ES2692886T3

ES2692886T3 - Métodos y medios para el salto eficaz de al menos uno de los siguientes exones del gen de distrofia muscular de Duchenne humana: 43, 46, 50-53

Info

Publication number: ES2692886T3
Application number: ES09788170.0T
Authority: ES
Inventors: Josephus Johannes De Kimpe; Gerardus Johannes Platenburg; Judith Christina Theodora Van Deutekom; Annemieke Aartsma-Rus; Garrit-Jan Boudewijn Van Ommen
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; Biomarin Technologies BV
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; Biomarin Technologies BV
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2018-12-05
Anticipated expiration: 2029-03-11
Also published as: US20110263682A1; EP2203173B1; JP7107622B2; EP2614827A2; ES2914775T3; US10876114B2; US20170044534A1; EP4183399A1; IL261127A; US20170107512A1; US20190112604A1; US20150166996A1; NZ592446A; US20140128592A1; CN102256606A; JP5879374B2; CN105641700A; IL205322A; WO2009054725A3; PT2203173E

Abstract

Oligonucleótido antisentido, donde dicho oligonucleótido antisentido comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido SEQ ID N.º: 287.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y medios para el salto eficaz de al menos uno de los siguientes exones del gen de distrofia muscular de Duchenne humana: 43, 46, 50-53.

5

Campo

[0001] La invención se refiere al campo de la genética, más específicamente la genética humana. La invención en particular se refiere a la modulación del empalme del pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne humana. 10

Antecedentes de la invención

[0002] Las miopatías son trastornos que resultan en degradación funcional de los músculos. La distrofia muscular (MD) se refiere a enfermedades genéticas que se caracterizan por debilidad y degeneración progresiva de los 15 músculos esqueléticos. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (BMD) son las formas más comunes de distrofia muscular en la infancia. Son trastornos recesivos y, debido a que el gen responsable de la DMD y de la BMD reside en el cromosoma X, las mutaciones afectan principalmente a varones con una incidencia de aproximadamente 1 de 3500 niños.

20

[0003] La DMD y la BMD están causadas por defectos genéticos en el gen de DMD que codifica la distrofina, una proteína muscular que se requiere para las interacciones entre el citoesqueleto y la matriz extracelular para mantener la estabilidad de las fibras musculares durante la contracción. La DMD es un trastorno neuromuscular severo y letal que da como resultado una dependencia en soporte de silla de ruedas antes de la edad de 12 y los pacientes con DMD frecuentemente mueren antes de la edad de treinta debido a un fallo respiratorio o cardíaco. 25 En cambio, los pacientes con BMD permanecen frecuentemente ambulatorios hasta más tarde en la vida y tienen esperanzas de vida casi normales. Las mutaciones DMD en el gen de DMD se caracterizan por inserciones o deleciones o mutaciones puntuales sin sentido que cambian el marco, dando como resultado la ausencia de distrofina funcional. Las mutaciones de BMD en general mantienen el marco de lectura intacto, permitiendo la síntesis de una distrofina parcialmente funcional. 30

[0004] Durante la última década, la modificación específica del empalme para restaurar el marco de lectura interrumpido de la transcripción de distrofina ha emergido como una terapia prometedora para la distrofia muscular de Duchenne (DMD) (van Ommen, van Deutekom, Aartsma-Rus, Curr Mol Opin Ther. 2008;10(2):140-9, Yokota, Duddy, Partidge, Acta Myol. 2007;26(3): 179-84, van Deutekom et al., N Engl J Med. 35 2007;357(26):2677-86). Utilizando oligonucleótidos antisentido (AON) que interfieren con el empalme de señales, el salto de exones específicos se puede inducir en el pre-ARNm de DMD, restaurando así el marco de lectura abierto y convirtiendo la DMD severa en un fenotipo BMD más suave (van Deutekom et al. Hum Mol Genet. 2001; 10: 1547-54; Aartsma-Rus et al., Hum Mol Genet 2003; 12(8):907-14.). La demostración conceptual in vivo se obtuvo primero en el modelo de ratón mdx, que tiene deficiencia de distrofina debido a una mutación sin 40 sentido en el exón 23. Las inyecciones intramusculares e intravenosas de AON dirigidas al exón 23 mutado restauraron la expresión de distrofina durante al menos tres meses (Lu et al. Nat Med. 2003; 8: 1009-14; Lu et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102(1):198-203). Esto se acompañó de restauración de proteínas asociadas a la distrofina en la membrana de la fibra, así como de mejora funcional del músculo tratado. El salto in vivo de exones humanos también se ha conseguido en el modelo de ratón con hDMD, que contiene una copia completa 45 del gen de DMD humano integrado en el cromosoma 5 del ratón (Bremmer-Bout et al. Molecular Therapy. 2004; 10: 232-40; ' t Hoen et al. J Biol Chem. 2008; 283: 5899-907).

[0005] Recientemente, un primer estudio en humanos se completó exitosamente donde un AON que induce el salto del exón 51 se inyectó en una pequeña área del músculo anterior tibial de cuatro pacientes con DMD. 50 Nueva expresión de distrofina se observó en la mayoría de las fibras musculares en todos los cuatros pacientes tratados, y el AON fue seguro y bien tolerado (van Deutekom et al. N Engl J Med. 2007; 357: 2677-86).

Descripción de la invención

55

Método

[0006] La invención se define en las reivindicaciones. En un primer aspecto, la presente descripción proporciona un método para inducir y/o promover el salto de al menos uno de los exones 43, 46, 50-53 del pre-ARNm de DMD en un paciente, preferiblemente en una célula aislada de un paciente, donde el método comprende 60 proporcionar a dicha célula y/o dicho paciente una molécula que se enlaza a una extensión continua de al menos 8 nucleótidos dentro de dicho exón.

[0007] Por consiguiente, un método según la invención se proporciona para inducir y/o promover el salto de al menos el exón 52 de pre-ARNm de DMD en una célula aislada de un paciente, donde el método comprende 65 proporcionar a dicha célula y/o dicho paciente un oligonucleótido que se enlaza a una extensión continua de al

menos 8 nucleótidos dentro de dicho exón. Debe entenderse que dicho método abarca un método in vitro o ex vivo.

[0008] Tal y como se define en este documento, un pre-ARNm de DMD significa preferiblemente el pre-ARNm de un gen de DMD de un paciente con DMD o BMD. 5

[0009] Un paciente se entiende preferiblemente que significa un paciente con DMD o BMD como se define más tarde en este documento o un paciente susceptible de desarrollar DMD o BMD debido a su contexto genético. En el caso de un paciente con DMD, un oligonucleótido usado corregirá preferiblemente una mutación presente en el gen de DMD de dicho paciente y, por lo tanto, creará preferiblemente una proteína DMD que se parecerá a 10 una proteína BMD: dicha proteína será preferiblemente una distrofina funcional como se define más tarde en este documento. En el caso de un paciente con BMD, un oligonucleótido usado corregirá preferiblemente una mutación presente en el gen BMD de dicho paciente y, por lo tanto, creará preferiblemente una distrofina que será más funcional que la distrofina que estaba originalmente presente en dicho paciente con BMD.

15

[0010] El salto del exón se refiere a la inducción en una célula de un ARNm maduro que no contiene un exón particular que está normalmente presente en el mismo. El salto del exón se realiza mediante una célula que expresa el pre-ARNm de dicho ARNm con una molécula capaz de interferir con secuencias esenciales tales como, por ejemplo, el donador de empalme de la secuencia de aceptor de empalme que se requiere para el empalme de dicho exón, o una molécula que es capaz de interferir con una señal de inclusión de exón que se 20 requiere para el reconocimiento de una extensión de nucleótidos como un exón que se va a incluir en el ARNm. El término pre-ARNm se refiere a un ARNm precursor no procesado o parcialmente procesado que se sintetiza a partir de un modelo de ADN en el núcleo celular por transcripción.

[0011] En el contexto de la invención y divulgación, inducir y/o promover el salto de un exón como se indica en 25 este documento significa que al menos el 1 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del ARNm de DMD en una o más células (musculares) de un paciente tratado no contendrá dicho exón. Esto se valora preferiblemente mediante PCR como se describe en los ejemplos.

