NO313201B1

NO313201B1 - Nukleinsyreanalog, anvendelse derav, in vitro-fremgangsmåte og kit

Info

Publication number: NO313201B1
Application number: NO19934235A
Authority: NO
Inventors: Ole Buchardt; Michael Egholm; Peter Eigil Nielsen; Rolf Henrik Berg
Original assignee: Berg Rolf H
Priority date: 1991-05-24
Filing date: 1993-11-23
Publication date: 2002-08-26
Also published as: DE69232055T2; AU1884392A; CA2109320C; EP1074559B1; WO1992020702A1; DE69220946D1; AU1880692A; US20120115136A1; ATE205504T1; US5977296A; DE69232055D1; JP2007306926A; EP1074559A1; US7378485B2; EP1162206A3; EP1411063A1; HU9303023D0; FI935208A0; EP1411063B1; KR0133131B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyreanaloger for anvendelse innenfor feltet diagnostikk, blant annet for oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, identifikasjon eller kvantifisering av en eller flere kjemiske eller mikrobiologiske deler.

Oligodioksyribonukleotider (oligo-DNA) anvendes innen diagnostiske prosedyrer. Det ble blant annet anvendt for testing av tilstedeværelse av spesifikke mikroorganismer eller for testing av tilstedeværelse av generiske predisposi-sjoner, blant annet overfor sykdom, i rettsvitenskap og i mikrobiologi generelt. Anvendelser av oligo-DNA i dette området er selvfølgelig avhengig av evnen som slike oligo-DNA har til å hybridisere til komplementære nukleinsyresekvenser. Merkede oligo-DNA prober blir anvendt i hybridiserings-analyser for å probe immobilisert moll DNA for tilstedeværelse av spesifikke sekvenser. I amplifikasjonsprosedyrer blir hybridiseringsegenskapen til oligo-DNA anvendt for å hybridisere oligo-DNA primerene til templatmolekyler som skal bli amplifisert.

Oligo-DNA som har lengder på 100 basepar blir nå rutinemessig syntetisert ved anvendelse av en fasemetode og fullstendig automatiske syntesemaskiner er konversielt tilgjengelige. Muligheten av å konstruere syntetiske DNA-analoger som kan hybridisere til naturlig DNA på en sekvensspesifikk måte og som har kjemiske egenskaper som er fordelaktig forskjellig fra selve DNA, er blitt vurdert. Dette arbeidet er blitt motivert av den mulige anvendelsen av slike forbindelser "anti-sens" terapeutiske midler hvor anvendelsen av konvensjonelle oligo-DNA møter vanskeligheter på grunn av at slike umodifiserte oligonukleotider har en kort halveringstid in vivo på grunn av den naturlige tilværelsen av nukleaser, er vanskelig og dyrt å fremstille i en hvilken som helst mengde og penetrerer cellemembraner dårlig.

PCT-søknad W086/05518 beskriver DNA-analoger som har et skjelett med en sekvens av ligander, vanligvis nukleotidbaser som har evne til sekvensspesifikk hybridisering til naturlig forekommende nukleinsyrer. Et antall forskjellige skjelett-strukturer er beskrevet. Ingen spesifikk eksemplifikasjon av forutsetningene til slike forbindelser er gitt og det eksisterer ingen data som viser affiniteten til de krevde analogene for DNA.

PCT-søknad W086/05519 beskriver diagnostiske reagenser og systemer omfattende DNA-analoger av samme type men igjen eksisterer det ingen eksemplifikasjon.

PCT-søknad W086/12060 beskriver oligonukleotidanaloger basert på forskjellige byggestener som de er syntetisert ut ifra. Byggestenene er eksemplifisert, men det er ingen eksempler for fremstilling av oligonukleotidanalog fra disse og dermed ingen indikasjon på ytelsen til analogene.

Det er videre kjent å modifisere DNA-skjelettet med det mål å øke resistensen overfor nuklease og generelt forbedre egnetheten til DNA for anvendelse i anti-sens terapeutiske metoder. Andre forsøk på å konstruere DNA-analoger er beskrevet i den innledende delen av W086/05518 nevnt ovenfor.

Den vanlig erfaringen har vært at modifikasjoner av skjelettet til naturlig DNA fører til en reduksjon i stabiliteten til hybridet dannet mellom det modifiserte oligonukleotidet og dets koplimentær normale oligonukleotid, analysert ved måling av Tm verdien. Den konvensjonelle viten innenfor dette området er at modifikasjoner av skjelettet alltid destabiliserer hybridet, dvs. resulterer i lave Tm verdier og derfor bør modifikasjon være så liten som mulig for å oppnå hybrider med bare en liten reduksjon i Tm verdien som det best oppnåelige resultat.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse innen diagnostikk eller i analyse av nukleinsyreanaloger av ny struktur, fortrinnsvis med den tidligere ukjente egenskapen av å danne hybrider med komplementær sekvens konvensjonelle nukleinsyrer som er mere stabil med hensyn på Tm verdien enn det et lignende hybrid dannet av en konvensjonell nukleinsyre med tilsvarende sekvens og/eller som har større selektivitet for den komplementære sekvensen sammenlignet med sekvenser som involverer en grad av følparing enn det som vil fremkomme fra nevnte tilsvarende konvensjonelle nukleinsyre med tilsvarende sekvens.

Oppfinnelsen tilveiebringer en nukleinsyreanalog for anvendelse i oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter, kjennetegnet ved at analogen er en peptidnukleinsyre (PNA) som omfatter et polyamidskjelett som bærer en mengde ligander respektivt" i avstand beliggende langs skjelettet, nevnte ligander er hver uavhengig naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser eller nukleobasebindende grupper, hvor hver ligand er bundet direkte til, eller indirekte til, et nitrogenatom i nevnte skjelett, og nevnte ligand bærer nitrogenatomer som i hovedsak blir separert fra hverandre i nevnte skjelett ved fra 4 til 8 mellomliggende atomer, hvor nevnte analog blir inkorporert eller konjugert til et detekterbart merke.

Oppfinnelsen omfatter også en nukleinsyreanalog for anvendelse i oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter, kjennetegnet ved at analogen er en nukleinsyreanalog istand til å hybridisere til en nukleinsyre av komplementær sekvens for å danne et hybrid som er mer stabilt mot denaturering ved varme enn et hybrid mellom det konvensjonelle deoksyribonukleotid som korresponderer til nevnte analog og nevnte nukleinsyre, hvor nevnte analog er inkorporert eller blir konjugert til et detekterbart merke.

Videre omfatter oppfinnelsen nukleinsyreanalog for anvendelse i oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter, kjennetegnet ved at analogen er en nukleinsyreanalog istand til å hybridisere til en dobbelttrådet nukleinsyre hvori én tråd har en sekvens komplementær til nevnte analog, for å erstatte den andre tråden fra nevnte ene tråd, hvor nevnte analog blir inkorporert eller konjugert til et detekterbart merke.

Separering av nitrogenbærende atomer i skjelettet til nukleihsyreanalogene definert ovenfor (PNA) er fortrinnsvis med fem atomer. I nukleinsyreanalogene med formel I (nedenfor) er dette blitt vist å gi den sterkeste affiniteten for DNA. Det kan derimot i noen tilfelle være ønskelig å redusere bindingsstyrken mellom PNA og DNA ved å plassere en eller flere åv ligandene ved en mindre enn optimal avstand, f.eks. i en avstand på mer enn 5 atomer, f.eks. med opptil 14 atomer eller mer.

Det er foretrukket at ikke mer enn 25% av interligand "spacingene" vil være på 6 atomer eller mer. Det er mer foretrukket at ikke mer enn 10 til 15% av interligand "spacingene" vil være på 6 atomer eller mer. Asanitrogen-atomene vil være ligandene (direkte eller via 1inkergrupper blir selv ikke telt i "spacingene" referert til ovenfor).

En alternativ eller ytterligere metode for å redusere styrken til DNA-bindingen er å utelate visse av ligandene ved å plassere en del som bidrar lite eller ikke noe til binding av DNA, f.eks. hydrogen. Ikke mer enn 25% av lengandposisjonene vil fortrinnsvis være okkupert av ikke-bindende deler, f.eks. ikke mer enn 10 til 15%.

Representativ ligander omfatter enten de 4 viktigste naturlig forekommende DNA-basene (dvs. thymin, cytozin, adenin eller guanin) eller andre naturlige forekommende nukleobaser (f.eks. inosin, urasil, 5-metylcytozin eller tiourasil ) eller kunstige baser (f.eks. bromurasil, asaadeniner eller asaguaniner osv.) koblet til et peptidskjelett gjennom en egnet linker.

I foretrukne utførelsesformer har nukleinsyreanalogene anvendt i oppfinnelsen den generelle formelen (I):

hvor:

n er minst 2,

hver av iA-L<11> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, ( C^- C^)alkanoyl, naturlige forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA interkalatorer. nukleobase-bindende grupper og reporter ligander, minst en av L^-Ln er en naturlig forekommende nukleobase, en ikke-naturlig forekommende nukleobase, en DNA interkalator eller en nukleobase-bindende gruppe, hver av A-^-An er en enkelt binding, en metylengruppe eller en gruppe med formlene (Ila) eller (Ilb):

hvor:

X er 0, S, Se, NR<3>, CH2 eller C(CH3)2<; >Y er en enkelt binding, 0, S eller NR<4>; hver av p og q er et tall fra 1 til 5, summen p+q er ikke mer enn 10, hver av r og s er null eller et tall fra 1 til 5, summen r+s er ikke mer enn 10, hver R^- og R<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen (C^-C4)alkyl som kan være hydroksy-eller alkoksy- eller alkyltio-substituert, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen og hver R<3> og R<4> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C-L-C4 )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert ( C^- C^)alkyl, hydroksy, alkoksy , alkyltio og amino, hver av B^-Bn er N eller R<3>N<+>, hvor R3 er som definert ovenfor, hver av C<1->^ er CR6R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R<7>CH2, hvor R<k> er hydrogen og R<7> blir valgt fra gruppen bestående av sidekjeder av naturlig forekommende alfa aminosyrer, eller R^ og R<7> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-C(, )alkyl , aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C^-C6)alkoksy, ( C^ Cf^ )alkoksy, ( C±- C6 )alkyltio , NR<3>R<4> og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor og R<5> er hydrogen, (C^-Cfc)alkyl, hydroksy-, alkoksy-, eller alkyltio- substituert (C^-C^)alkyl, eller R<6> og R<7> fullfører sammen et alisyklisk eller heterosyklisk system, hver av D^-Dn er CR<6>R<7>, CH2CR<6>R<7 >eller CHR^CHR<7>, hvor R^ og R<7> er som definert ovenfor, hver av Gi<->G<11>-<1> er

i hvilken som helst orientering, hvor R<3> er som definert ovenfor, Q er -C02H, -C0NR'R'', -S03H eller -S02NR'R'' eller et aktivert derivat og -C02H eller -SO3H, og

I er -NHR » » »r » » » » eller -NR'<*>'C(0)R'''',

hvor R', R'', R'<*>' og R'''' blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, aminobeskyttende grupper, reporter1igander, interkalatorer, chelatorer, peptider,

proteiner, karbohydrater, lipider, steroider, oligonukleotider og oppløselige og ikke-oppløselige polymerer. Alternativt kan C og D være CHR<6>(CH2)SCHR<7> hvor S kan være fra 0 til 2.

Foretrukne peptidnukleinsyrer har generelt formel (III):

hvor:

hver L blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, heterosykler, f.eks. en, to eller tre ringer, naturlig forekommende nukleobaser og ikke-forekommende nukleobaser, hver R<7>' blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjedene til naturlig forekommende alfa aminosyrer, n er et tall fra 1 til 60, hver av k, 1 og m er uavhengig null eller et tall fra 1 til 5, fortrinnsvis er summen av k og m 1 eller 2, mest foretrukket 1,

R<n> er OH, NH2 eller -NHLysNH2, og

R<1> er H eller C0CH3

Spesielt foretrukket er forbindelser med formel (III) hvor hver L uavhengig blir valgt fra gruppen bestående av nukleobasene thymin (T), adenin (A), cytozin (C), guanin (G) og urasil (U), spesielt thymin, og n er et tall fra 1 til 30, spesielt fra 4 til 20. Et eksempel på en slik forbindelse er gitt i fig. 1 som viser den strukturelle likheten mellom slike forbindelser og enkelt-trådete DNA.

Peptidnukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan bli syntetisert ved tilpasning av standard peptidsynteseprosedyrer, enten i oppløsning eller på en fast fase. Syntonene som blir anvendt kan være spesielt konstruerte monomeraminosyrer eller deres aktiverte derivater, beskyttet med standard beskyttende grupper. Oligonukleotidanalogene kan også bli synetisert ved anvendelse av de tilsvarende diasidene og diaminene.

Monomersyntonene anvendt for å produsere forbindelsene for anvendelse i oppfinnelsen kan bli valgt fra gruppen bestående av aminosyrer, diasider og diaminer med generelle formler:

hvor L, A, B, C og D er som definert ovenfor med unntagelse av at hvilke som helst aminogrupper deri kan bli beskyttet med aminobeskyttende grupper, E er C00H, CSOH, S00H, S020H eller et aktivert derivat derav og F er NHR<3> eller NPgR<3>, hvor R<3> er som definert ovenfor og Pg er en aminobeskyttende gruppe.

Foretrukne monomersyntoner er aminosyrer med formelen (VII):

eller amino-beskyttede og/eller syreterminaltaktiverte derivater derav, hvor L blir valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, heterosykler, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser og beskyttede derivater derav, og R<7>' blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjedene til naturlig forekommende alfaaminosyrer. Spesielt foretrukket er slike syntoner med formel (4) hvor R<7>' er hydrogen og L blir valgt fra gruppen bestående av nukleobasene thymin (T), adenin (A), cytozin (C), guanin (G) og urasil (U) og beskyttede derivater derav.

I henhold til oppfinnelsen er det innbefattet anvendelse av nukleinsyreanaloger som definert ovenfor for oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, identifikasjon eller kvantitering av en eller flere kjemiske eller mikro-biologiske deler. Vanligvis er den delen som blir detektert i første henseende en nukleinsyre og nevnte del vil bli detektert via dets karakteristiske sekvenser av nukleinsyrebaser ved hybridir sering.

Nukleinsyreanalogene som definert ovenfor kan bli anvendt i en fremgangsmåte for oppfanging av en nukleinsyre omfattende å bringe i kontakt under hybriserende betingelser nevnte nukleinsyrer med en nukleinsyreanalog for anvendelse i oppfinnelsen immobilisert til en fast bærer, hvor den immobiliserte nukleinsyreanalogen har en sekvens av ligander egnet for å hybridisere til nevnte nukleinsyre eller nukleinsyreanalog som skal bli oppfanget.

Den faste bæreren kan ha mange forskjellige former som er kjent i sammenheng med imobilisering av konvensjonelle oligonukleotider for anvendelse ved affinitetsoppfanging. En fast bærer kan blant annet være en plate, et filter, en multi-brønn plate eller en "dipstick". Den kan ta form av individuelle partikler så som kuler og slike partikler kan bli holdt i en kolonne hvorgjennom nukleinsyreinnholdende oppløsninger kan bli kjørt for å muliggjøre oppfanging av ønskede arter.

Den oppfangede nukleinsyren kan bli gjenkjent, detektert, identifisert eller kvantifisert på forskjellige måter. Etter vasking kan den oppfangede nukleinsyren være den eneste nukleinsyren som er igjen i systemet og kan bli detektert ved hjelp av et hvilket som helst reagehssystem egnet for demonstrering av tilstedeværelse av nukleinsyre enten om den er spesifikk for den oppfangede sekvensen eller ikke. Dersom f.eks. den oppfangede nukleinsyren er DNA og blir oppfanget i enkelttrådet form av et relativt kort PNA, kan overhengende enkelttrådete DNA bli spaltet av nuklease og spaltingspro-duktene kan bli detektert ved hjelp av konvensjonelle metoder. Dersom DNA er dobbelttrådet og PNA igjen er relativt kort, kan den delen av DNA som er igjen i dets opprinnelige dobbelttrådet form (dvs. som ikke blir erstattet av PNA) blir detektert ved hjelp av konvensjonelle DNA interkalatorer som ikke blir bundet til PNA-DNA dupleksen. Antistoffer som gjenkjenner nukleinsyrer kan bli anvendt for å detektere nukleinsyrer (RNA, dsDNA eller ssDNA) bundet til den immobiliserte nukleinsyreanalogen.

Ved affinitetsoppfanging av nukleinsyreartene ved anvendelse av konvensjonelle oligonukleotider immobilisert til en fast bærer er det nødvendig normalt å rense målnukleinsyren. Nukleasene som kan være tilstede i prøven angriper den immobiliserte mukleinsyren. Lite spesifikk binding blir oppnådd i praksis ved slik uspesifikk binding. Det er videre nødvendig å denaturere DNA til enkelttrådet form før oppfangingen kan foregå.

Nukleinsyreanalogene med formel I angitt ovenfor er ikke mottagelige for angrep av nukleaser og gir vanligvis høyere nivåer av spesifikk binding i kraft av deres høye affinitet for nukleinsyre av komplementær sekvens enn det som blir oppnådd ved anvendelse av konvensjonell oligonukleotider som immobiliserte arter. Nukleinsyreanalogene anvendt i henhold til oppfinnelsen kan hybridisere til nukleinsyrer av komplementær sekvens uten at nukleinsyrene først blir denaturert til enkelttrådet form. Når målnukleinsyren er blitt oppfanget kan den bli frigjort fra den immobiliserte nukleinsyreanalogen ved å utsette den immobiliserte nukleinsyreanalogen og oppfanget nukleinsyre for dehybridiserende betingelser så som varme og dimetylformamid.

Den immobiliserte nukleinsyreanalogen kan omfatte sekvensielle ligander så som thymin, hybridiserbar til poly A halene av mENA for oppfanging av mRNA.

Oppfinnelsen omfatter en affinitetsoppfangingskolonne omfattende immobiliserte nukleinsyreanaloger som beskrevet ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor også fordelen ved anvendelse av PNA molekyler i fast-fasekjemi (se f.eks. "Solid-Phase Biochemistry - Analytical and Synthetic Aspects", W. H. Scouten, ed., John Wiley & Sons, New York, 1983), spesielt fast-fasebiosystemer, spesiell bioanalyse eller fast-faseteknikker som vedrører diagnostisk deteksjon/- kvantifisering eller affinitetsrensing av komplementære nukleinsyrer (se f.eks. "Affinity Chromatography - A Practical Approach" , P. D. G. Dean, W. S. Johnson og F. A. Middle, eds., IRL Press Ltd., Oxford 1987). Fremgangsmåtene av idag for utførelse av slike bioanalyser eller rensnings-teknikker omfatter nesten bare "normale" eller delvis modifiserte oligonukleotider som er enten fysisk absorbert eller bundet gjennom en vesentlig permanent kovalent forankringsbinding til kuleformige faste bærere så som cellulose, glasskuler, inkludert de med kontrollert porøsitet (Mizutani, et al., J. Chromatogr., 1986, 356, 202), "Sepha-dex" , "Sepharose", agarose, polyakrylamid, porøs partikkel-formig aluminiumoksid, hydroksyalkyl, metakrylatgeler, diolbundet silika, porøse keramiske stoffer eller kontinuer-lige materialer så som filterskiver av nylon og nitrocellu-lose. Et eksempel anvendte den kjemiske syntesen av oligo-dT på cellulosekuler for affinitetsisolering av poly A halen inneholdende mENA (Gilham in "Methods i Enzymology", L. Grossmann og K. Moldave, eds., vol. 21, del D, side 191, Academic Press, New York og London, 1971). Alle ovennevnte metoder kan anvendes innenfor denne oppfinnelsen. Når mulig er kovalentlig binding foretrukket i forhold til fysisk adsorpsjon av molekylene det gjelder p.g.a. at sistnevnte tilnærmelse har ulempen med at noen av de mobiliserte molekylene kan bli vasket ut (desorbert) iløpet av hybridi-serings- eller affinitetsprosessen. Det er derfor liten kontroll av i hvilken grad den art adsorbert på overflaten av bærematerialet går tapt iløpet av de forskjellige behand-lingene som bæreren har blitt utsatt for iløpet av bioanalyse-/rensningsprosedyren. Alvorlighetsgraden av dette problemet vil selvfølgelig avhenge av raten hvorved likevekt mellom adsorberte og frie arter oppnås. I visse tilfeller kan det være omtrent umulig å utføre en kvantitativ analyse med akseptabel nøyaktighet og/eller reproduserbarhet. Tap av adsorberte arter iløpet av behandling av bæreren med kroppsvæsker, vandige reagenser eller vaskemedium vil generelt være ventet å være mest uttalt for arter med relativt lav molekylvekt. I kontrast med oligonukleotider er PNA molekylet lettere å få koblet på faste bærere p.g.a. at de inneholder sterke nukleofile og/eller elektrofile sentere. Den direkte oppstillingen av oligonukleotider på faste bærere lider av en ekstrem lav belastning av det immobiliserte molekylet p.g.a. den lave overflatekapasiteten til materi-alene som muliggjør vellykket anvendelse av kjent fosfor-amiditkjemi for konstruksjon av oligonukleotidene. (Beaucage og Caruthers, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859; Caruthers, Science, 1985, 232, 281). Ved anvendelse av den alternative fosfittriestermetoden (Letsinger og Mahadevan, J. Am. Chem. Soc. 1976, 98, 3655 ), som er egnet for faste bærere med en høy overflate/belastningskapasitet, kan bare relativt kort oligonukleotider dessverre bli oppnådd. Når det gjelder konvensjonell fast-fase peptidsyntese er derimot sistnevnte bærere gode materialer for oppbygging av immobiliserte PNA molekyler (side-kjede beskyttende grupper kan bli fjernet fra den syntetiserte PNA kjeden uten spaltning av forankringsbin-dingen som holder kjeden til den faste bæreren). PNA arter drar fordeler av ovennevnte fast-fase teknikker med hensyn på mye høyere (og fortsatt sekvens-spesifikk) bindingsaffinitet for komplementære nukleinsyrer og fra den unike sekvens-spesif ikke gjenkjenningen av (og sterke bindinger til) nukleinsyrene som er tilstede i dobbelt-trådete strukturer. De kan også bli applisert på faste bærere i store mengder som dermed ytterligere øker sensitiviteten/kapasiteten til fast-fase teknikken. Visse typer av studier vedrørende anvendelse av PNA innen fast-fase kjemi kan videre bli anvendt og lettet eller i stor grad akselerert ved anvendelse av den nylig rapporterte "light-directed, spatially addressable, parallell chemical synthesis" teknologi (Fodor, et al., Science, 1991, 251, 767 ),. en teknikk som kombinerer fast-fase kjemi "og fotolitografi for å produsere tusenvis av sterkt forskjellige, men identifiserbare, permanent immobiliserte forbindelser (også peptider) på en vesentlig simultan måte.

Det er blitt oppdaget at PNA ifølge formel I utviser en egenskap som aldri før er blitt observert og som omfatter at en slik nukleinsyreanalog kan hybridisere til en konvensjonell nukleinsyre presentert i dobbel-trådet form og som under slike betingelser kan hybridisere til tråden som har en sekvens som er komplementær med analogen og kan forflytte den andre tråden fra den opprinnelige nukleinsyredupleksen. Slik gjenkjenning kan foregå på dsDNA sekvenser som er 5-60 basepar i lengde. Sekvenser mellom 10 og 20 baser er av interesse på grunn av at dette er området hvor unike DNA sekvenser fra prokaryoter og eukaryoter finnes. Reagenser som gjenkjenner 17-18 baser er av spesiell interesse p.g.a. at dette er lengden på unike sekvenser i det humane genomet. Det er også blitt observert at når en slik hybridiserings-reaksjon blir utført i oppløsning hybridiserer en andre tråd av nukleinsyreanalogen som har samme sekvens som den første til nukleinsyretråden med komplementær sekvens for å danne en trippel heliks struktur hvor to lignende tråder av PNA blir hybridisert til en enkelt tråd av en konvensjonell nukleinsyre. Det antas at den første PNA tråden hybridiserer med inter-base hydrogenbindingen av vanlig type, mens den andre PNA tråden mottas i "major groove" av den opprinnelige dupleksen ved Hoogsteen parring. Når PNA er immobilisert til en fast bærer blir hybridisering til dobbelttrådet nukleinsyre med forflytting av en tråd derifra observert, men dannelsen av trippel heliks strukturer kan bli forhindret ved imobilisering av PNA.

Oppfinnelsen omfatter en nukleinsyreanalog som definert ovenfor og som inkorporerer eller konjugerer til en detekter-bar markør. Generelt kan alle metoder for merking av peptider, DNA og/eller RNA som for tiden er kjent bli anvendt også på PNA. Fremgangsmåte for merking vil derfor innbefatte anvendelse av radio-isotopmarkører, enzymmarkører, biotin, spinmarkører, fluoroforer, kjemiluminisensmarkører, antigen-markører eller antistoffmarkører.

Merket PNA som beskrevet ovenfor kan bli anvendt i metoder for gjenkjenning, deteksjon eller kvantifisering av målnuk-leinsyrer omfattende hybridisering av nevnte mål til en merket nukleinsyreanalog som definert ovenfor med tilstrekkelig komplementær sekvens å hybridisere dermed under hybridiserende betingelser og detektering eller kvantifisering av nevnte markør av nukleinsyreanalogen som er på denne måte hybridisert til nevnte mål.

Eventuelt kan målene bli immobilisert på et substrat før hybridiseringen.

I en slik fremgangsmåte kan målet bli immobilisert på substratet ved hybridisering av den første region av målet til en oppfangingsnukleinsyre eller nukleinsyreanalog med en sekvens som er tilstrekkelig komplementær med nevnte første region for å hybridisere den med og som selv blir immobilisert til nevnte substrat og den merkede nukleinsyreanalogen kan bli hybridisert til en andre region av målet.

Evnen som i det minste foretrukne nukleinsyreanaloger ifølge oppfinnelsen har til å hybridisere til en dobbel-trådet målnukleinsyre og erstatte en tråd derifra er blitt beskrevet ovenfor. Oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for erstatning av en tråd fra en nukleinsyredupleks omfattende hybridisering til nevnte dupleks av en nukleinsyreanalog som definert ovenfor som har en affinitet for den andre tråden av nevnte dupleks som er tilstrekkelig for å muliggjøre erstatning av nevnte ene tråd derifra.

Oppfinnelsen vedrører en in vitro-fremgangsmåte for oppfanging av en nukleinsyre, kjennetegnet ved å bringe nevnte nukleinsyre i kontakt under hybridiseringsbetingelser med en nukleinsyreanalog som definert i hvilket som helst av kravene 12 til 23 immobilisert på et fast støttemedium, hvis nukleinsyreanalog har en sekvens av ligander egnet til å hybridisere til nevnte nukleinsyre.

Videre omfattermoppfinnelsen in vitro-fremgangsmåte for å gjenkjenne, detektere eller kvantifisere en målnukleinsyre, kjennetegnet ved at den omfatter å hybridisere nevnte målnukleinsyre til en merket nukleinsyreanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11 for tilstrekkelig å komplementere sekvensen til derved å hybridisere under hybridiseringsbetingelser og detektere eller kvantifisere mere av nevnte nukleinsyreanalog som så blir hybridisert til nevnte målnukleinsyre.

Omfattet av oppfinnelsen er også in vitro-fremgangsmåte for å erstatte én tråd fra nukleinsyredupleks, kjennetegnet ved at den omfatter å hybridisere til nevnte dupleks en nukleinsyreanalog som har en affinitet for den andre tråden av nevnte dupleks tilstrekkelig til å være istand til å erstatte nevnte ene tråd derfra.

Oppfinnelsen omfatter også in vitro-fremgangsmåte for å detektere, identifisere eller kvantifisere en dobbelttrådet målnukleinsyre, kjennetegnet ved at den omfatter å hybridisere dertil en erstatningsnukleinsyreanalog som tidligere nevnte, istand til å erstatte én tråd fra en dobbeltrådet målnukleinsyre hvori den andre tråden er av komplementær sekvens til nevnte erstattede nukleinsyreanalog, hvori nevnte erstattede nukleinsyreanalog er av tilstrekkelig komplementær sekvens til nenvte andre tråd av nevnte dobbelttrådet målnukleinsyre for å hybridisere dertil for å erstatte nevnte ene tråd av nevnte målnukleinsyre i enkelttrådet form, og detektere eller kvantifisere tilstedeværelse av nevnte ene erstattede tråd.

Den forflyttede tråden kan bli brutt ned til fragmenter og tilstedeværelse av nevnte fragmenter kan bli detektert. Den forflyttede tråden kan fortrinnsvis bli brutt ned med angrep av en nuklease. Man kan derfor detektere tilstedeværelse av en spesifikk dobbel-trådet målnukleinsyresekvens ved hybridisering dertil av et komplementært PNA for å produsere trådforflytting for å produsere enkelt-trådet DNA i reaksjonsblandingen og spalte enkelt-trådet DNA ved anvendelse av en nuklease for å produsere nukleotider hvor tilstedeværelsen kan bli detektert som en indikator som spesifikt mål dobbelttrådet DNA var opprinnelig tilstede.

Foreliggende oppfinnelse vedrører et kit for anvendelse i en diagnostisk prosedyre, kjennetegnet ved at kittet omfatter minst én merket nukleinsyreanalog som tidligere nevnt, og minst ett deteksjonsreagens for å detektere nevnte merkede nukleinsyreanalog.

Generelt vil nukleinsyreanalogene være i oppløsning i en hybridiseringsbuffer. Et slikt kit vil generelt også innbefatte minst en vaskebufferoppløsning.

Når nukleinsyreanalogen er indirekte merket, f.eks. med biotin, kan kitet innbefatte et konjugat mellom en enzym-markør og et materiale så som avidin som kan bli bundet til markøren av nukleinsyreanalogen.

Når nukleinsyreanalogen er enten direkte eller indirekte enzymmerket kan kittet omfatte et substrat for enzymet som er egnet til å gjennomgå en registrerbar reaksjon formidlet av enzymet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse in vitro ved oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter av en nukleinsyreanalog som er en peptidnukleinsyre (PNA), som omfatter et polyamidskjelett som bærer en mengde ligander ved respektivt i avstand beliggende langs nevnte skjelett, hvor nevnte ligander hver er uavhengig naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser eller nukleobasebindende grupper, hvor hver nevnte ligand blir bundet direkte eller indirekte til et nitrogenatom i nevnte skjelett, og nevnte ligand som bærer nitrogenatomer hovedsakelig blir separert fra hverandre i nevnte skjelett ved fra 4 til 8 mellomliggende atomer.

