JPH02156895A - 好塩菌による５’‐ヌクレオチド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は好塩菌による５′−ヌクレオチド類の製造法に
関するものであって、さらに詳しくは５′−ヌクレオチ
ド類の過度な酵素分解を抑制して効果的に５２−ヌクレ
オチド類を製造する方法に係る。

［従来の技術］ ５′−リボヌクレオチド類が調味料あるいは医薬原料と
して有用な化合物である。５′−リボヌクレオチド類の
製造法としては、５′−フォスフオシエステラーゼを単
独に、あるいはこれと５′−アデニル酸デアミナーゼを
併用してリボ核酸に作用させる方法が公知である。この
方法によれば、５′−アデニル酸、５′−グアニル酸、
５′シチジル酸、５′−ウリジル酸などで例示される５
′−リボヌクレオチド類を得ることができ、５′−アデ
ニル酸デアミナーゼを併用した場合は、さらに５′−イ
ノシン酸を得ることができる（特公昭３６−４９７７号
、同３６−５２８７号、同３６−１６６３０号の各公報
参照）。

一方、中度好塩性菌であるミクロコツカスパリアンスサ
ブスピーシーズハロフィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
　ｖａｒｉａｎｓ　５ｕｂｓｐ、　ｈａｌｏｐｈｉｌｕ
ｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）は、菌体外に好塩性酵素ヌ
クレアーゼを生成し、この酵素はエキソ型分解でリボ核
酸を末端から逐次分解して５′−ヌクレオチド類を生成
させる。また、この菌は培地中に適量の無機燐酸とＭ　
ｇ２＋又はＣａ”イオンを添加して培養すると、菌体の
フロックを形成し、そのフロック表面に培養中に生成さ
れた好塩性酵素が吸着されるため、フロック自体が一種
の固定化酵素となることが知られている。従って、培養
液中の好塩性ヌクレアーゼを吸着したフロックを用いて
リボ核酸を分解させることにより、５′−リボヌクレオ
チドの生産が可能である。

しかしながら、この菌は好塩性酵素ヌクレアーゼ以外に
、５″−ヌクレオチド類を分解してヌクレオシド類を生
成する酵素５′−ヌクレオチダーゼも生成する。このた
め、前記の菌体フロックを作用させてリボ核酸の分解に
より５′−ヌクレオチド類を生産する場合には、フロッ
ク中に共存する５′−ヌクレオチダーゼによって５ｔ−
ヌクレオチド類が分解されてしまう関係で、効率的に５
′−ヌクレオチド類を生産できない欠点があった。

こうした欠点の解消方法の一つとして、特開昭６３−１
６９９９２号公報には５′＝ヌクレオチダーゼの活性を
、Ｚｎ２＋イオンの添加によって抑制することが提案さ
れている。しかし、亜鉛は有害な重金属であるので、食
品添加物などに使用される５′−ヌクレオチド類を製造
するに際しては、この方法を推奨することができない。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的の一つは、なんら有害金属を使用すること
なく、好塩性酵素ヌクレアーゼと共存する５′−ヌクレ
オチダーゼの酵素活性を抑制して、好塩性細菌ミクロコ
ツカスパリアンスサブスピーシーズハロフィラスを利用
するリボ核酸の酵素分解によって、５′−ヌクレオチド
類を効率的に製造する方法を提供することにある。そし
て、本発明の別の目的は、他の微生物によるコンタミネ
ーションを懸念せずに、リボ核酸から５′−ヌクレオチ
ド類を製造できる方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、中度好塩菌ミクロコツカスパリアンスサ
ブスピーシーズハロフィラスが生産する好塩性酵素のな
かにあって、５′−ヌクレオチダーゼの活性のみを選択
的に抑制する活性抑制剤について、数多くの実験研究を
重ねた結果、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が所
期の活性抑制作用を備えていることを見出した。

従って、本発明は中度好塩菌ミクロコツカスパリアンス
サブスピーシーズハロフィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｖａｒｉａｎｓ　５ｕｂｓｐ、　ｈａｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）が生産する好塩性酵素系
を利用してリボ核酸の酵素分解反応により５′−ヌクレ
オチド類を製造する方法に於いて、反応系内に０．２５
ｍＭ以上のエチレンジアミン四酢酸又はその塩が存在す
る条件下に、リボ核酸の酵素分解反応を行わせることを
特徴とする。

