CN100547080C - 杂交方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可以进行有效的杂交反应的杂交方法、使用该杂交方法的高感度的靶基因的检测方法、以及显著提高靶基因的检测感度的信号扩增方法。该杂交方法是使用反应溶液中的寡核苷酸的杂交方法，在反应溶液中部分地形成反应温度区域，在该反应温度区域中进行杂交反应。

Description

杂交方法
技术领域
本发明涉及在使用了寡核苷酸的杂交反应中使反应温度区域在反应溶液中部分形成、然后在该反应温度区域中进行杂交反应而有效形成杂交物的杂交方法，使用了该杂交方法的基因的检测方法，以及信号扩增方法；所述信号扩增方法使用该杂交方法，可以提高与DNA芯片或者DNA微阵列(参照非专利文献1等。在本说明书中总称DNA芯片和DNA微阵列为DNA微阵列。)、微型板、以及磁性体粒子等用于检测基因的反应机械材料结合的靶基因的检测感度。
背景技术
作为用于检测基因的反应机械材料(以下，称为反应平台。)，微型板、DNA微阵列、磁性体粒子等价格低，容易均匀地控制反应温度，且不需要特殊的设备，市场上有大量的使用了显色系酶或发光系酶的基因诊断试剂盒出售。
目前，这些反应平台的温度控制在通常称为恒温槽的设备中进行。特别是在基因的检测中，在目的基因、或者通过PCR法等放大的基因上标识酶等，作为一般的生化学反应，使用基于恒温槽的均一反应温度。
另一方面，本发明人等提出了不使用酶的新型等温核酸放大法(探针自聚合物的形成方法)(专利文献1～4)。图1～图3是专利文献1记载的方法的概略说明图。例如，如图1所示，专利文献1记载的方法是使用由3处区域构成的1对寡核苷酸探针18(HoneyComb Probe、以下称为HCP。)的方法，第1HCP(X区域，Y区域以及Z区域)和第2HCP(Z’区域，Y’区域以及X’区域)各自的3处区域具有相互互补的碱基序列，在使两者发生反应的情况下，对按照只和区域的1处杂交的方式对各区域的碱基序列作出努力(图2)。通过该努力，在使多个1对HCP发生反应的情况下，如图9所示，依赖于反应温度相互杂交，可以形成探针的自聚合物20(图9的箭头)(图3)。在本说明书中，通过这些寡核苷酸探针的自聚合反应(Probe alternation link self-assembly reaction)的聚合物的形成法被称为PALSAR法。
另外，本发明人等发现，通过利用PALSAR法可以提高靶基因的检测感度(专利文献5)。图4表示在利用了PALSAR法的微型板中的信号扩增方法的一个例子。如图4(a)所示，在微型板10等反应机械材料上结合靶基因12的捕获探针14(capture probe)，接着如图4(b)所示，捕获靶基因12之后，如图4(c)所示，在HCP和靶基因中加入具有互补区域的寡核苷酸DNA16(专利文献5的接合探针。在本发明中，将具有与检测的靶基因互补的序列、以及与形成自聚合物的核酸(探针)互补的序列两者的探针称为辅助探针。)，进而如图4(e)所示，加入多对的HCP18，通过自聚合反应形成自聚合物20，而可以使信号扩增。
专利文献1：专利第3267576号公报
专利文献2：专利第3310662号公报
专利文献3：国际公开第02/31192号公报
专利文献4：特开2002-355081号公报
专利文献5：国际公开第03/029441号公报
专利文献6：国际公开第92/20702号公报
非专利文献1：Marshall，A.，Hodgson，J.DNA chips：an array ofpossibilities.Nat Biotechnol.16，27-31，1998.
非专利文献2：Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54，3607-3630.，
非专利文献3：Koshkin AA et al.J.Am.Chem.Soc.1998.120，13252-13253.，
非专利文献4：Wahlestedt C et al.PNAS.2000.97，5633-5638.
非专利文献5：H.C.Birnboim，J.Doly，Nucleic Acids Res.，7，1513(1979)
但是，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，通过均一的反应温度的PALSAR法是在反应溶液中均一地形成自聚合物，所以当通过使用了均一反应温度的信号扩增来检测基因时，与在固相结合的靶基因上HCP的自聚合物形成反应相比，靶基因上以外的反应溶液中的HCP的自聚合物的形成反应更优先。
图5是表示通过使用了均一反应温度的PALSAR法进行信号扩增的一个例子的概略说明图，(a)表示通过均一反应温度形成自聚合物；(b)表示在进行自聚合物的形成反应之后进行清洗，该清洗后的在靶基因上结合的自聚合物。如图5可知，尽管通过在靶基因上形成的自聚合物可以获得足够的信号扩增効果，但在靶基因上以外的反应溶液中形成的自聚合物通过随后的清洗被除去，所以与实际的自聚合物的总形成量相比，信号扩增减少。
发明内容
本发明的目的在于，提供可以进行有效的杂交反应的杂交方法、使用了该杂交方法的高感度的靶基因检测方法、以及显著提高靶基因的检测感度的信号扩增方法。
本发明人等为了解决上述问题，以提高在靶基因上的HCP的自聚合物形成效率为目的，进行潜心研究，结果发现，通过在反应溶液中部分设定反应温度区域，可以显著提高在靶基因上的HCP的自聚合物形成效率，另外，不仅是HCP的自聚合物反应，即便是在一般的杂交反应中，通过在反应溶液中部分设定反应温度区域，可以显著提高在靶基因上的杂交物形成效率，从而完成了本发明。
即，本发明的杂交方法是使用反应溶液中的寡核苷酸的杂交方法，其特征在于，在反应溶液中部分形成反应温度区域，在该反应温度区域中进行杂交反应。
在本发明中，作为上述杂交反应，没有特别限制，使用具有可以相互杂交的互补碱基序列区域的多种寡核苷酸探针使其杂交，由此，更适合包括寡核苷酸发生自聚合而形成双链的自聚合物的自聚合反应。
作为上述的多种寡核苷酸探针的第1例，可以举出由如下所述的探针构成的一对寡核苷酸探针，所述的探针是从5’端侧按顺序至少设置核酸区域X、核酸区域Y以及核酸区域Z且具有下述化学式(1)的结构的由3处以上的核酸区域形成的第1探针、和从5’端侧按顺序至少设置核酸区域X’、核酸区域Y’以及核酸区域Z’且具有下述化学式(2)的结构的由3处以上的核酸区域形成的第2探针(专利文献1以及2)。
[化1]
Figure C20058001169300121
[化2]
Figure C20058001169300122
(在上述化学式(1)以及(2)中，X和X’、Y和Y’、Z和Z’分别是可以杂交的互补核酸区域。)
图1～图3是表示使用一对寡核苷酸探针(一对HCP)的自聚合反应的例子的概略说明图，所述的一对寡核苷酸探针是由3处核酸区域所形成的第1探针(第1HCP)和第2探针(第2HCP)构成。如图1～图3所示，使用多对具有上述化学式(1)以及(2)的结构的一对寡核苷酸探针18(图1)、以交替交叉的方式使其杂交(图2)，由此寡核苷酸发生自聚合，形成双链的自聚合物(聚合物)20(图3)。
作为上述的多种寡核苷酸探针的第2例，可以举出具有二聚体形成用探针含有系和交联探针含有系且该交联探针的碱基序列是可以对由该二聚体形成用探针所形成的二聚体进行交联的碱基序列的多个寡核苷酸探针，其中，所述的二聚体形成用探针含有系是从含有多对二聚体形成用探针的第1系至第(2n-1)(n≥1)系顺序形成n个，其中的二聚体形成用探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域、中央区域、以及5’侧区域这3个区域，使各寡核苷酸的中央区域成为相互互补的碱基序列，使3’侧区域以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列，所述的交联探针含有系是从分别含有多对交联探针的第2系至第2n系顺序形成n个，其中的交联探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域以及5’侧区域这2个区域，使各寡核苷酸的3’侧区域以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列(专利文献4)。