Videre omfatter oppfinnelsen in vitro-anvendelse ved oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter av en nukleinsyreanalog som er en nukleinsyreanalog istand til å hybridisere til en nukleinsyre eller komplementær sekvens for å danne et hybrid som er mer stabilt mot denaturering ved varme enn et hybrid mellom den konvensjonelle deoksyribonukleotid korresponderende til nevnte analog og nevnte nukleinsyre.

Oppfinnelsen omfatter også in vitro-anvendelse ved oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter av en nukleinsyreanalog som er en nukleinsyreanalog som er istand til å hybridisere til en dobbelttrådet nukleinsyre hvori én tråd har en sekvens komplementær til nevnte analog, for å erstatte den andre tråden fra den nevnte ene tråden.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse for in vitro-deteksjon eller isolering av en spesifikk nukleinsyre fra en oligonukleotidanalog som binder mer sterkt til dens komplementære sDNA eller ENA-tråder enn det korresponderende DNA eller ENA, respektivt.

Oppfinnelsen vil bli beskrevet i ytterligere detalj og vil bli illustrert med referanse til de vedlagte figurene hvor: Fig. 1 viser et naturlig forekommende deoksyribooligonukleo-tid (A) og en peptidnukleinsyre (PNA) ifølge oppfinnelsen

(B).

Fig. 2 viser eksempler på naturlig forekommende og ikke

naturlig forekommende nukleobaser for DNA gjenkjenning og reportergrupper.

Fig. 3 angir en skjematisk illustrasjon av (A) fotospaltning ved Acr1_(Taeg)10-Lys-NH2 (Acr <T>10Lys-NH2), (b) fotoavtrykk ved diaso-koblet akridin av Acr1-(Taeg^g-Lys-NHg °§ foretrukket KMnC^-spaltning og (c) S^-nuklease forsterket spaltning og (d) mikrokokkusnuklease spaltning av Acr<1->

(Taeg)^Q-Lys-NH2 bindingssete.

Fig. 4 angir eksempler på PNA monomer syntoner.

Fig. 5 viser Acr<1> liganden og en PNA, Acr<1->(Taeg)10-Lys-NH2. Fig. 6 angir et generelt skjema for fremstilling av monomer syntoner . Fig. 7 angir et generelt skjema for preparering av Acr<1 >liganden. Fig. 8 viser et generelt skjema for fast-fase PNA syntese som illustrerer preparering av lineære ubeskyttede PNA amider. Fig. 9 viser analytiske HPLC kromatogrammer av: (A) rå H-[Taeg]15-NH2 etter HF-spaltning (før lyofilisering), (B) urenset Acr<1->[Taeg]15-NH2 etter HF-spaltning (før lyofili-strering) og (C) renset Acr<1->[Taeg]i5-NH2. Buffer A, 5$ Ch3CN/95# H20/0.0445# TFA, buffer B, b0% CH3CN/40# H20-/0.0390# TFA, lineær gradient, 0-100$ B i 30 min, strømnings-rate, 1,2 ml/min, kolonne, Vydac C^g (5 ^m, 0,46 x 25 cm). Fig. 10 viser analytiske HPLC kromatogrammer av: (A) renset H-[Taeg]10-Lys-NH2 og (B) renset H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2 ved anvendelse av samme betingelser som i fig. 9. Fig. Ila og 11b viser binding av AcrT^g-Lys til dA10.5'-<32>p-merket oligonukleotid (1) (5' -GATCCT10G) ble inkubert i fravær eller nærvær av AcrT-LQ-Lys °S * fravær eller nærvær av oligonukleotidet (2) (5' -GATCCT10G) °g prøvene ble analysert ved polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) og autoradiografi under "native betingelser" (fig. Ila) eller under "denaturerende betingelser" (fig. 11b). Figurene 12a-c viser kjemisk, fotokjemisk og enzymatisk probing av dsDNA-AcrT10-Lys-NH2 komplekset. Kompleksene mellom AcrT10-Lys-NH2 og et <32>P-ende merket DNA fragment inneholdende en dA^g/dt^o mål-sekvens ble probet ved affinitet fotospaltning (fig. 12a, kolonne 1-3, fig. 12b, kolonne 1-3), fotoavtrykk (fig. 12a, kolonne 5-6), kaliumpér-manganatprobing (fig. 12b, kolonne 4-6) eller probing ved stafylokokknuklease (fig. 12b, kolonne 8-10) eller ved nuklease Si (fig. 12c). Enten ble A-tråden (fig. 12a) eller T-tråden (figurene 12b,c) probet. Fig. 13 angir en prosedyre for syntese av beskyttede PNA syntoner. Fig. 14 angir en prosedyre for syntese av en beskyttet adeninmonomersynton. Fig. 15 angir en prosedyre for syntese av en beskyttet guaninmonomersynton.

Fig. 16 angir eksempler på PNA skjelettendringer.

Fig. 17 angir en prosedyre for syntese av thyminmonomersynto-ner med sidekjeder som tilsvarer normale aminosyrer. Figurene 18a og 18b angir prosedyrer for synteser av en aminopropylanalog og en propionylanalog av en thyminmonomersynton. Fig. 19 angir en prosedyre for syntese av en aminoetyl-p-alanin analog av thyminmonomersynton. Fig. 20 viser en PAGE autoradiograf som demonstrerer at PNAs-T10, -TgC og -T8C2 blir bundet til dobbelttrådet DNA med høy sekvensspes ifisitet. Fig. 21 viser en graf basert på densitometrisk scanning av PAGE autoradiografer som demonstrerer kinetikken av binding av PNA-T-lo til et dobbelttrådet mål. Fig. 22 viser en graf basert på densitometrisk scanning av PAGE autoradiografer som demonstrerer termiske stabilitetene til PNA med varierende lengder bundet til et A^q/T^q dobbelttrådet DNA mål. Fig. 23 viser en elektroforetisk gelfarving som demonstrerer at restriksjonsenzymaktiviteten overfor DNA blir inhibert når PNA er bundet proksymalt til restriksjonsenzymgjenkjennings-setet. Fig. 24 viser en PAGE autoradiograf som demonstrerer at <125>j_ merket PNA-T^o blir bundet til et komplementært dA^g oligonukleotid. Figurene 25a til c viser prosentvis binding oppnådd ved varierende temperaturer mellom en immobilisert PNA og paring eller et basefeilparet oligo-DNA. Fig. 26 er en autoradiograf som viser inhibisjon av transkripsjonen ved RNA polymerase ved T^q PNA på den tran-skriberte tråden. Fig. 27 er en autoradiograf av en blanding av merket plasmid dsDNA oppfanget på en immobilisert komplementær til en av disse og vasket ved varierende temperaturer. Fig. 28 kombinerer en etidiumbromidgel og en autoradiograf derav som illustrerer den kvantitative bestemmelsen av plasmid dsDNA ved trådforflytting ved PNA. I PNA med formel I og monomersyntoner anvendt i produksjon derav er ligand L hovedsaklig en naturlig forekommende nukleobase koblet ved posisjonen som finnes i naturen, d.v.s. posisjon 9 for adenin eller guanin, og posisjon 1 for thymin eller cytozin. Alternativt kan hver av noen av ligandene L være en ikke-naturlig forekommende nukleobase (nukleobase-analog), en annen base-bindingsdel, en aromatisk del, (C^-C4)alkanoyl, hydroksy eller selv hydrogen. Noen typiske . nukleobaseligander og illustrerende syntetiske ligander er vist fig. 2. L kan videre være en DNA interkalator, en reporterligand så som f.eks. en fluorofor, radiomarkør, spinnmarkør, hapten eller en protein-gjenkjennende ligand så som biotin.

I monomersyntoner kan L være utstyrt med beskyttende grupper. Dette er illustrert i fig. 4 hvor Pg<1> er en syre, en base eller en hydrogenolytisk eller fotokjemisk spaltbar beskyttede gruppe så som f.eks. t-butoksy-karbonyl (Boe), fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) eller 2-nitrobenzyl (2Nb).

Linker A kan være forskjellige grupper så som -CR<1>R<2>C0-,-CR1R<2>CS-, -CR1R<2>CSe, -CR<1>R<2>CNHR<3->, -CR^R<2-> og -CR1R<2>C=C(CH3-)2-. hvor R<1>, R<2> og R<3> er som definert ovenfor. A er fortrinnsvis metylenkarbonyl (-CH2CO-). A kan også være en lengre kjededel så som propanoyl, butanoyl eller pentanoyl, eller tilsvarende derivat hvor 0 blir erstattet med en annen verdi av X eller kjeden blir substituert med R^R<2> eller er heterogen, inneholdende Y. A kan videre være en (C2-C^)alkylen kjede, en (C2-C£,)alylen kjede substituert med R^R<2 >eller kan være heterogen, inneholdende Y. I visse tilfelle kan A bare være en enkeltbinding.

I den foretrukne formen ifølge oppfinnelsen er B et nitrogenatom som derved presenterer muligheten for et achiralt skjelett. B kan også være R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor.

I den foretrukne formen ifølge oppfinnelsen er C -CR^R<7->, men kan også være en tokarbonenhet, dvs. -CHR^CHR<7> - eller-CR<6>R<7>C<H>2-, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor. R<6> og R<7 >kan også være en heteroarylgruppe så som f. eks. pyrrolyl, furyl, tionyl, imidasolyl, pyridyl, pyrimidinyl, indolyl, eller kan sammen fullføre et alisyklisk system så som f.eks. 1,2-syklobutandiyl, 1,2-syklopentandiyl eller 1,2-syklohek-sandiyl.

I den foretrukne formen ifølge oppfinnelsen er E i monomer-syntonet COOH eller et aktivert derivat derav og G i oligomeren er -C0NR<3->. (Fortrinnsvis i orienteringen -R<3>NOC i formel I). Som definert ovenfor kan E også være CSOH, SOOH, S02OH eller et aktivert derivat derav, hvorved G i oligomeren blir henholdsvis -CSNR<3->, -S0NR<3-> og -S02NR<3-->Aktiveringen kan f.eks. bli oppnådd ved anvendelse av et syreanhidrid eller et aktivt esterderivat, hvor hydrogen i gruppene representert ved E blir erstattet med en avspaltbar gruppe egnet for dannelsen av det voksende skjelettet,

Aminosyrene som danner skjelettet kan være identisk eller forskjellig. Vi har funnet at de som er basert på 2-aminoetylglysin er spesielt godt egnet for hensikten ifølge oppfinnelsen.

I noen tilfelle kan det være av interesse å koble ligander ved en av endeterminalene (Q, I) for å modulere bindings-karaktertrekkene til PNA. Representative ligander omfatter DNA interkalatorer som vil forbedre dsDNA bindingen eller basiske grupper, så som lysin eller polylysin som vil styrke bindingen av PNA forårsaket av elektrostatisk interaksjon. For å redusere negativt ladede grupper så som karboksy kan sulfogrupper bli anvendt. Konstruksjonen av syntonene muliggjør videre at andre deler blir liggende ikke-terminale posisjoner.

PNA oligomerene kan bli konjugert til lavmolekylære effekto-ligander så som ligander som har nukleaseaktivitet eller alkylerende aktivitet eller reporter1igander (fluoressens, spinmarkør, radioaktive, proteingjenkjenningsligander, f.eks. biotin eller haptener). I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen blir PNA konjugert til peptider eller proteiner hvor peptidene har signaliserende aktivitet og proteinene er f.eks. enzymer, transkripsjonsfaktorer eller antistoffer. PNA kan videre bli koblet til vann-oppløselige eller vann-uoppløselige polymerer. I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen blir PNA konjugert til oligonukleotider eller karbohydrater. Når ønskelig kan en PNA oligomer bli syntetisert på samme del (f.eks. en peptidkjede, reporter, interkalator eller annen type av ligand-inneholdende gruppe) koblet til en fast bærer.

Syntese av PNA for anvendelse i oppfinnelsen blir diskutert i detalj nedenfor, hvor fig. 1 illustrerer en av de foretrukne PNA eksemplene og sammenligner dets struktur med det til et komplementært DNA.

Syntese av PNA oligomerer og polymerer.

Prinsippet for forankring av molekyler på en fast matrix som er behjelpelig med å utgjøre mellomprodukter iløpet av kjemiske omdanninger er kjent som fast-fase syntese eller Merrifield syntese (se f.eks. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 1963, 85, 2149 og Science, 1986, 232, 341). Etablerte metoder for den trinnvise eller fragmentvise fast-fase oppstillingen av aminosyrer til peptider anvender normalt en kuleformet matrix av delvis kryss-bundede styren-divinyl-bensenkopolymer, idet den kryss-bundede kopolymeren er blitt dannet ved perlepolymerinsering av styrenmonomeren hvor det er blitt tilsatt en blanding divinylbensener. Et nivå på 1-2% kryss-binding ble vanligvis anvendt. En slik matrix kan også bli anvendt i fast-fase PNA syntesen i henhold til foreliggende oppfinnelse (fig. 8).

Vedrørende den opprinnelige funksjonaliseringen av den faste fasen er mer enn femti metoder blitt beskrevet når det gjelder tradisjonell fast-fase peptidsynteser (se f.eks. Barany og Merrifield i "The Peptides" Vol. 2, Academic Press, New York, 1979, s. 1-284 og Stewart og Young "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chemical Company, Illinois, 1984). Reaksjonene for innføring av klormetylfunk-sjonaliteten (Merrifield harpiks, via en klormetylmetyl-eter/SnCl4 reaksjon) aminometylfunksjonalitet (via en N-hydroksymetylftalimid reaksjon, se Mitchell, et al., Tetrahedron Lett., 1976, 3795), og benshydrylaminofunksjo-nalitet Pietta, et al., J. Chem. Soc, 1970, 650 ) er den mest anvendte. Uansett egenskap er hensikten med funksjonaliteten normalt å danne en forankdringsbinding mellom kopolymer fastbæreren og C-terminusen til den første aminosyre som skal bli koblet til den faste bæreren. Det er genrelt hen-siktsmessig å uttrykke "konsenstrasjon" til en funksjonell gruppe med hensyn på millimol pr. gram (mmol/g). Andre reaktive funksjonaliteter som opprinnelig er blitt innført omfatter 4-metylbenshydrylamino og 4-metoksybenshydrylamino. Alle disse etablerte metodene er i prinsippet nyttige innenfor foreliggende oppfinnelse. Foretrukne metoder for PNA syntese anvender aminometyl som innledende funksjonalitet, idet aminometyl er spesielt foredelaktig med hensyn på innkorporering av "spacer" eller "handle" grupper på grunn av reakvtiviteten til aminogruppen med aminometylfunksjonalitet med hensyn på den vesentlige kvantitative dannelsen av amidbindinger til en karboksylsyregruppe ved den ene enden av det spacer-dannende reagenset. Et stort antall relevante spacer- eller skaft("handle")-dannende bifunksjonelle reagenser er blitt beskrevet (se Barany, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30, 705), spesielt reagenser som er reaktive overfor aminogrupper som finnes i aminometylfunk-sjonen. Representative bifunksjonelle reagenser omfatter 4-(haloalky)aryl-lavere alkanolske syrer så som 4-(bromometyl)-fenyleddiksyre, Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)aryl-lavere alka-noiske syrer som som Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)pefyl-eddiksyre, N-Boc-p-acylbenshydrylaminer så som N-Boc-p-glutaroylbenshydrylamin, N-Boc4'-lavere alkyl-p-acylbenshydrylaminer så som N-Boc-4'-metyl-p-glutarolylbenshydryl-amin, N-Boc-4'-lavere alkoksy-p-acylbenshydrylaminer så som N-Boc-4'-metoksy-p-glutaroyl-benshydrylamin og 4-hydroksy-metylfenoksyeddiksyre. En type spacer-gruppe som er spesielt relevant innenfor denne sammenhengen er fenylasetamidometyl (Pam) (Mitchell og Merrifield, J. Org. Chem., 1976, 41, 2015) som, avledet fra den elektrontiltrekkende virkningen til 4-fenylasetamidometylgruppen, er omtrent 100 ganger mere stabil enn den klassiske benzylester- bindingen overfor Boc-amino avspaltningsreagenset trifluoreddiksyre (TFA).

Visse funksjonaliteter (f.eks. benshydrylamino, 4-metylbenshydrylamino og 4-metoksybenshydrylamino som kan bli inkorporert for spaltning av en sytetisert PNA kjede fra den faste bæreren slik at C-terminalen til PNA kjeden er i amidform krever ingen introduksjon av en spacer-gruppe. En hvilken som helst slik funksjonalitet kan med fordel bli anvendt i foreliggende oppfinnelse.

En alternativ strategi vedrørende innføring av spacer eller skaft-grupper er den såkalte "preformed handle" strategien (se Tam, et al., Synthesis, 1979, 955-957), som medfører fullstendig kontroll over koblingen av den første aminosyre-syren og utelukker muligheten av komplikasjoner som oppstår fra tilstedeværelse av uønskede funksjonelle grupper som ikke er relatert til peptid eller PNA syntesen. I denne strategien blir spacer eller skaft-grupper, av samme type som beskrevet ovenfor, omsatt med den første aminosyren som er ønskelig å bli bundet til den faste bæreren, idet aminosyren er en N-beskyttet og eventuelt beskyttet ved andre sidekjeder som ikke er relevante med hensyn på veksten av den ønskede PNA kjeden. I de tilfellene hvor en spacer eller skaft-gruppe er ønskelig kan den første aminosyren som skal bli koblet til den faste bæreren enten bli koblet til den frie reaktive enden av en spacergruppe som er blitt bundet til den opprinnelige innførte funksjonaliteten (f.eks. en aminometylgruppe) eller kan bli omsatt med det spacer-dannende reagenset. Det spacer-dannende reagenset blir deretter omsatt med den opprinnelige innførte funksjonaliteten. Andre nyttige forankringsmåter omfatter "multi-detachable" harpikser (Tam, et al., Tetrahedron Lett., 1979, 4935 og J. Am. Chem. Soc. , 1980, 102, 611, Tam, J. Org. Chem., 1985, 50, 5291) som gir mer enn en måte for frigjøring og som derved muliggjør mer fleksibilitet i syntesekonstruk-sjonen.

Egnede valg for N-beskyttelse er tertbutyloksykarbonyl (Boe) gruppen (Carpino, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4686, Anderson, et al., J. Am. Chem. soc., 1957, 79, 6180) normalt i kombinasjon med benzyl-baserte grupper for beskyttelse av sidekjedene og 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) gruppen (Carpino, et al., J. Am. Chem. Soc., 1970, 92, 5748 og J. Org. Chem., 1972, 37, 3404), normalt i kombinasjon med tert-butyl (tBu) for beskyttelse av hvilke som helst sidekjeder til tross for at et antall andre muligheter eksisterer som er velkjente innen konvensjonell fast-fase peptidsynteser. Mange andre nyttige aminobeskyttende grupper eksisterer og noen av disse er Adoc (Hass, et al., J. Am. Chem. Soc, 1966, 88, 1988), Bpoc (Sieber, Heiv. Chem. Acta., 1968, 51, 614), Mcb (Brady, et al., J. Org. Chem., 1977, 42, 143), Bie (Kemp, et al., Tetrahedron, 1975, 4624), o-nitrofenylsulfenyl (Nps)

(Zervas, et al., J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 3660) og di t iasukkinoyl (Dts) (Barany, et al., J. Am. Vhem. Soc, 1977, 99, 7363). Disse aminobeskyttende gruppene, spesielt de som er basert på den meget anvendte uretanfunksjona-

liteten, forhindrer på en vellykket måte rasemiseringen (formidlet ved tautomerisering av de lett dannede oksasolinon (aslakton) mellom produktene (Goodman, et al., J. Am. Chem. Soc, 1964, 86, 2918)) iløpet av koblingen av de fleste a-aminosyrene. I tillegg til slike aminobeskyttende grupper kan mange ellers "unyttige" ikke-uretantype aminobeskyttende grupper anvendes ved oppstilling av PNA molekyler, spesielt de som blir dannet fra achirale enheter. Derfor er ikke bare ovennevnte aminobeskyttende grupper (eller de som er avledet fra noen av disse gruppene) nyttig innenfor sammenhengen av foreliggende oppfinnelse, men hvilke som helst aminobeskyttende grupper som stort sett oppfølger følgende krav: (1) stabilitet overfor svake syrer (ikke-signifikant angrepet av karboksylgrupper), (2) stabilitet overfor svake baser eller nukleofiler (ikke-signifikant angrepet av angjeldende aminogrupper), (3) motstand overfor acylering (ikke-signifikant angrepet av aktivert aminosyrer). Tillegg: (4) den beskyttende gruppen må være nær opptil kvantitativ fjernbar uten alvorlige sidereaksjoner og (5) den optiske integrite-ten, om noen, til den innkommende aminosyren bør fortrinnvis bli sterkt konservert ved koblingen. Valg av side-kjede beskyttende grupper avhenger generelt av valget av aminobeskyttende gruppe kommende av at beskyttelse av side-kjede funksjonalitetene må motstå betingelsene med gjentatte aminobeskyttende sykler. Dette er tilfelle om strategien for kjemisk oppstilling av PNA molkyler f.eks. bygger på forskjellig syrestabilitet til amino- og side-kjedebeskytten-de grupper (som er tilfelle for ovennevnte "Boc-benzyl" tilnærmelse) eller anvender en ortogonal, dvs. kjemoselektiv beskyttende metode (som er tilfelle for ovennevnte "Fmoc-tBu" metode).

Etter kobling av den første aminosyren er det neste stadiet av fast-fase syntesen systematisk dannelse av ønsket PNA kjede. Denne dannelsen involverer i gjentatte avspaltnings-/koblingssykluser. Den temporært beskyttende gruppen, så som en Boe eller Fmoc gruppe, på den sist-koblede aminosyren blir fjernet kvantitativt ved en egnet behandling, f.eks. ved asidolyse, så som med trifluoreddiksyre, når det gjleder Boe, eller ved baseblanding, så som med piperidin når det gjelder Fmoc, for å frigjøre den N-terminale aminofunksjonen.

Den neste ønskede N-beskyttede aminosyren ble deretter koblet til N-terminalen av den sist-koblede aminosyren. Denne koblingen av N-terminalen til en aminosyre med N-terminalen til den sist-koblede aminosyren kan bli oppnådd på flere måter. Den kan f. eks. bli bundet ved å høytstyre den innkommende aminosyren i en form med karboksylgruppen aktivert med hvilke som helst av flere metoder, inkludert den opprinnelige dannelsen av et aktiv ester derivat så som en 2,4,5-triklorofenylester (Pless, et al., Heiv. Chim. Acta, 1963, 46, 1609), en ftalimidoester (Nefkens, et al., J. Am. Chem. Soc. , 1961, 83, 1263), en pentaklorofenylester (Kupryszewski, Rocz. Chem., 1961, 35, 595), en pentafluorfenylester (Kovacs, et al., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 183), en o-nitrofenylester (Bodanzsky, Nature, 1955, 175, 685) en imidasolester (Li, et al., J. Am. Chem. Soc, 1970, 92, 7608), og en 3-hydroksy-4-okso-3,4-dihydrokvinasolin (Dhbt-OH) ester (Konig, et al., Chem. Ber., 1973, 103, 2024 og 2034), eller den innledende dannelsen av et anhydrid så som et symmetrisk anhydrid (V/ieland, et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1971, 10, 336). Alternativt, kan karboksylgruppen til den innkommende aminosyren bli omsatt direkte med N-terminalen til den sist-koblede aminosyren ved hjelp av et kondensasjonsreagens så som f.eks. disykloheksylkarbodiimid (Sheehan, et al., J. Am. Chem. Soc, 1955, 77, 1067 ) eller derivater derav. Bensotriasolyl N-oksytrisdimetylaminofos-foniumheksfluorfosfat (BOP), "Castro's reagent" (se f.eks. Rivaille, et al., Tetrahedron, 1980, 36, 3413) er anbefalt for oppstilling av PNA molekyler inneholdende sekundære aminogrupper. Aktiverte PNA monomerer analoge med de nylig-rapporterte aminosyrefluoridene (Carpino, J. Am. Chem. Soc, 1990, 112, 9651) er lovende for anvendelse i PNA syntesen. Etter oppstilling av den ønskede PNA kjeden, inkludert beskyttende grupper, vil det neste trinnet normalt være avspaltning av aminosyredelene til PNA kjeden og spaltning av syntetisert PNA fra den faste bæreren. Disse prosessene kan foregå vesentlig samtidige for derved å tilveiebringe det frie PNA molkylet i ønsket form. I tilfeller hvor kondensa-sjon av to separat syntetiserte PNA kjeder skal bli utført er det mulig ved valg av en egnet spacer-gruppe ved begynnelsen av syntesen å spalte de ønskede PNA kjedene fra deres respektive fase bærere (begge peptidkjedene inkorporerer fortsatt deres side-kjede beskyttende grupper) og endelig fjerning av de side-kjede beskyttende gruppene etter f.eks. kobling av de side-kjede beskyttende peptidkjedene for å danne en lengre PNA kjede.

I ovennevnte "Boc-benzyl" beskyttende skjema blir den endelige avspaltningen av side-kjedene og frigjøring av PNA molekylet fra den faste bæreren som oftest utført ved anvendelse av sterke syrer så som vannfri HF (Sakakibara, et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1965, 38, 4921), bortris (trifluorasetat) (Pless, et al., Heiv. Chim. Acta, 1973, 46, 1609), og sulfonsyrer så som trifluormetansulfonsyre og metansulf onsyre (Yajima, et al., J. Chem. Soc, Chem. Comm. , 1974, 107). Denne konvensjonelt sterk syre (f.eks. vannfri HF) avspaltningsmetoden produserer meget reaktive karbokationer som kan føre til alkylering og acylering av følsomme residier i PNA kjeden. Slike side-reaksjoner blir bare delvis unngått ved tilstedeværelse av oppfangningsmidler så som anisol, fenol dimetyl, sulfid og merkaptoetanol og derfor blir sulf id-assistert asidolytiske Sjj2 avspal tnings-metoden (Tam, et al., J. Am. Chem. soc, 1983, 105, 6442 og J. Am. Chem. Soc, 1986, 108, 5242 ), den såkalte "lave" som fjerner forløpene til skadelige karbokationer for å danne inerte sulfoniumsalter, ofte anvendt peptid og PNA syntese, enten alene eller i kombinasjon med "høye" metoder. Mindre ofte, i spesialtilfeller, blir andre metoder anvendt for avspaltning og/eller sluttspaltning av PNA-fastbærerbindin-gen, f.eks., slike metoder som base-katalysert alkoholyse (Barton, et al., J. Am. chem. Soc., 1973, 95, 4501 ), og ammonolyse samt hydrasinolyse (Bodanszky, et al., Chem. Ind., 1964, 1423), hydrogenolyse (Jones, Tetrahedron Lett. 1977, 2853 og Schlatter, et al., Tetrahedron Lett. 1977, 2861)) og fotolyse (Rich og Gurwara, J. Am. Chem. Soc, 1975, 97, 1575 ) ) .

I kontrast til den kjemiske syntesen av "normal" peptider kan trinnvis kjededannelse av achirale PNA som de som er basert på aminoetylglysyl skjelett enhetene binde enten fra N-terminusen eller C-terminusen på grunn av at koblingsreaksjonene er fri rasemisering.

Basert på kjennsgjerningen at de fleste operasjonene er identiske i syntesesyklusene til fast-fase peptidsyntesen (som også er tilfelle for fast-fase PNA syntese), ble en ny matrix PEPS, nylig introdusert (Berg, et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8024, og Internasjonal Patentsøknad WO 90/02749) for å lette preparering av et stort antall peptider. Denne matrixen består av en polyetylen (PE) film med utragende lang-kjedede polystyren (PS) podninger (molekylvekt i størrelse på 10^). Belastningskapasiteten til filmen er like høy som i en kuleformig matrix, men PEPS har den ytterligere fleksibiliteten for å tilfredsstille multipel synteser samtidig. I en ny konfigurasjon for fast-fase peptidsyntese er PEPS filmen konstruert i form av diskrete, merkede ark hvor hver virker som en individuell del. Iløpet av alle identiske trinn ved syntesesyklusene blir arkene holdt sammen i en enkelt reaksjonsbeholder for å muliggjøre samtidig preparering av mange peptider ved en rate som er nære opp til et enkelt peptid ved hjelp av konvensjonelle metoder. Det ble resonert at PEPS-filmbæreren, omfattende linker eller spacer-grupper tilpasset til den spesielt gjeldende kjemien burde være spesielt verdifull ved syntese av multiple PNA molekyler, idet disse er enkle å syntetisere på grunn av at bare fire foreskjellige reaksjons-deler er normalt nødvendig, en av hver av de fire "pseudo-nukleotid" enhetene. PEPS-filmbæreren har derfor blitt vellykket testet i et antall PNA synteser utført på en parallell og vesentlig simultan måte. Utbyttet og kvaliteten til produktene oppnådd fra PEPS var sammenlignbar med de som ble oppnådd ved anvendelse av den tradisjonelle polystyren kuleformige bæreren. Eksperimenter med andre geometrier av pepspolymeren så som f.eks. ikke-vevd felt, knyttet nett, pinner eller mikrobrønnplater har ikke indikert noen begrensninger ved synteseeffektiviteten.

To andre metoder foreslått for den samtidige syntensen av et stort antall peptider vedrører også fremstilling av mange forskjellige PNA molekyler. Den første av disse metodene

(Geysen, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1984, 81, 3998)

anvender akryliske syre-podede poletylen-staver og 96-. mikrotiter brønner for å imobilisere de voksende peptidkjedene og å utføre den oppdelte sytensen. Fremgangsmåten er bare anvendbar på en mikrogramskala. Den andre metoden

(Houghten, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1985, 82, 5131)

anvender en "tepose" inneholdende tradisjonelt-anvendte polymerkuler. Andre relevante forslag for multippelt peptid eller PNA syntese i foreliggende oppfinnelse omfatter den samtidige anvendelsen av to forskjellige bærere med forskjellige tettheter (Tregear, i "Chemistry and Biology og Peptides", J. Meienhofer, ed., Ann Arbor Sei. Publ., Ann Arbor, 1972, s. 175-178), kombinering av reaksjonsbeholdere via en manifold (Gorman, Anal. Biochem., 1984, 136, 397), flerkolonne fast-fase syntese (f.eks. Krchnak, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1989, 33, 209), og Holm og Meldal i "Proceedings of the 20th European Peptide Symposium", G. Jung og E. Bayer, eds., Walter de Gruyter & Co., Berlin 1989, s. 208-210), og anvendelse av cellulosepapir (Eichler, et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 1989, 54, 1746).