［作　　　用］ 既述した通り、ミクロコツカスパリアンスサブスピーシ
ーズハロフィラスが生産する好塩性酵素のなかにあって
、ヌクレアーゼはリボ核酸を末端から逐次分解して５′
−ヌクレオチド類を生成させるが、５′−ヌクレオチダ
ーゼはその５″−ヌクレオチド類を分解する。然るに、
本発明で使用するエチレンジアミン四酢酸またはその塩
は、ヌクレアーゼの酵素活性を実質的に損なうことなく
、５′−ヌクレオチダーゼの酵素活性を選択的に抑制す
る活性抑制剤として機能する。

従って、ミクロコツカスパリアンスサブスピーシーズハ
ロフィラスが生産する好塩性酵素系にてリボ核酸を分解
し、５′−ヌクレオチド類を製造するに際し、その分解
反応系に適当量のエチレンジアミン四酢酸又はその塩を
存在させれば、この活性抑制剤によって５′−ヌクレオ
チダーゼによる５′−ヌクレオチド類の分解が抑制され
るため、５′−ヌクレオチド類を効率良く製造すること
ができるのである。

本発明に於いて、５′−ヌクレオチダーゼの酵素活性を
事実上阻害するためには、リボ核酸を酵素的に分解する
反応系に、少なくとも０．２５ｍＭのエチレンジアミン
四酢酸又はその塩が存在することを必要とするが、その
上限は約１０１以下とすることが好ましく、それ以上の
添加はヌクレアーゼの活性まで抑制してしまう不都合が
ある（第１図参照）。そして、本発明で使用可能なエチ
レンジアミン四酢酸塩としては、アンモニウム塩、カリ
ウム塩、ナトリウム塩などを挙げることができる。

［実　施　例］ 以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例では説明の便宜上、中度好塩菌ミクロコツカスパ
リアンスサブスピーシーズハロフィラスが生産する好塩
性酵素を菌体から分離して使用しているが、菌体を分離
させず、既述したようなフロック体酵素をリボ核酸に作
用させる場合にも、本発明の方法が適用できることに留
意すべきである。

実施例１　（ＥＤＴＡの活性抑制評価〕ＮａＣ１３モル
、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）　１　、０％、酵母エキス
（Ｄｉｆｃｏ）１．０％からなる培地（ｐＨ＝７．０）
で、中度好塩菌ミクロコツカスパリアンスサブスピーシ
ーズハロフィラスをＰ、３０°Ｃで４日間培養後、培養
液を５°Ｃで１０分間遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ）
　シて菌体を沈澱させ、好塩性ヌクレアーゼ及び好塩性
５′−ヌクレオチダーゼが共存する上澄み液を得た。こ
の上澄み液を使用して好塩性ヌクレアーゼ及び好塩性５
′−ヌクレオチダーゼの酵素活性に及ぼすエチレンジア
ミン四酢酸の影響を調査した。その結果を第１図に示す
。

ここで、ヌクレアーゼの活性測定は、０　、４　ｍＱの
リボ核酸（Ｓｉｇｍａ　ｔｙｐｅ　ＸＩ、Ｌ２５ｍＨ／
Ｑ）、０　、４　ｍＱの０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（４Ｍ　ＮａＣ１含有、ｐＨ＝８．０）、０．１ｍ
Ｑの２０％ＭｇＳＯ４・７Ｈ□Ｏ溶液及び０　、１　ｍ
（ｌの各種濃度のＥＤＴＡ溶液からなる反応液１　ｍＱ
、に、上記の酵素含有上澄み液０．１ｍｆｌを添加し、
４０℃で２時間反応させた後、これに３＋＋＋Ｑの９９
．５％エタノールを加え、氷水中で１５分間静置し、そ
の後、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた
上澄み液の吸光度を、２６０ｎｍで測定する方法で行い
、ＥＤＴＡ無添加の場合の吸光度を酵素活性１００とし
た場合の相対活性を求めた。尚、ヌクレアーゼ活性の１
単位（Ｕ）は、上記の条件で吸光度を１だけ増加させる
のに必要な酵素量である。

