HU221003B1 - Peptid-nukleinsavak - Google Patents

Peptid-nukleinsavak Download PDF

Info

Publication number
HU221003B1
HU221003B1 HU9303023A HU9303023A HU221003B1 HU 221003 B1 HU221003 B1 HU 221003B1 HU 9303023 A HU9303023 A HU 9303023A HU 9303023 A HU9303023 A HU 9303023A HU 221003 B1 HU221003 B1 HU 221003B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
group
amino
nucleobase
taeg
pna
Prior art date
Application number
HU9303023A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9303023D0 (en
HUT66597A (en
Inventor
Rolf Henrik Berg
Ole Buchardt
Michael Egholm
Peter Eigil Nielsen
Original Assignee
Rolf Henrik Berg
Ole Buchardt
Michael Egholm
Peter Eigil Nielsen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27220741&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU221003(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DK98791A external-priority patent/DK98791D0/da
Priority claimed from DK98691A external-priority patent/DK98691D0/da
Application filed by Rolf Henrik Berg, Ole Buchardt, Michael Egholm, Peter Eigil Nielsen filed Critical Rolf Henrik Berg
Publication of HU9303023D0 publication Critical patent/HU9303023D0/hu
Publication of HUT66597A publication Critical patent/HUT66597A/hu
Publication of HU221003B1 publication Critical patent/HU221003B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgyát olyan vegyületek képezik, amelyek nem polinukleotidok, mégis kötődnek komplementer DNS- és RNS-szálakhoz, méghozzá erősebben mint a megfelelő DNS. Pontosabban, a találmány tárgyát olyan vegyületek képezik, amelyekben a természetes nukleobázisok vagy más, a nukleobázisokhoz kapcsolódó egységek kovalens kötésekkel egy poliamidgerinchez kötődnek.
Az oligonukleotidokat egészen 100 nukleotid hosszig (bázispár, bp) rutinszerűen szintetizálják szilárd fázisú módszerekkel, a kereskedelmi forgalomban hozzáférhető teljesen automatizált berendezésekkel. Az oligoribonukleotidok szintézise azonban sokkal kevésbé számít rutinnak. Az oligoribonukleotidok emellett sokkal kevésbé stabilak, mint az oligodezoxiribonukleotidok, ezért az oligoribonukleotidokat sokkal kiteijedtebben használják az olyan orvosi és biológiai kísérletekben, amelyek például a génterápiára, illetve a transzkripció vagy a transzláció szabályozására irányulnak.
Egy gén működése úgy kezdődik, hogy a benne tárolt információ hírvivő RNS-sé (mRNS) íródik át, amely a riboszómális komplexszel kölcsönhatásba lépve irányítja egy, a szekvencia által kódolt fehéqe szintézisét. Ezt a szintetikus folyamatot hívjuk transzlációnak. A transzlációhoz számos komplementer faktornak és építőelemnek kell jelen lennie, az aminosavaknak és transzfer-RNSüknek (tRNS), amelyek egy átlagos sejtben mind jelen vannak.
A transzkripció iniciációjához egy promoter szekvencia specifikus felismerése szükséges az RNSszintetizáló enzim, az RNS-polimeráz által. A prokarióta sejtekben számos esetben, az eukarióta sejteknél valószínűleg minden esetben ez a felismerés úgy játszódik le, hogy egy fehéqe transzkripciós faktor szekvenciaspecifikus módon kötődik a promoterhez. Más fehérjék, amelyek szintén kötődnek a promoterhez, de amelyeknek a kötődése megakadályozza az RNS-polimeráz működését, represszorként ismertek. Tehát a gén aktiválását tipikusan pozitívan szabályozzák a transzkripciós faktorok és negatívan szabályozzák a represszorok.
A legtöbb szokásos gyógyszer úgy hat, hogy kölcsönhatásba lép, illetve befolyásolja egy vagy több megcélzott endogén fehéqe, például enzim működését. Az ilyen gyógyszerek azonban általában nem specifikusak a megcélzott fehéqékre, hanem más fehérjékkel is kölcsönhatásba lépnek. Tehát a gyógyszerből viszonylag nagy dózisra van szükség ahhoz, hogy hatékonyan befolyásoljuk a megcélzott fehérje működését. A gyógyszerek tipikus napi dózisai testtömeg-kilogrammra számítva 10-5-10-1 millimól, azaz egy 100 kg testtömegű személyre számítva 10-3-10 millimól. Ha ezt a befolyásolást ehelyett az mRNS-sel való kölcsönhatás, illetve inaktiválása révén lehetne elérni, akkor a gyógyszerhatóanyag mennyiségének drasztikus csökkenését lehetne elérni, természetesen a megfelelő mellékhatások csökkenésével együtt. További csökkenés lenne elérhető, ha az ilyen kölcsönhatást helyspecifikussá lehetne tenni. Mivel a működő gén folyamatosan termel mRNS-t, ezért még előnyösebb lenne, ha a gén transzkripcióját teljesen meg lehetne állítani.
Az oligodezoxinukleotidok nyújtanak erre lehetőséget. Például a szintetikus oligodezoxinukleotidok használhatók antiszenszpróbákként arra, hogy blokkoljuk, és végül teljesen elbontsuk az mRNS-t. Tehát a szintetikus DNS in vivő el tudja nyomni a transzlációt. Az is lehetséges, hogy egy állat genomját befolyásoljuk, például oly módon, hogy háromszoros hélixeket alakítunk ki oligonukleotidok vagy más DNS-felismerő ágensek alkalmazásával. Azonban számos hátránya van a háromszoros hélix kialakulásának. Például csak homopurinszekvenciáknál alkalmazható, és a fiziológiásnál jóval magasabb ionerősséget és alacsony pH-t igényel.
Emellett a módosítatlan oligonukleotid gyakorlatilag nem használható sem az antiszenszmegközelítésben, sem a háromszoros hélixmegközelítésben, mivel in vivő felezési ideje rövid, nagyon nehéz előállítani milligrammnál nagyobb mennyiségben, és ezért nagyon drága, ezenfelül nagyon gyengén tud csak áthatolni a membránokon.
Ezen problémák megoldására nagyon kiteijedten kutatják a javítások lehetőségeit és az alternatívákat. Például azokat a problémákat, amelyek a kétszálú DNSnek (dsDNS) a háromszoros hélix kialakulásán keresztül való felismerésével vannak kapcsolatban, egy elmés „visszakapcsoló” kémiai kötéssel oldották meg, amikor is az egyik szálon levő polipurinszekvenciát ismerik fel, majd „visszakapcsolnak”, és a másik szálon ismernek fel egy homopurinszekvenciát (McCurdy, Moulds, and Froehler, Nucleosides, in press). Emellett jó hélixképződést értek el mesterséges bázisok alkalmazásával, ezzel megjavítva a kötődési körülményeket, ami az ionerősséget és a pH-t illeti.
Azzal a céllal, hogy megnöveljék a felezési időt, valamint a membránon való átjutást, a polinukleotidvázban is nagyszámú változtatást hajtottak végre, habár eddig a várt eredményt nem sikerült elérni. Ezen változtatások közé tartozik a metil-foszfonátok, monotiofoszfátok, ditiofoszfátok, foszforamidátok, foszfát-észterek, áthidalt foszforamidátok, áthidalt foszfor-tioátok, áthidalt metilén-foszfonátok, defoszfo-intemukleotid analógok, amelyek sziloxánhidakat, karbonáthidakat, karboxi-metil-észter-hidakat, acetamidhidakat, karbamáthidakat, tioéter-, szulfoxi-, szulfonohidakat tartalmaznak, továbbá, különböző „plasztik” DNS-ek, aanomer-hidak és boránszármazékok.
A WO 86/05518 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben egy polimerkompozíciót igényelnek, amely hatékonyan kötődik egy, a bázisok megcélzott szekvenciáját tartalmazó egyszálú oligonukleotidhoz. Erről a kompozícióról azt állítják, hogy nem homopolimer, lényegében sztereoreguláris polimermolekulákat tartalmaz, az alábbi képlet szerint:
Rl ^2 R-3 Rn
B-B-B...B, amelyben (a) Rj.. .Rn jelentése felismerő egységek, amelyeket purin, purinszerű, pirimidin és pirimidinszerű heterociklusok közül választunk ki, amelyek hatékonyan kötődnek Watson-Crick-párok kiala2
HU 221 003 Bl kulása révén a megfelelő, a célszekvenciában található bázisokhoz;
(b) n értéke annyi, hogy a polimermolekula és a célszekvencia között kialakuló Watson-Crickhidrogénkötések össz-száma legalább 15 legyen;
(c) B-B vázalkotó egységek, amelyeket túlnyomó részben kémiailag stabil, lényegében töltetlen, túlnyomó részben akirális kötések kötnek össze;
(d) a vázképző egységek hossza 5-7 atom, ha a vázképző egységnek ciklikus a szerkezete, és
4-6 atom, ha a vázképző egységek aciklusos szerkezetűek;
(e) a vázképző egységek hordozzák a felismerő egységeket olyan pozíciókban, amelyek lehetővé teszik a Watson-Crick-bázispárok kialakulását a felismerő egységek és a megfelelő, a célszekvenciában található bázisok között.
A WO 86/05518 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint a felismerőegységek különböző semleges nukleobázisok és nukleobázisanalógok lehetnek, a vázképző egységek pedig vagy ciklusos vázképző egységek, amelyek furán- vagy morfolingyűrűt tartalmaznak, vagy aciklusos vázképző egységek lehetnek, amelyeknek a szerkezetét az (I), (II) és (III) általános képlettel lehet leírni, amelyben E jelentése -CO- vagy -SO2- csoport. A leírás általános utasítást tartalmaz az alegységek szintézisére, a vázképző egységek kapcsolási reakcióira és a polimer-összeépítés stratégiáira. A specifikáció azonban nem tartalmaz példákat, amelyekben az igényelt vegyület vagy szerkezet előállítása szerepel. Jóllehet a WO 86/05518 jelzi, hogy az igényelt polimerkészítmény képes célszekvenciák megkötésére, feltehetően diagnosztikai és terápiás alkalmazási lehetőségei vannak, ennek ellenére a bejelentés nem tartalmaz az igényelt polimer kötési affinitására vonatkozó adatokat.
A WO 86/05519 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés olyan diagnosztikai reagensekre és rendszerekre terjed ki, amelyek a WO 86/05518 számú leírásban közölt polimereket tartalmazzák, de szilárd hordozóhoz kötve. A WO 86/05519 számú leírás emellett nem ad meg példákat arra vonatkozóan, hogy az igényelt diagnosztikai reagenseket miképpen kell előállítani, és nagyon kevés adatot ad meg az ilyen reagens diagnosztikai hatékonyságáról.
A WO 89/12060 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés különböző, oligonukleotidanalógok szintézisében alkalmazható építőelemeket, valamint olyan oligonukleotidanalógokat ad meg, amelyek úgy jönnek létre, hogy ezeket az építőelemeket meghatározott sorrendben egymás mellé építik. Az építőelemek lehetnek „merev” (gyűrűt tartalmazó) vagy „flexibilis” (gyűrűt nem tartalmazó) elemek. Mindkét esetben az építőelemek egy hidroxicsoportot és egy merkaptocsoportot tartalmaznak, amelyeken keresztül az építőelemek a leírás szerint egymáshoz kapcsolhatók, és így oligonukleotidanalógok hozhatók létre. Az oligonukleotidanalógokban a kapcsolóegység lehet szülöd (-S-) szulfoxid (-SO-) vagy szulfon (-SO2-) csoport. A WO 89/12060 számú leírás egy általános leírást ad meg az építőelemek szintézisére és a kapcsolási reakciókra, amelyek az oligonukleotidanalógok szintéziséhez szükségesek, az építőelemek készítését ismertető kísérleti példákkal együtt. A leírás azonban nem tartalmaz olyan példákat, amelyek egy igényelt oligonukleotidanalóg készítésére irányulnak, és nem ad meg adatokat az oligonukleotidanalógnak egy céloligonukleotidhoz való kötődése erősségéről.
Emellett az oligonukleotidok vagy származékaik interkalátorokhoz vannak kötve, hogy ezzel javítsák a kötődésüket polilizinhez vagy egyéb bázikus csoportokhoz, hogy ezzel javítsák mind a kétszálú, mind az egyszálú DNS-hez való kötődésüket, valamint a peptidekhez való kötődésüket, hogy ezzel elősegítsék a membránon való áthatolásukat. Az ilyen kapcsolódás azonban nem eredményez kielégítő kötődést sem az egyszálú, sem a kétszálú DNS-hez. Más esetleges problémák, amelyek például a metil-foszfonátok és monotio-foszfátok alkalmazásából erednek, például a kiralitás fellépése, a nem kielégítő szintetikus kitermelési százalék, vagy nehézségek a szilárd fázissal segített szintézis végrehajtásában.
A legtöbb esetben ezek közül a módosítások közül csak néhány alkalmazható. Még ebben az esetben is csak rövid szekvenciák - gyakran csak dimerek vagy monomerek - állíthatók elő. Emellett az aktuálisan előállított oligomerek ritkán mutattak DNS- vagy RNSkötődést, illetve nem vizsgálták őket biológiailag.
Ezeknek a vázképző módosításoknak a legnagyobb többsége a módosított oligonukleotid és a komplementer természetes oligonukleotid közötti hibridek csökkent stabilitását eredményezte, amit a Tm értékek mérésével lehet igazolni. Ennek következtében a szakterületen általánosan ismert tény, hogy a vázban végzett módosítások destabilizálják az ilyen hibrideket, azaz alacsonyabb Tm értékeket eredményeznek, és ezért ezeket minimális mértékben kell csak végrehajtani.
A találmány tárgyát olyan vegyületek képezik, amelyek ssDNS- és RNS-láncokhoz képesek kapcsolódni, és stabil hibrideket hoznak létre velük.
A találmány tárgya továbbá olyan vegyületek előállítása, amelyek erősebben kötődnek az ssDNS- és RNS-szálakhoz mint a megfelelő DNS-szál.
A találmány tárgya továbbá olyan vegyületek előállítása, amelyekben a természetben előforduló nukleobázisok vagy egyéb nukleobáziskötő egységek kovalens kötéssel egy peptidvázhoz vannak kötve.
A találmány tárgya továbbá olyan vegyületek előállítása, amelyek nem lehetnek RNS-molekulák, és amelyek képesek egy kétszálú polinukleotid egyik láncához kötődni, és ezáltal kiszorítani a másik szálat.
A találmány tárgya továbbá terápiás és megelőző eljárásokban alkalmazható, az ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények kidolgozása.
A találmány tárgyát a vegyületek egy új osztálya képezi, amelyek peptid-nukleinsavakként (PNA-k) ismertek, amelyek a komplementer ssDNS- és RNSszálakhoz sokkal erősebben kötődnek, mint a megfelelő DNS. A találmány szerinti vegyületek általában
HU 221 003 Bl olyan ligandumokat tartalmaznak, amelyek egy aza-nitrogénen keresztül kapcsolódnak a peptidvázhoz. A jellemző ligandumok közé tartozik például a négy természetes DNS-bázis (azaz a timin, citozin, adenin vagy guanin), és más, a természetben is előforduló nukleobázisok (például az inozin, uracil, 5-metil-citozin vagy tiouracil), továbbá a mesterséges bázisok (például a bróm-timinek, azaadeninek vagy azaguaninek stb.) egy alkalmas linkeren keresztül egy peptidgerinchez kapcsolva.
Néhány előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti peptid-nukleinsavak a (IV) általános képlettel szemléltethetők, amelyben:
n értéke legalább 2,
L>-Lejelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, hidroxil-, 1-4 szénatomos alkanoilcsoportok, természetes nukleobázisok, nem természetes nukleobázisok, aromás egységek, DNSinterkalátorok, nukleobáziskötő csoportok, heterociklusos egységek és riporterligandumok, az L'-L egységek közül legalább az egyik egy természetes nukleobázis, egy nem természetes nukleobázis, egy DNS-interkalátor vagy egy nukleobázist kötő csoport;
A1-An jelentése egyszeres kötés, metiléncsoport vagy egy (V) vagy (VI) általános képletű csoport, amelyekben
X jelentése O, S, Se, NRA CH2 vagy C(CH3)2;
Y jelentése egyszeres kötés, O, S vagy NRA p és q értéke nulla vagy 1 és 5 közötti egész szám, p és q értékének összege nem lehet 10-nél több; r és s értéke nulla, vagy 1 és 5 közötti egész szám, s és r értékének összege nem lehet 10-nél több;
R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1 -4 szénatomos alkilcsoport, amely lehet hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tio-csoporttal helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkiltio-csoport, aminocsoport vagy halogénatom, és
R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben lehet hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tiocsoporttal helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport vagy aminocsoport;
B'-Bn jelentése N vagy R3N, ahol R3 jelentése a fentiekben meghatározott;
C1-CA jelentése CR®R7, CHR6CHR7 vagy CR6R7CH2 képletű csoport, ahol R6 jelentése hidrogénatom, és R7 jelentése valamely természetes alfa-aminosav oldallánca, illetve R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 2-6 szénatomos alkilcsoport, aril-, aralkil-, heteroaril-, hidroxil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-tio-csoport vagy N3R4 vagy SR5 általános képletű csoport, ahol R3 és R4 jelentése a fentiekben meghatározott, R5 jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkiltio-csoporttal lehet helyettesítve, illetve R6 és R7 együttesen egy aliciklusos vagy heterociklusos rendszert képeznek;
D*-Dn jelentése CR6R7> CH2CR6R7 vagy
CHR6CHR7 általános képletű csoport, amelyekben R6 és R7 jelentése a fenti;
Gi-G1 jelentése -NR3CO-, -NR3CS-, -NR3SO- vagy -NR3SO2-Y általános képletű csoport, ahol R3 jelentése a fenti, és
Y bármelyik orientációban lehet,
Q jelentése -CO2H, -CONR’R”, -SO3H vagy
-SO2NR’R” általános képletű csoport, illetve a -CO2H vagy -SO3H aktivált származéka; és
I jelentése -NHR”’R” vagy -NR”’C(O)R” általános képletű csoport, ahol R’, R”, R’” és R”” jelentése egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, alkilcsoport, amino-védőcsoport, riporterligandum, interkalátor, kelátképző, peptid, fehérje, szénhidrát, lipid, szteroid, oligonukleotid és oldható vagy oldhatatlan polimer.
A találmány szerinti peptid-nukleinsavak abban különböznek a WO 86/05518 számú leírásban leírtaktól, hogy a felismerőegységeik egy aza-nitrogénhez és nem amid nitrogénhez, vagy egy hidrazinegységhez vagy a gerincben levő szénatomhoz kapcsolódnak a gerincben.
Az előnyös peptid-nukleinsavak szerkezete a (VII) általános képlettel írható le, amelyben
L jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, fenilcsoport, heterociklusos egység, természetben előforduló nukleobázis vagy a természetben elő nem forduló nukleobázis;
R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, illetve a természetben előforduló alfa-aminosavak oldalláncai;
n értéke 1 és 60 közötti egész szám;
k, 1 és m értéke egymástól függetlenül nulla, illetve és 5 közötti egész szám;
Rhjelentése OH, NH2 vagy -NHLysNH2 képletű csoport; és
R> jelentése hidrogénatom vagy COCH3 csoport. Különösen előnyösek azok a (VII) általános képletű vegyületek, amelyekben mindegyik L jelentése egymástól függetlenül timin (T), adenin (A), citozin (C), guanin (G) vagy uracil (U), k és m értéke nulla vagy 1, n értéke 1 és 30 közötti egész szám, különösen 4 és 20 közötti egész szám. Egy ilyen vegyületre láthatunk példát az 1. ábrán, amely az ilyen vegyületek és az egyszálú DNS közötti szerkezeti hasonlóságot mutatja.
A találmány szerinti peptid-nukleinsavakat standard peptidszintézis-módszerekkel szintetizáljuk, oldatban vagy szilárd fázisban. A használt szintézisegységek speciálisan tervezett monomer aminosavak vagy aktivált származékaik, amelyek standard védőcsoportokkal vannak védve. Az oligonukleotidanalógokat is a megfelelő disavak és diaminok felhasználásával szintetizálhatjuk.
Tehát a találmány szerinti új monomer szintézisegységeket a (VIII), (IX) vagy (X) általános képletű aminosavak, disavak és diaminok közül választjuk ki, amelyekben L, A, B, C és D jelentése a fenti azzal a különbséggel, hogy bármelyik aminocsoport amino-védőcsoportokkal lehet védve; E jelentése COOH, CSOH,
HU 221 003 Bl
SOOH, SO2OH csoport vagy ezeknek aktivált származéka; F jelentése NHR3 vagy NPgR3 csoport, amelyben R3 jelentése a fenti, Pg jelentése pedig aminovédőcsoport.
Az előnyös monomer szintézisegységek a (XI) általános képletű aminosavak, illetve ezek aminopozícióban védett és/vagy a savpozícióban aktivált származékai, amelyekben L jelentése hidrogénatom, fenilcsoport, heterociklusos egység, természetes nukleobázis, nem természetes nukleobázis, illetve ezek védett származékai; R7’ jelentése lehet egymástól függetlenül hidrogénatom és a természetben előforduló aminosavak oldalláncai. Különösen előnyösek azok a (XI) általános képletű szintézisegységek, amelyekben R7' jelentése hidrogénatom, L pedig lehet timin (T), adenin (A), citozin (C), guanin (G) és uracil (U), valamint ezek védett származékai.
Teljesen váratlanul ezek a vegyületek is képesek felismerni a duplex DNS-t az egyik szál helyettesítésével, és ennélfogva a másikkal egy kettős hélixet hozva létre. Az ilyen felismerés 5-60 bázispár hosszúságú dsDNS-szekvenciákkal történhet meg. Számunkra a 10-20 bp méretű szekvenciák az érdekesek, mivel ez az a tartomány, amelyen belül a prokarióták és az eukarióták egyedi DNS-szekvenciái találhatók. Különösen azok a reagensek az érdekesek, amelyek 17-18 bázist ismernek fel, mivel ez a hossz jellemző a humángenomban levő egyedi szekvenciákra. A találmány szerinti vegyületek képesek hármas hélixet is képezni dsDNS-sel.
Jóllehet a találmány szerinti vegyületek javított kötődési képessége alkalmassá teszi azokat hatékony antiszensz ágensként való alkalmazásra, azért az várható, hogy a rokon reagensek egy kiterjesztett köre lánchelyettesítést is okozhat, most, hogy a dsDNS-nek ezt a meglepő és váratlan tulajdonságát felfedeztük.
A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók kiválasztott gének expressziójának gátlására egy szervezet sejtjeiben, oly módon, hogy az említett szervezethez egy, az előzőkben meghatározott reagenst adunk, amely specifikusan kötődik az említett gének specifikus szekvenciáihoz.
A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók továbbá eljárás kiválasztott gének transzkripciójának és/vagy replikációjának gátlására, illetve egy szervezet sejtjeiben található kétszálú DNS adott régiói degradációjának indukálására, oly módon, hogy az említett szervezethez az előzőkben meghatározott reagenst adjuk.
A találmány tárgya továbbá eljárás sejtek vagy vírusok elpusztítására, amelynek során az említett sejteket vagy vírusokat egy, az előzőkben meghatározott reagenssel hozzuk érintkezésbe, amely specifikusan kötődik az említett sejtek vagy vírusok genomjának szekvenciáihoz.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékletben megadott ábrákat, mert a jelen találmány számos tárgya és előnye a szakterületen jártas szakember számára jobban érthető a mellékelt ábrák alapján.
Az 1. ábrán egy természetes dezoxiribo-oligonukleotid (A) és egy, a találmány szerinti peptidnukleinsav (PNA) található (B).
A 2. ábrán a DNS-felismeréshez és riportercsoportként használható természetes és nem természetes nukleobázisokra láthatunk példákat.
A 3. ábrán sematikus illusztrációkat láthatunk (a) az Acr*-(Taeg)10-Lys-NH2 (Acr-T10-LysNH2) fotohasításáról;
(b) a diazokapcsolt akridin vagy Acr1-(Taeg)10LysNH2 és az előnyös KMnO4-hasítás fotolenyomatáról;
(c) az Sj nukleázzal fokozott hasításról és (d) az Acr1-(Taeg)10-Lys-NH2 kötőhely mikrococcusnukleázos hasításáról.
A 4. ábrán a találmány szerinti PNA monomer szintetikus egységekre látunk példákat.
Az 5. ábrán az Acr1 ligandumot és egy PNA-t, az Acr’-(Taeg)10-Lys-NH2-et láthatjuk.
A 6. ábrán a monomer szintézisegységek készítésének általános sémáját láthatjuk.
A 7. ábrán az Acr1 ligandum készítésének általános sémáját láthatjuk.
A 8. ábrán egy lineáris, nem védett PNA amidőn keresztül történő szilárd fázisú PNA-szintézis általános sémáját láthatjuk.
A 9. ábrán analitikai HPLC kromatogramokat láthatunk:
(A) nyers H-[Taeg]15-NH2 HF-es hasítás után (liofilezés előtt);
(B) nyers Acr1-[Taeg]15-NH2 HF-es hasítás után (liofilezés előtt);
(C) tisztított Acr1-[Taeg])5-NH2.
Az A puffer összetétele 5% CH3CN/95% víz/0,0445% TFA; a B puffer összetétele: 60% CH3CN/40% víz/0,039% TFA; lineáris gradiens, 0-100% B 30 perc alatt; áramlási sebesség: 1,2 ml/perc; oszlop: Vydac C18 (5 pm, 0,46x25 cm).
A 10. ábrán analitikai HPLC kromatogramok láthatók:
(A) tisztított H-[Taeg]I0-Lys-NH2 és (B) tisztított H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2 ugyanolyan körülményeket alkalmazva, mint a 9. ábránál.
A 11 A. és 11B. ábrákon az AcrTlO-Lys kötődését láthatjuk dA10-hez. 5’-32P-vel jelzett oligonukleotidot (1) (5’-GATTCA10G) inkubálunk Acr-T10-LysNH2 jelenlétében vagy távollétében a (2) oligonukleotiddal (5’-GATCCT10G) és a mintákat poli(akril-amid) gélelektroforézissel (PAGE) és autoradiográfiával elemezzük „természetes körülmények” (11 A. ábra) vagy „denaturáló körülmények” (11B. ábra) között.
A 12A-C. ábrákon a dsDNS-Acr-T10-LysNH2 komplex kémiai, fotokémiai és enzimes próbáját láthatjuk. Az Acr-T10-LysNH2 és a 32P-vel végjelzett dA1()/dT10 célszekvenciát tartalmazó DNS-fragmens közötti komplexet vizsgáljuk affinitás-fotohasítással (12A. ábra, 1-3. sáv, 12B. ábra, 1-3. sáv), fotolenyomattal (12A. ábra, 5-6. sáv), kálium-permanganátpróbával (12B. ábra, 4-6. sáv), illetve Staphylococcus-nukleázzal végzett próbával (12B. ábra, 8-10. sáv) vagy Sj nukleázzal végzett próbával. Mind az A szálat (12A. ábra) mind a T szálat (12B., C. ábrák) vizsgáljuk.
HU 221 003 Bl
A 13. ábrán egy eljárás látható védett PNA szintézisegységek előállítására.
A 14. ábrán egy eljárás látható védett adenin szintézisegység előállítására.
A 15. ábrán egy eljárás látható védett guanin szintézisegység előállítására.
A 16. ábrán példák láthatók a PNA gerinc megváltoztatására.
A 17. ábrán egy eljárás látható timin monomer szintézisegységek előállítására, olyan oldalláncokkal, amelyek megfelelnek a normál aminosavaknak.
A 18A. és 18B. ábrákon eljárások láthatók egy timin monomer szintézisegység aminopropilanalógja és egy propionilanalógja szintézisére.
A19. ábrán eljárás látható egy timin monomer szintézisegység amino-etil-P-alanin-analógjának előállítására.
A 20. ábrán egy PAGE autoradiogram látható, amely azt igazolja, hogy a PNA-T10 -T9C és -T8C2 magas szekvenciaspecifitással kötődik kétszálú DNS-hez.
A 21. ábrán egy grafikon látható, amely PAGE autoradiogramok denzitometriás leolvasásával készült, és amely a PNA-T10-nek egy kétszálú célmolekulához való kötődése kinetikáját mutatja.
A 22. ábrán egy grafikon látható, amely PAGE autoradiogramok denzitometriás leolvasásával készült, és amely a különböző hosszúságú PNA-k és egy A10/T10 kétszálú DNS célmolekula kötődésének hőstabilitását mutatja.
A 23. ábrán egy megfestett elektroforézisgélt láthatunk, amelyről leolvasható, hogy a restrikciós enzimnek egy adott DNS-sel szembeni aktivitása gátlódik, ha a restrikciós enzim felismerési helyéhez közel egy PNA kötődik.
A 24. ábrán egy PAGE autoradiogram látható, amely azt igazolja, hogy a 125I-jelzett PNA-T10 kötődik a komplementer dA10 oligonukleotidhoz.
A 25. ábrán egy, a találmány szerinti peptidnukleinsav látható.
A 26. ábrán egy, a találmány szerinti peptidnukleinsav szintézisének menete látható.
A 27. ábrán a tozilcsoportnak mint nitrogén védőcsoportnak a tesztjét láthatjuk peptid-nukleinsavak szintézise során.
A találmány szerinti oligonukleotidanalógokban és monomer szintézisegységekben az L ligandum elsődlegesen egy természetes nukleobázis, amely a természetben megfigyelt pozícióhoz kötődik, azaz az adenin és a guanin esetében a 9-es pozícióhoz, és a timin és citozin esetében az 1-es pozícióhoz. Egy másik megvalósítási mód szerint L lehet egy természetben elő nem forduló nukleobázis (nukleobázisanalóg), egy másik báziskötő egység, egy aromás egység, 1 -4 szénatomos alkanoilcsoport, hidroxicsoport vagy éppen hidrogénatom. Néhány tipikus nukleobázisligandumot és jellegzetes szintetikus ligandumot a 2. ábrán mutatunk be. Emellett L lehet egy DNS-interkalátor, egy riporterligandum, azaz például egy fluorofór, radioaktív jelzés, spin jelzés, haptén vagy egy fehérjefelismerő ligandum, mint például a biotin.
A monomer szintézisegységekben L védőcsoportokkal blokkolva lehet. Ezt a 4. ábrán mutatjuk be, ahol Pg1 jelentése egy sav, egy bázis, vagy egy hidrogénezéssel vagy fotokémiai úton hasítható csoport, ilyen például a t-butoxi-karbonil (Boc), a fluor-endmetil-oxi-karbonil (Fmoc) vagy a 2-nitrobenzil (2 Nb) csoport.
Az A linker számos különböző csoport közül választható, lehet például -CR’R2CO-, CR'R2CSe-, -CR1R2CNHR3-, -CR’CNHR3- -CR1 R2C=CH2és -CR’R2C=C(CH3)2-, ahol R1 és R3 jelentése az előzőkben meghatározott. A jelentése előnyösen metilénkarbonil-csoport (-CH2CO~). Az A jelentése lehet emellett egy hosszabb szénláncú egység, például propánod-, butanoil- vagy pentanoilcsoport, illetve ezek megfelelő származéka, amelyekben O helyett X lehet, illetve a lánc lehet helyettesítve R’R2 csoporttal, vagy lehet Y-t tartalmazó heterogén lánc. Emellett A jelentése lehet 2-6 szénatomos alkilénlánc, egy R'R2vel helyettesített 2-6 szénatomos alkilénlánc, illetve lehet Y-t tartalmazó heterogén lánc. Adott esetben A jelentése lehet egyszeres kötés.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint B jelentése nitrogénatom, és ezáltal egy akirális gerinc lehetőségét adja. B lehet emellett R3N+ is, ahol R3 jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatároztunk.
A találmány előnyös megvalósítási formájában C jelentése -CR6CR7-, de lehet egy két szénatomos egység is, azaz -CHR6CHR7- vagy -CR6R7CH2-, amelyben R6 és R7 jelentése az előzőkben meghatározott. R6 és R7 jelentése lehet heteroaromás csoport is, azaz például pirrolil-, fúrd-, tienil-, imidazolil-, piridil-, pirimidind-, indolilcsoport, illetve a kettő együtt egy teljes aliciklusos rendszert képezhet, azaz például lehet
1,2-ciklobután-di-il-, 1,2-ciklopentán-di-il- vagy 1,2ciklohexán-di-il-csoport.
A találmány előnyös megvalósítási formájában E jelentése a monomer szintézisegységben COOH, illetve annak egy aktivált formája, G jelentése az oligomerben -CONR3-. Az előző meghatározás szerint E jelentése lehet CSOH, SOOH, SO2OH csoport, illetve ezek aktivált származéka, míg G jelentése az oligomerben -CSNR3-, -SONR3- és -SO2NR3-. Az aktiválást elérhetjük például savanhidrid vagy egy aktív észterszármazék alkalmazásával, ahol a csoportokban levő, E-vel jelzett hidrogént egy lehasadó csoporttal helyettesítjük, amelyet a növekvő gerinc készítéséhez építettünk be.
A gerincet képező aminosavak lehetnek azonosak vagy különbözőek. Azt találtuk, hogy a 2-amino-etilglicin-alapúak különösen alkalmasak a találmány céljaira.
Néhány esetben érdekes lehet, ha ligandumokat kapcsolunk akármelyik véghez (Q, I), hogy befolyásoljuk a PNA-k kötődési jellemzőit. A jellemző ligandumok közé tartoznak a DNS-interkalátorok, amelyek javítják a dsDNS kötődését, vagy a bázikus csoportok, például a lizin vagy polilizin, amely erősíti a PNA kötődését az elektrosztatikus kölcsönhatás következtében. A negatí6
HU 221 003 Bl van töltött csoportok csökkentéséhez karboxi- vagy szulfocsoportok használhatók. A szintézisegységek tervezése lehetővé teszi, hogy az ilyen egyéb egység a nem terminális pozícióban forduljon elő.