[0012] Preferiblemente, un método de la invención o divulgación de inducir y/o promover el salto de al menos uno 30 de los siguientes exones 43, 46, 50-53 del pre-ARNm de DMD en una o más células (musculares) de un paciente proporciona a dicho paciente una proteína distrofina funcional y/o reduce la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho paciente y/o aumenta la producción de una distrofina funcional en dicho paciente. Proporcionar a un paciente una proteína distrofina funcional y/o disminuir la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho paciente se aplica típicamente a un paciente con DMD. Aumentar la producción de una 35 distrofina funcional se aplica típicamente a un paciente con BMD.

Por lo tanto, un método preferido de la invención o divulgación es un método donde a un paciente o a una o más células de dicho paciente se proporciona una proteína distrofina funcional y/o donde la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho paciente se disminuye y/o donde la producción de una distrofina funcional se aumenta en dicho paciente, donde el nivel de dicha distrofina aberrante o funcional se evalúa por 40 comparación con el nivel de dicha distrofina en dicho paciente al inicio del método. La disminución de la producción de una distrofina aberrante se puede evaluar en el nivel de ARNm y preferiblemente significa que el 99 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o menos de la cantidad inicial de ARNm de distrofina aberrante sigue siendo detectable por RT-PCR. Un ARNm o proteína distrofina aberrante también se denomina en este caso como un ARNm o proteína distrofina no funcional. Una proteína distrofina no funcional es 45 preferiblemente una proteína distrofina que no es capaz de enlazarse a actina y/o miembros del complejo de proteína DGC. Un ARNm de proteína distrofina o de distrofina no funcional no tiene típicamente, o no codifica, una proteína distrofina con un C-terminal intacto de la proteína.

El incremento de la producción de una distrofina funcional en dicho paciente o en una célula de dicho paciente se puede evaluar en el nivel de ARNm (por análisis RT-PCR) y preferiblemente significa que una cantidad 50 detectable de un ARNm de distrofina funcional es detectable por RT-PCR. En otra forma de realización, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del ARNm de distrofina detectable es un ARNm de distrofina funcional.

[0013] El aumento de la producción de una distrofina funcional en dicho paciente o en una célula de dicho 55 paciente se puede evaluar en el nivel de proteína (por análisis de inmunofluorescencia y de transferencia Western) y preferiblemente significa que una cantidad detectable de una proteína distrofina funcional es detectable por análisis de inmunofluorescencia o de transferencia Western. En otra forma de realización, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la proteína distrofina detectable es una proteína distrofina funcional. 60

[0014] Tal y como se define en este documento, una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina de tipo salvaje que corresponde con una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID N.º: 1. Una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina, que tiene un dominio de enlace a actina en su parte N terminal (primeros 240 aminoácidos en el N terminal), un dominio rico en cisteína (aminoácidos 3361 hasta 65 3685) y un dominio C terminal (últimos 325 aminoácidos en el C terminal) donde cada uno de estos dominios

están presentes en una distrofina de tipo salvaje como es conocido para la persona experta. Los aminoácidos indicados en este documento corresponden a los aminoácidos de la distrofina de tipo salvaje que se representan en la SEQ ID N.º: 1. En otras palabras, una distrofina funcional es una distrofina que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje. "Al menos hasta cierto punto" significa preferiblemente al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de una 5 actividad correspondiente de una distrofina funcional de tipo salvaje. En este contexto, una actividad de una distrofina funcional es preferiblemente enlace a actina y al complejo de glicoproteína asociada a distrofina (DGC) (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144). El enlace de distrofina a actina y al complejo DGC se puede visualizar o bien por coinmunoprecipitación 10 usando extractos de proteína total o bien por análisis de inmunofluorescencia de secciones transversales, a partir de una biopsia muscular, como es conocido para la persona experta.

[0015] Los individuos o pacientes que padecen distrofia muscular de Duchenne tienen típicamente una mutación en el gen que codifica la distrofina que evita la síntesis de la proteína completa, es decir, de una parada 15 prematura evita la síntesis del C-terminal. En la distrofia muscular de Becker, el gen de DMD también comprende una mutación en comparación con el gen de tipo salvaje, pero la mutación no induce típicamente una parada prematura y el C-terminal se sintetiza típicamente. Como resultado, se sintetiza una proteína distrofina funcional que tiene al menos la misma especie de actividad que la proteína de tipo salvaje, aunque no necesariamente la misma cantidad de actividad. El genoma de un individuo con BMD codifica típicamente una proteína distrofina 20 que comprende la parte N terminal (primeros 240 aminoácidos en el N terminal), un dominio rico en cisteína (aminoácidos 3361 hasta 3685) y un dominio C terminal (últimos 325 aminoácidos en el C terminal), pero su dominio con forma de barra central puede ser más corto que el de una distrofina de tipo salvaje (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 34: 135-144). El salto del 25 exón para el tratamiento de la DMD se dirige típicamente a superar una parada prematura en el pre-ARNm mediante el salto de un exón en el dominio en forma de barra para corregir el marco de lectura y permitir la síntesis del resto de la proteína distrofina que incluye el C-terminal, aunque la proteína sea algo más pequeña como resultado de un dominio de barra menor. En una forma de realización preferida, a un individuo que tiene DMD y en tratamiento con un método tal y como se define en este documento se le proporcionará una distrofina 30 que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje. Más preferiblemente, si dicho individuo es un paciente con Duchenne o se sospecha que es un paciente con Duchenne, una distrofina funcional es una distrofina de un individuo con BMD: típicamente dicha distrofina es capaz de interactuar tanto con la actina como con el DGC, pero su dominio con forma de barra central puede ser más corto que el de una distrofina de tipo salvaje (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy 35 mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144). El dominio en forma de barra central de la distrofina de tipo salvaje comprende 24 repeticiones de tipo espectrina (Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144). Por ejemplo, un dominio en forma de barra central de una distrofina como se 40 proporciona en este documento puede comprender de 5 a 23, de 10 a 22 o de 12 a 18 repeticiones de tipo espectrina siempre y cuando se pueda enlazar a actina y a DGC.

[0016] Un método de la invención o divulgación puede aliviar una o más características de una célula miogénica o muscular de un paciente o aliviar uno o más síntomas de un paciente con DMD que tiene una deleción que 45 incluye, pero de forma no limitativa, los exones 44, 44-46, 44-47, 44-48, 44-49, 44-51, 44-53 (corregible por salto del exón 43), 19-45, 21-45, 43-45, 45, 47-54, 47-56 (corregible por salto del exón 46), 51, 51-53, 51-55, 51-57 (corregible por salto del exón 50), 13-50, 19-50, 29-50, 43-50, 45-50, 47-50, 48-50, 49-50, 50, 52 (corregible por salto del exón 51), los exones 8-51, 51, 53, 53-55, 53-57, 53-59, 53-60, (corregible por salto del exón 52) y los exones 10-52, 42-52, 43-52, 45-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 52 (corregible por salto del exón 53) en el gen de 50 DMD, que ocurre en un total del 68 % de todos los pacientes con DMD con una deleción (Aartsma-Rus et al., Hum. Mut. 2009).

Alternativamente, un método de la invención o divulgación puede mejorar una o más características de una célula muscular de un paciente o aliviar uno o más síntomas de un paciente con DMD que tiene mutaciones pequeñas en, o duplicaciones de exón único del exón 43, 46, 50-53 en el gen de DMD, que ocurre en un total del 55 36 % de todos pacientes con DMD con una deleción (Aartsma-Rus et al, Hum. Mut. 2009)

[0017] Además, para algunos pacientes se requiere el salto simultáneo de uno de más exones además del exón 43, exón 46 y/o exón 50-53 para restaurar el marco de lectura abierto, entre los que se incluyen pacientes con deleciones específicas, mutaciones (puntuales) pequeñas, o duplicaciones de exón dobles o múltiples, tales 60 como (pero de forma no limitativa) una deleción de los exones 44-50 que requiere el salto conjunto de los exones 43 y 51, con una deleción de los exones 46-50 que requiere el salto conjunto de los exones 45 y 51, con una deleción de los exones 44-52 que requiere el salto conjunto de los exones 43 y 53, con una deleción de los exones 46-52 que requiere el salto conjunto de los exones 45 y 53, con una deleción de los exones 51-54 que requiere el salto conjunto de los exones 50 y 55, con una deleción de los exones 53-54 que requiere el salto 65 conjunto de los exones 52 y 55, con una deleción de los exones 53-56 que requiere el salto conjunto de los

exones 52 y 57, con una mutación sin sentido en el exón 43 o el exón 44 que requiere el salto conjunto de los exones 43 y 44, con una mutación sin sentido en el exón 45 o el exón 46 que requiere el salto conjunto de los exones 45 y 46, con una mutación sin sentido en el exón 50 o el exón 51 que requiere el salto conjunto de los exones 50 y 51, con una mutación sin sentido en el exón 51 o el exón 52 que requiere el salto conjunto de los exones 51 y 52, con una mutación sin sentido en el exón 52 o el exón 53 que requiere el salto conjunto de los 5 exones 52 y 53, o con una duplicación de exón doble o múltiple que implica a los exones 43, 46, 50, 51, 52, y/o 53.

