BR112014033004B1

BR112014033004B1 - Oligonucleotídeo para tratamento de pacientes com distrofia muscular

Info

Publication number: BR112014033004B1
Application number: BR112014033004-2A
Authority: BR
Inventors: Judith Christina Theodora Van Deutekom
Original assignee: Biomarin Technologies B.V.
Priority date: 2012-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2021-10-19
Also published as: EP2870246A2; IL236504A0; EP2870246B1; AU2013285698A1; US20150191725A1; CA2877644A1; CN110257379A; WO2014007620A3; IL236504B; RU2015103227A; HK1209456A1; BR112014033004A2; CN110257379B; CN104603271B; WO2014007620A2; RU2674600C2; CN104603271A; JP2015522275A; EP3608407A1; RU2018141234A

Abstract

oligonucleotídeo para tratamento de pacientes com distrofia muscular. a invenção refere-se a um oligonucleotídeo e a uma composição farmacêutica compreendendo o referido oligonucleotídeo. este oligonucleotídeo é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon a partir de um pré-rnam de distrofina e a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mrna, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon, em que o referido oligonucleotídeo é adequado para o salto do referido primeiro e segundo éxons do referidao pré-mrna, e de preferência o trecho total de éxons no meio.

Description

Campo da invenção

[001] A invenção refere-se ao campo da genética humana, mais especificamente a um método para a concepção de um único oligonucleotídeo que é de preferência capaz de induzir o salto de dois ou mais éxons de um pré-mRNA. A invenção proporciona ainda o referido oligonucleotídeo, uma composição farmacêutica compreendendo o referido oligonucleotídeo, e o uso do referido oligonucleotídeo, tal como aqui identificado.

Antecedentes da invenção

[002] Os oligonucleotídeos estão surgindo na medicina para o tratamento de doenças genéticas como a distrofia muscular. Distrofia muscular (DM) refere-se a doenças genéticas que são caracterizadas por uma fraqueza progressiva e degeneração dos músculos esqueléticos. Distrofia muscular de Duchenne (DMD) e Distrofia Muscular de Becker (BMD) são as formas mais comuns na infância de distrofia muscular, e são aqui utilizadas para ilustrar a invenção. DMD é um distúrbio neuromuscular grave e letal, resultando em uma dependência de apoio de cadeira de rodas antes dos 12 anos, e os pacientes com DMD muitas vezes morremantes da idade de trinta anos devido à insuficiência respiratória ou cardíaca.

[003] DMD é causada por mutações no gene DMD; principalmente deleções ou duplicações de estrutura- deslocável de um ou mais éxons, inserções ou deleções pequenas de nucleotídeos, ou por mutações pontuais sem sentido, que normalmente resultam na ausência de distrofina funcional. Durante a última década, a modificação de splicing especificamente induzida a fim de restaurar o quadro de leitura interrompido do transcrito DMD tem emergido como uma terapia promissora para a distrofia muscular de Duchenne (DMD) (van Ommen G.J. et al, Yokota T., et al, van Deutekom et al., Goemans N.M., et al.,). Usando os oligonucleotídeos anti-sentido sequência-específicos (AONs) que têm como alvo um éxon específico flanqueando ou contendo a mutação e interferem com os seus sinais de splicing, o salto daquele éxon pode ser induzido durante o processamento do pré-mRNA de DMD. Apesar do transcrito truncado resultante, o quadro aberto de leitura é restaurado e uma proteína é introduzida, a qual é semelhante às encontradas nos pacientes com distrofia muscular de Becker tipicamente mais branda. O salto do éxon induzido por AON fornece uma mutação específica e, portanto, uma abordagem terapêutica potencialmente personalizada para pacientes com DMD, e pacientes com BMD específica grave. Uma vez que a maioria das mutações aglomera em torno de 45 a 55 éxons no gene DMD, o salto de um éxon específico naquela região pode ser terapêutico para uma subpopulação de pacientes com uma variedade de mutações. O salto do éxon 51 afeta as maiores subpopulações de pacientes (aproximadamente 13%), incluindo aqueles com deleções dos éxons 45 a 50, 48 a 50, 50, ou 52. Para algumas mutações, o salto de mais do que um éxon é necessário para restaurar o quadro aberto de leitura. Por exemplo, para pacientes com DMD com uma deleção do éxon 46 ao éxon 50 no gene DMD, apenas o salto de ambos os éxons 45 e 51 seria corretivo. Para o tratamento desses pacientes, a administração de dois oligonucleotídeos, um se direcionando para o éxon 45 e o outro se direcionando para o éxon, é necessária. A viabilidade de saltar dois ou múltiplos éxons consecutivos, através de uma combinação de AONs, ou em um coquetel ou em constructos de genes entregues viralmente, tem sido estudada extensivamente (Aartsma-Rus A. et al., 2004; Béroud C., et al.; Van Vliet L., et al.; Yokota T., et al.; Goyenvalle A., et al.,). O salto de multi-éxons seria aplicável a subpopulações de pacientes combinadas, permitem a mimetização de deleções conhecidas por estarem associadas com fenótipos relativamente suaves, e iria proporcionar uma ferramenta para visar mutações raras fora da região de deleção do ponto quente no gene DMD. Um inconveniente para o desenvolvimento de fármacos que compreendem vários oligonucleotídeos é, no entanto, que as autoridades de regulamentação de medicamentos podem considerar oligonucleotídeos de sequências diferentes como fármacos diferentes, cada um exigindo prova de produção estável, testes de toxicidade e clínicos. Portanto, existe uma necessidade de um composto molecular único capaz de induzir o salto de pelo menos dois éxons para facilitar o tratamento de subgrupos combinados de pacientes com DMD.

Descrição da invenção

[004] A invenção proporciona um método para a concepção de um único oligonucleotídeo, em que o referido oligonucleotídeo é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon e a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon. Os oligonucleotídeos obtidos pelo referido método são preferencialmente capazes de induzir o salto do referido primeiro éxon e do referido segundo éxon do referido pré-mRNA. De preferência, o salto do éxon(s) adicional também é induzido, em que o referido éxon(s) adicional é/são preferencialmente localizado entre o referido primeiro e o referido segundo éxon. O transcrito resultante do referido pré-mRNA, em que os referidos éxons estão saltados, está in-frame.

Oligonucleotídeo

[005] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um oligonucleotídeo que é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon e a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon.

[006] Este oligonucleotídeo é de preferência capaz de induzir o salto dos referidos primeiro e segundo éxons do referido pré-mRNA; mais preferencialmente o salto do éxon(s) adicional é induzido, em que o referido éxon adicional(s) é/são preferencialmente localizados entre os referidos primeiro e segundo éxons, e em que o transcrito resultante está in frame.

[007] O salto do éxon interfere com os processos de splicing naturais que ocorrem dentro de uma célula eucariótica. Em eucariotas superiores, a informação genética para proteínas no DNA da célula é codificada em éxons que são separados uns dos outros por sequências intrônicas. Estes íntrons são em alguns casos muito extensos. A maquinaria de transcrição de eucariotas gera um pré-mRNA que contém ambos os éxons e íntrons, enquanto a máquina de splicing, muitas vezes, já durante a produção contínua do pré-mRNA, gera o mRNA real codificante para a proteína real por remoção dos íntrons, e ligando os éxons presentes no pré-mRNA durante um processo denominado splicing.

[008] Um oligonucleotídeo da invenção que é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon a partir de um pré-mRNA e a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA é para ser interpretado como um oligonucleotídeo adequado para a ligação a uma região de um primeiro éxon a partir de um pré-mRNA, e adequado para a ligação a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA. Tal oligonucleotídeo da invenção é caracterizado pela sua função de ligação (isto é, capaz de se ligar), quando utilizado com ou quando usado em combinação com um pré-RNAm, de preferência em uma célula. Dentro deste contexto “capaz de” pode ser substituído por “poder”. Assim, o técnico especialista no assunto apreciará que um oligonucleotídeo capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon e capaz de se ligar a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA, definida por uma sequência de nucleotídeos, define o referido oligonucleotídeo estruturalmente, ou seja, o referido oligonucleotídeo possui uma sequência tal que é reversa- complementar com a sequência da referida região do referido primeiro éxon, e também reversa-complementar com a sequência da referida região do referido segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA. O grau de complementaridade reversa com as referidas regiões do referido primeiro e/ou o referido segundo éxon que é necessário para um oligonucleotídeo da invenção pode ser inferior a 100%. Uma certa quantidade de incompatibilidades ou uma ou duas lacunas podem ser permitidas, como é abordado mais adiante. A sequência de nucleotídeos de uma região de um primeiro éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido segundo éxon (ou a sequência de nucleotídeos de uma região de um segundo éxon que tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon), para que o oligonucleotídeo da invenção é capaz de ligação, poderia ser concebida usando um método da invenção, tal como explicado mais adiante. O pré-mRNA preferido é um pré-mRNA de distrofina. As combinações preferidas dos primeiro e segundo éxons do pré-mRNA de distrofina. e regiões preferenciais dos referidos primeiro e segundo éxons da distrofina são definidas na tabela 2. O oligonucleotídeo da invenção é de preferência capaz de induzir o salto dos referidos primeiro e segundo éxons do referido pré-RNAm da distrofina; mais preferencialmente o salto do éxon(s) adicional é induzido, em que o referido éxon(s) adicional é/são preferencialmente localizados entre os referidos primeiro e segundo éxons, e em que o transcrito de distrofina resultante está in frame, de preferência, como na Tabela 1.

[009] Um transcrito está in frame quando ele tem um quadro aberto de leitura que permite a produção de uma proteína. O estado in frame de um mRNA pode ser avaliado por análise de sequência e/ou RT-PCR, como conhecido por uma Técnico especialista no assunto. A proteína resultante que resulta da tradução do transcrito in frame podem ser analisada por imunofluorescência e/ou análise de western blot utilizando anticorpos que reagem de forma cruzada com a referida proteína, tal como é conhecido por uma Técnico especialista no assunto. Ao longo da presente invenção, um oligonucleotídeo, tal como aqui identificado pode ser dito funcional se um transcrito resultante in frameé identificado por RT-PCR e/ou análise da sequência, ou, se a proteína resultante a partir do referido transcrito in frameé identificada por imunofluorescência e/ou análise de Western blot, em um sistema relevante in vitro ou in vivo dependendo da identidade do transcrito. Se o transcrito é o transcrito da distrofina, um sistema relevante pode ser uma célula muscular, ou miotubos, ou fibra muscular ou miofibras de um doador saudável ou de um paciente com DMD como explicado neste documento posteriormente.

[010] Em uma modalidade, uma região de um segundo éxon (presente no interior do mesmo pré-mRNA como uma região de um primeiro éxon) tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade com uma região de um primeiro éxon tal como identificado acima (regiões preferidas de um primeiro e de um segundo éxon de distrofina são identificadas na Tabela 2). A porcentagem de identidade pode ser avaliada ao longo de todo o comprimento do referido primeiro e/ou segundo éxon, ou sobre uma região de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130,140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos, tal como exemplificado para dos éxons de distrofina neste documento. É evidente para o técnico especialista no assunto que um primeiro e um segundo éxon tal como aqui identificados são dois éxons distintos de um único pré-mRNA, ou dois éxons distintos dentro do mesmo pré-mRNA. Um primeiro éxon tal como aqui identificado pode ser localizado a montante de (ou seja, 5') do segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA como aqui identificado, ou o referido segundo éxon pode estar a montante do referido primeiro éxon. De preferência, o referido primeiro éxon está localizado a montante do referido segundo éxon. É evidente para um técnico especialista no assunto que um oligonucleotídeo da invenção pode ser concebido, em primeiro lugar, para ser capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon; em vista da identidade de uma região do referido primeiro e o referido segundo éxons, o referido oligonucleotídeo pode ser também, em segundo lugar, capaz de se ligar à referida região do referido segundo éxon. A concepção reversa é possível: um oligonucleotídeo da invenção pode ser concebido, em primeiro lugar, para ser capaz de se ligar a uma região de um segundo éxon; em vista da identidade de uma região do referido primeiro e o referido segundo éxons, o referido oligonucleotídeo pode ser também, em segundo lugar, capaz de se ligar à referida região do referido primeiro éxon.

[011] A porcentagem de identidade entre uma região do primeiro e uma região do segundo éxon pode ser avaliada ao longo de toda a região do referido primeiro éxon, em que aquela região pode ser mais curta, mais longa ou igualmente longa como a parte da referida região à qual o oligonucleotídeo da invenção é capaz de se ligar. A região do primeiro éxon e a região do segundo éxon, tal como aqui utilizada, pode também ser identificada como a(s) região(s) de identidade. De preferência, a região do primeiro éxon, que define a identidade com a região do segundo éxon é igualmente longa ou mais longa do que a parte daquela referida região à qual o oligonucleotídeo da invenção é capaz de se ligar. Tem que ser entendido que o oligonucleotídeo da invenção pode ser capaz de se ligar a uma parte menor, ou uma parte se sobrepõem parcialmente, das referidas regiões usadas para avaliar identidade de sequência do primeiro e/ou segundo éxon. É, por conseguinte, para ser entendido que um oligonucleotídeo que é capaz de se ligar a uma região de um primeiro e de um segundo éxon pode ligar uma parte da referida região do referido primeiro éxon e do referido segundo éxon. A referida parte pode ser tão longa como a referida região do referido primeiro e/ou do referido segundo éxon. A referida parte pode ser mais curta ou mais longa que a referida região do referido primeiro e/ou do referido segundo éxon. A referida parte pode ser constituída no interior da referida região do referido primeiro e/ou do referido segundo éxon. A referida parte pode sobrepor-se com a referida região do referido primeiro e/ou o referido segundo éxon. Esta sobreposição pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, ou mais nucleotídeos no lado 5' e/ou 3' da região do referido primeiro e/ou segundo éxon. O oligonucleotídeo pode ser de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, ou mais nucleotídeos mais longo ou mais curto do que a região do referido primeiro e/ou o referido segundo éxon, e pode estar no lado 5' ou 3' da referida região da primeira e/ou segunda região.

[012] A região, sendo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, ou até 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos usada para calcular a porcentagem de identidade entre um primeiro éxon e um segundo éxon pode ser um trecho contínuo, ou pode ser interrompida por uma, duas, três, quatro ou mais lacunas, desde que a porcentagem de identidade ao longo de toda a região é pelo menos 50%.

[013] A porcentagem de identidade entre a região do primeiro e a região do segundo éxons pode ser avaliada utilizando qualquer programa conhecido pelo técnico especialista no assunto. De preferência, a referida identidade é avaliada como se segue: o melhor alinhamento de pares entre os primeiro e segundo éxons utilizando a ferramenta online EMBOSS Matcher utilizando as configurações padrão (Matriz: EDNAFULL, Gap_penalty: 16, Extend_penalty: 4).

[014] Um oligonucleotídeo, tal como aqui utilizado refere-se preferencialmente a um oligômero que é capaz de se ligar a, se direcionar a, hibridizar com, e/ou é complementar reverso para uma região ou para uma parte de uma região de um primeiro e um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA.

[015] Um oligonucleotídeo, tal como aqui identificado (isto é, que é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon e a uma região de um outro éxon (isto é, um segundo éxon) dentro do mesmo pré-mRNA, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon) é também, de preferência, pelo menos 80% complementar reversa à referida região do referido primeiro éxon e, pelo menos, 45% complementar reversa à referida região do referido segundo éxon. Mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo tem pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% de complementaridade reversa à referida região do referido primeiro e, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% complementar reversa à referida região do referido segundo éxon. A complementaridade reversa é preferivelmente, mas não necessariamente, avaliada ao longo de todo o comprimento do oligonucleotídeo.

[016] Um oligonucleotídeo englobado pela presente invenção pode compreender, pelo menos, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 nucleotídeos. Um oligonucleotídeo englobado pela presente invenção pode compreender, no máximo, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 nucleotídeos. O comprimento do oligonucleotídeo da invenção é definido pelo número total de nucleotídeos englobados em que o referido oligonucleotídeo, independentemente de quaisquer modificações presente no referido oligonucleotídeo. Como discutido mais abaixo, os nucleotídeos podem conter certas modificações químicas, mas esses nucleotídeos modificados são ainda considerados nucleotídeos no contexto da presente invenção. Dependendo da química de um oligonucleotídeo, o comprimento ótimo de umoligonucleotídeo pode ser distinto. Por exemplo, comprimento de um oligonucleotídeo 2'-O-metil-fosforotioato pode ser desde 15 até 30. Se este oligonucleotídeo é ainda modificado, tal como aqui exemplificado, o comprimento ótimo pode ser encurtado para 14, 13 ou ainda inferior.

[017] Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo da invenção é não mais do que 30 nucleotídeos, para limitar a possibilidade de eficiência de síntese reduzida, rendimento, pureza ou escalabilidade, biodisponibilidade reduzida e/ou a captação e tráfico celular, segurança reduzida, e para limitar o custo dos produtos. Em uma modalidade mais preferida, um oligonucleotídeo é de 15 e 25 nucleotídeos. Mais preferencialmente um oligonucleotídeo abrangido pela invenção consiste em 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos. O comprimento do oligonucleotídeo da invenção é de preferência tal que a funcionalidade ou atividade do oligonucleotídeo é definida através da indução de pelo menos 5% de salto dos primeiro e segundo éxons (e qualquer éxon (s) no meio), ou através da facilitação de que pelo menos 5% de um transcrito in frameé formado, quando, pelo menos, 100 nM do referido oligonucleotídeo está sendo utilizado para transfectar uma cultura de células relevante in vitro. A avaliação da presença do referido transcrito já foi aqui explicada. Uma cultura de células relevante é uma cultura de células em que o pré-mRNA compreendendo o referido primeiro e o referido éxon é transcrito, e emendado em um transcrito de RNAm. Se o pré-mRNA é o pré-mRNA de distrofina, uma cultura de células relevante compreende células musculares (diferenciadas). Neste caso, pelo menos 20% de um transcrito in frameé formado quando pelo menos 250 nM do referido oligonucleotídeo está sendo utilizado.

[018] A região de um primeiro éxon pode ser pelo menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ou até 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos. Uma região de um primeiro éxon também pode ser definida como sendo pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% do comprimento do referido éxon. Uma região de um primeiro éxon pode ser denominada de uma região de identidade.

[019] A região de um segundo éxon pode ser pelo menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ou até 90, 100, 110,120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos. Uma região de um segundo éxon pode ser definida como sendo pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% do comprimento do referido éxon. Uma região de um segundo éxon pode ser denominada de uma região de identidade.

[020] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo da invenção é capaz de se ligar a uma região do éxon U + l (primeiro éxon) de um pré-mRNA, em que uma região de outro éxon D-1 (segundo éxon) dentro do mesmo pré-mRNA tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido éxon (U + l), em que o referido oligonucleotídeo é para o salto do referido U + l e do referido D-l éxons (e do éxon(s) adicional preferencialmente localizado entre o referido primeiro e o referido segundo éxons) do referido pré-mRNA, para se obter um transcrito in-frame em que os éxons U e D são emendados em conjunto (por exemplo, de preferência para o DMD como na Tabela 1). Um oligonucleotídeo da invenção também é aqui identificado como um composto. Um oligonucleotídeo da presente invenção é preferencialmente um oligonucleotídeo anti-sentido (ou seja, AON). Um oligonucleotídeo é de preferência o salto dos referidos dois éxons (isto é, o referido primeiro (U + 1) e o referido segundo (D-l) éxons) do referido pré-mRNA, e em que o transcrito resultante (em que U é diretamente emendado a D) está in-frame (por exemplo, de preferência para o DMD como na Tabela 1). Pode-se dizer que o referido oligonucleotídeo induz ao salto dos referidos dois éxons em um único pré- mRNA. Opcionalmente, o salto do éxon(s) adicional é induzido, em que o referido éxon(s) adicional é/são preferencialmente localizados entre os referidos primeiro e segundo éxons, e o transcrito resultante está in frame.

[021] Um oligonucleotídeo é mais preferencialmente para o salto dos referidos dois éxons (isto é, o referido primeiro e o referido segundo éxon), e todo eo trecho de éxons entre o referido primeiro e o referido segundo éxons, no referido pré-mRNA, a fim de remover qualquer mutação dentro do referido trecho, e para obter um transcrito que é mais curto, mas que possui um quadro aberto de leitura restaurado, permitindo a produção de proteína.

[022] Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, acredita-se que, devido à identidade de sequência de pelo menos 50%, ou similaridade entre os referidos dois éxons, um único oligonucleotídeo da invenção é capaz de se ligar e induzir o salto de ambos os éxons, e, de preferência, todo o trecho de éxons no meio, a fim de se obter um transcrito mais curto, que está in frame. Os referidos dois éxons podem assim serem adjacentes em um pré-mRNA, ou podem ser separados por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 éxons. A região que engloba um ou mais éxons presentes entre o referido primeiro e o referido segundo éxons também pode ser chamada de um trecho de éxons (múltiplos) ou um trecho multi-éxon. De preferência, o primeiro éxon desse um trecho multi-éxon é o primeiro éxon aqui identificado anteriormente, e o último éxon deste um trecho multi-éxon é o segundo éxon aqui identificado anteriormente. Um oligonucleotídeo da invenção pode também ser identificado como um oligonucleotídeo que é capaz de induzir o salto dos referidos dois éxons, ou o salto de um trecho de (múltiplos) éxons, ou ao salto do referido trecho multi-éxon. Em uma modalidade preferida, o salto de ambos o primeiro éxon e o segundo éxon é induzido pela utilização de um único oligonucleotídeo da invenção. Em uma modalidade preferida, o salto de mais do que um, mais do que 2, mais do que 3, mais do que 4, mais do que 5, mais do que 6, mais do que 7, mais do que 8, mais do que 9, mais do que 10, mais do que 11, mais do que 12, mais do que 13, mais do que 14, mais do que 15, mais do que 16, mais do que 17 éxons, mais do que 18, mais do que 19, mais do que 20, mais do que 21, mais do que 22, mais do que 23, mais do que 24, mais do que 25, mais do que 26, mais do que 27, mais do que 28, mais do que 29, mais do que 30, mais do que 31, mais do que 32, mais do que 33, mais do que 34, mais do que 35, mais do que 36 mais do que 37, mais do que 38, mais do que 39, mais do que 40, mais do que 41, mais do que 42, mais do que 43, mais do que 44, mais do que 45, mais do que 46, mais do que 47, mais do que 48 , mais do que 49, mais do que 50 éxons utilizando um único oligonucleotídeo é realizado e, por conseguinte, este salto de mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 éxons é realizado, não utilizando uma mistura ou coquetel de dois ou mais oligonucleotídeos distintos, ou não usando dois ou mais oligonucleotídeos distintos que podem ser ligados com um ou mais ligante(s), ou não utilizando uma constructo de genes transcrevendo dois ou mais oligonucleotídeos diferentes. Em uma modalidade é, por conseguinte, fornecido que a invenção abrange um único oligonucleotídeo e não inclui dois ou mais oligonucleotídeos diferentes, o referido único oligonucleotídeo sendo capaz de se ligar ao referido primeiro e ao referido segundo éxons, e capaz de induzir o salto de pelo menos o referido primeiro e segundo éxons dentro de um único pré-mRNA, como aqui explicado. Neste contexto, o técnico especialista no assunto entende que a palavra “único” não se refere ao número de moléculas necessárias a fim de induzir o salto do éxon. Único refere-se à sequência de um oligonucleotídeo: a invenção abrange uma única sequência de oligonucleotídeo e sua utilização, e não compreende duas ou mais sequências de oligonucleotídeos distintos, a referida sequência única de oligonucleotídeo sendo capaz de se ligar ao referido primeiro e ao referido segundo éxons, e capaz de induzir ao salto de pelo menos o referido primeiro e o referido segundo éxons dentro de um único pré-mRNA, tal como explicado aqui. Esta é a primeira invenção permitindo o salto de mais do que um éxon com apenas um único oligonucleotídeo, a fim de tratar uma doença causada por uma mutação (rara) em um gene, desde que os diferentes éxons no referido gene compreendam regiões que têm pelo menos 50% de identidade de sequência.

