CN101501193B - 用于治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病的方法和手段 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了施加仅与人基因转录物中重复性序列互补的寡核苷酸分子的方法和药剂，还提供了对用以诊断、治疗或预防人体中与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病之药剂的制备。因此，本发明提供了治疗与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病的方法。本发明还涉及可在本发明中应用以阻止重复序列扩增的转录物在细胞内积累和/或翻译的经修饰寡核苷酸。

Description

用于治疗与DNA重复不稳定性相关的遗传病的方法和手段
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及治疗与在其编码或非编码序列中具有不稳定重复的基因相关的遗传病，最特别地，涉及在引起人亨廷顿舞蹈症的HD基因或引起I型肌强直性营养不良的DMPK基因中的不稳定重复。
背景技术
基因特异性的微卫星及小卫星重复序列导致卫星中重复序列长度增加，这种不稳定性与约35种人遗传病相关。例如，三核苷酸重复不稳定可见于造成X连锁脊延髓肌萎缩症(spinal and bulbar muscular atrophy，SBMA)、I型肌强直性营养不良(myotonic dystrophy type 1，DM1)、脆性X综合征(FRAX基因A、E、F)、亨廷顿舞蹈症(HD)和一些脊髓小脑共济失调疾病(SCA基因家族)的基因中。不稳定重复还可见于基因(例如亨廷顿舞蹈症基因)的编码区中，由此通过改变蛋白质功能和/或蛋白质折叠而导致疾病表型。不稳定重复单元还可见于非翻译区中，例如I型肌强直性营养不良(DM1)在3’UTR中，或者在内含子序列中，例如II型肌强直性营养不良(DM2)。对于DMPK来说，正常重复数约为5至37，但突变前和完全疾病状态增加到2至10倍或更多，多至50、100有时1000个或更多重复单元。对于DM2/ZNF9来说，已有报道称增加到10000个或更多重复(Cleary和Pearson，Cytogenet.Genome Res.100：25-55，2003)。
造成亨廷顿舞蹈症的基因HD位于第4号染色体。亨廷顿舞蹈症以常染色体显性方式遗传。当该基因具有编码一段多谷氨酰胺的超过35个CAG的三核苷酸重复时，重复数可在后续世代中扩大。由于该重复的长度逐渐增加，疾病的严重程度通常增加，并且在后续世代中在更小的年龄出现，这一过程称为早现遗传。HD基因的产物是348kDa的胞质蛋白亨廷顿蛋白(huntingtin)。在正常形式中，亨廷顿蛋白具有少于40个谷氨酰胺氨基酸残基的特征序列；致病的突变亨廷顿蛋白具有超过40个残基。突变体亨廷顿蛋白分子在神经元细胞中的连续表达导致形成大的蛋白质沉积物，最终导致细胞死亡，尤其是在额叶和基底神经节(主要在尾状核中)中。疾病的严重程度一般与额外残基的数目成正比。
DM1是成年人中最常见的肌营养不良，它是一种主要发生在骨骼肌、心脏和脑中的进行性、退行性、多***遗传病。DM1是由人19q染色体上DMPK基因(强直性肌营养不良蛋白激酶)的3’非翻译区中不稳定三核苷酸(CTG)n重复的扩增造成的(Brook等，Cell，1992)。II型强直性肌营养不良(DM2)是由ZNF9基因的内含子1中CCTG的扩增造成的(Liquori等，Science 2001)。在I型强直性肌营养不良的情况下，DMPK转录物的核-胞质输出被该重复序列长度的增加所阻断，其形成发夹样二级结构，积累于核小点(nuclear foci)中。带有一段长(CUG)n重复序列的DMPK转录物可形成发夹样结构，其与肌盲蛋白(muslceblind)家族的蛋白质结合然后在核中的核糖核小点(ribonuclear foci)中聚集。这些核内含物被认为与肌盲蛋白螯合，并且有可能与其它因子螯合，随后对细胞产生限制性。在DM2中，带有(CCUG)n已扩增重复的ZNF9RNA的积累在核中形成相似的小点。因为肌盲蛋白是剪接因子，因此它们的缺乏导致其它转录物剪接的显著重排。许多基因的转录物随之开始异常剪接，例如包含胎儿外显子，或排除外显子，导致产生非功能性蛋白质和细胞功能受损。
上文的论述和新见解已经带来这样的理解，即不稳定重复疾病(例如I型强直性肌营养不良、亨廷顿舞蹈症等)可通过完全或至少部分去除导致该疾病的异常转录物来进行治疗。对于DM1，在核内积累的异常转录物可被下调或部分去除。就DM而言，甚至异常转录物相对小的降低也可释放大量(有可能是足量)被螯合的细胞因子，由此帮助恢复正常RNA加工和细胞代谢(Kanadia等，PNAS 2006)。在HD的情形中，HD患者细胞中亨廷顿蛋白沉积物积累的减少可改善疾病症状。
已有一些使用反义核酸、RNA干扰或核酶来设计用于不稳定重复疾病I型肌强直性营养不良的治疗方法和药剂的尝试。(i)Langlois等(Molecular Therapy，Vol.7No.5，2003)设计了能够切割DMPK mRNA的核酶。提供了具有与紧临CUG重复之前的DMPK 3’UTR互补的一段RNA的锤头状核酶。在体内，载体转录的核酶能够在转染细胞中将包含已扩增CUG重复的mRNA以及正常mRNA切割并且分别减少63％和50％。因此，正常转录物也受到此方法的严重影响，所影响的含有已扩增重复的mRNA没有被特异性地靶向。
(ii)Langlois等(Journal Biological Chemistry，vol 280，no.17，2005)使用RNA干扰进行了另一种方法。将慢病毒递送的短发夹RNA(shRNA)引入DM1成肌细胞中，证明其下调核中保留的突变体DMPK mRNA。测试了4种shRNA分子，两种与DMPK编码区互补，一种与3’UTR中的独特序列互补，一种带有无关序列的阴性对照。前两种shRNA能够将带有已扩增重复的突变体DMPK转录物下调至约50％，但是甚至更有效地将胞质野生型转录物下调至约30％或更低。通过阳离子型脂质递送等同的合成siRNA是无效的。针对3’UTR序列的shRNA被证明对两种转录物都是无效的。因此，此方法也不选择性靶向至已扩增重复的mRNA类型。
(iii)Furling等(Gene Therapy，Vol.10，p795-802，2003)的第三种方法使用了表达149bp长反义RNA的重组逆转录病毒来抑制人DM1成肌细胞中的DMPK mRNA水平。将逆转录病毒设计成为DM1细胞提供与39bp长的(CUG)13次重复及该重复后的110bp区域互补的149bp长的反义RNA，以提高特异性。此方法使突变(重复序列已扩增的)DMPK转录物减少80％，相比较而言，野生型DMPK转录物减少50％，并恢复了受感染DM1成肌细胞中的分化和功能性特征。因此，此方法也不选择性靶向至已扩增重复的mRNA种类，其依赖于非常长的反义RNA，并且仅可与重组病毒递送技术联合使用。
发明详述
上文所述方法和技术提供了基于核酸的方法，其非选择性地致使与重复不稳定性和/或扩增相关的遗传病的受影响的重复序列已扩增的等位基因和未受影响的(正常)等位基因均进行降解。另外，现有技术利用对疾病相关基因具有特异性的序列，并且没有提供可应用于数种与重复序列扩增相关的遗传病的方法。最后，现有技术仅教导了涉及使用重组DNA载体递送***的方法，它需要针对每种寡核苷酸和靶细胞进行调整，并仍需要进一步优化。
本发明提供了通过使用短单链核酸分子解决这些问题的方案，所述短单链核酸分子包含仅与已扩增重复区域互补的序列，或者由其组成，即它不依赖于与包含重复序列的基因的外显子或内含子中的独特序列杂交。另外，不要求所采用的核酸(寡核苷酸)通过RNA酶H介导的降解机制减少转录物。
