JP2003235590A - 核酸類縁体並びに診断薬および分析方法におけるその使用方法 - Google Patents
核酸類縁体並びに診断薬および分析方法におけるその使用方法Info
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Abstract
ついてその捕捉、認識、検出、同定または定量化に使用
する核酸類縁体であって、(a)主鎖に沿ったそれぞれ
空間を置いた異なる位置において複数のリガンドを有す
るポリアミド主鎖から構成されるペプチド核酸(PN
A)において、前記リガンドがそれぞれ独立して天然の
核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基結合基であ
り、前記リガンドは各々前記主鎖の窒素原子に直接また
は間接に結合せしめられ、かつ前記リガンドが4つから
8つまでの介在する原子によって前記主鎖のなかで相互
に分離された窒素原子を有するものである、前記ペプチ
ド核酸(PNA)、(b)核酸類縁体であって、相補的
配列の核酸とハイブリッド形成して、前記類縁体に相当
する従来公知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸と
の間で形成されたハイブリッドよりも熱による変性に対
する安定性がより高いハイブリッドを形成する能力を有
する前記核酸類縁体;または(c)一本鎖が前記類縁体
に相補的である配列を有する二重鎖核酸とハイブリッド
形成して、かくして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換
せしめる能力を有する前記核酸類縁体、及びこれらの核
酸類縁体を診断薬および分析方法に用いる前記方法が記
載される。好ましい化合物は、以下の式を有する: 【化学式III】 なお本式において:Lはそれぞれ独立して、水素、フェ
ニル、例えば一つ、二つまたは三つのリングの異項環、
天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から成る群から
選択される;R7’はそれぞれ独立して、水素および天
然のアルファアミノ酸の側鎖から成る群から選択され
る;nは、1から60までの整数である;k、lおよび
mのそれぞれは独立して、ゼロまたは1から5までの整
数である;好ましくは、kとmとの和は1または2であ
り、最も好ましくは1である;Rhは、OH、NH2ま
たは−NHLysNH2である;およびRiはHまたは
COCH3である。
Description
て、例えば一つまたはそれ以上の化学的または微生物学
的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または
定量化などを行うために幾つかの核酸類縁体を使用する
ことに関する。
ゴ−DNA類)は、診断薬の手法においてますます頻繁
に用いられおり、例えば、特異的な微生物の確認を行う
試験、例えば疾病など一般的な素因を確認するための試
験、法医学分野および微生物学全般などにおいて用いら
れている。このような分野におけるオリゴ−DNA類の
用途は、当然のことながら、かかるオリゴ−DNA類が
相補的核酸の塩基配列とハイブリドを形成することがで
きる能力に依拠している。例として挙げれば、標識した
オリゴ−DNAプロ−ブは、固定化した標的DNA類を
探索して特異的な塩基配列の存在を確認するためのハイ
ブリダイゼ−ション測定法に用いられている。増幅操作
法においては、オリゴ−DNA類の有するこのようなハ
イブリダイゼ−ション特性を利用して、増幅するべき鋳
型分子にオリゴ−DNAプライマ−をハイブリッドさせ
でいるのである。
達するオリゴ−DNA類は現在、固体支持体法を用いて
合成されており、完全自動合成装置が幾つか市販されて
いる。しかしながら、これまで注目が払われてきたの
は、塩基配列に特異的に天然DNAとハイブリド形成し
ながら、なおDNAそれ自体とは有利に異なる化学的特
性を有する能力がある合成DNA類縁体を構築・構成す
ることが出来るか否かということであった。このような
研究は大半は、 ”アンチセンス”治療薬にこのような
化合物が用いる可能性があるのではないかという動機の
基づいているのであるが、この場合従来のオリゴ−DN
A類を使用すると幾つかの困難が伴うのである。その理
由は、このような非修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレ
ア−ゼが天然に存在するため生体内(インビボ)で半減
期が短く、また量の多少を問わず製造コストが高くしか
も細胞膜透過性能が劣るからである。
/0518号において、おそらくは天然の核酸と塩基配
列に特異的にハイブリダイゼ−ションする能力を有する
リガンドの、典型的にはヌクレオチド塩基の配列を有す
る主鎖を持ったDNA類縁体が開示されており、また主
鎖として、異なったものが数多く開示されている。この
ような化合物を提供する方法について、具体的な例示は
一切示されておらず、請求されている化合物のDNAに
対する親和性を示すデ−タも一切ない。国際特許出願
(PCT)WO86/05519号は、同種のDNA類
縁体から成る診断薬試薬および診断薬システムを特許請
求しているが、やはりここでも具体的な例示は全くな
い。
60号においては、合成の原料たる種々の構成単位に基
づいたオリゴヌクレオチド類縁体が記載されている。こ
のような構成単位の例示はなされているが、これら構成
単位からオリゴヌクレオチド類縁体を現実に製造する実
施例は全くなく、従ってこのような類縁体の有する性能
について明示も一切されていない。
めかつアンチセンセンス治療方法に用いるDNAの安定
性を全般的に改良する目的で、DNA主鎖を修飾するこ
とが知られている。またDNA類縁体を設計する別の試
みも幾つか、上記したWO86/05518の導入部に
おいて議論されている。
を修飾すると、修飾されたオリゴヌクレオチドとその相
補的である通常のオリゴヌクレオチドとの間において形
成されるハイブリッドの安定性は、Tm値の測定によっ
て求めた場合低下する、ということであった。従って、
この領域における従来の知恵は、主鎖を種々に修飾する
と、必ずハイブリッドが不安定になる、即ちTm値が低
下することになるということであり、従って、実現可能
な最良の結果としてTm値を若干低下させたハイブリッ
ドを得るために、このような修飾は出来るだけ少なくす
るべきであるということである。
相補的配列の従来公知の核酸とハイブリッドを形成し、
而もそのハイブリッドのTm値における安定性を相当す
る配列を持つ従来公知の核酸が形成するハイブリッドよ
りも高くするような特性および/または相当する配列を
持つ前記従来公知の相当する核酸よりも不適合の程度に
関与する配列と比較した相補的配列に対する選択性をよ
り大きくする特性といった、従来知られていない特性を
有する新規な構造の核酸類縁体及びを診断薬または分析
にかかる核酸類縁体を使用する方法に関する。
学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認
識、検出、同定または定量化を行うために使用する核酸
類縁体であって、かかる類縁体が以下であるものを提供
する:即ち、(a)主鎖に沿ったそれぞれ空間を置いた
異なる位置において複数のリガンドを有するポリアミド
主鎖から構成されるペプチド核酸(PNA)において、
前記リガンドがそれぞれ独立して天然の核酸塩基、非天
然の核酸塩基または核酸塩基結合基であり、前記リガン
ドは各々前記主鎖の窒素原子に直接または間接に結合せ
しめられ、かつ前記リガンドが4つから8つまでの介在
する原子によって前記主鎖のなかで相互に分離された窒
素原子を有するものである、前記ペプチド核酸(PN
A)、(b)核酸類縁体であって、相補的配列の核酸と
ハイブリッド形成して、前記類縁体に相当する従来公知
のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成さ
れたハイブリッドよりも熱による変性に対する安定性が
より高いハイブリッドを形成する能力を有する前記核酸
類縁体;または(c)核酸類縁体であって、一本鎖が前
記類縁体に相補的である配列を有する二重鎖核酸とハイ
ブリッド形成して、かくして前記一本鎖からもう一方の
鎖を置換せしめる能力を有する前記核酸類縁体。
縁体(PNA類)の主鎖に原子を有する該窒素の分離
は、好ましくは五つの原子によって行われるのが好まし
い。式(I)(下記)を有する核酸類縁体において、か
かる分離によって、DNAに対する親和性が最も強くな
ることが見出されたのである。しかしながら、一つまた
はそれ以上のリガンドを最適以下の間隔で間に入れるこ
とによって、即ち5つ以上の原子の間隔、例えば14個
までの原子おいて間に入れることによって、該PNA類
とDNAとの間の結合力を減少させるのが所望される場
合もある。リガンド間の間隔の25%以下が6個の原子
またはそれ以上であるのが好ましい。更に好ましくは、
リガンド間の間隔の10ないし15%以下が、6個の原
子またはそれ以上である。該リガンドを有する(直接ま
たは結合基を介して)アザ窒素原子はそれ自体は、上記
した間隔においてカウントしない。
もう一つの方法は、このようなリガンドの内幾つかを除
外し、その代わりに例えば水素のようなDNAの結合に
殆どまたは全く寄与しない原子部を導入することであ
る。好ましくは、このようなリガンド位置の25%以下
は、例えば10から25%以下が非結合性原子部によっ
て占められる。
然DNA塩基(即ち、チミン、シトシン、アデニンまた
はグアニン)またはその他の天然の核酸塩基(例えば、
イノシン、ウラシル、5−メチルシトシンまたはチオウ
ラシル)または適当な結合基を介してペプチド主鎖に結
合された人工の塩基類(例えば、ブロモウラシル、アザ
アデニン類またはアザグアニン類など)が挙げられる。
て使用される核酸類縁体は、以下の一般式(I)を有す
る:
ある、L1−Lnのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキ
シ、(C1−C4)アルカノイル、天然の核酸塩基類、非
天然の核酸塩基類、芳香族原子残基、DNA挿入基、核
酸塩基結合基およびリポ−タリガンドから構成される群
から選択されるが、L 1−Lnの内の少なくとも一つは、
天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基、DNA挿入基また
は核酸塩基結合基である;A1−Anのそれぞれは、一重
結合、メチレン基または下記式(IIa)又は(II
b)で表される基である:
NR3、CH2またはC(CH3)2である;Yは、一重結
合、O、SまたはNR4である;pおよびqのそれぞれ
は、1から5までの整数であり、p+qの和は、10以
下である;rおよびsのそれぞれは、ゼロまたは1から
5までの整数であり、r+sの和は、10以下である;
R1およびR2はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシも
しくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されてい
てもよい(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから構成され
る群から選択される;またR3およびR4のそれぞれは独
立して、水素、(C1−C4)アルキル、ヒドロキシもし
くはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された(C
1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル
チオおよびアミノから構成される群から選択される;B
1−Bnのそれぞれは、NまたはR3N+であり、ここにお
いてR3は上記において定義された通りである;C1−C
nのそれぞれは、CR6R7、CHR6CHR7またはCR6
R7CH2であり、ここにおいてR6は、水素でありまた
R7は、天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される
群から選択され、またはR6およびR7は独立して、水
素、(C2−C6)アルキル、アリ−ル、アラルキル、ヘ
テロアリ−ル、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキシ、
(C1−C6)アルキルチオ、NR3R4およびSR5から
構成される群から選択されるが、ここにおいてR3およ
びR4は、上記において定義された通りであり、R5は、
水素、(C1−C6)アルキル、ヒドロキシもしくはアル
コキシもしくはアルキルチオで置換された(C1−C6)
アルキルであり、またはR6およびR7とは一緒になっ
て、脂環系または異項環系を形成する;D1−Dnのそれ
ぞれは、CR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR
7であり、ここにおいてR6およびR7は、上記において
定義された通りである;G1−Gn-1のそれぞれは、いず
れかの方向での−CONR3−、CSNR3−、−SON
R3−または−SO2NR3−であって、なおここにおい
てR3は、上記において定義した通りである;Qは、−
CO2H、−CONR'R"、−SO3Hもしくは−SO2
NR'R"または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘
導体である;またIは、−NHR"'R""または−NR"'
C(O)R""であり、ここ においてR'、R"、R'"お
よびR""は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、
リポ−タリガンド、挿入基、キレ−ト化剤、ペプチド、
タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌク
レオチドならびに可溶および不溶のポリマ−から構成さ
れる群から選択されるものであって、何れも一つの検出
可能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめ
られたものである L1
(III)を有する:
て、水素、フェニル、天然の核酸塩基および非天然の核
酸塩基から構成される群から選択される;R7'は、水素
および天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群
から選択される;nは、1から60までの整数である;
kおよびmのそれぞれは独立して、ゼロまたは1であ
る;またlは独立して、ゼロから5である;Rhは、O
H、NH2または−NHLysNH2である;およびRi
は、HまたはCOCH3であって、何れも一つの検出可
能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめら
れたものである.
Lが独立して、核酸塩基であるチミン(T)、アデニン
(A)、シトシン(C)、グアニン(G)およびウラシ
ル(U)とから成る群から選択され、特にチミンであ
り、またnが1から30 までの整数であり、特に4か
ら20までの整数である化合物である。このような化合
物の一例は第1図に示してあるが、この図によれば、か
かる化合物と一本鎖DNAとの間の構造上の類似性が明
らかである。
固相上の何れかで標準ペプチド合成方法を採用して合成
してもよい。用いたこれらのシントンは、特別に設計し
たモノマ−アミノ酸またはそれらの活性化誘導体であっ
て、標準的な保護基で保護されたものであればよい。こ
のようなオリゴヌクレオチド類縁体はまた、相当する二
酸とジアミンを用いることによって合成することもでき
る。
に用いたモノマ−シントンは、以下の一般式(IV)、
(V)及び(VI)でそれぞれ表されるアミノ酸、二酸
およびジアミンから成る群から選択されてもよい。
は、上記のいて定義した通りである。但し、本式におけ
るアミノ基は全て、アミノ保護基によって保護されてい
てもよい;Eは、COOH、CSOH、SOOH、SO
2OHまたはこれらの活性化された誘導体であればよ
い;およびFは、NHR3またはNPgR3であり、ここ
においてR3は上記において定義された通りであり、P
gはアミノ保護基である。
(VII)を有するアミノ酸である:
らの末端活性化誘導体であるが、ここにおいてLは、水
素、フェニル、異項環、天然の核酸塩基、非天然の核酸
塩基およびこれらの保護された誘導体から成る群から選
択される;およびR7は独立して、水素および天然のア
ルファアミノ酸の側鎖から成る群から選択される。特に
好ましいのは、式(4)においてR7'が水素でありかつ
Lは核酸塩基であるチミン(T)、アデニン(A)、シ
トシン(C)、グアニン(G)およびウラシル(U)な
らびにこれらの保護された誘導体から成る群から選択さ
れるシントンである。
学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認
識、検出、同定または定量化などを行うために上記にお
いて定義された核酸類縁体を使用することが包含され
る。検出されるかかる個体単位としては先ず第一に、核
酸でありかつ前記固体単位はハイブリダイゼ−ションに
よってその特異的な核酸塩基配列を経由して検出される
ことが、通常は意図される。
体支持体に固定化された本発明において用いられる核酸
類縁体にハイブリッド形成条件下で核酸に接触せしめる
ことから成る核酸を捕捉する方法において、該固定化核
酸類縁体が、補足されるべき前記核酸または核酸類縁体
とハイブリッド形成に適したリガンドの配列を有してい
る前記核酸捕捉方法に使用してもよい。
来公知のオリゴヌクレオチドを固定化することに関連し
て公知である種々の形態を取ってもよい。固体支持体は
例えば、プレ−ト、フィルタ−、マルチウェルプレ−ト
またはディップスティックであればよく、またビ−ズの
ような個別の粒子の形状を取ってもよく、かかる粒子は
カラムに保持し、次いで核酸を含有する溶液をこのカラ
ムに流して所望の種を溶液から捕捉させればよい。
って認識され、検出され、同定されまたは定量化される
ことが出来る。洗浄後はかかる捕捉された核酸は系内に
残留する唯一の核酸であり得るので、捕捉された配列に
特異的か否かを問わず、核酸の存在を証明するのに適し
た試薬系であれば如何なるものによっても検出され得
る。即ち、例として挙げれば、捕捉された核酸がDNA
でありかつ比較的短いPNAによって一本鎖の形態で捕
捉された場合、懸垂状態の一重鎖DNAは、ヌクレア−
ゼによって消化してもよく、かつこのような消化物は通
常の方法に依って検出すればよい。このDNAが二本鎖
でありかつ該PNAが再び比較的短い場合は、該DNA
のうち当初の二本鎖の形態で残留している(即ち、PN
Aによって変位・置換されていない)部分は、PNA−
DNA二重らせんには結合しない通常のDNA挿入基に
よって検出することが出来る。核酸を認識する抗体を、
固定化した核酸類縁体に結合せしめた核酸(RNA、d
sDNAまたはssDNA)を検出するために使用して
もよい。
レオチドを用いて核酸種のアフィニティ−(親和性)捕
捉を行うに際しては、標的核酸を生成することが通常は
必要である。試料中に含まれてもよいヌクレア−ゼは、
固定化した核酸を攻撃する傾向がある。実際において
は、非特異性が極めて高い結合を用いると、特定な結合
は殆ど得られない。更には、当該捕捉が生起しないうち
に、かかるDNAを一本鎖にまで編変性せることが必要
である。
攻撃を受けにくく、典型的には相補的配列の核酸に対す
る親和性が高いため、固定化した種として通常のオリゴ
ヌクレオチドを用いて得た場合よりもより高度の特異的
結合を与えるのである。更には、本発明に従って使用さ
れた核酸類縁体は定型的には、相補的配列の核酸とハイ
ブリッドを形成する能力を有しているが、かかる核酸を
先ず一本鎖に変性せしめることはない。一旦標的核酸が
捕捉されると、固定化された核酸類縁体および捕捉され
た核酸を例えば加熱とジメチルホルムアミドなどのよう
な脱ハイブリダイゼ−ションの条件に供することによっ
て、固定化された核酸類縁体から開放・放出させればよ
い。
類縁体は、mRNAのポリA尾部とハイブリッド形成可
能であってかくして当該mRNAを捕捉する、例えばチ
ミンなど連続リガンドから構成されていればよい。
類縁体から構成される親和性捕捉カラムを包含する。
えば、”Solid−PhaseBiochemist
ry − Analytical and Synth
etic Aspects”、 W.H. Scout
en編著、John Wiley & Sons、Ne
w York、1983を参照)、特に固相バイオシス
テム、特にバイオアッセイまたは種々の固相技法であっ
て、診断的検出/定量化または相補的核酸の親和性生成
に関するもの(例えば、”AffnityChroma
tography − A Practical Ap
proach”、P.D.G. Dean、W.S.J
ohnson and F.A.Middle編著、I
RL Press Ltd.、Oxford 198
6;”Nucleic Acid Hybridiza
tion − A Practical Approa
ch”、B.D. Harnes and S.J.H
iggins、IRL Press Ltd.、Oxf
ord 1987を参照)に係ることが、理解可能であ
ろう。かかるバイオアッセイまたは精製法を実行する今
日的方法は、セルロ−ス、気孔率をコントロ−ルしたも
のを含むガラスビ−ズ(Mizutani、et a
l.。J. Chromatogr.、1986、35
6、202)ビ−ドにした固体支持体、”Sephad
ex”、”Sepharose”、アガロ−ス、ポリア
クリルアミド、多孔性粒状アルミナ、メタアクリル酸ヒ
ドロキシアルキルエステルのゲル、ジオ−ル結合シリ
カ、多孔性セラミック、またはナイロンやニトロセルロ
−スのフィルタ−ディスクなどの連続材料に物理的に吸
着させたかまたは実質的に永久的な共有結合によるアン
カリング結合を介して結合させた”通常の”または若干
修飾したオリゴヌクレオチドを用いるのが殆ど専らであ
る。一つの例において、mRNAを含むポリAテイルを
親和性単離するためのセルロ−スビ−ズ上でオリゴ−d
Tを化学的に合成することを用いている(”Metho
ds in Enzymology”におけるGilh
am、L. GrossmannおよびK. Mold
ave編著、21巻、part D、ペ−ジ191、A
cademic Press、New York an
d London、1971)。上記した方法は全て、
本発明の文脈において適用可能である。しかしながら、
可能ならば、共有結合の方が、該当する分子の物理的吸
着よりも好ましいのである。その理由は、後者の方法に
は、固定化した分子の内のいくつかがハイブリダイゼ−
ションまたは親和性過程において洗い流され得る(脱着
される)という欠点があるからである。すなわち、支持
体材料の表面に吸着された種は、支持体が当該バイオア
ッセイ/精製方法の過程において供される種々の処理の
間において失われるのであるが、そのような逸失の程度
を制御することが殆ど出来ない。このような問題の重大
さは勿論ことながら、吸着された種と”遊離状態の”種
との間における平衡が確立する差異の速度に大幅に依存
して変わるであろう。場合によっては、許容可能な精度
および/または再現性をもって定量的なバイオアッセイ
を実施することは、実際上不可能であるかもしれない。
このような支持体を体液、水性試薬または洗浄媒体で処
理する過程において吸着された種が逸失することは、一
般的にいえば分子量が比較的低い種について最も深刻と
なることが期待されるであろう。オリゴヌクレオチドと
比較して、PNA分子は、強度に求核性および/または
親電子性の中心を包含しているために固体支持体により
付着し易いのである。更には、固体支持体の上において
オリゴヌクレオチドを直接的に組み立て・構築すること
は、固定化した分子をロ−ドするに際して極めてわずか
しかロ−ド出来ないという欠点が生じるのである。その
理由は主として、オリゴヌクレオチドを構築するために
の最高技術水準であるホスホルアミダイト(phosp
horamidite)化学の利用を可能ならしめる種
々の物質・材料の表面性能・能力が低くなるためである
(Beaucage and Caruthers、T
etrahedron Lett.、1981、22、
1859;Caruthers、Science、19
85、232、281)。またこのようなことには、表
面/ロ−ディング性能が高い固体支持体に適している別
のフォスファイトトリエステル法を用いることによって
(Letsinger and Mahadevan、
J.Am.Chem.Soc.、1976、98、36
55)、比較的短いオリゴヌクレオチドしか得ることが
出来ないという事実が伴う。しかしながら、通常の固相
ペプチド合成に関しては、後者の支持体は、固定化した
PNA分子を構築するうえで優れた材料である(側鎖保
護基は、このような鎖を固体支持体に保持するアンカ−
リング結合を開裂させることなく、合成されたPNAか
ら除去することが可能である)。すなわち、PNA種
は、相補的核酸に対する結合親和性が極めて高いことに
関して、上記した固相技法から利点を受け、また二重鎖
構造で存在する核酸をさらにユニ−クに配列特異的に認
識すること(およびかかる核酸に強力な結合すること)
をからも利点を受けるのである。このようなPNA種は
また、大量に固体支持体にロ−ドすることが可能であ
り、かくして当該固相法の感度/能力を増大せしめるこ
とになる。更には、固相生化学でのPNAの使用に関す
るいくつかの種類の研究が、最近報告された”光−指示
された、空間的に取組可能な、平衡化学的合成”技術、
すなわち固相化学と写真石版術とを組み合わせて実質的
に同時に極めて多種の、但し同定可能で、永久的に固定
化された化合物(例えばペプチド)を精製せしめる技法
を利用することによって着手され、容易にされまたは大
いに加速されることが可能である。
とがなかった特性を示すことが見出されたのである。す
なわち、かかる核酸類縁体が二本鎖の形態で存在する通
常の核酸とハイブリッドを形成する能力を有しておりま
たこのような条件下において、当該類縁体に相補的な配
列を有する鎖とハイブリッドを形成しかつ当初の核酸二
重らせんからもう一方の鎖を置換せしめる能力を有して
いるということである。このような認識は、塩基対とし
て5−60対の長さであるdsDNA配列に対して行い
得るのである。塩基が10と20との間にある配列は、
原核細胞および真核細胞のDNAの独自配列が認められ
る範囲に相当するので、興味深いのである。17−18
の塩基を認識する試薬は、ヒトゲノムにおける独自配列
の長さに相当するので、特に興味の対象となる。
溶液中で行うと、該核酸類縁体の最初の鎖配と同じ配列
を有する二番目の鎖もやはり、相補的配列を有する核酸
鎖とハイブリッドを形成し、その結果PNAの二つの鎖
が通常の核酸の単一鎖とハイブリッドせしめられている
三重らせん構造を形成することが見出されたのである。
この最初のPNA鎖が通常の型式の塩基間水素結合によ
ってハイブリダイゼ−ションを行い、他方ではPNAの
二番目の鎖がHoogsteenの対合によって当初の
二重らせんの主要な溝の中で受容されることが観察され
ている。PNAが固体支持体に固定化された場合、二本
鎖核酸とのハイブリダイゼ−ションが、一本鎖がそれか
ら置換・変位さするのを伴って観察されるが、三重らせ
ん構造の形成は、該PNAの固定化によって阻止され得
るのである。
たはこれと接合した上記において定義された核酸類縁体
を包含する。目下のところ公知であるペプチド、DNA
および/またはRNAを標識化する方法は、一般的にP
NA類にも適用され得る。すなわち、標識化の方法は、
放射性同位元素標識、酵素標識、ビオチン、スピン標
識、 発蛍光団、化学発光標識、抗原標識または抗体標
識を使用することからなるであろう。
し、検出しまたは定量化する方法において、充分相補的
配列を有する上記において定義した標識核酸類縁体に前
記標的をハイブリダイゼ−ションさせて、かくしてハイ
ブリッドする条件においてハイブリダイゼ−ションを起
こさせ、次いでこうして前記標的にハイブリッドさせた
該核酸類縁体の前記標識を検出するかまたは定量化する
ことから成る前記認識、検出または定量化方法に使用し
てもよい。
−ションを行う前に基質に固定化させてもよい。
は、該標的の第一の領域を前記第一の領域に充分相補的
である配列を有しかつそれ自体前記基質に固定化されて
いる捕捉核酸または核酸類縁体にハイブリダイゼ−ショ
ンさせて、かくしてハイブリッドさせることによって基
質に固定化させてもよく、次いで標識核酸類縁体を該標
的の第二の領域にハイブリッドさせればよい。
縁体が、二本鎖標的核酸とハイブリッドしかつその一本
の鎖を置換させることが出来る能力については、上記に