[023] Um oligonucleotídeo da presente invenção é preferencialmente utilizado como uma parte da terapia com base na atividade de modulação de RNA, como aqui definido posteriormente. Dependendo da identidade do transcrito em que os primeiro e segundo éxons estão presentes, pode-se conceber um oligonucleotídeo, para prevenir, tratar ou retardar uma dada doença.

[024] Foi demonstrado que o direcionamento de dois éxons dentro de um único pré-mRNA com um único oligonucleotídeo capaz de se ligar a ambos os éxons, resulta em mRNA carecendo dos éxons direcionados e, além disso, de todo o trecho de éxons no meio. Uma vantagem de tal oligonucleotídeo, tal como aqui definido, é que defeitos causados por diferentes mutações no interior deste trecho multi-éxon podem ser tratados. Se alguém escolher usar dois ou mais oligonucleotídeos diferentes para induzir o salto de dois ou mais éxons, deve-se, por exemplo, ter em conta que cada oligonucleotídeo pode ter o seu próprio perfil de PK e que, assim, as condições teriam que ser verificadas em que cada um deles será presente de forma semelhante em uma mesma célula. Por conseguinte, outra vantagem da utilização de apenas um único oligonucleotídeo capaz de se ligar a dois éxons diferentes como identificado acima, é que a produção, a toxicidade, a determinação da dose e os ensaios clínicos são majoritariamente facilitados, uma vez que estes podem ser reduzidos para a produção e teste de um único composto simples.

[025] Abaixo características adicionais do oligonucleotídeo da invenção são definidas.

[026] Dentro do contexto da presente invenção, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo é capaz de se ligar, de se direcionar, hibridizar com, é complementar reversa com, e/ou é capaz de inibir a função de pelo menos uma sequência regulatória de splicing dentro de pelo menos o referido primeiro éxon e/ou o referido segundo éxon, e/ou está afetando a estrutura de pelo menos o referido primeiro éxon e/ou o referido segundo éxon:em que o referido oligonucleotídeo compreende uma sequência que é capaz de se ligar a, se direcionar, hibridizar com, e/ou é complementar reverso a um sítio de ligação para uma proteína serina-arginina (SR) no referido primeiro e/ou segundo éxon, e/ouem que o referido oligonucleotídeo é capaz de se ligar a, se direcionar, hibridizar com, e/ou é complementar reverso a um ativador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS), e/ou um silenciador exônico de splicing (ESS) no referido primeiro e/ou segundo éxon.

[027] Mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo que é capaz de se ligar a, se direcionar, hibridizar com, e/ou é complementar reverso a uma região de um primeiro éxon de pré-mRNA e/ou a uma região de um segundo éxon de pré-mRNA é capaz de especificamente inibir pelo menos uma sequência regulatória de emenda, e/ou afetar a estrutura de, pelo menos, o referido primeiro e/ou segundo éxon no referido pré-mRNA. Interferir com sequências e/ou estruturas regulatórias de splicing tem a vantagem de que tais elementos estão localizados dentro do éxon. Ao fornecer um tal oligonucleotídeo tal como aqui definido, é possível mascarar de forma eficaz pelo menos o referido primeiro e segundo éxon, e de preferência o trecho inteiro de éxons no meio, a partir do aparelho de splicing. A falha do aparelho de splicing para reconhecer estes éxons conduz assim ao salto ou exclusão destes éxons a partir do mRNA final. Esta modalidade concentra-se em apenas sequências codificantes. É pensado que isto permite que o método seja mais específico e, portanto fiável. A complementaridade reversa do referido oligonucleotídeo para a referida região do referido primeiro e/ou segundo éxon de um pré-mRNA é, de preferência, pelo menos, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[028] Portanto, a presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo anti-sentido para o uso como um medicamento para a prevenção, retardamento, melhora e/ou tratamento de uma doença em um indivíduo, em que o referido oligonucleotídeo é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon e a uma região de um segundo éxon, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon, em que o referido primeiro e o referido segundo éxons estão dentro de um mesmo pré-mRNA no referido indivíduo, em que a referida ligação resulta no salto do referido primeiro éxon e o referido segundo éxon e, de preferência no salto de um trecho de multi-éxons começando com o referido primeiro éxon, e abrangendo um ou mais éxons presentes entre o referido primeiro e o referido segundo éxons, e no máximo no salto de todo o trecho de éxons entre o referido primeiro e o referido segundo éxons, e em que um transcrito in frameé obtido, permitindo a produção de uma proteína funcional ou semi-functional.

[029] De um modo preferido, como aqui explicado, o referido oligonucleotídeo é capaz de induzir o salto de todo o trecho de éxons entre o referido primeiro éxon e o referido segundo éxon.

[030] Mais preferencialmente, tal como explicado aqui, a referida ligação do referido oligonucleotídeo é capaz de interferir com, pelo menos, uma sequência regulatória de splicing nas referidas regiões dos referidos primeiro e segundo éxons, e/ou com a estrutura secundária do referido primeiro e/ou do referido segundo éxons, e/ou com a estrutura secundária abrangendo pelo menos o referido primeiro e/ou o referido segundo éxons no referido pré-mRNA. Sequências regulatórias de splicing preferidas são apresentadas mais adiante.

[031] Por conseguinte, uma modalidade preferida refere-se a um oligonucleotídeo da invenção que é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon a partir de um pré-mRNA, e/ou para uma região ou de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA, em que a referida região do referido segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon (por exemplo, para DMD de preferência, como na Tabela 2), em que o referido oligonucleotídeo é capaz de induzir o salto do referido primeiro e segundo éxons do referida pré-mRNA, resultando em um transcrito que está in frame (por exemplo, de preferência para DMD como na Tabela 1 ou 6). O referido oligonucleotídeo fornecendo o referido indivíduo com uma proteína funcional ou semi-funcional, e o referido oligonucleotídeo compreendendo ainda:- uma sequência que é capaz de se ligar, de direcionar, de hibridizar com, e/ou é complementar reversa a uma região de um primeiro e/ou segundo éxon de pré-mRNA, que é hibridizado com uma outra parte de um primeiro e/ou segundo éxon de pré-mRNA (estrutura fechada), e/ou- uma sequência que é capaz de se ligar, de direcionar, de hibridizar com, e/ou é complementar reversa a uma região do referido primeiro e/ou segundo éxon de pré- mRNA que não está hibridizada no referido pré-mRNA (estrutura aberta).

[032] Para esta modalidade, é feito referência ao pedido de patente WO 2004/083446. Moléculas de RNA apresentam estruturas secundárias fortes, principalmente devido ao emparelhamento de base de trechos complementares-reversos ou parcialmente complementares-reversos dentro do mesmo RNA. Tem sido a muito desde o pensamento de que as estruturas do RNA desempenha um papel na função do RNA. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a estrutura secundária do RNA de um éxon desempenha um papel na estruturação do processo de splicing. Através da sua estrutura, um éxon é reconhecido como uma peça que deve ser incluído no mRNA. Em uma modalidade, um oligonucleotídeo é capaz de interferir com a estrutura de pelo menos o referido primeiro éxon e, provavelmente, também o referido segundo éxon e, possivelmente, também o trecho de éxons no meio, e, por conseguinte, capaz de interferir com o splicing do referido primeiro e provavelmente também do referido segundo éxon e, possivelmente, também o trecho de éxons entre eles, por mascaramento dos referidos éxons a partir do aparelho de splicing e resultando, assim, na exclusão dos referidos éxons. Sem estar limitado pela teoria, pensa-se que a sobreposição com uma estrutura aberta, melhora a eficiência de invasão de um oligonucleotídeo (ou seja, aumenta a eficiência com a qual o oligonucleotídeo pode entrar na estrutura), ao passo que a sobreposição com a estrutura fechada aumenta a eficiência de interferir com a estrutura secundária do RNA do éxon. Verificou-se que o comprimento da complementaridade reversa parcial para ambas estrutura fechada e aberta não é extremamente restrito. Foram observadas altas eficiências com um oligonucleotídeo com comprimentos variáveis de complementaridade reversa em qualquer estrutura. O termo complementaridade reversa é usado neste documento para se referir a um trecho de ácidos nucleicos que podem hibridizar com outro trecho de ácidos nucleicos sob condições fisiológicas. Condições de hibridização são definidas posteriormente. Não é, portanto absolutamente necessário que todas as bases na região de complementaridade reversa sejam capazes de emparelhar com bases na fita oposta. Por exemplo, ao projetar um oligonucleotídeo, pode-se desejar, por exemplo, incorporar um ou mais resíduos que não fazem par de bases com as bases na cadeia complementar reversa. Desemparelhamentos podem, em certa medida, serem permitidos, se nas circunstâncias na célula, o trecho de nucleotídeos ainda é capaz de hibridizar com a parte complementar reversa. No contexto da presente invenção, a presença de um desemparelhamento no oligonucleotídeo da invenção é preferida uma vez que em uma modalidade, o referido oligonucleotídeo tem pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% de complementaridade reverso a uma região de um primeiro éxon e/ou a uma região de um segundo éxon. A presença de um desemparelhamento em que o referido oligonucleotídeo é uma característica preferida da invenção uma vez que o referido oligonucleotídeo é capaz de se ligar a uma região do referido primeiro e a uma região do referido segundo éxon, tal como aqui anteriormente identificado.

[033] Outras vantagens de permitir a presença de um desemparelhamento em um oligonucleotídeo anti-sentido da invenção são aqui definidas, e são semelhantes às previstas pela presença de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação: evitar a presença de um CpG, evitar ou diminuir uma multimerização ou agregação potencial, evitar estruturas quadruplex, para permitir conceber um oligonucleotídeo com cinética de ligação ao RNA e/ou propriedades termodinâmicas melhoradas.

[034] De um modo preferido, a complementaridade reversa do oligonucleotídeo para a região de identidade entre o referido primeiro e/ou segundo éxon é de 45% para 65%, 50% a 75%, mas mais preferencialmente de 65% a 100% ou de 70% a 90%, ou de 75% a 85%, ou de 80% a 95%. Em geral, isto permite 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 desemparelhamento(s) em um oligonucleotídeo de 20 nucleotídeos. Portanto, podemos ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, ou 22 desemparelhamento(s) em um oligonucleotídeo de 40 nucleotídeos. De um modo preferido, menos do que 14 desemparelhamentos estão presentes em um oligonucleotídeo de 40 nucleotídeos. O número de desemparelhamentos é tal que um oligonucleotídeo da invenção é ainda capaz de se ligar a, hibridizar com, se direcionar para uma região do referido primeiro éxon e para uma região do referido segundo éxon, induzindo assim o salto de pelo menos o referido primeiro e o referido segundo éxons, e induzir a produção de um transcrito in frame, como explicado aqui. De preferência, a produção de um transcrito in frame é obtida com, pelo menos, 5% de eficiência utilizando pelo menos 100 nM do referido oligonucleotídeo para transfectar uma cultura de células in vitro relevante, como aqui anteriormente explicado.

[035] Deve ser salientado que a invenção abrange um oligonucleotídeo que não tem qualquer desemparelhamento com uma região de um primeiro éxon, e que pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, ou 22 desemparelhamentos com a região correspondente de um segundo éxon como aqui definido. No entanto, a invenção também abrange um oligonucleotídeo que não tem qualquer desemparelhamento com uma região de um segundo éxon, e que pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, ou 22 desemparelhamentos com a região correspondente de um primeiro éxon como aqui definido. Finalmente, a invenção abrange um oligonucleotídeo que pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, ou 22 desemparelhamentos com uma região de um primeiro éxon, e que pode ter 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 desemparelhamento com a região correspondente de um segundo éxon, tal como aqui definido. Aqui, novamente, é para ser entendido que o número de desemparelhamentos em um oligonucleotídeo da invenção é tal que o referido oligonucleotídeo é ainda capaz de se ligar a, hibridizar com, se direcionar para uma região do referido primeiro éxon e uma região do referido segundo éxon, como explicado aqui.

[036] Um oligonucleotídeo da invenção de preferência não atravessa uma lacuna no alinhamento de uma região de um primeiro éxon e uma região de um segundo éxon, tal como aqui identificado. O alinhamento é de preferência realizado usando a ferramenta online EMBOSS Matcher, tal como explicado aqui anteriormente. Em casos específicos, contudo, um oligonucleotídeo da invenção pode precisar atravessar uma lacuna, tal como aqui mencionado anteriormente. A referida lacuna é de preferência apenas uma lacuna. A referida lacuna é de preferência medindo menos do que 3 nucleotídeos, mais de preferência, apenas um nucleotídeo. O número e comprimento das lacunas é tal que um oligonucleotídeo da invenção é ainda capaz de se ligar a, hibridizar com, se direcionar para uma região do referido primeiro éxon e uma região do referido segundo éxon, induzindo assim o salto de pelo menos o referido primeiro e o referido segundo éxons, e induzindo a produção de um transcrito in frame como explicado aqui.

[037] A estrutura (isto é, estruturas abertas e fechadas) é melhor analisada no contexto do pré-mRNA, em que os éxons residem. Essa estrutura pode ser analisada no RNA real. Contudo, é atualmente possível prever a estrutura secundária de uma molécula de RNA (a menores custos de energia) muito bem utilizando programas de estrutura- modelagem. Um exemplo não-limitativo de um programa adequado é o servidor web Mfold (Zuker, M.).

[038] Um técnico especialista no assunto será capaz de prever, com reprodutibilidade adequada, uma estrutura suscetível de um éxon, dada uma sequência de nucleotídeos. Melhores previsões são obtidas quando o fornecimento de tais programas de modelagem com ambos o referido éxon e sequências de íntron flanqueadoras. Normalmente não é necessário para modelar a estrutura do pré-mRNA inteiro.

[039] O emparelhamento de um oligonucleotídeo da invenção pode afetar a dobragem local ou estrutura 3D, ou conformação do RNA alvo (isto é, da região que abrange, pelo menos, o primeiro e/ou segundo éxons). A conformação diferente pode resultar no rompimento de uma estrutura reconhecida pela maquinaria de splicing. No entanto, quando o potencial (oculto) de sequências aceptoras e/ou doadoras de spliceestão presentes no primeiro e/ou segundo éxon alvo, ocasionalmente, uma nova estrutura é gerada definindo um (neo) éxon diferente, isto é, com uma extremidade 5' diferente, uma extremidade 3' diferente, ou ambas. Este tipo de atividade é abrangida pelo escopo da presente invenção conforme o éxon alvo está excluído do mRNA. A presença de um novo éxon, contendo parte do referido primeiro e/ou segundo éxon alvo no mRNA não altera o fato de que o éxon alvo, como tal, é excluído. A inclusão de um neo-éxon pode ser vista como um efeito colateral que ocorre apenas ocasionalmente. Existem duas possibilidades quando o salto de éxon é usado para restaurar (parte de) um quadro aberto de leitura de um transcrito que está interrompido como resultado de uma mutação. Uma delas é que o neo-éxon é funcional na restauração do quadro de leitura, enquanto que no outro caso, o quadro de leitura não é restaurado. Ao selecionar um oligonucleotídeo para a restauração de um quadro aberto de leitura por meio de múltiplos saltos de éxons é claro que sob estas condições apenas os oligonucleotídeos que são selecconados, de fato resultam no salto do éxon que restaura o quadro aberto de leitura de um dado transcrito, com ou sem um neo-éxon.

[040] Além disso, em outra modalidade preferida é fornecido um oligonucleotídeo da invenção que é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon a partir de um pré- mRNA e a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré- mRNA, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon (regiões preferidas para éxons de distrofina são identificadas na Tabela 2 ou Tabela 6), em que o referido oligonucleotídeo é capaz de induzir o salto do referido primeiro e segundo éxons do referido pré-mRNA, resultando em transcrição que está in frame (de preferência para DMD como na Tabela 1 ou Tabela 6). O referido oligonucleotídeo fornecendo o referido indivíduo com uma proteína funcional ou semi-funcional, e o referido oligonucleotídeo compreendendo ainda: uma sequência que é capaz de se ligar a, se direcionar para, hibridizar com, é complementar reversa a, e/ou é capaz de inibir uma função de um ou mais sítios de ligação para uma proteína serina- arginina (SR) no RNA de um éxon de um pré-mRNA.

[041] No pedido de patente WO 2006/112705 foi revelada a presença de uma correlação entre a eficácia de um oligonucleotídeo anti-sentido éxon-interno (AON) para induzir o salto de éxon e a presença de um sítio de ligação putativo SR no local do pré-mRNA alvo do referido AON. Portanto, em uma modalidade, o referido oligonucleotídeo tal como aqui definido é gerado compreendendo a determinação de um ou mais sítios de ligação (putativos) para uma proteína SR no RNA do referido primeiro e/ou do referido éxon e produzindo um oligonucleotídeo correspondente que é capaz de se ligar a, se direcionar a, hibridizar com, e/ou é complementar reverso ao referido RNA, e que sobrepõe, pelo menos em parte, o referido sítio de ligação (putativo). O termo “pelo menos parcialmente se sobrepõe” é aqui definido como para compreender uma sobreposição de apenas um único nucleotídeo de um sítio de ligação SR, bem como vários nucleotídeos de um ou mais dos referidos sítios de ligação, bem como uma sobreposição completa de uma ou mais sítios de ligação. Esta modalidade ainda, preferencialmente, compreende a determinação de uma estrutura secundária de um primeiro e/ou segundo éxon, uma região que é hibridizada para outra parte do referido primeiro e/ou segundo éxon (estrutura fechada) e uma região que não é hibridizada, em que a referida estrutura (estrutura aberta), e, subsequentemente, gerando um oligonucleotídeo que sobrepõe, pelo menos em parte, um ou mais dos referidos sítios de ligação (putativos), e que sobrepõe pelo menos parte da referida estrutura fechada, e sobrepõe pelo menos parte da referida estrutura aberta e com a ligação a, direcionamento para, hibridização com e/ou sendo complementar reverso a ambos os primeiro e segundo éxons. Deste modo, aumentar a probabilidade de se obter um oligonucleotídeo que é capaz de interferir com a inclusão dos referidos primeiro e segundo éxons, e se for o caso de todo o trecho de éxons no meio, a partir do pré-mRNA no mRNA. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria pensa-se atualmente que a utilização de um oligonucleotídeo dirigido a um sítio de ligação de proteína SR resulta em (pelo menos parcialmente) enfraquecimento da ligação de uma proteína SR para o referido sítio de ligação, que resulta em splicing interrompido ou prejudicado.

[042] De preferência, uma região de um primeiro éxon e/ou uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA de um oligonucleotídeo da invenção é capaz de se ligar a, compreende uma estrutura aberta/fechada, e/ou um sítio de ligação da proteína SR, mais de preferência, a referida estrutura aberta/fechada e o referido sítio de ligação da proteína SR parcialmente se sobrepõem, e ainda mais preferido que a referida estrutura aberta/fechada sobreponha completamente um sítio de ligação da proteína SR, ou um sítio de ligação da proteína SR sobreponha completamente uma estrutura aberta/fechada. Isto permite uma ruptura melhorada adicional de inclusão éxon.

[043] Além de sequências de sítios de consenso de splice, muitos (se não todos) éxons contêm sequências reguladoras de splicing tal como sequências de ativador exônico de splicing (ESE) para facilitar o reconhecimento dos sítios de splicinggenuínos pelo spliceossoma (Cartegni L, et al. 2002;. E Cartegni L, et al, 2003). Um subgrupo de fatores de splicing, denominado de proteínas SR, pode ligar- se a estes ESEs e recrutar outros fatores de splicing, como Ul e U2AF para (fracamente definidos) os sítios de splice. Os sítios de ligação das quatro proteínas mais abundantes SR (SF2/ASF, SC35, SRp40 e SRp55) foram analisados em detalhes (Cartegni L, et al., 2002) e Cartegni L, et al, 2003). Há uma correlação entre a eficácia de um oligonucleotídeo e a presença/ausência de um sítio de ligação SF2/ASF, SC35, e SRp40 e SRp55 em uma parte de um primeiro éxon ligado por,hibridizado por, e/ou direcionado pelo oligonucleotídeo. Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona, assim, um oligonucleotídeo, que se liga a, hibridiza com, se direciona para, e/ou é complementar reverso a um sítio de ligação para uma proteína SR. De preferência, a referida proteína SR é SF2/ASF ou SC35, SRp40 ou SRp55. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo se liga a, hibridiza com, se direciona para, e/ou é complementar reverso a um sítio de ligação para um SF2/ASF, SC35, SRp40, ou proteína SRp55 em um primeiro éxon e um sítio de ligação para uma proteína SF2/ASF, SC35, SRp40, ou SRp55 em um segundo éxon. Em uma modalidade mais preferida, o oligonucleotídeo se liga a, hibridiza com, se direciona para e/ou é complementar reverso a um sítio de ligação para uma proteína SF2/ASF, SC35, SRp40, ou SRp55 em um primeiro éxon, e um sítio de ligação correspondente para uma proteína SF2/ASF, SC35, SRp40, ou SRp55 semelhante em um segundo éxon.

[044] Em uma modalidade um paciente é fornecido com uma proteína funcional ou semi-funcional, utilizando um oligonucleotídeo que é capaz de ligação, direcionando uma sequência de RNA reguladora presente em um primeiro e/ou segundo éxon que é necessário para o processamento correto do referido éxon (s) em um transcrito. São necessárias várias sequências cis-atuantes de RNA para o splicing correto de éxons em um transcrito. Em particular, elementos suplementares, tais como ativadores exônicos de splicing (ESEs) são identificados para regular o splicingespecífico e eficiente de éxons alternativos e constitutivos. Utilizando um composto que compreende um oligonucleotídeo que se liga a ou que seja capaz de se ligar a um dos elementos suplementares no referido primeiro e/ou segundo éxon(s), a sua função reguladora é perturbada de modo que os éxons são saltados. Assim, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo da invenção é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon a partir de um pré-mRNA, e à região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon, em que o referido oligonucleotídeo é capaz de induzir o salto do referido primeiro e segundo éxons do referido pré-mRNA; em que a referida região do referido primeiro éxon e/ou a referida região do referido segundo éxon compreende um ativador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS), e/ou uma sequência ativadora de splicing (SES), e/ou em que o referido oligonucleotídeo é capaz de se ligar a, se direcionar para, é capaz de inibir e/ou é complementar reverso ao referido ativador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS), e/ou uma sequência ativadora de splicing (SES),

[045] Abaixo são descritas químicas preferidas do oligonucleotídeo da invenção.

[046] Um oligonucleotídeo é normalmente conhecido como um oligômero que tem características de hibridização básicas semelhantes aos ácidos nucleicos naturais. A hibridização foi definida na parte dedicada às definições no fim da descrição da invenção. Dentro deste pedido, o termo oligonucleotídeo e oligômero são utilizados indiferentemente. Diferentes tipos de nucleosídeos podem ser usados para gerar o referido oligonucleotídeo da invenção. Um oligonucleotídeo pode compreender, pelo menos, uma ligação de internucleosídeos modificada, e/ou pelo menos uma modificação de açúcar, e/ou pelo menos uma modificação de base, em comparação com um oligonucleotídeo à base de ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo que ocorre naturalmente.

[047] Uma “ligação de internucleosídeos modificada” indica a presença de uma versão modificada do fosfodiéster como ocorre naturalmente no RNA e DNA. Exemplos de modificações de ligação de internucleosídeos que são compatíveis com a presente invenção são fosforotioato (PS), fosforotioato quiralmente puro, fosforoditioato (PS2), fosfonoacetato (PACE), fosfonoacetamida (PACA), tiofosfoacetato, tiofosfonoacetamida, pró-fármaco de fosforotioato, H-fosfonato, metil fosfonato, metil fosfonotioato, metil fosfato, metil fosforotioato, etil boranofosforotioato, metil boranofosfato, metil boranofosforotioato, metil boranofosfonato, metil boranofosfonotioato, e derivados dos mesmos. Outra modificação inclui fosforamidito, fosforoamidato, N3’P5’, fosforoamidato, fosforodiamidato, fosforotioamidato, fosforotiodiamidato, sulfamato, dimetilenosulfóxido, sulfonato, metileneimino (MMI), oxalil e ácido nucleico tioacetamido (ANAT), e seus derivados. Dependendo do seu comprimento, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 modificações de cadeia principal. Também está englobado pela invenção para introduzir mais do que uma modificação de cadeia principal distinta no referido oligonucleotídeo.