A találmány egy további tárgya szerint a PNAoligomerek alacsony molekulatömegű effektorligandumokhoz kötődnek, azaz például nukleázaktivitással vagy alkilezőaktivitással rendelkező ligandumokhoz, illetve riporterligandumokhoz (fluoreszcens, spinjelzési, radioaktív, fehérjefelismerő ligandumok, például a biotin vagy haptének). A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a PNA-kat peptidekhez vagy fehérjékhez konjugáljuk, ahol a fehérjék jelzőaktivitással rendelkeznek, és a fehérjék lehetnek például enzimek, transzkripciós faktorok vagy antitestek. A PNA-kat emellett vízben oldható vagy vízben nem oldható polimerekhez lehet kapcsolni. A találmány tárgya továbbá, hogy a PNA-kat oligonukleotidokhoz vagy szénhidrátokhoz kapcsoljuk. Ha szükséges, akkor egy PNAoligomert néhány egységre lehet szintetizálni (azaz például egy peptidláncra, riporterre, interkalátorra vagy más típusú ligandumtartalmú csoportra), egy szilárd hordozóhoz kapcsolva.
Az ilyen konjugátumokat gének befolyásolására lehet használni (például génre célzott gyógyszerek), diagnosztikai, biotechnológiai vagy tudományos céllal.
A találmány további tárgya szerint a PNA-kat RNS vagy ssDNS megcélzására lehet használni, hogy antiszensz típusú génszabályozó egységeket és hibridizációs próbákat állítsunk így elő, nukleinsavak azonosítására és tisztítására. Emellett a PNA-kat oly módon is lehet módosítani, hogy tripla hélixeket képezzenek dsDNS-sel. Azok a reagensek, amelyek szekvenciaspecifikusan kötődnek a dsDNS-hez, génre célzott gyógyszerként használhatók. Ezeket úgy tekinthetjük, mint olyan hasznos gyógyszereket, amelyek betegségek, például rák, AIDS és más vírusfertőzések kezelésére lehet használni, és hatékonynak bizonyulhatnak bizonyos genetikai betegségek kezelésében is. Emellett ezek a reagensek használhatók a kutatásban és a diagnosztizálásban, specifikus nukleinsavak kimutatására és izolálására.
A hármashélix-elméletet tekintik az egyetlen ismert elméletnek a szakterületen a dsDNS szekvenciaspecifikus felismerését illetően. A hármas hélix képződése azonban nagymértékben csak a homopurin-homopiridin szekvenciák felismerésére vonatkozik. A szálhelyettesítés jobb mint a hármashélix-felismerés, amennyiben lehetővé teszi bármely, a négy természetes bázisból álló szekvencia felismerését. Emellett a szálhelyettesítéses felismerés könnyen lejátszódik fiziológiás körülmények között, azaz semleges pH-η, szobahőmérsékleten (20-40 °C) és közepes ionerősség (100-150 mmol/1) mellett.
A génekre célzott gyógyszereket a megcélzott gén szabályozórégiójával (promoter) komplementer nukleobázisszekvenciával (10-20 egységet tartalmaz) tervezzük. Ennek következtében, a gyógyszer beadása után hozzákötődik a promoterhez és blokkolja az RNS-polimeráz hozzáférését. Ennek következtében nem keletkezik mRNS, és így géntermék (fehéije) sem. Ha a célpont egy vírus létfontosságú génjében található, akkor nem keletkezik életképes vírusrészecske. Egy másik megvalósítási mód szerint a célpont lehet a promoter után, és ezzel azt okozza, hogy az RNS-polimeráz leáll ebben a pozícióban, és így csonkított, működésképtelen mRNS/fehérje keletkezik.
Az ssDNS szekvenciaspecifikus felismerését a komplementer bázisok hibridizációjával hasonlóképpen alkalmazhatjuk specifikus gének és vírusok megcélzására. Ebben az esetben a célszekvencia az mRNS-ben található, oly módon, hogy a gyógyszernek a célponthoz való kapcsolódása gátolja a riboszómák működését, és ennek következtében az mRNS fehérjévé való transzlációját. A találmány szerinti peptidnukleinsavak jobbak, mint a korábbi reagensek, amennyiben lényegesen magasabb affinitással rendelkeznek a komplementer ssDNS-hez. Emellett nem tartalmaznak töltést és vízben oldódnak, ami megkönnyítheti a sejtbe való bejutásukat, nem biológiai aminosavak amidjait tartalmazzák, amely biológiailag stabillá teheti őket, valamint rezisztenssé az enzimatikus lebomlással, például proteázokkal szemben.
A PNA oligomerek biokémiai/biológiai tulajdonságait az alábbi kísérletekkel illusztrálhatjuk.
1. Szekvenciadiszkrimináció a dsDNS-szinten (63. példa, 20. ábra)
Az Srpróba technika alkalmazásával a Tlo, T5CT4(T9C) & T2CT2CT4(T8C2) PNA-nak a pUC19 plazmid BamHI, Sáli vagy PstI hasítási helyére klónozott Ajo, A5GA4(A9G) & A2GA2GA4 (A8G2) felismerési szekvenciákhoz való kötődésében fennálló különbséget elemezzük. Az eredmények (20. ábra) azt mutatják, hogy a három PNA az alábbi relatív hatékonysággal kötődik a megfelelő felismerési szekvenciákhoz: PNA-T10: A|0>AgG>A8G2, PNA-T9C: A9G>A10-A8G2, PNA-T8C2: A8G2>A8G>Ai0. Tehát 37 °C-on tíz közül egy helytelen bázispárosodás csökkenti a hatékonyságot (körülbelül 5-10-ed részére), míg két helytelen bázispár már nem fogadható el.
2. A PNA-T10-dsDNS lánchelyettesitési komplex képződésének kinetikája (66. példa, 21. ábra)
A PNA és a 32P-végjelzett dsDNS-ffagmens közötti komplexképződést S! nukleázzal vizsgáljuk a PNA és a 32P-végjelzett dsDNS fragmens összekeverését követő különböző időpontokban (21. ábra).
3. A PNA-dsDNS komplex stabilitása (67. példa,
22. ábra)
A PNA-Tn és a 32P-dsDNS (A10/T10) célpont között komplexeket hozunk létre (60 perc, 37 °C). A komplexeket azután a kiválasztott hőmérsékleten 10 percig inkubáljuk fölöslegben levő oligo-dA10-zel, szobahőmérsékletre hűtjük, majd KMnO4-próbának vetjük alá. Az eredmények azt mutatják, hogy a PNA-dsDNS komplex hőstabilitása a PNA-oligonukleotid komplexekét tükrözi „Tm”-ben kifejezve.
4. Restrikciós enzimek hasításának gátlása PNAval (65. példa, 23. ábra)
A pT10-plazmid-konstrukció egy dA10/dT10 részt tartalmaz a pUCIO plazmid BamHI hasítási helyére
HU 221 003 Bl klónozva. Tehát a pTlO plazmid BamHI vagy Pvull restrikciós enzimmel való hasítása két kis DNS-fragmenst eredményez, az egyiknek a mérete 211, a másiké 111 bázispár. A PNA-T10 jelenlétében egy 336 bázispár méretű fragmenst kapunk, ami megfelel annak, hogy csak a Pvull hasítás játszódott le. Tehát a BamHI restrikciós enzimmel való hasítást a restrikciós hasítási hely elejéhez kötődő PNA gátolja. Az eredmények azt is mutatják, hogy a PNA-dsDNS komplex 100%-os hatásfokkal keletkezhet. Hasonló eredmények kaphatók a pT8C2 plazmid és a PNAT8C2 alkalmazásával,
5. A I25I-vel jelzett PNA kötődése az oligonukleotidokhoz (63. példa, 24. ábra)
Egy Tyr-PNA-TI0-Lys-NH2 molekulát 125I-vel jelzünk, Na125I és kloramin-T alkalmazásával, majd HPLC-vel tisztítjuk. A I25I-PNA-Tj0-ről PAGE-val és autoradiográfiával ki lehet mutatni, hogy kötődik az oligo-dA10-hez (24. ábra). A kötődés kompetitív módon gátolható denaturált boíjútimusz-DNS-sel.
A dsDNS szekvenciaspecifikus felismerését egy PNA-nak egy dAio/dTlo célszekvenciához való kötődésével illusztráljuk, amely PNA 10, timinnel szubsztituált 2-amino-etil-glicil egységből áll, C-terminálisa egy lizin-amid, N-terminálisa pedig egy komplex 9-aminoakridin-ligandum (9-Acr1-(Taeg)10-Lys-NH2,11 A. és 11B. ábra). A célszekvencia egy 248 bázispár méretű, 32P-végjelzett DNS-fragmensben található.
A lánchelyettesítést az alábbi típusú kísérletekkel igazoljuk:
1. A 9-Aer1 ligandumtól (5. ábra), amelyet egy 4nitrobenzamido-csoporttal láttunk el, hogy biztosítsuk a DNS besugárzás hatására történő hasítását, az várható, hogy csak a kötődési helyének szoros közelségében levő helyen hasítja a DNS-t. A fenti 248 bp méretű DNS-fragmenst tartalmazó PNA-t besugározva, szelektív hasítás figyelhető meg a dA10/dT10 szekvenciában (3a. ábra).
2. Egy úgynevezett fotolenyomat-vizsgálatban, ahol egy szintetikus diazokapcsolt akridin besugárzás hatására hasítja a DNS-t (kivéve ahol a DNS-t az említett kötóvegyület védi) egy DNS-kötő anyag jelenlétében történő DNS-kölcsönhatás hatására.
Az ilyen kísérletet végezve a fenti 248 bp méretű dsDNS-fragmenssel, az derült ki, hogy az megvédi a PNA kötési helyet a fotohasítással szemben (3b. ábra).
3. Hasonló típusú kísérletben a DNS-t hasító mikrococcusnukleáz, amelyet hatásában szintén gátol a legtöbb DNS-kötő reagens, fokozott hasítást mutatott a T10 célpontnál (3c. ábra).
4. Egy másik hasonló típusú kísérletben az egyszálú timinligandumok jól ismert nagy érzékenységét használjuk ki a kálium-permanganát-oxidációval szemben (ellentétben a kétszálú timinligandumok érzéketlenségével). A 248 bp méretű fragmens oxidációja a reagens jelenlétében a szálnak csak a T10 szálán mutatott oxidációt (3b. ábra).
5. Egy hasonló típusú kísérletben az S( nukleáz egyszál-specifitása világosan mutatta, hogy a célnak csak a Tj0 szálát érte támadás (3d. ábra).
A (Taeg)10 (Taeg)10-Lys-NH2 és az Acri-(Taeg)10Lys-NH2 nagyon hatékony kötődését (11 A. és 11B. ábrák) a megfelelő dA10-hez két különböző módon igazoljuk:
1. A ligandum-oligonukleotid komplexek lassabban vándorolnak, mint a puszta oligonukleotid, poli(akrilamid)-gélben végzett elektroforézis során. Ennek következtében az ilyen kísérleteket AcrI-(Taeg)10-Lys-NH2vel és 32P-végjelzett dA10-zel végezzük. Ez lassúbb vándorlást mutat olyan körülmények között, ahol a normál dA10/dT10 duplex stabil, valamint olyan körülmények között, ahol az ilyen komplex instabil (denaturálógél). Egy kontrollkísérletet is végeztünk Acri-fTaegLo-LysNH2-vel és 32P-végjelzett dT|0-zel, ahol nem találtunk késést a fenti körülmények között.
2. Ha DNS-duplexek keletkeznek (dsDNS) egyszálú DNS-ből, akkor az extinkciós koefficiens csökken (hipokróm hatás). így követhető a DNS denaturálódása, oly módon, hogy mérjük az abszorbancia változását például a Tm függvényében (Tm az a hőmérséklet, ahol a duplex 50%-a eltűnik egyszálú DNS-ek keletkezése közben).
Duplexek képződnek az egyszálú oligodezoxiribonukleotidok és az alábbiakban felsorolt PNA-k között. Tipikus esetben a T-ben gazdag szálból 0,3 OD260 hibridizál 1 ekvivalensnyi másik szállal, oly módon, hogy az elegyet 5 percig 90 °C-on tartjuk, szobahőmérsékletre hűtjük, majd 30 percig ott tartjuk, és végül 5 °C-on tartjuk legalább 30 percig. A használt pufferekben, mindegyikben 10 mmol/1 foszfát és 1 mmol/1 EDTA található.
Az alacsony sótartalmú puffer nem tartalmaz nátrium-kloridot, míg a közepes sótartalmú puffer 140 mmol/1 NaCl-t, a magas sótartalmú puffer 500 mmol/1 NaCl-t tartalmaz. Mindegyik puffemek 7,2 a pH-ja. A hibridek olvadáspontját egy Gilford Response berendezésben határozzuk meg. Az alábbi extinkciós koefficienseket használjuk: A: 15,4 ml/pmolxcm; T: 8,8; G: 11,7 és C: 73, mind a normál oligonukleotidok, mind a PNA esetében. Az olvadáspontgörbéket 0,5 °C/perc lépésekben rögzítjük. A Tm értéket az A26o hőmérsékletgörbe első deriváltjának maximumából határozzuk meg.
Az oligonukleotidok listája:
1. 5’-AAA-AAA-A A
2. 5’-AAA-AAA-AAA-A
3. 5’-TTT-TTT-TTT-T
4. 5’-AAA-AAG-AAA-A
5. 5’-AAG-AAG-AAA-A
6. 5’-AAA-AGA-AAA-A
7. 5’-AAA-AGA-AGA-A
8. 5’-TTT-TCT-TTT-T
9. 5’-TTT-TCT-TCT-T
10. 5’-TTT-TTC-TCT-T
11. 5’-TTT-TTC-TTC-T
12. 5’-TTC-TTC-TTT-T
13. 5’-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT
14. 5’-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA
A PNA-k listája
a. TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH2
HU 221 003 Bl b TTT-TTT-TT-Lys-NH2
c. TTT-TTC-TTT-T-Lys-NH2
d. TTC-TTC-TTT-T-Lys-NH2
e. Acr-TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH2
f. Ac-TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH2
Oligo/PNA Alacsony sótartalom Közepes sótartalom Magas sótartalom
1+b 56,0 51,5 50,0
2+a 73,0 72,5 73,0
2+c 41,5 és 52,0*
2+e 84,5 86,0 körülbelül 90
2+f 74,0
4+a 60,0 59,0 61,5
4+c 74,5 72,0 72,5
4+f 62,0
5+a 47,0
5+c 57,5
5+f 46,5
7+a 46,0
7+c 58,0
7+f 43,5
7+12 23,0
13 + 14 39,0
*Két eltérő olvadáspont-hőmérséklet látható, ez azt mutatja, hogy lokális olvadás figyelhető meg a teljes denaturálódás előtt
Az RNS-A (poli rA) és a PNA-T10-Lys-NH2 között keletkező hibrid olyan magas hőmérsékleten olvad meg, hogy nem mérhető (>90 °C). De specifikus hibridizáció mutatható ki az A260 értékben megfigyelhető nagy csökkenéssel, az RNS-A-val való összekeverés esetében, de a G, C és U esetében ez nem mutatható ki. A kísérletet úgy végezzük, hogy 1 ml PNA-oldatot összekeverünk 1 ml RNS-oldattal, mindegyik mennyisége A26o=O,6, majd ezután méqük az abszorbanciát 260 nm-en. Ezután a mintát 5 percig 90 °C-on tartjuk, szobahőmérsékletre hűtjük és itt tartjuk 30 percig, végezetül 30 percig 5 °C-on.
RNS PNA A260 keverés előtt A260 keverés után A26O keverés és melegítés után
RNS-A PNA-T10-lys-NH2 0,600 0,389 0,360
RNS-U PNA-Tí0-lys-NH2 0,600 0,538 0,528
RNS-G PNA-T10-lys-NH2 0,600 0,514 0,517
RNS-C PNA-T10-lys-NH2 0,600 0,540 0,532
A fenti mérésekből az alábbi következtetéseket lehet levonni. Van bázistömörödés, mivel olvadási görbe figyelhető meg. A PNA-DNS hibrid sokkal stabilabb, mint egy normál DNS-DNS hibrid, a PNA-DNS hibrid pedig még ennél is stabilabb. A hibás bázispárosodások a Tm érték jelentős csökkenését okozzák, attól függetlenül, hogy a hibás bázis a DNS-ben vagy a PNA-szálban található. A Tm érték csak gyengén függ az ionerősségtől, a normál oligonukleotidokkal ellentétben.
A találmány szerinti PNA-k szintézisét az alábbiakban tárgyaljuk, ahol is az 1. ábra az egyik előnyös PNA-példát jelenti, és szerkezetét a komplementer DNS-hez hasonlítjuk ezen az ábrán.
A PNA-oligomerek és -polimerek szintézise
Azt az eljárást, amelynek során a molekulákat olyan szilárd hordozóhoz rögzítjük, amely segít abban, hogy a kémiai átalakítások során a közbenső termékekkel elszámoljunk, szilárd fázisú szintézisnek vagy Merrifield-szintézisnek nevezik [Merrifield, Journal of the American Chemical Society, 85, 2149 (1963); Science, 232, 341 (1986)]. A kidolgozott módszerek, amelyek során aminosavakat lépésenként vagy fragmensenként építünk össze peptidekké, normális körülmények között egy térhálós sztirol-divinil-benzolkopolimer gyöngyhordozót alkalmaznak, amely a sztirolmonomer gyöngypolimerizációja során keletkezik, amelyhez divinil-benzolok keverékét adták. Általában 1-2%-os térhálósodási szintet használnak. Egy ilyen hordozó használható a jelen találmány szerinti szilárd fázisú PNA-szintézisben is.
A szilárd fázis kezdeti funkcionalizálására több mint ötven módszert írtak le, a hagyományos szilárd fázisú peptidszintézissel kapcsolatban [Bárány and Merrifield in „The Peptides”, 2, Academic Press, New York, 1-284 (1979), Stewart and Young „Solid Phase Peptide Synthesis”, 2nd ed., Pierce Chemical Company, Illinois (1984)]. A klór-metil funkciós csoport bejuttatására szolgáló reakciók (Menifield-gyanta; klór-metil-éter/SnCl4 reakció), az amino-metil funkciós csoport bejuttatására szolgáló reakciók [N-hidroximetil-ftálimid-reakció; Mitchell et al., Tetrahedron Lett., 3795 (1976)], és a benzhidril-amino funkciós csoportok bevitelére szolgáló reakciók [Pietta et al., Journal of the Chemical Society, 650 (1970)] a legszélesebben alkalmazott módszerek. Természetétől függetlenül a funkciós csoport célja normális körülmények között az, hogy egy lehorgonyzó kötést hozzanak létre a kopolimer szilárd hordozó és az első, a szilárd hordozóhoz kapcsolandó aminosav C-terminálisa között. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a horgonyzó kötések kialakulhatnak a szilárd hordozó és az aminosav N-terminálisa között. Általában kényelmes, ha a funkciós csoportok „koncentrációját” mmol/g egységben fejezzük ki. Más bevezetett reaktív funkciós csoport lehet például a 4-metil-benzhidril-amino- és a 4-metoxi-benzhidril-amino-csoport. Az összes ilyen kidolgozott módszert elvileg alkalmazhatjuk a jelen találmány szerint. A PNA-szintézis előnyös módszereiben az indító funkciós csoportként amino-metil-csoportot használunk, mivel az amino-metil-csoport különösen előnyös a „spacer” (helykitöltő) vagy „tartó” csoportok szempontjából, mivel az amino-metil funkciós csoport rendelkezik megfelelő reakcióképességgel ah9
HU 221 003 Bl hoz, hogy amidkötést alakítson ki egy karbonsavcsoporttal a spacerképzó reagens egyik végén. Nagyszámú megfelelő spacer- és tartóképző bifunkciós reagenst írtak le [Bárány et al., Int. J. Peptide Rés., 30, 705 (1987)], különösen olyan reagenseket, amelyek az amino-metil-fúnkcióval szemben rendelkeznek reakcióképességgel, azaz például az amino-metil-fúnkció. A jellegzetes bifunkciós csoportok közé tartoznak a 4(halogén-alkil)-(rövid szénláncú alkén)-savak, azaz a
4-(bróm-etil)-fenil-ecetsav, a Boc-amino-acil-4-(oximetil)-aril-(rövid szénláncú alkán)-savak, azaz például a Boc-amino-acil-4-(oxi-metil)-fenil-ecetsav, az NBoc-p-acil-benzhidril-aminok, azaz az N-Boc-pglutaroil-benzhidril-amin, az N-Boc-4’-(rövid szénláncú alkoxi)-p-acÍl-benzhidril-aminok, azaz az N-Boc-4’metoxi-p-glutaroil-benzhidril-amin és a 4-hidroximetil-fenoxi-ecetsav. Az egyik típusú, a találmány szerint különösen megfelelő spacer csoport a fenilacetamido-metil (Pam) tartó [Mitchell and Merrifield, Journal of Organic Chemistry, 41, 2015 (1976)], amely a 4-fenil-acetamido-metil-csoport elektronszívó hatása következtében körülbelül százszor stabilabb, mint a klasszikus benzil-észter-kötés, a Boc-amino védőcsoportot eltávolító reagenssel, a TFA-val szemben.
Bizonyos funkciós csoportok (azaz például a benzhidril-amino-, 4-metil-benzhidril-amino és 4-metoxibenzhidril-amino-csoportok), amelyeket a szintetizált PNA-láncnak a szilárd hordozóról való lehasítása miatt építhetünk be, oly módon, hogy a PNA-lánc Cterminálisa amid formában van, nem igénylik spacer csoport bevitelét. Bármely ilyen funkciós csoport előnyösen alkalmazható a találmány szerint.
Egy alternatív stratégia a spacer vagy tartó csoportok bevitelére az úgynevezett „előregyártott tartó” stratégia [Tam et al., Synthesis, 955-957 (1979)], amely teljes kontrollt biztosít az első aminosav kapcsolása felett, és kizárja a komplikációk lehetőségét, amely a peptid- vagy PNA-szintézishez nem kapcsolódó, nemkívánatos funkciós csoportok jelenlétéből származik. Ebben a stratégiában a spacer vagy tartó csoportok, ugyanazok a fajták, amelyeket az előzőkben ismertettünk, reagálnak azzal az első aminosawal, amelyet a szilárd hordozóhoz akarunk kapcsolni, az aminosav védett a nitrogénen, és adott esetben a másik oldalláncon is védve van, amely nem lényeges a kívánt PNA-lánc növekedése szempontjából. Tehát azokban az esetekben, amikor a spacer vagy tartó csoportra szükség van, az első, a szilárd hordozóhoz kapcsolandó csoportot vagy egy spacer csoport szabad reakcióképes végéhez kapcsoljuk, amelyet az először bevitt funkciós csoporthoz (például egy amino-metil-csoporthoz) kötöttünk, illetve reagáltathatjuk a spacerképző reagenssel. A spacer-képző reagenst azután az először bevitt funkciós csoporttal reagáltatjuk. Más használható rögzítő séma például a „többszörösen lekapcsolható” gyanták [Tam et al., Tetrahedron Lett., 4935 (1979); Journal of the American Chemical Society, 102, 611 (1980), Tam, Journal of Organic Chemistry, 50, 5291 (1985)], amelyek a lekapcsolásnak több mint egy módját teszik lehetővé, és ennélfogva sokkal nagyobb flexibilitást biztosítanak a szintézis tervezésében.
Az N-atom megvédésére megfelelő a terc-butil-oxikarbonil-csoport (Boc) [Carpino, Journal of the American Chemical Society, 79, 4427 (1957); McKay et al., Journal of the American Chemical Society, 79, 4686 (1957); Anderson et al., Journal of the American Chemical Society, 79, 6180 (1957)], általában benzilalapú csoportokkal kombinálva az oldalláncok megvédése céljából, valamint a 9-fluor-enil-metil-oxikarbonil-csoport (Fmoc) [Carpini et al., Journal of the American Chemical Society, 92, 5748 (1970); Journal of Organic Chemistry, 37, 3404 (1972)], általában tercbutil-csoporttal (tBu) kombinálva bármely oldallánc megvédése céljából, jóllehet számos egyéb lehetőség létezik, amelyek jól ismertek a szokásos szilárd fázisú peptidszintézisben. Tehát számos egyéb hasznos amino-védőcsoport létezik, ilyen például az Adoc [Hass et al., Journal of the American Chemical Society, 88, 1988 (1966)], a Bpoc [Sieber, Helv. Chem. Acta, 51, 614 (1968)], az Mcb [Brady et al., Journal of Organic Chemistry, 42, 143 (1977)], a Bic [Kemp et al., Tetrahedron, 4624 (1975)]; az o-nitro-fenil-szulfenilcsoport (Nps) [Zervas et al., Journal of the American Chemical Society, 85, 3660 (1963)] és a ditiaszukcinoil-csoport (Dts) [Bárány et al., Journal of the American Chemical Society, 99, 7363 (1977)]. Ezek az amino-védőcsoportok, különösen azok, amelyek a széles körben alkalmazott uretánfúnkcióra alapulnak, sikeresen megakadályozzák a racemizációt (amely a könnyen képződő oxazolinon (aclakton)-intermediereken keresztül játszódik le) [Goodman et al., Journal of the American Chemical Society, 86, 2918 (1964)] a legtöbb α-aminosav kapcsolása során. Az ilyen aminovédőcsoportok mellett számos, egyébként „értéktelen” nem uretán típusú amino-védőcsoport használható a PNA-molekulák összeállításakor, különösen az akirális egységekből felépülőknél. így nemcsak az előzőkben említett amino-védőcsoportok (vagy azok, amelyek bármelyik ilyen csoportból származnak) jól használhatók a találmány végrehajtása során, hanem bármely olyan amino-védőcsoport, amely nagymértékben kielégíti az alábbi elvárásokat:
(1) stabil az enyhe savakkal szemben (nem támadják meg jelentős mértékben a karboxilcsoportok), (2) stabil az enyhe bázisokkal vagy nukleofilekkel szemben (nem támadják meg jelentős mértékben a kérdéses aminocsoportok);
(3) ellenáll az acilezésnek (nem támadják megjelentős mértékben az aktivált aminosavak); emellett (4) a védőcsoportnak majdnem teljesen eltávolíthatónak kell lennie, káros mellékreakciók nélkül; és (5) a bejövő aminosav optikai integritását, ha egyáltalán létezik ilyen, nagyon magas fokon meg kell őriznie a kapcsolás során.
Végezetül, az oldallánc védőcsoportok megválasztása általában az amino-védőcsoport megválasztásától függ, mivel az oldallánc funkciós csoportoknak ki kell bírniuk az amino-védócsoportok ismételt elválasztási ciklusát. Ez igaz akkor is, ha a PNA-molekulák kémiai összeállítása például az amino- és oldallánc-védócsoportok savakkal szembeni különböző stabilitásán ala10
HU 221 003 Bl pul (ez a helyzet például az előzőkben említett ,3ocbenzil” megközelítésben), illetve egy ortogonális, azaz kemoszelektív védelmi sémát alkalmaz (ez a helyzet például az előzőkben említett „Fmoc-tBu” megközelítésben).
Az első aminosav kapcsolását követően, a szilárd fázisú szintézis következő lépése a kívánt PNA-lánc szisztematikus kifejlesztése. A kifejlesztés magában foglalja az ismételt védőcsoport eltávolítás/kapcsolás ciklust. Az ideiglenes védőcsoportot, azaz például az utolsónak kapcsolt aminosav Boc vagy Fmoc csoportját kvantitatíve eltávolítjuk egy megfelelő kezeléssel, például acidolízissel, mondjuk trifluor-ecetsavval a Boc esetében, illetve bázikus kezeléssel, mondjuk piperidinnel a Fmoc esetében, az N-terminális aminíünkció felszabadítása érdekében.
A következő, alkalmas N-védett aminosavat azután az utoljára kapcsolt aminosav N-terminálisához kapcsoljuk. Ezt a kapcsolást egy aminosav C-terminálisa és az utoljára kapcsolt aminosav N-terminálisa között számos különböző módon elérhetjük. Például a bejövő aminosav karboxilcsoportját közvetlenül reagáltathatjuk az utoljára kapcsolt aminosav N-terminálisával, egy kondenzációs reagens, például diciklohexil-karbodiimid (DCC) [Sheehan & Hess et al., Journal of the American Chemical Society, 77, 1067 (1955)] és diizopropilkarbodiimid (DIC) [Sraantakis et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 73, 336 (1976)] segítségével vagy azoknak a származékaival. Egy másik módszer szerint a kötést úgy lehet végrehajtani, hogy a bejövő aminosavat a számos ismert módszer egyikének segítségével készített aktivált karboxicsoport formájában kötjük meg, beleértve egy aktív észterszármazék kezdeti kialakítását, ilyen például a 2,4,5-triklór-fenil-észter [Pless et al., Helv. Chim. Acta, 46, 1609 (1963)], a ftálimid-észter [Nefkens et al., Journal of the American Chemical Society, 83, 1263 (1961)], a pentaklór-fenilészter [Kupryszewski, Rocz. Chem., 35, 595 (1961)], a pentafluor-fenil-észter [Kovács et al., Journal of the American Chemical Society, 85, 183 (1963)], az o-nitrofenil-észter [Bodánszky, Natúré, 175, 685 (1955)], az imidazol-észter [Li et al., Journal of the American Chemical Society, 92, 7608 (1970)], a 3-hidroxi-4-oxo3,4-dihidrokinazolin-észter (Dhbt-OH) [Konig, et al., Chem. Bér., 103, 2024 és 2034 (1973)], illetve egy anhidrid, például egy szimmetrikus anhidrid kezdeti kialakítása [Wieland et al., Angew. Chem., Interferon. Ed. Engl., 10, 336 (1971)]. A benzotriazolil-N-oxi-trisz-dimetil-amino-foszfónium-hexafluor-foszfatot (BOP) „Castro reagens” [Rivaille et al., Tetrahedron, 36, 3413 (1980)] akkor javasoljuk, ha szekunder aminocsoportokat tartalmazó PNA-molekulákat kell összerakni. Végezetül, az újabban ismertetett aminosav-fluoridokkal analóg aktivált PNA-monomerek [Carpino, Journal of the American Chemical Society, 112, 9651 (1990)] nagyon ígéretesek a PNA-szintézisben való alkalmazás szempontjából is.
A kiválasztott PNA-lánc összeállítását követően, beleértve a védőcsoportokat is, a következő lépésben a PNA-lánc aminosavegységeinek védőcsoportjait távolítjuk el, illetve lehasítjuk a szintetizált PNA-t a szilárd hordozóról. Ezek a folyamatok lényegében szimultán léphetnek fel, és így kaphatjuk meg a szabad PNAmolekulát a kívánt formában. Egy másik módszer szerint azokban az esetekben, amikor két külön szintetizált PNA-molekulát kondenzáltatunk, lehetséges, hogy egy megfelelő spacer csoportot választunk a szintézis kezdetén, hogy a kívánt PNA-láncokat a megfelelő szilárd hordozóról lehasítsuk (mindkét peptidlánc tartalmazza még az oldallánc-védőcsoportokat), és végezetül eltávolítjuk az oldallánc-védőcsoportokat, például a két oldalláncban védett peptidláncnak egy hosszabb PNA-lánc kialakítása érdekében végzett kapcsolása után.
Az előzőkben említett ,3oc-benzil” védelmi sémában az oldalláncok végső védőcsoport-mentesítése és a PNA-molekula felszabadítása a szilárd hordozóról a legtöbbször úgy hajtható végre, hogy erős savat használunk, például vízmentes HF-ot [Sakibara et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 38, 4921 (1965)], bór-trisz(trifluor-acetátot) [Pless et al., Helv. Chim. Acta, 46, 1609 (1973)] és szulfonsavat, például trifluor-metánszulfonsavat és metánszulfonsavat [Yajima et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm., 107 (1974)]. Ez a szokásos erős sav (például a vízmentes HF) védócsoport-eltávolítási módszer nagyon reakcióképes szénkationokat eredményez, ami a PNAláncban levő érzékeny csoportok alkilezéséhez és acilezéséhez vezet. Az ilyen mellékreakciókat csak részben lehet tisztítóanyagok jelenlétével elkerülni, ilyenek például az anizol, a fenol, dimetil-szulfid és merkaptoetanol, ennek következtében a szulfid részvételével lezajló acidolitikus SN2 védócsoport-eltávolítási módszert [Tam et al., Journal of the American Chemical Society, 105, 6442 (1983); Journal of the American Chemical Society, 108, 5242 (1986)], az úgynevezett „alacsony” módszert, amely eltávolítja a veszélyes szénkationokat semleges szulfóniumsók képzése közben, gyakran alkalmazzák a peptid és PNA szintézisében, akár egyedül, akár a „magas” módszerrel kombinálva. Ritkábban, speciális esetekben más módszereket használnak a védőcsoportok eltávolítására és/vagy a PNA-szilárd hordozó kötés végső elhasítására, ilyen például a báziskatalizált alkoholízis [Barton et al., Journal of the American Chemical Society, 95, 4501 (1973)] az ammonolízis, valamint a hidrazinolizis [Bodánszky et al., Chem. Ind., 1423 (1964)], a hidrogenolízis [Jones, Tetrahedron Lett., 2853 (1977); Schlatter et al., Tetrahedron Lett., 2861 (1977)] és a fotolízis [Rich and Gurwara, Journal of the American Chemical Society, 97, 1575 (1975)].
Végezetül, a „normál” peptidek kémiai szintézisével szemben az akirális PNA-k láncának lépésenkénti felépítése, például azoké, amelyek az amino-etil gerincegységeken alapulnak, kiindulhat mind az Nterminálisról mind a C-terminálisról, mivel a kapcsolási reakciók racemizációmentesek. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy jóllehet a Cterminálison kezdődő szintézisek általában védett savcsoportokat, valamint szabad vagy aktivált savcsoportokat használnak, az N-terminálison kezdődő szintézisek rendszerint védett savcsoportokat és szabad vagy aktivált aminocsoportokat használnak.