Idet den konvensjonelle kryss-bundede styren/divinylbensenko-polymer matrixen av PEPS bæreren for tiden er foretrukket når det gjelder fast-fase PNA syntese utgjøre en ikke-begrensende liste av eksempler på faste bærere som kan være relevante: (1) Partikler basert på kopolymerer av dimetylakrylamid kryss-bundet med N,N'-bisakryloyetylendiamin, inkludert en kjent mengde N-tertbutoksykarbonyl-beta-alanyl-N'-akryloyl-heksametylendiamin. Flere spacermolekyler blir vanligvis tilsatt via betaalanylgruppen etterfulgt av aminosyre residiet subenhet. Dette alanyl-inneholdende monomer kan også bli erstattet med en akryloylsarkosinmonomer iløpet av polymeriseringen for å danne harpikskuler. Polymeriseringen blir etterfulgt av reaksjon av kulene med et etylendiamin for å danne harpikspartikler som inneholder primære aminer som kovalentlig koblet funksjonalitet. De polyakrylamid-baserte bærerene er relativt mer hydrofile enn polystyren-baserte bærere og blir vanligvis anvendt med polaraprotiske oppløs-ningsmidler inkludert dimetylformamid, dimetyl-asetamid, N-metylpyrrolidon o.l. (se Atherton, et al., J. Am. Chem. Soc, 1975, 97, 6584, Bioorg. Chem. 1979, 8, 351) og J.C.S. Perkin I 538 (1981)), (2) en annen gruppe av faste bærere er basert på silika-inneholdende partikler så som porøse glasskuler og silikagel. Eksempel er reaksjonsproduktet til triklor-[3-(4-klormetyl)-fenyl]propylsilan og porøse glasskuler (se Parr og Grohmann, Angew. Chem. Internal. Ed. 1972, 11, 314) solgt under varemerket "PORASIL E" av Waters Associates, Framing-ham, MA, USA. Likeledes er en monoester av 1,4-dihyroksyme-tylbensen og silika (solgt under varemerket "BIOPAK" av Waters Associates) blitt rapportert å være nyttig (se Bayer og Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503), (3) en tredje generell type av nyttige faste bærere kan bli betegnet kompositter p.g.a. at de inneholder to hovedingredienser: En harpiks og et annet materiale som er også vesentlig inert for de anvendte organiske syntesereaksjonsbetingelsene. Et eksempel på en kompositt (se Scott, et al., J. Chrom. Sei., 1971, 9, 577) anvender glasspartikler belagt med en hydrofob, kryss-bundet styrenpolymer inneholdende reaktive klormetyl-grupper og var fra Northgate Laboratories, Inc., Hamden, CT, USA. ET annet eksempel på en kompositt inneholder en kjerne av fluorbehandlet etylpolymer hvor det er blitt podet polystyren (se Kent og Merrifield, Israel J. Chem. 1978, 17, 243) og van Rietschoten i "Peptides 1974", Y. Wolman, Ed., Wiley og Sons, New York, 1975, s. 113-116), og (4) kontinuer-lige faste bærere forskjellig fra PEPS, så som bomullsark (Lebl og Eichler, Peptide Res. 1989, 2, 232) og hyrdoksypro-pylakrylat-belagte polypropylenmembraner (Daniels, et al., Tetrahedron Lett. 1989, 4345), er egnede for PNA syntesen.

Enten manuelt eller automatisk drevet blir fast-fase PNA syntesen ifølge foreliggende oppfinnelse normalt utført i batcher. Det meste av syntesene kan også bli utført på kontinuerlig-strømningsvis måte hvor bæreren er pakket i kolonner (Bayer, et al., Tetrahedron Lett., 1970, 4503 og Scott, et al., J. Chromatogr. Sei., 1971, 9, 577). Med hensyn på kontinuerlig-strømning fast-fase syntese ser det ut som om den rigide poly(dimetylakrylamid)-Kieselguhr bæreren

(Atherton, et al. , J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1981, 1151)

er spesielt vellykket, men andre verdifulle konfigurasjoner vedrøre den som er dannet for standard kopoly(styren-1%)divinylbensen) bæreren (Krchnak, et al., Tetrahedron Lett., 1987, 4469).

Fast-fase teknikken er for tiden foretrukket når det gjelder PNA syntese, men andre metodologier eller kombinasjoner derav, f.eks., i kombinasjon med fast-fase teknikken kan også anvendes: (1) klassiske oppløsnings-fasemetodene peptidsyntese (f. eks., Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin-New York 1984), enten ved trinnvis oppstilling eller ved segment/fragmentkondensasjon er av spesiell relevanse med betraktning av spesielt produksjoner i stor skala (gram, kilogram og til og med tonn) av PNA forbindelsene , (2) den såkalte "væske-fase" strategien som anvender oppløselige polymeriske bærere så som lineær polystyren (Shemyakin, et al., Tetrahedron Lett., 1965, 2323) og poletylenglykol (PRG) (Mutter og Bayer, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1974, 13,88) er nyttig (3) tilfeldig polymerisasjon (se f.eks. Odian, "Principles of Polymerization", McGraw-Gukk, New York (1970)) som gir blandinger av mange molekylvekter ("polydisperse" ) peptid eller PNA molekyler er spesielt relevante for screening av antivirale effekter, (4) en teknikk basert på anvendelsen av polymer-bårede aminosyreaktive estere (Fridkin, et al., J. Am. Chem. Soc, 1965, 87, 4646 ), noen ganger referert til som "invers Merrifield syntese" eller "polymerisk reagenssynte-se", gir fodelen av isolering og rensing av mellomprodukter og kan dermed tilveiebringe en spesielt egnet metode for syntese av PNA molekyler med middels størrelse som eventuelt er beskyttede og som deretter kan bli anvendt for fragment-kondensasjon til større PNA molekyler, (5) det blir betraktet at PNA molekylet kan bli kapslet enzymatisk av enzymer så som proteaser eller derivater derav med nye spesifisiteter (oppnådd f.eks. ved hjelp av kunstige midler så som pro-teinomkonstruering). Noen kan også betrakte utvikling av "PNA ligaser" for kondensasjonen av et antall PNA fragmenter til meget store PNA molekyler, (6) p.g.a. at antistoffer kan bli dannet for omtrent et hvilket som helst molekyl av interesse kan de nye utviklede katalytiske antistoffene (absymene), oppdaget samtidig av gruppene til Lerner (Tramantano, et al., Science, 1986, 234, 1566) og Schultz (Pollack, et al., Science, 1986, 234, 1570) bør også bli betraktet som potensielle kandidater for oppstilling av PNA molekyler. Det har derfor vært betraktelig suksess når det gjelder produsering av absymer som katalyserer absyl-transfer reaksjoner (se f.eks. Shokat, et al., Nature, 1989, 338, 269) og referansene deri). Fullstendige kunstige enzymer ble nylig laget av gruppen til Stewart (Hahn, et al., Science, 1990, 248, 1544) og kan bli utviklet for å tilfredsstille PNA syntese. Konstruksjon av generelt anvendbare enzymer, ligaser og katalytiske antistoffer som kan formidle spesifikke koblingsreaksjoner ville bli lettere oppnådd for PNA syntese enn for "normal" peptidsyntese på grunn av at PNA molekyler ofte består av bare 4 forskjellige aminosyrer (en for hver av de fire native nukleobasene) sammenlignet med de 20 naturlige ved "occurring" (proteinogeniske) aminosyrer som utgjør peptider. Ikke en eneste bestemt strategi er fullstendig egnet for syntese av et spesifikt PNA molekyl og derfor er det noen ganger best med en kombinasjon av metoder. (a) Eksperiment for syntese av monomere byggestener.

Monomerene blir fortrinnsvis syntetisert ved hjelp av det generelle skjemaet som er beskrevet i fig. 8. Dette involverer preparering av enten metyl eller etylesteren til

(Bocaminoetyl)glysin med en beskyttelses-/avspaltningsprose-dyre som beskrevet i eksemplene 21-23. Syntese av thyminmonomeren er beskrevet i eksemplene 24-25 og den til den beskyttede cytozinmonomeren er beskrevet i eksempel 26.

Syntese av beskyttet adeninmonomer (fig. 14) involverer alkylering med etylbromasetat (eksempel 27) og verifisering av substitusjonsposisjonen ved røntgenkrystallografi, som ønsket 9-posisjon. N^-aminogruppen ble deretter beskyttet med besnyloksykarbonylgruppen ved anvendelse av reagenset N-etyl-benzyloksykarbonylimidasoltetrafluorborat (eksempel 28). Enkel hydrolyse av produkt ester (eksempel 29) ga N^-benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyladenin som deretter ble anvendt i standardprosedyren (eksemplene 10-11), fig. 8). Adeninmonomeren er blitt dannet til to forskjellige PNA-oligomerer (eksempel 30 og 31).

Syntese av beskyttet G-monomer er beskrevet i fig. 15. Utgangsmaterialet, 2-amin-6-klorpurin, ble alkylert med bromeddiksyre (eksempel 32) og kloratomet ble deretter substituert med en benzyloksygruppe (eksempel 36). Den resulterende syren ble koblet til (bokaminoetyl)glysinmetylester (eksempel 33) med midlet PyBrop™ og den resulterende esteren ble hydrolisert (eksempel 23). 0^-benzyl-gruppen ble fjernet i det endelige HF-spaltningstrinnet ved syntese av PNA-oligomeren. Spaltningen ble verifisert ved å finne den ventede massen til den endelige PNA-oligomeren ved inkorporering til en PNA-oligomer ved anvendelse av diisopro-pylkarbodiimid som kondenseringsmiddel (eksempel 52).

Følgende forkortelser blir anvendt i de eksperimentelle eksemplene: DMF, N,N-dimetylformamid, DCC , N,N-disykloheksylkarbodiimid, DCU, N,N-disykloheksylurea, THF tetrahydro-furan, aeg, N-acetyl (2'-aminoetyl)glysin, pfp, pentafluorfe-nyl, Boe, tert-butoksykarbonyl, z, benzyloksykarbonyl, NMR, nuklear magnetisk magnetisk resonnans, s, singlet, d, dublett, dd, dublett av dubletter, t, triplett, kvartett, m, multiplett, b, bred, S, kjemisk skift.

NMR spektra ble registrert på enten et JEOL FX 900 spektrome-ter eller en Bruker 250 MHz med tetrametylsilan som indre standard. Massespektrometri ble utført på et MassLab VG 12-250 kvadropolinstrument utstyrt med en VG FAB kilde og probe. Smeltepunktene ble registrert på Buchi smeltepunkt apparatur er ukorrigerte. N,N-dimetylformamid ble utført over 4Å molekylære sikter, destillert og lagret over 4Å molekylær-sikter. Pyridin (HPLC kvalitet) ble tørket og lagret over 4 Å molekylære sikter. Andre oppløsningsmidler som ble anvendt var enten med høyest kvalitet eller som på forhånd var destillert. Dioksan ble sendt igjennom basisk aluminiumok-syd før bruk. Bocanhydrid, 4-nitrofenol, metylbromasetat, benzyloksykarbonylklorid, pentafluorfenol ble alle oppnådd gjennom Aldrich Chemical Company. thymin, cytozin, adenin ble alle oppnådd fra Sigma.

Tynnsjiktskrommatografi (Tic) ble utført ved anvendelse av følgende oppløsningsmiddelsystemer: (1) kloroform:trietylamin:metanol, 7:1:2, (2) metylenklorid:metanol, 9:1, (3) kloroform:metanoleddiksyre 85:10:5. Flekkene ble visualisert ved UV (254 nm) eller/og spraying med en ninhydrinoppløsning (3 g ninhydrin i 1000 ml 1-butanol og 30 ml eddiksyre), etter oppvarming ved 120°C i 5 min. og etter spraying, ny oppvarming.

Utvidete skjeletter ("backbones")

Variasjoner av gruppene A, C og D (fig. 16) ble demonstrert ved syntese av monomeriske byggesten inkorporering til PNA-ol igomerer .

I et eksempel var C gruppen en CH(CH3) gruppe. Syntesen av den tilsvarende monomeren er beskrevet i fig. 17. Det involverer preparering av Boc-beskyttet l-amino-2,3-pro-pandiol (eksempel 35) som blir spaltet av periodat til bokaminoasetaldehyd som blir anvendt direkte i neste reaksjon. Bokamonoasetaldehydet kan bli kondensert med forskjellige aminer og i eksempel 36 ble alaninet etylester anvendt. I eksemplene 17-19 ble de tilsvarende thymin-monomerene dannet. Monomeren er blitt inkorporert til en 8-mer med DCC-koblingsprotokollen (eksemplene 30 og 31).

I et annet eksemple er D-gruppen (CHg^ gruppen. Syntese av den tilsvarende monomeren er beskrevet i fig. 18.A og beskrevet i eksemplene 40 og 46.

I et annet eksempel er A-gruppen (CH2)2C0 gruppen. Syntese av den tilsvarende thyminmonomeren er beskrevet i fig. 18.B og eksemplene 42 til og med 45.

I et annet eksempel er C-gruppen en (Cltø^ gruppe. Syntese av thymin og beskyttet cytozinmonomer er beskrevet i fig. 19 og eksemplene 46 til og med 51. Hybridiseringseksperimentene med en PNA-oligomer innholdende en enhet er beskrevet i eksempel 61 som viser en signifikant senkning av affiniteten, men en retensjon av spesifisiteten.

Eksempel 1.

tert-Butyl 4-nitrofenylkarbonat

Natriumkarbonat (29,14 g, 0,275 mol) og 4-nitrofenol (12,75 g, 91,6 mmol) ble blandet med dioksan (250 ml). Boc-anhydrid

(20,0 g, 91,6 mmol) ble overført til en blanding med dioksan (50 ml). Blandingen ble tilbakestrømmet ilt, avkjølt til 0°C, filtrert og konsentrert til 1/3 og deretter helt inn i vann (350 ml) ved 0°C. Etter omrøring i 1/2 t ble produktet samlet ved filtrering, vasket med vann og deretter tørket over sikapent i våkum. Utbyttet var 21,3 g (97$). Sm.p. 73,0-74,5°C (litt. 78,5-79,5°C). Anal. for C11<H>13N05 beregnet C: 55,20(55,23) H: 5,61(5,48) N: 5,82(5,85).

Eksemple 2.

(N'-Boc-2'-aminoetyl)glysin (2)

Tittelforbindelsen ble dannet ved en modifikasjon av prosedyren til Heimer, et al., N-(2-Aminoetyl)glysin (1, 3,00 g, 25,4 mmol) ble løst opp i vann (50 ml), dioksan (50 ml) ble tilsatt og pH ble justert til 11,2 med 2 N natriumhydroksid. tert-Butyl-4-nitrofenylkarbonat (7,29 g, 30,5 mmol) ble løst opp i dioksan (40 ml) og dråpevis tilsatt over en periode på 2 t og iløpet av denne tiden ble pH opprett-holdt ved 11,2 med 2 N natriumhydroksid. pH ble justert periodisk til 11,2 i tre eller flere timer og deretter ble oppløsningen latt stå over natt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og pH ble forsiktig justert til 3,5 med 0,5 M saltsyre. Den vandige oppløsningen ble vasket med kloroform (3 x 200 ml), pH justert tol 9,5 med 2N natriumhydroksid og oppløsningen ble avdampet til tørrhet i våkum (14 mmHg). Resten ble ekstrahert med DMF (25+2x10 ml) og ekstraktene filtrert for å fjerne salt i overskudd. Dette resulterer i en oppløsning av tittelforbindelsen i omtrent 60$ utbytte og mer enn 95$ renhet ifølge tic (system 1 og visualisert med ninhydrin, Rf=0,3). Oppløsningen ble anvendt i følgende prepareringer av Boc-aeg derivatere uten ytterligere rensning.

Eksempel 3.

N-l-Karboksymetylthymin (4)

Denne prosedyren er forskjellig fra litteratursyntesen, men er lettere, gir høyere utbytter og etterlater ikke noe ureagert thymin i produktet. Til en suspensjon av thymin (3, 0,40 g, 0,317 mol) og kaliumkarbonat (87,7 g, 0,634 mmol) in DMF (900 ml) ble det tilsatt metylbromasetat (30,00 ml, 0,317 mmol). Blandingen ble omfattende omrørt over natt under nitrogen. Blandingen ble filtrert og avdampet til tørrhet i våkum. Den faste resten ble behandlet med vann (300 ml) og 4 N saltsyre (12 ml), omrørt i 15 min. av 0°C filtrert og vasket med vann (2 x 75 ml). Presipitatet ble behandlet med vann (120 ml) og 2N natriumhydroksid (60 ml) og ble kokt i 10 min. Blandingen ble avkjølt til 0°C, filtrert og den rene tittelforbindelsen ble presipitert ved tilsetning av 4 N saltsyre (70 ml). Utbyttet etter tørking i våkum over sikapent: 37,1 g (64$). ^H-NMR: (90 MHz, DMS0-d6): 11,33 ppm (2,1H,NH), 7,49(d,J=0,92Hz,1H,ArH), 4,38 (s,2H,CH2), 1,76 (d,J=0,92Hz,T-CH3).

Eksempel 4.

N-l-Karboksymetylthyminpentfluorfenylester ( 5)

N-l-Karboksymetylthymin (4, 10,0 g, 54,3 mmol) og pentafluorfenol (10,0 g, 54,3 mmol) ble løst opp i DMF (100 ml) og avkjølt til 5°C i isvann. DCC (13,45 g, 65,2 mmol) ble deretter tilsatt. Når temperaturen gikk under 5°C ble isbadet fjernet og blandingen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket to ganger med DMF (2 x 10 ml). Det kombinerte filtratet ble helt i eter (1400 ml) og avkjølt til 0°C. Petroleumeter (1400 ml) ble tilsatt og blandingen ble latt stå over natt. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og grundig vasket med petroleumeter. Utbytte: 14,8 g (78$). Produktet var rent nok for å utføre reaksjon, men en analytisk prøve ble oppnådd ved omkrystallisering fra 2-propanol. Sm.p. 200,5-206°C Anal. for C13H7F5N204. Funnet (beregnet) C: 44,79(44,59), H: 2,14(2,01) N: 8,13(8,00), FAB-MS: 443 (M+l+glyserol), 351 (M+l ) . <3->H-NMR (90 MHz , DMS0-d6 ) : 11,52 ppm (s.lH.NH), 7,64 (s.lH.ArH), 4,99 (s,2H,CH2), 1,76 (s,3H,CH3).

Eksempel 5.

1-(Boc-aeg)thymin (6)

Til DMF-oppløsningen ovenfor ble det tilsatt trietylamin (7,08 ml, 50,8 mmol) etterfulgt av N-l-karboksymetyltymipen-tafluorfenylester (5, 4,45 g, 12,7 mmol). Den resulterende oppløsningen ble omrørt ilt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og behandlet med kation byttemateriale ("Dowex 50W X-8" , 40 g) i 20 min. Kation byttemater ialet ble fjernet ved filtrering, vasket med diklormetan (2 x 15 ml) og diklormetan (150 ml) ble tilsatt. Den resulterende oppløsningen ble vasket med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum, først av en vannutsuger og deretter ved en oljepumpe. Resten ble ristet med vann (50 ml) og avdampet til tørrhet. Denne prosedyren ble gjentatt en gang. Resten ble deretter løst opp i metanol (75 ml) og helt inn i eter (600 ml) og petroleumeter (1,4 L). Etter omrøring over natt ble det hvite, faste stoffet isolert ved filtrering og vasket med petroleumeter. Tørking over sikapent i våkum ga 3,50 g (71,7 %). Sm.p.142-147°C. Analyse for C16<H>24<N>407. Funnet (beregnet) C: 49,59(50,00) H: 6,34(6,29 ) N: 14,58(14,58). ^-H-NMR (250 MHz, DMS0-d6): På grunn av begrenset rotasjon rundt den sekundære amidbindingen ble flere av signalene doblet i forholdet 2:1, (indikerte listen ved mj . for major og mi. for minor). 12,73 ppm (b,lH, -C02H), 11,27 ppm (s, mj., imide), 11,25 ppm (s, mi., imide), 7,30 ppm (s, mj., ArH), 7,26 ppm (s, mi., ArH), 6,92 ppm (unres. t, mj . , BocNH), 6,73 ppm (unres. t, mi., BocNH), 4,64 ppm (2, mj., T-CH2-C0-), 4,47 ppm (2, mi., T-CH2-C0-), 4,19 ppm (s, mi., C0NRCH2C02H), 3,97 ppm (2, m j . , CONCH2-C02H), 3,41-2,89 ppm (unres. m, -CH2CH2- og vann), 1,75 ppm (2,3H, T-CH3), 1,38 ppm (s, 9H, t-Bu). 1<3>C-NMR: 170,68 ppm (CO), 170,34 (CO), 167,47 (CO), 167,08 (CO), 164,29 (CO), 150,9 (C5"), 141,92 (C6"), 108,04 (C2'), 77,95 og 77,68 (Thy-CH2CO), 48,96, 47,45 og 56,70 (CH2CH2- ogNCH2C02H), 37,98 (Thy-CH3), 28,07 (t-Bu). FAB-MS: 407 (M+Na<+>), 385

(M+H<+>).

Eksempel 6.

l-(Boc-aeg)thyminpentafluorfenylester (7, Boc-Taeg.OPfp) l-(Boc-aeg)thymin (6) (2,00 g, 5,20 mmol) ble løst opp i DMF (5 ml) og metylenklorid (15 ml) ble tilsatt. Pentafluorfenol (1,05 g, 5,72 mmol) ble tilsatt og oppløsningen ble avkjølt til 0°C i isbad. DDC ble deretter tilsatt (1,29 g, 6,24 mmol) og isbadet ble fjernet etter 2 min. Etter 3 t ved omrøring ved romtemperatur ble presipitert DCU fjernet ved filtrering og vasket med metylenklorid. Det kombinerte filtratet ble vasket to ganger med en vanndig natriumhydrogenkarbonat og en gang med en metted natriumfluorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Den faste resten ble løst opp i dioksan (150 ml) og helt inn i vann (200 ml) ved 0°C. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket over sikapent i våkum. Utbytte: 2,20 g ( 77%). En analytisk prøve ble oppnådd ved omkrystallisering fra 2-propanol. Sm.p. 174-175,5°C. Analyse for C22<H>23<N>4<0>7F5, funnet (beregnet): C: 48,22(48,0-1), H: 4,64(4,21), N: 9,67(10,18). -'■H-NMR (250 MHz, CDC13): På grunn av begrenset rotasjon rundt den sekundære amidbindingen ble flere av signalene doblet i forhold 6:1 (som idikert i listen med mj . for major og mi. for minor). 7,01 ppm (s, mi., arH), 6,99 ppm (s, mj., ArH), 5,27 ppm (unres. t, BocNH), 4,67 ppm (s, mj., T-CH2-C0-) , 4,60 ppm (s, mi., T-CH2-C0-), 4,45 ppm (s, mj., C0NRCH2C02Pfp) , 4,42 ppm (s, mi., C0NRCH2C02Pfp) , 3,64 ppm (t,2H,BocNHCH2CH2-), 3,87ppm

(<M>q",2H,BocNHCH2CH2-), 1,44 (s,9H,t-Bu). FAB-MS: 551 (10, M+l), 495 (10, M+l-tBu), 451 (80, Boe).

Eksempel 7.

N<4->Benzyloksykarbonylcytozin (9)

Over en periode på 1 t ble benzyloksykarbonylklorid (52 ml, 0,36 mol) tilsatt dråpevis til en suspensjon av cytozin (8, 20,0 g, 0,18 mol) i tørr pyridin (1000 ml) ved 0°C under nitrogen i ovnstørket utstyr. Oppløsningen ble deretter omrørt over natt og pyridinsuspensjonen ble deretter avdampet til tørrhet i våkum. Vann (200 ml) og 4 N saltsyre ble tilsatt for å oppnå pH -1. Det resulterende hvite presipitat ble filtrert ut, vasket medvann og delvis tørket av luftsug. Det forsatt våte presipitatet ble kokt med absolutt etanol (500 ml) i 10 min., avkjølt til 0°C, filtrert, vasket grundig med eter og tørket i våkum. Utbytte: 24,7 g (54$). Sm.p. >250°C. analyse for <C>^2<H>^2<N>3°3- Funnet (beregnet), C: 58,59(58,77), H: 4,55(4,52), N: 17,17(17,13). Det ble ikke registrert NMR spektra på grunn av at det ikke var mulig å løse opp produktet.

Eksempel 8.

N<4->Benzyloksykarbonyl-N<1->karboksymetylcytozin (10)

I en trehalset rundbundet flaske ustyrt med mekanisk røring og nitrogentilførsel ble det plassert metylbromasetat (7,82 ml, 82,6 mmol) og en suspensjon av N<4->benzyloksykarbonyl-cytozin (9, 21,Og, 82,6 mmol) og kaliumkarbonat (11,4 g, 82,6 mmol) i tørr DMF (900 ml). Blandingen ble omfattende omrørt over natt, filtrert og avdampet til tørrhet i våkum. Vann (300 ml) og 4 N saltsyre (10 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 15 minutter ved 0°C, filtrert og vasket med vann (2 x 75 ml). Det isolerte presipitatet ble behandlet med vann (120 ml), 2N natriumhydroksid (60 ml), omrørt i 30 min., filtrert, avkjølt til 0°C og 4 N saltsyre (35 ml) ble tilsatt. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering, vasket grundig med vann, omkrystallisert fra metanol (1000 ml) og vasket grundig med eter. Dette ga 7,70 g (31$) ren forbindelse. Morvæsken fra omkrystalliseringen ble redusert til et volum på 200 ml og avkjølt til 0°C. Dette ga ytterligere 2,30 g av et materiale som var rent ifølge tic, men som hadde en rødaktig farge. Sm.p. 266-274°C. Analyse for C14<H>13N305. Funnet (beregnet), C: 55,41(55,45), H: 4,23(4,32), N: 14,04(13,86). ^H-NMR (90 MHz, DMS0-d6): 8,02 ppm (d,J=7 ,32Hz,lH,H-6), 7,39 (s,5H,Ph), 7,01 (d,J=7,32Hz,1H-,H-5), 5,19 (s,2H,PhCH2-), 4,52 (s,2H).

Eksempel 9.

N<4->Benzyloksykarbonyl-N<1->karboksymetyl-cytozinpentafluorfeny-lester (11)

N<4->Benzyloksykarbonyl-N<1->karboksymetyl-cytozin (10, 4,00 g-, 13,2 mmol) og pentafluorfenol (2,67 g, 14,5 mmol) ble blandet med DMF (70 ml), avkjølt til 0°C med isvann og DCC (3,27 g, 15,8 mmol) ble tilsatt. Isvannet ble fjernet etter 3 min. og blandingen ble omrørt i 3 t ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering, vasket med DMF og filtratet ble avdampet til tørrhet i våkum (0,2 mmHg). Den faste resten ble behandlet med metylenklorid (250 ml), omfattende omrørt i 15 min., filtrert, vasket to ganger med fortynnet natriumhydrogenkarbonat og en gang med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Den faste resten ble omkrystallisert fra 2-propanol (150 ml) og krystallene ble grundig vasket med eter. Utbytte 3,40 g (55$). Sm.p. 241-245°C. Analyse forC2rjH12N3F505. Funnet (beregnet), C: 51,56(51,18), H: 2,77(2,58), N: 9,24(8,95). <X>H-NMR (90 MHz, CDC13): 7,66 ppm (d , J=7 ,63Hz , 1H ,H-6 ) , 7,37 (s,5H,Ph), 7,31 (d,J=7,63Hz,lH,H-5), 5,21 (s,2H,PhCH2-), 4,97 (s,2H,NCH2-). FAB-MS: 470 (M+l).

Eksempel 10.

N<4->Benzyloksykarbonyl-l-Boc-aeg-cytozin (12)

Til en oppløsning av (N-Boc-2-aminoetyl)glysin (2) i DMF, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble det tilsatt trietylamin (7,00 ml, 50,8 mmol) og N<4->benzyloksykarbonyl-N<1->karboksyme-tylcytozinpentafluorfenylester (11, 2,70 g, 5,75 mmol). Etter omrøring av oppløsningen ilt ved romtemperatur ble metylenklorid (150 ml) metted natriumklorid (250 ml), og 4 N saltsyre til pH -1 tilsatt. Det organiske laget ble separert og vasket to mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum, først med en vannutsuger og deretter med en oljepumpe. Den oljeholdige resten ble behandlet med vann (25 ml) og ble på ny avdampet til tørrhet i våkum. Denne prosedyren ble deretter gjentatt. Den oljeholdige resten (2,80 g) ble deretter løst opp i metylenklorid (100 ml), petroleumeter (250 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt over natt. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og vasket med petroleumeter. Tic (system 1) viste vesentlige mengder pentafluorfenol, men det ble ikke gjort noe forsøk på å fjerne det. Utbytte: 1,72 g (59$). Sm.p. 156°C(decomp. ) . <1->H-NMR (250 MHz, CDC13): På grunn av begrenset rotasjon rundt den sekundære amidbindingen ble flere av signalene doblet i forholdet 2:1 (indikert i listen med mj . for major og Mi. for minor). 7,88 ppm (dd,lH,H-6), ,39 (m,5H,Ph), 7,00 (dd,1H-H-5), 6,92 (b,lH,BocNH), 6,74 (b,1H,ZNH)-?, 5,19 (s,2H,Ph-CH3 ) , 4,81 ppm (s.mj., Cyt-CH2-C0-), 4,62 ppm (s,mi., Cyt-CH2-C0-), 4,23 (s, mi., C0NRCH2C02H) , 3,98 ppm (s, mj. , C0NRCH2C02H), 3,42-3,02 (unres. m, -CH2CH2- og vann), 1,37 (s,9H,tBu). FAB-MS: 504 (M+l), 448 (M+l+tBu).

Eksempel 11.