不希望受到理论的限制，本发明可通过改变未成熟RNA的转录后加工和/或剪接来引起转录物水平下降。通过选择性剪接和/或转录后加工降低转录物水平被认为产生缺少过度扩增或不稳定的(三)核苷酸重复但仍具有功能活性的转录物。通过改变RNA加工和/或剪接减少异常转录物可防止细胞中重复序列已扩增的异常转录物在细胞中积累和/或翻译。
不希望受到理论的限制，还认为本发明的方法提供了针对包含已扩增重复序列的受影响转录物的特异性，因为与已扩增重复序列进行杂交的动力学更有利。重复序列特异性的互补核酸寡核苷酸分子与RNA或DNA分子中互补区段杂交的可能性随着重复区段大小的增加而增加。RNA分子(特别是包含重复序列的RNA分子)通常内部配对，形成包含开口环和闭合发夹部分的二级结构。仅有开口部分对互补核酸来说是相对可接近的。与疾病不相关的野生型转录物的短重复区段经常仅为5至约20-40个重复，因为二级结构相对不易于与互补核酸碱基配对。相反，已扩增重复序列和疾病相关等位基因的重复单元通常扩增至少2倍，但经常更多，3、5、10倍、多达100倍，甚至对一些不稳定重复的疾病来说扩增超过1000倍。这种扩增提高了该重复的部分(至少暂时)位于开放环结构中的可能性，并因此相对于野生型等位基因更易于与互补核酸分子碱基配对。因此，尽管寡核苷酸与野生型和重复序列已扩增的转录物中存在的重复序列都互补并且理论上与两种转录物都可以杂交，但是本发明教导的是，与重复部分互补的寡核苷酸优先与疾病相关或导致疾病的转录物杂交，而正常转录物功能相对不受影响。这种选择性对于治疗与重复不稳定性相关的疾病来说是有益的，而与异常转录物减少的机制无关。
因此，本发明提供了通过提供仅与重复序列互补和/或仅能够与其杂交的核酸分子来治疗与不稳定顺式元件DNA重复相关的遗传病的方法。因此，本发明优先靶向已扩增重复的转录物，而正常的野生型等位基因相对不受影响。这是有利的，因为正常等位基因因此提供了基因的正常功能，这至少是理想的并且取决于带有不稳定DNA重复的特定基因而在许多情况下可能对受治细胞和/或个体来说是必要的。
另外，此方法不仅限于与特定的不稳定DNA重复相关的遗传病，而是可应用于任何已知不稳定DNA重复疾病，例如但不限于：具有多谷氨酰胺(CAG)重复的编码区重复疾病：亨廷顿舞蹈症、Haw-River综合征、肯尼迪病/脊髓延髓肌萎缩症、脊髓小脑共济失调；或者具有多丙氨酸(GCG)重复的疾病，例如：婴儿痉挛综合征、颅骨锁骨发育不全(deidocranial dysplasia)、睑裂狭小/上睑下垂/倒转型内眦赘皮综合征、手-足-生殖器综合征、并指多指、眼咽肌营养不良、前脑无裂畸形。根据本发明治疗的在基因非编码区具有重复的疾病包括三核苷酸重复疾病(大多数是CTG和/或CAG和/或CCTG重复)：I型肌强直性营养不良、II型肌强直性营养不良、弗里德赖希共济失调(主要是GAA)、脊髓小脑共济失调、孤独症。另外，本发明方法可用于脆性位点相关的重复疾病，包括多种脆性X综合征、雅各布森综合征和其它不稳定重复元件疾病，例如肌阵挛型癫痫、面肩肱型营养不良和某些形式的II型糖尿病.
本发明的另一个优点是可将重复区域特异性寡核苷酸直接施用于细胞，它不依赖于基于载体的递送***。现有技术中已描述的技术(例如上文提及的用于治疗DM1和从细胞中除去DMPK转录物的技术)需要使用基于载体的递送***以将足够水平的寡核苷酸施用至细胞。质粒或病毒载体的使用对于治疗目的来说不是很理想，这是由于目前对治疗性重组DNA载体的严格安全性规定、用于大范围临床应用的足够重组载体的生产以及对施用后过度(或非特异性)应答而言有限的控制和可逆性。尽管如此，未来很可能在这些领域进行优化，质粒的病毒递送可具有有利的长期效果。本发明人出人意料地发现了，与对转录物中独特序列具有特异性的寡核苷酸相比，包含与已扩增重复的转录物中重复序列互补的序列或者由所述序列组成的寡核苷酸由于其杂交分子靶标的扩增而对其靶标具有高得多的亲和力/亲合力。由于对重复序列已扩增的靶转录物的高亲和力和亲合力，较少量的寡核苷酸就足以通过RNA酶H降解、RNA干扰降解或改变翻译后加工(包括但不限于剪接或外显子跳跃(exon skipping))活性对重复序列已扩增的等位基因产生充分的抑制和/或减少。仅与重复序列互补的本发明寡核苷酸可通过合成产生，并在使用用于直接递送寡核苷酸到细胞和/或组织的常用技术直接递送到细胞时具有足够有效的效力。需要时，可通过使用本发明的方法和寡核苷酸分子来避免使用重组载体递送***。
在第一个方面中，本发明公开并教导了包含仅与人基因转录物中重复序列互补的序列或由所述序列组成的寡核苷酸在制备用于诊断、治疗或预防顺式元件重复不稳定性相关的人遗传病的药物中的用途。因此，本发明提供了用于治疗与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病的方法。
在第二个方面中，本发明还涉及可用于本发明第一方面的和/或用于本发明方法来阻止重复已扩增的转录物在细胞中积累和/或翻译的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可包含仅与下文所定义重复序列互补的序列。优选地，所述重复序列是本发明寡核苷酸长度的至少50％，更优选至少60％，再优选至少70％，再优选至少80％，甚至更优选至少90％或更多。在一个最优选的实施方案中，本发明寡核苷酸由仅与下文所定义重复序列互补的序列组成。例如，寡核苷酸可包含仅与下文所定义重复序列互补的序列和靶向部分，后者下文被称为靶向配体。
本文将重复或重复元件或重复序列或重复区段定义为在受试者(包括人受试者)基因组中的转录基因序列中的重复单元或重复性核苷酸单元(包括三核苷酸重复单元，或者是4、5或6个核苷酸的重复单元)的至少3、4、5、10、100、1000次或更多次重复。
寡核苷酸可以是单链或双链的。双链意为由两个互补链形成的异源二聚体，例如siRNA。在一个优选实施方案中，寡核苷酸是单链的。单链寡核苷酸相比于双链siRNA寡核苷酸来说具有几个优点：(i)预计其合成比两条互补siRNA链更容易；(ii)有更宽范围的化学修饰有可能用于优化更有效的细胞摄入、更好的(生理)稳定性和降低潜在的一般副作用；和(iii)siRNA更有可能产生非特异性作用和过度的药理学作用(例如对治疗方案或剂量的有效性和选择性的控制可能性较小)和(iv)siRNA较不可能作用于核内，不能针对内含子。因此，在第一方面的一个优选实施方案中，本发明涉及包含仅与人基因转录物中重复序列互补的序列或者由所述序列组成的单链寡核苷酸在制备用于诊断、治疗或预防与元件重复不稳定性相关的人遗传病的药物中的用途。
所述寡核苷酸优选包含至少10个至约50个与重复元件互补的连续核苷酸，优选12至45个、更优选12至30个、最优选12至25个与重复区段(优选具有三核苷酸重复单元或四核苷酸重复单元)互补的核苷酸。所述寡核苷酸可与转录物中编码区内的重复区段(优选多谷氨酰胺(CAG)或多丙氨酸(GCG)编码区段)互补和/或与之杂交。所述寡核苷酸还可与非编码区(例如5’或3’非翻译区)或前体RNA分子中存在的内含子序列互补和/或能与之杂交。
在一个优选实施方案中，本发明方法中使用的寡核苷酸包含与下述重复元件互补的序列，或者由其组成，所述重复元件具有选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复核苷酸单元作为重复核苷酸单元，并且所述寡核苷酸是单链或双链寡核苷酸。优选地，所述寡核苷酸是双链的。