[048] Também abrangido no escopo da invenção está um oligonucleotídeo que compreende uma ligação de internucleosídeos que pode ser diferente no que respeito aos átomos de nucleosídeos que são conectados uns aos outros, quando comparada com a ligação de internucleosídeos de ocorrência natural. A este respeito, o oligonucleotídeo da invenção pode compreender, pelo menos, uma ligação de internucleosídeos contruída como monômeros ligados 3'-3', 5'-5', 2'-3', 2'-5', 2'-2'. A numeração da posição pode ser diferente de outras substâncias químicas, mas a ideia permanece dentro do escopo da invenção.

[049] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo da presente invenção compreende pelo menos uma modificação de fosforotioato. Em uma modalidade mais preferida, um oligonucleotídeo da invenção é totalmente fosforotioato modificado.

[050] Uma “modificação de açúcar” indica a presença de uma versão modificada da porção de ribosil conforme ocorre naturalmente em RNA e DNA (ou seja, a porção furanosil), tais como açúcares bicíclicos, tetrahidropiranos, morfolinos, açúcares 2'-modificados, açúcares 3'- modificados, açúcares 4'-modificados, açúcares 5'- modificados, e açúcares 4'-substituíveis. Exemplos de modificações de açúcar adequadas incluem, mas não estão limitadas a, resíduos de nucleotídeos 2'-O-modificados RNA, tais como 2'-O-alquil ou 2'-O-(substituído)alquil, por exemplo, 2'-O-metil, 2'-O-(2-cianoetil), 2'-O-(2- metoxi)etil (2'-MOE), 2'-O-(2-tiometil)etil, 2'-O-butiril, 2'-O-propargil, 2'-O-alil, 2'-O-(2-amino)propil, 2'-O-(2- (dimetilamino)propil), 2'-O-(3-amino)propil, 2'-O-(3- (dimetilamino)propil), 2'-O-(2-amino)etil, 2'-O-(3- guanidino)propil (como descrito no pedido de patente WO 2013/061295, Universidade de Witwatersrand, incorporado aqui na sua totalidade por referência), 2'-O-(2- (dimetilamino)etil); 2'-O-(haloalcoxi)metil (Arai K. et al.), por exemplo, 2'-O-(2-cloroetoxi)metil (MCEM), 2'-O- (2,2-dicloroetoxi)metil (DCEM); 2'-O-alcoxicarbonil, por exemplo, 2'-O-[2-(metoxicarbonil)etil] (MOCE), 2'-O-[2-(N- metilcarbamoil)etil] (MCE), 2'-O-[2-(N,N- dimetilcarbamoil)etil] (DMCE); 2'-O- [metilaminocarbonil]metil; 2'-azido; 2'-amino e 2'-amido substituído; 2'-halo, por exemplo F, FANA (ácido nucleico 2'-F-arabinosil de); modificações carba-açúcar e aza-açúcar; 3'-O-alquil, por exemplo 3'-O-metil, 3'-O-butiril, 3'-O- propargil; 2',3'-didesóxi, e seus derivados. Outra modificação de açúcar inclui porções de açúcar modificadas de ácido nucleico “em ponte” ou “bicíclico” (BNA), tais como as encontradas em, por exemplo, ácido nucleico bloqueado (LNA), xylo-LNA, α-LNA, β-D-LNA, cEt (2'-O, 4'-C etil constrangido) LNA, cMOEt (2'-O,4'-C metoxietil constrangido) LNA, ácido nucleico etileno-em ponte (ENA), BNANC[N-Me] (como descrito em Chem. Commun. 2007, 3765-3767 Kazuyuki Miyashita et al, que é aqui incorporado na sua totalidade por referência), CRNs como descrito no pedido de patente WO 2013/036868 (Marina Biotech, incorporado aqui na sua totalidade por referência); ácido nucleico desbloqueado (UNA) ou outros nucleosídeos acíclicos, tais como os descritos no pedido de patente US 2013/0130378 (Alnylam Pharmaceuticals), incorporado aqui na sua totalidade por referência; BNA 5'-metil substituído (como descrito no pedido de patente US 13/530,218, que é incorporado na sua totalidade por referência); ácido nucleico ciclohexenil (CeNA), ácido nucleico altriol (ANA), ácido nucleico hexitol (HNA), hNA fluorado (F-HNA), piranosil-RNA (p-ARN), 3'- desoxipiranosil-DNA (p-DNA); ou outras porções de açúcar modificadas, tais como morfolino (PMO), morfolino catiônico (PMOPlus), PMO-X; tricycloDNA; triciclo-PS-DNA, e seus derivados. Derivados de BNA são, por exemplo, descritos no documento WO 2011/097641, o qual é aqui incorporado na sua totalidade por referência. Exemplos de PMO-X são descritos em WO2011150408, que é incorporado aqui na sua totalidade por referência. Dependendo do seu comprimento, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 modificações de açúcar. Também está abrangido pela invenção para introduzir mais do que uma modificação de açúcar distinta no referido oligonucleotídeo.

[051] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreende pelo menos uma modificação de açúcar selecionada a partir de 2'-O-metil, 2'-O-(2- metoxi)etil, 2'-F, morfolino, um nucleotídeo em ponte ou BNA, ou o oligonucleotídeo compreende ambos os nucleotídeos em ponte e nucleotídeos 2'-desóxi (mixmers BNA/DNA). Os oligonucleotídeos compreendendo um nucleotídeo 2'-flúor(2- 'F) têm sido mostrados em serem capazes de recrutar o fator de ligação ativador de interleucina 2 e 3 (ILF2/3), e é assim capaz de induzir o salto do éxon no pré-mRNA alvo (Rigo F, et al, WO2011/097614).

[052] Em outra modalidade, um oligonucleotídeo como aqui definido compreende ou consiste de um LNA ou um derivado do mesmo. Mais de preferência, o oligonucleotídeo de acordo com a invenção é modificado ao longo do seu comprimento total com uma modificação de açúcar selecionada a partir de 2'-O- metil, 2'-O-(2-metoxi)etil, morfolino, ácido nucleico em ponte (BNA) ou mixmer BNA/DNA. Em uma modalidade mais preferida, um oligonucleotídeo da invenção é 2'-O-metil totalmente modificado.

[053] Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo da presente invenção compreende pelo menos uma modificação de açúcar e pelo menos uma ligação de internucleosídeos modificada. Tais modificações incluem ácido nucleico à base de peptídeo (PNA), PNA agrupamento- boro modificado, ácido nucleico peptídeo-oxi baseado em pirrolidona (POPNA), ácido nucleico à base de glicerol ou glicol (GNA), ácido nucleico à base de treose (TNA), ácido nucleico à base de treoninol acíclico (aTNA), oligonucleotídeos à base de morfolino (PMO, PPMO, PMO-X), oligômeros à base de morfolino catiônicos (PMOPlus, PMO-X),e oligonucleotídeos com cadeias principais integradas (ONIBs), oligonucleotídeos amida-pirrolidina (POMs); e seus derivados. Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo da invenção compreende uma cadeia principal peptídica de ácido nucleico e/ou uma cadeia principal de fosforodiamidato morfolino ou um derivado do mesmo. Em uma modalidade mais preferida, o oligonucleotídeo de acordo com a invenção é 2'-O-metil fosforotioato modificado, ou seja, compreende pelo menos uma modificação de 2'-O-metil- fosforotioato, de preferência, o oligonucleotídeo de acordo com a invenção é 2'-O-fosforotioato metil totalmente modificado. De preferência, o oligonucleotídeo modificado de 2'-O-metil fosforotioato ou o oligonucleotídeo totalmente modificado de 2'-O-metil fosforotioato é um oligonucleotídeo de RNA.

[054] O termo “modificação de base” ou “base modificada” como aqui identificado refere-se à modificação de uma base que ocorre naturalmente no RNA e/ou DNA (ou seja, base pirimidina ou purina), ou à bases sintetizadas de novo. Tais bases sintetizadas de novo poderiam ser qualificadas como “modificadas” por comparação com uma base existente.

[055] Em adição às modificações acima descritas, o oligonucleotídeo da invenção pode compreender modificações adicionais, tais como tipos diferentes de resíduos de nucleotídeos de ácido nucleico ou de nucleotídeos, como descrito abaixo. Diferentes tipos de resíduos de nucleotídeos de ácido nucleico podem ser utilizados para gerar um oligonucleotídeo da invenção. O referido oligonucleotídeo pode possuir pelo menos uma modificação de cadeia principal, e/ou uma modificação de açúcar e/ou pelo menos uma modificação de base em comparação com um oligonucleotídeo baseado em RNA ou DNA.

[056] Um oligonucleotídeo pode compreender as bases purinas naturais (adenina, guanina), ou pirimidinas (citosina, timina, uracila) e/ou bases modificadas, tal como definidas abaixo. Dentro do contexto da invenção, uma uracila pode ser substituída por uma timina.

[057] Uma modificação de base inclui uma versão modificada das bases purina e pirimidina naturais (por exemplo, adenina, uracila, guanina, citosina, e timina), tais como hipoxantina, ácido orótico, agmatidina, lisidina, pseudouracila, pseudotimina, pseudouracila N1-metil, 2- tiopirimidina (por exemplo, 2-tiouracila, 2-tiotimina), 2,6- diaminopurina, G-clamp. e seus derivados, pirimidina 5- substituída (por exemplo 5-halouracila, 5-metiluracila, 5- metilcitosina, 5-propiniluracila, 5-propinilcitosina , 5- aminometiluracila, 5-hidroximetiluracila, 5- aminometilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, Super T), 5- octilpirimidina, 5-tiofenepirimidina, 5-octin-1- ilpirimidina, 5-etinilpirimidina, 5-(piridilamida), 5- isobutil, 5-fenil, conforme descrito no pedido de patente US 2013/0131141 (RXi), incorporado aqui na sua totalidade por referência; 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, 7-aza-2,6- diaminopurina, 8-aza-7-desazaguanina, 8-aza-7-desaza- adenina, 8-aza-7-desaza-2,6-diaminopurina, Super G , Super A, e N4-etilcitosina, ou seus derivados; N2- ciclopentilguanina (cPent-G), N2-ciclopentil-2-aminopurina (cPent-AP), e N2-propil-2-aminopurina (Pr-AP), ou seus derivados; e bases degeneradas ou universais, como 2,6- difluorotolueno ou bases ausentes, tais como sítios abásicos (por exemplo, 1-desoxirribose, 1,2-didesoxiribose, 1-desoxi- 2-O-metilribose, ou os derivados da pirrolidina, em que o oxigênio do anel foi substituído com nitrogênio (azaribose)). Exemplos de derivados de Super A, Super G e Super T podem ser encontrados na patente US 6,683,173 (Epoch Biosciences), que é aqui incorporada integralmente por referência. cPent-G, cPent-AP e Pr-AP foram mostrados para reduzir os efeitos imunoestimulantes quando incorporados em siRNA (Peacock H. et al.), e características semelhantes foram mostradas para pseudouracila e N1-metilpseudouracila (pedido de patente US 2013/0123481, modeRNA Therapeutics, incorporado aqui integralmente por referência).

[058] “Timina” e “5-metiluracila” podem ser trocadas entre si ao longo do documento. Em analogia, “2,6- diaminopurina” é idêntica a “2-aminoadenina”, e estes termos podem ser trocados entre si ao longo do documento.

[059] Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo da presente invenção compreende pelo menos uma base de 5-metilcitosina e/ou pelo menos uma 5- metiluracila e/ou pelo menos uma 2,6-diaminopurina, que é para ser entendido que pelo menos uma das nucleobases de citosina do referido oligonucleotídeo foi modificada por substituição do próton na posição 5 do anel de pirimidina com um grupo metil (ou seja, uma 5-metilcitosina), e/ou que pelo menos uma das nucleobases de uracila do referido oligonucleotídeo foi modificada por substituição do próton na posição 5 do anel de pirimidina com um grupo metil (ou seja, uma 5-metiluracila), e/ou que pelo menos uma das nucleobases adenina do referido oligonucleotídeo foi modificada por substituição do próton na posição 2 com um grupo amino (isto é, uma 2,6-diaminopurina), respectivamente. Dentro do contexto da presente invenção, a expressão “a substituição de um próton com um grupo metil na posição 5 do anel de pirimidina” pode ser substituída pela expressão “a substituição de uma pirimidina com uma 5- metilpirimidina,” com a pirimidina referindo-se apenas à uracila, apenas à citosina ou a ambas. Do mesmo modo, dentro do contexto da invenção, a expressão “a substituição de um próton com um grupo amino na posição 2 da adenina” pode ser substituída pelo termo “substituição de uma adenina com uma 2,6-diaminopurina”. Se o referido oligonucleotídeo tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais citosinas, uracilas, e/ou adeninas, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais citosinas, uracilas e/ou adeninas respectivamente podem ter sido modificadas dessa forma. Em uma modalidade preferida, todas as citosinas, todas asuracilas e/ou todas as adeninas foram modificadas desta maneira, ou substituídas por 5- metilcitosina, 5-metiluracila e/ou 2,6-diaminopurina, respectivamente.

[060] Foi verificado que a presença de uma 5- metilcitosina, 5-metiluracila e/ou uma 2,6-diaminopurina em um oligonucleotídeo da invenção tem um efeito positivo em pelo menos um dos parâmetros, ou uma melhoria de pelo menos um dos parâmetros do referido oligonucleotídeo. Neste contexto, os parâmetros podem incluir: afinidade de ligação e/ou cinética, atividade de silenciamento, bioestabilidade, distribuição (intra-tecido), captação celular e/ou tráfico, e/ou imunogenicidade do referido oligonucleotídeo, tal como explicado abaixo.

[061] Uma vez que várias modificações, como mencionadas acima, são conhecidas por aumentar o valor Tm e desse modo aumentar a ligação de um determinado nucleotídeo ao seu correspondente no seu mRNA alvo, estas modificações podem ser exploradas para promover a ligação de um oligonucleotídeo da invenção com ambas uma região de um primeiro e de um segundo éxon no contexto da invenção. Uma vez que as sequências de um oligonucleotídeo da presente invenção podem não ser 100% complementar reversa para uma dada região de um primeiro éxon e/ou de um segundo éxon, modificações que aumentam Tm, tal como um nucleotídeo em ponte ou BNA (tal como LNA), ou uma modificação de base selecionada a partir de 5-metilpirimidinas e/ou 2,6- diaminopurina pode ser implementada de preferência em uma posição do nucleotídeo que é complementar reversa para a referida primeira e/ou a referida segunda região dos referidos éxons.

[062] A afinidade de ligação e/ou ligação ou cinética de hibridização depende das propriedades termodinâmicas do AON. Estas são pelo menos em parte, determinadas pela temperatura de fusão do referido oligonucleotídeo (Tm; calculado com, por exemplo, a calculadora de propriedades de oligonucleotídeos(http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html ouhttp://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) para o RNA de cadeia simples, usando a Tm de base e o modelo de vizinho mais próximo) e/ou a energia livre do complexo de éxon do oligonucleotídeo-alvo (utilizando a estrutura do RNA versão 4.5 ou RNA mfold versão 3.5). Se uma Tm é aumentada, a atividade de salto do éxon tipicamente aumenta, mas quando uma Tm é muito elevada, o AON deverá tornar-se menos sequência-específico. Uma Tm aceitável e energia livre dependem da sequência do oligonucleotídeo. Portanto, é difícil para gerar intervalos preferidos para cada um destes parâmetros.

[063] Uma atividade de um oligonucleotídeo da invenção é de preferência definida da seguinte forma:- aliviar um ou mais sintoma(s) de uma doença associada a uma mutação presente em uma primeira e/ou em uma segunda e/ou uma mutação presente no interior do trecho iniciando no referido primeiro e terminando no referido segundo éxon, de preferência aliviando um ou mais sintoma(s) de DMD ou BMD; e/ou- aliviar uma ou mais características de uma célula de um paciente, de preferência uma célula muscular de um paciente; e/ou- fornecer ao referido indivíduo com uma proteína funcional ou semi-funcional, de preferência uma proteína de distrofina funcional ou semi-funcional; e/ou- pelo menos em parte diminuir a produção de uma proteína aberrante no referido indivíduo, de preferência, pelo menos em parte, diminuir a produção de uma proteína de distrofina aberrante no referido indivíduo. Cada um desses recursos e ensaios para a avaliação dos mesmos foi definido mais adiante.

[064] Um oligonucleotídeo preferido da invenção, que compreende uma base de 5-metilcitosina e/ou uma 5- metiluracila e/ou uma base de 2,6-diaminopurina é esperado em exibir um aumento da atividade por comparação com a atividade correspondente de um oligonucleotídeo sem qualquer base 5-metilcitosina, sem qualquer 5-metiluracila, e sem qualquer 2,6-diaminopurina. Esta diferença em termos de atividade pode ser de pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%. Biodistribuição e bioestabilidade são, de preferência, pelo menos em parte determinadas por um ensaio de ligação de hibridização validado adaptado de Yu et al., 2002. Em uma modalidade, as amostras de tecidos homogeneizados ou de plasma são incubadas com uma sonda de captura de oligonucleotídeo específica. Após a separação, um oligonucleotídeo marcado com DIG é ligado ao complexo e a detecção seguida usando uma peroxidase ligada ao anticorpo anti-DIG. A análise farmacocinética não compartimental é realizada usando o pacote de software WINNONLIN (modelo 200, versão 5.2, Pharsight, Mountainview, CA). Os níveis de AON (μg) por mL de plasma ou mg de tecido são monitorizados ao longo do tempo para avaliar a área sob a curva (AUC), a concentração de pico (Cmax), tempo para atingir a concentração (Tmáx), a meia-vida terminal, e a desfasagem da absorção (tlag). Tal ensaio preferido foi descrito na parte experimental. Um oligonucleotídeo pode estimular uma resposta imune inata por ativação dos receptores do tipo Toll (TLR), incluindo TLR9 e TLR7 (Krieg A.M., et al., 1995). A ativação de TLR9 normalmente ocorre devido à presença de sequências de CG não metiladas presentes nos oligodesoxinucleotídeos (ODNs), imitando o DNA bacteriano que ativa o sistema imune inato através da liberação de citocina mediada por TLR9. A modificação 2'-O-metil pode, no entanto, reduzir significativamente tal efeito possível. TLR7 foi descrito para reconhecer repetições uracila em RNA (Diebold S.S., et al., 2006).

[065] A ativação de TLR9 e TLR7 resulta em um conjunto de respostas imunes coordenadas que incluem a imunidade inata (macrófagos, células dendríticas (DC), e as células NK) (Krieg A.M. et al, 1995; Krieg A.M., 2000). Várias quimio- e citocinas, tais como IP-10, TNF-α, IL-6, MCP-1 e IFNα (Wagner H., et al, 1999; Popovic P.J., et al., 2006) têm sido implicadas neste processo. As citocinas inflamatórias atraem células defensivas adicionais do sangue, tais como as células T e B. Os níveis destas citocinas podem ser investigados por testes in vitro. Em suma, o sangue humano total é incubado com concentrações crescentes de oligonucleotídeos após o que os níveis das citocinas são determinados por kits padrão de ELISA disponíveis comercialmente. Uma diminuição na imunogenicidade preferencialmente corresponde a uma diminuição detectável da concentração de pelo menos uma das citocinas mencionadas acima por comparação com a concentração de citocina correspondente, em um ensaio em uma célula tratada com um oligonucleotídeo compreendendo, pelo menos, uma 5-metilcitosina e/ou 5-metiluracila, e/ou 2,6- diaminopurina em comparação com uma célula tratada com um oligonucleotídeo correspondente que não possui 5- metilcitosinas, 5-metiluracilas, ou 2,6-diaminopurinas.

[066] Assim, um oligonucleotídeo preferido da invenção tem um parâmetro melhorado, tal como uma imunogenicidade aceitável ou diminuída e/ou uma melhor biodistribuição e/ou aceitável ou cinéticas de ligação de RNA melhoradas e/ou propriedades termodinâmicas por comparação com um oligonucleotídeo correspondente sem uma 5- metiluracila, e sem uma 2,6-diaminopurina. Cada um destes parâmetros poderia ser avaliado usando ensaios conhecidos do técnico especialista no assunto.

[067] Um oligonucleotídeo preferido da invenção compreende ou consiste de uma molécula de RNA ou uma molécula de RNA modificada. Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo é de cadeia simples. O técnico especialista no assunto entenderá que é, no entanto possível que um único oligonucleotídeo de cadeia simples pode formar uma estrutura de cadeia dupla interna. No entanto, este oligonucleotídeo é ainda denominado de um oligonucleotídeo de cadeia simples no contexto da presente invenção. Um oligonucleotídeo de cadeia simples tem várias vantagens em comparação com um siRNA de cadeia dupla oligonucleotídica: (i) a sua síntese está prevista para ser mais fácil do que duas cadeias de siRNA complementares; (ii) existe uma ampla gama de modificações químicas possíveis para aumentar a absorção nas células, uma melhor estabilidade (fisiológica), e para diminuir os potenciais efeitos adversos genéricos; (iii) siRNAs têm um maior potencial de efeitos não-específicos (incluindo genes fora do alvo), e farmacologia exagerada (por exemplo, menor possibilidade de controle da eficácia e seletividade pelo esquema de tratamento ou dose) (iv) siRNAs são menos propensos a agir no núcleo, e não podem ser dirigidos contra íntrons.

[068] Em uma modalidade, um oligonucleotídeo da invenção compreende um sítio abásico ou um monômero abásico. Dentro do contexto da invenção, tal monômero pode ser chamado de um sítio abásico ou um monômero abásico. Um monômero abásico é um resíduo de nucleotídeo ou um bloco de construção que carece de uma nucleobase, em comparação com um resíduo de nucleotídeo correspondente compreendendo uma nucleobase. Dentro do contexto da invenção, um monômero abásico é, portanto, uma parte de um bloco de construção de um oligonucleotídeo, mas que carece de uma nucleobase. Tal monômero abásico pode estar presente, ou acoplado, ou ligado, ou conjugado com um terminal livre de um oligonucleotídeo.

[069] Em uma modalidade mais preferida, um oligonucleotídeo da invenção compreende de 1 a 10 ou mais monômeros abásicos. Portanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais monômeros abásicos podem estar presentes em um oligonucleotídeo da invenção.

[070] Um monômero abásico pode ser de qualquer tipo conhecido e concebível por uma Técnico especialista no assunto, exemplos não limitativos dos quais são descritosabaixo:

[071] Aqui, R1 e R2 são independentemente H, um oligonucleotídeo ou outro sítio(s) abásico, desde que não ambos R1 e R2 sejam H, e R1 e R2 não sejam ambos um oligonucleotídeo. Um monômero(s) abásico pode estar ligado em qualquer um ou ambos os terminais do oligonucleotídeo, conforme especificado anteriormente. Deve ser notado que um oligonucleotídeo ligado a um ou dois sítio(s) abásicos ou monômero(s) abásicos, pode compreender menos do que 10 nucleotídeos. A este respeito, o oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode compreender pelo menos 10 nucleotídeos, opcionalmente incluir um ou mais sítios abásicos ou monômeros abásicos em um ou ambos os terminais. Outros exemplos de sítios abásicos que são abrangidos pela invenção são descritos no pedido de patente US 2013/013378 (Alnylam Pharmaceuticals), incorporado aqui na sua totalidade por referência.

[072] Dependendo do seu comprimento, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 modificações de bases. Também está englobado pela invenção introduzir mais do que uma modificação de base distinta no referido oligonucleotídeo.