HU 221 003 Bl
Annak a felismerésnek az alapján, hogy a legtöbb lépés azonos a szilárd fázisú peptidszintézis szintetikus ciklusában (csakúgy mint a szilárd fázisú PNAszintézis esetében) egy új hordozót (jele PEPS) vezettek be újabban a gyakorlatba [Berg et al., Journal of the American Chemical Society, 111, 8024 (1989); valamint a WO 90/02749 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés] nagyszámú peptid készítésének megkönnyítésére. Ez a hordozó egy poletilén (PE)-film, hosszú szénláncú polisztirol (PS)-láncokkal (a molekulatömegük körülbelül 106). A film töltési kapacitása olyan magas, mint a gyöngy formájú hordozóé, de a PEPS-nek megvan az a további rugalmassága, hogy szimultán alkalmas többszörös szintézisekre. Tehát a szilárd fázisú peptidszintézis egy új konfigurációjában a PEPS-film diszkrét, jelzett lapok formáját veszi fel, és ezek közül mindegyik egy külön résznek számít. A szintetikus ciklusok összes azonos lépéseiben a lapokat együtt tartjuk egy reakcióedényben, hogy ezzel lehetővé tegyük több különböző peptid egyidejű előállítását, olyan sebességgel, amely közel van ahhoz, amely sebességgel egyetlen peptidet lehet előállítani a szokásos módszerekkel. Ezért nyilvánvaló, hogy a PEPS-film-hordozó, amely kapcsoló- vagy spacercsoportokat tartalmaz, a kérdéses kémiához adaptálva, különösen értékes lehet több különböző PNA-molekula szintézisében; ezeket elvileg egyszerű szintetizálni, mivel csak négy különböző reakciókörülményre van szükség, azaz egy-egy a négy különböző „pszeudonukleotid”-egységhez. Tehát a PEPS-film-hordozót sikeresen vizsgálták számos, párhuzamosan és lényegében hasonló módon végzett PNA-szintézisben. A termelési százalék és a PEPS-ből kapott termékek minősége összehasonlítható azokéval, amelyeket a klasszikus polisztirolgyöngy hordozóval kapunk. Emellett az egyéb geometriájú PEPS-polimer, például a filc, kötött háló, pálcika vagy mikroporózus lemez alkalmazása sem jelent semmi korlátozást a szintetikus hatékonyságban.
Két egyéb, nagyszámú peptid szimultán szintézisére használt módszer is használható több különböző PNAmolekula szintézisére. Az első ezen módszerek közül [Geysen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 3998 (1984)] akrilsawal ojtott polietilénpálcákat és 96 nyílásos mikrotiter lemezeket használ a növekedő peptidláncok immobilizálására, és a térben korlátozott szintézis végrehajtására. Jóllehet nagyon hatékony módszer, de hátránya az, hogy csak mikrogramm mennyiségben alkalmazható. A második módszer [Houghten, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 5131 (1985)] egy „teászacskót” használ, amely a hagyományos polimergyöngyöket alkalmazza. A találmányban alkalmazható egyéb megfelelő módszer a többszörös peptid- vagy PNA-szintézisre lehet például a két különböző sűrűségű hordozó egyidejű alkalmazása [Tregear, in „Chemistry and Biology of Peptides”, J. Meienhofer, ed., Ann Arbor Sci. Publ., Ann Arbor, 175-178 (1972)] kombinálva a reakcióedényeket egy többszörös [Gorman, Analytical Biochemistry, 136, 397 (1984)], többoszlopos szilárd fázisú szintézissel [Krchnak et al., Interferon. J. Peptide Protein Rés., 33,
209 (1989); Hóim and Meldal, in „Proceedings of the 20th European Peptide Symposium”, G. Jung and E. Bayer, eds., Walter de Gruyter & Co. Berlin, 208-210 (1989)], valamint a cellulózpapír alkalmazása [Eichler et al., Collect. Czech. Chem. Comm., 54, 1746 (1989)].
Miközben a szokásos térhálós sztirol/divinil-benzol kopolimer hordozót és a PEPS-hordozót tartjuk jelenleg a szilárd fázisú PNA-szintézis számára előnyösnek a szintén alkalmazható hordozók egy nem korlátozó jellegű listáját az alábbiakban adjuk meg:
(1) Ν,Ν’-biszakriloil-etilén-diaminnal - beleértve ismert mennyiségű terc-butoxi-karbonil-p-alanilN’-akriloil-hexametilén-diamint is - térhálósított dimetil-akril-amid kopolimeralapú részecskék. Számos spacer molekulát lehet hozzáadni a β-alanilcsoporton keresztül, majd ezt követik az aminosav alegységek. Emellett, a β-alanilt tartalmazó monomert a polimerizáció során helyettesíteni lehet akriloil-szarkozinnal, gyöngyök kialakítása céljából. A polimerizációt a gyöngyök reakciója követi etilén-diaminnal, olyan részecskék kialakítása céljából, amelyek primer aminokat tartalmaznak kovalensen kötött funkciós csoportként. A poli(akril-amid)-alapú hordozók viszonylag sokkal hidrofilebbek mint a polisztirolalapú hordozók, és általában poláris aprotikus oldószerekben használják, beleértve a dimetil-formamidot, dimetil-acetamidot, Nmetil-pirrolidont és hasonlókat [Atherton et al., Journal of the American Chemical Society, 97, 6584 (1975); Bioorg. Chem., 8, 351 (1979); J. C. S. Perkin I 538 (1981)];
(2) a szilárd hordozók egy másik csoportja szilikáttartalmú részecskéken alapul, például porózus üveggyöngyökön és szilikagélen. A triklór-[3-(4-klórmetil)-fenil]-propil-szilán és a porózus üveggyöngyök reakciótermékének egyik példáját [Parr and Grohmann, Angew. Chem. Internál. Ed., 11, 314 (1972)] „PORASIL” márkanévvel árulja a Waters Associates (Framingham, MA, USA). Hasonlóképpen, az 1,4-dihidroxi-metil-benzol és a szilikát egy monoészteréről („BIOPAK” márkanévvel árulja a Waters Associates) kiderült, hogy hasznos ebben a reakcióban [Bayer and Jung, Tetrahedron Lett., 4503 (1970)];
(3) a hasznos szilárd hordozó egy harmadik általános típusát úgy határozhatjuk meg, mint amely két fő adalékanyag keverékéből áll: egy gyanta, és egy másik anyag, amely lényegében szintén semleges az alkalmazott szintézis reakciókörülményei között. Egy példa a keverékre [Scott et al„ J. Chrom. Sci., 9, 577 (1971)], ebben reaktív klór-metil-csoportokat tartalmazó hidrofób, térhálósított sztirolpolimerrel borított üveggyöngyöket alkalmaznak, ezt a Northgate Laboratories, Inc. (Hamden, CT, USA) szállítja. Egy másik keverék fluorozott etilénpolimert tartalmaz, amelyet polisztirollal ojtottak [Kent and Merrifield, Israel J. Chem., 17, (1978); van Rietschoten in „Peptides 1974”, Y. Wolman, Ed., Wiley and Sons, New York, 113-116 (1975)];
(4) a PEPS-től eltérő folytonos szilárd hordozók, például a gyapotlapok [Lebl and Eichler, Peptide Rés., 2, 232 (1989)] és a hidroxi-propil-akriláttal borított
HU 221 003 BI polipropilénmembránok [Daniels et al., Tetrahedron Letters, 4345 (1989)] is alkalmasak a PNA-szintézisre.
Akár automatizáltan, akár manuálisan végezzük, a szilárd fázisú PNA-szintézist a találmány szerint általában sarasonként végezzük. A legtöbb szintézis azonban ugyanolyan jól végezhető folyamatos rendszerben is, ahol a hordozót oszlopokba töltjük [Bayer et al., Tetrahedron Letters, 4503 (1970); Scott et al., J. Chromatogr. Sci., 9, 577 (1971)]. Ami a folyamatos szilárd fázisú szintézist érinti, a merev poli-(dimetil-akrilamid)-Kieselgél hordozó [Atherton et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1151 (1981)] különösen jól használhatónak tűnik, de egyéb értékes konfigurációt is kidolgoztak, például a standard kopoli-(sztirol-l%divinil-benzol) hordozóra [Krchnak et al., Tetrahedron Letters, 4469 (1987)].
Jóllehet jelenleg a szilárd fázisú technikát tartják előnyösnek a PNA-szintézisre, más módszerek, illetve azok kombinációja például a szilárd fázisú technikával is jól alkalmazható:
(1) a klasszikus folyadékfázisú módszerek a peptidszintézishez [Bodanszky, „Principles of Peptide Synthesis”, Springer-Verlag, Berlin-New York (1984)], akár lépésenként való összeállításhoz, akár szegmens/fragmens kondenzációhoz, különösen megfontolandók, főleg, ha nagy mennyiségű PNA-vegyület előállításáról (gramm, kilogramm vagy éppen tonnák) van szó;
(2) az úgynevezett „folyadékfázis”-stratégia, amelyben oldható polimerhordozókat, például lineáris polisztirolt [Shemyakin et al., Tetrahedron Letters, 2323 (1965)] és polietilénglikolt (PEG) [Mutter and Bayer, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 13, 88 (1974)] alkalmaznak, szintén jól használható;
(3) random polimerizáció [Odian, „Principles of Polimerization”, McGraw-Hill, New York (1970)], amely számos különböző molekulatömegű („polidiszperz”) peptid és PNA-molekulákat eredményez, különösen jól alkalmazható olyan célokra, mint például vírusellenes hatásra való szűrővizsgálat;
(4) a polimeralapú aminosavaktív észterek használatán alapuló technika [Fridkin et al., Journal of the American Chemical Society, 87, 4646 (1965)], amelyre néha úgy hivatkoznak mint a „fordított Merrifieldszintézisre” vagy „polimerreagens-szintézisre” a közbenső termékek izolálásának és tisztításának előnyét biztosítja, és ezáltal különösen alkalmas módszer a közepes méretű, adott esetben védett PNA-molekulák előállítására, amelyeket azután nagyobb PNA-molekulák előállítására lehet használni fragmenskondenzációval;
(5) elképzelhető, hogy a PNA-molekulákat enzimatikusan is össze lehet rakni, például proteázokkal vagy ezek új specifitással rendelkező származékaival (amelyeket például mesterséges eszközökkel, mondjuk génsebészeti módszerekkel állíthatunk elő). Az is elképzelhető, hogy „PNA-ligázokat” fejlesztenek ki számos PNA-fragmens nagyméretű PNA-molekulává való kondenzációjára;
(6) mivel tulajdonképpen bármely kiválasztott molekulával szemben előállíthatok antitestek, az újabban kifejlesztett katalitikus antitestek (abzimek), amelyeket egyszerre két csoport is felfedezett, Lemer csoportja [Tramantano et al., Science, 234, 1566 (1986)], valamint Schultz csoportja [Pollack et al., Science, 234, 1570 (1986)}, szintén lehetnek jelöltek arra, hogy PNAmolekulákat rakjanak velük össze. Jelentős sikereket értek el olyan abzimek előállításával, amelyek az aciltranszfer reakciókat katalizálják [Shokat et al., Natúré, 338, 269 (1989); valamint a cikkben található referenciák], Végezetül, teljesen mesterséges enzimeket fejlesztett ki legújabban Stewart csoportja [Hahn et al., Science, 248,1544 (1990)], amelyek a PNA-szintézis követelményeinek megfelelően fejleszthetők. Az olyan általánosan használt enzimek, ligázok és katalitikus antitestek tervezése, amelyek képesek specifikus kapcsolási reakciók végzésére, sokkal könnyebben elérhető a PNAszintézishez mint a „normál”-peptidszintézishez, mivel a PNA-molekulák gyakran csak négy különböző aminosavat (egyet-egyet a négy természetes nukleobázishoz) tartalmaznak, szemben a húsz természetes aminosawal, amelyek a peptidek alkotóelemei (proteinogén aminosavak). Összefoglalva, nincs olyan egyedi stratégia, amely teljesen alkalmas egy specifikus PNA-molekula szintézisére, ezért néha a legjobb eredményt a módszerek kombinációja adja.
A találmány tárgya továbbá eljárás a peptid-nukleinsavak alkalmazására gyógyító- vagy megelőző kezelésekben. A valószínű gyógyászati és megelőző célpontok közé tartozik a herpesz szimplex vírus (HSV), a humán papillómavírus (HPV), a humán immunhiányt okozó vírus (HÍV), a Candida albicans, az influenzavírus, a citomegalovírus (CMV), az intracelluláris adhéziós molekulák (ICÁM), az 5-lipoxigenáz (5-LO), a foszfolipáz A2 (PLA2), a proteinkináz C (PKC) és a RAS onkogén. A potenciális célpontok közé tartozik a szem, az ajak, a genitáliák herpeszes fertőzése, valamint a szisztémás herpesz szimplex I és II fertőzések; genitális szemölcsök; nyaki rák; általános szemölcsök; Kaposiféle szarkóma; AIDS; bőrfertőzések és szisztémás gombafertőzések; influenza, tüdőgyulladás; retinitisz és tüdőgyulladás immunszuppresszált betegekben; mononukleózis; szem-, bőr- és szisztémás gyulladás; keringési betegségek; rák; asztma; pszoriázis; keringési összeomlás; szívinfarktus; emésztőszervi megbetegedések; vesebajok; reumatoid artritisz; csontritkulás; akut hasnyálmirigy-gyulladás; szeptikus sokk és Crohn-féle betegség.
A gyógyászati vagy megelőző kezeléshez a találmány szerinti peptid-nukleinsavakat egy gyógyászati készítménybe formulázhatjuk, amely tartalmazhat hordozókat, sűrítőket, hígítókat, puffereket, konzerválószereket, felületaktív anyagokat és hasonlókat. A gyógyászati készítmények tartalmazhatnak egy vagy több aktív adalék anyagot, azaz például antimikrobiális hatóanyagokat, gyulladáscsökkentő anyagokat, fájdalomcsillapítókat és hasonlókat a peptid-nukleinsav mellett.
A gyógyászati készítményt számos különböző módon lehet bejuttatni a szervezetbe, attól függően, hogy helyi vagy szisztémás kezelésre van-e szükség, valamint a kezelendő felülettől függően. Az adagolást vé13
HU 221 003 Bl gezhetjük topikálisan (beleértve a szembe való adást, a vaginális, rektális, intranazális adagolást), szájon át, belégzéssel vagy parenterálisan, például intravénás vagy szubkután, intraperitonális vagy intramuszkuláris injekcióban.
A topikális kezeléshez készített készítmények lehetnek kenőcsök, oldatok, krémek, gélek, cseppek, kúpok, spray-k, folyadékok és porok. A szokásos gyógyászati hordozók, vizes, por- vagy olajalapok, sűrítők, és hasonlók szintén szükségesek vagy kívánatosak lehetnek.
Az orális beadásra készített készítmények közé tartoznak a porok vagy granulátumok, vizes vagy nemvizes szuszpenziók vagy oldatok, kapszulák, zacskók vagy tabletták. Sűrítők, ízanyagok, hígítók, emulgeálószerek, diszpergáló segédanyagok vagy kötőanyagok is kívánatosak lehetnek.
A parenterális beadásra szánt készítmények lehetnek steril vizes oldatok, amelyek tartalmazhatnak puffereket, hígítóanyagokat és más megfelelő adalék anyagokat is.
A dózis nagysága függ a kezelendő állapot súlyosságától és reagálóképességétől, de normális körülmények között napi egy vagy két dózis az elfogadott, a kezelés tartama pedig néhány naptól néhány hónapig tarthat, illetve addig, ameddig a gyógyulás elérhető, vagy a betegség enyhülése be nem következik. A szakterületen jártas szakember könnyen meg tudja határozni az optimális dózisokat, a dózisok formáját és az ismétlődés sűrűségét.
Az ilyen típusú kezeléseket számos különböző szervezettel végezhetjük, amelyek az egysejtű prokariótáktól és eukariótáktól a többsejtes eukarióta szervezetekig változhatnak. Bármely szervezetnél, amely alkalmazza a DNS-RNS transzkripciót vagy az RNS-fehérjetranszlációt, az öröklés alapvető részeként, a metabolikus vagy sejtes szabályozás érzékeny a találmány szerinti gyógyászati és/vagy megelőző kezelésre. Láthatóan különböző szervezetek, beleértve a baktériumokat, élesztőket, protozoákaζ algákat, az összes növényt, az összes magasabb rendű állati életformát, beleértve a meleg vérű állatokat, kezelhető ezzel az eljárással. Továbbá, mivel egy többsejtes eukarióta minden egyes sejtje kezelhető, mivel mindegyikben van mind DNS-RNS transzkripció és RNS-fehéqe-transzláció, a sejtaktivitásuk integrális részeként. Emellett számos eukarióta sejtszerv (például a mitokondriumok és kloroplasztok) is rendelkezik a transzkripciós és transzlációs mechanizmussal. Tehát egyedi sejtek, sejtpopulációk vagy sejtszervek is beletartoznak a szervezetek azon körébe, amelyet a terápiás vagy diagnosztikus foszforotioát oligonukleotidokkal lehet kezelni. A továbbiakban a gyógyítás vagy terápia jelentése az, hogy megszüntetjük a beteg állapotot, oly módon, hogy egy szervezetet elpusztítunk, illetve szabályozzuk a hibás vagy veszélyes sejtnövekedést vagy expressziót.
A találmány tárgya továbbá a PNA-molekulák előnyös alkalmazása szilárd fázisú biokémiában [„SolidPhase Biochemistry - Analytical and Synthetic Aspects”, W. H. Scouten, ed., John Wiley & Sons, New York (1983)], nevezetesen szilárd fázisú biorendszerekben, különösen bioesszékben vagy szilárd fázisú technikákban, amelyek a komplementer nukleinsavak diagnosztikus kimutatásával/mérésével vagy affinitástisztításával foglalkoznak [„Affinity Chromatography - A Practical Approach”, P. D. G. Dean, W. S. Johnson and E. A. Middle, eds., IRL Press Ltd., Oxford (1986); „Nucleic Acid Hibridization - A Practical Approach”, B. D. Hames and S. J. Higgins, IRL Press Ltd., Oxford (1987)]. A manapság ilyen bioesszék vagy tisztítási technikák kivitelezésére használt módszerek majdnem kizárólag „normális”, vagy enyhén módosított oligonukleotidokat alkalmaznak fizikailag abszorbeálva, vagy egy, lényegében állandó kovalens kötéssel a szilárd hordozóhoz, például cellulózhoz, üveggyöngyökhöz (beleértve a szabályos pórusméretűeket is) rögzítve [Mizutani et al., J. Chromatogr., 356, 202 (1986)], „Sephadex” „Sepharose”, agaróz, poli(akril-amid), porózus alumínium-oxid-részecskék, hidroxi-alkilmetakrilát-gélek, dióihoz kötött szilikátok, porózus kerámiák vagy folytonos anyagok, azaz például a nejlonból vagy nitrocellulózból készült szűrőkorongok. Az egyik példában az oligo-dT cellulózgyöngyöket alkalmazzák a poliA farkat tartalmazó mRNS-affinitás izolálására [Gilham in Methods in Enzymology, L. Grossmann and K. Moldave, eds., 21, D rész, 191. old., Academic Press, New York and London (1971)]. Az összes említett módszer alkalmazható a találmány megvalósítása során. Ha azonban lehetséges, akkor a kérdéses molekuláknál a kovalens kötést részesítjük előnyben a fizikai adszorpcióval szemben, mivel az utóbbi megközelítésnek az a hátránya, hogy néhány rögzített molekulát le lehet mosni (deszorbeálódnak) a hibridizáció vagy az affinitási eljárás során. Tehát kevéssé lehet szabályozni, hogy egy, a hordozóanyag felületére adszorbeálódott anyag mennyire vész el a különböző kezelések során, amelyeknek a hordozót kitesszük a bioesszé/tisztítási eljárás során. Ennek a problémának a súlyossága természetesen nagymértékben függ az adszorbeált és „szabad” molekulák közötti egyensúlytól. Bizonyos esetekben egyszerűen lehetetlen elfogadható pontosságú és/vagy reprodukálhatóságú mennyiségi meghatározást végezni. A hordozó testfolyadékokkal, vizes reagensekkel vagy mosóközegekkel végzett kezelése során elveszett adszorbeált molekulák mennyisége különösen a viszonylag kis molekulatömegű molekuláknál lesz várhatóan jelentős. Az oligonukleotidokkal szemben, a PNA-molekulákat egyszerűbben lehet a szilárd hordozóra rögzíteni, mivel erős nukleofil és/vagy elektrofil részeket tartalmaznak. Emellett az oligonukleotidok közvetlen összerakása a szilárd hordozón azzal a problémával küzd, hogy a rögzített molekulának nagyon alacsony a töltöttsége, főleg azoknak az anyagoknak az alacsony felszíni kapacitása miatt, amelyek lehetővé teszik a jelenleg legjobbnak ismert foszforamidit-kémia alkalmazását az oligonukleotidok készítésében [Beaucaga and Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981); Caruthers, Science, 232, 281 (1985)]. Ennek is az a problémája, hogy az alternatív foszfit-triészter-módszer alkalmazásával [Letsinger and Mahadevan, Journal of the American Chemical
HU 221 003 Bl
Society, 98, 3655 (1976)], amelyet a magas felszíni/töltési kapacitású szilárd hordozókra dolgoztak ki, csak viszonylag rövid oligonukleotidok állíthatók elő. Ami a szokásos szilárd fázisú peptidszintézist illeti, az utóbbi hordozók kiváló anyagok rögzített PNA-molekulák felépítéséhez (az oldallánc védőcsoportokat eltávolítják a szintetizált PNA-láncról anélkül, hogy elhasítanák a láncot a szilárd hordozóhoz rögzítő kötést). Tehát a különböző PNA-molekulák számára előnyt jelentenek az előzőkben említett szilárd fázisú technikák a komplementer nukleinsavakkal szemben mutatott sokkal magasabb (és még szekvenciaspecifikus) kötési affinitás miatt, valamint a kétszálú struktúrákban levő nukleinsavakkal szemben mutatott további egyedi szekvenciaspecifikus felismerés (és erős kötődés) miatt. Ezeket is nagy mennyiségben lehet felvinni a szilárd hordozóra, és ezzel tovább lehet fokozni a szilárd fázisú technika érzékenységét/kapacitását. Emellett bizonyos típusú, a PNA szilárd fázisú biokémiában való alkalmazására vonatkozó vizsgálatok is megközelíthetők, megkönnyíthetők, illetve nagymértékben felgyorsíthatók az újabban közölt „fénnyel irányított, térben irányítható, párhuzamos kémiai szintézis” technológiával [Fodor et al., Science, 251, 767 (1991)], ami egy olyan technika, amelynek során a szilárd fázisú kémiát és a fotolitográfiát kombinálják sok ezer, nagyon eltérő, de azonosítható, permanensen rögzített vegyületek (például peptidek) előállítására, lényegében szimultán.
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük.
A monomereket előnyösen a 13. ábrán vázolt általános séma szerint szintetizáljuk. Ez magában foglalja a (Boc-amino-etil)-glicin metil- vagy etil-észterének előállítását, a 24-26. példákban közölt védőcsoport beviteli/védőcsoport eltávolítási eljárás alkalmazásával. A timinmonomer szintézisét a 27-28. példákban közöljük, a védett citozinmonomer szintézisét pedig a 29. példában közöljük.
A védett adeninmonomer szintézise (14. ábra) magában foglalja az etil-bróm-acetáttal végzett alkilezést (30. példa), valamint a szubsztitúció helyének igazolását röntgen-krisztallográfiával, mivel azt a 9-es pozícióban akarjuk elérni. Az N6-aminocsoportot ezután benzil-oxi-karbonil-csoporttal védjük meg, az N-etilbenzil-oxi-karbonil-imidazol-tetrafluor-borát-reagens alkalmazásával (31. példa). A termékként kapott észter egyszerű hidrolízisével (32. példa) kapjuk az N6benzil-oxi-karbonil-9-karboxi-metil-adenint, amelyet azután a standardeljárásban használtunk (33-34. példa, 13. ábra). Az adeninmonomert azután két különböző PNA-oligomerbe építjük be (56., 57., 71. és 73. példa).
A védett G monomer szintézisét a 15. ábrán mutatjuk. A kiindulási anyagot, a 2-amino-6-klór-purint bróm-ecetsavval alkilezzük (35. példa), majd a klóratomot egy benzil-oxi-csoporttal helyettesítjük (36. példa). A keletkező savat kapcsoljuk a (Boc-amino-etil)glicin-metil-észterhez (a 26. példából) a PyBrop™ reagenssel, majd a kapott észtert hidrolizáljuk (37. példa). Az O6-benzil-csoportot eltávolítjuk a PNA-oligomerszintézis végső HF-hasítási lépésében. A hasítást azzal igazoljuk, hogy megtaláljuk a végső PNA-oligomer várt molekulatömegét, egy PNA-oligomerbe beépülve, diizopropil-karbodiimidet használva kondenzációs reagensként (55. és 71. példa).
Az A, C és D csoportok változásait (16. ábra) monomer építőkövek szintézisével, valamint a PNA oligomerekben való beépüléssel lehet igazolni.
Az egyik példa szerint a C csoport egy CH(CH3)csoport. A megfelelő monomer szintézisét a 17. ábrán mutatjuk be. Ez magában foglalja a Boc-védett 1-amino-2,3-propán-diol készítését (38. példa), amelyet peijodáttal hasítva kapjuk a boc-amino-acetaldehidet, amelyet a következő reakcióban közvetlenül felhasználunk. A boc-amino-aldehidet számos különböző aminnal lehet kondenzáltami; a 39. példában az alaninetil-észtert használjuk. A 40-42. példákban a megfelelő timinmonomereket készítjük el. A monomert egy nyolctagú oligomerbe építjük be (60. példa) a DCCkapcsolási eljárással (56. és 57. példa).
Egy másik példa szerint a D csoport egy (CH2)3-csoport. A megfelelő monomer szintézisét a 18A. ábrán mutatjuk be, valamint a 43-44. példákban közöljük.
Egy másik példa szerint az A csoport egy (CH2)CO-csoport. A megfelelő timinmonomer szintézisét a 18B. ábrán mutatjuk be, valamint a 46-48. példákban közöljük.
Egy másik példa szerint a C csoport egy (CH2)2-csoport. A timin- és védett citozinmonomerek szintézisét a 19. ábrán mutatjuk be, és a 49-54. példákban közöljük. Az egy egységet tartalmazó PNA-oligomerrel végzett hibridizációs kísérleteket a 61. és 81. példákban közöljük, ezek az affinitás jelentős csökkenését mutatják, de azt is, hogy a specifitás megmarad.
A kísérleti részben az alábbi rövidítéseket használjuk:
DMF: N,N-dimetil-formamid;
DCC: N,N-diciklohexil-karbodiimid;
DCU: N,N-diciklohexil-karbamid;
THF: tetrahidrofurán;
aeg: N-acetil-(2 ’ -amino-etil)-glicin;
pfp: pentafluor-fenil;
Boc: terc-butil-oxi-karbonil;
Z: benzil-oxi-karbonil;
NMR; mágneses magrezonancia; s: szingulett;
d: duplett;
dd: duplettek duplettje;
t: triplett;
q: kvartett;
m: multiplett;
b: széles;
δ: kémiai eltolódás.
Az NMR-spektrumokat vagy egy JEOL FX 90Q spektrométerrel vagy egy Bruker 250 MHz berendezéssel vesszük fel, belső standardként tetrametil-szilánt alkalmazva. A tömegspektrometriás méréseket egy MassLab vegyület 12-250 kvadrupol berendezéssel végezzük, amelyet egy VG FAB forrással és próbával láttunk el. Az olvadáspontokat Büchi olvadáspont15
HU 221 003 Bl berendezéssel határozzuk meg, és nem korrigáljuk. Az Ν,Ν-dimetil-formamidot 4-10’°m pórusméretű molekulaszitán szárítjuk, desztilláljuk, majd 4· 10-10m pórusméretű molekulaszitán tároljuk. A piridint (HPLC minőség) szárítjuk, majd 4 · 10-i°m pórusméretű molekulaszitán tároljuk. Az egyéb használt oldószer vagy a legmagasabb minőségi követelményeknek is eleget tesz, vagy felhasználás előtt ledesztilláljuk. A dioxánt felhasználás előtt bázikus alumínium-hidroxidon bocsátjuk át. A bocanhidridet, a 4-nitro-fenolt, a metil-bróm-acetátot, a benzil-oxi-karbonil-kloridot és a pentafluor-fenolt az Aldrich Chemical Company-tól vásároljuk. A timint, citozint, adenint a Sigamtól vásároljuk.
A vékonyréteg-kromatográfiát (Tlc) az alábbi oldószerrendszerekkel hajtjuk végre:
(1) kloroform: trietil-amin: metanol, 2:1:2;
(2) diklór-metán:metanol, 9:1;
(3) kloroform .metanol: ecetsav, 85:10:5.
A foltokat UV fényben (254 nm) tesszük láthatóvá, és/vagy pedig ninhidrinoldattal való permetezéssel (3 g ninhidrin 1000 ml 1-butanolban és 3- ml ecetsav), miután 5 percre 120 °C-on tartjuk, majd a permetezés után ismét 120 °C-on tartjuk.
1. példa terc-Butil-4-nitro-fenil-karbonát
29,14 g (0,275 mól) nátrium-karbonátot és 12,75 g (91,6 mmol) 4-nitro-fenolt keverünk össze 250 ml dioxánban. 20,0 g (91,6 mmol) Boc-anhidridet adunk az elegyhez 50 ml dioxánban. Az elegyet 1 óra hosszat visszafolyó hűtő alatt forraljuk, majd 0 °C-ra hűtjük, megszüljük, és egyharmadára betöményítjük, végül pedig 350 ml vízre öntjük 0 °C-on. Fél óra hosszat kevertetjük, majd a terméket szűréssel kinyeijük, vízzel mossuk, majd szárítószer felett csökkentett nyomáson szárítjuk.
Kitermelés: 21,3 g (97%); olvadáspont 73-74,5 °C (litt. 78,5-79,5 °C);
elemanalízis CnH13NP5 képletre: talált (számított)
C: 55,20 (55,23); H: 5,61 (5,48); N: 5,82(5,85)
2. példa (N’-Boc-2 ’-amino-etil)-glicin (2)
A címben szereplő vegyületet Heimer és munkatársai módszerének módosításával készítjük [Heimer et al., Int. J. Pept., 23, 203-211 (1984)]. 3,00 g (1;
25,4 mmol) N-(2-amino-etil)-glicint oldunk 50 ml vízben, 50 ml dioxánt adunk hozzá, majd a pH-t 11,2-re állítjuk 2 mol/1 NaOH hozzáadásával. 7,29 g (30,5 mmol) terc-butil-4-nitro-fenil-karbonátot oldunk 40 ml dioxánban, majd 2 óra alatt cseppenként az oldathoz adjuk, mialatt a pH-t 11,2-n tartjuk 2 mol/1 nátrium-hidroxiddal. A pH-t periodikusan 11,2-re állítjuk még három óra hosszat, majd az oldatot éjszakán át állni hagyjuk. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd a pH-ját óvatosan 3,5-re állítjuk 0,5 mol/1 sósav hozzáadásával. A vizes oldatot kloroformmal mossuk (3 χ 300 ml), a pH-t 9,5-re állítjuk 2 mol/1 nátrium-hidroxiddal, majd az oldatot csökkentett nyomáson (2000 Pa) szárazra pároljuk. A maradékot dimetil-formamiddal extraháljuk (25+2x10 ml), majd az extraktumot megszűrjük, a feleslegben levő só eltávolítására. Ennek eredményeképpen a címben szerepló vegyület egy oldatát kapjuk 60%-os kitermeléssel, 95%-nál nagyobb tisztaságban (vékonyréteg-kromatográfia, 1-es rendszer, előhívás ninhidrinnel, Rf=0,3). Az oldatot az alábbi Boc-aeg preparátumokban alkalmazzuk, további tisztítás nélkül.
3. példa
N-l-Karboxi-metil-timin (4)
Ez az eljárás eltér az irodalomban leírttól, de egyszerűbb, jó kitermelést ad, és nem hagy reagálatlan timint a termékben. 3,4 g (0,317 mól) timin és 87,7 g (0,634 mmol) kálium-karbonát 900 ml dimetilformamidban készült szuszpenziójához 30,0 ml (0,317 mmol) bróm-acetátot adunk. Az elegyet nitrogén alatt erősen kevertetjük egy éjszakán át. Az elegyet megszűrjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A szilárd maradékot 300 ml vízzel kezeljük, majd 12 ml 4 mol/1 sósavat adunk hozzá, 15 percig 0 °C-on kevertetjük, megszüljük, majd 2 χ 75 ml vízzel mossuk. A csapadékot 120 ml vízzel és 60 ml 2 mol/1 nátriumhidroxiddal mossuk, majd tíz percig forraljuk. Az elegyet 0 °C-ra hűtjük, megszűrjük, majd a címben szereplő tiszta vegyületet 70 ml 4 mol/1 sósav hozzáadásával kicsapjuk. A kitermelés szárítás (csökkentett nyomáson, szárítószer felett) után: 37,1 g (64%).
•H-NMR (90 MHz, DMSO-dJ δ: 11,33 ppm (s, IH,
NH); 7,49 (d, J=0,92 Hz, IH, AiH); 4,38 (s, 2H,
CH2); 1,76 (d, J=0,92 Hz, T-C//3).
4. példa
N-l -Karboxi-metil-timin-pentafluor-enil-észter (5)
10,0 g (4, 54,3 mmol) N-l-karboxi-metil-timint és 10,0 g (54,3 mmol) pentafluor-fenolt oldunk 100 ml dimetil-formamidban, majd 5 °C-ra hűtjük jeges vízben. 13,45 g (65,2 mmol) DCC-t adunk hozzá. Amikor a hőmérséklet 5 °C alá hűl, akkor a jeges vízfürdőt eltávolítjuk, és az elegyet 3 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük. A kicsapott DCU-t szűréssel eltávolítjuk, majd kétszer mossuk dimetil-formamiddal (2 χ 10 ml). Az egyesített szűrletet 1400 ml éterbe öntjük, majd 0 °C-ra hűtjük. 1400 ml petrolétert adunk hozzá, majd az elegyet éjszakán át állni hagyjuk. A címben szereplő vegyületet szűréssel izoláljuk, majd alaposan mossuk petroléterrel. Kitermelés: 14,8 g (78%). A termék elég tiszta ahhoz, hogy a következő reakciót elvégezzük vele, de analitikai mintát készítünk belőle 2-propanolból való átkristályosítással. Olvadáspont: 200,5-206 °C. Elemanalízis CI3H7F5N2O4 képletre: mért (számított)
C: 44,79 (44,59); H: 2,14 (2,01); N: 8,13 (8,00) FAB-módszer: 443 (M+l+glicerin), 351 (M+l). •H-NMR (90 MHz; DMSO-d6) δ: 11,52 ppm (s, IH,
NH); 7,64 (s, AiH); 4,99 (s, 2H, CH2); 1,76 (s, 3H,
Ctf3).