应用包含与转录物中多谷氨酰胺(CAG)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：由人基因HD、HDL2/JPH3、SBMA/AR、SCA1/ATX1、SCA2/ATX2、SCA3/ATX3、SCA6/CACNAIA、SCA7、SCA17、AR或DRPLA中重复序列的扩增造成的人疾病亨廷顿舞蹈症、一些形式的脊髓小脑共济失调或Haw-River综合征、X连锁脊髓延髓肌营养不良和/或齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩。
应用包含与转录物中多丙氨酸(GCG)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：由人基因ARX、CBFA1、FOXL2、HOXA13、HOXD13、OPDM/PABP2、TCFBR1或ZIC2中重复序列的扩增造成的人疾病：婴儿痉挛综合征、颅骨锁骨发育不全、睑裂狭小、手-足-生殖器综合征、并指多指、眼咽肌营养不良和/或前脑无裂畸形。
应用包含与转录物中(CUG)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：分别由人基因DM1/DMPK、SCA8或JPH3中重复序列的扩增造成的人遗传病I型肌强直性营养不良、8型脊髓小脑共济失调和/或2型亨廷顿舞蹈症样疾病(Huntington’s disease-like 2)。优选地，这些基因为人类来源。
应用包含与转录物中(CCUG)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：由DM2/ZNF9基因中重复序列的扩增造成的人遗传病II型肌强直性营养不良。
应用包含与转录物中(CGG)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：由FRAXA/FMR1、FRAXE/FMR2和FRAXF/FAM11A基因中重复序列的扩增造成的人脆性X综合征。
应用包含与转录物中(CCG)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：由FRA11B/CBL2基因中重复的扩增造成的人遗传病雅各布森综合征。
应用包含与转录物中(GAA)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：人遗传病弗里德赖希共济失调。
应用包含与内含子中(ATTCT)n节段互补的序列或由其组成的寡核苷酸在以下疾病的诊断、治疗和/或预防中特别有用：人遗传病10型脊髓小脑共济失调(SCA10)。
用于本发明方法的与重复序列互补的寡核苷酸可包含以下分子或由其组成：RNA、DNA、锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代磷酰二胺(morpholino phosphorodiamidate，PMO)、亚乙基桥联核酸(ethylene bridged nucleic acid，ENA)或其混合物/杂交物，其包含天然DNA及RNA分子与合成的修饰核苷酸的组合。在这些寡核苷酸中，磷酸二酯骨架化学结构可进一步被其它修饰所替换，例如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯。还存在其它寡核苷酸修饰，新的修饰也有可能被开发并用于实践中。但是，所有这些寡核苷酸都具有能序列特异性地结合RNA的寡聚物性质。因此，在一个优选实施方案中，所述寡核苷酸包含以下分子或者由其组成：带有或不带有包含硫代磷酸酯之骨架的RNA核苷酸、DNA核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、吗啉代磷酰二胺、亚乙基桥联核酸(ENA)核苷酸或其混合物。
含有至少部分天然DNA核苷酸的寡核苷酸可用于诱导通过RNA酶H活性(EC.3.1.26.4)降解细胞中的DNA-RNA杂交分子。
包含天然RNA核糖核苷酸或RNA样合成核糖核苷酸的寡核苷酸可用于本发明的方法，以形成双链RNA-RNA杂交体，其通过RNA干扰或沉默(RNAi/siRNA)途径发挥酶依赖性反义核酸的作用，通过有义-反义链配对参与靶标RNA识别，然后通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)降解靶标RNA。
作为替代或补充，立体封闭的反义寡核苷酸(非RNA酶H依赖性反义核酸)干扰基因表达或者其它前体RNA或信使RNA依赖性的细胞过程，特别是(但不限于)RNA剪接和外显子跳跃，这通过结合靶标序列RNA转录物并阻碍诸如翻译的过程或者封闭剪接供体或剪接受***点来实现。使用修饰反义寡核苷酸进行的剪接和外显子跳跃技术已充分描述，是本领域普通技术已知的，例如可见于US6,210,892、WO9426887、WO04/083446和WO02/24906。另外，空间位阻可抑制蛋白质、核因子等的结合，因此有助于减少疾病如DM1中核积累或核糖核小点。
可包含与(已扩增的)重复序列互补的合成或修饰核苷酸的本发明寡核苷酸可用于本发明方法，以通过siRNA/RNA干扰或沉默途径减少含有重复的转录物或使其失活。
用于本发明方法的单链或双链寡核苷酸可包含以下分子或由其组成：DNA核苷酸、RNA核苷酸、2’-O取代的核糖核苷酸(包括烷基和甲氧基乙基取代)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和吗啉代(PMO)反义寡核苷酸和亚乙基桥核苷酸(ENA)及其组合，任选地是与RNA酶H依赖性反义核酸的嵌合体。锁核酸在寡核苷酸中的整合改变了碱基配对后双链体的构象，提高了双链体的稳定性。因此，LNA碱基在寡核苷酸序列中的整合可用于提高本发明互补寡核苷酸的以下能力：即在体外和体内主动提高转录物的RNA、降解抑制积累或者提高外显子的跳跃能力。肽核酸(PNA)是其中骨架是假肽而不是糖的人工DNA/RNA类似物，由于结合提高和更高的解链温度而能够与互补DNA寡聚物形成特别稳定的复合体。PNA也是用于本发明反义核酸和外显子跳跃应用的优良试剂。最优选地，用于本发明方法的寡核苷酸包含至少部分或全部的2’-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯RNA核苷酸或2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸。在本发明中最优选使用包含以下序列或者由其组成的寡核苷酸来诊断、治疗或预防顺式元件重复不稳定遗传病，所述序列与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(CCG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补，长度为10至50个、更优选12至35个、最优选12至25个核苷酸，并且包含2’-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯RNA核苷酸、2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸、LNA核苷酸或PMO核苷酸。
因此，在一个优选实施方案中，本发明的和用于本发明的寡核苷酸包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补的序列或者由其组成，长度为10至50个核苷酸，还具有以下特征：
(a)包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸(例如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸)、LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核苷酸可以任何组合使用和/或与DNA硫代磷酸酯或RNA核苷酸一起使用；和/或