可以举出如下所述的自聚合反应，即通过使该寡核苷酸探针进行杂交，寡核苷酸发生自聚合，从而形成自聚合物。上述探针的杂交优选在使二聚体形成用探针进行杂交、形成各系的二聚体(二聚体探针)之后，使该二聚体和交联探针进行杂交，形成自聚合物。
在上述的多种寡核苷酸探针的第2例中，在是n＝1的情况下，第1系的二聚体形成用探针和第2系的交联探针的互补碱基序列的组合存在两种。
作为n＝1时的1例，就可以使用的上述探针的碱基序列而言，其
第1系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
第2系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第2系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
作为n＝1时的其他例，就可以使用的上述探针的碱基序列而言，其
第1系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第2系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第2系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
在上述的多种寡核苷酸探针的第2例中，在n≥2的情况下，第1、第3、…、第(2n-1)系的二聚体形成用探针和第2、第4、…、第2n系的交联探针的互补碱基序列的组合存在两种。作为n≥2时的1例，就可以使用的上述探针的碱基序列而言，其
第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
作为n≥2时的其它例子，就可以使用的上述探针的碱基序列而言，其
第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
具体说明使用了上述的多种寡核苷酸探针的第2例的自聚合反应。例如，在n＝1的情况下，利用使用一对二聚体形成用探针而形成的具有下述化学式(3)的结构的二聚体探针、和具有下述化学式(4)的结构的一对交联探针或者具有下述化学式(5)的结构的一对交联探针，使这些探针进行杂交，由此形成具有下述化学式(6)的结构的自聚合物。
[化3]
Figure C20058001169300151
[化4]
Figure C20058001169300152
[化5]
(在式(3)～式(5)中，A和A’、B和B’、C和C’、D和D’以及F和F’分别是可以杂交的互补核酸区域。)
[化6]
Figure C20058001169300161
作为上述的多种寡核苷酸探针的第3例，可以举出如下所述的多对二聚体形成用探针，其中，所述的二聚体形成用探针是，自第1系至第k(k≥2)系顺序形成多个含有一对二聚体形成用探针的系，且具有分别使(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(b)第(k-1)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第k系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(d)最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第1的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
成为相互互补的碱基序列的结构，另外，自第1系至第k系形成该多对二聚体形成用探针；其中的一对二聚体形成用探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域、中央区域、以及5’侧区域这3个区域，使各寡核苷酸的中央区域成为相互互补的碱基序列，使3’侧区域、以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列(专利文献3)。
作为上述的多种寡核苷酸探针的第4例，可以举出如下所述的多对二聚体形成用探针，其中，所述的二聚体形成用探针是，自第1系至第k(k≥2)系顺序形成多个含有一对二聚体形成用探针的系，且具有分别使
(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(b)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第k系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(d)最后的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第1的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
成为相互互补的碱基序列的结构，另外，自第1系至第k系形成该多对二聚体形成用探针；其中的一对二聚体形成用探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域、中央区域、以及5’侧区域这3个区域，使各寡核苷酸的中央区域成为相互互补的碱基序列，使3’侧区域、以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列(专利文献3)。
在上述的多种寡核苷酸探针的第3以及第4例中，可以举出：使自第1系至第k系的多对二聚体形成用探针进行杂交，由此使寡核苷酸发生自聚合而形成自聚合物的自聚合反应。二聚体形成用探针的杂交优选，分别在各系使二聚体形成用探针进行杂交而分别形成二聚体(二聚体探针)，然后使各系的二聚体探针进行杂交，形成自聚合物。
具体说明使用了上述的多种寡核苷酸探针的第3或者第4例的自聚合反应。例如、在k＝2的情况下，利用使用一对二聚体形成用探针形成的具有下述化学式(7)的结构的二聚体探针、和使用一对二聚体形成用探针形成的具有下述化学式(8)的结构的二聚体探针或者使用一对二聚体形成用探针形成的具有下述化学式(9)的结构的二聚体探针，使这些探针进行杂交，由此形成具有下述化学式(10)的结构的自聚合物。
[化7]
Figure C20058001169300171
[化8]
Figure C20058001169300181
[化9]
Figure C20058001169300182
(在式(7)～式(9)中，A和A’、B和B’、C和C’、D和D’以及F和F’分别是可以杂交的互补核酸区域。)
[化10]
Figure C20058001169300183
本发明的信号扩增方法，其特征在于，使用具有可以相互杂交的互补碱基序列区域的多种寡核苷酸探针，使其进行杂交，由此寡核苷酸发生自聚合，形成双链的自聚合物，利用如上所述的自聚合反应，可以提高用于检测基因的反应机械材料中靶基因的检测感度，其中，该自聚合反应是使用上述本发明的杂交方法进行的。
为了连接上述靶基因和上述自聚合物，优选使用具有与在靶基因的碱基序列和自聚合物的形成中使用的至少1个寡核苷酸探针的碱基序列分别互补的区域的辅助探针。另外，还优选以包括与靶基因互补的序列的方式构成在上述自聚合物的形成中使用的寡核苷酸探针的至少1个。
本发明的信号扩增方法通过检测所形成的自聚合物，可以进行靶基因的高感度检测。作为检测自聚合物的方法，没有特别限制，例如，优选预先用标记物质标记在上述自聚合反应中使用的寡核苷酸探针，并检测标记物质，由此检测自聚合物。对上述标记物质没有特别限制，可以广泛使用公知的标记物质。例如、可以举出放射性同位素、荧光物质、发光物质、显色物质、显色系酶或者发光系酶等。