5. példa l-(Boc-aeg)-timin (6)
A fenti dimetil-formamid-oldathoz 7,08 ml (50,8 mmol) trietil-amint (5), majd 4,45 g (12,7 mmol)
HU 221 003 Bl
N- 1-karboxi-metil-timin-pentafluor-enil-észtert adunk. A kapott oldatot 1 óra hosszat kevertetjük. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és 20 percig 40 g kationcserélő anyaggal kezeljük („Dowex 50W X-8”). A kationcserélőt szűréssel eltávolítjuk, 2 χ 15 ml diklór-metánnal mossuk az oldatot, majd 1150 ml diklór-metánt adunk hozzá. A kapott oldatot telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd először vízsugárszivattyúval, majd olajszivattyúval létesített csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 50 ml vízzel kirázzuk, majd szárazra pároljuk. Ezt az eljárást még egyszer megismételjük. A maradékot ezután 75 ml metanolban oldjuk, majd 600 ml éter és 1,4 liter petroléter elegyébe öntjük. Éjszakán át való kevertetés után a fehér szilárd anyagot szűréssel izoláljuk, majd petroléterrel mossuk. Szárítószer felett csökkentett nyomáson szárítva 3,5 g (71,7%) anyagot kapunk. Olvadáspont 142-147 °C.
Elemanalízis C16H24N4O7 képletre: mért (számított)
C: 49,59(50,00);H: 6,34(6,29);N: 14,58(14,58).
'H-NMR (250 MHz, DMSO-dg) δ: Mivel a szekunder amidkötés körül korlátozott a rotáció, ezért számos jel megduplázódik 2:1 arányban (a listában mj-vel jelezzük a fő- és mi-vel a mellékcsúcsokat). 12,73 ppm (b, 1H, -CO2H); 11,27 ppm (s, mj., imid); 11,25 ppm (s, mi., imid); 7,30 ppm (s, mj., ArH); 7,26 ppm (s, mi., ArH); 6,92 ppm (unres., t, mj., BocNH); 6,73 ppm (unres., t; mi., BocNH);
4,64 ppm (s, mj., T-CH2-CO~); 4,47 ppm (s, mi., T-CH2-CO-); 4,19 ppm (s, mi.,
CONRCH2CO2H); 3,97 ppm (s, mj., CONRCH2CO2H); 3,41-2,89 ppm (unres. m, -CH2CH2- és víz); 1,75 ppm (s, 3H, T-CH3); 1,38 ppm (s, 9H t-Bu).
*3C-NMR: 170,68 ppm (CO); 170,34 (CO); 167,47 (CO); 167,08 (CO); 164,29 (CO); 150,9 (C5”); 141,92 (C6”); 108,04 (C2’); 77,95 és
77,68 (Thy-CH2CO); 48,96, 47,45 és
46,70 (-CH2CH2- és NCH2CO2H); 37,98 (ThyCHj); 28,07 (t-Bu).
FAB-MS: 407 (M+Na+); 385 (M+H+).
6. példa l-(Boc-aeg)-timin-pentafluoenil-észter (7, BocTaeg.Opfp)
2,00 g (5,2 mmol) l-(Boc-aeg)-timint (6) oldunk ml dimetil-formamidban és 15 ml diklór-metánban. 1,05 g (5,72 mmol) pentafluor-fenolt adunk hozzá, majd az oldatot jeges vízfürdőben 0 °C-ra hűtjük. Ezután 1,29 g (6,24 mmol) DCC-t adunk hozzá, és 2 perc elteltével eltávolítjuk a jégfürdőt. Három óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten, majd a kicsapódott DCU-t szűréssel eltávolítjuk és diklór-metánnal mossuk. Az egyesített szűrletet kétszer mossuk vizes nátrium-hidrogén-karbonáttal, majd egyszer mossuk telített nátrium-kloriddal, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A szilárd maradékot 150 ml dioxánban oldjuk, majd 200 ml vízre öntjük 0 °C-on. A címben szereplő vegyületet szűréssel izoláljuk, vízzel mossuk, majd szárítószeren csökkentett nyomáson szárítjuk. Kitermelés: 2,20 g (77%). Analitikai mintát 2propanolból való kristályosítással állítunk elő. Olvadáspont 174-175,5 °C.
Elemanalízis C22H23N4O7F5 képletre: mért (számított)
C: 48,22 (48,01); H: 4,64 (4,21); N: 9,67 (10,18). 'H-NMR (250 MHz, CDC13) δ: Mivel a szekunder amidkötés körül korlátozott a rotáció, ezért számos jel megduplázódik 2:1 arányban (a listában mj.vel jelezzük a fő- és mi.-vel a mellékcsúcsokat). 7,01 ppm (s, mi., ArH); 6,99 ppm (s, mj., ArH); 5,27 ppm (unres. t, BocNH); 4,67 ppm (s, mj., TCH2-CO-); 4,60 ppm (s, mi., T-CH2-CO-); 4,45 ppm (s, mj., CONRCH2CO2Pfp); 4,42 ppm (s, mi., CONRCH2CO2Pfp); 3,64 ppm (t, 2H, BocNHCH2CH2-); 3,87 ppm („q”, 2H,
BocNHCH2CH2-); 1,44 (s, 9H, t-Bu).
FAB-MS: 551 (10; M+l); 495 (10; M + l-tBu);
451 (80; -Boc).
7. példa
N4-Benzil-oxi-karbonil-citozin (9)
Körülbelül 1 óra alatt 52 ml (0,36 mól) benzil-oxikarbonil-kloridot adunk cseppenként 20,0 g (0,18 mól) citozin (8) 1000 ml vízmentes piridinnel készült oldatához 0 °C-on, nitrogénatmoszférában, hővel szárított berendezésben. Az oldatot azután éjszakán át kevertetjük, majd a piridines szuszpenziót csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. 200 ml vizet és 4 mol/1 sósavat adunk hozzá a ρΗ=1 érték elérése céljából. A kapott fehér csapadékot kiszűijük, vízzel mossuk, majd levegőt átszivatva rajta részlegesen megszárítjuk. A még nedves csapadékot 500 ml abszolút etanollal forraljuk 10 percig, 0 °C-ra hűtjük, megszüljük, alaposan mossuk éterrel, majd csökkentett nyomáson megszárítjuk. Kitermelés 24,7 g (54%). Olvadáspont >250 °C. Elemanalízis C12HuN3O3 képletre: mért (számított)
C: 58,59 (58,77); H: 4,55 (4,52); N: 17,17(17,13). NMR-spektrum nem készült, mivel az anyagot nem lehetett feloldani.
8. példa
N4-Benzil-oxi-karbonil-N1 -karboxi-metil-citozin (10)
Egy háromnyakú, gömbölyű fenekű lombikba, amelyet mechanikai keverővei és nitrogénatmoszféra biztosítására alkalmas feltéttel láttunk el, 7,82 ml (82,6 mmol) metil-bróm-acetátot teszünk, majd 21 g (82,6 mmol) N4-benzil-oxi-karbonil-citozin (9) és
11,4 g (82,6 mmol) kálium-karbonát 900 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült szuszpenzióját adjuk hozzá. A keveréket erősen kevertetjük éjszakán át, majd megszüljük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. 300 ml vizet és 10 ml 4 mol/1 sósavat adunk hozzá, az elegyet 15 percig 0 °C-on kevertetjük, megszüljük, majd vízzel mossuk (2 χ 75 ml). Az izolált csapadékot 120 ml vízzel, majd 60 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxiddal kezeljük, 39 percig kevertetjük, 0 °C-ra hűtjük, majd 35 ml 4 mol/1 sósavat adunk hozzá. A címben szereplő vegyületet szűréssel izoláljuk, alaposan mossuk vízzel, majd 1000 ml metanolból átkristályosítjuk, és ismét ala17
HU 221 003 Bl posan mossuk éténél. így kapunk 7,70 g (31%) tiszta vegyületet. Az átkristályosítás anyalúgjának térfogatát 200 ml-re csökkentjük, majd 0 °C-ra hűtjük. így kapunk még 2,30 g anyagot, amely vékonyréteg-kromatográfía alapján elég tiszta, de vöröses színe maradt. Olvadáspont: 266-274 °C.
Elemanalízis C14H13N3O5 képletre: mért (számított)
C: 55,41 (55,45); H: 4,23 (4,32); N: 14,04(13,86).
Ή-NMR (90 MHz; DMSO-d6) δ: 8,02 ppm (d, J=7,32 Hz, 1H, H-6); 7,39 (s, 5H, Ph); 7,01 (d, J=7,32 Hz, 1H, H-5); 5,19 (s, 2H, PhC//2-); 4,52 (s, 2H).
9. példa
W-benzil-oxi-karbonil-N1karboxi-metil-citozin-pentafluor-fenil-észter (11)
4,0 g (13,2 mmol) N4-benzil-oxi-karbonil-N1-karboxi-metil-citozint (10) és 2,67 g (14,5 mmol) pentafluorfenolt összekeverünk 70 ml dimetil-formamiddal, jeges vízfürdőben 0 °C-ra hűtjük, majd 3,27 g (15,8 mmol) DCC-t adunk hozzá. Három perc múlva eltávolítjuk a jeges vízfürdőt, majd a keveréket 3 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük. A kicsapódott DCU-t szűréssel eltávolítjuk, dimetil-formamiddal mossuk, majd a szűrletet csökkentett nyomáson (27 Pa) szárazra pároljuk. A szilárd maradékot 250 ml diklór-metánnal kezeljük, 15 percig erősen kevertetjük, szüljük, majd kétszer mossuk hígított nátrium-hidrogén-karbonáttal, egyszer pedig telített nátrium-kloriddal, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A szilárd maradékot 150 ml 2-propanolból kristályosítjuk, majd a kristályokat alaposan mossuk éterrel. Kitermelés
3,4 g (55%). Olvadáspont: 241-245 °C.
Elemanalízis C20H12N3F5O5-re: mért (számított)
C: 51,56 (51,18); H: 2,77(2,58); N: 9,24(8,95).
Ή-NMR (90 MHz; CDC13): 7,66 ppm (d, J=7,63 Hz, 1H, H-6); 7,37 (s, 5H, pH); 7,31 (d, J=7,63 Hz, 1H, H-5); 5,21 (s, 2H, PhC//2-); 4,97 (s, 2H, NC//2-).
FAB-MS: 470 (M+l)
10. példa
N4-Benzil-oxi-karbonil-l-Boc-aeg-citozin (12)
Az előzőkben leírt módon előállított (N-Boc-2-amino-etil)-glicin (2) oldathoz 7,0 ml (50,8 mmol) trietilamint, valamint 2,7 g (5,75 mmol) N4-benzil-oxikarbonil-N1-karboxi-metil-citozin-pentafluor-fenil-észtert (11) adunk. Miután az oldatot 1 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertettük, 150 ml diklór-metánt, 250 ml telített nátrium-kloridot és annyi 4 mol/1 sósavat adunk, hogy a pH körülbelül 1 legyen. A szerves fázist elválasztjuk, majd kétszer mossuk telített nátrium-kloriddal, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, először vízsugárszivattyút, majd olajszivattyút használva. Az olajos maradékot 25 ml vízzel kezeljük, majd csökkentett nyomáson ismét szárazra pároljuk. Ezt az eljárást megismételjük. Az olajos maradékot (2,8 g) 100 ml diklór-metánban oldjuk, 250 ml petrolétert adunk hozzá, majd az elegyet éjszakán át kevertetjük. A címben szereplő szűréssel izoláljuk, majd petroléterrel mossuk. Vékonyréteg-kromatográfiával (1.
rendszer) jelentős mennyiségű pentafluor-fenol mutatható ki, de nem teszünk kísérletet eltávolítására. Kitermelés: 1,72 g (59%). Olvadáspont 156 °C (bomlás).
Ή-NMR (250 MHz, CDC13) δ: mivel a szekunder amidkötés körül korlátozott a rotáció, ezért számos jel megduplázódik 2:1 arányban (a listában mj.-vel jelezzük a fő- és mi.-vei a mellékcsúcsokat). 7,88 ppm (dd, 1H, H-6); 7,39 (m, 5H, Ph); 7,00 (dd,
IH, H-5); 6,92 (b, 1H, BocN„); 6,74 (b, 1H, ZN//
-?); 5,19 (s, 2H, Ph-C//3); 4,81 ppm (s, mj.,
Cyt-CH2-CO-); 4,62 ppm (s, mi.,
Cyt-CH2-CO-); 4,23 (s, mi., CONRC//2CO2H);
3,98 ppm (s, mj., CONRC//2CO2H); 3,42-3,02 (unres., m, -CH2CH2- és víz); 1,37 (s, 9H, tBu).
FAB-MS: 504 (M+l); 448 (M+l-tBu).
II. példa
N4-Benzil-oxi-karbonil-l -Bocaeg-citozin-pentafluor-fenil-észter (13)
1,5 g (2,98 mmol) N4-benzil-oxi-karbonil-l-Bocaeg-citozint (12) és 548 mg (2,98 mmol) pentafluorfenolt feloldunk 10 ml dimetil-formamidban. 10 ml diklór-metánt adunk hozzá, majd a reakcióelegyet jeges vízfürdőben 0 °C-ra hűtjük, majd 676 mg (3,28 mmol) DCC-t adunk hozzá. Három perc múlva eltávolítjuk a jeges vízfürdőt, majd a keveréket 3 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük. A csapadékot szűréssel izoláljuk, majd egyszer mossuk diklór-metánnal. A csapadékot 150 ml forrásban levő dioxánban oldjuk, majd az oldatot 15 °C-ra hűtjük, ekkor a DCU kicsapódik. A DCUt szűréssel eltávolítjuk, és a kapott szűrletet 250 ml 0 °Cos vízre öntjük. A címben szereplő vegyületet szűréssel izoláljuk, egyszer mossuk vízzel, majd szárítószeren csökkentett nyomáson szárítjuk. Kitermelés 1,30 (65%). Elemanalízis C29H28N5O8F5 képletre: mért (számított)
C: 52,63 (52,02); H: 4,41 (4,22);N: 10,55 (10,46). Ή-NMR (250 MHz; DMSO-dJ: lényegében ugyanazt a spektrumot adja, mint az előző sav, valószínűleg az észter hidrolízise miatt.
FAB-MS: 670 (M+l); 614 (M+1-tBu).
12. példa
4-Klór-karboxi-9-klór-akridin
6,25 g (26,1 mmol) 4-karboxi-akridont, 25 ml tionil-kloridot és 4 csepp dimetil-formamidot óvatosan melegítünk nitrogénáramban, ameddig az összes szilárd anyag feloldódik. Az oldatot ezután 40 percig visszafolyó hűtő alatt forraljuk. Az oldatot lehűtjük, majd a tionil-klorid-felesleget csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A tionil-klorid utolsó nyomait száraz benzollal (Na-Pb-n szárítva) kétszer együtt desztillálva távolítjuk el. A megmaradt sárga port közvetlenül használjuk a következő reakcióban.
13. példa
4-(5-Metoxi-karbonil-pentil-amido-karbonil)-9klór-akridin
4,7 g (25,9 mmol) metil-6-amino-hexanoátot feloldunk 90 ml diklór-metánban, 0 °C-ra hűtjük, majd 15 ml trietil-amint adunk hozzá, és a keletkező oldatot
HU 221 003 Bl a fenti savkloridhoz adjuk. A savkloridot tartalmazó gömblombikot jeges vízfürdőben 0 °C-ra hűtjük. Az elegyet 30 percig 0 °C-on, majd 3 óra hosszat szobahőmérsékleten alaposan kevertetjük. A kapott keveréket megszűrve eltávolítjuk a megmaradt szilárd anyagot, amelyet azután 20 ml diklór-metánnal mosunk. A vörösesbarna diklór-metános szűrletet ezt követően kétszer mossuk telített nátrium-hidrogén-karbonáttal, egyszer mossuk nátrium-kloriddal, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott olajos anyaghoz 35 ml vízmentes benzolt és ligroint (60-80 °C, Na-Pb felett szárítva) adunk. Az elegyet visszafolyó hűtő alatt forraljuk. Aktív szenet és celitet adunk hozzá, majd a keveréket 3 óra hosszat visszafolyó hűtő alatt forraljuk. Szűrés után a címben szereplő vegyületet mágneses keverőn hűtés közben kristályosítjuk. Szűréssel izoláljuk, majd petroléterrel mossuk. A terméket szilárd kálium-hidroxid felett tároljuk. Kitermelés 5,0 g (50%).
14. példa
4-(5-Metoxi-karbonil-pentil)-amido-karbonil-9[6 ’-(4 ”-nitro-benzamido-hexil-amino]-aminoakridin
1,30 g (3,38 mmol) 4-(4-metoxi-karbonil-pentilamído-karbonil)-9-klór-akridint és 5 g fenolt nitrogénáramban 30 percig 80 °C-on tartunk, majd 897 mg (3,38 mmol) 6-(4’-nitrobenzamido)-l-hexil-amint adunk hozzá. A hőmérsékletet 2 óra hosszat 120 °C-on tartjuk. A reakcióelegyet lehűtjük, majd 80 ml diklórmetánt adunk hozzá. A kapott oldatot háromszor mossuk 60-60 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxiddal, majd egyszer vízzel, utána pedig csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott vörös olajat (1,8 g) 40 ml diklórmetánban oldjuk, majd 0 °C-ra hűtjük. 120 ml étert adunk hozzá, majd a kapott oldatot éjszakán át kevertetjük. Ennek eredményeképpen szilárd anyag és egy olaj keverékét kapjuk. A szilárd anyagot szűréssel kinyerjük. A szilárd anyagot és az olajat újraoldjuk 80 ml diklór-metánban, majd cseppenként 150 ml hideg éterhez adjuk. Húszperces kevertetés után a címben szereplő vegyületet szűréssel nyeljük ki narancsszínű kristályok formájában. A terméket éterrel mossuk, majd csökkentett nyomáson kálium-hidroxid felett szárítjuk. Kitermelés 1,60 g (77%). Olvadáspont 145-147 °C.
15. példa
4-(5-Karboxi-pentil)-amido-karbonil-9-[6’-(4 ”nitro-benzamido)-hexil-amino]-amino-akridin 503 mg (0,82 mmol) 4-(5-metoxi-karboxi-pentil)amido-karbonil-9-[6’-(4”-nitro-benzamido)-hexil-aminoj-amino-akridint oldunk 30 ml dimetil-formamidban, majd 30 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidot adunk hozzá. 15 percig kevertetjük, az oldatot dekantáljuk, ekkor egy olajos anyag marad vissza, amelyet 150 ml forrásban levő metanolban oldunk, megszüljük, majd 1/3 térfogatára betöményítjük. A metanolos oldathoz 125 ml étert, majd 5-6 csepp etanolos sósavat adunk. Az oldatot 1 óra 0 °C-on végzett kevertetés után dekantáljuk. Az olajos anyagot újra oldjuk 25 ml metanolban, és 150 ml éterrel kicsapjuk. A címben szereplő vegyületet éjszakán át tartó kevertetés után sárga kristályok formájában izoláljuk.
Kitermelés 417 mg (80%). Olvadáspont 173 °C (boml.).
16. példa (a) 4-(5-Pentafluor-fenil-oxi-karbonil-pentil)amido-karbonil-9-[6 ‘-(4 -nitro-benzamido)hexil-amino]-amino-akridin (AcriOpjp)
A fenti savból 300 mg-ot (0,480 mmol) feloldunk 2 ml dimetil-formamidban, majd 8 ml diklór-metánt adunk hozzá. 97 mg (0,53 mmol) pentafluor-fenolt 2x2 ml diklór-metános adagban adunk hozzá. A kapott oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd 124 mg (0,60 mmol) DCCt adunk a reakcióelegyhez. A jeges vízfürdőt 5 perc múlva eltávolítjuk, majd a reakcióelegyet éjszakán át hagyjuk kevertetni. A kicsapódott DCU-t centrifugálással eltávolítjuk, és a kapott üledéket csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, először vízsugárszivattyú, majd olajszivattyú alkalmazásával. A maradékot 20 ml diklórmetánban oldjuk, szűrjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot ismét diklór-metánban, valamint 150 ml petroléterben oldjuk. 1 ml 5 mol/1 koncentrációjú sósavat adunk hozzá. Az oldószert 30 perces 0 °C-on végzett kevertetés után dekantálással eltávolítjuk. A megmaradt olajos anyagot 100 ml diklór-metánban oldjuk. 150 ml petrolétert adunk hozzá, majd a reakcióelegyet éjszakán át kevertetjük. A következő napon a kicsapódott kristályos anyagot szűréssel izoláljuk, majd sok petroléterrel mossuk. Kitermelés (szárítás után) 300 mg (78%). Olvadáspont 97,5 °C (boml.). Mindegyik mintának megfelelő volt az elemanalízise, az Ή- és 13C-NMR- és tömegspektruma.
(b) A 8. ábrán szereplő PNA-vegyiiletek kísérleti előállítása
Anyagok: Boc-Lys (C1Z), benzhidril-aminkopoli(sztirol-l%-divinil-benzol)-gyanta (BHA-gyanta) és p-metil-benzhidril-amin-kopoli(sztirol-1 %-divinilbenzol)-gyanta (MBHA-gyanta) kereskedelmi forgalomba hozza a Peninsula Laboratories. A többi reagens és oldószer: Biograde trifluor-ecetsav a Halocarbon Products-tól; diizopropil-etil-amid (99%-os, tovább nem desztilláltuk) és N-acetil-imidazol (98%) az Aldrichtól; a vizet kétszer desztilláljuk; vízmentes HF a Union Carbide-től; szintézis minőségű N,N-dimetil-formamid és analitikai minőségű diklór-metán (nem desztilláltuk tovább) a Merck-től; HPLC minőségű acetonitril a LabScan-től; purum minőségű anizol, N,N’-diciklohexilkarbodiimid, diizopropil-karbodiimid, puriss. minőségű
2,2,2-trifluor-etanol a Fiukétól és trifluor-metánszulfonsav a Fluoradtól.
Általános módszerek és megjegyzések
Hacsak külön nem jelezzük, akkor a következők érvényesek. A PNA-vegyületeket a lépésenként! szilárd fázisú módszerrel szintetizáljuk [Merrifield, Journal of the American Chemical Society, 85, 2149 (1963)], szokásos peptidkémia alkalmazásával, az N-atom „időleges” megvédésére a TFA-ra labilis terc-butil-oxi-karbonil (Boc)-csoportot használva [Merrifield, Journal of the American Chemical Society, 86, 304 (1964)], a savra stabilabb benzil-oxi-karbonil (Z)- és 2-klór-benzil19
HU 221 003 BI oxi-karbonil (ClZ)-csoportokat az oldallánc „állandó” megvédésére használjuk. C-terminális amidok előállítása céljából a PNA-kat HF-re labilis BHA- vagy MBHA-gyantákon állítjuk össze (az MBHA-gyanta megnövekedett érzékenységgel rendelkezik a végső HF-hasításra, a helyettesítetlen BHA-gyantához viszonyítva [Matsueda et al., Peptides, 2, 45 (1981)]. Mindegyik reakciót (kivéve a HF-reakciókat) manuálisan működtetett standard szilárd fázisú reakcióedényekben hajtjuk végre, amelyeket durva üvegszűrővel szereltünk fel [Merrifield et al., Biochemistry, 21, 5020 (1982)].
A kvantitatív ninhidrinreakciót (Kaiser-teszt), amelyet eredetileg Merrifield és munkatársai fejlesztettek ki [Sárin et al., Analytical Biochemistry, 117, 147 (1981)] a „normális” aminosavakat tartalmazó peptidekhez, si- 15 kérésén alkalmaztuk (lásd az I—III. táblázatokat), a „normálisan” alkalmazott extinkciós koefficienst használva, azaz az epszilon=15 000 M-'cirr* egységet minden csoportra, az egyes kapcsolási reakciók lejátszódása mértékének meghatározásához, valamint a növekedő 20 peptidláncok számának mérésére. Az Sn_j elméleti helyettesítést n számú csoport kapcsolásánál (feltételezve mind a védőcsoportok komplett eltávolítását és a teljes kapcsolást, valamint azt, hogy sem lánctermináció, sem a PNA-láncok elvesztése nem történik meg a szinteti- 25 kus ciklusban) az alábbi egyenlettel lehet számítani:
Sn=Sn_j χ [1+(Sn_j xdelta-MW χ 10-3 mmol/mmol)]-1 ahol delta-MW jelentése molekulatömeg-nyereség ([delta-MW]=g/mol), Sn_j jelentése elméleti helyettesítés az előző, n-1 számú csoport kapcsolása után ([S]=mmol/g). Egy adott kapcsolás mértékének becsült értékét (%) a mért helyettesítéshez viszonyítva számítjuk (hacsak S nincs meghatározva), és ez magában foglalja a korábbi ciklusból szabadon maradt szabad aminocsoportokra vonatkozó korrekciót is. A HF-reakciókat egy Diaflon HF-berendezésben hajtjuk végre (Toho
Kaséi, Osaka, Japán). Vydac C18 fordított fázisú oszlopokat (5 pm, 0,46 χ 25 cm és 5 pm, 1,0x25 cm) használunk az analitikai és félpreparatív HPLC-hez egy SP8000 berendezésben. Az A puffer összetétele 5 térfo5 gat% acetonitril vízben, amely 445 pl trifluor-ecetsavat tartalmaz literenként, a B puffer 60 térfogat% acetonitril vízben, amely 390 pl trifluor-ecetsavat tartalmaz literenként. A lineáris gradiens 0-100% B puffer 30 perc alatt, az áramlási sebesség 1,2 ml/perc (analiti10 kai) és 5 ml/perc (félpreparatív). Az eluenseket 215 nmen (analitikai), illetve 230 nm-en (félpreparatív) mérjük. A PNA-k molekulatömegét 252Cf plazmadeszorpciós repülési idő tömegspektrometriával határozzuk meg, a leggyakoribb izotópok átlagából.
17. példa
Az Acr’-[Taeg]ty-NHj és rövidebb származékai szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]I5-BHA-gyanta lépésenkénti összerakása
A szintézist 100 mg előre duzzasztott és semlegesített BHA-gyantával kezdjük (a kvantitatív ninhidrinreakcióval meghatározva 0,57 mmol NHj/g-ot tartalmaz), egyszeri kapcsolásokat alkalmazva („1 szintézis protokoll”), 3,2 ekvivalens BocTaeg-Opfp-t alkalmazva 33% DMF/CH2C12 keverékben. Az egyes kapcsolási reakciókat úgy hajtjuk végre, hogy legalább 12 óra hosszat rázatunk egy manuálisan működtetett 6 ml-es standard szilárd fázisú reakcióedényt, majd az elrea30 gálatlan aminocsoportokat a szintézis kiválasztott lépéseiben acetilezéssel blokkoljuk. A lánchosszabbodás előrehaladását az egyes lépésekben a kvantitatív ninhidrinreakcióval ellenőrizzük (lásd 1. táblázat). A védett Boc-[Taeg]5-BHA-, Boc-[Taeg]10-BHA- és Boc35 [Taeg]15-BHA-gyanták aliquot részeit 5, 10 és 15 kapcsolás után kivesszük.
I. táblázat
Szintetikus lépés Kapcsolt csoport Helyettesítés a védőcsoport eltávolítása után (mmol/g) Megmaradt szabad aminocsoport (pmol/g) Kapcsolás becsült mértéke
Mért Elméleti Egyszeri kapcsolás Acetilezés %
0” 0,57
1 BocTaeg ND 0,50 1,30 <99,7
2 BocTaeg ND 0,44 1,43 <99,9
3 BocTaeg 0,29 0,39 3,33 <99,3
4 BocTaeg 0,27 0,35 13,30 99,3
5 BocTaeg 0,26 0,32 8,33 >99,9
6 BocTaeg ND 0,30 7,78 >99,9
7 BocTaeg ND 0,30 13,81 7,22 <97,8
8 BocTaeg ND 0,28 14,00 <99,9
9 BocTaeg ND 0,24 30,33 93,2
10 BocTaeg 0,16 0,23 11,67 2,67 >99,9
1 11 BocTaeg ND 0,21 4,58 >99,9
HU 221 003 Bl
I. táblázat (folytatás)
Szintetikus lépés Kapcsolt csoport Helyettesítés a védőcsoport eltávolítása után (mmol/g) Megmaradt szabad aminocsoport (pmol/g) Kapcsolás becsült mértéke
Mért Elméleti Egyszeri kapcsolás Acetilezés %
12 BocTaeg ND 0,20 5,87 <99,4
13 BocTaeg ND 0,19 1,67 >99,9
14 BocTaeg ND 0,18 14,02 <93,1
15 BocTaeg 0,07 0,17 4,20 3,33 <93,1
(b) Az Acr1 -[Taeg]IS-BHA-gyanta szintézise
A maradék Boc-[Taeg]]5-BHA-gyanta védőcsoport mentesítése után (a becsült száraztömeg körülbelül 30 mg; körülbelül 0,002 mmol növekvő láncok), a H[Taeg] 15-BHA-gyantát körülbelül 50 ekvivalens (80 mg; 0,11 mmol) Acr'-OPfp-vel reagáltatjuk, amely körülbelül 1 ml, körülbelül 66%-os DMF/CH2Cl2-ben van oldva (azaz a pentafluor-fenil-észtemek egy 0,1 mol/l-es oldata) egy 3 ml-es szilárd fázisú reakcióedényben. A kvantitatív ninhidrinreakció alapján Ítélve, az akridinegység kapcsolási reakciója közel kvantitatív.
(c) A H-[TaegJ3-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]5-BHA-gyanta egy részét 50%-os trifluor-ecetsawal kezeljük diklór-metánban, az N-terminális Boc-csoport eltávolítása céljából (amely a potenciálisan káros terc-butil-kation prekurzora), a HF-hasítás előtt. A semlegesítés és mosás után (amelyet hasonlóképpen hajtunk végre, mint ahogy azt az „1 szintézisprotokoll”-ban írtuk le), majd 2 óra hosszat szárítjuk csökkentett nyomáson, a kapott
67.1 mg (száraztömeg) H-[Taeg]5-BHA-gyantát 5 ml HF:anizol 9:1 térfogatarányú elegyével hasítjuk, 0 °C-on 60 percig kevertetve. A HF eltávolítása után a maradékot 15-15 percig 4x15 ml vízmentes dietiléterrel kevertetjük az anizol eltávolítása céljából, gravitációsan szűrjük egy zsugorított üvegszűrőn, majd szárítjuk. A PNA-t ezután 60 ml (4 χ 15 ml, mindegyikkel 15 percig kevertetjük) 10%-os vizes ecetsavoldattal extraháljuk. Ennek az oldatnak az alikquot részeit analitikai fordított fázisú HPLC-vel elemezzük a nyers PNS tisztaságának megállapítása céljából. A 13,0 percnél jelentkező főcsúcs a teljes abszorbancia 93%-áért felelős. A maradék oldatot lefagyasztjuk, majd liofilezzük, így kapunk körülbelül 22,9 mg nyersterméket. Végezetül a nyerstermékből 19 mg-ot 5 sarzsban tisztítunk (mindegyik 3,8 mg-ot tartalmaz 1 ml vízben). A főcsúcsot félpreparatív fordított fázisú oszlop alkalmazásával gyűjtjük össze. Az acetonitrilt speed-vackal eltávolítjuk, majd a maradék oldatot szárazjégen lefagyasztjuk, ezt követően liofílezzük, így kapunk
13.1 mg >99%-os tisztaságú H-[Taeg]5-NH2-t. A PNA-molekula könnyen oldódik vízben, és molekulatömege megfelel a tömegspektrometriai meghatározásoknak. Az (M+H)+-ra számított m/z 1349,3, a mért m/z érték 1347,8.
(d) A H-[Taeg] 10-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett H-[Taeg]10-BHA-gyanta egy részét a (c) pontban leírtak szerint kezeljük, így kapunk 11,0 mg nyersanyagot 18,9 mg száraz H-[Taeg]10-BHA-gyanta HF-fel való hasítása után. A 15,5 percnél megjelenő főcsúcs a teljes abszorbanciának körülbelül 53%-áért felelős. A nyerstermék körülbelül 1 mg-ját ismételten megtisztítjuk (az alábbiakban ismertetendő okok miatt), így kapunk körülbelül 0,1 mg, legalább 80%os, de feltehetően 99%-nál tisztább H-[Taeg]10-NH2-t. A főcsúcs után eluálódó meglehetősen széles farkat, amely az összabszorbanciának körülbelül 20%-áért felelős, nem lehet eltávolítani (csak kismértékben csökkenteni) az ismételt tisztítással. A tömegspektrum alapján ítélve, amely megerősíti a helyes molekulatömegű H-[Taeg]10-NH2 jelenlétét, a farokjelenséget a célmolekulának egy többé-kevésbé jól definiált aggregációs/konformációs állapotváltozásának tulajdoníthatjuk. Ennélfogva, a nyerstermék valószínűleg többet tartalmaz a célmolekulából mint az említett 53%. A H-[Taeg]1()-NH2 könnyen oldódik vízben. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2679,6, a mért m/z érték 2681,5.
(e) A H-[TaegJ 1S-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett H-[Taeg]15-BHA-gyanta egy részét a (c) pontban leírtak szerint kezeljük, így kapunk 3,2 mg nyersanyagot 13,9 mg száraz H-[Taeg]i5-BHA-gyanta HF-fel való hasítása után. A 15,5 percnél megjelenő főcsúcs egy széles kidudorodásban található, a teljes abszorbanciának körülbelül 53%-áért felelős. Ezt a kidudorodást ismét (lásd az előző szekciót) a H[Taeg]15-NH2 célmolekula aggregációs/konformációs állapotváltozásainak tulajdoníthatjuk, mivel az összegyűjtött „kidudorodás” tömegspektrometriás elemzése nem jelzi más molekulák jelenlétét. Az összes nyersterméket megtisztítjuk a „kidudorodás” összegyűjtésével, így kapunk körülbelül 2,8 mg anyagot. Az (M+A)+-ra számított m/z érték 4033,9, a mért m/z érték 4032,9.
(f) Az Acr1-[Taeg]I5-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Acr'-[Taeg]15-BHA-gyanta egy részét a (b) pontban leírt módon kezeljük, így kapunk 14,3 mg nyersanyagot 29,7 mg száraz Acr1 -[Taeg] 15-BHAgyanta HF hasításával. A 23,7 percnél levő főcsúcs és
HU 221 003 Bl egy „dimer” (lásd alább) 29,2 percnél az összabszorbanciának körülbelül 40%-áért felelős (12B. ábra). A nyersterméket ismételten megtisztítjuk, így kapunk körülbelül 1 mg feltehetően >99% tisztaságú Acr1[Taeg]15-NH2-t, a 27,4 és 29,2 percnél eluálódó, önmagával aggregálódott molekulákkal „szennyezve”, és végül egy nagy széles kidudorodást, amely a 100%-os B pufferrel eluálódik (12C. ábra). Ez az értelmezés összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy ezek a csúcsok növekszenek meg állás (több óra) közben vizes ecetsavas oldatban, és végül kvantitatíve kicsapódnak. Az (M+H)+ számított m/z értéke 4593,6, a mért m/z érték 4588,7.