[073] Deste modo, em uma modalidade o oligonucleotídeo, de acordo com um aspecto da invenção, compreende:(a) pelo menos uma modificação de base selecionada a partir de 2-tiouracila, 2-tiotimina, 5-metilcitosina, 5- metiluracila, timina, 2,6-diaminopurina; e/ou (b) pelo menos uma modificação de açúcar selecionada a partir de 2'-O-metil, 2'-O-(2-metoxi)etil, 2'-O-desóxi (DNA), 2'-F, morfolino, um nucleotídeo em ponte ou BNA, ou o oligonucleotídeo compreende ambos os nucleotídeos em ponte e 2'-desoxi nucleotídeos modificados (mixmers BNA/DNA); e/ou(c) pelo menos uma modificação de cadeia principal selecionada a partir de fosforotioato ou fosforodiamidato.

(074] Em outra modalidade o oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreende:(a) pelo menos uma modificação de base selecionada a partir de 5-metilpirimidina e 2,6-diaminopurina; e/ou(b) pelo menos uma modificação de açúcar, que é 2'-O- metil; e/ou(c) pelo menos uma modificação da cadeia principal, que é fosforotioato.

[075] Em uma modalidade, um oligonucleotídeo da invenção compreende pelo menos uma modificação em comparação com um oligonucleotídeo de ocorrência natural à base de ribonucleotídeo ou de desoxirribonucleotídeo, mais preferivelmente(a) pelo menos uma modificação de base, de preferência selecionada dentre 2-tiouracila, 2-tiotimina, 5- metilcitosina, 5-metiluracila, timina, 2,6-diaminopurina, mais preferencialmente selecionada a partir de 5- metilpirimidina e 2,6-diaminopurina; e/ou (b) pelo menos uma modificação de açúcar, de preferência selecionada a partir de 2'-O-metil, 2'-O-(2- metoxi)etil, 2'-O-desoxi (DNA), 2'-F, morfolino, um nucleotídeo em ponte ou BNA, ou o oligonucleotídeo compreende ambos os nucleotídeos em ponte e os nucleotídeos 2'-desoxi modificados (mixmers BNA/DNA), mais de preferência, a modificação do açúcar é 2'-O-metil; e/ou(c) pelo menos uma modificação da cadeia principal, de preferência selecionada a partir de fosforotioato ou fosforodiamidato, mais preferencialmente a modificação da cadeia principal é fosforotioato.

[076] Assim, um oligonucleotídeo de acordo com esta modalidade da invenção compreende uma modificação da base (a), e nenhuma modificação de açúcar (b), e nenhuma modificação da cadeia principal (c). Outro oligonucleotídeo preferido de acordo com este aspecto da invenção compreende uma modificação do açúcar (b), e nenhuma modificação de base (a), e nenhuma modificação da cadeia principal (c). Outro oligonucleotídeo preferido de acordo com este aspecto da invenção compreende uma modificação da cadeia principal (c), e nenhuma modificação de base (a), e nenhuma modificação de açúcar (b). Além disso, os oligonucleotídeos possuindo nenhuma das modificações mencionadas acima são entendidos para serem englobados pela presente invenção, bem como os oligonucleotídeos compreendendo duas, ou seja, (a) e (b), (a) e (c), e/ou (b) e (c), ou todas as três das modificações (a), (b) e (c), como definido acima.

[077] Em uma modalidade preferida, o oligonucleotídeo de acordo com a invenção é modificado ao longo de todo o seu comprimento, com uma ou mais da mesma modificação, selecionada a partir de (a) uma das modificações de base; e/ou (b) uma das modificações de açúcar; e/ou (c) uma das modificações da cadeia principal.

[078] Com o advento da tecnologia de mimetização de ácido nucleico, tornou-se possível gerar moléculas que têm semelhantes, de preferência as mesmas características de hibridização em espécie não necessariamente em quantidade, como o próprio ácido nucleico. Esses equivalentes funcionais são, obviamente, também adequados para utilização na invenção.

[079] Em outra modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende uma inosina, uma hipoxantina, uma base universal, uma base degenerada e/ou um nucleosídeo ou nucleotídeos contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação ou um equivalente funcional da mesma. O uso de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção é muito atrativo, tal como explicado abaixo. Inosina, por exemplo, é uma base modificada conhecida, que pode emparelhar com três bases: uracila, adenina, e citosina. Inosina é um nucleóosídeo que é formado quando a hipoxantina está ligada a um anel de ribose (também conhecido como uma ribofuranose), através de uma ligação β [beta]-N9-glicosídica. Inosina (I) é geralmente encontrada em tRNAs e é essencial para a tradução adequada do código genético, em pares de bases de oscilação. Um par de bases de oscilação pode existir entre G e U, ou entre I e U por um lado, e A ou C, por outro lado. Isto é importante na formação da estrutura secundária do RNA. A sua estabilidade termodinâmica é comparável à do par de bases de Watson-Crick. O código genético compensa a disparidade no número de aminoácidos (20) para códons tripleto (64), por meio de pares de bases modificadas na primeira base do anti-códon.

[080] Uma primeira vantagem da utilização de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção permite conceber um oligonucleotídeo que é capaz de se ligar a uma região de um primeiro éxon a partir de um pré-mRNA, e é capaz de se ligar a uma região de um segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon. Em outras palavras, a presença de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base de degenerada e/ou um de nucleotídeos contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção permite a ligação do referido oligonucleotídeo a uma região de um primeiro éxon e a uma região de um segundo éxon do referido pré-mRNA.

[081] Uma segunda vantagem do uso de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção permite conceber um oligonucleotídeo que abrange um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), sem a preocupação de que o polimorfismo possa atrapalhar a eficiência de emparelhamento do oligonucleotídeo. Por conseguinte, na invenção, a utilização de uma tal base permite conceber um oligonucleotídeo que pode ser utilizado por um indivíduo que tem um SNP dentro do trecho de pré-mRNA que é direcionado por um oligonucleotídeo da invenção.

[082] Uma terceira vantagem do uso de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção é quando o referido oligonucleotídeo normalmente contém um CpG se alguém tivesse concebido como sendo complementar a uma parte de um primeiro pré-mRNA de éxon, tal como aqui identificado. A presença de um CpG em um oligonucleotídeo está geralmente associada com um aumento da imunogenicidade do referido oligonucleotídeo (Dorn A. e Kippenberger S.,). Este aumento da imunogenicidade é indesejável, pois pode induzir à destruição das fibras musculares. Substituindo a guanina por uma inosina em um, dois ou mais CpGs no referido oligonucleotídeo é esperado para fornecer um oligonucleotídeo com um ou nível diminuído e/aceitável de imunogenicidade. A imunogenicidade pode ser avaliada em um modelo animal através da avaliação da presença de células CD4+e/ou CD8+e/ou infiltração de mononucleócitos inflamatórios em biópsias musculares do referido animal. A imunogenicidade pode também ser avaliada no sangue de um animal ou de um ser humano tratado com um oligonucleotídeo da invenção através da detecção da presença de um anticorpo neutralizante e/ou um anticorpo que reconhece o referido oligonucleotídeo utilizando um imunoensaio padrão conhecido pelo técnico especialista no assunto. Um aumento na imunogenicidade de preferência corresponde a um aumento detectável de pelo menos um destes tipos de células em comparação com a quantidade de cada tipo de célula em uma biópsia do músculo correspondente de um animal antes do tratamento ou tratado com um oligonucleotídeo correspondente que tem pelo menos uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação. Alternativamente, um aumento na imunogenicidade pode ser avaliado através da detecção da presença ou de uma quantidade crescente de um anticorpo neutralizante ou um anticorpo que reconhece o referido oligonucleotídeo utilizando um imunoensaio padrão. Uma diminuição da imunogenicidade de preferência corresponde a uma diminuição detectável de pelo menos um destes tipos de células, em comparação com a quantidade de tipo célula correspondente na biópsia do músculo correspondente de um animal antes do tratamento ou tratado com um oligonucleotídeo correspondente não tendo inosina (hipoxantina) e/ou base universal e/ou base degenerada e/ou nucleotídeos contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação. Alternativamente, uma diminuição da imunogenicidade pode ser avaliada pela ausência de ou uma quantidade decrescente do referido composto e/ou anticorpos neutralizantes utilizando um imunoensaio padrão.

[083] Uma quarta vantagem de usar uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção é o de evitar ou reduzir uma multimerização de potencial ou agregação de oligonucleotídeos. Por exemplo, é conhecido que um oligonucleotídeo que compreende um motivo de quarteto G- tem a tendência para formar um quádruplo, um multímero ou agregado formado pelo emparelhamento de bases de Hoogsteen de quatro oligonucleotídeos de cadeia simples (Cheng A.J. e Van Dyke MW), que é claro não desejado: como um resultado a eficiência do oligonucleotídeo deverá ser diminuída. Multimerização ou agregação é preferencialmente avaliada através de técnicas padrão de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante conhecidas pelo técnico especialista no assunto. Em uma modalidade preferida, menos de 20% ou 15%, 10%, 7%, 5% ou menos de uma quantidade total de um oligonucleotídeo da invenção tem a capacidade de multimerizar ou agregar, avaliada utilizando o ensaio acima mencionado.

[084] Uma quinta vantagem da utilização de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção é, portanto, também para evitar estruturas quádruplas que têm sido associadas com a atividade antitrombótica (Macaya RF, et al.), bem como com o ligante, e a inibição do receptor sequestrante de macrófagos (Suzuki K., et al.,).

[085] Uma sexta vantagem do uso de uma inosina (hipoxantina) e/ou uma base universal e/ou uma base degenerada e/ou um nucleotídeo contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação em um oligonucleotídeo da invenção é permitir a concepção de um oligonucleotídeo com melhores cinética de ligação ao RNA e/ou propriedades termodinâmicas. A cinética de ligação ao RNA e/ou propriedades termodinâmicas são, pelo menos em parte, determinadas pela temperatura de fusão de um oligonucleotídeo (Tm; calculado com o calculador de propriedades de oligonucleotídeos (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html) para o RNA de cadeia simples utilizando a Tm de base e o modelo de vizinho mais próximo), e/ou a energia livre do complexo de éxon do AON-alvo (usando RNA structure version 4.5). Se uma Tm é demasiada elevada, o oligonucleotídeo deve ser menos específico. Uma Tm aceitável e a energia livre dependem da sequência do oligonucleotídeo. Portanto, é difícil dar intervalos preferidos para cada um destes parâmetros. Uma Tm aceitável pode ser variada entre 35 e 85°C e uma energia livre aceitável pode ser variada entre 15 e 45 kcal/mol.

[086] Dependendo do seu comprimento, um oligonucleotídeo da presente invenção pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 inosinas (hipoxantina) e/ou bases universais e/ou bases degeneradas e/ou nucleotídeos contendo uma base capaz de formar um par de bases de oscilação ou um seus equivalentes funcionais.

[087] De preferência, o referido oligonucleotídeocompreende RNA, conforme cadeias duplas de RNA/RNA são muito estáveis. Prefere-se que um oligonucleotídeo de RNA compreenda uma modificação proporcionando o RNA com uma propriedade adicional, por exemplo, resistência a endonucleases, exonucleases e RNAaseH, força de hibridização adicional, estabilidade aumentada (por exemplo, em um fluido corporal), flexibilidade aumentada ou diminuída, toxicidade reduzida, transporte intracelular aumentado, especificidade para tecido, etc. Modificações preferidas foram identificadas acima.

[088] Uma modalidade proporciona, assim, um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma modificação. Um oligonucleotídeo modificado preferido é 2'-O-metil totalmente modificado. Em uma modalidade da invenção, um oligonucleotídeo compreende ou consiste de um oligonucleotídeo híbrido compreendendo uma modificação de oligorribonucleotídeo de 2'-O-metil fosforotioato e uma modificação de ácido nucleico em ponte (BNA, como exemplificado acima). Em outra modalidade da invenção, um oligonucleotídeo compreende ou consiste de um oligonucleotídeo híbrido compreendendo uma modificação do 2'-O-metoxietil fosforotioato e um ácido nucleico em ponte (BNA, como exemplificado acima). Em outra modalidade da invenção, um oligonucleotídeo compreende ou consiste de um oligonucleotídeo híbrido compreendendo uma modificação de ácido nucleico em ponte (BNA, como exemplificado acima) e uma modificação de oligodesoxirribonucleotídeo. Esta combinação particular compreende melhor a especificidade de sequência em relação a um equivalente que consiste apenas de ácido nucleico em ponte, e compreende eficácia melhorada quando comparada com um oligonucleotídeo consiste de modificação oligo(desoxi)ribonucleotídeo 2'-O- metilfosforotioato.

[089] O composto tal como descrito na presente invenção pode, preferivelmente, possuir grupos ionizáveis. Grupos ionizáveis podem ser ácidos ou bases, e pode ser carregados ou neutros. Grupos ionizáveis podem estar presentes como par de íons com um contra-íon adequado que transporta a carga oposta(s). Exemplos de contra-íons catiônicos são o sódio, potássio, césio, Tris, lítio, cálcio, magnésio, trialquilamônio, trietilaamônio, e tetraamônio. Exemplos de contra-íons aniônicos são o cloreto, brometo, iodeto, lactato, mesilato, acetato, trifluoroacetato, dicloroacetato, e citrato. Exemplos de contra-íons foram descritos (por exemplo, Kumar L,), que é incorporado aqui na sua totalidade por referência. Exemplos de aplicação de contra-íons di ou trivalentes, especialmente Ca2+, têm sido descritas como a adição de características positivas de oligonucleotídeos selecionados em Pedido de Patente Norte- Americano 2012046348 (Replicor), que é aqui incorporado na sua totalidade por referência. Contra-íons divalentes ou trivalentes preferidos são selecionados a partir da seguinte lista ou grupo: cálcio, magnésio, cobalto, ferro, manganês, bário, níquel, cobre, e zinco. Um contra-íon divalente preferido é o cálcio. Está, portanto, incluído na presente invenção preparar, obter e utilizar uma composição que compreende um oligonucleotídeo da invenção, e qualquer outro contra-íon identificado acima, de preferência o cálcio. Tal método para a preparação da referida composição que compreende o referido oligonucleotídeo e o referido contra- íon, preferivelmente cálcio, pode ser como se segue: um oligonucleotídeo da invenção pode ser dissolvido em um excipiente aquoso farmaceuticamente aceitável, e, gradualmente, uma solução que compreende o referido contra- íon é adicionada ao oligonucleotídeo dissolvido de tal forma que o complexo de oligonucleotídeo quelato permanece solúvel.

[090] Portanto, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo da invenção foi posto em contato com uma composição compreendendo tal contra-íon, de preferência Ca2+, para formar um complexo de quelato de oligonucleotídeo compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos idênticos ligados por um contra-íon tal como aqui identificado. Uma composição compreendendo um complexo quelato de oligonucleotídeos idênticos ligados por um contra-íon, preferivelmente cálcio, é, por conseguinte, englobada pela presente invenção.

Método para a concepção de um oligonucleotídeo

[091] De acordo com um outro aspecto da invenção, é proporcionado um método para conceber um oligonucleotídeo, em que o referido método conduz a um oligonucleotídeo tal como identificado acima.

[092] Este método compreende as seguintes etapas:(a) identificar uma combinação in frame de um primeiro e um segundo éxon em um mesmo pré-mRNA, em que uma região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com uma região do referido primeiro éxon;(b) concepção de um oligonucleotídeo que é capaz de se ligar à referida região do referido primeiro éxon e à referida região do referido segundo éxon, e(c) em que a referida ligação resulta no salto do referido primeiro éxon e do referido segundo éxon, de preferência no salto de um trecho de multi-éxon começando com o referido primeiro éxon, e que engloba um ou mais éxons presentes entre o referido primeiro e o referido segundo éxons, e principalmente no salto de todo o trecho de éxons entre o referido primeiro e o referido segundo éxons.

[093] Na etapa b) de um tal método, o referido oligonucleotídeo é de preferência concebido de modo que a sua ligação interfere com pelo menos uma sequência regulatória de splicing nas referidas regiões do referido primeiro e/ou segundo éxons no referido pré-mRNA.

[094] Em alternativa, ou em combinação com a interferência de uma sequência reguladora de splicing, a ligação do referido oligonucleotídeo de preferência interfere com a estrutura secundária abrangendo, pelo menos, o referido primeiro e/ou o referido segundo éxons no referido pré-mRNA.

[095] O oligonucleotídeo que pode ser obtido por este método é capaz de induzir o salto do referido primeiro e segundo éxons do referido pré-mRNA. De preferência, o salto do éxon(s) adicional é induzido, em que o referido éxon(s) adicional é/são preferencialmente localizados entre o referido primeiro e o referido segundo éxon, e em que o transcrito de mRNA resultante está in frame. O oligonucleotídeo é de preferência capaz de induzir o salto de todo o trecho de éxons entre o referido primeiro éxon e o referido segundo éxon. Em uma modalidade, as referidas regiões do referido primeiro éxon e do referido segundo éxon compreendem um elemento regulador de splicing, de modo que a ligação do referido oligonucleotídeo é capaz de interferir com, pelo menos, uma sequência regulatória de splicing nas referidas regiões dos referidos primeiro e segundo éxons.Também está englobado que a ligação do referidooligonucleotídeo interfere com a estrutura secundária abrangendo, pelo menos, o referido primeiro e/ou o referido segundo éxons no referido pré-mRNA. A sequência regulatória de splicing preferida compreende um sítio de ligação para uma proteína serina-arginina (SR), um ativador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS), e/ou um silenciador exônico de splicing (ESS).

[096] Cada característica deste método já foi aqui definida ou é conhecida pelo técnico especialista no assunto.

Oligonucleotídeos preferidos

[097] De preferência, um oligonucleotídeo da invenção é para o uso como um medicamento, mais preferivelmente o referido composto é para o uso na terapêutica de modulação de RNA. Mais preferido, a referida modulação de RNA conduz à correção de um quadro de leitura transcricional interrompido, e/ou para o restabelecimento da expressão de uma proteína desejada ou antecipada. O método da invenção e o oligonucleotídeo da invenção podem, assim, em princípio, serem aplicados a qualquer doença associada à presença de uma mutação de desregulação no quadro, que conduz a um transcrito aberrante e/ou à ausência de uma proteína codificada, e/ou à presença de uma proteína aberrante. Em uma modalidade preferida, o método da invenção e o oligonucleotídeo da invenção são aplicados aos genes associados a doenças que transportam sequências repetitivas e, portanto, regiões com identidade de sequência relativamente alta (isto é, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80% de identidade de sequência entre uma região de um segundo éxon e uma região de um primeiro éxon tal como aqui definida). Exemplos não limitativos são genes com repetições tipo espectrina (como o gene DMD envolvido na distrofia muscular de Duchenne, tal como aqui descrito), repetições tipo Kelch (tal como o gene KLHL3 envolvido na hipertensão hiperpotássica familiar (Louis-Dit-H Picard et al.), o gene KLHL6 envolvido na leucemia linfocítica crônica (Puente XS et al.), o gene KLHL7 envolvido na retinite pigmentosa (Friedman JS et al.), os genes KLHL7/12 envolvidos na síndrome de Sjogren (Uchida K et al.), o gene KLHL9 envolvido na miopatia distal (Cirak S et al.), O gene KLHL16 ou GAN envolvido na neuropatia axonal gigante (Bomont P et al.) , o gene KLHL19 ou KEAP1 envolvido em vários cânceres (Dhanoa BS et al.), o gene KLHL20 envolvido na leucemia promielocítica (Dhanoa BS et al.), ou o gene KLHL37 ou ENC1 envolvido em tumores cerebrais (Dhanoa BS et al.), repetições de tipo FGF, repetições do tipo EGF (tal como o gene NOTCH3 envolvido em CADASIL (Chabriat H et al.), os genes SCUBE envolvidos no câncer ou doença óssea metabólica, o gene neurexin-1 (NRXN1) envolvido em distúrbios neuropsiquiátricos e epilepsia idiopática generalizada (RS Moller et al.), o gene Del-1, o gene Tenascin-C (TNC) envolvido na aterosclerose e doença das artérias coronárias (Mollie A et al.), o gene THBS3, ou o gene Fibrilina (FBN1) envolvido na síndrome de Marfan (Rantamaki T et al.)), as repetições tipo Anquirina (tal como o gene ANKRD1 envolvido na cardiomiopatia dilatada (Dubosq-Bidot L et al.), o gene ANKRD2, o gene ANKRD11 envolvido na síndrome KBG (Sirmaci A et al.), o gene ANKRD26 envolvido em trombocitopenia (Noris P et al.), ou diabetes (Raciti GA et al.), o gene ANKRD55 envolvido na esclerose múltipla (Alloza I et al.), ou o gene TRPV4 envolvido na atrofia muscular espinhal distal (Fiorillo C et al.)), repetições tipo HEAT (tal como o gene htt envolvidas na doença de Huntington), repetições tipo Anexina, repetições ricas em leucina (tais como genes NLRP2 e NLRP7 envolvidos em abortos recorrentes idiopáticos (Huang JY et al.), o gene LRRK2 envolvido na doença de Parkinson (Abeliovich A et al.), o gene NLRP3 envolvido na doença de Alzheimer ou meningite (Heneka MT et al.), o gene NALP3 envolvido na insuficiência renal (Knauf M et al.), ou o gene LRIG2 envolvido na síndrome urofacial (Stuart HM et al.), ou domínios de inibidores de serina-protease (tais como o gene SPINK5 envolvido na síndrome de Netherton (Hovnanian A et al.), como descrito em Andrade M.A. et al.

[098] Dentro do contexto da invenção, um pré-mRNA ou transcrito preferido é o pré-mRNA ou transcrito de distrofina. Este pré-mRNA ou transcrito preferido é de preferência um humano. Uma doença relacionada com a presença de uma mutação presente no pré-mRNA de distrofina é DMD ou BMD, dependendo da mutação. E combinações e regiões preferidas do primeiro e segundo éxons a partir do pré-mRNA para serem usadas no contexto da invenção são identificadas na tabela 2.

[099] Em uma modalidade preferida, um composto da invenção é utilizado para induzir o salto do éxon em uma célula, em um órgão, em um tecido e/ou em um paciente, de preferência em um paciente BMD ou DMD ou em uma célula, órgão, tecido derivados do referido paciente. O salto do éxon resulta em um mRNA maduro que não contenha um éxon saltado e assim, quando o referido éxon codifica para aminoácidos, pode conduzir à expressão de um alterado, internamente truncado, mas parcialmente para largamente funcional produto de distrofina. A tecnologia para o salto de éxon está dirigida para a utilização de AONs ou AON transcrevendo constructos de genes. As técnicas de salto de éxon hoje em dia são exploradas a fim de combater distrofias musculares genéticas. Resultados promissores foram relatados recentemente por nós e outros sobre a terapia de salto do éxon induzida por AON, destinada a restabelecer o quadro de leitura do pré-mRNA de distrofina em células do camundongo mdx e pacientes com DMD (Heemskerk H., et al.,; Cirak S., et al.,; Goemans et al.,). Pelo salto alvo de um éxon específico, um fenótipo de DMD grave (faltando distrofina funcional) é convertido em um fenótipo BMD mais brando (que expressa distrofina funcional ou semi-funcional). O salto de um éxon é, de preferência, induzido pela ligação de AONs se dirigindo para uma sequência de éxon interno.

[100] A seguir, a invenção é ilustrada por um pré- mRNA de distrofina mutante, em que um primeiro e um segundo éxon estão presentes. Tal como aqui definido, pré-mRNA de distrofina, de preferência, significa um pré-mRNA de um gene de DMD que codifica para uma proteína de distrofina. O pré- mRNA de distrofina mutado corresponde a um pré-mRNA de um paciente BMD ou DMD com uma mutação quando comparado com um pré-mRNA de DMD de tipo selvagem de uma pessoa não afetada, resultando em (níveis reduzidos de) uma proteína aberrante (BMD), ou na ausência de distrofina funcional (DMD). Um pré- mRNA de distrofina é também chamado um pré-mRNA de DMD. Um gene de distrofina também pode ser chamado de um gene DMD. A distrofina e DMD podem ser utilizadas indiferentemente ao longo do pedido.

