DE69919869T2

DE69919869T2 - Stimulierung des immunsystems

Info

Publication number: DE69919869T2
Application number: DE69919869T
Authority: DE
Inventors: Karl-Hermann Schlingensiepen; Reimar Schlingensiepen; Wolfgang Brysch
Original assignee: Biognostik Gesellschaft fuer Biomolekulare Diagnostik mbH
Current assignee: Biognostik Gesellschaft fuer Biomolekulare Diagnostik mbH
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: AU5154999A; DE69919869D1; US20080124301A1; WO1999063975A3; CA2334960C; JP4627369B2; ATE274923T1; CA2334960A1; EP1089764A2; JP2002517434A; US8629117B2; ES2226414T3; WO1999063975A2; EP1089764B1

Description

Im Stand der Technik sind zwei verschiedene Wege zur Verstärkung der Immunantwort gegen neoplastische Zellen eingeschlagen worden. Ein Weg nutzt die Zugabe von Cytokinen wie Interleukin-2 (IL-2) oder die Transfektion von Tumorzellen und/oder Immunzellen mit Genen, die für Cytokine wie IL-2 oder andere die Immunantwort verstärkende Proteine codierend sind, wie die Transfektion von Tumorzellen mit Lymphotactin oder die ähnliche Transfektion von T-Lymphocyten mit dem Ligand CD-40.
Der zweite Weg nutzt die Hemmung von immunsuppressiven Molekülen zur Verstärkung der Immunantwort des Körpers auf Tumorzellen. Somit wird in J. NEUROSURG. 78 (1993) 944-51, Jachimaczak et al. (1993) und WO 94/25588, Schlingensiepen et al. (1994) die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden gelehrt, die auf TGF-β abzielen, um eine tumorinduzierte Immunsuppression zu reversieren.
Mehrere Dokumente des Standes der Technik lehren, dass eine Kombination dieser beiden Wege entweder nicht effektiv oder gegenüber der Verwendung eines der beiden, allein angewandten Weges nicht vorteilhaft ist.
Somit wird in CANCER BIOTHER. 8(2), 1993, 159 – 170, Gridley et al., sowie CANCER BIOTHER. 9(4), 1994, 317 – 327, Mao et al., jeweils gelehrt, dass eine Kombination aus einem antitransformierenden Wachstumsfaktor-β-Antikörper mit IL-2 keine signifikanten Antitumorwirkungen verursacht.
Weiterhin wird in PROC. NATL. ACAD. SCI 93, (1996), 2909-2414, Fakhrai et al. gelehrt, dass eine Kombination aus einer Transfektion mit Antisense-Sequenzen kodierenden Genen zur Transformation des Wachstumsfaktors β (TGF-β) TGF-β mRNA mit der Transfektion von IL-2 in Tumorzellen die Immunantwort gegen den Tumor im Vergleich zur Transfektion mit TGF-β-Antisense allein nicht verstärkt.
Im Gegensatz dazu sind überraschenderweise bestimmte Kombinationen von Stimulatoren und Inhibitoren wirksamer als einer der Wege allein.
WO-A-96/02143 offenbart ein Verfahren zur Behandlung von Krebs unter Verwendung von Krebszellen, die dahingehend genetisch modifiziert sind, dass sie die Expression eines Immunosuppressivums, z.B. TGF-β, hemmen und ein immunstimulatorisches Mittel exprimieren.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Medikament, umfassend eine Kombination aus

– wenigstens einem Inhibitor der Wirkung einer eine Immunantwort negativ beeinflussenden Substanz, wobei die Substanz aus der aus TGF-β und dessen Rezeptoren, VEGF und dessen Rezeptoren, Interleukin 10 (IL-10) und dessen Rezeptoren, PGE₂ und dessen Rezeptoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei der Inhibitor eine Molmasse von weniger als 100 kDa hat,
– wobei der Inhibitor ein Oligonucleotid ist und
– wenigstens ein eine Immunantwort positiv beeinflussender Stimulator.