(g) 1. szintézisprotokoll (1) Boc-védőcsoport eltávolítás TFA/CH2C12 (1:1, térfogat/térfogat), 3 ml, 3 χ 1 perc és 1 χ 30 perc;
(2) mosás CH2Cl2-vel, 3 ml, 6x1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel (1:19 térfogat/térfogat), 3 ml, 3 χ 2 perc;
(4) mosás CH2Cl2-vel, 3 ml, 6 χ 1 perc, szárítás egy percig;
(5) a PNA-gyantából 2-5 mg-os mintát veszünk, alaposan megszárítjuk, majd a szubsztitúció meghatározásához kvantitatív ninhidrinelemzést végzünk;
(6) 3,2 ekvivalens (0,18 mmol: 100 mg) BocTaegOPfp hozzáadása 1 ml diklór-metánban oldva, majd 0,5 ml dimetil-formamid hozzáadása (a pentafluorfenil-észter végkoncentrációja körülbelül 0,12 mól); a végső kapcsolási reakciót 12-24 óra hosszat hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten rázatva;
(7) mosás dimetil-formamiddal, 3 ml, 1x2 perc;
(8) mosás diklór-metánnal, 3 ml, 4 χ 1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel, 3 ml, 2x2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 3 ml, 6 χ 1 perc;
(11) a védett PNA-ból 2-5 mg mintát kiveszünk gyors kvalitatív ninhidrinteszt végzéséhez, majd további 2-5 mg-ot alaposan megszárítunk a kvantitatív ninhidrinelemzéshez, hogy meghatározzuk a kapcsolás mértékét (a 7., 10. és 15. ciklus után a reagálatlan aminosavakat N-acetil-imidazollal diklór-metánban reagáltatva blokkoljuk).
18. példa
Acr‘-[Taeg]ls-Lys-NH2 és rövidebb származékai szilárd fázisú szintézise (a) Boc-[TaegJI5-Lys(ClZ)-BHA gyanta lépésenkénti elkészítése
A szintézist Boc-Lys(ClZ) 100 mg előre duzzasztott és semlegesített BHA-gyantára (0,57 mmol NH2/g) való kvantitatív felvitellel indítjuk (standard DCC in situ kapcsolás tiszta diklór-metánban). A védett PNAlánc további hosszabbítását egyenkénti kapcsolással végezzük („2. szintézisprotokoll”) 1-5 és 10-15 ciklusban, 3,2 ekvivalens Boc-[Taeg]-OPfp körülbelül 33%os dimetil-formamid/diklór-metános oldatával. Az
5-10. ciklusban extra mennyiségű DCC-t használunk (azaz in situ), a szabad Boc-[Taeg]-OH-savat körülbelül 33%-os dimetil-formamid/diklór-metán oldatban. Az összes kapcsolási reakciót úgy hajtjuk végre, hogy legalább 12 óra hosszat manuálisan működtetett 6 mles standard szilárd fázisú reakcióedényben reagáltatjuk. A reagálatlan aminocsoportokat acetilezéssel blokkoljuk, a szintézisnek ugyanabban a lépésében, mint a 17. példában. A védett Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)BHA- és Boc-[Taeg]10-Lys(Clz)-BHA-gyanták aliquot részeit kivesszük 5 és 10 PNA-csoport összeépítése után. A Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-BHA-gyanta nyers hasítási termékének HPLC kromatogrammja alapján ítélve (lásd az (e) szekciót), az 5-10. PNA-csoportok további „szabad sav”-kapcsolása nem jelent jelentős előrelépést a szintézisben, a 17. példában végzett alapos egyszeri kapcsolásos reakciókkal összehasonlítva.
(b) Az Acrt-fTaeg]}0-Lys(ClZ)-BHA-gyanta szintézise
Miután a Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-BHA-gyanta egy részéről (becsült száraz tömege körülbelül 90 mg; körülbelül 0,001 mmol növekedő lánc) a védőcsoportokat eltávolítottuk, a H-[Taeg]15-BHA-gyantát körülbelül 20 ekvivalens (141 mg; 0,19 mmol) Acr1OPfp-vel reagáltatjuk 1 ml, körülbelül 66%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben oldva, 3 ml-es szilárd fázisú reakcióedényben. A kvalitatív ninhidrinreakció alapján megítélve az akridinegység kapcsolódása közel kvantitatív.
(c) Az Acr!-[Taeg] 15-Lys(ClZ)-BHA-gyanták szintézise
Miután a maradék Boc-[Taeg]15-Lys(ClZ)-BHAgyantáról (becsült száraztömeg körülbelül 70 mg; körülbelül 0,005 mmol növekedő lánc) eltávolítottuk a védőcsoportokat, a H-[Taeg]15-BHA-gyantát körülbelül 20 ekvivalens (91 mg; 0,12 mmol) Acri-OPfp-vel reagáltatjuk 1 ml, körülbelül 66%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben oldva, 3 ml-es szilárd fázisú reakcióedényben. A kvalitatív ninhidrinreakció alapján megítélve az akridinegység kapcsolódása közel kvantitatív.
(d) A H-[Taeg]5-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
Miután a maradék Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)-BHA egy részét a 17(c). példában leírt módon kezeltük, 8,9 mg nyersanyagot kaptunk 19,0 mg száraz H-[Taeg]5Lys(ClZ)-BHA-gyanta HF-fel végzett hasítása után. A 12,2 percnél eluálódó főcsúcs (14,2 percnél eluálódik, ha 10%-os vizes ecetsavas oldat helyett vizes oldatból injektáljuk) az összabszorbancia körülbelül 90%-áért felelős. Körülbelül 2,2 mg nyersterméket megtisztítva körülbelül 1,5 mg 99%-os tisztaságú H[Taeg]5-Lys-NH2-t kapunk.
(e) A H-[Taeg] 1(r-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
Miután a maradék Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-BHA egy részét a 17(c) példában leírt módon kezeltük,
1,7 mg nyersanyagot kaptunk 7,0 mg száraz H[Taeg]10-Lys(ClZ)-BHA-gyanta HF-fel végzett hasítása után. A 15,1 percnél eluálódó főcsúcs (17,0 percnél eluálódik, ha 10%-os vizes ecetsavas oldat helyett vizes oldatból injektáljuk) az összabszorbancia körülbelül 50%-áért felelős. Körülbelül 1,2 mg nyersterméket megtisztítva körülbelül 0,2 mg 95%-os tisztaságú H[Taeg]10-Lys-NH2-t kapunk. Az (M+H)+-re számított m/z érték 2807,8, a mért m/z érték 2808,2.
HU 221 003 Β1 (f) Az Acr‘-[Taeg] }0-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
99,1 mg (száraztömeg) Acri-fTaegjio-Lys/ClZ)BHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján hasítunk, így kapunk 42,2 mg nyersterméket. A 25,3 percnél eluálódó főcsúcs (23,5 percnél eluálódik, ha 10%-os vizes ecetsavas oldat helyett vizes oldatból injektáljuk) az összabszorbancia körülbelül 45%-áért felelős. Körülbelül 8,87 mg nyersterméket megtisztítva körülbelül 5,3 mg >97%-os tisztaságú H-[Taeg]10-Lys-NH2-t kapunk. Az (M+H)+-re számított m/z érték 2850,8, a mért m/z érték 2849,8.
(g) Az Acri-jTaegj 15-Lys-NH2 hasítása és tisztítása
78,7 mg (száraztömeg) védett Acr'-fTaegjjQ-Lys(ClZ)-BHA-gyantát az l(c) példában leírtak alapján hasítunk, így kapunk 34,8 mg nyersterméket. A 23,5 percnél eluálódó föcsúcs (körülbelül ugyanez az elúciós ideje, ha 10%-os vizes ecetsavas oldat helyett vizes oldatból injektáljuk), és egy „dimer” 28,2 percnél az összabszorbancia körülbelül 35%-áért felelős. Körülbelül 4,5 mg nyersterméket megtisztítva körülbelül 1,6 mg feltehetően >95%os tisztaságú H-[Taeg]10-Lys-NH2-t kapunk. Ez a termék nem szabadítható meg a „dimer” csúcstól, amelynek mennyisége vizes ecetsavas oldatban állva növekszik.
(h) 2. szintézisprotokoll (1) Boc-védőcsoportok eltávolítása TFA/diklórmetán eleggyel (1:1 térfogat/térfogat), 3 ml, 3x1 perc és 1 χ 30 perc;
(2) mosás CH2Cl2-vel, 3 ml, 6 χ 1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel (1:19 térfogat/térfogat), 3 ml, 3x2 perc;
(4) mosás CH2Cl2-vel, 3 ml, 6 χ 1 perc, szárítás egy percig;
(5) a PNA-gyantából 2-5 mg-os mintát veszünk, alaposan megszáritjuk, majd kvantitatív ninhidrinelemzést végzünk;
(6) az 1-5. és 5-10. ciklusban a kapcsolási reakciót úgy végezzük, hogy 3,2 ekvivalens (0,18 mmol; 100 mg) BocTaeg-OPfp-t adunk hozzá 1 ml diklór-metánban oldva, majd 0,5 ml dimetil-formamidot adunk hozzá (a pentafluor-fenil-észter végkoncentrációja körülbelül 0,12 mól); a végső kapcsolási reakciót 12-24 óra hosszat hagyjuk lejátszódni rázatás közben; az 5-10. ciklusokban további kapcsolást végzünk, 0,12 mól DCC-vel kapcsolunk 0,12 mól BocTaeg-OH-t 1,5 ml dimetilformamid/diklór-metán elegyben (1:2, térfogat/térfogat);
(7) mosás dimetil-formamiddal, 3 ml, 1 χ 2 perc;
(8) mosás diklór-metánnal, 3 ml, 4 χ 1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel, (1:19, térfogat/térfogat) 3 ml, 2 χ 2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 3 ml, 6χ 1 perc;
(11) a védett PNA-ból 2-5 mg mintát kiveszünk kvalitatív ninhidrinteszt végzéséhez, a 7., 10. és 15. ciklus után a reagálatlan aminosavakat N-acetilimidazollal diklór-metánban reagáltatva blokkoljuk.
19. példa
A H-[Taeg]-Lys-NH2 javított szilárdfázisú szintézise
A védett PNA-t egy MBHA-gyantán állítjuk össze, az előző példákban használt BHA-gyanta töltésének körülbelül a felét alkalmazva. Emellett az összes ciklust, egy kivételével, a kapcsolatlan aminosavak acetilezése követi. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a szintézis menetét:
(a) A Boc-LyslClzfiNH-CHjp-CHrCfilffiCfffgyanta (MBHA-gyanta) készítése 0,3 mmol/g indulási szubsztitúcióval
A Boc-Lys(CIZ)-MBHA-gyanta kívánt szubsztitúciója 0,25-0,30 mmol/g. Ennek az értéknek az eléréséhez 1,5 mmol Boc-Lys(ClZ)-t kapcsolunk 5,0 g semlegesített és előre duzzasztott MBHA-gyantához (a kvantitatív ninhidrinreakcióval meghatározva 0,64 mmol/g NH2-t tartalmaz), egyedi „in situ” kapcsolást alkalmazva (1,5 mmol DCC) 60 ml diklór-metánban. A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy 3 óra hosszat egy manuálisan működtetett, 225 ml-es szilárd fázisú reakcióedényben rázatjuk. A reagálatlan aminocsoportokat ezután acetilezéssel blokkoljuk, ecetsavanhidrid/piridin/diklórmetán (1:1:2, térfogat/térfogat/térfogat) eleggyel végezve az acetilezést 18 óra hosszat. A semlegesített gyantán végzett kvantitatív reakció azt mutatta, hogy csak 0,00 093 mmol/g szabad amin maradt (lásd I. táblázat), azaz az eredeti aminocsoportoknak csak a 0,15%-a. A helyettesítés mértékét a védőcsoportok eltávolításával és ninhidrinelemzéssel végeztük, és azt találtuk, hogy 0,32 mmol/g a semlegesített H-Lys(ClZ)MBHA-gyantán. Ez jól egyezik a 0,30 mmol/g BocLys(ClZ)/g gyanta kvantitatív kapcsolásával (lásd II. táblázat).
(b) Boc-jTaeg] 3-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta lépésenkénti összerakása
Az (a) szekcióban készített teljes H-Lys(ClZ)MBHA-gyantasarzsot közvetlenül használjuk (ugyanabban a reakcióedényben) a Boc-[Taeg]3-Lys(ClZ)MBHA-gyanta készítéséhez, egyedi kapcsolások alkalmazásával („3. szintézisprotokoll”), 2,5 ekvivalens BocTaeg-OPfp-t alkalmazva tiszta diklór-metánban. A kvantitatív ninhidrinreakciót a szintézis során végig alkalmazzuk (lásd II. táblázat).
(c) Boc-[Taegjg-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta lépésenként! összerakása
Körülbelül 4,5 g nedves Boc-[Taeg]3-Lys(ClZ)MBHA-gyantát (körülbelül 0,36 mmol növekedő lánc; összesen körülbelül 19 g, a (b) szekcióban készített nedves gyantából kivéve) egy 55 ml-es SPPS reakcióedénybe helyezünk. A Boc-[Taeg]g-Lys(ClZ)MBHA-gyantát egyedi kapcsolásokkal rakjuk össze („4. szintézisprotokoll”), 2,5 ekvivalens BocTaegOPfp-t használva körülbelül 30%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben. A szintézis menetét minden lépésben a kvantitatív ninhidrinreakcióval követjük (lásd II. táblázat).
(d) Boc-jTaeg] 10-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta lépésenkénti összerakása
Körülbelül 1 g nedves Boc-[Taeg]g-Lys(ClZ)MBHA-gyantát (körülbelül 0,09 mmol növekedő lánc; összesen körülbelül 4 g, a (c) szekcióban készített nedves gyantából kivéve) egy 20 ml-es SPPS reakcióedénybe helyezünk. A Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)MBHA-gyantát egyedi kapcsolásokkal rakjuk össze, az
HU 221 003 Bl előző szekcióban használt egyedi lépéses protokoll alkalmazásával, 2,5 ekvivalens BocTaeg-OPfp-t használva körülbelül 30%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben. A reakcióelegy térfogata 3 ml (erős rázás). A szintézis menetét minden lépésben a kvantitatív ninhidrinreakcióval követjük (lásd II. táblázat).
II. táblázat
Szintézislépés Kapcsolt csoport Helyettesítés a védőcsoport eltávolítása után (mmol/g) Megmaradt szabad aminocsoport (gmol/g) Kapcsolás becsült mértéke
Mért Elméleti Egyszeri kapcsolás Acetilezés %
| „0” BocLys(ClZ) 0,32 0,28 0,93
[ 1 BocTaeg 0,23 0,26 0,97 0,54 >99,9
1 2 BocTaeg 0,21 0,24 0,92 0,46 99,8
3 BocTaeg 0,19 0,23 1,00 0,57 99,7
4 BocTaeg 0,18 0,21 1,85 99,3
5 BocTaeg 0,17 0,20 2,01 0,19 99,9
6 BocTaeg 0,15 0,19 1,69 0,10 99,0
7 BocTaeg 0,11 0,18 1,11 0,66 99,1
8 BocTaeg 0,12 0,17 1,82 0,44 99,0
9 BocTaeg 0,10 0,17 5,63 0,56 94,8
1 10 BocTaeg 0,11 0,16 1,54 0,67 99,1
(e) Ac-[Taeg] l0-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta szintézise
Miután a Boc-[Taeg]I0-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta egy részéről (becsült száraztömeg körülbelül 45 mg) eltávolítottuk a védőcsoportokat, kvantitatíve acetilezzük egy 2 ml-es ecetsavanhidrid/piridin/diklór-metán eleggyel (1:1:2, térfogat/térfogat/térfogat) 2 óra hosszat egy 3 ml-es szilárd fázisú reakcióelegyben.
(j) H-[Taeg] 1<rLys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta egy részét a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 24 mg nyersanyagot 76 mg száraz H[Taeg]5-Lys(ClZ)-BHA-gyanta HF-os hasításával. A 15,2 percnél eluálódó főcsúcs (amely tartalmaz szennyezéseket is, például deléciós peptideket és különböző melléktermékeket) az összabszorbancia körülbelül 78%-áért felelős. A főcsúcs felelős a „főcsúcs plusz deléciós csúcsok” abszorbanciájának 88%-áért, ami jól egyezik a 90,1%-ra becsült teljes kapcsolási kitermeléssel, amelyet úgy kapunk, hogy összegezzük a II. táblázatban szereplő egyes kapcsolási kitermeléseket. A nyersterméknek egy 7,2 mg-os részét két sarzsból tisztítjuk, félpreparatív fordított fázisú oszlopon (a főcsúcsot szárazjég/2propanol eleggyel hűtött lombikba szedve). Mindegyik
3,6 mg, 1 ml vízben. A fagyasztott oldatot közvetlenül liofilezzük (anélkül, hogy előtte speed-vac-ban eltávolítanánk az acetonitrilt), így kapunk 4,2 mg 82%-os tisztaságú H-[Taeg]10-Lys-NH2-t.
(g) Ac-[Taeg]ia-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
Az Ac-[Taeg]10-Lys(ClZ)-BHA-gyanta 400 mg-os részét (száraztömeg) a 17(c) példában leírtak alapján hasítjuk, azzal a különbséggel, hogy TFA-kezelést alkalmazunk, így kapunk 11,9 mg nyersterméket. A 15,8 percnél eluálódó főcsúcs az összabszorbancia körülbelül 75%-áért felelős. A nyerstermék 4,8 mg-os részét tisztítjuk, így kapunk körülbelül 3,5 mg >95% tisztaságú Ac-[Taeg]10-Lys-NH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2849,8, a mért m/z érték 2848,8.
(h) 3. szintézisprotokoll (1) Boc-védőcsoportok eltávolítása TFA/diklórmetán eleggyel (1:1 térfogat/térfogat), 3 ml, 3x1 perc és 1 χ 30 perc;
(2) mosás CH2Cl2-vel, 100 ml, 6χ 1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel (1:19 térfogat/térfogat), 3 ml, 3x2 perc;
(4) mosás CH2Cl2-vel, 100 ml, 6x1 perc, szárítás egy percig;
(5) a PNA-gyantából 2-5 mg-os mintát veszünk, alaposan megszárítjuk, majd kvantitatív ninhidrinelemzést végzünk a szubsztitúció meghatározására;
(6) 2,5 ekvivalens (3,75 mmol; 2,064 g), 35 ml diklór-metánban oldott BocTaeg-OPfp-adunk hozzá (a pentafluor-fenil-észter végkoncentrációja körülbelül 0,1 mól); a kapcsolási reakciót 12-24 óra hosszat hagyjuk lejátszódni rázatás közben;
(7) mosás dimetil-formamiddal, 100 ml, 1x2 perc (a BocTaeg-OH-csapadék eltávolítására);
(8) mosás diklór-metánnal, 100 ml, 4x1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel, (1:19, térfogat/térfogat) 100 ml, 2x2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 100ml, 6x1 perc;
(11) a védett PNA-ból 2-5 mg mintát kiveszünk kvalitatív ninhidrinteszt végzéséhez, majd további 2-5 mgot alaposan megszárítunk kvantitatív ninhidrinelemzés végzésére, a kapcsolás mértékének meghatározására;
HU 221 003 Bl (12) a reagálatlan aminocsoportokat acetilezéssel blokkoljuk, az acetilezéshez 100 ml ecetsavanhidrid/piridin/diklór-metán (1:1:2 térfogat/térfogat/térfogat) elegyét használjuk, 2 óra hosszat;
(13) mosás diklór-metánnal, 100 ml, 6χ 1 perc;
(14) 2x2-5 mg védett PNA-gyantát kiveszünk, semlegesítjük DIEA/diklór-metán eleggyel (1:19, térfogat/térfogat), majd diklór-metánnal mossuk a kvalitatív és kvantitatív ninhidrinelemzéshez.
(i) 4. szintézisprotokoll (1) Boc-védőcsoportok eltávolítása TFA/diklórmetán eleggyel (1:1 térfogat/térfogat), 25 ml, 3x1 perc és 1 x 30 perc;
(2) mosás CH2Cl2-vel, 25 ml, 6x1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel (1:19 térfogat/térfogat), 25 ml, 3 χ 2 perc;
(4) mosás CH2Cl2-vel, 25 ml, 6x1 perc, szárítás egy percig;
(5) a PNA-gyantából 2-5 mg-os mintát veszünk, alaposan megszárítjuk, majd kvantitatív ninhidrinelemzést végzünk a szubsztitúció meghatározására;
(6) 2,5 ekvivalens (0,92 mmol; 0,506 g), 6 ml diklór-metánban oldott BocTaeg-OPfp-t adunk hozzá, majd 3 ml diklór-metánt adunk hozzá (a pentafluorfenil-észter végkoncentrációja körülbelül 0,1 mól); a kapcsolási reakciót 20-24 óra hosszat hagyjuk lejátszódni rázatás közben;
(7) mosás dimetil-formamiddal, 25 ml, 1 χ 2 perc;
(8) mosás diklór-metánnal, 25 ml, 4x1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/CH2Cl2-vel, (1:19, térfogat/térfogat) 25 ml, 2 χ 2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 25 ml, 6 χ 1 perc;
(11) a védett PNA-ból 2-5 mg mintát kiveszünk kvalitatív ninhidrinteszt végzéséhez, majd további 2-5 mgot alaposan megszárítunk kvantitatív ninhidrinelemzés végzésére, a kapcsolás mértékének meghatározására;
(12) a reagálatlan aminocsoportokat acetilezéssel blokkoljuk, az acetilezéshez 25 ml ecetsavanhidrid/piridin/diklór-metán (1:1:2 térfogat/térfogat/térfogat) elegyét használjuk, 2 óra hosszat (kivéve az első ciklust);
(13) mosás diklór-metánnal, 25 ml, 6χ 1 perc;
(14) 2x2-5 mg védett PNA-gyantát kiveszünk, semlegesítjük DIEA/diklór-metán eleggyel (1:19, térfogat/térfogat), majd diklór-metánnal mossuk a kvalitatív és kvantitatív ninhidrinelemzéshez.
20. példa
H-[Taeg] 3-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) Boc-[Taeg]5-C(z)aeg-[Taeg]rLys(CIZ)MBHA-gyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 2,5 g nedves Boc-[Taeg]3-Lys(ClZ)MBHA-gyantát (körülbelül 1/6-a az összes megmaradó körülbelül 16 g nedves gyantának; körülbelül 0,75 g száraz gyanta körülbelül 0,15 mmol növekedő láncok) egy 6 ml-es SPPS reakcióedénybe tesszük. A Boc[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát úgy rakjuk össze, hogy duplán kapcsoljuk az összes Taegmaradékot, a szokásos 2,5 ekvivalens BocTaeg-OPfp alkalmazásával 2,5 ml, körülbelül 30%-os dimetilformamid/diklór-metán-elegyben, azzal a különbséggel, hogy az első csoportot egyszeresen kapcsoljuk. A C(Z)aeg-maradékot úgy visszük be, hogy 2,0 ekvivalens BocC(Z)aeg-OPfp-vel kapcsoljuk TFE/diklórmetán (1:2 térfogat/térfogat) oldatban. A szintézis menetét mindegyik lépésben a kvantitatív ninhidrinreakcióval követjük.
III. táblázat
Szintetikus lépés Kapcsolt csoport Helyettesítés a védőcsoport eltávolítása után (mmol/g) Megmaradt szabad aminocsoport (pmol/g) Kapcsolás becsült mértéke
Mért Elméleti 1. kapcsolás 2. kapcsolás Acetizlezés %
3 0,19 0,23 1,00 0,57
4 BocTaeg 0,17 0,21 4,88 97,3 97,3
5 BocC(Z)aeg 0,11 0,20 70,20 27,98 1,33 78,4(46)
6 BocTaeg 0,10 0,19 24,79 4,58 2,40 95,4(75)
7 BocTaeg 0,09 0,18 8,55 1,61 0,20 >99,9(93)
8 BocTaeg 0,08 0,17 6,53 0,80 0,45 99,0(91)
1 9 BocTaeg 0,07 0,16 9,26 3,66 0,61 94,8(86)
1 ιθ BocTaeg 0,07 0,15 5,32 1,48 0,60 98,8(86)
(b) H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]rLys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása 55
A Boc-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys(Clz)-BHAgyanta egy részét az l(c) példában leírtak alapján kezeljük, 66,9 mg száraz H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4Lys(ClZ)-BHA-gyanta HF-os hasításával 14,4 mg nyersanyagot kapunk. A 14,5 percnél jelentkező fő- 60 csúcs az összabszorbancia >50%-áért felelős. A nyerstermékből egy 100,0 mg-os részt 8 részletben tisztítunk (mindegyik részt 1 ml vízben oldva), így kapunk körülbelül 9,1 mg 96%-os tisztaságú H-[Taeg]5-Caeg[Taeg]4-Lys-NH2-t (13B. ábra). Az (M+H)+-ra számított m/z érték=2793,8, a mért m/z érték=2790,6.
HU 221 003 Bl
21. példa
Acr'-(Taeg)l0-Lys-NH2 kötődése a dA/0-hez (11 A. ábra)
100 ng Acr'JTaegjjo-Lys-t 15 percig szobahőmérsékleten inkubálunk 50 cps 5’[32P]-vel végjelzett d(GATCCA10G) oligonukleotiddal 20 ml TE-pufferben (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 1 mmol/1 EDTA). A mintát jégbe hűtjük (15 perc), majd poli(akril-amid) gélelektroforézissel elemezzük. 10 μΐ mintához 2 μΐ 50%-os glicerint, 5 TBE-t (TBE=90 mmol/1 Triszborát, 1 mmol/1 EDTA, pH=8,3) adunk, majd a mintát poli(akril-amid) gélelektroforézissel (15% akrilamid, 0,5% biszakrilamid) elemezzük TBE-pufferben 4 °Con. A minta 10 μΐ-es részét liofilezzük, majd 10 μΐ 80%os formamid, 1 TBE összetételű oldatban újra oldjuk, 5 percig 90 °C-on tartjuk, majd karbamid/poli(akrilamid) gélelektroforézissel elemezzük (15% karbamid, 0,5% biszakrilamid, 7 mol/1 karbamid) TBE-pufferben. A [32P]-t tartalmazó DNS-csíkokat autoradiográfiával tesszük láthatóvá, erősítőfóliát és Agfa Curix RPI röntgenfilmet használunk (expozíció -80 °C, 2 óra).
Az oligonukleotidokat Biosearch 7500 DNS-szintetizátoron szintetizáljuk, gamma[32P]-ATP-vel jelezzük (Amersham, 5000 Ci/mmol) polinukleotid-kináz alkalmazásával, majd poli(akril-amid) gélelektroforézissel tisztítjuk, standardtechnikák alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)].
22. példa
Lánchelyettesítési komplex képződése
Egy plazmidkonstrukció DNS-szekvenciájában található dA10-dT10 célszekvenciát készítünk, oly módon, hogy két oligonukleotidot [d(GATCCA10G)+ + d(GATCCT10G)] klónozunk a pUC19 plazmid BamHI hasítási helyére, Escherichia coli JM101 törzsben, a standardtechnikák alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)]. A kívánt plazmidot (jele pTlO) az egyik keletkező klónból izoláljuk, majd lúgos extrakcióval és CsCl-en végzett centrifugálással tisztítjuk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)]. A 3’-[32P]-vel végjelzett 248 bp méretű DNSffagmenst, amely a dA10dT10 célszekvenciát tartalmazza, úgy állítjuk elő, hogy a pTlO DNS-t EcoRI és PvuII restrikciós enzimekkel hasítjuk, a hasított DNS-t a[32ldATP-vel jelezzük (Amersham, 4000 Ci/mmol), az Escherichia coli-DNS-polimeráz Klenow-fragmensének felhasználásával (Boehringer Mannheim), majd a 248 bp méretű DNS-fragmenst poli(akrilamid) gélelektroforézissel tisztítjuk (5% akrilamid, 0,06% biszakrilamid, TBE-puffer). Ezt a DNS-fragmenset úgy állítjuk elő, hogy az 5’ végen [32P]-vel végjelezzük, az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pTlO plazmidot baktérium-alkalikusfoszfatázzal kezelve (Boehringer Mannheim), majd a plazmid-DNS-t gélelektroforézissel tisztítjuk alacsony olvadáspontú agarózban, majd gamma[32P]-ATP-vel jelezzük, polinukleotid-kináz alkalmazásával. A PvuII restrikciós enzimmel való kezelés után a 248 bp méretű fragmenst a fentiekben leírt módon tisztítjuk.
Az Acr1-(Taeg)]0-Lys-NH2 és a 248 bp méretű DNS fragmens közötti komplex úgy alakul ki, hogy 50 ng Acr'-(Taeg)10-Lys-NH2-t 500 cps 32P-vel jelzett 248 bp méretű ffagmenssel, valamint 0,5 pg boíjútimusz-DNSsel inkubáljuk 100 μΐ pufferben 60 percig 37 °C-on.
23. példa
A lánchelyettesítő komplex vizsgálata (a) Staphylococcus nukleázzal (12B. ábra)
A lánchelyettesítő komplexet 25 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4,1 mmol/1 MgCl2 0,1 mmol/1 CaCl2 összetételű pufferben alakítjuk ki, a fentiekben leírt módon. A komplexet 5 percig 20 °C-on 750 E/ml Staphylococcusnukleázzal kezeljük (Boehringer Mannheim), majd a reakciót 25 mmol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le. A DNS-t 2 térfogat etanol, 2% kálium-acetát hozzáadásával kicsapjuk, majd 80% formamid, TBE összetételű oldatban oldjuk, 5 percig 90 °C-on tartjuk, majd nagy felbontású poli(akril-amid) gélelektroforézissel (10% akrilamid, 0,3% biszakrilamid, 7 mol/1 karbamid) és autoradiográfiával vizsgáljuk.
(b) Affinitás fotohasitás (12A.+12B. ábra)
A komplexet TE-pufferben hozzuk létre. Egy Eppendorf csőben levő mintát felülről 300 nm-es fénnyel (Philips TL 20 W/12 fluoreszcens fénycső, 24 Jm“2s_1) 30 percig sugárzunk be. A DNS-t a fentiek szerint kicsapjuk, majd 20 percre 90 °C-ra melegítjük. A liofilezést követően a DNS-t a fentiekben leírt módon poli(akrilamid) gélelektroforézissel vizsgáljuk.
(c) Kálium-permanganát (12B. ábra)
A komplexet 100 μΐ TE-ben készítjük, és 5 μΐ 20 mmol/1 koncentrációjú KMnO4-et adunk hozzá. 20 °C-on 15 másodpercig hagyjuk reagálni, majd a reakciót 50 μΐ 1,5 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát (pH=7,0), 1 mol/1 koncentrációjú β-merkapto-etanol összetételű oldat hozzáadásával állítjuk le. A DNS-t kicsapjuk, piperidinnel kezeljük, majd a fentiekben leírt módon elemezzük.
(d) Fotolenyomat-készítés (12B. ábra)
A komplexet 100 μΐ ΤΕ-pufferben hozzuk létre, majd 0,1 pg/μΙ diazo-kapcsolt akridint (DHA), [Nielsen et al., Nucleic Acids Research, 16, 3877-88 (1988)] adunk hozzá. A mintát 30 percig 365 nm-es fénnyel sugározzuk be (Philips TL 20 W/09N, 22 Jm-2s-'), majd az „affinitás fotohasitás” részben leírtak alapján kezeljük.
(e) Sj nukleáz (12C. ábra)
A komplexet 50 nmol/1 nátrium-acetát, 200 mmol/1 NaCl, 0,5% glicerin, 1 mmol/1 ZnCl2 (pH=4,5) összetételű pufferben hozzuk létre, majd 5 percig 20 °C-on 0,5 E/ml Sj nukleázzal kezeljük (Boehringer Mannheim). A reakciót a „Staphylococcus-nukleáz” pontban leírtak alapján állítjuk le és kezeljük tovább.
24. példa
N-Benzil-oxi-karbonil-N’-(boc-aminoetil)-glicin
52,86 g (0,477 mól) aminoetil-glicint feloldunk 900 ml vízben, majd 900 ml dioxánt adunk hozzá.
HU 221 003 Bl
A pH-t 11,2-re állítjuk 2 mol/1 NaOH hozzáadásával. Miközben a pH-t 11,2-n tartjuk, 128,4 g (0,537 mól) terc-butil-p-nitro-fenil-karbonátot oldunk 720 ml dioxánban, és 2 óra alatt cseppenként hozzáadjuk a vizes oldathoz. A pH-t még legalább 3 óra hosszat 11,2 értéken tartjuk, majd egy éjszakán át kevertetjük a reakcióelegyet. A sárga oldatot 0 °C-ra hűtjük, pH-ját 3,5re állítjuk 2 mol/1 sósavval. Az elegyet kloroformmal mossuk (4x100 ml), majd a vizes fázis pH-ját 9,5-re állítjuk 2 mol/1 nátrium-hidroxid hozzáadásával (0 °Con). 73,5 ml (0,515 mól) benzil-oxi-karbonil-kloridot adunk hozzá fél óra alatt, miközben a pH-t 9,5-ön tartjuk 2 mol/1 nátrium-hidroxiddal. A következő 4 órában a pH-t gyakran állítjuk, majd az oldatot éjszakán át kevertetjük. A következő napon az oldatot éterrel mossuk (3 χ 600 ml), majd az oldat pH-ját 1,5-re állítjuk 2 mol/1 sósavval (0 °C-on). A címben szereplő vegyületet etilacetátos extrakcióval állítjuk elő (5 χ 1000 ml). Az etilacetát-oldatot magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. így kapunk 138 g anyagot, amelyet 300 ml éterben oldunk, majd 1800 ml petroléter hozzáadásával kicsapjuk. Kitermelés 124,7 g (79%). Olvadáspont 64,5-85 °C. Elemanalízis C17H24N2O6 képletre: mért (számított)
C: 58,40 (57,94); H: 7,02 (6,86); N: 7,94(7,95).