另外，相对于通过与上述靶基因结合的寡核苷酸的自聚合反应而形成自聚合物，使标记探针进行杂交，可以检测自聚合物的存在。作为标记探针，可以使用用显色系酶、发光系酶、或者放射性同位素等标记的探针。
进而，相对于上述自聚合物，加入具有与核酸结合的性质的荧光物质，通过该荧光物质的光化学变化，可以检测上述自聚合物的存在。作为荧光物质，优选的荧光物质具有***到双链碱基对中的性质。
本发明的靶基因的检测方法的第1的实施方式，其特征在于，使用上述本发明的信号扩增方法检测靶基因。
本发明的靶基因的检测方法的第2的实施方式，其特征在于，利用反应溶液中寡核苷酸的杂交反应，检测基因，其中，该杂交反应包括使用上述本发明的杂交方法进行杂交反应。
优选以在上述靶基因的一部分具有互补序列的方式，构成在上述杂交反应中使用的核苷酸的至少一个。
在本发明中，对用于检测上述基因的反应机械材料没有特别限制，可以用于为了基因检测的各种反应机械材料，尤其适合用于微型板、DNA微阵列、以及磁性体粒子等。
在本发明中，作为上述靶基因，可以使用单链的DNA和/或RNA、以及双链的DNA和/或RNA。另外，作为上述靶基因，还可以使用含有SNPs(单核苷酸多态)的基因。
在本发明中，优选预先用标记物质标记在上述杂交反应中使用的寡核苷酸，并检测标记物质，由此检测靶基因。对上述标记物质没有特别限制，可以广泛使用公知的标记物质。例如，可以举出放射性同位素、荧光物质、发光物质、显色物质、显色系酶或者发光系酶等。
上述寡核苷酸通常由DNA或者RNA构成，还可以是核酸类似物。作为核酸类似物，例如，可以举出肽核酸(PNA、专利文献6)或LockedNucleic Acid(LNA、非专利文献2～4)。另外，一对寡核苷酸探针通常由相同种类的核酸构成，例如可以使DNA探针和RNA探针成为一对。即，探针的核酸的种类可以从DNA、RNA或核酸类似物(例如PNA或LNA等)中进行选择。另外，一个探针内的核酸组成没有必要由一种、例如只由DNA构成，根据需要，例如还可以使用由DNA和RNA构成的寡核苷酸探针(嵌合体探针)，这包括在本发明制中。
就上述寡核苷酸探针的各互补碱基序列区域的长度而言，以碱基数量计，至少为5个碱基，优选10～100个碱基，进一步优选15～30个碱基。
这些探针可以采用公知的方法合成。例如在是DNA探针的情况下，可以使用Applied Biosystem公司的DNA合成装置394型，利用ホスホァミダィド豪斯豪阿密达以道(ホスホァミダィド)法进行合成。另外，作为其他方法，有磷酸三酯法、H-磷酸酯法、硫代磷酸酯法等，还可以通过任何方法合成。
对在本发明中使用的寡核苷酸探针的个数没有特别限制，但在102～1015个的范围内使用。对反应缓冲液的组成、浓度没有特别限制。可以适当使用在核酸放大中常用的通常的缓冲液。pH也适合在常用的范围内，优选使用pH7.0～9.0的范围的缓冲液。在部分的反应温度区域应用的反应温度是40～80℃，优选55～65℃。
本发明中的靶基因(DNA或者RNA)测定用试样，可以应用有可能含有该核酸的所有试样。靶基因是可以通过试样适当制备或离析的基因，没有特别限制。例如，可以举出血液、血清、尿、粪便、脑脊液、组织液、细胞培养物等源自生物体的试样，有可能含有或者感染病毒、细菌、真菌等的试样等。另外，还可以使用通过公知的方法放大试样中的靶基因而得到的DNA或者RNA等核酸。
通过本发明，可以通过简便的方法提高靶基因的检测感度。另外，通过本发明可以提高杂交反应中的杂交物形成效率。进而通过本发明，可以放大在检测中使用的自聚合物的形成，提高信号扩增。
附图说明
图1是表示一对HCP的概略说明图。
图2是表示一对HCP的结合形式的概略说明图。
图3是表示由多对HCP形成的自聚合物的概略说明图。
图4是表示利用了PALSAR法的微型板中信号扩增法的一个例子的概略说明图。
图5是表示通过使用了均一的反应温度的PALSAR法进行信号扩增的方法的一个例子的概略说明图。
图6是表示使用了微型板的使用部分的反应温度区域的靶基因的检测方法的一个例子的概略说明图。
图7是表示通过本发明的使用了部分的反应温度区域的信号扩增来检测靶基因的方法的一个例子的概略说明图。
图8是表示通过本发明的使用了部分的反应温度区域的信号扩增来检测基因的方法的其他例子的概略说明图。
图9是表示实验例1的结果的照片。
图10是表示实验例2的结果的照片。
图11是表示实施例1的工序图的概略说明图。
图12是表示实施例2的工序图的概略说明图。
图13是表示实施例3的工序图的概略说明图。
图14是表示实施例4的工序图的概略说明图。
图15是表示实施例4以及比较例4的结果的曲线图。
图中：10-微型板，12-靶基因，14-捕获探针，15-标记物质，16-辅助探针，17-一对HCP的一个，18-一对HCP，20-自聚合物，22-加热板，24-冷却机构，50-辅助探针-1，51-辅助探针-2，52-靶基因，53-探针A，54-捕获探针-1，55-辅助探针-3，56-捕获探针-2，57-探针B，58-捕获探针-3，59-探针C，60-靶基因。
具体实施方式
下面，根据附图说明本发明的实施方式，图示的例子只是例示，只要不脱离本发明的技术思想，就可以进行各种变形。
在热传播方法中有热传导(分子的碰撞)、对流(物质的移动)、以及放射(电磁波)的3种。本发明的杂交方法是，利用该热传播方法使微型板等检测平台内的反应溶液的温度不均一，在反应溶液内部分制作反应温度区域。
可以将该部分的反应温度区域的设定应用在利用了杂交反应的基因检测中，特别优选用于通过利用了图4或图8所示的PALSAR法的信号扩增来检测基因。在本发明中，在靶基因的固定部位付近、例如在检测用平台的底部等部分地形成反应温度区域，通过优先进行在该检测用平台底部的杂交反应，可以高感度地进行基因检测。
下面，具体说明杂交反应中部分的反应温度区域的形成的例子。
本发明是，通过只使反应溶液的一部分达到适于杂交的温度，只在该局部有效进行杂交反应，可以以良好的感度进行使用了杂交的靶基因的检测。只要仅以局部为反应温度进行杂交反应，就在本发明的范围内，但优选在反应溶液中设置高温区域以及低温区域，使得在反应溶液中产生温度梯度，而仅使局部为反应温度，更优选通过加热高温区域并冷却低温区域而产生。另外，优选预先冷却反应溶液以使杂交反应不进行
具体而言，可以举出在图6中示出了概略说明图的使用了微型板的使用部分的反应温度区域的杂交方法的例子。下面，以使用微型板作为反应平台的情况为例，具体说明本发明的靶基因的检测方法。其中，其他的平台也同样可以应用于微型板。
首先，在捕获了靶基因的微型板10中添加用于杂交反应的寡核苷酸，然后将微型板10全体例如冷却至4℃[图6(a)]。冷却后，如图6(b)所示，将微型板10放置到加热板22等加热机构上，将冷却机构24(例如，保冷剂(-20℃)或者与其类似的冷却板，例如冷却的铝封口等)覆盖其上，进行杂交反应[图6(c)]，其中所述的加热板22已将温度调节至适合杂交反应的温度。
杂交反应优选使用具备上述加热机构以及冷却机构的设备，对反应溶液进行加热以及冷却而进行，上述加热机构以及冷却机构优选可以控制温度。在用微型板进行杂交反应的情况下，上述加热机构以及冷却机构都进一步优选用平面接触微型板的结构，特别优选底面可以进行加热以及冷却两者。
进一步具体说明进行自聚合反应作为杂交反应的例子。图7是表示通过在微型板设定部分的反应温度区域的信号扩增来检测基因的方法的一例的概略说明图，是使用本发明的杂交方法进行图4中的步骤(e)～(f)的自聚合反应的例子。
如上述的图4(e)所示，在捕获了靶基因的微型板10中加入用于自聚合反应的多种寡核苷酸探针，然后进行冷却。冷却后，如图7(a)所示，通过在接近靶基因的阶层W(微型板的底部)设定成最适合自聚合反应的温度，只在该部位进行杂交反应。如图7(b)所示，随着反应时间的经过，从微型板的底部向上部达到最适合自聚合反应的温度，所以在清洗后，如图7(c)所示，只与靶基因结合成大的自聚合物，可以高感度地检测基因。