N4 -Benzy lok sykarbonyl -1 - Boc-aeg-cytozinpentaf luorf enylester

(13)

N<4->Benzyloksykarbonyl-l-Boc-aeg-cytozin (12, 1,50 g, 2,98 mmol) og panetafluorfenol (548 mg, 2,98 mmol) ble løst opp i DMF (10 ml) metylenklor id (10 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0°C i et isbad og DCC (676 mg, 3,28 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 3 min. og blandingen ble omrørt i 3 t. ved romtemperatur. Presipitatet ble isolert ved filtrering og vasket en gang med metylenklorid. Presipitatet ble løst opp i kokende dioksan (150 ml) og oppløsningen ble avkjølt til 15°C, hvorved DCU presipitert. DCU ble fjernet ved filtrering og det resulterende filtratet ble helt inn i vann (250 ml) ved 0°C. Forbindelsen ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket over sikapent i våkum. Utbytte: 1,30 g (65$). Analyse for C29<H>28<N>5°8F5• Funnet (beregnet), C: 52,63(52,02), H: 4,41(4,22), N: 10,55(10,46). ^H-NMR (250 MHz, MDS0-d6): viste vesentlige spektra til ovennevnte syre, sannsynligvis forårsaket av hydrolyse av esteren. FAB-MS: 670 (M+l), 614 (M+l+-tBu).

Eksempel 12.

4-Klorkarboksy-9-klorasridin

4-karboksyasridon (6,25 g, 26,1 mmol), tionylklorid (25 ml) og 4 dråper DMF ble forsiktig oppvarmet under en nitro-genstrøm helt til alt det faste materialet var løst opp. Oppløsningen ble deretter tilbakestrømmet i 40 min. Oppløsningen ble avkjølt og tionylklorid i overskudd ble fjernet i våkum. Siste spor av tionylklorid ble fjernet ved koavdampning med tørr bensen (tørket over Na-Pb) to ganger. Det gjenværende gule pulveret ble anvendt direkte i neste reaksjon.

Eksempel 13.

4-(5-Metoksykarbonylpentylamidokarbonyl)-9-klorasridin

Metyl 6-aminoheksanoathydroklorid (4,70 g, 25,9 mmol) ble løst opp i metylenklorid (90 ml), avkjølt til 0°C og trietylamin (15 ml) ble tilsatt og den resulterende oppløs-ningen ble deretter øyeblikkelig tilsatt til syrekloridet fra ovenfor. Den rundbunnede flasken inneholdende syrekloridet ble avkjølt til 0°C i et isbad. Blandingen ble omfattende omrørt i 30 min. ved 0°C og 3 t. ved romtemperatur. Den resulterende blandingen ble filtrert for å fjerne gjenværende faste stoffer som ble vasket med metylenklorid (20 ml). Det rødbrune metylenkloridfiltratet ble deretter vasket to ganger med mettet natriumhydrogenkarbonat, en gang med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Til den resulterende oljeholdige forbindelsen ble det tilsatt tørr bensen (35 ml) og ligroin (60-80°C, tørket over Na-Pb). Blandingen ble oppvarmet til - tilbakeløp. Aktivert karbon og selit ble tilsatt og blandingen ble tilbakestrømmet i 3 min. Etter filtrering ble tittelforbindelsen krystallisert ved avkjølig med magnetisk røring. Det ble isolert ved filtrering og vasket med petroleumeter. Produktet ble lagret over fast kaliumhydroksid. Utbytte 5,0 g (50$).

Eksempel 14.

4-( 5-Metoksykarbonylpentyl)amidokarbony1-9-[6'-(4' ' -ni-trobensamido)heksylamino]-aminoasridin

4-(5-Metoksykarbonylpentylamidokarbony1)-9-klorasridin (1,30 g, 3,38 mmol) og fenol (5 g) ble oppvarmet til 80°C i 30 min. under en nitrogenstrøm og deretter ble 6-(4'-nitrobensamido)-1-heksylamin (897 mg, 3,38 mmol) tilsatt. Temperaturen ble øket til 120°C i 2 t. Reaks j onsblandingen ble avkjølt og metylenklorid (80 ml) ble tilsatt. Den resulterende oppløsningen ble vasket tre ganger med 2N natriumhydroksid (60 ml posjoner) og en gang vann, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i Våkum. Den resulterende røde oljen

(1,8 g) ble least opp i metylenklorid (40 ml), avkjølt til 0°C. Eter (120 ml) ble tilsatt og den resulterende oppløs-ningen ble omrørt over natt. Dette resulterte i en blanding av fast materiale og en olje. Det faste stoffet ble isolert ved filtrering. Det faste stoffet og oljen ble påny oppløst i metylenklorid (80 ml) og tilsatt dråpevis kald eter (150 ml). Etter 20 min. med omrøring ble tittelforbindelsen isolert ved filtrering i form av orange krystaller. Produktet ble vasket med eter og tørket i våkum over kaliumhydroksid. Utbytte 1,60 g ( 77%). Sm.p. 145-147°C.

Eksempel 15.

4-(5-Karboksyfentyl)aminokarbonyl-9-[6'-(4''-nitrobensamido)-heksylamino]-aminoasridin

4-(5-Metoksykarbonylpentyl)amidokarbonyl-9-[6'-(4''-ni - trobensamido )heksylamino]aminoasridin (503 mg, 0,82 mmol) ble løst opp i DMF (30 ml) og 2N natriumhydroksid (30 ml) ble tilsatt. Etter omrøring i 15 min. ble 2N saltsyre (35 ml) og vann (50 ml) tilsatt ved 0°C. Etter omrøring i 30 min. ble oppløsningen dekantert og ga en oljeholdig forbindelse som ble løst opp i kokende metanol (150 ml), filtrert og konsentrert til 1/3 volum. Til metanoloppløsningen ble det tilsatt eter (125 ml) og 5-6 dråper HC1 i etanol. Oppløs-ningen ble dekantert etter 1 t. omrøring ved 0°C. Den oljeholdige forbindelsen ble påny løst opp i metanol (25 ml) og presipitert med eter (150 ml). Tittelforbindelsen ble isolert som gule krystaller etter omrøring over natt. Utbytte 417 mg ( 80%). Sm.p. 173°C (dekomp.).

Eksempel 16.

(a) 4-(5-pentafluorfenyloksykarbonylpentyl)amidokarbonyl-9-[6'-(4''-nitrobensamido)heksylamino]-aminoasridin(Acr^Opfp)

Ovennevnte syre (300 mg, 0,480 mmol) ble løst opp 1 DMF (2 ml) og metylenklorid (8 ml) ble tilsatt. Pentafluorfenol (97 mg, 0,53 mmol) overført med 2 x 2 ml metylenklorid ble tilsatt. Den resulterende oppløsningen ble avkjølt til 0°C hvoretter DCC (124 mg, 0,60 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 5 minutter og blandingen ble latt stå med omrøring over natt. Presipitert DCU ble fjernet ved sentrifugering og sentrifugatet ble avdampet til tørrhet i våkum, ført med en vannutsuger og deretter med en oljepumpe. Resten ble løst opp i metylenklorid (20 ml), filtrert og avdampet til tørrhet i våkum. Resten ble påny løst opp i metyleklorid og petroleumeter (150 ml). En 1 ml del 5M HC1 eter ble tilsatt. Oppløsningsmiddelet ble fjernet ved dekantering etter 30 min. omrøring ved 0°C. Den gjenværende oljeholdige forbindelsen ble løst opp i metylenklorid (100 ml). Petroleumeter (150 ml) ble tilsatt og blandingen ble latt stå med røring over natt. Neste dag ble det gule presipiterte krystallinske materialet isolert ved filtrering og ble vasket med rikelig mengder petroleumeter. Utbytte etter tørking var 300 mg (78$). Sm.p. 97,5°C (dekomp.). Alle prøvene viste tilfredsstillende elementanalyse ^-H- og <13>C-NMR og massespektra. (b) Eksperimentelt for syntese av PNA forbindelser, jfr. fig. 8.

Materialer: Boc-Lys (C1Z), benshydrylamin-kopoly(styren-l$-divinylbensen harpiks (BHA harpiks) og p-metylbenshydrylamin-kopoly(styren-l$-divninylbensen) harpiks (MBHA harpiks) ble oppnådd fra Peninsula Laboratories. Andre reagenser og oppløsningsmidler var: Biograde trifluoreddiksyre fra Halocarbon Products, diisopropyletylamin (99$, ble ikke ytterligere destillert) og N-acetylimidasol (98$) fra Aldrich, H2O ble destillert to ganger, vannfri HF fra Union Carbide, sytesekvalitet N,N-dimetylformamid og analytisk kvalitet metylenklorid (ble ikke ytterligere destillert) fra Merck, HPLC kvalitet asetonitril fra Lab-Scan, purum kvalitet anisol, N,N'-disykloheksylkarbodiimid og puriss. kvalitet 2,2,2-trifluoretanol fra Fluka.

(b) Generelle metoder og anmerkninger

Dersom ikke annet er angitt gjelder følgende.

PNA forbindelsene ble sytetisert ved trinnvis fast-fase metoden (Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 2149 ) som anvender konvensjonell peptidkjemi ved anvendelse av TFA-labil tert-butyloksykarbonyl (Boe) gruppe for "temporær" N-beskyttelse (Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 1964, 86, 304 ) og mere syre-stabil benzyloksykarbonyl (Z) og 2-klorbenzyloksy-karbonyl (C1Z) grupper for "permanent" sidekjedebeskyttelse. For å oppnå C-terminale amider ble PNA oppstilt på HF-labile BHA ekker MBHA harpikser (MBHA harpiksen har øket mottakelighet for sluttlig HF spaltning relativt til usubstituert BHA harpiks (Matsueda, et al., Peptides, 1981, 2, 45 ). Alle reaksjonene (unntatt HF reaksjonene) ble utført i manuelt drevet standard fast-fase reaksjonsbeholdere utstyrt med en grov glassfritte (Merrifield, et al., Biochemistry, 1982, 21, 5020). Den kvantitative ninhydrinreaksjonen (Kaiser testen) som opprinnelig er utviklet av Merrifield og medarbeidere (Sarin, et al., Anal. Biochem., 1981, 117, 147) for peptider inneholdende "normale" aminosyrer ble med hell anvendt (se tabell I-III) ved anvendelse av den "normalt" anvendte effektive ekstingsjonskoeffisienten E 15000

M_<1>cm-<1> for alle residier for å bestemme fullstendigheten av individuelle koblinger samt måling av antall voksende peptidkjeder. Den teoretiske substitusjonen Sn_^ med kobling av residienummer n (med antagelse av både fullstendig avspaltning og kobling samt p.g.a at verken kjedeterminering eller tap av PNA kjeder iløpet av syntesesyklusen) blir beregnet fra ligningen: Sn = Sn_ 1 x (1 + Sn_-L x AMW x 10~<3> mmol/mol))-<1> hvor AMW er økningen i molekylvekt ([aMW] = g(mol) og Sn_^ er den teoretiske substitusjonen ved kobling av det foregående residiet n-1 ([S] =mmol/g). Den vurderte verdien (#) på grad av individuell kobling blir beregnet relativt til den målte substitusjonen (derson ikke S var bestemt) og omfatter korreksjon for antall gjenværende frie aminogrupper etter den tidligere syklusen. HF reaksjonene ble utført ie en Diaflon HF apparatur fra Tono Kasei (Osaka, Japan). Vydac C-^g (5 pm, 0,46 x 25 cm og 5 pm, 1,0 x 25 cm) reversf asekolonner ble anvendt for analytisk og semi-preparativ HPLC på et SP8000 instrument. Buffer A var 5 vol-$ asetonitril i vann inneholdende 445 ul trifluoreddiksyre pr. liter og buffer B var 60 vol-$ asetonitril i vann inneholdende 390 pl trifluoreddiksyre pr. liter. Den lineære gradienten var 0-100$ buffer B i 30 min., strømningsratene 1,2 ml/min. (analytisk) og 5 ml/min. (semipreparativ). Elueringsmidlene ble registrert ved 215 nm (analytisk) og 230 nm (semi-preparativ). Molekylvektene til PNA ble bestemt ved <252>Cf plasma desorpsjon "time-of-f1ight" massespektrometri fra gjennom-snittet til de mest hyppige isotopene.

Eksempel 17.

Fast-fase syntese av Acr-^-[Taeg] 15-NH2 og kortere derivater.

(a) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]15-BHA harpiks Syntesen ble initiert på 100 mg forsvellet og nøytralisert BHA harpiks (bestemt ved den kvantitative ninhydrinreaksjonen og inneholder 0,57 mmol NH2/g) ved anvendelse av enkeltkoblinger ("Synteseprotokoll 1") ved anvendelse av 3,2 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i omtrent 33$ DMF/CH2C12. De individuelle koblingsreaksjonene ble utført ved risting i minst 12 t. i en manuelt drevet 6 ml standard fast-fast reaksjonsbeholder og ureagert aminogruppe ble blokkert ved acetylering ved valgte stadier av sytesen. Progresjonen av kjedeelongeringen ble registrert ved flere stadier ved den kvantitative ninhydridreaksjonen (se tabell I). Deler av beskyttet Boe-[Taeg]5-BHA, Boe-[Taeg]10-BHA og Boe-[Taeg]15<->BHA harpikser ble tatt ut etter sammenstilling av henholdsvis 5, 10 og 15 residier.

Etter avspaltning av den gjenværende Boe-[Taeg] j^-BHA harpiksen (vurdert tørrvekt på omtrent 30 mg, ca. 0,002 mmol voksende kjeder), H-[Taeg]15-BHA harpiks ble omsatt med omtrent 50 ekvivalenter (80 mg, 0,11 mmol) Acr<1->0Pfp i 1 ml omtrent 66$ DMF/Ch2Cl2 (dvs. en 0,11 M oppløsning av pentafluorfenylester) i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder. Vurdert ifølge en kvalitativ ninhydrinreaksjon var koblingen av akridindelen nærmest kvantitativ.

(c) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]5~NH2

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]g-BHA harpiksen ble behandlet med 50$ trifluoreddiksyre i metylenklorid for å fjerne den N-terminale Boe gruppen (som er en forløper av det potensielt skadelige tert-butylkationet) før HF spaltningen. Etter nøytralisering og vasking (utført på lignende måte som i trinnet 2-4 i "Synteseprotokoll 1" og tørking i 2 t. i våkum ble resulterende 67,1 mg (tørrvekt) H-[Taeg]5-BHA harpiksen spaltet med 5 ml HF:anisol (9:1, v/v) og omrøring ved 0°C i 60 min. Etter fjerning av HF ble resten omrørt med tørr dietyleter (4 x 15 ml, 15 min. hver) for å fjerne anisol, filtrert under tyngdekraft gjennom en frittet glasstrakt og tørket. PNA ble deretter ekstrahert i en 60 ml (4 x 15 ml, omrøring 15 min. hver) 10$ vanndig eddiksyre-oppløsning. Alikvoter av denne oppløsningen ble analysert ved analytisk revers-fase HPLC for å bestemme renheten av rå PNA. Hovedtoppen ved 13,0 min. utgjorde omtrent 93$ av den totale absorbansen. Den gjenværende oppløsningen ble frosset og lyofilisert for å tilveiebringe omtrent 22,9 mg råmateriale. Til slutt ble 19,0 mg av råproduktet renset fra fem batcher som hver inneholder 3,8 mg i 1 ml H20. Hovedtoppen ble samlet ved anvendelse av en semi-preparativ revers-fase kolonne. Asetonitril ble fjernet på en speedvac og den gjenværende oppløsningen ble frosset (tørris) og deretter lyofilisert til 13,1 mg >99$ ren H-[Taeg]5-NH2. PNA molekylet ble lett løst opp i vann og hadde riktig molekylvekt ifølge massespektralbestemmelser. For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien 1349,3 og den målte m/z verdien var 1347,8.

(d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]^Q-NHg

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]iq-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i del (c) og ga 11,0 mg råmateriale ved HF spaltning av 18,9 mg tørr H- [Taeg] ±q-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 15,5 min. utgjorde omtrent 53$ av den totale absorbansen. Omtrent 1 mg av råproduktet ble gjentatte ganger renset (av grunner beskrevet nedenfor) for å oppnå omtrent 0,1 mg av minst 80$, men antageligvis >99$ ren H-[Taeg] -LQ-NH2. En bred hale som eluerte etter måltoppen og utgjorde omtrent 20$ av den totale absorbansen var ikke mulig å fjerne (bare litt forminsket) ved gjentatt rensing. Vurdert fra massespekteret som bare bekrefter tilstedeværelse av H-[Taeg]1Q-NH2 med riktig molekylvekt, utgjør halefenome-net mer eller mindre veldefinerte aggregasjons-/konfor-masjonsstadier til målmolekylet. Råproduktet inneholder sannsynligvis mere enn ovennevnte 53$ målmolekyl. H-[Taeg] 10-NH2 blir lett løst opp i vann. For (M+H)<+> er den beregnede m/z verdien 2679,6 og den målte m/z verdien var 2681,5 .

(e) Spaltning, rensing og identifikajon av H-[Taeg]1g-NH2

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]15-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i seksjon (c) og ga 3,2 mg råmateriale ved HF spaltning av 13,9 mg tørr H-[Taeg]5-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 22,6 min. ble lokalisert i en stor topp som utgjorde omtrent 60$ av den totale absorbansen (fig. 12a). Igjen (se den foregående delen) kan denne toppen tilskrives aggregasjons-/konformasjonstilstandene til målmolekylet H-[Taeg]i5~NH2 p.g.a. massespektralanalyser av denne samlede "toppen" viste ikke tilstedeværelse av andre molekyler. Det totale råproduktet ble renset og samlet "toppen" til omtrent 2,8 mg materiale. for (m+Na)<+> var den beregnede m/z verdien 4033,9 og den målte m/z verdien var 4032,9.

(f) Spaltning, rensing og identifikasjon av Acr<1->[Taeg]15-NH2

En del av den beskyttede Acr<1->[Taeg]15-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i del (b) og ga 14,3 mg råmateriale ved HF spaltning av 29,7 mg tørr Acr<1->[Taeg]15-BHA harpiks. Sammen utgjorde hovedtoppen ved 23,7 min. og en "dimer" (se nedenfor) ved 29,2 min. omtrent 40$ av den totale absorbansen (fig. 12b). Råproduktet ble gjentatte ganger renset til omtrent 1 mg av sannsynligvis >99$ ren Acr<1->[Taeg]15-NH2 "kontaminert" med selv-aggregerte molekyler som eluerte ved 27,4 min., 29,2 min. og til slutt som en stor bred topp som eluerte med 100$ buffer B (fig. 12c). Denne vurderingen er i samsvar med observasjonen om at disse toppene vokser ved henstand (i timer) i vanndig eddiksyreoppløsning og til slutt presipiterer ut kvantitativt. for (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien 4593,6 og den målte m/z verdien var 4588,7.

(g) Synteseprotokoll 1

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 3 ml , 3x1 min. og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2C12, 3 ml , 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 3 ml, 3 x 2 min., (4) vasking med CH2C12, 3 ml, 6x1 min., og avrenning i 1 min., (5) 2-5 mg prøve av PNA-harpiksen kan bli tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjonen, (6) addisjon av 3,2 ekv. (0,18 mmol, 100 mg) Boe Taeg-OPfp løst opp i 1 ml CH2C12 etterfulgt av til tilsetning av 0,5 ml DMF (sluttkonsentras j on av pentafluorfenylester omtrent 0,12 M), koblingsreaksjonen ble kjørt i totalt 12-24 t. med risting ved romtemperatur, (7) vaskin med DMF, 3 ml, lx 2 min., (8) vasking med CH2C12, 3 ml, 4x1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), 3 ml 2 x 2 min., (10) vasking med CH2C12, 3 ml, 6x1 min., (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut for hurtig kvalitativ ninhydrintest og ytterligere 2-5 mg blir grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme koblingsgraden (etter syklusene 7, 10 og 15 ble ureagert aminogruppe blokkert ved acetylering med N-acetylimidasol i metylenklorid).

Eksempel 18.

Fast-fase syntese av Acr<1->[Taeg]15-Lys(C1Z)-BHA og kortere derivater (a) Trinnvis oppstilling av Boc-[Taeg]^5~Lys(ClZ)-BHA harpiks.

Syntesen ble initiert ved en kvantitativ belastning (standard DCC in situ kobling in bar CH2C12) av Boc-Lys(ClZ) på 100 mg forsvellet og nøytralisert BHA harpiks (0,57 mmol NH2/g). Ytterligere utvidelse av den beskyttede PNA-kjeden anvendt til enkeltkoblinger ("Syntetisk Protokoll 2") for syklusene 1 til 5 og syklusene 10 til 15 ved anvendelse av 3,2 ekvivalenter BocTaeg-OPfg i omtrent 33$ DMF/CH2C12. Syklusene 5 til 10 anvendte en ekstra rett DCC (dvs. in situ) kobling av den frie syren BocTaeg-OH i omtrent 33$ DMF/CH2C12. Alle koblingsreaksjonene ble utført ved risting i minst 12 t. i en manuelt drevet 6 ml standar fast-fase reaksjonsbeholder. Ureagert aminogruppe ble blokkert ved acetylering med de samme stadiene av syntesen som i eksempel 17. Deler av beskyttet Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)-BHA og Boe-[Taeg]10-Lys(C1Z)-BHA harpikser ble tatt ut etter oppstilling av henholdsvis 5 og 10 PNA residier. Vurdert ved analytisk HPLC kromatogram av det råe spaltningsproduktet fra Boe-[Taeg]^g-Lys(C1Z)-BHA harpiksen (se seksjon (e)) ga en ytterligere "fri syre" kobling av PNA residiene 5 til 10 ikke noen signifikant forbedring av synteseutbyttet sammenlignet med de enkelt-koblede residiene i eksempel 17.

(b) Syntese av Acr1-[Taeg]10-Lys(C1Z )-BHA harpiks

Etter avspaltning av endel av Boe-[Taeg]io-Lys(C1Z)-BHA harpiksen (vurdert tørrvekt er omtrent 90 mg, omtrent 0,01 mmol voksende kjeder), ble H-[Taeg]^5-BHA harpiksen omsatt med omtrent 20 ekvivalenter (141 mg, 0,19 mmol) Acr^-OPfp i 1 ml av omgrent 66$ DMF/CH2CI2 i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder. Vurdert ved en kvalitativ ninhydrinreaksjon var koblingen av akridindelen nærmest kvantitativ.

(c) Syntese av Acr<1->[Taeg]15-Lys(ClZ)-BHA harpiks

Etter avspaltning av gjenværende Boe-[Taeg]^g-Lys(C1Z)-BHA harpiks (vurdert tørrhet omtrent 70 mg, omtrent 0,005 mmol voksende kjeder), H-[Taeg]^5-Lys(ClZ)-BHA harpiks ble omsatt med omtrent 25 ekvivalenter (91 mg, 0,12 mmol) Acr<i->OPfp i 1 ml omtrent 66$ DMF/CH2Cl2 i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder. Vurdert ved en kvalitativ ninhydrinreaksjon var koblingen av akridindelen nærmest kvantitativ.

(d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]5-Lys-NH2

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i eksempel 17c til 8,9 mg råmateriale ved HF spaltning av 19,0 mg tørr H-[Taeg]5~ Lys(ClZ)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 12,2 min. (eluerte ved 14,2 min. dersom injisert fra en vanndig oppløsning istedenfor 10$ vanndig eddiksyreoppløsning) utgjorde omtrent 90$ av den totale absorbansen. Omtrent 2,2 mg av råproduktet ble renset til omtrent 1,5 mg 99$ ren H-[Taeg]g-Lys-N^.

(e) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]^Q-Lys-NH2

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]-Lg-Lys(C1Z)-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i eksempel 17c til 1,7 mg av råmaterialet ved HF spaltning av 7,0 mg tørr H-[Taeg]^Q-Lys(ClZ)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 15,1 min. (eluert ved 17.0 min. dersom injisert fra en vanndig oppløsning istedenfor 10$ vanndig eddiksyreoppløsning) utgjorde omtrent 50$ av den totale absorbansen. Omtrent 1,2 g av råproduktet ble renset til omtrent 0,2 mg >95$ ren H-[Taeg]^g-Lys-NHg• Fig. 13a. For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien 2807,8 og den målte m/z verdien var 2808,2.

(f) Spaltning, rensing og identifikasjon av Acrl-[Taeg]^q-Lys-NH2

99.1 mg beskyttet Acr<1->[Taeg]10-Lys(clz)-BHA harpiks (tørr vekt) ble spaltet som beskrevet i eksempel 17c til 42,2 mg råmateriale. Hovedtoppen ved 25,3 min. (eluerte ved 23,5 min. dersom den ble injisert fra en vanndig oppløsning istedenfor 10$ vanndig eddiksyreoppløsning) utgjorde omtrent 45$ av den totale absorbansen. En 8,87 mg del av råproduktet ble renset til omtrent 5,3 mg av >97$ ren H-[Taeg]10-Lys-NH2. For (M+H)<+> når den beregnede m/z verdien var 2850,8 og den målte m/z verdien var 2849,8.

(g) Spaltning og rensing av Acr1-[Taeg]ig-Lys-N^

En 78,7 mg del av beskyttet Acr 1-[Taeg]15-Lys(C1Z)-BHA harpiks (tørr vekt) ble spaltet som beskrevet i eksempel I del (c) til 34,8 mg råmateriale. Hovedtoppen ved 23,5 min.

(omtrent samme elueringstid dersom injisert fra en vanndig oppløsning istedenfor 10$ vanndig eddiksyreoppløsning) og en "dimer" ved 28,2 min. utgjorde omtrent 35$ av den totale absorbansen. Omtrent 4,5 mg av råproduktet ble renset til omtrent 1,6 mg av antagelig >95$ ren H-[Taeg]ig-Lys-NH2• Denne forbindelsen kunne ikke være fri for "dimer" toppen som vokste ved henstand i vanndig eddiksyreoppløsning.

(h) Synteseprotokoll 2

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 3 ml , 3x1 min. og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2CI2, 3 ml, 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2Dl2 (1: 19» v/v), 3 ml, 3x2 min., (4) vasking med CH2C12, 3 ml, 6x1 min. og avrenning i 1 min., (5) 2-5 mg prøve PNA-harpiks kan bli tatt ut og grundig tørket for en kvalitativ ninhydrinanalyse, (6) for syklusene 1 til 5 og syklusene 10 til 15 ble koblingsreaksjonen utført ved tilsetning av 3,2 ekv. (0,18 mmol, 100 mg) BocTaeg-OPfp løst opp i 1 ml CH2C12 etterfulgt av tilsetning av 0,5 ml DMF (sluttkonsentrasjon av pentafluorfenylester omtrent 0,12 M), koblingsreaksjonen ble utført i totalt 12-24 t. med risting, syklusene 5 til 10 anvendte ytterligere 0,12 M DCC kobling av 0,12 M BocTaeg-0H i 1,5 ml DMF/CH2C12 (1:2, v/v), (7) vasking med DMF, 3 ml, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 3 ml, 4x1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), 3 ml, 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 3 ml, 6x1 min., (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut for en kvalitativ ninhydrintest (etter syklusene 7, 10 og 15 ble ureagert aminogruppe blokkert ved acetylering med N-acetylimidasol i metylenklorid ).

Eksempel 19.

Forbedret fast-fase syntese av H-[Taeg]10-Lys-NH2

Beskyttet PNA ble oppstilt på en MBHA harpiks ved anvendelse av omtrent halvparten av belastningen av BHA harpiksen anvendt i de foregåene eksemplene. Alle syklusene med unntagelse av en ble etterfulgt av acetylering av ukoblede aminogrupper. Følgende beskriver syntesen i detalj: (a) Fremstilling av Boc-Lys(C1Z)-NH-CH(p-CH3-C6H4)-C6H4 harpiks (MBHA harpiks) med en innledende substitusjon av 0,3 mmol/g

Den ønskede substitusjonen av Boc-Lys(C1Z)-MBHA harpiks var 0,25 - 0,30 mmol/g. For å oppnå denne verdien ble 1,5 mmol Boc-Lys(ClZ) koblet til 5,0 g nøytralisert og forsvellet MBHA harpiks (bestemt ved den kvantitative ninhydrinreaksjonen og inneholder 0,64 mmol NH2/g) ved anvendelse av en enkelt "in situ" kobling (1,5 mmol DCC) i 60 ml CH2C12. Reaksjonen ble utført ved risting i 3 t. i manuelt drevet, 225 ml, standard, fast-fase reaksjonsbeholder. Ureagert aminogruppe ble deretter blokkert ved acetylering med en blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 18 t. En kvantitativ ninhydrinreaksjon på den nøytraliserte harpiksen viste at bare 0,00093 mmol/g fri amin var igjen (se tabell I), dvs. 0,15 $ av de opprinnelige aminogruppene. Sub-st itusj onsgraden ble vurdert ved avspaltning og ninhydrinanalyse og ble funnet å være 0,32 mmol/g for den nøytralisert H-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen. Dette er i samsvar med maksimalver-dien av 0,28 mmol/g for en kvantitativ kobling av 0,30 mmol Boc-Lys(C1Z)/g harpiks (se tabell II).

(b) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg)3-Lys(C1Z)-MBHA harpiks

Hele batchen av H-Lys(C1Z)-MBHA harpiks fremstilt i seksjon (a) ble brukt direkte (i den samme reaksjonsbeholder) for å oppstille(Boc-[Taeg]3~Lys(ClZ)-MBHA harpiksen ved enkeltkoblinger (Syntese Protokoll 3") ved anvendelse av 2,5 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i hver CH2C12. Den kvantitative ninhydrinreaksjonen ble anvendt i syntesen (se tabell II).

(c) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]8-Lys(C1Z)-MBHA harpiks

Omtrent 4,5 g våt Boe-[Taeg]3-Lys(C1Z)-MBHA harpiks (omtrent 0,36 mmol voksende kjeder, tatt ut av totalt omtrent 19 g vårt harpiks dannet i del (b)) ble plassert i en 55 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boe-[Taeg]g-Lys(C1Z )-MBHA harpiksen ble dannet ved enkeltkoblinger ("Syntese Protokoll 4") ved anvendelse av 2,5 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i omtrent 30$ DMF/CH2C12. Progresjonen av syntesen ble registrert ved alle trinnene ved hjelp av kvantitativ ninhydrinreaksjon (se tabell II).

(d) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]8-Lys(C1Z)-MBHA harpiks Omtrent 1 g våt Boc-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks (omtrent 0,09 mmol voksende kjeder tatt ut av totalt omtrent 4 g våt harpiks preparert i del (c)) ble plassert i en 20 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boe-[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved enkelt-koblingsprotokoll anvendt i den foregående delen ved anvendelse av 2,5 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i omtrent 30$ DMF/CH2C12. Reaksjonsvolumet var 3 ml (vigorøs risting). Sytesen ble registrert ved den kvantitative ninhydrinreaksjonen (se tabell II).