In einer bevorzugten Ausführungsform hemmt der Inhibitor die Synthese oder Funktion von Molekülen, die die Immunantwort unterdrücken oder hinunterregulieren oder negativ beeinflussen. Das Oligonucleotid kann als Antisense-Nucleotid oder als Ribozym dienen.
Vorzugsweise beeinflusst der Stimulator die Immunantwort positiv, indem er die Präsentation von Antigenen erhöht und/oder die Proliferation und/oder Funktion von Immunzellen verbessert.
In einer bevorzugten Ausführungsform verbessert der Stimulator die Synthese oder Funktion von Molekülen, die die Immunantwort stimulieren, verbessern, hinaufregulieren und/oder positiv regulieren. Insbesondere stimuliert und/oder verbessert der Stimulator die Synthese und/oder Funktion von Faktoren wie GM-CSF, SCF, CSF, IFN-γ, den FLT-3-Liganden sowie monocytenchemotaktischen Proteinen (MCP-1), Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-12 und/oder Interleukin-18 oder ist eines der genannten Interleukine oder ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Viren, viralen Antigenen, in Tumorzellen oder Pathogenen, aber nicht in normalen Zellen exprimierten Antigenen, organspezifischen Antigenen, die in betroffenen Organen, die für den Organismus nicht wesentlich sind, z.B. Prostata-, Eierstock-, Brust-, melaminerzeugenden Zellen exprimiert werden, besteht.
Die Stimulatoren sind vorzugsweise ausgewählt aus

a) Chemokinen einschließlich Lymphotactin und/oder Immunzellen anziehenden Substanzen und/oder
b) Viren und/oder Teilen von Viren einschließlich Retroviren, Adenoviren, Papillomaviren, Epstein-Barr-Viren, nichtpathogenen Viren einschließlich dem Virus der nichtklassischen Geflügelpest (Newcastle-Disease-Virus), dem Kuhpockenvirus und/oder
c) autologen und/oder heterologen MHC-Molekülen und/oder
d) Molekülen, die an der Antigenprozessierung beteiligt sind, und/oder
e) Molekülen, die an der Antigenpräsentation beteiligt sind, und/oder
f) Molekülen, die an der Vermittlung von Immunzellen-Wirkungen beteiligt sind, und/oder
g) Molekülen, die an der Vermittlung von cytotoxischen Wirkungen von Immunzellen beteiligt sind, und/oder
h) Molekülen, die am Antigen-Transport beteiligt sind, und/oder
i) costimulierenden Molekülen,
j) Peptiden, die die Erkennung durch Immunzellen und/oder cytotoxische Wirkungen von Immunzellen verbessern,
k) denjenigen Peptiden, die eine oder mehrere Aminosäuren enthalten, die zwischen einem Protein in der Zielzelle und den anderen Zellen innerhalb eines Organismus unterscheiden,
l) den Peptiden nach j), wobei es sich um Folgendes handelt:
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen des Ras-Protein-Aminos enthalten, und/oder
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen des Proteins p53 enthalten, und/oder
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen des EGF-Rezeptor-Proteins enthalten, und/oder
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen von Fusionspeptiden und/oder Fusionsproteinen enthalten, und/oder
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen und/oder durch Gen-Umordnungen und/oder Gen-Translokationen verursachte Aminosäuresubstitutionen enthalten und/oder
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen des Retinoblastom-Proteins enthalten, und/oder
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen von Proteinen enthalten, die von Onkogenen und/oder Proto-Onkogenen kodiert werden, und/oder
– Peptide, die eine oder mehrere Mutationen und/oder Aminosäuresubstitutionen von Proteinen enthalten, die von Anti-Onkogenen und/oder Tumorsuppressionsgenen codiert werden, und/oder
– Peptide, die von Proteinen stammen, die sich in der Zielzelle um eine oder mehr als eine Aminosäure von den Proteinen unterscheiden, die von anderen Zellen im selben Organismus exprimiert werden, und/oder
– Peptide, die von viralen Antigenen stammen und/oder von viralen Nucleinsäuren codiert werden und/oder
– Peptide, die von Proteinen stammen, die in einem erkrankten Organ, aber nicht im Nervensystem, dem Muskel, dem Blutbildungssystem oder anderen für das Überleben wesentlichen Organen exprimiert werden. Erkrankte Organe sind z.B. die Prostata, der Eierstock, die Brust, melaminerzeugende Zellen und dergleichen.
m) Tumorzellenextrakten und/oder Tumorzellenlysaten und/oder Zusatzstoffen,
n) Fusionszellen von dendritischen und Tumorzellen.