•H-NMR (250 MHz, CDC13) δ: 7,33 & 7,32 (5H, Ph); 5,15 & 5,12 (2H, PhCH2); 4,03 & 4,01 (2H, NC7Í2CO2H); 3,46 (b, 2H, BocNHCH2Ctf2); 3,28 (b, 2H, BocNHCH2C//2); 1,43 & 1,40 (9H, Bu).
HPLC (260 nm) 20,71 perc (80,2%) és 21,57 perc (19,8%). Az UV spektrumok (200 nm-300 nm) azonosak, jelezve, hogy a kisebbik csúcs Bis-Z-AEG.
25. példa
N’-Boc-amino-etil-glicin-észter g (0,170 mól) N-benzil-oxi-karbonil-N’(boc-amino-etil)-glicint és 6,0 g N,N-dimetil-4-amino-piridint oldunk 500 ml abszolút etanolban, majd 0 °C-ra hűtjük, mielőtt 42,2 g (0,204 mól) DCC-t adunk hozzá. A jeges vízfürdőt 5 perc elteltével eltávolítjuk, majd a kevertetést további 2 óra hosszat folytatjuk. A kicsapott DCU-t (32,5 g szárítva) szűréssel eltávolítjuk, majd éténél mossuk (3 χ 100 ml). Az egyesített szűrletet ezután egymás után mossuk hígított kálium-hidrogén-szulfáttal (2x400 ml), hígított nátrium-hidrogén-karbonáttal (2 χ 400 ml) és telített nátrium-kloriddal (1 x400 ml). A szerves fázist megszűrjük, majd magnézium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így kapunk 66,1 g olajos anyagot, amely valamennyi DCU-t tartalmaz.
Az olajat 600 ml abszolút etanolban oldjuk, majd
6,6 g 10%-os csontszenes palládiumot adunk hozzá. Az oldatot atmoszferikus nyomáson hidrogénezzük, a tartályt 2 mol/1 nátrium-hidroxiddal töltjük fel. 4 óra elteltével 4,2 literes elméleti fogyásból 3,2 liter fogy el. A reakcióelegyet celiten szűrjük át, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így kapunk 39,5 g (94%) olajos anyagot. Az olajos anyag 13 g-os részletét szilikagél (SiO2)-kromatográfiával tisztítjuk. Miután
300 ml, diklór-metánban készült 20%-os petroléterrel eluáltuk, a címben szereplő vegyületet 1700 ml, diklórmetánban készített 5%-os metanolos oldattal eluáljuk. Az oldószert kielégítő tisztaság eléréséig eltávolítjuk a frakciókból (csökkentett nyomáson), a kitermelés 8,49 g. Egy másik módszer szerint 10 g nyersanyagot tisztítunk golyóshűtőn végzett desztillációval.
•H-NMR (250 MHz, CD3OD) δ; 4,77 (b, s, NH); 4,18 (q, 2H, MeC/f2-); 3,38 (s, 2H, NC/í2CO2Et); 3,16 (t,
2H, BocNHC//2CH2); 2,68 (t, 2H, BocNHCH2CW,);
1,43 (s, 9H, Bu) és 1,26 (t, 3H, CH3).
•3C-NMR δ: 171,4 (COEt); 156,6 (CO), 78,3 ((CH3)3Q; 59,9 (CH2); 49,0 (CH2); 48,1 (CH2);
39,0 (CH2); 26,9 (CH2) és 12,6 (CH3).
26. példa
N’ Boc-amino-elil-glicin-metil-észter
A fenti eljárást alkalmazzuk, azzal az eltéréssel, hogy etanol helyett metanolt használunk. A végterméket oszlopkromatográfíával tisztítjuk.
27. példa
-(Boc-aeg)-timin-etil-észter
13,5 g (54,8 mmol) N’-Boc-amino-etil-glicin-etilésztert, 9,84 g (60,3 mmol) DhbtOH-t és 11,1 g (60,3 mmol) l-karboxi-metil-timint oldunk 210 ml dimetil-formamidban. Ezután 210 ml diklór-metánt adunk az elegyhez. Az oldatot etanol/jég fürdőben 0 °C-ra hűtjük, majd 13,6 g (65,8 mmol) DCC-t adunk hozzá. A jeges fürdőt 1 óra múlva eltávolítjuk, majd a kevertetést még két óra hosszat folytatjuk szobahőmérsékleten. A kicsapódott DCU-t szűréssel eltávolítjuk, majd kétszer mossuk diklór-metánnal (2x75 ml). A kombinált szűrlethez 650 ml diklór-metánt adunk. Az oldatot ezután mossuk kálium-hidrogén-szulfáttal (2 χ 500 ml), hígított nátriumhidrogén-karbonáttal (3x500 ml) és telített nátriumkloriddal (1 χ 500 ml). A szerves fázisból szűréssel eltávolítunk valamennyi csapadékot, majd a szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Az olajos maradékot 150 ml diklórmetánban oldjuk, szűrjük, majd a címben szereplő vegyületet 350 ml petroléter hozzáadásával kicsapjuk 0 °C-on. A diklór-metán/petroléter eljárást még egyszer megismételjük. így kapunk 16,0 g (71%) anyagot, amely HPLC vizsgálatok alapján több mint 99%-os tisztaságú.
28. példa l-(Boc-aeg)-timin
A fentiekből származó anyagot 194 ml THF-ben szuszpendáljuk (0,2 mol/l-es oldat lesz), majd 116 ml 1 mol/1 vizes lítium-hidroxidot adunk hozzá. Az elegyet 45 percig kevertetjük szobahőmérsékleten, majd szűréssel eltávolítjuk a maradék DCU-t. 40 ml vizet adunk az oldathoz, amit azután 300 ml diklór-metánnal mosunk. További 30 ml vizet adunk hozzá, majd az alkalikus oldatot még egyszer mossuk 150 ml diklórmetánnal. A vizes oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd a pH-t 2-re állítjuk 1 mol/1 sósav hozzáadásával (körülbelül 110 ml). A címben szereplő vegyületet etil-acetáttal extraháljuk (9x200 ml), az egyesített extraktumokat
HU 221 003 Bl magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot metanolból lepároljuk, egy éjszakán át való szárítás után színtelen üvegszerű anyagot kapunk. Kitermelés 9,57 g (64%). HPLC >98% RT=14,8 perc.
Elemanalízis C16H24N4O7x0,25 H2O képletre:
mért (számított) C: 49,29 (49,42); H : 6,52 (6,35); N: 14,11 (14,41). Mivel a szekunder amin körül korlátozott a rotáció, ezért számos jel megduplázódik 2:1 arányban (a listában mj.-vel jelöljük a fő-, mi.-vel jelöljük a mellékcsúcsokat).
Ή-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ: 12,75 (b. s., IH, CO2H); 11,28 (s, „IH”, mj., imid NH); 11,26 (s, „IH”, mi., imid NH); 7,30 (s, „IH”, mj., T H-6); 7,26 (s, „IH”, mi., T H-6); 6,92 (b. t„ „IH”, mj., BocNH); 6,73 (b. t„ „IH”, mi., BocNH); 4,64 (s, „2H”, mj., C//2CON); 4,46 (s, „2H”, mj., CH2CON); 4,19 (s, „2H”, mi., C/72CO2H); 3,97 (s, „2H”, mj., CH2CO2H); 3,63-3,01 (feloldatlan m, víz, CH2CH2); 1,75 (s, CH3) és 1,38 (s, 9H, »Bu).
29. példa
N4-Benzil-oxi-karbonil-l-(Boc-aeg)-citozin
5,0 g (20,3 mmol) N’-Boc-amino-etil-glicin-etilésztert, 3,64 g (22,3 mmol) DhbtOH-t és 6,77 g (22,3 mmol) N4-benzil-oxi-karbonil-l-karboxi-metil-citozint szuszpendálunk 100 ml dimetil-formamidban. Ezután 100 ml diklór-metánt adunk hozzá. Az oldatot 0 °Cra hűtjük, és 5,03 g (24,4 mmol) DCC-t adunk hozzá. A jeges fürdőt 2 óra elteltével eltávolítjuk, majd a kevertetést még egy óra hosszat folytatjuk szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet ezután csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 100 ml éterben szuszpendáljuk, majd erősen kevertetjük 30 percig. A szilárd anyagot szűréssel izoláljuk, majd az éteres mosást kétszer megismételjük. Az anyagot azután erősen kevertetjük 15 percig híg nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal (körülbelül 4%-os oldat, 100 ml). Ezt az eljárást megismételjük, aminek eredményeképpen szárítás után 17,0 g sárgás szilárd anyagot kapunk. A szilárd anyagot 200 ml dioxánnal forraljuk, majd forrón szüljük. Hűtés után 200 ml vizet adunk hozzá. A kicsapódott anyagot szűréssel izoláljuk, vízzel mossuk, majd szárítjuk. A HPLC szerint (260 nm-en végzett megfigyelés) ennek az anyagnak a tisztasága 99%-nál nagyobb, a DCU mellett. Az észtert ezután 100 ml THF-ben szuszpendáljuk, 0 °C-ra hűtjük, majd 61 ml 1 mol/1 LiOH-t adunk hozzá. Miután 15 percig kevertettük, a keveréket megszüljük, majd a szűrletet diklór-metánnal mossuk (2x 150 ml). Az alkalikus oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd a pH-t 2 mol/1 sósavval 2,0-ra állítjuk. A címben szereplő vegyületet szűréssel izoláljuk, majd egyszer mossuk vízzel, így kapunk szárítás után 11,3 g fehér port. Az anyagot 300 ml diklór-metánban oldjuk, majd 300 ml petrolétert adunk hozzá. A szűrés és mosás után 7,1 g (69%) anyagot kapunk, tisztasága HPLC mérés szerint 99%, RT=19,5 perc, egy kis szennyeződés található 12,6 percnél (körülbelül 1%), ez valószínűleg a Z-védőcsoport eltávolításával kapott monomer.
Elemanalízis C23H29N5O8 képletre: mért (számított)
C: 54,16 (14,87); H: 5,76 (5,81) és N: 13,65 (13,91).
Ή-NMR (240 MHz, DMSO-d6) δ: 10,78 (b. s, IH,
CO2H); 7,88 (két átlapoló dublett, IH, Cyt H-5);
7.41- 7,32 (m, 5H, Ph); 7,01 (2 átlapoló dublett,
IH, Cyt H-6); 6,94 & 6,78 (feloldatlan triplettek,
IH, BocNH); 5,19 (s, 2H, PhCT/2); 4,81-4,62 (s,
2H, CH2CON); 4,17-3,98 (s, 2H, CH2CO2H);
3.42- 3,03 (m, benne víz, CH2CH2) és 1,38 &
1,37 (s, 9H, lBu).
13C-NMR δ: 150,88; 128,52; 128,18; 127,96; 93,90;
66,53; 49,58 és 28,22.
IR: frekvencia cm-1 egységben (intenzitás)
3423 (26,4), 3035 (53,2), 2978 (41,4), 1736 (17,3),
1658 (3,8), 1563 (23,0), 1501 (6,8) és 1456 (26,4).
30. példa
9-Karboxi-metil-adenin-etil-észter
10,0 g (74 mmol) adenint és 10,29 g (74,0 mmol) kálium-karbonátot szuszpendálunk dimetil-formamidban, majd 8,24 ml (74 mmol) etil-bróm-acetátot adunk hozzá. A szuszpenziót 2,5 óra hosszat nitrogénatmoszférában kevertetjük, majd megszűrjük. A szilárd maradékot háromszor mossuk dimetil-formamiddal (10 ml). Az egyesített szűrleteket csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A sárgás narancsszínű szilárd anyagot 200 ml vízre öntjük, majd annyi 4 mol/1 sósavat adunk hozzá, hogy a pH-értéke körülbelül 6 legyen. Miután 10 percig 0 °C-on kevertettük, a szilárd anyagot kiszűrjük, vízzel mossuk, majd 150 ml 96%-os etanolból kristályosítjuk. A címben szereplő vegyületet szűréssel izoláljuk, majd alaposan mossuk éterrel. Kitermelés 3,4 g (20%). Olvadáspont 215,5-220 °C. Elemanalízis C9HnN5O2 képletre: talált (számított)
C: 48,86(48,65); H: 5,01 (4,91);N: 31,66(31,42). Ή-NMR (250 MHz, DMOS-d^ δ: (s, 2H, H-2 & H8), 7,25 (b. s., 2H, NH2) 5,06 (2H, NCH2) 4,17 (q,
2H, J=7,ll Hz, OCH2) és 1,21 (t, 3H, J=7,13 Hz,
NCH2) i3C-NMR δ: 152,70,141,30, 61,41,43,97 és 14,07. FAB-MS 222 (MH+).
IR [frekvencia cm-‘-ben (intenzitás)]: 3855 (54,3),
3274 (10,4), 3246 (14,0), 3117 (5,3), 2889 (22,3),
2940 (33,9), 2876 (43,4), 2753 (49,0), 2346 (56,1),
2106 (57,1), 1899 (55,7), 1762 (14,2), 1742 (14,2),
1742 (1,0), 1671 (1,8), 1644 (10,9), 1606 (0,6),
1582 (7,1), 1522 (43,8), 1477 (7,2), 1445 (35,8) és
1422 (8,6).
Az alkilezés pozícióját röntgen-krisztallográfiával határozzuk meg olyan kristályokon, amelyeket 96%-os etanolból kristályosítunk át.
Egy másik módszer szerint a 9-karboxi-metiladenin-etil-észtert az alábbiak szerint lehet előállítani. 50,0 g (0,37 mmol) adenint oldunk 1100 ml dimetilformamidban kétliteres háromnyakú gömblombikban, amely egy nitrogénbevezetóvel, mechanikus keverővei és csepegtetőtölcsérrel van ellátva, majd 16,4 g (0,407 mól) hexánnal mosott nátrium-hidrid-ásványolaj diszperziót adunk hozzá. A keveréket 2 óra hosszat
HU 221 003 Bl kevertetjük, majd 3 óra alatt cseppenként 75 ml (0,67 mól) etil-bróm-acetátot adunk hozzá. A keveréket még egy óra hosszat kevertetjük, majd vékonyrétegkromatográfiával vizsgálva megállapíthatjuk, hogy az adenin teljesen átalakult. A reakcióelegyet 133,3 Pa nyomáson szárazra pároljuk, majd 500 ml vizet adunk az olajos maradékhoz, aminek hatására a címben szereplő vegyület kikristályosodik. A szilárd anyagot 600 ml 96%-os etanolból kristályosítjuk. Kitermelés szárítás után 53,7 g (65,6%). Tisztaság HPLC alapján (215 nm-en) >99,5%.
31. példa
N6-Benzil-oxi-karbonil-9karboxi-metil-adenin-etil-észter
3,4 g (15,4 mmol) 9-karboxi-metil-adenin-etilésztert oldunk 50 ml vízmentes dimetil-formamidban óvatos melegítés közben, majd 20 °C-ra hűtjük, és 62 mmol N-etil-benzil-oxi-karbonil-imidazol 50 ml diklór-metánnal készült oldatához csepegtetjük 15 perc alatt, jeges hűtés közben. Némi csapadékképződés figyelhető meg. A jeges fürdőt eltávolítjuk, majd az oldatot egy éjszakán át kevertetjük. A reakcióelegyet 100 ml telített nátrium-hidrogén-karbonáttal kezeljük. 10 perces kevertetés után a fázisokat elválasztjuk, majd a szerves fázist mossuk egymás után egy térfogat vízzel, majd hígított kálium-hidrogén-szulfáttal (kétszer), végül pedig telített nátrium-kloriddal. Az oldatot magnéziumszulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így kapunk 11 g olajos anyagot. Az anyagot 25 ml diklór-metánban oldjuk, 0 °C-ra hűtjük, majd 50 ml petroléterrel kicsapjuk. Ezt az eljárást még egyszer megismételjük, így kapunk 3,45 g (63%) címben szereplő vegyületet. Olvadáspont 132-35 °C. Elemanalizis C17H17N5O4 képletre: mért (számított)
C: 56,95 (57,46); H: 4,71 (4,82); N: 19,35 (19,71) •H-NMR (250 MHz; CDC13) Ő: 8,77 (s, IH, H-2 vagy
H-8); 7,99 (s, IH, H-2 vagy H-8); 7,45-7,26 (m, 5H, Ph); 5,31 (s, 2H, N-C/f^; 4,96 (s, 2H, Ph-CZ/2); 4,27 (q, 2H, J=7,15 Hz, C772CH3) és 1,30 (t, 3H, J=7,15 Hz, CH2C//3).
*3C-NMR δ: 153,09; 143,11; 128,66; 67,84; 62,51; 44,24 és 14,09.
FAB-MS: 356 (MH+)és 312 (MH+-CO2).
IR: frekvencia cm*‘-ben (intenzitás). 3423 (52,1);
3182 (52,8); 3115 (52,1); 3031 (47,9); 2981 (38,6); 1747 (1,1); 1617 (4,8); 15,87 (8,4); 1552 (25,2); 1511 (45,2); 1492 (37,9); 1465 (14,0) és 1413 (37,3).
32. példa
N6-Benzil-oxi-karbonil-9-karboxi-metil-adenin
3,2 g (9,01 mmol) N6-benzil-oxi-karbonil-9karboxi-metil-adenin-etil-észtert elegyítünk 50 ml etanollal, majd 0 °C-ra hűtjük. 50 ml 2 mol/l-es nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá, ennek hatására az anyag gyorsan oldatba megy. 30 percig 0 °C-on tartjuk, majd a lúgos oldatot 2 χ 50 ml diklór-metánnal mossuk. A vizes oldat pH-ját 1,0-ra állítjuk 4 mol/1 sósav hozzáadásával 0 °C-on, ennek hatására a címben szereplő vegyület kicsapódik. Szűrés, vízzel való mosás és szárítás után a kitermelés 3,08 g (104%). A termék sót tartalmaz, és az elemanalízisben ez tükröződik is.
Elemanalízis C15H13N5O4 képletre: mért (számított)
C: 46,32 (55,05); H: 4,24 (4,00); N: 18,1 (21,4) és
C/N: 2,57 (2,56).
‘H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ: 8,70 (s, 2H, H2 és H-8); 7,50-7,35 (m, 5H, pH); 5,27 (s, 2H,
N-CZZj); és 5,15 (s, 2H, Ph-CZZ2).
‘3C-NMR δ: 168,77, 152,54, 151,36, 148,75, 145,13,
128,51,128,17,127,98,66,76 és 44,67.
IR (KBr) 3484 (18,3); 3109 (15,9); 3087 (15,0);
2966 (17,1); 2927 (19,9); 2383 (53,8); 1960 (62,7);
1739 (2,5); 1688 (5,2); 1655 (0,9); 1594 (11,7);
1560 (12,3); 1530 (26,3); 1499 (30,5); 1475 (10,4);
1455 (14,0); 1429 (24,5) és 1411 (23,6).
FAB-MS: 328 (MH+) és 284 (MH+-CO2).
HPLC (215 nm, 260 nm) az 1. rendszerben:
15,18 perc, kisebb szennyeződések, mindegyik 2%nál kisebb.
33. példa
N6-Benzil-oxi-karbonil-l-(Boc-aeg)-adenin-etilészter
2,0 g (8,12 mmol) N’-Boc-amino-etil-glicin-etilésztert, 1,46 g (8,93 mmol) DhbtOH-t és 2,92 g (8,93 mmol) N6-benzil-oxi-karbonil-9-karboxi-metiladenint oldunk 15 ml dimetil-formamidban. Ezután 15 ml diklór-metánt adunk hozzá. Az oldatot etanol/jég fürdőben 0 °C-ra hűtjük. 2,01 g (9,74 mmol) DCC-t adunk hozzá. A jeges fürdőt 2,5 óra elteltével eltávolítjuk, majd a kevertetést még további 1,5 óra hosszat szobahőmérsékleten folytatjuk. A kicsapódott DCU-t szűréssel eltávolítjuk, majd egyszer mossuk 15 ml dimetilformamiddal és kétszer 15 ml diklór-metánnal. Az egyesített szűrlethez még 100 ml diklór-metánt adunk. Az oldatot ezután egymás után mossuk híg nátrium-hidrogénkarbonáttal (2x100 ml), hígított kálium-hidrogénszulfáttal (2x100 ml), majd végül telített nátriumkloriddal (1 χ 100 ml). A szerves fázist csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így kapunk 3,28 g (73%) sárgás olajos anyagot. A nyerstermék HPLC-s vizsgálata azt mutatja, hogy csak 66%-os tisztaságú, számos szennyeződést tartalmaz, a főcsúcsnál mind kevésbé, mind erősebben polárosokat. Az olajat 50 ml abszolút etanolban oldjuk, majd aktív szenet adunk hozzá. 5 percig kevertetjük, és az oldatot leszűrjük. A szűrlethez 30 ml vizet adunk, majd egy éjszakán át kevertetjük. A következő napon a fehér csapadékot szűréssel eltávolítjuk, vízzel mossuk, szárítjuk, így kapunk 1,16 g (26%) anyagot, amelynek tisztasága HPLC-s mérés szerint 98%-nál magasabb. Az anyalúghoz vizet adva újabb 0,53 g, körülbelül 95%-os tisztaságú anyagot kapunk. Elemanalízis C26H33N7O7 χ H2O képletre: mért (számított)
C: 55,01 (54,44); H: 6,85 (6,15); N: 16,47(17,09) ‘H-NMR (250 MHz, CDC13) δ: 8,74 (s, IH, Ade H2); 8,18 (b. s, IH, ZNH); 8,10 & 8,04 (s, IH, H-8);
7,46-7,34 (m, 5H, Ph); 5,63 (feloldatlan, t, IH,
BocNH); 5,30 (s, 2H, PhCH2); 5,16 & 5,00 (s, 2H,
HU 221 003 BI
C//2CON); 4,29 & 4,06 (s, 2H, Ctf2CO2H); 4,20 (q, 2H, OC//2CH3); 3,67-3,29 (m, 4H, CH2CH2); 1,42 (s, 9H, ’Bu) és 1,27 (t, 3H, OCH2C//3. A spektrumban etanol és DCU nyomai láthatók.
34. példa
N6-Benzil-oxi-karbonil-l-(Boc-aeg)-adenin 1,48 g (2,66 mmol) N6-benzil-oxi-karbonil-l-(Bocaeg)-adenin-etil-észtert szuszpendálunk 13 ml THFben, majd a reakcióelegyet 0 °C-ra hűtjük. 8 ml 1 mol/1 lítium-hidroxidot adunk hozzá. 15 perces kevertetés után a reakcióelegyet megszüljük, 25 ml plusz vizet adunk hozzá, majd az oldatot 2 χ 25 ml diklór-metánnal mossuk. A vizes oldat pH-ját 1 mol/1 sósavval 2,0-ra állítjuk. A csapadékot szűréssel izoláljuk, vízzel mossuk, majd szárítjuk, így kapunk 0,83 g anyagot (58%). A terméket még kétszer kicsapjuk diklór-metán/petroléter eleggyel, így kapunk 0,77 g (55%) anyagot szárítás után. Olvadáspont 119 °C (bomlik).
Elemanalízis C24H29N7O7xH2O képletre: mért (számított)
C: 53,32 (52,84);H: 5,71 (5,73); N: 17,68(17,97)
FAB-MS 528,5 (MH+) •H-NMR (250 MHz, DMSO-dJ δ: 12,75 (nagyon b, IH, CO2H); 10,65 (b. s, IH, ZNH); 8,59 (d, IH, J=2,14 Hz, Ade H-2); 8,31 (s, IH, Ade H-8); 7,49-7,31 (m, 5H, Ph); 7,03 & 6,75 (feloldatlan, t, IH, Ade H-8); 5,33 & 5,16 (s, 2H, CH2CON); 5,22 (s, 2H, PhCtf2); 5,22 (s, 2H, PhCtf2); 4,34-3,99 (s, 2H, CH2CO2H); 3,54-3,03 (m’s, vizet tartalmaz, CH2CH2) és 1,39 & 1,37 (s, 9H, *Bu).
•3C-NMRö: 170,4; 166,6; 152,3; 151,5; 149,5; 145,2; 128,5; 128,0; 127,9; 66,32; 47,63; 47,03; 43,87 és 28,24.
35. példa
2-Amino-6-klór-9-karboxi-metil-purin
5,02 g (29,6 mmol) 2-amino-6-klór-purin és
12,91 g (93,5 mmol) 50 ml dimetil-formamiddal készített szuszpenziójához 4,70 g (22,8 mmol) brómecetsavat adunk. A reakcióelegyet erősen kevertetjük 20 óra hosszat nitrogénatmoszférában. Ezután 150 ml vizet adunk hozzá, majd az oldatot celiten átszűrjük, így tiszta sárga oldatot kapunk. Az oldatot 4 mol/1 sósavval pH=3-4 értékre savanyítjuk. A csapadékot szűrjük és csökkentett nyomáson szárítjuk szárítószer felett. Kitermelés 3,02 g (44,8%).
•H-NMR (DMSO-dg): d=4,88 ppm (s, 2H); 6,95 (s, 2H); 8,10 (s, IH).
36. példa
2-Amino-6-benzil-oxi-9-karboxi-metil-purin 2,0 g (87,0 mmol) nátriumot feloldunk 20 ml benzil-alkoholban, majd 2 óra hosszat 130 °C-on tartjuk. Miután 0 °C-ra hűtöttük, 85 ml dimetilformamiddal készült 2-amino-6-klór-9-karboxi-metilpurin-oldatot (4,05 g, 18,0 mmol) adunk hozzá lassan, majd a keletkező szuszpenziót egy éjszakán át 29 °Con kevertetjük. 100 ml 1 mol/1 nátrium-hidroxidoldatot adunk hozzá, majd a tiszta oldatot 3 χ 100 ml etil-acetáttal mossuk. A vizes fázist azután 4 mol/1 sósavval pH=3-ra savanyítjuk. A csapadékot 200 ml etilacetátban felvesszük, majd a vizes fázist 2 χ 100 ml etilacetáttal extiaháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 2x75 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 300 ml etanolból átkristályosítjuk. Szárítószer felett csökkentett nyomáson szárítva 2,76 g anyagot kapunk (52%). Olvadáspont 159-65 °C.
Elemanalízis (számított, mért):
C (56,18; 55,97); H (4,38; 4,32); N (23,4; 23,10).
•H-NMR (DMSO-d6) δ: 4,82 ppm (s, 2H); 5,51 (s, 2H); 6,45 (s, 2H); 7,45 (m, 5H); 7,82 (s, IH).
37. példa
N-([2-Amino-6-benzil-oxi-purin-9-il]-acetil)-N-(2Boc-amino-etil)-glicin [BocGaeg-OH monomer] 0,50 g (1,67 mmol) 2-amino-6-benzil-oxi-9-karboximetil-purint, 0,65 g (2,80 mmol) metil-N-(2-[terc-butoxikarbonil-amino]-etil-glicinátot, 0,54 g (4,19 mmol) diizopropil-etil-amint és 0,798 g (1,71 mmol) bróm-triszpirrolidino-foszfónium-hexa-fluor-foszfátot (PyBroP) kevertetünk 4 óra hosszat dimetil-formamidban. A tiszta oldatot 40 ml 1 mol/1 jégbehűtött nátrium-hidrogén-karbonát-oldatba öntjük, majd 3x40 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist 2x40 ml 1 mol/1 káliumhidrogén-szulfáttal, 1 x 40 ml 1 mol/1 nátrium-hidrogénkarbonáttal és 60 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk. Vízmentes nátrium-szulfáton való szárítás és csökkentett nyomáson való bepárlás után a szilárd maradékot 20 ml etil-acetát/hexán 2:1 arányú elegyéből átkristályosítjuk, így kapjuk a metil-észtert 63%-os kitermeléssel [MS-FAB 514 (M+l)]. A hidrolízist úgy végezzük, hogy az észtert 30 ml etanol/víz 1:2 elegyben oldjuk, amely 1 ml tömény nátrium-hidroxidot tartalmaz. Kétórás kevertetés után az oldatot megszűrjük és pH=3-ra savanyítjuk 4 mol/1 sósav hozzáadásával. A címben szereplő vegyületet szűréssel nyerjük ki. Kitermelés 370 mg (72% a hidrolízisre). A HPLC-vel mért tisztaság 99%nál nagyobb. A szekunder amid körüli korlátozott rotáció következtében számos jel 2:1 arányban megduplázódik (a listában mj.-vel jelöljük a fő-, mi.-vel a másodlagos csúcsokat).
•H-NMR (250 MHz, DMSO-dJ: d=l,4 ppm (s, 9H);
3,2 (m, 2H); 3,6 (m, 2H); 4,1 (s, mj„ CONRC/í2COOH); 4,4 (s, mj„ Gua-Ctf2CO); 5,0 (s, mi., Gua-C7/2CO-); 5,2 (s, mj., Gua-C//2CO); 5,6 (s, 2H); 6,5 (s, 2H); 6,9 (m, mi., BocNH); 7,1 (m, mj., BocNH); 7,5 (m„ 3H); 7,8 (s, IH); 12,8 (s, IH).
•3C-NMR 170,95; 170,52; 167,29; 166,85; 160,03; 159,78; 155,84; 154,87; 140,63; 136,76; 128,49; 128,10; 113,04; 78,19; 77,86; 66,95; 49,22; 47,70; 46,94; 45,96; 43,62; 43,31 és 28,25.
38. példa
3-Boc-amino-l ,2-propán-diol g (0,440 mól, 1,0 ekv.) 3-amino-1,2-propán-diolt oldunk 1000 ml vízben, majd 0 °C-ra hűtjük. 115 g
HU 221 003 Bl (0,526 mól, 1,2 ekv.) di-terc-butil-dikarbonátot adunk hozzá egy részletben. A reakcióelegyet vízfürdőben hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni kevertetés közben. A pH-t 10,5 értéken tartjuk 120 ml vizes nátriumhidroxid-oldattal (17,56 g, 0,440 mól, 1,0 ekv.). Amikor a teljes mennyiségű vizes nátrium-hidroxid-oldatot hozzáadtuk a reakcióelegyhez, akkor egy éjszakán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Ezt követően 750 ml etilacetátot adunk a reakcióelegyhez, majd 0 °C-ra hűtjük. A pH-t 2 mol/1 kénsav hozzáadásával 2,5-re állítjuk, erős kevertetés közben. A fázisokat elválasztjuk, és a vizes fázist további etil-acetáttal (6x350 ml) mossuk. A szerves fázis térfogatát 900 ml-re csökkentjük csökkentett nyomáson való bepárlással. A szerves fázist azután 1 χ 1000 ml kétszeresre hígított telített kálium-hidrogénszulfát-oldattal és 1x500 ml telített vizes nátriumkloriddal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson bepárolva kapunk 50,12 g (60%) címben szereplő vegyületet. A terméket diklór-metánból való bepárlással majd ezt követő hűtéssel megszilárdítjuk.
Ή-NMR (CDC13/TMS): d=l,43 (s, 9H), Me3C),
3,25 (m, 2H, CH2) 3,57 (m, 2H, CH2) 3,73 (m, 1H,
CH).
'3C-NMR (CDC13/TMS): d=28,2 (Me3C),
157,0 (C=O).
39. példa
2-(Boc-amino)-etil-L-alanin-metil-észter
20,76 g (0,109 mól, 1 ekv.) 3-Boc-amino-l,2-propándiolt szuszpendálunk 150 ml vízben. 24,97 g (0,109 mól, 1 ekv.) kálium-m-perjodátot adunk hozzá, majd a reakcióelegyet 2 óra hosszat szobahőmérsékleten nitrogénatmoszférában kevertetjük. A reakcióelegyet megszüljük, és a vizes fázist 6x250 ml kloroformmal extraháljuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepárolva majdnem kvantitatíve megkapjuk a Boc-aminoacetaldehidet színtelen olaj formájában, amelyet minden további tisztítás nélkül használunk az alábbi eljárásban.
0,8 g 10%-os csontszenes palládiumot adunk 250 ml metanolhoz nitrogénatmoszférában, 0 °C-ra való hűtés és erős kevertetés közben. 4,49 g (54,7 mmol, 2 ekv.) vízmentes nátrium-acetátot és 3,82 g (27,4 mmol, 1 ekv.) L-alanin-metil-észter-hidrokloridot adunk hozzá. 4,79 g (30,1 mmol, 1,1 ekv.) Boc-aminoacetaldehidet oldunk 150 ml MeOH-ban, majd a reakcióelegyhez adjuk. A reakcióelegyet atmoszferikus nyomáson hidrogénezzük, ameddig a hidrogénfelvétel le nem áll. A reakcióelegyet celiten szűrjük át, amit azután további MeOH-val mosunk. A metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot 150 ml vízben szuszpendáljuk, majd a pH-értékét 8,0-ra állítjuk 0,5 mol/1 NaOH erős kevertetés közben cseppenként való hozzáadásával. A vizes fázist 4x250 ml diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, celiten átszűijük, majd csökkentett nyomáson bepárolva 6,36 g (94%) címben szereplő vegyületet kapunk tiszta, világossárga olaj formájában.
MS (FAB-MS): m/z (%)=247 (100, M+l, 191 (90),
147 (18).
'H-NMR (250 MHz, CDC13) 8: 1,18 (d, J-7,0 Hz,
3H, Me), 1,36 (s, 9H, Me3C), 1,89 (b, 1H, NH),
2,51 (m, 1H, CH2) 2,66 (m, 1H, CH2), 3,10 (m, 2H,
CH2), 3,27 (q, J=7,0 Hz, 1H, CH), 3,64 (s, 3H,
OMe), 5,06 (b, 1H, karbamát NH).
C-NMR 8: d=18,8 (Me), 28,2 (Me3C), 40,1,
47,0 (CH2), 51,6 (OMe), 56,0 (CH), 155,8 (karbamát C=O), 175,8 (észter C=O).