[101] Um paciente é preferencialmente destinado a significar um paciente que tem DMD ou BMD como aqui definido posteriormente, ou um paciente suscetível de desenvolver DMD ou BMD, devido ao seu (ou dela) antecedente genético. No caso de um paciente DMD, um composto utilizado de preferência corrigirá uma mutação presente no gene DMD do referido paciente e, por conseguinte, de preferência criará uma proteína distrofina que será semelhante a uma proteína distrofina de um doente BMD: a referida proteína será preferencialmente uma distrofina funcional ou semi- funcional, tal como aqui definido posteriormente. No caso de um paciente BMD, um oligonucleotídeo anti-sentido da invenção de preferência modificará uma mutação como presente no gene BMD do referido paciente, e de preferência criará uma distrofina que vai ser mais funcional do que a distrofina que estava originalmente presente no referido paciente BMD.

[102] Tal como aqui definido, uma distrofina funcional é preferivelmente uma distrofina do tipo selvagem correspondente a uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos tal como identificada em SEQ ID NO: 1. A distrofina funcional é preferivelmente uma distrofina, que tem um domínio de ligação atuante na sua parte N-terminal (primeiros 240 aminoácidos no terminal N), um domínio rico em cisteína (aminoácidos 3361 até 3685), e um domínio C terminal (últimos 325 aminoácidos no terminal C) de cada um destes domínios estando presentes em um tipo selvagem de distrofina, como é conhecido pelo técnico especialista no assunto. Os aminoácidos aqui indicados correspondem aos aminoácidos da distrofina de tipo selvagem sendo representados pela SEQ ID NO: 1. Em outras palavras, uma distrofina funcional ou semi-funcional é uma distrofina que apresenta, pelo menos, em certa medida, uma atividade da distrofina de tipo selvagem. “Pelo menos em certa medida” significa preferencialmente pelo menos 10%, 20% ou 30%, 40% 50%, 60% 70%, 80% 90%, 95% ou 100% de uma atividade correspondente de uma distrofina de tipo selvagem. Neste contexto, uma atividade de uma distrofina funcional é, de preferência, a ligação à actina e interação com o complexo de glicoproteína associado à distrofina (DGC) ou (DAGC) (Ehmsen J et al,). A ligação da distrofina à actina e ao complexo DGC pode ser visualizada por qualquer co- imunoprecipitação utilizando extratos proteicos totais, ou análise de imunofluorescência de seções transversais, a partir de uma biópsia de um músculo suspeito de ser distrófico, como conhecido pelo técnico especialista no assunto.

[103] Os indivíduos que sofrem de DMD tipicamente têm uma mutação no gene que codifica a distrofina que impede a síntese da proteína completa, por exemplo, uma paragem prematura impede a síntese do terminal-C. Na BMD o gene de distrofina também compreende uma mutação, mas esta mutação não interrompe o quadro aberto de leitura, e o C-terminal está sintetizado. Como resultado, uma proteína distrofina (semi-) funcional ou funcional é gerada, que tem uma atividade semelhante em espécie com a proteína de tipo selvagem, embora não necessariamente uma quantidade similar de atividade. O genoma de um indivíduo BMD codifica tipicamente para uma proteína distrofina compreendendo a parte N terminal (primeiros 240 aminoácidos no terminal N), um domínio rico em cisteína (aminoácido 3361 até 3685) e um domínio do C terminal (325 últimos aminoácidos no terminal C), mas na maioria dos casos, a sua haste central em forma de domínio pode ser mais curta do que a de um tipo selvagem da distrofina (Monaco A.P., et al,). O salto do éxon para o tratamento da DMD é tipicamente direcionado para ultrapassar a paragem prematura do pré-mRNA através do salto de um éxon flanqueando ou contendo a mutação. Isto permite a correcção do quadro aberto de leitura e a síntese de uma proteína distrofina truncada internamente, mas incluindo o C- terminal. Em uma modalidade preferencial, um indivíduo com DMD e sendo tratado com um oligonucleotídeo da invenção irá sintetizar uma distrofina que apresenta, pelo menos, em certa medida, uma atividade semelhante a de um tipo selvagem de distrofina. Mais preferivelmente, se o referido indivíduo é um paciente DMD ou suspeito de ser um paciente DMD, uma distrofina (semi-) funcional é uma distrofina de um indivíduo possuindo BMD: tipicamente a referida distrofina é capaz de interagir tanto com a actina e DGC ou DAGC (Ehmsen J., et al, Monaco AP, et al,).

[104] O domínio central da haste da distrofina do tipo selvagem é composto por 24 repetições tipo espectrina (Ehmsen J., et al,). Em muitos casos, o domínio central em forma de haste em proteínas tipo BMD é mais curto do que o de um tipo selvagem de distrofina (Monaco AP, et al).Por exemplo, um domínio de haste central em forma de uma distrofina como aqui fornecido pode compreender 5 a 23, 10 a 22 ou 12 a 18 repetições de espectrina semelhantes, contanto que se pode ligar à actina e ao DGC.

[105] Aliviar um ou mais sintoma(s) de DMD ou BMD em um indivíduo utilizando um composto da invenção pode ser avaliado por qualquer dos seguintes ensaios: prolongamento do tempo até à perda da caminhada, a melhora da força muscular, melhora da capacidade de levantar peso, melhora do tempo necessário para se levantar do chão, melhora no tempo de caminhada de nove metros, melhora no tempo necessário para subida de quatro escadas, melhora do grau de função da perna, melhora da função pulmonar, melhora da função cardíaca, melhora da qualidade de vida. Cada um destes ensaios é conhecido pelo técnico especialista no assunto. Como um exemplo, a publicação de Manzur et al (Manzur A.Y. et al) dá uma vasta explicação de cada um destes ensaios. Para cada um destes ensaios, assim que uma melhora detectável ou prolongamento de um parâmetro medido em um ensaio foi encontrado, de preferência significará que um ou mais sintomas de DMD ou BMD foi aliviado em um indivíduo utilizando um composto da invenção. A melhora detectável ou prolongamento é de preferência uma melhora estatisticamente significativa ou prolongamento, conforme descrito em Hodgetts et al (Hodgetts S., et al,). Alternativamente, a redução de um ou mais sintoma(s) de DMD ou BMD pode ser avaliada medindo um melhoramento de uma função da fibra muscular, a integridade e/ou a sobrevivência. Em um método preferido, um ou mais sintoma(s) de um ou de um paciente DMD ou um BMD é/são aliviados e/ou uma ou mais característica(s) de uma ou mais células musculares de um paciente DMD ou um BMD é/são melhoradas. Tais sintomas ou características podem ser avaliados a nível celular, tecido ou no próprio paciente.

[106] Um alívio de uma ou mais características de uma célula muscular de um paciente DMD ou BMD pode ser avaliado por qualquer dos seguintes ensaios sobre uma célula miogênica ou células musculares daquele paciente: captação de cálcio reduzida pelas células musculares, diminuição da síntese de colágeno, morfologia alterada, biossíntese de lipídios alterada, diminuição do estresse oxidativo, e/ou melhora da função das fibras musculares, integridade e/ou sobrevivência. Estes parâmetros são normalmente avaliados através de imunofluorescência e/ou histoquímica de seções transversais de biópsias musculares. A melhora da função da fibra muscular, a integridade e/ou a sobrevivência pode ser avaliada usando pelo menos um dos seguintes ensaios: uma diminuição detectável da creatina quinase no sangue, uma diminuição detectável de necrose de fibras musculares em um corte transversal de uma biópsia do músculo suspeito de ser distrófico, e/ou um aumento detectável da homogeneidade do diâmetro das fibras musculares a uma seção transversal de uma biópsia do músculo suspeita de ser distróficas. Cada um destes ensaios é conhecido pelo técnico especialista no assunto.

[107] A creatina quinase pode ser detectada no sangue, conforme descrito em Hodgetts et al (hodgetts S., et al,). Uma diminuição detectável na creatina quinase pode significar um decréscimo de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com a concentração da creatina quinase em um mesmo paciente DMD ou BMD antes do tratamento.

[108] Uma diminuição detectável da necrose de fibras musculares é preferencialmente avaliada em uma biópsia do músculo, mais preferencialmente, como descrito em Hodgetts et al (Hodgetts S., et ai,) utilizando seções de biópsia. Uma diminuição detectável de necrose pode ser um decréscimo de 5%, 10%>, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da área de necrose foi identificada usando seções de biópsia. A diminuição é medida por comparação com a necrose, tal como avaliado em um mesmo paciente DMD ou BMD antes do tratamento.

[109] Um aumento detectável da homogeneidade do diâmetro de uma fibra muscular é preferencialmente avaliado em uma seção transversal de biópsia do músculo, mais preferencialmente, como descrito em Hodgetts et al (Hodgetts S., et al,). O aumento é medido por comparação com a homogeneidade do diâmetro de uma fibra muscular em um mesmo paciente DMD ou BMD antes do tratamento.

[110] De preferência, um oligonucleotídeo da invenção fornece o referido indivíduo com (níveis mais elevados de) uam proteína distrofina funcional e/ou (semi) funcional (tanto para DMD e BMD) e/ou é capaz de, durante, pelo menos em parte, reduzir a produção de uma proteína distrofina aberrante no referido indivíduo. Neste contexto, “uma” funcional e/ou “uma” semi-funcional pode significar que as várias formas de distrofina funcional e/ou semi- funcional poderiam ser geradas. Isto pode ser esperado quando uma região de pelo menos 50% de identidade entre um primeiro e um segundo éxon sobrepõe-se com uma ou mais outra região (s) de pelo menos 50% de identidade entre os outros primeiro e segundo éxons, e quando o referido oligonucleotídeo é capaz de ligação aà referida parte de sobreposição de tal forma que vários trechos diferentes de éxons são saltados, e vários transcritos in frame diferente produzidos. Esta situação é ilustrada no exemplo 4, em que um único oligonucleotídeo de acordo com a invenção (PS816; SEQ ID NO:1679) é capaz de induzir a produção de vários transcritos in frame, que compartilham todos o éxon 10 como primeiro éxon, e em que o segundo éxon pode ser 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48 ou 55.

[111] Níveis superiores referem-se ao aumento de uma proteína distrofina funcional e/ou (semi) funcional por comparação com um nível correspondente de uma proteína distrofina funcional e/ou (semi) funcional em um paciente antes do início do tratamento com um oligonucleotídeo da invenção. O nível da referida proteína distrofina funcional e/ou (semi) funcional é preferencialmente avaliado através de imunofluorescência ou análise de Western blot (proteína).

[112] A diminuição da produção de um mRNA de distrofina aberrante, ou proteína distrofina aberrante, preferivelmente significa que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou menos da quantidade inicial de mRNA da distrofina aberrante, ou proteína distrofina aberrante, ainda é detectável por RT PCR (mRNA) ou imunofluorescência ou análise de Western blot (proteína). Um mRNA aberrante de distrofina ou proteína também é aqui referido como um menos funcional (em comparação com um tipo selvagem da proteína distrofina funcional, tal como anteriormente aqui definido) ou mRNA não funcional de distrofina ou proteína. Uma proteína distrofina não-funcional é de preferência uma proteína distrofina que não é capaz de se ligar a actina e/ou membros do complexo proteína DGC. Uma proteína distrofina ou mRNA de distrofina não funcionais geralmente não têm, ou não codificam uma proteína distrofina com um C-terminal intacto da proteína. Em uma modalidade preferida, uma técnica de salto de éxon (também chamado de RNA-modulante ou troca de splicing) é aplicada.

[113] Aumentar a produção de um mRNA de distrofina funcional e/ou semi-funcional e/ou proteína, de preferência, significa que um tal mRNA de distrofina funcional e/ou semi- funcional e/ou proteína é detectável ou é aumentada de pelo menos 5%, 10% , 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, em comparação com a quantidade detectável do referido mRNA e/ou proteína detectável no início do tratamento. A referida detecção pode ser realizada por meio de RT-PCR (mRNA) ou imunofluorescência ou análise de Western blot (proteína).

[114] Em outra modalidade, um composto da invenção proporciona o referido indivíduo com uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional. Esta proteína distrofina funcional ou semi-funcional ou mRNA pode ser detectado como uma proteína distrofina ou mRNA aberrante, como aqui anteriormente explicado.

[115] Através do co-salto alvo dos referidos dois éxons (o referidao primeiro e o referido segundo éxons), o salto do éxon adicional =(s) pode ser induzido, em que o referido éxon(s) adicional é/são de preferência localizados entre o referido primeiro e o referido segundo éxons, e em que o transcrito da distrofina resultante está in frame (de preferência como na Tabela 1 ou 6), um fenótipo de DMD ou BMD grave é convertido em BMD mais brando, ou mesmo fenótipo assintomático. O co-salto dos referidos dois éxons é preferencialmente induzido pela ligação de um oligonucleotídeo para uma região de um primeiro éxon do pré- mRNA de distrofina e através da ligação de um oligonucleotídeo para uma região de um segundo éxon dentro do pré-mRNA de distrofina, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon. De preferência, os referidos primeiro e segundo éxons da distrofina, e as regiões de identidade nela, são os indicados na tabela 2 ou 6. O referido oligonucleotídeo apresenta, de preferência nenhuma sobreposição com as sequências não-éxon. O referido oligonucleotídeo de preferência, não se sobrepõem com os locais de jsplice, pelo menos, na medida em que estes não estão presentes em um íntron. O referido oligonucleotídeo dirigido para uma sequência de éxon interno, de preferência não contém uma sequência complementar reversa para um íntron adjacente. Uma técnica de salto de éxon é de preferência aplicada de tal forma que a ausência dos referidos dois éxons, de preferência de éxon(s) adicional, mais preferencialmente localizada entre o referido primeiro e o referido segundo éxons a partir de um mRNA produzido a partir de um pré-mRNA de DMD gera uma região de codificação para a expressão (superior) de uma mais (semi-)funcional - embora mais curta - proteína distrofina. Neste contexto (tipicamente um paciente BMD), inibindo a inclusão dos referidos dois éxons, de preferência do éxon(s) adicional localizado entre os referidos primeiro e segundo éxons, de preferência, significa que:- ao nível do mRNA da distrofina original, aberrante (menos funcional) é reduzido com pelo menos 5%, tal como avaliado por RT-PCR, ou que um nível de proteína distrofina aberrante correspondente é reduzido com, pelo menos, 2%,tal como avaliado por imunofluorescência ou análise de Western blot utilizando anticorpos anti-distrofina; e/ou- um transcrito in frame que codifica uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional é detectável, ou o seu nível é aumentado de pelo menos 5%, tal como avaliado por RT-PCR (nível de mRNA) ou de, pelo menos, 2%, tal como avaliado por imunofluorescência ou Western blot usando anticorpos anti-distrofina (nível de proteína).

[116] A diminuição na proteína distrofina aberrante, menos funcional ou não funcional é de preferência pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% e é, de preferência, linear ou paralela à detecção ou o aumento da produção de um transcrito de distrofina ou proteína mais funcional ou semi-funcional. Neste contexto (tipicamente um paciente DMD), inibindo a inclusão dos referidos dois éxons, de preferência do éxon(s) adicional localizado entre os referidos primeiro e segundo éxons, de preferência significa que os (níveis mais elevados de) uma proteína distrofina mais funcional ou (semi) funcional ou mRNA é fornecida ao referido indivíduo.

[117] Uma vez que um paciente DMD é fornecido com (níveis mais elevados) de uma proteína distrofina (mais) funcional ou (semi) funcional, a causa da DMD é, pelo menos em parte, atenuada. Por isso, seria, então, esperado que os sintomas da DMD sejam suficientemente reduzidos. A presente invenção proporciona ainda a percepção de que o salto de um trecho inteiro de pelo menos dois éxon sde distrofina a partir de um pré-mRNA compreendendo os referidos éxons seja induzido ou aumentado, quando se utiliza um único oligonucleotídeo dirigido para (ou capaz de se ligar, ou hibridizar com, ou reverso complementar a, ou capaz de direcionar) ambos os éxons exteriores do referido trecho. Ao longo do pedido em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo da invenção é, por conseguinte, pelo menos 80% complementar reverso da referida zona do referido primeiro éxon e, pelo menos, 45% complementar reverso à referida região do referido segundo éxon tal como aqui definido, em que os referidos primeiro e segundo éxons correspondem aos éxons exteriores do trecho de éxon que é para ser pulado. Mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo tem pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% de complementaridade reversa à referida região do referido primeiro e, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% complementar reverso à referida região do referido segundo éxon. A frequência de salto aumentada também aumenta o nível de mais proteína distrofina (semi-) funcional produzida em uma célula muscular de um indivíduo DMD ou BMD.

[118] Um oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção que é preferencialmente utilizado é preferencialmente complementar reverso ou é capaz de se ligar ou hibridizar com ou se direcionar para uma região de um primeiro éxon de distrofina, a referida região tendo pelo menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, ou mais nucleotídeos, é preferencialmente complementar reverso ou é capaz de se ligar ou hibridizar com ou se direcionar para uma região de um segundo éxon de distrofina, a referida região tendo pelo menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, ou mais nucleotídeos, em que a referida região do referido segundo éxon dentro do mesmo pré-mRNA tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon.

[119] Dentro do contexto da invenção, um oligonucleotídeo pode compreender ou consistir de um equivalente funcional de um oligonucleotídeo. Um equivalente funcional de um oligonucleotídeo significa de preferência um oligonucleotídeo, tal como aqui definido, em que um ou mais nucleotídeos foram substituídos, e em que uma atividade do referido equivalente funcional é retida pelo menos em alguma extensão. De um modo preferido, uma atividade do referido composto que compreende um equivalente funcional de um oligonucleotídeo está proporcionando uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional. A referida atividade do referido composto compreendendo um equivalente funcional de um oligonucleotídeo é, por conseguinte, de preferência, avaliada por quantificação da quantidade de uma proteína distrofina funcional ou uma semi-funcional. A distrofina funcional ou semi-funcional é aqui definida como sendo de preferência uma distrofina capaz de se ligar à actina e aos membros do complexo de proteína DGC, e para apoiar a estrutura da membrana da fibra muscular e flexibilidade. A avaliação da referida atividade de um composto que compreende um oligonucleotídeo ou equivalente funcional preferencialmente inclui RT-PCR (para detectar o salto do éxon no nível do RNA), e/ou imunofluorescência ou análise de Western blot (para detectar a expressão da proteína e localização). A referida atividade é de preferência mantida em pelo menos em alguma extensão, quando se representa pelo menos 50%, ou, pelo menos, 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% ou mais da atividade correspondente do referido composto que compreende um oligonucleotídeo onde o equivalente funcional se deriva. Ao longo deste pedido, quando o termo oligonucleotídeo é utilizado, este pode ser substituído por um equivalente funcional do mesmo, tal como aqui definido.

[120] Assim, a utilização de um oligonucleotídeo, ou de um equivalente funcional do mesmo, que compreende ou consiste em uma sequência que é capaz de se ligar a, se direcionar a, hibridizar com, e/ou é reversa-complementar a uma região de um primeiro éxon de distrofina, que é capaz de se ligar a, se direcionar a, hibridizar com, e/ou é reversa- complementar a uma região de um segundo éxon de distrofina, e em que a referida região do segundo éxon dentro do pré- mRNA de distrofina tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon apresenta resultados terapêuticos de DMD por:- aliviar um ou mais sintoma(s) ou de DMD ou BMD; e/ou- aliviar uma ou mais características de uma célula muscular de um paciente; e/ou- proporcionar o referido indivíduo com uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional; e/ou- pelo menos em parte diminuir a produção de uma proteína distrofina aberrante no referido indivíduo.

[121] Cada uma destas características já foi definida neste documento.

[122] De um modo preferido, um oligonucleotídeo está compreendendo ou consistindo de uma sequência que é capaz e se ligar a, se direcionar a, hibridizar com, e/ou é reversa-complementar a uma região de um primeiro éxon DMD ou distrofina, em que uma região de um segundo éxon DMD ou distrofina dentro do mesmo pré-mRNA tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon. Os referidos primeiro e segundo éxons são preferivelmente selecionados a partir do grupo de éxons incluindo éxons 8 a 60, em que o trecho dos éxons a partir do primeiro éxon e compreendendo o segundo éxon com o último éxon, quando pulado, produz um quadro de transcrição. As combinações de éxons in-frame preferidas no mRNA de distrofina são dadas na Tabela 1, 2 ou 6.

[123] Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, a identidade dos primeiros e segundo éxons da distrofina pode ser determinada por um ou mais dos seguintes aspectos. Em uma modalidade, um ou mais íntrons presentes entre o primeiro éxon e o segundo éxon não são excepcionalmente grande. Neste contexto, um íntron excepcionalmente grande no gene da distrofina pode ser 70, 80, 90, 100, 200 kb ou mais; por exemplo, íntron 1 (~83 kb), íntron 2 (~170 kb), íntron 7 (~110 kb), íntron 43 (~70 kb), íntron 44 (~248 kb), íntron 55 (~119 kb), ou íntron 60 (~96 kb). Além disso, em uma modalidade adicional, pode já ser um exemplo de um paciente BMD expressando uma proteína distrofina truncada, em que este primeiro, este segundo e o trecho de éxon a partir do referido primeiro éxon ao referido segundo éxon tinha sido suprimido. Outro critério pode ser a aplicabilidade relativamente grande dos éxons saltados para subpopulações combinados de pacientes DMD (e/ou BMD) com mutações específicas relevantes.

[124] Em uma modalidade preferida, um trecho in-frame de éxons DMD é saltado (mais preferencialmente totalmente saltado dentro de um transcrito), em que os éxons exteriores são definidos por um primeiro e um segundo éxon como se segue: - o primeiro éxon é o éxon 8 e o segundo éxon é o éxon 19 ( aplicável a ~7% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 9 e o segundo éxon é o éxon 22 ( aplicável a ~11% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 9 e o segundo éxon é o éxon 30 ( aplicável a ~14% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 10 e o segundo éxon é o éxon 18 ( aplicável a ~5% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 10 e o segundo éxon é o éxon 30 ( aplicável a ~13% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 10 e o segundo éxon é o éxon 42 ( aplicável a ~16% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 10 e o segundo éxon é o éxon 47 (aplicável a ~ 29% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 10 e o segundo éxon é o éxon 57 (aplicável a ~ 72% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 10 e o segundo éxon é o éxon 60 (aplicável a ~ 72% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 11 e o segundo éxon é o éxon 23 (aplicável a ~8% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 13 e o segundo éxon é o éxon 30 (aplicável a ~10% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 23 e o segundo éxon é o éxon 42 ( aplicável a ~7% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 34 e o segundo éxon é o éxon 53 (aplicável a ~42% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 40 e o segundo éxon é o éxon 53 (aplicável a ~38% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 44 e o segundo éxon é o éxon 56 (aplicável a ~40% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 45 e o segundo éxon é o éxon 51 (aplicável a ~17% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 45 e o segundo éxon é o éxon 53 (aplicável a ~ 28% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 45 e o segundo éxon é o éxon 55 (aplicável a ~ 33% dos pacientes com DMD), - o primeiro éxon é o éxon 45 e o segundo éxon é o éxon 60 (aplicável a ~37% dos pacientes com DMD), ou - o primeiro éxon é o éxon 56 e o segundo éxon é o éxon 60 (aplicável a ~2% dos pacientes com DMD),

[125] Portanto, em uma modalidade, um oligonucleotídeo da invenção induz o salto dos seguintes éxons de distrofina: éxons 8 a 19, éxons 9 a 22, éxons 9 a 30, éxons 10 a 18, éxons 10 a 30, éxons 10 a 42, éxons 10 a47, éxons 10 a 57, éxons 10 a 60, éxons 11 a 23, éxons 13 a30, éxons 23 a 42, éxons 34 a 53, éxons 40 a 53, éxons 44 a56, éxons 45 a 51, éxons 45 a 53, éxons 45 a 55, oéxons 45a 60 ou éxons 56 a 60.

