 enlazada a la parte Fc de IgG1 humano.
Un inhibidor TNFa mas preferido es ethanercept (Amgen, America)26.
La dosis usual de ethanercept es aproximadamente 0,2 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 0,5 mg/kg dos veces una semana.
La administracion es preferiblemente subcutanea.
[0041] En otra forma de realizacion preferida segun la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con una fuente de mIGF-1.
Tal y como se define aquf, una fuente de IGF-1 preferiblemente abarca el propio mIGF-1, un compuesto capaz de aumentar la expresion y/o actividad de mIGF-1.
Mejorar es aquf sinonimo de aumentar.
Expresion de mIGF-1 es sinonimo de cantidad de mIGF-1. mIGF-1 promueve regeneracion de musculos a traves de aumento en la actividad de celula satelital, y reduce inflamacion y fibrosis27.
Herida local muscular produce expresion aumentada de mIGF-1.
En ratones transgenicos con extra genes IGF-1, hipertrofia muscular y fibras musculares aumentadas son observadas27.
De forma similar, ratones mdx transgenicos muestran degeneracion de fibra muscular reducida28.
Regulacion del gen mIGF-1 y/o administracion de cantidades extra de protefna mIGF-1 o un equivalente funcional de la misma (especialmente la isoforma mIGF-1 Ea [como descrita en 27, isoforma homologa humana IGF-1 4: SEC ID n.°: 2]) promueven asf el efecto de otras, preferiblemente geneticas, terapias para DMD, incluyendo omision de exon inducido por el antisentido.
Los niveles adicionales de mIGF-1 en los ratones transgenicos anteriormente mencionados no inducen problemas cardfacos ni provocan cancer, y no tienen efectos secundarios patologicos.
Un aspecto de la presente divulgacion proporciona asf un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion a dicho individuo de un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional, y provision a dicho individuo de una fuente de mIGF-1, preferiblemente el mismo mIGF-1, un compuesto capaz de aumentar expresion y/o actividad de mIGF-1.
Como declarado antes, la cantidad de mIGF-1 es por ejemplo aumentada por aumento de expresion del gen mIGF-1 y/o por administracion de protefna mIGF-1 y/o un equivalente funcional de la misma (especialmente la isoforma mIGF-1 Ea [como descrita en 27, isoforma homologa humana IGF-1 4: SEC ID n.°: 2]).
Una combinacion de mIGF-1, o un compuesto capaz de aumentar la expresion de mIGF-1 o la actividad de mIGF-1, y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional para uso como un medicamento es tambien proporcionado en esta divulgacion, al igual que un uso de mIGF-1, o un compuesto capaz de aumentar expresion de mIGF-1 o actividad mIGF-1, y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
En una forma de realizacion, tal combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde se forma una protefna distrofina muy corta que no es suficientemente funcional.
[0042] En el contexto de la divulgacion, una cantidad o actividad aumentada de mIGF-1 se puede alcanzar mediante el aumento del nivel de expresion genica de un gen IGF-1, mediante el aumento la cantidad de una correspondiente protefna IGF-1 y/o mediante el aumento de una actividad de una protefna IGF1.
Una protefna preferida mIGF-1 ha sido anteriormente definida aquf.
Un aumento de una actividad de dicha protefna se entiende aquf que significa cualquier cambio detectable en una actividad biologica ejercida por dicha protefna o en el nivel estable de dicha protefna en comparacion con dicha actividad o estado estable en un individuo que no ha sido tratado.
Cantidad o actividad aumentada de mIGF-1 son preferiblemente evaluadas por deteccion de expresion aumentada de biomarcador de hipertrofia muscular GATA-2 (como descrita en 27).
[0043] Nivel de expresion genica es preferiblemente evaluado usando tecnicas de biologfa molecular tradicionales tales como analisis de (tiempo real) PCR, series o northern.
Un nivel estable de una protefna se determina directamente por cuantificacion de la cantidad de una protefna. Cuantificar una cantidad de protefna se puede realizar por cualquier tecnica conocida tal como electrotransferencia o inmunoensayo que utiliza un anticuerpo dirigido contra una protefna.
La persona experta entendera que alternativamente o en combinacion con la cuantificacion de un nivel de expresion genica y/o una protefna correspondiente, la cuantificacion de un sustrato de una protefna correspondiente o de
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cualquier compuesto conocido por asociarse con una funcion o actividad de una protefna correspondiente o la cuantificacion de dicha funcion o actividad de una protefna correspondiente que utiliza un ensayo especffico se puede utilizar para valorar la alteracion de un nivel de actividad o estado estable de una protefna.
[0044] En un metodo de la divulgacion, una actividad o nivel de estado estable de dicha protefna se puede alterar en el nivel de la protefna misma, por ejemplo proporcionando una protefna a una celula de una fuente exogena.
[0045] Preferiblemente en la divulgacion, un aumento o una regulacion del nivel de expresion de un dicho gen significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresion de dicho gen usando series.
Mas preferiblemente, un aumento del nivel de expresion de dicho gen significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o mas.
En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un aumento del nivel de expresion de dicha protefna significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresion de dicha protefna usando electrotransferencia y/o usando ELISA o un ensayo adecuado.
Mas preferiblemente, un aumento del nivel de expresion de una protefna significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o mas.
[0046] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un aumento de actividad de polipeptido significa un aumento de al menos 5% de una actividad de polipeptido que utiliza un ensayo adecuado.
Mas preferiblemente, un aumento de actividad de polipeptido significa un aumento de al menos 10%, aun mas preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o mas.
El aumento es preferiblemente evaluado por comparacion con actividad correspondiente en el individuo antes del tratamiento.
[0047] Una forma preferida de proporcionar una fuente de mIGF1 segun la divulgacion es introducir una codificacion de transgen mIGF1, preferiblemente una isoforma mIGF-1 Ea (como descrita en 27, isoforma homologa humana IGF-1 4: SEC ID n.°: 2), mas preferiblemente en un vector AAV como mas tarde definido aquf.
Tal fuente de mIGF1 es especfficamente expresada en el tejido muscular como se describe en ratones en 27.
[0048] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con un antioxidante.
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Estres oxidativo es un factor importante en la progresion de DMD y promueve inflamacion y fibrosis cronica .
Los productos mas predominantes de estres oxidativo, los lfpidos peroxidados, se aumentan por un promedio de 35% en ninos con Duchenne.
Niveles aumentados de la superoxido-dismutasa de enzimas y catalasa reducen la cantidad excesiva de radicales libres que causan estos efectos.
De hecho, un complemento dietetico Protandim® (LifeVantage) fue clfnicamente evaluado y se descubrio que aumenta niveles de superoxido-dismutasa (hasta 30%) y catalasa (hasta 54%), que de hecho significativamente inhibieron la peroxidacion de lfpidos en 29 personas saludables30.
Tal gestion eficaz de estres oxidativo preserva asf la calidad muscular y asf promueve el efecto positivo de terapia de DMD.
Idebenona es otro antioxidante potente con una estructura qufmica derivada de coenzima natural Q10.
Protege la mitocondria donde trifosfato de adenosina, ATP, se genera por fosforilacion oxidante.
La ausencia de distrofina en DMD negativamente afecta a este proceso en el corazon, y probablemente tambien en el musculo esqueletico.
Idebenona fue recientemente aplicada en ensayos clfnicos en EEUU y Europa que demuestran eficacia en aspectos neurologicos de Ataxia de Friedreich31.
Una prueba clfnica de fase IIa aleatorizada doble ciego controlada por placebo con Idebenona ha sido iniciada recientemente en la Belgica, incluyendo 21 ninos con Duchenne de 8 a 16 anos de edad.
El objetivo primario de este estudio es decidir el efecto de Idebenona en la funcion del musculo del corazon.
Ademas diferentes pruebas seran realizadas para detectar el beneficio funcional posible en la fuerza muscular en los pacientes.
Cuando es eficaz, Idebenona es un compuesto complementario preferido para usar en un metodo segun la presente divulgacion para mejorar el efecto terapeutico de terapia DMD, especialmente en el corazon.
Un aspecto de la presente divulgacion proporciona asf un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion a dicho individuo de un antioxidante y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
Una combinacion de un antioxidante y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional para uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso de un antioxidante y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde una protefna distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
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Dependiendo de la identidad del antioxidante, la persona experta conocera que cantidades son preferiblemente usadas.
Un antioxidante puede incluir bacosido, silimarina, curcumina, un polifenol, preferiblemente epigalocatequina-3- galato (EGCG).
Preferiblemente en la divulgacion, un antioxidante es una mezcla de antioxidantes como el complementar dietetico Protandim® (LifeVantage).
Una capsula diaria de 675mg de Protandim® comprende 150 mg de B. monniera (45% bacosidos), 225mg de S. marianum (70-80% silimarina), 150 mg de W. polvo de somnifera, 75mg de te verde (98% polifenoles donde 45% EGCG) y 75mg de curcuma (95% curcumina).
[0049] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con un inhibidor de canal ionico.
La presencia de membranas musculares danadas en DMD altera el pasaje de iones de calcio en las miofibras, y la homeostasis de calcio consecuentemente interrumpido activa muchas enzimas, por ejemplo proteasas, que causan dano adicional y necrosis muscular.
Canales ionicos que contribuyen directamente a la acumulacion patologica de calcio en el musculo distrofico son objetivos potenciales para compuestos complementarios para tratar DMD.
Existen pruebas de que algunos farmacos, tales como pentoxifilina, bloquean canales de calcio sensible al ejercicio32 y antibioticos que bloquean canales activados de extension reducen necrosis de miofibra en ratones mdx y niveles de creatina-cinasa en ninos con DMD 33.
Una forma de realizacion la divulgacion proporciona asf un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende la administracion a dicho individuo de un inhibidor de canal ionico y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
Una combinacion de un inhibidor de canal ionico y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional para su uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso de un inhibidor de canal ionico y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde una protefna distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
[0050] Preferiblemente en la divulgacion, inhibidores de canal ionico de la clase de xantinas se usan.
Mas preferiblemente, dichas xantinas son los derivados de metilxantinas, y de la forma mas preferible, dichos derivados de metilxantina son elegidos del grupo consistente en pentoxifilina, furafilina, isofilina, propentofilina, pentifilina, teofilina, torbafilina, albifilina, enprofilina y derivados de las mismas.
Muy preferido es el uso de pentoxifilina.
Inhibidores de canal ionico de la clase de xantinas mejoran la frecuencia de omision de un exon de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exon, cuando se usa un oligonucleotido dirigido hacia el exon o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exon.
La frecuencia de omision mejorada tambien aumenta el nivel de protefna distrofina funcional producida en una celula muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0051] Dependiendo de la identidad del inhibidor de canal ionico, la persona experta conocera que cantidades son preferiblemente usadas.
Dosificaciones adecuadas de pentoxifilina estan entre aproximadamente 1 mg/kg/dfa y aproximadamente 100 mg/kg/dfa, dosificaciones preferidas estan entre aproximadamente 10 mg/kg/dfa y 50 mg/kg/dfa.
Dosificaciones tfpicas usadas en seres humanos son 20 mg/kg/dfa.
[0052] En una forma de realizacion de la divulgacion, un inhibidor de canal ionico se administra a dicho individuo antes de la administracion de un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional.
En esta forma de realizacion, se prefiere que dicho inhibidor de canal ionico se administre al menos un dfa, mas preferido al menos una semana, mas preferido al menos dos semanas, mas preferido al menos tres semanas antes de la administracion de un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
[0053] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con un inhibidor de proteasa.
Calpafnas son proteasas activadas de calcio que se aumentan en el musculo distrofico y son responsables de la degeneracion de miofibra.
Inhibidores de calpaina tales como calpastatina, leupeptina34, calpeptina, inhibidor de calpaina III, o PD150606 son por lo tanto aplicados para reducir el proceso de degeneracion.
Un compuesto nuevo, BN 82270
(Ipsen) que tiene accion doble tanto como un inhibidor de calpaina como un aumento de la fuerza muscular antioxidante, disminuyo el suero CK y redujo la fibrosis del diafragma mdx, indicando un efecto terapeutico con este nuevo compuesto35.
Ademas compuesto de Leupeptina/Carnitina (Myodur) ha sido propuesto recientemente para ensayos clfnicos en pacientes con DMD.
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[0054] MG132 es ademas inhibidor proteasomico que ha mostrado reducir dano de membrana muscular, y mejorar las senales histopatologicas de distrofia muscular 36
MG-132 (CBZ-leucil-leucil-leucinal) es un inhibidor permeable a celulas proteasomico (Ki=4nM), que inhibe Activacion de nFkappaB evitando la degradacion de IkappaB (IC50 = 3 pM).
Ademas, es un peptido aldehfdo que inhibe proteolisis mediada por ubiquitina por union e inactivacion de proteasomas 20S y 26S.
MG-132 ha mostrado inhibir la degradacion proteasomica de protefnas asociadas a la distrofina en el modelo de raton mdx distrofico 36.
Este compuesto es asf tambien adecuado para su uso como un compuesto farmacologico complementario para DMD.
Ademas proporcionado en la divulgacion es por lo tanto un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion a dicho individuo de un inhibidor de proteasa y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
Una combinacion de un inhibidor de proteasa y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional para su uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso de un inhibidor de proteasa y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde una protefna distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Dependiendo de la identidad del inhibidor de proteasa, la persona experta conocera que cantidades son preferiblemente usadas.
[0055] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con L-arginina.
Falta de distrofina se une con la perdida del complejo DGC en las membranas de fibra, incluyendo sintasa de oxido nftrico neuronal (nNOS).
La expresion de un transgen en ratones mdx nNOS redujo en gran medida el dano de la membrana muscular.
De forma similar, administracion de L-arginina (el sustrato para sintasa de oxido nftrico) aumento produccion de NO y expresion de utrofina sobrerregulada en ratones mdx.
seis semanas de tratamiento con L-arginina mejoraron patologfa muscular y la disminucion de CK en suero en ratones mdx 37
El uso de L-arginina como una terapia complementaria en combinacion con un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional no ha sido descrito.