(b)是单链寡核苷酸。
因此，在另一个优选实施方案中，本发明的和用于本发明的寡核苷酸包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补的序列或者由其组成，长度为10至50个核苷酸，还具有以下特征：
(c)包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸(例如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸)、LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核苷酸可以任何组合使用和/或与DNA硫代磷酸酯或RNA核苷酸一起使用；和/或
(d)是双链寡核苷酸。
如果本发明涉及具有两条互补链的双链寡核苷酸，其中反义链仅与人基因转录物中的重复序列互补，则此双链寡核苷酸优选不是具有反义RNA链(CUG)7和有义RNA链(GCA)7的siRNA，其应用于转染或未转染与GFP融合的人亨廷顿基因外显子1的培养的猴成纤维细胞(COS-7)或人神经母细胞(SH-SY5Y)细胞系，如Wanzhao Liu等((2003)，Proc.Japan Acad，79：293-298)所述。更优选地，本发明不涉及双链寡核苷酸siRNA(带有反义链(CUG)7和有义链(GCA)7)，也不涉及它在制备治疗或预防亨廷顿舞蹈症(更优选治疗或预防含有亨廷顿舞蹈症基因外显子1的构建体)的药物中的用途。
尽管使用一种寡核苷酸可能就足以减少重复序列已扩增的转录物(例如核积累的DMPK或ZNF9转录物或其片段)的量，或者足以减少重复序列已扩增的HD蛋白的积累，但是组合2、3、4、5或更多种寡核苷酸也在本发明的范围内。可将包含与转录物重复部分互补的序列或由其组成的寡核苷酸有利地与包含以下序列或者由其组成的寡核苷酸组合，该序列与含有重复的转录物中的独特序列互补和/或能与之杂交。包含重复序列特异性寡核苷酸的本发明方法和本发明药物还可与任何其他用于顺式元件重复不稳定性遗传病的治疗或药物相组合。对于诊断目的，本发明方法中使用的寡核苷酸可带有放射性标记或荧光标记，以允许在样品中、在体内原位细胞中、离体或体外检测转录物。对于肌强直性营养不良，可将标记的寡核苷酸用于诊断目的，以使DMPK或ZNF9RNA转录物分子与相关蛋白质的核聚集体显影。荧光标记可包含Cy3、Cy5、FITC、TRITC、罗丹明、GFP等。放射性标记可包含3H、35S、32/33P、125I。还可使用酶和/或免疫原性半抗原，例如地高辛、生物素和其它分子标签(HA、Myc、FLAG、VSV、lexA)。因此，在另一个方面中，本发明公开了其中使用上述寡核苷酸的体外或离体检测和/或诊断方法。
用于本发明的寡核苷酸适于直接体内施用至患有或有风险发生顺式元件重复不稳定疾病的个体的细胞、组织和/或器官，并可体内、离体或体外直接施用。或者，所述寡核苷酸可由能使该寡核苷酸在人细胞中表达的核酸载体提供，以获得所述寡核苷酸的持续来源。本发明的寡核苷酸分子可以能使所述寡核苷酸在人细胞中表达的表达载体形式提供给受治疗的细胞、组织、器官和/或受试者。所述载体优选通过基因递送运载体引入细胞中。优选的用于递送的运载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、腺病毒载体、Semliki森林病毒载体(SFV)、EBV载体等。适用于靶向式同源重组和整合进人细胞基因组的质粒、人工染色体、质粒也可适用于递送寡核苷酸。本发明优选的是转录由polIII启动子驱动的载体和/或其中转录物是与U1或U7转录物相融合的形式，这对于递送小转录物得到良好的结果。
在一个优选的实施方案中，使用约0.1nM至约1μM的寡核苷酸浓度。更优选地，所使用的浓度是约0.3至约400nM，甚至更优选约1至约200nM。如果使用数种寡核苷酸，则此浓度可指寡核苷酸的总浓度或所加入的每种寡核苷酸的浓度。如上文给出的寡核苷酸的浓度范围是体外或离体使用的优选浓度。本领域普通技术人员会理解，根据所使用的寡核苷酸、待治疗的靶细胞、基因靶标及其表达水平、所使用的培养基以及转染和孵育条件，所使用寡核苷酸浓度可进一步变化，并且可能需要进一步优化。
更优选地，本发明中用于预防、治疗或诊断顺式元件重复不稳定疾病的寡核苷酸是通过合成产生的，并以配制成可药用组合物中的形式直接施用至细胞、组织、器官和/或患者。递送药物组合物到受试者优选通过在人体的一个或多个部位的一种或多种胃肠外注射来进行，例如静脉内和/或皮下和/或肌内和/或椎管内和/或心室内给药，优选注射给药。椎管内或心室内给药(脑脊液中)优选地通过将扩散泵引入受试者身体来实现。多种灌注泵是本领域普通技术人员已知的。
用于靶向包含与重复序列互补的序列或由其组成的寡核苷酸分子的药物组合物可包含多种赋形剂，例如稀释剂、填充剂、防腐剂、增溶剂等，例如可见于Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第二十版.Baltimore，MD：Lippincott Williams & Wilkins，2000。
对于本发明方法来说，特别优选的是使用有助于将所述寡核苷酸递送至和递送进细胞的赋形剂，特别是能够形成将被复合或俘获的物质和/或寡核苷酸递送穿过细胞膜的复合体、运载体和/或脂质体的赋形剂。许多这样的物质是本领域已知的。合适的物质包括能够自组装成可递送寡核苷酸至细胞的颗粒的聚乙烯亚胺(PEI)、ExGen 500、合成的两亲性物质(SAINT-18)、lipofectin TM、DOTAP和/或病毒衣壳蛋白。Lipofectin代表脂质体转染剂的一个实例。它由两种脂质成分组成：阳离子脂质N-[1-(2，3二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)(以及是其甲基硫酸盐的DOTAP)和中性脂质二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。所述中性成分介导胞内释放。另一组递送***是多聚纳米颗粒。已知作为DNA转染剂的多聚阳离子(例如二乙胺基乙基(DEAE)-葡聚糖)可与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)组合，配制成可递送寡核苷酸跨过细胞膜进入细胞的阳离子纳米颗粒。除了这些常见纳米颗粒材料之外，鱼精蛋白这种阳离子肽提供了将寡核苷酸配制成胶体的替代方法。此胶体纳米颗粒***可形成所谓的proticle，其可通过简单的自组装过程来制备，以包装所述寡核苷酸并介导其胞内释放。本领域普通技术人员可选择并调整任何上述或其它市售的替代赋形剂及递送***来包装和递送寡核苷酸，以在本发明中递送用于治疗人体中顺式元件重复不稳定疾病的寡核苷酸。
另外，所述寡核苷酸可与特殊设计成促进摄入到细胞、细胞质和/或细胞核内的靶向配体共价或非共价连接。这样的配体可包含(i)识别细胞、组织或器官特异性元件以促进细胞摄入的化合物(包括但不仅限于肽(样)结构)和/或(ii)能够促进摄入到细胞中和/或从囊泡(例如内体或溶酶体)中胞内释放寡核苷酸的化合物。这些靶向配体还涵盖促进寡核苷酸穿过血脑屏障而摄入到脑中的分子。因此，在一个优选实施方案中，为药物中的核酸至少提供了用于递送的赋形剂和/或靶向配体和/或递送寡核苷酸到细胞和/或增强其细胞内递送的装置。因此，本发明还涵盖这种药物组合物，其包含本发明寡核苷酸，并且还包含至少一种用于递送的赋形剂和/或靶向配体和/或递送寡核苷酸到细胞和/或增强其细胞内递送的装置。