Bei diesen Fusionszellen handelt es sich um Hybridomzellen, die aus einer Mischung von dendritischen Zellen und Tumorzellen stammen. Dendritische Zellen werden beispielsweise durch eine Behandlung von PBMC mit GM-CSF und IL-4 oder einer Mischung aus GM-CSF, IL-4 und IFN-γ oder dem FLT-3-Liganden erzeugt. Eine Verschmelzung von dendritischen Zellen mit Tumorzellen kann z.B. unter Verwendung von PEG (Polyethylenglycol) oder eine Elektrofusion bewirkt werden.
Überraschenderweise verbesserte eine Behandlung von PBMC mit VEGF-Oligonucleotiden die Anzahl und/oder Wirksamkeit von dendritischen Zellen.
Beim Inhibitor handelt es sich um ein Oligonucleotid. Vorzugsweise sind die Oligonucleotide von 1 im Medikament der vorliegenden Erfindung brauchbar.
In einer weiteren Ausführungsform macht die Erfindung Oligonucleotide mit einer der in den 1–2 bis 1–4 angegebenen Sequenzen verfügbar.
Auch Oligonucleotide mit 1 bis 10 zusätzlichen Nucleotiden am 5'- oder 3'-Ende sind Teil der Erfindung.
Für eine Transfektion verwendete Oligonucleotid-Sequenzen sind gewöhnlich viel längere Sequenzen als diejenigen, die für Antisense-Oligonucleotide verwendet werden, deren Länge gewöhnlich nicht 30 Basen übersteigt und die als kurze einsträngige Sequenzen angewandt werden und nicht in ein Vektorsystem integriert sind.
Weil transfizierte Sequenzen gewöhnlich viel länger als Oligonucleotide sind, wäre, wenn bei der Antisense-Technik eine Kreuzhemmung von verschiedenen Elementen einer Proteinfamilie aufträte, eine solche Kreuzhemmung anderer mRNA als der Ziel-mRNA mit transfizierten Antisense-Sequenzen im Vergleich zu Oligonucleotiden viel wahrscheinlicher. In Cell Growth Differ, Band 6(12), Februar 1995, S. 1635 – 1642, F. Huang et al., wird jedoch gelehrt, dass "nur der Transfektant K6 39 bzw. 33% der Konzentrationen der TGF-beta1-mRNA und des aktiven sezernierten TGF-beta1-Proteins der parentalen Linie aufwies. K6 wies keine Änderung der Expression von TGF beta2 auf, und die Expression von TGF beta3 wurde weder in der parentalen noch in der Transfektions-Zelllinie nachgewiesen." Daher war es überraschend, gemäß dieser Erfindung Oligonucleotide zu finden, die dazu fähig waren, die Expression sowohl von TGF-β₁ als auch TGF-β₂, z.B. TGF-β1-14, TGF-β1-15, TGF-β-17-c-2260, TGF-β-123-2262, TGF-β-23-2268, TGF-β2-4, TGF-β2-14, TGF-β2-15, TGF-β2-9, TGF-β2-14/1, TGF-β2-14/2, TGF-β1-136, signifikant zu vermindern. Weiterhin wurden überraschenderweise Oligonucleotide konstruiert, die dazu fähig waren, die Expression sowohl von TGF-β₂ als auch von TGF-β₃ signifikant zu reduzieren.