[126] De preferência, um oligonucleotídeo da invenção compreende ou é constituído por uma sequência que é capaz de se ligar, de se direcionar, de hibridizar, e/ou é reversa-complementar a uma região de um primeiro éxon de pré-mRNA de distrofina, de tal modo que a parte complementar reversa é pelo menos 30% do comprimento do referido oligonucleotídeo da invenção, mais preferencialmente pelo menos 40%, ainda mais preferencialmente pelo menos 50%, aindamais preferencialmente pelo menos 60%, ainda maispreferencialmente pelo menos 70%, ainda maispreferencialmente pelo menos 80%, ainda maispreferencialmente pelo menos 90% ou ainda maispreferencialmente pelo menos 95%, ou ainda maispreferencialmente 98% e mais de preferência até 100%. Neste contexto, um primeiro éxon é preferencialmente o éxon 8, 9, 10, 11, 13, 23, 34, 40, 44, 45, ou 56 de pré-mRNA de distrofina, tal como aqui definido. O referido oligonucleotídeo pode compreender sequências de flanqueamento adicionais. Em uma modalidade mais preferida, o comprimento da referida parte complementar reversa do referido oligonucleotídeo tem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 nucleotídeos. Podem ser utilizados vários tipos de sequências de flanqueamento. De preferência, sequências de flanqueamento são usadaspara modificar a ligação de uma proteína ao referido oligonucleotídeo, ou para modificar uma propriedade preferencialmente para modificar a afinidade de ligação ao RNA alvo. Em outra modalidade preferida, as sequências de flanqueamento adicionais são complementares reversas às sequências do pré-mRNA de distrofina que não estão presentes no referido éxon.

[127] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende ou consiste de uma sequência que é capaz de se se ligar, de se direcionar a, de hibridizar com, e é reversa-complementar a pelo menos uma região de um primeiro e a uma região de um segundo éxon de distrofina como presente em um pré-mRNA de distrofina, em que os referidos primeiro e segundo éxons são selecionados dentre o grupo dos éxons 8 (SEQ ID NO:2), 9 (SEQ ID NO:3), 10 (SEQ ID NO:4), 11 (SEQ ID NO:1761), 13 (SEQ ID NO:1762),18 (SEQ ID NO:5), 19 (SEQ ID NO:6), 22 (SEQ ID NO:7), 23 (SEQ ID NO:8), 30 (SEQ ID NO:9), 34 (SEQ ID NO:1763), 40 (SEQ ID NO:1764), 42 (SEQ ID NO:11), 44 (SEQ ID NO:1765), 45 (SEQ ID NO:12), 47 (SEQ ID NO:10), 51 (SEQ ID NO:1760), 53 (SEQ ID NO:13), 55 (SEQ ID NO:14), 56 (SEQ ID NO:15), 57 (SEQ ID NO:1744), ou 60 (SEQ ID NO:16), e as referidas regiões possuindo pelo menos 10 nucleotídeos. No entanto, as referidas regiões podem também ter pelo menos 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos. Para os éxons preferidos identificados acima, o técnico especialista no assunto é capaz de identificar uma região de um primeiro éxon e uma região de um segundo éxon utilizando técnicas conhecidas na arte. Mais preferivelmente, a ferramenta online EMBOSS Matcher é usada, como aqui anteriormente explicado. Ainda mais de preferência, as regiões de identidade preferidas do primeiro e segundo éxons de distrofina para as quais um oligonucleotídeo da invenção liga-se preferencialmente e/ou é pelo menos em parte complementar reverso para, foram apresentadas na Tabela 2. Complementaridade reversa é, neste contexto, de preferência, pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. A sequência de oligonucleotídeo preferida para ser utilizada na invenção é capaz de se ligar a, hibridizar com, se direcionar a, e/ou é complementar reversa a uma região de identidade entre os referidos primeiro e segundo éxons, de preferência da Tabela 2, e tem um comprimento de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 nucleotídeos, mais preferivelmente menos de 40 nucleotídeos, ou mais preferivelmente menos do que 30 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente menos do que 25 nucleotídeos, e mais preferivelmente de 20 a 25 nucleotídeos. Complementaridade reversa é, neste contexto, de preferência pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[128] Em uma modalidade, um oligonucleotídeo preferido é tal que os primeiro e segundo éxons de distrofina são os indicados na tabela 1, 2 ou 6, e que o referido oligonucleotídeo é capaz de se ligar às primeira e segunda regiões de éxons correspondentes tal como identificadas na tabela 2 ou 6, e conforme definidas pela SEQ ID NO: 17-1670, 1742, 1743, ou 1766-1777.

[129] Os oligonucleotídeos preferidos são revelados na Tabela 3, e compreendem ou consistem da SEQ ID NO: 16711741. Outros oligonucleotídeos preferidos compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 1778 a 1891 tal como descrito na Tabela 6. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem SEQ ID NO: 1671 a 1741 ou 1778 a 1891, e têm 1, 2, 3, 4, 5 ou mais nucleotídeos ou 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos a menos do que a sua SEQ ID NO exata, como fornecida na tabela 3 ou 6. Estes nucleotídeos adicionais podem estar presentes no lado 5' ou 3' de uma dada SEQ ID NO. Estes nucleotídeos faltantes podem ser nucleotídeos presentes no lado 5' ou 3' de uma dada SEQ ID NO. Cada um destes oligonucleotídeos pode ter qualquer um dos produtos químicos tal como definido aqui anteriormente, ou combinações dos mesmos. Em cada um dos oligonucleotídeos identificados por uma SEQ ID NO neste documento, uma U pode ser substituída por uma T.

[130] Os oligonucleotídeos mais preferidos são apresentados abaixo.

[131] Se o primeiro éxon da distrofina é éxon 8 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 19, uma região preferida do éxon 8 compreende ou consiste em SEQ ID NO:17, e uma região preferida do éxon 19 compreende ou consiste em SEQ ID NO:18. Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1722, ou 1723, ou compreende a SEQ ID NO: 1722, ou 1723 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[132] Se o primeiro éxon da distrofina é éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 13, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO:101, e uma região preferida do éxon 13 compreende ou consiste em SEQ ID NO:102.

[133] Se o primeiro éxon da distrofina é éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 14, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO:103, e uma região preferida do éxon 14 compreende ou consiste em SEQ ID NO:104.

[134] Se o primeiro éxon da distrofina é éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 15, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO:105, e uma região preferida do éxon 15 compreende ou consiste em SEQ ID NO:106.

[135] Se o primeiro éxon da distrofina é éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 18, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO:109, e uma região preferida do éxon 18 compreende ou consiste em SEQ ID NO:110. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem: - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1679 a 1681, 1778, 1812, 1813, 1884 a 1886, 1890, ou 1891, e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos ou - uma sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1814 e têm um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1815 a 1819 e têm um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1820, 1824, e têm um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780 e têm um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1822 e têm um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, - uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1887 e têm um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1888 ou 1889 e e têm um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1827 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1828 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[136] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 18, outra região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1766, e outra região preferida do éxon 18 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1767. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835 e têm um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[137] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 18, outra região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1768, e outra região preferida do éxon 18 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1769. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1673 ou 1674 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[138] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 20, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 111, e uma região preferida do éxon 20 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 112.

[139] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 27, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 121, e uma região preferida do éxon 27 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 122.

[140] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 30, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 127, e uma região preferida do éxon 30 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 128. De preferência, o oligonucleotídeo compreende: - uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1679 a 1681, 1812, 1813, 1884 a 1886, 1890, ou 1891 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos ou - uma sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1814 e têm um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou - uma sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1675 ou 1676 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou - uma sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1677 ou 1678 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1784, 1836 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1786, 1838 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1780 e têm um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1785, 1837 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[141] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 30, outra região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1772, e outra região preferida do éxon 30 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1773. De preferência, o oligonucleotídeo compreende:- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1688, 1689, 1839, 1840, 1841, 1842, 1843 ou 1844 e têm um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 e têm um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1849, 1850 e têm um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1787, 1851 e têm um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[142] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 31, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 129, e uma região preferida do éxon 31 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 130.

[143] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 32, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 131, e uma região preferida do éxon 32 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 132.

[144] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 35, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 137, e uma região preferida do éxon 35 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 138.

[145] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 42, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 151, e uma região preferida do éxon 42 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 152.

[146] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 44, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 153, e uma região preferida do éxon 44 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 154.

[147] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 47, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 157, e uma região preferida do éxon 47 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 158.

[148] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 48, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 159, e uma região preferida do éxon 48 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 160.

[149] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 55, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 167, e uma região preferida do éxon 55 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 168.

[150] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 57, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 169, e uma região preferida do éxon 57 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 170.

[151] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 60, uma região preferida do éxon 10 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 173, e uma região preferida do éxon 60 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 174.

[152] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1673 ou compreende a SEQ ID NO: 1673, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[153] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1675 ou compreende a SEQ ID NO: 1675 e tem um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[154] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1677 ou compreende a SEQ ID NO: 1677, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[155] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1679 ou compreende a SEQ ID NO: 1679, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Um oligonucleotídeo preferido compreende a sequência de bases SEQ ID NO:1679 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Opcionalmente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 de U da SEQ ID NO:1679 foram substituídos por uma T. Em uma modalidade preferida, todas as U da SEQ ID NO:1679 foram substituídos por T. Um oligonucleotídeo preferido compreendendo a SEQ ID NO: 1679 compreende qualquer dos produtos químicos aqui anteriormente definidos: uma modificação de base e/ou uma modificação de açúcar e/ou uma modificação da cadeia principal.

[156] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1681 ou compreende a SEQ ID NO: 1681, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[157] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1684 ou compreende a SEQ ID NO: 1684 e tem um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[158] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1685 ou compreende a SEQ ID NO: 1685 e tem um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[159] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1686 ou compreende a SEQ ID NO: 1686 e tem um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[160] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1688 ou compreende a SEQ ID NO:1688 e tem um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Um oligonucleotídeo preferido compreende a sequência de bases SEQ ID NO:1688 e tem um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Opcionalmente, 1, 2, 3, 4, 5, 6 de U da SEQ ID NO: 1688 foram substituídas por uma T. Em uma modalidade preferida, todas as U da SEQ ID NO:1688 foram substituídos por T. Um oligonucleotídeo preferido que compreende a SEQ ID NO: 1688 compreende qualquer um dos produtos químicos aqui anteriormente definidos: uma modificação de base e/ou uma modificação de açúcar e/ou uma modificação da cadeia principal.

[161] Para cada um dos oligonucleotídeos representados pela SEQ ID NO:1673, 1675, 1677, 1679, 1681, 1684, 1685, 1686 e 1688, o primeiro éxon de distrofina é o éxon 10. No entanto, o segundo éxon de distrofina é o éxon 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48, 55, 57, ou 60. Isto significa que usando qualquer um destes oligonucleotídeos a formação de vários transcritos in frames pode ocorrer, cada um levando à produção de uma proteína de distrofina truncada mas (semi)funcional.

[162] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 11 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 23, uma região preferida do éxon 23 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 191, e uma região preferida do éxon 23 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 192. De preferência, o oligonucleotídeo compreende:- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 e têm um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[163] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 13 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 30, uma região preferida do éxon 13 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 285, e uma região preferida do éxon 30 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 286. De preferência, o oligonucleotídeo compreende:- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 e têm um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860,1875 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1857, 1872 e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[164] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 23 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 42, uma região preferida do éxon 23 compreende ou consiste de SEQ ID NO:776, e uma região preferida do éxon 42 compreende ou consiste de SEQ ID NO: 777. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 1698 a 1703.

[165] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 34 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 53, uma região preferida do éxon 34 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1294, e uma região preferida do éxon 53 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1295. De preferência, o oligonucleotídeo compreende:- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 e têm um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou- uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 e têm um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[166] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 40 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 53, uma região preferida do éxon 40 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1477, e uma região preferida do éxon 53 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1478. De preferência, o oligonucleotídeo compreende:- uma sequência de bases conforme definida emqualquer uma das SEQ ID NO: 1804, 1880 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou - uma sequência de bases conforme definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1805, 1881 e têm um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[167] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 44 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 56, uma região preferida do éxon 44 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1577, e uma região preferida do éxon 56 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1558. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 e têm um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[168] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 45 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 51, uma região preferida do éxon 45 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1567, e uma região preferida do éxon 51 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1568. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 1730 a 1731.

[169] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 45 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 53, uma região preferida do éxon 45 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1569, e uma região preferida do éxon 53 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1570. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 1732 a 1737.

[170] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 45 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 55, uma região preferida do éxon 45 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1571, e uma região preferida do éxon 55 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1572. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 1704 a 1719, 1788, 1852, 1789, 1853.

[171] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1706 ou compreende a SEQ ID NO: 1706, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Um oligonucleotídeo preferido compreendendo a SEQ ID NO:1706 e que tem um comprimento de 25 nucleotídeos consiste de SEQ ID NO: 1706.

[172] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1707 ou compreende a SEQ ID NO: 1707 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Um oligonucleotídeo preferido compreendendo a SEQ ID NO:1707 e que tem um comprimento de 25 nucleotídeos consiste de SEQID NO: 1706.

[173] Um oligonucleotídeo preferido consiste em SEQ ID NO: 1713 ou compreende a SEQ ID NO: 1713 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Um oligonucleotídeo preferido compreendendo a SEQ ID NO:1713 e que tem um comprimento de 25 nucleotídeos consiste de SEQ ID NO: 1710.

[174] Os oligonucleotídeos preferidos compreendem uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 e têm um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[175] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 45 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 55, outra região preferida do éxon 45 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1774, e outra região preferida do éxon 55 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1775. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem uma sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[176] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 45 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 60, uma região preferida do éxon 45 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1577, e uma região preferida do éxon 60 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1578. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 1738 a 1741.

[177] Se o primeiro éxon de distrofina é o éxon 56 e o segundo éxon de distrofina é o éxon 60, uma região preferida do éxon 56 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1742, e uma região preferida do éxon 60 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1743. Os oligonucleotídeos preferidos compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 1720 a 1721.

[178] Oligonucleotídeos mais preferidos incluem:(a) a sequência de bases, tal como definida na SEQ ID NO: 1673 ou 1674 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(b) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1675 ou 1676 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(c) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1677 ou 1678 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(d) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1679 a 1681, e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(e) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1684 a 1686, e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(f) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1688 ou 1689 e têm um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou uma das SEQ ID NO: 1704-1706 e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos,(h) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1707 a 1709, e possuem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(i) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1710, 1713 a 1717, e têm um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[179] Os oligonucleotídeos ainda mais preferidos compreendem:(a) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1679 a 1681, 1778, 1812, 1813, 1884 a 1886, 1890, ou 1891, e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos ou SEQ ID NO: 1814 e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(b) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1688, 1689, ou 1839 a 1844, e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(c) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1673 ou 1674, e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(d) a sequência de bases, tal como definida na SEQ ID NO: 1675 ou 1676, e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(e) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1677 ou 1678, e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(f) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1684 a 1686, e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou(g) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1704 a 1706 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos,(h) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1707 a 1709 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (i) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1710, 1713 a 1717 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos ou (j) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1815 a 1819, e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (k) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1820, 1824, e tendo um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (l) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (m) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780, e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (n) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1822 e tendo um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (o) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (p) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835, e tendo um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (q) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1887 e têm um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (r) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1888 ou 1889 e e têm um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (s) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1827 e têm um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (t) uma sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1828, e têm um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (u) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1784, 1836, e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (v) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1786, 1838, e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (w) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1780 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (x) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1785, 1837, e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (y) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 e tendo um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (z) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1849, 1850 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (a1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1787, 1851, e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (b1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 e tendo um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (c1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (d1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862, e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (e1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (f1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (g1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873, e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (h1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (11) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (j1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1857, 1872, e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (k1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 e tendo um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (12) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (m1)a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1804, 1880, e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (n1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1805, 1881 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos, ou (o1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883, e tendo um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[180] O oligonucleotídeo de acordo com a invenção, que compreende ou consiste de uma sequência tal como definida por um número de SEQ ID também pretende englobar um oligonucleotídeo compreendendo a sequência de bases, tal como definida na SEQ ID. Os oligonucleotídeos que têm uma cadeia principal modificada (isto é, porções de açúcar modificadas e/ou ligações internucleosídicas modificadas) com respeito aos definidos pelas SEQ IDs estão também englobados no âmbito da invenção. Cada base de U em uma NO SEQ ID de um oligonucleotídeo tal como aqui identificado pode ser modificada ou substituída por uma T.

Composição

[181] Em um outro aspecto, é fornecida uma composição compreendendo um oligonucleotídeo conforme descrito na seção anterior intitulada “Oligonucleotídeo”. Essa composição preferencialmente compreende ou consiste de um oligonucleotídeo conforme definido anteriormente. Uma composição preferida compreende um único oligonucleotídeo, tal como definido acima. É, portanto, claro que o salto de pelo menos o referido primeiro e o referido segundo éxon é obtido utilizando um único oligonucleotídeo, e não utilizando um coquetel de oligonucleotídeos distintos.

[182] Em uma modalidade preferida, a referida composição é para utilização como um medicamento. A referida composição é, portanto, uma composição farmacêutica. Uma composição farmacêutica compreende normalmente um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade preferida, uma composição da presente invenção compreende um composto tal como aqui definido e, opcionalmente, compreende ainda uma formulação, agente de enchimento, conservante, solubilizante, veículo, diluente, excipiente, sal, adjuvante e/ou solvente farmaceuticamente aceitáveis. Tais veículo, agente de enchimento, conservante, solubilizante, diluente, sal, adjuvante, solvente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis podem, por exemplo, serem encontrados em Remington. O composto como descrito na invenção pode possuir pelo menos um grupo ionizável. Um grupo ionizável pode ser uma base ou ácido, e pode ser carregado ou neutro. Um grupo ionizável pode estar presente como par de íons com um contra-íon adequado que transporta a carga oposta(s). Exemplos de contra-íons catiônicos são o sódio, potássio, césio, Tris, lítio, cálcio, magnésio, trialquilamônio, trietilamônio, e tetraalquilamônio. Exemplos de contra-íons aniônicos são o cloreto, brometo, iodeto, lactato, mesilato, acetato, trifluoroacetato, dicloroacetato, e citrato. Exemplos de contra-íons foram descritos (Kumar L., que é incorporado aqui em sua totalidade por referência). Portanto, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo da invenção é posto em contato com uma composição compreendendo tais grupos ionizáveis, preferencialmente Ca2+para formar um complexo de quelato de oligonucleotídeo compreendendo dois ou mais oligonucleotídeos idênticos ligados por um cátion multivalente tal como aqui já definido.

[183] Uma composição farmacêutica pode ser formulada ainda para uma ajuda adicional na melhoria da estabilidade, solubilidade, absorção, biodisponibilidade, atividade farmacocinética, farmacodinâmica, e absorção celular do referido composto, em particular, formulações compreendendo excipiente ou conjugados capazes de formar complexos, nanopartículas, micropartículas, nanotubos, nanogéis, hidrogéis, poloxâmeros ou plurônicos, polimersomas, colóides, microbolhas, vesículas, micelas, lipoplexos, e/ou lipossomas. Exemplos de nanopartículas incluem nanopartículas poliméricas, nanopartículas de ouro, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de sílica, nanopartículas lipídicas, nanopartículas de açúcar, nanopartículas de proteína e nanopartículas de peptídeos.

[184] Uma composição preferida compreende pelo menos um excipiente que pode ajudar ainda mais a melhorar o direcionamento e/ou entrega da referida composição e/ou do referido oligonucleotídeo para e/ou em um músculo e/ou uma célula. A célula pode ser uma célula muscular.

[185] Outra composição preferida pode compreender pelo menos um excipiente categorizado como um segundo tipo de excipiente. Um segundo tipo de excipiente pode compreender ou conter um grupo conjugado como aqui descrito para aumentar a orientação e/ou administração da composição, e/ou do oligonucleotídeo da invenção a um tecido e/ou célula, e/ou em um tecido e/ou célula, como por exemplo, tecido muscular ou célula. Ambos os tipos de excipientes podem ser combinados em conjunto em uma única composição, tal como aqui identificada. Grupos conjugados preferidos são revelados na parte dedicada para as definições.

[186] O técnico especialista no assunto pode selecionar combinar e/ou adaptar um ou mais dos excipientes acima referidos ou alternativos, e outros sistemas de administração para formular e fornecer um composto para uso na presente invenção.

[187] Tal composição farmacêutica da invenção pode ser administrada em uma concentração eficaz em conjunto de vezes a um animal, preferencialmente um mamífero. O mamífero mais preferido é um ser humano. Um composto ou uma composição como aqui definidos para utilização de acordo com a invenção podem ser adequadaos para administração direta a uma célula, tecido e/ou um órgão in vivo deindivíduos, de preferência os referidos indivíduos são afetados por ou em risco de desenvolver BMD ou DMD, e podem ser administrados diretamente in vivo, ex vivo ou in vitro. A administração pode ser por viasistémica e/ou parenteral, por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraventricular, intratecal, intramuscular, intranasal, enteral, intravítrea, intracerebral, epidural ou via oral.

[188] De preferência, uma tal composição farmacêutica da invenção pode ser encapsulada sob a forma de uma emulsão, suspensão, comprimido, pastilha, cápsula ou gel mole para administração por via oral, ou sob a forma de aerossol ou de pó seco para administração ao trato respiratório e pulmões.

[189] Em uma modalidade, um composto da invenção pode ser utilizado juntamente com outro composto já conhecido para ser utilizado para o tratamento da referida doença. Estes outros compostos podem ser usados para retardar a progressão da doença, para reduzir comportamentos ou movimentos anormais, para reduzir a inflamação do tecido muscular, para melhorar a função das fibras musculares, a integridade e/ou a sobrevivência e/ou melhorar, aumentar ou restaurar a função cardíaca. Exemplos são, mas não estão limitados a, um esteróide, preferencialmente um (glico) corticosteróide, um inibidor de ECA (de preferência perindopril), um bloqueador do receptor de tipo 1 da angiotensina II (de preferência losartana), um inibidor do fator de necrose tumoral alfa (TNFα) , um inibidor de TGFD (de preferência, decorina), biglicano recombinante humano, uma fonte de mIGF-1, um inibidor de miostatina, manose-6- fosfato, um antioxidante, um inibidor do canal iônico, um inibidor da protease, um inibidor da fosfodiesterase (de preferência um inibidor de PDE5, tais como sildenafil ou tadalafil), L-arginina, bloqueadores de dopamina, amantadina, tetrabenazina, e/ou co-enzima Q10. Esta utilização combinada pode ser uma utilização sequencial: cada componente é administrado em uma composição distinta. Alternativamente, cada composto pode ser utilizado em conjunto em uma única composição.

Uso

[190] Em um aspecto adicional, é fornecido o uso de uma composição ou um composto tal como aqui descritos para o uso como um medicamento ou parte da terapia, ou aplicações em que o composto exerce a sua atividade intracelular.

[191] Em uma modalidade preferida, um composto ou composição da invenção é para o uso como um medicamento, em que o medicamento é para a prevenção, retardamento, melhora e/ou tratamento de uma doença tal como aqui definida, de preferência DMD ou BMD.

Método para prevenir, retardar, melhorar e/ou tratar de uma doença

[192] Em um aspecto adicional, é fornecido um método para prevenir, retardar, melhorar e/ou tratar de uma doença tal como aqui definida, de preferência DMD ou BMD. A referida doença pode ser prevenida, tratada, retardada, ou melhorada em um indivíduo, em uma célula, tecido ou órgão do referido indivíduo. O método compreendendo a administração de um oligonucleotídeo ou de uma composição da invenção ao referido indivíduo ou um sujeito em necessidade do mesmo.