[0056] Ademas proporcionado en la divulgacion es por lo tanto un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion L-arginina a dicho individuo y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
Una combinacion de L-arginina y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional para su uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso de L-arginina y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde una protefna distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
[0057] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con bloqueador de receptor Losartana de angiotensina II tipo 1 que normaliza arquitectura muscular, reparacion y funcion, como se muestra en el modelo de raton mdx deficiente en distrofina 23
Un aspecto de la presente divulgacion proporciona asf un metodo para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion a dicho individuo del bloqueador de receptor Losartana de angiotensina II tipo 1,
y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
Una combinacion de bloqueador de receptor Losartana de angiotensina II tipo 1 y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional para su uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso para bloqueador de receptor Losartana de angiotensina II tipo 1 y un compuesto para suministrar a un individuo una protefna de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios sfntomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios sfntomas de una forma severa de BMD donde una protefna distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Dependiendo del bloqueador de receptor Losartana de angiotensina II tipo 1, la persona experta conocera que cantidades son preferiblemente usadas.
[0058] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se combina con un inhibidor de enzima de conversion de angiotensina (ECA), preferiblemente perindoprilo.
Inhibidores de la ACE son capaces de reducir la presion sangufnea.
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Iniciacion temprana de tratamiento con perindoprilo se asocia a una mortalidad inferior en pacientes con DMD 22 Un aspecto de la presente divulgacion proporciona asf un metodo para aliviar uno o varios smtomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, el metodo comprendiendo administracion a dicho individuo de un inhibidor ECA, preferiblemente perindoprilo, y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protema distrofina funcional.
Una combinacion de un inhibidor ECA, preferiblemente perindoprilo, y un compuesto para suministrar a un individuo una protema distrofina funcional para su uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso de un inhibidor ECA, preferiblemente perindoprilo, y un compuesto para suministrar a un individuo una protema de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios smtomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios smtomas de una forma severa de BMD donde una protema distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional.
Las dosis usuales de un inhibidor ECA, preferiblemente perindoprilo son aproximadamente de 2 a 4 mg/dfa 22.
[0059] En una forma de realizacion mas preferida de la divulgacion, un inhibidor ECA se combina con al menos uno de los compuestos complementario previamente identificados.
[0060] En otra forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto para suministrar a un individuo una protema distrofina funcional se combina con un compuesto que es capaz de aumentar la omision de exon y/o inhibir ensamblaje de espliceosoma y/o empalme.
Compuestos qmmicos pequenos, tales como por ejemplo derivados de indol espedfico, han mostrados que selectivamente cohiben ensamblaje y empalme de espliceosoma38, por ejemplo por interferencia con la union de protemas ricas en en arginina o serina (SR) para su potenciadores de empalme afines (ISE o ESE) y/o por interferencia con la union de represores de empalme para secuencias de silenciador (ESS o ISS).
Estos compuestos son por lo tanto adecuados para aplicar como compuestos complementarios que mejoran omision de exon.
[0061] Ademas proporcionado por la divulgacion es por lo tanto un metodo para aliviar uno o varios smtomas de distrofia muscular de Duchenne en un individuo, donde el metodo comprende administracion a dicho individuo de un compuesto para aumento de omision de exon y/o inhibicion de ensamblaje de espliceosoma y/o empalme, y un compuesto para suministrar a dicho individuo una protema distrofina funcional.
Una combinacion de un compuesto para aumento de omision de exon y/o inhibicion de ensamblaje de espliceosoma y/o empalme y un compuesto para suministrar a un individuo una protema distrofina funcional para su uso como un medicamento es tambien proporcionado en la divulgacion, al igual que un uso de un compuesto para aumento de omision de exon y/o inhibicion de ensamblaje de espliceosoma y/o empalme y un compuesto para suministrar a un individuo una protema de distrofina funcional para la preparacion de un medicamento para aliviar uno o varios smtomas de DMD.
En una forma de realizacion de la divulgacion, dicha combinacion se usa para aliviar uno o varios smtomas de una forma severa de BMD donde una protema distrofina muy corta se forma que no es suficientemente funcional. Dependiendo de la identidad del compuesto que es capaz de aumentar omision de exon y/o inhibir ensamblaje de espliceosoma y/o empalme, la persona experta conocera que cantidades son preferiblemente usadas.
En una forma de realizacion mas preferida de la divulgacion, un compuesto para aumento de omision de exon y/o inhibicion de ensamblaje de espliceosoma y/o empalme se combina con un inhibidor ECA y/o con cualquier compuesto complementario como identificados aqrn antes.
[0062] Un producto farmaceutico que comprende un compuesto para suministrar a un individuo una protema distrofina funcional, cualquiera de los compuestos complementario anteriormente mencionado, y un portador , relleno, conservante, adyuvante, solubilizador, diluyente y/o excipiente farmaceuticamente aceptable es tambien proporcionado.
Tal portador, relleno, conservante, adyuvante, solubilizador, diluyente y/o excipiente farmaceuticamente aceptable puede por ejemplo encontrarse en el Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
[0063] Por lo tanto, aqrn descrito es un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la invencion, donde dicho compuesto complementario comprende un esteroide, un inhibidor ECA (preferiblemente perindoprilo),bloqueador de receptor Losartana de angiotensina II tipo 1, un inhibidor (TNFa) de necrosis de tumor de factor-alfa, una fuente de mIGF-1, preferiblemente mIGF-1, un compuesto para aumento de expresion mIGF-1, un compuesto para aumento actividad mIGF-1, un antioxidante, un inhibidor de canal ionico, un inhibidor de proteasa, L-arginina y/o un compuesto para aumento de omision de exon y/o inhibicion de ensamblaje de espliceosoma y/o empalme.
Como se describe antes en la divulgacion, un individuo dispone de una protema distrofina funcional en varias maneras, por ejemplo por supresion de codon de terminacion por gentamicina o PTC12416,17, o por entrega de gen mediado por virus adeno-asociado (AAV) de un gen funcional de mini o micro-distrofina18-20.
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[0064] Preferiblemente, sin embargo, dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, para al menos en parte disminuir la produccion de una protefna de distrofina aberrante en dicho individuo.
Disminuir la produccion de una distrofina aberrante ARNm, o protefna distrofina aberrante, preferiblemente significa que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos de la cantidad inicial de distrofina aberrante ARNm, o protefna de distrofina aberrante, sigue siendo detectable por RT PCR (ARNm) o inmunofluorescencia o electrotransferencia (protefna).
Una distrofina aberrante ARNm o protefna es tambien denominada en este caso como una ARNm o protefna distrofina no funcional.
Una protefna distrofina no funcional es preferiblemente una protefna de distrofina que no es capaz de enlazar actina y/o miembros del complejo de protefna DGC.
Una protefna distrofina no funcional o distrofina ARNm tfpicamente no tiene o no codifica una protefna de distrofina con una C-terminal intacta de la protefna.
Dicho oligonucleotido preferiblemente comprende un antisentido oligorribonucleotido.
En una forma de realizacion preferida una tecnica de omision de exon es aplicada.
Omision de exon interfiere con los procesos de empalme natural que ocurren dentro de una celula eucariota.
En eucariotas mas altas la informacion genetica para protefnas en el ADN de la celula se codifica en exones que son separados entre sf por secuencias intronicas.
Estos intrones son en algunos muy largos.
La maquinaria de transcripcion de eucariotas genera un pre-ARNm que contiene tanto exones como intrones, mientras que la maquinaria de empalme, a menudo ya durante la produccion del pre-ARNm, genera la region de codificacion real de la protefna cortando y empalmando juntos los exones presentes en el pre-mRNA.
[0065] Omision de exon produce ARNm maduro que carece de al menos un exon omitido.
Asf, cuando dicho exon codifica para aminoacidos, omision de exon lleva a la expresion de un producto alterado. Tecnologfa para omision de exon es actualmente dirigida hacia el uso de oligonucleotidos antisentido (AON).
Mucho de este trabajo es hecho en el modelo de raton mdx para distrofia muscular de Duchenne.
El raton mdx, que lleva un mutacion sin sentido en el exon 23 del gen de distrofina, ha sido usado como un modelo animal de DMD.
A pesar de la mutacion mdx, que deberfa excluir la sfntesis de una protefna distrofina funcional, fibras positivas de distrofina raras de origen natural han sido observadas en el tejido muscular mdx.
Se piensa que estas fibras positivas de distrofina han surgido de un mecanismo de omision de exon aparentemente de origen natural, bien debido a mutaciones somaticas o a traves de empalme alternativo.
AON dirigidos hacia, respectivamente, el 3' y/o 5' sitios de empalme de intrones 22 y 23 en el pre-ARNm de distrofina, han mostrados interferir con factores normalmente implicados en la eliminacion de intron 23 de modo que tambien exon 23 fue quitado del mRNA3, 5 6 39, 40
[0066] Por la omision dirigida de un exon especffico, un fenotipo DMD se convierte en un mas suave fenotipo BMD. La omision de un exon es preferiblemente inducido por la union de AON dirigidos a unos o ambos de los sitios de empalme, o secuencias internas de exon.
Un oligonucleotido dirigido hacia una secuencia interna de exon tfpicamente exhibe ninguna superposicion con secuencias sin exon.
Preferiblemente no se superpone con los sitios de empalme al menos no en la medida en que estos estan presentes en el intron.
Un oligonucleotido dirigido hacia una secuencia interna de exon preferiblemente no contiene una secuencia complementario para un intron adyacente.
Ademas proporcionado es asf un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la invencion, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, para inclusion de inhibicion de un exon de un pre-ARNm de distrofina en el ARNm producido del empalme de dicho pre-ARNm.
Una tecnica de omision de exon es preferiblemente aplicada de manera que la ausencia de un exon de ARNm producida de pre-ARNm de distrofina genera una region de codificacion para una protefna distrofina funcional, sin embargo mas corta.
En este contexto, inhibir inclusion de un exon preferiblemente significa que la deteccion de la distrofina original aberrante ARNm es disminuida en al menos aproximadamente 10% como evaluado por RT-PCR o que una protefna distrofina aberrante correspondiente es disminuida en al menos aproximadamente 10% como evaluado por Inmunofluorescencia o analisis de electrotransferencia.
La reduccion es preferiblemente de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.
[0067] Una vez se preve un paciente de DMD con una protefna distrofina funcional, la causa de DMD es apartada. Por lo tanto, luego serfa previsto que los sfntomas de DMD sean suficientemente aliviados.
Sin embargo, como ya se ha descrito antes, la presente invencion proporciona la comprension de que, aunque tecnicas de omision de exon son capaces de proporcionar una protefna distrofina funcional, un sfntoma de dMd sigue siendo ademas aliviado por administracion a un paciente con DMD de un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para inflamacion de tejido muscular de reduccion, y/o un compuesto complementario para mejorar la funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular.
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Ademas, la presente invencion proporciona la comprension de que una terapia complementaria que contrarresta la inflamacion no afecta negativamente a la terapia de AON.
La presente invencion ademas proporciona la comprension de que la frecuencia de omision de un exon de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exon es mejorado, cuando se usa un oligonucleotido dirigido hacia el exon o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exon.
La frecuencia de omision mejorada tambien aumenta el nivel de protefna distrofina funcional producido en una celula muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0068] Ya que un exon de un pre-ARNm de distrofina solo sera incluido en el ARNm resultante cuando los sitios de empalme son reconocidos por el complejo de espliceosoma, sitios de empalme son objetivos obvios para AON.
Una forma de realizacion de la presente divulgacion por lo tanto proporciona un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a una region sin exon de una distrofina pre ARNm.
En una forma de realizacion de la divulgacion, se usa un AON que es unicamente complementario a una region sin exon de una distrofina pre ARNm.
Esto sin embargo no es necesario: es tambien posible usar un AON que comprende una secuencia especffica de intron asf como secuencia especffica de exon.
Tal AON comprende una secuencia que es complementaria a una region sin exon de una distrofina pre ARNm, al igual que una secuencia que es complementaria a una region de exon de una distrofina pre ARNm.
Por supuesto, un AON no es necesariamente complementario a la secuencia entera de un exon o intron de distrofina.
AON que son complementarios a una parte de tal exon o intron son preferidos.
Un AON es preferiblemente complementario a por lo menos parte de un exon de distrofina y/o intron, donde dicha parte tiene al menos 13 nucleotidos.
[0069] Empalme de un pre-ARNm de distrofina ocurre via dos reacciones de transesterificacion secuencial.
Primero, el 2'OH de un nucleotido de punto de derivacion especffico en el intron que se define durante ensamblaje de espliceosoma ejecuta un ataque nucleofflico en el primer nucleotido del intron en el 5' sitio de empalme que forma el lazo intermedio.
Segundo, el 3'OH del liberado 5' exon luego ejecuta un ataque nucleofflico en el nucleotido ultimo del intron en el 3' sitio de empalme juntando asf los exones y liberando el lazo de intron.
El punto de derivacion y sitios de empalme de un intron son asf implicados en un evento de empalme.
Por lo tanto, un oligonucleotido que comprende una secuencia que es complementaria hasta tal punto de derivacion y/o sitio de empalme es preferiblemente usado para omision de exon.
Ademas proporcionado es por lo tanto un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la divulgacion, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de empalme y/o punto de derivacion de una distrofina pre ARNm.
[0070] Ya que sitios de empalme contienen secuencias de consenso, el uso de un oligonucleotido o un equivalente funcional del mismo (aquf tambien llamado un AON) que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de empalme implica el riesgo de hibridacion promiscua.
Hibridacion de AON para otros sitios de empalme diferentes a los sitios del exon a ser omitido podrfan facilmente interferir con la exactitud del proceso de empalme.
Para superar estos y otros problemas potenciales relacionados con el uso de AON que son complementarios a una secuencia de intron, una forma de realizacion preferida de la divulgacion proporciona un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un exon de pre-ARNm de distrofina.
Preferiblemente, dicho AON es capaz de inhibir especfficamente una senal de inclusion de exon de al menos un exon en dicho pre-ARNm de distrofina.
Interferir con una senal de inclusion de exon (EIS) tiene la ventaja de que tales elementos se situan en el exon. Proporcionando un AON para que el interior del exon sea omitido, es posible interferir con la senal de inclusion de exon y asf eficazmente enmascarar el exon del equipo de empalme.
El fallo del equipo de empalme de reconocer el exon a ser omitido asf lleva a exclusion del exon del ARNm final.
Esta forma de realizacion no interfiere directamente con el proceso enzimatico de la maquinaria de empalme (la union de los exones).