图8是表示通过在微型板设定部分的反应温度区域的信号扩增来检测基因的方法的其他例子的概略说明图。图8是使用了一对HCP的号放大，表示使用一对HCP的一方的一个区域是与靶基因互补的区域的一对HCP的例子。通过PALSAR法，如图8(a)所示，在检测用平台(微型板10或DNA微阵列等)的底部结合用于捕获基因的捕获探针14，利用图8(b)～图8(d)所示的步骤来捕获靶基因12(例如、E.coli-16SrRNA等)，向该靶基因12中加入具有与靶基因互补的区域的HCP17[图8(b)]，使该靶基因12和HCP17结合[图8(c)]，如图8(d)所示，加入多对的HCP18，通过自聚合反应形成自聚合物20，可以放大信号。
在本发明中，在该步骤(d)-(e)的自聚合反应中，在用于检测靶基因的存在的平台的底部部分地形成反应温度区域，优先在该检测用平台的底部进行自聚合反应，由此可以显著提高靶基因上的自聚合物形成效率[图8(e)]，可以高感度地进行基因检测。其中，在图8中表示的例子是，预先用标记物质来标记在自聚合反应中使用的一对HCP的一方，通过检测标记物质来检测自聚合物，由此检测靶基因を检测，但对自聚合物的检测方法没有特别限制。
实施例
下面，举出实施例进一步具体说明本发明，但这些实施例只是例示，当然不限定性解释本发明。
(实验例1以及2)
通过使用了一对探针的PALSAR法的反应温度、时间的差异的自聚合物形成。
<各溶液的制备方法>
(1)杂交溶液的制备
制备以下的试剂，并用作杂交溶液。
杂交溶液-1
[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)]
(2)杂交·HCP溶液的制备
在上述杂交溶液-1中溶解下述一对探针(HCP-1以及HCP-2)并使浓度为2pmol/μL，将其作为杂交·HCP溶液。
HCP-1的碱基序列(序列编号1)
5，-X区域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y区域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z区域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)-3′
HCP-2的碱基序列(序列编号2)(5’末端异羟基洋地黄毒苷配基标记)
DIG-5，-X，区域(GATGCAAGACACGAGACATG)·Y’区域(GATGGTGTTCACTGTAGCAG)·Z’区域(GACTGGTCTATGTCGAGAAC)-3’
<反应以及检测方法>
将上述杂交·HCP溶液分别注入到128个0.2mL的微管中，每管20μL，在分别对其中的1/2进行“实验例1：在94℃下加热分注后的管30秒”、或者“实验例2：在冰上冷却分注后的管”之后，在各反应温度(37.0、39.6、41.4、43.8、46.4、48.7、50.5、53.0、55.0、57.1、58.7、60.6、62.8、64.6、66.0或者68.0℃)下使其反应30分钟、1小时、或者3小时，在冰上使其骤冷。利用0.5％琼脂糖凝胶电泳对它们进行确认。
图9是表示实验例1的结果的照片，图10是表示实验例2的结果的照片。在图9以及图10中，(a)是表示在各反应温度下反应30分钟的结果，(b)是表示在各反应温度下反应1小时的结果，(c)是表示在各反应温度下反应3小时的结果。另外，在图9以及图10中，各道的样品的温度条件如下所示。
M：尺寸记号、1：37.0℃，2：39.6℃，3：41.4℃，4：43.8℃，5：46.4℃，6：48.7℃，7：50.5℃，8：53.0℃，9：55.0℃，10：57.1℃，11：58.7℃，12：60.6℃，13：62.8℃，14：64.6℃，15：66.0℃，16：68.0℃。
如图9所示，在进行94℃的热变性的实验例1中，在任何反应时间内都可以确认在55℃以上有滞留在琼脂糖凝胶的孔内的大小的自聚合物形成(图中的箭头)。另一方面，如图10所示，在不进行热变性的实验例2中，可以与实验例1一样在55℃以上确认自聚合物的形成，在不到55℃下确认看成是HCP的非特异性凝聚的涂抹带，即使反应时间延长也出现相同的趋势。由此，在本实验例中使用的杂交·HCP溶液的条件中一对探针(HCP-1以及2)的自聚合物形成的最佳反应温度是55℃附近。
(实施例1～3以及比较例1～3)
通过使用了部分的反应温度区域的杂交反应来检测靶基因的检测感度的测定
实施例1～3是，在使用了HCP的杂交反应中，以使用了均一的反应溶液的情况为对照(比较例1～3)，来确认在反应溶液中作成部分的反应温度区域的情况的效果。下面，将作成部分的反应温度区域使其发生反应的条件称为「C/H」，将在作为的对照的均一反应温度下使其发生反应的条件称为「H/H」。
另外，在进行使用了HCP的反应的情况下，将使用一对HCP(HCP-1以及HCP-2)进行自聚合反应的情况下记载为「2HCP」，将只使用HCP中的单链(HCP-1或者HCP-2)进行杂交反应的情况记载为「1HCP」。
<各溶液的制备>
(1)杂交溶液的制备
制备以下的试剂，在下述实施例1～3以及比较例1～3中用作杂交溶液。
杂交溶液-1：
[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)]
杂交溶液-2：
[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)、20％甲醛、Salmon sperm DNA(10μg/mL)]
杂交溶液-3：
[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)、5％PEG20000]
(2)溶菌液的制备
将在生理盐水悬浮用胰酶大豆琼脂培养了18小时金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)而成的液体作为培养菌原液。用生理盐水将其稀释成规定的细菌数，将通过碱-SDS法(非专利文献5)发生溶菌的液体作为用于下述实施例1～3以及比较例1～3的含有靶rRNA的溶菌液。关于细菌数，作成培养菌原液的稀释系列，从用胰酶大豆琼脂培养得到的活细菌数计算出规定的细菌数。
(实施例1以及比较例1)
比较对“C/H”以及“H/H”条件下的靶基因的检测感度以及靶基因上的自聚合物的形成效率的効果。实施例1的概略说明图表示于图11。
<各溶液的制备方法>
(1)第1杂交·探针溶液的制备
在0.2mL微管中加入下述辅助探针-1(100pmol/μL)10μL、下述辅助探针-2(100pmol/μL)10μL、下述探针A(100pmol/μL)10μL、杂交溶液-270μL，用搅拌器充分混合，在94℃下加热30秒加热之后，马上冰冷却，作为探针混液。
在已分别注入了3.9m L上述杂交溶液-2的15mL锥形管中加入上述探针混液，用搅拌器充分混合，将其用作在靶rRNA和捕获探针的杂交中使用的第1杂交·探针溶液(各探针的终浓度为0.25pmol/μL)。
辅助探针-1(图11的符号50)的碱基序列(序列编号3)
5′-T1区域(TAGCTAATGCAGCGCGGATCC)·S区域(GAGAAAGTTCATAGATATAC)·X区域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y区域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z区域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)-3′
辅助探针-2(图11的符号51)的碱基序列(序列编号4)
5′-X区域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y区域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z区域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)·S’区域(GTATATCTATGAACTTTCTC)·T2区域(ATCTATAAGTGACAGCAAGAC)-3′
