CN102459595A

CN102459595A - 用于治疗dmd的包含肌苷的寡核苷酸

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Publication number: CN102459595A
Application number: CN201080025220XA
Authority: CN
Inventors: 朱迪思·克里斯蒂娜·塞奥多拉·万多伊特科姆; 约瑟夫斯·约翰尼斯·德吉姆彼; 勒德乌斯·约翰尼斯·普拉滕伯格
Original assignee: PROSENSA TECHNOLOGIES BV
Current assignee: PROSENSA TECHNOLOGIES BV
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2012-05-16
Also published as: NZ595955A; US20160264967A1; US20120046342A1; US20150203849A1; US20210254071A1; AU2010239779A1; IL215888A0; US20200291399A1; US20240141339A1; CA2759899A1; ES2593836T3; HK1167433A1; EP2421971B1; US11034956B2; JP2012524540A; US11634714B2; US10533171B2; WO2010123369A1; EP2421971A1; US20170204414A1

Abstract

本发明提供了包含肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的寡核苷酸或其功能等同物，其中寡核苷酸或其功能等同物包括与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补的序列，所述部分为包括至少8个核苷酸的一段连续序列。本发明还提供了所述寡核苷酸用于预防或治疗DMD或BMD的用途。

Description

用于治疗DMD的包含肌苷的寡核苷酸

发明领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。

发明背景

肌肉病症是通常对个体生活具有显著影响的疾病。肌肉病症可具有遗传因素或非遗传因素。具有遗传因素的一组重要的肌肉疾病为贝克型肌营养不良(Becker Muscular Dystrophy，BMD)和杜氏肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)。这些病症是由肌肉蛋白质的基因缺损引起的。

贝克型肌营养不良和杜氏肌营养不良是具有相对高发病率的遗传性肌营养不良。在杜氏和贝克型肌营养不良中，肌肉蛋白质即肌营养不良蛋白受到影响。在杜氏肌营养不良中，不存在肌营养不良蛋白，然而在贝克型肌营养不良中，存在一些肌营养不良蛋白，但是肌营养不良蛋白的产生最常见是不足的和/或存在的肌营养不良蛋白是异常形成的。两种疾病都与隐性X连锁遗传有关。DMD起因于DMD基因中的移码突变。DMD基因转录物(mRNA)中的移码引起截短的非功能性肌营养不良蛋白蛋白质的产生，从而导致渐进性肌萎缩和无力。由于突变不引起DMD转录物(mRNA)移码，所以出现BMD。由于不同于不存在肌营养不良蛋白的DMD，BMD中存在有部分功能至大半功能的肌营养不良蛋白，因此BMD症状普遍没有DMD严重。DMD的发作早于BMD。DMD通常在幼童时期自己表现出来，BMD在青少年或成年早期表现出来。BMD的进展比DMD慢以及更难以预测。患有BMD的患者可活到成年中期或晚期。患有DMD的患者很少活过三十多岁。

肌营养不良蛋白在肌纤维中发挥重要的结构作用，其连接细胞外基质和细胞骨架。N末端区域结合肌动蛋白，而C末端是肌营养不良蛋白糖蛋白复合物(DGC)的一部分，其跨越肌膜。不存在肌营养不良蛋白时，机械应力导致肌膜破裂，引起钙不受控制地流入肌纤维内部，从而触发钙激活的蛋白酶和纤维坏死。

对于大多数遗传性肌营养不良而言，目前没有临床上适用的有效疗法可以利用。为了与遗传性肌营养不良作斗争，当前探讨了外显子跳跃技术。近来我们和其他人已经报道了关于基因疗法的有希望的结果，所述基因疗法旨在恢复来自mdx小鼠、GRMD狗(参考文献59)和DMD患者的细胞中肌营养不良蛋白前体mRNA的阅读框^1-11。通过特定外显子的靶向跳跃，将DMD表型(缺乏肌营养不良蛋白)转化成较温和的BMD表型(有部分功能至大半功能的肌营养不良蛋白)。优选通过靶向剪接位点的一个或两个或外显子-内部序列的反义寡核糖核苷酸(AONs)的结合诱导外显子的跳跃。由于当两个剪接位点被剪接体复合物识别时，外显子仅仅被包含在mRNA中，所以认为剪接位点是AON的明显靶标。更优选地，使用一个或多个AON，其对参与外显子的正确剪接的一个或多个外显子序列的至少一部分是特异性的。使用对外显子46序列特异性的外显子-内部AON，以前我们就能在来自两个具有外显子45缺失的不同DMD患者的培养的肌管中调节剪接模式¹¹。AON治疗后，外显子46被跳跃，其导致至少75％细胞中阅读框的恢复和肌营养不良蛋白合成的诱导。最近我们证明在人对照和患者肌肉细胞中使用外显子-内部AON也可对39个不同DMD外显子有效地诱导外显子跳跃^{1，2，11-15}。

因此，应用于肌营养不良蛋白基因上的外显子跳跃技术导致DMD患者中生成至少具有部分功能的-虽然较短-肌营养不良蛋白蛋白质。由于DMD是由功能失调的肌营养不良蛋白蛋白质引起的，所以预期一旦向DMD患者提供功能性肌营养不良蛋白蛋白质，就能充分地减轻DMD症状。然而，本发明洞悉即使外显子跳跃技术能诱导肌营养不良蛋白的合成，但通过合并肌苷和/或含有能在所述寡核苷酸中形成摆动碱基对的碱基的核苷酸，能更进一步改善用于外显子跳跃技术的寡核苷酸。

发明内容

寡核苷酸

在第一方面中，提供了包含肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的寡核苷酸或其功能等同物，其中寡核苷酸或其功能等同物包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补的序列，所述部分为包含至少8个核苷酸的一段连续序列。

在本发明的寡核苷酸中肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的用途非常吸引人，如下所说明。例如，肌苷为已知能与三个碱基即尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶配对的修饰碱基。肌苷为次黄嘌呤通过β-N9-糖苷键与核糖环(也称为呋喃核糖)连接时形成的核苷。肌苷通常存在于tRNA中，并且对于摆动碱基对中遗传密码的正确翻译是必不可少的。摆动碱基对为RNA二级结构中基本的G-U和I-U/I-A/I-C对。所述摆动碱基对的热力学稳定性可与沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)的热力学稳定性相比。摆动碱基对对于遗传密码的正确翻译是关键的。通过使用反密码子的第一个碱基中的修饰碱基对，遗传密码补偿三联密码子(64)的氨基酸(20)数目的不一致。类似地，当设计用于聚合酶链式反应的引物时，肌苷是有用的，因为它会与腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶无差别地配对。使用这种碱基的第一个优点允许设计跨过单核苷酸多态性(SNP)的引物，不用担心所述多态性会破坏引物的退火效率。因此在本发明中，这种碱基的使用允许设计可用于个体的寡核苷酸，所述个体在被本发明的寡核苷酸靶向的一段肌营养不良蛋白前体mRNA序列内具有SNP。在本发明的寡核苷酸中使用肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的第二个优点是，如果已经将其设计为与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补，所述部分为包含至少8个核苷酸的一段连续序列，那么所述寡核苷酸通常会含有CpG。寡核苷酸中CpG的存在通常与所述寡核苷酸提高的免疫原性有关(参考文献60)。这种提高的免疫原性是不希望的，因为它可引起肌纤维分解。预期在所述寡核苷酸中用相应的肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基替换一个、两个或更多个CpG，可提供具有降低的和/或可接受水平的免疫原性的寡核苷酸。可在动物模型中通过评价所述动物的肌肉活检中CD4⁺和/或CD8⁺细胞和/或炎性单核细胞浸润的存在而评价免疫原性。通过使用技术人员已知的标准免疫测定检测中和抗体和/或识别所述寡核苷酸的抗体的存在，也可在用本发明的寡核苷酸治疗的动物或人类的血液中评价免疫原性。

通过比较治疗前或用具有至少一个肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的相应寡核苷酸治疗的动物的相应肌肉活检中每个细胞类型的量，免疫原性的提高优选地对应于这些细胞类型中至少一种的可检测的增加。或者，可通过使用标准免疫测定检测中和抗体或识别所述寡核苷酸的抗体的存在或增加量而评价免疫原性的提高。

通过比较治疗前或用不具有肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的相应寡核苷酸治疗的动物的相应肌肉活检中每个细胞类型的量，免疫原性的下降优选地对应于这些细胞类型种至少一种的可检测的减少。或者，可使用标准免疫测定通过所述化合物和/或中和抗体的缺乏或减少量而评价免疫原性的下降。

在本发明的寡核苷酸中使用肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的第三个优点是，避免或减少寡核苷酸可能的多聚化(multimersation)或聚集。例如，已知包含G-四联体基序的寡核苷酸具有形成通过四个单链寡核苷酸的胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base-pairing)形成四链体(quadruplex)、多聚体或聚集体(参考文献61)的倾向，这当然是不希望的：预期寡核苷酸的效率会因此降低。优选地，通过技术人员已知的标准聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳技术评价多聚化或聚集。在优选实施方案中，本发明的寡核苷酸总量的不到20％或15％、10％、7％、5％或更少具有使用上述测定评价的多聚化或聚集的能力。

因而，在本发明的寡核苷酸中使用肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的第四个优点是，还避免了与抗血栓形成活性(参考文献62)以及与巨噬细胞清除剂受体结合和抑制(参考文献63)有关的四链体结构。

在本发明的寡核苷酸中使用肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的第五个优点是，允许设计具有改善的RNA结合动力学和/或热力学性质的寡核苷酸。RNA结合动力学和/或热力学性质至少部分地由寡核苷酸的解链温度(Tm；使用基本Tm和最邻近模型通过用于单链RNA的寡核苷酸性质计算器(http://www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html)计算)和/或AON-靶外显子复合物(使用RNA结构版本4.5)的自由能确定。如果Tm过高，则预期寡核苷酸特异性较低。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸序列。因此，难以为这些参数中的每一个指定优选的范围。可接受的Tm可在35℃-65℃的范围内变动，并且可接受的自由能可在15kcal/mol至45kcal/mol的范围内变动。

因此，技术人员首先选择寡核苷酸作为可能的治疗化合物。在第二个步骤中，技术人员可以使用本发明以通过降低所述寡核苷酸的免疫原性和/或避免聚集和/或四链体形成和/或通过优化所述寡核苷酸的Tm和/或AON-靶复合物的自由能，而进一步优化所述寡核苷酸。技术人员可设法在所述寡核苷酸中合适位置引入至少一个肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基，并且评价免疫原性和/或聚集和/或四链体形成和/或Tm和/或AON-靶复合物的自由能怎样被所述肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的存在改变。如果所述改变不提供期望的免疫原性和/或聚集和/或四链体形成和/或其Tm和/或AON-靶复合物的自由能的改变或降低，技术人员可以选择在所述寡核苷酸中引入另外的肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基，和/或在所述寡核苷酸内的不同的合适位置引入给定的肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基。

包含肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的寡核苷酸可定义为其中至少一个核苷酸已被肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基取代的寡核苷酸。技术人员了解如何测试核苷酸是否含有能形成摆动碱基对的碱基。由于例如肌苷可与尿嘧啶、腺嘌呤和/或胞嘧啶形成碱基对，这意味着至少一个能与尿嘧啶、腺嘌呤和/或胞嘧啶形成碱基对的核苷酸已被肌苷取代。然而，为了保证特异性，只要保持如本文后面定义的所述寡核苷酸的功能活性的可接受水平，含有肌苷的寡核苷酸优选包含至少一个、两个、三个、四个能与尿嘧啶或腺嘌呤或胞嘧啶形成碱基对的核苷酸的取代。

包含肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的寡核苷酸优选是还能显示可接受水平的不包含肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的相应寡核苷酸的功能活性的寡核苷酸。优选地，所述寡核苷酸的功能活性是，为个体提供功能性肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA和/或至少部分地减少异常肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的产生。本文后面会定义这些特征的每一个。这种功能活性的可接受水平优选为不包含肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的相应寡核苷酸的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的功能活性。通过比较不包含肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的相应寡核苷酸的功能活性，可以如在个体的肌肉组织内或肌肉细胞内或在细胞内体外测量这种功能活性。可在mRNA水平，优选使用RT-PCR进行功能性评价。可在蛋白质水平，优选使用横切片的蛋白质印迹分析或免疫荧光分析进行功能性评价。