Se piensa que esto permite que el metodo sea mas especffico y/o fiable.
Se piensa que un EIS es una estructura particular de un exon que permite a receptor y donador de empalme asumir una conformacion espacial particular.
En este concepto es la conformacion espacial particular lo que habilita la a maquinaria de empalme reconocer el exon.
Sin embargo, la divulgacion ciertamente no esta limitada a este modelo.
Se ha descubierto que agentes capaces de union a un exon son capaces de inhibicion de un EIS.
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Un AON puede especfficamente contactar dicho exon en cualquier punto y todavfa ser capaz de especfficamente inhibir dicho EIS.
[0071] Utilizando AON internos de exon especffico para una secuencia de exon 46, fuimos previamente capaces de modular el modelo de empalme en miotubos cultivados de dos pacientes con DMD diferentes con una supresion de exon 45 11.
Despues del tratamiento AON, exon 46 fue omitido, lo que resulto en un marco de lectura restaurado y la induccion de sfntesis de distrofina en al menos 75% de las celulas.
Hemos recientemente mostrado que omision de exon puede tambien ser inducida eficazmente en el control humano y series de pacientes con mutaciones diferentes, incluyendo supresiones, duplicaciones y mutaciones puntuales, para 39 exones DMD diferentes usando AONinterno de exon 1 2 1 -15.
[0072] Un equivalente funcional de un oligonucleotidos preferiblemente significa un oligonucleotido tal y como se define aquf donde uno o varios nucleotidos han sido sustituidos y donde una actividad de dicho equivalente funcional se retiene por lo menos hasta cierto punto.
Preferiblemente, una actividad de dicho equivalente funcional es proporcionar una protefna distrofina funcional.
Dicha actividad de dicho equivalente funcional es por lo tanto preferiblemente evaluada por cuantificacion de la cantidad de una protefna distrofina funcional.
Una distrofina funcional es aquf preferiblemente definida como una distrofina capaz de enlazar actina y miembros del complejo de protefna DGC.
La evaluacion de dicha actividad de un oligonucleotido es preferiblemente hecha por RT-PCR o por Inmunofluorescencia o analisis de electrotransferencia.
Dicha actividad es preferiblemente retenida por lo menos hasta cierto punto cuando representa al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70% o al menos 80% o al menos 90% o al menos 95% o mas de actividad correspondiente de dicho oligonucleotido del cual el equivalente funcional deriva.
En todo esta aplicacion, cuando la palabra oligonucleotido se usa se puede sustituir por un equivalente funcional del mismo tal y como se define aquf.
[0073] Por lo tanto, el uso de un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende o consistente en una secuencia que es complementaria a un exon de pre-ARNm de distrofina proporciona buenos resultados anti- DMD.
Se usa un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria a por lo menos parte de exon de pre-ARNm de distrofina 2, 8, 9, 17, 19, 29, 40-46, 48-53, 55 o 59, donde dicha parte tiene al menos 13 nucleotidos.
Sin embargo, dicha parte tambien puede tener al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos.
[0074] De la forma mas preferible en la divulgacion se usa un AON que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria a por lo menos parte de exon de pre-ARNm de distrofina 51, 44, 45, 53, 46, 43, 2, 8, 50 y/o 52, donde dicha parte tiene al menos 13 nucleotidos.
Sin embargo, dicha parte tambien puede tener al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos.
Muchos oligonucleotidos preferidos de la divulgacion se identifican por cada uno de las siguientes secuencias SEC ID NO: 3 a SEC ID n.°: 284.
Por consiguiente, un oligonucleotido mas preferido como usado en la divulgacion se representa por una secuencia de SEC ID NO:3 a SEC ID NO:284.
Un oligonucleotido mas preferido como usados en la divulgacion es seleccionado del grupo consistente en SEC ID NO:3 a NO:284.
El oligonucleotido antisentido de la invencion comprende una secuencia que es complementaria a una parte de pre- ARNm de distrofina de exon humano 51 y dicho oligonucleotido se representa por SEC ID NO:204.
[0075] Dichos exones se enumeran en el orden decreciente de aplicabilidad de poblacion de pacientes.
Por lo tanto, el uso de un AON que comprende una secuencia que es complementaria a por lo menos parte de distrofina pre-exon de ARNm 51 es adecuado para uso en una parte mas grande de la poblacion de pacientes con DMD en comparacion con un AON que comprende una secuencia que es complementaria a exon de pre-ARNm de distrofina 44, etcetera.
[0076] En una forma de realizacion preferida, un oligonucleotido de la divulgacion que comprende una secuencia que es complementaria a parte de distrofina pre-ARNm es tal que la parte complementaria es al menos 50% de la longitud del oligonucleotido de la invencion, mas preferiblemente al menos 60%, aun mas preferiblemente al menos 70%, aun mas preferiblemente al menos 80%, aun mas preferiblemente al menos 90% o aun mas preferiblemente al menos 95%, o aun mas preferiblemente 98% o mas.
En una forma de realizacion mas preferida de la divulgacion, el oligonucleotido consiste en una secuencia que es complementaria a parte de distrofina pre-ARNm tal y como se define aquf.
Por ejemplo, un oligonucleotido puede comprender una secuencia que es complementaria a parte de distrofina pre- ARNm tal y como se define aquf y secuencias flanqueantes adicionales.
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En una forma de realizacion mas preferida de la divulgacion, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleotido es de al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 nucleotidos. Preferiblemente en la divulgacion, secuencias flanqueantes adicionales se utilizan para modificar la union de una protefna al oligonucleotido, o para modificar una propiedad termodinamica del oligonucleotido, mas preferiblemente para modificar afinidad de union de ARN objetivo.
[0077] Una forma de realizacion preferida de la divulgacion proporciona un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la invencion, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende:
- una secuencia que es complementaria a una region de un exon de pre-ARNm de distrofina que se hibridiza a otra parte de un exon de pre-ARNm de distrofina (estructura cerrada), y
- una secuencia que es complementaria a una region de un exon de pre-ARNm de distrofina que no se hibridiza en dicho pre-ARNm de distrofina (estructura abierta).
[0078] Para esta forma de realizacion, se hace referencia a nuestra solicitud de patente WO 2004/083432.
Moleculas ARN muestran estructuras secundarias fuertes, en su mayorfa debido a emparejamiento de base de extensiones complementarias o parcialmente complementarias en el mismo ARN.
Se ha pensado desde hace mucho tiempo que estructuras en el ARN juegan un papel en la funcion del ARN.
Sin pretender imponer ninguna teorfa, se cree que la estructura secundaria del ARN de un exon juega un papel en la estructuracion de del proceso de empalme.
A traves de su estructura, un exon es reconocido como una parte que necesita de incluida en el ARNm.
Aquf esta funcion de senalizacion es referida como una senal de inclusion de exon.
Un oligonucleotido complementario de esta forma de realizacion es capaz de interferir con la estructura del exon y es asf capaz de interferir con la senal de inclusion de exon del exon.
Se ha descubierto que muchos oligonucleotidos complementarios de hecho comprenden esta capacidad, algunos mas eficaces que otros.
Oligonucleotidos de esta forma de realizacion preferida, es decir aquellos con dicha superposicion dirigidos hacia estructuras abiertas y cerradas en el exon nativo ARN, son una seleccion de todos los oligonucleotidos posibles.
La seleccion abarca oligonucleotidos que pueden interferir eficazmente con una senal de inclusion de exon.
Sin pretender imponer ninguna teorfa se piensa que la superposicion con una estructura abierta mejora la eficiencia de invasion del oligonucleotido (es decir aumenta la eficiencia con la cual el oligonucleotido puede introducir la estructura), mientras que el recubrimiento con la estructura cerrada aumenta posteriormente la eficiencia de interferencia con la estructura secundaria del ARN del exon, y asf interfieren con la senal de inclusion de exon.
Se ha descubierto que la longitud de la complementariedad parcial para la estructura abierta y cerrada no es extremadamente restringida.
Tenemos rendimientos altos observados con oligonucleotidos con longitudes variables de complementariedad en cualquiera de estas estructura.
El termino complementariedad se utiliza en este caso para referirse a una extension de acidos nucleicos que pueden hibridar otra extension de acidos nucleicos bajo condiciones fisiologicas.
Es asf no absolutamente requerido que todas las bases en la region de complementariedad sean capaces de emparejar con bases en la cadena opuesta.
Por ejemplo, al disenar del oligonucleotido uno puede querer incorporar por ejemplo un residuo que no empareja base con la base en la cadena complementaria.
Incompatibilidades pueden hasta cierto punto ser permitidas, si dadas las circunstancias en la celula, la extension de nucleotidos es capaz de hibridacion a la parte complementaria.
En una forma de realizacion preferida de la divulgacion una parte complementaria (bien a dicha estructura abierto o a dicha estructura cerrada) comprende al menos 3, y mas preferiblemente al menos 4, nucleotidos consecutivos.
Las regiones complementarias son preferiblemente disenadas de manera que, cuando combinadas, son especfficas para el exon en el pre-ARNm.
Tal especificidad se puede crear con varias longitudes de regiones complementarias ya que esta depende de las secuencias reales en otros (pre) ARNm en el sistema.
El riesgo de que tambien uno o varios otros pre-ARNm sera capaz de hibridar al oligonucleotido disminuye al aumentar el tamano del oligonucleotido.
Es claro que oligonucleotidos que comprenden incompatibilidades en la region de complementariedad pero que retienen la capacidad de hibridar a la region objetivo en el pre-ARNm, pueden ser usados.
Sin embargo, preferiblemente al menos las partes complementarias no comprenden tales incompatibilidades ya que estas tfpicamente tienen una eficiencia mas alta y una especificidad mas alta, que oligonucleotidos con tales incompatibilidades en unas regiones complementarias.
Se piensa que fuerzas de hibridacion mas altas, (es decir, aumentando numero de interacciones con la cadena opuesta) son favorables para aumentar la eficiencia del proceso de interferencia con la maquinaria de empalme del sistema.
Preferiblemente, la complementariedad es entre 90 y 100%.
En general esto permite aproximadamente 1 o 2 incompatibilidades16 en un oligonucleotido de alrededor de 20 nucleotidos.
[0079] La estructura secundaria es mejor analizada en el contexto del pre-ARNm donde el exon reside.
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Tal estructura se puede analizar en el ARN real.
Sin embargo, es actualmente posible predecir bastante bien la estructura secundaria de una molecula de ARN (con costes de energfa mfnimos), usando programas de modelado de estructura.
Un ejemplo no limitativo de un programa adecuado es ARN mfold version 3.1 server41.
Un experto en la tecnica sera capaz de predecir, con reproducibilidad adecuada, una estructura posible del exon, dada la secuencia de nucleotidos.
Mejores predicciones se obtienen cuando se proporciona tal programa de modelacion con tanto el exon como secuencias de intrones flanqueantes.
Es tfpicamente no necesario modelar la estructura del pre-ARNm entero.
[0080] Las estructuras abierta y cerrada a las que el oligonucleotido es dirigido, son preferiblemente adyacentes una a la otra.
Se piensa que de esta manera el recocimiento del oligonucleotido a la estructura abierta induce abertura de la estructura cerrada a partir de lo cual el recocimiento progresa a esta estructura cerrada.
A traves de esta accion la estructura previamente cerrada asume una conformacion diferente.
La conformacion diferente produce la interrupcion de la senal de inclusion de exon.
Sin embargo, cuando secuencias aceptoras (crfptico) de empalme y/o donantes potenciales estan presentes en el exon dirigido, ocasionalmente una senal de inclusion de exon nueva es generada definiendo un (neo) exon diferente, es decir con un diferente 5' extremo, un diferente 3' extremo, o ambos.
Este tipo de actividad esta dentro del campo de la presente divulgacion ya que el exon dirigido es excluido del ARNm.
La presencia de un exon nuevo, que contiene parte del exon dirigido, en el ARNm no altera el hecho de que el exon dirigido, como tal, es excluido.
La inclusion de un neoexon puede verse como un efecto secundario que ocurre solo ocasionalmente.
Hay dos posibilidades cuando la omision de exon se utiliza para devolver (parte de) un marco de lectura abierto de distrofina que es interrumpido como resultado de una mutacion.
Una es que el neoexon es funcional en la restauracion del marco de lectura, mientras que en el otro caso el marco de lectura no es restaurado.
Al seleccionar los oligonucleotidos para restaurar los marcos de lectura de distrofina mediante omision de exon es por supuesto claro que bajo estas condiciones solo se seleccionan aquellos oligonucleotidos que de hecho resultan en omision de exon que restaura el marco de lectura abierto de distrofina, con o sin un neoexon.
[0081] Ademas proporcionado es un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la divulgacion, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de union para una protefna arginina de serina (SR) en el ARN de un exon de un pre-ARNm de distrofina.
En nuestra solicitud de patente WO 2006/112705 hemos descrito la presencia de una correlacion entre la efectividad de un oligonucleotido antisentido interno de exon (AON) en la omision de exon de induccion y la presencia de un sitio de union SR predicho (por ejemplo por ESEfinder) en el sitio de pre-ARNm objetivo de dicho AON.
Por lo tanto, en una forma de realizacion de la divulgacion un oligonucleotido es generado comprendiendo determinacion de un sitio de union (putativa) para una protefna SR (Ser-Arg) en el ARN de un exon de distrofina y produciendo un oligonucleotido que es complementario a dicho ARN y que al menos parcialmente se superpone a dicho sitio de union (putativo).
El termino "al menos parcialmente se superpone" es definido aquf para comprender una superposicion de solo un unico nucleotido de un sitio de union SR al igual que nucleotidos multiples de dicho sitio de union al igual que una superposicion completa de dicho sitio de union.
Esta forma de realizacion preferiblemente comprende ademas determinacion de una estructura secundaria de dicho ARN, una region que se hibrida a otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una region que es no hibridada en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente genera un oligonucleotido que al menos parcialmente superpone dicho (putativo) sitio de union y que superpone al menos parte de dicha estructura cerrada y superpone al menos parte de dicha estructura abierta.
De esta manera aumentamos la oportunidad de obtencion de un oligonucleotido que es capaz de interferir con la inclusion de exon del pre-ARNm en el ARNm.
Es posible que una primera region de union SR seleccionado no tiene la estructura cerrada-abierta solicitada en cuyo caso ademas (segundo) sitio de union a protefnas SR se selecciona que es luego posteriormente evaluado para la presencia de una estructura cerrada-abierta.