探针A(图11的符号53)的碱基序列(序列编号5)
5’-K1区域(CGACGACGACGACGACGACG)·T3区域(GCGGTTCAAAATATTATCCGG)-3’
(2)第2杂交·HCP溶液的制备
在0.2mL微管中加入上述实验例1记载的HCP-1(100pmol/μL)以及HCP-2(100pmol/μL)各30μL，加入40μL杂交溶液-1，用搅拌器充分混合，在94℃下加热30秒然后马上冰冷却，作为HCP混液。
将该HCP混液加入到已分注了1.9m L上述杂交溶液-1的15mL锥形管中，用搅拌器充分混合，作为第2杂交·HCP溶液(各探针的终浓度为1.5pmol/μL)，在实施例1-1以及比较例1-1中使用。
另外，作为在实施例1-2以及比较例1-2中使用的第2杂交·HCP溶液，使用30μL灭菌蒸馏水来代替HCP-1，一样制备溶液。
<微型板的制备>
将具有与金黄色葡萄球菌的rRNA互补的序列的下述捕获探针-1固定在带形孔型的96孔微型板上，在实施例1、实施例3、比较例1以及比较例3中使用。
捕获探针-1(图11的符号54)的碱基序列(序列编号6)
5’-T4区域(CGTCTTTCACTTTTGAACCAT)·K1’区域(CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG)-3’-酰胺键(Amino link)
<反应以及检测方法>
(1)第1杂交
向2.0mL微管中加入上述制备的溶菌液(菌浓度：1×105CFU/mL)800μL、第1杂交·探针溶液800μL，用搅拌器充分混合，在45℃下反应1小时。图11的(a)以及(b)是该反应工序的概略说明图。另外，作为对照，使用生理盐水来代替溶菌液，一样进行反应。
将该反应液各100μL分注到上述制备的带形孔型的96孔微型板中，用板密封器紧密地密封，进而在45℃下反应1小时。图11的(c)以及(d)是该反应工序的概略说明图。
在上述反应后，用清洗液(50mM-Tris，0.3M-NaCl，0.01％-TritonX-100，pH7.6)对96孔微型板进行清洗。
(2)第2杂交(通过HCP的自聚合物或者杂交物形成反应)
在上述清洗后、将第2杂交·HCP溶液各以50μL分注到已彻底清除清洗液的96孔微型板中、用板密封器紧密地密封。
在实施例1、即实施例1-1以及实施例1-2中，使用上述微型板的带形孔的一半，在“C/H”条件下使其反应。实施例1中的“C/H”条件如下所示。
用4℃的保冷库冷却带形孔30分钟之后，将冷却的带形孔设置在分間恒温槽(ク一ルスタット、ァナテック制)的微型板用铝封口(重量：828g，宽度12.1cm，直径8.2cm，高度4.2cm)上，在微型板上载置冷却机构(STRATA冷却器的盖、STRATAGENE制)，将恒温槽设定成45℃或者55℃，使其反应1小时。
在比较例1、即比较例1-1以及比较例1-2中，使用上述带形孔的剩余部分，在“H/H”条件下使其反应。比较例1的“H/H”条件如下所示。
在室温下放置带形孔30分钟之后，用设定成45℃或者55℃的孵化器使其发应1小时。
(3)检测
在清洗微型板孔之后，加入溶解于50mM-Tris(pH7.6)的POD标记抗异羟基洋地黄毒苷配基(60mU/mL)50μL，用37℃的孵化器使其反应。在用清洗液清洗后，加入含有0.2M乙酸缓冲液(pH5.0)、0.06％TMB以及0.04％H2O2的显色液50μL，在暗处放置15分钟，测定655nm的吸光度。将吸光度的结果显示于表1以及表2。
[表1]
第二杂交在反应温度45℃下的吸光度
Figure C20058001169300291
[表2]
第二杂交在反应温度55℃下的吸光度
Figure C20058001169300292
如表1以及表2所示，在1HCP、2HCP中，都是C/H条件下的实施例1的测定值高于H/H条件下的比较例1的测定值，通过使用C/H条件，在靶基因上有效地进行杂交反应。
另外，在C/H条件下的实施例1中，与使用1HCP的实施例1-2相比，使用2HCP的实施例1-1的测定值更高，另一方面，在H/H条件下的比较例1中，与使用1HCP的比较例1-2相比，使用2HCP的比较例1-2的测定值与其相同或其以下。根据该结果，确认阶段性地作成溶液中的反应温度的C/H与均一的反应温度的H/H相比，更能在靶基因上通过HCP形成自聚合物。
(实施例2以及比较例2)
关于C/H中的阶段性反应温度的作成，加入基于HCP的杂交物形成或者自聚合物形成的反应液量来进行确认。实施例2的概略说明图如图12所示。
<各溶液的制备方法>
(1)第1杂交·探针溶液的制备
向0.2mL微管中加入下述辅助探针-3(100pmol/μL)20μL、80μL杂交溶液-2，用搅拌器充分混合，在94℃下加热30秒之后，马上冰冷却而作为探针液。
辅助探针-3(图12的符号55)的碱基序列(序列编号7)
5′-X区域(CATGTCTCGTGTCTTGCATC)·Y区域(CTGCTACAGTGAACACCATC)·Z区域(GTTCTCGACATAGACCAGTC)·T2区域(ATCTATAAGTGACAGCAAGAC)-3′
向已分注7.9mL杂交溶液-2的15mL锥形管中加入上述探针液，用搅拌器充分混合，将其用作在靶rRNA和捕获探针的杂交中使用的第1杂交·探针溶液(探针的终浓度：0.25pmol/μL)。
(2)第2杂交·HCP溶液的制备
向0.2mL微管中加入实验例1记载的HCP-1(100pmol/μL)以及HCP-2(100pmol/μL)各32μL、36μL的杂交溶液-1，用搅拌器充分混合，在94℃下加热30秒之后，马上冰冷却作为HCP混液，一共准备3管。
将该HCP混液分别加入到3管已分注了1.5mL杂交溶液-1的15mL锥形管中，用搅拌器充分混合，作为第2杂交·HCP溶液(各终浓度2pmol/μL)。
另外，作为在实施例2-2以及比较例2-2中使用的第2杂交·HCP溶液，使用32μL的灭菌蒸馏水来代替HCP-1，一样制备溶液。
<微型板的制备>
将具有与金黄色葡萄球菌的rRNA互补的序列的下述捕获探针-2固定在带形孔型的96孔微型板上，在实施例2以及比较例2中使用。
捕获探针-2(图12的符号56)的碱基序列(序列编号8)
5’-T4区域(CGTCTTTCACTTTTGAACCAT)-3’-酰胺键
<反应以及检测方法>
(1)第1杂交
向上述制备的带形孔型的96孔微型板中分注上述制备的溶菌液(细菌浓度：1×105CFU/mL)各50μL、第1杂交·探针溶液50μL，用板密封器紧密地密封，在45℃下使其反应1小时。图12是该反应工序的概略说明图。另外，作为对照，使用生理盐水来代替溶菌液，-样进行反应。
在反应后，使用板清洗器并利用清洗液进行清洗。
(2)第2杂交(基于HCP的自聚合物或者杂交物形成反应)
在清洗后，将第2杂交·HCP溶液分别以50μL或者100μL分别分注到已彻底清除清洗液的96孔微型板中，用板密封器紧密地密封。
在实施例2、即实施例2-1以及实施例2-2中，使用“C/H”条件使上述微型板的带形孔中的一半在50℃或者55℃下反应1小时。其中，“C/H”条件除了使用保冷剂作为冷却机构且变更恒温槽的设定温度以外，与实施例1一样进行。
在比较例2、即比较例2-1以及比较例2-2中，使用“H/H”条件使上述带形孔的剩余部分在50℃或者55℃下反应1小时。其中，“H/H”条件除了微型板加热器(DIGENE制)来代替孵化器且变更设定温度以外，与比较例1一样进行。
(3)检测
通过和实施例1一样的方法测定吸光度。结果如表3以及表4所示。其中，表3以及表4中所示的各吸光度的数值是，从所测定的数值中减去使用生理盐水代替溶菌液的的对照实验的测定数值而得到的数值。
[表3]
第二杂交在反应温度50℃下的吸光度
Figure C20058001169300321
[表4]
第二杂交在反应温度55℃下的吸光度
Figure C20058001169300322