[193] O método de acordo com a invenção, em que um oligonucleotídeo ou composição, tal como aqui definidos, podem ser adequados para administração a uma célula, tecido e/ou um órgão in vivo deindivíduos, de preferência indivíduos afetados por BMD ou DMD, ou em risco de desenvolver tal doença, e pode ser administrado in vivo, ex vivo ou in vitro. Um indivíduo ou sujeito com essa necessidade é, de preferência um mamífero, mais preferencialmente um ser humano.

[194] Em uma modalidade, em um método da invenção, uma concentração de um oligonucleotídeo ou composição é variada de 0,01 nM a 1. Mais preferivelmente, a concentração utilizada é 0,02 a 400 nM, ou de 0,05 a 400 nM, ou de 0,1 a 400 nM, ainda mais preferivelmente de 0,1 a 200 nM.

[195] Os intervalos de doses de um oligonucleotídeo ou composição de acordo com a invenção são de preferência concebidos com base em estudos de doses crescentes em ensaios clínicos (uso in vivo), para os quais existem requisitos protocolares rigorosos. Um oligonucleotídeo, tal como aqui definido, pode ser utilizado em uma dose a qual é variada entre 0,01 e 200 mg/kg ou 0,05 a 100 mg/kg, ou 0,1 a 50 mg/kg, ou 0,1 a 20 mg/kg, de preferência de 0,5 a 10 mg/kg.

[196] Os intervalos de concentração ou dose de um oligonucleotídeo ou composição tal como fornecidos acima são concentrações ou doses preferidas para utilizações in vitro ou ex vivo. O técnico especialista no assunto entenderá que, dependendo da identidade do oligonucleotídeo utilizado, a célula alvo a ser tratada, o gene-alvo e os seus níveis de expressão, o meio utilizado e as condições de transfecção e de incubação, a concentração ou dose do referido oligonucleotídeo utilizado podem ainda variar, e podem necessitar de serem otimizados para qualquer outros.

Definições

[197] “Identidade de sequência”, tal como é conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de ácido nucleico (polinucleotídeo ou nucleotídeo), tal como determinado por comparação das sequências. Na técnica, a porcentagem de “identidade” ou “similaridade” indica o grau de relação de sequências entre sequências de ácidos nucleicos, tal como determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências. “Identidade” pode ser substituída por “similaridade” aqui. De preferência, a porcentagem de identidade é determinada por comparação de toda a SEQ ID NO como aqui identificada. No entanto, parte de uma sequência também pode ser usada. Parte de uma sequência neste contexto significa, pelo menos, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de uma dada sequência ou SEQ ID NO.

[198] “Identidade” e “similaridade” podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo mas não limitados aos descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer Gribskov, M.e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

[199] Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade e semelhança entre duas sequências incluem, por exemplo, o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BestFit and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). A família de programas BLAST 2.0, que pode ser usada para pesquisas de similaridade de banco de dados inclui: por exemplo, BLASTN para sequências de consulta de nucleotídeos contra sequências de nucleotídeos do banco de dados. Os programas da família BLAST 2.0 estão disponíveis ao público a partir do NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al.,NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido pode também ser utilizado para determinar a identidade.

[200] Os parâmetros preferidos para a comparação de ácido nucleico incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Matriz de comparação: compatibilidades = + 10, incompatibilidade = 0; Penalidade para Gap: 50; Penalidade para Comprimento de Gap: 3. Disponível como o programa Gap da Genetics Computer Group, localizada em Madison, Wis. Dados acima são os parâmetros de omissão para comparações de ácidos nucleicos.

[201] Outro método preferido para determinar a identidade e similaridade de sequências é o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, SB e Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453, Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).

[202] Outro método preferido para determinar a identidade e similaridade de sequências é pela utilização do EMBOSS Matcher e o algoritmo Waterman-Eggert (alinhamento local de duas sequências; [Schoniger and Waterman, Bulletin of Mathematical Biology 1992, Vol. 54 (4), pp. 521-536; Vingron and Waterman, J. Mol. Biol. 1994; 235(1), p1-12.]). http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.htmlou http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/matcher. As definições dos parâmetros utilizados neste algoritmo são encontradas no seguinte sítio eletrônico: http://emboss.sourceforge.net/docs/themes/AlignFormats.html #id. De preferência, as configurações padrão (Matriz: EDNAFULL, Gap_penalty: 16, Extend_penalty: 4) são usadas. Emboss Matcher fornece os melhores alinhamentos locais entre duas sequências, mas alinhamentos alternativos são fornecidos também. A Tabela 2 apresenta os melhores alinhamentos locais entre dois éxons diferentes, de preferência os éxons de distrofina, que são preferencialmente utilizados para a concepção de oligonucleotídeos. No entanto, também alinhamentos alternativos e, portanto, as regiões de identidade alternativas entre dois éxons podem ser identificadas e utilizadas para a concepção de oligonucleotídeos, que também é parte desta invenção.

[203] Ao longo do pedido, o termo “se liga”, “se direciona”, “hibridiza” poderiam ser utilizados intercambiavelmente quando utilizados no contexto de um oligonucleotídeo que é complementar reverso para uma região de um pré-RNAm, tal como aqui identificado. De igual modo, as expressões “é capaz de se ligar a”, “é capaz de se direcionar” e “é capaz de hibridizar” podem ser utilizados alternadamente para indicar um oligonucleotídeo que tem uma certa sequência que permite a ligação, o direcionamento, ou a hibridização com uma sequência alvo. Sempre que uma sequência alvo é definida aqui ou conhecida na técnica, o técnico especialista no assunto é capaz de construir todas as estruturas possíveis do referido oligonucleotídeo, utilizando o conceito de complementaridade reversa. A este respeito, será entendido que um número limitado de desemparelhamentos de sequência ou lacunas entre o oligonucleotídeo da invenção e as sequências-alvo no primeiro e/ou segundo éxon é permitida, desde que a ligação não seja afetada, como discutido acima. Assim, um oligonucleotídeo que é capaz de se ligar a uma determinada sequência alvo, pode ser considerado como um oligonucleotídeo que é complementar reverso para aquela sequência alvo. No contexto da invenção, “hibridiza” ou “é capaz de hibridizar” é utilizado sob condições fisiológicas em uma célula, de preferência uma célula humana, a menos que indicado de outra forma.

[204] Tal como aqui utilizado, “hibridização” refere-se ao emparelhamento de compostos oligoméricos complementares (por exemplo, um composto anti-sentido e o seu ácido nucleico alvo). Embora não se limitando a um mecanismo particular, o mecanismo mais comum de emparelhamento envolve a ligação de hidrogênio, que pode ser de Watson-Crick, de Hoogsteen ou ligação de hidrogênio de Hoogsteen invertida, entre nucleosídeos complementares ou bases nucleotídicas (nucleobases). Por exemplo, a base natural adenina é nucleobase complementar à nucleobases natural timina, 5-metiluracila, uracila, que pareia através da formação de ligações de hidrogênio. A base natural guanina é nucleobase complementar às bases naturais citosina e 5- metilcitosina. A hibridização pode ocorrer sob diferentes circunstâncias.

[205] Do mesmo modo, “complementaridade reversa” é usada para identificar duas sequências de nucleotídeos que são capazes de hibridizar uma com a outra, enquanto que uma das sequências está orientada de 3 'para 5', e a outra no sentido reverso, ou seja, de 5' para 3'. Assim, um nucleosídeo A em uma primeira sequência de nucleotídeos é capaz de emparelhar com um nucleosídeo A* em uma segunda sequência de nucleotídeos através das suas respectivas nucleobases, e um nucleosídeo B, localizado na posição 5' do nucleosídeo supramencionado A na primeira sequência de nucleotídeos, é capaz de emparelhar com um nucleosídeo B*, que está localizado na posição 3' do nucleosídeo supramencionado A* na segunda sequência de nucleotídeos. No contexto da presente invenção, a primeira sequência de nucleotídeos é tipicamente um oligonucleotídeo da invenção, e a segunda parte de sequência de nucleotídeos de um éxon de um pré-mRNA, de preferência, o pré-mRNA de distrofina. Um oligonucleotídeo é de preferência dito ser complementar reverso a uma região de um éxon (o primeiro e/ou segundo éxon) quando o referido oligonucleotídeo tem pelo menos 45, 50, 55, 60, 65 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% de complementaridade reversa com a referida região do referido primeiro e/ou segundo éxon. De preferência, a complementaridade reversa é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[206] Dentro do contexto da presente invenção, os excipientes incluem polímeros (por exemplo, polietilenoimina (PEI), polipropileneimina (PPI), derivados de dextrano, butilcianoacrilato (PBCA), hexilcianoacrilato (PHCA), poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), poliaminas (por exemplo, espermina, espermidina, putrescina, cadaverina), quitosana, poli(amido aminas) (PAMAM), poli (amina éster), éter polivinílico, polivinilpirrolidona (PVP), polietileno glicol (PEG) ciclodextrinas, ácido hialurônico, ácido colomínico, e derivados dos mesmos, dendrímeros (por exemplo, poli (amidoamina)), lipídeos (por exemplo, 1,2- dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP), cloreto de dioleoildimetilamônio (DODAC), derivados de fosfatidilcolina [por exemplo, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)], derivados de liso-fosfatidilcolina [por exemplo, 1- estearoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (S-LysoPC)], esfingomielina, 2-{3-[Bis-(3-amino-propil)-amino]- propilamino}-N-ditetracedil-carbamoil metilacetamida (RPR209120), derivados de fosfoglicerol (por exemplo, 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, sais de sódio (DPPG- Na), derivados de ácido fosfatídico [ácido 1,2-distearoil- sn-glicero-3-fosfatídico, sal de sódio (DSPA), derivados de fosfatidiletanolamina [por exemplo, dioleoil-L-R- fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DSPE), 2-dftanoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DPhyPE),], N-[1-(2,3-dioleoilóxi)propil]- N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), N-[1-(2,3-dioleilóxi)propil]- N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), 1,3-di-oleoilóxi-2-(6- carbóxi-espermil)-propilamida (DOSPER), (1,2- dimiristiolxipropil-3-dimetilhidroxi etil amônio (DMRIE), (N1-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonana-1,9-diamina(CDAN), brometo de dimetildioctadecilamônia (DDAB), 1- palmotoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC), (ácido b-L-Arginil-2,3-L-diaminopropiônico N-palmitil-N-olelil- amida triclocamundongo (AtuFECT01), derivados de N,N- dimetil-3-aminopropano [por exemplo, 1,2-distearoilóxi-N,N- dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleilóxi-N,N-dimetil- 3-aminopropano (DoDMA), 1,2-Dilinoleilóxi-N,N-3- dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4- dimetilaminometil [1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), derivados de fosfatidilserina [1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina, sais de sódio (DOPS)], colesterol, proteínas (por exemplo, albumina, gelatinas, atelocolágeno), e peptídeos (por exemplo, protamina, PepFects, NickFects, poliarginina, polilisina, CADY, MPG).

[207] Dentro do contexto da presente invenção, grupos conjugados são selecionados dentre o grupo consistindo de porções de direcionamento, porções de aumentar a estabilidade, porções de aumentar a captação, porções de aumentar a solubilidade, porções de reforço farmacocinético, porções de reforço farmacodinâmico, porções de aumentar a atividade, moléculas repórter e medicamentos, em que estes porções podem ser peptídeos, proteínas, carboidratos, polímeros, derivados de etileno-glicol, vitaminas, lipídeos, radicais polifluoroalquilo, esteróides, colesterol, porções fluorescentes e porções marcadas radioativamente. Grupos conjugados podem ser opcionalmente protegidos, e podem ser ligados diretamente a um oligonucleotídeo da invenção ou através de um ligante bivalente ou multivalente.

[208] Grupos conjugados incluem porções que aumentam o direcionamento, a absorção, a solubilidade, a atividade, a farmacodinâmica, a farmacocinética, ou que diminuem a toxicidade. Exemplos de tais grupos incluem peptídeos (por exemplo, glutationa, poliarginina, peptídeos RXR (ver, por exemplo, Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 525), poliornitina, TAT, TP10, pAntp, polilisina, NLS, penetratin, MSP, ASSLNIA, MPG, CADY, Pep-1, Pip, SAP, SAP(E), Transportan, buforina II, polimixina B, histatina, CPP5, NickFects, PepFects), vivo-porter, proteínas (por exemplo,anticorpos, avidina, Ig, transferrina, albumina), carboidratos (por exemplo, glicose, galactose, manose, maltose, maltotriose, ribose, trealose, glicosamina, N- acetilglicosamina, lactose, sucrose, fucose, arabinose, talose, ácido siálico, ácido hialurônico, ácido neuramínico, ramnose, quinovose, galactosamina, N-acetilgalactosamina, xilose, lixose, frutose, manose-6-fosfato, 2-desoxirribose, glucal, celulobiose, chitobiose, chitotriose), polímeros (por exemplo, polietileno glicol, polietilenoimina, ácido poliláctico, poli(amidoamina)), derivados de etileno-glicol (por exemplo, trietilenoglicol, tetraetilenoglicol), vitaminas solúveis em água (por exemplo, a vitamina B, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C), vitaminas solúveis em gordura (por exemplo, vitamina A, D, D2, D3, E, K1, K2, K3), lipídeos (por exemplo, palmitil, miristil, oleil, estearil, batil, glicerofosfolipídeo, glicerolipídeo, esfingolipídeo, ceramida, cerebrosídeo, esfingosina, esterol, prenol, erucil, araquidonil, linoleil, linolenil, araquidil, butiril, sapeinil, elaidil, lauril,beenílico, nonilo, decilo, undecilo, octilo, heptilo, hexil, pentil, DOPE, DOTAP, terpenil, diterpenos, triterpenóides), porções de polifluoroalquila (por exemplo, perfluoro [1H, 1H, 2H, 2H]- alquila), fármacos aprovados de MW < 1500 Da que têm afinidade para as proteínas específicas (por exemplo, AINEs, tais como o ibuprofeno (mais são descritos na patente US 6,656,730, aqui incorporados por referência), antidepressivos, antivirais, antibióticos, agentes alquilantes, amebicidas, analgésicos, androgênios, inibidores da ECA, anorexiantes, antiácidos, anti- helmínticos, anti-angiogênicos, antiadrenérgicos, antianginosos, anticolinérgicos, anticoagulantes, anticonvulsivantes, antidiabéticos, antidiarreicos, antidiuréticos, antídotos, antifúngicos, anti-eméticos, anti-vertigem, anti-gotas, antigonadotrópicos, anti- histamínicos, anti-hiperlipidêmicos, anti-hipertensivos, antimalrials, anti-enxaquecas, antineoplásicos, antipsicóticos, anti-reumáticos, anti-tireóides, anti- toxinas, antitussígenos, ansiolíticos, anticoncepcionais, estimulantes do sistema nervoso central, quelantes, agentes cardiovasculares, descongestionantes, agentes dermatológicos, diuréticos, expectorantes, de diagnóstico, agentes gastrointestinais, anestésicos, glicocorticóides, antiarrítmicos, imunoestimulantes, imunossupressores, laxantes, agentes hansenostáticos metabólicos, agentes respiratórios, mucolíticos, relaxantes musculares, nutracêuticos, vasodilatadores, trombolíticos, tônicos uterinos, vasopressores),compostos naturais de MW <2000 Da (por exemplo, antibióticos, eicosanóides, alcalóides, flavonóides, terpenóides, co-fatores de enzimas, policetídeos), esteróides (por exemplo, prednisona, prednisolona, dexametasona, lanosterol, ácido eólico, estrano, androstano, pregnano, cholane, colestano, ergosterol, colesterol, cortisol, cortisona, deflazacort), triterpenóides pentacíclicos (por exemplo, ácido 18β- glicirretínico, ácido ursólico, amirina, carbenoloxone, enoxolona, acetoxolone, ácido betulínico, ácido asiático, eritrodiol, ácido oleanólico), poliaminas (por exemplo, espermina, espermidina, putrescina, cadaverina), porções fluorescentes (por exemplo, FAM, carboxifluoresceína, FITC, TAMRA, JOE, HEX, TET, rodamina, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, CW800, BODIPY, AlexaFluors, DABCYL, DNP), moléculas repórter (por exemplo, acridinas, biotinas, digoxigenina, porções (radio) isotopicamente marcada (por exemplo, com 2H, 13C, 14C, 15N, 18O, 18F, 32P, 35S, 57Co, 99mTc, 123I, 125I, 131I, 153Gd) e as combinações dos mesmos. Tais grupos conjugados podem ser ligados diretamente aos compostos da invenção, ou atravésde um ligante. Este ligante pode ser bivalente (obtendo-se uma mistura 1:1 de conjugado) ou multivalente, obtendo-se um oligômero com mais do que um grupo conjugado. Procedimentos para acoplamento de um tal grupo conjugado, diretamente ou atravésde um ligante, ao oligômero, de acordo com a invenção, são conhecidos na técnica. Também dentro do contexto da invenção está o uso de nanopartículas para as quais os oligonucleotídeos da invenção são ligados covalentemente, na medida em que tais constructos são chamados ácidos nucleicos esféricos (SNAS), como por exemplo, descrito em J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12192 (Hurst et al, aqui incorporado na sua totalidade por referência).

[209] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo “compreender” e suas conjugações são usados em seu sentido não limitativo para significar que os itens seguindo a palavra estão incluídos, mas os itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, o verbo “consistir” pode ser substituído por “consistir essencialmente em” significando que um oligonucleotídeo ou uma composição como aqui definidos, podem compreender componente(s) adicional do que os especificamente identificados, o referido componente(s) adicional não alterando a característica única da invenção. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais do que um dos elementos está presente, a menos que o contexto claramente exija que seja um, e apenas um dos elementos. Os artigos indefinidos “um” ou “uma”, portanto, geralmente significampelo menos um”.

[210] As palavras “cerca de” ou “aproximadamente”, quando utilizadas em associação com um valor numérico (cerca de 10), de preferência significa que o valor pode ser o valor dado de 10 mais ou menos 1% do valor.

[211] Cada modalidade tal como é aqui identificada pode ser combinada entre si, salvo indicação ao contrário. Todas as referências de patentes e literaturas citadas no presente relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[212] Os exemplos que se seguem são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de qualquer forma.

Exemplos Tabelas 1 a 3

[213] Tabela 1. Lista de possíveis combinações de éxons no transcrito do gene DMD para as quais o éxon U (a montante) tem um quadro aberto de leitura continuado com o éxon D (a jusante) se os éxons U + 1 (um primeiro éxon) para D-1 (um segundo éxon), e quaisquer éxons no meio, são removidos da transcrição.

[214] Tabela 2. Lista das regiões de éxon: sequência de trechos com (parcialmente) alta identidade de seqüência ou similaridade (pelo menos 50%) entre dois éxons de distrofina diferentes, conforme identificados como o melhor alinhamento de pares por EMBOSS Matcher usando as configurações padrão (Matriz: EDNAFULL, Gap_penalty: 16, Extend_penalty: 4) (http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss matcher/nucleotide.h tml) .O salto destes éxons, e de preferência quaisquer éxons entre, resultaria em um transcrito de DMD in frame (como na Tabela 1).

[215] Tabela 3. Lista de sequências de bases preferidas dos oligonucleotídeos de acordo com a invenção. Os oligonucleotídeos compreendendo estas sequências de bases são capazes de se ligarem a regiões altamente semelhantes (trechos de sequências com > 50% de identidade) em dois éxons de DMD diferentes (tal como exemplificado na Tabela 2), ecé apazes de induzir o salto destes dois éxons, e quaisquer xons do meio para gerar um trancrito de DMD in frame.

*D = 2,6-diaminopurina; C = 5-metilcitosina; X = C or 5- metilcitosina, Y = U or 5-metiluracila; Z = A ou 2,6-

[216] Tabela 6. Lista de combinações de éxons adicionais e/ou mais preferidos, de regiões de identidade de éxons adicionais e/ou mais preferidas, e oligonucleotídeos adicionais e/ou mais preferidos com as suas sequências de bases, modificações químicas e números de identificação da sequência, em que * = LNA, C = 5- metilcitosina, U = 5-metiluracila, D = 2,6- diaminopurina, X = C ou 5-metilcitosina, Y = U ou 5-metiluracila, Z = A ou 2,6-diaminopurina, e <.> todos 2'-flúor nucleotídeos (como na SEQ ID NO: 1844).

Exemplos 1 a 5 Materiais e métodos

[217] A concepção dos oligonucleotídeos foi baseada principalmente na complementaridade reversa para trechos de sequência específicos, altamente semelhante em dois éxons de DMD diferentes, conforme identificado por EMBOSS Matcher, e tal como descrito na Tabela 2. Outros parâmetros de sequência foram tomados em consideração, em que a presença de estruturas secundárias de RNA parcialmente abertas/fechadas nos referidos trechos de sequências (como previsto por RNA structure version 4.5 ou RNA mfold version 3.5 (Zuker, M.) e/ou a presença de sítios de ligação de proteína-SR putativa nos referidos trechos de sequências (como previsto pelo software ESE-finder (Cartegni L, et al. 2002 and Cartegni L, et al, 2003). Todos os AONs foram sintetizados por Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Netherlands) , ou obtidos a partir de fonte comercial (ChemGenes, US), e contêm cadeias principais de 2’-O-metil RNA e fosforotioato de comprimento total (PS). Todos os oligonucleotídeos foram 2’-O-metil fosforotioato RNA, e sintetizados em escala de 10 μmol usando um sintetizador OP-10 (GE/ÂKTA OligoPilot), através de protocolos de fosforamidita padrão. Os oligonucleotídeos foram clivados e desprotegidos em uma sequência de duas etapas (DIEA seguida por tratamento com NH4OH conc.), purificados por HPLC, e dissolvidos em água, e um excesso de NaCl foi adicionado aos íons de troca. Após evaporação, os compostos foram redissolvidos em água, dessalinizados por FPLC e liofilizados. A espectrometria de massa confirmou a identidade de todos os compostos, e a pureza (determinada por UPLC) foi considerada aceitável para todos os compostos (> 80%). Para os experimentos in vitroaqui descritos, 50 μ M de soluções de trabalho de AONs foram preparados em tampão de fosfato (pH 7,0).

Cultura de tecidos, transfecção e análise por RT-PCR

[218] As células musculares de controle diferenciadas humanas saudáveis (miotubos) foram transfectadas em placas de 6-poços, a uma concentração padrão de AON de 400 nM, de acordo com os procedimentos operacionais padrão não-GLP. Para a transfecção, foi usada polietilenimina (ExGen500; Fermentas Netherlands), (2 μl per μg AON, in 0,15M NaCl). Procedimentos de transfecção acima mencionados foram adaptados de material e métodos previamente relatados (Aartsma-Rus A., et al., 2003). Ao fim de 24 horas após a transfecção, o RNA foi isolado e analisado por RT-PCR. Resumidamente, para gerar cDNA, uma mistura de hexâmero aleatório (1,6 μg/μl; Roche Netherlands) foi utilizada na reação de transcriptase reversa (RT) na entrada de 500-1000 ng de RNA. A análise de PCR foi, subsequentemente, feita em 3μl de cDNA para cada amostra, e incluiu um PCR inicial e aninhado utilizando primers específicos do gene de DMD (ver Tabelas 4 e 5). O isolamento do RNA e a análise de RT-PCR foram realizados de acordo com os procedimentos operacionais não-GLP padrão, adaptados a partir de material e métodos previamente relatados (Aartsma- Rus A., et al., 2002; and Aartsma-Rus A., et al, 2003). Os produtos de RT-PCR foram analisados por eletroforese em gel (geles de agarose 2%). Os fragmentos de RT-PCR resultantes foram quantificados através da análise de DNA Lab-on-a-chip (Agilent Technologies USA; DNA 7500 LabChips). Os dados foram processados pelo software “Agilent 2100 Bioanalyzer” e Excel 2007. A razão entre os produtos transcritos menores (contendo o esperado salto de éxon múltiplo) para a quantidade total de produtos transcritos foi avaliada (representando as eficiências de salto em porcentagens), e diretamente comparada com a de células não transfectadas. Os fragmentos de PCR foram também isolados a partir de géis de agarose (kit de extração de gel QIAquick, Qiagen Holanda) para a verificação da sequência (sequenciamento Sanger, BaseClear, Holanda).