Este proceso es continuo hasta que una secuencia se identifica que contiene un sitio de union a protefnas SR al igual que una (parcialmente superpuesta) estructura cerrada-abierta.
Esta secuencia es luego usada para disenar un oligonucleotido que es complementario a dicha secuencia.
[0082] Tal metodo para generar un oligonucleotido es tambien realizado por inversion del orden descrito, es decir primero generando un oligonucleotido que comprende determinacion, de una estructura secundaria de ARN de un exon de distrofina, una region que asume una estructura que se hibrida para otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una region que es no hibridada en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente generando un oligonucleotido, del cual al menos una parte de dicho oligonucleotido es complementaria a dicha estructura cerrada y del cual al menos otra parte de dicho oligonucleotido es complementaria a dicha estructura abierta.
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Este es luego seguido de determinacion si un sitio de union a SR protefnas al menos superposiciona con dicha estructura abierta/cerrada.
De esta manera el metodo de WO 2004/083432 es mejorado.
En otra forma de realizacion de la divulgacion las selecciones son realizadas simultaneamente.
[0083] Sin desear quedar limitado por ninguna teorfa es actualmente pensado que el uso de un oligonucleotido dirigido a un sitio de union a SR protefnas resulta (al menos parcialmente) en perjudicar la union de una SR protefna al sitio de union de una SR protefna que produce empalme interrumpido o perjudicado.
[0084] Preferiblemente, una estructura abierta/cerrada y un sitio de union a protefnas SR parcialmente se superponen e incluso mas preferido una estructura abierta/cerrada superpone completamente un sitio de union a protefnas SR o un sitio de union a protefnas SR superpone completamente una estructura abierta/cerrada.
Esto permite una interrupcion mejorada de inclusion de exon.
[0085] Ademas secuencias de sitios de empalme de consenso, muchos (si no todos) exones contienen secuencias reguladoras de empalme tal como secuencias de empalme exonico intensificador (ESE) para facilitar el reconocimiento de sitios de empalme genuinos por la espliceosoma 42,43.
Un subgrupo de factores de empalme, llamado protefnas SR, pueden enlazar con estos ESE y reclutar otros factores de empalme, tales como U1 y U2AF a sitios de empalme (debilmente definidos).
Los sitios de union de las cuatro mas abundantes protefnas SR (SF2/ASF, SC35; SRp40 y SRp55) han sido analizados en detalle y estos resultados se iimplementan en ESEfinder, una fuente de Internet que predice sitios de union potenciales para estas protefnas SR 42, 4 .
Hay una correlacion entre la eficacia de un AON y la presencia/ausencia de un sitio de union SF2/ASF, SC35 y SRp40.
En una forma de realizacion preferida, la divulgacion asf proporciona un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico como se ha descrito anteriormente, donde dicha protefna SR es SF2/ASF o SC35 o SRp40.
[0086] En una forma de realizacion de la divulgacion, se proporciona a un paciente con DMD una protefna distrofina funcional usando un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que es capaz de especfficamente unir una secuencia de ARN regulador que se requiere para el empalme correcto de un exon de distrofina en una transcripcion.
Diferentes secuencias de ARN que actuan en cis se requieren para el empalme correcto de exones en una transcripcion.
En particular, elementos suplementarios tales como potenciadores de empalme intronico o exonico (ISE y ESE) o silenciadores (ISS y ESE) se identifican por ajustar empalme especffico y eficaz de exones constitutivos y alternativos.
Usando oligonucleotidos antisentido especfficos de secuencia (AON) que enlazan con los elementos, su funcion reguladora es perturbada de modo que el exon es omitido, como se muestra para DMD.
Por lo tanto, en una forma de realizacion preferida de la divulgacion, un equivalente oligonucleotido o funcional del mismo se usa que es complementario a un empalme intronico intensificador (ISE), un empalme exonico intensificador (ESE), un silenciador de empalme intronico (ISS) y/o un silenciador de empalme exonico (ESS).
Como ya descrito aquf antes, un exon de distrofina es en una forma de realizacion preferida omitido por un agente capaz de inhibir especfficamente una senal de inclusion de exon de dicho exon, de modo que dicho exon no se reconoce por la maquinaria de empalme como una parte que necesita ser incluida en el ARNm.
Como resultado, un ARNm sin dicho exon es formado.
[0087] Un AON usado en un metodo de la presente divulgacion es preferiblemente complementario a una parte consecutiva de entre 13 y 50 nucleotidos de exon de distrofina ARN o intron de distrofina ARN.
En una forma de realizacion un AON usado en un metodo de la presente divulgacion es complementario a una parte consecutiva de entre 16 y 50 nucleotidos de un exon de distrofina ARN o intron de distrofina ARN.
Preferiblemente, dicho AON es complementario a una parte consecutiva de entre 15 y 25 nucleotidos de dicho exon ARN.
Mas preferiblemente, un AON se usa que comprende una secuencia que es complementaria a una parte consecutiva de entre 20 y 25 nucleotidos de un exon de distrofina ARN o un intron de distrofina ARN.
[0088] Diferentes tipos de acido nucleico se pueden utilizar para generar el oligonucleotido.
Preferiblemente, dicho oligonucleotido comprende ARN, ya que hfbridos de ARN/ARN son muy estable.
Ya que uno de los objetivos de la tecnica de omision de exon es dirigir el empalme en sujetos se prefieren que el ARN oligonucleotido comprende una modificacion que proporciona el ARN con una propiedad adicional, por ejemplo resistencia para endonucleasas y RNaseH, fuerza de hibridacion adicional, estabilidad aumentada (por ejemplo en un fluido corporal), flexibilidad aumentada o disminuida, toxicidad reducida, transporte intracelular aumentado, especificidad de tejido, etc. Preferiblemente dicha modificacion comprende una modificacion oligorribonucleotida 2'- O-metil-fosforotioato.
Preferiblemente dicha modificacion comprende un modificacion de oligodesoxirribonucleotido de fosforotioato 2'-O- metilo.
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Una forma de realizacion asf proporciona un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la invencion, donde un oligonucleotido se usa que comprende ARN que contiene una modificacion, preferiblemente una ribosa modificada de 2'-0-metilo (ARN) o modificacion de deoxiribosa (ADN).
[0089] En una forma de realizacion de la divulgacion proporciona un oligonucleotido hfbrido comprendiendo un oligonucleotido que comprende una modificacion de 2'-0-metil-fosforotioato de oligo(deoxi)ribonucleotido y acido nucleico bloqueado.
Esta combinacion particular comprende mejor especificidad de secuencia en comparacion con un equivalente consistente en acido nucleico bloqueado, y comprende efectividad mejorada cuando comparada con un oligonucleotido consistente en modificacion ribonucleotida 2'-0-metil-fosforotioato oligo(deoxi).
[0090] Con el descubrimiento de tecnologfa de imitacion de acido nucleico se ha hecho posible generar moleculas que tienen una caracterfsticas de hibridacion similar, preferiblemente igual, en especie, no necesariamente en la cantidad como acido nucleico mismo.
Tales equivalentes funcionales son por supuesto tambien adecuadas para usar en un metodo de la divulgacion.
[0091] Ejemplos preferidos de equivalentes funcionales de un oligonucleotido son acido nucleico de peptido y/o acido nucleico bloqueado.
De la forma mas preferible, una fosforodiamidada de morfolino se usa.
Ejemplos no limitativos adecuados pero de equivalentes de oligonucleotidos de la invencion se pueden encontrar en
Hfbridos entre uno o varios de los equivalentes entre ellos y/o junto con acido nucleico son por supuesto tambien adecuados.
En una forma de realizacion preferida de la divulgacion, acido nucleico bloqueado se usa como un equivalente funcional de un oligonucleotido, ya que acido nucleico bloqueado muestra una afinidad objetivo mas alta y toxicidad reducida y por lo tanto muestra una eficiencia mas alta de omision de exon.
[0092] En una forma de realizacion de la divulgacion un oligonucleotido, o un equivalente funcional del mismo, que es capaz de inhibir inclusion de un exon de distrofina en la distrofina ARNm se combina con al menos otro oligonucleotido, o equivalente funcional del mismo, que es capaz de inhibir inclusion de otro exon de distrofina en la distrofina ARNm.
De esta manera, inclusion de dos o mas exones de un pre-ARNm de distrofina en el ARNm producido de este pre- ARNm es evitada.
Esta forma de realizacion de la divulgacion es posteriormente referida como omision doble o multi-exon2,15.
En la mayorfa de los casos omision de exon doble produce la exclusion de solo los dos exones objetivo del pre- ARNm de distrofina.
Sin embargo, en otros casos se ha observado que los exones objetivo y toda la region en medio de dichos exones en dicho pre-ARNm no estaban presentes en el ARNm producido incluso cuando otros exones (exones de intervencion) estaban presentes en tal region.
Esta multi-omision fue sobre todo asf para la combinacion de oligonucleotidos derivados del gen DMD, donde un oligonucleotido para exon 45 y un oligonucleotido para exon 51 se anadio a una celula que transcribe el gen de DMD.
Tal configuracion resulto en el ARNm que no contenfa exones 45 a 51 siendo producido.
Aparentemente, la estructura del pre-ARNm en presencia de los oligonucleotidos mencionados fue tal que la maquinaria de empalme fue estimulada para conectar exones 44 y 52 entre si.
[0093] Ademas proporcionado es por lo tanto un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la divulgacion, donde una secuencia de nucleotidos se usa que comprende al menos 8, preferiblemente entre 16 y 80, nucleotidos consecutivos que son complementarios a un primer exon de un pre-ARNm de distrofina y donde se usa una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleotidos consecutivos que son complementarios a un segundo exon de dicho pre-ARNm de distrofina.
[0094] En una forma de realizacion preferida de la divulgacion dicho primer y dicho segundo exon son separados en dicho pre-ARNm de distrofina por al menos un exon al que dicho oligonucleotido no es complementario.
[0095] Segun la divulgacion, es posible especfficamente promover la omision de tambien los exones de intervencion mediante una conexion entre los dos oligonucleotidos complementarios.
Por lo tanto, en una forma de realizacion extensiones de nucleotidos complementarios a por lo menos dos exones de distrofina se separan por una fraccion de conexion.
Al menos dos extensiones de nucleotidos son asf enlazados en esta forma de realizacion para formar una unica molecula.
Ademas proporcionado es por lo tanto un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la divulgacion donde dicho oligonucleotido, o equivalente funcional del mismo, para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional es complementario a por lo menos dos exones en un pre-ARNm de distrofina, donde dicho equivalente oligonucleotido o funcional comprende al menos dos partes donde una primera parte comprende un oligonucleotido teniendo al menos 8, preferiblemente entre 16 y 80, nucleotidos consecutivos que son
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complementarios a un primero de dicho al menos dos exones y donde una segunda parte comprende un oligonucleotido con al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleotidos consecutivos que son complementarios a un segundo exon en dicho pre-ARNm de distrofina.
Segun la divulgacion, la conexion puede ser a traves de cualquier medio pero es preferiblemente realizada a traves de una conexion de nucleotido.
En este ultimo caso el numero de nucleotidos que no contienen un recubrimiento entre uno u otro exon complementario pueden ser cero, pero es preferiblemente entre 4 a 40 nucleotidos.
La fraccion de conexion puede ser cualquier tipo de fraccion capaz de conectar oligonucleotidos.
Preferiblemente en la divulgacion, dicha fraccion de conexion comprende al menos 4 nucleotidos de uracilo. Actualmente, muchos compuestos diferentes estan disponibles que imitan caracterfsticas de hibridacion de oligonucleotidos.
Tal compuesto, llamado aquf un equivalente funcional de un oligonucleotido, es tambien adecuado para la presente divulgacion si tal equivalente comprende en especie caracterfsticas de hibridacion similares no necesariamente en la cantidad.
Equivalentes funcionales adecuados son mencionados antes en esta descripcion.
Tal y como se menciona, oligonucleotidos de la divulgacion no tienen que consistir en solo oligonucleotidos que contribuyen a la hibridacion al exon objetivo.
Puede haber material adicional y/o nucleotidos anadidos.
[0096] El gen de DMD es un gen grande, con muchos exones diferentes.
Considerando que el gen se localiza en el cromosoma X, son en sus mayorfa ninos los que son afectados, aunque ninas tambien pueden ser afectadas por la enfermedad, ya que puede recibir una copia mala del gen de ambos padres, o padecen de una inactivacion particularmente diagonal del alelo funcional debido a una inactivacion particularmente sesgada de cromosoma X en sus celulas musculares.
La protefna es codificada por una pluralidad de exones (79) en una gama de al menos 2,6 Mb.
Defectos pueden ocurrir en cualquier parte del gen de DMD.
Omision de un exon particular o exones particulares pueden, muy a menudo, suponer un ARNm reestructurado que codifica una protefna distrofina mas corta de los normal pero al menos parcialmente funcional.
Un problema practico en el desarrollo de un medicamento basado en tecnologfa de omision de exon es la pluralidad de mutaciones que pueden suponer una deficiencia en la protefna distrofina funcional en la celula.
A pesar del hecho de que ya varias mutaciones se pueden corregir mediante la omision de un unico exon, esta
pluralidad de mutaciones requiere la generacion de un gran numero de diferentes farmacos en cuanto a exones
diferentes de mutaciones diferentes necesitan ser omitidos.
Una ventaja de un compuesto capaz de inducir omision de dos o mas exones, es que mas de un exon se puede omitir con un unico farmaco.
Esta propiedad no es solo practicamente muy util en que solo un numero limitado de farmacos necesita ser
generado para tratar muchas mutaciones de DMD diferentes o de BMD particulares severas.
Otra opcion ahora abierto al experto en la tecnica es escoger protefnas de distrofina reestructurada particularmente funcional y producir compuestos capaces de generador estas protefnas de distrofina preferidas.
Tales resultados finales preferidos son ademas referidos como distrofinas de fenotipo moderado.
[0097] Cada compuesto, un oligonucleotido y/o un compuesto complementario tal y como se define aquf para uso segun la presente divulgacion se puede adecuar para administracion directa a una celula, tejido y/o un organo in vivo de individuos afectados o a riesgo de desarrollar DMD o BMD, y se puede administrar directamente in vivo, ex vivo o in vitro.
