DE60219215T2

DE60219215T2 - Prionen-bindende peptidsequenzen

Info

Publication number: DE60219215T2
Application number: DE60219215T
Authority: DE
Inventors: Theodoros Sklaviadis; Cindy Panagiotides; John Paspaltsis; Basil Karageorgis
Original assignee: Centre For Research And Technology Hellas/intitute Of Agrobiotechnology Ina Thermi; CT FOR RES AND TECHNOLOGY HELL; Panagiotides Cindy Vasilika; Sklaviadis Theodoros Vasilika
Current assignee: Centre For Research And Technology Hellas/intitute Of Agrobiotechnology Ina Thermi; CT FOR RES AND TECHNOLOGY HELL; Panagiotides Cindy Vasilika; Sklaviadis Theodoros Vasilika
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2002-10-23
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2022-10-24
Also published as: EP1554305B1; EP1554305A1; DE60219215D1; AU2002342850A1; ES2283608T3; DK1554305T3; AU2002342850A8; WO2004037854A1; PT1554305E; ATE358136T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft proteinartige Verbindungen, die an das Prion Protein binden, und prophylaktische und therapeutische Verwendungen dieser Verbindungen, um die Umwandlung eines normalen Prion Proteins (PrP^C) in die Protease resistente störungsassoziierte Isoform, PrP^SC, zu hemmen.
Die Prion Störungen sind eine Familie fataler neurodegenerativer Störungen, die zur Gruppe der übertragbaren subakuten spongiformen Enzephalopathien (engl.: transmissable subacute spongiform encephalopatie (TSE)) gehören. Zurzeit sind Creuzfeldt-Jakob Krankheit (engl.: Creuzfeldt-Jacob disease (CJD)), Kuru, fatales familiäres Insomnie Syndrom und Gertmann Straussler Scheinker Syndrom die Formen, die Menschen befallen. Unter diesen ist die CJD die häufigste, die ungefähr einen Menschen pro Million Bevölkerung pro Jahr weltweit befällt (Johnson und Gibbs, (1998) N. Engl. J. Med. 339:1994-2004). Prion Störungen von Tieren schließen die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) in Rindern, Scrapie in Schafen und Ziegen und die chronische Tuberkulose von Maultierhirschen und Rothirschen ein. BSE, die zum ersten Mal 1986 im Vereinigten Königreich identifiziert wurde, wurde in Europa in den 90er Jahren eine bedeutende Epidemie. Bis April 2001 waren 181.500 BSE infizierte Rinder in Europa, vorwiegend in Großbritannien, identifiziert worden (World Health Organization, 2001, Official Journal of the European Communities, Special Report No. 14/2001 C324/1 from the court of auditors, 2001). Außerhalb Europas ist in Kanada, den Falkland Inseln, dem Oman und kürzlich in Japan über BSE infizierte Rinder berichtet worden. Es wird vermutet, dass eine neue Prion Störung, eine variante CJD, als eine Kreuzspezies Infektion durch den Verzehr BSE infizierter Rinder durch Menschen aufgekommen ist. Über einhundert Fälle der varianten CJD in Menschen wurden seit Juni 2001 diagnostiziert (World Health Organization, 2001, vide supra). Gegenwärtig gibt es keine wirksame Behandlung oder Prophylaxe für Prion Störungen.
Ein gemeinsames Merkmal aller TSE-Krankheiten ist die Anhäufung einer abweichenden Isoform des normalen Prion Proteins (bezeichnet als PrP oder PrP^C). Das zelluläre Prion Protein (PrP^C) ist ein Sialoglykoprotein, das durch ein Gen kodiert ist, das in Menschen auf Chromosom 20 lokalisiert ist (Oesch, B. et al., Cell 40:735-746, (1985); Basler, K. et al., 46:417-428 (1986); Liao, Y. J. et al., Science 233:364-367 (1986); Meyer, R. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2310-2314 (1986); Sparkes, R. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7358-7362 (1986); Bendheim, P. E. et al. J. Infect. Dis. 158:1198-1208 (1988); Turk, E. et al. Eur. J. Biochem. 176:21-30 (1988)). Das PrP Gen wird in neuralem und nicht neuralem Gewebe exprimiert, die höchste Konzentration von mRNA liegt in Neuronen vor (Chesebro, B. et al., Nature 315:331-333 (1985); Kretzschmar, H. A. et al., Am. J. Pathol. 122:1-5 (1986); Brown, H. R. et al., Acta Neuropathol. 80:1-6 (1990); Cashman, N. R. et al., Cell 61:185-192 (1990); Bendheim, P. E., Neurology 42:149-156 (1992)).
Das Translationsprodukt eines PrP Gens besteht aus 253 Aminosäuren in Menschen (Kretzschmar, H. A. et al., DNA 5:315-324 (1986); Pucket, C. et al., Am. J. Hum. 49:320-329 (1991)), 254 in Hamstern und Mäusen oder 256 Aminosäuren in Schafen und durchläuft mehrere post-translationale Modifikationen. In Hamstern wird ein Signalpeptid aus 22 Aminosäuren am N-Terminus abgespalten, 23 Aminosäuren werden vom C-Terminus entfernt nach Zugabe eines Glykosylphosphatidylinositol (GPI) Ankers, und Asparagin verbundene Oligosaccharide werden an die Reste 181 und 197 in einer Schlaufe, die durch eine Disulfid Bindung gebildet wird, angehängt (Turk, E. et al., Eur. J. Biochem. 176:21-30 (1988); Hope, J. et al., EMBO J. 5:2591-2597 (1986); Stahl, N. et al., Cell 51:229-240 (1987); Stahl, N. et al., Biochemistry 29:5405-5412 (1990); Safar, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6377 (1990)).