本发明还涉及用于减少细胞中包含重复的基因转录物的方法，所述方法包括施用单链或双链寡核苷酸分子，所述寡核苷酸分子优选包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸(例如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸)、LNA核苷酸或PMO核苷酸，长度为10至50个核苷酸，仅与重复序列互补。所述核苷酸可组合使用和/或与DNA硫代磷酸酯核苷酸一起使用。
在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其变化形式以非限制性含义使用，意指包括此词后面的项目在内，但是不排除没有具体提及的组合和/或项目。另外，没有具体数词修饰的要素不排除存在多于一个(种)要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个(种)且仅存在一个(种)要素。因此，没有数词修饰通常指“至少一个(种)”。
图例
图1：从以不同寡核苷酸或模拟对照转染的肌管中分离的RNA的Northern印迹。肌管来源自永生化小鼠成肌细胞系，其含有与无(CTG)重复的正常小鼠DMPK基因相邻的带有扩增长度约500的(CTG)n重复的转基因人DMPK基因。印迹显示了人DMPK mRNA(上)、小鼠DMPK(mDMPK)mRNA(中)和小鼠GAPDH mRNA(下)。
图2：通过磷光成像仪(phosphoimager)分析对图1的人和小鼠DMPK信号进行定量，相对于GAPDH信号进行归一化。结果相对于模拟处理(设为100)来表示。
图3：从含有小鼠-人嵌合DMPK基因的小鼠肌管中分离的总RNA的Northern印迹，其中mDMPK基因的3’部分被包含(CTG)110重复的人DMPK基因的相应区段替换。检测印迹中的DMPK mRNA(上图)和小鼠GAPDH mRNA(下图)。用反义寡核苷酸PS58或对照转染细胞。
图4显示用多种浓度的寡核苷酸PS58处理过的DM500肌管的应答。通过Northern印迹分析随后是磷光成像仪分析对hDMPK的表达进行定量。信号相对于GAPDH信号进行归一化，并相对于模拟处理后的应答进行表示。
图5显示在不同时间点(收获前2h、4h、8h和48h)用200nM PS58转染的DM500肌管总RNA的Northern印迹。模拟处理在收获前48小时进行。Northern印迹显示人和小鼠DMPK以及小鼠GAPDH的mRNA。通过磷光成像仪分析对它们进行定量，归一化的DMPK信号相对于模拟处理进行表示。
图6显示在用200nM PS58或模拟对照转染后2天、4天、6天和8天收获的DM500肌管总RNA的Northern印迹。如上所述进行Northern印迹分析和定量。
图7显示经寡核苷酸PS58(20和200nM)或模拟对照处理的转化有MyoD的成肌细胞总RNA的Northern印迹分析。所述成肌细胞来自获得自先天性I型肌强直性营养不良患者的成纤维细胞，所述患者带有具有长度为约1500的三联体重复扩增的hDMPK等位基因以及具有正常长度的11次重复的hDMPK等位基因。将Northern印迹与人DMPK(hDMPK)探针和GAPDH mRNA探针杂交。将人DMPK信号相对于GAPDH信号进行归一化，并相对于模拟对照进行表示。
图8显示对转染有200nM仅对(CUG)重复序列具有特异性的寡核苷酸PS58、对外显子1中序列具有特异性的寡核苷酸PS113或者模拟对照的DM500肌管进行的RT-PCR分析。RT-PCR分析使用对hDMPK mRNA及小鼠中具有天然(CUG)重复的以下三种其它基因转录物具有特异性的引物来进行：带有(CUG)6的Ptbp1 mRNA、带有(CUG)6的多配体蛋白聚糖3(Syndecan3)mRNA和带有(CUG)9的滑行蛋白β(Taxilinbeta)mRNA。将信号强度相对于肌动蛋白信号进行归一化，并相对于模拟对照进行表示。
图9显示用200nM PS58(B)或模拟对照(A)转染的DM500成肌细胞的FISH分析。处理开始后48小时，洗涤并固定细胞，然后与荧光标记的寡核苷酸Cy3-(CAG)10-Cy3杂交。使用Bio-Rad MRC1024激光共聚焦扫描显微镜和LaserSharp2000采集软件显现指示hDMPK(CUG)500mRNA在核中积累的核糖核小点。
图10显示图9所示实验中用PS58或模拟对照转染的DM500成肌细胞的核中存在核糖核小点的相对细胞计数.
图11显示用PS58或模拟对照处理的DM500小鼠的肌肉中hDMPKmRNA的RT-PCR分析。简言之，在GPS复合物中将PS58(2nmol)注射到一岁龄DM500小鼠中，24小时后重复此过程。15天后，分离小鼠跖肌和腓肠肌中，使用总RNA对hDMPK和小鼠肌动蛋白进行RT-PCR。将hDMPK信号的强度相对于肌动蛋白信号进行归一化，值相对于模拟对照进行表示。
图12显示用不同寡核苷酸(200nM)或模拟对照处理的DM500肌管的Northern印迹分析。PS58、PS146和PS147带有完全的2’O-甲基硫代磷酸酯骨架，但长度不同，分别为(CAG)7、(CUG)10和(CUG)5。PS142具有带有(CAG)7序列的完全的硫代磷酸酯DNA骨架。将hDMPK和mDMPK信号相对于小鼠GAPDH归一化，并表示为相对于模拟对照的百分比。下图显示定量。
实施例
实施例1
永生化成肌细胞系使用本领域技术人员已知的标准技术来源于DM500或CTG110小鼠。DM500小鼠来源于得自巴黎Gourdon小组的小鼠。CTG110小鼠在下文描述，存在于Nijmegen的Wieringa和Wansink小组。将在DMPK基因中具有不同长度(CTG)n重复的永生化成肌细胞系DM500或CTG110生长至亚汇合，并在33℃下5％CO2气氛中维持在以0.1％明胶包被的平皿中。将成肌细胞在添加了20％FCS、50μg/ml庆大霉素和20单位γ干扰素/ml的DMEM中亚汇合培养。通过以下步骤诱导肌管形成：在以Matrigel(BD Bioscience)包被的平皿上培养成肌细胞，并将汇合的成肌细胞培养物置于37℃下添加有5％马血清和50μg/ml庆大霉素的DMEM中。5天之后，在此低血清培养基上，培养物中出现收缩的肌管，用期望的寡核苷酸对其进行转染。按以下特定顺序加入NaCl(500mM，过滤除菌)、寡核苷酸和转染试剂PEI(ExGen 500，Fermentas)并直接混匀，以进行转染。根据说明书(ExGen 500，Fermentas)，寡核苷酸转染溶液含每微克寡核苷酸5微升的ExGen 500。在室温孵育15分钟后，将寡核苷酸转染溶液加入到带有所培养肌管的低血清培养基中，并轻轻混匀。寡核苷酸终浓度为200nM。用不含寡核苷酸的转染溶液进行模拟对照处理。在37℃孵育4小时后，将新鲜培养基加入到培养物中(得到约2.3×的稀释液)，继续在37℃孵育过夜。第二天除去含有寡核苷酸的培养基，向肌管加入新鲜的低血清培养基，在37℃再保持一天。在加入寡核苷酸到肌管培养物后48小时(在转换成诱导肌管形成的低血清条件后第七天)，用“总RNA小量试剂盒”(Bio-Rad)分离并制备RNA，以用于Northern印迹和RT-PCR分析。将Northern印迹与放射性人DMPK(hDMPK)探针和小鼠GAPDH探针杂交。用于DMPK的探针是人DMPK cDNA，其由带有完整3’UTR和11个CTG的DMPK开放读码框组成。