Überraschenderweise wurden sogar Oligonucleotide gefunden, die dazu fähig waren, die Expression von TGF-β₂ sowie von TGF-β₁ und TGF-β₃, z.B. b1-N17, b1-N14, b1-N24, TGF-β2-9, TGF-β2-14, TGF-β-2-15, TGF-β-17-c-2260, TGF-β-12-9/20-2261, TGF-β-123-2262, TGF-β-12-9/22-2263, TGF-β-23-2268, TGF-β1-98-11, TGF-β1-98-23, TGF-β3-98-7, TGF-β3-98-10, TGF-β-1-rwk-5, TGF-β-3-rwk-2, TGF-β-1-rwk-5, TGF-β-3-rwk-9, TGF-β-3-rwk-23, TGF-β1-3, TGF-β1-10, signifikant zu reduzieren.
Somit sind Oligonucleotide, die gegen die Expression von wenigstens zwei der Wachstumsfaktoren TGF-β₁, TGF-β₂ und/oder TGF-β₃ wirksam sind, auch Teil der Erfindung.
Diese Befunde waren auch mit Hinblick auf die Tatsache überraschend, dass ein Sequenzvergleich zwischen den mRNA von TGF-β₂, TGF-β₁ und TGF-β₃ zeigte, dass keine einzige Sequenz mit einer Länge von 20 Basen gefunden werden konnte, die innerhalb der drei verschiedenen mRNA identisch wäre. Sogar wenn eine solche hypothetische Sequenz wirklich existieren würde, wäre die Hemmung aller drei mRNA durch eine solche hypothetische Consensus-Sequenz extrem unwahrscheinlich, weil im Fachgebiet wohlbe kannt ist, dass nur eine kleine Minderheit von zu einer bestimmten mRNA komplementären Antisense-Sequenzen tatsächlich eine so genannte Antisense-Wirkung ausübt, d.h, die Expression des betreffenden Proteins hemmt.
Die endotheliale Synthese des Monocyten-chemotaktischen Proteins-1 (MCP-1) ist sowohl unter physiologischen als auch entzündlichen Bedingungen mit der Regulierung der Monocyten-Rekrutierung für extravasculäre Pools in Zusammenhang gebracht worden.
MCP-1-Antisense-Oligonucleotide konnten die Monocyten-Infiltration modulieren und waren somit entzündungshemmend.
Diese Antisense-Oligonucleotide sind zur Behandlung von Entzündungskrankheiten, z.B. Asthma, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Diabetes, Glomerulonephritis, dem akuten Atemnotsyndrom und der Bildung von arteriosklerotischen Plättchen, brauchbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Oligonucleotide und/oder Ribozyme und/oder Nucleinsäuren an den Basen, den Zuckern und/oder den Phosphatresten der Oligonucleotide Modifikationen auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Oligonucleotide und/oder Ribozyme und/oder Nucleinsäuren Modifikationen auf, wobei die Modifikationen Phosphorthioat- (S-ODN-)Internucleotidbindungen und/oder Methylphosphonat-Internucleotidbindungen und/oder Phosphoramidatbindungen und/oder Peptidbindungen und/oder 2'-O-Derivate wie 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Methoxyethoxy-Modifikationen des Zuckers und/oder Modifikationen der Basen sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Oligonucleotide und/oder Ribozyme und/oder Nucleinsäuren mit Folsäure, Hormonen, Steroidhormonen wie Östrogen, Progesteron, Corticosteroiden, Mineralocorticoiden, Peptiden, Proteoglykanen, Glycolipiden, Phospholipiden, Polyethylenimin oder andere Polykationen und Derivaten davon gekoppelt oder damit vermischt.
Weiterhin macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten, Neoplasmen oder Infektionskrankheiten durch die Verabreichung eines Medikaments der Erfindung an bedürftige Patienten verfügbar. Das Verfahren ist zur Behandlung von Leukämie, des Nicht-Hodgkin-Lymphoms, des Hodgkin-Lymphoms, des Bronchialkarzinoms, des Ösophaguskarzinoms, des Kolorektal-Karzinoms, von Magenkarzinomen, Intestinaltumoren, Lebertumoren, Gallenblasen- und Gallengangkarzinomen, Pankreaskarzinomen, Analkarzinomen, Brustkrebs, Ovarialkarzinomen, Zervixkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Prostatakarzinomen, Harnblasenkarzinomen, malignen Melanomen, Gehirntumoren und/oder Sarkomen besonders geeignet.