In Prion bedingten Enzephalopathien wird PrP^C in eine veränderte Form, bezeichnet als PrP^SC, umgewandelt, die von PrP^C unterscheidbar ist insofern, dass PrP^SC (i) aggregiert; (ii) Proteinase K resistent ist insofern, dass nur die N-terminalen 67 Aminosäuren durch die Proteinase K Verdauung entfernt werden unter Bedingungen, bei denen PrP^C komplett abgebaut wird; und (iii) eine Veränderung in der Protein Konformation von α-helikal für PrP^C in eine veränderte Form aufweist (Oesch B. et al., Cell 40:735-746 (1985); Bolton, D. C. et al., Science 218:1309-1311 (1982); McKinley, M. P. et al., Cell 35:57-62 (1982); Bolton, D. C. et al., Biochemistry 23:5898-5905 (1984); Prusiner, S. B. et al., Cell 38:127-134 (1984); Bolton, D. C. et al., Arch. Biochem. Biophys. 258:1515-22 (1987)).
Mehrere Beweisführungen schlagen vor, dass PrP^SC eine Schlüsselkomponente des übertragbaren Erregers sein kann, der für Prion bedingte Enzephalopathien verantwortlich ist (Prusiner, S. B. Science 252:1515-22 (1991)), und es wurde ermittelt, dass sein Protease resistentes Kernstück das bedeutende Strukturprotein der amyloidartigen Fibrillen, die sich unter einigen dieser Bedingungen intrazerebral akkumulieren, ist (Brendheim, P. E. et al., Nature 310:418-421 (1984); DeArmond, S. J. et al., Cell 41:221-235 (1985); Kitamoto, T. et al., Ann. Neurol. 20:204-208 (1986); Robert, G. W. et al., N. Engt. Med. 315:1231-1233 (1986); Ghetti, B. et al., Neurology 39:1453-1461 (1989); Tagliavini, F. et al., EMBO J. 10:513-519 (1991); Kitamoto, T. et al., Neurology 41:306-310 (1991)).
Zusammenfassend wird die abnorme Konfiguration des Prion Proteins (PrP^SC) als infektiös und resistent gegen Proteolyse betrachtet (Prusiner, S.B. (1991) Science 252:1515-1522; Prusiner, S.B. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 95:13363-13383). Normales PrP Protein (PrP^C) wird in den meisten Geweben des Körpers exprimiert, wobei das Nervengewebe die höchsten PrP^C Expressionsspiegel zeigt (Bendheim et al. (1992), Neurology 42, 149-156, Horiuchi et al., (1995) J. Gen. Virol. 76: 2583-2587). Im Unterschied zu PrP^SC ist die normale Form von PrP^SC Protease sensitiv und nicht infektiös. Es wird jedoch angenommen, dass PrP^SC von der normalen zellulären Isoform abgeleitet ist (Prusiner, S.B. (1991) Science 252:1515-1522). Die in vitro Umwandlung von PrP^C in PrP^SC, die durch zellfreies PrP^SC katalysiert wird (wie ursprünglich 1994 durch Kocisko, D.A., Come, J.H., Priola, S.A., Chesebro, B., Raynond, C.J., Lansbury, P.T. und Caughey, B. (1994) Nature 370:471-474 berichtet), verleiht dieser Theorie Rückhalt.
Ein Hauptziel für eventuelles therapeutisches Eingreifen in neurodegenerative Störungen, insbesondere in Prion Störungen, ist die Umwandlung von PrP^C in PrP^SC. Eine Vielzahl von Inhibitoren der PrP^SC Bildung, die Anthracycline, Congo Red, polysulfatierte Glucosaminoglykane und Heparine einschließen, wurden auf mögliche therapeutische Zweckmäßigkeit in der Behandlung oder Prävention von Prion Störungen untersucht (Ehlers, B. und Diringer, H. (1984) J. Gen. Virol. 65:1325-1330.; Caughey, B. und Race, R.E. (1992) J. Neurochem. 59:768-771.; Caspi, S., Sasson, S.B., Taraboulos, A. und Gabizon, R. (1998) J. Biol. Chem. 273:3483-3489.; Kimberlin, R.H. und Walker, C.A. (1986) Antimicrob. Agents Chemother. 30:409-413; Caughey, B. und Raymond, G.J. (1993) J. Virol. 67:643-650). Inhibitorische Peptide mit Homologie zu PrP sind ebenfalls als eventuelle therapeutische Mittel zur Behandlung von Prion Störungen vorgeschlagen worden (Chesebro, B. et al, US Patentanmeldung 2001/0041790 ; Kapurniotou, A. et al, US Patentanmeldung 2001/0007015 ; Cashman et al, Cashman, N. et al, WO 00/78344 ; Collinge, J. et al, WO 01/07479 ; Soto-Jara, C. et al, US Patent 5 948 763 ). Kürzlich screente Prusiners Gruppe eine Reihe von Arzneimitteln, von denen bekannt ist, dass sie die Bluthirnschranke durchdringen, um zu bestimmen, ob sie die Bildung von PrP^SC inhibieren könnten (Korth, C., May, B.C.H., Cohen, F.E. und Prusiner, S.B. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:9836-9841). Sie fanden zwei Arten von Arzneimitteln, Acridin und Phenothiazin Derivate, die ziemlich wirksame Inhibitoren der PrP^SC Bildung in Neuroblastom Zellen sind.