[0098] Alternativamente, medios adecuados para suministrar celulas con un oligonucleotido o equivalente de los mismos estan presentes en la tecnica. Un equivalente oligonucleotido o funcional del mismo puede por ejemplo ser proporcionado a una celula en forma de un vector de expresion donde el vector de expresion codifica una transcripcion que comprende dicho oligonucleotido.
El vector de expresion es preferiblemente introducido en la celula via un vehfculo de entrega de gen.
Un vehfculo de entrega preferido es un vector vfrico tal como un vector viral adeno-asociado (AAV) o un vector retrovfrico tal como un vector lentivirus 4 51,52 y similar.
Tambien plasmidos, cromosomas artificiales, plasmidos adecuados para recombinacion homologa dirigida e integracion en el genoma humano de celulas pueden ser adecuadamente aplicados para entrega de un oligonucleotido tal y como se define aquf.
Preferido para la actual divulgacion son aquellos vectores donde transcripcion es conducida de promotores Pollll, y/o donde transcripciones estan en las fusiones de forma con transcripciones U1 o U7, que producen buenos resultados entregando transcripciones pequenas.
Esta en la habilidad del artesano disenar transcripciones adecuadas.
Preferido son transcripciones conducidas por Pollll.
Preferiblemente en forma de una transcripcion de fusion con una transcripcion Ulor U7 4 51, 52 Tales fusiones se pueden generar como se describe 53, 54 El oligonucleotido se puede entregar como es.
Sin embargo, el oligonucleotido tambien puede ser codificado por el vector vfrico.
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Tfpicamente esto es en forma de un transcrito de ARN que comprende la secuencia del oligonucleotido en una parte de la transcripcion.
[0099] Mejoras en medios para suministrar celulas con un oligonucleotido o equivalente de las mismas, son anticipadas considerando el avance que ya ha sido hasta ahora conseguido.
Tales mejoras futuras pueden por supuesto ser incorporadas para conseguir el efecto mencionado en la reestructuracion de ARNm que utiliza un metodo de la divulgacion.
[0100] El oligonucleotido o equivalente del mismo se puede entregar como es a las celulas.
Al administrar el oligonucleotido o equivalente del mismo a un individuo, se prefiere que el oligonucleotido sea disuelto en una solucion que es compatible con el metodo de entrega.
Para administracion intravenosa, subcutanea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular se prefiere que la solucion sea una solucion salina fisiologica.
Particularmente preferido para un metodo de la divulgacion es el uso de un excipiente que ayudara en la entrega de un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario a una celula y en una celula, preferiblemente una celula muscular.
Preferidos son excipientes capaces de formar complejos, vesfculas y/o liposomas que entregan tal compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario complejo o retenido en una vesfcula o liposoma a traves de una membrana celular.
Muchos de estos excipientes se conocen en la tecnica. Excipientes adecuados comprenden polietilenimina (PEI), o polfmeros cationicos similares, incluyendo polipropilenimina o copolfmeros de polietilenimina (PECs) y derivados, ExGen 500, anfifilos sinteticos (SAINT-18), lipofectinTM, proteinas capsidas DOTAP y/o vfricas que son capaces de auto ensamblaje en partfculas que pueden entregar tales compuestos, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario tal y como se define aquf a una celula, preferiblemente una celula muscular.
Tales excipientes han mostrados eficazmente entregar (oligonucleotido tal como antisentido) acidos nucleicos a una amplia variedad de celulas cultivadas, incluyendo celulas musculares.
Su potencial de transfeccion alta se combina con una toxicidad exceptuada de baja a moderada en cuanto a supervivencia de celula total.
La facilidad de modificacion estructural puede utilizarse para permitir otras modificaciones y el analisis de sus ademas (en vivo) caracterfsticas de transferencia de acido nucleico y toxicidad.
[0101] Lipofectina representa un ejemplo de un agente de transfeccion liposomica.
Consiste en dos componentes lfpidicos, un lfpido cationico N-[1-(2,3 dioleoiloxi)propil]-N,N,Cloruro de n- trimetilamonio (DOTMA) (cp.
DOTAP que es la sal de metilsulfato) y una dioleoilfosfatidiletanolamina de lfpido neutral (DOPE).
El componente neutral media la liberacion intracelular.
Otro grupo de sistemas de entrega son nanopartfculas polimericas.
[0102] Policationes tales como dietilaminoetilaminoetilo DEAE)-dextrano, que son bien conocidas como reactivo de transfeccion de ADN se puede combinar con butilcianoacrilato (PBCA) y hexilcianoacrilato (PHCA) para formular nanopartfculas cationicas que pueden entregar un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario a traves de membranas celulares en celulas.
[0103] Ademas de estos materiales de nanopartfcula comunes, la protamina de peptido cationico ofrece un metodo alternativo para formular un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario como coloides.
Este sistema de nanopartfcula coloidal puede formar asf llamados proticles, que se puede preparar por un simple proceso de autoensamblaje para embalaje y mediar liberacion intracelular de un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario.
La persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera del anterior u otros excipientes alternativos disponibles comercialmente y sistemas de entrega para embalaje y entrega de un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario para su uso para entregar dicho compuesto para el tratamiento de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en seres humanos.
[0104] Ademas, un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario podrfa ser de manera covalente o de manera no covalente enlazado a un ligando de objetivo especfficamente disenado para facilitar la comprension en la celula, citoplasma y/o su nucleo.
Tal ligando podrfa comprender (i) un compuesto (incluyendo pero no limitado a estructuras de peptidos o tipo peptido) reconociendo elementos especfficos de celula, tejido u organo facilitando consumo celular y/o (ii) un compuesto qufmico capaz de facilitar la absorcion en celulas y/o la liberacion intracelular de un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario de vesfculas, por ejemplo endosomas o lisosomas.
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[0105] Por lo tanto, en una forma de realizacion preferida de la divulgacion, un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementary se formulan en un medicamento que dispone de al menos un excipiente y/o un ligando objetivo para entrega y/o un dispositivo de entrega de dicho compuesto a una celula y/o aumentando su entrega intracelular.
Por consiguiente, la presente divulgacion tambien abarca una composicion farmaceuticamente aceptable que comprende un compuesto tal y como se define aquf, preferiblemente un oligonucleotido y opcionalmente junto con un compuesto complementario y ademas que comprende al menos un excipiente y/o un ligando objetivo para entrega y/o un dispositivo de entrega de dicho compuesto a una celula y/o aumentando su entrega intracelular.
Debe entenderse que un oligonucleotido y un compuesto complementario no se puede formular en una composicion o preparacion unica.
Dependiendo de su identidad, la persona experta conocera que tipo de formulacion es el mas apropiado para cada compuesto.
[0106] En una forma de realizacion preferida la divulgacion proporciona un kit de partes que comprende un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional y un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir inflamacion de tejido muscular , y/o un compuesto complementario para mejorar la funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular.
[0107] En una forma de realizacion preferida de la divulgacion, una concentracion de un oligonucleotido tal y como se define aquf, que oscila entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 1 pM, se usa.
Mas preferiblemente, la concentracion usada oscila entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 400 nM, aun mas preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200 nM.
Si diferentes oligonucleotidos se usan, esta concentracion puede referirse a la concentracion total de oligonucleotidos o la concentracion de cada oligonucleotido anadido.
Las gamas de concentracion de oligonucleotidos como dadas arriba son concentraciones preferidas para usos in vitro o ex vivo.
La persona experta entendera que dependiendo del oligonucleotidos usado, la celula objetivo a ser tratada, el gen objetivo y sus niveles de expresion, el medio usado y la transfeccion y condiciones de incubacion, la concentracion de oligonucleotidos usado puede variar ademas y puede necesitar ser optimizada ademas.
[0108] Mas preferiblemente, un compuesto, preferiblemente un oligonucleotido y un compuesto complementario para usarse para prevenir o tratar DMD o BMD, es sinteticamente producido y administrado directamente a una celula, un tejido, un organo y/o pacientes en la forma formulada en una composicion o preparacion farmaceuticamente aceptable.
La entrega de una composicion farmaceutica al sujeto es preferiblemente realizada por una o varias inyecciones parenterales, por ejemplo administraciones intravenosas y/o subcutaneas y/o intramusculares y/o intratecales y/o intraventriculares, preferiblemente inyecciones a uno o multiples sitios en el cuerpo humano.
[0109] Ademas de omision de exon la presente divulgacion proporciona la comprension, tambien es posible proporcionar un paciente de DMD con una protefna distrofina funcional con una terapia basada en translectura de codones de parada.
Compuestos capaces de suprimir codones de parada son especialmente adecuados para un subgrupo de pacientes con DMD que es afectado por mutaciones sin sentido (~7%) dando como resultado la formacion de un codon de parada dentro de su gen de distrofina.
En una forma de realizacion de la divulgacion dicho compuesto capaz de suprimir codones de parada comprende la gentamicina antibiotica.
En un estudio reciente en ratones mdx, tratamiento de gentamicina indujo expresion de distrofina nueva hasta 20% del nivel normal, sin embargo con variabilidad entre animales.
Ensayos humanos con gentamicina han sido sin embargo no concluyentes 55
PTC124 pertenece a una clase nueva de moleculas pequenas que imita a concentraciones inferiores la actividad de translectura de la gentamicina.
Administracion de PTC124 resulto en la produccion de distrofina funcionalmente activa de longitud completa tanto in vitro y en ratones mdx 16
Ensayos fase I/II con PTC124 estan actualmente en curso, no solo para aplicacion en DMD sino tambien para fibrosis qufstica 16, 17
Las referencias 16 y 17 tambien describen dosificaciones preferidas del PCT124 compuesto para usar en la presente divulgacion.
Ademas proporcionado es por lo tanto un metodo, combinacion, uso o producto farmaceutico segun la divulgacion, donde dicho compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional comprende un compuesto para suprimir codones de parada.
Dicho compuesto para suprimir codones de parada preferiblemente comprende gentamicina, PTC124 o un equivalente funcional de estos.
De la forma mas preferible, dicho compuesto comprende PTC124.
[0110] En una forma de realizacion de la divulgacion, un individuo dispone de una protefna distrofina funcional que utiliza un vector, preferiblemente un vector vfrico, que comprende un gen de micro-mini-distrofina.
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De la forma mas preferible, se usa un vector vfrico adeno-asociado recombinante (rAAV).
AAV es un parvoviru de ADN monocatenario que es no patogeno y muestra un ciclo de vida colaborador- dependiente.
A diferencia de otros virus (adenovirus, retrovirus, y virus herpes simplex), vectores rAAV han demostrado ser muy eficaces en el musculo esqueletico maduro de transduccion.
Aplicacion de rAAV en estudios "adicion de gen" de DMD tradicionales ha sido obstaculizada por sus restringidos lfmites de empaquetado (< 5 kb).
Por lo tanto, rAAV es preferiblemente aplicado para la entrega eficaz de un gen mucho mas pequeno de micro o mini-distrofina.
Administracion de tal gen de micro o mini-distrofina produce la presencia de una protefna distrofina al menos parcialmente funcional.
Se hace referencia a 18"20.
[0111] Un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional y al menos un compuesto complementario segun la invencion se pueden administrar a un individuo en cualquier orden.
En una forma de realizacion, dicho compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional y dicho al menos un compuesto complementario se administran simultaneamente (lo que significa que dichos compuestos se administran dentro de 10 horas, preferiblemente dentro de una hora).
Este es sin embargo no necesario.
En una forma de realizacion al menos un compuesto complementario se administra a un individuo en la necesidad del mismo antes administracion de un compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional. Tambien se describe por lo tanto un metodo que comprende:
- administracion a un individuo en necesidad de un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir la inflamacion de tejido muscular, y/o administracion a dicho individuo de un compuesto complementario para mejorar la funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular y, posteriormente,
- administracion a dicho individuo de un compuesto para suministrar a dicho individuo una protefna distrofina funcional.
[0112] En otra forma de realizacion, dicho compuesto para suministrar a un individuo una protefna distrofina funcional se administra antes de la administracion de dicho al menos uno compuesto complementario.
[0113] Ademas proporcionado es un metodo para al menos en parte que aumentar la produccion de una protefna distrofina funcional en una celula, dicha celula que comprende pre-ARNm un gen de distrofina que codifica una protefna aberrante de distrofina, donde el metodo comprende:
proporcionar a dicha celula un compuesto para inhibir inclusion de un exon en el ARNm producido del empalme de dicho pre-ARNm de distrofina, y
proporcionar a dicha celula un compuesto complementario para reducir la inflamacion, preferiblemente para reducir inflamacion de tejido muscular, y/o proporcionar a dicha celula un compuesto complementario para mejorar la funcion, integridad y/o supervivencia de fibra muscular,
donde el metodo comprende ademas permitir el movimiento de ARNm producido de empalme de dicho pre- ARNm.
En una forma de realizacion de la divulgacion dicho metodo se realiza in vitro, por ejemplo utilizando un cultivo celular.
[0114] En este contexto, aumentar la produccion de una protefna distrofina funcional ha sido anteriormente definido aquf.
[0115] A menos que se indique lo contrario cada forma de realizacion como se describe en este caso se puede combinar con otra forma de realizacion como se describe en este caso.
[0116] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que artfculos despues de la palabra son incluidos, pero artfculos no especfficamente mencionados no son excluidos.
Ademas el verbo "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente en", lo que signifca que un compuesto o compuesto complementario tal y como se define aquf puede comprender componentes adicional ademas de aquellos especfficamente identificados, dicho componentes adicional no alterando la caracterfstica unica de la divulgacion.
[0117] Ademas, referencia a un elemento por el artfculo indefinido "un" o "uno" no excluye la posibilidad de que mas de uno del elemento este presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos.
El artfculo indefinido "un" o "uno" asf normalmente significa "al menos uno".
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[0118] La palabra "aproximadamente" o "alrededor de" cuando se usa en asociacion con un valor numerico (aproximadamente 10, alrededor de 10) preferiblemente significa que el valor puede ser el valor dado de 10 mas o menos 1% del valor.
[0119] La invencion es posteriormente explicada en los siguientes ejemplos.
Estos ejemplos no limitan el ambito de la invencion, sino que meramente sirven para clarificar la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
[0120]
Figura 1. Representacion esquematica de omision de exon.