如表3以及表4所示，在C/H条件下的实施例2中，与使用1HCP的实施例2-2相比，使用2HCP的实施例2-1的测定值更高，与H/H条件下的比较例2中使用了2HCP的比较例2-1相比，都呈现较高的测定值。另外，关于1HCP，在C/H条件下的实施例2-2中，当使反应液量从50μL向100μL增加时，测定值增高，但在H/H条件下的比较例2-2中，即使改变反应液量也没有看到差别。根据这些结果，在C/H中进一步阶段性地作成溶液中的反应温度，容易地在靶基因上通过HCP形成自聚合物，同时非PALSAR法的通常的单链杂交效率也增高。
(实施例3以及比较例3)
改变应用部分的反应温度区域的第2杂交的反应液量，确认对单链探针的杂交效率以及基于HCP的自聚合物的形成效率的効果。实施例3的概略说明图显示于图13。
<各溶液的制备>
(1)第1杂交·探针溶液-1的制备
向0.2mL微管中加入实施例1记载的辅助探针-1(100pmol/μL)以及辅助探针-2(100pmol/μL)各10μL、80μL的杂交溶液-2，用搅拌器充分混合，在80℃下加热30秒之后，马上冰冷却作为探针混液。
将该探针混液加入到已分注3.9mL冷却的杂交溶液-2的15mL锥形管中，用搅拌器充分混合，将其作为在与靶rRNA的杂交中使用的第1杂交·探针溶液-1(各探针的终浓度：0.25pmol/μL)。
(2)第1杂交·探针溶液-2的制备
向0.2mL微管中加入实施例1记载的探针A(100pmol/μL)10μL、90μL的杂交溶液-2，用搅拌器充分混合，在80℃下加热30秒之后，马上冰冷却作为探针混液。
将该探针混液加入到已分注1.9mL冷却的杂交溶液-2的15mL锥形管中，用搅拌器充分混合，将其作为在靶rRNA和捕获探针的杂交中使用的第1杂交·探针溶液-2(探针的终浓度：0.25pmol/μL)。
(3)第2杂交·HCP溶液的制备
向0.2mL微管中加入实验例1记载的HCP-1(100pmol/μL)以及HCP-2(100pmol/μL)各40μL、20μL的杂交溶液-1，用搅拌器充分混合，在80℃下加热30秒之后，马上冰冷却作为HCP混液。
将该HCP混液加入到已分注1.9mL的杂交溶液-1的15mL锥形管中，用搅拌器充分混合，作为第2杂交·HCP溶液(各探针的终浓度：2pmol/μL)，在实施例3-1以及比较例3-1中使用。
另外，作为在实施例3-2以及比较例3-2中使用的第2杂交·HCP溶液，使用40μL灭菌蒸馏水来代替HCP-1，一样制备溶液。
<反应以及检测方法>
(1)第1杂交
向实施例1记载的带形孔型的96孔微型板中加入50μL第1杂交·探针溶液-2，用板密封器紧密地密封，在45℃下使其反应1小时。图13的(c)以及(d)是该反应工序的概略说明图。
在反应后，使用板清洗器并利用清洗液进行清洗。
同时，向1.5mL微管中加入采用上述的方法调制成5×104CFU/mL的溶菌液或者生理盐水(对照)500μL、500μL的第1杂交·探针溶液-1，用搅拌器充分混合，在45℃下使其反应1小时。图13的(a)以及(b)是该反应工序的概略说明图。
将该反应液各100μL分注到通过上述第1杂交·探针溶液-2的反应后的微型板中，用板密封器紧密地密封，进而在45℃下使其反应1小时。图13的(b)、(d)以及(e)是该反应工序的概略说明图。
在反应后，使用板清洗器并利用清洗液进行清洗。
(2)第2杂交(基于HCP的自聚合物或者杂交物形成反应)
在上述清洗后，将第2杂交·HCP溶液分别以50μL或者100μL分注到已彻底清除清洗液的96孔微型板中，用板密封器紧密地密封。
在实施例3、即实施例3-1以及实施例3-2中，使用上述微型板的带形孔中的一半，“在C/H”条件下使其反应。实施例3中的“C/H”条件如下所述。
用4℃的保冷库冷却带形孔30分钟之后，将冷却的带形孔设置在微型板加热器(DIGENE制)上，在微型板上载置预先用4℃的保冷库冷却的铝封口(aluminium block)、在其上载置冷却机构(STRATA冷却器的盖、STRATAGENE制)，将微型板加热器设定成55℃后使其反应1小时。
在比较例3、即比较例3-1以及比较例3-2中，在“H/H”条件下使上述带形孔的剩余部分在55℃下反应1小时。其中，“H/H”条件除了变更设定温度以外，与比较例2一样进行。
其中，在实施例3以及比较例3中，为了提高和带形孔的粘附性，在反应前向任何封口上都滴下矿物油。
(3)检测
采用和实施例1一样的方法测定吸光度。结果显示于表5。其中，表5中所示的各吸光度的数值是、从所测定的数值中减去使用生理盐水来代替溶菌液的对照实验的测定数值而得到的数值。
[表5]
Figure C20058001169300341
如表5所示，在1HCP、2HCP中，C/H的测定值都比H/H高，当反应液量从50μL向100μL增加时，关于作为通常的杂交的1HCP，特别是C/H的测定值升高。根据这些结果，在C/H中进一步阶段性地作成溶液中的反应温度，容易地在靶基因上通过HCP形成自聚合物，同时，非PALSAR法的通常的单链杂交的效率也提高。
(实施例4以及比较例4)
实施例4使用标记寡核苷酸DNA，将均一的反应温度溶液作为对照(比较例4)，比较反应溶液中作成部分的反应温度区域的情况下的靶基因的检测效率。
<各溶液的制备方法>
(1)杂交·探针溶液-A的制备
在杂交溶液-2[4XSSC、0.2％SDS、1％Blocking reagent(Roche制)、20％甲醛、Salmon sperm DNA(10μg/mL)]中溶解下述探针B并使浓度为0.025pmol/μL，将其作为杂交·探针溶液-A。
探针B(图14的符号57)的碱基序列(序列编号9)
5’-K1区域(CGACGACGACGACGACGACG)·T5区域(AAATCGACAGCGTTTACAGCG)-3′
(2)杂交·探针溶液-B的制备
在上述杂交溶液-2中溶解5′末端标有DIG标签的下述探针C并使其浓度为0.025pmol/μL，将其作为杂交·探针溶液-B。
探针C(图14的符号59)的碱基序列(序列编号10)(5’末端异羟基洋地黄毒苷配基标记)
DIG-5′-T6区域(TTATCACGTTAGCTACGGGCGC)-3′
(3)溶菌液的制备
将用巧克力琼脂培养基培养了18小时流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)悬浮于生理盐水中而成的液体作为培养菌原液。将其用生理盐水稀释并使菌浓度为1×107CFU/mL，采用碱-SDS法(非专利文献5)使其溶菌，将其作为溶菌液。关于菌数，作成培养菌原液的稀释系列，从用巧克力琼脂培养基进行培养得到的活细菌数计算出规定的细菌数。其中，将使用生理盐水来代替溶菌液并进行相同反应的情况作为对照
<微型板的制备>
将具有与流感嗜血杆菌的rRNA互补的序列的下述捕获探针-3分别固定在带形孔型的96孔微型板上，在实施例4以及比较例4中使用。
捕获探针-3(图14的符号58)的碱基序列(序列编号11)
5′-T7区域(CAGAGTTAAACCCCAACCCCC)·K1’区域(CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG)-3′-酰胺键
<反应以及检测方法>
(1)杂交反应
向上述制备的带形孔型的96孔微型板中以50μL分注杂交·探针溶液-A，在将微型板设定成45℃的条件下使其反应1小时。图14(a)是该反应工序的概略说明图。
在反应后，用清洗液(50mM-Tris，0.3M-NaCl，0.01％-TritonX-100，pH7.6)进行清洗。
在清洗后，向已彻底清除清洗液的96孔微型板中分注上述制备的溶菌液50μL、50μL的杂交·探针溶液-B，用板密封器紧密地密封。其中，细菌数是4×105CFU/well。
实施例4在将上述微型板的下部控制成45℃、将上部电控制成20℃的条件下反应1小时。图14(b)是该反应工序的概略说明图。在反应后，用清洗液进行清洗。
另一方面，比较例4在将微型板设定成45℃的条件进行同样的反应以及清洗。
(2)检测