Ein Ansatz zur Prävention von Prion Störungen wäre ein Impfstoff gegen PrP. Für viele bakterielle und virale Infektionen haben sich Impfstoffe als recht wirksam erwiesen, wobei sie Immunität gegen eine Vielzahl von Störungen sowohl beim Menschen als auch bei Haustieren bereitstellen. Die schlechte Immunogenität von PrP hat jedoch die Entwicklung eines Impfstoffes, der gegen Prion Störungen wirksam ist, behindert. Jedoch wird die eventuelle Verwendung von Antikörpern zur Prophylaxe von Prion Störungen in vielen Labors rege untersucht. Mehrere Gruppen haben für die Anwendung von anti-PrP Antikörpern von positiven Wirkungen berichtet. Kürzliche Entwicklungen schließen die Darlegung von sowohl Prävention oder Verzögerungen in Protease resistenter Prion Bildung in kultivierten Zellen (Enari, M. und Weissmann, C. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:9295-9299) als auch in einigen Fällen eine Umkehrung der Bildung von PrP^SC in Prion infizierten Zellen (Peretz, D. et al. (2001) Nature 412:739-743) ein.
Obwohl eine Vielzahl von Ansätzen in Richtung des Ziels von Prävention und/oder Therapie von Prion Störungen gemacht worden sind, gibt es keine bestehenden prophylaktischen oder therapeutischen Behandlungen, die sich entweder in Menschen oder Tieren als wirksam erwiesen haben.
Für mehrere der oben erwähnten Verbindungen ist gezeigt worden, dass sie den Beginn klinischer Symptome verzögern und die Überlebenszeit für Tiere, die experimentell mit Scrapie infiziert wurden, verlängern, aber keine hat sich als wirksame Therapie für Prion Störungen erwiesen. Darüber hinaus weisen einige dieser Moleküle ein solch hohes Risiko für eventuelle toxische Wirkungen auf, dass sie keine geeignete Auswahl für therapeutische Mittel darstellen würden, um damit entweder Menschen oder Tiere zu behandeln. Die toxischen Nebenwirkungen können allgemeine Toxizität sein, die zum Beispiel für Acridin und Phenothiazin kritisch ist. Darüber hinaus sind für die Peptide und Proteine, die im Stand der Technik bekannt sind, allergische Antworten als ein Ergebnis der Verabreichung der Arzneimittel häufig ein schweres Problem.
Beruhend auf der Arbeit, die bis heute mit Zellkultur Modellen durchgeführt wurde, weist die Verwendung von Antikörpern zur Behandlung von Prion Störungen Potential auf, befindet sich aber noch in den frühen Stadien der Entwicklung. Dieser therapeutische Ansatz weist Nachteile auf, wovon einer die kurze Halbwertszeit der Antikörper ist und ein anderer die Schwierigkeit, Antikörper über die Bluthirnschranke zu bringen, um Zielgebiete im Gehirn zu erreichen.
Yehiely F. et al., "Identification of Candidate Binding to Prion Protein", Neurobiology of Disease, 1997, Seite 339-355, beschreibt die Identifikation von Proteinen, die an PrP binden, durch Verwenden eines Fusionsproteins, das PrP und alkalische Phosphatase enthält, für Screening Experimente.
Das US Patent 6,365,359 beschreibt Proteine und funktionell äquivalente pharmakologische Wirkgruppen und Verfahren zum Erzeugen und/oder Nachweisen von Inhibitoren der Prion Bildung.
Somit liegt die technische Aufgabe, die der Erfindung zugrunde liegt, darin, Verbindungen bereitzustellen, die sowohl die Bluthirnschranke durchdringen können als auch befähigt sind, mit hoher Affinität an PrP zu binden, und die deshalb als wirksame Inhibitoren der PrP^SC Bildung im Gehirn verwendet werden können. Zusätzlich liegt eine weitere zu lösendes Aufgabe darin, Verbindungen mit den verringerten toxischen Nebenwirkungen bereitzustellen. Dies schließt insbesondere die Verringerung der allergischen Antwort auf Verabreichen an einen Patienten oder ein Tier ein. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Verbindungen, die gegen enzymatische Inaktivierung resistenter sind, bereitzustellen.
Die obige technische Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Die Erfindung betrifft besonders eine proteinartige Verbindung, bestehend aus der Formel B – [G₃ – B]_x, wobei jedes B unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR.: 1 bis 24 ausgewählt ist, G₃ drei Glycin Reste darstellt und x eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, wobei die Verbindung befähigt ist an PrP zu binden.