40. példa
N-(Boc-amino-etil)-N-(l-timinil-acetil)-L-alaninmetil-észter
1,23 g (5,0 mmol) Boc-amino-etil-L-alanin-metilészter 10 ml dimetil-formamidban készült oldatához 0,90 g (5,52 mmol) Dhbt-OH-t és 1,01 g (5,48 mmol) 1timinil-ecetsavat adunk. Amikor az 1-timinil-ecetsav feloldódott, akkor 10 ml diklór-metánt adunk hozzá, és az oldatot jégfürdőben lehűtjük. Miután a reakcióelegy hőmérséklete elérte a 0 °C-t, 1,24 g (6,01 mmol) DCC-t adunk hozzá. A hozzáadás után 5 percen belül a jeges vízfürdőt eltávolítjuk. Két órával később vékonyrétegkromatográfiás elemzéssel igazoljuk, hogy a reakció lejátszódott. A keveréket megszüljük, és a csapadékot 100 ml diklór-metánnal mossuk. A kapott oldatot kétszer extraháljuk 150 ml telített nátrium-hidrogén-karbonáttal, majd kétszer extraháljuk 25 ml telített kálium-hidrogénszulfáttal 100 ml vízben. 150 ml telített nátrium-kloriddal végzett végső extrakció után az oldatot magnéziumszulfáton szárítjuk, majd bepároljuk, így kapunk egy fehér habot. A habot oszlopkromatográfiával tisztítjuk szilikagélen, metanolgradienst tartalmazó diklór-metánt használva eluálószerként. így kapunk 99%-nál nagyobb tisztaságú vegyületet (HPLC, 1,08 g, 52,4%).
FAB-MS: 413 (M+l) és 431 (M+l+víz).
Ή-NMR (CDC13) 8: 4,52 (s, 2H, CH2); 3,73 (s, 3H,
OMe); 3,2-3,6 (m, 4H, etil-CH2); 1,90 (s, 3H, Me
T-ben); 1,49 (d, 3H, Me Ala-ban, J=7,3 Hz);
1,44 (s, 9H, Boc).
41. példa
N-(Boc-amino-etil)-N-(l-timinil-acetil)-L-alanin
A címben szereplő vegyület metil-észteréből 2,07 g-ot (5,02 mmol) oldunk 100 ml metanolban, majd jeges vízfürdőben lehűtjük. 100 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidot adunk hozzá. 10 percig kevertetjük, majd az elegy pH-ját 4 mol/1 sósavval 3-ra állítjuk. Az oldatot ezután 3 x 100 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves extraktumokat magnézium-szulfáton szárítjuk. Bepárlás után a keletkező habot 400 ml etilacetátban oldjuk, majd néhány ml metanolt adunk hozzá a szilárd anyag feloldására. Ezután annyi petrolétert adunk hozzá, hogy a csapadékképződés meginduljon. Egy éjszakán át -20 °C-on tartjuk, majd a csapadékot szűréssel eltávolítjuk. így kapunk 1,01 g (50,5%) tiszta vegyületet (>99% HPLC-vel). A vegyületet 2propanolból átkristályosíthatjuk.
FAB-MS: 399(M+l).
Ή-NMR (DMSO-d^) 8: 11,35 (s, 1H, COO); 7,42 (s,
1H, H6); 4,69 (s, 2H, CH2); 1,83 (s, 3H, Me T-ben);
1,50-1,40 (m, 12H, Me Ala+Boc-ban).
HU 221 003 Bl
42. példa (a) N-(Boc-amino-etil)-N-(1 -timinil-acetil)-Dalanin-metil-észter
2,48 g (10,1 mmol) Boc-amino-etil-alanin-metilészter 20 ml dimetil-formamidban készült oldatához
1,80 g (11,0 mmol) Dhbt-OH-t és 2,14 g (11,6 mmol) timinil-ecetsavat adunk. Az 1-timinil-ecetsav feloldódása után 20 ml diklór-metánt adunk hozzá, majd az oldatot jeges vízfürdőben lehűtjük. Amikor a reakcióelegy hőmérséklete eléri a 0 °C-t, akkor 2,88 g (14,0 mmol) DCC-t adunk hozzá. A hozzáadás után 5 percen belül DCUcsapadék kiválása figyelhető meg. 35 perc elteltével a jeges vízfürdőt eltávolítjuk. A reakcióelegyet 3,5 órával később megszűrjük, majd a csapadékot 200 ml diklórmetánnal mossuk. A kapott oldatot kétszer extraháljuk 200 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal, majd kétszer extraháljuk 100 ml telített kálium-hidrogén-szulfát vizes oldattal. 250 ml telített nátrium-kloriddal végzett végső extrakció után az oldatot magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepárolva olajos anyagot kapunk. Az olajat rövid szilikagél oszlopkromatográfiával tisztítjuk, metanolgradienst tartalmazó diklór-metánt használva eluálószerként. így a petroléterrel végzett kicsapás után kapunk egy, a HPLC-s vizsgálatok szerint 96% tisztaságú anyagot (1,5 g, 25,3%).
FAB-MS: 413 (M+l).
Ή-NMR(CDC1J δ: 5,64 (1,1H, BocNH, J=5,89Hz);
4.56 (d, 2H, CHJ; 4,35 (q, 1H, CH Ala-ban,
J=7,25 Hz); 3,74 (s, 3H, OMe); 3,64-3,27 (m, 4H, etil H-k); 1,90 (s, 3H, Me T-ben); 1,52-1,44 (t, 12H, Boc+Me Ala-ban).
(b) N-(Boc-amino-etil)-N-(l-timinil-acetil)-Dalanin
1.57 g (3,81 mmol) címben szereplő vegyület metilészterét oldjuk 100 ml metanolban, majd jeges vízfürdőben hűtjük. 100 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidot adunk hozzá. 10 percig kevertetjük, majd az elegy pH-ját 4 mol/1 sósavval 3-ra állítjuk. Az oldatot azután 3 χ 100 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves kivonatokat magnézium-szulfáton szárítjuk. Bepárlás után az olajat 200 ml etil-acetátban oldjuk. Ezután petrolétert adunk hozzá (600 ml térfogatig), ameddig a csapadékképződés megkezdődik. Éjszakán át állni hagyjuk -20 °C-on, majd a csapadékot szűréssel eltávolítjuk. így kapunk 1,02 g (67,3%) címben szereplő vegyületet, amely HPLC szerint 94%-os tisztaságú. FAB-MS: 399 (M+l).
'H-NMR 8: 11,34 (s, 1H, COOH); 7,42 (s, 1H, H6);
4,69 (s, 2H, CHJ; 4,40 (q, 1H, CH Ala-ban,
J=7,20 Hz); 1,83 (s, 3H, Me T-ben); 1,52-1,40 (m,
12H, Boc+Me Ala-ban).
43. példa
N-(N’-Boc-3 ’-amino-propil)-N-[(1-timinil)-acetil] glicin-metil-észter
2,84 g (0,0115 mól) N-(N’-Boc-3’-amino-propil)glicin-metil-észtert oldunk 35 ml dimetil-formamidban, majd 2,07 g (0,0127 mmol) DhbtOH-t és 2,34 g (0,0127 mól) 1-timinil-ecetsavat adunk hozzá. 35 ml diklór-metánt adunk hozzá, majd az elegyet jeges vízfürdőben 0 °C-ra hűtjük. 2,85 g (0,0138 mól) DCC hozzáadása után az elegyet 2 óra hosszat 0 °C-on kevertetjük, majd 1 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük. A kicsapódott DCU-t szűréssel eltávolítjuk, 25 ml diklór-metánnal mossuk, majd további 150 ml diklórmetánt adunk a szűrlethez. A szerves fázist nátriumhidrogén-karbonáttal extraháljuk (1 térfogat telített oldat hígítva 4 térfogat vízzel, 6 χ 250 ml), majd káliumszulfáttal (1 térfogat telített oldat 4 térfogat vízzel hígítva, 3x250 ml), végül telített vizes nátrium-kloriddal (1 χ 250 ml), magnézium-szulfáton szárítjuk, végül csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A szilárd maradékot 35 ml diklór-metánban szuszpendáljuk, végül 1 óra hosszat kevertetjük. A kicsapódott DCU-t szűréssel eltávolítjuk, majd 25 ml diklór-metánnal mossuk. A szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, majd a maradékot szilikagél oszlopon tisztítjuk, metanol és diklór-metán elegy ével végezve az elúciót (3-7% metanolgradiens diklór-metánban). így kapjuk a címben szereplő anyagot (3,05 g, 64%). Olvadáspont 76-79 °C (bomlás).
Elemanalízis C18H28N4O7 képletre: mért (számított)
C: 52,03 (52,42); H: 6,90 (6,84); N: 13,21 (13,58). A vegyület Ή- és 13C-NMR-spektruma megfelelő.
44. példa
N-(N’-Boc-3 ’-amino-propil)-N-[(l-timinil)-acetilglicin
3,02 g (0,00732 mól) N-(N’-Boc-3’-amino-propil)N-[(l-timinil)-acetil-glicin-metil-észtert oldunk 25 ml metanolban, majd 1,5 óra hosszat 25 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxiddal kevertetjük. A metanolt csökkentett nyomáson való bepárlással eltávolítjuk, majd a pH-t 0 °C-on 4 mol/1 sósavval 2-re állítjuk. A terméket szűréssel izoláljuk fehér kristályok formájában, 3x10 ml vízzel mossuk, majd csökkentett nyomáson szárítószeren szárítjuk. Kitermelés 2,19 g (75%).
Elemanalízis C17H26N4O7xH2O képletre: mért (számított)
C: 49,95 (49,03); H: 6,47 (6,29); N; 13,43 (13,45). A vegyület Ή- és 13C-NMR-spektruma megfelelő.
45. példa
3-(l-Timinil)-propionsav-metil-észter
14,0 g (0,11 mól) timint szuszpendálunk metanolban. 39,6 ml (0,44 mól) metil-akrilátot adunk hozzá, katalitikus mennyiségű nátrium-hidroxiddal. Az oldatot sötétben refluxáltatjuk 45 óra hosszat, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, majd a maradékot 8 ml metanolban oldjuk melegítés közben. Jégfürdőben való hűtés után a terméket 20 ml éter hozzáadásával kicsapjuk, szűréssel izoláljuk, 3 χ 15 ml éterrel mossuk, majd csökkentett nyomáson szárítószer felett szárítjuk. Kitermelés 11,23 g (48%). Olvadáspont 112-119 °C. Elemanalízis C9H12N2O4 képletre: mért (számított)
C: 51,14 (50,94); H: 5,78 (5,70); N: 11,52(13,20). A vegyület *H- és '3C-NMR-spektruma megfelelő.
HU 221 003 Bl
46. példa
3-(l-Timind)-propionsav
1,0 g (0,0047 mól) 3-(l-timinil)-propionsav-metilésztert szuszpendálunk 15 ml 2 mol/1 nátriumhidroxidban, majd 10 percig forraljuk. A pH-t tömény sósav hozzáadásával 0,3-ra állítjuk. Az oldatot 10 χ 25 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist telített vizes nátrium-kloriddal extraháljuk, magnéziumszulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így kapjuk a címben szereplő vegyületet fehér szilárd anyag formájában (0,66 g, 71%). Olvadáspont 118-121 °C.
Elemanalízis CgH10N2O4 képletre; mért (számított)
C: 48,38 (48,49); H: 5,09 (5,09);N: 13,93(14,14).
A vegyület »H- és 13C-NMR-spektruma megfelelő.
47. példa
N-(N’-Boc-amino-etd)-N-[(l-timind)-propanoil]glicin-etil-észter
1,0 g (0,0041 mól) N-(N’-Boc-amino-etil)-glicinetil-észtert oldunk 12 ml dimetil-formamidban. 0,73 g (0,0045 mól) DhbtOH-t és 0,89 g (0,0045 mól) 3-(ltiminil)-propionsavat adunk hozzá. Ezután 12 ml diklórmetánt adunk hozzá, és az elegyet jeges vízfürdőben 0 °C-ra hűtjük. 1,01 g (0,0049 mól) DCC hozzáadása után a reakcióelegyet 2 óra hosszat 0 °C-on, majd 1 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük. A kicsapódott DCU-t szűréssel eltávolítjuk, 25 ml diklór-metánnal mossuk, majd további 50 ml diklór-metánt adunk a szűrlethez. A szerves fázist nátrium-hidrogén-karbonáttal (1 térfogat telített oldat 1 térfogat vízzel hígítva, 6 χ 100 ml), majd kálium-szulfáttal (1 térfogat telített oldat 4 térfogat vízzel hígítva, 3 χ 100 ml), majd telített vizes nátriumkloriddal (1 χ 100 ml) extraháljuk, magnézium-szulfáton szántjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A szilárd maradékot 15 ml diklór-metánban szuszpendáljuk, majd 1 óra hosszat kevertetjük. A kicsapódott DCUt szűréssel eltávolítjuk, majd diklór-metánnal mossuk. A szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, majd a maradékot szilikagél oszlopon tisztítjuk (l-6%os metanolgradiens diklór-metánban). így kapjuk a címben szereplő vegyületet fehér szilárd anyag formájában (1,02 g, 59%).
Elemanalízis C19H30N4O7 képletre: mért (számított)
C: 53,15 (53,51); H: 6,90 (7,09); N: 12,76(13,13).
A vegyület Ή- és 13C-NMR-spektruma megfelelő.
48. példa
N-(N ’-Boc-amino-etil)-N-[(1 -timinil)-propánod]glicin
0,83 g (0,00195 mól) N-(N’-Boc-amino-etil)-N-[(ltiminil)-propanoil]-glicin-etil-észtert oldunk 25 ml metanolban. 25 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidot adunk hozzá. Az oldatot 1 óra hosszat kevertetjük. A metanolt csökkentett nyomáson való bepárlással eltávolítjuk, majd a pH-t 4 mol/1 sósavval 2-re állítjuk 0 °C-on. A terméket szűréssel izoláljuk, 3x15 ml éterrel mossuk, majd csökkentett nyomáson szárítószer felett szárítjuk. Kitermelés 0,769 g (99%). Olvadáspont 213 °C (bomlás).
49. példa
Mono-Boc-etilén-diamin (2)
10,0 (0,0418 mól) g terc-butil-4-nitro-fenilkarbonátot (1) oldunk 50 ml dimetil-formamidban, majd cseppenként 30 perc alatt 27,9 ml (0,418 mól) etilén-diamin és 50 ml dimetil-formamid-oldatához adjuk, majd egy éjszakán át kevertetjük. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, majd a kapott olajat 250 ml vízben oldjuk. 0 °C-ra való hűtés után a pH-t 4 mol/1 sósavval 3,5-re állítjuk. Az oldatot azután megszűrjük, és 3x250 ml kloroformmal extraháljuk. A pH-t 0 °C-on 12-re állítjuk 2 mol/1 nátrium-hidroxid hozzáadásával, majd a vizes oldatot 3 x 300 ml diklórmetánnal extraháljuk. 250 ml telített vizes nátriumkloriddal való kezelés után a diklór-metános oldatot magnézium-szulfáton szárítjuk. Szűrés után az oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így kapunk 4,22 g (63%) terméket olaj formájában.
iH-NMR (90 MHz; CDC13) δ: 1,44 (s, 9H); 2,87 (t,
2H); 3,1 (q, 2H); 5,62 (s, széles).
50. példa (N-Boc-amino-etil)-$-alanin-metil-észter sósavas só
16,28 g (0,102 mól) mono-Boc-etilén-diamint (2) oldunk 400 ml acetonitrilben és 91,5 ml (1,02 mól) metilakrilátot adunk az elegyhez 200 ml acetonitrilben oldva. Az oldatot egy éjszakán át refluxáltatjuk sötétben, hogy elkerüljük a metil-akrilát polimerizációját. Miután csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, éter és víz 200+200 ml-es keverékét adjuk hozzá, majd az oldatot megszűrjük és erősen kevertetjük. A vizes fázist még egyszer extraháljuk éterrel, majd fagyasztva szárítva kapunk egy sárga anyagot. Etil-acetátból átkristályosítva kapunk 13,09 g (46%) címben szereplő vegyületet. Olvadáspont 138-140 °C.
Elemanalízis C, !H23N2O4C1 képletre: mért (számított)
C: 46,49 (46,72); H: 8,38 (8,20); N: 9,83 (9,91);
Cl: 12,45(12,54).
Ή-NMR (90 MHz; DMSO-d6) δ: 1,39 (s, 9H);
2,9 (m, 8H); 3,64 (s, 3H).
57. példa
N-[(l-Timinil)-acetil]-N’-Boc-amino-etil-$-alaninmetd-észter
2,0 g (0,0071 mól) (N-Boc-amino-etil)-P-alaninmetil-észter-hidrokloridot (3) és 2,828 g (0,0812 mól) 1-timinil-ecetsavat oldunk 50 ml dimetilformamidban. 1,12 ml (0,0812 mól) trietil-amint adunk hozzá, majd a reakcióelegyet egy éjszakán át kevertetjük. 200 ml diklór-metán hozzáadása után a szerves fázist 3x250 ml vizes nátrium-hidrogénkarbonáttal, 3x250 ml félig telített vizes káliumhidrogén-szulfáttal, és 250 ml telített vizes nátriumkloriddal extraháljuk, majd magnézium-szulfáton szárítjuk. Szűrés és csökkentett nyomáson történő szárazra párolás után 2,9 g (99%) olajos anyagot kapunk.
HU 221 003 Bl •H-NMR (250 MHz; CDC13) δ: a szekunder amid körüli korlátozott rotáció következtében számos jel megduplázódik; 1,43 (s, 9H); 1,88 (s, 3H); 2,63 (t, IH); 2,74 (t, IH); 3,25-3,55 (4xt, 8H); 3,65 (2xt, 2H); 3,66 (s, 1,5); 3,72 (s, 1,5); 4,61 (s, IH); 4,72 (s, 2H); 5,59 (s, 0,5H); 5,96 (s, 0,5H); 7,11 (s, IH); 10,33 (s, IH).
52. példa
N-[(l-Timinil)-acetil]-N’-Boc-amino-etil-$-alanin 3,0 g (0,073 mól) N-[(l-timinil)-acetil]-N’-Boc-amino-etil-P-alanin-metil-észtert oldunk 30 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidban, a pH-t 0 °C-on 2-re állítjuk 4 mol/1 sósav hozzáadásával, majd az oldatot 2 óra hosszat kevertetjük. A csapadékot szűréssel izoláljuk, háromszor mossuk hideg vízzel, majd szárítószer felett csökkentett nyomáson szárítjuk. Kitermelés: 2,23 g (77%). Olvadáspont 170-176 °C.
Elemanalízis C17H26N4O7 χ H2O képletre: mért (számított)
C: 49,49(49,03);H: 6,31 (6,78);N: 13,84(13,45).
•H-NMR (90 MHz, DMSO-d6) δ: 1,38 (s, 9H);
1,76 (s, 3H); 2,44 és 3,29 (m, 8H); 4,55 (s, 2H);
7,3 (s, IH); 11,23 (s, IH).
FAB-MS: 399 (M+l).
53. példa
N-[(l-(N4-Z)-Citozil)-acetil]-N’-Boc-amino-etil-$kalanin-metil-észter
2,0 g (0,0071 mól) (N-Boc-amino-etil)-p-alaninmetil-észter sósavas sót (3) és 3,319 g (0,0071 mól 1(N-4-Z)-citozil-ecetsav-pentafluor-fenil-észtert (5) oldunk 50 ml dimetil-formamidban. 0,99 ml (0,0071 mól) trietil-amint adunk hozzá, majd a reakcióelegyet egy éjszakán át kevertetjük. 200 ml diklórmetán hozzáadása után a szerves fázist 3 χ 250 ml vizes nátrium-hidrogén-karbonáttal, 3x250 ml félig telített vizes kálium-hidrogén-szulfáttal és 250 ml telített vizes nátrium-kloriddal extraháljuk, majd magnéziumszulfáton szárítjuk. Szűrés és csökkentett nyomáson történő szárazra párolás után 3,36 g szilárd anyagot kapunk, amelyet metanolból átkristályosítunk. Kitermelés 2,42 g (64%). Olvadáspont 158-161 °C.
Elemanalízis C25H33N5O8 képletre: mért (számított)
C: 55,19 (56,49); H: 6,19 (6,26); N: 12,86(13,18). •H-NMR (250 MHz; CDC13) δ: a szekunder amid körüli korlátozott rotáció következtében számos jel megduplázódik; 1,43 (s, 9H); 2,57 (t, IH); 3,60-3,23 (m-ek, 6H); 3,60 (s, 1,5H); 3,66 (s, 1,5H); 4,80 (s, IH); 4,88 (s, IH); 5,20 (s, 2H); 7,80-7,25 (m-ek, 7H).
FAB-MS: 532 (M+l).
54. példa
N-[(1 -(N4-Z)-Citozil)-acetil]-N ’-Boc-amino-etil-ftalanin
0,621 g (0,00122 mól) N-[(l-(N4-Z)-citozil)-acetil]N’-Boc-amino-etil-P-alanin-metil-észtert oldunk 8,5 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidban, a pH-t 0 °C-on 2-re állítjuk 4 mol/1 sósavval, majd az oldatot 2 óra hosszat kevertetjük. A csapadékot szűréssel izoláljuk, háromszor mossuk hideg vízzel, majd csökkentett nyomáson szárítószeren szárítjuk. Kitermelés 0,326 g (54%). A fehér szilárd anyagot 2-propanolból átkristályosítjuk, majd petroléterrel mossuk. Olvadáspont 163 °C (bomlás).
Elemanalízis C24H31N5O8 képletre: mért (számított)
C: 49,49 (49,03); H: 6,31 (6,78); N: 13,84(13,45). •H-NMR (250 MHz; CDC13) δ: a szekunder amid körüli korlátozott rotáció következtében számos jel megduplázódik; 1,40 (s, 9H); 2,57 (t, IH); 2,65 (t, IH); 3,60-3,32 (m-ek, 6H); 4,85 (s, IH); 4,98 (s, IH); 5,21 (s, 2H); 5,71 (s, IH, széles); 7,99-7,25 (m-ek, 7H).
FAB-MS: 518 (M+l).
55. példa
Egy guanincsoportot tartalmazó PNA-oligomer (a) A H-[Taeg]s-[Gaeg]-[Gaeg]4-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise
A védett PNA-t egy Boc-Lys(ClZ)-vel módosított MBHA-gyantán állítjuk össze, körülbelül 0,15 mmol/g szubsztitúcióval (kvantitatív ninhidrinreakcióval meghatározva). A kapcsolatlan aminosavak blokkolását a BocGaeg-OH-monomer bevitele előtt hajtjuk végre.
(b) A H-[Taeg]5-[Gaeg]-[Gaeg]4-Lys-NH2 lépésenkénti összeállítása (szintetikusprotokoll)
A szintézist 102 mg (száraztömeg) előre duzzasztott (egy éjszakán át DCM-ben) és semlegesített BocLys(ClZ)-MBHA-gyantán kezdjük. A végrehajtott lépések az alábbiak:
(1) a Boc védőcsoport eltávolítása TFA/DCM-mel (1:1, térfogat/térfogat), 1x2 perc és 1 χ 1/2 óra, 3 ml;
(2) mosás DCM-mel, 4 χ 20 mp, 3 ml; mosás dimetil-formamiddal, 2 χ 20 mp, 3 ml;
(3) semlegesítés DIEA/DCM-mel (1:19 térfogat/térfogat), 2x3 perc, 3 ml;
(4) mosás DCM-mel, 4x20 mp, 3 ml, majd szárítás 1 percig;
(5) 4 ekvivalens diizopropil-karbodiimid (0,06 mmol; 9,7 pl) és 4 ekvivalens (0,06 mmol; 24 mg) BocTaeg-OH vagy 0,6 ml DCM/DMF (1:1 térfogat/térfogat) elegyben oldott BocGaeg-OH hozzáadása (a monomer végkoncentrációja 0,1 mol/1), a kapcsolási reakciót fél óra hosszat hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten rázatva;
(6) szárítás 20 mp-ig;
(7) mosás dimetil-formamiddal 2x20 mp, illetve 1x2 perc, 3 ml; mosás DCM-mel 4x20 mp, 3 ml;
(8) semlegesítés DIEA/DCM-mel (1:19 térfogat/térfogat), 2x3 perc, 3 ml;
(9) mosás DCM-mel 4 χ 20 mp, 3 ml, majd 1 percig szárítás;
(10) kvalitatív Kaiser-teszt;
(11) a reagálatlan aminosavcsoportok blokkolása Ac2O/piridin/DCM (1:1:2, térfogat/térfogat) eleggyel, 1 x 1/2 óra, 3 ml;
(12) mosás DCM-mel, 4x20 mp, 2x2 perc és 2x20 mp, 3 ml.
Az 1-12. lépéseket addig ismételjük, ameddig a kívánt szekvenciát meg nem kapjuk. Mindegyik kvalita34
HU 221 003 Bl tív Kaiser-teszt negatív (szalmasárga szín, anélkül, hogy a gyöngyök elszínezödnének), jelezve, hogy a kapcsolás közel 100%-os. A PNA-oligomert a normális eljárások alkalmazásával hasítjuk és tisztítjuk. FABMS: 2832.11 [M*+l] (számított: 2832.15).
56. példa
A H-Taeg-Aaeg-[Taeg] g-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-Taeg-A(Z)aeg-[TaegJg-Lys(ClZ)-MBHAgyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 0,3 g nedves Boc-[Taeg]8-Lys(ClZ)MBHA-gyantát 3 ml-es reakcióedénybe teszünk. A Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]8-Lys(ClZ)-MBHAgyantát egyedi A(Z)aeg csoport in situ DCC kapcsolásával állítjuk össze, 0,19 mol/1 BocA(Z)aeg-OH és 0,16 mól DCC-t alkalmazva 2,5 ml 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben, valamint 0,15 mól BocTaeg-OPfp egyszeri kapcsolásával tiszta diklórmetánban („5. szintetikusprotokoll”). A szintézist kvantitatív ninhidrinreakcióval kísérjük, ami azt mutatja, hogy az A(Z)aeg-nek körülbelül 50%-a, a Taeg-nek körülbelül 96%-a beépült.
(b) A H-Taeg-Aaeg-[Taeg]g-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]8-Lys(ClZ)BAH gyantát a 40c példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 15,6 mg nyersanyagot, 53,1 mg száraz H-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]8-Lys(ClZ)-BHAgyanta HF-dal végzett hasítása után. A 14,4 percnél jelentkező főcsúcs az összabszorbanciának kevesebb mint 50%-áért felelős. A nyersterméknek egy 0,5 mgos részét megtisztítva körülbelül 0,1 mg H-Taeg-Aaeg[Taeg]g-Lys-NH2-t kapunk. Az (MH+)+-ra számított m/z érték 2816,16, a mért m/z érték 2816,28.
(c) 5. szintézisprotokoll (1) Boc védőcsoport eltávolítása TFA/diklór-metán (1:1, térfogat/térfogat) eleggyel, 3x1 perc és 1 χ 30 perc;
(2) mosás diklór-metánnal, 2,5 ml, 6 χ 1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/diklór-metán (1:19, térfogat/térfogat) eleggyel, 2,5 ml, 3 χ 2 perc;
(4) mosás diklór-metánnal, 2,5 ml, 6x1 perc, szárítás 1 percig;
(5) 2-5 mg PNA-gyantamintát kiveszünk és alaposan megszárítunk egy kvantitatív ninhidrin elemzéshez, hogy a szubsztitúció mértékét meghatározzuk;
(6) 0,47 mmol (0,25 g) BocA(Z)aeg-OH-t 1,25 ml dimetil-formamidban oldunk, majd 0,47 mmol (0,1 g) DCC-t adunk hozzá 1,25 ml diklór-metánban oldva, illetve 0,36 mmol (0,20 g) BocTaeg-OPfp-t 2,5 ml diklórmetánban oldva; a kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatás során hagyjuk lejátszódni;
(7) mosás dimetil-formamiddal, 2,5 ml, 1 χ 2 perc;
(8) mosás diklór-metánnal, 2,5 ml, 4x1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/diklór-metánnal, (1:19, térfogat/térfogat) 2,5 ml, 2 χ 2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 2,5 ml, 6χ 1 perc;
(11) a védett PNA-gyantából 2-5 mg-os mintát veszünk, majd alaposan megszárítjuk a kvantitatív ninhidrinelemzéshez, amelynek célja, hogy meghatározzuk a kapcsolás mértékét;
(12) a reagálatlan aminosavakat acetilezéssel blokkoljuk, 25 ml ecetsavanhidrid/piridin/diklór-metán (1:1:2, térfogat/térfogat/térfogat) elegyet alkalmazva, 2 órán keresztül (az utolsó ciklus kivételével); és (13) diklór-metánnal mossuk, 2,5 ml, 6χ 1 perc;
(14) a védett PNA-gyantából 2x2-5 mg-os mintát veszünk, DIEA/diklór-metán (1:19, térfogat/térfogat) eleggyel semlegesítjük, majd a ninhidrinelemzéshez diklór-metánnal mossuk.
57. példa
A H-[TaegJ 2-Aaeg-[TaegJ 5-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]^LysjClZ)MBHA-gyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 0,5 g nedves Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát 5 ml SPPS reakcióedénybe teszünk. A Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHAgyantát az A(Z)aeg- és a Taeg-csoportok in situ DCC kapcsolásával állítjuk össze, 0,15-0,2 mól védett PNAmonomer (szabad sav) alkalmazásával, valamint ekvivalens mennyiségű DCC alkalmazásával 2 ml tiszta diklór-metánban („6. szintézisprotokoll”). A szintézist kvantitatív ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy háromszoros kapcsolás után az A(Z)aeg 82%ban épült be (az első kapcsolásnál körülbelül 50%-os a beépülés; a negyedik HOBt-közvetített kapcsolás 50%os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben nem emeli jelentősen az összkapcsolási szintet), a Taeg-csoportok pedig egyszeri kapcsolással kvantitatíven beépülnek.
(b) A H-[Taeg]2-Aaeg-[Taeg]5-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 40(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 16,2 mg nyersanyagot 102,5 mg száraz H-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)BHA-gyanta HF-os hasításával. A nyerstermék egy kis részét megtisztítjuk. Az (MH+)+-ra számított m/z érték 2050,85, a mért m/z érték 2050,90.
(c) 6. szintézisprotokoll (1) Boc védőcsoport eltávolítása TFA/diklór-metán (1:1, térfogat/térfogat) eleggyel, 3x1 perc és 1 χ 30 perc;
(2) mosás diklór-metánnal, 2,5 ml, 6 χ 1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/diklór-metán (1:19, térfogat/térfogat) eleggyel, 2 ml, 3 χ 2 perc;
(4) mosás diklór-metánnal, 2 ml, 6 χ 1 perc, szárítás 1 percig;
(5) 2-5 mg PNA-gyantamintát kiveszünk és alaposan megszárítunk egy kvantitatív ninhidrinelemzéshez, hogy a szubsztitúció mértékét meghatározzuk;
(6) 0,44 mmol (0,23 g) BocA(Z)aeg-OH-t 1,5 ml diklór-metánban oldunk, majd 0,44 mmol (0,09 g) DCC-t adunk hozzá 0,5 ml diklór-metánban oldva, illetve 0,33 mmol (0,13 g) BocTaeg-OH-t 1,5 ml diklórmetánban oldva, majd 0,33 mmol (0,07 g) DCC-t adunk hozzá 0,5 ml diklór-metánban oldva; a kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatás során hagyjuk lejátszódni;
(7) mosás dimetil-formamiddal, 2 ml, 1 χ 2 perc;
HU 221 003 BI (8) mosás diklór-metánnal, 2 ml, 4x1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/diklór-metánnal, (1:19, térfogat/térfogat) 2 ml, 2 x2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 2 ml, 6χ 1 perc;
(11) a védett PNA-gyantából 2-5 mg-os mintát ve- 5 szünk, majd alaposan megszárítjuk a kvantitatív ninhidrinelemzéshez, amelynek célja, hogy meghatározzuk a kapcsolás mértékét;
(12) a reagálatlan aminosavakat acetilezéssel blokkoljuk, 25 ml ecetsavanhidrid/piridin/diklór-metán (1:1:2, térfogat/térfogat/térfogat) elegyet alkalmazva, órán keresztül (az utolsó ciklus kivételével); és (13) diklór-metánnal mossuk, 2 ml, 6x1 perc;
(14) a védett PNA-gyantából 2x2-5 mg-os mintát veszünk, DIEA/diklór-metán (1:19, térfogat/térfogat) 15 eleggyel semlegesítjük, majd a ninhidrinelemzéshez diklór-metánnal mossuk.
58. példa
A H-T4C2TCT-LysNH2 PNA-oligomert a 93. példában leírtak alapján állítjuk elő. Az ezzel a szekvenciával végzett hibridizálási kísérletek megoldják az orientáció kérdését, mivel ez valóban aszimmetrikus. Az ilyen kísérletekkel a Tm érték pH-függóségének kérdé10 se, valamint a keletkező komplexek sztöchiometriája is megoldható.
A H-T4C2TCT-LysNH2 PNA-oligomerrel végzett hibridizációs kísérleteket az alábbiak szerint hajtjuk végre:
Sor Hibridizációs partner pH Tm S
1. 5’-(dA)4(dG)2(dA)(dGXdA)(dG) 7,2 55,5 2:1
2. 5’-(dA)4(dG)2(dA)(dGXdAXdG) 9,0 26,0 2:1
3. 5’-(dA)4(dG)2(dA)(dG)(dA)(dG) 5,0 88,5 2:1
4. 5’-(dGXdAXdG)(dA)(dG)2(dA)4 7,2 38,0 2:1
1 5· 5’-(dG)(dAXdG)(dA)(dG)2(dA)4 9,0 31,5 -
6. 5’-(dG)(dAXdG)(dA)(dG)2(dA)4 5,0 52,5 -
7. 5’-(dA)4(dG)(dT)(dA)(dG)(dA)(dG) 7,2 39,0 -
8. 5’-(dA)4(dG)(dT)(dA)(dG)(dA)(dG) 9,0 <20,0 -
9. 5’-(dA)4(dGXdTXdA)(dGXdA)(dG) 5,0 39,0 -
10. 5’-(dA)4(dG)2(dT)(dG)(dA)(dG) 7,2 31,5 -
11. 5’-(dA)4(dG)2(dT)(dG)(dA)(dG) 5,0 50,5 -
12. 5’-(dG)(dA)(dG)(dA)(dT)(dGXdA)4 7,2 24,5 -
13. 5’-(dG)(dA)(dG)(dA)(dT)(dG)(dA)4 9,0 <20,0 -
14. 5’-(dGXdAXdG)(dA)(dT)(dG)(dA)4 5,0 57,0 -
15. 5’-(dGXdA)(dG)(dT)(dG)2(dA)4 7,2 25,0 -
16. 5’-(dG)(dA)(dGXdT)(dG)2(dA)4 5,0 39,5 -
1 52,0
S=a sztöchiometria meghatározása UV-keverési görbékkel - =nincs meghatározva
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy egy valóban kevert szekvencia egy jól meghatározott olvadási görbét eredményez. A PNA-oligomerek mindkét orientációban képesek kötődni (összehasonlítandó az 1. és 4. sor), jóllehet az N-terminális/5’ orientáció nincs preferálva. Ha a T-vel vagy C-vel szemben egyetlen rossz illeszkedés van, akkor ez a Tm értékét több mint 16 °Ckal csökkenti pH=7,2-nél; pH=5,0-nál a Tm értéke több mint 27 °C-kal csökken. Ez azt mutatja, hogy nagyon magas fokú szekvenciaszelektivitás létezik, ami egy általános tulajdonsága lehet mindegyik PNA C/T szekvenciának.