Die erforderlichen Dosen des Medikaments der vorliegenden Erfindung hängen von der Krankheit und der Schwere der Krankheit ab. Obwohl höhere Gehalte wirksamer sind, haben sie oft einen höheren Grad an Nebeneffekten. Geeignete Dosen sind so ausgewählt, dass Konzentrationen der Oligonucleotide im Bereich von 0,1 bis 10 μmol/l und Konzentrationen der Cytokine im Patientenblut im Bereich von 10 bis 1000 U/ml erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Inhibitor der Wirkung einer eine Immunantwort negativ beeinflussenden Substanz auf einen Tumor oder eine andere pathologisch betroffene Stelle oder ein anderes pathologisch betroffenes Organ lokal aufgetragen, und der eine Immunantwort positiv beeinflussende Stimulator wird systemisch aufgetragen (z.B. i.v. oder s.c. oder oral).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Inhibitor der Wirkung einer eine Immunantwort negativ beeinflussenden Substanz systemisch (z.B. i.v. oder s.c. oder oral) auf den Tumor aufgetra gen, und der eine Immunantwort positiv beeinflussende Stimulator wird auf einen Tumor oder eine andere pathologisch betroffene Stelle oder ein anderes pathologisch betroffenes Organ lokal aufgetragen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Inhibitor der Wirkung einer eine Immunantwort negativ beeinflussenden Substanz systemisch (z.B. i.v. oder s.c. oder oral) auf den Tumor aufgetragen, und der eine Immunantwort positiv beeinflussende Stimulator wird systemisch (z.B. i.v. oder s.c. oder oral) aufgetragen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Inhibitor der Wirkung einer eine Immunantwort negativ beeinflussenden Substanz auf einen Tumor oder eine andere pathologisch betroffene Stelle oder ein anderes pathologisch betroffenes Organ lokal aufgetragen, und der eine Immunantwort positiv beeinflussende Stimulator wird auf einen Tumor oder eine andere pathologisch betroffene Stelle oder ein anderes pathologisch betroffenes Organ lokal aufgetragen.
1 veranschaulicht in der vorliegenden Erfindung brauchbare Oligonucleotide.
2A veranschaulicht die Wirkungen von Oligonucleotiden (Endkonzentration 5 μM) auf die Sekretion von TGF-β2 in Gliomazellen in 10 % MEM-Dulbecco-Medium (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
2B veranschaulicht die Wirkungen von Oligonucleotiden (Endkonzentration 5 μM) auf die Sekretion von TGF-β1 in PBMC in 10 % FCS RPMI 1640-Medium (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
3A veranschaulicht die Wirkungen von Oligonucleotiden (Endkonzentration 5 μM) auf die Sekretion von TGF-β1 in PBMC in 10 % FCS RPMI 1640-Medium (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
3B veranschaulicht die Wirkungen von Oligonucleotiden (Endkonzentration 5 μM) auf die Sekretion von TGF-β2 in Gliomazellen in 10 % FCS RPMI 1640-Medium (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
4A veranschaulicht die TGF-β1-Konzentration (ELISA) in Gliomazellen (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
4B veranschaulicht die TGF-β2-Konzentration (ELISA) in Gliomazellen (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
5 veranschaulicht die Lyse von Tumorzellen: LAK-Cytotoxizität, Verhältnis Gliomazellen/PBMC: 1:20.
6A veranschaulicht dendritische Zellen, die aus PBMC erzeugt sind (% der Kontrolle). Cytokine: GM-CSF (400 U/ml) + IL-4 (300 U/ml).
6B veranschaulicht die Lyse von Tumorzellen: Wirkungen von 5 μM VEGF-Antisense-Oligonucleotiden auf die LAK-Cytotoxizität. Das Verhältnis Tumorzellen/DC/PBMC betrug 1:5:20.