[0018] En un método preferido de la divulgación, se induce el salto del exón 43, o se induce el salto del exón 46, o se induce el salto del exón 50, o se induce el salto del exón 51, o se induce el salto del exón 52, o se induce el 10 salto del exón 53. Una inducción del salto de dos de estos exones también se abarca por un método de la divulgación. Por ejemplo, preferiblemente el salto de los exones 50 y 51, o 52 y 53, o 43 y 51, o 43 y 53, o 51 y 52. Dependiendo del tipo y de la identidad (los exones específicos implicados) de la mutación identificada en un paciente, la persona experta conocerá qué combinación de exones se necesita saltarse en dicho paciente.

15

[0019] En un método preferido, uno o más síntomas de un paciente con DMD o BMD se alivia(n) y/o una o más características de una o más células musculares de un paciente con DMD o BMD se mejora(n). Tales síntomas o características se pueden evaluar en el nivel de célula, de tejido o en el propio paciente.

[0020] Un alivio de una o más características se puede evaluar por cualquiera de los ensayos siguientes en una 20 célula miogénica o célula muscular de un paciente: absorción de calcio reducida por células musculares, síntesis de colágeno disminuida, morfología alterada, biosíntesis de lípidos alterada, estrés oxidativo disminuido, y/o función, integridad, y/o supervivencia mejorada de las fibras musculares. Estos parámetros se evalúan normalmente usando análisis de inmunofluorescencia y/o histoquímicos de secciones transversales a partir de biopsias musculares. 25

La mejora de la función, integridad y/o supervivencia de las fibras musculares se puede evaluar utilizando al menos uno de los siguientes ensayos: una reducción detectable de quinasa creatina en la sangre, una reducción detectable de necrosis de fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo sospechoso de ser distrófico, y/o un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de las fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo sospechoso de ser distrófico. Cada uno de estos ensayos es 30 conocido para la persona experta.

[0021] La quinasa creatina se puede detectar en la sangre como se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602.2006). Una reducción detectable de quinasa creatina puede significar una reducción del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación 35 con la concentración de quinasa creatina en un mismo paciente con DMD o BMD antes del tratamiento.

[0022] Una reducción detectable de necrosis de fibras musculares se evalúa preferiblemente en una biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602.2006) usando secciones transversales de biopsia. Una reducción detectable de necrosis 40 puede ser una reducción del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del área donde la necrosis se ha identificado usando secciones transversales de biopsia. La reducción se mide por comparación con la necrosis evaluada en un mismo paciente con DMD o BMD antes del tratamiento.

[0023] Un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de una fibra muscular se evalúa preferiblemente 45 en una sección transversal de biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602.2006). El aumento se mide por comparación con la homogeneidad del diámetro de una fibra muscular en un mismo paciente con DMD o BMD antes del tratamiento.

Un alivio de uno o más síntomas se puede evaluar por cualquiera de los ensayos siguientes en el propio 50 paciente: prolongación del tiempo para perder la capacidad de andar, mejora de la fuerza muscular, mejora de la capacidad para levantar peso, mejora del tiempo necesitado para levantarse del suelo, mejora en el tiempo para andar nueve metros, mejora en el tiempo necesitado para subir cuatro escalones, mejora del grado de función de la pierna, mejora de la función pulmonar, mejora de la función cardíaca, mejora de la calidad de vida. Cada uno de estos ensayos es conocido para la persona experta. Como un ejemplo, la publicación de Manzur et al (Manzur 55 AY et al, (2008), Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy (revisión), Wiley publishers, The Cochrane collaboration.) da una explicación extensa de cada uno de estos ensayos. Para cada uno de estos ensayos, tan pronto como se descubre una mejora detectable o una prolongación de un parámetro medido en un ensayo, significará preferiblemente que uno o más síntomas de distrofia muscular de Duchenne o de distrofia muscular de Becker se han aliviado en un individuo utilizando un método de la invención. La mejora o 60 prolongación detectable es preferiblemente una mejora o prolongación estadísticamente significativa como se describe en Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602.2006). Alternativamente, el alivio de uno o más síntomas de distrofia muscular de Duchenne o de distrofia muscular de Becker se puede evaluar midiendo una mejora de una función, integridad y/o supervivencia de la fibra muscular como se define más tarde en este documento. 65

[0024] Un tratamiento en un método según la invención puede tener una duración de al menos una semana, al menos un mes, al menos varios meses, al menos un año, al menos 2, 3, 4, 5, 6 años o más.

Cada molécula u oligonucleótido o equivalente de los mismos tal y como se define en este documento para el uso según la invención puede ser adecuado para la administración directa a una célula, un tejido y/o un órgano in vivo de individuos afectados por DMD o BMD o en riesgo de desarrollarla, y se puede administrar directamente in 5 vivo, ex vivo o in vitro. La frecuencia de administración de una molécula o un oligonucleótido o una composición de la invención puede depender de diferentes parámetros tales como la edad del paciente, la mutación del paciente, el número de moléculas (dosis), la formulación de dicha molécula. La frecuencia puede oscilar entre al menos una vez cada dos semanas, o tres semanas o cuatro semanas o cinco semanas o un período de tiempo más largo. 10

[0025] Una molécula u oligonucleótido o equivalente de los mismos se puede administrar como tal a una célula. Al administrar dicha molécula, oligonucleótido o equivalente de los mismos a un individuo, se prefiere que esté disuelto en una solución que sea compatible con el método de administración. Para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular, se prefiere que la solución sea una 15 solución salina fisiológica. Particularmente preferido para un método de la invención es el uso de un excipiente que mejorará adicionalmente la administración de dicha molécula, oligonucleótido o equivalente funcional de los mismos tal y como se define en este documento, a una célula y en una célula, preferiblemente una célula muscular. Los excipientes preferidos se definen en el apartado titulado "Composición farmacéutica".

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[0026] En un método preferido de la invención, se usa un oligonucleótido antisentido adicional que es capaz de inducir y/o promover el salto de otro exón del pre-ARNm de DMD de un paciente. Preferiblemente, el segundo exón se selecciona de: exón 51, 53, 55, 57, 59 o 69 del pre-ARNm de DMD de un paciente. Las moléculas que se pueden usar se representan en cualquiera de las tablas 1 a 7. De esta manera, se evita la inclusión de dos o más exones de un pre-ARNm de DMD en ARNm producido a partir de este pre-ARNm. Esta forma de realización 25 es posteriormente referida como salto de exón doble o múltiple (Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, et al. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet 2004;74(1):83-92, Aartsma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons. Mol Ther 2006;14(3):401-7). En la mayoría de los casos, el salto del exón doble produce la 30 exclusión de solo los dos seleccionados como objetivo del pre-ARNm de DMD. Sin embargo, en otros casos se ha observado que los exones objetivo y toda la región entremedias de dichos exones en dicho pre-ARNm no estaban presentes en el ARNm producido incluso cuando otros exones (exones intervinientes) estaban presentes en tal región. Este salto múltiple fue, por lo tanto, notable para la combinación de oligonucleótidos derivados del gen de DMD, donde un oligonucleótido para el exón 45 y un oligonucleótido para el exón 51 se añadieron a una 35 célula que transcribe el gen de DMD. Tal disposición resultó en la producción de ARNm que no contenía los exones 45 a 51. Aparentemente, la estructura del pre-ARNm en presencia de los oligonucleótidos mencionados fue tal que la maquinaria de empalme se estimuló para conectar los exones 44 y 52 entre sí.

Es posible promover específicamente el salto de también los exones intervinientes proporcionando un enlace entre los dos oligonucleótidos complementarios. Por lo tanto, en una forma de realización, extensiones de 40 nucleótidos complementarios a al menos dos exones de distrofina se separan por una fracción de enlace. Al menos dos extensiones de nucleótidos se enlazan así en esta forma de realización para formar una molécula única.