おいて記載した通りである。本発明は、核酸の二重らせ
んから一本鎖を置換する方法において、前記二重ラセン
から一本鎖を置換することができる程充分な、前記二重
らせんの内のもう一方の鎖に対する親和性を有する上記
において定義した核酸類縁体を前記二重らせんにハイブ
リッドさせることから成る前記置換方法を包含する。
類縁体に相補的な配列を一方の鎖が有する二本鎖標的か
ら他の一本鎖を置換する能力がある前記核酸類縁体を二
本鎖標的にハイブリッドさせるに際して、前記置換核酸
類縁体が、ハイブリダイゼ−ションさせるに充分な、前
記二本鎖標的の内の前記もう一方の鎖に対する相補的配
列を有しており、その結果一本鎖の形態における前記標
的の前記一本鎖を置換するものであり、次いで前記二本
鎖標的からの置換後に前記一本鎖の存在を検出しまたは
これを定量化することから成る、二本鎖標的核酸を検出
し、同定しまたは定量化する方法を包含する。
し、次いで前記斑だの存在を検出してもよい。置換され
た一本鎖は好ましくは、ヌクレア−ゼによる作用によっ
て破断させてもよい。すなわち、特異的な二本鎖標的核
酸配列の存在の検出を、該標的核酸配列に相補的PNA
をハイブリッドさせて鎖置換を行わしめ、かくして該反
応混合物中において一本鎖DNAを生成せしめ、次いで
ヌクレア−ゼを用いて一本鎖DNAを消化させてヌクレ
オチド類を生成させることによって行うことが出来る
が、この際かかるヌルレオチドの存在を、当該標的二本
鎖DNAが当初に存在していたという指標・標識として
検出することが可能である。
酸類縁体を少なくとも一種組み込んで成り、かつ好まし
くはかかる核酸類縁体を標識化したものを少なくとも一
種、例えば一つの標識PNAおよび前記標識を検出する
のに使用する検出試薬を少なくとも一種とを含んで成る
診断薬に使用出来るキットを包含する。
イブリダイゼ−ション緩衝液として溶液状で提供され
る。このようなキットは通常は、洗浄緩衝溶液を少なく
とも一種包含する。
標識化した場合、当該キットは、酵素標識と該核酸類縁
体の標識と結合する能力がある物質、例えばアビジンと
の間の抱合体を含有して成るものであってもよい。
で標識化した場合は、該キットは、該酵素によって仲介
されるモニタ−可能な反応を行うに適している該酵素の
基質を包含して成るものであってもよい。
よびその製造に用いたモノマ−シントンにおいて、リガ
ンドLは主として、自然界において見出される位置、す
なわちアデニンまたはグアニンについては9位の位置ま
たチミンまたはシトシンについては1位の位置に結合さ
せた天然の核酸塩基である。その代わりに、これらリガ
ンドLの内のいくつかはそれぞれ、非天然の核酸塩基
(核酸塩基類縁体)、他の塩基結合性原子部、芳香族原
子部、(C1−C4)アルカノイル、ヒドロキシまたは水
素であってもよい。いくつかの典型的な核酸塩基リガン
ドおよび具体的な合成リガンドは、第2図に示してあ
る。更には、Lは、DNA挿入基、例えば発蛍光団、ラ
ジオ標識、スピン標識、ハプテンなどのリポ−タ−リガ
ンド、またはビオチンなどのタンパク質認識リガンドで
あり得る。
護基を設けていてもよい。このことは、第4図に図示し
てあるが、本図においてPg1は、酸、塩基または例え
ばt−ブトキシカルボニル(Boc)、フルオレニルメ
チルオキシカルボニル(Fmoc)または2−ニトロベ
ンジル(2Nb)などの水素分解性もしくは光化学的に
開裂可能な保護基である。
CR1R2CS、CR1R2Cse−、−CR1R2CNHR
3−、−CR1R2C=CHや−CR1R2C=C(CH3)
2−、−なおR1 、R2およびR3は上記において定義し
た通りである−などの種々の基であり得る。Aは、メチ
レンカルボニル(−CH2CO−)である。また、A
は、プロパノイル、ブタノイルまたはペンタノイルなど
のより長鎖の原子部またはそれに相当する誘導体であっ
て、その酸素原子がその他のXで表される原子で置換さ
れるかまたはその原子鎖がR1R2で置換されるかYを含
む不均一であるものであってもよい。さらに、Aは、
(C2−C6)アルキレン鎖、R1R2で置換された(C2
−C6)アルキレン鎖であってもよく、またはYを含む
不均一なものであってもよい。場合によっては、Aは単
に一重結合であればよい。
素原子であり、かくしてアキラル主鎖の可能性が生じ
る。BはまたR3N+−本式においてR3は上記におい
て定義した通りである−であってもよい。
CR6R7−であるが、また二つの炭素単位、すなわち−
CHR6CHR7−または−CR6CR7CH2−−本式に
おいて、R6およびR7は上記において定義された通りで
ある−であってもよい。R6およびR7はまた、例えばピ
ロ−ロリル、フリル、チオニル、イミダゾリル、ピリジ
ル、ピリミジニル、インドリルなどのヘテロアリ−ル基
であってもよく、または両者は共同して例えば1、2−
シクロブタンジイル、1、2−シクロペンタンジイルま
たは1、2−シクロヘキサンヂイルなどの脂環系を形成
してもよい。
−シントンにおけるEはCOOHまたはその活性化され
た誘導体であり、またオリゴマ−におけるGは、−CO
NR 3−である。(好ましくは、式Iにおける−R3NO
Cの方向において)。上記において定義したように、E
はまた、CSOH、SOOH、SO2OH、またはそれ
らの活性化された誘導体であってもよく、またこの時オ
リゴマ−におけるGは、−CSNR3−、−SONR3−
および−SO2NR3−となる。かかる活性化は、例えば
酸無水物または活性エステル誘導体を用いて行えばよ
く、この際Eで表される基における水素は、成長する主
鎖を精製させるために適した解離する基によって置換さ
れている。
もまたは異なっていてもよい。本発明者らは、2−アミ
ノエチルグリシンに基づいたものが本発明の目的に特に
適していることを見出したのである。
においてリガンドを結合させて、PNA類の結合特性を
変調させることは興味深いことであり得る。代表的なリ
ガンドとしては、dsDNAの結合を改善するDNA挿
入基または例えばリシンまたはポリリシンなどの、静電
的相互作用によってPNAの結合を強化する塩基性基が
挙げられる。カルボキシやスルフォ基などのマイナスに
荷電した基を減少させる基を使用することも可能であろ
う。シントンの設計によって更には、その他の原子部を
端末でない位置に移動させることもできる。
活性またはアルキル化活性を有するリガンドまたはリポ
−タ−リガンドなどの(発蛍光団、スピン標識、放射性
物質、タンパク質認識リガンド、たとえばビオチンまた
はハプテン)低分子量の作動リガンドに共軛・接合させ
てもよい。本発明のまた別の局面においては、このよう
なPNA類は、ペプチドまたはタンパク質に共軛・接合
させるのであるが、かかるペプチドは信号発信活性を有
しかつかかるタンパク質はたとえば酵素、転写因子また
は抗体である。また、PNA類は、水溶性または非水溶
性のポリマ−に結合させることもできる。本発明の別の
局面において、これらのPNA類は、オリゴヌクレオチ
ドまたは炭水化物に共軛・接合させられる。保証された
場合は、PNAオリゴマ−は、固体支持体に結合された
何らかの原子部(たとえば、ペプチド鎖、リポ−タ−、
挿入基またはその他の種類のリガンド含有基)の上にお
いて合成することも出来る。
成は、以下において詳細に議論されるが、ここにおいて
第1図は好ましいPNAの例の一つを表し、その構造を
相補的DNAの構造になぞらえている。
学変化の過程において中間生成物を解明するうえで役に
立つのであるが、固相合成またはメリフィ−ルド合成と
して知られている(たとえば、J.Am.Chem.S
oc.、1963、85、2149およびSCIENC
E、1986、232、341を参照のこと)。アミノ
酸を段階的にまたは断片的に組み立ててペプチドにする
方法として確立されているのは通常は、若干架橋処理さ
れたスチレン−ジビニルベンゼンコポリマ−から成るビ
−ズにしたマトリックスを用いるが、このような架橋処
理したコポリマ−は、ジビニルベンゼン類の混合物を添
加したスチレンをパ−ル重合させることによって形成さ
せられたものである。架橋密度・程度として1−2%が
通常は用いられ、かかるマトリックスも、本発明に従っ
て固相PNA合成に使用することが出来る(第1図)。
ることに関して、五十以上の方法が、従来の固相ペプチ
ド合成に関連して記載されている(たとえば、”The
Peptides” Vol.2におけるBaran
y and Merrified、Academic
Press、New York、1979、pp.1−
284、およびStewart and Youn
g、”Solid Phase Peptide Sy
nthesis”、2nd Ed.、PierceCh
emical Company、Illinois、1
984)。クロロメチル官能性(Merrified
resin;クロロメチルメチルエ−テル/SnCl4
反応を経由),アミノメチル官能性(N−ヒドロキシメ
チルフタルイミド反応を経由して;Mitchell
ら、Tetrahedron Lett.、1976、
3795)およびベンゾヒドリルアミノ官能性(Pie
ttaら、J.Chem.Soc.、1970、65
0)を導入する反応が、最も広く用いられている。その
本質如何に拘らず、このような官能性の目的は、通常は
かかるコポリマ−の固体支持体とその固体支持体にカッ
プリング結合させるべき第一のアミノ酸のC−末端との
間にアンカ−止め結合を形成させることである。官能基
の”濃度”をグラム当たりミリモル(mmole/g)
で表すことが一般的には好都合である。当初に導入した
他の反応性官能性としては、4−メチルベンゾヒドリル
アミノおよび4−メトキシベンゾヒドリルアミノが挙げ
られる。これらの確立された方法は全て、原則として本
発明の文脈の範囲内において有用である。PNA合成の
好ましい方法は、当初官能性としてアミノメチルを使用
するが、それは、アミノメチルが、スペ−サ−形成試薬
の一端においてカルボキシル酸へのアミド結合を本質的
に定量的に形成させることに関連してアミノメチル官能
性のアミノ基が持つ反応性が高いために”スペ−サ−”
または”ハンドル(handle)”基を導入すること
に関して有利であるから。該当するスペ−サ−またはハ
ンドル形成性二官能性基について膨大な数の基が記載さ
れている(Barranyら、Int.J.Pepti
de Protein Res.、1987、30、7
05を参照)が、特にたとえばアミノメチル官能におい
て見出されているようなアミノ基に対する反応性の高い
試薬が記載されている。代表的な二官能性試薬として
は、たとえば4−(ブロモメチル)フェニル酢酸などの
4−(ハロアルキル)アリ−ル−低級アルカン酸、たと
えばBoc−アミノアシル−4−(オキシメチル)フェ
ニル酢酸などのBoc−アミノアシル−4−(オキシメ
チル)アリ−ル−低級アルカノン酸、たとえばN−Bo
c−p−グルタロイルベンゾヒドリルアミンなどのN−
Boc−p−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばN
−Boc−4’−メチル−p−グルタロイルベンゾヒド
リルアミンなどのN−Boc−4’−低級アルキル−p
−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばN−Boc−
4’−メトキシ−p−グルタロイル−ベンゾヒドリリル
アミンなどのN−Boc−4’−低級アルコキシ−p−
アシルベンゾヒドリルアミン、および4−ヒドロキシメ
チルフェノキシ酢酸が挙げられる。本発明の文脈の範囲
内において特に該当するスペ−サ−基の一種類は、フェ
ニルアセトアミドメチル(Pam)ハンドル(Mitc
hell and Merrifield、J.Or
g.Chem.、1976、41、2015)であり、
これは4−フェニルアセトアミドメチル基の電子吸引効
果から派生して、Boc−アミノ脱保護試薬であるトリ
フルオロ酢酸(TFA)に対する古典的なベンジルエス
テル結合よりもほぼ100倍安定である。
ように合成したPNA鎖を固体支持体から開裂させる目
的のために導入させてもよいいくつかの官能性(たとえ
ば、ベンゾヒドリルアミノ、4−メチルベンゾヒドリル
アミノおよび4−メトキシベンゾヒドリルアミノ)は、
スペ−サ−基の導入を一切必要としない。このような官
能性は何れも、有利には本発明の文脈において使用する
ことが出来る。
るもう一つの戦略は、所謂”予備形成したハンドル”戦
略(Tamら、Synthesis、1979、955
−957を参照)であって、これは、第一のアミノ酸を
カップリング結合させることを完璧に制御することが出
来またペプチドまたはPNA合成に関係しない所望しな
い官能基が存在することから起因する複雑な状況が生ず
る可能性を排除するものである。この戦略においては、
スペ−サ−またはハンドル基は、前記したものと同様の
種類の基であるがこれらを固体支持体に結合させたいと
希望する第一のアミノ酸と反応させるが、該アミノ酸は
N−保護されておりかつ随意には所望のPNA鎖の伸張
について該当しないその他の側鎖において保護される。
すなわち、スペ−サ−またはキハンドル基が望ましい場
合においては、固体支持体にカップリングさせるべき第
一のアミノ酸は、当初に導入した官能性(たとえば、ア
ミノメチル基)に導入させておいたスペ−サ−基の遊離
の反応性末端にカップリング・結合させることが出来る
かまたはスペ−サ−形成試薬と反応させることが出来
る。スペ−サ−形成性試薬は、次いで当初に導入した官
能性と反応させる。他の有用なアンカ−止めスキ−ムと
しては、”多重脱離可能な(multi−detach
able)”樹脂(Tamら、Tetrahedron
Lett.、1979、4935およびJ.Am.C
hem.Soc.、1980、102、611;Ta
m、J.Org.Chem.、1985、50529
1))であり、この樹脂は、一つ以上の放出・解離型式
が可能であり、かくして合成デザインにおいて一層の柔
軟性をもたらすものである。
通常は側鎖の保護のためのベンジルに関連した基と組合
せて用いる第三級−ブチルオキシカルボニル(Boc)
基(Carpino、J.Am.Chem.Soc.、
1957、79、4427;McKayら、J.Am.
Chem.Soc.、1957、79、4686;An
dersonら、J.Am.Chem.Soc.、19
57、79、6180)および如何なる側鎖をも保護す
るための第三級ブチル(tBu)と組合せて用いる9−
フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基
(Carpinoら、J.Am.CHem.Soc.、
1970、92、5748およびJ.Org.Che
m.、1972、37、3404)である。尤も、通常
の固相ペプチド合成において公知であるその他の多くの
可能性がある。すなわち、種々のその他のアミノ保護基
が存在するのであり、その内のいくつかは、Adoc
(Hassら、J.Am.Chem.Soc.、196
6、88、1988)。Bpoc(Sieber、He
lv.Chem.Acta.、1968、51、61
4)、Mcb(Bradyら、J.Org.Che
m.、1977、42、143),Bic(Kepm
ら、Tetrahedron、1975、4624),
o−ニトロフェニルスルフェニル(Nps)(Zerv
esら、J.Am.Chem.Soc.、1963、8
5、3660)およびジチアスクシノイル(Dts)
(Baranyら、J.Am.Chem.Soc,、1
977、99、7363)である。これらのアミノ保護
基は、特にウレタン官能性に基づく保護基は、大半のア
ルファ−アミノ酸のカップリングの過程においてラセミ
化(容易に生成するオキサゾリノン(アスラクトン)中
間体の互変異性化によって仲介される)を成功裏に抑止
する。このようなアミノ保護基以外に、それ以外では”
無用の”非ウレタン型式のアミノ保護基の全体は、PN
A分子、特にアキラル単位から構築したPNA分子を構
築するに際しては適用可能である。すなわち、上記した
アミノ保護基(またはこれらの基から誘導されたもの)
は、本発明の文脈の範囲内において有用であるばかりで
なく、以下の要件をほぼ満たすアミノ保護基の実際上全
てのものが有用である:(1)温和な酸に対する安定性
(カルボキシル基によって有意に攻撃されない);
(2)温和な酸または求核試薬に対する安定性(問題と
なるアミノ基によって有意に攻撃されない);(3)ア
セチル化に対する抵抗性(活性化されたアミノ基によっ
て有意に攻撃されない);さらに(4)該保護基は、重
大な副反応を伴うことなく定量的な除去可能性に近いも
のでなくてはならない;および(5)導入されるアミノ
酸の光学的完全さが、好ましくはカップリングに際して
高度に保存されるべきである。最後に、側鎖保護基の選
択は一般的に、側鎖官能性の保護は繰り返されるアミノ
脱保護サイクルの条件に耐えるものでなくてはならない
ので、アミノ保護基の選択に依存して異なる。PNAを
化学的に構築する全般的な戦略が、たとえばアミノと側
鎖保護基の特異的な酸安定性に依拠しようとも(たとえ
ば上記した”Boc−ベンジル”の手法)、または直交
的な、すなわち化学選択的な保護スキ−ムを用いようと
も(たとえば、上記した”Fmoc−tBu”手法の当
てはまる)、このことは真実である。
固相合成の次ぎの工程は、所望するPNA鎖を系統的に
合成することである。このような合成は、繰り返し行う
脱保護/カップリングサイクルを包含する。たとえばB
ocやFmoc基などの、最後にカップリングしたアミ
ノ酸の暫定的な保護基は、たとえばBocの場合はトリ
フルオロ酢酸を用いた酸分解、Fmocの場合はピペリ
ジンを用いた塩基処理などの適当な処理に依って定量的
に除去し、かくしてN−末端アミノ機能を遊離せしめる
のである。
いで、最後にカップリングさせたアミノ酸のN−末端に
カップリングさせる。アミノ酸のC−末端に最後にカッ
プリングさせたアミノ酸のN−末端をこのようにカップ
リングさせることは、いくつかの方法で行い得る。たと
えば、2、4、5−トリクロロフェニルエステル(Pl
essら、Helv.Chim.Acta、1963、
46、1609)、フタルイミドエステル(Nefke
nsら、J.Am.Chem.Sco.、1961、8
3、1263)、ペンタクロロフェニルエステル(Ku
pryszewski、Rocz.Chem.、196
1、35、595)、ペンタフロロフェニルエステル
(Kovacsら、J.Am.Chem.Soc.、1
963、85、183)、o−ニトロフェニルエステル
(Bodanzsky、Nature、1955、17
5、685)、イミダゾ−ルエステル(Liら、J.A
m.Chem.Soc.、1970、92、7608)
および3−ヒドロキシ−4−オキソ−3、4−ジヒドロ
キナゾリン(Dhbt−OH)エステル(Konig
ら、Chem.Ber.、1973、103、2024
および2034)などの活性エステル誘導体を当初に形
成させること、またはたとえば対称無水物などの無水物
を当初に形成させることを含む、いくつかの方法の何れ
を用いてある形態の導入アミノ酸にカルボキシル基を付
与する事によって結合させることが出来る。その代わり
に、導入するアミノ酸のカルボキシル基には直接的に、
たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド(Seeha
nら、J.Am.Chem.Soc.、1955、7
7、1076)またはその誘導体などの縮合試薬を用い
て最後にカップリングしたアミノ酸のN−端末と反応さ
せることが出来る。ベンゾトリアゾリル N−オキシト
リス−ジメチルアミノホスホニウム ヘキサフルオロホ
スフェ−ト(BOP)、すなわち”カストロの試薬”
(たとえば、Rivailleら、Tetrahedr
on、1980、36、3413)が、第二級アミノ基
を含むPNA分子を構築する場合勧められる。最後に、
最近報告されたアミノ酸弗化物(Carpino、J.
Am.Chem.Soc.、1990、112、965
1)niruijisita活性化PNAモノマ−も、
PNA合成においても使用できる相当な見込みがある。
後、次ぎの工程は、通常はPNA鎖のアミノ酸部位の脱
保護と合成したPNAを固体支持体から開裂させること
であろう。これらのプロセスは、実質的に同時に生起さ
せて、その結果所望の形状で遊離のPNA分子を得るこ
とが可能である。その代わりに、これら二つの別々に合
成されたPNA鎖を縮合させねばならない場合は、合成
のスタ−ト時に適当なスペ−サ−基を選択して、かくし
て所望のPNA鎖をそれぞれの固体支持体から開裂させ
(両方のペプチド鎖ともなおそれぞれ側鎖保護基を含ん
でいる)、次いで最後に、たとえば二つの側鎖保護され
たペプチド鎖をカップリングさせた後側鎖保護基を除去
して、かくしてより長いPNA鎖を形成せしめることに
よって、このような反応は可能である。
ムにおいて、側鎖の最終的な脱保護およびPNA分子の
固体支持体からの開放は、たとえば無水HF(Saka
kibaraら、Bull.Chem.Soc.Jp
n.、1965、38、4921)、トリス(トリフル
オロ酢酸)ホウ素(Plessら、Helv.Chi
m.Acta、1973、46、1609)およびトリ
フルオロメタンスルホン酸やメタンスルホン酸(Yaj
imaら、J.Am.Chem.Soc.、Chem.
Comm.、1974、107)などのスルホン酸類な
どの強酸を使用することに依って実施されるのがもっと
も多い。このような通常の強酸(たとえば、無水HF)
による脱保護方法は、極めて反応性の強いカルボカチオ
ンを生成し、それによってPNA鎖の中における敏感な
残基のアルキル化やアシル化が起きる可能性がある。こ
のような副反応は、アニソ−ル、フェノ−ル、ジメチル
サルファイドやメルカプトエタノ−ルなどのスカベンジ
ャ−(捕捉剤)を存在させることによっては部分的にし
か回避出来ないので、従ってサルファイドを用いた酸加
水分解的SN2脱保護法(Tamら、J.Am.Che
m.Soc.、1983、105、6442およびJ.
Am,Chem.Soc.、1986、108、524
2),所謂”低い”方法は、有害なカルボカチオンの前
駆体を除いて、不活性なスルフォニウム塩を形成させる
のであるが、ペプチドやPNA合成においては単独でま
たは”高い”方法と組合せて頻繁に用いられる。それ程
頻繁ではないが、特別の場合には、脱保護することおよ
び/またはPNA−固体支持体との結合を最終的に開裂
させるために用いられる方法としては、たとえば、塩基
接触アルコ−ル分解(Bartonら、J.Am.Ch
em.soc.、1973、95、4501)やアンモ
ニア分解ならびにヒドラジン分解(Bodanszky
ら、Chem.Ind.、1964、1423)、水素
分解(Jones、Tetrahedron Let
t.、1977、2853およびSchlatter
ら、Tetrahedron Lett.、1977、
2861)および光分解(Rich and Gurw
ara、J.Am.Chem.Sco.、1975、9
7、1575)などの方法が挙げられる。
と異なって、たとえばアミノエチルグリシル主鎖単位に
基づいたPNA類などのアキラルPNA類の段階的鎖構
築は、かかるカップリング反応はラセミ化を伴わないの
で、N−端末またはC−端末の何れかから出発すること
が出来る。
イクルにおけるのと同一である(固相PNA合成につい
ても当てはまるように)事実を認識することに基づい
て、新規のマトリックス、すなわちPEPS が多数の
ペプチド類の合成を容易にするために最近導入された
(Bergら、J.Am.Chem.Soc.、198
9、111、8024および国際特許出願WO 90/
02749号)。このようなマトリックスは、長鎖のポ
リスチレン(PS)グラフト(106のオ−ダ−の分子
量)をぶら下げたポリエチレン(PE)フィルムから構
成される。このフィルムのロ−ディングの能力は、ビ−
ズマトリックスと同じ程度に高いが、PEPSには、多
段合成に同時に適合させる別の柔軟性がある。すなわ
ち、新規な固相ペプチド合成方法においては、かかるP
EPSフィルムは、不連続の標識されたシ−トに加工さ
れるが、それぞれのシ−トは、個別の分画部として機能
する。このような合成サイクルの同一の工程の全てにお
いて、これらのシ−トは、単一の反応容器の中において
一体に保持され、かくして通常の方法による単一ペプチ
ドの合成と近似した速度で複数のペプチド合成を同時に
実施せしめることが可能である。
特殊化学に適合せしめられた結合基またはスペ−サ−基
を含んで成り、複数のPNA分子の合成において特に有
用で貴重であるはずと推定された。それというのも、四
つの”プソイド−ヌクレオチド”単位のそれぞれに対し
て一つずつ、僅かに四つの異なる反応分画部しか通常は
必要とされないので、概念上合成が簡単であるからであ
る。すなわち、PEPSフィルム支持体は、平行したか
つ実質的に同時の態様でかす多くのPNA合成において
試験されて、何れも成功している。PEPSから得られ
た製品の収率と品質は、伝統的なポリスチレンビ−ズ支
持体を使用することによって得られた収率と品質に比肩
し得るものであった。また、たとえば不織フェルト、編
みネット、スティックまたはマイクロウエルプレ−トな
どその他の外観形状のPEPSポリマ−を用いた実験の
意結果では、合成効率に何等の制限もないことが判って
いる。多数のペプチドを同時に合成するために提案され
た他の二つの方法もやはり、多数の異なるPNA分子を
調製製造するために適用され得る。これらの方法の最初
の方法は(Geysenら、Porc.Natl.Ac
ad.Sci,USA、1984、84、3998)、
アクリル酸グラフトポリエチレン製ロッドおよび96個
のマイクロリットルウエルを用いて、成長するペプチド
鎖を固定化しかつ分画化した合成を実施するものであ
る。この方法は、極めて効率がよいものの、マイクログ
ラムのスケ−ルでのみ適用可能であるに過ぎない。第二
の方法は(Houghten、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、1985、82、513
1)、伝統的に使用されてきたポリマ−ビ−ズを用いる
ものである。その他多重ペプチドまたはPNA合成のた
めに提案された方法で、本発明の文脈の範囲内に入る方
法には、密度の異なる二つの相異なる支持体を同時に用
いる方法(Tregaer、”Chemistry a
nd Biology ofPeptides”、J.
Meierhofer編著、Ann ArborSc
i,Publ.、Ann Arbor、1972 p
p.175−178)、マニホルドを介して異なる反応
容器を組み合わせる方法(Gorman、Anal.B
iochem.、1984、136、397)、マルチ
カラム固相合成法(たとえば、Krscnakら、In
t.J.Peptide Protein Res.、
1989、33、209およびHolm and Me
ldal、”Proceedings of the
20th European Peptide Sym
podium”、G.JungおよびE.Bayer編
著、Walter de Gruyter & C
o.、Berlin、1989pp208−210)お
よびセルロ−スペ−パ−を使用する方法(Eichle
rら、Collect.Czech.Chem.Com
mun.、1989、54、1746)がある。従来か
らある架橋スチレン/ジビニルベンゼンコポリマ−マト
リックスおよびPEPS支持体が目下とのところ固相P
NA合成の文脈において好ましいのであるが、該当し得
る固体支持体の例として、これに限定されないリストに
は以下のものが含まれる:すなわち(1)既知量のN−
第三級−ブトキシカルボニル−ベ−タ−アラニル−N’
−ヘキサメチレンジアミンを含むN、N’−ビサクリロ
イルエチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルア
ミドのコポリマ−を用いた粒子。いくつかのスペ−サ−
分子は、典型的にはベ−タアラニル基を介して、次いで
アミノ酸残基によって付加される。また、このベ−タア
ラニル含有モノマ−は、重合過程においてアクロイルサ
ルコシンモノマ−で置換して、樹脂ビ−ズを形成するの
である。かかる重合を行ったあとで、ビ−ズにエチレジ
アミンを反応させて、共有結合で結合させた官能基とし
て一級アミンを含有する樹脂粒子を形成する。このポリ
アクリルアミドを用いた支持体は、相対的にポリスチレ
ンを用いた支持体よりも親水性が高く、ジメチルホルム
アミド、ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン
などを含む極性の高い、非水性の溶媒とともに通常は使
用される(Athertonら、J.Am.Chem.
Soc.、1975、97、6584、Bioorg.
Chem.、1979、8、351およびJ.C.