En un paciente con distrofia muscular de Duchenne que tiene una supresion de exon 50, se genera una transcripcion fuera del marco en que exon 49 se empalma a exon 51 (Panel A).
Como resultado, un codon de parada se genera en exon 51, que aborta prematuramente sfntesis de distrofina.
La union especffica de secuencia del oligonucleotido antisentido interno de exon PRO051 interfiere con la inclusion correcta de exon 51 durante empalme de modo que el exon es en realidad omitido (Panel B).
Esto restaura el marco de lectura abierto de la transcripcion y permite la sfntesis de una distrofina similar a la de pacientes con distrofia muscular de Becker (BMD).
Figura 2. Preseleccion de estudios de los cuatro pacientes.
Imagenes de resonancia magnetica de las piernas inferiores de los cuatro pacientes (a la izquierda pierna de paciente 3 y piernas adecuadas de los otros tres pacientes) muestran la condicion adecuada del musculo anterior tibial (menos del 50% infiltracion de grasa y fibrosis) (Panel A).
El diagnostico de distrofia muscular de Duchenne en estos pacientes fue confirmado por coloracion de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina de secciones transversales de muestras de biopsia obtenidas previamente del musculo de cuadrfceps (Panel B).
Ninguna expresion de distrofina fue observada, con la excepcion de una fibra en el paciente 2 positiva de distrofina, o revertiente (flecha).
Reaccion en cadena de transcriptasa-polimerasa-inversa (RT-PCR)
Analisis de la region de transcripcion que flanquea las mutaciones de los pacientes y exon 51 confirmo las mutaciones individuales en miotubos no tratados (NT) y la respuesta positiva para PRO051 (es decir, omision de exon 51) en miotubos tratados (T) en el nivel de ARN (Panel C).
Los rendimientos de omision de exon fueron 49% para paciente 1, 84% para paciente 2, 58% para paciente 3, y 90% para paciente 4.
Un sitio de empalme crfptico dentro de exon 51 es a veces activado por PRO051 en el cultivo celular, dando como resultado un producto de empalme aberrante extra, como se ha visto en la muestra tratada de paciente 4.
Via M muestra un marcador de tamano 100-bp, y via C ARN muscular de control saludable.
Analisis de secuencias de los fragmentos RT-PCR de miotubos tratados y no tratados identifico la omision precisa de exon 51 para cada paciente (Panel D).
Los nuevos transcritos dentro del marco de lectura llevaron a sfntesis de distrofina sustancial, como detectado por analisis de inmunofluorescencia de miotubos tratados con el uso de anticuerpo monoclonal NCL-DYS2 (Panel E).
Ninguna distrofina fue detectada antes del tratamiento
Figura 3. Analisis RT-PCR de ARN aislado de secciones en serie de muestras de biopsia de los pacientes. Despues del tratamiento con PRO051, analisis de reaccion en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) muestra fragmentos de transcripcion nuevos mas cortos para cada paciente.
El tamano y secuencia de estos fragmentos apoyan la omision precisa de exon 51.
Ninguna variantes de empalme adicional fue observada.
A 28 dfas, transcripciones de ARN dentro del marco de lectura todavfa significativas fueron detectadas, sugiriendo persistencia prolongada de PRO051 en el musculo.
Debido a la pequena cantidad de material de seccion, condiciones RCP de sensibilidad alta fueron usadas; este proceso excluyo la cuantificacion precisa de rendimientos de omision y la correlacion significativa entre niveles de ARN y protefna.
M denota marcador de tamano, y C control.
Figura 4. Efecto restaurador de distrofina de una unica dosis intramuscular de PRO051.
Analisis de inmunofluorescencia con el uso del anticuerpo de distrofina MANDYS106 claramente muestra expresion distrofina en las membranas de la mayorfa de fibras en toda la muestra de biopsia obtenida de cada paciente (Panel A).
Las areas indicadas por las escuadras se muestran en la ampliacion mas alta en el Panel B. En comparacion, una muestra de un paciente no tratado con distrofia muscular de Duchenne (DMD) y una muestra de control saludable muscular de gastrocnemio (HC) se incluye en las muestras de los pacientes. Fibras revertientes putativas se indican por flechas.
El numero total de fibra muscular que contenfa distrofina y laminina a2 fueron contados manualmente y las proporciones de distrofina para laminina a2 fueron fijadas (Panel C).
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Analisis de electrotransferencia de extractos de protefna total aislados de las muestras de biopsia de los pacientes con el uso de anticuerpo NCL-DYS1 muestra expresion de distrofina restaurada en todos pacientes (Panel E).
Para cada paciente, 30 pg (via derecha) y 60 pg (via izquierda) fueron cargadas; en comparacion, 3 pg de protefna total de una muestra muscular de gastrocnemio saludable fueron tambien cargados (para evitar sobreexposicion).
Debido a las supresiones relativamente pequenas en el gen DMD de estos pacientes, ninguna de las diferencias fueron observadas en los tamanos de protefna.
En el paciente 1, una irregularidad de transferencia perturbo la deteccion de senal en la via 60-pg.
Para corregir por la densidad variable de fibra muscular en las secciones transversales diferentes, la senal de distrofina fluorescente total (porcentaje de area) en cada seccion fue fijada como una proporcion al porcentaje de area de laminina a2 (Panel D).
Figura 5 de ejemplo de referencia.
Niveles de omision de exon 23 en el nivel de ARN en diferentes grupos musculares (Q: musculo de cuadrfceps; TA: musculo anterior tibial; DIA: musculo de diafragma) en ratones mdx (dos ratones por grupo) tratados con PS49 solo (grupo 3) o con PS49 y prednisolona (group4).
Figura 6A,B de ejemplo de referencia en celulas musculares, exon de gen DMD 44 (A) o exon 45 (B) niveles de omision se mejoran con concentraciones en aumento de pentoxifilina (de 0 a 0,5 mg/ml).
Los niveles de omision de exon de figura 6C 23 en el nivel de ARN en diferentes grupos musculares (Q: musculo de cuadrfceps; TA: musculo anterior tibial; Tri: musculo de triceps; HRT: musculo cardiaco) en ratones mdx (dos ratones por grupo) tratadas con PS49 solo (grupo 3) o con PS49 y pentoxifilina (grupo 4). Figura 7. Secuencia de aminoacidos de gen de distrofina (DMD)
Figura 8 de ejemplo de referencia.
Secuencia de amino acido de Isoforma 4 de IGF-1 humano.
Figura 9 de ejemplo de referencia.
Varios oligonucleotidos dirigidos contra los exones indicados del gen de distrofina (DMD)
Ejemplos Ejemplo 1
[0121] En un estudio clfnico reciente la seguridad, tolerabilidad, y efecto restaurador local de distrofina del compuesto de antisentido PRO051 fueron evaluados.
El estudio clfnico fue recientemente publicado.
El contenido de la publicacion es reproducida aquf como ejemplo 1A.
En resumen, PRO051 es un, molecula de ARN sintetica modificada con secuencia 5'-UCA AGG AAG AUG GCA UUU CU-3', y disenada para especfficamente inducir omision del exon 51 59
Lleva fracciones de ribosa sustituida de 2'-0-metilo de longitud completa y uniones de internucleotido de fosforotioato.
Cuatro pacientes con DMD con supresiones de gen DMD especfficas diferentes corregibles por omision de exon 51 fueron incluidos.
A dfa 0, una serie de parametros de seguridad fueron evaluados.
La pierna del paciente (es decir musculo anterior tibial) fue fijada con un molde de plastico hecho a medida y su posicion fue cuidadosamente registrada.
Un anestesico topico (EMLA) fue usado para entumecer la piel.
Cuatro inyecciones de PRO051 fueron dadas a lo largo de una lfnea de ruta de 1,5 cm entre dos tatuajes de piel pequena, usando una aguja electromiografica de 2,5 cm (MyoJect Disposable Hypodermic Needle Electrode, TECA Accessories) para asegurar la entrega intramuscular.
Cada volumen de inyeccion fue 200 pl, que contiene 200 pg PRO051, dispersado en partes iguales a angulos de aproximadamente 30 grados.
A dfa 28, la misma serie de parametros de seguridad fue evaluada nuevamente.
La pierna fue posicionada utilizando el molde propio del paciente, y una biopsia muscular semi-abierta fue tomada entre los tatuajes con anestesia local que utiliza unos forceps con dos mordazas afiladas (Blakesley Conchotoma, DK Instruments).
La biopsia fue congelada rapidamente en el 2-metilbutano enfriado en nitrogeno lfquido.
Pacientes fueron tratados consecutivamente.
Cuando el estudio, dos pacientes (nr. 1 y 2) estaban tambien en corticosteroides (prednisona o deflazacort), uno acababa de terminar tratamiento de esteroide (nr.4) y un paciente habfa usado nunca esteroides (nr.3) (ver tabla 1). Este ultimo paciente fue tambien el que perdio ambulacion en la edad mas joven cuando se compara con los otros tres pacientes.
La biopsia fue analizada, para detectar omision de exon especffico en el nivel de ARN (RT analisis PCR, no mostrado) y expresion nueva de distrofina en el nivel de protefna (analisis de inmunofluorescencia y electrotransferencia25, resumido en la tabla 1).
Evaluacion de la serie de parametros de seguridad (parametros de plasma y orina rutinarios para renal y funcion de hfgado, niveles de electrolito, cuentas de celula sangufnea, hemoglobina, valores aPTT, AP50 y CH50 ) antes y despues del tratamiento, indico que el compuesto PRO051 fue localmente seguro y bien tolerado.
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Para analisis de inmunofluorescencia, secciones transversales fijadas con acetona de la biopsia fueron incubadas durante 90 minutos con anticuerpos monoclonales contra el dominio de varilla central (MANDYS106, Dr. G. Morris, UK, 1:60), el dominio C-terminal (NCL-DYS2, Novocastra Laboratories Ltd., 1:30) o, como referencia, laminina- a2 (Chemicon International, Inc, 1:150),
seguido de anticuerpo IgG anti-raton de cabra (H+L) Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Inc, 1:250) durante una hora.
Secciones fueron montadas con Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories Inc.).
Para analisis de imagen cuantitativo se uso el software ImageJ (W. Rasband, NIH, EE.UU;
http://rsb.info.nih.gov/ij) como descrito 60,61.
Secciones transversales enteras fueron subdivididas en la serie de 6-10 imagenes adyacentes, dependiendo del tamano de seccion.
Para asegurar mediciones fiables, coloracion de las secciones y registro de todas imagenes fue realizado en una sesion, utilizando ajustes de exposicion fijados, y evitando saturacion de pfxeles.
El umbral de intensidad inferior fue fijado en el fondo de distrofia muscular de Duchenne, y fluorescencia positiva fue cuantificada para cada seccion (porcentaje de area), tanto para distrofina como laminina-a2.
Analisis de electrotransferencia fue realizado como descrito 1, utilizando homogenizados agrupados de conjuntos de cuatro secciones 50 pm en serie en toda la biopsia.
Para los pacientes 30 y 60 pg protefna total fueron aplicados y para la muestra de control 3 pg.
La mancha fue incubada durante toda la noche con anticuerpo monoclonal de distrofina NCL-DYS1 (Novocastra Laboratories, 1:125), seguido de IgG-HRP anti-raton de cabra (Santa Cruz Biotechnology, 1:10.000) durante una hora.
Bandas inmunoreactivas fueron visualizadas utilizando el CL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare) y Hyperfilm ECL (Amersham, Biosciences).
Intensidades de senal fueron medidas utilizando ImageJ.
Expresion de protefna distrofina nueva en el sarcolema fue detectada en la mayorfa de fibra muscular en el area tratada en los cuatro pacientes.
Las fibras en cada seccion fueron manualmente contadas tras la coloracion para laminina-a2, una protefna de lamina basal inafectada por deficiencia de distrofina.
Los numeros individuales variaron, de acuerdo con el tamano de biopsia y la calidad de los musculos de los pacientes.
En las secciones mas grande, paciente 2 tenia 726 fibras, de las cuales 620 fueron positivas en distrofina, mientras paciente 3 tenia 120 fibras, de las cuales 117 fueron positivas en distrofina.
Las intensidades de distrofina fueron tfpicamente inferiores a aquellas en una biopsia muscular saludable.
Analisis de electrotransferencia26 confirmo la presencia de distrofina en cantidades variables.
Las senales de distrofina fueron escaneadas y correlacionadas al control (por pg protefna total).
Las cantidades variaron de 3% en el paciente 3 con el musculo mas distrofico, a 12% en el paciente 2 con el musculo mejor conservado.
Ya que tal comparacion basada en protefna total no corrige para las cantidades variables de tejido fibrotico y adiposo en los pacientes de distrofia muscular de Duchenne, tambien cuantificamos la senal de fluorescencia de distrofina con respecto a la laminin-a2 situada de forma similar en cada seccion, por analisis ImageJ.
Cuando esta proporcion de distrofina/laminina-a2 fue fijada a 100% para la seccion de control, los dos pacientes que fueron co-tratados con corticosteroides mostraron los maximos porcentajes de distrofina, 32% en el paciente 1 y 35% en el paciente 2 (tabla 1).
El porcentaje mfnimo de distrofina fue detectado en el paciente 3, 17%.
En el paciente 4 un porcentaje intermedio de 25% fue observado.
Estos porcentajes se correlacionaron a la calidad relativa del musculo objetivo, que fue mejor en pacientes n° 1 y 2, y peor en el paciente n° 3.
Tabla 1.
Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4
Edad (anos)
10 13 13 11
Edad a perdida de ambulacion (anos)
9 11 7 10
Tratamiento de esteroides
Si Si Nunca Hasta enero 2006
Proporcion laminina distrofina-alfa2
32% 35% 17% 25%
[0122] Conclusion: el efecto del compuesto antisentido PRO051 fue mas prominente en aquellos pacientes que fueron tambien sometidos a corticosteroides.
Ejemplo 1A
[0123] Reproducido Van Deutekom JC et al, (2007) Antisense Oligonucleotide PRO051 Restores Local Dystrophin in DMD Patients. N Engl J Med., 357(26): 2677-86 .
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Metodos
Pacientes y diseno de estudio
[0124] Pacientes con distrofia muscular de Duchenne que teman entre 8 y 16 anos de edad fueron aceptables para participar en el estudio.