本发明上下文中，如存在于寡核苷酸中的肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基，存在于所述寡核苷酸的一部分中，所述部分与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补，所述部分为包含至少8个核苷酸的一段连续序列。因此，在优选实施方案中，包含肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的寡核苷酸或其功能等同物，其中寡核苷酸或其功能等同物包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补的序列，所述部分为包含至少8个核苷酸的一段连续序列，并且其中所述肌苷和/或含有碱基的核苷酸存在于如前面句子定义的与肌营养不良蛋白前体mRNA的至少一部分互补的寡核苷酸序列中。

然而，如本文后面所定义的，这种肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基也可存在于连接部分中，所述连接部分存在于本发明的寡核苷酸中。本文后面会定义优选的连接部分。

在优选实施方案中，这种寡核苷酸优选为药物。更优选地，所述药物用于预防或治疗个体或患者的杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良。如本文所定义的，DMD前体mRNA优选表示DMD或BMD患者的DMD基因的前体mRNA。患者优选旨在表示患有DMD或BMD的患者或者由于其遗传背景易患DMD或BMD的患者。

在DMD患者的情况下，所用的寡核苷酸会优选地校正如存在于所述患者的DMD基因中的DMD突变的至少一个突变，并且因此会优选地产生貌似BMD肌营养不良蛋白的肌营养不良蛋白：优选地，所述肌营养不良蛋白为如本文后面所定义的功能性肌营养不良蛋白。

在BMD患者的情况下，所用的寡核苷酸会优选地校正如存在于所述患者的DMD基因中的BMD突变的至少一个突变，并且因此会优选地产生一个或多个肌营养不良蛋白，所述肌营养不良蛋白比最初存在于所述BMD患者中的肌营养不良蛋白更具功能性。更优选地，所述药物为个体提供一个功能性的或多个功能性的肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA和/或至少部分地减少异常肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的产生。

优选地，通过诱导和/或促进患者的一个或多个细胞、优选肌肉细胞中如本文所确定的DMD前体mRNA的至少一个外显子跳跃，本发明方法为所述患者提供更多个功能性营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的产生增加和/或减少所述患者中异常或功能较低的肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的产生。

为患者提供更具功能性的肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA和/或减少所述患者中异常肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的产生，通常用于DMD患者中。增加更具功能性的或功能性肌营养不良蛋白和/或mRNA的产生，通常用于BMD患者中。

因此，优选方法是为患者或者所述患者的一个或多个细胞提供更具功能性的或功能性肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的产生增加，和/或减少所述患者中异常肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的产生的方法，其中通过比较在开始所述方法时所述患者中所述肌营养不良蛋白和/或mRNA的水平，评价所述异常或更具功能性的肌营养不良蛋白蛋白质和/或mRNA的水平。

如本文所定义的，功能性肌营养不良蛋白优选为对应于具有如SEQID NO：1中确定的氨基酸序列的蛋白质的野生型肌营养不良蛋白。优选地，功能性肌营养不良蛋白是具有在其N末端部分(N末端前240个氨基酸)中的肌动蛋白结合结构域、富半胱氨酸结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端最后325个氨基酸)，这些结构域的每一个都存在于如技术人员已知的野生型肌营养不良蛋白中。本文所指出的氨基酸对应于SEQ ID NO：1所示的野生型肌营养不良蛋白的氨基酸。在另一实施方案中，功能性肌营养不良蛋白为至少在某种程度上显示野生型肌营养不良蛋白的活性的肌营养不良蛋白。“至少在某种程度上”优选表示野生型功能性肌营养不良蛋白的相应活性的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在本上下文中，野生型肌营养不良蛋白的活性优选为与肌动蛋白和肌营养不良蛋白伴随糖蛋白复合物(DGC)⁵⁶的结合。如技术人员已知的，通过使用总蛋白提取物的免疫共沉淀或横切片的免疫荧光分析使肌营养不良蛋白与肌动蛋白和与DGC复合物的结合可视化，所述总蛋白提取物和切片来自疑为营养不良的肌肉的活检。

患有杜氏肌营养不良的个体通常在编码肌营养不良蛋白的基因中具有突变，所述突变防止完整蛋白质的合成，即过早终止防止所述蛋白质的C末端合成。在贝克型肌营养不良中，与野生型相比，肌营养不良蛋白基因也包含突变，但是所述突变通常不包括过早终止，并且通常合成蛋白质的C末端。因此，合成至少与野生型蛋白质具有相同类型活性的功能性肌营养不良蛋白蛋白质，但活性的量不一定相同。在优选实施方案中，功能性肌营养不良蛋白蛋白质表示框内肌营养不良蛋白基因。BMD个体的基因组通常编码肌营养不良蛋白蛋白质，所述蛋白质包含N末端部分(N末端前240个氨基酸)、富半胱氨酸结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端最后325个氨基酸)，但是其中心杆状结构域可以比野生型肌营养不良蛋白的更短⁵⁶。用于DMD治疗的外显子跳跃优选但不唯一地涉及通过跳过杆状结构域状的结构域中的外显子而克服前体mRNA中的过早终止，以校正阅读框并允许合成包括C末端在内的肌营养不良蛋白蛋白质的剩余部分，虽然由于较小的杆状结构域蛋白质变小一些。在优选实施方案中，为患有DMD并用如本本所定义的寡核苷酸治疗的个体提供肌营养不良蛋白，所述肌营养不良蛋白至少在某种程度上显示野生型肌营养不良蛋白的活性。更优选地，如果所述个体为杜氏肌营养不良患者或者疑似为杜氏肌营养不良患者，功能性肌营养不良蛋白为患有BMD的个体的肌营养不良蛋白：优选地，所述肌营养不良蛋白与肌动蛋白和DGC均能相互作用，但是其中心杆状结构域可以比野生型肌营养不良蛋白(Aartsma-Rus et al(2006，参考文献56)的更短。野生型肌营养不良蛋白的中心杆状结构域包含24个血影蛋白样重复⁵⁶。例如，只要如本文所提供的肌营养不良蛋白的中心杆状结构域能够与肌动蛋白和与DGC结合，它就可包含5至23个、10至22个或12至18个血影蛋白样重复。

减少所述患者或所述患者的细胞中异常肌营养不良蛋白的产生，可在mRNA水平评价，且优选地表示通过RT-PCR仍然可以检测到的异常肌营养不良蛋白mRNA初始量的99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少。在本文中异常肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质也称为非功能性或近于非功能性或半功能性肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质。优选地，非功能性肌营养不良蛋白前体mRNA导致框外肌营养不良蛋白蛋白质，这表示将不产生和/或没有检测到肌营养不良蛋白蛋白质。优选地，非功能性肌营养不良蛋白蛋白质为不能结合肌动蛋白和/或DGC蛋白质复合物成员的肌营养不良蛋白蛋白质。通常非功能性肌营养不良蛋白蛋白质或肌营养不良蛋白mRNA没有或不编码具有蛋白质的完整C末端的肌营养不良蛋白蛋白质。

增加所述患者或所述患者的细胞中功能性肌营养不良蛋白的产生，可以在mRNA水平(通过RT-PCR分析)评价，且优选地表示可检测量的功能性或框内肌营养不良蛋白mRNA是通过RT-PCR可以检测的。在另一实施包方案中，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多可检测的肌营养不良蛋白mRNA为功能性或框内肌营养不良蛋白mRNA。

增加所述患者或所述患者的细胞中功能性肌营养不良蛋白的产生，可以在蛋白质水平(通过免疫荧光和蛋白质印迹分析)评价，且优选地表示可检测量的功能性肌营养不良蛋白蛋白质是通过免疫荧光或蛋白质印迹分析可以检测的。在另一实施方案中，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多可检测的肌营养不良蛋白蛋白质为功能性肌营养不良蛋白蛋白质。

优选地，通过比较存在于用本发明的所述分子或组合物治疗前的个体或患者中的量，在所述个体或患者的肌肉组织或肌肉细胞中评价增加或减少。或者，可用所述个体或患者的肌肉组织或细胞进行比较，在局部治疗的情况下，所述肌肉组织或细胞尚未用所述寡核苷酸或组合物治疗。

在优选的方法中，使用本发明的分子或组合物减轻来自DMD或BMD患者的一个或多个症状和/或减轻来自DMD或BMD患者的肌肉细胞或组织的一个或多个特征。可在患者自身评价这类症状。可在给定患者的细胞或组织水平评价这类特征。可以通过对来自患者的肌原细胞或肌肉细胞的以下分析的任一个而评价一个或多个特征的减轻：肌肉细胞钙摄取减少、胶原蛋白合成减少、形态学改变、脂质生物合成改变、氧化应激下降和/或肌纤维功能、完整性和/或存活改善。通常使用肌肉活检横切片的免疫荧光和/或组织化学分析来评价这些参数。

可以通过以下分析的任一个评价使用本发明的分子或组合物减轻个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状：丧失行走能力前的时间延长、肌肉强度改善、举重能力改善、从地板上站起来花费的时间改善、行走九米的时间改善、爬四层楼梯花费的时间改善、腿功能等级改善、肺功能改善、心脏功能改善、生活质量改善。技术人员已知这些分析的每一个。作为实例，Manzur等人(2008，参考文献58)的出版物给出这些分析的每一个的详细说明。对于这些分析的每一个，只要发现分析中所测量的参数的可检测的改善或延长，优选其意味着使用本发明的分子或组合物减轻个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状。可检测的改善或延长优选为如Hodgetts等人(2006，参考文献57)所述的统计学上显著的改善或延长。或者，可通过测量如本文后面所定义的肌纤维功能、完整性和/或存活的改善，来评价杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的减轻。

如本文所用的寡核苷酸优选包含反义寡核苷酸或反义寡核糖核苷酸。在优选的实施方案中，使用外显子跳跃技术。外显子跳跃干扰真核细胞中发生的天然剪接过程。在高等真核生物中，在被内含子序列相互分开的外显子中编码细胞DNA中蛋白质的遗传信息。在一些情况下，这些内含子非常长。真核生物的转录机制生成含有外显子和内含子的前体mRNA，而往往早在前体mRNA产生过程中，剪接机制通过将存在于前体mRNA中的外显子剪接到一起而生成蛋白质的实际编码区。

外显子跳跃引起缺少至少一个被跳跃的外显子的成熟mRNA。因此，当所述外显子编码氨基酸时，外显子跳跃引起改变的产物的表达。目前，外显子跳跃技术针对反义寡核苷酸(AON)的用途。在用于杜氏肌营养不良的mdx小鼠模型中作了大量的这一工作。mdx小鼠在外显子23中带有无义突变。尽管有会妨碍功能性肌营养不良蛋白蛋白质合成的mdx突变，但已经在mdx小鼠组织中观察到少见的天然存在的肌营养不良蛋白阳性纤维。认为由于体细胞突变或通过可选择的剪接，这些肌营养不良蛋白阳性纤维由明显地天然存在的外显子跳跃机制产生。已经显示，分别针对肌营养不良蛋白前体mRNA中的内含子22和23的3′和/或5′剪接位点的AON干扰通常参与去除内含子23的因子，以便也从mRNA中去除外显子23^{3，5，6，39，40}。

通过特定外显子的靶向跳跃，将DMD表型转化成较温和的BMD表型。优选地，通过靶向剪接位点的一个或两个或外显子-内部序列的AON的结合诱导外显子跳跃。针对外显子内部序列的寡核苷酸通常不显示与非外显子序列重叠。优选地，所述寡核苷酸不与剪接位点重叠，至少在所述剪接位点存在于内含子中的情况下不重叠。针对外显子内部序列的寡核苷酸优选不含有与相邻内含子互补的序列。因此，还提供了本发明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其功能等同物用于抑制在由肌营养不良蛋白前体mRNA的剪接产生的mRNA中增加(inclusion)所述前体mRNA的外显子。优选应用外显子跳跃技术，从而肌营养不良蛋白前体mRNA产生的mRNA中外显子的缺乏生成用于更具功能性的虽然更短-肌营养不良蛋白蛋白质的编码区。在本上下文中，抑制外显子的增加优选意指最初的异常肌营养不良蛋白mRNA和/或蛋白质的检测如本文前面所定义地减少。