S.、Perkin I、538(1981)を参
照);(2)第二の固体支持体のグル−プは、たとえ
ば、多孔質のガラスビ−ズやシリカゲルなどのシリカ含
有粒子を用いるものである。一つの例は、Waters
Associates、Framingham、M
A、USAが”PORASIL”なる商標で市販されて
いるトリクロロ−[3−(−クロロメチル)−フェニ
ル]プロピルシランおよび多孔質のガラスビ−ズとの反
応生成物(Parr and Grohmann、An
gew.Chem.Internal.Ed.、197
2、11、314を参照)である。同様に、1,4−ジ
ヒドロキシメチルベンゼンとシリカとのモノエステル
(Waters Associatesによって”BI
OPAK”なる商標で販売されている)が、有用である
と報告されている(Bayer and Jung、T
etrahedron Lett.、1970、450
3);(3)有用な固体支持体の三番目の種類は、二種
の主要成分を含有しているという意味で複合物と称する
ことが出来る:すなわち、樹脂および使用した有機合成
反応条件に対して実質的にに不活性であるたの材料であ
る。一つの複合物の例は(Scottら、J.Chro
m.Sci、1971、9、577を参照)、疎水性の
架橋処理したクロロメチル基を含むスチレンポリマ−で
被覆したガラス粒子を用いたものであり、Hamde
n、CT、USAのNorthgateLaborat
ories、Inc.によって製造販売されていたもの
である。もう一つの複合物の例は、ポリスチレンがグラ
フトされているフッ素化エチレンポリマ−のコア−を含
有するものである(Kent and Merrifi
eld、Israel J.Chem.、1978、1
7、243およびvanRietschoten,”P
eptides 1974”、Y.Wolman編著、
Wiley and Sons、New York、1
975、pp.113−116を参照);(4)たとえ
ばコトンシ−トなどのPEPS以外の同一種に属する固
体支持体(Lebl and Eichler、Pep
tideRes.、1989、2、232)およびヒド
ロキシプロピルアクリレ−トでコ−トされたポリプロピ
レン膜(Danielsら、Tetrahedron
Lett.、1989、4345)もPNA合成に適し
ている。
脈における固相PNA合成は、通常はバッチ法で行われ
る。しかしながら、このような合成の大半は、支持体を
カラムに充填して(Bayerら、Tetrahedr
on Lett.、1970、4503およびScot
tら、J.Chromatogr.Sci.、197
1、9、577)連続フロ−の型式で同様に実施しても
よい。連続フロ−固相合成に関して、硬質のポリ(ジメ
チルアクリルアミド)−珪藻土(Kieselguh
r)支持体(Athertonら、J.Chem.So
c.Chem.Commu.、1981、1151)
が、特に成功しているように見えるが、もう一つの有用
で貴重な方法は、標準的なコポリ(スチレン−1%−ジ
ビニルベンゼン)支持体のために工夫されたものに関す
るものである(Krchnakら、Tetrahedr
on Lett.、1987、4469)。
において好ましいのであるが、その他の方法論またはた
とえばそれらとこのような固相法との組合せも適用され
る:すなわち、(1)ペプチドの古典的な溶液相法(た
とえば、Bodanszky、”Principles
of Peptide Synthesis”、Sp
ringer−Verlag、Berlin−New
York 1984)であって段階的な構築法によるか
またはセグメント/フラグメント縮合法によるものが、
PNA化合物の特に大規模な製造(グラム。キログラム
またはトンまでも)を考慮する場合に特別に該当する;
(2)所謂”液相”戦略であって、たとえば線状ポリス
チレンなどの溶解性ポリマ−支持体(Shemyaki
nら、Tetrahdron Lett.、1965、
2323)やポリエチレングリコ−ル(PEG)(Mu
tter and Bayer、Angew.Che
m.、Int.Ed.Engl.、1974、13、8
8)を用いるものが有用である;(3)種々の分子量の
(”poly−disperse”)ペプチドまたはP
NA分子を生成するランダム重合(たとえば、Oida
n、”Principles of Polymeri
zation”、 McGraw−Hill、New
York(1970)を参照)抗ウイルス効果のスクリ
−ニングの目的のために特に該当する;(4)ポリマ−
に支持されたアミノ酸の活性エステル(Fridkin
ら、J.Am.Chem.Soc.、1965、87、
4646)を使用した方法であって、”逆Merrif
ield合成法”または”ポリメリック試薬合成法”と
も称される方法には、中間物の単離および精製ができる
という利点があり、従って、中間の大きさの任意に保護
されたPNA分子で、後刻引き続いてフラグメント縮合
してより大きいサイズのPNA分子に変換することが出
来るPNA bunsiを合成するための特に適した方
法を提供し得るものである;(5)PNA分子をたとえ
ばプロテア−ゼまたは新規な特異性を有するその誘導体
(たとえばタンパク質工学などの人工的手段によって得
られる)を用いて酵素的に構築することが見込まれる。
また、数多くのPNAフラグメントを縮合して極めて大
きなPNA分子に変えるための”PNAリガ−ゼ”を開
発することも見込むことが出来る;(6)抗体は、興味
の対象とする実質的に如何なる分子としても生成させる
ことが出来るので、Lerner(Tramantan
oら、Science、1986、234、1566)
とSchultz(Pollackら、Scienc
e、1986、234、1570))のグル−プによっ
て同時に発見された、最近開発された接触抗体(abz
ymes)も、PNA分子を構築するための潜在的な候
補として考慮されるべきであろう。すなわち、アシル−
トランスファ−反応を接触・触媒するabzymesを
産生させるのに顕著な成功が成されている(たとえば、
Shokatら、Nature、1989、338、2
69およびそれに引用されている文献を参照).sai
goni、対細菌Stewartのグル−プ(Han
ら、Science、1990、248、1544)に
よって開拓された完全に人工的な酵素を、PNA合成に
適するように開発することも出来るであろう。
接触抗体など、特異的なカップリング反応を仲介するこ
とが可能なものの設計は、”通常の”ペプチド合成より
もPNA合成のための方がより容易に実施されるはずで
ある。その理由は、PNA分子は、ペプチドを構成する
二十個の天然の(タンパク質生成性−proteino
genic−)アミノ酸と比較して、僅か四つの異なる
アミノ酸(四つの天然の塩基のそれぞれの一つに対応す
るもの)から構成されている場合が多いからである。結
論として、特異的なPNA分子を合成するためには単一
の戦略では如何なるものも適合することはなく、従って
時にはいくつかの方法の組合せが最善に機能することが
あり得るであろう。
示した一般的スキ−ムによって合成される。この合成
は、実施例21−23において記載した保護/脱保護方
法を用いて(Bocアミノエチル)グリシンのメチルま
たはエチルエステルの何れかの製造を包含して成る。チ
ミンモノマ−の合成は、実施例24−25において記載
されており、また保護されたシトシンモノマ−の合成は
実施例26において記載されている。
4図)は、臭化酢酸エチルによるアルキル化(実施例2
7)およびX線結晶学を用いた置換位置の確認−所望と
する9位−を包含して成るものであった。次いでN6−
アミノ基をN−エチル−ベンジルオキシカルボニルイミ
ダゾ−ル テトラフルオロ硼酸エステル試薬を用いてベ
ンジルオキシカルボニル基で保護した(実施例28)。
このエステル生成物を単に加水分解すると、N6−ベン
ジルオキシカルボニル−9−カルボキシメチルアデニン
が得られ、これを次ぎに標準方法に用いた(実施例10
−11、第8図)。このアデニンモノマ−を構築して、
二つの異なるPNA−オリゴマ−とした(実施例30お
よび31)。
図において概略を示してある。この出発物質である2−
アミノ−6−クロロプリンを臭化酢酸でアルキル化し
(実施例32)、次いでこの塩素原子をベンジルオキシ
基で置換した(実施例36)。得られた酸を試薬PyB
roptmを用いて(Bocアミノエチル)グリシンメ
チルエステル(実施例36)とカップリングさせ、次い
で得られれたエステルを加水分解した(実施例23)。
このO6−ベンジル基をPNA−オリゴマ−の合成にお
いて最終のHF−開裂工程で除去した。開裂は、縮合剤
としてジイソプロピルカルボジイミドを用いてPNA−
オリゴマ−に組み込んだ場合、最終のPNA−オリゴマ
−の予期した量を測定することによって確認した(実施
例52)。以下に記載する略記号を実験実施例において
使用する:DMF、N、N−ジメチルホルムアミド;D
CC、N、N−ジシクロヘキシルカルボジイミド;DC
U、N、N−ジシクロヘキシル尿素;THF、テトラヒ
ドロフラン;aeg、N−アセチル(2’−アミノエチ
ル)グリシン;pfp、ペンタフルオロフェニル;Bo
c、第三級−ブトキシカルボニル;Z、ベンジルオキシ
カルボニル;NMR、核磁気共鳴;s、一重項;d、二
重項;t、三重項;q、四重項;m、多重項;b、ブロ
−ド;δ、化学シフト。
を内部標準として用いてJEOLFX 90Q 分光計
またはBruker 250MHzで記録した。質量分
光測定は、VG FAB源およびプロ−ブを備えたMa
ssLab VG 12−250四極子装置で行った。
融点は、Buchi融点測定装置で記録し、補正は行わ
なかった。N、N−ジメチルホルムアミドは、4Åモレ
キュラ−シ−ブで乾燥し、蒸留し次いで4Åモレキュラ
−シ−ブ上で保存した。ピリジン(HPLCグレ−ド)
は、4Åモレキュラ−シ−ブ上で乾燥し、保存した。そ
の他の溶媒は、入手可能な最高級品質のものかまたは使
用前に蒸留した。ジオキサンは、使用前に塩基性アルミ
ナを通した。Boc無水物、4−ニトロフェノ−ル、臭
化酢酸メチル、塩化ベンジルオキシカルボニル、ペンタ
フルオロフェノ−ルは全て、Aldrich Chem
ical Companyを介して入手した。チミン、
シトシン、アデニンは全て、Sigma を介して入手
した。
下の溶媒系を用いて行った:(1)クロロホルム:トリ
エチルアミン:メタノ−ル、7:1:2;(2)塩化メ
チレン:メタノ−ル、9:1;(3)クロロホルム:メ
タノ−ル:酢酸 85:10:5。スポットは、UV
(254nm)によってまたは/および120℃におい
て5分間加熱後ニンヒドリン溶液(100mlの1−ブ
タノ−ルおよび30ml酢酸中に3gニンヒドリン)を
噴霧し次いで噴霧後再度加熱することによって可視化さ
せた。
−構成単位を合成し、PNA−オリゴマ−に組み入れる
ことによって証明される。一つの例において、グル−プ
CはCH(CH3)基である。相応するモノマ−の合成
は、第17図において概略を示すが、Boc−保護され
た1−アミノ−2、3−プロパンジオ−ル(実施例3
5)の製造を包含して成り、このものは、過ヨウ素酸塩
で開裂してbocアミノアセトアルデヒドとし、このも
のを直接次の反応に用いる。このbocアミノアセトア
ルデヒドを種々のアミンと縮合させることが出来る;実
施例36において、アラニンエチルエステルを使用し
た。実施例17−19において、相当するチミンモノマ
−類を調製した。このようなモノマ−は、DCC−カッ
プリングプロトコ−ルによって8−量体に組み入れた
(実施例30および31)。
H2)3である。相当するモノマ−の合成は、第18a図
において概略を示し、かつ実施例40および46におい
て記載してある。
H2)2CO基である。チミンおよび保護されたシトシン
モノマ−の合成は、第19図および実施例46から51
にまでにおいて概略を示してある。一つのユニットを包
含するPNA−オリゴマ−を用いたハイブリダイゼ−シ
ョン実験は、実施例61に記載しており、これによれ
ば、親和性が著しく低下しているが特異性は保持されて
いることが示される。
よび4−ニトロフェノ−ル(12.75g;91.6m
ol)をジオキサン(250ml)と混合した。Boc
−無水物(20.0g:91.6mol)をジオキサン
(50ml)tとともにこの混合物に移した。この混合
物を1時間還流し、0℃にまで冷却し、ろ過し、1/3
にまで濃縮し、次いで0℃において水(350ml)に
注いだ。1/2時間攪拌した後、この生成物を濾取し、
水で洗浄し、次いで真空下でsicapent上で乾燥
した。収率、21.3g(97%)。m.p.73.0
−74.5℃(litt.78.5−79.5℃)。元
素分析、C11H13NO5、実験値(理論値) C:5
5.20(55.23) H:5.61(5.48)
N:5.82(5.85)
調製した。N−(2−アミノエチル)グリシン(1、
3.00g;25.4mol)を水(50ml)に溶解
し、ジオキサン(50ml)を加え、次いでpHを2N
水酸化ナトリウムで11.2に調節した。第三級−ブチ
ル−4−ニトロフェノ−ル炭酸エステル(7.29g;
30.5 mmol)をジオキサン(40ml)に溶解
し、2時間かけて滴下したが、この間においてpHは2
N水酸化ナトリウムで11.2に維持した。pHは、3
時間以上定期的に11.2に調節し、次いで溶液を一夜
放置した。溶液を0℃にまで冷却し、pHを注意深く
0.5M塩酸で3.5に調節した。この水溶液を0.5
Mクロロホルム(3 x 200ml)で洗浄し、pH
を2N水酸化ナトリウムで9.5に調節し、この溶液を
真空下で(14mmHg)蒸発乾凅した。残渣をDMF
(25+2x10ml)で抽出し、抽出液をろ過して、
過剰の塩を除去した。こうすることによって、表題化合
物の溶液が収率約60%でかつtlc(溶媒系1、ニン
ヒドリンで可視化した、Rf=0.3)による純度が9
5%以上で得られる。この溶液をこれ以上精製すること
なく以後のBoc−aegの製造に使用した。
単であり、高い収率が得られ、製品中に未反応のチミン
が残留しない。DMF(900ml)中にチミン(3、
40.0g;0.317mol)および炭酸カリウム
(87.7g;0.634mmol)を分散させた分散
液に、臭化酢酸メチルエステル(30.00ml;0.
317mmol)を加えた。この混合物を窒素雰囲気下
で一夜激しく攪拌した。この混合物をろ過し、真空下で
蒸発乾凅した。固形の残渣を水(300ml)および4
N塩酸(12ml)で処理し、0℃において15分間攪
拌し、ろ過し、水(2x75ml)で洗浄した。沈殿物
を水(120ml)および2N水酸化ナトリウム(60
ml)で処理し、10分間沸騰させた。この混合物を0
℃に冷却し、ろ過し、次いで純粋の表題化合物を4N塩
酸(70ml)を添加することによって沈殿させた。s
icapent上で真空下乾燥させた後での収率、3
7.1g(64%)。1H− NMR(90MHz;D
MSO−d6):11.33 ppm(s,1H,N
H);7.49(d,J=0.92Hz,1H,Ar
H);4.38(s,2H,CH 2;1.76(d,J
=0.92Hz,T−CH 3)。
ニル エステル(5) N−1−カルボキシメチルチミン(4、10.0g;5
4.3mmol)およびペンタフルオロフェノ−ル(1
0.0g;54.3mmol)をDMF(100ml)
中に溶解し、氷水で0℃にまで冷却した。DCC(1
3.45g;65.2mmol)を次ぎに添加した。温
度が5℃以下になったとき、氷浴を取り除き、混合物を
常温で3時間攪拌した。沈殿したDCUをろ過して除去
し、DMF(2 x 10ml)で二度洗浄した。濾液
を合わせてエ−テル(1400ml)に注ぎ、0℃にま
で冷却した。石油エ−テル(1400ml)を添加し、
混合物を一夜放置した。表題化合物をろ過して単離し、
石油エ−テルで完全に洗浄した。収率:14.8g(7
8%)。この製品は、次ぎの反応を実施する出来るほど
純粋であったが、分析用サンプルを2−プロパノ−ルか
ら再結晶して得た。m.p.200.5−206℃。元
素分析、C13H7F5N2O4、実験値(理論値)C:4
4.79(44.59) H:2.14(2.01)
N:8.13(8.00)。FAB−MS:443(M
+1+グリセリン)、351(M+1)。 1 H−NMR(90MHz;DMSO−d6):11.
52ppm(s,1H,NH);7.64(s,1H,
ArH);4.99(s,2H,CH 2);1.76
(s,3H,CH 3)。
l;50.8mmol)を加え、次いでN−1−カルボ
キシメチルチミン ペンタフルオロフェニルエステル
(5、4.45g;12.7mmol)を加えた。生じ
た溶液は、1時間攪拌し、0℃に冷却しカチオン交換物
質(”Dowex 50W X−8”、40g)で20
分間処理した。このカチオン交換物質をろ過して除去
し、ジクロロメタン(2 x 15ml)で洗浄し、ジ
クロロメタン(150ml)を加えた。生じた溶液を飽
和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で
乾燥し、真空下で蒸発乾凅したが、先ず水アスピレ−タ
で、次いでオイルポンプで行った。残渣を水(50m
l)で振盪し、蒸発乾凅した。この方法をもう一度繰り
返した。残渣を次いでメタノ−ル(75ml)に溶解
し、エ−テル(600m)と石油エ−テル(1.4L)
に注いだ。一夜攪拌した後で、白色固体をろ過して単離
し、石油エ−テルで洗浄した。真空下でsicapen
t上で乾燥して、3.50g(71.7%)が得られ
た。m.p.142−147℃。元素分析、C16H24N
4O7、実験値(理論値) C:49.59(50.0
0) H:6.43(6.29) N:14.58(1
4.58)。1H−NMR(250MHz,DMSO−
d6)。二級アミド結合の周囲の回転が限定されている
ため、シグナルのいくつかが、2:1の比率で二重化し
た(リストにおいて大きい方はmjでまた小さい方はm
iで示してある)。12.73ppm(b,1H,−C
OOH);11.27ppm(s,mj.,イミド);
11.25ppm(s,mi.,イミド);7.30p
pm(s,mj.,ArH);7.26ppm(s,m
i.,ArH);6.92ppm(unres.t,m
j.,BocNH);6.73ppm(ures.t;
mi.,BocNH)4.64ppm(s,mj.,T
−CH2−CO−);4.47ppm(s,mi.,T
−CH2−CO−);4.19ppm(s,mi.,C
ONRCH 2CO2H);3.97ppm(s,mj.,
CONRCH 2CO2H);3.41−2.89ppm
(ures.m,−CH2CH2−および水);1.75
ppm(s,3H,T−CH3);1.38ppm
(s,9H,t−Bu);13C−NMR:170.68
ppm(CO);170.34(CO);167.47
(CO;167.08(CO);164.29(C
O);150.9(C5”);141.92(C
6”);108.04(C2’);77.95および7
7.68(Thy−CH 2CO);48.96、47.
45および46.70(−CH 2CH 2−およびNCH 2
CO2);37.98(Thy−CH 3);28.07
(t−Bu)。FAB−MS:407(M+Na+);
385(M+H+)。
エステル(7、Boc−Taeg.0Pfp) 1−(Boc−aeg)チミン(6)(2.00g;
5.20mmol)をDMF(5ml)に溶解し、次い
で塩化メチレン(15ml)を加えた。ペンタフルオロ
フェノ−ル(1.05g;5,72mmol)を炭化
し、溶液を氷浴中で0℃にまで冷却した。次いでDDC
を加え(1.29g;6.24mmol)、次いで2分
後に氷浴を取りはずした。常温で攪拌しつつ3時間経過
後、沈殿したDCUをろ過して除去し、塩化メチレンで
洗浄した。濾液を合わせて、重炭酸ナトリウム溶液で二
度洗浄しまた飽和塩化ナトリウム溶液で一度洗浄し、硫
酸マグネシウムで乾燥し、真空化で蒸発乾凅した。固体
の残渣をジオキサン(150ml)に溶解し、0℃で水
(200m)に注いだ。表題化合物をろ過して単離し、
水で洗浄し真空化でsicapent上で乾燥した。収
率:2.20g(77%)。分析用試料を2−プロパノ
−ルから再結晶化して得た。m.p.174−175.
5℃。元素分析、C22H23N4O7F5、実験値(理論
値) C:48.22(50.00) H:4.64
(4.21) N:9.67(10.18)。 1 H−NMR(250MHz、CDCl3):二級アミド
結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのい
くつかが、6:1の比率で二重化した(リストにおいて
大きい方はmjでまた小さい方はmiで示してある)。
7.01ppm(s,mi.,ArH);6.99pp
m(s,mj.,ArH);5.27ppm(unre
s.t,BocNH);4.67ppm(s,mj.,
T−CH2−CO−);4.60ppm(s,mi.,
T−CH2−CO−);4.45(s,mj.,CON
RCH 2CO2Pfp);4.42ppm(s,mi.,
CONRCH 2CO2Pfp);3.64ppm(t,2
H,BocNHCH2CH 2−);3.87ppm(”
q”,2H,BocNHCH 2CH2−);1.44
(s,9H,t−Bu)。FAB−MS:551(1
0;M+1);495(10;M+1−tBu);45
1(80;−Boc).
2ml;0.36mol)を、乾燥ピリジン(1000
ml)にシトシン(8、20.0g;0.18mol)
を分散させた分散液に0℃において、オ−ブンで乾燥さ
せた装置の中で窒素雰囲気中にて滴下した。この溶液を
一夜攪拌し、その後このピリジン分散液を真空下で蒸発
乾凅させた。水(200ml)と4N塩酸を添加して、
pH〜1にした。生じた白色沈殿をろ過して除き、水で
洗浄し、空気をサクションして部分的に乾燥した。まだ
湿潤している沈殿を無水アルコ−ル(500ml)と一
緒に10分間沸騰させ、0℃にまで冷却し、ろ過し、エ
−テルデで 完全に洗浄し、真空下で乾燥した。収率、
24.7g(54%)。m.p.>250℃。元素分
析、C14H11N3O3、実験値(理論値) C:58.5
9(58.77) H:4.55(4.52) N:1
7.17(17.13)。NMRスペクトルは、本製品
を溶解出来なかったため一切記録しなかった。
チルシトシン(10) メカニカル攪拌装置と窒素封入装置を備えた三口丸底フ
ラスコに臭化酢酸メチルエステル(7.82ml;8
2.6mmol)およびN4−ベンジルオキシカルボニ
ルシトシン(9、21.0g;82.6mmol)と炭
酸カリウム(11.4g;82.6mmol)を乾燥D
MF(900ml)中に分散させた分散液を入れた。こ
の混合物を一夜激しく攪拌し、ろ過し、真空下で蒸発乾
凅した。水(300ml)と4N塩酸(10ml)とを
加え、混合物を0℃で15分間攪拌し、ろ過し、水(2
x 75ml)で洗浄した。単離した沈殿を水(12
0ml)、2N水酸化ナトリウム(60ml)処理し、
30分間攪拌し、ろ過し、0℃に冷却し4N塩酸(35
ml)を加えた。表題化合物をろ過して単離し、よく水
で洗浄し、メタノ−ル(1000ml)から再結晶し、
よくエ−テルで洗浄した。こうして、7.70g(31
%)の純品を得た。再結晶母液を200mlの容積にま
で濃縮し、0℃に冷却した。こうすることによって、さ
らに2.30gの物質を得たが、このものは、tlcで
純品でありことが判り、淡赤色を呈していた。m.p.
266−274℃。元素分析、C14H13N3O5、実験値
(理論値) C:55.41(55.45) H:4.
23(4.532) N:14.04(13.86)。
1H− NMR(90MHz;DMSO−d6):
8.02ppm(d,J=7.32Hz,1H,H−
6);7.39(s,5H,Ph);7.01(d,J
=7.32Hz,1H,H−5);5.19(s,2
H,PhCH 2−);4.52(s,2H)。
チルシトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル(1
1) N4−ベンジルオキシカルボニル−N−カルボキシメチ
ルシトシン(10、4.00g;13.2mmol)お
よびペンタフルオロフェノ−ル(2.67g;14.5
mmol)をDMF(70m)と混合し、氷浴で0℃に
まで冷却し、DCC(3.27g;15.8mmol)
を添加した。この氷浴を3分後に取りはずし、混合物を
室温で3時間攪拌した。沈殿したDCUをろ過して除去
し、DMFで洗浄し、次いで濾液を真空下で(0.2m
mHg)蒸発乾凅した。固体の残渣を塩化メチレン(2
50ml)で処理し、15分間激しく攪拌し、溶かし、
希重炭酸ナトリウム溶液で二度また飽和塩化ナトリウム
液で一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で
蒸発乾凅した。固体の残渣を2−プロパノ−ル(150
ml)で再結晶し、結晶をよくエ−テルで洗浄した。収
率、3.40g(55%)。m.p.241−245
℃。元素分析、C20H12N3F5O5、実験値(理論値)
C:51.56(51.18) H:2.77(2.
58) N:9.24(8.95)。 1H− N
MR(90MHz;CDCl3):7.66ppm
(d,J=7.63Hz,1H,H−6);7.37
(s,5H,Ph);7.31(d,J=7.63H
z,1H,H−5);5.21(s,2H,PhCH 2
−);4.97(s,2H,NCH 2)。FAB−M
S:470(M+1)。
−シトシン(12) 上記において調製した(N−Boc−2−アミノエチ
ル)グリシン(2)をDMF に溶かした溶液に、トリ
エチルアミン(7.00ml;50.8mmol)およ
びN4−ベンジルオキシカルボニル−N1−カルボキシ
メチルシトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル(1
1、2,70g;5,75mmol))を加えた。この
溶液を室温で1時間攪拌した後、塩化メチレン(150
ml)、飽和塩化ナトリウム液(250ml)、および
pH〜1までの4N塩酸を加えた。有機層を分離し、飽
和塩化ナトリウム液で二度洗浄し、硫酸マグネシウムで
乾燥し、真空下で蒸発乾凅したが、先ず最初は水アスピ
レ−タ−、次ぎにオイルポンプを用いて蒸発乾凅した。
油状の残渣を水(25ml)で処理し、再度、真空下で
蒸発乾凅した。この方法を繰り返した。油状残渣(2.
80g)を次ぎに塩化メチレン(100ml)に溶解
し、石油エ−テル(250ml)を加え、この混合物を
一夜攪拌した。表題化合物をろ過して単離し、石油エ−
テルで洗浄した。Tlc(溶媒系1)の結果、実際量の
ペンタフルオロフェノ−ルが存在することが判ったが、
これを除去しようとする試みは行わなかった。収率:
1,72g(59%)。1H−NMR(250MHz、
CDCl3)。二級アミド結合の周囲の回転が限定され
ているため、シグナルのいくつかが、2:1の比率で二
重化した(リストにおいて大きい方はmjでまた小さい
方はmiで示してある)。7.88ppm(dd,1
H,H−6);7.39(m,5H,Ph);7.00
(dd,1H,H−5);6.92(b,1H,Boc
NH);6.74(b,1H,ZNH)−?;5.19
(s,2H,Ph−CH 3);4.81ppm(s,m
j.,Cyt−CH2−CO−);4.62ppm
(s,mi.,Cyt−CH−CO=);4.23
(s,mi.,CONRCH 2CO2H);3.98pp
m(s,mj.,CONRCH 2CO2H);3.42−
3.02(unres.m,−CH2CH2−および
水);1.37(s,9H,tBu)。FAB−MS:
504(M+1);448(M+1−tBu)。
−シトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル(13) N4−ベンジルオキシカルボニル−1−Boc−aeg
−シトシン(12、1.50g;2.98mmol))
およびペンタフルオロフェノ−ル(548mg;2.9
8mmol)をDMF(10m)に溶解し、塩化メチレ
ン(10ml)を添加し、反応混合物を氷浴中で0℃に
まで冷却し、DDC(676mg;3.28mmol)
を添加した。この氷浴を3分後に取り除き、混合物を常
温で3時間攪拌した。沈殿をろ過して単離し、塩化メチ
レンで一度洗浄した。この沈殿を、沸騰ジオキサン(1
50ml)に溶解し、生じた溶液を15℃にまで冷却し
たが、この際DCUが沈殿した。このDCUをろ過して
除去し、生じた濾液を0℃において水(250ml)に
注いだ。表題化合物をろ過して単離し、水で洗浄し真空
下においてsicapent上で乾燥した。収率:1.
30g(65%)。元素分析、C29H28N5O8F5、実
験値(理論値) C:52.63(52.02) H:
4.41(4.22) N:10.55(10.4
6)。1H−NMR(250MHz,DMSO−d6):
本質的の上記酸のスペクトルを示したが、該エステルが
加水分解したことに起因するのが最も可能性が高い。F
AB−MS:670(M+1);614(M+1−tB
u).
ol)、塩化チオニル(25ml)および4滴のDMF
を、固体の物質が全て溶解するまで窒素を流しながら緩
やかに加熱した。次いでこの溶液を40分間還流し、過
剰の塩化チオニルを真空下で除去した。塩化チオニルの
最後の痕跡量を乾燥ベンゼン(Na−Pbで乾燥)と一
緒に二度蒸発させて除去した。残留する黄色の粉末を直
接次ぎの反応にそまま用いた。
ル)−9−クロロアクリジン 6−アミノヘキサノン酸メチル塩酸塩(4.70g;2
5.9mmol)を塩化メチレン(90ml)に溶解
し、0℃にまで冷却し、トリエチルアミン(15ml)
を加え、生じた溶液を直ちに酸の塩化物に上から加え
た。この酸塩化物を入れた丸底のフラスコを氷浴中で0
℃にまで冷却した。この混合物を0℃で30分間また室
温で3時間激しく攪拌し、この混合物をろ過して残留す
る固形物除去したが、この固形物を塩化メチレン(20
ml)で洗浄した。この赤−茶色の塩化メチレンろ液を
飽和重炭酸ナトリウムで二度洗浄しまた飽和塩化ナトリ
ウムで一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下
で蒸発乾凅した。得られた油状の物質に、乾燥ベンゼン
(35ml)およびリグロイン(60−80℃、Na−
Pbで乾燥)を加えた。この混合物を還流するまで加熱
した。活性炭およびセライトを加えて、この混合物を3
分間還流した。ろ過した後で、表題化合物は、磁気攪拌
下で冷却すると結晶化した。この藻をろ過して単離し、
石油エ−テルで洗浄した。本品は、固形の水酸化カリウ
ム上で保存した。収率:5.0g(50%)。
ニル)−9−[6’−(4”−ニトロベンズアミド)ヘ
キシルアミノ]−アミノアクリジン 4−(5−メトキシカルボニルペンチルアミドカルボニ
ル)−9−クロロアクリジン(1.30g;3.38m
mol)およびフェノ−ル(5g)を、窒素気流下で3
0分間で80℃にまで加熱し、その後6−(4’−ニト
ロベンズアミド)−1−ヘキシルアミン(897mg;
3,38mmol)を加えた。温度は2時間で120℃
まで上昇した。反応混合物を冷却し、塩化メチレン(8
0ml)を加えた。生じた溶液は2N水酸化ナトリウム
(60ml)で三度また水で一度洗浄し、硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅した。得た赤色オイル
(1.8g)を塩化メチレン(40ml)に溶解し、0
℃にまで冷却した。エ−テル(120ml)を加え、出
た溶液を一夜攪拌した。こうすることによって、固形物
質とオイルの混合物が得られた。この固形ブツヲろ過し
て単離した。固形物とオイルとを塩化メチレン(80m
l)に再度溶解し、冷エ−テル(150ml)に滴下し
た。20分間攪拌したあと、表題化合物をろ過してオレ
ンジ色の結晶として単離した。本品をエ−テル出洗浄
し、水酸化カリウム上で真空にて乾燥した。収率:1.
60g(77%)。m.p.145−147℃。
9−[6’−(4”−ニトロベンズアミド)ヘキシルア
ミノ]−アミノアクリジン 4−(5−メトキシカルボニルペンチル)アミドカルボ
ニル)−9−[6’−(4”−ニトロベンズアミド)ヘ
キシルアミノ]−アミノアクリジン(503mg;0.