Todos los pacientes teman supresiones que eran corregibles por omision de exon 51 y no teman ninguna muestra de distrofina en la biopsia muscular del diagnostico precedente.
Tratamiento de glucocorticoide concurrente fue permitido.
Consentimiento informado escrito se obtuvo de los pacientes o sus padres, segun fuera apropiado.
Durante el periodo de preseleccion (alrededor de 60 dfas), cada estado mutacional del paciente y respuesta de omision de exon positivo para PRO051 in vitro fueron confirmados, y la condicion del musculo anterior tibial fue determinado por formacion de imagenes por resonancia magnetica de T1 de peso (MRI).62 Para que pacientes fueran incluidos en el estudio, tejido fibrotico y adiposo podna componer no mas de 50% de su musculo objetivo.
[0125] Durante la visita de referencia, medidas de seguridad fueron evaluadas.
En cada paciente, la pierna que iba a ser inyectada fue fijada con un molde de plastico hecho a medida y su posicion fue registrada.
Una mezcla euectica topica de anestesicos locales (EMLA) fue usada para entumecer la piel.
Cuatro inyecciones de PRO051 fueron dadas a lo largo de una lmea de medicion de 1,5 cm situada entre dos tatuajes de piel pequenos con el uso de una aguja electromiografica de 2.5 cm (MyoJect Disposable Hypodermic Needle Electrode, TECA Accessories) para asegurar entrega intramuscular.
El volumen de cada inyeccion fue 200 pl conteniendo 200 pg de PRO051, que fue dispersado en partes iguales a angulos de aproximadamente 30 grados.
[0126] A dfa 28, medidas de seguridad fueron evaluadas nuevamente.
La pierna que habfa sido inyectada fue posicionada con el uso del molde propio del paciente, y una biopsia muscular semiabierto fue realizada entre los tatuajes bajo anestesia local con unos forceps con dos mordazas afiladas (Blakesley Conchotoma, DK Instruments).63La muestra de biopsia fue congelada rapidamente en el 2-metilbutano enfriado en el nitrogeno lfquido.
[0127] Pacientes fueron tratados consecutivamente desde mayo 2006 hasta marzo 2007 y conforme a las buenas pautas de practica clmica (Good Clinical Practice) y las provisiones de la declaracion de Helsinki.
El estudio fue aprobado por el comite Dutch Central Committee on Research Involving Human Subjects y por la junta de revision institucional local del Leiden University Medical Center.
Todos autores contribuyeron al diseno de estudio, participaron en la recoleccion y analisis de los datos, tuvieron acceso completo y libre a los datos, juntamente escribieron el manuscrito, y certifican la completitud y exactitud de los datos y analisis presentados.
Descripcion de PR0051
[0128] PRO051 es una molecula sintetica de ARN modificada con secuencia 5'- UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU- 3'.12 Lleva moleculas de ribosa 2'-0-metil-sustituida de longitud completa y uniones de internucleotido de fosforotioato.
El farmaco fue proporcionado por Prosensa B.V. en viales de 1 mg de material liofilizado sin excipiente.
Fue disuelto y administrado en solucion salina esteril sin conservantes (0,9% cloruro de sodio).
Se descubrio que PRO051 no era mutagenico por prueba bacteriana Ames.
En los estudios reguladores de seguridad Good Laboratory Practice, ratas que recibieron una unica administracion de hasta 8 mg por kilogramo de peso corporal intramuscularmente y 50 mg por kilogramo por via intravenosa no mostraron ningun efecto adverso; monos que recibieron PRO051 durante 1 mes parecieron aguantar dosis hasta 16 mg por kilogramo por semana cuando el farmaco fue administradas por infusion intravenosa de 1 hora o por inyeccion subcutanea, sin efectos adversos clmicamente pertinentes.
Preseleccion In vitro
[0129] Un cultivo de mioblasto primario preexistente 1 fue usado para la preseleccion de paciente 4.
Para los otros tres pacientes, fibroblastos fueron convertidos en celulas miogenicas tras la infeccion con un vector adenoviral que contiene el gen para el factor de transcripcion miogenica (myoD) como se describe con anterioridad.1, 64, 65 Cultivos de miotubo fueron modificados con PRO051 (100 nM) y polietilenimina (2 pl por microgramo de PRO051), segun las instrucciones del fabricante para ExGen500 (MBI Fermentas).
ARN fue aislado despues de 48 horas.
Analisis de reaccion en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT, pCR) inmunofluorescencia, y electrotransferencia fueron realizados como proporcionado con anterioridad1,12. Fragmentos de la PCR fueron analizados con el uso del 2100 bioanalizador (Agilent) y aislados para secuenciacion por el Leiden Genome Technology Center.
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Evaluacion de seguridad
[0130] En la lfnea de referencia y a 2 horas, 1 dfa, y 28 dfas despues de la inyeccion, todos pacientes han recibido un examen ffsico completo (con la medicion de constantes vitales) y fueron sometidos a electrocardiograffa.
Ademas, plasma y orina fueron obtenidos para determinar funcion renal y de hfgado, niveles de electrolitos, cuentas de celula completa, el tiempo de tromboplastina parcial activada, y valores de actividad de complemento en las vfas tradicionales (CH50) y alternativas (AP50).
El uso de medicamentos concomitantes fue registrado.
En la lfnea de referencia y en el dfa 28, la fuerza del musculo anterior tibial fue evaluada con el uso de la escala del Medical Research Council 66 para evaluar si los procedimientos habfan afectado al rendimiento muscular. (En esta escala, una puntuacion de 0 indica ningun movimiento y una puntuacion de 5 indica fuerza muscular normal.) Como solo una area pequena del musculo fue tratada, no fue previsto beneficio clfnico en cuanto a fuerza muscular aumentada.
A cada visita, eventos adversos fueron registrados.
Evaluacion de ARN
[0131] Secciones en serie (50 pm) de la muestra de biopsia muscular congelada fueron homogeneizadas en la solucion de ARN-Bee (Campro Scientific) y MagNA Lyser Green Beads (Roche Diagnostics).
ARN total fue aislado y purificado segun las instrucciones del fabricante.
Para DNA complementario, sfntesis fue realizada con transcriptasa inversa Transcriptor (Roche Diagnostics) con el uso de 500 ng de ARN en una reaccion de 20-pl a 55°C durante 30 minutos con cebadores inversos especfficos de exon humano 53 o 54.
Analisis PCR fueron realizados como se describe con anterioridad1,12. Productos fueron analizados en geles de agarosa 2% y secuenciados.
Ademas, RT-PCR con el uso de un cebador establecido para la prueba de truncamiento de protefna 67 fue usado para rapidamente filtrar para eventos especfficos de empalme aberrante en todo el gen DMD.
Evaluacion de nivel de protefna
[0132] Para analisis de inmunofluorescencia, secciones fijadas con acetona fueron incubadas durante 90 minutos con anticuerpos monoclonales contra el dominio de varilla central (MANDYS106, Dr. G. Morris, Reino Unido) a una dilucion de 1:60, el dominio C-terminal (NCL-DYS2, Novocastra Laboratories) a una dilucion de 1:30, o (como una referencia) laminina a2 (Chemicon internacional), una protefna de lamina basal que se inafecta por deficiencia de distrofina, a una dilucion de 1:150, seguido de anticuerpos IgG (H+L) antiraton de cabra Alexa fluor 488 (Molecular Probes) a una dilucion de 1:250 durante 1 hora.
Secciones fueron montadas con Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories).
ImageJ software (W. Rasband, National Institutes of Health,
http://rsb.info.nih.gov/ij) fue usado para analisis de imagen cuantitativo como se describe con anterioridad.60,61 Secciones transversales enteras fueron subdivididas en series de 6 a 10 imagenes adyacentes, dependiendo del tamano de la seccion.
Para asegurar mediciones fiables, coloracion de las secciones y registro de todas las imagenes fueron realizados durante una sesion con el uso de ajustes de exposicion fijados y la evitacion de saturacion de pfxeles.
El umbral de intensidad inferior fue establecido al fondo para distrofia muscular de Duchenne, y fluorescencia positiva fue cuantificada para cada seccion (porcentaje de area), tanto para distrofina como laminina a2.
[0133] Analisis de electrotransferencia 28 fue realizado como se describe con anterioridad1 con el uso de homogenizados agrupados de conjuntos de cuatro secciones en serie 50-pm en toda la muestra de biopsia.
Para cada paciente, dos cantidades de protefna total - 30 pg y 60 pg - fueron aplicadas, y para la muestra de control, 3 pg.
El inmunoblot (analisis de electrotransferencia) fue incubado durante toda la noche con anticuerpo monoclonal de distrofina NCL-DYS1 (Novocastra Laboratories) a una dilucion de 1:125, seguido de IgG antiraton de cabra marcado con peroxidasa de rabano picante (Santa Cruz Biotechnology) a una dilucion de 1:10,000 durante 1 hora.
Bandas inmunoreactivas fueron visualizadas con el uso del sfstema de deteccion de electrotransferencia ECL Plus Western blotting detection system (GE Healthcare) y Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences).
Intensidades de senal fueron medidas con el uso del software ImageJ.
Resultados
Preseleccionar de pacientes
[0134] El estudio fue planificado para incluir de cuatro a seis pacientes.
Seis pacientes fueron invitados a participar, y uno declino la invitacion.
Los restante cinco pacientes fueron preseleccionados.
Primero, la condicion del musculo anterior tibial fue evaluada en MRI.
Se considero que la condicion muscular de cuatro pacientes era adecuada para el estudio (figura 2A), y la ausencia de distrofina fue confirmada en las muestras de biopsia original de los pacientes (figura 2B).
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Segundo, el estado mutacional y respuesta de omision de exon positivo para PRO051 de estos cuatro pacientes fueron confirmados en los cultivos de fibroblasto.
Tratamiento PRO051 ha generado un nuevo fragmento de ARN mas corto mensajero para cada paciente, representando de 46% (en el paciente 4) a 90% (en el paciente 1) del producto RT-PCR total (figura 2C).
Omision precisa de exon 51 fue confirmada por secuenciacion (figura 2d).
No se descubrio que otras regiones de transcripcion fueran alteradas.
Analisis de inmunofluorescencia mostraron una preponderancia de miotubos positivos de distrofina (figura 2E), un hallazgo que fue confirmado por analisis de electrotransferencia (no mostrado).
Asf, los cuatro pacientes fueron juzgados aceptables para tratamiento PRO051.
Sus caracterfsticas de lfnea de referencia se muestran en la tabla 2.
Seguridad y eventos adversos
[0135] Todos los pacientes tuvieron uno o varios eventos adversos.
Sin embargo, solo un paciente informo de dolor local moderado en el sitio de inyeccion, que fue considerado un evento adverso relacionado con el farmaco de estudio.
Otros eventos incluyeron dolor de leve a moderado despues de la biopsia muscular.
Dos pacientes tuvieron formacion de ampollas bajo los vendajes usados para cierre de la herida.
En el periodo entre inyeccion y biopsia, dos pacientes informaron de unos dfas de sintomas tipo gripe, y un paciente tuvo diarrea moderada durante 1 dfa.
En la lfnea de referencia, las puntuaciones de fuerza muscular del musculo anterior tibial tratado en pacientes 1, 2, 3, y 4 fueron respectivamente 4, 2, 3, y 4, en la escala del Medical Research Council.
Ninguno de los pacientes mostro cambios en la fuerza de este musculo durante el estudio o alteraciones significativas en las medidas de laboratorio estandares o medidas aumentadas de productos de empalme de complemento o tiempo de tromboplastina parcial activado.
Ninguna respuesta inflamatoria local o toxica fue detectada en las secciones de musculo de los pacientes (datos no mostrado).
Paciente 3 exitosamente fue sometido a cirugfa preplanificada para escoliosis en el mes despues de que el estudio fuera completado.
ARN y nivel de protefna
[0136] A dfa 28, una biopsia del area tratada fue realizada en cada paciente.
Musculo total ARN fue aislado de secciones en serie en toda la muestra de biopsia.
En todos los pacientes, RT-PCR identifico un fragmento nuevo mas corto provocado por la omision de exon-51 como confirmado por secuenciacion (figura 3).
Un analisis mas detallado de transcripcion no mostro otras alteraciones (datos no mostrados).
Analisis de inmunofluorescencia de secciones a lo largo de la muestra de biopsia de cada paciente mostraron senales claras del sarcolema de distrofina en la mayorfa de las fibras musculares (figura 4A y 4B).
Anticuerpos de distrofina proximal y distal a las supresiones que fueron usadas incluyeron MANDYS106 (figura 4A y 4B) y NCL-DYS2 (similar al MANDYS106, no mostrado).
Las fibras en cada seccion fueron manualmente contadas tras la coloracion para laminina a2.68 Los numeros individuales variaron, de acuerdo con el tamano de la muestra de biopsia y la calidad del musculo.
En las secciones mas grandes, paciente 2 tenia 726 fibras, de las cuales 620 fueron positivas en distrofina, mientras que paciente 3 tenia 120 fibras, de las cuales 117 fueron positivas en distrofina (figura 4A y 4C).
Las intensidades de distrofina fueron tfpicamente inferiores a aquellas en una muestra de biopsia muscular saludable (figura 4B).
Las fibras unicas con una senal de distrofina mas intensa en pacientes 2 y 3 podrfan ser bien fibras revertientes (figura 4B).
[0137] Analisis de electrotransferencia confirmo la presencia de distrofina en cantidades variables (figura 4E).
Las senales de distrofina fueron escaneadas y correlacionadas al control (por microgramo de protefna total).
Las cantidades variaron de 3% en el paciente 3, que tenia el musculo mas-distrofico, a 12% en el paciente 2, que tenia el musculo mejor conservado.
Ya que tal comparacion basandose en protefna total no corrige para las cantidades variables de tejido fibrotico y adiposo en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, tambien cuantificamos la senal de fluorescencia de distrofina (figura 4A y 4B) con respecto a la de la laminina a2 situada de forma similar en cada seccion por analisis ImageJ.
Cuando la proporcion de distrofina para laminina a2 fue establecida a 100 para la seccion de control, pacientes 1, 2, 3, y 4 tuvieron proporciones de 33, 35, 17, y 25, respectivamente (figura 4D).