一方、５′−ヌクレオチダーゼの活性測定は、０．０５
ｕＱの５２−アデニル酸（２０ｍｇ／ｍＱ）、　０．８
ｍ１２の０、ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｌｆｉ衝液（４Ｍ
　ＮａＣ１含有、　ｐｕ＝ｇ、ｏ）、０．０５ｍｆｌの
２ｍＭ　ＣｏＣ１□溶液、０．０５ｕＱの４０％ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２０溶液及び０．０５ｕＱの各種濃度のＥＤ
ＴＡ溶液からなる反応液１−に、上記の酵素含有上澄み
液０゜１ｍＱ、を添加し、３０°Ｃで４時間反応させた
後、２ＮのＨ２ＳＯ４：　２．５％の（Ｎ）ｌ、　）ｓ
　Ｍｏ７０□、・４Ｈ２０：　１０％のアスコルビン酸
＝３　：　１　：　１（Ｖ／Ｖ）の混合液１　、１　ｍ
Ｑを添加して４０℃で９０分間反応させ、しかる後、８
２０ｎｍの吸光度を測定する方法で行い、ＥＤＴＡ無添
加の場合の吸光度を酵素活性１００とした場合の相対活
性を求めた。尚、５′−ヌクレオチダーゼ活性の１単位
（Ｕ）は、上記の条件で吸光度を１だけ増加させるのに
必要な酵素量である。

第１図に示す実験結果から明らかなように、ヌクレアー
ゼ及び５″−ヌクレオチダーゼの活性は、反応系内に添
加したＥＤＴＡの増量に伴って無添加の場合より増加す
るが、５′−ヌクレオチダーゼの活性は系内のＥＤＴＡ
濃度がほぼ０　、２５ｍＭを越えると激減する。これに
対してヌクレアーゼの活性は、系内のＥＤＴＡ濃度が約
５ｍＭを越えてもＥＤＴＡ無添加の場合に匹敵する活性
を有している。

従って、反応系内に約０．２５ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤ
ＴＡを存在させることにより、ヌクレアーゼの活性を実
質的に阻害することなく、５′−ヌクレオチダーゼの活
性を選択的に抑制できることが分かる。

実施例２〔５′−ヌクレオチド類の製造〕実施例１で得
られた酵素含有上澄み液を限外濾過膜（分画分子量１０
，０００）を用いて１０倍に濃縮した酵素液（ヌクレア
ーゼ活性＝２４８．２　Ｕ／ｍＱ、５′−ヌクレオチダ
ーゼ活性＝６６４．ＯＵ／ｍｆｌ）２０ｎ＋Ｑと、リボ
核酸溶解緩衝液［５０ｍ溝Ｔｒｉｓ−１１ｃｌ緩衝液（
１％リボ核酸、２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，２Ｍ　Ｎａ
Ｃ１゜ｐＨ＝８．０）コ２５顧及びＥＤＴＡ溶液（予め
Ｎ　ａ　ＯＨでｐＨ８，０に調製済み、２Ｍ　ＮａＣ１
含有）５ｍＱを混合し、４０℃の一定温度で７時間反応
を行った後、反応生成物を分析した。結果を第１表に示
す。

第１表 上表に示される通り、反応系にＥＤＴＡを添加すること
により、無添加の場合に比較して５′−ヌクレオチド類
の生成量を増加させ、ヌクレオシド類の生成を減少させ
ることができる。特に、５′−グアニル酸は５′−ヌク
レオチダーゼの作用で通常グアノシンまで分解されてし
まうが、本発明の方法によれば、この分解をも抑えるこ
とができる。

［発明の効果］ 中度好塩菌ミクロコツカスパリアンスサブスピーシーズ
ハロフィラスが生産する好塩性酵素系にて、リボ核酸を
分解させる場合に於いて、適当量のエチレンジアミン四
酢酸又はその塩は、５′−ヌクレオチド類の生成に寄与
する酵素ヌクレアーゼの活性を阻害することなく、５′
−ヌクレオチダーゼの活性を選択的に抑制するため、本
発明の方法に従えば、効率良く５′−ヌクレオチド類を
製造することができるばかりでなく、塩濃度の高い分解
反応条件が採用できるので、他の微生物によるコンタミ
ネーションも防止することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥＤＴＡの添加量とヌクレアーゼ及び５′−ヌ
クレオチダーゼの酵素活性との関係を示すグラフである
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、中度好塩菌ミクロコッカスバリアンスサブスピーシ
   ーズハロフイラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｖａｒｉａ
   ｎｓｓｕｂｓｐ．ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２
   １９７１）の生産する好塩性酵素系を、リボ核酸に作用
   させて酵素分解反応により５′−ヌクレオチド類を製造
   する方法に於いて、反応系内に０．２５ｍＭ以上のエチ
   レンジアミン四酢酸又はその塩が存在する条件下に、リ
   ボ核酸の酵素分解反応を行うことを特徴とする５′−ヌ
   クレオチド類の製造法。