82mmol)をDMF(30ml)に溶解し、2N水
酸化ナトリウム(30ml)を添加した。15分間攪拌
した後、2N塩酸(35ml)および水(50ml)を
0℃で加えた。30分間攪拌したあとで、溶液をデカン
トしたところ、オイル状の物質が得られ、これを沸騰メ
タノ−ル(150ml)に溶解し、ろ過し、 1/3の
容積にまで濃縮した。このメタノ−ル溶液に、エ−テル
(125ml)およびエタノ−ルに溶かした塩酸5−6
滴を加えた。この溶液を0℃において1時間攪拌した後
でデカントした。オイル状の物質を再びメタノ−ル(2
5ml)に溶解し、エ−テル(150ml)で沈殿させ
た。一夜攪拌した後で表題化合物が黄色結晶として単離
された。収率:417mg(80%)。m.p.173
℃(分解)。
ニルペンチル)アミドカルボニル)−9−[6’−
(4”−ニトロベンズアミド)ヘキシルアミノ]−アミ
ノアクリジン(Acr1Opfp) 上記の酸(300mg;0.,480mmol)をDM
F(2ml)と塩化メチレン(8ml)に溶解し、ペン
タフルオロフェノ−ル(97mg;0.53mmol)
を2 x 2mlの塩化メチレンと共に移して添加し
た。生じた溶液を0℃まで冷却し、この後DCC(12
4mg;0.60mmol)を加えた。氷浴を5分後に
取り除き、混合物を一夜攪拌しつつ放置した。沈殿した
DCUを遠心分離して除去し、遠心分離液を真空下で蒸
発乾凅したが、先ず水アスピレ−タで次いでオイルポン
プで蒸発乾凅した。残渣を塩化メチレン(20ml)中
に溶解し、ろ過し、真空にて蒸発乾凅した。残渣を再び
塩化メチレンと石油エ−テル(150ml)に溶解し
た。エ−テル中の5N塩酸1mlを添加し、0℃で30
分間攪拌した後、溶媒をデカンテ−ションで除去した。
残留するオイル状物質を塩化メチレン(100ml)に
溶解し、石油エ−テルを加え、混合物を一夜攪拌しつつ
放置した。翌日、黄色の沈殿結晶物をろ過して単離し、
大量の石油エ−テルで洗浄した。収率:300mg(7
8%)、乾燥後。m.p.97,5℃(分解)。全ての
試料は、帰属するべき元素分析結果、1H−および13C
−NMRおよび質量スペクトルを示した。
参照。 材料:Boc−Lys(ClZ)、ベンゾヒドリルアミ
ン−コポリ(スチレン−1%−ジビニルベンゼン)樹脂
(BHA樹脂)およびp−メチルベンゾヒドリルアミン
−コポリ(スチレン−1%−ジビニルベンゼン)樹脂
(MBHA樹脂)をPneinsula Labora
toriesから購入した。その他の試薬および溶媒
は、それぞれ以下から購入した:即ち、Biograd
eのトリフルオロ酢酸は、Halocarbon Pr
oducts社から;ジイソプロピルエチルアミン(9
9%;これ以上蒸留しなかった)およびN−アセチルイ
ミダゾ−ル(98%)は、Aldrich社から;H2
Oは、二度蒸留した;無水HFは、Union Car
bide社から;合成グレ−ドのN、N−ジメチルホル
ムアミドおよび分析グレ−ドの塩化メチレン(これ以上
蒸留しなかった)は、Merck社から;HPLCグレ
−ドのアセトニトリルは、Lab−Scan社から;p
urumグレ−ドのアニソ−ル、N、N−ジシクロヘキ
シルカルボジイミドおよびpuriss.グレ−ドの
2、2、2−トリフルオロエタノ−ルは、Fluka社
から購入した。
は、”一時的な”N−保護のためにTFA−反応活性な
第三級−ブチルオキシカルボニル(Boc)基を用い
(Merrifield、J.Am.Chem.Sc
o,、1964、86、304)また”永久的な”側鎖
保護のためにもっと酸に安定なベンジルオキシカルボニ
ル(Z)および2−クロロベンジルオキシカルボニル
(ClZ)を用いて段階的固相方法(Merrifie
ld、J.Am.Chem.Soc.、1963、8
5、2149)によって合成した。C−末端アミドを得
るために、PNA類は、HF−反応活性なBHAまたは
MBHA樹脂(このMBHA樹脂は、未置換BHA樹脂
を基準として最終HF開裂を受け易い(Matsued
aら、Peptides、1981、2、45))の上
において構築した。全ての反応は(HF反応を除い
て)、粗いガラスフリットを備えた、手動操作する標準
固相反応容器において行った(Merrifield
ら、Biochemistry、1982、21、50
20)。元来”通常の”アミノ酸を包含するペプチドの
ためにMerrifieldおよびその共同研究者(S
arinら、Anal.Biochem.、1981、
117、147)によって開発された定量的なニンヒド
リン反応が、全ての樹脂に対して”通常”用いられてき
た有効吸光係数ε=15000M-1cm-1を用いると、
うまく適用され、個別のカップリングの完結度ならびに
成長するペプチド鎖の数を測定出来た。カップリング時
の残留基nの理論的置換度Sn−1は(合成サイクルの
過程において脱保護とカップリングが完璧でありかつP
NAの鎖終了もその逸失も一切ないことを前提とす
る)、以下の式から算定される:
1 xΔMW x 10-3 mmol/mol))-1
大分([ΔMW]=g/mol)であり、またSn−1
は、先行する残留基n−1のカップリング時の理論的置
換度である([S]=mmol/g)。個別のカップリ
ングの程度の推定値(%)は、測定した置換度を基準と
して算出され(Sが決定されない限り)かつ先立つサイ
クルのあとの残留する遊離アミノ酸基の数について補正
はしていない。HF反応は、Toho Kasei(O
saka、Japan)製のDiaflonHF装置で
実施した。Vydac C18(5ミクロン、0.46
x 25cmおよび5ミクロン。1 x 25cm)
逆相カラムは、それぞれSP8000計器において分析
用および半−合成用HPLCに用いた。緩衝液液Aは、
1リットル当たり445マイクロリットルのトリフルオ
ロ酢酸を含む60容量%のアセトニトリル/水溶液であ
り、また緩衝液Bは、1リットル当たり390マイクロ
リットルのトリフルオロ酢酸を含む60容量%のアセト
ニトリル/水溶液である。直線勾配は、30分で0−1
00%の緩衝液Bで、流速は1.2ml/分(分析用)
と5ml/分(半製造用)であった。溶出液は215n
m(分析用)と230nm(半製造用)においてモニタ
−した。PNA類の分子量は、最も多い同位元素の平均
値から252Cfプラズマ脱着の飛行時間質量分光測定法
によって決定した。
体の固相合成 (a)Boc−[Taeg]15−BHA樹脂の段階的合
成 この合成は、事前膨潤させ、中和したBHA樹脂100
mgの上で(定量的ニンヒドリン反応によって0.57
mmol/NH2/g含有する旨決定された)、3.2
等量のBocTaeg−OPfpをほぼ33%のDMF
/CH2Cl2中で用いて開始した。個別のカップリン
グ反応は、手動操作する、6mlの標準固相反応容器内
で少なくとも12時間振盪することによって実施し、未
反応のアミノ基は、合成の選択された段階でアセチル化
することによってブロックした。鎖延長の過程は、定量
的ニンヒドリン反応によっていくつかの段階でモニタ−
した(第I表を参照)。保護されたBoc−[Tae
g]5−BHA、Boc−[Taeg]10−BHAおよ
びBoc−[Taeg]15−BHAの一部を、それぞれ
5、10および15の残基を構築した後で取り出した。
樹脂の合成 残留Boc−[Taeg]15−BHA樹脂(推定乾燥重
量はほぼ30mg;0.002mmol成長鎖)の脱保
護を行ったあと、3mlの固相反応容器において、H−
[Taeg]15−BHA樹脂を66%ほぼDMF/CH
2Cl21ml中ほぼ50当量(80mg;0.11mm
ol)のAcr1−OPfp(即ち、ペンタフルオロフ
ェノ−ル0.11M溶液)に反応させた。定量的ニンヒ
ドリン反応によって判定されたように、アクリジン部の
カップリングはほぼ定量的に近似していた。
裂、精製および同定 保護されたBoc−[Taeg]5−BHA樹脂の一部
を、塩化メチレン中50%のトリフルオロ酢酸と反応さ
せて、HF開裂に先だってN−末端Boc(これは、潜
在的に有害な三級−ブチルの前駆体である)を除去し
た。中和しかつ洗浄し(”合成実験記録”工程2−4の
方法と同様の方法で)次いで真空で2時間乾燥した後、
生じた67.1mg(乾燥重量)のH−[Taeg]15
−BHA樹脂を0℃において60分間攪拌しつつ5ml
のHF:アニソ−ルで開裂させた。HFを除去した後、
残渣を乾燥ジエチルエ−テル(4 x 15ml、それ
ぞれ15分間)とともに攪拌して、アニソ−ルを除去
し、フリット処理したガラス漏とで重力ろ過し、乾燥さ
せた。PNAを次ぎに60ml(4 x 15ml、そ
れぞれ15分間攪拌)の酢酸水溶液に抽出した。この溶
液のいくつかのアリコ−トを分析用逆相HPLCによっ
て分析して、この粗製PNAの純度を測定した。13.
0分における主ピ−クは、前吸光率のほぼ93%を占め
ていた。残りの溶液は、凍らせ、次いで凍結乾燥する
と、粗製物がほぼ22.9mgが得られた。最後に、1
9.0mgのこの粗製物をそれぞれ1mlの水に3.8
mgを含む五つのバッチから精製した。この主ピ−ク
は、半合成用逆相カラムを用いて集めた。アセトニトリ
ルをスピ−ドvacで除き、残留溶液を凍結し(ドライ
アイス)、その後凍結乾燥させると、99%以上の純度
のH−[Taeg]5−NH2が13.1mg得られた。
このPNA分子は、直ちに水に溶解し、質量分光分析に
よる測定に基づいて正確な分子量を有していた。(M+
H)+について、計算したm/z値は1349.3であ
りまた測定したm/z値は1347.8であった。
裂、精製および同定 保護したBoc−[Taeg]10−BHAの一部を上記
(c)項において記載したように処理し、18.9mg
の乾燥H−[Taeg]10−BHA樹脂をHF開裂する
と11.0mgの粗製物が得られた。15.5分におけ
る主ピ−クは、全吸光度のほぼ53%を占めていた。ほ
ぼ1mgのこの粗製物を繰り返して(下記する理由によ
って)、少なくとも80%の、恐らくは99%以上の純
度のH−[Taeg]10−NH2がほぼ1mg得られ
た。標的ピ−クの後で溶出しかつ全吸光度のほぼ20%
を占めるもう少しブロ−ドのテイル部は、繰り返し精製
しても除去出来なかった(若干減少しただけ)。質量ス
ペクトルは正確な分子量のH−[Taeg]10−NH2
の存在を確認するものであったが、そのスペクトルから
判定して、このようなテイル現象は、多少とも充分に定
義された、いくつかの凝集/配座状態にある標的分子に
よるものである。従って、この粗製物は、標的分子を上
記した53%以上は含有している可能性がある。H−
[Taeg]10−NH2は、水に容易に溶解する。(M
+H)+については、計算m/z値は2679.6であ
りかつ測定m/z値は2681.5であった。
裂、精製および同定 保護したBoc−[Taeg]10−BHA樹脂の一部を
(c)項において記載したと同様に処理して、13.9
mgの乾燥Boc−[Taeg]15−BHA樹脂をHF
開裂して3.2mgの粗製物を得た。22.6分におけ
る主ピ−クは、ブロ−ドな膨れ部に位置し、全吸光度の
ほぼ60%を占めていた(第12a図)。再び(前項を
参照)、この膨れ部は、質量スペクトルによってこの集
積した”膨れ部”を分析したところ、他の分子の存在が
ないことが判ったので、いくつかの凝集/配座状態の標
的分子H−[Taeg]15−NH2によるものである。
この粗製物を全て”膨れ部”を集めて精製したところ、
ほぼ2.8mgの物質を得た。(M+H)+について
は、計算m/z値は4033.9でありかつ測定m/z
値は4032.9であった。
開裂、精製および同定 保護されたAcr1−[Taeg]15−BHA樹脂の一
部を(b)項において記載したように処理して29.7
mgの乾燥Acr1−[Taeg]15−BHA樹脂をH
F開裂して14.3mgの粗製物を得た。全て合わせる
と、23.7に分における主ピ−クおよび29.2分に
おける”ダイマ−”(下記を参照)は、全吸光度のほぼ
40%を占めていた(第12b図)。この粗製物を繰り
返し精製して、恐らくは99%以上の純度のAcr1−
[Taeg]15−NH2 −27.4分、29.2分お
よび最後に100%緩衝液Bで溶出する大きく、ブロ−
ドな膨れ部として溶出する自己凝集分子で”汚染され
た”−がほぼ1mg得られた(第12c図)。このよう
な解釈は、これらのピ−クが酢酸水溶液中において放置
すると(数時間)成長し、最後に定量的に下降するとい
う観察結果と一致する。(M+H)+については、計算
m/z値は4593.6でありかつ測定m/z値は45
88.7であった。
oc−脱保護、3ml、3x1分および1x30分;
(2)CH2Cl2による洗浄、3ml、6x1分;
(3)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)によ
る中和、3ml、3x2分;(4)CH2Cl2による洗
浄、3ml、6x1分、および1分間のドレ−ン;
(5)2−5mgのPNA−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定
する;(6)1mlのCH2Cl2に溶解した3.2当量
の(0.18mmol;100mg)BocTaeg−
OPfpを添加し、次いで0.5mlのDMF(最終の
ペンタフルオロフェノ−ル濃度^0.12M))を添加
する;(7)DMFによる洗浄、3ml、1x2分;
(8)CH 2Cl2による洗浄、3ml、4x1分;
(9)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)によ
る中和、3ml、2x2分;(10)CH2Cl2による
洗浄、3ml、6x1分;(11)2−5mgの保護P
NA樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に
供し、さらに2−5mgをよく乾燥してニンヒドリン定
量分析に供して、カップリング度を測定する(サイクル
7、10および15の後で、未反応アミノ基を塩化メチ
レン中でN−アセチルイミダゾ−ルによるアセチル化を
行いブロックした)。
導体の固相合成
(CIZ)−BHA樹脂の段階的構築 この合成は、Boc−Lys(CIZ)を予め膨潤さ
せ、中和したBHA樹脂(0.57mmolNH2/
g)100mgに定量的にロ−ディング(純CH2Cl
2中での標準的DCCによるin−situカップリン
グ)することによって開始した。この保護したPNA樹
脂鎖をさらに延長するために、ほぼ33%DMF/CH
2Cl2中3.2当量のBocTaeg−OPfpを用い
て、サイクル1から5までおよび10から15までにつ
いて単一カップリング(”合成実験記録2”)を用い
た。サイクル5から10までは、ほぼ33%SMF/C
H2Cl2中遊離の酸BocTaeg−OHをまた別のス
トレ−トDCC(即ち、in situ)カップリング
させる方法を用いた。全てのアカップリング反応を手動
操作式の6ml標準固相反応容器中において少なくとも
12時間振盪することによって実施した。未反応のアミ
ノ基を、実施例17において行ったと同様に、この合成
の同じ段階においてアエチル化することによってブロッ
クした。保護したBoc−[Taeg]5−Lys(C
IZ)−BHA樹脂およびBoc−[Taeg]10−L
ys(CIZ)−BHA樹脂を一部ずつ、5および10
PNA残基を組み立てた後で取り出した。Boc−[T
aeg]10−Lys(CIZ)−BHA樹脂の分析用H
PLCクロマトグラムから判定して((e)項を参
照)、PNA残基5から10までにさらに”遊離酸”カ
ップリングさせても、実施例17における完全単一カッ
プリングした残基と比較して、合成収率は改善されるこ
とはなかった。
(CIZ)−BHA樹脂の合成 Boc−[Taeg]10−Lys(CIZ)−BHA樹
脂の一部を脱保護した後で(推定乾燥重量はほぼ90m
g;^0.01mmolの成長鎖)、このH−[Tae
g]15−BHA樹脂に3mlの固相反応容器のおいてほ
ぼ66%DMF/CH2Cl2中ほぼ20当量の(141
mg;0.19mmol)のAcr1−OPfpを反応
させた。定量的ニンヒドリン反応から判定して、アクリ
ジン部のカップリングは、定量的に近かった。
(CIZ)−BHA樹脂の合成 残留Boc−[Taeg]15−Lys(CIZ)−BH
A樹脂(推定乾燥重量はほぼ70mg;0.005mm
ol成長鎖)を脱保護したあとで、このH−[Tae
g]15−Lys(CIZ)−BHA樹脂に3mlの固相
反応容器のおいてほぼ66%DMF/CH2Cl2中ほぼ
25当量の(91mg;0.12mmol)のAcr1
−OPfpを反応させた。定量的ニンヒドリン反応から
判定して、アクリジン部のカップリングは、定量的に近
かった。
精製および同定 保護したBoc−[Taeg]5−Lys(CIZ)−
BHA樹脂の一部を実施例17cにおいて記載したよう
に処理し、19.0mgの乾燥H−[Taeg]5−L
ys(CIZ)−BHA樹脂をHF開裂すると8.9m
gの粗製物が得られた。12.2分における主ピ−クは
(10%酢酸溶液の代わりに水溶液から注入すると1
4.2分において溶出)、全吸光度のほぼ90%を占め
ていた。ほぼ2.2mgの粗製物を精製すると、99%
純度のH−[Taeg]5−Lys−NH2がほぼ1.
5mg得られた。
2の開裂、精製および同定 保護したBoc−[Taeg]10−Lys(CIZ)−
BHA樹脂の一部を実施例17cにおいて記載したよう
に処理し、7.0mgの乾燥H−[Taeg] 10−Ly
s(CIZ)−BHA樹脂をHF開裂すると1.7mg
の粗製物が得られた。15.1分における主ピ−クは
(10%酢酸溶液の代わりに水溶液から注入すると1
7.0分において溶出)、全吸光度のほぼ50%を占め
ていた。ほぼ1.2mgの粗製物を精製すると、95%
以上の純度のH−[Taeg]10−Lys−NH2がほ
ぼ0.2mg得られた。(M+H)+については、計算
m/z値は2807.8でありかつ測定m/z値は28
08.2であった。
−NH2の開裂、精製および同定 保護したBoc−[Taeg]10−Lys(CIZ)−
BHA樹脂の99.1mg(乾燥重量)を実施例17c
において記載したように処理し、42.2mgの粗製物
を得た。25.3分における主ピ−クは(10%酢酸溶
液の代わりに水溶液から注入する23.5分において溶
出)、全吸光度のほぼ45%を占めていた。8.87m
gの粗製物を精製すると、97%以上の純度のH−[T
aeg] 10−Lys−NH2がほぼ5.3mg得られ
た。(M+H)+については、計算m/z値は285
0.8でありかつ測定m/z値は2849.8であっ
た。
−NH2の開裂、精製および同定 保護したAcr1−[Taeg]10−Lys(CIZ)
−BHA樹脂の78.7mg(乾燥重量)を実施例1
(c)項において記載したように開裂させ、34.8m
gの粗製物を得た。23.5分における主ピ−ク(10
%酢酸溶液の代わりに水溶液から注入しても同じ溶出時
刻において溶出)および28.2分における”ダイマ
−”は、全吸光度のほぼ35%を占めていた。ほぼ4.
5mgの粗製物を精製すると、95%以上の純度のH−
[Taeg]10−Lys−NH2がほぼ1.6mg得ら
れた。この化合物は、”ダイマ−”ピ−クを無くすこと
は出来ず、酢酸水溶液中に放置すると増大した。
oc−脱保護、3ml、3x1分および1x30分;
(2)CH2Cl2による洗浄、3ml、6x1分;
(3)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)によ
る中和、3ml、3x2分;(4)CH2Cl2による洗
浄、3ml、6x1分、および1分間のドレ−ン;
(5)2−5mgのPNA−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供する;(6)サイ
クル1から5までおよびサイクる10から15までに就
いては、カップリング反応は、1mlのCH2Cl2に溶
解した3.2当量の(0.18mmol;100mg)
BocTaeg−OPfpを添加し、次いで0.5ml
のDMF(最終のペンタフルオロフェノ−ル濃度^0.
12M))を添加することによって実施した;このカッ
プリング反応は、振盪しつつ全体として12−24時間
進行させた;サイクル5から10までは、1.5mlの
DMF/CH2Cl2(1:2、v/v)中で0.12M
BocTaeg−OHをさらに0.12MDCCでカッ
プリングさせた;(7)DMFによる洗浄、3ml、1
x2分;(8)CH2Cl2による洗浄、3ml、4x1
分;(9)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)
による中和、3ml、2x2分;(10)CH2Cl2
による洗浄、3ml、6x1分;(11)2−5mgの
保護PNA樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量
試験に供し、さらに2−5mgをよく乾燥してニンヒド
リン定量分析に供してる(サイクル7、10および15
の後で、未反応アミノ基を塩化メチレン中でN−アセチ
ルイミダゾ−ルによるアセチル化を行いブロックし
た)。
合成 保護されたPNAをMBHA樹脂の上で、前記実施例に
おいて使用したBHA樹脂のロ−ディングのほぼ半分を
用いて構築した。更には、一つのサイクルを除いて全て
のサイクルは、カップリングしないアミノ基をアセチル
化することによってこれに従った。以下にこの合成法を
詳細に記述する:
Boc−Lys(CIZ)−NH−CH(p−CH3−
C6H4)−C6H4樹脂(MBHA樹脂)の製造 Boc−Lys(CIZ)−MBHA樹脂の所望の置換
度は0.25−0.30mmol/gであった。この数
値を得るために、1.5mmolのBoc−Lys(C
IZ)を、60mlのCH2Cl2中にて単一in−si
tuカップリング(1.5mmolのDCC)剤を用い
て、中和し、事前に膨潤させたMBHA樹脂(定量ニン
ヒドリン反応によって0.64mmolNH2/gを含
有することが測定された)5.0gにカップリングさせ
た。この反応は、手動操作式の225ml標準固相反応
容器の中において3時間振盪することによって実施し
た。未反応のアミノ基を無水酢酸.ピリジン/CH2C
l2(1:1:2、v/v/v)の混合物を用いて18
時間アセチル化してブロックした。中和した樹脂の上で
の定量的ニンヒドリン反応を行ったところ、僅か0.0
0093mmol/gの遊離アミンが残留すること(第
I表を参照)、即ち原初のアミノ基の0.15が残留し
ていることが判った。置換度は、脱保護しニンヒドリン
分析して決定したが、中和したH−Lys(CIZ)−
MBHA樹脂について0.32mmol/gであること
が判った。0.30mmolBoc0Lys(CIZ)
/g樹脂なる定量的カップリングに対する最大値0.2
8mmol/gと充分に比肩できるものである(第II
表を参照)。
(CIZ)−MBHA樹脂の段階的構築 (a)項で製造したH−Lys(CIZ)−MBHA樹
脂の全バッチをそのまま(同じ反応容器中において)用
いて、2.5当量のBocTaeg−OPfpを純CH
2Cl2中において用いて単一カップリング(”合成実験
記録3”)によってBoc−[Taeg]3−Lys
(CIZ)−MBHA樹脂を構築した。定量的ニンヒド
リン反応を、この合成全体にわたって適用した(第II
表を参照)。
(CIZ)−MBHA樹脂の段階的合成 湿潤Boc−[Taeg]3−Lys(CIZ)−MB
HA樹脂ほぼ4.5g(^0.36mmolの成長鎖;
(b)項において製造した全部で19gの湿潤樹脂から
取り出した)を、55mlのSPPS反応容器のなかに
入れた。Boc−[Taeg]8−Lys(CIZ)−
MBHA樹脂を、ほぼ30%DMF/CH2Cl2中にお
いて2.5当量のBocTaeg−OPfpを用いて単
一カップリング(”合成実験記録4”)で構築した。合
成の進行は、全ての段階において定量的ニンヒドリン反
応によってモニタ−した(第II表を参照)。
(CIZ)−MBHA樹脂の段階的構築 湿潤Boc−[Taeg]3−Lys(CIZ)−MB
HA樹脂ほぼ1g(0.09mmoloの成長鎖;
(c)項におい手製造した全部で4gの湿潤樹脂から取
り出した)を、20mlのSPPS反応容器のなかに入
れた。Boc−[Taeg]10−Lys(CIZ)−M
BHA樹脂を、ほぼ30%DMF/CH2Cl2中におい
て2.5当量のBocTaeg−OPfpを用いて前記
した項において使用した単一カップリング合成実験記録
によって構築した。反応容量は3mlであった(激しく
振盪)。合成は、定量的ニンヒドリン反応によってモニ
タ−した(第II表を参照)。
(CIZ)−MBHA樹脂の合成 Boc−[Taeg]10−Lys(CIZ)−MBHA
樹脂の一部を(推定乾燥重量はほぼ45mg)脱保護し
た後、この樹脂を3mlの固相反応容器の中において無
水酢酸/ピリジン/CH2Cl2(1:1:1、v/v/
v)の混合液2mlを用いて2時間定量的にアセチル化
した。
2の開裂、精製および同定 保護したBoc−[Taeg]10−Lys(CIZ)−
BHA樹脂の一部を実施例17cにおいて記載したよう
に処理して、76mgの乾燥H−[Taeg] 5−Ly
s(CIZ)−BHA樹脂をHF開裂すると24mgの
粗製物が得られた。15.2分における主ピ−クは(欠
失ペプチドや種々の副生物などの不純物を含む)、全吸
光度のほぼ78%を占めていた。このピ−クはまた、”
主ピ−クおよび欠失ピ−ク”吸光度のほぼ88%を占め
ていたが、このことは、第II表における個別のカップ
リング収率をまとめて得た全推定カップリング収率とし
ての90.1%と用く合致している。7.2mgの粗製
物を二つのバッチから半合成用逆相カラムを用いて精製
した(主ピ−クをドライアイス/2−イソプロパノ−ル
で冷却したビ−カ−に集める)。それぞれは、H2O1
ml中に3.6mgを含有していた。凍結した溶液をそ
のまま凍結乾燥して(speed vacにおいてアセ
トニトリルを予め除去することなく)82%純度のH−
[Taeg] 10−Lys−NH2がほぼ4.2mg得ら
れた。
H2の開裂、精製および同定 保護したAc−[Taeg]10−Lys(CIZ)−B
HA樹脂の400.0mg(乾燥重量)を実施例17c
において記載したように開裂させたが、TFA処理を行
うことはせずに、11.9mgの粗製物を得た。15.
8分における主ピ−クは、全吸光度のほぼ75%を占め
ていた。4.8mgの粗製物を精製すると、95%以上
の純度のH−[Taeg]10−Lys−NH2がほぼ
3.5mg得られた。(M+H)+については、計算m
/z値は2849.8でありかつ測定m/z値は284
8.8であった。
oc−脱保護、3ml、3x1分および1x30分;
(2)CH2Cl2による洗浄、100ml、6x1分;
(3)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)によ
る中和、100ml、3x2分;(4)CH2Cl2によ
る洗浄、100ml、6x1分、および1分間のドレ−
ン;(5)2−5mgのPNA−樹脂試料を取り出し、
完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換度
を測定する;(6)35mlのCH2Cl2に溶解した
2.5当量の(3.75mmol;2.064g)Bo
cTaeg−OPfpを添加(最終ペンタフルオロフェ
ノ−ルの濃度は〜0.1M);カップリング反応は、振
盪しつつ合わせて20−24時間進行させた;(7)D
MFによる洗浄、100ml、1x2分(BocTae
g−OHの沈殿を除去するため);(8)CH2Cl2に
よる洗浄、100ml、4x1分;(9)DIEA/C
H2Cl2(1:19、v/v)による中和、100m
l、2x2分;(10)CH2Cl2による洗浄、100
ml、6x1分;(11)2−5mgの保護PNA樹脂
試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さ
らに2−5mgをよく乾燥してニンヒドリン定量分析に
供してカップリング度を測定;(12)無水酢酸/ピリ
ジン/CH2Cl2(1:1:1、v/v/v)の混合液
100mlを用いて2時間アセチル化を行って未反応ア
ミノ基をブロックする;(13)CH2Cl2による洗
浄、100ml、6x1分;(14)2 x 2−5m
gの保護PNA樹脂試料を取り出し、DIEA/CH2
Cl2(1:19、v/v)で中和し次いでCH2Cl2
で洗浄してニンヒドリン定性および定量分析に供する。
oc−脱保護、25ml、3x1分および1x30分;
(2)CH2Cl2による洗浄、25ml、6x1分;
(3)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)によ
る中和、25ml、3x2分;(4)CH2Cl2による
洗浄、25ml、6x1分、および1分間のドレ−ン;
(5)2−5mgのPNA−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換度を測
定する;(6)6mlのCH2Cl2に溶解した2.5当
量の(0.92mmol;0.506g)BocTae
g−OPfpを添加si,次いで3mlのDMFを添加
(最終ペンタフルオロフェノ−ルの濃度は〜0.1
M);カップリング反応は、振盪しつつ合わせて20−
24時間進行させた;(7)DMFによる洗浄、25m
l、1x2分;(8)CH2Cl2による洗浄、25m
l、4x1分;(9)DIEA/CH2Cl2(1:1
9、v/v)による中和、100ml、2x2分;(1
0)CH2Cl2による洗浄、25ml、6x1分;(1
1)2−5mgの保護PNA樹脂試料を取り出し、迅速
ニンヒドリン定量試験に供し、さらに2−5mgをよく
乾燥してニンヒドリン定量分析に供してカップリング度
を測定;(12)無水酢酸/ピリジン/CH2Cl
2(1:1:2、v/v/v)の混合液25mlを用い
て2時間アセチル化を行って未反応アミノ基をブロック
する(最初のサイクルの後は除く);(13)CH2C
l2による洗浄、100ml、6x1分;(14)2
x 2−5mgの保護PNA樹脂試料を取り出し、DI
EA/CH2Cl2(1:19、v/v)で中和し次いで
CH2Cl2で洗浄してニンヒドリン定量分析に供する。
−NH2の固相合成
−[Taeg]5−Lys(CIZ)−MBHA樹脂の
段階的合成 湿潤Boc−[Taeg]3−Caeg−Lys(CI
Z)−MBHA樹脂をほぼ2.5g(残留するほぼ16
gの全湿潤樹脂の〜1/6;〜0.75g乾燥樹脂〜
0.15mmolの成長鎖)6mlのSPPS反応容器
に入れた。Boc−[Taeg]5−Caeg−[Ta
eg]4−Lys(CIZ)−MBHA樹脂を、ほぼ3
0%のDMF/CH2Cl22.5mlの中において通常
の2.5当量のBocTaeg−OPfpを用いて全て
のTaeg残基を二重カップリングさせて構築した。但
し、最初の残基は単一カップルさせた。C(Z)aeg
−残基の導入は、THF/CH2Cl2(1:2、v/
v)中においてBocC(Z)aeg−OPfpの2当
量でカップリングさせて行った。この合成の進行は、定
量的ニンヒドリン反応によって全ての段階でモニタ−し
た(表III)。
[Taeg]4−Lys−NH2の開裂、精製および同定 保護したBoc−[Taeg]5−Caeg−[Tae
g]4−Lys(CIZ)−BHA樹脂の一部を実施例
1の第c項において記載したように処理し、66.9m
gの乾燥したH−[Taeg]5−Caeg−[Tae
g]4−Lys(CIZ)−BHA樹脂をHFで開裂さ
せて14.4mgの粗製物を得た。14.5分における
主ピ−クは、全吸光度のほぼ50%を占めていた。10
0mgの粗製物を精製すると(8バッチ;それぞれ1m
lのH2Oに溶解)、96%の純度のH−[Taeg]5
−Caeg−[Taeg]4−Lys−NH2がほぼ9.