在清洗微型板孔之后，加入溶解于50mM-Tris(pH7.6)的POD标记抗异羟基洋地黄毒苷配基(60mU/mL)50μL，用37℃的孵化器使其反应。在用清洗液进行清洗之后，加入含有0.2M乙酸缓冲液(pH5.0)、0.06％TMB以及0.04％H2O2的显色液50μL，在暗处放置15分钟，测定655nm的吸光度。结果显示于表6以及图15。
[表6]
  细菌数(CFU/well)   实施例4   比较例4
  0   0.057   0.056
  4x10<sup>5</sup>   1.433   0.941
如表6以及图15所示，将下部控制成45℃、将上部电控制成20℃的实施例4，与比较例4相比，测定值更高，感度提高。根据该结果，可以确认不仅在通过HCP的自聚合反应的信号扩增中，即便在使用标记寡DNA的情况的检测中，也可以提高感度。
序列表
<110>卫材R&D管理有限公司
<120>杂交方法
<130>76694-PCT-CN
<140>PCT/JP2005/8248
<141>2005-04-28
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<151>2004-04-28
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<170>PatentIn version 3.1
<210>1
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<213>人工序列
<220>
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<400>1
catgtctcgt gtcttgcatc ctgctacagt gaacaccatc gttctcgaca tagaccagtc    60
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<220>
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<220>
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<222>(1)..(1)
<223>标记在5’端的异羟基洋地黄毒苷配基
<400>2
gatgcaagac acgagacatg gatggtgttc actgtagcag gactggtcta tgtcgagaac    60
<210>3
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<220>
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cctgctacag tgaacaccat cgttctcgac atagaccagt c                       101
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<220>
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catgtctcgt gtcttgcatc ctgctacagt gaacaccatc gttctcgaca tagaccagtc    60
gtatatctat gaactttctc atctataagt gacagcaaga c                       101
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<223>标记在3’端的酰胺键
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atctataagt gacagcaaga c                                              81
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cagagttaaa ccccaacccc ccgtcgtcgt cgtcgtcgtc g                        41

Claims (32)

1.一种杂交方法，是使用反应溶液中的寡核苷酸的杂交方法，其特征在于，
在反应溶液中部分地形成反应温度区域，在该反应温度区域中进行杂交反应，其中，所述杂交反应是，使用具有能够相互杂交的互补碱基序列区域的多种寡核苷酸探针使其进行杂交，由此使寡核苷酸发生自聚合，形成双链的自聚合物的自聚合反应。
2.如权利要求1所述的杂交方法，其中，
所述多种寡核苷酸探针是由第1探针和第2探针构成的一对寡核苷酸探针，所述的第1探针由从5’端侧顺次至少设置有核酸区域X、核酸区域Y以及核酸区域Z且具有下述化学式(1)的结构的3处以上的核酸区域组成，所述第2探针由从5’端侧顺次至少设置有核酸区域X’、核酸区域Y’以及核酸区域Z’且具有下述化学式(2)的结构的3处以上的核酸区域组成；
[化1]
Figure C2005800116930002C1
[化2]
在所述化学式(1)以及(2)中，X和X’、Y和Y’、Z和Z’分别是能够杂交的互补的核酸区域。
3.如权利要求1所述的杂交方法，其中，
所述多种寡核苷酸探针具有二聚体形成用探针含有系和交联探针含有系，
所述二聚体形成用探针含有系是从含有多对二聚体形成用探针的第1系至第(2n-1)(n≥1)系顺序形成n个，其中的二聚体形成用探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域、中央区域、以及5’侧区域这3个区域，使各寡核苷酸的中央区域成为相互互补的碱基序列，使3’侧区域以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列，
所述交联探针含有系是从分别含有多对交联探针的第2系至第2n系顺序形成n个，其中的交联探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域以及5’侧区域这2个区域，使各寡核苷酸的3’侧区域以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列，
该交联探针的碱基序列是能够对由该二聚体形成用探针形成的二聚体进行交联的碱基序列。
4.如权利要求3所述的杂交方法，其中，
所述n＝1，就所述探针的碱基序列而言，
第1系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
第2系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第2系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
5.如权利要求3所述的杂交方法，其中，
所述n＝1，就所述探针的碱基序列而言，
第1系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第2系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第2系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第2系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第2系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
6.如权利要求3所述的杂交方法，其中，
所述n≥2，就所述探针的碱基序列而言，
第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
7.如权利要求3所述的杂交方法，其中，
所述n≥2，就所述探针的碱基序列而言，