由于只有当两个剪接位点都被所述剪接体复合物识别时，肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子将包含在生成的mRNA中，因此所述剪接位点为AON的明显靶标。因此，一个实施方案提供了包含与肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区互补的序列的寡核苷酸或其功能等同物。在一个实施方案中，使用只与肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区互补的AON。但这不是必须的：也可使用包含内含子特异性序列和外显子特异性序列的AON。这种AON包含与肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区互补的序列，和与肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子区互补的序列。当然，AON不必与肌营养不良蛋白外显子或内含子的全部序列互补。优选与这种外显子或内含子的一部分互补的AON。优选地，AON与肌营养不良蛋白外显子和/或内含子的至少一部分互补，所述部分至少具有8、10、13、15、20个核苷酸。

通过两个连续的酯交换反应发生肌营养不良蛋白前体mRNA的剪接。首先，在剪接体组装中限定的内含子中的特定分支点核苷酸的2′OH执行对内含子的5′剪接位点上的第一个核苷酸的亲核攻击，形成套索中间体。其次，释放的5′外显子的3′OH然后对3′剪接位点上的内含子的最后一个核苷酸执行亲核攻击，从而连接外显子并释放内含子套索。因而内含子的分支点和剪接位点参与剪接事件。因此，优选包含与这种分支点和/或剪接位点互补的序列的寡核苷酸用于外显子跳跃。因此，还提供了包含与肌营养不良蛋白前体mRNA的剪接位点和/或分支点互补的序列的寡核苷酸或其功能等同物。

由于剪接位点含有共有序列，因此包含与剪接位点互补的序列的寡核苷酸或其功能等同物(在本文中也称为AON)的使用伴随混杂杂交的风险。AON与其他剪接位点而不是将要跳过的外显子的位点的杂交，可能轻易地干扰剪接过程的精确性。为了克服这些以及其他与内含子序列互补的AON的使用有关的潜在性问题，一个优选实施方案提供了包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子互补的序列的寡核苷酸或其功能等同物。优选地，所述AON能特异性地抑制所述肌营养不良蛋白前体mRNA中至少一个外显子的外显子增加信号(exon inclusion signal)。干扰外显子增加信号(EIS)具有这些元件位于外显子中的优点。通过提供用于将要跳过的外显子的内部的AON，可以干扰外显子增加信号，从而阻碍剪接装置，有效掩蔽外显子。因此，剪接装置不能识别将要跳过的外显子导致从最终mRNA中减少(exclusion)该外显子。所述实施方案不直接干扰剪接机制的酶促过程(外显子连接)。认为这可以使所述方法更加特异性和/或可靠。认为EIS是外显子的特殊结构，其可以使剪接受体和供体采取特定空间构象。在所述概念中，是所述特定空间构象使剪接机制能识别外显子。但是，本发明肯定并不限于这种模型。在优选实施方案中，采用能与外显子结合并抑制EIS的寡核苷酸。AON可在任何点特异性地接触所述外显子，还能特异性地抑制所述EIS。

在本发明的上下文中，寡核苷酸的功能等同物优选地意指如本文所定义的寡核苷酸，其中一个或多个核苷酸已被取代，并且其中至少在某种程度上保留所述功能等同物的活性。优选地，所述功能等同物的活性是提供功能性肌营养不良蛋白蛋白质。因此，优选通过定量功能性肌营养不良蛋白蛋白质的量或定量功能性肌营养不良蛋白mRNA的量而评价所述功能等同物的活性。在本文中，优选将功能性肌营养不良蛋白蛋白质(或功能性肌营养不良蛋白mRNA)定义为能够结合肌动蛋白和DGC蛋白质成员的肌营养不良蛋白蛋白质(或由所述mRNA编码的肌营养不良蛋白蛋白质)。优选通过RT-PCR(m-RNA)或免疫荧光或蛋白质印迹分析(蛋白质)进行寡核苷酸的所述活性的评价。优选地，当所述活性表示为所述功能等同物来源的所述寡核苷酸的至少50％或至少60％、或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或更多的相应活性时，至少在某种程度上保留所述活性。通过比较为所述功能等同物来源的所述寡核苷酸的相应寡核苷酸的活性，可以在个体的肌肉组织中或肌肉细胞中或在细胞中体外测量这种活性。贯穿本申请，当使用词语寡核苷酸时，它可被如本申请定义的功能等同物替代。

因此，包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子互补的序列或由所述序列组成的寡核苷酸或其功能等同物，提供良好的DMD治疗结果。在优选的实施方案中，使用包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子2至75的任一个的至少一部分互补的序列或由所述序列组成的寡核苷酸或其功能等同物，所述部分具有或包含至少13个核苷酸。但是，所述部分也可具有至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸。与寡核苷酸互补的肌营养不良蛋白前体mRNA的一部分也称为肌营养不良蛋白前体mRNA的一段连续序列。

最优选地，使用包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8、55、2、11、17、19、21、57、59、62、63、65、66、69和/或75的至少一部分互补的序列或由所述序列组成的AON，所述部分具有或包含至少13个核苷酸。但是，所述部分也可具有至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸。更优选的寡核苷酸用包含以下序列SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：539的每一个或由以下序列SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：539的每一个组成的序列表示，其中至少一个肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基存在于所述序列中。优选地，将肌苷引入这些序列的一个序列中，以替换鸟嘌呤、腺嘌呤或尿嘧啶。相应地，如本文所用的更优选的寡核苷酸用包含SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：486或SEQ ID NO：539、更优选SEQ ID NO：2至SEQ IDNO：237或SEQ ID NO：539、最优选SEQ ID NO：76或由所述序列组成的序列表示，其中至少一个肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基存在于所述序列中。优选地，将肌苷引入这些序列的一个序列中，以替换鸟嘌呤、腺嘌呤或尿嘧啶。

相应地，在另一优选的实施方案中，如本文所用的寡核苷酸用包含SEQ ID NO：540至SEQ ID NO：576或由所述序列组成的序列表示。更优选地，如本文所用的寡核苷酸用包含SEQ ID NO：557或由所述序列组成的序列表示。

所述外显子以患者群体适用性的递减顺序列出。因此，与包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子44互补的序列等的AON相比，包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子51的至少一部分互补的序列的AON的使用，适合于更大部分的DMD患者群体中。

在优选的实施方案中，本发明寡核苷酸包含与肌营养不良蛋白前体mRNA的一部分互补的序列，所述寡核苷酸为这样的：所述互补部分为本发明的寡核苷酸长度的至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％或更优选至少95％，或更优选至少98％或更优选至少99％，或更优选100％。在最优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸由与如本文所定义的肌营养不良蛋白前体mRNA的一部分互补的序列组成。作为实例，寡核苷酸可包含与如本文所定义的肌营养不良蛋白前体mRNA的一部分互补的序列和其他侧翼序列。在更优选实施方案中，所述寡核苷酸的所述互补部分的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸。优选地，其他侧翼序列用于修饰蛋白质与寡核苷酸的结合或修饰寡核苷酸的热动力性质，更优选地修饰靶RNA结合亲合性。

一个优选实施方案提供了寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸或其功能等同物包含

-与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的区域互补的序列，所述区域与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的另一部分杂交(封闭结构)；和

-与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的区域互补的序列，所述区域在所述肌营养不良蛋白前体mRNA中不杂交(开放结构)。

对于此实施方案，参考WO 2004/083432，所述WO 2004/083432的全文内容通过援引并入。RNA分子表现出强二级结构，主要由于相同RNA中互补或部分互补序列段的碱基配对导致的。长期以来，认为RNA中的结构在RNA的功能中发挥作用。在不受理论束缚的情况下，相信外显子RNA的二级结构在组织剪接过程中发挥作用。认为外显子结构是指导在mRNA中增加该外显子的一个参数。但是，其他参数也可在其中发挥作用。在本文中信号传导功能称为外显子增加信号。所述实施方案的互补寡核苷酸能干扰外显子结构，从而能干扰外显子的外显子增加信号。已经发现许多互补寡核苷酸的确具有这种能力，有的互补寡核苷酸比其他寡核苷酸更有效。所述优选实施方案的寡核苷酸，即具有针对天然外显子RNA中开放和封闭结构的所述重叠的寡核苷酸选自所有可能的寡核苷酸。所述选择包括能有效干扰外显子增加信号的寡核苷酸。在不受理论束缚的情况下，认为与开放结构的重叠改善了寡核苷酸的侵入效率和防止剪接因子的结合(即提高寡核苷酸可进入所述结构的效率)，然而与封闭结构的重叠随后提高干扰外显子RNA的二级结构的效率，从而干扰外显子增加信号。发现与封闭和开放结构的部分互补性的长度不受严格限制。我们已经观察到二者任一结构中具有互补性的可变长度的寡核苷酸的高效率。本文所用的术语互补性指的是在生理条件下可与核酸的另一段序列杂交的一段核酸序列。因此，并不是绝对要求互补性区域中所有碱基都能与相对链中的碱基配对。例如，当设计寡核苷酸时，可能想要掺入例如不与互补链上的碱基配对的残基。如果在细胞中的环境下，一段核苷酸序列能充分地与互补部分杂交，那么在某种程度上可允许错配序列。在此环境中，“充分地”优选意指使用如EP 1 619 249的实施例1中所述的凝胶迁移率变动分析，可检测到寡核苷酸的结合。任选地，可通过转染到患者的肌肉细胞中而进一步测试所述寡核苷酸。可用RT-PCR评价靶向外显子跳跃(如EP 1 619 249中所述)。互补区域优选设计为当组合时，它们对于前体mRNA中的外显子是特异性的。由于所述特异性取决于体系中其他(前体)mRNA的真实序列，所以可用互补区域的各种长度产生这种特异性。一个或多个其他前体mRNA也能与寡核苷酸杂交的风险随着寡核苷酸大小的增加而降低。在互补性区域中包含错配序列但是保留与前体mRNA中靶向区域杂交的能力的寡核苷酸可用于本发明中，这是明确的。然而，优选地，至少互补部分不包含这样的错配序列，因为所述互补部分通常比在一个或多个互补区域中具有这样的错配序列的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特异性。认为较高的杂交强度(即增加与相对链相互作用的数目)有利于提高干扰该体系的剪接机制的过程效率。优选地，互补性在90％-100％之间。通常，在大约20个核苷酸的寡核苷酸中这允许大约1至2个错配。

二级结构最好在存在外显子的前体mRNA的环境下分析。可在真实RNA中分析这种结构。但是，目前可以使用结构建模程序相当好地预测RNA分子的二级结构(耗费最少的精力)。适当的程序的非限制实例是RNA mfold版本3.1服务器⁴¹。给出核苷酸序列，本领域的技术人员将能够以适当的重现性预测外显子的可能结构。当为这种建模程序提供外显子和侧翼内含子序列时，得到最佳预测。通常不必构建整个前体mRNA结构的模型。

优选地，寡核苷酸所针对的开放和封闭结构相互靠近。认为以这种方式，寡核苷酸退火到开放结构诱导封闭结构的开放，于是退火在所述封闭结构中进行。通过所述作用，先前封闭的结构采取不同构象。所述不同构象导致外显子增加信号的中断。但是，当潜在(隐藏的)剪接受体和/或供体序列存在于靶向外显子内时，有时产生定义不同(新)外显子的新外显子增加信号，即具有不同5′端、不同3′端或两者。因为从mRNA中减少靶向外显子，这种活性类型在本发明的范围内。在mRNA中包含靶向外显子的一部分的新外显子的存在不改变像这样减少靶向外显子的事实。新外显子(neo-exon)的增加可看作仅仅有时出现的副作用。当外显子跳跃用于恢复肌营养不良蛋白的开放阅读框(的一部分)时，所述肌营养不良蛋白由于突变而被破坏，具有两种可能性。一种可能性是新外显子在阅读框恢复中是有功能的，然而在其他情况下，并未恢复所述阅读框。当选择用于藉由外显子跳跃而恢复肌营养不良蛋白阅读框的寡核苷酸时，当然清楚的是，在这些条件下，仅仅选择这样的寡核苷酸：其的确引起使用或不使用新外显子恢复肌营养不良蛋白开放阅读框的外显子跳跃。