1mg得られた。(M+H)+については、計算m/z
値は2793.8でありかつ測定m/z値は2790.
6であった。
チル)グリシン アミノエチルグリシン(52.86g;0.447mo
l)を水(900ml)に溶解し、ジオキサン(900
ml)を加えた。このpHを2N−NaOHで11.2
に調節した。pHを11.2に保持しつつ、三級−ブチ
ル−p−ニトロフェニル炭酸エステル(128.4g;
0.537mol)をジオキサン(720ml)に溶解
し、2時間かけて滴下した。このpHを少なくともさら
に3時間保持し、次いで攪拌しつつ一夜放置した。黄色
の溶液を0℃に冷却し、次いでpHを2N−HClで
3.5に調節した。混合物をクロロホルム(4 x 1
00ml)で洗浄し、水相のpHを0℃で2N−NaO
Hで再び9.5に調節した。塩化ベンジルオキシカルボ
ニル(73.5ml; 0.515ml)を、pHを2
N−NaOHで9.5に保持しつつ半時間かけて添加し
た。このpHをこの後4時間頻繁に調節し、この溶液を
攪拌しつつ一夜放置した。翌日、この溶液をエ−テル
(3 x 600ml)で洗浄し、そのpHを0℃にお
いて2N−HClで1.5に調節した。表題化合物を酢
酸エチル(5 x 1000ml)で抽出して単離し
た。この酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、
真空において蒸発乾凅した。こうして138gが得られ
たが、こののもをエ−テル(300ml)に溶解し、石
油エ−テル(1800ml)を加えて沈殿させた。収
率:124.7g(79%)。m.p.64.5−85
℃。C17H24N2O6の元素分析、測定値(理論値)
C:58.40(57.94);H:7.02(6.8
6);N:7.94(7.95)。1H−NMR(25
0MHz、CDCl3) 7.33 & 7.32(5
H,Ph);5.15 & 5.12(2H,PhCH
2);4.03 & 4.01(2H.NCH2CO
H);3.46(b,2H,BocNHCH2CH2);
3.28(b,2H,BocNHCH2CH2);1.4
3 & 1.40(9H,t−Bu)。HPLC(26
0nm) 20.71min.(80.2%)および2
1.57min.(19.8%)。UV−スペクトル
(200nm−300nm)は同一であり、小さいピ−
クはBis−Z−AEGから成ることが明かとなってい
る。
エチル)グリシン(60.0g;0.170mol)お
よびN,N−ジメチル−4−アミノピリジン(6.00
g)を無水エタノ−ル(500ml)に溶解し、0℃に
冷却して、その後にDCC(42.2g;0.204m
ol)を添加した。5分後に氷浴を取り除いて、攪拌を
さらに2時間継続した。沈殿したDCU(乾燥して3
2.5g)をろ過して除去し、エ−テル(3 x 10
0ml)で洗浄した。濾液を併せて、希硫酸水素ナトリ
ウム液(2 x 400ml)、希炭酸水素ナトリウム
液(2 x 400ml)および飽和塩化ナトリウム液
(1 x 400ml)で次々に洗浄した。有機相をろ
過し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥し、真空において
蒸発乾凅し、その結果DCUを含有するオイル状物質6
6.1gが得られた。この油状物を無水エタノ−ル(6
00ml)に溶解し、パラジムカ−ボン(6.6g)を
加えた。この溶液を大気圧で水素添加したが、この際保
存容器は2N−水酸化ナトリウムで満たした。4時間
後、4.2Lの理論値に比較して、3.3Lが費消され
た。この反応混合物をセライトでろ過し、真空において
蒸発乾凅したところ、油状物質が39.5g(94%)
が得られた。この油状物質13gをシリカゲル(600
g SiO2)クロマトグラフィ−で精製した。塩化メ
チレン中20%の石油エ−テル300mlで溶出した後
で、表題化合物を塩化メチレン中5%メタノ−ル170
0mlで溶出させた。溶媒を満足するべき純度のフラク
ションから真空において揮散させた。収率は8.49g
であった。その代わりに、粗製物10gをKugel
Rohr蒸留で精製した。1H−NMR(250MH
z、CD3OD)4.77(b,sNH); 4.18
(q,2H,MeCH2−);3.38(s,2H,N
CH2CO2Et);3.16(t,2H,BocNHC
H2CH2);2.68(t,2H.BocNHCH2C
H2);1.43(s,9H,tBu)および1.26
(t,3H,CH3)。13C−NMR171.4(C
OEt);156.6(CO);78.3((CH3)
C);59.9(CH2);49.0(CH2);39.
0(CH2);26.9(CH2)および12.6(CH
3)。
法を用いた。最終製品は、カラム精製法で精製した。
(13.5g;54.8mmol)、DhbtOH
(9.84g;60.3mmol)および1−カルボキ
シメチルチミン(11.1g;60,3mmol)をD
MF(210ml)に溶解した。塩化メチレン(210
ml)を次に加えた。この溶液をエタノ−ル/氷浴で0
℃にまで冷却し、DCC(13.6g;65.8mmo
l)を加えた。氷浴を1時間後に取り除き、攪拌をさら
に常温で2時間続行した。沈殿したDCUをろ過して除
き、塩化メチレン(2 x 75ml)で二度洗浄し
た。濾液を合わせて、これにさらに塩化メチレン(65
0ml)を加えた。この溶液を稀重炭酸ナトリウム液
(3 x 500ml)、希硫酸水素ナトリウム液(2
x500ml)および飽和塩化ナトリウム液(1 x
500ml)で連続して洗浄した。若干の沈殿をろ過
して有機相から除去し、有機相を硫酸マグネシウムで乾
燥し、真空において蒸発乾凅した。オイル状の残渣を塩
化メチレン(150ml)に溶解し、ろ過し、表題化合
物を0℃において石油エ−テル(300ml)を加えて
沈殿させた。この塩化メチレン/石油エ−テルの方法を
もう一度繰り返し、これによって物質16.0g(71
%)が得られたが、これは、HPLCによって99%以
上の純度であった。
得られる)中に溶解し、1Mの水酸化リチウム水溶液
(116ml)を加えた。この混合物を常温で45分間
攪拌し、次いでろ過して残留DCUを除去した。水(4
0ml)をこの溶液に加え、次に塩化メチレン(300
ml)で洗浄した。さらに追加の水(30ml)を加
え、このアルカリ性の溶液をさらにもう一度塩化メチレ
ン(150ml)で洗浄した。この水溶液を0℃にまで
冷却し、pHを1N−HCl(ほぼ110ml)を滴下
して2に調節した。表題化合物を酢酸エチル(9 x
200ml)で抽出し、抽出液を併せて、硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、真空中において蒸発乾凅した。残渣をも
う一度メタノ−ルから蒸発させて、一夜乾燥させると、
無色のガラス様の固体が得られた。収率:9.57g
(64%)。HPLC>98% RT = 14.8m
in。元素分析、C16H24N4O7C・0.25H2O、
実験値(理論値) C:49.29(49.42)
H:6.52(6.35); N:14.11(14.
41)。二級アミド結合の周囲の回転が限定されている
ため、シグナルのいくつかが2:1の比率で二重化した
(リストにおいて大きい方はmjでまた小さい方はmi
で示してある)。1H−NMR(250MHz、DMS
O−d6):12.75(b.s,1H,CO2H);1
1.28(s,”1H”,mj.,imideNH);
11.26(b.s..1H,CO 2H);7.30
(s,”1H”,mj.,T H−6);7.26
(s,”1H”,mi.,T H−6);6.92
(b.t.,”1H”,mj.,BocNH));6.
73(b.t.,”1H”,mi.,BcoNH));
4.64(s,”2H”,mj.,CH 2CON);
4.46(s,”2H”,mj.,CH 2CON);
4.19(s,”2H”,mi.,CH 2CO2H);
3.97(s,”2H”,mj.,CH 2CO2H);
3.63−3.01(分解されないm,水を含む,CH
2CH 2);1.75(s,3H,CH 3)および(s,
9H,tBu)。
g)シトシン N’−Boc−アミノエチルグリシンエチルエステル
(5.00g;20.3mmol)、DhbtOH
(3.64g;22.3mmol)およびN4−ベンジ
ルオキシカルボニル−1−カルボキシメチルシトシン
(6.77g;22.3mmol)をDMF(100m
l)に分散させた。塩化メチレン(100ml)を次に
加え、この溶液を0℃にまで冷却し、DCC(5.03
g;24.4mmol)を添加した。2時間後に氷浴を
取り除き、攪拌を常温でさらに1時間継続した。この反
応混合物を真空において蒸発乾凅し、残渣をエ−テル
(100ml)中に分散させ、30分間激しく攪拌し
た。固形物をろ過して単離し、エ−テル洗浄処理方法を
二度繰り返した。希重炭酸ナトリウム液(ほぼ4%溶
液、100ml)とともに15分間激しく攪拌し、ろ過
して、水で洗浄した。この方法をもう一度繰り返し、乾
燥後、放置すると淡黄色の固体物質が17.9g得られ
た。この固体をジオキサン(200ml)とともに煮沸
し、熱時ろ過した。冷却後、水(200ml)を加え
た。沈殿した物質をろ過して単離し、水で洗浄して、乾
燥した。HPLC(260nmにおいて観察)によれ
ば、この物質は、DCUの他に純度として99%であっ
た。このエステルをTHF(100ml)中に分散さ
せ、0℃にまで冷却して、1N−LiOH(61ml)
を加えた。15分間攪拌した後で、混合物をろ過し、濾
液を塩化メチレン(2 x 150ml)で洗浄した。
このアルカリ性の溶液を0℃にまで冷却し、pHを1N
−HClで2.0に調節した。表題化合物をろ過して単
離して、水で一度洗浄すると、乾燥後に白色の粉体が1
1.3gが得られた。この物質を塩化メチレン(300
ml)中に懸濁させ、石油エ−テル(300ml)を加
えた。ろ過し、次いで洗浄すると、乾燥後で7.1g
(69%)が得られた。HPLCの結果、RT=19.
5分で純度が99%でありまた12.6分において、恐
らくはZ−で保護されたモノマ−である不純物(ほぼ1
%)があることが判った。元素分析、C23H29N5O8、
実験値(理論値) C:54.16(54.87)
H:5.76(5.81); N:13.65(13.
91)。1H−NMR(250MHz、DMSO−
d6):10.78(b.s,1H,CO2H);7.8
8(二つのオ−バ−ラップする二重線,”1H”,Cy
tH−5);7.41−7.32(m,5H,Ph);
7.01(二つのオ−バ−ラップする二重線,”1
H”,CytH−5);6.94 & 6.78(un
res.三重線、1H,BocNH);5.19(s,
2H,PhCH 2));4.81 & 4.62(s,
2H,CH 2CON);4.17& 3.98(s,2
H,CH 2CO2H);3.42−3.03(m,水を含
有,CH 2CH 2)および1.38 & 1.37(s,
9H,tBu)。13C−NMR、150.88;12
8.52;128.18;127.96;93.90;
66.53;49.58および28.22。IR:周波
数、cm−1(強度)。3423(26.4,3035
(53.2)、2978(41.4))、1736(1
7.3)、1658(3.8)、1563(23.
0)、1501(6。8)および1456(26.2)
ウム(10.29g;74.0mmol)をDMFに懸
濁させ、臭化酢酸エチル(8.24ml;74mmo
l)を加えた。この懸濁液を室温で窒素雰囲気下で2.
5時間攪拌し、次いでろ過した。固形の残渣をDMF
(10ml)三酸度洗浄した。濾液を併せて、真空にお
いて蒸発乾凅し、黄−オレンジ色の固形物質を水(20
0ml)に注ぎ、4N−HClをpH〜6になるように
加えた。0℃で10分間攪拌した後で、固形物をろ過し
て除き、水で洗浄し、96%エタノ−ルから再結晶し
た。表題化合物をろ過して単離し、エ−テルでよく洗浄
した.収率:3。4g(20%)。m.p. 215.
−220℃。元素分析、C9H11N5O2、実験値(理論
値) C:48.86(48.65) H:5.01
(4.91); N:31.66(31.42)。1H
−NMR(250MHz、DMSO−d6):(s,2
H,H−2 & H−8);7.25(b.s.,2
H,NH2);5.06(s,2H,NCH2));4.
17(q,2H,J=7.11Hz,OCH2)および
1.21(t,3H,J=7.13Hz,NCH2)。
13C−NMR。152.70、141.30、61.4
1、43.97および14.07。FAB−MS.22
2(MH+)。IR:周波数、cm−1(強度)。38
55(54.3),3274(10.4)、3246
(14.0))、3117(5.3)、2989(2
2.3)、2940(33.9)、2876(43.
4),2753(49.0),2346(56.1),
2106(57.1),1899(55.7),176
2(14.2),1742(14.2),1742
(1.0),1671(1.8),1644(10.
9),1606(0.6),1582(7.1),15
22(43.8),1477(7.2),1445(3
5.8)および1422(8.6)。アルキル化の位置
は、96%エタノ−ルから再結晶して得た結晶について
のX−線結晶学によって確認した。
ルアデニンエチルエステル 9−カルボキシメチルアデニンエチルエステル(3.4
0g;15.4mmol)を乾燥DMF(50ml)に
緩やかに加熱して溶解させて、20 ℃にまで冷却し塩
化メチレン(50ml)にN−エチルベンジルオキシカ
ルボニルイミダゾ−ルN−エチル テトラフルオロ硼酸
エステル(62mmol)を溶かした溶液に氷で冷却し
ながら15分かけて加えた。若干の沈殿が認められた。
氷浴を取り除いて、溶液を一夜攪拌した。この反応混合
物を飽和重炭酸ナトリウム液(100ml)で処理し、
10分間攪拌した後、二相を分離し、有機相を当量の
水、希流酸水素ナトリウム液(二度)で、および飽和塩
化ナトリウム液で連続して洗浄した。この溶液を硫酸マ
グネシウムで乾燥し、真空において蒸発乾凅したとこ
ろ、油状物11gが得られた。この物質を塩化メチレン
(25ml)に溶解し、0℃に冷却し、石油エ−テル
(50ml)で沈殿させた。この方法をもう一度繰り返
して、表題化合物3.45g(63%)が得られた。
m.p.132−35℃。元素分析、C17H17N5O4、
実験値(理論値) C:56.95(57.46)
H:4.71(4.82); N:19.35(19.
71)。1H−NMR(250MHz、CDCl3):
8.77(s,1H,H−2 & H−8);7.99
(s.,1H,H−2またはH−8);7.45−7.
26(m,5H,Ph);5.31(s,2H,NCH
2));4.96(s,2H,Ph−CH 2);4.27
(q,2H,J=7.15Hz,CH 2CH2)および
1.30(t,3H,J=7.15Hz,CH2C
H 3)。13C−NMR。153.09;143.11;
67.84;62.51;44.24および14.0
9。FAB−MS:356(MH+)および312(M
H+−CO2)。IR:周波数、cm−1(強度)。3
423(52.1);3182(52.8);3115
(52.4));3031(47.9);2981(3
8.6);1747(1.1);1617(4.8),
1587(8.4);1552(25.2);1511
(45.2);1492(37.9);1645(1
4.0)および1413(37.3)。
ルアデニン N6−ベンジルオキシカルボニル−9−カルボキシメチ
ルアデニンエチルエステル(3.20g;9.01mm
ol)をメタノ−ル(50ml)と混合し、0℃に冷却
した。水酸化ナトリウム溶液(50ml;2N)を加え
たところ、この物質が急速に溶解した。0℃において3
0分経過して、このアルカリ性溶液を塩化メチレン(2
x 50ml)で洗浄し、0℃において4N−JCl
でpH1.0に調節したところ、表題化合物が沈殿し
た。ろ過し、水で洗浄しかつ乾燥後の収率は、3.08
g(104%)であった。この製品は塩を含有してお
り、元素分析にこのことが反映されていた。元素分析、
C15H13N5O4、実験値(理論値) C:46.32
(55.05) H:4.24(4.00); N:1
8.10(21.40)およびC/N:2.57(2.
56)。1H−NMR(250MHz、DMSO−d
6):8.70(s,1H,H−2 & H−8);
7.50−7.35(m,5H,Ph);5.27
(s,2H,NCH 2)および5.15(s,2H,p
H−CH 2)。13C−NMR。168.77;152.
54;151.36;148.75;145.13;1
28.51;128.17;127.98;66.67
および44.67。IR:周波数、(KBr)。348
4(18.3);3109(15.9);3087(1
5.0));2966(17.1);2927(19.
9);2383(53.8);1960(62.7),
1739(2.5);1688(5.2);1655
(0.9);1594(11.7);1560(12.
3);1530(26.3);1499(30.5);
1475(10.4);1455(14.0);142
9(24.5)および1411(23.6)。FAB−
MS:328(MH+)および284(MH+−C
O2)。HPLC(215nm、260nm)、溶媒系
1:15.18分、マイナ−な不純物は全てで2%以
下。
g)アデニンエチルエステル N’−Boc−アミノエチルグリシンエチルエステル
(2.00g;8.12mmol)、DhbtOH
(1.46g;8.93mmol)およびN6−ベンジ
ルオキシカルボニル−9−カルボキシメチルアデニン8
2.92g;8.93mmol)をDMF(15ml)
に溶解した。塩化メチレン(15ml)を加え、この溶
液をエタノ−ル/氷浴で0℃にまで冷却した。DCC
(2.01g;9.74mmol)を加え、2.5時間
後に氷浴を取り除いて常温で1.5時間攪拌を継続し
た。沈殿したDCUを濾して除去し、DMF(15m
l)で一度、塩化メチレン(2 x 15ml)で二度
洗浄した。濾液を併せ、これにさらに塩化メチレン(1
00ml)を添加した。この溶液を希重炭酸ナトリウム
液(2x 100ml)、希流酸水素カリウム液(2
x 100ml)および飽和塩化ナトリウム液(1 X
100 ml)で連続して洗浄した。有機層を真空に
おいて蒸発乾凅し、こうして淡黄色の油状物質3.28
g(73%)が得られた。この粗製物のHPLCの結
果、純度は僅かに66%に過ぎず、主ピ−クよりも極性
が高いかまたは低い不純物がいくつか含まれていること
が判った。油状物を無視エタノ−ル(50ml)に溶解
し、活性炭を加えた。5分間攪拌した後で、溶液をろ過
し、濾液を水(30ml)と混合し一夜攪拌しつつ放置
した。翌日、白色の沈殿をろ過して除去して、水で洗浄
し、乾燥したところ、HPLCによる純度が98%以上
である物質1.16g(26%)が得られた。母液に水
を加えたところ、純度がほぼ95%である物質がさらに
0.53g得られた。元素分析、C26H33N7O7・H2
O、実験値(理論値) C:55.01(54.4
4);H:6.85(6.15)およびN:16.47
(17.09)。1H−NMR(250MHz、CDC
l3):8.74(s,1H,AdeH−2);8.1
8(b.s,1H,ZNH);8.10 & 8.04
(s,1H,H−8);7.46−7.34(m,5
H,Ph);5.63(unres.t,1H,Boc
NH);5.30(s,2H,PhCH2);5.16
& 5.00(s,2H,CH 2CON);4.29
& 4.06(s,2H,CH 2CO2H);4.20
(q,2H,OCH 2CH3);3.67−3.29
(m,4H,CH 2CH 2);1.42(s,9H,tB
u)および1.27(t,3H,OCH 2CH 3)。スペ
クトルの結果、痕跡量のエタノ−ルおよびDCUの存在
が明となった。
g)アデニン N6−ベンジルオキシカルボニル−1−(Boc−ae
g)アデニンエチルエステル(1.48g;2.66m
mol)をTHF(13ml)中に懸濁させ、混合物を
0℃に冷却した。水酸化リチウム(8ml;1N)を添
加し、15分間攪拌した後で反応混合物をろ過し、さら
に水(25ml)を添加し、この溶液を塩化メチレン
(2 x 25ml)で洗浄した。この水溶液のpHを
1N−HClでpH2.0に調節した。沈殿をろ過して
単離して、水で洗浄し、乾燥して、0.82g(58
%)が得られた。本品を塩化メチレン/石油エ−テルで
二度再度沈殿させ、乾燥後0.77g(55%)が得ら
れた。m.p.119℃(分解)。元素分析、C24H29
N7O7・H2O、実験値(理論値) C:56.32
(52.84) H:5.71(5.73); N:1
7.68(17.97)。FAB−MS。528.5
(MH+)。1H−NMR(250MHz、DMSO−
d6):12.75(very b,1H,CO2H);
10.65(b.s,1H,ZNH);8.59(d,
1H,J=2.14Hz,Ade H−2);8.31
(s,1H,Ade H−8);7.49−7.31
(m,5H,Ph);7.03&6.75(unres
olv.t,1H,BocNH);5.33 & 5.
16(s,2H,CH2CON);5.22(s,2
H,PhCH 2));4.34−3.99(s,2H,
CH2CO2H);3.54−3.03(m’s、水を含
有、CH 2CH 2)および1.39 & 1.37(s,
9H,tBu)。13C−NMR。170.4;166.
6;152.3;151.5;149.5;145.
2;128.5;128.0;127.9;66.3
2;47.63;47.03;43.87および28.
24。
mmol)と炭酸カリウム(12.91g;93.5m
mol)をDMF(50ml)に溶かした溶液に、臭化
酢酸(4.70g;22.8mmol)を加えた。この
混合物を20時間窒素雰囲気下で激しく攪拌し、水(1
50ml)を添加し、溶液をセライトを通してろ過した
ところ、透明な黄色溶液が得られた。この溶液を4N−
塩酸でpH3に酸性化し、沈殿物をろ過し、sicap
ent上で真空下で乾燥した。収率83.02g;4
4.8%)。1H−NMR(DMSO−d6):d=4.
88ppm(s,2H);6.95(s,2H);8.
10(s,1H)。
ルプリン ナトリム(2.0g;87.0mmol)をベンジルア
ルコ−ル(20ml)に溶解し、130℃で2時間加熱
した。0℃にまで冷却したあとで、2−アミノ−6−ク
ロロ−9−カルボキシメチルプリン(4.05g;1
8.0mmol)をDMF(85ml)中に溶かした溶
液をゆっくりと添加し、生じた懸濁液を20℃において
一夜攪拌した。水酸化ナトリウム溶液(1N、100
m)を加え、、透明な溶液を酢酸エチル(3 x 10
0ml)で洗浄した。水相を4N塩酸でpH3に酸性化
した。沈殿物を酢酸エチル(200ml)にとり、水相
を酢酸エチル(2 x 100ml)で抽出した。有機
層を併せて、飽和塩化ナトリウム液(2 x 75m
l)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で
蒸発乾凅させた。残渣をエタノ−ルから再結晶化させ
た。真空下でのsicapent上での乾燥後の収率:
2,76g(52%)。m.p.159−65℃。元素
分析、実験値(理論値) C:(56.18;55.9
7) H(4.38;4.32)、 N(23.4;2
3.10)。1H−NMR(250MHz、DMSO−
d6):4.82ppm(s,2H);5.51(s,
2H);6.45(2,2H);7.45(m,5
H);7.82(s,1H)。
イル]−アセチル)−N−(2−Boc−アミノエチ
ル)−グリシン[BocGaeg−OHモノマ−] 2−アミノ−6−ベンジルオキシ−9−カルボキシメチ
ルプリン(0.050g;1.67mmol)、メチル
−N(2−[第三級−ブトキシカルボニルアミノ]エチ
ル)−グリシンエステル(0.65g;2.80mmo
l)、ジイソプロピルエチルアミン(0.54g;4.
19mmol)およびブロモ−トリス−ピロリジノ−ホ
スホニウム−ヘキサフロロホスフェ−ト(PyBroP
(R))(0.798g;1.71mmol)をDMF
(2ml)中で4時間攪拌した。透明な溶液を重炭酸ナ
トリウムの氷冷液(3 x 40 ml)に注ぎ、酢酸
エチル(3 x 40ml)で抽出した。有機相を硫酸
水素カリウム溶液(1N;2 x 40 ml)、重炭
酸ナトリウム溶液(1N;1 x 40ml)および飽
和塩化ナトリウム溶液(60ml)で洗浄した。無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発したあとで、固形
残渣を酢酸エチル/ヘキサン(20ml(2:1))か
ら再結晶化して、収率63%でメチルエステルを得た
(MS−FAB514(M+1)。このエステルを濃水
酸化ナトリウム液(1ml)を含むエタノ−ル/水(3
0ml(1:2))に溶解することによって加水分解を
行った。2時間攪拌した後で、この溶液をろ過し、4N
−塩酸を酸化してpH3に酸性化した。表題化合物を、
ろ過して得た。収率:370mg(加水分解に対して7
2%)。HPLCによる純度は、99%以上であった。
二級アミドの回転が制限されていたために、シグナルの
いくつかは、2:1の比率で二重化した(リストにおい
ては、主要ピ−クについてmj.でまた小さいピ−クは
mi.で表してある)。1H−NMR(250MHz、
DMSO−d6):d=1.4ppm.(s,9H);
3.2(m,2H);3.6(m,2H);4.1
(s,mj.,CONRCH 2COOH);4.4
(s,mi.,CONRCH 2COOH);5.0
(s,mj.,Gua−CH 2CO−);5.2(s,
mj.,Gua−CH 2CO);5.6(s,2H);
6.5(s,2H);6.9(m,mi.,BocN
H);7.1(m.mj.,BocNH);7.5
(m.,3H);7.8(s,1H);12.8(s,
1H)。13C−NMR。170.95;170.52;
167.29;166.85;160.03;159.
78;155.84;154.87;140.63;1
36.76;128.49;128.10;113.0
4;78.19;77.86;66.95;49.2
2;47.70;46.94;45.96;43.6
2;43.31および28.25。
g;0.440mol、1、0eq.)を水(1000
ml)に溶解し、0℃にまで冷却した。ジ−三級−ブチ
ル炭酸エステル(115.0g、0.526mol、
1,2eq.)を一度に加えた。この反応混合物を攪拌
しつつ水浴上で室温にまで加温した。pHを水(120
ml)に溶かした水酸化ナトリウム(17.56g、
0.440mol,1.0eq.)で10.5に維持し
た。水酸化ナトリウム溶液を添加し終えたとき、反応混
合物を室温で一夜攪拌した。その後、酢酸エチル(75
0ml)を反応混合物に加え、次に0℃に冷却した。p
Hを激しく攪拌しつつ4N−硫酸で2.5に調節した。
二つの相を分離し、水相を別の酢酸エチル(6 x 3
50ml)で洗浄した。有機相の容量を減圧下で蒸発さ
せて900mlにまで減少させた。有機相を飽和硫酸水
素カリウム溶液を二倍量に希釈したもの(1 x100
0ml)および飽和塩化ナトリウム溶液(1 x 50
0ml)で洗浄した。有機相を乾燥させ(MgSO
4)、減圧下で蒸発させて、表題化合物を50.12g
(60%)を得た。このものは、塩化メチレンから蒸発
させ次いで凍結させて、固化させることが出来た。1H
−NMR(CDCl3/TMS):d=1.43(s,
9H,Me3C)、3.25(m,2H,CH2)、3.