7A veranschaulicht die Wirkungen von Oligonucleotiden (Endkonzentration 5 μM) auf die Sekretion von TGF-β1 in PMBC in 10 % FCS-RPMI-1640-Medium (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
7B veranschaulicht die Wirkungen von Oligonucleotiden (Endkonzentration 5 μM) auf die Sekretion von TGF-β2 in Tumorzellen in 10 % FCS-RPMI-1640-Medium (3-tägige Inkubation mit Oligonucleotiden).
8 veranschaulicht die Lyse von Tumorzellen: Wirkungen von Oligonucleotiden auf die LAK-Cytotoxizität. Das Verhältnis Tumorzellen/PBMC betrug 1:20.
Beispiele
Herstellung von PBMC- und Tumorzellen
Periphäre einkernige Blutzellen (PBMC) wurden durch eine standardmäßige Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation aus dem venösen Blut gesunder Spender isoliert. Kurzgefasst wurde mit Heparin versetztes Blut mit gleichen Volumina an komplettem Medium (CM:RMPI-1640-Medium, unterstützt durch 10 Vol.-% fötales Kalbserum und 1 mM L-Glutamin) vermischt und schichtweise auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) angeordnet. Nach einer für 30 min bei Raumtemperatur und 400 g erfolgenden Zentrifugation wurden PBMC-Banden an der Plasma-Ficoll-Grenzfläche isoliert, drei Mal gewaschen und in komplettem Medium wieder suspendiert. Die Lebensfähigkeit der Zelle, bestimmt durch Trypanblau-Ausschluss, betrug mehr als 97 %.
Humane Gliomazellen wurden aus Tumorproben von Patienten mit anaplastischem Astrozytom (WHO-Grad III) oder aus einem Glioblastom (WHO-Grad IV) erstellt.
Messung der Zellvermehrung
Für PBMC-Vermehrungsassays (Einarbeitung von 3H-Thymidin und Zellzählung) wurden frisch isolierte PBMC für 72 h in Platten mit 96 Näpfen mit runden Böden (Nunc, Copenhagen, Dänemark) mit einer Endkonzentration von 10⁵ Zellen/Napf (100 μl CM) kultiviert. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen mit einem Hämacytometer gezählt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels Trypanblau-Färbung bestimmt. Behandelte und unbehandelte Zellen wiesen nach einem 72-stündigen Wachstum in vitro (mit oder ohne S-ODN) eine Lebensfähigkeit von 95 – 100 % auf.
Für die Tumorwachstumsexperimente wurden Platten mit 96 Näpfen mit ebenem Boden (Numc, Dänemark) mit 10⁴/100 μl Gliomazellen beimpft, und die Zellen wurden mit Cytokinen und/oder Oligonucleotiden inkubiert. Die DNA-Syntheserate wurde mittels eines standardmäßigen 3H-Thymidin-Einarbeitungsassays gemessen, und die Bestimmung der Zellzahl wurde gemäß der obigen Beschreibung durchgeführt.
Quantifizierung des Proteins TGF-β1 in Kultur-Überständen durch eine enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA)
Das Kulturmedium wurde nach 3 Tagen geerntet, durch Zentrifugation von Zellkomponenten gereinigt, filtriert und bis zur Weiterverarbeitung bei –70°C aufbewahrt. Die Konzentrationen von TGF-β1 und TGF-β2 wurden nach der Ansäuerung der Überstände mittels TGF-β1- und TGF-β2-ELISA (R&D Systems, Minneapolis, USA) gemäß der Empfehlungen des Herstellers zweifach gemessen.
Die 1 – 4 und 7 veranschaulichen die Wirkung der Oligonucleotide auf die Sekretion von TGF-β in Zellen. Die Konzentration von TGF-β ist als optische Dichte angegeben. Je höher die optische Dichte ist, desto höher ist die Konzentration des TGF-β.
Die 1A und 1B veranschaulichen die Wirkung der Oligonucleotide auf die Sekretion von TGF-β. Kontrolloligonucleotide (GAA GGA ATT ACC ACT TTC) haben keine Wirkung, während die in den Figuren aufgeführten Oligonucleotide die Sekretion von TGF-β vermindern. Die Oligonucleotide in 1 sind gegen TGF-β1 wirksamer.