此外还提供了寡核苷酸或其功能等同物，其包含与肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子RNA中的丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白的结合位点互补的序列。在WO 2006/112705中，我们已经公开了外显子-内部反义寡核苷酸(AON)在诱导外显子跳跃中的有效性以及所述AON的靶前体mRNA位点中(例如被ESE finder)预测的SR结合位点的存在之间存在相关性。因此，在一实施方案中，生成寡核苷酸，其包括确定肌营养不良蛋白外显子RNA中用于SR(Ser-Arg)蛋白质的(推定的)结合位点，并且产生与所述RNA互补以及与所述(推定的)结合位点至少部分地重叠的寡核苷酸。术语“至少部分地重叠”在本文中定义为包含SR结合位点的仅仅单个核苷酸的重叠、所述结合位点的多个核苷酸的重叠以及所述结合位点的完全重叠。优选地，本实施方案还包括确定来自所述RNA的二级结构、与所述RNA的另一部分杂交的区域(封闭结构)和在所述结构中不杂交的区域(开放结构)，随后生成与所述(推定的)结合位点至少部分重叠以及与所述封闭结构的至少一部分重叠和与所述开放结构的至少一部分重叠的寡核苷酸。这样，我们增加了获得寡核苷酸的机会，所述寡核苷酸能干扰来自前体mRNA的外显子增加到mRNA中。有可能第一个选择的SR结合区域没有需要的开放-封闭结构，在此情况下，选择另一(第二个)SR蛋白质结合位点，随后测试所述另一(第二个)SR蛋白质结合位点的开放-封闭结构的存在。持续所述过程，直到确定含有SR蛋白质结合位点和(部分重叠)开放-封闭结构的序列。然后用所述序列设计与所述序列互补的寡核苷酸。

也通过颠倒所述顺序实施生成寡核苷酸的这样的方法，即首先生成寡核苷酸，其包括确定来自肌营养不良蛋白外显子RNA的二级结构、采取与所述RNA的另一部分杂交的结构的区域(封闭结构)和不在所述结构中杂交的区域(开放结构)，随后生成寡核苷酸，所述寡核苷酸的至少一部分与所述封闭结构互补并且所述寡核苷酸的至少另一部分与所述开放结构互补。然后确定SR蛋白质结合位点是否至少与所述开放/封闭结构重叠。这样改进了WO 2004/083432的方法。在另一实施方案中所述选择同时进行。

在不希望受理论束缚的情况下，当前认为针对SR蛋白质结合位点的寡核苷酸的使用引起(至少部分地)损害SR蛋白质与SR蛋白质结合位点的结合，其导致中断的或受损的剪接。

优选地，开放/封闭结构和SR蛋白质结合位点部分重叠，更优选地，开放/封闭结构与SR蛋白质结合位点完全重叠或者SR蛋白质结合位点与开放/封闭结构完全重叠。这考虑到改善外显子增加的破坏。

除了共有剪接位点序列之外，还有许多(如果不是全部)外显子含有剪接调节序列例如外显子剪接增强子(ESE)序列，以促进剪接体识别真正的剪接位点^42，43。一亚群剪接因子，称为SR蛋白质，可与这些ESE结合并且将其他剪接因子如U1和U2AF募集至(弱定义的)剪接位点。已经详细分析了四个最丰富的SR蛋白质(SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55)的结合位点，并且这些结果应用于ESE finder中，所述ESE finder为预测这些SR蛋白质的潜在结合位点的网络资源^42，43。AON的效力与SF2/ASF、SC35和SRp40结合位点的存在/缺乏之间存在相关性。在优选实施方案中，本发明因而提供了如上所述的组合，其中所述SR蛋白质为SF2/ASF或SC35或SRp40。

在一个实施方案中，寡核苷酸或其功能等同物能特异地结合转录物中肌营养不良蛋白外显子的正确剪接所需的调节RNA序列。若干顺式作用RNA序列是转录物中外显子的正确剪接所需的。特别是，确定其他元件例如内含子或外显子剪接增强子(ISE和ESE)或沉默子(ISS和ESE)以调节组成型和选择性外显子的特异性的有效剪接。如为DMD所显示的，使用与所述元件结合的序列特异性反义寡核苷酸(AON)，扰乱这些元件的调节功能，从而跳过外显子。因此，在一个优选的实施方案中，使用与内含子剪接增强子(ISE)、外显子剪接增强子(ESE)、内含子剪接沉默子(ISS)和/或外显子剪接沉默子(ESS)互补的寡核苷酸或其功能等同物。如本申请先前已经描述的，在一个优选实施方案中，肌营养不良蛋白外显子被能特异地抑制所述外显子的外显子增加信号的试剂跳过，从而作为需要在mRNA中增加的部分的所述外显子不被剪接机制识别。因此，形成了没有所述外显子的mRNA。

优选地，本文所用的AON与肌营养不良蛋白外显子RNA或肌营养不良蛋白内含子RNA的8-50个核苷酸的连续部分或一段连续序列互补。在一个实施方案中，本文所用的AON与肌营养不良蛋白外显子RNA或肌营养不良蛋白内含子RNA的14-50个核苷酸的连续部分或一段连续序列互补。优选地，所述AON与所述外显子RNA的14-25个核苷酸的连续部分或一段连续序列互补。更优选地，使用包含与肌营养不良蛋白外显子RNA或肌营养不良蛋白内含子RNA的20-25个核苷酸的连续部分或一段连续序列互补的序列的AON。

可使用不同类型的核酸以生成寡核苷酸。优选地，所述寡核苷酸包含RNA，因为RNA/RNA杂合体非常稳定。由于外显子跳跃技术的一个目的是在个体中指导剪接，因此优选的是，寡核苷酸RNA包含为RNA提供其他性质的修饰，例如内切核酸酶、外切核酸酶和核糖核酸酶H(RNaseH)抗性、另外的杂交强度、稳定性(例如在体液中)提高、柔性增加或减少、毒性降低、胞内运输增加、组织特异性等。优选地，所述修饰包括2’-O-甲基硫代磷酸酯寡核糖核苷酸修饰。优选地，所述修饰包括2’-O-甲基硫代磷酸酯寡脱氧核糖核酸修饰。因此，一个实施方案提供了所使用的包含RNA的寡核苷酸，所述RNA含有修饰，优选2’-O-甲基修饰的核糖(RNA)或脱氧核糖(DNA)修饰。

在一个实施方案中，本发明提供了包含寡核苷酸和锁核酸的杂交寡核苷酸，所述寡核苷酸包含2’-O-甲基硫代磷酸酯寡(脱氧)核糖核苷酸修饰。与由锁核酸组成的等同物相比，所述具体的寡核苷酸具有更好的序列特异性，并且当与由2’-O-甲基硫代磷酸酯寡(脱氧)核糖核苷酸修饰组成的寡核苷酸相比时，具有改善的有效性。

随着核酸模拟技术的出现，可以生成在种类上而不必在数量上具有与核酸本身相似的，优选相同的杂交特征的分子。当然，所述功能等同物也适合用于本发明中。寡核苷酸的功能等同物的优选实例为肽核酸和/或锁核酸。最优选地，使用吗啉代磷酸二酰胺。可在参考文献44至50中找到本发明的寡核苷酸的等同物的合适但非限制性实例。当然，等同物的一个或多个相互之间和/或与核酸之间的杂交也是合适的。在优选的实施方案中，锁核酸作为寡核苷酸的功能等同物使用，由于锁核酸显示出更高的靶亲和性和降低的毒性，因此表现出更高的外显子跳跃效率。

在一个实施方案中，将能抑制在肌营养不良蛋白mRNA中增加肌营养不良蛋白外显子的寡核苷酸或其功能等同物与能抑制在肌营养不良蛋白mRNA中增加另一个肌营养不良蛋白外显子的至少一其他寡核苷酸或其功能等同物组合。这样便防止了在由所述前体mRNA产生的mRNA中增加肌营养不良蛋白前体mRNA的两个或更多个外显子。本实施方案进一步称为双外显子跳跃或多外显子跳跃^2，15。在大多数情况下，双外显子跳跃导致在肌营养不良蛋白前体mRNA中仅减少两个靶向外显子。但是，在其他情况下，即使当其他外显子(间插外显子(intervening exon))存在于所述前体mRNA中的靶向外显子之间的整个区域时，发现所述外显子和所述区域不存在于产生的mRNA中。对于来源于DMD基因的寡核苷酸的组合，多外显子跳跃显著如此，其中将外显子45的寡核苷酸和外显子51的寡核苷酸加入到转录DMD基因的细胞中。这种构成(set-up)导致生成的mRNA不含有外显子45至51。明显地，在所述寡核苷酸存在下的前体mRNA的结构为如此，即刺激剪接机制以使外显子44和52相互连接。多外显子跳跃的其他优选实例为：

-靶向外显子17和第二个外显子48的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子或外显子17和外显子48之间整个区域的跳跃。

-靶向外显子17和第二个外显子51的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子或外显子17和外显子51之间整个区域的跳跃。

-向外显子42和第二个外显子55的寡核苷酸靶的用途，其可导致所述两个外显子或外显子42和外显子55之间整个区域的跳跃。

-向外显子43和第二个外显子51的寡核苷酸靶的用途，其可导致所述两个外显子或外显子43和外显子51之间整个区域的跳跃。

-靶向外显子43和第二个外显子55的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子或外显子43和外显子55之间整个区域的跳跃。

-靶向外显子45和第二个外显子55的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子或外显子45和外显子55之间整个区域的跳跃。

-靶向外显子45和第二个外显子59的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子或外显子45和外显子59之间整个区域的跳跃。

-靶向外显子48和第二个外显子59的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子或外显子48和外显子59之间整个区域的跳跃。

-靶向外显子50和第二个外显子51的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子的跳跃。

-靶向外显子51和第二个外显子52的寡核苷酸的用途，其可导致所述两个外显子的跳跃。

因此还提供了包含至少8个、优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，所述连续核苷酸与肌营养不良蛋白前体mRNA的第一个外显子互补，其中使用包含至少8个、优选16-80个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸与所述肌营养不良蛋白前体mRNA的第二个外显子互补。所述第一个和所述第二个外显子可以是一样的。

在一个优选实施方案中，所述第一个和所述第二个外显子在所述肌营养不良蛋白前体mRNA中被不与所述寡核苷酸互补的至少一个外显子分开。或者，所述第一个和所述第二个外显子是相邻的。

通过提供所述两个互补寡核苷酸之间的连接，也可以特异性地促进间插外显子的跳跃。因此，在一个实施方案中，与至少两个肌营养不良蛋白外显子互补的核苷酸序列被连接部分分开。因而，本实施方案中连接核苷酸的至少两段序列，从而形成单个分子。因此，还提供了与肌营养不良蛋白前体mRNA中至少两个外显子互补的寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸或其功能等同物包含至少两部分，其中第一部分包含具有至少8个、优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，所述连续核苷酸与所述至少两个外显子的第一个互补，并且其中第二部分包含具有至少8个、优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，所述连续核苷酸与所述肌营养不良蛋白前体mRNA中第二个外显子互补。可通过任何方式进行连接，但是优选通过核苷酸连接而实现。在后一情况下，不含有一个或另一个互补外显子间重叠的核苷酸的数目可以为零，但是优选为4-40个核苷酸。连接部分可为任何类型的能连接寡核苷酸的部分。优选地，所述连接部分包含至少4个尿嘧啶核苷酸。目前，可采用许多模拟寡核苷酸的杂交特征的不同化合物。如果这种等同物在种类上而不必在数量上具有相似的杂交特征，那么这种化合物，其在本文中称为寡核苷酸的功能等同物，也适用于本发明。本说明书前面描述了合适的功能等同物。如所述的，本发明的寡核苷酸不一定只由有助于与靶向外显子杂交的寡核苷酸组成。还可以有添加的其他材料和/或核苷酸。

DMD基因是具有许多不同外显子的大基因。考虑到所述基因位于X染色体上，尽管女孩也会受到这种疾病的侵袭，但是主要是男孩受到侵袭，由于他们会接收来自双亲的基因坏拷贝，或者由于他们的肌肉细胞中特别偏好的X染色体失活而遭受特别偏好的功能性等位基因失活。该蛋白质由许多(79个)超过至少2.4Mb范围的外显子编码。缺陷可出现在DMD基因的任何部分。一个具体外显子或多个具体外显子的跳跃往往可导致编码比正常更短但至少具有部分功能的肌营养不良蛋白蛋白质的重构mRNA。基于外显子跳跃技术的药物开发中的实际问题是，可能导致细胞中功能性肌营养不良蛋白蛋白质缺陷的许多突变。尽管存在已经通过单一外显子跳跃能够校正许多不同突变的事实，然而所述多个突变需要生成一系列不同的药物，因为对于不同的突变，不同的外显子需要被跳过。寡核苷酸或者包含至少两个如本文后面所定义的能诱导两个或更多个外显子跳跃的不同寡核苷酸的组合物的优点是，使用单一药物可跳过多个外显子。这种性质不仅仅是在实践上很有用，因为仅仅需要生成有限数量的药物用于治疗许多不同DMD或者特别严重的BMD突变。如今本领域技术人员可选的另一个选项是，选择具有特别功能的重构的肌营养不良蛋白蛋白质和制备能生成这些优选肌营养不良蛋白蛋白质的化合物。这些优选的最终结果进一步称为温和表型肌营养不良蛋白。