[0027] En el caso de que se usen más de un compuesto o una molécula en un método de la invención o 45 divulgación, dichos compuestos se pueden administrar a un individuo en cualquier orden. En una forma de realización, dichos compuestos se administran simultáneamente (lo que significa que dichos compuestos se administran en 10 horas, preferiblemente en una hora). Esto, sin embargo, no es necesario. En otra forma de realización, dichos compuestos se administran consecutivamente.

50

Molécula

[0028] En un segundo aspecto, se proporciona una molécula para el uso en un método como se describe en el apartado precedente titulado "Método". Una molécula tal y como se define en este documento es preferiblemente un oligonucleótido u oligonucleótido antisentido (AON). 55

[0029] Se ha descubierto por los presentes investigadores que cualquiera de los exones 43, 46, 50-53 se salta específicamente a una alta frecuencia utilizando una molécula que preferiblemente se enlaza a una extensión continua de al menos 8 nucleótidos dentro de dicho exón. Aunque este efecto se puede asociar a una afinidad de enlace superior de dicha molécula, en comparación con una molécula que se enlaza a una extensión continua 60 inferior a 8 nucleótidos, podría haber otros parámetros intracelulares implicados que favorecen las características termodinámicas, cinéticas o estructurales del dúplex híbrido. En una forma de realización preferida, se usa una molécula que se enlaza a una extensión continua de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos dentro de dicho exón. 65

[0030] En una forma de realización preferida, una molécula o un oligonucleótido de la divulgación que comprende una secuencia que es complementaria a una parte de cualquiera de los exones 43, 46, 50, 51 o 53 de pre-ARNm de DMD, o una molécula o un oligonucleótido de la invención que comprende una secuencia que es complementaria a una parte del exón 52 de pre-ARNm de DMD, es tal que la parte complementaria es al menos el 50 % de la longitud del oligonucleótido de la invención, más preferiblemente al menos el 60 %, aún más 5 preferiblemente al menos el 70 %, aún más preferiblemente al menos el 80 %, aún más preferiblemente al menos el 90 % o aún más preferiblemente al menos el 95 %, o aún más preferiblemente el 98 % y de la forma más preferible hasta el 100 %. "Una parte de dicho exón" significa preferiblemente una extensión de al menos 8 nucleótidos. En una forma de realización más preferida, un oligonucleótido de la invención o divulgación consiste en una secuencia que es complementaria a parte de dicho exón pre-ARNm de DMD tal y como se define en este 10 documento. Por ejemplo, un oligonucleótido puede comprender una secuencia que es complementaria a parte de dicho pre-ARNm de DMD de exón tal y como se define en este documento y secuencias flanqueadoras adicionales. En una forma de realización más preferida, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleótido es de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos. Preferiblemente, se 15 utilizan secuencias flanqueadoras adicionales para modificar el enlace de una proteína a dicha molécula u oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinámica del oligonucleótido, más preferiblemente para modificar la afinidad de enlace a ARN objetivo.

[0031] Una molécula preferida para usarse en un método de la divulgación se enlaza o es complementaria a una 20 extensión continua de al menos 8 nucleótidos en una de las siguientes secuencias de nucleótidos seleccionadas de:

5'-AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCA-UUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG-3' (SEQ ID N.º: 2) para el salto del exón 43; 25

5'-UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAG-CAACUAAAAGAAAAGC-3' (SEQ ID N.º: 3) para el salto del exón 46;

5'-GGCGGTAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGC 30 UCCUGGACUGACCACUAUUGG-3' (SEQ ID N.º: 4) para el salto del exón 50;

5'-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUAC-3' (SEQ ID N.º: 5) para el salto del exón 51; y 35

5'-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAG-GACAGGCCAGAG-3' (SEQ ID N.º: 7) para el salto del exón 53.

[0032] Una molécula preferida para usarse en un método de la invención se enlaza o es complementaria a una 40 extensión continua de al menos 8 nucleótidos en la siguiente secuencia de nucleótidos:

5'-AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUU-UGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3' (SEQ ID N.º: 6) para el salto del exón 52.

[0033] De las numerosas moléculas que teóricamente se pueden preparar para enlazarse a las extensiones 45 continuas de nucleótidos tal y como se define en las SEQ ID N.º 2-7 en uno de dichos exones, la invención y divulgación proporcionan moléculas diferentes que se pueden usar en un método para el salto eficaz de al menos uno del exón 43, exón 46 y/o exón 50-53. Aunque el efecto del salto se puede conducir a la densidad relativamente alta de los sitios de enlace a proteínas SR putativos en dichas extensiones, podría haber otros parámetros implicados que favorecen la absorción de la molécula u otros parámetros intracelulares tales como 50 características termodinámicas, cinéticas o estructurales del dúplex híbrido.

[0034] Se descubrió que una molécula que se enlaza a una extensión continua comprendida en o consistente en cualquiera de las SEQ ID N.º 2-7 resulta en el salto altamente eficaz del exón 43, exón 46 y/o exón 50-53 respectivamente en una célula y/o en un paciente al que se proporciona esta molécula. Por lo tanto, en una 55 forma de realización preferida, se proporciona un método donde una molécula se enlaza a una extensión continua de al menos 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 nucleótidos en las SEQ ID N.º 2-7.

[0035] En una forma de realización preferida para inducir y/o promover el salto de cualquiera del exón 43, exón 46 y/o exón 50-53, la invención o divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en una 60 secuencia de nucleótidos antisentido seleccionada de las secuencias de nucleótidos antisentido representadas en cualquiera de las tablas 1 a 6. Una molécula de la divulgación preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 16, SEQ ID N.º 65, SEQ ID N.º 70, SEQ ID N.º 91, SEQ ID N.º 110, SEQ ID N.º 117, SEQ ID N.º 127, SEQ ID N.º 165, SEQ ID N.º 166, SEQ ID N.º 167, SEQ ID N.º 246, SEQ ID N.º 299, SEQ ID N.º: 357. 65

[0036] Una molécula preferida de la divulgación comprende una secuencia basada en nucleótidos, de nucleótidos o de oligonucleótidos antisentido de entre 8 y 50 nucleótidos o bases, más preferido de entre 10 y 50 nucleótidos, más preferido de entre 20 y 40 nucleótidos, más preferido de entre 20 y 30 nucleótidos, tal como 20 nucleótidos, 21 nucleótidos, 22 nucleótidos, 23 nucleótidos, 24 nucleótidos, 25 nucleótidos, 26 nucleótidos, 27 nucleótidos, 28 nucleótidos, 29 nucleótidos, 30 nucleótidos, 31 nucleótidos, 32 nucleótidos, 33 nucleótidos, 34 5 nucleótidos, 35 nucleótidos, 36 nucleótidos, 37 nucleótidos, 38 nucleótidos, 39 nucleótidos, 40 nucleótidos, 41 nucleótidos, 42 nucleótidos, 43 nucleótidos, 44 nucleótidos, 45 nucleótidos, 46 nucleótidos, 47 nucleótidos, 48 nucleótidos, 49 nucleótidos o 50 nucleótidos.

Una molécula más preferida de la invención o divulgación comprende una secuencia basada en nucleótidos de 25 nucleótidos. 10

[0037] Además, ninguna de las secuencias indicadas se deriva de partes conservadas de sitios de unión de empalme. Por lo tanto, dicha molécula no es probable que medie el empalme diferencial de otros exones del pre-ARNm de DMD o exones de otros genes.

15

[0038] En una forma de realización, una molécula de la invención o divulgación es una molécula compuesta que se enlaza a la secuencia específica, o una proteína tal como una proteína de enlace a ARN o una proteína de dedo de zinc no natural que se ha modificado para ser capaz de enlazarse a la secuencia de nucleótidos correspondiente en una molécula de pre-ARN de DMD. Los métodos para cribar moléculas compuestas que se enlazan a secuencias de nucleótidos específicas se describen, por ejemplo, en PCT/NL01/00697 y en la patente 20 de EE. UU. 6,875,736. Los métodos para diseñar proteínas de dedo de zinc de enlace a ARN que se enlazan a secuencias de nucleótidos específicas se describen por Friesen y Darby, Nature Structural Biology 5: 543-546 (1998).

[0039] Una molécula preferida de la divulgación se enlaza al menos parte de la secuencia de la SEQ ID N.º 2: 5'-25 AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCA-UUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG-3' que está presente en el exón 43 del gen de DMD. Más preferiblemente, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 8 a la SEQ ID N.º 69. En una forma de realización más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 16 y/o la SEQ 30 ID N.º 65.