2 veranschaulicht weitere Oligonucleotide und deren Wirkungen auf die Sekretion von TGF-β. TGF-β-14 ist gegen die Sekretion von TGF-β1 und -β2 besonders wirksam.
3 veranschaulicht weitere Oligonucleotide, die gegen die Sekretion von TGF-β1 und -β2 wirksam sind. Diese Oligonucleotide sind gegen TGF-β2 wirksamer, sind aber auch gegen TGF-β1 wirksam.
8 veranschaulicht eine supraadditive Wirkung auf die Cytotoxizität von Tumorzellen durch eine Kombination von 2 μM jeweils eines TGF-β1- und eines TGF-β2-Antisense-Oligonucleotids im Vergleich zu einer einzigen 5-μM-Dosis eines der Oligonucleotide.
CARE-LASS (Calceinfreisetzungsassay) zur Messung der cytotoxischen PBMC-Aktivität
Ein standardmäßiger Calceinfreisetzungsassay (CARE-LA55-Assay) zur Bestimmung der cytotoxischen Aktivität von PBMC wurde gemäß der Beschreibung von R. Lichtenfels, W. E. Biddison, H. Schulz, A. B. Vogt und R. Martin, (ARE-LASS (calcein-release assay), an improved fluorescence-based test system to measure cytotoxic lymphocyte activity, J. Immunol. Meth., 172:227 – 239, 1994, angewandt.
Ziel- und Effektorzellen
Am Tag des Assays wurde malignes Glioma geerntet, zwei Mal in 5 % FCS/PBS gewaschen und mit Calcein-AM (Molecular Probes, USA) für 30 min bei 37°C inkubiert. Markierte Zielzellen wurden zwei Mal in 5 % FCS/PBS gewaschen, auf 100 000/ml eingestellt und auf Miktotiterplatten mit 96 Näpfen mit U-Form (Nunc, Dänemark) mit einem Endvolumen von 100 μl/Napf ausplattiert.
PBMC wurde mit 5 % FCS/PBS gewaschen und auf eine Endkonzentration von 1 – 10 Millionen Zellen/ml eingestellt.
Zellen wurden mit Cytokinen und Oligodeoxynucleotiden gemäß der Beschreibung in den einzelnen Experimenten behandelt.
Assay
Zur Messung der CTL-Aktivität wurden Effektorzellen auf Miktotiterplatten mit 96 Näpfen mit U-Form mit Ziel:Effektor-Verhältnissen von 1:10 bis 1:100 ausplattiert. Zur Messung der spontanen Freisetzung und der gesamten Freisetzung von Calcein wurden die Näpfe mit 200 μl 5 % FCS/PBS bzw. 200 μl Lysepuffer (50 mM Natriumborat, 0,1 % Triton, pH-Wert 9,0) vorbeladen. Nach einem Inkubieren der Platte für 4 h bei 37°C in einem Inkubator wurden 100 μl Überstände in neue Näpfe überführt und unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzscanners (Titertek Fluoroskan II, Deutschland) vermessen. Sowohl für die Anregung als auch für die Emission wurden die Filtereinstellungen 2 gewählt (ex 2 – 485 nm, em 2 – 538 nm). Der Prozentwert der Cytotoxizität wurde mittels der folgenden Gleichung bestimmt:
In einem Satz Experimente wurden Gliomazellen, dendritische Zellen (DC) und PBMC gemeinsam kultiviert. In diesen Experimenten wurden DC unter Verwendung der Cytokine GM-CSF und IL4 aus PBMC erzeugt. Zellen wurden weiterhin mit erfindungsgemäßen Antisense-VEGF-Oligonucleotiden oder – als Kontrollexperimente – ohne Oligonucleotide behandelt. Tumorzellen wurden auch mit den Cytokinen GM-CSF und IL4 mit oder ohne Oligonucleotide behandelt.
PBMC wurden nur mit erfindungsgemäßen Oligonucleotiden, aber nicht mit den Cytokinen GM-CSF und IL4 behandelt. Oligonucleotide wurden, sofern in den Beschreibungen in den Figuren nichts anderes aufgeführt ist, mit einer Konzentration von 5 μM verwendet.