Der Ausdruck "proteinartige Verbindung" bezeichnet eine Verbindung, die wenigstens einen ersten Strukturteil, der ein Polymer oder ein Oligomer aus L-Aminosäuren und/oder D-Aminosäuren ist, die durch Peptid Bindungen überbrückt werden, und einen oder mehrere wahlweise zweite Teile umfasst, die nicht eine oder mehrere Aminosäuren, wie Oligomere oder Polymere von Aminosäuren, umfassen und die mit dem (den) ersten Teil(en) durch kovalente oder nicht kovalente Bindungen verbunden sind. Die Aminosäuren, die den ersten Teil bilden, schließen die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren, modifizierte Aminosäuren oder natürlich vorkommende, aber seltene Aminosäuren ein. Die Aminosäuren können z.B. durch Glykosylierung modifiziert werden. Die Modifikationen sind gewöhnlich an den Termini des ersten Teils der proteinartigen Verbindung lokalisiert. Die bevorzugten Modifikationen sind eine Amid Gruppe am C-Terminus und/oder ein Formyl oder ein Pyroglutamyl Rest am N-Terminus. Die derart modifizierten proteinartigen Verbindungen können gegen proteolytische Angriffe von Carboxypeptidasen bzw. Aminopeptidasen stabiler sein.
Der Ausdruck "befähigt sein, an PrP zu binden" bedeutet, dass Binden der entsprechenden Verbindung im folgenden Test messbar ist. Bovines Serum Albumin (BSA), Maltose bindendes Protein (MBP) und ein Fusionsprotein aus MBP und humanem PrP sind auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Die zu testende Verbindung wird als PrP bindend bezeichnet, wenn das Binden an das Fusionsprotein das Binden sowohl an BSA als auch MBP signifikant übersteigt. Unspezifisches Binden wird durch Blockieren mit 5 mg/ml BSA, 0,02% NaN₃, 0,1 M NaHCO₃, pH 8,6 und durch dreimaliges Waschen mit TBS/0,5% v/v Tween-20 (TBS: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) unterdrückt. Wenn die Verbindung ein Peptid ist, dann wird der Test mit 5·10¹¹ Phagen, die das Peptid durch Display entwickeln, statt mit dem Peptid selbst durchgeführt. Der Ausdruck "befähigt sein, an PrP zu binden" bedeutet, dass die Dissoziationskonstante für das Binden an PrP (für gewöhnlich) weniger als 1 μM, vorzugsweise weniger als 300 mM, weiter vorzugsweise weniger als 100 nM beträgt.
Die Ausdrücke "biologisch aktive Derivate" und "funktionell aktive Derivate oder Teile davon" umfassen irgendein Derivat eines Peptids, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR.: 1 bis 24, das auch befähigt ist an PrP zu binden und dadurch PrP gegen die Konformationsänderung in PrP^SC stabilisiert und die begleitende Amyloid Plaque Bildung stört.
Die ersten drei Sequenzen SEQ ID NR.: 19 bis 24 sind allgemeine PrP bindende Sequenzmotive, die 5 bis 6 Aminosäuren umfassen, welche an proteinartige Verbindungen die Fähigkeit des Bindens an PrP vermitteln und deshalb den PrP/PrP^SC Übergang und die begleitende Amyloid Plaque Bildung verhindern.
Die Sequenzen SEQ ID NR.: 1 und 12 sind eine bevorzugte Auswahl für Sequenz SEQ ID NR.: 19, die sie umfassen, die Sequenzen SEQ ID NR.: 2 und 4 sind eine besonders bevorzugte Auswahl für Sequenz SEQ ID NR.: 20 und ähnlich die Sequenzen SEQ ID NR.: 9 und 15 für Sequenz SEQ ID NR.: 21. Die Sequenzen SEQ ID NR.: 22 bis 24 umfassen die Sequenzen gemäß der SEQ ID NR.: 10 und 11.
X bezeichnet eine Wasserstoff bindende Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus C, W, N, Q, S, T, Y, K, R, H, D, E.
Z ist eine aromatische Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus F, W und Y.
Die Sequenzen SEQ ID NR.: 1 bis 24 zeigen eine besonders schlechte Immunogenität.
Proteinartige Verbindungen, die diese Sequenzen umfassen, binden sehr stark an PrP, dadurch stabilisieren sie PrP gegen die Konformationsänderung in PrP^SC und stören die begleitende Amyloid Plaque Bildung und verhindern, stoppen oder kehren die Entwicklung neurodegenerativer Störungen um, insbesondere die Entwicklung von TSE-Krankheiten.
Zusätzlich können die spezifizierten proteinartigen Verbindungen die Bluthirnschranke leicht durchqueren. Dies ist eine Voraussetzung für die Verwendung der Peptide als therapeutische Mittel, da die zu verhindernde Amyloid Bildung im zentralen Nervensystem stattfindet.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft proteinartige Verbindungen, wobei wenigstens einer der Aminosäure Reste ein D-Aminosäure Rest ist. Die Aufnahme von D-Aminosäuren führt zu einer verbesserten Resistenz gegen proteolytische Spaltung ohne die Affinität des Bindens an das PrP Protein zu beeinflussen. Der D-Aminosäure Rest kann an jeder Position der proteinartigen Verbindung angeordnet sein. Eine besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform sind proteinartige Verbindungen, die 3 D-Aminosäure Reste umfassen, weiter bevorzugt 5 D-Aminosäure Reste, am meisten bevorzugt 7 D-Aminosäure Reste.