En una forma de realización más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 65. Se descubrió que esta molécula es muy eficaz en la modulación del empalme del exón 43 del pre-ARNm de DMD en una célula muscular y/o en un paciente.

35

[0040] Otra molécula preferida de la divulgación se enlaza a al menos parte de la secuencia de la SEQ ID N.º 3: 5'-UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAG-CAACUAAAAGAAAAGC-3' que está presente en el exón 46 del gen de DMD. Más preferiblemente, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 70 a la SEQ ID N.º 122. 40

En una forma de realización aún más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 70, SEQ ID N.º 91, SEQ ID N.º 110, y/o SEQ ID N.º 117.

En una forma de realización más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 117. Se descubrió que esta molécula es muy eficaz 45 en la modulación del empalme del exón 46 del pre-ARNm de DMD en una célula muscular o en un paciente.

[0041] Otra molécula preferida de la divulgación se enlaza a al menos parte de la secuencia de la SEQ ID N.º 4: 5'-GGCGGTAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACU-GACCACUAUUGG-3' que está presente en el exón 50 del gen de DMD. Más preferiblemente, la divulgación 50 proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 123 a la SEQ ID N.º 167 y/o de la SEQ ID N.º 529 a la SEQ ID N.º 535.

En una forma de realización aún más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 127, o la SEQ ID N.º 165, o la SEQ ID N.º 166 y/o la SEQ ID N.º 167. 55

En una forma de realización más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 127. Se descubrió que esta molécula es muy eficaz en la modulación del empalme del exón 50 del pre-ARNm de DMD en una célula muscular y/o en un paciente.

[0042] Otra molécula preferida de la divulgación se enlaza a al menos parte de la secuencia de la SEQ ID N.º 5: 60 5'-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAA

UGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUAC-3' que está presente en el exón 51 del gen de DMD. Más preferiblemente, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de 65 nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 168 la SEQ ID N.º 241.

[0043] Otra molécula preferida de la invención se enlaza a al menos parte de la secuencia de la SEQ ID N.º 6:

5'-AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUU-UGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3’ que está presente en el exón 52 del gen de DMD. Más preferiblemente, la invención o la divulgación proporcionan una molécula que comprende o consiste en la 5 secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 242 a la SEQ ID N.º 310. En una forma de realización aún más preferida, la invención o divulgación proporcionan una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 246 y/o la SEQ ID N.º 299. En una forma de realización más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 299. Se descubrió que esta molécula es muy eficaz en la modulación del empalme 10 del exón 52 del pre-ARNm de DMD en una célula muscular y/o en un paciente. La invención proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º: 287.

[0044] Otra molécula preferida de la divulgación se enlaza a al menos parte de la secuencia de la SEQ ID N.º 7: 5'-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAG-15 GACAGGCCAGAG-3' que está presente en el exón 53 del gen de DMD. Más preferiblemente, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 311 a la SEQ ID N.º 358.

En una forma de realización más preferida, la divulgación proporciona una molécula que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido de la SEQ ID N.º 357. Se descubrió que esta molécula es muy eficaz 20 en la modulación del empalme del exón 53 del pre-ARNm de DMD en una célula muscular y/o en un paciente.

[0045] Una secuencia de nucleótidos de una molécula de la invención y divulgación puede contener residuos de ARN, o uno o más residuos de ADN, y/o uno o más análogos de nucleótido o equivalentes, como se detallará adicionalmente a continuación en este documento. 25

[0046] Se prefiere que una molécula de la invención comprenda uno o más residuos que se modifican para aumentar la resistencia a nucleasa, y/o para aumentar la afinidad del nucleótido antisentido a la secuencia objetivo. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la secuencia del nucleótido antisentido comprende al menos un análogo de nucleótido o equivalente, donde un análogo de nucleótido o equivalente se define como un 30 residuo con una base modificada, y/o un esqueleto modificado, y/o un enlace internucleósido no natural, o una combinación de estas modificaciones.

[0047] En una forma de realización preferida, el análogo de nucleótido o equivalente comprende un esqueleto modificado. Ejemplos de tales esqueletos se proporcionan por esqueletos de morfolino, esqueletos de 35 carbamato, esqueletos de siloxano, esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona, esqueletos de formacetilo y tioformacetilo, esqueletos de metilenformacetilo, esqueletos de riboacetilo, esqueletos que contienen alqueno, esqueletos de sulfamato, sulfonato y sulfonamida, esqueletos de metileneimino y metilenhidrazino, y esqueletos de amida. Los oligómeros de morfolino fosforodiamidato son oligonucleótidos con esqueleto modificado que se han investigado previamente como agentes antisentido. Los oligonucleótidos de morfolino tienen un esqueleto 40 sin carga donde el azúcar desoxirribosa del ADN se sustituye por un anillo de seis miembros y el enlace fosfodiéster se sustituye por un enlace fosforodiamidato. Los oligonucleótidos de morfolino son resistentes a la degradación enzimática y parecen funcionar como agentes antisentido por obstaculizar la traducción o interferir con el empalme de pre-ARNm en vez de por activar la RNasa H. Los oligonucleótidos de morfolino se han administrado exitosamente a células de cultivo de tejido por métodos que interrumpen físicamente la membrana 45 celular, y un estudio que compara diferentes de estos métodos descubrió que la carga de raspaduras fue el método de administración más eficaz; sin embargo, debido a que el esqueleto de morfolino está sin carga, los lípidos catiónicos no son mediadores eficaces de la absorción de oligonucleótidos de morfolino en las células. Un informe reciente demostró la formación de tríplex por un oligonucleótido de morfolino y, debido al esqueleto no iónico, estos estudios mostraron que el oligonucleótido de morfolino fue capaz de formar tríplex en ausencia de 50 magnesio.

[0048] Se prefiere adicionalmente que el enlace entre los residuos en un esqueleto no incluya un átomo de fósforo, tal como un enlace que se forma por enlaces internucleósidos de alquilo o de cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósidos de heteroátomo y alquilo o de cicloalquilo mixtos, o uno o más enlaces 55 internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta.

[0049] Un análogo de nucleótido o equivalente preferido comprende un ácido nucleico peptídico (PNA), con un esqueleto de poliamida modificada (Nielsen, et al. (991) Science 254, 1497-1500). Las moléculas basadas en PNA son imitaciones reales de moléculas de ADN en cuanto a reconocimiento de pares bases. El esqueleto del 60 PNA está compuesto de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina enlazadas por enlaces peptídicos, donde las nucleobases se enlazan al esqueleto mediante enlaces de metileno-carbonilo. Un esqueleto alternativo comprende un monómero de PNA de pirrolidina extendido con un carbono (Govindaraju y Kumar (2005) Chem. Commun, 495-497). Dado que el esqueleto de una molécula de PNA contiene grupos fosfato no cargados, los híbridos PNA-ARN son normalmente más estables que los híbridos ARN-ARN o ARN-ADN, respectivamente 65 (Egholm et al (1993) Nature 365, 566-568).

[0050] Un esqueleto preferido adicional comprende un análogo de nucleótido de morfolino o equivalente, donde el azúcar ribosa o desoxirribosa se sustituye por un anillo de morfolino de 6 miembros. Un análogo de nucleótido o equivalente más preferido comprende un oligómero de morfolino fosforodiamidato (PMO), donde el azúcar ribosa o desoxirribosa se sustituye por un anillo de morfolino de 6 miembros, y el enlace fosfodiéster aniónico 5 entre anillos de morfolino adyacentes se sustituye por un enlace fosforodiamidato no iónico.