优选地，基于临床试验(体内应用)中递增剂量研究，设计本发明的寡核苷酸的剂量范围，对于所述临床试验，存在严格的规程要求。可以在0.1mg/kg至20mg/kg之间、优选在0.5mg/kg至10mg/kg之间变动的剂量使用如本文所定义的分子或核苷酸。

在优选的实施方案中，使用在0.1nM至1μM之间变动的如本文所定义的寡核苷酸的浓度。优选地，所述范围是在细胞模型如肌肉细胞或肌肉组织中用于体外应用。更优选地，所用浓度在0.3nM至400nM之间、更优选在1nM至200nM之间变动。如果使用几个寡核苷酸，所述浓度或剂量可以指寡核苷酸的总浓度或剂量或者所添加的每个寡核苷酸的浓度或剂量。

如上所给出的寡核苷酸的浓度或剂量范围为用于体外或离体应用的优选浓度或剂量。技术人员应当了解，根据所用的寡核苷酸、要治疗的靶细胞、基因靶标及其表达水平、所用的介质和转染及孵育条件，所用的寡核苷酸的浓度或剂量可进一步改变和需要进一步优化。

如本文所定义的用于本发明的用途的寡核苷酸，可适合体内给予给个体的细胞、组织和/或器官，所述个体受到DMD或BMD侵袭或者具有罹患DMD或BMD的风险，并且可体内、离体(ex vivo)或体外给予。所述寡核苷酸可直接或间接地体内施用给个体的细胞、组织和/或器官，所述个体受到DMD或BMD侵袭或者具有罹患DMD或BMD的风险，并且可直接或间接地体内、离体或体外给予。由于杜氏和贝克型肌营养不良在肌肉细胞中具有明显表型，所以优选所述细胞是肌肉细胞，还优选所述组织为肌肉组织和/或还优选所述器官包含肌肉组织或由肌肉组织组成。优选器官为心脏。优选地，所述细胞包含编码突变的肌营养不良蛋白蛋白质的基因。优选地，所述细胞为患有DMD或BMD的个体的细胞。

可使用本领域已知的合适方式，间接地给予本发明的寡核苷酸。例如，可以以表达载体形式将寡核苷酸给予个体或者所述个体的细胞、组织或器官，其中所述表达载体编码包含所述寡核苷酸的转录物。优选地，通过基因递送载体(gene delivery vehicle)将所述表达载体引入到细胞、组织、器官或个体中。在优选实施方案中，提供了包含表达盒或转录盒的基于病毒的表达载体，所述表达盒或转录盒驱动如本文所确定的分子的表达或转录。优选递送载体为病毒载体如腺伴随病毒载体(AAV)或者逆转录病毒载体如慢病毒载体^4，51，52等。质粒、人工染色体、适于细胞的人基因组中靶向同源重组和整合的质粒也可适当地用于递送如本文所定义的寡核苷酸。对于本发明，优选这样的载体，即在所述载体中，转录受PolIII启动子驱动，和/或其中转录物为具有U1或U7转录物的融合物形式，所述载体获得良好的递送小转录物的结果。设计合适的转录物属于技术人员的技能。优选PolIII驱动的转录物。优选地，采用具有U1或U7转录物的融合转录物形式^4，51，52。可如参考文献53和54所述，生成所述融合物。按照原来的样子，可递送所述寡核苷酸。但是，所述寡核苷酸也可由病毒载体编码。通常这为RNA转录物形式，所述RNA转录物在转录物的一部分中包含所述寡核苷酸序列。

考虑到目前已实现的进展，预期为个体或者所述个体的细胞、组织、器官提供寡核苷酸和/或其等同物的方式的改进。当然，可以纳入这些未来的改进以达到所述的对使用本发明的方法重构mRNA的影响。寡核苷酸和/或其等同物可以按照原来的样子递送到个体或所述个体的细胞、组织或器官。当给予寡核苷酸和/或其等同物时，优选将寡核苷酸和/或其等同物溶于适合所述递送方法的溶液中。对于静脉内、皮下、肌内、鞘内和/或心室内给药，优选所述溶液为生理盐溶液。在本发明中，特别优选使用赋形剂，所述赋形剂有助于将如本文所定义的组分中的每一个递送至细胞和/或细胞中，优选肌肉细胞。优选能形成递送如本文所定义的每个组分的复合物、纳米粒子、微胶粒、小囊泡(vesicle)和/或脂质体的赋形剂，所述组分通过细胞膜被复合或捕获到小囊泡或脂质体中。许多所述赋形剂是本领域内已知的。合适的赋形剂包括聚乙烯亚胺(PEI)或者类似的阳离子聚合物，包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PEC)和衍生物、合成的两性分子(SAINT-18)、脂质体(lipofectin^TM)、DOTAP和/或能自组装成颗粒的病毒外壳蛋白质，所述颗粒能将如本文所定义的每个组分递送至细胞，优选递送至肌肉细胞。已显示所述赋形剂可将寡核苷酸如反义核酸有效地递送至多种培养的细胞，包括肌肉细胞。根据总细胞存活，将它们的高转染潜能与期望的低毒性至中等毒性结合。结构修饰的便利，可用于允许其他修饰和分析它们的其他(体内)核酸转移特征和毒性。

脂质体(lipofectin)代表脂质体转染剂的实例。它由两个脂质组分组成，即阳离子脂质N-[1-(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三甲胺盐酸盐(DOTMA)(比较DOTAP，其为甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组递送体系为聚合物纳米粒子。

熟知作为DNA转染剂的聚阳离子如二乙氨基乙基(DEAE)-葡聚糖可与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)组合，以配制阳离子纳米粒子，所述纳米粒子可将如本文所定义的每个组分、优选寡核苷酸，横跨细胞膜递送到细胞中。

除了这些普通纳米粒子材料外，阳离子肽鱼精蛋白也提供备选方法以用胶体配制寡核苷酸。这种胶体纳米粒子***可形成所谓的颗粒，其通过简单的自我组装过程制备，以包装寡核苷酸并介导寡核苷酸的细胞内释放。技术人员可选择和改造以上或其他市售的选择性赋形剂和递送***的任一个，以包装和递送用于本发明的寡核苷酸，从而递送所述寡核苷酸用于治疗人类中的杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良。

另外，可以将寡核苷酸共价或非共价连接于经特别设计而促进摄取到细胞、细胞质和/或其细胞核中的引导配体。这种配体可包含(i)识别促进细胞摄取的细胞、组织或器官特异性元件的化合物(包括但不限于肽(样)结构)和/或(ii)能促进摄取到细胞中和/或从小囊泡如内体或溶酶体胞内释放寡核苷酸的化合物。

因此，在优选的实施方案中，将寡核苷酸配制在组合物或药物或组合物中，向所述组合物或药物提供有至少一种赋形剂和/或用于递送的引导配体和/或所述组合物的送递工具(delivery device)，用于送递至细胞胞和/或增强其细胞内递送。相应地，本发明还包括药学上可接受的组合物，所述组合物包含寡核苷酸，并且还包含至少一种赋形剂和/或用于送递的引导配体和/或所述寡核苷酸的递送工具，用于送递到细胞和/或增强其细胞内递送。

应当了解，如果组合物包含其他组分如本文后面所定义的辅助化合物，那么所述组合物的每个组分可能不被配制在单一组合或组合物或制剂中。根据它们的特性，技术人员应当理解对于如本文所定义的每个组分，哪种类型的配方是最适当的。在优选实施方案中，本发明提供多组分试剂盒(kit of parts)形式的组合物或制剂，所述多组分试剂盒包含寡核苷酸和如本文后面所定义的另外的辅助化合物。

优选的寡核苷酸用于预防或治疗个体中杜氏肌营养不良(DMD)或贝克型肌营养不良(BMD)。可用本发明的寡核苷酸治疗的个体也许已经诊断为患有DMD或BMD。或者，也许可用本发明的寡核苷酸治疗的个体还未诊断为患有DMD或BMD，但是考虑到他的或她的遗传背景，所述个体可以是具有在将来罹患DMD或BMD的风险增加的个体。优选的个体为人类。

组合物

另一方面，提供了包含本文所定义的寡核苷酸的组合物。优选地，所述组合物包含本文所定义的至少两种不同的寡核苷酸。更优选地，所述两种不同的寡核苷酸经设计跳过本文前面所定义的不同的两个或更多个外显子，用于多外显子跳跃。

在优选的实施方案中，所述组合物优选为药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂和/或赋形剂。

还提供了可包含任何药学上可接受的载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂、稀释剂和/或赋形剂的这种药物组合物。例如可在Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(雷明顿：药学技术与实践)，20^th Edition.Baltimore，MD：Lippincott Williams&Wilkins，2000中找到所述药学上可接受的载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂、稀释剂和/或赋形剂。本申请前面已经定义了所述组合物的每个特征。

如果使用几个寡核苷酸，则本文已经定义的浓度或剂量可指所有所用的寡核苷酸的总浓度或剂量或每个所用的或添加的寡核苷酸的浓度或剂量。因此，在一个实施方案中，提供了组合物，其中所用的每一核苷酸或全部寡核苷酸的给药剂量在0.5mg/kg至10mg/kg的范围内变动。

优选组合物还包含：

a)用于减少炎症，优选用于减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或

b)用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，和/或

c)显示通读活性的化合物。

已经出乎意料地发现，当使用针对外显子或针对所述外显子的一个或两个剪接位点的寡核苷酸时，如果向表达所述前体mRNA的细胞也提供了用于减少炎症，优选用于减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，那么来自包含所述外显子的前体mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率就增强了。所述增强的跳跃频率也提高了DMD或BMD个体的肌肉细胞中所产生的功能性肌营养不良蛋白蛋白质的水平。

根据本发明，即使当通过施给本发明的寡核苷酸而恢复DMD患者中肌营养不良蛋白蛋白质缺陷时，组织炎症和受损肌肉细胞的存在仍然继续加剧DMD的症状。因此，即使DMD的原因-即功能失调的肌营养不良蛋白蛋白质-减轻了，仍然通过另外使用根发明的辅助疗法，进一步改善DMD的治疗。此外，本发明洞悉炎症减少不会引起肌肉细胞AON摄取的显著减少。这是令人吃惊的，因为通常炎症增强细胞、血液和其他化合物的运输。因而在炎症过程中也增强了AON摄取/递送。因此，在本发明之前，预期对抗炎症的辅助疗法包括消极地影响AON疗法的风险。然而，看来情况并非如此。

用于减少炎症的辅助化合物包括任何能至少部分地减少炎症，优选由受损肌肉细胞引起的炎症的疗法。最优选地，所述辅助化合物能减少肌肉组织炎症。优选地，通过检测疑为营养不良的肌肉组织中浸润性免疫细胞如中性粒细胞和/或肥大细胞和/或树突细胞和/或淋巴细胞数目的增加而评价炎症。优选地，在具有如上鉴别的特异性染色的免疫细胞后，在疑为营养不良的肌肉组织活检的横切片中进行所述评价⁵⁷。优选地，在显微镜下进行定量。因此，优选地，通过检测疑为营养不良的肌肉组织的横切片中免疫细胞数目的降低而评价炎症减少。优选地，检测降低意思是，与治疗前同一个体中相应免疫细胞的数目相比，如上识别的至少一类免疫细胞的数目降低至少1％、2％、3％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。最优选地，在所述活检的横切片中检测不到浸润性免疫细胞。

用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物包括任何疗法，与不存在所述辅助化合物的其他相似情况相比，所述疗法能可测量地增强肌纤维功能、完整性和/或存活。使用以下分析中的至少一种评价肌纤维功能、完整性和/或存活的改善：血液中肌酸激酶可检测的减少、疑为营养不良的肌肉的活检横切片中肌纤维坏死可检测的减少和/或疑为营养不良的肌肉的活检横切片中肌纤维直径同质性可检测的增加。这些分析中的每一种都是技术人员已知的。