Die proteinartige Verbindung, wie oben definiert, bestehend aus der Formel B – [G₃ – B]_x, wobei jedes B unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR.: 1 bis 24 ausgewählt ist, G₃ drei Glycin Reste darstellt (die ein G₃ Gelenk bilden) und x eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, B kann unabhängig ausgewählt werden, weist die folgende Struktur auf, wenn z.B. x = 20: B0 – [G3 – B1] – [G3 – B2] – [G3 – B3] – [G3 – B4] – [...] – [G3 – B20],wobei alle B⁰, B¹, B², ... bis B²⁰ dieselbe oder eine unterschiedliche Bedeutung aufweisen können. Es wurde festgestellt, dass diese proteinartigen Verbindungen die Bluthirnschranke in einem ausreichenden Ausmaß durchdringen können. Die Verfügbarkeit der Arzneimittel kann weiter verstärkt werden durch Verwenden fester kolloidaler Partikel, genannt Nanopartikel (NP) und Mikropartikel (MP), die einen Durchmesser von 30 bis 500 nm (NP) oder größer als 0,5 μm (MP) aufweisen, als Mittel, welches das Durchdringen verstärkt. NP und MP werden aus Polylactidpolyglykolidsäure (engl.: polylactide polyglycolide acid (PGLA)), Polyalkylcyanoacrylat (PACA) oder Chitosan präpariert und halten gastrischen und intestinalen Flüssigkeiten stand. Grenzflächenaktive Mittel, Eisentransferrin oder biologische Toxine, die die Bluthirnschranke durchqueren, können zusätzlich verwendet werden, um den Transport von Arzneimittel beladenen NP an das Gehirn zu fördern. Als ein Beispiel siehe Schroeder et al. Life Sci. 66, 495-502 (2000).
Die Resistenz der proteinartigen Verbindungen gegenüber proteolytischer Spaltung wird sogar in der Abwesenheit irgendwelcher Modifikationen oder irgendwelcher modifizierter Aminosäure Reste oder D-Aminosäure Reste weiter verbessert.
Andererseits wird die Affinität der proteinartigen Verbindung für PrP und die inhibitorische Wirkung auf die Bildung von PrP^SC und die begleitende Amyloid Plaque Bildung aufgrund der Flexibilität der B – [G₃ – B]_x Gruppe erhalten oder sogar verbessert.
Vorzugsweise haben sämtliche B⁰, B¹, B², ... bis B²⁰ dieselbe Bedeutung. Aufgrund der Tatsache, dass in diesem Fall die Sequenz des ersten Strukturteils der proteinartigen Verbindung hoch redundant ist, kann die Immunogenität der proteinartigen Verbindung weiter verringert werden.
Die erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindungen können wie die im Stand der Technik bekannten Peptide modifiziert werden, z.B. an den Termini durch eine Amid und/oder Formyl oder Pyroglutamyl Gruppe (vide supra).
Erfindungsgemäß kann die proteinartige Verbindung eine peptidomimetische Verbindung als ein biologisch aktives Derivat eines Peptids sein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR.: 1 bis 24, das außerdem befähigt ist, an PrP zu binden und dadurch PrP gegen die Konformationsänderung in PrP^SC stabilisiert und die begleitende Amyloid Plaque Bildung stört. Peptidomimetische Verbindungen werden als Strukturen definiert, die als geeignete Substituenten für Peptide in Interaktionen mit anderen Makromolekülen dienen. Die Entdeckung von peptidomimetischen Verbindungen ist durch Screenen von reinen Verbindungsbibliotheken möglich. Alternativ wird computergestützte Modellerstellung verwendet, um Analoga des Originalmoleküls zu entwerfen. Dieser Ansatz wird eine Anzahl von Peptid Substituenten mit verbesserter Biostabilität und derselben oder verbesserten biologischen Funktion ergeben.
Die erfindungsgemäße proteinartige Verbindung kann durch Exprimieren einer Nukleinsäure hergestellt werden, die eine Nukleotidsequenz umfasst, welche die primäre Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines funktionell aktiven Derivates oder Teils davon kodiert. Funktionell aktive Derivate oder Teile der proteinartigen Verbindung sind Derivate und Teile der erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindungen, die befähigt sind, an PrP zu binden. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure wie oben definiert. Es wird verstanden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen auch durch chemische Synthese hergestellt werden können.
Die erfindungsgemäße proteinartige Verbindung kann ferner zum Behandeln eines Säugers verwendet werden, wenn pharmazeutische prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer neurodegenerativen Störung, insbesondere einer TSE-Krankheit, benötigt wird. Dies beinhaltet die Verwendung einer erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindung für die Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer neurodegenerativen Störung, insbesondere einer TSE-Krankheit. Allgemeiner ausgedrückt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren des Unterdrückens oder Umkehrens der Umwandlung von PrP in PrP^SC durch in Kontakt bringen von entweder PrP oder PrP^SC mit einer erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindung.
Als eine Verwendung der erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindung zum Verhindern oder Behandeln einer neurodegenerativen Störung oder einer mit Amyloid oder amyloidartigen Ablagerungen assoziierten Störung wird die erfindungsgemäße proteinartige Verbindung in einer wirksamen Menge einem Probanden, der einen Bedarf daran aufweist, verabreicht, wobei der Proband ein Mensch oder ein Tier, insbesondere ein Säuger, sein kann. Gleichermaßen schließt ein Verfahren zum Nachweisen solcher Störungen oder Störungen auch das Verabreichen einer ausreichenden Menge der proteinartigen Verbindung als eine Sonde ein, um ihr Binden an Fibrillen Ablagerungen durch gut bekannte bildgebende Techniken zu visualisieren. Da die erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindungen die Bluthirnschranke leicht durchdringen, kann das diagnostische Verfahren nicht nur in vitro (z.B. durch Inkubieren von Schnitten des zentralen Nervensystems mit der markierten Verbindung als eine Sonde und mikroskopische Untersuchung des Ergebnisses), sondern auch in vivo (z.B. durch orale Verabreichung der markierten proteinartigen Verbindung und das bildgebende Darstellen der Verteilung der Verbindungen im zentralen Nervensystem) durchgeführt werden.