57(m,2H,CH2)、3.73(m,1H,C
H)、13C−NMR(CDCl3/TMS):d=2
8.2(Me3C)、42.6(CH2)、63.5、7
1.1(CH2OH,CHOH)、79.5(Me
3C)、157(C=O)。
ステル 3−Boc−アミノ−1、2−プロパンジオ−ル(2
0.76g;0.1090mol。1eq.)を水(1
50ml)に溶解した。m−過ヨウ素酸カリウム(2
4.97g;0.190mol、1eq.)を加え、反
応混合物を窒素雰囲気中で室温で2時間攪拌した。反応
混合物をろ過し、水相をクロロホルム(6x 250m
l)で抽出した。有機相を乾燥し(MgSO2)、蒸発
させると無色の油状物としてBoc−アミノアセトアル
デヒドが殆ど定量的な収率で得られ、このものを精製す
ることなく次の処理法に用いた。パラジウム−カ−ボン
(10%、0.8g)を窒素雰囲気中で冷却し(0℃)
かつ激しく攪拌しつつMeOH(250ml)に加え、
無水酢酸ナトリウム(4.49g;54.7mmol、
2eq.)およびL−アラニンメチルエステル塩酸塩
(3.82g;27.4mmol、1eq.)を加え
た。Boc−アミノアセトアルデヒド(4.79g;3
0.1mmol、1.1eq.)をMeOH(150m
l)に溶かし、反応混合物に加えた。反応混合物を常
圧、常温で、水素吸収が止むまで水素添加した。反応混
合物をセライトを通してろ過させたが、セライトをさら
にMeOHで洗浄した。このMeOHを減圧下で除去
し、残渣を水(150ml)に溶解し、pHを激しく攪
拌しつつ0.5N−NaOHを滴下することによって
8.0に調節した。水相を塩化メチレン(4 x 25
0ml)で抽出し、有機相を乾燥し(MgSO)、セラ
イトでろ過し、減圧下で蒸発させて透明で、若干黄色の
油状物として表題化合物が6.36g(94%)得られ
た。MS(FAB−MS):m/z(%)=247(1
00,M+1,191(90),147(18)。1H
−NMR(250MHz、CDCl3):1.18
(d,J=7.0Hz,3H,Me)、1.36(s,
9H,Me3C)、1.89(b,1H,NH)、2.
51(m,1H,CH2)、2.66(m,1H,C
H2)、3.10(m,2H,CH2)、3.27(、J
=7.0Hz,1H,CH)、3.64(s,3H,O
Me)、5.06(b,1H,カルバメ−トNH)。
13C−NMR d=18.8(Me)、28.2(Me
3C)、40.1、47.0(CH2)、51.6(Me
O),56.0(CH),155.8(カルバメ−トC
=O)、175.8(エステルC=O)。
セチル)−L−アラニンメチルエステル Boc−アミノエチル−(L)−アラニンメチルエステ
ル(1.23g,5.0mmol)をDMF(10m
l)に溶かした溶液に、Dhbt−OH(0./90
g,5.52mmol)および1−チミニル酢酸(1.
01g,5.48mmol)を添加した。1−チミニル
酢酸が溶解した時に、クロロメタン(10ml)を加
え、溶液を氷浴で冷却した。この反応混合物が0に達し
た時に、DCC(1.24g,601mmol)を加
え、添加後5分でDCUの沈殿が認められた。二時間後
に、TLC分析の結果、反応が完結したのを確認した。
この混合物をろ過し、沈殿をジクロロメタン(199m
l)で洗浄した。得た溶液を5%重炭酸ナトリウム(1
50ml)で二度、また飽和硫酸水素カリウム液(25
ml)を水(100m)に溶かした液で二度洗浄した。
飽和塩化ナトリウム液で最終的に抽出した後、溶液を硫
酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させると、白色発泡物を
得た。この発泡物を、メタノ−ル傾斜のジクロロメタン
を溶出溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトグラ
フィ−によって精製した。これによって、純品を得た
(HPLCで99%以上)(1.08g,52.8
%)。FAB−MS*413(M+1)および431
(M+1+水)。1H−NMR(CDCl3):4.5
2(s,2H,CH’2);3.73(s,3H,OM
e);3.2−3.6(m,4H,エチルCH
2‘s)、1.90(s,3H,TにおけるMe);
1.49(d,3H,AlaにおけるMe);1.44
(s,9H,Boc)。
セチル)−L−アラニン 表題化合物のメチルエステル(2.07g,5.02m
mol)をメタノ−ル(100ml)に溶解し、氷浴で
冷却し、2N水酸化ナトリウム(100ml)を加え
た。10分間攪拌した後で、混合物のpHを4M−塩化
水素で3に調節した。その後この溶液を酢酸エチル(3
x 100ml)で抽出し、有機抽出液を併せて、硫
酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た発泡物を酢酸
エチル(400ml)と数mlのメタノ−ルに溶かし
て、この固形物を溶解した。石油エ−テルを沈殿物が生
成し始めるまで加え、−20℃で一夜放置した後、沈殿
物をろ過して除いた。こうすることによって、純品を
1.01g(50.5%)得た(HPLCで99%以
上)。この化合物を2−プロパノ−ルから再結晶した。
FAB−MS:399(M+1)。1H−NMR(DM
SO−d6):11.35(s,1H,COO);7.
42(s,1H,H’6);4.69(s,2H,C
H’2);1.83(s,3H,TにおけるMe);
1.50−1.40(M、12H、Ala + Boc
におけるMe)。
−(1−チミニルアセチル)−D−アラニンメチルエス
テル Boc−アミノエチルアラニンメチルエステル(2.4
8g;10.1mmol)をDMF(20ml)に溶か
した溶液にDhhbt−OH(1.80g;11.0m
mol)およびチミニル酢酸(2.14g;11.6m
mol)を添加した。1−チミニル酢酸が溶解した後
で、塩化メチレン(20m)を加え、この溶液を氷浴で
冷却した。反応混合物が0℃に達した時に、DCC
(2.88g;14.0mmol)を加えた。添加後5
分でDCUの沈殿が認められた。35分後に、氷浴を取
り除き、3.5時間後に反応混合物をろ過し、沈殿を塩
化メチレン(200ml)で洗浄した。得た溶液を5%
重炭酸ナトリウム液(200ml)で二度、また飽和流
酸水素カリウム水溶液(100ml)で二度抽出し、飽
和塩化ナトリウム液(250ml)で最終的に抽出した
後で、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させると油状物
を得た。この油状物をメタノ−ル傾斜の塩化メチレンを
溶出溶媒として用いて、短いカラムシリカゲルクロマト
グラフィ−で精製した。こうすることによって、石油エ
−テルで沈殿させた後でHPLCによる純度が96%の
化合物が得られた(1.05g;25.3%)。FAB
−MS:413(M+1)。1H−NMR(CDC
l3):5.64(t,1H,BocNH,J=5.8
9Hz);4.56(d,2H,CH’2);4.35
(q,1,H,AlaにおけるCH,J=7.25);
3.74(s,3H,OMe);3.64−3.27
(m,4H,エチルのH’);1.90(s,3H,T
におけるMe);1.52−1.44(t,12H,A
laにけるBoc+Me)。
−(1−チミニルアセチル)−D−アラニン 表題化合物のメチルエステル(1.57g,3.81m
mol)をメタノ−ル(100ml)に溶解し、氷浴で
冷却し、水酸化ナトリウム(100ml;2M)を加え
た。10分間攪拌した後で、混合物のpHを4M−塩化
水素で3に調節した。その後この溶液を酢酸エチル(3
x 100ml)で抽出し、有機抽出液を併せて、硫
酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た油状物を酢酸
エチル(200ml)に溶かし、石油エ−テルを沈殿物
が生成し始めるまで加え、−20℃で一夜放置した後、
沈殿物をろ過して除いた。こうすることによって、表題
化合物を1.02g(67.3%)得たが、純度はHP
LCで99%以上であった。FAB−MS:399(M
+1)。1H−NMR:11.34(s,1H,COO
H);7.42(s,1H,H’6);4.69(s,
2H,CH’2);4.40(q,1H,Alaにおけ
るCH、J=7。20Hz);1.83(s,3H,T
におけるMe);1.52−1.40(m、12H、A
laにおけるBoc+Me)。
[(1−チミニル)アセチル]グリシンメチルエステル N(N’−Boc−3’−アミノプロピル)グリシンメ
チルエステル(2.84g;0.0115mol)をD
MF(35ml)に溶解し、その後DhbtOH(2.
07g;0.0127mol)と1−チミニル酢酸
(2.34g;0.0127mol)を加えた。塩化メ
チレン(35ml)を加えて、混合物を氷浴で0℃に冷
却した。DCC(2.85g;0.0138mol)を
加えた後、混合物を2時間0℃で攪拌し、その後室温で
1時間攪拌した。沈殿したDCUをろ過して除去し、塩
化メチレン(25ml)で洗浄し、更に追加量の塩化メ
チレン(150ml)を濾液に加えた。有機相を重炭酸
ナトリウム(飽和液を当量の水で希釈、6 x 250
ml)で抽出し、硫酸カリウム(飽和液を4倍量の水で
希釈、3 x 250ml)次いで飽和塩化ナトリウム
で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し真空下で蒸発乾凅
した。固体の残渣を塩化メチレン(35ml)に懸濁さ
せて、1時間攪拌した。沈殿したDCUは、ろ過して除
去し、塩化メチレン(25ml)で洗浄した。濾液を真
空下で蒸発乾凅して、残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフィ−で、メタノ−ルと塩化メチレン(塩化メチレ
ン中3−7%メタノ−ルの傾斜)の混合物で溶出して精
製した。こうすることによって、表題化合物を白色固体
として得た(3.05g、64%)。m.p.76−7
9℃(分解)。元素分析、C18H28N4O7、実験値(理
論値) C:52.03(52.42) H:6.90
(6.84); N:13.21(13.58)。この
化合物は、満足すべき1Hおよび13C−NMRスペクト
ルを示した。
[(1−チミニル)アセチル]グリシン N−(N’−Boc−3’−アミノプロピル)−N−
[(1−チミニル)アセチル]グリシンメチルエステル
をメタノ−ル(25ml)に溶解し、2M−水酸化ナト
リウム(25ml)と共に1.5時間攪拌した。メタノ
−ルを真空下で蒸発させて除去し、pHを4M−塩酸で
0℃において2に調節した。本製品をろ過して白色結晶
として単離し、水(3 x 10ml)で洗浄し、真空
下でsicapentで乾燥した。収率:2.19(7
5%)。元素分析、C17H26N4O7・H2O、実験値
(理論値) C:49.95(49.03) H:6.
47(6.29); N:13.43(13.45)。
この化合物は、満足すべき1H−および13C−NMRス
ペクトルを示した。
懸濁させ、メタアクリル酸メチル(39.6ml;0.
44mol)を触媒量の水酸化ナトリウムとともに加え
た。この溶液を45時間暗所で還流させ、真空下におい
て蒸発乾凅させ、残渣を加熱しつつメタノ−ル(8m
l)に溶解させた。氷浴で冷却した後、生成物をエ−テ
ル(20ml)を加えて沈殿させ、ろ過して単離し、エ
−テル(20ml)で洗浄し、真空下でsicapen
t上で乾燥させた。収率;11.23g(48%)。
m.p. 112−119℃。元素分析、C9H12N2O
4、実験値(理論値) C:51.14(50.94)
H:5.78(5.70);N:11.52(13.
20)。この化合物は、満足すべき1H−および13C−
NMRスペクトルを示した。
0.0047mol)を2M−水酸化ナトリウム(15
ml)に溶解し、10分間煮沸させた。pHを濃塩酸を
用いて0.3に調節した。この溶液を酢酸エチル(10
x 25ml)で抽出し、有機層を飽和塩化ナトリウ
ム液で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸
発乾凅させると、表題化合物が白色固体として得られた
(0.66g;71%)。m.p.118−121℃。
元素分析、C8H10N2O4、実験値(理論値) C:4
8.38(48.49) H:5.09(5.09);
N:13.98(14.14)。この化合物は、満足
すべき1H−および13C−NMRスペクトルを示した。
[(1−チミニル)プロパノイル]グリシンエチルエス
テル N(N’−Boc−アミノエチル)グリシンエチルエス
テル(1.0g;0.0041mol)をDMF(12
ml)に溶解し、その後DhbtOH(0.73g;
0.0045mol)と1−チミニルプロパン酸(0.
89g;0.0045mol)を加えた。塩化メチレン
(12ml)を加えて、混合物を氷浴で0℃に冷却し
た。DCC(1.01g;0.0049mol)を加え
た後、混合物を2時間0℃で攪拌し、その後室温で1時
間攪拌した。沈殿したDCUをろ過して除去し、塩化メ
チレン(25ml)で洗浄し、更に追加量の塩化メチレ
ン(50ml)を濾液に加えた。有機相を重炭酸ナトリ
ウム(飽和液を当量の水で希釈、6 x 100ml)
で抽出し、硫酸カリウム(飽和液を4倍量の水で希釈、
3 x 100ml)次いで飽和塩化ナトリウム(1
x 100ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し
真空下で蒸発乾凅した。固体の残渣を塩化メチレン(1
5ml)に懸濁させて、1時間攪拌した。沈殿したDC
Uは、ろ過して除去し、塩化メチレン(25ml)で洗
浄した。濾液を真空下で蒸発乾凅して、残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィ−で、メタノ−ルと塩化メチ
レン(塩化メチレン中3−7%メタノ−ルの傾斜)の混
合物で溶出して精製した。こうすることによって、表題
化合物を白色固体として得た(1.02g、59%)。
元素分析C19H30N4O7、実験値(理論値) C:5
3.15(53.51) H:6.90(7.09);
N:12.76(13.13)。この化合物は、満足
すべき1Hおよび13C−NMRスペクトルを示した。
[(1−チミニル)プロパノイル]グリシン N−(N’−Boc−3’−アミノエチル)−N−
[(1−チミニル)プロパノイル]グリシンエチルエス
テル(0.83g;0.00195mol)をメタノ−
ル(25ml)に溶解した。水酸化ナトリウム(25m
l;2M)を加え、この溶液を1時間攪拌した。メタノ
−ルを真空下で蒸発させて除き、pHを4M−塩酸で0
℃において2に調節した。本品をろ過して単離し、エ−
テル(3 x15ml)で抽出し、真空下でsicap
entの上で乾燥させた。収率:0.769g(99
%)。m.p.213℃(分解)
(1)(10.0g;0.0418mol)をDMF
(50ml)に溶解し溶液を、30分かけてエチレンジ
アミン(27.9ml;0.418mol)およびDM
F(50ml)の溶液に加え、一夜攪拌した。この混合
物を真空下で蒸発乾凅させて、得られた油状物を水(2
50ml)に溶解した。0℃に冷却した後、pH を
4M−塩酸で3.5に調節した。この溶液をろ過し、ク
ロロホルム(3 x 250ml)で抽出した。このp
Hを2M−水酸化ナトリウムで0℃において12に調節
し、水溶液を塩化メチレン(3 x 300ml)で抽
出した。飽和塩化ナトリウム水溶液で(250ml)処
理した後で、塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウム上で
乾燥し、ろ過して、生じた溶液を真空下で蒸発乾凅し
て、本品(油状物)94.22gが得られた。1H−N
MR(90MHz;CDCl3):δ1.44(s,9
H);2.87(t,2H);3.1(q,2H);
5.62(s,broad)。
チルエステル塩酸塩 モノ−Boc−エチレンジアミン(2)(16.28
g;0.102mol)をアセトニトリル(440m
l)に溶解し、アクリル酸メチル(91.50ml;
1.02mol)をアセトニトリル(200ml)と一
緒にこの混合物に移した。この溶液を暗所で窒素雰囲気
下で一夜還流して、アクリル酸メチルの重合を回避し
た。真空下で蒸発乾凅した後で、水とエ−テルの混合物
(200 + 200ml)を加え、生じた溶液をろ過
して、激しく攪拌した。水相をもう一度エ−テルで抽出
し、次いで凍結乾燥して、黄色の固体を得た。酢酸エチ
ルから再結晶して、表題化合物を13.09gを得た。
m.p.138−140℃。元素分析C11H23N2O4C
l、実験値(理論値) C:46.49(46.72)
H:8.38(8.20); N:9.83(9.9
1);Cl:12.45(12.54)。1H−NMR
(DMSO−d6):δ1.39s,9H);2.9
(m.8H);3.64(s,3H).
ミノエチル−β−アラニンメチルエステル (N−Boc−アミノ−エチル)−β−アラニンメチル
エステル・塩酸塩(3)(2.0g;0.0071mo
l))および1−チミニル酢酸ペンタフルオロフェニル
エステル(5)(2.828g;0.00812mo
l)をDMF(50ml)に溶解した。トリエチルアミ
ン(1.12ml;0.00812mol)を加え、混
合物を一夜攪拌した。塩化メチレン(200ml)を添
加後、有機層を重炭酸ナトリウム水溶液(3 x 25
0ml)、半飽和流酸水素カリウム水溶液(3 x 2
50ml)と飽和塩化ナトリウム水溶液(250ml)
で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過し、次い
で真空下で蒸発乾凅すると、2.9g(99%)の収量
で生成物が得られた(油状物)。1H−NMR(250
MHz;CDCl3:二級アミドの周囲の回転が制限さ
れるため、信号のいくつかが二重化した。δ1.43
(s,9H);1.88(s,3H);2.63(t,
1H);2.74(t,1H);3.25−3.55
(4xt,8H);3.65(2xt,2H);3.6
6(s,1.5);3.72(s,1.5);4.61
(s,1H);5.72(s,2H);5.59(s,
0.5H);5.96(s,0.5H);7.11
(s,1H);10.33(s,1H)。
ミノエチル−β−アラニン N−[(1−チミニル)アセチル]−N’−Boc−ア
ミノエチル−β−アラニンメチルエステル(3.0g;
0.0073mol)を2M−水酸化ナトリウム(30
ml)に溶解し、pHを4M−塩酸で0℃において2に
調節し、溶液を2時間攪拌した。沈殿をろ過して単離
し、冷水で三度洗浄し、真空下においてsicapen
t上で乾燥した。収率、2.23g(77%)。m.
p.170−176℃。元素分析C17H26N4O7・H2
O、実験値(理論値) C:49.49(49.03)
H:6.31(6.78); N:13.84(1
3.45);1H−NMR(DMSO−d6):δ1.3
8(s,9H);1.76(s,3H);2.44およ
び3.29(m,8H);4.55(s,2H);7.
3(s,1H);11.23(s,1H)。FAB−M
S:399(M+1)
N’−Boc−アミノエチル−β−アラニンメチルエス
テル (N−Boc−アミノ−エチル)−β−アラニンメチル
エステル・塩酸塩(3)(2.0g;0.0071mo
l)および1−(N−4−Z)−シトシル酢酸ペンタフ
ルオロフェニルエステル(5)(3.319g;0.0
071mol)をDMF(50ml)に溶解した。トリ
エチルアミン(0.99ml;0.0071mol)w
o加え、混合物を一夜攪拌した。塩化メチレン(20
0,l)を添加した後で、有機層を重炭酸ナトリウム水
溶液(3 x 250ml)、半飽和硫酸水素カリウム
水溶液(3 x 250ml)および飽和塩化ナトリウ
ム水溶液で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過
して、真空下で蒸発乾凅して、3.36gの固体の化合
物が得られたが、このものをメタノ−ルから再結晶し
た。収率:2.42g(64%)。m.p.158−1
61℃。元素分析C25H 33N5O8、実験値(理論値)
C:55.19(56.49) H:6.19(6.2
6); N:12.86(13.18)。1H−NMR
(250MHz;CDCl3):二級アミドの周囲の回
転が制限されるため、信号のいくつかが二重化した;δ
1.43(s,9H);2.57(t,1H);3.6
0−3.23(m’s,6H);3.60(s,1.5
H);3.66(s,1.5H);4.80(s,1
H);4.88(s,1H);5.20(s,2H);
7.80−7.25(m’s,7H)。FAB−MS:
532(M+1)
N’−Boc−アミノエチル−β−アラニン N−[(1−(N4−Z)−シトシル)アセチル]−
N’−Boc−アミノエチル−β−アラニンメチルエス
テル(0.621g;0.0012mol)を2M−水
酸化ナトリウム(8.5ml)に溶解して2時間攪拌し
た。その後に、pHを4M−塩酸で0℃において2に調
節し、この溶液を2時間攪拌した。沈殿をろ過して単離
して、冷水で三度洗浄し、真空下でsicapent上
で乾燥した。収率:0.326g(54%)。この白色
固体を2−プロパノ−ルから再結晶し、石油エ−テルで
洗浄した。m.p.163第(分解)。元素分析C24H
31N 5O8、実験値(理論値) C:49.49(49.
03) H:6.31(6.78); N:13.84
(13.45)。1H−NMR(250MHz;CDC
l3):二級アミドの周囲の回転が制限されるため、信
号のいくつかが二重化した;δ1.40(s,9H);
2.57(t,1H);2.65(t,1H);3.6
0−3.32(m’s,6H);4.85(s,1
H);4.98(s,1H);5.21(s,2H);
5.71(s,1H,broad);7.99−7.2
5(m’s,7H)。FAB−MS:518(M+1)
−[Taeg]4−Lys−NH2の固相合成 保護されたPNAを、置換度がほぼ0.15であるBo
c−Lys(CIZ)で修飾したMBHA樹脂の上で構
築した(定量的ニンヒドリン反応で測定)。カップルし
ていないアミノ基のキャッピングは、BocBaeg−
OHモノマ−を導入する前に初めて行った。
−[Taeg]4−Lys−NH2の段階的合成(合成実
験記録) 合成は、予備膨潤(DCM中で一夜)させかつ中和した
Boc−Lys(CIZ)−MBHA樹脂102mg
(乾燥重量)において開始した。実施した工程は以下の
通りである:(1)TFA/CH2Cl2(1:1、v/
v)によるBoc−脱保護、1x2分および1x1/2
時間、3ml;(2)DCMによる洗浄、4x20秒、
3ml;DMFによる洗浄、2x20秒、3ml;DC
Mによる洗浄、2x20秒、3ml、および30秒間の
ドレ−ン;(3)DIEA/DCM(1:19、v/
v)による中和、2x3分、3ml;(4)DCMによ
る洗浄、4x20秒、3mlおよび1分間のドレ−ン;
(5)4当量のジイソプロピルカルボジイミド(0.0
6mmol;9.7μl)および4当量(0.06mm
ol;24mg)のBocTaeg−OHまたは(0.