[219] Tabela 4. Conjuntos de primer de PCR utilizados para a detecção do salto dos éxons alvos.

[220] Tabela 5. Sequências dos primers

Resultados Exemplo 1. Segmentação do trecho de sequência com alta similaridade no éxon 10 e 18 com AONs em diferentes locais.

[221] Com base em um trecho de sequência altamente semelhante (63%) nos éxons 10 (SEQ ID NO: 109) e 18 (SEQ ID NO: 110), uma série de AONs foram concebidos dispersos sobre o referido trecho de sequência, ou 100% de complementaridade reversa ao éxon 10 (PS814; SEQ ID NO: 1675, PS815; SEQ ID NO: 1677, PS816; SEQ ID NO: 1679) ou ao éxon 18 (PS811; SEQ ID NO: 1673). Após transfecção em culturas de miotubos de controle saudáveis humanos, análise de RT-PCR demonstrou que todas as quatro AONs foram capazes de induzir o salto do éxon 10 e 18 (confirmado por análise da sequência) (Figura 1). PS811 e PS816 têm maiores percentuais de complementaridade reversa com ambos os éxons (Fig.1b), e foram mais eficientes com eficiências de salto de éxons 10 a 18 de 70% e 66%, respectivamente (Figura 1C). PS814 foi menos eficiente, o qual pode ter sido inerente à sua localização e/ou o comprimento mais curto (21 versus 25 nucleotídeos) e, portanto, menor afinidade de ligação ou estabilidade. Nenhum salto de éxon 10 a 18 foi observado em células não tratadas (NT). Estes resultados foram altamente reprodutíveis (éxons 10 a 18 saltando por PS816 em 20/20 transfecções diferentes), e demonstram que o salto de um trecho de multi-éxon do éxon 10 e 18 é possível pelo uso de um único AON que é capaz de se ligar a ambos os éxons 10 e 18, em uma região com elevada semelhança de sequências (63%), e que é capaz de induzir o salto destes éxons e todos os éxons no meio. Embora vários fragmentos saltantes de éxon adicionais possam ser obtidos nesta região transcrita, o transcrito resultante em que o éxon 9 foi diretamente emendado ao 19 (um transcrito in frame) foi mais abundante em todos os experimentos.Exemplo 2. Direcionamento do trecho de sequência com alta similaridade nos éxons 10 e 18 com AONs de diferentes comprimentos.

[222] Dentro do trecho de sequência altamente semelhante nos éxons 10 (SEQ ID NO: 109) e 18 (SEQ ID NO: 110), foi avaliado o efeito de AONs com diferentes comprimentos para identificar o comprimento mínimo mais eficaz. A seguir à transfecção de PS816 (um 25-mer; SEQ ID NO:1679), PS1059 (um 21-mer; SEQ ID NO:1684), ou PS1050 (um 15-mer; SEQ ID NO:1682) nas células musculares humanas de controle (ou seja, os miotubos diferenciados), a análise de RT-PCR demonstrou que as três AONs foram capazes de induzir o salto do éxon 10 a 18 (confirmado por análise de sequência) (Fig.2a, B). PS816 e PS1059 foram mais eficientes (68% e 79% respectivamente). O PS1050 mais curto foi menos eficaz (25%). Nenhum salto de éxon 10 a 18 foi observado em células não tratadas (NT). Estes resultados indicam que o salto de um trecho multi-éxon do éxon 10 a 18 é possível usando AONs de 15, 21 e 25 nucleotídeos. AONs mais longos estão previstos para funcionar também. O 21-mer PS1059 foi o candidato mais eficaz, mais curto. O 15-mer PS1050 foi menos eficiente, que pode ter sido inerente à sua complementaridade reversa reduzida ao éxon 18 (47%; Fig 2B), e/ou a afinidade reduzida ou estabilidade de ligação ao RNA alvo. Modificações de bases podem ser necessárias para aumentar a Tm, e, assim, estabilidade de ligação ou afinidade dupla de 15-mers, a fim de melhorar a sua bioatividade. O produto transcrito resultante mais abundante neste experimento foi novamente em que o éxon 9 foi diretamente emendado ao 19 (um transcrito in frame).Exemplo 3. Direcionamento do trecho de sequência com alta similaridade no éxon 10 e 18 com AONs com a química de base modificada

[223] As características particulares de uma química do AON escolhido, pelo menos em parte afeta a entrega de um AON ao transcrito alvo: via de administração, bioestabilidade, biodistribuição, a distribuição intra- tecido, e a absorção e tráfico celular. Além disso, a otimização da química do oligonucleotídeo é concebida para melhorar a afinidade de ligação e estabilidade, melhorar a atividade, melhorar a segurança, e/ou para reduzir o custo dos produtos, reduzindo o comprimento ou a melhora dos procedimentos de síntese e/ou de purificação. Dentro do trecho de sequência altamente semelhante nos éxons 10 (SEQ ID NO: 109) e 18 (SEQ ID NO: 110), foi avaliado o efeito de 2’-O-methyl RNA AONs com diferentes bases modificadas (tais como pirimidinas 5-substituídas e 2,6-diaminopurinas). Após a transfecção de PS816 (um 2’-O-metil RNA AON regular, SEQ ID NO: 1679), PS1168 (PS816, mas com todas As substituídos por 2,6-diaminopurinas; SEQ ID NO: 1681), PS1059 (um 2'- O- metilfosforotioato RNA AON; SEQ ID NO: 1684), PS1138 (PS1059, mas com todas Cs substituído por 5-metilcitosinas; SEQ ID NO: 1685), ou PS1170 (PS1059, mas com todas As substituídas por 2,6-diaminopurinas; SEQ ID NO: 1686) (Fig.3b) em células musculares humanas saudáveis de controle (isto é, miotubos diferenciadas), análise de RT-PCR demonstrou que todos os cinco AONs foram capazes de induzir o salto do éxon 10 a 18 (confirmado por análise da sequência ) (Fig.3). PS816 foi mais eficaz (88%). Embora as modificações de bases nestas sequências particulares não melhorarem ainda mais a bioatividade, elas podem ter um efeito mais positivo sobre a biodistribuição, estabilidade, e/ou segurança, tal que os compostos menos eficientes são ainda favorecidos para o desenvolvimento clínico. Estes resultados indicam que o salto de um trecho multi-éxon do éxon 10 a 18 é possível usando AONs com bases modificadas. O produto transcrito resultante mais abundante neste experimento foi novamente em que o éxon 9 foi diretamente emendado ao 19 (um transcrito in frame).Exemplo 4. PS816 induz ao salto de outros trechos multi- éxon in-frame

[224] O trecho de sequência altamente semelhante nos éxons 10 (SEQ ID NO: 109) e 18 (SEQ ID NO: 110) também está (em parte) presente nos éxons 30 (SEQ ID NO:128), 31 (SEQ ID NO:130), 32 (SEQ ID NO:132), 42 (SEQ ID NO:152), 47 (SEQ ID NO:158), 48 (SEQ ID NO:160), 57(SEQ ID NO:170), e 60 (SEQ ID NO:174) (Fig.4A, B, Tabela 2). Nós, aqui, portanto, focamos na detecção do salto de trecho de multi-éxons diferentes a seguir à transfecção de 400 nM PS816 (SEQ ID NO: 1679). Foram usados diferentes conjuntos de primers (Tabela 4 e 5) para esse fim. De fato, com a análise de RT- PCR, observou-se o salto do éxon in-frame 10 a 30, éxon 10 a 42, éxon 10 a 47, éxon 10 a 57, e/ou éxon 10 a 60 em múltiplos experimentos (confirmados por análise de sequência), que não foi observado em células não-tratadas. Como um exemplo, a Fig.4C mostra o salto induzida por PS816 éxon 10 a 18, éxon 10 a 30, e éxon 10 a 47. Apesar de vários eventos de salto de éxon múltiplos adicionais (ou in-frame ou out-of-frame), o transcrição resultante em que o éxon 9 foi diretamente emendado ao 19 (um transcrito in frame) foi mais reprodutível, e parecia mais abundante em todos os experimentos. Estes resultados confirmam que o salto de éxon múltiplo pode ser induzido através do gene de DMD usando um único AON, que é capaz de se ligar a um trecho de sequência que é altamente semelhante entre os dois éxons diferentes, e capaz de induzir o salto destes éxons e todos os éxons entre, para gerar um transcrito de DMD in frame.Exemplo 5. Direcionamento de um trecho de sequência com alta similaridade no éxon 45 e 55 com AONs com a química de base modificada.

[225] Com base em um trecho de sequência altamente semelhante (80%) nos éxons 45 (SEQ ID NO: 1571) e 55 (SEQ ID NO: 1572), uma série de AONs foram concebidos dispersos sobre o referido trecho de sequência, ou 100% complementares reversos ao éxon 45 (PS1185; SEQ ID NO:1706, PS1186; SEQ ID NO:1707) ou 96% ao éxon 55 (com um desemparelhamento) (PS1188; SEQ ID NO:1713) (Fig.5A). Em todos os três AONs. As As foram substituídas por 2,6-diaminopurinas. Após transfecção em culturas de miotubos saudáveishumanos de controle, a análise de RT-PCR demonstrou que PS1185, PS1186, e PS1188 eram capazes de induzir o salto do éxon 45 a 55 (confirmado por análise da sequência) (Fig.5B). Nenhum salto de éxon 45 a 55 foi observado em células não tratadas (NT). Estes resultados demonstram que o salto de outro trecho multi-éxon, do éxon 45 a 55, é possível pelo uso de um único AON que é capaz de se ligar a ambos os éxons 45 e 55, em uma região com elevada similaridade de sequências (80%), e que é capaz de induzir o salto destes éxons e todos os éxons no meio. O transcrito resultante no éxon 44, que foi diretamente emendado ao 56 estava in frame, e foi observado em vários experimentos. Tal como para os experimentos de salto de éxon 10 a 18 (exemplo 3), foi aqui demonstrado novamente que AONs com bases modificadas podem ser aplicados de forma eficaz. Além disso, os resultados obtidos com PS1188 indicam que AONs não precisam ser 100% complementares reversos para um dos éxons alvo, mas também podem ser concebidos como estruturas híbridas, nas quais não existem 100% de complementaridade reversa para qualquer éxon alvo.

Legendas das figuras

[226] Figura 1. A) Localização de PS811 (SEQ ID NO:1673), PS814 (SEQ ID NO:1675), PS815 (SEQ ID NO:1677) e PS816 (SEQ ID NO:1679) no trecho de sequência que é altamente semelhante (63% ) no éxon 10 e éxon 18. B) Características de AON e eficiências. A porcentagem de complementaridade reversa (rev. comp.) de cada AON ou ao éxon 10 ou éxon 18 é indicada. C) Análise de RT-PCR. Nas células musculares humanas saudáveis (ou seja, miotubos diferenciados) todos os quatro AONs foram eficazes em induzir o salto de um trecho multi-éxon do éxon 10 ao éxon 18. PS811 e PS816 foram mais eficientes. Caixas no lado da esquerda da figura representam o conteúdo dos produtos transcritos amplificados por PCR. (M: marcador do tamanho de DNA; NT: células não tratadas)

[227] Figura 2. A) Análise de RT-PCR. Em células musculares humanas saudáveis (ou seja, miotubos diferenciados), AONs com comprimentos diferentes, mas com a mesma sequência alvo de núcleo dentro do trecho de sequência que é altamente semelhante (63%) no éxon 10 e éxon 18, foram testados. PS816 (SEQ ID NO: 1679), um 25-mer, e PS1059 (SEQ ID NO: 1684), um 21-mer foram os mais eficientes (68% e 79%, salto do éxon 10 a 18, respectivamente). O PS1050 15-mer (SEQ ID NO:1682) era menos eficaz. Caixas no lado da esquerda da figura representam o conteúdo dos produtos transcritos amplificados por PCR. (M: tamanho do marcador de DNA; NT: células não tratadas) B) características e eficiências de AON. A porcentagem de complementaridade reversa (rev. comp.) de cada AON ou ao éxon 10 ou éxon 18 é indicada.

[228] Figura 3. A) Análise de RT-PCR. Nas células musculares humanas saudáveis (ou seja, miotubos diferenciados), AONs com diferentes químicas de base foram testados: PS816 (um 2'-O-metil fosforotioato RNA AON regular; SEQ ID NO: 1679), PS1168 (PS816, mas com todas as As substituídas por 2,6-diaminopurinas; SEQ ID NO:1681), PS1059 (um 2'O-metil-fosforotioato RNA AON; SEQ ID NO:1684), PS1138 (PS1059, mas com todas as Cs substituídas por 5- metilcitosinas; SEQ ID NO:1685), ou PS1170 (PS1059, mas com todos as As substituídas por 2,6-diaminopurinas; SEQ ID NO:1686). O salto de éxons 10 a 18 foi observado para todos os AONs testados. PS816 foi mais eficaz (88%). Nestas sequências específicas as modificações de bases não melhoraram ainda mais a bioatividade. Caixas no lado esquerdo da figura indicam os produtos transcritos de PCR amplificados. (M: tamanho do marcador de DNA; NT: células não tratadas) B) características e eficiências de AON.

[229] Figura 4. A) Trechos de sequência altamente semelhante nos éxons 10, 18, 30 e 47, como vários alvos para PS816. As SEQ ID NO’s estão se referindo aos alinhamentos de éxon de comprimento total EMBOSS (como na Tabela 2). Em fonte cinzenta a parte de sequência que não foi incluída no alinhamento EMBOSS, mas que é adjacente à parte com elevada complementaridade reversa para PS816. B) Visão global de alinhamento de éxon e porcentagens de complementaridade reversa de PS816 (rev. comp.) C) Análise de RT-PCR. Múltiplos saltos de trecho de éxons podem ser induzidos por PS816, aqui identificados como salto de éxon 10 a 18, de éxon 10 a 30, e de éxon 10 a 47. As transcrições resultantes estão in frame. Estes não foram detectados em células não tratadas (NT). Caixas no lado esquerdo e direito da figura representam o conteúdo dos produtos transcritos amplificados por PCR. (M: marcador do tamanho de DNA)

[230] Figura 5. A) Localização de PS1185 (SEQ ID NO:1706), PS1186 (SEQ ID NO:1707), e PS1188 (SEQ ID NO:1713) no trecho de sequência que é altamente semelhante (80%) no éxon 45 e éxon 55. A tabela resume as características de AON. A porcentagem de complementaridade reversa (rev. comp.) de cada AON ou ao éxon 45 ou éxon 55 é indicada. B) Análise de RT-PCR. Nas células musculares humanas saudáveis(ou seja, miotubos diferenciados) todos os três AONs foram eficazes em induzir o salto de um trecho multi-éxon do éxon 45 ao éxon 55. Caixas no lado da esquerda da figura representam o conteúdo dos produtos transcritos amplificados por PCR. (M: marcador do tamanho de DNA; NT: células não tratadas).Lista de referência Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson AA, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Ver artigo 1 encontrado usando uma busca alternativa: Neuromuscul Disord. 2002; 12:S71-7. 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Claims

1. Método para a concepção de um oligonucleotídeo para produzir uma proteína pelo menos parcialmente funcional caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as seguintes etapas:(a) identificar uma combinação in-frame de um primeiro e um segundo éxon em um mesmo pré-mRNA, em que uma região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a região do rederido primeiro éxon;(b) conceber um oligonucleotídeo que é capaz de se ligar à referida região do referido primeiro éxon e à referida região do referido segundo éxon, e(c) em que a referida ligação resulta no salto do referido primeiro e o referido segundo éxons, de preferência no salto de um trecho de multi-éxons iniciando com o referido primeiro éxon, e englobando uma ou mais éxons presentes entre o referido primeiro e o referido segundo éxons, e no méaximo no salto do trecho inteiro dos éxons entre o referido primeiro e o referido segundo éxons.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é capaz de se ligar a uma parte de uma região dentro de um primeiro éxon e uma parte de uma região dentro de uma segunda região.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a ligação do referido oligonucleotídeo é capaz de interferir com pelo menos uma sequência regulatória de splicing nas referidas regiões dos referidos primeiro e segundo éxons, e/ou com a estrutura secundária que engloba pelo menos o referido primeiro e/ou o referido segundo éxons no referido pré-mRNA.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória de splicing compreende um ativador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS) e/ou um sítio de ligação para uma proteína serina-arginina (SR).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo não é capaz de se ligar às sequências de não-éxons.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é capaz de induzir o salto do trecho inteiro de éxons entre o referido primeiro éxon e o referido segundo éxon.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo compreende de 10 a 40 nucleotídeos.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo copmpreende pelo menos uma modificação comparado com o oligonucleotídeo à base ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo de ocorrência natural, mais preferencialmente;(a) pelo menos uma modificação de base, de preferência selecionada dentre 2-tiouracila, 2-tiotimina, 5- metilcitosiona, 5-metiluracila, timina, 2,6-diaminopurina, mais preferencialmente selecionada a partir de 5- metilpirimidina e 2,6-diaminopurina; e/ou(b) pelo menos uma modificação de açúcar, de preferência selecionada a partir de 2’-O-metil, 2’-O-(2-metoxi)etil, 2’- O-desoxi(DNA), 2’-F, morfolino, um nucleotídeo em ponte ou BNA, ou o oligonucleotídeo compreende ambos os nucleotídeos em ponte e os nucleotídeos 2’-desoxi modificados (mixmers BNA/DNA), mais de preferência a modificação do açúcar 2’-O- metil; e/ou(c) pelo menos uma modificação da cadeia principal, de preferência selecionada a partir de fosforotiotato ou fosforodiamidato, mais preferencialmente a modificação da cadeia principal é fosforotiotato.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo compreende um ou mais grupos conjugados, opcionalmente protegidos, selecionados a partir do grupo que consiste em peptídeos, proteínas, carboidratos, fármacos, porções de direcionamento, porções que aumentam captação, porções que aumentam a solubilidade, porções que aumentam a farmacodinâmica, porções que aumentam a farmacocinética, polímeros, derivados de etileno-glicol, vitaminas, lipídeos, porções de polifluoroalquila, esteroides, colesterol, porções fluorescentes, moléculas repórter, moléculas marcadas radioativamente e combinações das mesmas, ligadas diretamente ou através de um ligante bivalente ou multivalente, a um terminal ou resíduo interno.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é para uso como um medicamento para prevenir, retardar, melhorar e/ou tratar DMD ou BMD em um indivíduo e em que os referidos primeiro e segundo éxons são selecionados a partir dos éxons 10, 18, 30, 8, 9, 11, 13, 19, 22, 23, 34, 40, 42, 44, 45, 47, 51, 53, 55, 56, 57 ou 60 de pré-mRNA de distrofina.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro éxon é o éxon 10, e o referido segundo éxon é o éxon, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 60.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é capaz de induzir o salto de éxons de distrofina 10 a 18, éxons 10 a 30, éxons 10 a 42, éxons 10 a 47, éxons 10 a 57, éxons 10 a 60, éxons 8 a 19, éxons 9 a 22, éxons 9 a 30, éxons 11 a 23, éxons 13 a 30, éxons 23 a 42, éxons 34 a 53, éxons 40 a 53, éxons 44 a 56, éxons 45 a 51, éxons 45 a 53, éxons 45 a 55, éxons 45 a 60, e/ou éxons 56 a 60.

13. Oligonucleotídeo antisense caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, preferencialmente para uso como um medicamento para prevenir, retardar, melhorar e ou tratar uma doença em um indivíduo,em que o referido oligonucleotídeo é capaz de se ligar a uma região dentro de um primeiro éxon e a uma região dentro de um segundo éxon, em que a referida região do referido segundo éxon tem pelo menos 50% de identidade com a referida região do referido primeiro éxon,em qie o referido oligonucleotídeo não é capaz de se ligar às sequências de não-éxon,em que o referido primeiro e o referido segundo éxons estão dentro de um mesmo pré-mRNA no referido indivíduo, em que a referida ligação do referido oligonucletoídeo é capaz de interferir com pelo menos uma sequência regulatória de splicing nas referidas regiões do referido primeiro e referido segundo éxons, e/ou com a estrutura secundária que engloba pelo menos o referido primeiro e/ou o referido segundo éxons no referido pré-mRNA,em que a referida sequência regulatória de splicing compreende um ativador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS), e/ou um sítio de ligação para uma proteína serina-arginina (SR), ou e/ouem que a referida ligações do referido oligonucleotídeo resulta no salto do referido primeiro éxon e do referido segundo éxon, de preferência no salto de um trecho de multi- éxons iniciando com o referido primeiro éxon e englobando um ou mais éxons presentes entre o referido primeiro e o referido segundo éxons, e no máximo no salto do trecho inteiro de éxons entre o referido primeiro e o referido segundo éxons,em que um transcrito in frameé obtido permitindo a produção de uma proteína pelo menos parcialmente funcional; eem que a referida sequência de oligonucleotídeo não é parte de um coquetel ou uma combinação de duas ou mais sequências de oligonucleotíde distintas, possivelmente ligadas por um ou mais ligante(s).

14. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de base, tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1679, 1688, 1671 a 1678, 1680 a 1687, 1689 a 1741 ou 1778 a 1891, e que tem um comprimento que é definido pelo número de nucleotídeos presentes na referida sequência de bases, ou que é de 1, 2, 3, 4, ou 5 nucleotídeos mais longos.

15. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que compreende parte da sequência de bases, tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1679, 1688, 1671 a 1678, 1680 a 1687, 1689 a 1741 em que a referida parte corresponde à sequência de bases conforme definida em qualquer uma das referidas sequências com 1, 2, 3, 4, ou 5 nucleotídeos menos do que definido na referida sequência de bases.

16. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1679 a 1681, 1778, 1812, 1813, 1884 a 1886, 1890, ou 1891, e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos ou SEQ ID NO: 1814 e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (b) a sequência de base tal como definida na SEQ ID NO: 1688, 1689, ou 1839 a 1844, e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (c) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1673 ou 1674, e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (d) a sequência de bases, tal como definida na SEQ ID NO: 1675 ou 1676 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (e) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1677 ou 1678 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (f) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1684 ou 1686 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (g) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1704 ou 1706 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (h) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1707 ou 1709 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (i) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1710, 1713 a 1717 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (j) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1815 a 1819 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (k) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1820, 1824 e tendo um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (l) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1826, 1780, 1782, 1832 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (m) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1821, 1825 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (n) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1822 e tendo um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (o) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (p) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835, e tendo um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (q) a sequência de bases como definida na SEQ ID NO: 1887 e tendo um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (r) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1888 ou 1889 e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (s) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1827 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (t) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1828 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (u) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1784, 1836 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (v) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1786, 1838 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (w) a sequência de bases tal como definida na SEQ ID NO: 1780 e tendo um comprimento 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (x) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1785, 1837 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (y) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 e tendo um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (z) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1849, 1850 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (a1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1787, 1851 e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (b1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 e tendo um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (c1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (d1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (e1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (f1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 e tendo um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (g1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (h1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (11) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (j1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1857, 1872 e tendo um comprimento de 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (k1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 e tendo um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (l1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 e tendo um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (m1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1804, 1880 e tendo um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (n1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1805, 1881 e tendo um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos; ou (o1) a sequência de bases tal como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 e tendo um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

17. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 16, e opcionalmente compreende ainda um veículo, diluente, excipiente, sal, adjuvante e/ou solvente farmaceuticamente aceitáveis.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais oligonucleotídeos idênticos, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 16 ligados por um contra-íon, preferivelmente cálcio.

19. Uso de um oligonucleotídeo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 16 ou uma composição tal como definida em qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que é para a produção de um medicamento para prevenir, retardar, melhorar e/ou tratar uma doença, preferencialmente BMD ou DMD.