可以如57中所述检测血液中的肌酸激酶。肌酸激酶可检测的减少可以指与治疗前同一个体中肌酸激酶的浓度相比，减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。

优选地，在肌肉活检中评价肌纤维坏死可检测的减少，更优选地，如57中所述使用活检横切片评价肌纤维坏死可检测的减少。坏死可检测的减少可以是面积减少了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中已使用活检横切片鉴别坏死。通过比较治疗前在同一个体中所评价的坏死而测量所述减少。

优选地，在肌肉活检横切片中评价肌肉肌纤维直径同质性可检测的增加，更优选地，如57中所述，进行评价。

在一个实施方案中，使用用于增加受损肌肉细胞更新的辅助化合物。用于增加受损肌肉细胞更新的辅助化合物包括任何能至少部分地诱导和/或增加受损肌肉细胞更新的疗法。受损肌肉细胞为具有比健康完整的肌肉细胞显著地更少的临床上可测量的功能性的肌肉细胞。在不存在肌营养不良蛋白时，机械应力导致肌膜破裂，引起钙不受控制地流入肌纤维内部，从而触发钙激活的蛋白酶和纤维坏死，导致肌肉细胞受损。增加受损肌肉细胞的更新意思是，与不增加受损肌肉细胞更新的情况相比，受损肌肉细胞被更快地分解和/或去除。优选地，在肌肉活检中评价受损肌肉细胞的更新，更优选地，如57中所述使用活检横切片评价受损肌肉细胞的更新。可检测的更新的增加可以是面积增加了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中已使用活检横切片鉴别了更新。通过比较如治疗前同一个体中所评价的更新，测量所述增加。

在不希望受理论束缚的情况下，认为优选增加肌肉细胞的更新，因为这减少了炎症应答。

根据本发明，还包含用于减少炎症，优选用于减少个体中肌肉组织炎症的辅助疗法的本发明组合物尤其适合用作药物。与不包含所述辅助化合物的组合相比，这种组合物甚至能更好地减轻杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状。当使用针对外显子或针对所述外显子的一个或两个剪接点的寡核苷酸时，本实施方案还增强来自包含所述外显子的前体mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率。所述增强的跳跃频率也提高了DMD或BMD个体的肌肉细胞中所产生的功能性肌营养不良蛋白蛋白质的水平。

因此，进一步提供了还包含用于减少炎症，优选用于减少所述个体中肌肉组织炎症的辅助化合物的组合物，所述组合物用作药物，优选用于治疗或预防或对抗DMD。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成功能不充分的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质或者改变的或截短的肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质。

用于减少炎症的优选辅助化合物包括类固醇、TNF-α抑制剂、mIGF-1源和/或抗氧化剂。然而，本发明也包括如本文所定义的能减少炎症的任何其他化合物。后面详细介绍这些化合物中的每一种。详细介绍的所述化合物中的每一种都可单独使用或相互组合使用和/或与用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物的一种或多种组合使用。

此外，包含用于改善个体中肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助疗法的组合物尤其适合用作药物，优选用于治疗或预防DMD。与不包含所述辅助化合物的组合物相比，这类组合物甚至能更好地减轻杜氏肌营养不良的一个或多个症状。

用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活的优选辅助化合物包括离子通道抑制剂、蛋白酶抑制剂、L-精氨酸和/或血管紧张素II I型受体阻断剂。然而，本发明也包括如本文所定义的能改善肌纤维功能、完整性和/或存活的任何其他化合物。后面详细介绍这些化合物种的每一种。详细介绍的所述化合物种的每一种都可单独使用或相互组合使用和/或与用于减少炎症的辅助化合物的一种或多种组合使用。

在特别优选的实施方案中，组合物还包含类固醇。这种组合物引起DMD症状的显著减轻。当使用针对外显子或所述外显子的一个或两个剪接点的寡核苷酸时，该实施方案还增强来自包含所述外显子的前体mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率。所述增强的跳跃频率也提高了DMD或BMD个体的肌肉细胞中所产生的功能性肌营养不良蛋白蛋白质的水平。

在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成功能不充分的非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。

类固醇是特征为具有通常排列为6-6-6-5型的四稠环碳骨架的萜类脂质。类固醇依据连接于这些环的官能团和环的氧化态而变化。类固醇包括通常用于减轻肿胀和炎症的激素和药物，例如***、***和维生素D。

根据本发明，DMD患者中辅助类固醇疗法的附助作用包括减少组织炎症、抑制细胞毒性细胞及改善钙体内平衡。在年纪较小的男孩中获得最积极的结果。优选地，类固醇为皮质类固醇，更优选地，为糖皮质类固醇。优选地，根据本发明，组合使用***类固醇如***、***龙或地夫可特²¹。基于临床试验中递增剂量研究，设计用于如本文所述的治疗用途的类固醇或糖皮质类固醇的剂量范围，对于所述临床试验，存在严格的规程要求。对于***和***龙，常用剂量为0.5-1.0mg/kg/天，优选为0.75mg/kg/天，对于地夫可特，常用剂量为0.4-1.4mg/kg/天，优选为0.9mg/kg/天。

在一个实施方案中，在给予如本文前面所定义的组合物前，将类固醇给予所述个体。在该实施方案中，优选在给予所述组合物前至少一天，更优选至少一个星期，更优选至少两个星期，更优选至少三个星期，给予所述类固醇。

在另一优选的实施方案中，组合还包含肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制剂。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为刺激炎症应答的促炎性细胞因子。用中和抗体英利昔单抗(Remicade)药理阻断TNF-α活性，在临床上减少炎性疾病的症状是非常有效的。在mdx小鼠中，英利昔单抗和伊那西普(etanercept)都延迟并减少营养不良肌肉的坏死^24，25，在长期处理训练的成年mdx小鼠中证明对肌肉强度、氯化物通道功能和CK水平降低具有其他生理益处²⁶。设计用于其他临床条件的这些高度特异性消炎药是用于DMD的类固醇使用的很有吸引力的替代物。在一个实施方案中，当肌肉损伤和衰退特别显著时，TNF-α抑制剂的使用限于男孩中密集型肌肉生长期。

也提供了还包含TNFα抑制剂、用作药物的组合物。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成功能不充分、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。优选的TNF-α抑制剂为由与人IgG1的Fc部分连接的TNF-α的人p75受体的胞外配体-结合结构域组成的二聚融合蛋白。更优选的TNFα抑制剂为依那西普(ethanercept，Amgen，America)²⁶。依那西普的常用剂量大约为0.2mg/kg，优选大约为0.5mg/kg，每周两次。优选皮下给药。

在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物还包含mIGF-1源。如本文所定义的，IGF-1源优选包含mIGF-1自身，能增强mIGF-1表达和/或活性的化合物。在本申请中，增强与提高同义。mIGF-1表达与mIGF-1量同义。mIGF-1通过提高卫星细胞活性而促进肌肉再生，并且减少炎症和坏死²⁷。肌肉局部损伤导致mIGF-1表达增加。在具有其他IGF-1基因的转基因小鼠中观察到肌肉肥大和扩大的肌纤维²⁷。同样，转基因mdx小鼠显示肌纤维退化减少²⁸。mIGF-1基因的上调和/或额外量的mIGF-1蛋白质或其功能等同物(尤其为mIGF-1Ea同种型(如27中所述，人同系物IGF-1同种型4：SEQ ID NO：577))的给药因而促进用于DMD的其他疗法，优选基因疗法的作用，包括反义诱导的外显子跳跃。上述转基因小鼠中其他mIGF-1水平不会引起心脏问题或促进癌症，并且没有病理学副作用。如前所述，例如通过增强mIGF-1基因表达和/或给予mIGF-1蛋白质和/或其功能等同物(尤其为mIGF-1Ea同种型(如27中所述，人同系物IGF-1同种型4：SEQ ID NO：577))而增加mIGF-1的量。也提供了用作药物的还优选地包含mIGF-1、能增强mIGF-1表达和/或mIGF-1活性的化合物的本发明组合物。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，这种组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成功能不充分的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。

在本发明的上下文中，可通过提高IGF-1基因的基因表达水平、增加相应IGF-1蛋白质的量和/或提高IGF-1蛋白质的活性，而达到增加mIGF-1的量或活性。本文前面已经定义了优选的mIGF-1蛋白质。在本文中所述蛋白质活性的提高应理解为表示，与未治疗的个体中所述活性或稳态相比，所述蛋白质产生的生物活性或所述蛋白质的稳态水平的任何可检测的改变。优选地，通过检测肌肉肥大生物标记物GATA-2(如27中所述)增加的表达而评价mIGF-1的增加量或活性。

优选地，使用经典的分子生物学技术如(实时)PCR、阵列或Northern分析评价基因表达水平。通过定量蛋白质的量直接确定蛋白质的稳态水平。可用任何已知技术如使用针对蛋白质而产生的抗体的蛋白质印迹或免疫测定定量蛋白质的量。技术人员应当理解，可选地或与基因表达水平和/或相应蛋白质的定量结合，使用特定分析定量相应蛋白质或已知与相应蛋白质的功能或活性相关的任何化合物的底物或定量相应蛋白质的所述功能或活性，可用于评价蛋白质的活性或稳态水平的改变。

在本发明中，例如可通过将来自外源性来源的蛋白质供给细胞，在蛋白质自身水平改变所述蛋白质的活性或稳态水平。

优选地，所述基因表达水平的提高或上调意思是使用阵列，所述基因表达水平提高了至少5％。更优选地，所述基因表达水平的提高意思是提高了至少10％，更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。在另一个优选的实施方案中，所述蛋白质表达水平的提高意思是使用蛋白质印迹和/或使用ELISA或适当分析，所述蛋白质表达水平提高了至少5％。更优选地，所述蛋白质表达水平的提高意思是提高了至少10％，更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。

在另一个优选的实施方案中，多肽活性的提高意思是使用适当分析，多肽活性提高了至少5％。更优选地，多肽活性的提高意思是提高了至少10％，更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。优选地，通过比较治疗前个体中相应活性而评价所述提高。

提供mIGF-1源的优选方式是，引入编码mIGF-1、优选mIGF-1 Ea同种型(如27中所述，人同系物IGF-1同种型4：SEQ ID NO：577)的转基因，更优选地在如本文后面所定义的AAV载体中。在如27中所述的小鼠的肌肉组织中特异性表达这种mIGF-1源。

在另一个优选实施方案中，组合物还包含抗氧化剂。氧化应激是DMD进展中的重要因子，并且促进慢性炎症和纤维化²⁹。在患有杜氏肌营养不良的男孩中，氧化应激的最普遍产物即过氧化脂质平均增加了35％。过氧化物歧化酶和过氧化氢酶的酶水平的提高减少了引起这些作用的过量自由基。事实上，临床上试验了膳食补充剂Protandim

(LifeVantage)，并且发现所述膳食补充剂提高了过氧化物歧化酶(多达30％)和过氧化氢酶(多达54％)的水平，其的确显著地抑制了29位健康人中脂质的过氧化³⁰。因而，氧化应激的这种有效管理保持肌肉质量，从而促进DMD疗法的积极作用。艾地苯醌(Idebenone)是具有衍生自天然辅酶Q10的化学结构的另一个有效抗氧化物。它保护线粒体，在所述线粒体中，通过氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(ATP)。DMD中肌营养不良蛋白缺乏对心脏中也可能骨骼肌中的这个过程有负面影响。最近，艾地苯醌应用于美国和欧洲的临床试验中，证明对弗里德赖希共济失调(Friedreich’s Ataxia)的神经学方面具有功效³¹。最近，已经在比利时开始IIa期双盲、安慰剂对照的、艾地苯醌的随机临床试验，其中包括21位8-16岁的患有杜氏肌营养不良的男孩。这项研究的主要目的是确定艾地苯醌对心肌功能的影响。此外，将进行一些不同的试验，以检测对于患者中肌肉强度的可能的功能性益处。有效时，艾地苯醌为根据本发明组合使用的优选的辅助化合物，以增强尤其是心脏中DMD疗法的疗效。还提供了用作药物的、还包含抗氧化剂的组合物。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。根据抗氧化剂的特性，技术人员应当知道优选使用的量。抗氧化剂可以包括假马齿苋皂素(bacoside)、水飞蓟素(silymarin)、姜黄素和/或多酚。优选地，多酚是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或包括EGCG。优选地，抗氧化剂是作为膳食补充剂Protandim(LifeVantage)的抗氧化剂的混合物。每日675mg Protandim