06mmol;30mg)のBocGaeg−OHを
0.6mlのDCM/DMF(1:1、v/v)に溶解
して添加、このカップリング反応は、室温で振盪させな
がら1/2時間進行させた;(6)サクションを20秒
間適用した;(7)DMFによる洗浄、2x20秒及び
1x2分、3ml;(8)DIEA/DCM(1:1
9、v/v)による中和、2x3分、3ml;(9)D
CMによる洗浄、4x20秒、3mlおよび1分間のド
レ−ン;(10)定性的Kaiser試験;(11)未
反応アミノ基をAc2O/ピリジン/DCM(1:1:
2、v/v)。1x1/2時間、3ml;および(1
2)DCMによる洗浄、4x20秒、2x2分;2x2
0秒。工程1−12は、所望の配列が得られるまで繰り
返した。定性的Kaiser試験は全て、マイナスであ
り(わら様の黄色、ビ−ズには一切着色しない)、カッ
プリング収率はほぼ100%であることを示していた。
PNA−オリゴマ−を開裂させ、通常の方法で精製し
た。FAB−MS:2832.11[M+1](計算値
2832.15)。
H2の固相合成
−[Taeg]8−Lys(CIZ)−MBHAの固相
合成 湿潤Boc−[Taeg]8−Lys(CIZ)−MB
H樹脂ほぼ0.3gを3mlのSPPS反応容器に入れ
た。Boc−Taeg−A(Z)aeg−[Taeg]
8−Lys(CIZ)−MBHA樹脂を、2.5mlの
50%DMF/CH2Cl2中0.15M−DCCと共に
0.19MのBoc(A)(Z)aeg−OHを用いた
in situDCCカップリング(単一)および純C
H2Cl2中において0.15MのBocTaeg−O
Pfpとの単一カップリングによって組み立て・構築し
た(”合成実験記録5”)。この合成は、定量的ニンヒ
ドリン反応によってモニタ−したが、これによってA
(Z)aegの導入率はほぼ50%でありまたTaeg
の導入率はほぼ96%であることが明らかになった。
g]8−Lys−NH2の開裂、精製および同定 保護されたBoc−Taeg−A(Z)aeg−[Ta
eg]8−Lys(CIZ)−BHA樹脂を実施例40
cにおいて記載したように処理して、乾燥H−Taeg
−A(Z)aeg−[Taeg]8−Lys(CIZ)
−BHA樹脂53.1mgをHF開裂すると粗製物質が
ほぼ15.6mgが得られた。14.4分における主ピ
−クは、全吸光度の50%以下を占めていた。この粗製
物0.5mgを精製して、H−Taeg−Aaeg−
[Taeg]8−Lys−NH2が0.1mg得られた。
(MH+)+について、計算m/z値は、2816.1
6でありかつ測定m/z値は2816.28。
oc−脱保護、2.5ml、3x1分および1x30
分;(2)CH2Cl2による洗浄、2.5ml、6x1
分;(3)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)
による中和、2.5ml、3x2分;(4)CH2Cl2
による洗浄、2.5ml、6x1分、および1分間のド
レ−ン;(5)2−5mgのPNA−樹脂試料を取り出
し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換
度を測定する;(6)1.25mlのDMFに溶解した
0.47mmol(0.25g)のBocTaeg−O
Hを添加し、次いで1.25mlのCH2Cl2に溶かし
た0.47mmol(1g)のDCCまたは2.5ml
のCH2Cl2に溶かした0.36mmol(0.20
g)のBocTaeg−OPfpを添加する;カップリ
ング反応は、振盪しつつ全部で20−24時間進行させ
た;(7)DMFによる洗浄、2.5ml、1x2分;
(8)CH2Cl2による洗浄、2.5ml、4x1分;
(9)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)によ
る中和、2.5ml、2x2分;(10)CH2Cl2に
よる洗浄、2.5ml、6x1分;(11)2−5mg
の保護PNA樹脂試料を取り出し、よく乾燥してニンヒ
ドリン定量分析に供して、カップリング度を測定する;
(12)未反応アミノ基を無水酢酸/ピリジン/CH2
Cl2(1:1:2、v/v/v)の混合物25ml用
いて2時間アセチル化することによってブロックする
(最後のサイクルを除く);および(13)CH2Cl
2による洗浄、2.5ml、6x1分;(14)保護さ
れたPNA−樹脂の2x2−5mg試料を取り出し、D
IEA/CH2Cl2(1:19、v/v)による中和
し、CH2Cl2で洗浄してニンヒドリン分析を行った。
−NH2の固相合成
aeg−[Taeg]5−Lys(CIZ)−MBHA
樹脂の段階的合成 湿潤Boc−[Taeg]5−Lys(CIZ)−MB
HA樹脂ほぼ0.5gを5mlのSPPS反応容器に入
れた。Boc−[Taeg]2−A(Z)aeg−[T
aeg]8−Lys(CIZ)−MBHA樹脂を、2m
lの/CH2Cl 2中の当量のDCCと共に0.15Mか
ら0.20Mの保護されたPNAモノマ−(遊離酸)を
用いたA(Z)aegとTaeg残基とのin sit
uDCCカップリングを行うことによって組み立て・構
築した(”合成実験記録6”)。この合成は、定量的ニ
ンヒドリン反応によってモニタ−したが、これによって
三回のカップリングを行った後でA(Z)aegの導入
率はほぼ82%であり(一回目のカップリングでは、導
入率はほぼ50%であった;50%DMF/CH2Cl2
中での四回目のHOBt仲介カップリングでは、全カッ
プリング収率は有意には増大しなかった)またTaeg
残基の導入率は定量的であることが明らかになった。
g]2−Lys−NH2の開裂、精製および同定 保護されたBoc−[Taeg]2−A(Z)aeg−
[Taeg]5−Lys(CIZ)−BHA樹脂を実施
例40cにおいて記載したように処理して、乾燥H−
[Taeg]2−A(Z)aeg−[Taeg]5−Ly
s(CIZ)−BHA樹脂102.5mgをHF開裂す
ると粗製物質がほぼ16.2mgが得られた。この粗製
物の一部を精製した。(MH+)+について、計算m/
z値は、2050.85でありかつ測定m/z値は20
50.90であった。
oc−脱保護,2ml,3x1分および1x30分;
(2)CH2Cl2による洗浄、2ml、6x1分;
(3)DIEA/CH2Cl2(1:19、v/v)によ
る中和、2ml、3x2分;(4)CH2Cl2による洗
浄、2.5ml、6x1分、および1分間のドレ−ン;
(5)2−5mgのPNA−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定
する;(6)1.5mlのCH2Cl2に溶解した0.4
4mmol(0.23g)のBocA(Z)aeg−O
Hを添加し、次いで0.5mlのCH2Cl2に溶かした
0.47mmol(1g)のDCCまたは1.5mlの
CH2Cl2に溶かした0.33mmol(0.13g)
のBocTaeg−OHを添加する;カップリング反応
は、振盪しつつ全部で20−24時間進行させた;
(7)DMFによる洗浄、2ml、1x2分;(8)C
H 2Cl2による洗浄、2ml、4x1分;(9)DIE
A/CH2Cl2(1:19、v/v)による中和、2m
l、2x2分;(10)CH2Cl2による洗浄、2m
l、6x1分;(11)2−5mgの保護PNA樹脂試
料を取り出し、よく乾燥してニンヒドリン定量分析に供
して、カップリング度を測定する;(12)未反応アミ
ノ基を無水酢酸/ピリジン/CH2Cl2(1:1:2、
v/v/v)の混合物25ml用いて2時間アセチル化
することによってブロックする(最後のサイクルを除
く);(13)CH2Cl2による洗浄、2ml、6x1
分;および(14)保護されたPNA−樹脂の2x2−
5mg試料を取り出し、DIEA/CH2Cl2(1:1
9、v/v)による中和し、CH2Cl2で洗浄してニン
ヒドリン分析を行った。
一つのチミンリガンドをHで置換すると、Tmが73℃
から48℃まで低下することが判る。また単一塩基ミス
マッチを導入する効果も示してある。
生物学的性質を、以下の実験によって説明する。
63、第20図) S1−ヌクレア−ゼプロ−ビング技法を用いて、プラス
ミドpUC19のBamHI、SalIまたはPSTI
にクロ−ンした認識配列A10、A5GA4(A9G)&A2
GA2GA4(A8G2)に対するT10、T5CT4(T
9C)&T2CT2CT 4(T8C2)PNAの結合の識別を
解析した。この結果(第20図)、三つのPNAは、以
下の相対的な効率でそれぞれの認識配列に結合すること
が判った:PNA−T10:A10>A9G≫A8G2、PN
A−T9C:A9G>A10≫A8G2、PNA−T8C2:A
8G2≧A9G≫A10。即ち、37℃において、10につ
き1のミスマッチがあると、効率が減少し(5−10倍
と推定)、他方では二つのミスマッチは受け入れられな
い。
ブリダイゼ−ションによるds−DNAからの単一鎖D
NAの置換(第20図)−実施例63。
合体形成の速度論(実施例64、第21図) 複合体形成は、PNAと32P−end標識dsDNA
フラグメントを混合した後異なる時点でS1−ヌクレア
−ゼによってプロ−ブした(第21図)。
の複合体を形成させた(60分、37℃)。これらの複
合体は、過剰のオリゴ−dA10の存在下所望の温度にお
いて培養し、室温に冷却しKMnO4でプロ−ブした。
その結果(第22図)、PNA−dsDNA複合体の熱
安定性はPNAオリゴヌクレオチド複合体の熱安定性
を”Tm”とういう点で反映していることが判る。
施例64、第23図) プラスミド構成、pT10は、pUC19中のBamH
I部位にクロ−ンしたdA10/dT10 tractを含
有している。即ち、BamHIおよびPvuIIによる
PT10の開裂を行うと、211と111bpなる二つ
の小さいDNAフラグメントが生じる。PNA−T10の
存在下では、336bpフラグメントが得られるが、こ
れはPvuIIのみに因る開裂に相当する(第23
図)。即ち、BあMIIによる開裂は、制限酵素部位に
近接して結合したPNAによって抑制される。このよう
な結果も、PNA−dsDNA複合体を100%収率で
形成させることが出来ることを示している。
レチドへの結合(実施例63、第24図) Tyr−PNA−T10−Lys−NH2をNa125Iおよ
びクロラミン−Tを用いて125Iで標識し、HPLCで
精製した。この125I−PNA−T10は、PAGEおよ
びオ−トラジオグラフィ−によってオリゴ−dA10に
結合することが判った。このような結合は、過剰の変成
した子牛胸腺DNAによって拮抗させることが出来た。
Aの配列特異的認識は、10のチミン置換2−アミノエ
チルグリシル単位から成るPNA−そのC−終末はリシ
ンアミドでありまたN−終末は複合9−アミノアクリジ
ンリガンド(9−Acr1−(taeg)10−Lys−
NH2、第11aおよび11b図)である−がdA10/
dT10標的配列に結合することよって説明される。この
標的は、248 bp32P−end(末端)−標識DN
A−フラグメントに含まれる。 1)この9−Acr1は(第5図)、照射時のDNAの
開裂を確実にするため4−ニトロベンズアミドを付して
おり、その結合部位に極めて近接してDNAを開裂させ
ることが予期されるに過ぎない。上記248 bp D
NAフラグメントとともにPNAを照射すると、dA10
/dT10配列における選択的開裂が認められる(第3a
図)。
おいて、合成ジアゾ結合アクリジンは紫外線照射下にお
いて、DNAと相互作用した場合にDNAを開裂させる
(但し、DNAが前記結合性物質で保護されている場合
は除く)。このような実験は、上記した248bpds
DNAを用いて行ったが、その結果PNA結合部位の光
開裂に対する保護が明らかとなった(第3b図)。
開裂性酵素であるMicrococcusヌクレア−ゼ
は、矢張り大抵のDNA−結合性試薬によってその作用
が阻害されるが、T10−標識における開裂を増大させた
(第3c図)。
チミンリガンドは(二本鎖チミンリガンドとは異なっ
て)過マンガン酸カリウムによる酸化を極めて受け易い
のであるが、この性質を利用した。この試薬の存在下で
248bpを酸化したところ、標的のT10−鎖の酸化の
みが起こることが判った(第3b図)。
ア−ゼが持つ一本鎖特異性によって、標的のT10−鎖の
みが攻撃されたことが判った(第3d図)。
−NH2およびAcr1−(taeg) 10−Lys−NH
2(第5図)が相当するdA10に極めて効率よく結合す
ることは、以下の二つの方法で説明・証明された:
に、PNA−オリゴヌクレオチッド複合体は、ポリアク
リルアミドゲル中での電気泳動を行うと一本鎖オリゴヌ
クレオチッドよりも泳動速度が遅いはずである。従っ
て、このような実験は、Acr1−(Taeg)10−L
ys−NH2および32P−endで標識したdT10につ
いて行った。この結果、通常のdA10/dT10二重らせ
んが安定である条件においてはまたこのような二重らせ
んが不安定である(変成性ゲル)条件下においても泳動
が遅延することが判った。対照実験を、Acr1−(T
aeg)10−Lys−NH2と32P−endで標識した
dT10との混合物で行ったが、その結果上記した条件下
では全く遅延しないことが判った。
(dsDNA)を形成させると、吸光度係数は減少する
(淡色効果)。即ち、DNAの変性は、吸光率の変化を
たとえば、二重らせんの50%が消失して一本鎖を生じ
る温度であるTmを函数として測定することによって追
跡することができる。二重らせんは、一本鎖オリゴデオ
キシリブヌクレオチドと以下に列挙するPNA類とから
形成した。典型的には、T−リッチ鎖の0.3OD260
を1当量の他の鎖と、90℃において5分間加熱し、次
いで室温にまで冷却することによハイブリダイゼ−ショ
ンさせ、次いで30分間保持し、最後に5℃の冷蔵庫に
少なくとも30分間保存した。使用した緩衝液は全て、
りん酸が10mMかつEDTAが1mKであった。低塩
緩衝液は塩化ナトリウムを一切含有しておらず、一方中
塩緩衝液は、140mMのNaClを含有しまた高塩緩
衝液は500mMのNaClを含有していた。これら緩
衝液の全ては、pHが7.2であった。ハイブリッドの
融点は、Gilford Response装置で測定
した。以下に記載する吸光度係数を用いた:通常のオリ
ゴヌクレオチッドおよびPNAの双方とも、A:15.
4ml/μmol・cm;T:8,8;G:11.7お
よびC:7.3とした。融解曲線を0.5℃/分刻みで
記録した。Tmは、A260と温度との曲線の一次微分係
数も最大値から求めた。
ト: 1.5’−AAA−AAA−AA 2.5’−AAA−AAA−AAA−A 3.5’−TTT−TTT−TTT−T 4.5’−AAA−AAG−AAA−A 5.5’−AAG−AAG−AAA−A 6.5’−AAA−AGA−AAA−A 7.5’−AAA−AGA−AGA−A 8.5’−TTT−TCT−TTT−T 9.5’−TTT−TCT−TCT−T 10.5’−TTT−TTC−TTT−T 11.5’−TTT−TTC−TTC−T 12.5’−TTC−TTC−TTT−T 13.5’−TTT−TTT−TTT−TTT−TTT 14.5’−AAA−AAA−AAA−AAA−AAA
H2 f.Ac−TTC−TTT−TTT−T−Lys−NH
2
Lys−NH2との間のハイブリッドは、測定出来ない
ほどの高温で融解する(>90℃)。しかし、特異的な
ハイブリダイゼ−ションは、RNA−A−但しG、Cお
よびUではない−と混合した時のA260が大幅に低下す
ることによって証明される。実験は、PNA溶液1ml
とRNA溶液1ml−何れもA260=0.6−とを混合
し、次いで260nmにおける吸光度を測定することに
よって行う。その後、試料を90℃に5分間加熱し、室
温にまで冷却し、この温度に30分間保持子、最後に5
℃において30分間保存する。
が出来る。融解曲線が認められるので、塩基スタッキン
グがある。PNA−DNAハイブリッドの方が、通常の
DNA−DNAハイブリッドよりも安定性が高く、而も
PNA−RNAはさらにこれよりも安定である。ミスマ
ッチによって、誤対合した塩基がDNA鎖にあるかまた
はPNA鎖にあるかに拘らず、Tmが大幅に低下する。
このTm値は、通常のオリゴヌクレオチドとは異なりイ
オン強度にわずかしか依存していない。
の結合(第11a図) Acr1−(Taeg)10−Lys(100ng)を2
0μlのTE緩衝液(10mMトリスHCl、1mME
DTA、pH7.4)中において50cpsの5’−[
32P]−end−で標識したオリゴヌクレオチッドと一
緒に室温で15分間培養した。試料を氷で冷却し(15
分間)、ポリアクリルアミド中でのゲル電気泳動法(P
AGE)で分析した。試料の10μlに、2μlの50
%のグリセリン、5μlのTBE(TBE=90mMト
リス硼酸塩、1mMEDTA、pH8.3)を加え、試
料を4℃においてTBE緩衝液中でのPAGE(15%
アクリルアミド、0.5%ビスアクリルアミド)によっ
て分析した。この試料10μlを凍結乾燥して、10μ
lの80%ホルムアミド、1TBEに再度溶解し、90
℃に加熱(5分間)し、尿素/TBE緩衝液中でのPA
GE(15%アクリルアミド、0.5%ビスアクリルア
ミド)によって分析した。[32P]−含有DNAバンド
を増幅スクリ−ンおよび−80℃において2時間露光し
たアグファクリックス(Agfa Curix)RPI
X−線フィルムを用いて、オ−トラジオグラフィ−で可
視化した。
TP(Amersham、5000Ci/mmol)と
ポリヌクレオチドキナ−ゼで標識したBioserac
h7500DNA合成装置で合成し、標準技法を用いて
PAGEで精製した(Maniatisら、(198
5):A Laboratory Manual、Co
ld Spring Harbor Laborato
ries)。第11a図および第11b図において、
5’−32Pで標識したオリゴヌクレオチド1は、5’−
GASTCCA10Gであり、Acr−T10−Lys−N
H2の不存在下(レ−ン1および4)または存在下(レ
−ン2および5、25pmol;レ−ン3および6、7
5pmol))で培養し、また5’−GATCCT10G
である”オリゴ−2”の不存在化(レ−ン1から3ま
で)または存在化(レ−ン4から6まで)で培養した。
5’−32Pで標識したオリゴ2は、同じPNAの不存在
下(レ−ン7) または存在下(レ−ン8、25pmo
l;レ−ン9、75pmol)で培養し、上記において
詳細に記載したようなPAGEで分析した。第11a図
に示した結果によれば、PNAでハイブリダイゼ−ショ
ンしたと同様に(レ−ン1から3まで)ssDNAの遅
延化が明らかであり、PNAが、標識した相補オリゴヌ
クレオチド(レ−ン4から6まで)に対してDNAオリ
ゴヌクレオチドと競合・拮抗する能力を有していること
が判る。dsDNAに起因するバンドの強度は、PNA
濃度を上げるに応じてより急速に増大し、泳動速度が遅
いPNA−DNAハイブリッドを表すバンドで置換され
る。レ−ン7から9までは、このPNAは、相補的でな
いT10オリゴDNAには影響を及ぼさないことを示す。
第11b図においては、DNA変成条件で行ったもので
あるが、PNA−DNA二重らせんが未変成のままであ
る。
を、標準的方法に従い(Maniatisら、198
6)Escherichia coli JM101株
を用いて二つのオリゴヌクレオチド(d(GATCCA
10G)+d(GATCCT10G)))をpUC19のB
amHI制限酵素部位にクロ−ンすることによって構成
した。所望のプラスミド(pT10と称する)を得られ
たクロ−ンの一つから単離し、アルカリ性抽出法および
CsCl遠心分離法(Maniatisら、1986)
によって精製した。dA10/dT10標的配列を含む24
8bpの3’−[32P]−end(末端)で標識したD
NAフラグメントを、このpT10DNAを制限酵素E
coRIおよびPvuIIで開裂し、次にE.coli
DNAポリメラ−ゼ(Boehringer Mann
heim)のKlenowフラグメントを用いてこの開
裂したDNAをα[32P]−dATP(4000Ci/
mmol,Amsterdam)で標識し、248bp
DNAフラグメントをPAEG(15%アクリルアミ
ド、0.5%ビスアクリルアミド、TBE緩衝液)によ
って精製して得た。このDNAフラグメントは、Eco
RIで開裂したpT10プラスミドをバクテリア性アル
カリ性ホスファタ−ゼ(Boehringer Man
nheim)で処理し、このプラスミドDNAを低融点
アガロ−スでのゲル電気泳動法で精製し、次いでγ[32
P]ATPとポリヌクレオチドキナ−ゼで標識すること
によって、5’−endにおける[32P]標識を付して
得た。PvuIIで処理した後、248pbDNAを上
記のように精製した。Acr1−(Taeg)10−Ly
s−NH2と248bpDNAフラグメントとの複合体
を、Acr1−(Taeg)10−Lys−NH250n
gを500cpsのP−標識した248 bpフラグメ
ントと0.5μーgの子牛胸腺DNAとともに、下記に
おいてさらに詳細に述べるように、100μlの25m
MTris−HCl、1mMMgCl2、0.1mMC
aCl2、pH7.4中において37℃において60分
間培養することによって形成させた。
(第12b図レ−ン8から10)。鎖置換複合体を上記
したように生成させた。この複合体を20℃において5
分間750 U/mlのスタフィロコッカス(Stap
hylococcus)ヌクレア−ゼ(Boehrin
ger Mannheim)で処理し、この反応をED
TAを25mMまで添加することによって停止させた。
このDNAを2容量のエタノ−ル−2%酢酸カリウム−
で沈殿させ、80%ホルムアミド、TBEに再溶解さ
せ、90℃に加熱し(5分間)、高分解PAGE(10
%アクリルアミド、0.3%ビスアクリルアミド、7M
尿素)とオ−トラジオグラフィ−によって分析した。レ
−ン8は、PNAを含有せず、レ−ン9は40pmol
またレ−ン10は120pmolのPNAを含有してい
る。PNAが含有されているので、フットプリントの生
成が認められ、この結果スタフィロコッカスヌクレア−
ゼによって消化を受け易くなることおよび従ってdsD
NAからssDNAの置換が増大することが判る。
第12b図;何れの場合もレ−ン1から3まで) 複合体をTE緩衝液中で生成させた。Eppendor
f管に入れた試料に300nmにおいて(Philip
s TL)20W/12蛍光灯、243Jm-2/s)3
0分間UV照射した。DNAは、上記したように沈殿さ
せ、1Mピペリジンに取り、90℃にまで20分間加熱
した。凍結乾燥した後で、DNAは、上記したPAGE
によって分析した。もう一度、それぞれの場合におい
て、レ−ン1は、PNAは一切含有せず、レ−ン2およ
び3は、それぞれ40pmolと120pmolのPN
Aを含有する。PNAに結合したDNA鎖(A10鎖)
は、アクリジンエステルの位置において(第12a図の
レ−ン1から3まで)開裂して、新しいバンドを与える
が、またPNAによって置換された鎖は(T10鎖)ラ
ンダムに開裂子、フットプリントを与える。
レ−ン4から6まで) 複合体を100μlのTE中で生成させ、20mMKM
nO4を5μl添加した。20℃において15秒経過
後、1.5M酢酸ナトリウム、pH7.0、1M2−メ
ルカプトエタノ−ルを添加して反応を停止させた。DN
Aを沈殿させ、ピペリジンで処理して、上記した様に分
析した。レ−ン4から6までにおいては、レ−ン1から
3までと同様のPNA濃度を用いた。かくして再び、過
マンガン酸塩により置換されたssDNAの開裂を示す
フットプリントの生成を認める。
図レ−ン5から6まで) 複合体を100μlTEにおいて生成させ、ジアゾ−結
合アクリジン(0.1μg/μl)(DHA、Niel
senら(1988)、Nucl.AcidsRes.
16、3877−88)を添加した。試料を365nm
(Philips TL 20W/09N、22Jm-2
/s)で30分間照射し、上記した様に処理して、”ア
フィニティ−光開裂”に供した。PNAの存在下におい
て、(レ−ン6)このDNAは、保護されておりかつ保
護された領域において開裂に相当するバンドは消滅す
る。
−ン1から3) 複合体を50mM酢酸ナトリウム、20mMNacl、
0.5%グリセリン、1mMZnCl2、pH4.5に
おいて生成させ、0.5U/mlにおいてヌクレア−ゼ
S1(Boehringer Mannheim)で2
0℃において5分間処理した。反応を停止させ、さらに
上記”スタフィロコッカスヌクレア−ゼ”項において記
載した様に処理した。使用したPNAの量は、ゼロ(レ
−ン1から3まで)または120pmol(レ−ン4か
ら6まで)であり、レ−ン7がサイズの標準を示す。か
くして再び、PNAで置換されたT10DNA鎖の開裂
が認められる。
対するハイブリダイゼ−ションの感度 PNAオリゴマ−H−T4C2TCTC−LysNH2を
合成実験記録6によって製造し、逆相HPLCによって
精製し、FAB−mass分光分析法によって同定し
た;実験値(理論値):2746.8(2447.1
5)。この配列を用いたハイブリダイゼ−ション実験に
よって、実際のところ非対照であるので、配向の問題が
解決される。このような実験によって、Tmの温度依存
性や生成した複合体の化学量論の問題も解決される。P
NA−オリゴマ−H−T4C2TCTC−LysNH2を
用いたハイブリダイゼ−ション実験を以下のように行っ
た:
明確な輪郭の融解曲線をもたらしたことが明らかとなっ
た。PNA−オリゴマ−は実際に両方の配向において結
合することが可能である(第1列と第4列を比較のこ
と)。尤もN−末端/5’−配向に対する優先性が認め
られる。TまたはCに対向する単一ミスマッチを導入し
た結果、pH 7.2において16℃以上もTmが低下
することになった;pH5.0においては、このTm値
は、27℃以上も低下した。このことは、極めて高度の
配列選択性があることを示している。
のpH依存性が認められ、Hoogstenの塩基対合
がハイブリッドを形成する上で重要であることを示して
いる。従って、化学量論が2:1であることが判明した
ことは、驚くに当たらない。配列に対称性がないことお
よびミスマッチが存在した場合Tmが極めて大きく低下
することは、相補的DNAに結合した場合Watson
−Crick鎖およびHoogsten鎖が平行するこ
とを示している。このことは、双方の配向・方向、即ち
5’/N−末端および3’/N−末端についても当ては
まるのである。
クレオチドに対するハイブリダイゼ−ション実験結果を
以下に示す:
7列を比較すると明らかなように、Gは、このような態
様においてDNA−鎖におけるC/AとG/Tとを識別
することが可能であり、即ち配列識別が認められる。第
3列における複合体は更には、UV−混合曲線から2P
NA:1DNA複合体であることが決定された。
る配列特異性 延長された主鎖(β−アラニン修飾)を有する単一ユニ
ットのPNA−オリゴマ−に対するハイブリダイゼ−シ
ョンデ−タは、以下の通りである:
から、塩基特異的認識が保持されていることが明らかで
ある。
0mMりん酸ナトリウム、pH7.0の40μl中に溶
解し、1mCiのNa125Iと2μlのクラミン−T
(CH3CN中50mM)を添加する。この溶液を20
℃に10分間放置し、次いで0.5+5cmのセファデ
ックスG10カラムに通す。放射能を含む最初の二つの
フラクション(それぞれ100μl)を集め、HPLC
で精製する:即ち、1%のC3FCOOH水溶液中0−
60%CH3CN勾配を用いた逆相C−18である。125
I−PNAは、PNAピ−クの直後に溶出する。溶媒は
減圧下で除去する。
s−T10/T9C/T8C2の結合(第20図) 表示したプラスミドの二本鎖、32Pで標識したEcoR
I−PvuIIフラグメント(EcoRI部位の3’−
末端で標識した大きいフラグメント)200cps、キ
ャリア−子牛胸腺DNA0.5μgおよび100μl緩
衝液(200mMNaCl、50mM酢酸ナトリウム、
pH4.5、1mMZnSO4)中の表示したPNA3
00ngから成る混合物を37℃において120分間培
養した。ヌクレア−ゼS1を50単位を加え、20℃に
おいて5分間培養した。0.5MEDTA3μlを添加
することによって反応を停止させ、エタノ−ル中2%の
酢酸カリウム液250μlを加えることによってDNA
を沈殿させた。このDNAを10%ポリアクリルアミド
配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析し、放射
能標識したDNAバンドをオ−トラジオグラフィ−で可
視化した。得られた完全なバンドパタ−ンから、鎖置換
によって一本鎖DNAが生成していることが明らかとな
っているが、このものは、ヌクレア−ゼによって攻撃さ
れ、より短鎖のオリゴヌルレオチドの混合物が得られ
る。それぞれの場合に使用した三種のPNAについて得
られた結果を比較した結果、得られるそれぞれの標的に
対する選択性があることが明らかとなっている。pUC
19に適当なオリゴヌクレオチドをクロ−ンすることに
よって標的プラスミドを調製した。標的A10:BamH
I部位(pT10と称するプラスミド)にクロ−ンしたオ
リゴヌクレオチドGATCCA10G&GATCCT
10G。標的A 5GA4:SalI部位(プラスミドpT9
C)にクロ−ンしたオリゴヌクレオチドTCGACT4
CT5G&TCGACA5GA4G。標的A2GA2GA4:
PstI部位(プラスミドpT2C2)にクロ−ンしたオ
リゴヌクレオチドGA2GA2GA4TGCA&GT4CT
2CT2CTGCA。ゲル中におけるこれらの標的の位置
は、左方へのバ−によって示される。A/Gは、標的P
10のA+G配列ラダ−である。
(10mMTris−HCl、1mMEDTA、pH
7.4)中のpNA−T10の表示量と混合し、37℃に
おいて120分間培養した。2μl x濃縮緩衝液(1
0mMTris−HCl、pH7.5、10mM、Mg
Cl2、50mMNaCl、1mMDTT)およびPv
uII(2単位)とBamHI(2単位)を添加し、培
養を60分間継続した。このDNAを5%ポリアクリル
アミド中でのゲル電気泳動法によって分析し、このDN
Aを臭化エチジウム染色法によって可視化した。有意比
率のPNAの存在下では(0.2、0.6)、酵素Ba
mHIの開裂パタ−ンは、変化せず、この酵素は開裂部
位に添ってPNAの存在によって抑制阻害されることが
判る。
(第21図) pT10の二本鎖、32Pで標識したEcoRI−Pvu
IIフラグメント(EcoRI部位の3’−末端で標識
した大きいフラグメント)200cps、キャリア−子
牛胸腺DNA0.5μgおよび100μl緩衝液(20
0mMNaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH4.
5、1mMZnSO4)中の表示したPNA−T10−L
ysNH2300ngから成る混合物を37℃において
120分間培養した。表示した時間において、ヌクレア
−ゼS1を50単位を7つの試料のそれぞれに加え、2
0℃において5分間培養した。鎖置換によって生成した
一本鎖DNAをこのヌクレア−ゼによって消化した。エ
タノ−ル中2%の酢酸カリウム液250μlを加えるこ
とによってDNAを沈殿させ、10%ポリアクリルアミ
ド配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析した。
鎖置換複合体の量を、標的配列におけるS1−開列の強
度をオ−トラジオグラフをデンシトメ−タ−で走査して
測定し、これに基づいて任意の単位で算定した。時間の
経過とともにこの複合体の生成が認められる。
5niおけると同様のもの)、子牛胸腺DNA0.5μ
gおよび300ngの所望のPNA(T10−LysNH
2、T8−LYSNH2またはT6−LYSNH2)とから
成る混合物を、100μの200mMNaCl、50m
M酢酸ナトリウム、pH4.5、1mMZnSO4中3
7℃において60分間培養した。オリゴヌクレオチドG
ATCCA10Gを2μgを加え、標識オリゴヌクレオチ
ドに対するPNAと拮抗させ、各試料を表示した温度に
おいて10分間加熱し、氷で10分間冷却し、次いで2
0℃に加温した。S1ヌクレア−ゼを50単位加え、単
一ヌクレオチドとして放出遊離された放射能の量を測定
した。T10DNA二重らせんに対する予期Tm値は、2
0℃であり、またT8については16℃であり、T6につ
いては12℃であった。相当するPNA/DNA値は、
T10>70℃であり、T8については60℃であり、ま
たT6については37℃であった。
で活性化したセファロ−ス(Sigma)10mgを1
0μgのPNAとともに50mMりん酸ナトリウム、p
H7.5において37℃で60分間培養した。このセフ
ァロ−スは、遠心分離によって単離し、50mMりん酸
ナトリウム、pH7.5の250μlで三回洗浄した。
ゴヌクレオチドの結合 100μのTE中1mgのPNA−セファロ−ス(実施
例67)を32Pで標識したオリゴヌクレオチドの50c
ps(100ng)と共に20℃において16時間培養
した。このセファロ−スを遠心分離して単離し、500
μlのTEで二回洗浄した。結合したオリゴヌルレオチ
ドを、”Cerenkov”方法を用いて液体シンチレ
−ションカウンティングによって求めた。三種の異なる
PNA−セファロ−スと4種のオリゴ−DNAについ
て、得られた結果を下記の表に示す。 この固定
化したPNAによる捕捉の特異性が明確に求められる
が、なお塩基対ミスマッチは一つだけ許容される。
CCAAAAAAAAAAGであり、A9Gは、5’−
TCGACAAAAAGAAAAGであり、A8G2
は、5’−GAAGAAGAAACTGACであり、ま
たmixは、5’−GATCACGCGTATACGC
GTある。PNA類は、以下の通り:T10:H−T10
LysNH2、T9C:H−T5CT4−LysNH2、T
8C2:H−T2CT2CT4−LysNH2、なし:エタ
ノ−ルアミン。
結合安定性の温度依存性オリゴヌクレオチド類を実施例
67および68において記載したようにpNA−セファ
ロ−ズに結合した。何れの場合においても、得られたP
−オリゴヌクレオチド−PNA−セファロ−スを高温で
洗浄し、セファロ−スを遠心分離して単離し、放射能
を”Cerenkov”カウンティングによって測定
し、セファロ−スを再び500μlにとり、以下に記載
する温度において培養し、遠心分離した。この図には、
当初結合に正規化した結果を示す。オリゴヌクレオチド
およびセファロ−スは、実施例68の表に記載した通り
であった。これら曲線間における変位は、ミスマッチが
一つ生じた場合オリゴヌクレオチド結合安定性が低下し
たことを示す。
(以下を参照)で開裂した)と10mMTris−HC
l、1mMEDTA、pH7.4の15μl中での10
0ngのPNAとを37℃において60分間培養した。
次いで、4μl5x 濃縮緩衝液(0.2MTris−
HCl(pH8.0)、40mMMgCl2、10mM
スペルミジン、125mMNaCl)を1μlのNTP
−mix(10mM ATP、10mM CTP、10
mM GTP、1mM UTP、0.1μCi/μl
32P−UTP、5mM DTT、2μg/ml tR
NA、1μG/mlへパリン)および3単位のRNAポ
リメラ−ゼと混合した。培養を37℃において10分間
継続した。このRNAを−20℃において96%エタノ
−ル中の2%酢酸カリウム液60μlを添加して沈殿さ
せ、8%ポリアクリルアミド配列決定ゲルにおける電気
泳動法によって分析した。RNA転写物をオ−トラジオ
グラフィ−で可視化した。使用したプラスミドは以下の
通りであった:レ−ン1から5まで;pA10KS(A
10標的は、転写された鎖の上に位置する)。レ−ン6
から10まで:pT10KS(A10標的は、転写され
ていない鎖の上に位置する)。このプラスミドは、実験
に先だって以下の制限酵素で処理した:レ−ン1,4,
6および9:PvuII;レ−ン2、5、7および1
0:Xha I;レ−ン3および8:BamII。レ−
ン4、5、9および10の試料は、PNAを含有してい
たが、その他は、含有していなかった。PNAT10をプ
ラスミドの転写された鎖に結合した場合、RNAの転写
は、PNA結合部位において阻止されることが、ゲルか
ら認めることが出来る。このPNAをプラスミドの転写
されていない鎖に結合すると、転写は阻止されないので
ある。
例67を参照)1mgを以下の32P−5’−末端標識し
たオリゴヌクレオチドの50cpsと共に20℃におい
て16時間培養した: 1:5’−GAT CCG GCA AAT CGG
CAA TAC GGCATA ACG GCT AA
A CGT CTT TAC GGCTTA
TCG GCT ATT CGG CAT TTC G
GCAAT TCG、 2:5’−GAT CCG GCT TAA CGG
CAA TTC GCTTAT ACG GCA TA
T CGG CTA ATC GGCATT
ACG GCT TTT CGG G、 3:5’−GAC AAA CAT ACA ATT
TCA ACA GAACCA AAA AAA AA
A AAA A、 4:5’−ACT GAC TAC CTA GGT
TTA CCG TGCCAG TCA 5:5’−GAA ACG GAT AGC TGC
A このセファロ−スを遠心分離して単離し、TEで三回洗
浄した。オリゴヌクレオチドを次に温度を上げつつ50
0μlのTEで洗浄して、除去し、1mlのエタノ−
ル、2%酢酸カリウムで沈殿させ、TBE緩衝液中20
%ポリアクリルアミド、7M尿素ゲルにおける電気泳動
法で分析し、オ−トラジオグラフィ−(−70℃、16
時間、増幅スクリ−ン)で検出した。結果を第26図に
示す。
ないオリゴヌクレオチド レ−ン2:40℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド レ−ン3:60℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド レ−ン4:80℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド
である。80℃までの温度において洗浄すると、相補的
プラスミドのみがPNA−セファロ−ズ上に保持される
ことが、理解することできる。この実施例によって、P
NAを用いたアフィニティ捕捉法によって混合物から一
つのオリゴヌクレオチドを抽出出来ることが証明され
る。
ついての定量的検定 50mMTris−HCl、1mMEDTA、pH7.