Etter avspaltning av en del av Boc-[Taeg]iø-Lys(C1Z)-MBA harpiksen (vurdert tørrvekt er omtrent 45 g) ble harpiksen deretter acetylert kvantitativt med en 2 ml blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Vl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t. i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder.

(f) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]^Q-Lys-NH2

En del av den beskyttede Boc-[Taeg]^Q-Lys(C1Z)-BHA harpiksen ble behnandlet som beskrevet i eksempel 17c for å tilveiebringe omtrent 24 mg av råmaterialet ved HF spaltning av av 76 mg tørr H-[Taeg]5~Lys(C1Z)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 15,2 min. (som innbefatter urenheter så som delesjonspep-tider og forskjellige biprodukter) utgjorde omtrent 78$ av den totale absorbansen. Hovedtoppen utgjorde også omtrent 88$ av "hovedtopp plussdelesjonstopper" absorbansen som er i samsvar med det totalt vurderte koblingsutbyttet på 90,1 $ oppnådd ved oppsummering av utbyttene ved de individuelle koblingene i tabell II. En 7,2 mg del av råproduktet ble renset fra 2 batcher ved anvendelse av en semi-preparativ revers-fase kolonne (oppsamling av hovedtoppen i en beholder avkjølt med tørris/2-propanol). Hver inneholdt 3,6 mg i 1 ml H20. Den frosne oppløsningen ble direkte lyofilisert (uten på forhånd fjerning av asetonitril på en speed vac) for å tilveiebringe 4,2 mg 82$ ren H-[Taeg]^0-Lys-NH2.

(g) Spaltning, rensing og identifikasjon av Ac-[Taeg]^Q-Lys-NH2

En 400,0 mg del av beskyttet Ac-[Taeg]10-Lys(ClZ)-BHA harpiks (tørrvekt) ble spaltet som beskrevet i eksempel 17c med unntagelse av TFA behandlingen som ga 11,9 mg råmateriale. Hovedtoppen ved 15,8 min. utgjorde omtrent 75$ av den totale absorbansen. En 4,8 mg del av råproduktet ble renset til omtrent 3,5 mg >95$ ren AC-[Taeg] 10-Lys-BH2. for (M+H)+ var den beregnede m/z verdien lik 2849,8 og den målte m/z veriden lik 2848,8.

(h) Syntese protokoll 3

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 100 ml, 3x1 min. og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2C12, 100 ml, 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (l:, 19, v/v), 100 ml, 3x2 min., (4) vasking med CH2C12, 100 ml, 6x1 min. og avrenning i 1 min., (5) 2-5 mg prøve av PNA-harpiksen ble tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjonen, (6) tilsetning av 2,5 ekv. (3,75 mmol, 2,064 g) BocTaeg-OPfp løst opp i 35 ml CH2C12 (sluttkonsentrasjon av pentafluorfenylester omtrent 0,1 M), koblingsreaksjonen ble latt gå i totalt 20-24 t. med risting, (7) vasking med DMF, 100 ml, 1x2 min. (for å fjerne presipitert BocTaeg-OH), (8) vasking med CH2C12, 100 ml, 4 x 1 min., (9) nøytralisering med CH2C12 (1: 19, v/v), 100 ml, 2 x 2 min., (10) vasking med CH2C12, 100 ml, 6x1 min., (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut for hurtigkvalitativ ninhydrintest og ytterligere 2-5 mg ble grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme koblingsgrade, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acylering med en 100 ml blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/Ch2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t., (13) vasking med CH2C12, 100 ml, 6x1 min., (14) 2 x 2-5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut, nøytralisert med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v) og vasket med CH2C12 for kvalitative og kvantitative ninhydrinanalyser.

(i) Syntese protokoll 4

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 25 ml, 3x1 min. og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2C12, 25 ml, 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), 25 ml, 3x2 min., (4) vasking med CH2C12, 25 ml , 6 x 1 min. og avrenning i 1 min., (5) 2-5 mg prøve av PNA-harpiksen blir tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse

for å bestemme substitusjonen, (6) tilsetning av 2,5 ekv. (0,92 mmol, 0,506 g) BocTaeg-OPfp løst opp i 6 ml CH2C12 etterfulgt av tilsetning av 3 ml DMF (sluttkonsentrasjon av pentafluorfenylester omtrent 0,1 M), koblingsreaksjonen ble latt gå i totalt 20-24 t. med risting, (7) vasking med DMF, 25 ml, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 25 ml, 4x1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), 25 ml, 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 25 ml, 6x1 min., (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut for en hyrtig kvalitativ ninhydrintest og ytterligere 2-5 mg blir grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme koblingsgraden, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acylering med en 25 ml blanding av eddiksyreanhydrid/- pyridin/Ch2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t. (unntatt etter første syklus), (13) vasking med CH2C12, 25 ml, 6x1 min., (14) 2 x 2-5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut, nøytralisert med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v) og vasket med CH2C12 for kvalitativ og kvanitativ ninhydrinanalyse.

Eksempel 20.

Fast-fase syntese av H[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4~Lys-NH2

(a) Trinnvis oppstilling av Boe-[TAEG]5-Caeg-[Taeg]4-Lys(C1Z )-MBHA harpiks.

Omtrent 2,5 g våt (Boe-[Taeg]3-Lys(V1Z)-MBHA harpiks (omtrent 1/6 av totalt gjenværende omtrent 16 g våt harpiks, omtrnt 0,75 g tørr harpiks omtrent 0,15 mmol voksende kjeder) ble plassert i en 6 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boe-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4~Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved dobbeltkobling av alle Taeg-residiene ved anvendelse av de vanlige 2,5 ekv. av BocTaeg-OPfp in 2,5 ml omtrent 30$ DMF/CH2C12, med unntagelse av at det første residiet var enkelt-koblet. Inkorporering av C(Z)aeg-residier ble oppfanget ved kobling med 2,0 ekvivalenter BocC(Z)aeg-0Pfp i TFE/CH2C12 (1:2, v/v). Synteseprogresjonen ble registrert ved alle trinnene ved kvantitativ ninhydrinreaksjon (se tabell III).

(b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2

En del av beskyttet Boe-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys(C1Z)-BHA harpiks ble behandlet som beskrevet i eksempel I del (c) til omtrent 14,4 mg råmateriale ved HF spaltning av 66,9 mg tørr H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys ( C1Z)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 14,5 min. utgjorde >50$ av den totale absorbansen. En 100,0 mg del av råproduktet ble renset (8 batcher, hver løst opp i 1 ml H2O) for å tilveiebringe omtrent 9,1 mg 96$ ren H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2 (fig. 13b). For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien lik 2793,8 og den målte m/z verdien lik 2790,6.

Eksempel 21.

N-Benzyloksykarbonyl-N-'(bokaminoetyl)glyserin

Aminoetylglysin (52,86 g, 0,447 mol) ble løst opp i vann (900 ml) og dioksan (900 ml) ble tilsatt. pH ble justert til 11,2 med sN NaOH.. pH ble holdt ved 11,2 og tert-butyl-p-nitrofenylkarbonat (128,4 g, 0,537 mol) ble løst opp i dioksan (720 ml) og dråpevis tilsatt iløpet av 2 timer. pH ble holdt ved 11,2 i minst tre timer og deretter omrørt over natt. Den gule oppløsningen ble avkjølt til 0°C og pH ble justert til 3,5 med 2N HC1. Blandingen ble vasket med kloroform (4x100 ml) og pH til den vandige fasen ble på ny justert til 9,5 med 2N NaOH ved 0°C. Benzyloksykarbonylklor id (73,5 ml, 0,515 mol) ble tilsatt over en halv time mens pH ble holdt 9,5 med 2N NaOH. pH ble ofte justert iløpet av de neste 4 timene og oppløsningen ble latt stå med omrøring over natt. På den følgende dagen ble oppløsningen vasket med eter (3x600 ml) og pH til oppløsningen ble deretter justert til 1,5 med 2 N HC1 ved 0°C. Tittelforbindelsen ble isolert ved ekstrahering med etylasetat (5x1000 ml). Etylasetatoppløsningen ble tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Dette førte til 138 g som ble løst opp i eter (300 ml) og presipitert ved tilsetning av petroleumeter (1800 ml). Utbytte 124,7 (79$). Sm.p. 64,5-85°C. Analyse for C17<H>24<N->206 funnet (beregnet) C: 58,40 (57,94), H: 7,02(6,86), N: 7,94(7,95 ). -^H-NMR (250 MHz, CDCI3) 7,33 & 7,32 (5H, Ph), 5,15 & 5,12 (2H, PCH2), 4,03 & 4,01 (2H, NCH2C02H), 3,46 (b, 2H, BocNHCH2CH2 ) , 3,28 (b, 2H, BocNHCH2CH2) , 1,43 & 1,40 (9H, <t>Bu). HPLC (260 nm) 20,71 min. (80,2 $) og 21,57 min.

(19,8 $). UV-spektrene (200 nm - 300 nm) er identiske og tyder på at den mindre toppen består av Bis-Z-AEG.

Eksempel 22.

N'-Boc-aminoetylglysinetylester

N-Benzyloksykarbonyl-N'-(bokaminoetyl)glysin (60,0 g, 0,170 mol) og N ,N-dimetyl-4-aminopyridin (6,00 g) ble løst opp i absolutt etanol (500 ml) og avkjølt til 0°C før tilsetning av DCC (42,2 g, 0,204 mol). Isbadet ble fjernet etter 5 minutter og omrøringen ble fortsatt ytterligere 2 timer. Presipitert DCU (32,5 g tørket) ble fjernet ved filtrering og vasket med eter (3x100 ml). Det kombinerte filtratet ble suksessivt vasket med fortynnet kaliumhydrogensulfat (2x400 ml), fortynnet natriumhydrogenkabonat (2x400 ml) og mettet natriumklorid (1x400 ml). Den organiske fasen ble filtrert og deretter tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum og ga 66,1 g av en oljeholdig forbindelse som inneholdt noe DCU.

Oljen ble løst opp i absolutt etanol (600 ml) og det ble tilsatt 10$ paladium på karbon (6,6 g). Oppløsningen ble hydrert ved atmosfærisk trykk og reservoaret ble fyllt med 2N natriumhyroksid. Etter 4 timer ble 3,3 L konsumert ut ifra teoretisk 4,2 L. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom selit og avdampet til tørrhet i våkum og ga 39,5 g (94$) av en oljeholdig forbindelse. En 13g del av den oljeholdige forbindelsen ble renset ved silikagel (600 g Si02) kromato-grafi. Etter eluering med 300 ml 20$ petroleumeter i metylenklorid ble tittelforbindelsen eluert med 1700 ml 5$ metanol i metylenklorid. Oppløsningsmiddelet ble fjernet fra fraksjoner med tilfredsstillende renhet, i våkum og utbyttet var 8,49 g. Alternativt ble 10 g av råmaterialet renset ved Kugel Rohr destillasjon. 1H-NMR (250 MHz, CD30D), 4,77 (b. s, NH), 4,18 (q, 2H, MeCHg-), 3,38 (s, 2H, NCH2C02Et), 3,16 (t, 2H, BocNHCH2CH2 ) , 2,68 (t, 2H, BocNHCH2CH2), 1,43 (s, 9H, tBu) ogl,26 (t, 3H, CH3) <13>C-NMR 171,4 (COEt) , 156,6 (CO), 78,3 ((CH3)3C), 59,9 (CH2), 48,1 (CH2), 39,0 (CH2), 26,9 (CH2) og 12,6 (CH3).

Eksempel 23.

N'-Boc-aminoetylglysinmetylester

Ovennevnte fremgangsmåte ble anvendt idet metanol ble erstattet for etanol. Sluttproduktet ble renset kolonneren-sing.

Eksempel 24.

1-(Boc-aeg )thyminetylester

N'-Boc-aminoetylglysinetylester (13,5 g, 54,8 mmol), DhbtOH (9,84 g, 60,3 mmol) og 1-karboksymetylthymin (11,1 g, 60,3 mmol) ble løst opp i DMF (210 ml). Metylklorid (210 ml) ble deretter tilsatt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C i et etanol/isbad og DCC (13,6 g, 65,8 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 1 time og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 2 timer ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket to ganger med metylenklorid (2 x 75 ml). Til det kombinerte filtratet ble det tilsatt ytterligere metylenklorid (650 ml). Oppløsningen ble suksessivt vasket med fortynnet natriumhydrogenkarbonat (3 x 500 ml), fortynnet kaliumhydrogensulfat (2 x 500 ml) og mettet natr iumklor id (1 x 500 ml). Noe presipitat ble fjernet fra den organiske fasen ved filtrering. Den organiske fasen ble tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Den oljeholdige resten ble løst opp i metylenklorid (150 ml), filtrert og tittelforbindelsen ble presipitert ved tilsetning av petroleumeter (350 ml) ved 0°C. Metylenklorid/petroleumeter prosedyren ble gjentatt en gang. Dette ga 16, 0 g (71$) av et materiale som hadde høyere renhet enn 99$ ifølge HPLC.

Eksempel 25.

l-(Boc-aeg) thymin

Materialet fra ovenfor ble suspendert i THF (194 ml og gir en 0,2 M oppløsning) og 1 M vanndig 1 itsiumhydroksid (116 ml) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 45 minutter ved romtemperatur og deretter filtrert for å fjerne gjenværende DCU. Vann (40 ml) ble tilsatt til oppløsningen som deretter ble vasket med metylenklorid (300 ml). Ytterligere vann (30 ml) ble tilsatt og den alkaliske oppløsningen ble vasket en gang til med metylen klorid (150 ml). Den vandige oppløs-ningen ble avkjølt til 0°C og pH ble justert til 2 ved dråpevis tilsetning av 1 N HC1 (omtrent 110 ml). Tittelforbindelsen ble ekstrahert med etylasetat (9 x 200 ml) de kombinerte ekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat og ble avdampet til tørrhet i våkum. Resten ble avdampet en gang fra metanol som etter tørking over natt ga et fargeløst glassaktig fast stoff. Utbytte 9,57 g (64$). HPLC > 98$ R-p=14,8 min. Analyse for C16<H>24<N>4<O>70O,25 H2O. funnet (beregnet) C: 49,29(49,42), H: 6,52(6,35), N: 14,11(14,41). På grunn av begrenset rotasjon rundt det sekundære aminet ble flere av signalene doblet i forholdet 2:1 (indikert i listen med mj. for major og mi. for minor). ^H-NMR (250 MHz, DMSO-d6): 12,75 (b.s., 1H, C02H), 11,28 (s, "1H", mj., imide NH), 11,26 (s, "1H", mi., imide NH), 7,30 (s, "1H", mj., T H16), 7,26 (s, "1H", mi., T H-6) , 6,92 (b.t., "1H", mj . , BocNH), 6,73 (b.t., "1H", mi., BocNH), 4,64 (s, "2H" , mj . , CH2C0N), 4,46 (s, "2H", mj., CH2C0N), 4,19 (s, "2H", mi., CH2C02H), 3,97 (s, "2H", mj . , CH2C02H), 3,63-3,01 (uoppløst m, innbefatter vann, CH2CH2), 1,75 (s, 3H, CH3) og 1,38 (s, 9H, "tBu) .

Eksempel 26.

N<4->Benzyloksykarbonyl-l-(Boc-aeg)cytozin

N'-Boc-aminoetylglysinetylester (5,00 g, 20,3 mmol), DhbtOH (3,64 g, 22,3 mmol) og N<4->benzyloksykarbonyl-l-karboksymetyl-cytozin (6,77 g, 22,3 mmol) ble suspendert i DMF (100 ml). Metylenklorid (100 ml) ble deretter tilsatt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og DCC (5,03 g, 24,4 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 2 t. og omrøringen ble fortsatt i ytterligere en time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter avdampet til tørrhet i våkum. Resten ble suspendert i eter (100 ml) og omrørt i 30 min. Det faste materialet ble isolert ved filtrering og etervaskprosedyren ble gjentatt to ganger. Materialet ble deretter omfattende omrørt i 15 min. med fortynnet natriumhydrogenkarbonat (omtrent 4$ oppløsning, 100 ml), filtert og vasket med vann. Denne prosedyren ble deretter gjentatt en gang og etter tørking ga den 17,0 g av et gulaktig fast materiale. Det faste materialet ble deretter kokt med dioksan (200 ml) og filtrert mens det var oppvarmet. Etter avkjøling ble vann (200 ml) tilsatt. Det prsipiterte materialet ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket. Ifølge HPLC (observert ved 260 nm) hadde dette materialet en renhet som var høyere enn 99$, bortsett fra DCU. Esteren ble deretter suspendert i THF (100 ml), avkjølt til 0°C og 1 N LiOH (61 ml) ble tilsatt. En omrøring i 15 min. ble blandingen filtrert og filtratet ble vasket med metylenklorid (2 x 150 ml). Den alkaliske oppløsningen ble deretter avkjølt til 0°C og pH ble justert til 2,0 med 1 N HC1. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og ble vasket en gang med vann og ga 11,3 g av et hvitt pulver etter tørking. Materialet ble suspendert i metylenklorid (300 ml) og petroleumeter (300 ml) ble tilsatt. Filtrering og vasking ga 7,1 g (69$) etter tørking. HPLC ga en renhet på 99$ R-r= 19,5 min. og en mindre urenhet ved 12,6 min. (omtrent 1$) som mest sannsynlig er Z-de beskyttet monomer. Analyse for C23<H>2g<N>50g funnet (beregnet) C: 54,16(54,87), H: 5,76(5,81) og N: 13,65(13,9-1). ^-H-NMR (250 MHz, DMS0-d6). 10,87 (b.s, 1H, C02H), 7,88 (2 overlappende dupletter, 1H, Cyt H-5), 7,41-7,32 (m, 5H, Ph), 7,01 (2 overlappende dupletter, 1H, Cyt H-6), 6,94 & 6,78 (uopp. tripletter, 1H, BocNH), 5,19 (s, 2H, PhCH2), 4,81 & 4,62 (s, 2H, CH2C0N), 4,17 & 3,98 (s, 2H, CH2C02H), 3,42-3.03 (m, innbefatter vann, CH2CH2) og 1,38 & 1,37 (s, 9H, "tBu). <13>C-NMR. 150,88, 128,52, 128,18, 127.96, 93,90, 66,53, 49,58 og 28,22. IR: Frekvensen i cm-<1> (intensitet). 3423 (26,4 ), 3035 (53,2 ), 2978 (41,4 ), 1736 (17,3), 1658 (3,8), 1563 (23,0), 1501 (6,8) og 145 (26,4).

Ekempel 27.

9-Karboksymetyladeninetylester

Adenin (10,0 g, 74 mmol) og kaliumkarbonat (10,29 g, 74,0 mmol) ble suspendert i DMF og etylbromasetat (8,24 ml, 74 mmol) ble tilsatt. Suspensjonen ble omrørt i 2,5 t. under nitrogen ved romtemperatur og deretter filtrert. Den faste resten ble vasket 3 ganger med DMF (10 ml). Det kombinerte filtratet ble avdampet til tørrhet i våkum. Det gul-oransje faste materialet ble helt inn i vann (200 ml) og 4 N HC1 ble tilsatt tol pH ca. 6. Etter omrøring ved 0°C i 10 min. ble det faste stoffet filtrert ut, vasket med vann og omkrystallisert fra 96$ etanol (150 ml). Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og grundig vasket med eter. Utbytte 3.4 g (20$). Sm.p. 215,5-220°C. Analyse for Cg<H>11<N>502 funnet (beregnet): C: 48,86(48,65), H: 5,01(4,91), N: 31,66(31,42). ^H-NMR (250 MHz, DMS0-d6): (s, 2H, H-2 & H-8), 7,25 (b. s., 2H, NH2), 5,06 (s, 2H, NCH2) , 4,17 (q, sH, J=7,ll Hz, 0CH2) og 1,21 (t, 3H, J=7,13 Hz, NCH2). <13>C-NMR. 152,70, 141,30, 61,41, 43,97 og 14,07. FAB-MS. 222 (MH+). IR: Frekvens i cm-<1> (intensitet). 3855 (54,3), 3274(10,4), 3246(14,0), 3117(5,3),2989(22,3), 2940(33,9), 2876(43,4), 2753(49,0), 2346(56,1), 2106(57,1), 1899(55,7), 1762(14,2), 1742(14,2), 1742(1,0), 1671(1,8), 1644(10,9), 1606(0,6), 1582(7,1), 1522(43,8), 1477(7,2), 1445(35,8) pg 1422(8,6). Posisjonen til alkyleringen ble verifisert ved røntgen-krystallografi på krystallet som ble oppnådd ved omkrystallisering fra 96$ etanol.

Eksempel 28.

N^-Benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyladninetylester

9-Karboksymetyladeninetylester (3,40 g, 15,4 mmol) ble løst i tørr DMF (50 ml) ved forsiktig oppvarming, avkjølt til 20°C og tilsatt til en oppløsning av N-etyl- benzyloksykarbonyli-midasoltetrafluorborat (62 mmol) i metylenklorid (50 ml) over en periode på 15 min. med isavkjøling. En viss grad av presipitasjon ble observert. Isbadet ble fjernet og oppløsningen ble omrørt over natt. Reaksjonsblandingen ble behandlet med mettet natriumhydrogenkarbonat (100 ml). Etter omrøring i 10 min. ble fasene separert og den organiske fasen ble vasket suksessivt med et volum vann, fortynnet kaliumhydrogensulfat (to ganger) og med mettet natriumklorid. Oppløsningen ble tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum og ga 11 g av et oljeholdig materiale. Materialet ble løst opp i metylenklorid (25 ml), avkjølt til 0oC og presipitert med petroleumeter (50 ml). Denne prosedyren ble gjentatt en gang til 3,45 g (63$) av tittelforbindelsen. Sm.p. 132-35°C. Analyse for C17H17<N>504 funnet (beregnet): C: 56,95(57,46), H: 4,71(4,82), N: 19,35(19,-71). 1-H-NMR (250 MHz, CDC13): 8,77 (s, 1H, H-2 eller H-8) , 7,99 (s, 1H.H-2 eller H-8), 7,45-7,26 (m, 5H, Ph), 5,31 (s, 2H, N-CH2), 4,96 (s, 2H, Ph-CH2), 4,27 (q, 2H, J=7,15 Hz, CH2CH3) og 1,30 (t,3H, J=7,15 Hz, CH2CH3). <13>C-NMR: 153,09, 143,11, 128,66, 67,84, 62,51, 44,24 og 14,09. FAB-MS: 356 (MH+) og 312 (MH+-C02). IR: frekvens i cm-<1> (intensitet). 3423 (52,1), 3182 (52,8), 3115(52,1), 3031(47,9), 2981(38,6), 1747(1,1), 1617(4,8), 15,87(8,4), 1552(25,2), 1511(45,2), 1492(37,9), 1465(14,0) og 1413(37,3).

Eksempel 29.

N^-Benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyladenin

N^-Benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyladeninetylester (3,20 g, 9,01 mmol) ble blandet med metanol (50 ml) avkjølt til 0°C. Natriumhydroksidoppløsning (50 ml, 2N) ble tilsatt og materialet ble hurtig oppløst. Etter 30 min. ved 0°C ble den alkaliske oppløsningen vasket med metylenklorid (2x50 ml). Den vandige oppløsningen ble bragt til pH 1,0 med 4 N EC1 ved 0°C hvorved tittelforbindelsen presipiterte. Utbytte etter filtrering , vasking med vann og tørking va 3,08 g (104$). Produktet inneholdt salt og elementanalyser reflekterte dette. Analyse for C15<H>13<N>5O4 funnet beregnet: C: 46,32(55,05), H: 4,24(4,00), N: 18,10(21,40) og C/N: 2,57(2,56). <1>H-NMR(250MHz, DMS0-d6): 8,70 (s, 2H, H-2 og H-8), 7,50-7,35 (m, 5H, Ph), 5,27 (s, sH, N-CH2) og 5,15 (s, 2H, Ph-CH2). <13>C-NMR. 168,77, 152,54, 151,36, 148,75, 145,13, 128,51, 128,17, 127,98, 66,76 og 44,67.Ir (KBr) 3484(18,3), 3109(15,9), 3087(15,0), 2966(17,1), 2927(19,9), 2383(53,8), 1960(62,7), 1739(2,5), 1688(5,2), 1655(0,9), 1594(11,7), 1560(12,3), 1530(26,3), 1499(30,5), 1475(10,4), 1455(14.0), 1429(24,5) og 1411(23,6). FAB-MS: 328 (MH+) og 284 (MH+-C02). HPLC (215 nm, 260 nm) i system 1: 15,18 min., mindre urenheter som alle var mindre enn 2$.

Eksempel 30.

N^-Benzyloksykarbonyl-1-(Boc-aeg)adeninetylester

N'-Boc-aminoetylglysinetylester (2,00 g, 8,12 mmol), DhbtOH (1,46 g, 8,93 mmol) og N<6->benzyloksykarbonyl-9-karboksymety-ladenin (2,92 g, 8,93 mmol) ble løst opp i DMF (15 ml). Metylenklorid (15 ml) ble tilsatt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C i et etanol/isbad. DCC (2,01 g, 9,74 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter2,5 t. og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 1,5 time ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket en gang med DMF (15 ml) og to ganger med metylenklorid (2 x 15 ml). Til det kombinerte filtratet ble det tilsatt ytterligere metylenklorid (100 ml). Oppløsningen ble vasket med fortynnet natriumhydrogenkarbonat (2 x 100 ml), fortynnet kaliumhydrogensulfat (2 x 100 ml) og mettet natriumklorid (1 x 100 ml). Den organiske fasen ble avdampet til tørrhet i våkum og ga 3,28 g (73$) av en gulaktig oljeholdig forbindelse. HPLC av råproduktet viste en renhet på bare 66$ med flere urenheter som begge var mer eller mindre polare enn hovedtoppen. Oljen ble løst opp i absolutt etanol (50 ml) og aktivert karbon ble tilsatt. Etter omrøring i 5 min. ble oppløsningen filtrert. Filtratet ble vasket med vann (30 ml) og ble latt stå med omrøring over natt. Neste dag ble det hvite presipitatet fjernet ved filtrering, vasket med vann og tørket og ga 1,16 g (26$) av et materiale med en renhet som var høyere enn 98$ ifølge HPLC. Tilsetning av vann til morvæsken ga ytterligere 0,53 g med en renhet på omtrent 95$. Analyse for <C>26<H>33N70H2O funnet (beregnet). C: 55,01(54,4-4), H: 6,85(6,15) og N: 16,47(17,09 ). ^-H-NMR (250 Mhz, CDCI3) 8,74 (s, 1H, Ade H-2),8,18 (b. s, 1H, ZNH), 8,10 & 8,04 (s, 1H, H-8), 7,46-7,34 (m,5H, Ph), 5,63 (uopp. t, 1H, BocNH), 5,30 (s, 2H, PhCH2) , 5,16 & 5,00 (s, 2H, CH2C0N), 4,29 & 4,06 (s, sH, CH2C02H), 4,20(q, 2H, 0CH2CH3), 3,67-3,29 (m, 4H, CH2CH2), 1,42 (s, 9H, ^ Bu) og 1,27 (t, 3H, 0CH2CH3). Spekteret viser spor av etanol og DCU.

Eksempel 31.

N^-Benzyloksykarbonyl-1-(Boc-aeg)adenin

N^-Benzyloksykarbonyl-l-(Boc-aeg)adeninetylester (1,48 g, 2,66 mmol) ble suspendert i THF (13 ml) og blandingen ble avkjølt til 0°C. Litiumhydroksid (8 ml, 1 N) ble tilsatt. Etter 15 min. omrøring ble reaksjonsblandingen filtrert, ekstra vann (25 ml) ble tilsatt og oppløsningen ble vasket med metylenklorid (2 x 25 ml). pH til den vandige oppløs-ningen ble justert til pH 2,0 med 1 N HC1. Presipitatet ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket og ga 0,82 g (58$). Produktet represipiterte to ganger med metylenklorid/petroleumeter, 0,77 g (55$) etter tørking. Sm.p. 119°C (dekomp.). Analyse for C24<H>29<N>7O70H2O funnet (beregnet) C: 53,32(52,84), H: 5,71(5,73), N: 17,68(17,97). FAB-MS. 528,5 (MH+). ^H-NMR (250 MHz, DMS0-d6) . 12,75 (meget b, 1H, C02H), 10,65 (b. s, 1H, ZNH), 8,59 (d, 1H, J= 2,14 Hz, Ade H-2), 8,31 (s, 1H, Ade H-8), 7,49-7,31 (m, 5H, Ph), 7,03 & 6,75 (uopp. t, 1H, BocNH), 5,33 & 5,16 (s, 2H, CH2C0N), 5,22 (s, 2H, PhCH2 ), 4,34-3,99 (s, 2H, CH2C02H), 3,54-3,03 (m's innbefatter vann, CH2CH2) og 1,39 & 1,37 (s, 9H, "tBu). <13>C-NMR. 170,4, 166,6, 152,3, 151,5, 149,5, 145,2, 128,5, 128,0, 127,9, 66,32, 47,63, 47,03, 43,87 og 28,24.

Eksempel 32.

2-Amino-6-klor-9-karboksymetylpurin

Til en suspensjon av 2-amino-6-klorfurin (5,02 g, 29,6 mmol) og kaliumkarbonat (12,91 g, 93,5 mmol) i DMF (50 ml) ble det tilsatt bromeddiksyre (4,70 g, 22,8 mmol). Blandingen ble omfattende omrørt i 20 t. under nitrogen. Vann (150 ml) ble tilsatt og oppløsningen ble filtrert gjennom selit til en klar gul oppløsning. Oppløsningen ble surgjort til pH på 3 med 4 N saltsyre. Presipitatet ble filtrert og tørket i våkum over sikapent. Utbytte 3,02 g, 44,8 $). <1>H-NMR(DMS0-d6): d = 4,88 ppm (s, 2H), 6,95 (s, 2H), 8,10 (s, 1H).

Eksempel 33.