Wie hier verwendet schließt der Ausdruck "prophylaktische Behandlung" eines Zustands, wie einer TSE-Krankheit oder anderer Amyloidose Störungen, bei einem Probanden Verabreichen eines erfindungsgemäßen Peptids, Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen peptidiomimetischen Verbindung vor dem klinischen Ausbruch der Störung ein. "Therapeutische Behandlung" schließt die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Peptids, Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen peptidomimetischen Verbindung nach dem klinischen Ausbruch der Störung ein. Zum Beispiel umfasst erfolgreiche Verabreichung des erfindungsgemäßen Peptids nach Entwicklung einer Störung oder Störung die "therapeutische Behandlung" der Störung. Die Erfindung ist verwendbar in der Behandlung von Menschen wie auch für veterinärmedizinische Verwendungen in Tieren.
Die erfindungsgemäße proteinartige Verbindung kann durch irgendwelche Mittel, die ihren vorgesehenen Zweck erreichen, verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung über eine Anzahl verschiedener parenteraler Wege erfolgen, die subkutane, intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intrazerebrale, intranasale, orale, transdermale oder bukkale Wege einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die parenterale Verabreichung kann durch Bolus Injektion oder durch schrittweise Perfusion über die Zeit erfolgen.
Eine typische Behandlungsvorschrift zum Verhindern, Unterdrücken oder Behandeln eines Zustands, der mit Amyloid oder amyloidartigen Ablagerungen assoziiert ist, umfasst entweder (1) Verabreichung einer wirksamen Menge in einer oder zwei Dosen einer hohen Konzentration der erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindungen im Bereich von 0,5 bis 10 mg der entsprechenden Verbindung pro kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,5 bis 5 mg, oder (2) Verabreichung einer wirksamen Menge der entsprechenden Verbindung, verabreicht in mehreren Dosen niedrigerer Konzentrationen im Bereich von 10–1000 μg pro kg Körpergewicht, vorzugsweise 50–500 μg über einen Zeitraum bis zu und einschließlich mehrerer Monaten bis mehrerer Jahre.
Es wird verstanden, dass die verabreichte Dosierung vom Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, Art der gleichzeitigen Behandlung, wenn überhaupt, Frequenz der Behandlung und der Art der erwünschten Wirkung abhängig sein wird. Die Gesamtdosis, die für jede Behandlung benötigt wird, kann durch mehrere Dosen oder in einer einzigen Dosis verabreicht werden. Mit "wirksame Menge" ist eine Konzentration einer erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindung gemeint, die befähigt ist, die Bildung von Amyloid oder amyloidartigen Ablagerungen zu verlangsamen oder zu hemmen oder vorgebildete Fibrillen Ablagerungen aufzulösen. Solche Konzentrationen können routinemäßig vom Fachmann bestimmt werden. Es wird vom Fachmann außerdem erkannt werden, dass die Dosierung von der Stabilität der verabreichten proteinartigen Verbindung abhängen kann. Eine weniger stabile proteinartige Verbindung kann die Verabreichung in mehreren Dosen benötigen.
Präparate zur parenteralen Verabreichung schließen sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, die Hilfsmittel oder Trägerstoffe enthalten können, die im Stand der Technik bekannt sind, ein. Pharmazeutische Zusammensetzungen, wie Tabletten und Kapseln, können auch gemäß Routineverfahren zubereitet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Peptide umfassen, schließen sämtliche Zusammensetzungen ein, wobei die erfindungsgemäßen proteinartigen Verbindungen in einer wirksamen Menge enthalten sind, um ihren beabsichtigten Zweck zu erreichen. Zusätzlich können die pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, die Trägerstoffe und Hilfsmittel umfassen, die das Verarbeiten der aktiven Verbindungen in Präparate fördern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Vehikel sind im Stand der Technik gut bekannt und werden zum Beispiel in Gennaro, Alfonso, Hrsg., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage 1990, Mack Publishing Co., Esston Pa., beschrieben, einem Standardwerk auf diesem Gebiet. Pharmazeutisch verträgliche Vehikel können entsprechend der Verabreichungsform und der Löslichkeit und Stabilität der Peptide routinemäßig ausgewählt werden. Zum Beispiel können Rezepturen zur intravenösen Verabreichung sterile wässrige Lösungen einschließen, die außerdem Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusätze enthalten.
Geeignete Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form, zum Beispiel wasserlösliche Salze, ein. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindung, wie geeignete ölige Injektionssuspensionen, verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen fettige Öle, zum Beispiel Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, zum Beispiel Ethyloleate oder Triglyceride, ein. Wässrige Injektionssupensionen, die Substanzen, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, enthalten können, schließen zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol und/oder Dextran ein. Wahlweise kann die Suspension auch Stabilisatoren enthalten.