Der CARS-LASS (Calceinfreisetzungsassay) wurde zur Messung der cytotoxischen PBMC-Aktivität verwendet.
In einem Satz Experimente wurden Gliomazellen und PBMC zusammen entweder mit einem einzigen Oligonucleotid oder mit einer Kombination von Oligonucleotiden behandelt. Die einzelnen Oligonucleotide wurden in einer Konzentration von 5 μM zugegeben. Beim Kombinationsexperiment wurde jedes Oligonucleotid mit einer Konzentration von 2 μm vorgegeben. Sowohl PBMC- als auch Tumorzellen wurden getrennt für 72 h mit dem Oligonucleotid (den Oligonucleotiden) inkubiert.
Der CARE-LASS (Calceinfreisetzungsassay) wurde zur Messung der cytotoxischen PBMC-Aktivität verwendet.

Claims

Medikament, umfassend eine Kombination aus – wenigstens einem Inhibitor der Wirkung einer eine Immunantwort negativ beeinflussenden Substanz, wobei die Substanz aus der aus TGF-β und dessen Rezeptoren, VEGF und dessen Rezeptoren, Interleukin 10 (IL-10) und dessen Rezeptoren, PGE₂ und dessen Rezeptoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei der Inhibitor eine Molmasse von weniger als 100 kDa hat, – wobei der Inhibitor ein Oligonucleotid ist und – wenigstens ein eine Immunantwort positiv beeinflussender Stimulator.
Medikament nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid ein Antisense-Nucleotid und/oder ein Ribozym ist.
Medikament nach Anspruch 1, wobei die Oligonucleotide eine Sequenz gemäß 1 haben.
Medikament nach Anspruch 1, wobei der Stimulator die Synthese oder Funktion von Molekülen verbessert, die die Immunantwort stimulieren, verbessern, hinaufregulieren und/oder positiv regulieren.
Medikament nach Anspruch 4, wobei der Stimulator die Synthese und/oder Funktion von Faktoren wie GM-CSF, SCF, CSF, IFN, den FLT-3-Liganden, monocytenchemotaktische Proteine (MCP-1), Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-12 und/oder Interleukin-18 stimuliert und/oder verbessert oder eines der genannten Interleukine ist oder aus den Gruppen ausgewählt ist, die aus Viren, viralen Antigenen, in Tumorzellen oder Pathogenen, aber nicht in normalen Zellen exprimierten Antigenen, organspezifischen Antigenen, die in betroffenen Organen, die für den Organismus nicht wesentlich sind, oder Fusionszellen von dendritischen und Tumorzellen exprimiert werden, bestehen.
Medikament nach Anspruch 1, wobei das Medikament zwei oder mehr der Inhibitoren und/oder Stimulatoren umfasst.
Verwendung einer Kombination aus – wenigstens einem Inhibitor mit der Wirkung einer eine Immunantwort negativ beeinflussenden Substanz, wobei die Substanz aus der aus TGF-β und dessen Rezeptoren, VEGF und dessen Rezeptoren, Interleukin 10 (IL-10) und dessen Rezeptoren, PGE₂ und dessen Rezeptoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei der Inhibitor eine Molmasse von weniger als 100 kDa hat, – wobei der Inhibitor ein Oligonucleotid ist und – wenigstens ein eine Immunantwort positiv beeinflussender Stimulator zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Neoplasmen oder Infektionskrankheiten.
Verwendung nach Anspruch 7 zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten, Leukämien, Nicht-Hodgkin-Lymphomen, Hodgkin- Lymphomen, Bronchialkarzinomen, Ösophaguskarzinomen, Kolorektal-Karzinomen, Magenkarzinomen, Intestinaltumoren, Lebertumoren, Gallenblasen- und Gallengangkarzinomen, Pankreaskarzinomen, Analkarzinomen, Mastokarzinomen, Ovarialkarzinomen, Zervixkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Prostatakarzinomen, Harnblasenkarzinomen, maligne Melanomen, Gehirntumoren und/oder Sarkomen.