2-Amino-6-benzyloksy-9-karboksymetylpurin

Natrium (2,0 g, 87,0 mmol) ble løst opp i benzylalkohol (20 ml) og oppvarmet til 130°C i 2 t. Etter avkjøling til 0°C ble en oppløsning av 2-amino-6-klor-9-karboksymetylpurin (4,05 g, 18,0 mmol) i DMF (85 ml) sakte tilsatt og den resulterende suspensjonen ble omrørt over natt ved 20°C. Natriumhydroksidoppløsningen (IN, 100 ml) ble tilsatt og den klare oppløsningen ble vasket med etylasetat (3 x 100 ml). Vannfasen ble deretter surgjort til en pH på 3 med 4 N saltsyre. Presipitatet ble tatt opp i etylasetat (200 ml) og vannfasen ble ekstrahert med etylasetat (2 x 100 ml). De kombinerte organiske fasene ble vasket med mettet natrium-kloridoppløsning (2 x 75 ml), tørket med vannfri natriumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Resten ble omkrystallisert fra etanol (300 ml). Utbytte etter tørking i våkum over sikapent: 2,76 g (52$). Sm.p. 159-65°C. Analyse (beregnet, funnet) C(56,18, 55,97 ), H(4,38, 4,32 ), N(23,4, 23,10). XE-NMR (DMS0-d6): 4,82 ppm.(s,2H), 5,51 (s,2H), 6,45 (s,2H), 7,45 (m,5H), 7,82 (s,1H).

Ekesempel 34.

N-[2.Amino-6-benzyloksy-purin-9-yl]-acetyl )-N-(2-Boc-aminoetyl)-glysin [BocGaeg-OH monomer]

2-Amino-6-benzyloksy-9-karboksymetyl-purin (0,50 g, 1,67 mmol ), metyl-N(2-[tert-butoksykarbonylamino]etyl)-glysinat (0,65 g, 2,80 mmol), diisopropyletylamin (0,54 g, 4,19 mmol), og bromo-tris-pyrrolidino-fosfonium-heksafluorfosfat IPyBroP®) (0,798 g, 1,71 mmol) ble omrørt i DMF (2 ml) i 4 t. Den klare oppløsningen ble helt inn i en is-avkjølt oppløs-ning av natriumhydrogenkarbonat (1 N, 40 ml) og ekstrahert med etylasetat (3 x 40 ml). Det organiske laget ble vasket med kaliumhydrogensulfatoppløsning (1 N, 2 x 40 ml), natriumhydrogenkarbonat (1 N, 1 x 40 ml) og mettet natrium-kloridoppløsning (60 ml). Etter tørking med vannfri natriumsulfat og avdampning i våkum ble den faste resten omkrystallisert fra etylasetat/heksan (20 ml (2:1)) for å tilveiebringe metylesteren i 63$ utbytte (MS-FAB 514 (M+l). Hydrolyse ble oppnådd ved oppløsning av esteren i etanol/vann

(30 ml (1:2)) inneholdende kons. natriumhydroksid (1 ml). Etter omrøring i 2 t. hie oppløsningen filtrert og surgjort til en pH på 3 ved tilsetning av 4 N saltsyre. Tittelforbindelsen ble oppnådd ved filtrering. Utbytte: 370 mg (72$ for hydrolyse). Renhet ifølge HPLC var høyere enn 99$. På grunn av begrenset rotasjon rundt det sekundære amidet var flere av signalene koblet i forholdet 2:1 (indikert i listen med mj . for major og mi. for minor). 1H-NMR(250, MHz, DMS0-d6): d = 1,4 ppm. (s,9H), 3,2 (m,2H), 3,6 (m,2H), 4,1 (s, mj . , C0NRCH2C00H) , 4,4 (s, mi., C0NRCH2C00H), 5,0 (s, mi., Gua-CHgCO-), 5,2 (s, mj., Gua-CH2C0), 5,6 (s,2H), 6,5 (s,2H), 6,9 (m, mi., BocNH), 7,1 (m, mj . , BocNH), 7,5 (m.,3H), 7,8 (s,lH), 12,8 (s,lH). <13>C-NMR. 170,95, 170,52, 167,29, 166,85, 160,03, 159,78, 155,84, 154,87, 140,63, 136,76, 128,49, 128,10, 113,04, 78,19, 77,86, 66, 95, 49,22, 47,70, 46,94, 45,96, 43,62, 43,31 og 28,25.

Eksempel 35.

3-Boc-amino-l,2-propandiol

3-Amino-l,2-propandiol (40,00 g, 0,440 mol, 1,0 ekv.) ble løst opp i vann (1000 ml) og avkjølt til 0°C. Di-tert-butyldikarbonat (115,0 g, 0,526 mol, 1,2 ekv.) ble tilsatt i en porsjon. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved romtemperatur på et vannbad iløpet av omrøringen. pH ble opprett-holdt ved 10,5 med en oppløsning av natriumhydroksid (17,56 g, 0,440 mol, 1,0 ekv.) i vann (120 ml). Når tilsetningen av vanndig natriumhydroksid var fullført ble reaksjonsblandingen omrørt over natt ved romtemperatur. Deretter ble etylasetat (750 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen etterfulgt av avkjøling til 0°C. pH ble justert til 2,5 med 4 N svovelsyre med omfattende omrøring. Fasene ble separert og vannfasen ble vasket med ytterligere etylasetat (6x350 ml). Volumet av den organiske fasen ble redusert til 900 ml ved avdampning under redusert trykk. Den organiske fasen ble deretter vasket med en mettet vanndig oppløsning av kaliumhdrogensul-

fat fortynnet til to ganger av dens volum (1x1000 ml) og med mettet vanndig natriumklorid (1x500 ml). Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og avdampet under redusert trykk til 50,12 g (60$) av tittelforbindelsen. Produktet kunne stivne ved avdampning fra metylenklorid og påfølgende frysing. H.jjmr (CDC13/TMS): d = 1,43 (s, 9H, Me3C), 3,25 (m, 2H, CH2 ) , 3,57 (m, 2H, CH2), 3,73 (m, 1H, CH). <13>C-NMR (CDCI3/TMS): d = 28,2 (Me3C), 42,6 (CH2), 63,5 71,1 (CH20H, CHOH), 79,5 (Me3C), 157,0 (C=0).

Eksempel 36.

2-(Boe-amino)etyl-L-alaninmetylester

3-Boc-amino-l,2-propandiol (20,76 g, 0,109 mol, 1 ekv.) ble suspendert i vann (150 ml). Kalium m-periodat (24,97 g, 0,109 mol, 1 ekv.) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 t. ved romtemperatur under nitrogen. Reaksjonsblandingen ble filtrert og vannfasen ble ekstrahert med <]> kloroform (6x250 ml). Den organiske fasen ble tørket (MgS04)

og avdampet til et nesten kvantitativt utbytte av Boc-aminoasetaldehyd som en fargeløs olje som ble anvendt uten ytterligere rensing i følgende prosedyre.

Palladium-på-karbon (10$, 0,8 g) ble tilsatt til MeOH (250 <5> ml) under nitrogen med avkjøling (0°C) og omfattende omrøring. Vannfri natriumasetat (4,49 g, 54,7 mmol, 2 ekv.) og L-alaninmetylester, hydroklorid (3,82 g, 27,4 mmol, 1 ekv.) ble tilsatt. Boc-aminoasetaldehyd (4,79 g, 30,1 mmol,

1,1 ekv.) ble løst opp i MeOH (150 ml) og tilsatt til D reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble hydrert ved atmosfærisk trykk og romtemperatur helt til hydrogenopptaket var opphørt. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom selit som var vasket med ytterligere MeOH. MeOH ble fjernet under

redusert trykk. Resten ble suspendert i vann (150 ml) og pH <5> justert til 8,0 ved dråpevis tilsetning av 0,5 N NaOH med omfattende omrøring. Vannfasen ble ekstrahert med metylenklorid (4x250 ml). Den organiske fasen ble tørket (MgS04),

filtrert gjennom selit og avdampet under redusert trykk for å tilveiebringe 6,36 g (94$) av tittelforbindelsen som en klar, noe gul olje. MS (FAB-MS): m/z ($) = 247 (100, M+l, 191 (90 ), 147 (18). 1-H-NMR (250 MHz, CDC13). 1,18 (d, J=7,0 Hz, 3H, Me), 1,36 (s, 9H, Me3C), 1,89 (b, 1H, NH), 2,51 (m, 1H, CH2), 2,66 (m, 1H, CH2), 3,10 (m, sH, CH2), 3,27 (q, J=7,0 Hz, 1H, CH), 3,64 (s, 3H, OMe), 5,06 (b, 1H, karbamat NH). 1<3>V-NMR. d = 18,8 (Me), 28,2 (Me3C), 40,1, 47,0 (CH2), 51,6 (OMe), 56,0 (CH), 155,8 (karbamat C=0) , 175,8 (ester C=0).

Eksempel 37.

N-(Boc-aminoetyl)-N-(1-thyminylacetyl)-L-alaninmetylester

Til en oppløsning av Boc-aminoetyl-(1)-alaninmetylester (l,23g, 5,0 mmol) i DMF (10 ml) ble det tilsatt Dhbt-OH (0,90 g, 5,52 mmol) og 1-thyminyleddiksyre (1,01 g, 5,48 mmol). Når 1-thyminyleddiksyre ble oppløst, ble diklormetan (10 ml) tilsatt og oppløsningen ble avkjølt på et isbad. Etterat reaks j onsblandingen hadde nådd 0°C ble DCC (1,24 g, 6,01 mmol) tilsatt. Iløpet av 5 min. etter tilsetningen fremkom et presipitat av DCU. Etter ytterligere 5 min. ble isbadet fjernet. To timer senere viste TLC analyse at reaksjonen var ferdig. Blandingen ble filtrert og presipitatet vasket med diklormetan (100 ml). Den resulterende oppløsningen ble ekstrahert to ganger med 5$ natriumhydrogenkarbonat (150 ml) og to ganger med mettet kaliumhydrogensulfat (25 ml) i vann (100 ml). Etter en endelig ekstrahering med mettet natriumklorid (150 ml) ble oppløsningen tørket med magnesiumsulfat og avdampet til et hvitt skum. Skummet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel ved anvendelse av diklormetan med en metanolgradient som elueringsmiddel. Dette ga en ren forbindelse (>99$ ved HPLC) (1,08 g, 52,4 $). FAB-MS: 413 (M+l) og 431 (M+l + vann). 1H-NMR (CDCI3): 4,52 (s, 2H, CH2), 3,73 (s, 3H, OMe), 3,2-3,6 (m, 4H, etyl CH2' s) , 1,90 (s, 3H, Me i T), 1,49 (d, 3H, Me i ala, J=7,3 Hz), 1,44 (s, 9H, Boe).

Eksempel 38.

N-(Boc-aminoetyl )-N-(1-thyminylacetyl)-L-alanin

Metylesteren til tittelforbindelsen (2,07 g, 5,02 mmol) ble løst opp i metanol (100 ml) og avkjølt på et isbad. 2 M natriumhydroksid (100 ml) ble tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble pH til blandingen justert til 3 med 4 M hydrogen-klorid. Oppløsningen ble deretter ekstrahert med etylasetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske ekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat. Etter avdampning ble det resulterende skummet oppløst i etylasetat (400 ml) og noen få ml metanol for å oppløse det faste materialet. Petroleumeter ble deretter tilsatt helt presipiteringen begynte. Etter henstand over natt ved -20°C ble presipitatet fjernet ved filtrering. Dette ga 1,01 g (50,5 %) ren forbindelse (>99# ved HPLC). Forbindelsen kan bli omkrystallisert fra 2-propanol. FAB-MS: 399 (M+l). -'-H-NMR (DMS0-d6): 11,35 (s, IH, C00), 7,42 (s, 1H, H'6), 4,69 (s, 2 H, CH'2), 1,83 (s, 3 H, Me i T), 1,50-1,40 (m, 12 H, Me i Ala + Boe).

Eksempel 39.

(a) N-(Boc-aminoetyl )--N-(1-thyminylacetyl)-D-alaninmetylester

Til en oppløsning av Boc-aminoetylalaninmetylester (2,48 g, 10,1 mmol) i DMF (20 ml) ble det tilsatt Dhbt-OH (1,80 g, II, 0 mmol) og thyminyleddiksyre (2,14 g, 11,6 mmol). Etter oppløsning av 1-thyminyleddiksyre ble metylenklorid (20 ml) tilsatt og oppløsningen avkjølt på et isbad. Når reaksjonsblandingen hadde nådd 0°C ble DCC (2,88 g, 14,0 mmol) tilsatt. Iløpet av 5 min. etter tilsetningen fremkom et presipitat av DCU. Etter 35 min. ble isbadet fjernet. Reaksjonsblandingen ble filtert 3,5 t. senere og presipitatet ble vasket med metylenklorid (200 ml). Den resulterende oppløsningen ble ekstrahert to ganger med 5$ natriumhydrogenkarbonat (200 ml) og to ganger med mettet kaliumhydrogensulfat i vann (100 ml). Etter en endelig ekstrahering med mettet natriumklorid (250 ml) ble oppløsningen tørket med magnesiumsulfat og avdampet til en olje. Oljen ble renset ved hjelp av kort kolonne si 1ikagelkromatografi ved anvendelse av metylenklorid med en metanolgradient som elueringsmiddel. Dette ga en forbindelse som var 96$ ren ifølge HPLC (1,05 g, 25,3 $) etter presipitering med petroleumeter. FAB-MS: 413 (M+l). ^-H-NMR (CDC13): 5,64 (t, 1 H, BocNH, J=5,89 Hz), 4,56 (d, 2 H, CH*2 ) , 4,35 (q, 1 H, Ch i Ala, J=7,25 Hz), 3,74 (s, 3 H, OMe), 3,64-3,27 (m, 4 H, etyl H's), 1,90 (s, 3 H, Me i T), 1,52-1,44 (t, 12 H, Boc-Me i Ala).

(b) N-(Boc-aminoetyl)-N-(1-thyminylacetyl)-D-alanin

Metylesteren av tittelforbindelsen (1,57 g, 3,81 mmol) ble løst opp i metanol (100 ml) og avkjølt på et isbad. Natriumhydroksid (100 ml, 2 M) ble tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble pH til blandingen justert til 3 med 4 M hydrogen-klorid. Oppløsningen ble deretter ekstrahert med etylasetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske ekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat. Etter avdampning ble oljen løst opp i etylasetat (200 ml). Petroleumeter ble tilsatt (til et totalvolum på 600 ml) helt til presipiteringen begynte. Etter henstand over natt ved -20°C ble presipitatet fjernet ved filtrering. Dette 1,02 g (67,3 $) av tittelforbindelsen som var 94$ ren ifølge HPLC. (FAB-MS: (M+!). ^-H-NMR: 11,34 (s, 1 H, COOH), 7,42 (s, 1 H, H'6), 4,69 (s, 2 H, CH'2). 4,40 (q, 1 H, CH iAla, J=7,20 Hz), 1,83 (s, 3 H, Me i T), 1,52-I, 40 (m, 12 H, Boe + Me i Ala).

Eksempel 40.

N-(N'Boc-3'-aminopropyl)-N-[(l-tymilyl ) acetyl ] gly sinme tyl-ester

N-(N'-Boc-3'-aminopropyl )glysinmetylester (2,84 g, 0,0115 mol) ble løst opp i DMF (35 ml) etterfulgt av tilsetning av DhbtOH (2,07 g, 0,0127 mol) og 1-thyminyleddiksyre (2,34 g, 0,0127 mol). Metylenklorid (35 ml) ble tilsatt og blandingen avkjølt til 0°C på et isbad. Etter tilsetning av DCC (2,85 g, 0,0138 mol) ble blandingen omrørt ved 0°C i 2 t., etterfulgt av 1 t. ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering, vasket med metylenklorid (25 ml) og en ytteligere mengde metylenklorid (150 ml) ble tilsatt til filtratet. Den organiske fasen ble ekstrahert med natriumhydrogenkarbonat (1 volum mettet fortynnet med 1 volum vann, 6 x 250 ml), kaliumsulfat (1 volum mettet fortynnet med 4 volum vann, 3 v 250 ml) og mettet vanndig natriumklorid (1 x 250 ml), tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Den faste resten ble suspendert i metylenklorid

(35 ml) og omrørt ilt. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket med metylenklorid (25 ml). Filtratet ble avdampet til tørrhet i våkum og resten renset ved kolonnekromatografi på silikagel, eluerende med en blanding av metanol og metylenklorid (gradient fra 3-7$ metanol i metylenklorid). Dette ga tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (3,05 g, 64$). Sm.p. 76-79°C (dekomp.) Analyse for C18<H>28<N>407, funnet (beregnet) C: 52,03 (52,42) H: 6,90 (6,84) N: 13,21 (13,58). Forbindelsen viste tilfredsstillende ^ E og <13>C-NMR spektere.

Eksempel 41.

N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)-N-[(1-thyminyl)acetyl]glysin

N-(N'-Boc-3'-aminopropyl )-N- [ (thyminyl) acetyl] gly sinmetyle-ster (3,02 g, 0,00732 mol) ble løst opp i metanol (25 ml) og omrørt i 1,5 t. med 2 M natriumhydroksid (25 ml). Metanol ble fjernet ved avdampning, i våkum, og pH justert til 2 med 4 M saltsyre ved 0°C. Produktet ble isolert som hvite krystaller ved filtrering, vasket med vann (3 x 10 ml) og tørket over sikapent i våkum. Utbytte 2,19 g (75$). Analyse for C<17>H26N4<0>7, H20. funnet (beregnet) C: 49,95 (49,03) H: 6,47 (6,29) N: 13,43 (13,45). Forbindelsen viste tilfredsstillende <1>H og 13C-NMR spektre.

Eksempel 42.

3-(1-Thyminyl)-propansyremetylester

Thymin (14,0 g, 0,11 mol) ble suspendert i metanol. Metylakrylat (39,6 ml, 0,44 mol) ble tilsatt sammen med katalytiske mengder natriumhydroksid. Oppløsningen ble tilbakestrøm-met i mørket i 45 t., avdampet til tørrhet, i våkum og residiet ble løst opp i metanol (8 ml) med oppvarming. Etter avkjøling på et isbad ble produktet presipitert ved tilsetning av eter (20 ml), isolert ved filtrering, vakset med eter (3 x 15 ml) og tørket over sikapent i våkum. Utbytte 11,23 g (48$). Sm.p. 112-119°C. Analyse for C9H12N204, funnet (beregnet) C: 51,14 (50,94) H: 5,78 (5,70) N: 11,52 (13,20). Forbindelsen viste tilfredsstillende <1>H og 1<3>C-NMR spektre.

Eksempel 43.

3-(1-Thyminyl)-propansyre

3-(1-Thyminyl)-propansyremetylester ( 1, q g, 0,0047 mol) ble suspendert i 2 M natriumhydroksid (15 ml )og kokt i 10 min. pH ble justert til 0,3 med kons. saltsyre. Oppløsningen ble ekstrahert med etylasetat (10 x 25 ml). Den organiske fasen ble ekstrahert med mettet vanndig natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum for å gi tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (0,66 g, 71$). Sm.p. 118-1221°C. Analyse for CgH10N2°4' funnet (beregnet) C: 48,38 (48,49) H: 5,09 (5,09) N: 13,93 (14,14). Forbindelsen viste tilfredsstillende ^H og <13>C-NMR spektre.

Eksempel 44.

N-(N'-Boc-aminoetyl)-N-[(1-thyminyl)propanyl]glysinetylester

N-(N'-Boc-aminoetyl)glysinetylester (1,0 g, 0,0041 mol) løst opp i DMF (12 ml). DhbtOH (0,73 g, 0,0045 mol) og 3-(l-thyminyl)propanoisk syre (0,89 g, 0,0045 mol) ble tilsatt. Metylenklorid (12 ml) ble deretter tilsatt og blandingen ble avkjølt til 0oC på et isbad. Etter tilsetning av DCC (1,01 g, 0,0049 mol) ble blandingen omrørt ved 0°C i 2 t. etterfulgt av 1 t. ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering, vasket med metylenklorid (25 ml) og en ytterligere mengde metylenklorid (50 ml) ble tilsatt til filtratet. Den organiske fasen ble ekstrahert med natriumhydrogenkarbonat (1 volum mettet fortynnet med 1 volum vann, 6 x 100 ml), kaliumsulfat (1 volum mettet fortynnet med 4 volum vann, 3 x 100 ml) og mettet vanndig natriumklorid (1 x 100 ml), tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i våkum. Den faste resten ble suspendert i metylenklorid (15 ml) og omrørt i 1 t. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket med metylenklorid. Filtratet ble avdampet til tørrhet i våkum og resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel, eluerende med en blanding av metanol og metylenklorid (gradient fra 1 til 6$ metanol i metylenklorid). Dette ga tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (1,02 g, 59$). Analyse for C-L<g>B^<g>^Oy, funnet (beregnet) C: 53,15 (53,51) H: 6,90 (7,09) N: 12,76 (13,13). Forbindelsen viste tilfredsstillende 1H pg <13>C-NMR spektre.

Eksempel 45.

N-(N'-Boc-aminoetyl)-N-[(1-thyminyl)propanyl]glysin

N-(N ' -Boc-aminoetyl )-N-[(l-thyminyl)propanyl]glysinetylester (0,83 g, 0,00195 mol) ble løst opp i metanol (25 ml. Natriumhydroksid (25 ml, 2 M) ble tilsatt. Oppløsningen ble omrørt ilt. Metanol ble fjernet ved avdampning i våkum og pH ble justert til 2 med 4 M saltsyre ved 0°C. Produktet ble isolert ved filtrering, vasket med eter (3 x 15 ml) og tørket over sikapent i våkum. Utbytte 0,769 g, 99$). Sm.p. 213°C (dekomp. ).

Eksempel 46.

Mono-Boc-etylendiamin (2)

tert-Butyl-4-nitrofenylkarbonat (1) (10,0 g, 0,0418 mol) løst opp i DMF (50 ml) ble dråpevis tilsatt over en periode på 30 min. til en oppløsning av etylediamin (27,9 ml, 0,418 mol) og DMF (50 ml) og omrørt over natt. Blandingen ble avdampet til tørrhet i våkum og den resulterende oljen ble løst opp i vann (250 ml). Etter avkjøling til 0°C ble pH juster til 3,5 med 4 M saltsyre. Oppløsningen ble deretter filtrert og ekstrahert med kloroform (3x250 ml). pH ble justert til 12 ved 0°C med 2 M natriumhydroksid og den vandige oppløsningen ble ekstrahert med metylenklorid (3x300 ml). Etter behandling med mettet vanndig natriumklorid (250 ml) ble metylkloridoppløsningen tørket over magnesiumsulfat. Etter filtrering ble oppløsningen avdampet til tørrhet i våkum og ga 4,22 g (63$) av produktet (olje). 1H-NMR (90 MHz, CDC13), 51,44 (s, 9H), 2,87 (t, 2H), 3,1 (q, 2H), 5,62 (s, broad).

Eksempel 47.

(N-Boc-aminoetyl)-p<->alaninmetylester, HC1

Mono-Boc-etylendiamin (2) (16,28 g, 0,102 mol) ble løst opp i asetonitril (400 ml) og metylakrylat (91,50 ml, 1,02 mol) ble overført til blandingen med asetonitril (200 ml). Oppløs-ningen ble tilbakestrømmet over natt under nitrogen i mørket for å unngå polymerisering av metylakrylat. Etter avdampning til tørrhet i våkum ble en blanding av vann og eter (200 + 200 ml) tilsatt og oppløsningen ble filtrert og omfattende omrørt. Den vandige fasen ble ekstrahert en gang til med eter og deretter frysetørket for å tilveiebringe et gult fast stoff. Omkrystallisering fra etylasetat ga 13,09 g (46$) av tittelforbindelsen. Sm.p. 138-140°C. Analyse for 0-^23^0-4C1, funnet (beregnet) C: 46,49 (46,72) H: 8,38 (8,20) N: 9,83 (9,91) Cl: 12,45 (12,54 ). <i>H-NMR (90 MHz, DMS0-d6 ): S 1,39 (s, 9H), 2,9 (m, 8H), 3,64 (s, 3H).

Eksempel 48.

N-[ (1-thyminyl)acetyl]-N *-Boc-aminoetyl-p-alaninmetylester

(N-Boc-amino-etyl )-p-alaninmetylester, HC1 , (3) (2,0 g, 0,0071 mol) og 1-thyminyleddiksyrepentafluorfenylester (5)

(2,828 g, 0,00812 mol) ble løst opp i DMF (50 ml). Trietylamin (1,12 ml, 0,00812 mol) ble tilsatt og blandingen omrørt over natt. Etter tilsetning av metylenklorid (200 ml) ble den organiske- fasen ekstrahert med vanndig natriumhydrogenkarbonat (3x250 ml), halvmettet vanndig kaliumhydrogensulfat (3x250 ml) og mettet vanndig natriumklorid (250 ml) og tørket over magnesiumsulfat. filtrering og avdampning til tørrhet i våkum resulterte i 2,9 g (99$) utbytte (olje). 1H-NMR (250 MHz, CDCI3): På grunn av begrenset rotasjon rundt det sekundære amidet har flere av signalene blitt doblet, 5 1,43 (s, 9H), 1,88 (s, 3H), 2,63 (t, 1H), 2,74 (t, 1H), 3,25-3,55 (4xt, 8H), 3,65 (2xt, 2H), 3,66 (s, 1,5), 3,72 (s, 1,5), 4,61 (2, 1H), 4,72 (s, 2H), 5,59 (s, 0, 5H), 5,96 (s, 0, 5H), 7,11 (s, 1H), 10,33 (s, 1H).

Eksempel 49.

N-[(1-Thyminyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p<->alanin

N - [ (1-Thyminyl )acetyl]-N' - Boc-aminoetyl-p-alaninmetylester (3,0 g, 0,0073 mol) ble løst i 2 M natriumhydroksid (30 ml), pH justert til 2 ved 0°C med 4 M saltsyre og oppløsningen ble omrørt i 2 t. Presipitatet ble isolert ved filtrering, vasket tre ganger med kaldt vann og tørket over sikapent i våkum. Utbytte 2,23 g (77$). Sm.p. 170-176°C. Analyse for <C>17<H>26<N>407, H20, funnet (beregnet) C: 49,49 (49,03), H: 6,31 (6,78) N: 13,84 (13,45). 1H-NMR (90 MHz, DMS0-d6) : S 1,38 (s, 9H), 1,76 (s, 3H), 2,44 og 3,29 (m, 8H), 4,55 (s, 2H), 7,3 (s, 1H), 11,23 (s, 1H). FAB-MS: 399 (M+l).

Eksempel 50.

N-[(l-(N<4->Z)-sytosyl(acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p<->alaninmetylester

(N-Boc-amino-etyl )-(3-alaninmetylester , HC1 (3) (2,0 g, 0,0071 mol) og l-(N-4-Z)-sytosyleddiksyrepentafluorfenylester (5)

(3,319 g, 0,0071 mol) ble løst opp i DMF (50 ml). Trietylamin (0,99 ml, 0,0071 mol) ble tilsatt og blandingen omrørt over natt. Etter tilsetning av metylenklorid (200 ml) ble den organiske fasen ekstrahert med vanndig natriumhydrogenkarbonat (3x250 ml), halvmettet vanndig kaliumhydrogensulfat (3x250 ml) og mettet vanndig natriumklorid (250 ml) og tørket over magnesiumsulfat. Filtrering og avdampning til tørrhet i våkum resulterte i 3,36 g fast forbindelse som ble omkrystl-lisert fra metanol. Utbytte 2,42 g (64$). Sm.p. 158-161°C. Analyse for <C>25<H>33<N>508, funnet (beregnet) C: 55,19 (56,49) H: 6,19 (6,26) N: 12,86 (13,18). ^-H-NMR (250 MHz, CDC13): På grunn av begrenset rotasjon rundt det sekundære amidet var flere av signalene doblet- S 1,43 (s, 9H), 2,57 (t, 1H), 3,60-3,23 (m's, 6H), 3,60 (s, 1.5H), 3,66 (s, 1,5H), 4,80 (s, 1H), 4,88 (s, 1H), 5,20 (s, 2H) , 7,80-7,25 (m's, 7H). FAB-MS: 532 (M+l).

Eksempel 51.

N-[(1-(N4-Z )-sytosyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p-alanin

N-[(l--(N-4-Z)-sytosyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p-alaninmetylester (0,621 g, 0,0012 mol) ble løst opp i 2 M natriumhydroksid (8,5 ml) og omrørt i 2 t. Deretter ble pH justert til 2 ved 0°C med 4 M saltsyre og oppløsningen ble omrørt i 2 t. Presipitatet ble isolert ved filtrering, vasket 3 ganger med kaldt vann og tørket over sikapent i våkum. Utbytte 0,326 g (54$). Det hvite fast stoffet ble omkrystallisert fra 2-propanol og vasket med petroleumeter. Sm.p. 163°C (dekomp.). analyse for 024^^503, funnet (beregnet) C: 49,49 (49,03) H: 6,31 (6,78) N: 13,84 (13,45). ^H-NMR (250 MHz, CDCI3): På grunn av begrenset rotasjon det sekundære amidet var flere av signalene doble, S 1,40 (s, 9H), 2,57 (t, 1H), 2,65 (t, 1H), 3,60-3,32 (m<*>s, 6H), 4,85 (s, 1H), 4,98 (s, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,71 (s, 1H, broad), 7,99-7,25 (m's, 7H). FAB-MS: 518 (M+l).

Ekesempel 52.

Eksempel på en PNA-oligomer med et guaninresidie

(a) Fast-fase syntese av H-[Taeg]5-[Gaeg]-[Taeg]4~Lys-NH2

Beskyttet PNA ble oppstilt på en Boc-Lys(ClZ) modifisert MBHA harpiks med en substitusjon på omtrent 0,15 mmol/g (bestemt ved kvantitativ ninhydrinreaksjon). Capping av ukoblede aminogrupper ble bare utført før innkorporering av BocGaeg-OH monomeren.