[0051] En una otra forma de realización adicional, un análogo de nucleótido o equivalente de la invención comprende una sustitución de uno de los oxígenos que no forman puente en el enlace fosfodiéster. Esta modificación desestabiliza ligeramente el apareamiento de bases, pero añade resistencia significativa a la 10 degradación de nucleasa. Un análogo de nucleótido o equivalente preferido comprende fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, H-fosfonato, metil y otro alquil fosfonato entre los que se incluye 3'-alquileno fosfonato, 5'-alquileno fosfonato y fosfonato quiral, fosfinato, fosforamidato entre los que se incluye 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriéster, selenofosfato o boranofosfato. 15

[0052] Un análogo de nucleótido o equivalente preferido adicional de la invención comprende una o más fracciones de azúcar que son mono o disustituidas en la posición 2', 3' y/o 5' tales como un -OH; -F; alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, alilo, arilo, o aralquilo (C1-C10) inferiores sustituidos o no sustituidos, lineales o ramificados, que se pueden interrumpir por uno o más heteroátomos; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-20 , S- o N-alquinilo; O-, S-, o N-alilo; O-alquil-O-alquilo, -metoxi, -aminopropoxi; -aminoxi; metoxietoxi; -dimetilaminooxietoxi; y -dimetilaminoetoxietoxi. La fracción de azúcar puede ser una piranosa o derivado de la misma, o una desoxipiranosa o derivado de la misma, preferiblemente una ribosa o un derivado de la misma, o una desoxirribosa o un derivado de la misma. Tales fracciones de azúcar derivadas preferidas comprenden ácido nucleico bloqueado (LNA), donde el átomo de carbono en 2' se enlaza al átomo de carbono en 3' o 4' del anillo 25 de azúcar formando así una fracción de azúcar bicíclica. Un LNA preferido comprende ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-C-etileno (Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No.1: 241-242). Estas sustituciones vuelven el análogo de nucleótido o equivalente resistente a la RNasa H y a la nucleasa y aumentan la afinidad al ARN objetivo.

30

[0053] Se entiende por una persona experta que no es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido antisentido se modifiquen uniformemente. Además, más de uno de los análogos o equivalentes anteriormente mencionados se pueden incorporar en un oligonucleótido antisentido único o incluso en una posición única dentro de un oligonucleótido antisentido. En algunas formas de realización, un oligonucleótido antisentido de la invención tiene al menos dos tipos diferentes de análogos o equivalentes. 35

[0054] Un oligonucleótido antisentido preferido según la invención comprende un oligonucleótido antisentido 2'-O alquilfosforotioato, tal como ribosa 2'-O-metil modificada (ARN), ribosa 2'-O-etil modificada, ribosa 2'-O-propil modificada, y/o derivados sustituidos de estas modificaciones tales como derivados halogenados.

40

[0055] Un oligonucleótido antisentido más preferido según la invención consiste en ribosa 2'-O-metilfosforotioato.

[0056] Un equivalente funcional de una molécula de la invención o divulgación se puede definir como un oligonucleótido tal y como se define en este documento, donde una actividad de dicho equivalente funcional se retiene en al menos alguna medida. Preferiblemente, una actividad de dicho equivalente funcional induce el salto 45 del exón 43, 46, 50, 51, 52, o 53 y proporciona una proteína distrofina funcional. Dicha actividad de dicho equivalente funcional se evalúa, por lo tanto, preferiblemente por detección de salto del exón 43, 46, 50, 51, 52, o 53 y cuantificando la cantidad de proteína distrofina funcional. Una distrofina funcional se define en este documento preferiblemente como una distrofina capaz de enlazarse a actina y a miembros del complejo de proteína DGC. La evaluación de dicha actividad de un oligonucleótido se hace preferiblemente por RT-PCR o por 50 análisis de inmunofluorescencia o de transferencia Western. Dicha actividad se retiene preferiblemente en al menos alguna medida cuando representa al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % o más de la actividad correspondiente de dicho oligonucleótido del que se deriva el equivalente funcional. En toda esta solicitud, cuando se usa la palabra oligonucleótido, se puede sustituir por un equivalente funcional del mismo tal y como se define en este documento. 55

[0057] Se entenderá por una persona experta que oligonucleótidos antisentido diferentes se pueden combinar para el salto eficaz de cualquiera del exón 43, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 y/o exón 53 del pre-ARNm de DMD humano. Se abarca en la presente invención o divulgación el uso de uno, dos, tres, cuatro, cinco o más oligonucleótidos para el salto de uno de dichos exones (es decir, exón 43, 46, 50, 51, 52, o 53). También se 60 abarca el uso de al menos dos oligonucleótidos para el salto de al menos dos de dichos exones. Preferiblemente se saltan dos de dichos exones. Más preferiblemente, estos dos exones son:

 43 y 51, o

 43 y 53, o 65

 50 y 51, o

 51 y 52, o

 52 y 53.

La persona experta conocerá qué combinación de exones se prefiere saltarse dependiendo del tipo, el número y la ubicación de la mutación presente en un paciente con DMD o BMD. 5

[0058] Un oligonucleótido antisentido se puede enlazar a una fracción que mejora la absorción del oligonucleótido antisentido en las células, preferiblemente células musculares. Ejemplos de tales fracciones son colesteroles, carbohidratos, vitaminas, biotina, lípidos, fosfolípidos, péptidos que penetran en las células, entre los que se incluyen, pero de forma no limitativa, antennapedia, TAT, transportan y aminoácidos positivamente 10 cargados tales como oligoarginina, poliarginina, oligolisina o polilisina, dominios de enlace a antígeno tales como proporcionados por un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, o un dominio de enlace a antígeno monocatenario tal como un dominio de enlace a antígeno de dominio único de camélido.

[0059] Un oligonucleótido antisentido preferido comprende un PMO enlazado a péptido. 15

[0060] Un oligonucleótido antisentido preferido que comprende uno o más análogos de nucleótido o equivalentes de la invención modula el empalme en una o más células musculares, incluidas células musculares cardíacas, tras la administración sistémica. En este aspecto, la administración sistémica de un oligonucleótido antisentido que comprende un análogo de nucleótido o equivalente específico puede resultar en la selección como objetivo 20 de un subconjunto de células musculares, mientras que un oligonucleótido antisentido que comprende un análogo de nucleótido o equivalente diferente puede resultar en la selección como objetivo de un subconjunto diferente de células musculares. Por lo tanto, en una forma de realización se prefiere usar una combinación de oligonucleótidos antisentido que comprende análogos de nucleótido o equivalentes diferentes para inducir el salto del exón 43, 46, 50, 51, 52, o 53 del pre-ARNm de DMD humano. 25

[0061] Una célula se puede proporcionar con una molécula capaz de interferir con secuencias esenciales que resultan en un salto altamente eficaz del exón 43, exón 46, exón 50, exón 51, exón 53 (según la divulgación) o exón 52 (según la invención) del pre-ARNm de DMD humano mediante la expresión de oligonucleótidos antisentido derivados de plásmido o la expresión vírica proporcionada por vectores basados en adenovirus o en 30 virus adenoasociados. En una forma de realización preferida, se proporciona un vector de expresión basado en virus que incluye un casete de expresión que impulsa la expresión de una molécula como se identifica en este documento. La expresión se impulsa preferiblemente por un promotor de polimerasa III, tal como un promotor U1, U6, o U7 de ARN. Un músculo o célula miogénica se puede proporcionar con un plásmido para expresión de oligonucleótido antisentido proporcionando el plásmido en una solución acuosa. Alternativamente, un plásmido 35 se puede proporcionar por transfección usando agentes de transfección conocidos tales como, por ejemplo, LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) o polietilenimina (PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), o derivados de los mismos.

[0062] Un sistema de expresión de oligonucleótido antisentido preferido es un vector basado en virus asociado a 40 adenovirus (AAV). Se han desarrollado vectores basados en AAV de cadena simple y doble que se pueden usar para la expresión prolongada de pequeñas secuencias de nucleótidos antisentido para saltar muy eficazmente el exón 43, 46, 50, 51, 52 o 53 del pre-ARNm de DMD.

[0063] Un vector basado en AAV preferido comprende un casete de expresión que se impulsa por un promotor 45 de polimerasa III (Pol III). Un promotor Pol III preferido es, por ejemplo, un promotor U1, U6, o U7 de ARN.

[0064] La invención, por lo tanto, también proporciona un vector basado en virus, que comprende un casete de expresión impulsado por el promotor Pol III para la expresión de una secuencia antisentido de la invención para inducir el salto del 52 del pre-ARNm de DMD humano. Un vector basado en virus según la divulgación 50 comprende un casete de expresión impulsado por el promotor Pol III para la expresión de una o más secuencias antisentido de la divulgación para inducir el salto del exón 43, exón 46, exón 50, exón 51 o exón 53 del pre-ARNm de DMD humano.

Composición farmacéutica 55

[0065] Si es necesario, una molécula o un vector que expresa un oligonucleótido antisentido de la invención se puede incorporar en una mezcla o composición farmacéuticamente activa añadiendo un portador farmacéuticamente aceptable.