Discusion
[0138] Nuestro estudio mostro que inyeccion intramuscular local de PRO051, un oligorribonucleotido antisentido 2OMeP complementario a una secuencia de 20 nucleotidos dentro de exon 51, indujo omision de exon-51, corrigio el
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marco de lectura, y asf indujo distrofina en el musculo en los cuatro pacientes con distrofia muscular de Duchenne que recibieron terapia.
Fibras positivas de distrofina fueron descubiertas en las muestras de biopsia de los pacientes, lo que indica la dispersion del compuesto en el area inyectada.
Ya que ningun excipiente de mejora de entrega fue usado, comprension PRO051 no ha parecido ser un factor potencialmente limitante mayor.
No podemos excluir que permeabilidad aumentada de la membrana de fibra distrofica tuviera un efecto favorable.
Los pacientes produjeron niveles de distrofina que fueron de 3 a 12% del nivel en el musculo de control saludable, como se muestra en el analisis de electrotransferencia de protefna total.
Ya que la presencia de fibrosis y grasa puede llevar a alguna subestimacion de distrofina en extractos de protefna total, determinamos la proporcion de distrofina para laminina a2 en las secciones transversales, que oscilo de 17 a 35, en comparacion con 100 en el musculo de control.
El efecto restaurador de distrofina de PRO051 fue limitado al area tratada, y ninguna mejora de fuerza del musculo entero fue observada.
Tratamiento sistemico futuro requerira administracion repetida para aumentar y mantener expresion de distrofina a un nivel mas alto y para obtener eficacia clfnica.
[0139] Debido a reglamentos de etica medica con relacion a intervenciones en menores, no pudimos obtener una muestra de biopsia de los musculos contralaterales de los pacientes que no habfan sido inyectados.
Sin embargo, los pacientes mostraron menos del 1% de fibras revertientes en las muestras de biopsia de diagnostico original obtenidos de 5 a 9 anos antes de la iniciacion del estudio (tabla 2 y figura 2B).
Consideramos muy posible que los efectos que observamos estuvieran relacionados con la naturaleza y secuencia del PRO051 reactivo en vez de con un aumento marcado en fibras revertientes.
De hecho, una unica fibra posiblemente revertiente que tenia una senal de distrofina aumentada fue observada en tanto paciente 2 como paciente 3 (figura 4B).
[0140] En resumen, nuestro estudio mostro que administracion local de PRO051 a musculo en cuatro pacientes con distrofia muscular de Duchenne restauro la distrofina a niveles que varfan de 3 a 12% o 17 a 35%, dependiendo de la cuantificacion relativa a protefna total o contenido de miofibra.
De acuerdo con la naturaleza claramente localizada del tratamiento, mejora funcional no se observo.
El resultado consistentemente mas pobre en el paciente 3, que tenia la enfermedad mas avanzada, sugiere la importancia de llevar a cabo ensayos clfnicos en pacientes a una edad relativamente joven, cuando relativamente poco tejido muscular ha sido sustituido por fibrosis y tejido adiposo.
Nuestras conclusiones proporcionan una indicacion de que omision de exon mediado de antisentido pueden ser un metodo potencial para restaurar sfntesis de distrofina en los musculos de pacientes con distrofia muscular de Duchenne.
Ejemplo 2: ejemplo de referencia
[0141] En un estudio preclfnico en ratones mdx (modelo animal para DMD) el efecto de prednisona de compuesto complementario en la omision de exon inducido por AON fue evaluado.
Ratones Mdx (C57Bl/10ScSn-mdx/J) fueron obtenidos de Charles River Laboratories (Pafses Bajos).
Estos ratones son deficientes en distrofina debido a un mutacion sin sentido en el exon 23.
Omision de exon inducida por AON 23 es terapeutica en ratones mdx eliminando la mutacion sin sentido y la correccion del marco de lectura abierto.
Se inyecto subcutaneamente a dos ratones mdx por grupo con: grupo 1) sal fisiologica (semanas 1- 8), grupo 2) prednisolona (1mg/kg, semanas 1-8), grupo 3) oligonucleotido PS49 antisentido especffico de raton disenado para especfficamente inducir omision de exon 23 (100mg/kg, semana 4 (5 veces), semana 5-8 (2 veces), grupo 4) prednisolona (1mg/kg, semana 1-8) + PS49 (100mg/kg, semana 4 (5 veces), semana 5-8 (2 veces).
PS49 (5' GGCCAAACCUCGGCUUACCU 3') tiene un esqueleto de fosforotioato de longitud completa y moleculas de ribosa modificada de 2'O-metilo.
[0142] Todos los ratones fueron sacrificados 1 semana despues de la ultima inyeccion.
Grupos de musculos diferentes, incluyendo cuadrfceps, anterior tibial, y musculos de diafragma fueron aislados y congelados en el 2-metilbutano enfriado en nitrogeno lfquido.
Para analisis RT-PCR, las muestras musculares fueron homogeneizadas en la solucion de RNA-Bee (Campro Scientific, Pafses Bajos).
ARN total fue aislado y purificado segun las instrucciones del fabricante.
Para sfntesis de ADNc con transcriptasa inversa (Roche Diagnostics, Pafses Bajos), 300 ng de ARN fue usado en una reaccion 20 pl a 55°C durante 30 min, inverso cebado con cebadores especfficos de gen DMD de raton.
Primero PCR fueron realizados con conjuntos de cebador externo, durante 20 ciclos de 94°C (40 seg), 60°C (40 seg), y 72°C (60 seg).
Un pl de esta reaccion (diluida 1:10) fue luego reamplificada utilizando combinaciones de cebador anidado en los exones directamente flanqueando exon 23, con 30 ciclos de 94°C (40 seg), 60°C (40 seg), y 72°C (60 seg).
Productos PCR fueron analizados en 2% geles de agarosa.
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Rendimientos de omision fueron determinados por cuantificacion de productos PCR que utilizan el DNA 1000 LabChip® Kit y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Pafses Bajos).
Ninguna omision de exon 23 fue observada en los musculos de ratones tratados con sal fisiologica o prednisolona solo (grupos 1 y 2).
Niveles de omision de exon 23 fueron detectados y comparados por grupo muscular entre ratones tratados con PS49 solo (grupo 3) y ratones tratados con PS49 y prednisolona de compuesto complementario (grupo 4).
En los musculos cuadrfceps (Q), anterior tibial (TA), y diafragma (DIA), niveles de omision de exon 23 fueron tfpicamente mas altos en el grupo 4 cuando se compara con grupo 3 (figura 5).
Esto indica que prednisolona de compuesto complementario de hecho mejora niveles de omision de exon 23 en ratones mdx tratados con PS49.
Ejemplo 3: ejemplo de referencia
[0143] A., B. Cultivos de celulas muscular diferenciado (miotubos) derivados de un individuo de control saludable fueron modificados con 250 nM PS188 ([5' UCAGCUUCUGUUAGCCACUG 3'; SEC ID n.°: 10] un AON optimizado para especfficamente omitir exon 44) o 250 nM PS221 ([5' AUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUGC 3'; SEC ID n.°: 60] un AON optimizado para especfficamente omitir exon 45) en presencia de 0 a 0,5 mg/ml pentoxifilina, uso de del polfmero de reactivo de transfeccion UNIFectilin (2,0 pl UNIFectilin por pg AON en 0,15M NaCl).
UNIFectilin interactua electrostaticamente con acidos nucleicos, a condicion que el acido nucleico se carga negativamente (tal como AON de fosforotioato de 2'-0-metilo).
Pentoxifilina (Sigma Aldrich) fue disuelta en agua.
ARN total fue aislado 24 hrs tras la transfeccion en la solucion de RNA-Bee (Campro Scientific, Pafses Bajos) segun las instrucciones del fabricante.
Para sfntesis de ADNc con transcriptasa inversa (Roche Diagnostics, Pafses Bajos), 500 ng de ARN fue usado en una reaccion 20 pl a 55°C durante 30 min, cebado inverso con cebadores especfficos de gen DMD.
Primero PCR fueron realizados con conjuntos de cebador externos, durante 20 ciclos de 94°C (40 seg), 60°C (40 seg), y 72°C (60 seg).
Un pl de esta reaccion (diluido 1:10) fue luego reamplificado utilizando combinaciones de cebador anidado en los exones directamente flanqueando exon 44 o 45, con 30 ciclos de 94°C (40 seg), 60°C (40 seg), y 72°C (60 seg). Productos PCR fueron analizados en 2% geles de agarosa.
Rendimientos de omision fueron determinados por cuantificacion de productos PCR utilizando el DNA 1000 LabChip® Kit y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Pafses Bajos).
[0144] Tanto con PS188 como PS221, niveles en aumento de exon 44 o 45 omision fueron obtenidos con concentraciones en aumento de la pentoxifilina de compuesto complementario cuando se compara con aquellos obtenidos en celulas que no eran co-tratadas con pentoxifilina (ver figura 6).
Estos resultados indican que pentoxifilina mejora niveles de omision de exon en el musculo celulas.
C.
[0145] En un estudio preclfnico en ratones mdx (modelo animal para DMD) el efecto de pentoxifilina de compuesto complementario en la omision de exon inducido por AON fue evaluado.
Ratones Mdx (C57Bl/10ScSn-mdx/J) fueron obtenidos de Charles River Laboratories (Pafses Bajos).
Estos ratones son deficientes en distrofina debido a un mutacion sin sentido en el exon 23.
Omision de exon inducido por AON 23 es terapeutico en ratones mdx eliminando la mutacion sin sentido y correccion del marco de lectura abierto.
Dos ratones mdx por grupo fueron inyectados subcutaneamente con: grupo 1) pentoxifilina (50 mg/kg, semana 1-2), grupo 2) oligonucleotido PS49 antisentido especffico de raton disenado para especfficamente inducir omision de exon 23 (100mg/kg, semana 2 (2 veces), grupo 3) pentoxifilina (50 mg/kg, semana 1-2) + PS49 (100mg/kg, semana 2 (2 veces).
pS49 (5' GGCCAAACCUCGGCUUACCU 3') tiene un esqueleto de fosforotioato de longitud completa y moleculas de ribosa modificada de 2'O-metilo.
[0146] Todos los ratones fueron sacrificados 1 semana despues de la ultima inyeccion.
Grupos de musculos diferentes, incluyendo cuadrfceps, tibial anterior, triceps y musculos cardiacos fueron aislados y congelados en el 2-metilbutano enfriado en nitrogeno lfquido.
Para analisis RT-PCR, las muestras musculares fueron homogeneizadas en la solucion de RNA-Bee (Campro Scientific, Pafses Bajos).
ARN total fue aislado y purificado segun las instrucciones del fabricante.
Para sfntesis de ADNc con transcriptasa inversa (Roche Diagnostics, Pafses Bajos), 300 ng de ARN fue usado en una reaccion 20 pl a 55°C durante 30 min, cebado inverso con cebadores especfficos de gen DMD de raton.
Primero PCR fueron realizados con conjuntos de cebador externo, durante 20 ciclos de 94°C (40 seg), 60°C (40 seg), y 72°C (60 seg).
Un pl de esta reaccion (diluido 1:10) fue luego reamplificada utilizando combinaciones de cebador anidado en los exones directamente flanqueando exon 23, con 30 ciclos de 94°C (40 seg), 60°C (40 seg), y 72°C (60 seg).
Productos PCR fueron analizados en 2% geles de agarosa.
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Rendimientos de omision fueron determinados por cuantificacion de productos PCR utilizando el DNA 1000 LabChip® Kit y el bioanalizador de Agilent 2100 (Agilent Technologies, Pafses Bajos).
Ninguna omision de exon 23 fue observada en los musculos de ratones tratados con pentoxifilina solo (grupos 1). Niveles de omision de exon 23 fueron detectados y comparados por grupo muscular entre ratones tratados con PS49 solo (grupo 2) y ratones tratados con PS49 y pentoxifilina de compuesto complementario (grupo 3).
En el cuadriceps (Q), anterior tibial (TA), triceps (tri) y musculos cardiacos (HRT), los niveles de omision de exon 23 fueron ripicamente mas altos en el grupo 3 cuando se compara con grupo 2 (figura 6c).
Esto indica que pentoxifilina de compuesto complementario de hecho mejora los niveles de omision de exon 23 en ratones mdx tratados con PS49.
Tabla 2. Caracteristicas de lmea de referencia de los pacientes con DMD
Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4
Edad (anos)
10 13 13 11
Supresion
Exon 50 Exones 48-50 Exones 49-50 Exon 52
Edad a la perdida de ambulacion
9 11 7 10
(anos) Escoliosis
No No Sf Sf
Niveles de creatina-cinasa (U/l)1
5823 2531 717 4711
Tratamiento de esteroides
Sf Sf Nunca Hasta enero
Fuerza musculo TA (escala MRC)
4 2 3 2006 4
Estado MRI musculo TA
Moderado2 Moderado2 Moderado2 Moderado2
% fibras revertientes
N.D <1% N.D.
1 nivel normal: <200 U/l 2 menos del 50% infiltracion de grasa y/o fibrosis [Mercuri et al., 2005)
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Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Combinacion de:
    - un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte de exon 51 de pre-ARNm de distrofina humana y dicho oligonucleotido se representa por SEC ID n.°: 204
    y
    - un compuesto complementario para reducir la inflamacion, donde este compuesto comprende un esteroide, donde dicha combinacion es para su uso como un medicamento, para aliviar uno o varios sfntomas de distrofia muscular de Duchenne en dicho individuo.
  2. 2. Combinacion para uso segun la reivindicacion 1, donde la ausencia de dicho exon de ARNm producida por dicha distrofina pre-ARNm genera una region de codificacion para una protefna de distrofina funcional.
  3. 3. Combinacion para uso segun la reivindicacion 1 o 2, donde dicho oligonucleotido comprende ARN.
  4. 4. Combinacion para uso segun la reivindicacion 3, donde dicho ARN contiene una 2'-0-metilo ribosa modificada (ARN).
  5. 5. Combinacion para uso segun la reivindicacion 3 o 4, donde dicho oligonucleotido es un 2'-0 metilo oligorribonucleotido fosforotioato.
  6. 6. Combinacion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, donde dicho oligonucleotido es un acido nucleico peptido, acido nucleico bloqueado, fosforodiamidada de morfolino, o cualquier combinacion de los mismos.
  7. 7. Un producto farmaceutico que comprende
    - una combinacion tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6 y
    - un portador, adyuvante, diluyente y/o excipiente farmaceuticamente aceptable.
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