Neurodegenerative Störungen oder Störungen, die mit abnormer Proteinfaltung in Amyloid oder amyloidartige Ablagerungen assoziiert sind, die durch Verabreichen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung behandelt oder verhindert werden sollen, schließen Alzheimer Krankheit, FAF, Down Syndrom, andere Amyloidose Störungen wie TSE-Krankheiten, Prion assoziierte humane neurodegenerative Störungen, wie Kuru, Creuzfeldt-Jakob Störung (engl.: Creutzfeld-Jacob Disorder (CJD)), Gerstmann Straussler Scheinker Syndrom (GSS) sowie tierische Prion Störungen, wie Scrapie, spongiforme Enzephalopathie, übertragbare Nerz Enzephalopathie und chronische Tuberkulose von Maultierhirsch und Rothirsch ein.
Neben prophylaktischen und therapeutischen Behandlungen können die entsprechenden erfindungsgemäßen Verbindungen auch verabreicht werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Amyloid oder amyloidartigen Ablagerungen in vivo nachzuweisen und zu diagnostizieren. Ein gestaltetes Peptid, das befähigt ist, an Strukturdeterminanten in einem entsprechenden Amyloid oder einer amyloidartigen Ablagerung zu binden, das nicht radioaktiv oder mit einem Radioisotop markiert ist, wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, kann einem Probanden zum Diagnostizieren des Ausbruchs oder der Anwesenheit einer Störung oder einer Störung, die mit abnormer Proteinfaltung in Amyloid oder amyloidartige Fibrillen Ablagerungen assoziiert ist, verabreicht werden. Das Binden eines solchen markierten Peptids nach Verabreichung an Amyloid oder amyloidartige Ablagerungen kann durch in vivo bildgebende Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, nachgewiesen werden.
Die Figuren zeigen:
1 und 2 zeigen die Ergebnisse eines Bindungstests von durch Phagen Display entwickelten erfindungsgemäßen Peptiden und PrP, das mit Maltose bindendem Protein (MBP) fusioniert ist;
Ordinate: OD_405nm
Abszisse:
Die Legende lautet folgendermaßen:

erster Balken eines Balkentriplets: Fusionsprotein von Maltose bindendem Protein und PrP
zweiter Balken eines Balkentriplets: Maltose bindendes Protein
dritter Balken eines Balkentriplets: Bovines Serum Albumin

Die Peptide sind folgendermaßen abgekürzt:

p1	SEQ ID NR.: 1
p2	SEQ ID NR.: 2
p3	SEQ ID NR.: 3
p4	SEQ ID NR.: 4
p5	SEQ ID NR.: 5
p6	SEQ ID NR.: 6
p7	SEQ ID NR.: 7
p8	SEQ ID NR.: 8
p9	SEQ ID NR.: 9
p10	SEQ ID NR.: 10
p11	SEQ ID NR.: 11
p12	SEQ ID NR.: 12
p13	SEQ ID NR.: 13
p14	SEQ ID NR.: 14
p15	SEQ ID NR.: 15
p16	SEQ ID NR.: 16
p17	SEQ ID NR.: 17
p18	SEQ ID NR.: 18

Der Wildtyp Phage, der die normale Phagen Heptapeptid Sequenz am N-Terminus seines kleinen Hüllproteins aufweist, wird als "Kontrolle" abgekürzt.
In 1 und 2 wurden die Peptid tragenden M13 Bakteriophagen Derivate auf ihr Binden an die angegebenen Proteine, die in einzelnen Kammern einer Mikrotiterplatte immobilisiert worden sind, getestet. Die nach ausgiebigem Waschen gebunden gebliebene Menge an Phagen wurde durch einen ELISA Test bestimmt durch Verwenden eines Meerrettich Peroxidase gekoppelten monoklonalen Antikörpers, der das Haupthüllprotein von M13 Phagen erkennt (ABTS als Substrat ergibt ein grünes Produkt, dessen Absorption bei 405 Nanometern ausgelesen wird). Die Experimente wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Mit der nun allgemein beschriebenen Erfindung, wird sie leichter verstanden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Darstellung bereitgestellt werden und die nicht beabsichtigen, die vorliegende Erfindung einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Isolierung von PrP bindenden Sequenzen durch Verwenden von Phagen Display:
Die PhD7 Bibliothek wurde von New England Biolabs (Kalifornien, USA) bezogen. Diese Bibliothek weist eine Diversität von ~2,8 × 10⁹ zufallsbedingten Heptapeptiden, fusioniert an den N-Terminus des kleinen Hüllproteins pIII des filamentösen Bakteriophagen M13 auf. Für das Phagen Display Experiment wurden zwei Polystyrol Petrischalen 94 × 16 mm (Greiner, Deutschland) beschichtet, die erste mit 3,5 ml MBP-6xHis 100 μg/ml in 0,1 M NaHCO₃ pH 8,6 (MBP: Maltose bindendes Protein) und die andere mit derselben Menge und Konzentration an rhMBP-PrP-6x-His (rh: rekombinant human). Das Beschichten wurde über Nacht (> 16 h) bei 4°C mit sanftem Schütteln in einem befeuchteten Behälter durchgeführt. Nach dem Beschichten wurden die Petrischalen mit BSA 5 mg/ml (Sigma A-3059) in 0,1 M NaHCO₃ pH 8,6 für 1 h bei 4°C blockiert und sechs Mal mit TEST (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% v/v Tween-20) gewaschen. 2 × 10¹¹ pfu (engl.: Plaque forming units (Plaque bildende Einheiten)) der PhD7 Bibliothek, verdünnt in 2 ml TEST, wurden zu der Petrischale, die mit MBP-6xHis beschichtet wurde, zugegeben. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln wurde der Überstand, der die ungebundenen Phagen enthielt, vorsichtig in die rhMBP-PrP-6xHis beschichtete Petrischale pipettiert und für 1 h bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubiert. Freies MBP-6xHis wurde zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben, um die restlichen Phagen mit Affinität für MBP-6xHis zu blockieren. Die Petrischale wurde dann zehn Mal mit TEST gewaschen, und die gebundenen Phagen Klone wurden mit 2 ml 0,2 M Glycin pH 2,2, 1 mg/ml BSA für 10 min eluiert und mit 300 μl 1 M Tris-HCl pH 9,1 neutralisiert. Eluierte Phagen wurden im F⁺ E. coli ER2537 Stamm vermehrt und gemäß der vom Hersteller empfohlenen Anleitungen titriert. 2 × 10¹¹ pfu der amplifizierten Phagen wurden für die zweite der fünf durchgeführten Panning Runden verwendet. Die folgenden Panning Runden wurden auf dieselbe Weise durchgeführt mit den folgenden Ausnahmen (1) die Inkubationszeit der Phagen in der rhMBP-PrP-6xHis beschichteten Petrischale wurde auf 30 min verringert (2) die Konzentration von Tween-20 in dem TBS wurde auf 0,5% v/v erhöht.