60

[0066] Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición, preferiblemente una composición farmacéutica que comprende una molécula que incluye un oligonucleótido antisentido según la invención, y/o un vector basado en virus que expresa la(s) secuencia(s) antisentido según la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

65

[0067] Una composición farmacéutica preferida comprende una molécula tal y como se define en este documento y/o un vector tal y como se define en este documento, y un portador o excipiente farmacéutico aceptable, opcionalmente combinados con una molécula y/o un vector tal y como se define en este documento que es capaz de inducir el salto del exón 51, 53, 55, 57, 59 o 69 del pre-ARNm del DMD. Las moléculas preferidas capaces de inducir el salto de cualquiera de estos exones se identifican en cualquiera de las tablas 1 a 5 7.

[0068] Los excipientes preferidos incluyen excipientes capaces de formar complejos, vesículas y/o liposomas que administren tal molécula tal y como se define en este documento, preferiblemente un oligonucleótido en un complejo o retenido en una vesícula o liposoma a través de una membrana celular. Muchos de estos excipientes 10 se conocen en la técnica. Excipientes adecuados comprenden polietilenimina y derivados, o polímeros catiónicos similares, que incluyen copolímeros de polipropilenimina o polietilenimina (PEC) y derivados, ExGen 500, anfifilos sintéticos (SAINT-18), lipofectinTM, DOTAP y/o proteínas cápsidas víricas que son capaces de autoensamblarse en partículas que pueden administrar tal molécula, preferiblemente un oligonucleótido tal y como se define en este documento, a una célula, preferiblemente una célula muscular. Se ha mostrado que tales excipientes 15 administran eficazmente ácidos nucleicos (oligonucleótido tal como antisentido) a una amplia variedad de células cultivadas, incluidas células musculares. Su alto potencial de transfección se combina con una toxicidad exceptuada de baja a moderada en cuanto a la supervivencia celular en general. La facilidad de modificación estructural se puede utilizar para permitir otras modificaciones y el análisis de sus características de transferencia de ácido nucleico (in vivo) adicionales y toxicidad. 20

[0069] La lipofectina representa un ejemplo de un agente de transfección liposómica. Consiste en dos componentes lipídicos, un lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) (cp. DOTAP que es la sal de metilsulfato) y un lípido neutro dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). El componente neutro media la liberación intracelular. Otro grupo de sistemas de administración son las nanopartículas 25 poliméricas.

[0070] Los policationes tales como dietilaminoetilaminoetilo (DEAE)-dextrano, que son bien conocidas como reactivo de transfección de ADN, se pueden combinar con butilcianoacrilato (PBCA) y hexilcianoacrilato (PHCA) para formular nanopartículas catiónicas que pueden administrar una molécula o un compuesto tal y como se 30 define en este documento, preferiblemente un oligonucleótido, a través de las membranas celulares en las células.

[0071] Además de estos materiales de nanopartícula comunes, la protamina peptídica catiónica ofrece un enfoque alternativo para formular un compuesto tal y como se define en este documento, preferiblemente un 35 oligonucleótido tal como los coloides. Este sistema de nanopartículas coloidales puede formar las llamadas protículas, que se pueden preparar por un proceso de autoensamblaje simple para envasar y mediar la liberación intracelular de un compuesto tal y como se define en este documento, preferiblemente un oligonucleótido. La persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera de los excipientes anteriores u otros excipientes alternativos y sistemas de administración disponibles comercialmente para envasar y administrar un compuesto 40 tal y como se define en este documento, preferiblemente un oligonucleótido para el uso en la presente invención para administrar dicho compuesto para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en humanos.

[0072] Además, un compuesto tal y como se define en este documento, preferiblemente un oligonucleótido, 45 podría enlazarse de manera covalente o de manera no covalente a un ligando de selección de objetivo diseñado específicamente para facilitar la absorción en la célula, citoplasma y/o su núcleo. Tal ligando podría comprender (i) un compuesto (que incluye, pero de forma no limitativa, estructuras (de tipo) peptídicas) que reconoce elementos específicos de la célula, tejido u órgano que facilitan la absorción celular y/o (ii) un compuesto químico capaz de facilitar la absorción en las células y/o la liberación intracelular de un compuesto tal y como se define 50 en este documento, preferiblemente un oligonucleótido de vesículas, por ejemplo, endosomas o lisosomas.

[0073] Por lo tanto, en una forma de realización preferida, un compuesto tal y como se define en este documento, preferiblemente un oligonucleótido, se formula en un medicamento que se proporciona con al menos un excipiente y/o un ligando de selección de objetivo para la administración y/o un dispositivo de administración de 55 dicho compuesto a una célula y/o que mejora su administración intracelular. Por consiguiente, la invención también abarca una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un compuesto tal y como se define en este documento, preferiblemente un oligonucleótido, y que además comprende al menos un excipiente y/o un ligando de selección de objetivo para la administración y/o un dispositivo de administración de dicho compuesto a una célula y/o que mejora su administración intracelular. 60

Debe entenderse que una molécula o compuesto u oligonucleótido no se puede formular en una única composición o preparación. Dependiendo de su identidad, la persona experta conocerá qué tipo de formulación es la más apropiada para cada compuesto.

[0074] En una forma de realización preferida, se usa una concentración in vitro de una molécula o un 65 oligonucleótido tal y como se define en este documento, que oscila entre 0,1 nM y 1 □M. Más preferiblemente, la

concentración usada oscila entre 0,3 y 400 nM, aún más preferiblemente entre 1 y 200 nM. Una molécula o un oligonucleótido tal y como se define en este documento se puede usar en una dosis que oscila entre 0,1 y 20 mg/kg, preferiblemente entre 0,5 y 10 mg/kg. Si se usan varias moléculas u oligonucleótidos, estas concentraciones pueden referirse a la concentración total de oligonucleótidos o a la concentración de cada oligonucleótido adicionado. Los rangos de concentración de (de los) oligonucleótido(s) dados anteriormente son 5 concentraciones preferidas para usos in vitro o ex vivo. La persona experta entenderá que dependiendo del (de los) oligonucleótido(s) usado(s), la célula objetivo que se va a tratar, el objetivo genético y sus niveles de expresión, el medio usado y las condiciones de transfección e incubación, la concentración del (de los) oligonucleótido(s) usado(s) puede variar adicionalmente y puede necesitar optimizarse adicionalmente.

10

[0075] Más preferiblemente, un compuesto, preferiblemente un oligonucleótido, que se va a usar en la invención o divulgación para prevenir, tratar la DMD o la BMD se produce sintéticamente y se administra directamente a una célula, un tejido, un órgano y/o pacientes en la forma formulada en una composición o preparación farmacéuticamente aceptable. La administración de una composición farmacéutica al sujeto se realiza preferiblemente mediante una o más inyecciones parenterales, por ejemplo, administraciones intravenosas y/o 15 subcutáneas y/o intramusculares y/o intratecales y/o intraventriculares, preferiblemente inyecciones, en un sitio o en múltiples sitios en el cuerpo humano.

[0076] Un oligonucleótido preferido tal y como se define en este documento que comprende opcionalmente uno o más análogos de nucleótido o equivalentes de la invención o divulgación modula el empalme en una o más 20 células musculares, incluidas las células musculares cardíacas, tras la administración sistémica. En este aspecto, la administración sistémica de un oligonucleótido que comprende un análogo de nucleótido específico o equivalente puede resultar en la selección como objetivo de un subconjunto de células musculares, mientras que un oligonucleótido que comprende un análogo de nucleótido o equivalente diferente puede resultar en la selección como objetivo de un subconjunto diferente de células musculares. 25

[0077] En este aspecto, la administración sistémica de un oligonucleótido que comprende un análogo de nucleótido o equivalente específico puede resultar en la selección como objetivo de un subconjunto de células musculares, mientras que un oligonucleótido que comprende un análogo de nucleótido o equivalente diferente puede resultar en la selección como objetivo de un subconjunto diferente de células musculares. Por lo tanto, en 30 esta forma de realización, se prefiere usar una combinación de oligonucleótidos que comprende diferentes análogos de nucleótido o equivalentes para modular el empalme del ARNm de DMD en al menos un tipo de células musculares.

[0078] En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona una molécula o un vector basado en 35 virus para el uso como un medicamento, preferiblemente para modular el empalme del pre-ARNm de DMD, más preferiblemente para promover o inducir el salto del exón 52 como se identifica en este documento. En una forma de realización preferida de la divulgación, se proporciona una molécula o un vector basado en virus para el uso como un medicamento, preferiblemente para modular el empalme del pre-ARNm de DMD, más preferiblemente para promover o inducir el salto de cualquiera de los exones 43, 46, 50, 51 y 53 como se identifica en este 40 documento.