胶囊包含150mg假马齿苋(B.monniera)(45％假马齿苋皂素)、225mg水飞蓟(S.marianum)(70-80％水飞蓟素)、150mg催眠睡茄(W.somnifera)粉、75mg绿茶(98％多酚，其中45％EGCG)和75mg姜黄(95％姜黄素)。

在另一个优选的实施方案中，组合物还包含离子通道抑制剂。DMD中受损肌肉膜的存在妨碍钙离子进入肌纤维中，因此破坏的钙体内平衡激活许多导致其他损伤和肌肉坏死的酶，如蛋白酶。直接有助于营养不良肌肉中钙的病理积聚的离子通道，是辅助化合物治疗DMD的潜在靶标。有证据表明一些药物如己酮可可碱阻断运动敏感钙通道³²，且阻断牵张激活通道的抗生素降低mdx小鼠中肌纤维坏死并降低患有DMD的男孩中的CK水平³³。也提供了用作药物、还包含离子通道抑制剂的组合物。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。

优选地，使用黄嘌呤类离子通道抑制剂。更优选地，所述黄嘌呤是甲基黄嘌呤衍生物，并且最优选地，所述甲基黄嘌呤衍生物选自己酮可可碱、呋拉茶碱、利索茶碱、丙戊茶碱、喷替茶碱、茶碱、托巴茶碱、阿比茶碱、恩丙茶碱及其衍生物。最优选使用己酮可可碱。当使用针对外显子或所述外显子的一个或两个剪接位点的寡核苷酸时，黄嘌呤类离子通道抑制剂增强来自包含所述外显子的前体mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率。所述增强的跳跃频率也提高了DMD或BMD个体的肌肉细胞中所产生的功能性肌营养不良蛋白蛋白质的水平。

根据离子通道抑制剂的特性，技术人员应当知道优选使用的数量。己酮可可碱的合适剂量在1mg/kg/天至100mg/kg天之间，优选剂量在10mg/kg/天至50mg/kg/天之间。用于人的典型剂量为20mg/kg/天。

在一个实施方案中，在给予包含寡核苷酸的组合物前，将离子通道抑制剂给予所述个体。在本实施方案中，优选在给予包含寡核苷酸的组合物前至少一天，更优选至少一个星期，更优选至少两个星期，更优选至少三个星期，给予所述离子通道抑制剂。

在另一个优选的实施方案中，组合物还包含蛋白酶抑制剂。钙蛋白酶(calpain)是在营养不良肌肉中增加的且对肌纤维退化起作用的钙激活蛋白酶。因此，钙蛋白酶抑制剂如钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)、亮抑酶肽³⁴、calpeptin、钙蛋白酶抑制剂III或PD150606用于减少退化过程。具有作为钙蛋白酶抑制剂和抗氧化剂双重作用的新化合物BN 82270(Ipsen)提高肌肉强度、降低血清CK并减少mdx隔膜纤维化，表明这种新化合物具有疗效³⁵。最近，已经提出用于DMD患者中临床试验的另一个化合物亮抑酶肽/肉毒碱(Myodur)。

MG132是已经显示可减少肌肉膜损伤并改善肌营养不良的组织病理征兆的另一个蛋白酶体抑制剂³⁶。MG-132(CBZ-亮氨酰-亮氨酰-亮氨酸缩醛)是细胞渗透性的蛋白酶体抑制剂(Ki＝4nM)，它通过防止IkappaB退化(IC50＝3μM)而抑制NFkappaB激活。此外，MG-132是通过结合20S和26S蛋白酶体并使之失活而抑制泛素介导的蛋白水解的肽醛。MG-132已显示抑制营养不良mdx小鼠模型中肌营养不良蛋白相关蛋白质的蛋白酶体退化³⁶。因此，这种化合物也适合用作DMD的辅助药用化合物。还提供了用作药物、还包含蛋白酶抑制剂的组合物。所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，所述组合用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。根据所述蛋白酶抑制剂的特性，技术人员应当知道优选使用的数量。

在另一个优选的实施方案中，组合物还包含L-精氨酸。肌营养不良蛋白缺乏与纤维膜上DGC-复合物损失，包括神经元一氧化氮合酶(nNOS)。mdx小鼠中nNOS转基因的表达大大地减少了肌肉膜损伤。同样，给予L-精氨酸(一氧化氮合酶的底物)提高了mdx小鼠中NO产生和上调了肌营养相关蛋白(utrophin)表达。六星期的L-精氨酸治疗改善了mdx小鼠中肌肉病理并降低了血清CK³⁷。还未公开L-精氨酸作为本发明的组合物中另一组分的用途。

还提供了用作药物、还包含L-精氨酸的组合物。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。

在另一个优选的实施方案中，组合物还包含血管紧张素II 1型受体阻断剂氯沙坦(Losartan)，如在肌营养不良蛋白缺乏mdx小鼠模型中显示的，氯沙坦使肌构筑、修复和功能正常化²³。还提供了用作药物、还包含血管紧张素II 1型受体阻断剂氯沙坦的组合物。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。根据血管紧张素II 1型受体阻断剂的特性，技术人员应当知道优选使用的数量。

在另一个优选的实施方案中，组合物还包含血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，优选培哚普利。ACE抑制剂能降低血压。早期启动用培哚普利治疗与DMD患者中较低死亡率相关²²。还提供了用作药物、还包含ACE抑制剂、优选培哚普利的组合物。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。ACE抑制剂，优选培哚普利的常用剂量大约为2-4mg/天²²。

在更优选的实施方案中，将ACE抑制剂与至少一种先前确定的辅助化合物组合。

在另一个优选的实施方案中，组合物还包含显示通读活性的化合物。显示通读活性的化合物可以为任何能抑制终止密码子的化合物。对于20％的DMD患者而言，肌营养不良蛋白基因突变包括点突变，其中13％的突变为无义突变。显示通读活性或能抑制终止密码子的化合物为能提供增加量的功能性肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质和/或减少量的异常或截短的肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质的化合物。优选地，增加的意思是增加了至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。优选地，减少的意思是减少了至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。优选地，通过比较存在于用所述显示通读活性的化合物治疗前的个体中的量，在所述个体的肌肉组织或肌肉细胞中评价所述蛋白质的增加或减少。或者，可用所述个体的肌肉组织或细胞进行比较，在局部治疗的情况下，所述肌肉组织或细胞尚未用所述化合物治疗。优选地，使用蛋白质印迹分析在蛋白质水平进行量的评价。

显示通读活性的优选化合物包含或组成为氨基糖苷，包括但不限于遗传霉素(G418)、巴龙霉素、庆大霉素和/或3-(5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)苯甲酸及其衍生物(参考文献64、65)。显示通读活性的更优选化合物包含或组成为PTC124^TM和/或其功能等同物。PTC124^TM为PTCTherapeutics，Inc.South Plainfield，New Jersey的注册商标。又称为PTC124^TM的3-(5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)苯甲酸(参考文献16、17)属于在较低浓度模拟庆大霉素通读活性一类新的小分子(参考文献55)。3-(5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)苯甲酸或庆大霉素的功能等同物为如本文前面所定义的能显示通读活性的化合物。最优选地，显示通读活性的化合物包含或组成为庆大霉素和/或又称为PTC124^TM的3-(5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)苯甲酸。还提供了用作药物、还包含显示通读活性的化合物的组合物，优选地，所述化合物包含或组成为庆大霉素和/或3-(5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)苯甲酸。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。显示通读活性的化合物，优选3-(5-(2-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)苯甲酸或庆大霉素的常用剂量在3mg/kg/天至200mg/kg/天之间变动，优选剂量在10mg/kg/天至50mg/kg/天之间或者一天两次。

在更优选的实施方案中，将显示通读活性的化合物与至少一种先前确定的辅助化合物组合。

在另一个优选实施方案中，组合物还包含能增强外显子跳跃和/或抑制剪接体组装和/或剪接的化合物。已经显示小化学化合物，例如特定吲哚衍生物，选择性地抑制剪接体组装和剪接³⁸，例如通过干扰富丝氨酸和精氨酸(SR)蛋白质与其同源剪接增强子(ISE或ESE)的结合和/或干扰剪接阻抑物与沉默基因序列(ESS或ISS)的结合。因此，这些化合物适合作为增强外显子跳跃的辅助化合物而应用。还提供了用作药物、还包含用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体组装和/或剪接的化合物的组合物。优选地，所述药物用于减轻DMD的一个或多个症状。在一个实施方案中，所述组合物用于减轻BMD严重形式的一个或多个症状，其中形成了功能不足的、非常短的肌营养不良蛋白蛋白质。根据能增强外显子跳跃和/或抑制剪接体组装和/或剪接的所述化合物的特性，技术人员应当知道优选使用的数量。在更优选的实施方案中，将用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体组装和/或剪接的化合物与ACE抑制剂和/或如本文前面所确定的任何辅助化合物组合。

因此，本发明提供了还包含辅助化合物的组合物，其中所述辅助化合物包括类固醇、ACE抑制剂(优选培哚普利)、血管紧张素II 1型受体阻断剂氯沙坦、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制剂、mIGF-1源优选mIGF-1、用于增强mIGF-1表达的化合物、用于提高mIGF-1活性的化合物、抗氧化剂、离子通道抑制剂、蛋白酶抑制剂、L-精氨酸、显示通读活性和/或抑制剪接体组装和/或剪接的化合物。

在一个实施方案中，使用包含微或小肌营养不良蛋白基因的载体，优选病毒载体，还为个体提供功能性肌营养不良蛋白蛋白质。更优选地，使用重组腺伴随病毒(rAAV)载体。AAV是非致病性并且显示辅助病毒依赖型(helper-dependent)生活周期的单链DNA细小病毒。与其他病毒(腺病毒、逆转录病毒和单纯疱疹病毒)相反，已经证明rAAV载体在转导成熟骨骼肌中是非常有效的。rAAV在经典DMD“基因添加”研究中的应用被其有限的包装限制(＜5kb)所阻碍。因此，优选地，将rAAV应用于小得多的微或小肌营养不良蛋白基因的有效递送。这种微或小肌营养不良蛋白基因的给予引起至少具有部分功能的肌营养不良蛋白蛋白质的存在。见参考文献18-20。

可以以任何顺序将组合物的每个组分给予个体。在一个实施方案中，同时给予每个组分(意思是在10小时内，优选1小时内给予每个组分)。然而这不是必须的。在一个实施方案中，在给予寡核苷酸前，将至少一种辅助化合物给予有需要的个体。或者，在给予至少一种辅助化合物前，将寡核苷酸给予有需要的个体。

用途

另一方面，提供了本文所定义的寡核苷酸或组合物在制备用于预防或治疗个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的药物中的用途。本文前面已经定义了所述用途的每个特征。

根据本发明的用途或方法中的治疗为期至少一个星期、至少一个月、至少几个月、至少一年、至少2、3、4、5、6年或更长。根据本发明，供使用的本文所定义的每个分子或寡核苷酸或其等同物可以适合直接体内给予个体的细胞、组织和/或器官，所述个体受到DMD或BMD侵袭或者具有罹患DMD或BMD的风险，或者直接地体内、离体或体外施用。本发明的寡核苷酸、组合物、化合物或辅助化合物的给药频率可以取决于一些参数，如患者年龄、患者的突变、分子数量(即剂量)、所述分子的配方。所述频率的变动范围可以是两个星期或者三个星期或者四个星期或者五个星期或者更长时间周期内至少一次。

方法

另一方面，提供了用于减轻个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状或者减轻所述个体的肌原细胞或肌肉细胞的一个或多个特征的方法，所述方法包括将本文所定义的寡核苷酸或组合物给予所述个体。

还提供了增强、诱导或促进患有杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的个体中来自表达肌营养不良蛋白前体mRNA的细胞中所述前体mRNA的外显子的跳跃的方法，所述方法包括将本文所定义的寡核苷酸或组合物给予所述个体。