(b) Trinnvis oppstilling av H-[Taeg]5-[Gaeg]-[Taeg]4-Lys-NH2

(syntese protokoll)

Syntesen ble initiert på 102 mg (tørrvekt) forsvellet (over natt i DCM) og nøytralisert Boc-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. Trinnene som ble utført var som følger: (1) Boc-avspaltning med TFA/DCM (1:1, v/v), 1x2 min. og 1 x 1/2 t., 3 ml, (2) vasking med DCM, 4 x 20 sek., 3 ml, vasking med DMF, 2 x 20 sek., 3 ml, vasking med DCM 2 x 20 sek., 3 ml. og avrenning i 30 sek., (3) nøytralisering med DIEM/DCM (1:19 v/v), 2x3 min., 3 ml. (4) vasking med DCM, 4 x 20 sek., 3 ml og avrenning i 1 min., (5) tilsetning av 4 ekv. diisoporpylkar-bodiimid (0,06 mmol, 9,7 pl) og 4 ekv. (0,06 mmol, 24 mg) BocTaeg-OH eller (0,06 mmol, 30 mg) BocGaeg-OH løst opp i 0,6 ml DCM/DMF (1:1, v/v) (sluttkonsentrasjon av monomer 0,1 M), og koblingsreaksjonen ble latt gå i 1/2 t. med risting ved romtemperatur, (6) suget ble påført i 20 sekunder (7) vasking med DMF, 2 x 20 sek. og 1 x 2 min., 3 ml, vasking med DCM 4 x 20 sek., 3 ml, (8) nøytralisering med DIEA/DCM (1:19 v/v), 2x3 min., 3 ml, (9) vasking med DCM 4 x 20 sek., 3 ml og avrenning i 1 min., (10) kvalitativ Kaiser test, (11) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acetylering med Ac20/pyridin/DCM (1:1:2, v/v), 1 x 1/2 t., 3 ml, og (12) vasking med DCM, 4 x 20 sek., 2x2 min. og 2 x 20 sek., 3 mol. Trinnene 1-12 ble gjentatt helt til den ønskede sekvensen ble oppnådd. Alle kvalitative Kaiser testene var negative (strå-gul farge uten farging av kulene) indikerte nesten. 100$ koblingsutbytte. PNA-oligomeren ble spaltet og renset ved hjelp av normalprosedyren. FAB-MS: 2832,11 [M<*>+l] (beregn. 2832,15).

Eksempel 53.

Fast-fase syntese av H-TAEG-Aaeg-[Taeg]g-Lys-NH2

(a) Trinnvis oppstilling av Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks.

Omtrent 0,3 g våt Boe-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 3 ml SPPS reaksjonsbeholder. BocTaeg-A(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC kobling (enkel) av A(Z)aeg residiet ved anvendelse av 0,19 M BocA(Z )aeg-0H sammen med 0,15 M DCC i 2,5 ml 50$ DMF/CH2C12 og en enkelt kobling med 0,15 M BocTaeg-OPfp i hver CH2C12 ("Syntese Protokoll 5"). Syntesen ble registrert ved kvantitativ ninhydrinreaksjon som viste omtrent 50$ inkorporering av A(Z)aeg og omtrent 96$ inkorporering av Taeg. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Taeg-Aaeg-[Taeg]8-Lys-NH2.

Beskyttet Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z)-BAH harpiks ble behandlet som beskrevet i eksempel 40c for å tilveiebringe omtrent 15,6 g råmateriale ved HF spaltning av 53,1 mg tørr H-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 14,4 min. utgjorde mindre enn 50$ av den totale absorbansen. En 0,5 mg del av råproduktet ble renset til omtrent 0,1 mg H-Taeg-Aaeg-[Taeg]g-Lys-NH2. For (MH+)<+> var den beregnede m/z verdien 1816,16 og den målte m/z verdien var 1816,28.

(c) Synteseprotokoll 5.

(1) Boc-avspaltningen med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 2,5 ml, 3 x 1 min. og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2C12, 2,5 ml, 6 x 1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), 2,5 ml, 3x2 min., (4) vasking med CH2C12, 2,5 ml, 6 x 1 min., og avrenning i 1 min., (5) 2-5 mg prøve PNA harpiks ble tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjon, (6) tilsetning av 0,47 mmol (0,25 g) BocA(Z)aeg-0H løst opp i 1,25 ml DMF etterfulgt av tilsetning av 0,47 mmol (0,1 g) DCC i 1,25 ml CH2C12, eller 0,36 mmol (0,20 g) BocTaeg-OPfp i 2,5 ml CH2C12, koblingsreaksjonen ble utført med totalt 20-24 t. risting, (7) vasking med DMF, 2,5 ml, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 2,5 ml, 4 x 1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), 2,5 ml, 2 x 2 min., (10) vasking med CH2C12, 2,5 ml, 6x1 min., (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme koblinggraden, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acetylering med en 25 ml blanding av eddiksyreanhydrid/- pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t. (unntatt etter siste syklus) og (13) vasking med CH2C12, 2,5 ml, 6x1 min., (14) 2 x 2-5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut, nøytralisert med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), og vasket med CH2C12 for ninhydrinanalyser.

Eksempel 54.

Fast-fase syntese av H-[Taeg]£-Aaeg-[Taeg]g-Lys-NHg

(a) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]g-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks.

Omtrent 0,5 g våt Boe[Taeg]5-Lys(VIZ)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]2~ A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpik ble oppstilt ved in situ DCC kobling av både av A(Z)aeg og Taeg residier ved anvendelse 0,15 M til 0,2 M beskyttet PNA monomer (fri syre) sammen med en ekvivalent mengde DCC i 2 ml bar CH2CI2 ("Syntese Protokoll 6"). Syntesen ble registrert ved den kvantitative ninhydrinreaksjonen som viste en total omtrent 82$ inkorporering av A(Z)aeg etter kobling tre ganger (den første koblingen ga omtrent 50$ inkorporering, en fjerde HOBt-formidlet kobling i 50$ DMF/CH2C12 økte ikke det totale koblingsutbyttet og kvantitativ inkorporering (enkeltkoblinger) av Taeg residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]2~Aaeg-[Tae<g>]5<->Lys-NH2.

Den beskyttede Boe-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z )-BHA hapiksen ble behandlet som beskrevet i eksempel 40c for å tilveiebringe omtrent 16,2 mg råmeteriale ved HF spaltning av 102,5 mg tørr H-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-BHA harpiks. En liten del av råproduktet ble renset. For (MH+)<+> var den beregnede m/z verdien 2050,85 og den målte m/z verdien var 2050 ,90 .

(c) Synteseprotokol1 6.

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 2 ml , 3x1 min., og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2CI2, 2 ml, 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2CI2 (1: 19, v/v), 2 ml, 3x2 min., (4) vasking med CHgC^, 2 ml, 6x1 min., og avrenning i 1 min., (5) 2-5 mg prøve PNA-harpik ble tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjon, (6) tilsetning av 0,44 mmol (0,23 g) BocA(Z)aeg-0H løst opp i 1,5 ml CH2CI2 etterfulgt av tilsetning av 0,44 mmol (0,09 g) DCC i 0,5 ml CH2C12 eller 0,33 mmol (0,13 g) BocTaeg-OH i 1,5 ml CH2C12 etterfulgt av tilsetning av 0,33 mmol (0,07 g) DCC i 0,5 ml CH2C12, koblingsreaksjonen ble kjørt i totalt 20-24 t. med risting, (7) vaskin med DMF, 2 ml, 1x2 min., (8) vaskin med CH2CI2, 2 ml, 4x1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1: 19, v/v), 2 ml, 2x2 min., (10) vasking med CB^C^, 2 ml, 6x1 min., (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme koblingsgraden, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acetylering med en 25 ml blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t.

(unntatt etter siste syklus), (13) vasking med CH2C12, 2 ml, 6x1 min., og (14) 2 x 2-5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut, nøytralisert med DIEA/CH2CI2 (1: 19, v/v) og vasket med CH2C12 for ninhydrinanalyser.

Eksempel 55.

Eksempel med en "ingen base" substitusjon.

Det fremgår at sammenlignet med H-T^Q-LysNHg resulterte erstatning av en thyminligand med H i et fall av Tm til 48°C fra 73°C. Effekten av også å introdusere en enkelt basefeil-paring er også vist.

Visse biokjemiske/biologiske egenskaper til PNA oligomerene er illustrert i følgende eksperimenter. 1. Sekvensdiskriminering på dsDNA nivå (eksempel 63, figur 20 ).

Ved anvendelse av S-^-nuklease probeteknikken ble diskrimine-ringen av bindingen av T10, T5CT4 (TgC) & T2CT2CT4 (T8<C>2) PNA til gjenkjenningssekvensene A^q, A5GA4 (AgG) & A2GA2GA4 (AgG2) klonet inn i BamHI, Sali eller Pstl sete av plasmid pUC19 analysert. Resultatetene (figur 20) viser at de tre PNA blir bundet til deres respektive gjenkjenningssekvenser med følgende relative effektiviteter: PNA T^q: A^q > A9<G >>> A8G2, PNA - TgC: AgG > A10 >> Ag<G>2. PNA - TgC2: AgG2 >-AgG >> A^q. Ved 77°C gir derfor en feilparing ut av ti redusert effektivitet (vurdert til 5-10 ganger), mens to feilparinger er ikke akseptert. 2. Forflytting av et enkelttrådet DNA fra en ds-DNA ved hybridisering av PNA T10/T9C/TgC2 (figur 20) - eksempel 63. 3. Kinetikken til PNA-T^g - dsDNA trådforflyttingskompleks-dannelse (eksempel 64, figur 21).

Kompleksdannelsen ble probet av S^-nuklease ved forskjellige tidspunkter etter blanding av PNA og <32>p-ende merket dsDNA fragment (fig. 21). 4. Stabiliteten til PNA-dsDNA komplekset (eksempel 65, figur 22 ).

Kompleksene mellom PNA-Tn og 32p-dsDNA (Aio/<T>^<q> mål ble dannet (60 min., 37°C). Kompleksene ble deretter inkubert ved ønsket temperatur i nærvær av overskudd oligo-dA^Q i 10 min., avkjølt til ET og probet med KMnC^. Resultatene (figur 22) viser at den termiske stabiliteten til PNA-dsDNA kompleksene tilsvarer den til PNA oligonukleotidkompleksene med hensyn på "Tm". 5. Inhibisjon av restriksjonsenzymspaltningen til PNA (eksempel 64, figur 23).

Plasmidkonstruksjonen, pTIO, inneholder en dA^o/dTio trakt klonet inn i BamHI ssete i pUC19. Spaltning av pTIO med BamHI og PvuII resulterer i to små DNA fragmenter på henholdsvis 211 og 111 bp. I nærvær av PNA-T10, blir et 336 bp fragment oppnådd tilsvarende være spaltning med PvuII (fig. 23). Spaltning ved BamHI blir derfor inhibert av PNA binding proksimalt til restriksjonsenzymsetet. Resultatene viser også at PNA-dsDNA komplekset kan bli dannet i 100°C utbytte. Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av pT8C2 plasmidet og PNA-T8C2. 6. Binding av <125>I-merket PNA til oligonukleotider (eksempel 63, fig. 24).

Tyr-PNA-T1Q-Lys-NH2 ble merket med 12<5>j veci anvendelse av Na<125>I og kloramin-T og renset ved HPLV. <125>I-PNA-T10 ble vist å bli bundet til oligo-dA^Q ved PAGE og autordiografi (figur 24). Bindingen kunne bli konkurrert av denaturert kalvetymus DNA i overskudd.

I punkt (1) ovenfor blir den sekvens-spesifikke gjenkjenningen av dsDNA illustrert ved binding av en PNA, bestående av 10 thyminsubstituerte 2-aminoetylglysyl enheter som C-terminerer i et lysinamid og N-terminerer i et kompleks 9-aminoakridinligand (9-Acr<1->(Taeg)^Q-Lys-NH2, figurene lia og b) til en dA^g/dT^Q målsekvens. Målet er innbefattet i et 248 bp <32>P-ende-merket DNA-fragment.

Tårdforflyttingen ble bekreftet ved følgende type av eksperimenter: 1) 9-Acr<1> liganden (figur 5) som er utstyrt med en 4-nitrobensamidogruppe for å forsikre spaltning av DNA ved bestrålning har ventet bare å spalte DNA i nærheten av dets bindingssete. Ved bestrålning av PNA med ovennevnte 248 bp DNA fragment blir selektiv spaltning ved dA^o/dT^Q sekvensen observert (figur 3a). 2) I en såkalt fotoavtrykksanalyse hvor et syntetisk diaso-koblet akridin under bestrålning spalter DNA ved interaksjon med DNA (med unntagelse av hvor DNA blir inkorporert av nevnte bindingsforbindelse).

Et slikt eksperiment ble utført med ovennevnte 248 bp dsDNA fragment som viste en klar beskyttelse overfor fotospaltning av PNA bindingssetet (figur 3b). (3) I et lignende eksperiment utviste DNA-spaltningsenzymet mikrokokkusnuklease, som også er hindret i dets virkning av de fleste DNA-bindende reagensene, økt spaltning ved T^q-målet (figur 3c). 4) I en annen eksperimenttype ble de velkjente med høy mottakelighet enkelttrådede thyminligandene (i forhold til dobbelttrådede thyminlegander) anvendt overfor kaliumperman-ganatoksidering. Oksidering av 248 bp i nærvær av reagenset viste bare oksidering av T^g-tråden til målet (figur 3b). 5) I en lignende demonstrasjon viste den enkelttrådede spesifisiteten til S^ nuklease at bare T^g-tråden til målet var angrepet (figur 3d).

Meget effektive bindinger av (Taeg)^Q, (Taeg)ig-Lys-NH2 og Acr<1->(Taeg)^Q-Lys-NH2 (figur 5) til tilsvarende dA-^g ble ytterligere illustrert på to måter: 1. Som vist i eksempel 56 nedenfor vil PNA-oligonukleotidkompleksene migrere saktere enn det enkelttrådede oligonukleotidet med elektroforese i polyakrylamidgeler. Slike eksperimenter -ble derfor utført med Acr 1-(Taeg^Q-Lys-NB^ og <32>p-ende-merket dA-^g. Dette viste begrenset migrering under betingelser hvor en normal dA^g/dT^g dupleks er stabil samt under betingelser hvor et slikt dupleks er ustabil (denaturerende gel). Et kontrolleksperiment ble utført med en blanding av Acr<l->(Taeg)^g-Lys-NH2 og <32>P-ende-merket dT-^g som ikke viste noen retardasjon under ovennevnte betingelser. 2. Ved dannelsen av DNA duplekser (dsDNA) fra enkelttrådet DNA reduseres ekstinsjonskoeffisienten (hypokromisiteten). Denaturer ing av DNA kan dermed bli fulgt ved måling av forandringene i absorbansen, for eksempel, som en funksjon av Tm, temperaturen hvor 50$ av et dupleks har blitt borte for å tilveiebringe enkelttråder.

Duplekset ble dannet fra enkelt-trådede oligodeoksyribonukle-otider og PNA er angitt nedenfor. Vanligvis var 0,3 0D2(,g av den T-rike tråden hybridisert med en ekvivalent av den andre tråden ved oppvarming til 90°C i 5 min., avkjøling til romtemperatur og oppbevart i 30 min. og tilslutt lagret kjølig ved 5°C i minst 30 min. Bufferene som ble anvendt var alle 10 mM i forsfat og 1 mM i EDTA. Lavsaltbuf feren inneholdt ikke natriumklorid, mens middelsaltbufferen inneholdt 140 mM NaCl og høysaltbufferen 500 mM NaCl. pH til alle bufferene var 7,2. Smeltetemperaturen til hybridene ble bestemt på en Gilford responsapparatur. Følgende eks-tinsjonskoeffisienter ble anvendt A: 15,4 ml/pmol-cm, T: 8,8, G: 11,7 og C: 7,3 for både normal oligonukleotider og PNA. Smeltekurvene ble registrert i trinn på 0,5 C/min. Tm ble bestemt fra det maksimale av 1. derivatet til plotet til A260 1 forhold til temperaturen.

Liste over oligodeoksyrobonukleotider:

Liste over PNA:

Hybridet dannet mellom RNA-A (poly rA) og PNA-T10-Lys-NH2 smelter med en slik høy tempteratur at det ikke kan bli målt (>90°C). Spesifikk hybridisering blir demonstrert ved det store fallet i A260 ved blanding med RNA-A, men ikke G,A og U. Eksperimentet blir utført ved blanding av 1 ml av en oppløsning av PNA og 1 ml av en oppløsning av RNA, hver med ^260 = 0,6 og deretter måling av absorbansen ved 260 nm. Deretter blir prøven oppvarmet til 90°C i 5 min., avkjølt til romtemperatur og oppbevart ved denne temperaturen i 30 min. og tilslutt lagret ved 5°C i 30 min.

Fra ovennevnte målinger kan følgende konklusjoner bli trukket. Det eksisterer basestabling p.g.a. at en smelte-kurve er observert. PNA-DNA hybridet er mere stabilt enn et normalt DNA-DNA hybrid og PNA-RNA er enda mer stabil. Feilparinger forårsaker signifikante fall i Tm-verdien enten om den feilparede basen er i DNA eller PNA-tråden. Tm-verdien er bare delvis avhengig av ionestyrken i motsetning til normale oligonukleotider.

Eksempel 56.

Binding av Acr1-(Taeg )10"Lys_NH2 t:il dA10 (firgur lia).

AcrTaeg )-LQ-Lys (100 ng) ble inkubert i 15 min. ved romtemperatur med 50 eps 5'-[<32>P]-endemerket oligonukleotid [d(GATCCA10G)] i 20 pl TE buffer (10 nM Tris-HCl, 1 nM EDTA, pH 7,4). Prøven ble avkjølt på is (15 min.) og analysert ved gelelektroforese i polyakrylamid (PAGE). Til 10 pl prøven ble det tilsatt 2 pl 50$ glyserol, 5 pl TBE (TBE = 90 nM Tris-borat, 1 mM EDTA, pH 8,3) og prøven ble analysert ved PAGE (15$ akrylamid, 0,5 $ bisakrylamid) i TBE buffer vd 4°C. En 10 pl del av prøven ble lyofilisert og på ny oppløst i 10 pl 80$ formamid, 1 TBE, oppvarmet til 90°C (5 min.) og analysert ved urea/PAGE (15$ akrylamid, 0,5 $ bisakrylamid, 7 M urea) in TBE. [<32>P]-inneholdende DNA bånd ble visualisert ved autoradiografi ved anvendelse av intensiverende sekter og Agfa Curix EPA røntenfilmer eksponert ved -80°C i 2 t.

01igonukleotidene ble syntetisert på en Biosearch 7500 DNA syntesemaskin, merket med -y[<32>P]-ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol) og polynukleotidkinase og renset ved PAGE ved anvendelse av standardteknikker (Maniatis et al. (1986): A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories).

I figur lia og figur aab er 5'-<32>P-merkede oligonukleotider 1 5'-GATCCA^qG. Dette ble inkubert i fravær (kolonne 1 og 4) eller nærvær av Acr-T^Q-Lys-NHg (i kolonnene 2 og 5, 25 pmol, kolonne 3 og 6, 75 pmol) og også i fravær (kolonne 1 til 3) eller i nærvær (kolonne 4 til 6) av "oligo-2" som var 5'-GATCCT10G. 5'-<32>P-merket oligo 2 ble inkubert i fravær (kolonne 7) eller nærvær av samme PNA (kolonne 8, 25 pmol, kolonne 9, 75 pmol) og analysert ved PAGE som beskrevet i detalj ovenfor.

Resultatene i figur lia viser retardasjon av ssDNA når det blir hybridisert av PNA (kolonne 1 til 3) og evnen som PNA har til å konkurrere med et DNA ol igonukleot id for merket komplementært oligonukleotid (kolonne 4 til 6). Intensiteten til båndet som kan tilskrives dsDNA vokser hurtigere når PNA konsentrasjonen øker og blir erstattet med et bånd som representerer det saktere bevegende PNA-DNA hybridet. Kolonne 7 til 9 viser at PNA ikke har noen virkning på T^q oligo DNA som det er ikke-komplementært til.

I figur 11b som ble kjørt under DNA denaturerende betingelser forblir PNA-DNA dupleksene udenaturert.

Eksempel 57.

Dannelsen av trådforflyttningskomplekset.

En dA-LQ-dTio målssekvens innbefattet i en plasmid DNA sekvens ble konstruert ved kloning av to oligonukleotider (d(GATC-CA10G) + d(GATCCT^qG)) inn i BamHI restriksjonsenzymsetet til pUC19 ved anvendelse av Eschericia coli JM101 stammen ved hjelp av standardteknikker (Maniatis et al., 1986). Det ønskede plasmidet (betegnet pTIO) ble isolert fra en av de resulterende klonene og renset ved alkalisk ekstraksjonspro-sedyre og CsCl sentrifugering (Maniatis et al., 1986). Et 3•_[<32p>]-ende-merket DNA fragment på 248 bp inneholdende dA10/dTio målsekvensen ble oppnådd ved spaltning av pTIO DNA med restriksjonsenzymene EcoRI og PvuII, merking av spaltet DNA med a[<32>P]-dATP (4000 Ci/mmol, Amersham) ved anvendelse av Klenow fragmentet til E. coli DNA polymerase (Boehringer Mannheim), og rensing av 248 bp DNA fragmentet ved PAGE (5$ akrylamid, 0,06 % bisakrylamid, TBE buffer). Dette DNA fragmentet ble oppnådd med [<32>P]-ende-merking ved 5'-enden ved behandling av EcoRI-spaltet pTIO plasmid med bakteriell alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim), rensing av plasmid DNA'et ved gelelektroforese i lavtsmeltende agarose og merking med 7[<32>P] ATP og polynukleotidkinase. Etter behandling med PvuII ble 248 bp DNA fragmentet renset som ovenfor.

Komplekset mellom Acr<1->(Taeg)1Q-Lys-NH2 og 248 bp DNA fragmentet ble dannet ved inkubering av 50 ng Acr<1->(Taeg)^Q-Lys-NHg med 500 eps <32->P-merket 249 bp fragment og 0,5 jig kalvetymus DNA i 100 pl 25 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0,1 mM CaClg, pH 7,4 i 60 min. ved 37°C som beskrevet nedenfor.

Eksempel 58.

Probing av trådforflyttningskomplekser med:

(a) Stafylokokkusnuklease (figur 12b kolonne 8 til 10).

Trådforflyttningskomplekset ble dannet som beskrevet ovenfor. Komplekset ble behandlet med Stafylokokkusnuklease (Boehringer Mannheim) med 750 U/ml i 5 min. ved 20°C og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av EDTA til 25 mM. DNA ble presipitert med 2 vol etanol, 2$ kaliumasetat på ny løst opp i 80$ formamid, TBE, oppvarmet til 90°C (5 min.) og analysert ved PAGE med høy resolusjon (10$ akrylamid, 0,3 $ bisakrylamid, 7 M urea) og autoradiografi. Kolonnen 8 inneholder ikke PNA, kolonne 9 40 pmol og kolonne 10 120 pmol. Når PNA blir inkludert fremkommer avtrykket som indikerer økende mottakelighet for spaltning ved Staflokokkusnuklease og dermed økende forflyttning av ssDNA fra dsDNA. (b) Affinitetsfotospaltning (figur 12a + 12b, kolonne 1 til 3 i hver tilfelle).

Komplekset ble dannet i TE buffer. En prøve innbefattet i et Eppendorf rør ble bestålt fra ovenfor ved 300 nm (Philips TL 20 W/12 fluoresent lysrør, 24Jm_<2>s_<1>) i 30 min. DNA ble presipitert som ovenfor, tatt opp i 1 M piperidin og oppvarmet til 90°C i 20 min. Etter lyofilisering ble DNA analysert ved PAGE som ovenfor. I hvert tilfelle inneholder kolonne 1 påny ikke noe PNA og kolonnene 2 og 3 inneholder 40 pmol og 120 pmol PNA. DNA tråden bundet til PNA (A10 tråden) spalter ved beliggenheten til akredinesteren (kolonnene 1 til 3 i figur 12a) som danner et nytt bånd (til), mens tråden som blir forflyttet av PNA (T10 tråden) spalter tilfeldig og produserer et avtrykk. (c) Kaliumpermanganat (figur 12b, kolonnene 4 til 6).

Komplekset ble dannet i 100 pl TE og 5 pl 20 mM KMn04 ble tilsatt. Etter 15 s ved 20°C ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 50 pl 1,5 M natr iumasetat, pH 7,0, 1 M 2-merkaptoetanol. DNA ble presipitert, behandlet med piperidin og analysert som ovenfor. De samme PNA konsentrasjonene blir anvendt i kolonnene 4 til 6 som i kolonnene 1 til 3. Man kan igjen se fremkomst av et avtrykk som viser spaltning av forflyttet ssDNA ved permanganat.

(d) Fotoavtrykk (figur 12a, kolonnene 5 til 6).

Komplekset ble dannet i 100 pl TE og diaso-koblet akridin (0,1 pg/ul ) (DHA, Nielsen et al. (1988) Nucl. Acids res. 16, 3877-88) ble tilsatt. Prøven ble bestålt ved 365 nm (Philips TL 20 W/09N, 22 Jm~<2>s-<1>) i 30 min. og behandlet som beksrevet for "affinitetsfotospaltning". I nærvær av PNA, (kolonne 6) blir DNA beskyttet og båndene som tilsvarer spaltning i den beskyttede regionen blir borte.

(e) S-^-nuklease (figur 12c, kolonnene 1 til 3).

Komplekset ble dannet i 50 mM natriumasetat, 200 mM NaCl, 0,5 % glyserol, 1 mM ZnCl2, pH 4,5 og behandlet med nuklease S^

(Boehringer Mannheim) ved 0,5 U/ml i 5 min. ved 20°C. Reaksjonen hie stoppet og ytterligere behandlet som beskrevet under "Stafylokokkusnuklease". Mengden av PNA som ble anvendt var null (kolonnene 1 til 3) eller 120 pmol (kolonnene 4 til 6) kolonne 7 viser størrelsesstandarder. Igjen sees spaltning av T^q DNA tråden forflyttet av PNA.

Eksempel 59.

Hybridiseringssensitiviteten ved (1) orientering (2) pH og (3) sekvensfeilparing.

PNA- oligomeren H-T4C2TCTC-LysNH2 ble dannet ifølge synteseprotokoll 6, renset ved reversfase HPLC og identifisert ved FAB-massespektrometri, funnet (beregnet) 2746,8 (2447,15). Hybridiseringseksperimentene med denne sekvensen bestemmer orienteringen p.g.a. at den er helt asymetrisk. Slike eksperimenter bestemmer også pH-avhengigheten til Tm og stoikiometrien til de dannete kompleksene.

Hybridiseringseksperimentene med PNA-oligomeren H-T4C2TCTC-LysNH2 ble utført som følger:

= støkiometri bestemt fra UV-blandingskurver = ikke bestemt

Disse resultatene viser at en riktig blandet sekvens ga opphav til veldefinerte smeltekurver. PNA-oligomerene kan binde i begge orienteringene (sammenlign rad 1 og 4), til tross for at det er preferanse for den N-terminale/5'-orienteringen. Innføring av en enkelt feilparing motsatt enten T eller C forårsaket en verdisering av tra med mer enn 16°C ved pH 7,2, ved pH 5,0 ble Tm-verdien redusert med mer enn 27°C. Dette viser at det er en meget høy grad av sekvensselektivitet.

Som angitt ovenfor er det en meget sterk pH-avhengighet for Tm-verdien og indikerer at Hoogsteen baseparingen er viktig for dannelsen av hybrider. Det er derfor ikke overraskend at støkiometrien ble funnet å være 2:1.

Mangel på symetri i sekvensen og den meget store senkningen av Tm hvor feilparinger er tilstede viser at Watson-Crick tråden og Hoogsteen tråden er parallelle når de er bundet komplementært DNA. Dette er tilfelle for begge orienteringene, dvs. 5'/N-terminal og 3'/N-terminal.

Eksempel 60.

Sekvensdiskriminering ved hybridisering.

Resultatene av hybridiseringseksperimentene med H-T5GT4-LysNHg til deoksyoligonukleotidene vist nedenfor var som følger:

Vist ved sammenligning av radene 1, 3 og 6 med radene 2, 4, 5 og 7 kan G på denne måten diskriminere mellom C/A og G/T i DNA-tråden, dvs. sekvensdiskriminering blir observert. Komplekset i rad 3 ble ytterligere bestemt å være 2 PNA:1 DNA kompleks ifølge UV-blandingskurvene.

Eksempel 61.

Sekvensspesifisitet ved hybridisering ved anvendelse av et modifisert skjelett.

Hybridiseringsdata for en PNA-oligomer med en enkelt enhet med et utvidet skjelett (p-alanin modifikasjon) er som følger:

Til tross for at smeltetemperaturene reduseres demonstrerer dataene at den basespesfikke gjenkjenningen blir beholdt.

Eksempel 62.

Iodineringsprosedyre - radioaktiv merking.

A 5 pg del av Tyr-PNA-T10-Lys-NH2 blir løst opp i 40 pl 100 mM Na-fosfat, pH 7,0 og 1 mCi Na<125>I og 2 pl kloramin-T (50 mM i CH3CN) blir tilsatt. Oppløsningen blir latt stå ved 20°C i 10 min. og deretter sendt gjennom en 0,5 + 5 cm sefadeks G10 kolonne. De første to fraksjonene (100 pl hver) inneholdende radioaktivitet blir samlet og renset ved HPLC: reversfase C-18 ved anvendelse av en 0-60$ CH3CN gradient i 0,1 $ CF3COOH i H20. <125>I-PNA eluerer rett etter PNA toppen. Oppløsningsmiddelet blir fjernet under redusert trykk.

Eksempel 63.

Binding av PNAs-T10/TgC/TgC2 til dobbelttrådede DNA målene A10/A9<G/A8G>2 (figur 20).

En blanding av 200 eps dobbelttrådede <32>P-merkede EcoRI-PvuII fragmenter (det store fragmentet er merket ved 3<*->enden av

EcoRI setet) til det indikerte plasmidet, 0,5 pg bærer kalvetymus DNA og 300 ng av det indikerte PNA i 100 pl buffer (200 mM NaCl, 50 mM Na-asetat, pH 4,5, 1 mM ZnS04) ble inkubert ved 37°C i 120 min. 50 enheter nuklease S^ ble tilsatt og inkubert ved 20°C i 5 min. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 3 pl 0,5 M EDTA og DNA ble presipitert ved tilsetning av 250 pl 2$ kaliumasetat i etanol. DNA ble analysert ved elektroforese i 10$ plyakrylamid sekvenseringsgeler og de radiomerkede DNA båndene ble visualisert ved autoradiografi. De fullstendige båndmønstrene som ble produsert viste produksjon ved trådforflyttning av enkelttrådet DNA som er angrepet av nukleasen for å danne en blanding av kortere oligonukleotider. Sammenligning av resultatene for tre PNA anvendt i hvert tilfelle viser selektiviteten for hvert mål som blir oppnådd.