第(2n-3)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-3)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
第(2n-2)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第(2n-1)系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
第(2n-2)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第(2n-1)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域、
二聚体形成用探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和交联探针的最后的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
交联探针的最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域，各自成为互补碱基序列。
8.如权利要求1所述的杂交方法，其中，
所述多种寡核苷酸探针是，具有如下所述的结构且自第1系至第k系形成的多对二聚体形成用探针，即
自第1系至第k(k≥2)系顺序形成多个含有一对二聚体形成用探针的系，
(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(b)第(k-1)系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第k系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(d)最后的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域和第1的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域、
成为相互互补的碱基序列的结构，另外，其中的一对二聚体形成用探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域、中央区域、以及5’侧区域这3个区域，使各寡核苷酸的中央区域成为相互互补的碱基序列，使3’侧区域、以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列。
9.如权利要求1所述的杂交方法，其中，
所述多种寡核苷酸探针是，具有如下所述的结构且自第1系至第k系形成的多对二聚体形成用探针，即
自第1系至第k(k≥2)系顺序形成多个含有一对二聚体形成用探针的系，
(a)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第k系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(b)第(k-1)系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第k系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
(c)最后的系的No.1-寡核苷酸的3’侧区域和第1的系的No.2-寡核苷酸的3’侧区域、
(d)最后的系的No.1-寡核苷酸的5’侧区域和第1的系的No.2-寡核苷酸的5’侧区域、
成为相互互补的碱基序列的结构，另外，其中的一对二聚体形成用探针是将No.1以及No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’侧区域、中央区域、以及5’侧区域这3个区域，使各寡核苷酸的中央区域成为相互互补的碱基序列，使3’侧区域、以及5’侧区域成为相互不互补的碱基序列。
10.如权利要求1～9中任意一项所述的杂交方法，其中，
所述寡核苷酸是由从DNA、RNA、PNA以及LNA中选择的至少一种核苷酸构成。
11.如权利要求1所述的杂交方法，其中，
所述寡核苷酸的至少一个标记有标记物质。
12.如权利要求11所述的杂交方法，其中，
所述标记物质是放射性同位素、荧光物质、发光物质、显色物质、显色系酶或者发光系酶。
13.一种信号扩增方法，其中，
使用具有能够相互杂交的互补碱基序列区域的多种寡核苷酸探针使其进行杂交，由此寡核苷酸发生自聚合，利用形成双链的自聚合物的自聚合反应，提高在用于检测基因的反应机械材料中的靶基因的检测感度，
其中该自聚合反应是使用权利要求1～9中任意一项所述的杂交方法而进行。
14.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
所述反应机械材料是微型板、DNA微阵列或者磁性体粒子。
15.如权利要求13或者14所述的信号扩增方法，其中，
所述靶基因是单链DNA和/或RNA。
16.如权利要求13或者14所述的信号扩增方法，其中，
所述靶基因是双链DNA和/或RNA。
17.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
所述靶基因包括SNPs(单核苷酸多态)。
18.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
在所述自聚合反应中使用的寡核苷酸探针的至少一个具有与所述靶基因的一部分互补的序列
19.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
为了连接所述靶基因和所述自聚合物，使用具有与靶基因的碱基序列和所述寡核苷酸探针的碱基序列分别互补的区域的辅助探针。
20.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
所述寡核苷酸探针是由从DNA、RNA、PNA以及LNA中选择的至少一种核苷酸构成。
21.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
所述寡核苷酸探针的至少一个标记有标记物质。
22.如权利要求21所述的信号扩增方法，其中，
所述标记物质是放射性同位素、荧光物质、发光物质、显色物质、显色系酶或者发光系酶。
23.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
对于在所述靶基因上结合的自聚合物，使标记探针进行杂交而检测所述自聚合物的存在。
24.如权利要求23所述的信号扩增方法，其中，
所述标记探针是用显色系酶、发光系酶、或者放射性同位素标记的标记探针。
25.如权利要求13所述的信号扩增方法，其中，
对于所述自聚合物，加入具有与核酸结合的型质的荧光物质，通过该荧光物质的光化学变化检测所述自聚合物的存在。
26.一种靶基因的检测方法，其中，
使用了权利要求13～15中任意一项所述的信号扩增方法。
27.一种靶基因的检测方法，其中，
利用反应溶液中的寡核苷酸的杂交反应来检测基因，该杂交反应包括使用权利要求1～12中任意一项所述的杂交方法进行的杂交反应。
28.如权利要求27所述的靶基因的检测方法，其中，
用于检测所述基因的反应机械材料是微型板、DNA微阵列或者磁性体粒子。
29.如权利要求27或者28所述的靶基因的检测方法，其中，
在所述杂交反应中使用的寡核苷酸的至少一个具有与所述靶基因的一部分互补的序列。
30.如权利要求28～30中任意一项所述的靶基因的检测方法，其中，
所述靶基因是单链DNA和/或RNA。
32.如权利要求28～30中任意一项所述的靶基因的检测方法，其中，
所述靶基因是双链DNA和/或RNA。
33.如权利要求28～32中任意一项所述的靶基因的检测方法，其中，
所述靶基因包括SNPs(单核苷酸多态)。
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