通过磷光成像仪分析来定量人和小鼠DMPK信号，并相对于GAPDH信号进行归一化。用于hDMPK mRNA的RT-PCR的引物位于3’非翻译区，其序列是5’-GGGGGATCACAGACCATT-3’和5’-TCAATGCATCCAAAACGTGGA-3’，用于小鼠肌动蛋白的引物如下：肌动蛋白有义5′-GCTAYGAGCTGCCTGACGG-3′和肌动蛋白反义5′-GAGGCCAGGATGGAGCC-3′。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分析，信号用Labworks 4.0(UVP BioImaging systems，Cambridge，UnitedKingdom)进行定量。将每个条带的强度相对于相应肌动蛋白条带的强度进行归一化，并相对于模拟对照进行表示。
如上所述在包含带有长度约500的(CTG)n重复的转基因人DMPK基因和不带(CTG)重复的正常小鼠DMPK基因的永生化成肌细胞DM500细胞系上测试了13种不同寡核苷酸(总结见表1)。图1显示了从以所述寡核苷酸转染的肌管中分离的RNA的Northern印迹分析，其中使用hDMPK探针和用作上样对照的GAPDH探针来显现。Northern印迹上的人DMPK(具有CTG重复)和小鼠DMPK(不带有CTG重复)的定量显示于图2。信号相对于小鼠GAPDH进行归一化，并以相对于模拟对照的方式表示。
表2显示了特异性寡核苷酸所引起的hDMPK mRNA水平降低。负(-)代表没有减少，带正(+)号的数字代表hDMPK mRNA分解的相对水平。显然，特异性靶向重复序列的寡核苷酸PS58在降低或改变hDMPK转录物方面比与hDMPK转录物独特序列互补的其它寡核苷酸强的多。
图3显示PS58在来自CTG110小鼠的小鼠永生化肌管中的作用，所述小鼠为含具有包含约110个(CTG)重复的人DMPK基因之3’部分的DMPK基因的敲入小鼠。Northern印迹分析显示，寡核苷酸PS58处理减少了含有(CTG)110重复的DMPK转录物，但是模拟处理后其没有减少。
实施例2(图4)
如上所述培养、制备并转染带有包含约(CTG)500重复扩增的人DMPK基因的DM500永生化成肌细胞细胞系(参见实施例1)。在此实施例中，用不同浓度的PS58进行转染。处理开始后84小时，收获肌管，如上所述对所分离的RNA进行Northern印迹分析(参见实施例1)。
图4显示用磷光成像仪分析进行的hDMPK mRNA信号定量，相对于不同浓度的GAPDH进行归一化。在这些条件下，在约1nM附近观察到半最高作用。
实施例3(图5和6)
如上所述培养、制备并转染带有包含约(CTG)500重复扩增的人DMPK基因的DM500永生化成肌细胞细胞系(参见实施例1)。但是，在此实施例中，在不同时间点用200nM PS58进行转染。通常在转换到低血清条件诱导肌管形成7天后收获DM500肌管。标准方法(如实施例1和2中)是在收获前48小时(2天)开始进行处理(转染)。现在，在收获前2至48小时(图5)或2至8天(图6)用PS58进行处理。如前述进行Northern印迹分析和定量。
图5显示，相比于模拟对照处理，DM500肌管中扩增的hDMPK mRNA在用寡核苷酸PS58处理的2小时内迅速减少。
图6显示了DM500肌管中扩增的hDMPK mRNA持续减少至少8天。应注意，对于8天实验的情况，在成肌细胞期(约60％汇合度，33℃，高血清)转染细胞，在收获前它们多次接受新鲜培养基(包括转染后2天时改变为低血清37℃)。实施例2和3表明了仅针对重复扩增的寡核苷酸所实现的高效抑制能力。这种作用的强度可受到这些模式细胞***中相对低水平hDMPK表达的影响，这也是人体中常见的。
实施例4(图7)
在此实施例中，使用了获得自先天性I型肌强直性营养不良(cDM1)人患者的成纤维细胞。这些患者细胞带有一个具有长为1500的三联体重复扩增的致病DMPK等位基因以及一个重复度长为11的正常DMPK等位基因。用PCR和Southern印迹确认在两个等位基因中的(CTG)n扩增的大小。
亚汇合培养成纤维细胞，37℃下5％CO2气氛中维持在以0.1％明胶包被的平皿中。在添加有10％FCS和50μg/ml庆大霉素的DMEM中亚汇合培养成纤维细胞。通过以下步骤诱导肌管形成：在以Matrigel(BDBiosciences)包被的平皿上培养成纤维细胞，在75％汇合时在添加有2％HS和50μg/ml庆大霉素的DMEM中用表达MyoD的腺病毒(Ad5Fib50MyoD，Crucell，Leiden)(MOI＝100)感染细胞2小时。孵育期过后，除去MyoD腺病毒，添加含10％FCS和50μg/ml庆大霉素的DMEM。所述细胞在此培养基中维持于37℃的5％CO2气氛下直至100％汇合。此时，将细胞置于添加了2％FCS和50μg/ml庆大霉素的DMEM中。5天后，在此低血清培养基中，按照说明书的方法(ExGen 500，Fermentas)并如上所述用PS58转染细胞。最终寡核苷酸浓度是200nM和20nM。处理开始后48小时(转换到低血清条件后7天)，用“总RNA小量试剂盒”(Bio-Rad)分离并制备RNA，以用于Northern印迹分析。将Northern印迹与放射性人DMPK(hDMPK)探针和小鼠GAPDH mRNA探针杂交。通过磷光成像仪分析来定量DMPK信号，并针对GAPDH信号进行归一化，以相对于模拟对照的形式表示。
图7显示经寡核苷酸PS58(20和200nM)处理的转化有MyoD的成肌细胞的Northern印迹分析。结果证明了对致病的hDMPK(CUG)1500RNA转录物有效的完全抑制，而较小的正常hDMPK(CUG)11RNA转录物仅仅在两个浓度下受到轻微影响。因此，针对重复区域的寡核苷酸显示出针对较大重复尺寸(或致病扩增)的选择性。
实施例5(图8)
在此实施例中，如上文实施例1中所述培养、转染和分析带有包含约(CTG)500重复扩增的人DMPK基因的DM500永生化成肌细胞细胞系。收获前48小时，用200nM仅对(CUG)重复序列具有特异性的寡核苷酸PS58、对外显子1中序列具有特异性的寡核苷酸PS113或者模拟对照处理DM500肌管。针对此小鼠细胞系中表达的hDMPK mRNA(参见实施例1的引物)及小鼠中具有天然(CUG)重复的三种其它基因(带有(CUG)6的Ptbp1、带有(CUG)6的多配体蛋白聚糖3和带有(CUG)9的滑行蛋白β)的转录物进行RT-PCR分析。
PCR所用引物如下：Ptbp1：5’-TCTGTCCCTAATGTCCATGG-3’和5’-GCCATCTGCACAAGTGCGT-3’；多配体蛋白聚糖3：5’-GCTGTTGCTGCCACCGCT-3’和5’-GGCGCCTCGGGAGTGCTA-3’；滑行蛋白β：5’-CTCAGCCCTGCTGCCTGT-3’和5’-CAGACCCATACGTGCTTATG-3’。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用Labworks 4.0程序(UVP BioImaging systems，Cambridge，UnitedKingdom)进行信号定量。使用相应的肌动蛋白信号对信号强度进行归一化，表示为相对模拟对照的形式。
图8显示PS58对hDMPK mRNA表达的最高抑制的RT-PCR结果。相比于与这些基因转录物没有互补序列的寡核苷酸PS113，带有天然小(CUG)重复的其它基因转录物不受(CUG)重复特异性的寡核苷酸PS58影响或仅有轻微影响。
此实施例证实了，仅针对重复区域的寡核苷酸对长片段重复(或引起疾病的扩增)相较于天然较短片段重复的选择性。
实施例6(图9和10)