Målplasmidet ble dannet ved kloning av de hensiktsmessige oligonukleotidene inn i pUC19. Mål A^q: oligonukleotidene GATCCA10 & GATCCT10G klonet inn i BamHI setet (plasmid betegnet pTIO). Mål A5GA4: oligonukleotidene TCGACT4CT5G & TCGACA5GA4G klonet inn i Sali setet (plasmid pT9C). Mål A2GA2GA4: oligonukleotidene GA2GA2GA4TGCA & GT4CT2CT2CTGCA inn i Pstl setet (plasmid pT8C2). Posisjonene til målene i gelen er angitt med streker til venstre. A/G er en A+G sekvensstige til mål P10.

Eksempel 64.

Inhibisjon av restriksjonsenzymspaltningen ved PNA (figur 23).

En 2 pg del av plasmid pTIO ble blandet med den indikerte mengden av PNA-T10 1 20 V1 TE buffer (10 mM Tris-HCl , 1 mM EDTA, pH 7,4) og inkubert ved 37°C i 120 min. 2 pl 10 x konsentrert buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM, MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT) og PvuII (2 enheter) og BamHI (2 enheter) ble tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i 60 min. DNA ble analysert ved gelelektroforese i 5$ polyakrylamid og DNA ble visualisert ved etidiumbromid farging.

I nærvær av en signifikant del PNA (0,2, 0,6) ble spalt-ningsmønsteret til enzymet Barn HI forandre og indikerte at enzymet ble inhibert ved tilstedeværelse av PNA sammen med spaltningssetet.

Eksempel 65.

Kinetikken til PNA-T10 - dsDNA tråd forflyttningskompleks-dannelsen (figur 21).

En blanding av 200 eps dobbelttrådet <32>P-merket EcoRI-PvuII fragmentet til pTIO (det større fragmentet merket ved 3'-enden av EcoRI setet), 0,5 pg bære kalvetymus DNA og 300 ng PNA-~T10-LysNH2 i 100 pl buffer (200 mM NaCl, 50 mM Na-asetat, pH 4,5, 1 mM ZnS04) ble inkubert ved 37°C. Ved de angitte tidspunktene ble 500 U S 1 nuklease tilsatt til hver av de 7 prøvene og inkubasjonen ble fortsatt i 5 min. ved 20°C. Et hvilket som helst enkelttrådet DNA produsert ved trådforflyttning blir spaltet av nukleasen. DNA blir deretter presipitert ved tilsetning av 250 pl 2$ kaliumasetat i etanol og analysert ved elektroforese i en 10$ polyakrylamid sekvenseringsgel. Mengden av trådforflyttningskomplekset ble beregnet i vilkårlige enheter ut ifra itensiteten til S^-spaltningen ved målsekvensen målt ved densitometrisk scanning av autoradiografer. Dannelsen av komplekset over tid kan sees.

Eksempel 66.

Stabiliteten til PNA-dsDNA kompleksene (figur 22).

En blanding av 200 eps <32>P-pT10 fragmentet (som i eksempel 65), 0,5 pg kalvetymus DNA og 300 ng av ønsket PNA (enten T10-L<y>sNH2, Tg-LysNH2 eller T6-LysNH2) ble inkubert i 100 pl 200 mM NaCl, 50 mM Na-asetat, pH 4,5, 1 mM ZnS04 i 60 min. ved 37°C. En 2 jig del av oligonukleotidet GATCCA10G ble tilsatt for å konkurrere med PNA for merket oligonukleotid og hver prøve ble varmet i 10 min. ved den indikerte temperaturen, avkjølt i is i 10 min. og varmet til 20°C. 50 U S 1 nuklease ble tilsatt og mengden av radioaktivitet frigjort som enkeltnukleotider ble målt.

Ventede Tm verdier for en T-^q DNA dupleks kunne være 20°C for T8 - 16°C og for Tfc - 12°C. De tilsvarende PNA/DNA verdiene er vist å være T10 > 70°C, Tg - 60°C og for T6 - 37°C.

Eksempel 67.

Imobilisering av PNA.

For preparering av PNA-Sefarose ble 10 mg syanogenbromid aktivert Sefarose (sigma) inkubert med 10 ug PNA i 100 pl 50 mM Na-fosfat, pH 7,5 i 60 min. ved 37°C. Sefarosen ble isolert ved sentrifugering og vasket tre ganger med 250 jil 50 mM Na-fosfat, pH 7,5.

Eksempel 68.

Binding av 5 '-32P-endemerket oligonukleotid til PNA-sefarose.

1 mg PNA-Sefarose (eksempel 67) i 100 jil TE ble inkubert med 50 eps (ca. 100 ng) <32>P-merket oligonukleotid i 16 t. ved 20°C. Sefarosen ble isolert ved sentrifugering og vasket to ganger med 500 jjI TE. Bundet oligonukleotid ble bestemt ved væskesintillasjonshelling ved anvendelse av "Cerenkov" metoden. Resultatene er vist i tabellen nedenfor for tre forskjellige PNA-sefaroser og fire oligo-DNA. Spesifisiteten av oppfangingen med immobilisert PNA fremgår klart, idet det bare tolereres en basepar feilparing.

I tabellen A10 er 5'-GATCCAAAAAAAAAAG,A9G er 5'-TCGACAAAAA-GAAAAG, A8G2 er 5' -GAAGAAGAAACTGAC og blanding er 5'-GATCACGCTATACGCGT. PNA er: T10: H-T10LysNH2, T9C: H-T5CT4-LysNH2, T8V2: H-T2CT2CT4-LysNH2, ingen:etanolamin.

Eksempel 69 (figur 25a, b og c).

Temperaturavhengigheten av stabiliteten til <32>P-oligonukleotid-bindingen til PNA-sefarose.

01igonukleotidene ble bundet til PNA-sefarose som beskrevet i eksemplene 67 og 69. I hvert tilfelle ble <32>P-oligonukleotid-PNA-sefarose deretter vasket ved økende temperatur. Sefarosen ble Isolert ved sentrifugering, radioaktiviteten ble bestemt ved "Cerenkov" telling og sefarosen ble på ny tatt opp i 500 pl TE, inkubert ved den neste ønskede temperaturen, sentrifugert osv. Figuren viser resultatene normalisert til opprinnelig binding. Oligonukleotidet og PNA-sefarosen var som beskrevet i tabellen i eksempel 68. Skiftene mellom kurvene viser den reduserte stabiliteten til oligonukleotidbindingen når en feilparing er tilstede.

Eksempel 70.

Inhibisjon av transkripsjonen ved PNA (figur 26).

En blanding av 100 ng plasmid DNA (spaltet med restrik-sjonsenzym PvuII (se nedenfor) og 100 ng PNA i 15 pl lOmM tTris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 ble inkubert ved 37°C i 60 min. Deretter ble 4 pl 5 x konsentrert buffer (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 40 mM MgCl2, 10 mM spermidin, 125 mM NaCl) blandet med 1 pl NTP-miks. (10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP, 1 mM UTP, 0,1 pCl/pl<32>P-UTP, 5 mM DTT, 2 pg/ml tRNA, 1 pg/ml heparin) og 3 enheter RNA polymerase. Inkubasjonen ble fortsatt i 10 min. ved 37°C. RNA ble deretter presipitert ved tilsetning av 60 pl 2$ kaliumasetat i 96$ etanol ved -20°C og analysert ved elektroforese i 8$ polyakrylamid sekvenseringsgeler. RNA transskriptene ble visualisert ved autoradiografi. Det anvendte plasifiidet var: Kolonne 1 til 5, pAlOKS (A10 målet er posisjoner-t på den transskriberte tråden). Kolonnene 6 til 10: pTlOKS { A- ±q målene er posisjonert på den ikke-transskrIberte tråden). Plasmidet ble behandlet med følgende restriksjonsenzymer før eksperimentet: Kolonnene 1, 4, 6 og 9: Puyll. kolonnene 2, 5, 7 og 10: Xha I, kolonnene 3 og 8: BamHI. Prøvene i kolonnene 4, 5, 9 og 10 inneholdt PNA, mens de gjenværende ikke gjorde dette. Det fremgår fra gelen at når PNA T-^q er bundet til transskriberte tråden, blir plasmidet, transskripsjonen av RNA stoppet ved PNA bindingssetet. Dersom PNA er bundet til den ikke-transskriberte tråden av plasmidet blir transskripsjonen ikke stoppet.

Ekempel 71.

Affiniteten PNA - sefarose (figur 27).

1 mg PNA-T10 sefarose (se eksempel 67) i 100 pl TE ble inkubert med ca. 50 eps av følgende <32>P-5'-endemerkede oligonukleotider: i 16 t. ved 20°C. Sefarosen ble isolert ved sentrifugering og vasket 3 ganger med TE. Oligonukleotidene ble deretter vasket med 500 pl TE ved økende temperaturer, presipitert med 1 ml etanol, 2$ kaliumasetat og analysert ved elektroforese i 20$ polyakrylamid, 7 M ureagel kjørt i TBE buffer og detektert ved autoradiografi (ca. 70°C, 16 t., intensiverende sikt). Resultatene er vist i figur 26. Kolonnenene er som følger: Kolonne 1: Oligonukleotidene ble ikke bundet til sefadeks, Kolonne 2: Oligonukleotidene ble vasket ut ved 40°C, Kolonne 3: Oligonukleotidene ble vasket ut ved 60°C, Kolonne 4: Oligonukleotidene ble vasket ut ved 80°C.

Bare plasmid 3 er komplementær med PNA. Det fremgår at ved vasking ved opptil 80°C blir vesentlig bare det komplementære plasmidet beholdt på PNA-sefarosen. Dette eksempelet illustrerer ekstrahering av et oligonukleotid fra en blanding derav ved affinitetsoppfangihg ved anvendelse av PNA.

Eksempel 72.

Kvantitativ analyse av en DNA sekvens i et ds plasmid ved pNA-tråd erstatning. 3 pg plasmid DNA spaltet ved de respektive restriksjonsenzymene angitt nedenfor i 10 pl 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 ble inkubert med 5000 cpm (ca. 10 ng) 125I-PNA-T10-Tyr og mengden av kald PNA T-^øTyr indikert ved totale PNA mengder angitt nedenfor i 60 min. ved 37°C. DNA ble presipitert ved 25 pl etanol. 2% kaliumasetat og deretter analysert ved elektroforese i b% polyakrylamid i TBE buffer. Gelen ble farget med etidiumbromid og deretter utsatt for autoradiografi (-70°C, 16 t. intensiverende sikt). Resultatene fremkommer i figur 28. "A" er etidiumfarget gel og "b" er det tilsvarende autoradiogrammet. Anvendte plasmider var:

Kolonnene 1 til 3: pT^ø + Haelll,

Kolonnene 4 til 6: pT^ø x Hinf1,

Kolonnene 7 til 9: pT10 x PvuII•

Totalmengden av PNA-T^ø-Tyr i hver prøve var:

Kolonnene 1, 4 og 7: ca. 10 ng,

Kolonnene 2, 5 og 8: 25 ng,

Kolonnene 3, 6 og 9: 25 0 ng.

Etidiumbromidgelen (a) viser størrelsen på DNA fragmentene som er produsert (inkludert DNA-PNA hybrider). Autoradiogra-fen (b) viser hvilket bånd i gelen (a) som inneholder PNA. Tilstedeværelse av et trådforflyttningskompleks framkommer i kolonne 1 og det samme gjør virkningen på intensiteten til dette båndet når det gjelder øking av proposjonen av kald PNA i kolonnene 2 og 3. Lignende resultater fremkommer for hvert av de andre to plasmidene i kolonnene 4 til 6 og 7 til 9. Beliggenheten av PNA-DNA båndet kan i hvert tilfelle bli anvendt for å identifisere plasmidet og den baserte intensiteten kan bli anvendt for å kvantifisere mengden av til-stedeværende plasmid.

Claims

1. Nukleinsyreanalog for anvendelse i oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter, karakterisert ved at analogen er en peptidnukleinsyre (PNA) som omfatter et polyamidskjelett som bærer en mengde ligander respektivt i avstand beliggende langs skjelettet, nevnte ligander er hver uavhengig naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser eller nukleobasebindende grupper, hvor hver ligand er bundet direkte til, eller indirekte til, et nitrogenatom i nevnte skjelett, og nevnte ligand bærer nitrogenatomer som i hovedsak blir separert fra hverandre i nevnte skjelett ved fra 4 til 8 mellomliggende atomer, hvor nevnte analog blir inkorporert eller konjugert til et detekterbart merke.

2. Nukleinsyreanalog ifølge krav 1,karakterisert ved at 1igandbærende nitrogenatomer i nevnte skjelett hver er azanitrogenatomer.

3. Nukleinsyreanalog for anvendelse i oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter, karakterisert ved at analogen er en nukleinsyreanalog istand til å hybridisere til en nukleinsyre av komplementær sekvens for å danne et hybrid som er mer stabilt mot denaturering ved varme enn et hybrid mellom det konvensjonelle deoksyribonukleotid som korresponderer til nevnte analog og nevnte nukleinsyre, hvor nevnte analog er inkorporert eller blir konjugert til et detekterbart merke.

4 . Nukleinsyreanalog for anvendelse i oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter, karakterisert ved at analogen er en nukleinsyreanalog istand til å hybridisere til en dobbelttrådet nukleinsyre hvori én tråd har en sekvens komplementær til nevnte analog, for å erstatte den andre tråden fra nevnte ene tråd, hvor nevnte analog blir inkorporert eller konjugert til et detekterbart merke.

5 . Merket nukleinsyreanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyreanalog som har den generelle formel: hvori: n er minst 2, hver lA-L11 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, (C^-C^ )alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA-interkalatorer, nukleobasebindende grupper og reporterligander, hvorved minst én L^-Ln er en naturlig forekommende nukleobase, en ikke-naturlig forekommende nukleobase, en DNA-interkalator, eller en nukleobasebindende gruppe; hvor hver av A^-A<11> er en enkel binding, en metylengruppe eller en gruppe med formelen: hvor: X er 0, S, Se, NR<3>, CH2 eller C(CH3)2<;>Y er en enkel hlnding, 0, S eller NR<4>; hver av p og q er et heltall fra 1 til 5, summen p+q er ikke mer enn 10; hver av r og s er null eller et heltall fra 1 til 5, hvor summen r+s ikke er mer enn 10; hver R<1> og R<2>"er uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen, (0^-04)alkyl som kan være hydroksy- eller alkoksy-eller alkyltiosubstituert, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen; og hver R<3> og R<4> er uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen, ( C^- C^)alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltiosubstituert (C-L-C4 )alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino; hver av B<1->Bn er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor; hver av C<1->Cn er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR6R<7>CH2, hvor R<6> er hydrogen og R<7> er valgt fra gruppen bestående av sidekjedene bestående av naturlig forekommende alfa-aminosyrer, eller R^ og R<7> er uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-C6 )alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C1-C6 )alkoksy, (C1-C6)alkyltio, NR<3>R<4> og SR<5>, hvor R<3> og R<4 >er som definert ovenfor, og R<5> er hydrogen, (C^-C^)alkyl, hydroksy-, alkoksy-, eller alkyl tiosubstituert (C^-C^, )alkyl, eller R^ og R<7> sammen fullstendiggjør et alicyklisk eller heterocyklisk system; hver av D-^-Dn er CR<6>R<7>, CH2CR<6>R7 eller CHR<6>CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor; hver av G1- Gn~ 1 er -CINR<3->, -CSNR<3->, -S0NR<3-> eller -SOgNR<3->, i hver orientering, hvor R<3> er som definert ovenfor; Q er -C02H, -CONR'R'<*>, -S03H eller -S02NR'R'' eller et aktivert derivat av -C02H eller -SO3H; og I er -NHR »•«r• » » » eller -NR ' * ' C (0 )R' " ' , hvor Ri, R'', R"' og R'<*>'' blir uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, aminobeskyttende grupper, rapporterings-ligander, interkalatorer, chelatorer, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider, steroider, oligonukleotider og oppløselige og ikke-oppløselige polymerer, som inkorporerer eller konjugerte til et detekterbart merke.

6. Merket nukleinsyreanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyreanalog som har den generelle formel: hvori: hver A^-An er en enkel binding eller en gruppe med formel: n, hver av L<1> til Ln, X, Y, p, q, r og s er som definert i krav 5, hver R<1> og R<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C-l~C4 )alkyl som kan være hydroksy- eller alkoksysubstituert, hydroksy, alkoksy, amino og halogen; og hver R<3> og R<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C^- C^)alkyl, hydroksy- eller alkoksysubstituert (C-L-C4 )alkyl, hydroksy, alkoksy og amino; hver av B<1->Bn er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor; hver av C<1->^ er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R<7>CH2, hvor R<6> er hydrogen og R<7> er valgt fra gruppen bestående av sidekjedene fra naturlig forekommende alfa-aminosyrer, eller R<6> og R<7> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (CgC^alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, metoksy NR<3>R<4> og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor; og R<5> er hydrogen, (C^-C^,)alkyl, hydrokys- eller alkoksysubstituert (C^-C^)alkyl, eller R<6> og R<7> sammen fullstendiggjør et alicyklisk system; hver av D-^-D<11> er CH2CR<6>R<7> eller CHR<6>CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er definert som ovenfor; og hver av G<1->G<n> er som definert i krav 5, som inkorporerer eller konjugerer til et detekterbart merke.

7. Merket nukleinsyreanalog ifølge krav 6,karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyreanalog som har den generelle formel: hvori: hver L er uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, naturlig forekommende nukleobaser og ikke-naturlig forekommende nukleobaser; hver R<7>' er uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjedene av naturlig forekommende alfa-aminosyrer; n er et heltall fra 1 til 60, hver k og m er uavhengig null eller én, og hver 1 er uavhengig fra null til 5;R<n> er OH, NH2 eller -NHLysNH2; og R<1> er E eller COCH3, inkorporert eller konjugert til et detekterbart merke.

8. Merket nukleinsyreanalog ifølge krav 7, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyreanalog som har den genrelle formel: ♦ hvori: L,R<7>' og n er som definert i krav 7, inkorporert eller konjugert til et detekterbart merke.

9. Merket nukleinsyreanalog ifølge krav 8, karakterisert ved at: hver L er uavhengig valgt fra gruppen bestående av nukleobasene tymin, adenin, cytosin, guanin og uracil; hver R<7>' er hydrogen; og n er et heltall fra 1 til 30.

10 . Merket nukleinsyreanalog ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte merke er et radioisotopmerke, et enzymmerke, biotin, en fluorofor, et kjemiluminescensmerke, et antigen, et antistoff eller et spinnmerke.

11. Merket nukleinsyreanalog ifølge krav 1, 2 eller et hvilket som helst av kravene 5 til 10, karakterisert ved at nevnte ligander er tymin og/eller cytosin.

12. Anvendelse in vitro ved oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter av en nukleinsyreanalog som er en peptidnukleinsyre (PNA), som omfatter et polyamidskjelett som bærer en mengde ligander ved respektivt i avstand beliggende langs nevnte skjelett, hvor nevnte ligander hver er uavhengig naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser eller nukleobasebindende grupper, hvor hver nevnte ligand blir bundet direkte eller indirekte til et nitrogenatom i nevnte skjelett, og nevnte ligand som bærer nitrogenatomer hovedsakelig blir separert fra hverandre i nevnte skjelett ved fra 4 til 8 mellomliggende atomer.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvori de nevnte 1igandbærende nitrogenatomene i nevnte skjelett hver er azanitrogenatomer.

14 . In vitro-anvendelse ved oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter av en nuklein syreanalog som er en nukleinsyreanalog istand til å hybridisere til en nukleinsyre eller komplementær sekvens for å danne et hybrid som er mer stabilt mot denaturering ved varme enn et hybrid mellom den konvensjonelle deoksyribonukleotid korresponderende til nevnte analog og nevnte nukleinsyre.

15. In vitro-anvendelse ved oppfanging, gjenkjenning, deteksjon, isolering, identifisering eller kvantifisering av én eller flere kjemiske eller mikrobiologiske enheter av en nukleinsyreanalog som er en nukleinsyreanalog som er istand til å hybridisere til en dobbelttrådet nukleinsyre hvori én tråd har en sekvens komplementær til nevnte analog, for å erstatte den andre tråden fra den nevnte ene tråden.

16. Anvendelse av en nukleinsyreanalog ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 15, hvori nukleinsyreanalogen har den generelle formel: hvori: n er minst 2, hver av L-^-Ln blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, ( C±- C$)alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA-interkalatorer, nukleobasebindende grupper og reporterligander, hvor minst én av L^-Ln er en naturlig forekommende nukleobase, en ikke-naturlig forekommende nukleobase, en DNA-interkalator eller en nukleobase-bindende gruppe; hver av A^-A11 er en enkelt binding, en metylengruppe eller en gruppe med formel: hvori: X er 0, S, Se, NE<3>, CH2 eller C(CH3)2<; > Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>; hver av p og q er et heltall fra 1 til 5, summen av p+q er ikke mer enn 10; hver av r og s er null eller et heltall fra 1 til 5, summen av r+s er ikke mer enn 10; hver R<*> og E<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C1-C4)alkyl som kan være hydroksy- eller alkoksy-eller alkyltiosubstituert, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen; og hver E<3> og E<4> blir uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen, ( C±- C% )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltiosubstituert (C^-C4)alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino; hver av B<1->Bn er N eller E<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor: hver av C1-Cn er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R<7>CH2, hvor R<6> er hydrogen og R<7> blir valgt fra gruppen bestående av sidekjedene av naturlig forekommende alfa-aminosyrer, eller R<6> og R<7 >blir uavhengig selektert fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-Cfc)alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C^C^)alkoksy, ( C1- Cb )alkyltio, NE<3>R4 og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor, og R<5> er hydrogen, (C-^-C^ )alkyl , hydroksy-, alkoksy-, eller alkyltiosubstituert (C-^-C^ )alkyl, eller R<6> og R<7> sammen fullstendiggjør et alicyklisk eller heterocyklisk system; hver av D<1->Dn er CR<6>R<7>, CH2CR<6>R<7> eller CHR<6>CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor; hver av G1- Gn- 1 er -CINR<3->, -CSNR<3->, -SONR<3-> eller -S02<N>R<3->, i begge orientering, hvor R<3> er som definert ovenfor; Q er -C02H, -CONR'R", -S03H eller -S02NR'R" eller et aktivert derivat av -C02H eller -SO3H; og I er -NHR » » »r »•»• eller -NR'''C(0)R' " ' , hvor Ri, R'', R'" og R'''<*> uavhengig blir valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, aminobeskyttende grupper, rapporterende ligander, interkalatorer, chelatorer, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider, steroider, oligonukleotider og oppløselige og ikke-oppløselige polymerer.

17. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 15, ved at nukleinsyreanalogen har den generelle formel: hvori : hver av A^-A<11> er en enkel binding, eller en gruppe med formel: n, hver av L<1> til Ln, X, Y, p, q, r og s er som definert i krav 5, hver Ri og R<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C^-C^alkyl som kan være hydroksy- eller alkoksy-susbstituert, hydroksy, alkoksy, amino og halogen; og hver R<3> og R<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C^-C4)alkyl, hydroksy- eller alkoksysubstituert (C^-C4)alkyl, hydroksy, alkoksy og amino; hver av B<1->Bn er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor; hver av C<1->Cn er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R7CH2, hvor R<6> er hydrogen og R<7> er selektert fra gruppen bestående av sidekjedene fra naturlig forekommende alfa-aminosyrer, eller R<6> og R<7> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-C6 )alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, metoksy NR<3>R<4> og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor, og R<5> er hydrogen, (C1-C4 )alkyl, hydroksy- eller alkoksysubstituert (C1-C4)alkyl, eller R<6> og R<7> sammen fullstendiggjør et alicyklisk system; hver av D-^-D11 er CH2CR<6>R<7> eller CHR<6>CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor; og hver av Gl<->G<n>-<1> er som definert i krav 5.

18. Anvendelse av nukleinsyreanalog ifølge krav 16, ved at nukleinsyreanalogen har den generelle formelen: hvori : hver L blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, naturlig forekommende nukleobaser og ikke-naturlig forekommende nukleobaser; hver R<7>' blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjedene fra naturlig forekommende alfa-aminsyrer; n er et heltall fra 1 til 60, hver k og m er uavhengig null eller én; og hver 1 er uavhengig fra null til 5; Rh er OH, NH2 eller -NHLysNH2; ogR<1> er H eller C0CH3.

19. Anvendelse av en nukleinsyreanalog ifølge krav 18, ved at nukleinsyreanalogen har den generelle formel: og L,R<7>' og n er som definert i krav 7.

20. Anvendelse ifølge krav 19, ved at: hver L blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av nukleobasene tymin, adenin, cytosin, guanin og uracil; hver R<7>' er hydrogen; og n er et heltall fra 1 til 30.

21. Anvendelse av en nukleinsyreanalog ifølge krav 12 og 13 eller et hvilket som helst av kravene 16 til 20, ved at nevnte ligander er tymin og/eller cytosin.

22. Anvendelse av en nukleinsyreanalog ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 21, ved at nukleinsyreanalogen inkorporeres eller blir konjugert til et detekterbart merke.

23. Anvendelse av en nukleinsyreanalog ifølge krav 22, ved at nevnte merke er et radioisotopmerke, et enzymmerke, biotin, en fluorofor, et kjemiluminescensmerke, et antigen, et antistoff eller et spinnmerke.

24 . In vitro-fremgangsmåte for oppfanging av en nukleinsyre, karakterisert ved å bringe nevnte nukleinsyre i kontakt under hybridiseringsbetingelser med en nukleinsyreanalog som definert i hvilket som helst av kravene 12 til 23 immobilisert på et fast støttemedium, hvis nukleinsyreanalog har en sekvens av ligander egnet til å hybridisere til nevnte nukleinsyre.

25 . Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at nevnte oppfangede nukleinsyre detekteres, gjekjen-nes, kvantifiseres eller identifiseres ved behandling med et nukleinsyre-gjenkjenningsmiddel mens det er bundet til nevnte immobiliserte nukleinsyreanalog.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25,karakterisert ved at den oppfangede nukleinsyren har en første region hybridisert til nevnte immobiliserte nukleinsyreanalog og en andre region som ikke er så hybridisert og blir behandlet med en merket nukleinsyre eller merket nukleinsyreanalog som tilpasses til å hybridisere til minst en del av nevnte andre region og nevnte merke kan detekteres.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 24, for oppfangig av et mRNA, karakterisert ved at nevnte immobiliserte nukleinsyreanalog omfatter sekvensielle ligander hybridiser-bare til poly-A-haler fra nevnte mRNA til oppfanging av nevnte mRNA.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert ved at nevnte sekvensielle lingander er tymin.

29. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 24, 27 eller 28, karakterisert ved at nevnte nukleinsyre, straks den er fanget opp, frigis fra nevnte immobiliserte nukleinsyreanalog ved å utsette den immobiliserte nukleinsyreanalogen og oppfangede nukleinsyren for dehybridiseringsbetingelser.

30. Nukleinsyreanalog ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 23, karakterisert ved at den er immobilisert på et fast støttemateriale.

31. Immobilisert nukleinsyreanalog ifølge krav 30, karakterisert v,ed at den er imkorporert i en affinitet soppf angingskolonne.

32. In vitro-fremgangsmåte for å gjenkjenne, detektere eller kvantifisere en målnukleinsyre, karakterisert ved at den omfatter å hybridisere nevnte målnukleinsyre til en merket nukleinsyreanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11 for tilstrekkelig å komplementere sekvensen til derved å hybridisere under hybridiseringsbetingelser og detektere eller kvantifisere mere av nevnte nukleinsyreanalog som så blir hybridisert til nevnte målnukleinsyre.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32,karakterisert ved at nevnte målnukleinsyre blir immobilisert på et substrat forut for nevnte hybridisering.

34 . Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at nevnte målnukleinsyre blir immobilisert til nevnte substrat ved hybridiseringen av en første region derav for en oppfanging av nukleinsyre eller nukleinsyreanalog som har en sekvens tilstrekkelig komplementær til første region for å hybridisere derved og som i seg selv er immobilisert til nevnte substrat og hvori nevnte merkede nukleinsyreanalog hybridiserer til en andre region av nevnte målnukleinsyre.

35 . In vitro-fremgangsmåte for å erstatte én tråd fra nukleinsyredupleks, karakterisert ved at den omfatter å hybridisere til nevnte dupleks en nukleinsyreanalog ifølge krav 3, som har en affinitet for den andre tråden av nevnte dupleks tilstrekkelig til å være istand til å erstatte nevnte ene tråd derfra.

36. In vitro-fremgangsmåte for å detektere, identifisere eller kvantifisere en dobbelttrådet målnukleinsyre, karakterisert ved at den omfatter å hybridisere dertil en erstatningsnukleinsyreanalog ifølge krav 3, istand til å erstatte én tråd fra en dobbeltrådet målnukleinsyre hvori den andre tråden er av komplementær sekvens til nevnte erstattede nukleinsyreanalog, hvori nevnte erstattede nukleinsyreanalog er av tilstrekkelig komplementær sekvens til nenvte andre tråd av nevnte dobbelttrådet målnukleinsyre for å hybridisere dertil for å erstatte nevnte ene tråd av nevnte målnukleinsyre i enkelttrådet form, og detektere eller kvantifisere tilstedeværelse av nevnte ene erstattede tråd.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at den erstattede tråden blir brutt ned til fragmenter og tilstedeværelsen av nevnte fragmenter detekteres.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 37,karakterisert ved at nevnte erstattede tråd blir brutt ned ved angrep av en nuklease.

39. Anvendelse for in vitro-deteksjon eller isolering av en spesifikk nukleinsyre fra en oligonukleotidanalog som binder mer sterkt til dens komplementære sDNA eller RNA-tråder enn det korresponderende DNA eller RNA, respektivt.

40. Kit for anvendelse i en diagnostisk prosedyre, karakterisert ved at kittet omfatter minst én merket nukleinsyreanalog ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11, og minst ett deteksjonsreagens for å detektere nevnte merkede nukleinsyreanalog.

41. Kit ifølge krav 40, karakterisert ved ytterligere å inkludere en nukleinsyreanalog som definert i et hvilket som helst av kravene 12 til 20 immobilisert på et fast støttemateriale.

42. Kit, karakterisert ved at det omfatter en immobilisert nukleinsyreanalog ifølge krav 30, i kombinasjon med minst ett nukleinsyregjenkjennende middel, for å detektere tilstedeværelsen av nukleinsyre oppfanget ved anvendelse av nevnte nukleinsyreanalog.

43. Kit ifølge krav 42, karakterisert ved at nevnte nukleinsyregjenkjenningsmiddel er en merket nukleinsyre .