4の10μl中で以下に示したそれぞれの制限酵素によ
って消化した3μgのプラスミドDNAを125I−PN
A−T10−Tyr5000cpm(10ng)と以下に
おいて全PNA量として表示した量の冷PNAT10Ty
rと共に37℃において培養した。DNAを25μlの
エタノ−ル、2%酢酸ナトリウムで沈殿させ、TBE緩
衝液中6%ポリアクリルアミドにおける電気泳動法によ
って分析した。このゲルを臭化エチジウムで染色し、そ
の後オ−トラジオグラフィ−に供した(−70℃、16
時間、増幅スクリ−ン)。得られた結果を第28図に示
す。”A”は、エチジウム染色ゲルであり、”b”は、
相当するオ−トラジオグラムである。使用したプラスミ
ドは、以下の通りであった: レ−ン1から3まで:pT10 + HaeIII レ−ン4から6まで:pT10 + Hinfl レ−ン7から9まで:pT10 + PvuII。 それぞれの試料中のPNA−T10−Tyrの全量は、以
下の通りであった: レ−ン1、4および7: 10ng; レ−ン2、5および8: 25ng; レ−ン3、6および9: 250ng; 臭化エチジウムゲル(a)は、生成したDNAフラグメ
ント(DNA−PNAハイブリッドを含む)の大きさを
示す。オ−トラジオグラフ(b)は、ゲル(a)中の何
れのバンドがPNAを含有しているかを示す。鎖置換複
合体の存在は、レ−ン1において認めることが出来る
が、レ−ン2および3において冷PNAの比率を増大さ
せることによってこのバンドの強度に及ぼす影響を認め
ることが出来る。同様の結果がレ−ン4から6までおよ
びレ−ン7から9までにおいて他の二つのプラスミドの
それぞれについて認められる。それぞれの場合における
PNA−DNAバンドの位置は、プラスミドを同定する
ために用いられ、またその強度は、存在するプラスミド
の量を定量化するために用いることが出来る。当業者
は、本発明の好ましい実施態様について多くの変更およ
び修正を行い得ることおよびかかる変更および修正は、
本発明の精神から逸脱することなく行い得ることを理解
するであろう。従って、添付する請求の範囲は、本発明
の真の精神および範囲に含まれる全ての等価の変更を包
含することが意図される。
本発明のペプチド核酸(PNA)(B)を示す。
基およびリポ−タ−基を示す。
(a)Acr1−(Taeg)10−Lys−NH2(Ac
rT10Lys−NH2)による光開裂;Acr 1−(Ta
eg)10−Lys−NH2のジアゾ−結合アクリジンに
よるフォトフットプリントおよび好ましいKMnO4−
開裂;および(c)S1−ヌクレア−ゼで増進せしめら
れた開裂と(d)Acr1−(Taeg)10−Lys−
NH2結合部位のミクロコッカスヌクレア−ゼによる開
裂。
す。
cr1−(Taeg)10−Lys−NH2を示す。
ある。
る。
相PNA合成の一般的概略図である。
である:(A)HF−開列後の粗製H−[Taeg]15
−Lys−NH2(凍結乾燥前);(B)HF開裂後の
粗製Acr1−[Taeg]15−Lys−NH2(凍結乾
燥前);および(C)精製Acr1−[Taeg]15−
Lys−NH2・緩衝液A、5%CH3CN/95% H
2O/0.0445%TFA;緩衝液B、60%CH3C
N/40%H2O/0.0390%TFA;直線勾配、
30分でBが0−100%;流量、 1.2ml/分;
カラム、Vydac C18 (5μm、0.46 x
25cm)。
すなわち、(A)精製H−[Taeg]10−Lys−N
H2および(B)H−[Taeg]5−Caeg−[Ta
eg]4−Lys−NH2−第9図におけると同一条件を
使用。
−LysのdA10・5’−32Pで標識したオリゴヌクレ
オチドへの結合を示す;(1)(5’−GATCCA10
G)をAcrT10−Lysの存在下または不存在下およ
びオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養し
た。(2)(5’−GATCCA10G)および試料を”
自然の条件”下(第11a図)または”変性条件”下
(第11b図)でポリアクリルアミドゲル電気泳動法
(PAGE)およびオ−トラジオグラフィ−によって分
析した。
−Lys−NH2錯体についての化学的、光化学的およ
び酵素的プロ−ビングを示す。dsDNA−AcrT10
−Lys−NH2とdA10/dT10標識配列を含む32P
−end標識化DNAフラグメントとの間の錯体を、ア
フィニティ−光開裂(第12a図、レ−ン1−3;第1
2b図、レ−ン1−3)、過マンガン酸塩プロ−ビング
(第12b図、レ−ン4−6)またはStaphylo
coccusヌクレア−ゼによるプロ−ビング(第12
b図、レ−ン8−10)もしくはヌクレア−ゼS1によ
るプロ−ビング(第12c図)によってプロ−ブした。
A鎖(第12a図)またはT鎖(第12b図、第12c
図)をプロ−ブした。
法を示す。
法を示す。
ンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
ミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプ
ロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
−アラニン類縁体を合成する手法を示す。
2が、高い配列特異性をもって二本鎖DNAに結合する
ことを実証するPAGEラジオオ−トグラフを示す。
の異なるPNA類の熱安定性を示すPAGEオ−トラジ
オグラフのデンシトメ−タ−走査に基づくグラフであ
る。
た、長さの異なるPNAの熱安定性を示す、PAGEオ
ートラジオグラフのデンシトメトリ走査に基くグラフで
ある。
限酵素認識部位の近位に結合させた場合抑制されること
を実証する電気泳動ゲル染色を示す。
10オリゴヌクレオチドに結合することを実証するPAG
Eオ−トラジオグラフを示す。
NAとマッチするまたは塩基一つがミスマッチしたオリ
ゴ−DNA類との間で異なる温度において実現される結
合の百分率を示す。
NAポリメラ−ゼ転写抑制を示すオ−トラジオグラフで
ある。
的である固定化されたDNAに捕捉されかつ異なる温度
において洗浄された標識化プラスミドdsDNA類の混
合物のオ−トラジオグラフである。
ラスミドdsDNAの定量を実証する臭化エチジウムゲ
ルとそのオ−トラジオグラフとを組合せたものである。
Claims (39)
- 【請求項1】 ポリアミド主鎖上において4乃至8つの
介在原子でそれぞれ分離されたアザ原子上にリガンドと
して天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基
結合基を結合して有する、下記一般式を有するペプチド
核酸(PNA)であって、一つまたはそれ以上の化学的
または微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検
出、同定または定量化を行うために使用される核酸類縁
体: 【化学式I】 但し上式において:nは、少なくとも2である;L1−L
nのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキシ、(C1−C
4)アルカノイル、天然の核酸塩基類、非天然の核酸塩
基類、芳香族原子残基、DNA挿入基、核酸塩基結合基
およびリポ−タリガンドから構成される群から選択され
るが、L 1−Lnの内の少なくとも一つは、天然の核酸塩
基、非天然の核酸塩基、DNA挿入基または核酸塩基結
合基である;A1−Anのそれぞれは、一重結合、メチレ
ン基または下記式で表される基である: 【化学式IIa】 又は 【化学式IIb】 但し本式において;Xは、O、S、Se、NR3、CH2
またはC(CH3)2である;Yは、一重結合、O、Sま
たはNR4である;pおよびqのそれぞれは、1から5
までの整数であり、p+qの和は、10以下である;r
およびsのそれぞれは、ゼロまたは1から5までの整数
であり、r+sの和は、10以下である;R1およびR2
はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコ
キシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい(C
1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル
チオ、アミノおよびハロゲンから構成される群から選択
される;またR3およびR4のそれぞれは独立して、水
素、(C1−C4)アルキル、ヒドロキシもしくはアルコ
キシもしくはアルキルチオで置換された(C1−C4)ア
ルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよび
アミノから構成される群から選択される;B1−Bnのそ
れぞれは、NまたはR3N+であり、ここにおいてR3は
上記において定義された通りである;C1−Cnのそれぞ
れは、CR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2
であり、ここにおいてR6は、水素でありまたR7は、天
然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択
され、またはR6およびR7は独立して、水素、(C2−
C6)アルキル、アリ−ル、アラルキル、ヘテロアリ−
ル、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキシ、(C1−
C6)アルキルチオ、NR3R4およびSR5から構成され
る群から選択されるが、ここにおいてR3およびR4は、
上記において定義された通りであり、R5は、水素、
(C1−C6)アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシ
もしくはアルキルチオで置換された(C1−C6)アルキ
ルであり、またはR6およびR7とは一緒になって、脂環
系または異項環系を形成する;D1−Dnのそれぞれは、
CR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7であ
り、ここにおいてR6およびR7は、上記において定義さ
れた通りである;G1−Gn-1のそれぞれは、いずれかの
方向での−CONR3−、CSNR3−、−SONR3−
または−SO2NR3−であって、なおここにおいてR3
は、上記において定義した通りである;Qは、−CO2
H、−CONR'R"、−SO3Hもしくは−SO2NR'
R"または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体
である;またIは、−NHR"'R""または−NR"'C
(O)R""であり、ここ においてR'、R"、R'"およ
びR""は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、リ
ポ−タリガンド、挿入基、キレ−ト化剤、ペプチド、タ
ンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレ
オチドならびに可溶および不溶のポリマ−から構成され
る群から選択されるものであって、何れも一つの検出可
能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめら
れたものである。 - 【請求項2】一つまたはそれ以上の化学的または微生物
学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定また
は定量化を行うために使用する核酸類縁体において、該
核酸類縁体が、相補的配列を有する核酸にハイブリダイ
ゼーションして、かくして前記類縁体に相当する従来公
知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成
されるハイブリッドよりも熱による変性に対して安定性
がより高いハイブリッドを形成する能力を有する、請求
項1において記載された核酸類縁体。 - 【請求項3】一つまたはそれ以上の化学的または微生物
学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定また
は定量化を行うために使用する核酸類縁体において、該
核酸類縁体が、一本鎖が前記類縁体に相補的である配列
を有する二重鎖核酸にハイブリダイゼーションして、か
くして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換せしめる能力
を有するものである、請求項1において記載された核酸
類縁体。 - 【請求項4】下の一般式を有する核酸類縁体を含んで成
る、請求の範囲第1項において記載された、標識化され
た核酸類縁体: 【化学式I】 但し上式において:A1−Anのそれぞれは、一重結合ま
たは下記式で表される基である: 【化学式IIa】 又は 【化学式IIb】 但し本式において;n、L1乃至Lnのそれぞれ、X、
Y、p、q、r及びsは、請求項1において定義した通
りである、R1およびR2はそれぞれ独立して、水素、ヒ
ドロキシもしくはアルコキシで置換されていてもよい
(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミ
ノおよびハロゲンから構成される群から選択される;ま
たR3およびR4のそれぞれは独立して、水素、(C1−
C4)アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシで置換
された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ
およびアミノから構成される群から選択される;B1−
Bnのそれぞれは、NまたはR3N+であり、ここにおい
てR3は、上記において定義された通りである;C1−C
nのそれぞれは、CR6R7、CHR6CHR7またはCH
R6R7CH2であり、ここにおいて、R6は水素であり、
またR7は、天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成さ
れる群から選択され、またはR6およびR7は独立して、
水素、(C2−C6)アルキル、アリ−ル、アラルキル、
ヘテロアリ−ル、ヒドロキシ、メトキシNR3R4および
SR5から構成される群から選択されるが、ここにおい
てR3およびR4は、上記において定義された通りであ
り、またR5は、水素、(C1−C6)アルキル、ヒドロ
キシもしくはアルコキシで置換された(C1−C6)アル
キルであり、またはR6およびR7とは一緒になって、脂
環系または異項環系を形成する;D1−Dnのそれぞれ
は、CH2R6R7またはCHR6CHR7であり、ここに
おいてR6およびR7は、上記において定義された通りで
ある;G1−Gn-1のそれぞれは、請求項1において定義
された通りであり、何れも一つの検出可能な標識を含ん
で成るか又は該標識に共役複合せしめられたものであ
る。 - 【請求項5】以下の一般式を有する核酸類縁体を含んで
成る、請求項2において記載された核酸類縁体: 【化学式III】 但し本式において:Lはそれぞれ独立して、水素、フェ
ニル、天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から構成
される群から選択される;R7'は、水素および天然のア
ルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択され
る;nは、1から60までの整数である;kおよびmの
それぞれは独立して、ゼロまたは1である;またlは独
立して、ゼロから5である;Rhは、OH、NH2または
−NHLysNH2である;およびRiは、HまたはCO
CH3であって、何れも一つの検出可能な標識を含んで
成るか又は該標識に共役複合せしめられたものである。 - 【請求項6】以下の一般式を有する核酸類縁体を含んで
成る、請求項3において記載された核酸類縁体: 【化学式IX】 但し本式において:L,R7'、RhおよびRi並びにn
は、請求項3において定義された通りであり、何れも一
つの検出可能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複
合せしめられたものである。 - 【請求項7】請求項6において記載された、標識化され
た核酸類縁体において:Lがそれぞれ、核酸塩基である
チミン、アデニン、シトシン、グアニン及びウラシルか
ら構成される群から選択される;R7'は、水素である;
またnは、1乃至30の整数である、前記核酸類縁体。 - 【請求項8】標識が、放射性同位元素標識、酵素標識、
ビオチン、発蛍光団、化学発光標識、抗原、抗体または
スピン標識である、前記請求項の内の何れか一項におい
て記載された核酸類縁体。 - 【請求項9】前記リガンドが、チミン及び/又はシトシ
ンである、請求項1乃至8の内の何れか一項において記
載された核酸類縁体。 - 【請求項10】ポリアミド主鎖上において4つ乃至8つ介
在原子でそれぞれ分離されたアザ原子上にリガンドとし
て天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基結
合基を結合して有する、下記一般式で表されるペプチド
核酸(PNA)を、一つまたはそれ以上の化学的または
微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同
定または定量化を行うために使用する方法: 【化学式I】 但し上式において:nは、少なくとも2である、 L1−Lnのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキシ、
(C1−C4)アルカノイル、天然の核酸塩基類、非天然
の核酸塩基類、芳香族原子残基、DNA挿入基、核酸塩
基結合基およびリポ−タリガンドから構成される群から
選択されるが、L 1−Lnの内の少なくとも一つは、天然
の核酸塩基、非天然の核酸塩基、DNA挿入基または核
酸塩基結合基である;A1−Anのそれぞれは、一重結
合、メチレン基または下記式で表される基である: 【化学式IIa】 又は 【化学式IIb】 但し本式において;Xは、O、S、Se、NR3、CH2
またはC(CH3)2である;Yは、一重結合、O、Sま
たはNR4である;pおよびqのそれぞれは、1から5
までの整数であり、p+qの和は、10以下である;r
およびsのそれぞれは、ゼロまたは1から5までの整数
であり、r+sの和は、10以下である;R1およびR2
はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコ
キシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい(C
1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル
チオ、アミノおよびハロゲンから構成される群から選択
される;またR3およびR4のそれぞれは独立して、水
素、(C1−C4)アルキル、ヒドロキシもしくはアルコ
キシもしくはアルキルチオで置換された(C1−C4)ア
ルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよび
アミノから構成される群から選択される;B1−Bnのそ
れぞれは、NまたはR3N+であり、ここにおいてR3は
上記において定義された通りである;C1−Cnのそれぞ
れは、CR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2
であり、ここにおいてR6は、水素でありまたR7は、天
然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択
され、またはR6およびR7は独立して、水素、(C2−
C6)アルキル、アリ−ル、アラルキル、ヘテロアリ−
ル、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキシ、(C1−
C6)アルキルチオ、NR3R4およびSR5から構成され
る群から選択されるが、ここにおいてR3およびR4は、
上記において定義された通りであり、R5は、水素、
(C1−C6)アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシ
もしくはアルキルチオで置換された(C1−C6)アルキ
ルであり、またはR6およびR7とは一緒になって、脂環
系または異項環系を形成する;D1−Dnのそれぞれは、
CR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7であ
り、ここにおいてR6およびR7は、上記において定義さ
れた通りである;G1−Gn-1のそれぞれは、いずれかの
方向での−CONR3−、CSNR3−、−SONR3−
または−SO2NR3−であって、なおここにおいてR3
は、上記において定義した通りである;Qは、−CO2
H、−CONR'R"、−SO3Hもしくは−SO2NR'
R"または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体
である;またIは、−NHR"'R""または−NR"'C
(O)R""であり、ここ においてR'、R"、R'"およ
びR""は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、リ
ポ−タリガンド、挿入基、キレ−ト化剤、ペプチド、タ
ンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレ
オチドならびに可溶および不溶のポリマ−から構成され
る群から選択されるものであって、何れも一つの検出可
能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめら
れたものである。 - 【請求項11】相補的配列を有する核酸にハイブリダイ
ゼーションして、かくして前記類縁体に相当する従来公
知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成
されるハイブリッドよりも熱による変性に対して安定性
がより高いハイブリッドを形成する能力を有する、請求
項1において記載された核酸類縁体を、一つまたはそれ
以上の化学的または微生物学的個体単位についてその捕
捉、認識、検出、同定または定量化を行うために使用す
る方法。 - 【請求項12】一本鎖が核酸類縁体に相補的である配列
を有する二重鎖核酸にハイブリダイゼーションして、か
くして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換せしめる能力
を有する、請求項1において記載された核酸類縁体を、
一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位
についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化を行
うために使用する方法。 - 【請求項13】 該核酸類縁体が、以下の一般式を有す
るものである、請求項10乃至12の内の何れか一項に
おいて記載された核酸類縁体を使用する方法: 【化学式I】 なお上式において:A1−Anのそれぞれは、一重結合ま
たは下記式で表される基である: 【化学式IIa】 又は 【化学式IIb】 但し本式において;n、L1乃至Lnのそれぞれ、X、
Y、p、q、r及びsは、請求項1において定義した通
りである、R1およびR2はそれぞれ独立して、水素、ヒ
ドロキシもしくはアルコキシで置換されていてもよい
(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミ
ノおよびハロゲンから構成される群から選択される;ま
たR3およびR4のそれぞれは独立して、水素、(C1−
C4)アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシで置換
された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ
およびアミノから構成される群から選択される;B1−
Bnのそれぞれは、NまたはR3N+であり、ここにおい
てR3は、上記において定義された通りである;C1−C
nのそれぞれは、CR6R7、CHR6CHR7またはCH
R6R7CH2であり、ここにおいて、R6は水素であり、
またR7は、天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成さ
れる群から選択され、またはR6およびR7は独立して、
水素、(C2−C6)アルキル、アリ−ル、アラルキル、
ヘテロアリ−ル、ヒドロキシ、メトキシNR3R4および
SR5から構成される群から選択されるが、ここにおい
てR3およびR4は、上記において定義された通りであ
り、またR5は、水素、(C1−C6)アルキル、ヒドロ
キシもしくはアルコキシで置換された(C1−C6)アル
キルであり、またはR6およびR7とは一緒になって、脂
環系または異項環系を形成する;D1−Dnのそれぞれ
は、CH2R6R7またはCHR6CHR7であり、ここに
おいてR6およびR7は、上記において定義された通りで
ある;G1−Gn-1のそれぞれは、請求項1において定義
された通りであり、何れも一つの検出可能な標識を含ん
で成るか又は該標識に共役複合せしめられたものであ
る。 - 【請求項14】該核酸類縁体が、以下の一般式を有する
ものである、請求項10において記載された核酸類縁体
を使用する方法: 【化学式III】 Lはそれぞれ独立して、水素、フェニル、天然の核酸塩
基および非天然の核酸塩基から成る群から選択される;
R7'はそれぞれ独立して、水素および天然のアルファア
ミノ酸の側鎖から成る群から選択される;nは、1から
60までの整数である;kおよびmのそれぞれは独立し
て、ゼロまたは1である;lは、ゼロから5である;R
hは、OH、NH2または−NHLysNH2である;お
よびRiは、HまたはCOCH3である。 - 【請求項15】該核酸類縁体が、以下の一般式を有する
ものである、請求項14において記載された核酸類縁体
を使用する方法: 【化学式IX】 なお上式において:L,R7',Rh、Riおよびnは、請
求項15において定義された通りである。 - 【請求項16】請求項15において記載された使用方法
において、 Lがそれぞれ、核酸塩基であるチミン、アデニン、シト
シン、グアニン及びウラシルから構成される群から選択
される;R7'は、水素である;およびnは、1乃至30
の整数である、前記使用方法。 - 【請求項17】リガンドが、チミン及び/又はシトシン
である、請求項10、11又は請求項12乃至16の内
の何れか一項において記載された核酸類縁体を使用する
方法。 - 【請求項18】該核酸類縁体が、一つの検出可能な標識
を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめられたもの
である、請求項10乃至17の内の何れか一項において
記載された核酸類縁体を使用する方法。 - 【請求項19】前記標識が、放射性同位元素標識、酵素
標識、ビオチン、発蛍光団、化学発光標識、抗原、抗体
またはスピン標識である、請求項18において記載され
た核酸類縁体を使用する方法。 - 【請求項20】核酸を捕捉する方法において、固体支持
体に固定化した、請求項10乃至19の内の何れか一項
において記載された核酸類縁体にハイブリッド形成条件
下において前記核酸を接触させるに際して、該核酸類縁
体が、前記核酸とハイブリダイゼーションするに適した
リガンドの配列を有するものである、核酸を捕捉する前
記方法。 - 【請求項21】捕捉された前記核酸が、前記固定化され
た核酸類縁体に結合された状態にある核酸認識薬剤で処
理することによって検出され、認識され、定量化されま
たは同定される、請求項20において記載された方法。 - 【請求項22】捕捉された該核酸が、前記固定化された
核酸類縁体にハイブリダイゼーションされた第一の領域
およびそのようにハイブリダイゼーションされていない
第二の領域であって、該第二の領域の少なくとも一部に
ハイブリダイゼーションするように適合せしめられてい
る標識核酸または核酸類縁体で処理された第二の領域を
有しているものである、請求項21において記載された
方法。 - 【請求項23】前記固定化された核酸類縁体が、加水分
解してmRNAのポリA尾部とハイブリダイゼーション
して、その結果前記mRNAを捕捉することが可能であ
る逐次リガンドを含んで成るものである、請求項20に
おいて記載された、mRNAを捕捉する方法。 - 【請求項24】前記逐次リガンドがチミンである、請求
項20において記載された方法。 - 【請求項25】一旦捕捉された前記核酸が、固定化され
た核酸類縁体と捕捉された核酸とを脱ハイブリダイゼー
ションする条件に供することによって該固定化核酸類縁
体から開放・放出される、請求項20、23又は24の
内の何れか一項において記載された方法。 - 【請求項26】固体支持体に固定化された、請求項10
乃至19の内の何れか一項において記載された核酸類縁
体。 - 【請求項27】アフィニティ捕捉カラムに導入された、
請求項26において記載された、固定化された核酸類縁
体。 - 【請求項28】ハイブリダイゼーションする条件下にお
いてハイブリダイゼーションするに充分に相補的な配列
を有する、請求項1乃至9の内の何れか一項において記
載された核酸類縁体に標的をハイブリダイゼーションさ
せ、かつ前記標的にハイブリダイゼーションさせた該核
酸類縁体の前記標識を検出するかまたは定量化すること
から成る、標的核酸を認識、検出または定量化する方
法。 - 【請求項29】前記標的核酸が、前記ハイブリダイゼー
ションに先だって支持体に固定化される、請求項28に
おいて記載された方法。 - 【請求項30】前記標的核酸が、前記支持体に固定化さ
れるに際して、その第一の領域を、捕捉された核酸また
は核酸類縁体であって、前記第一の領域に対してハイブ
リダイゼーションするに充分に相補的である配列を有し
かつそれ自体が前記支持体に固定化されている該捕捉核
酸または核酸類縁体にハイブリダイゼーションさせ、か
つ前記標識された核酸類縁体が、前記標的の第二の領域
にハイブリダイゼーションする、請求項29において記
載された方法。 - 【請求項31】核酸二重ラセンから一本鎖を置換する方
法において、前記二重ラセンに対して、前記核酸のもう
一方の鎖に対するアフィニティ−が前記一本鎖を置換す
ることが可能であるほどに充分である核酸類類縁体をハ
イブリダイゼーションさせることから成る前記置換方
法。 - 【請求項32】二本鎖標的核酸を検出し、同定しまたは
定量化する方法において、置換されない鎖が、置換核酸
類縁体に相補的な配列を有する二本鎖標的から一本鎖を
置換することができる置換核酸類縁体を該標的核酸にハ
イブリダイゼーションさせーなおその際、前記置換核酸
類縁体の配列が、自らにハイブリダイゼーションするに
充分に相補的あって、その結果、一本鎖の形態において
前記標的の一本鎖を置換するものであるー、その後に前
記置換された一本鎖を存在を検出するかまたは定量化す
ることから成る、前記検出、同定または定量化する方
法。 - 【請求項33】置換された鎖をフラグメントに切断しか
つ前記フラグメントの存在を検出する、請求項32にお
いて記載された方法。 - 【請求項34】前記置換された鎖が、ヌクレア−ゼの攻
撃によって切断される、請求項32において記載された
方法。 - 【請求項35】オリゴヌクレオチド類縁体をある特異的
核酸を検出するか又は単離するために使用する方法にお
いて、該オリゴヌクレオチド類縁体が、その相補的な一
本鎖DNA又はRNA鎖に対して相当するDNA又はR
NAよりもより強力に結合するものである前記方法。 - 【請求項36】請求項1乃至9の内の何れか一項におい
て記載された少なくとも一つの標識化された核酸類縁体
および前記標識化された核酸類縁体を検出する少なくと
も一つの検出試薬とを含んで成る、診断方法において使
用されるキット。 - 【請求項37】請求項10乃至16の内の何れか一項に
おいて記載された核酸類縁体を更に固体支持体に固定化
して成る、請求項36において記載されたキット。 - 【請求項38】請求項26において記載された、固定化
された核酸類縁体を、前記核酸類縁体を使用して捕捉さ
れた核酸の存在を検出する少なくとも一つの核酸認識薬
剤とを組合せて含んで成るキット。 - 【請求項39】該核酸認識薬剤が、標識化された核酸ま
たは標識化された核酸類縁体である、請求項38におい
て記載されたキット。
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