在此实施例中，培养、用PS58(200nM)转染带有包含约(CTG)500重复扩增的人DMPK基因的DM500永生化成肌细胞系。本实施例中，对细胞进行FISH分析。开始处理后48小时，用4％甲醛、5mM MgCl2和1×PBS固定细胞30分钟。与荧光标记的寡核苷酸Cy3-(CAG)10-Cy3在37℃下潮湿腔室中杂交过夜。杂交后，洗涤材料并包埋到mowiol中，使之干燥过夜。使用Bio-Rad MRC1024激光共聚焦扫描显微镜和LaserSharp2000采集软件显现核包含体(核糖核小点)。对总共50个细胞计数，对这些细胞的核中包含体的存在情况进行评分。
文献显示，含有(CUG)扩增重复的DMPK mRNA在核内累积并聚集，与调节性核蛋白和转录因子一起形成核糖核小点。因此，正常的核基因加工和细胞功能受到损害。
图9显示了在核内含有核糖核包含体的模拟处理的细胞，而在用PS58处理后，它们不再存在于细胞核内。图10显示，用PS58处理使得DM500肌管中对照条件下可见的含核糖核小点的细胞核的百分比明显降低。此结果证明，对hDMPK mRNA表达的抑制还抑制了富含疾病相关之三联体重复(CUG)的包含体。
实施例7(图11)
在本实施例中，在含有带约500个三联体(CTG)n扩增的hDMPK的DM500小鼠中体内评价PS58的作用。DM500小鼠通过体细胞扩增来源于DM300小鼠(例如，参见Gomes-Pereira M等(2007)PLoS Genet.20073(4)：e52)。通过Southern印迹和PCR分析确认约500的(CTG)三联体重复扩增。
简言之，按照所附说明书将PS58与转染试剂ExGen 500(Fermentas)混合用于体内应用。将PS58(2nmol，与Exgen 500一起在转染溶液中)(40μl)注射到一岁龄DM500小鼠的GPS复合体中，24小时后重复此过程。作为对照，类似地用不含PS58的转染溶液处理DM500小鼠。15天后，处死小鼠，分离肌肉，从组织中分离总RNA(使用Trizol，Invitrogen)。与上文所述类似，进行RT-PCR分析以检测肌肉中的hDMPK mRNA。使用Labworks 4.0程序(UVP BioImaging systems，Cambridge，UnitedKingdom)确定每个条带的强度，相对于相应肌动蛋白条带的强度进行归一化。引物位置如图所示。
图11显示相比于模拟处理，体内用PS58处理DM500小鼠强烈减少跖肌和腓肠肌中所存在的含有(CUG)n重复扩增的hDMPK mRNA。
实施例8(图12)
在此实施例中，对不同寡核苷酸(在长度和骨架化学性质方面不同)但都仅针对(CTG)n重复扩增的序列进行比较。如上文实施例1中所述培养、转染和分析DM500肌管。用磷光成像仪分析对Northern印迹定量，将DMPK信号针对GAPDH进行归一化。
这里，用下述寡核苷酸(200nM)处理DM500肌管，所有寡核苷酸均具有硫代磷酸酯骨架(参见表3)。
图12显示，对于所测试的所有寡核苷酸来说，DM500肌管的处理均导致具有(CUG)n扩增的hDMPK mRNA完全减少。在此条件下，所获得的最高效果不依赖于所用单链寡核苷酸的寡核苷酸长度、骨架修饰或可能的抑制机制。
实施例9
来自男性亨廷顿舞蹈症患者的成纤维细胞(GM 00305)获得自Coriell Cell Repository(Camden，New Jersey，US)，并根据所附说明书和本领域技术人员公知的标准技术进行培养。亨廷顿舞蹈症患者带有亨廷顿舞蹈症基因的一个健康的等位基因和一个致病的等位基因，其导致同时表达两种mRNA，分别带有正常数量的和扩增数量的(CAG)重复。
用带有与亨廷顿mRNA中(CAG)三联体重复互补的带有(CUG)7序列的21聚体2’O-甲基硫代磷酸酯RNA反义寡核苷酸PS57转染成纤维细胞。如制造商所指示，在100或200nM的PEI存在下进行转染。转染后24小时，收获细胞，分离总RNA，通过RT-PCR进行分析。使用下游外显子64中的引物(5’GAAAG TCAGT CCGGG TAGAA CTTC 3’和5’CAGAT ACCCG CTCCA TAGCAA 3’)确定亨廷顿转录物。此方法对两种类型的亨廷顿mRNA(正常的和具有额外(CAG)扩增的突变转录物)都进行检测。还测定了GAPDH mRNA(看家基因)。对信号进行定量，将亨廷顿mRNA的总量相对于相同样品中GAPDH mRNA的量进行归一化。结果以相对于来自成纤维细胞的对照处理(无寡核苷酸，其为100％)样品的形式表示。
在来自用100或200nM PS57转染的成纤维细胞的样品中，观察到相比于对照处理的细胞分别为约53％和66％的显著更低的总亨廷顿mRNA水平。
因此，仅针对(CAG)重复的寡核苷酸PS57诱导亨廷顿mRNA水平的降低，这些结果与相对于正常亨廷顿舞蹈症mRNA而选择性抑制突变体相一致。
表1：所测试的寡核苷酸总结
  寡核苷酸名   修饰   序列   位置
  PS40   2’OMe RNA硫代磷酸酯/FAM   GAGGGGCGUCCAGGGAUCCG   内含子14-外显子15
  PS41   2’OMe RNA硫代磷酸酯   GCGUCCAGGGAUCCGGACCG   内含子14-外显子15
  PS42   2’OMe RNA硫代磷酸酯   CAGGGAUCCGGACCGGAUAG   内含子14-外显子15
  PS56   DNA   CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG   外显子15中的重复
  PS58   2’OMe RNA硫代磷酸酯/FAM   CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG   外显子15中的重复
  PS59   2’OMe RNA硫代磷酸酯   UGAGUUGGCCGGCGUGGGCC   ESE外显子15
  PS60   2’OMe RNA硫代磷酸酯   UUCUAGGGUUCAGGGAGCGCGG   ESE外显子15
  PS61   2’OMe RNA硫代磷酸酯   ACUGGAGCUGGGCGGAGACCC   ESE外显子15
  PS62   2’OMe RNA硫代磷酸酯   CUCCCCGGCCGCUAGGGGGC   ESE外显子15
  PS113   DNA硫代磷酸酯   GAGCCGCCTCAGCCGCACCTC   外显子1
  PS114   DNA硫代磷酸酯   GAAGTCGGCCACGTACTTGTC   外显子1
  PS115   DNA硫代磷酸酯   GGAGTCGAAGACAGTTCTAGG   外显子15
  PS116   DNA硫代磷酸酯   GGTACACAGGACTGGAGCTGG   外显子15
表2：寡核苷酸转录后hDMPK mRNA的降低
  寡核苷酸   hDMPK mRNA的降低  SEQ ID No.’s
  PS40   +  1
  PS41   -  2
  PS42   -  3
  PS59   -  4
  PS60   -  5
  PS61   +/-  6
  PS62   -  7
  PS58   ++++  8
  PS56   -  9
  PS113   -  10
  PS114   -  11
  PS115   +/-  12
  PS116   +  13
(-)表示无降低，(+)表示hDMPK mRNA的降低水平
表3：实施例9中使用的寡核苷酸
 #   长度   (CAG)n  取代核糖  RNAse H分解可能性
 PS58   21-mer   n＝7  2’O-甲基  无
 PS146   30-mer   n＝10  2’O-甲基  无
 PS147   15-mer   n＝5  2’O-甲基  无
 PS142   21-mer   n＝7  脱氧核糖(DNA)  有
*所有寡核苷酸均全长为硫代磷酸酯并取代
序列表
<110>Prosensa B.V.