Das zweite Phagen Display Experiment wurde mit den folgenden Änderungen durchgeführt: (1) 60 × 15 mm Polystryrol Petrischalen (Greiner, Deutschland) wurden verwendet; die Volumina der verwendeten Lösungen wurden entsprechend angeglichen (2) die Konzentration von BSA in der Blockierungslösung wurde auf 10 mg/ml erhöht (3) eine Zweischritt Eluierung wurde durchgeführt; die Phagen wurden zuerst spezifisch mit 1 ml rhMBP-PrP-6xHis 100 μg/ml für 1 h bei Raumtemperatur eluiert, dann unspezifisch wie oben beschrieben (4) 3 Panning Runden wurden durchgeführt. DNA der Phagenklone der 3., 4. und 5. Runde des ersten Panning Experiments und der 2. und 3. Runde des zweiten Phagen Display Experiments wurden gemäß der vom Hersteller empfohlenen Anleitungen isoliert und durch MWG-Biotech (Deutschland) sequenziert.
Beispiel 2: Charakterisierung ausgewählter Phagen-präsentierter Peptide für PrP Binden durch ELISA
Mikrotiterplatten mit 96 Kammern und flachem Boden (Greiner) wurden für ELISA (engl.: Enzyme-linked immunosorbent assay (Enzym vermittelter Immuntest)) durch Vorbeschichten mit entweder 100 μg/ml rhMBP-PrP-6xHis oder 100 μg/ml MBP-6xHis, beides in 0,1 M NaHCO₃ pH 8,6, über Nacht bei 4°C in einer befeuchteten Kammer mit sanftem Kippschwenken vorbereitet. Im Anschluss an dreimaliges Waschen mit TBS/0,5% Tween-20 wurden die Kammern in den Platten anschließend für 2 h mit dem Blockierungspuffer, der 5 mg/ml BSA (Sigma A-3059), 0,02% NaN₃ in 0,1 M NaHCO₃ pH 8,6 enthält, blockiert. Nach sechsmaligem Waschen mit TBS/0,5% Tween-20 wurden die Platten mit 10¹² pfu aus jedem der isolierten Phagen Klone, die aus den vorherigen Runden des Phagendisplays erhalten wurden, inkubiert. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur wurden die ungebundenen Phagen anschließend durch sechsmaliges Waschen mit TBS/0,5% Tween-20 entfernt. Dann wurden die Platten mit Meerrettich Peroxidase konjugiertem anti-M13 monoklonalem Antikörper (Pharmacia # 27-9411-01) 1:5000 in Blockierungspuffer inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur wurden die Platten sechs Mal mit TBS/0,5% Tween-20 gewaschen, und der gebundene Phagen Antikörper Komplex wurden durch Zugabe von ABTS (Sigma A-1888) Lösung [0,05 M Natriumcitrat pH 4,0, 0,22 mg/ml 2',2'-Azino-bis-(3'ethylbenzthiazlin-6-sulfonsäure) und 0,05% H₂O₂] nachgewiesen und bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Die Absorption wurde dann bei 405 nm durch ELx800, ein automatisiertes Mikroplattenlesegerät (BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.), quantifiziert. Die Ergebnisse solcher Tests sind in 1 gezeigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Proteinartige Verbindung, bestehend aus der Formel B – [G₃ – B]_x, wobei jedes B unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR.: 1 bis 24 ausgewählt ist, G₃ drei Glycinreste darstellt und x eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, wobei die Verbindung befähigt ist, an PrP zu binden.
Verbindung nach Anspruch 1, umfassend mindestens einen D-Aminosäurerest.
Nukleinsäure, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, welche die primäre Aminosäuresequenz einer Verbindung nach Anspruch 1 kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 definiert und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in der Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer neurodegenerativen Störung.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die neurodegenerative Störung eine TSE-Krankheit ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 als Sonde für die ex vivo Diagnose einer neurodegenerativen Störung.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die neurodegenerative Störung eine TSE-Krankheit ist.