Uso

[0079] En un otro aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un oligonucleótido o molécula antisentido 45 según la invención, y/o un vector basado en virus que expresa una secuencia antisentido según la invención y/o una composición farmacéutica, para modular el empalme del pre-ARNm de DMD. El empalme se modula preferiblemente en una célula miogénica humana o célula muscular in vitro. Más preferido es que el empalme se module en una célula muscular humana in vivo. Por consiguiente, la invención se refiere además al uso de la molécula tal y como se define en este documento y/o el vector tal y como se define en este documento y/o la 50 composición farmacéutica tal y como se define en este documento para modular el empalme del pre-ARNm de DMD o para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente con DMD o BMD.

[0080] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos después de la palabra se incluyen, pero que los elementos 55 no mencionados específicamente no se excluyen. Además, el verbo "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente en" y significa que una molécula o un vector basado en virus o una composición tal y como se define en este documento puede comprender componente(s) adicional(es) a aquellos identificados específicamente, donde dicho(s) componente(s) adicional(es) no alteran la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento con el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que más 60 de uno del elemento estén presentes, a menos que el contexto requiera claramente que allí sea uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una", por lo tanto, significa normalmente "al menos uno/a". Cada forma de realización como se identifica en este documento se puede combinar a menos que se indique lo contrario.

65

[0081] Los ejemplos siguientes se ofrecen solo para fines ilustrativos y no se destinan para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplos

5

Ejemplos 1-4

Materiales y métodos

[0082] El diseño de AON se basó (parcialmente) en el solapamiento de estructuras secundarias abiertas del ARN 10 del exón objetivo como predicho por el programa m-fold, en sitios de enlace de proteína SR putativos (parcialmente) superpuestos como predicho por el software ESE-finder. Los AON se sintetizaron por Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Países Bajos), y contienen esqueletos de ARN de 2'-O-metil y fosforotioato en toda su longitud (PS).

15

Cultivo de tejido, transfección y análisis RT-PCR

[0083] Los cultivos de miotubo derivados a partir de un individuo sano ("control humano") (ejemplos 1, 3, y 4; salto del exón 43, 50, 52) o un paciente con DMD que lleva una deleción del exón 45 (ejemplo 2, salto del exón 46) se procesaron como se ha descrito previamente (Aartsma-Rus et al., Neuromuscul. Disord. 2002; 12: S71-77 20 y Hum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14). Para el cribado de AON, se transfectaron cultivos de miotubo con 50 nM y 150 nM (ejemplo 2), 200 nM y 500 nM (ejemplo 4) o solo 500 nM (ejemplos 1 y 3) de cada AON. Se usó el reactivo de transfección UNIFectylin (Prosensa Therapeutics BV, Países Bajos), con 2 µl de UNIFectylin por µg de AON. Las eficacias del salto de exón se determinaron por análisis RT-PCR anidada utilizando cebadores en los exones que flanquean los exones objetivos (43, 46, 50, 51, 52, o 53). Se aislaron fragmentos de PCR a partir 25 de geles de agarosa para la verificación de secuencia. Para la cuantificación, se analizaron los productos de PCR utilizando el DNA 1000 LabChips Kit en el bioanalizador Agilent 2100a (Agilent Technologies, EE. UU.).

Resultados

30

Salto del exón 43 de DMD.

[0084] Una serie de secuencias de dirección de AON dentro del exón 43 se diseñaron y transfectaron en los cultivos de miotubo de control sano. Los análisis de secuencias y de RT-PCR posteriores de ARN aislado demostraron que casi todos los AON dirigidos a una extensión de nucleótido continua dentro del exón 43 definida 35 en este documento como la SEQ ID N.º 2 fueron realmente capaces de inducir el salto del exón 43. PS237 (SEQ ID N.º: 65) indujo reproductivamente los niveles más altos de salto del exón 43 (hasta el 66 %) a 500 nM, como se muestra en la figura 1. Para comparación, también se muestran PS238 y PS240, que inducen niveles de salto del exón 43 de hasta el 13 % y el 36 % respectivamente (figura 1). El salto preciso del exón 43 se confirmó mediante análisis de secuencias de los nuevos fragmentos de transcripción más pequeños. No se observó salto 40 del exón 43 en células no tratadas (NT).

Salto del exón 46 de DMD.

[0085] Una serie de secuencias de dirección de AON dentro del exón 46 se diseñaron y transfectaron en los 45 cultivos de miotubo derivados a partir de un paciente con DMD que lleva una deleción del exón 45 en el gen de DMD. Para pacientes con tal mutación, el salto del exón 46 inducido por antisentido induciría la síntesis de una nueva proteína distrofina de tipo BMD que puede aliviar realmente uno o más síntomas de la enfermedad. Los análisis de secuencias y de RT-PCR posteriores de ARN aislado demostraron que casi todos los AON dirigidos a una extensión de nucleótido continua dentro del exón 46 definida en este documento como la SEQ ID N.º 3 50 fueron realmente capaces de inducir el salto del exón 46, incluso en concentraciones de AON relativamente bajas de 50 nM. PS182 (SEQ ID N.º: 117) indujo reproductivamente los niveles más altos de salto del exón 46 (hasta el 50 % a 50 nM y el 74 % a 150 nM), como se muestra en la figura 2. Para comparación, también se muestran PS177, PS179, y PS181, que inducen niveles de salto del exón 46 de hasta el 55 %, el 58 % y el 42 % respectivamente a 150 nM (figura 2). El salto preciso del exón 46 se confirmó mediante análisis de secuencias de 55 los nuevos fragmentos de transcripción más pequeños. No se observó salto del exón 46 en células no tratadas (NT).

Salto del exón 50 de DMD.

60

[0086] Una serie de secuencias de dirección de AON dentro del exón 50 se diseñaron y transfectaron en los cultivos de miotubo de control sano. Los análisis de secuencias y de RT-PCR posteriores de ARN aislado demostraron que casi todos los AON dirigidos a una extensión de nucleótido continua dentro del exón 50 definida en este documento como la SEQ ID N.º 4 fueron realmente capaces de inducir el salto del exón 50. PS248 (SEQ ID N.º: 127) indujo reproductivamente los niveles más altos de salto del exón 50 (hasta el 35 % a 500 nM), como 65 se muestra en figura 3. Para comparación, también se muestran PS245, PS246, y PS247, que inducen niveles

Claims

REIVINDICACIONES

1. Oligonucleótido antisentido, donde dicho oligonucleótido antisentido comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos antisentido SEQ ID N.º: 287. 5
2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, que comprende un oligonucleótido antisentido 2’-O-alquilfosforotioato.
3. Oligonucleótido según la reivindicación 2, que comprende una ribosa 2'-O-metilfosforotioato. 10
4. Oligonucleótido según la reivindicación 1, donde el oligonucleótido es un oligómero de morfolino fosforodiamidato (PMO).
5. Vector basado en virus, que comprende un casete de expresión que impulsa la expresión de un 15 oligonucleótido tal y como se define en la reivindicación 1.
6. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector basado en virus según la reivindicación 5 para el uso como un medicamento, preferiblemente para modular el empalme del pre-ARNm de la distrofina de un paciente con DMD o BMD o para el tratamiento de un paciente con DMD o BMD. 20
7. Composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y/o el vector según la reivindicación 5, un portador farmacéutico aceptable, y opcionalmente combinado con un oligonucleótido antisentido que es capaz de inducir o promover el salto de al menos uno de los exones 51, 53, 55, 57, 59 o 69 del preARNm de la distrofina de un paciente. 25
8. Método in vitro o ex vivo para inducir y/o promover el salto de al menos el exón 52 del pre-ARNm de la distrofina en una célula aislada de un paciente, donde el método comprende proporcionar a dicha célula un oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector según la reivindicación 5. 30
9. Método según la reivindicación 8, donde se usa un oligonucleótido antisentido adicional que es capaz de inducir o promover el salto de al menos uno de los exones 51, 53, 55, 57, 59 o 69 del pre-ARNm de la distrofina de un paciente.

35
10. Uso del oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, del vector según la reivindicación 5, o de la composición farmacéutica según la reivindicación 7 para modular el empalme del pre-ARNm de la distrofina en una célula miogénica humana o célula muscular in vitro, o para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente con DMD o BMD.

40