<120>用于治疗DNA重复不稳定性相关的遗传疾病的方法和物品
<130>P6010168PCT
<150>EP06118809.0
<151>2006-08-11
<150>EP06119247.2
<151>2006-08-21
<160>34
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS40
<400>1
gaggggcguc cagggauccg    20
<210>2
<211>20
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS41
<400>2
gcguccaggg auccggaccg    20
<210>3
<211>20
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS42
<400>3
cagggauccg gaccggauag    20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS56
<400>4
cagcagcagc agcagcagca g    21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS57
<400>5
cugcugcugc ugcugcugcu g    21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS58
<400>6
cagcagcagc agcagcagca g    21
<210>7
<211>20
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS59
<400>7
ugaguuggcc ggcgugggcc      20
<210>8
<211>22
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS60
<400>8
uucuaggguu cagggagcgc gg   22
<210>9
<211>21
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS61
<400>9
acuggagcug ggcggagacc c    21
<210>10
<211>20
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS62
<400>10
cuccccggcc gcuagggggc      20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS113
<400>11
gagccgcctc agccgcacct c    21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS114
<400>12
gaagtcggcc acgtacttgtc     21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS115
<400>13
ggagtcgaag acagttctag g          21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS116
<400>14
ggtacacagg actggagctg g          21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS142
<400>15
cagcagcagc agcagcagca g          21
<210>16
<211>30
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS146
<400>16
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 30
<210>17
<211>15
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸PS147
<400>17
cagcagcagc agcag    15
<210>18
<211>12
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸(CAG)n
<400>18
cagcagcagc ag        12
<210>19
<211>12
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸(GCG)n
<400>19
gcggcggcgg cg        12
<210>20
<211>12
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸(CUG)n
<400>20
cugcugcugc ug        12
<210>21
<211>12
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸(CGG)n
<400>21
cggcggcggc gg        12
<210>22
<211>12
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸(CCUG)n
<400>22
ccugccugcc ug             12
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物 1 hDMPK
<400>23
gggggatcac agaccatt        18
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物 2 hDMPK
<400>24
tcaatgcatc caaaacgtgg a     21
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>肌动蛋白有义引物
<400>25
gctaygagct gcctgacgg        19
<210>26
<211>17
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>肌动蛋白反义引物
<400>26
gaggccagga tggagcc        17
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物 1 Ptbp1
<400>27
tctgtcccta atgtccatgg     20
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物 2 Ptbp1
<400>28
gccatctgca caagtgcgt      19
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物1多配体蛋白聚糖3
<400>29
gctgttgctg ccaccgct       18
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物2多配体蛋白聚糖3
<400>30
ggcgcctcgg gagtgcta       18
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物1β滑行蛋白
<400>31
ctcagccctg ctgcctgt          18
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物2β滑行蛋白
<400>32
cagacccata cgtgcttatg         20
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物1亨廷顿
<400>33
gaaagtcagt ccgggtagaa cttc    24
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物2亨廷顿
<400>34
cagatacccg ctccatagcaa        21

Claims (19)

1.长度为10至50个核苷酸的单链寡核苷酸用于制备治疗或预防人顺式元件重复不稳定性相关遗传病的药物中的用途，所述单链寡核苷酸由仅与基因转录物中重复元件互补的序列组成，其中所述重复元件选自(CAG)n和(CUG)n。
2.根据权利要求1的用途，其中所述重复元件存在于基因转录物的编码序列中。
3.根据权利要求1的用途，其中所述重复元件存在于基因转录物的非编码序列中。
4.根据权利要求2的用途，其中所述寡核苷酸由与多谷氨酰胺(CAG)n节段互补的序列组成，并且其中所述重复不稳定性疾病是亨廷顿舞蹈症、脊髓小脑共济失调、Haw-River综合征、X连锁脊髓延髓肌营养不良和/或齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩。
5.根据权利要求3的用途，其中所述寡核苷酸由与(CUG)n重复互补的序列组成，并且其中所述重复不稳定性疾病是I型肌强直性营养不良、8型脊髓小脑共济失调和/或2型亨廷顿舞蹈症样疾病。
6.根据权利要求1至5中任一项的用途，其中所述寡核苷酸的长度为12至30个核苷酸。
7.根据权利要求1至5中任一项的用途，其中所述寡核苷酸由以下构成：具有或不具有包含硫代磷酸酯的骨架的RNA核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、吗啉代磷酰二胺(PMO)、亚乙基桥联核酸(ENA)核苷酸或其混合物、或者具有包含硫代磷酸酯的骨架的DNA核苷酸。
8.根据权利要求7的用途，其中所述寡核苷酸包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸。
9.权利要求8的用途，其中所述寡核苷酸包含至少部分或全部的2’-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯RNA核苷酸或2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸。
10.根据权利要求1至3中任一项的用途，其中所述寡核苷酸由(CAG)7组成并且是2’O-甲基RNA硫代磷酸酯，并且其中所述人顺式元件重复不稳定性相关遗传病是I型肌强直性营养不良。
11.根据权利要求1至3中任一项的用途，其中所述寡核苷酸由(CUG)7组成并且是2’O-甲基RNA硫代磷酸酯，并且其中所述人顺式元件重复不稳定性相关遗传病是亨亭顿舞蹈症。
12.根据权利要求1至3中任一项的用途，其中所述药物中的寡核苷酸由能够表达所述寡核苷酸的核酸载体来提供。
13.根据权利要求1至3中任一项的用途，其中所述药物中的寡核苷酸至少与用于递送所述寡核苷酸至细胞和/或增强其胞内递送的赋形剂和/或靶向配体一起提供。
14.单链寡核苷酸，其由与选自(CAG)n和(CUG)n的重复元件互补的序列组成，长度为10至50个核苷酸。
15.根据权利要求14的寡核苷酸，其还包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸、2’-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯RNA核苷酸、DNA硫代磷酸酯核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、吗啉代核苷酸和/或其组合。
16.根据权利要求14或15的寡核苷酸，其带有放射性标记或荧光标记。
17.包含根据权利要求1-15中任一项所定义寡核苷酸的药用组合物。
18.权利要求17的可药用组合物，其还包含至少一种用于递送所述寡核苷酸至细胞和/或增强其胞内递送的赋形剂和/或靶向配体。
19.权利要求1-15中任一项所定义的寡核苷酸在制备用于减少细胞中含重复的基因转录物的药物中的用途。
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