还提供了增加细胞中功能性肌营养不良蛋白蛋白质产生和/或减少异常肌营养不良蛋白蛋白质产生的方法，所述细胞包含编码异常肌营养不良蛋白蛋白质的肌营养不良蛋白基因的前体mRNA，所述方法包括为所述细胞提供本发明的寡核苷酸或组合物，并且允许由所述前体mRNA的剪接产生的mRNA翻译。在一个实施方案中，在体外如利用细胞培养实施所述方法。优选地，体内实施所述方法。

在本上下文中，本文已经较早地定义了增加功能性肌营养不良蛋白蛋白质的产生。

除非另外指出，本文所述的每个实施方案都可以与本文所述的另一个实施方案组合。

在本说明书及其权利要求中，动词“包含”及其词形变化以其非限制意义使用，意思是包括这个词后的项目，但是不排除没有特别提到的项目。此外，动词“由…组成”可用“基本上由…组成”替换，后者意思是本文所定义的化合物或辅助化合物除包含特别确定的组分之外，还可包含其他组分，所述其他组分不改变本发明的独特特征。

此外，用不定冠词“a(一个)”或“an(一个)”所提及成分，不排除存在多于一个所述成分的可能性，除非本环境明确要求存在一个且仅仅一个所述成分。因此，不定冠词“a”或“an”表示通常“至少一个”。

当词语“大约”或“约”与数值联合使用时(大约10、约10)，优选地表示该值可以为10±1％的值。

本说明书所引用的所有专利和参考文献的全文内容特此通过援引并入。除非另外指出，可将本申请所确定的每个实施方案组合在一起。

在以下实施例中进一步说明了本发明。这些实施例并不限制本发明的范围，而是仅仅用于阐明本发明。

附图简要说明

图1、在人对照肌管中，对都靶向外显子45内相同序列的PS220和PS305直接进行相对跳跃效率的比较。PS220可再现地诱导最高水平的外显子45跳跃(高达73％)，而使用PS305获得高达46％的最高外显子45跳跃水平。在未处理的细胞中未观察到外显子45跳跃。(M：DNA大小标记；NT：未处理的细胞)

图2、显示如通过RT-PCR分析而评价的含肌苷的AON的相对外显子45跳跃水平图。在人对照肌管中，当用PS220和PS305进行比较时(见图1)，测试所有靶向外显子45并且含有一个用于鸟嘌呤取代的肌苷的一系列新AON的相对外显子45跳跃效率。虽然在可变水平(4％-25％之间)，但所有新的含肌苷的AON都是有效的。PS220诱导最高水平的外显子45跳跃(高达72％)，然而使用PS305获得高达63％的最高外显子45跳跃水平。在未处理的细胞中未观察到外显子45跳跃。(M：DNA大小标记；NT：未处理的细胞)。

实施例

实施例1

材料和方法

AON设计是基于m折叠程序(m-fold program)所预测的靶外显子RNA的(部分地)重叠的开放二级结构，基于ESE-finder软件所预测的(部分地)重叠的推定的SR-蛋白质结合位点。AON由Prosensa TherapeuticsB.V.(Leiden，Netherlands)合成，并且含有2’-O-甲基RNA和全长硫代磷酸酯(PS)主链。

组织培养、转染和RT-PCR分析

如以前所述(Aartsma-Rus et al.，Neuromuscul.Disord.2002；12：S71-77和Hum Mol Genet 2003；12(8)：907-14)处理源自健康个体(“人对照”)(实施例1、3和4；外显子43、50、52跳跃)或携带外显子45缺失的DMD患者(实施例2；外显子46跳跃)的肌管培养物。为了筛选AON，对于每个AON(PS220和PS305)，以200nM转染肌管培养物。以每μg(微克)AON2μl UNIFectylin，使用转染试剂UNIFectylin(Prosensa Therapeutics BV，Netherlands)。使用位于靶向外显子45侧翼的外显子中的引物，通过巢式RT-PCR分析，确定外显子跳跃效率。从用于序列验证的琼脂糖凝胶中分离PCR片段。为了定量，使用DNA 1000LabChip Kit在Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，USA)上分析PCR产物。

结果

DMD外显子45跳跃。

在健康对照肌管培养物中直接进行两个AON的相对跳跃效率比较，所述两个AON为都靶向外显子45内相同序列的PS220(SEQ ID NO：76；5’-UUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUG-3’)和PS305(SEQ ID NO：557；5’-UUUGCCICUGCCCAAUGCCAUCCUG-3’)。分离的RNA的随后RT-PCR和序列分析证明，两个AON的确都能诱导外显子45跳跃。如图1所示，由一段GCCGC序列组成的PS220可再现地诱导最高水平的外显子45跳跃(高达73％)。然而，与PS220相同但是含有用于所述序列内位置4的G取代的肌苷的PS305也是有效的，并且导致高达46％的外显子45跳跃水平。在未处理的细胞(NT)中未观察到外显子45跳跃。

实施例2

材料和方法

AON设计是基于m折叠程序所预测的靶外显子45RNA的(部分地)重叠的开放二级结构，基于ESE-finder软件所预测的(部分地)重叠的推定的SR-蛋白质结合位点。AON由Prosensa Therapeutics B.V.(Leiden，Netherlands)合成，并且含有2’-O-甲基RNA、全长硫代磷酸酯(PS)主链和用于鸟嘌呤取代的肌苷。

组织培养、转染和RT-PCR分析

如以前所述(Aartsma-Rus et al.，Neuromuscul.Disord.2002；12：S71-77和Hum Mol Genet 2003；12(8)：907-14)，处理源自健康个体(“人对照”)的肌管培养物。为了筛选AON，对于每个AON，以200nM转染肌管培养物。以每μg AON2μl UNIFectylin，使用转染试剂UNIFectylin(ProsensaTherapeutics BV，Netherlands)。使用位于靶向外显子45侧翼的外显子中的引物，通过巢式RT-PCR分析，确定外显子跳跃效率。从用于序列验证的琼脂糖凝胶中分离PCR片段。为了定量，使用DNA 1000LabChip Kit在Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，USA)上分析PCR产物。

结果

DMD外显子45跳跃。

在健康对照肌管培养物中测试靶向外显子45并且含有一个肌苷取代的其他系列AON的外显子45跳跃效率，并且与PS220(没有肌苷；SEQID NO：76)和PS305(与PS220序列相同，但是具有肌苷取代；SEQ ID NO：557)直接进行比较。如图2所示，分离的RNA的随后RT-PCR和序列分析证明，所有新的AON(PS309至PS316)都能在4％(PS311)和25％(PS310)之间诱导外显子45跳跃。当与PS220和PS305比较时，PS220诱导最高水平的外显子45跳跃(高达72％)。在新的含肌苷的AON中，PS305是最有效的，显示高达63％的外显子45跳跃水平。在未处理的细胞(NT)中未观察到外显子45跳跃。

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序列表

DMD基因氨基酸序列

SEQ ID NO 1：

MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLL

EGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLG

LIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWS

DGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDT

TYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQ

QITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSL

MESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMD

LTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQS

NLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQ

EDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRW

VLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVL

KADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLE

KSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETVTTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITV

DSEIRKRLDVDITELHSWITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEKVNAIEREKAEKF

RKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQ

NNIIAFYNQLQQLEQMTTTAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSGLQPQI

ERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTNHFKQVFSDVQAREKELQTIFDTLPPMR

YQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQSGLYYL

STTVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQN

HIQTLKKWMAEVDVFLKEEWPALGDSEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEG

GQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQWDHMCQQVYARKEALKGGLEKTVSLQKD

LSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTE

SVNSVIAQAPPVAQEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSY

LEKANKWLNEVEFKLKTTENIPGGAEEISEVLDSLENLMRHSEDNPNQIRILAQTLT

DGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKSLHLIQESLTFI

DKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQI

DVAQKKLQDVSMKFRLFQKPANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVV

QSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQKKQTENPKELDERVTALKLHYN

ELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMPSNL

DSEVAWGKATQKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAV

TSRAEEWLNLLLEYQKHMETFDQNVDHITKWIIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLK

RLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANRGDHCRKLVEPQISELNHRFAAISHRIKTG

KASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQR

GDNLQQRITDERKREEIKIKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQ

ADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEIDRELQKKKEELNAVRRQAEGLSEDGA

AMAVEPTQIQLSKRWREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEISYVP

STYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDII

HSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRF

HYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNA

TGEEIIQQS SKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQKNILSEFQRDLN

EFVLWLEEADNIASIPLEPGKEQQLKEKLEQVKLLVEELPLRQGILKQLNETGGPVL

VSAPISPEEQDKLENKLKQTNLQWIKVSRALPEKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLE

EQLNHLLLWLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFDVQETEIAVQAKQPDVEEILSKGQHLYK

EKPATQPVKRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQ

PVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPALADFNRAWTELTDWLSLLDQVIKSQRVMVGD

LEDINEMIIKQKATMQDLEQRRPQLEELITAAQNLKNKTSNQEARTIITDRIERIQNQ

WDEVQEHLQNRRQQLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESWKEGPYTV

DAIQKKITETKQLAKDLRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENIN

ASWRSIHKRVSEREAALEETHRLLQQFPLDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKER

LLEDSKGVKELMKQWQDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDAVLLQRR

LDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAP

IGGDFPAVQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRE

LPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDE

LDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLAR

QLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTS

VQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAM

KLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHN

NLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQV

ASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAAL

FLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDI

CQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTS GEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPR

MGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAE

MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGE

LERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAE

AKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPST

SLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRG

RNTPGKPMREDTM

DMD基因外显子51

DMD基因外显子45

DMD基因外显子53

DMD基因外显子44

DMD基因外显子46

DMD基因外显子52

DMD基因外显子50

DMD基因外显子43

人IGF-1同型4氨基酸序列

SEQ ID NO 577：

MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAE

LVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPL

KPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYRM

Claims

1.包含肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的寡核苷酸或其功能等同物，其中所述寡核苷酸或其功能等同物包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补的序列，所述部分为包含至少8个核苷酸的一段连续序列。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述一段连续序列包含肌营养不良蛋白前体mRNA外显子RNA的13-50个核苷酸，优选14-25个核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述外显子包括外显子51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8、55、2、11、17、19、21、57、59、62、63、65、66、69和/或75。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含RNA，并且其中优选地，所述RNA含有修饰，优选2’-O-甲基修饰的核糖(RNA)或脱氧核糖(DNA)修饰，或者其中所述寡核苷酸的所述功能等同物包含肽核酸、锁核酸、吗啉代磷酸二酰胺或其任意组合，最优选吗啉代磷酸二酰胺。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少两个部分，其中第一部分包含具有至少8个、优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，所述连续核苷酸与所述至少两个外显子的第一个互补，并且其中第二部分包含具有至少8个、优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，所述连续核苷酸与所述肌营养不良蛋白前体mRNA中第二个外显子互补。

6.根据权利要求5所述的寡核苷酸，其中所述第一个和所述第二个外显子在所述肌营养不良蛋白前体mRNA中被不与所述核苷酸互补的至少一个外显子分开。

7.根据权利要求5所述的寡核苷酸，其中所述第一个和所述第二个外显子在所述肌营养不良蛋白前体mRNA中是相邻的。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的寡核苷酸，其用作药物，优选用于预防或治疗个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的寡核苷酸，其中所述药物为个体提供功能性肌营养不良蛋白蛋白质和/或至少部分地减少异常肌营养不良蛋白蛋白质的产生和/或增加功能性或更具功能性的肌营养不良蛋白蛋白质的产生。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的寡核苷酸，其中所述药物减轻所述个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状。

11.组合物，其包含至少两种不同的权利要求1-10中任一项所定义的寡核苷酸，其中优选地，所述组合物为药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂和/或赋形剂。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所用的每一寡核苷酸或全部寡核苷酸的给药剂量在0.5mg/kg至10mg/kg的范围之间变动。

13.根据权利要求11或12所述的组合物或者根据权利要求1-10中任一项所述的寡核苷酸，其中存在：

(a)用于减少炎症，优选用于减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或

(b)用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，和/或

(c)显示通读活性的化合物。

14.权利要求1-10中任一项所定义的寡核苷酸或权利要求11-13中任一项所定义的组合物在制备用于预防或治疗个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的药物中的用途。

15.减轻个体中杜氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的方法，所述方法包括给予所述个体权利要求1-10中任一项所定义的寡核苷酸或权利要求11-13中任一项所定义的组合物。