Amint a fentiekben jeleztük, a Tm érték nagyon erősen pH-fuggő, jelezve ezzel, hogy a Hoogsten-bázispár-képződés fontos a hibridek létrejötte szempontjából. Ennélfogva nem meglepő, hogy a sztöchiometriát 2:1-nek találtuk.
A szimmetria hiánya a szekvenciában és a Tm érték nagymértékű csökkenése, ha rossz bázispárosodás fordul elő, azt mutatja, hogy a Watson-Crick-szál és a Hoogsten-szál párhuzamos, ha a komplementer DNShez kötődik. Ez igaz mindkét orientáció esetében, azaz az 5’/N-terminális és a 3’/N-terminális esetében.
59. példa
A H-T5GT4-LysNH2 hibridizációs kísérletek eredményeit az alábbiakban mutatjuk be:
Sor Dezoxioligonukleotid Tm
1. 5’-(dA)5(dG)(dA)4-3’ 55,0
2. 5’-(dA)5(dG)(dA)4-3’ 47,0
3. 5’-(dA)5(dG)(dA)4-3’ 56,5
HU 221 003 Bl
Táblázat (folytatás)
Sor Dczoxioligonuklcotid Tm
4. 5’-(dA)5(dT)(dA)4-3’ 46,5
5. 5’-(dA)4(dG)(dA)5-3’ 48,5
6. 5’-(dA)4(dC)(dA)5-3’ 55,5
7. 5’-(dA)4(dTXdA)5-3’ 47,0
Amint az az 1., 3. és 6. soroknak a 2., 4., 5. és 7. sorokkal való összehasonlításából látható, a G különbséget tud tenni a C/A és a G/T között a DNS-láncban, azaz szekvenciamegkülönböztetést figyelhetünk meg. A 3. sorban levő komplexet emellett UV-keverési görbék alapján 2 PNA: 1 DNS komplexnek lehet meghatározni.
60. példa
Néhány szintetizált PNA-oligomer tömege, FAB tömegspektrometriás méréssel meghatározva, az alábbiakban látható:
Szekvencia Számított Mért
H-T4C2TCTC-LysNH2 2747,15 2746,78
H-T5GT4-LysNH2 2832,15 2832,11
H-T7-LysNH2 2008,84 2540,84
H-T,-LysNH2 2541,04 2540,84
H-T,„-LysNH2 2807,14 2806,69
H-T2CT5-LysNH2 2259,94 2259,18
H-T3(L-alaT)T4-LysNH2 2287,95 2288,60
| H-T4(Ac)T5-LysNH2 2683,12 2683,09
61. példa
A PNA-oligomemek egyetlen, kiterjesztett gerinccel (β-alanin-módosítás) rendelkező egységgel való hibridizációja az alábbi:
PNA DNS T m
H-T10-LysNH2 (dA)10 73 °C
H-T4(PT)T5-LysNH2 (dA)10 57 °C
H-T4(PT)T5-LysNH2 (dA)4(dG)(dA)5 47 °C
H-T4(pT)T5-LysNH2 (dA)4(dT)(dA)5 49 °C
1 H-T4(PT)T5-LysNH2 (dA)4(dT)(dA)5 47 °C
Jóllehet az olvadáspont hőmérséklete csökken, az adatok azt mutatják, hogy a bázisspecifikus felismerés megmarad.
62. példa
Példa a „bázis nélküli” szubsztitúcióra (XII és XIII általános képletű vegyületek)
PNA DNS T m
H-Tl0-LysNH2 (dA)10 73 °C
j H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)10 49 °C
PNA DNS T
H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)4(dG)(dA)5 37 °C
H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)4(dCXdA)5 41 °C
H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)4(dT)(dA)5 41 °C
H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)5(dGXdA)4 36 °C
H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)5(dC)(dA)4 40 °C
H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)5(dGXdA)4 40 °C
63. példa
Jódozási eljárás pg Tyr-PNA-T10-Lys-NH2 40 μΐ 100 mol/1 Nafoszfátban oldunk, majd 1 mCi Na125I-t és 2 μΐ klóramin-T-t (50 mol/1 acetonitrilben) adunk hozzá. Az oldatot 10 percig hagyjuk 20 °C-on állni, majd egy 0,5+5 cm-es Sephadex G10 oszlopon bocsátjuk át. Az első két radioaktivitást tartalmazó frakciót (mindegyik 100 μΐ) összegyűjtjük, majd HPLC-vel tisztítjuk: fordított fázisú C-18, 0-60%-os acetonitril-gradiens 0,1%os CF3COOH-val vízben oldva. A 125I-PNA közvetlenül a PNA-csúcs után eluálódik. Az oldószert csökkentett nyomáson távolítjuk el.
64. példa
A Ti(/T9C/TjC2 PNA-k kötődése az AÍ(/A9G/A8G2 kétszálú DNS-ekhez (20. ábra)
Az említett plazmidból származó 200 cps 32P-vel jelzett EcoRI-PvuII fragmens (az EcoRI hely 3’ végénél jelzett nagy fragmens), 0,5 pg hordozó borjútimusz-DNS és 300 ng PNA keverékét 100 pl pufferben (200 mmol/1 nátrium-klorid, 50 mmol/1 nátrium-acetát pH=4,5, 1 mmol/1 ZnSO4) inkubáljuk 120 percig 37 °C-on. Az S, nukleázból 50 egységnyit adunk a reakcióelegyhez, majd 5 percig 20 °C-on inkubáljuk. A reakciót 3 pl 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával leállítjuk, majd a DNS-t 250 pl 2%-os alkoholos kálium-acetát-oldat hozzáadásával kicsapjuk. A DNSt elektroforézissel elemezzük 10%-os poli(akril-amid) szekvenálógéleken, majd a radioaktívan jelzett DNScsíkokat autoradiográfiával tesszük láthatóvá.
A megcélzott plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő oligonukleotidokat pUC19 plazmidba klónozzuk. Az A10 cél: a GATCCA10G & GATCCT10G oligonukleotidokat a BamHI hasítási helyre klónozzuk (a plazmid jelzése pTlO). Az A5GA4 cél: aTCGACT4CT5G & TCGACA5GA4G oligonukleotidokat a Sáli hasítási helyre klónozzuk (a plazmid jele pT9C). Az A2GA2GA4 cél: a GA2GA2GA4TGCA & GT4CT2CT2CTGCA oligonukleotidokat a PstI hasítási helyre klónozzuk (a plazmid jelzése pT8C2). A megcélzott molekulák helyét a gélben a bal oldalon oszlopok jelzik. Az A/G egy A+G szekvencia létrája a P10 célmolekulának.
65. példa
A restrikciós enzimes hasítás gátlása PNA-val (23. ábra)
A pTlO plazmid 2 pg-os részét a jelzett mennyiségű PNA-T10-zel elegyítjük 20 pl TE pufferben (10 mmol/1
HU 221 003 Bl
TRIS-HC1,1 mmol/1 EDTA, pH=7,4), majd 120 percig 37 °C-on inkubáljuk. 2 pl 10 χ puffért (10 mmol/1 TRISHC1 pH=7,5, 10 mmol/1 MgCl2i 50 mmol/1 nátriumklorid, 1 mmol/1 DTT), 2 egység PvuII és 2 egység BamHI restrikciós enzimet adunk hozzá, majd további 60 percig inkubáljuk. A DNS-t 5%-os poli(akril-amid)gélen végzett gélelektroforézissel elemezzük, majd a DNS-t etídium-bromid-festéssel tesszük láthatóvá.
66. példa
A PNA-T1(rdsDNS lánchelyettesítési komplex képződésének kinetikája (21. ábra)
A pTlO plazmidból származó 200 cps 32P-vel jelzett
EcoRI-PvuII fragmens (az EcoRI hely 3’ végénél jelzett nagy fragmens), 0,5 pg hordozó boíjútimusz-DNS és 300 ng PNA-T10-LysNH2 keverékét 100 pl pufferben (200 mmol/1 nátrium-klorid, 50 mmol/1 nátrium-acetát pH=4,5,1 mmol/1 ZnSO4) inkubáljuk 37 °C-on. Az Sj nukleázból a jelzett időpontokban 50 egységnyit adunk 7 különböző reakcióelegyhez, majd 5 percig 20 °C-on inkubáljuk. A DNS-t 250 pl 2%-os alkoholos káliumacetát-oldat hozzáadásával kicsapjuk, majd elektroforézissel elemezzük 10%-os poli(akril-amid) szekvenálógélen. A lánchelyettesítési komplex mennyiségét a célszekvencia Sj-hasításának intenzitásából számítjuk, amit az autoradiogrammok denzitometriás kiértékelésével mérünk.
67. példa
A PNA-dsDNS komplexek stabilitása (22. ábra)
200 cps 32P-pT10 fragmens, 0,5 pg borjútimuszDNS és 300 ng kiválasztott PNA (lehet T10-LysNH2 T8LysNH2 vagy T6-LysNH2) keverékét 100 pl 200 mmol/1 nátrium-klorid, 50 mmol/1 nátrium-acetát pH=4,5, 1 mmol/1 ZnSO4 összetételű pufferben inkubáljuk 60 percig 37 °C-on. A GATCA10G oligonukleotid 2 pgos részét adjuk hozzá, és mindegyik mintát 10 percre a jelzett hőmérsékletre melegítjük, 10 percig jeges vízfürdőben tartjuk, majd 20 °C-ra melegítjük. 50 egység Sj nukleázt adunk hozzá, majd a mintákat kezeljük, elemezzük, és az eredményeket mennyiségileg értékeljük.
68. példa
A transzkripció gátlása PNA-val
100 ng plazmid-DNS (a PvuII restrikciós enzimmel hasítva, lásd alább) és 100 ng PNA-t 15 pl 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4,1 mmol/1 EDTA összetételű pufferben inkubáljuk 60 percig 37 °C-on. Ezt követően 4 pl 5 χ tömény puffért (0,2 mol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 40 mmol/1 MgCl2 10 mmol/1 spermidin, 125 mmol/1 nátrium-klorid) elegyítünk 1 pl NTP-keverékkel (10 mmol ATP, 10 mmol CTP, 10 mmol GTP, 1 mmol UTP, 0,1 pCi/pl 32P-UTP, 5 mmol DTT, 2 pg/ml tRNS, 1 pg/ml heparin) és 3 egység RNS-polimerázzal. Az inkubálást 10 percig végezzük 37 °C-on. Az RNS-t azután 60 pl 2%-os kálium-acetát 96%-os etanolban készült oldatával kicsapjuk -20 °C-on, majd elektroforézissel elemezzük 8%-os poli(akril-amid) szekvenálógélben. Az RNS-transzkriptumokat autoradiográfiásan tesszük láthatóvá. Az alábbi plazmidokat használjuk:
pT8C2-KS/pA8G2-KS: a GA2GA2GA2GTGAC & GT4CT2CT2CTGACA oligonukleotidok a pBluescriptKS+ Pstl hasítási helyére klónozva; pT10-KS/pA10KS (az inszertnek mindkét orientációját sikerült megkapni). pT10UV5: a GATCCA10 & GATCCT10G oligonukleotidok egy pUC18-származék BamHI hasítási helyére klónozva, amelyben az Escherichia coli lacUV5 promoterét az EcoRI hasítási helyre klónozva találjuk [Jeppesen et al., Nucleic Acids Research, 16, 9545 (1988)].
T3 RNS-polimeráz alkalmazásával a transzkripciós hosszabbodás leállását kapjuk PNA-T8C2-LysNH2-vel és a pA8G2-KS plazmiddal, amelyen a PNA-felismerési hely a templátszálon van, de ezt a jelenséget nem figyelhetjük meg a pT8C2-KS plazmiddal, amelynél a PNAfelismerési hely a nem templát szálon található. Hasonló eredményeket kaptunk a PNA-T10-LysNH2-vel és a ρΑΙΟ-KS, valamint a ρΤΙΟ-KS plazmidokkal (lásd
25. ábra). Escherichia coli-RNS-polimeráz és a pT10UV5 plazmid alkalmazásával (A10 szekvencia a templátszálon) a transzkripció hosszabbodásának leállását figyelhetjük meg a PNA-T10-LysNH2-vel.
69. példa
A PNA biológiai stabilitása pg PNA-T5 és 10 pg kontroll-, „normáf’-peptid 40 pl 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4 pufferben készült elegyét különböző mennyiségű sertésbélnyálkából származó peptidázokkal vagy Streptomyces caespitosusproteázzal kezeljük 10 percig 37 °C-on. A PNA és a peptid mennyiségét HPLC elemzéssel határozzuk meg (fordított fázisú C-18 oszlop; 0-60% acetonitril, 0,1% trifluor-ecetsav).
Azoknál a peptidáz/proteáz koncentrációknál, ahol a peptid teljes lebomlása figyelhető meg (nincs HPLC csúcs), a PNA még érintetlen.
70. példa
Génexpresszió gátlása
Annak eldöntésére, hogy a papillomavírus E2 mRNS-e expresszióját gátolja-e egy peptid-nukleinsav, egy előnyös teszt az E2 jól dokumentált transzaktivációs tulajdonságain alapul [Spalholtz et al., J. Virol., 61, 2128-2137 (1987)]. Egy riporterplazmidot (E2RECAT) készítünk, amely az E2-re reagáló elemet tartalmazza, amely egy E2-dependens-fokozóként működik. Az E2RECAT tartalmazza az SV40 korai promoterét is, egy korai poliadenilezési szignált és a klór-amfenikol-acetiltranszferáz (CAT)-gént. Ebben a plazmidban a CAT expressziója az E2 expressziójától függ. A CAT expressziónak az E2 jelenlététől való függését úgy vizsgáljuk, hogy ezt a plazmidot BPV-1-gyel transzformált Cl27 sejtekbe, fertőzetlen Cl27 sejtekbe és olyan C127 sejtekbe transzfektáljuk, amelyeket kotranszfektáltunk E2RECAT és E2 expressziós vektorral.
A. A BPV-1 E2-expresszió gátlása
A BPV-l-gyel transzformált C127 sejteket 12 mélyedéses lemezekre szélesztjük. Az E2REl-gyel végzett transzfekció előtt 24 órával a sejteket előkezeljük, antiszensz PNA-kat adunk a növesztő táptalajhoz 5,
HU 221 003 Bl és 30 mmol/1 végkoncentrációban. A következő napon a sejteket 10 pg E2RElCAT-tal transzfektáljuk a kalcium-foszfát kicsapási módszert alkalmazva. Tíz pg E2RElCAT-ot és 10 pg hordozó DNS-t (pUC19) elegyítünk 62 pl 2 mol/1 CaCl2-dal 250 pl végtérfogatban vízzel, majd 250 pl 2xHBSP-t adunk hozzá (1,5 mmol/1 Na2PO2, 10 mmol/1 KC1, 280 mmol/1 nátrium-klorid, 12 mmol/1 glükóz és 50 mmol/1 HEPES pH=7,0) és szobahőmérsékleten inkubáljuk 30 percig. Ebből az oldatból 100 mikrolitert adunk az egyes tesztmélyedésekben, majd 4 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Az inkubálás után a sejteket glicerinnel sokkoljuk 1 percig szobahőmérsékleten (15% glicerin 0,75 mmol/1 Na2PO2, 5 mmol/1 KC1, 140 mmol/1 NaCl, 6 mmol/1 glükóz és 25 mmol/1 HEPES, pH=7,0). A sokk után a sejteket háromszor mossuk szérummentes DMEM-mel, majd hozzáadunk 10% borjúmagzatszérumot és az eredeti koncentrációjú oligonukleotidot tartalmazó DMEM-et. 48 órával a transzfekció után a sejteket kinyeijük, és vizsgáljuk a CAT-aktivitásukat.
A CAT-aktivitás meghatározásához a sejteket kétszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, majd lekaparással nyeljük ki. A sejteket 100 pl 250 mmol/1 TRISHC1 pH=8,0 pufferben szuszpendáljuk, és háromszori lefagyasztással-felolvasztással feltétjük. A sejtkivonatból 24 mikrolitert használunk az egyes vizsgálatokban. Minden egyes vizsgálathoz az alábbiakat keverjük össze egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőben, majd inkubáljuk 1 óra hosszat 37 °C-on: 25 pl sejtkivonat, 4 pl 4 mmol/1 acetil-koenzim A, 18 pl víz és 1 pl 14C-klóramfenikol, 40-60 mCi/mmol. Inkubálás után a klóramfenikolt (acetilezett és nem acetilezett formák) etilacetáttal extraháljuk, majd szárazra pároljuk. A mintákat 25 pl etil-acetátban szuszpendáljuk vékonyrétegkromatográfiás lemezekre csöppentjük, majd kloroform: metanol 19:1 arányú elegyével kromatografáljuk. A kromatogrammokat autoradiográfiával elemezzük. Az acetilezett és nem acetilezett 14C-klóramfenikolnak megfelelő pontokat kivágjuk a vékonyréteg-kromatográfiás lemezről és folyadékszcintillációval számláljuk a CAT-aktivitás meghatározására. Azokat a peptid-nukleinsavakat tekintjük pozitívaknak, amelyek a CAT-aktivitást dózisfüggő módon csökkentik.
B. A HPV E2-expresszió-gátlása
A humán papillomavírus (HPV) E2 peptidnukleinsavakkal való gátlásának vizsgálata lényegében ugyanaz, mint a BPV-1 E2-vizsgálata. A HPVvizsgálathoz megfelelő HPV-ket koexpresszálunk vagy CV-1 vagy A431 sejtekbe PSV2NEO-val, az előzőekben ismertetett kalcium-foszfát-módszer alkalmazásával. Azokat a sejteket, amelyek felveszik a DNS-t, úgy választjuk ki, hogy G418 antibiotikumot tartalmazó táptalajon tenyésztjük a sejteket. A G418 rezisztens sejtekben azután vizsgáljuk a HPV-DNS és -RNS jelenlétét. Az E2-t expresszáló sejteket használjuk azután az antiszensz vizsgálatokhoz. Minden egyes PNAra a sejteket az előzőekben leírt módon előkezeljük, E2RElCAT-tal transzfektáljuk, majd vizsgáljuk a CAT-aktivitást az előzőekben leírt módon. Azokat a peptid-nukleinsavakat tekintjük pozitívaknak, amelyek dózisfüggő módon képesek elnyomni a CAT-aktivitást.
71. példa
Egy, négy természetes nukleobázist tartalmazó tagú PNA szintézise; H-[Taeg]-[Aaeg]-[GaegJ[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg]-[Caeg]-[Taeg][Caeg]-[Taeg]-[Aaegj-[Taeg]-[Gaeg]-[Taeg]LysNH2
A védett PNA-t egy Boc-Lys(ClZ) módosított MBHA gyantán állítjuk össze, körülbelül 0,145 mmol/g szubsztitúcióval. A kapcsolatlan aminosavcsoportok lezárását csak a BocGaeg-OH monomer beépülését megelőzően hajtjuk végre.
A szintézist 100 mg (száraztömeg) semlegesített Boc-Lys(ClA)-MBHA-gyantán indítjuk, amelyet egy éjszakán át előre duzzasztunk DCM-ben. A monomerek beépülését a 32. példában leírtak alapján végezzük, azzal a különbséggel, hogy az 5. lépésben a BocAaeg-OH monomert építjük be. Az 5. lépés a jelen szintézisben 4 ekvivalens diizopropil-karbodiimid hozzáadását (0,06 mmol;
9,7 pl) és 4 ekvivalens BocAaeg-OH (0,06 mmol; 32 mg) hozzáadását tartalmazza, 0,6 ml DCM/dimetilformamid 1:1 térfogat/térfogat arányú elegyében oldva (a monomer végkoncentrációja 0,1 mól). A kapcsolási reakciót 1x15 percig, majd 1 χ 60 percig (újrakapcsolás) hagyjuk lejátszódni.
Minden kvalitatív Kaiser-teszt negatív (szalmasárga szín, a gyöngyök nem színeződnek). A PNAoligomert lehasítjuk, majd a standardmódszerek alkalmazásával tisztítjuk. FAB-MS átlagos tömeg mért (számított) (M+H) 4145,1 (4146,1).
72. példa
A H-TAGTTATCTCTATCT-LysNH2 hibridizációja
DNS-cél pH Tm
I 5’ 3’ 5 60,5
5’ 3’ 7,2 43,0
5’-------- 3’ 9 38,5
3’ 5’ 5 64,5/49,0
3’ 5’ 7,2 53,5
3’ 5’ 9 51,5
Az a tény, hogy lényegében nincs csökkenés a Tm értékben a pH 7,2-ről 9,0-ra való változtatása közben, arra utal, hogy Hoogsten-bázispárosodás nem játszódik le. A Tm növekedése, miközben a pH-t 7,2-ről 5-re változtatjuk nagy a párhuzamos orientációhoz, és valószínűleg a 2:1 komplex kialakulásának a következménye. Az a vélemény alakult ki, hogy a Watson-Crickkapcsolódási motívumban a legelőnyösebb orientáció a 3’/N orientáció, a Hoogsteen-motívumban pedig az 5’/N orientáció a legstabilabb. Tehát az az eset fordulhat elő, hogy az a legstabilabb komplex, amelyben a két PNA-szál antiparallel.
Nagyon erős hajlam van láthatóan a Hoogsteen-szál parallel orientációjára. Ez megmagyarázni látszik,
HU 221 003 Bl hogy miért éppen pH 9-nél látszik egy 2:1 komplex az 5’/N orientációban. Emellett magyarázatot ad arra a kis veszteségre is, amikor a pH-t 7,2-ről 9-re változtatjuk a 3’/N esetben, mivel ez valószínűleg egy 1:1 komplex.
73. példa
A H-[Taeg]2-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-TaegCaeg-Taeg-Caeg-LysNH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aegA(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)MBHA-gyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 1 g nedves Boc-Lys(ClZ)-MBHAgyantát (0,28 mmol Lys/g) egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe teszünk. A Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-TaegC(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aegLys(ClZ)-MBHA-gyantát az első öt csoport in situ DCC kapcsolásával állítjuk össze, 0,16 mól BocC[Z]OH-t, BocTaeg-OH-t vagy Boc(Z)aeg-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”), majd analóg módon az utolsó öt csoport in situ DIC kapcsolásával („10. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót hagyjuk, hogy 20-24 óra alatt, rázatás közben játszódjon le. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépül, az első A(Z)aeg-csoport kivételével, amelyet kétszer kell kapcsolni. Az összkapcsolási hatékonyság körülbelül 96% (az első kapcsolás hatékonysága körülbelül 89%).
(b) A H-[Taeg]2-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-TaegCaeg-Taeg-Caeg-LysNH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aegA(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 53,4 mg nyersanyagot, 166,1 mg száraz Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aegA(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-os hasításával. A nyersterméket (53,4 mg) tisztítjuk, így kapunk 18,3 mg H-[Taeg]2Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg-CaegLysNH2-t. Az (M+H)+-re számított m/z érték 2780,17, a mért m/z érték 2780,07.
74. példa
A H-TTA TCA TCT C-Lys-NH2 hibridizációs tulajdonságai
A címben szereplő vegyületet az alábbi oligonukleotidokkal hibridizáltattuk:
Oligodezoxinukleotid pH Tm (°C)
5’-AAT AGT AGTG-3’ 5 31,5+
5’-AAT AGT AGTG-3’ 7,2 28,5+
5’-AAT AGT AGT G-3’ 9 28,0+
5’-GTG ATG ΑΤΑ A-3’ 7,2 30,5
5’-GTG ATG ΑΤΑ A-3’ 9 28,0
+ jelentése alacsony hipokrómérték
75. példa
Két, egymáshoz kötött párhuzamos láncot tartalmazó PNA (XVII. általános képletű vegyület) szintézise Az MBHA-gyanta 375 mg-os részét (töltés
0,6 mmol/g) hagyjuk egy éjszakán át duzzadni diklórmetánban. Miután egy órát hagytuk állni dimetilformamid/diklór-metán elegyben, a gyantát semlegesítjük, oly módon, hogy kétszer mossuk 5%-os diizopropil-etil-aminnal diklór-metánban (2 perc), majd diklór-metánnal mossuk (2 ml; 6x1 perc). 2 ml dimetil-formamidban oldott N,N’-di-Boc-aminoetilglicint (41,9 mg; 0,132 mmol) adunk a gyantához, majd 64,9 mg (0,315 mmol), 1 ml diklór-metánban oldott DCC-t adunk hozzá. 2,5 óra elteltével a gyantát háromszor mossuk dimetil-formamiddal (1 perc), majd egyszer mossuk diklór-metánnal (1 perc). A reagálatlan aminosavakat ezután lezárjuk, ecetsavanhidrid/diklórmetán/piridin elegyet (1 ml/2 ml/2 ml) használva 72 óra hosszat. 2 ml diklór-metánnal mossuk 4x1 percig, ezután a Kaiser-teszt azt mutatja, hogy nincs jelen aminocsoport. A gyantáról eltávolítjuk a védőcsoportot, majd az előzőkben leírt módon mossuk. Ezt követően 255,8 mg (67 mmol) 1:1 arányú dimetilformamid/diklór-metán elegyben oldott 6-(Bocamino)hexánsav-DHBT-észterrel reagáltatjuk éjszakán át. Mosás és semlegesítés után egy Kaiser-tesztet és egy izatintesztet végzünk. Mindegyik negatív. A lezárás után a PNA-láncok hosszabbítását a DCC kapcsolásokra leírt standardeljárásokkal végezzük. Mindegyik, a kapcsolási reakció után végrehajtott Kaiser-teszt negatív (sárga). Kvalitatív Kaiser-teszteket végzünk az 1., 2., 4. és 6. PNA-egység védőcsoportjának eltávolítása után. Mindegyik teszt kék színt ad. A PNAoligomereket standardmódszerek alkalmazásával hasítjuk és tisztítjuk.
Az egyes kapcsolásokban használt monomer és DCC mennyisége az alábbi (össztérfogat 4,5 ml):
Kapcsolás Monomer (T) DCC
1. 173 mg 95 mg
1 2- 176 mg 101 mg
3. 174 mg 97 mg
1 4· 174 mg 103 mg
5. 178 mg 97 mg
6. 173 mg 99 mg
7. 174 mg 95 mg
8. 175 mg 96 mg
A (70) szerkezetű PNA-ból, amelyben R70=T6 24,5 mg nyersterméket kapunk, amiből 6,9 mg lett a tisztítás után. Annál a PNA-nál, amelynél Ri=T8
28,8 mg nyersterméket kapunk, amiből 2,8 mg marad a tisztítás után. A termékeknek erős hajlamuk van az aggregálódásra, amit a komplex HPLC kromatogram jelez, azután, hogy néhány órát szobahőmérsékleten tároltuk 1 mg/ml feletti koncentrációban. A PNA-(T6)2 és a PNA-(T8)2 hibridizálódik a (dA)6-hoz, illetve a (dA)ghoz, Tm érték: 42 °C, illetve 59 °C.
HU 221 003 Bl
76. példa
A H-[Taeg] s-Lys(ClZ)-MBHA gyanta szilárd fázisú szintézise
A PNA-oligomert 500 mg (száraz tömeg) MBHAgyantán állítjuk össze, amelyet előzőleg diklór-metánban duzzasztottunk. A gyantát először körülbelül 0,15 mmol/g Boc-Lys(ClZ)-vel szubsztituáljuk, a kvantitatív ninhidrinreakció alapján meghatározva. Az oligomer lépésenkénti szintéziséhez, amelyet a 32. példában leírtak alapján végzünk, 0,077 g (0,2 mmol) BocTaegOH-t és 31,3 μΐ (0,2 mmol) diizopropil-karbodiimidet használunk 2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklórmetán elegyben minden egyes kapcsoláshoz. A kapcsolatlan aminocsoportok lezárását az egyes lépésekben a védőcsoportok eltávolítása előtt végezzük. Mindegyik kvalitatív Kaiser-teszt negatív, jelezve, hogy a kapcsolás hatásfoka közel 100%.
77. példa
A H-[Taeg] 4-[apgT]-[Taeg] 5-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise
A szintézist a 76. példából származó H-[Taeg]5Lys(ClZ)-MBHA-gyanta 1/4-ével kezdjük. Mind a Boc(apgT)-OH mind a BocTaeg-OH in situ diizopropilkarbodiimid (DIC) kapcsolását 1,2 ml 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben végezzük, 0,048 g (0,12 mmol), illetve 0,046 g (0,012 mmol) monomer, valamint 18,7 μΐ (0,12 mmol) diizopropil-karbodiimid alkalmazásával minden egyes kapcsolási lépésben. Mindegyik kvalitatív Kaiser-teszt negatív, jelezve a közel 100%-os kapcsolási hatásfokot. A PNA-oligomert hasítjuk, majd standardmódszerekkel tisztítjuk. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2820,115, a mért m/z érték 2820,92.
78. példa
A H-[Taeg] 4-[proT]-[Taeg] 5-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise
A szintézist a 76. példából származó H-[Taeg]5Lys(ClZ)-MBHA-gyanta 1/4-ével kezdjük. A BocTaegOH in situ diizopropil-karbodiimid (DIC) kapcsolását 1,2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben végezzük, 0,046 g (0,012 mmol) monomer, valamint
18,7 μΐ (0,12 mmol) diizopropil-karbodiimid alkalmazásával minden egyes kapcsolási lépésben. Az oldhatósági problémák miatt a 0,048 g (0,12 mmol) Boc-(proT)OH-t 2,5 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben szuszpendáljuk a kapcsolás előtt, a szuszpenziót megszüljük, és körülbelül 2 ml szűrletet használunk az éjszakán át tartó kapcsoláshoz. Mindegyik kvalitatív Kaiser-teszt negatív, jelezve a közel 100%-os kapcsolási hatásfokot. A PNA-oligomert hasítjuk, majd standardmódszerekkel tisztítjuk.
79. példa
A H-[Taeg]4-[proTj-[Taeg]S-Lys-NH2 hibridizációja
Oligodezoxinukleotid Tm (°C)
5’-AAA AAA AAA A 53,5
5’-AAA AGA AAA A 44,0
Oligodezoxinukleotid Tm (°C)
5’-AAA AAG AAA A 43,5
5’-AAA ACA AAA A 46,5
5’-AAA AAC AAA A 46,5
5’-AAA ATA AAA A 46,5
5’-AAA AAT AAA A 46,0
80. példa
A H-[Taeg]r[bC]-[Taeg]5-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise
A PNA-oligomert 100 mg (nedves tömeg) MBHAgyantán állítjuk össze, amelyet előzőleg egy éjszakán át diklór-metánban duzzasztottunk. A gyantát először körülbelül 0,25 mmol/g Boc-Lys(ClZ)-vel szubsztituáljuk, a kvantitatív ninhidrinreakció alapján meghatározva. Az oligomer lépésenkénti szintézisét a 9. protokoll szerint végezzük, 0,0323 g (0,06 mmol) BocTaeg-OH-t, 0,062 g (0,12 mmol) BocbC(Z>OH-t és 0,012 g (0,06 mmol) DC-t használva 1,2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklórmetán elegyben az egyes kapcsolási lépésekben. Mindegyik kvalitatív Kaiser-teszt negatív, jelezve a közel 100%-os kapcsolási hatásfokot. A PNA-oligomert hasítjuk, majd standardmódszerekkel tisztítjuk.
81. példa
A H-T4bCTs-Lys-NH2 hibridizációja
Oligodezoxinukleotid Tm (°C)
5’-AAA AAA AAA A 43,5
5’-AAA AGA AAA A 58,0
5’-AAA AAGAAA A 60,0
5’-AAA ACA AAA A 34,5
5’-AAA AAC AAA A 34,5
5’-AAA ATA AAA A 34,0
5’-AAAAAT AAAA 36,0
82. példa
A H-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg][Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-Lys-NH2 lépésenkénti összeállítása
A szintézist egy Boc [Taeg]3-Lys(ClZ)-MBHAgyantán indítjuk (a 76. példából), amelyet előzőleg egy éjszakán át diklór-metánban előduzzasztottunk. A gyanta körülbelül 100 mg (száraztömeg) Boc-Lys(ClZ)MBHA-gyantára hasonlít (töltés 0,15 mmol/g). A monomereket az 55. példában leírtak alapján építjük be, az 5. lépés kivételével (a Boc(Z)aeg-OH monomer beépítése). Az új 5. lépésben (az A(Z)aeg beépítése) 4 ekvivalens diizopropil-karbodiimidet (0,06 mmol; 9,7 μΐ) és 4 ekvivalens BocA(Z)aeg-OH-t (0,06 mmol; 32 mg) építünk be 0,6 ml diklór-metán/dimetil-formamid 1:1 elegyében oldva (a monomer végkoncentrációja 0,1 mól). A kapcsolási reakciót hagyjuk 1x15 percig folyni, majd 1 χ 60 percig (újrakapcsolás).
A kapcsolatlan aminocsoportok lezárását csak a BocA(Z)aeg-OH monomer beépítése előtt végezzük.
HU 221 003 Bl
A kapcsolási reakciót a kvalitatív ninhidrinreakcióval (Kaiser-teszt) ellenőrizzük. Mindegyik Kaiser-reakció negatív (szalmasárga szín, a gyöngyök nem színezódnek). A PNA-oligomert standardmódszerekkel hasítjuk és tisztítjuk.
84. példa
A H-T4ATs-LysNH2 hibridizációs tulajdonságai
Oligodezoxinukleotid Tm (°C)
5’-AAA AAA AAA A 59,5
5’-AAA AGA AAA A 45,0
5’-AAA AAG AAA A 45,5
5’-AAA ACA AAA A 48,0
5’-AAA AAC AAA A 48,0
5’-AAA ATA AAA A 52,0
| 5’-AAA AAT AAA A 52,5
82. példa
A H-[Tieg]-[Taeg]-[Taeg]-[Tieg]-[Gaeg][Gaeg]-[Taeg]-[Gaeg]-[Taeg]-[Gaeg]-Lys-NH2 lépésenkénti összeállítása
A védett PNA-t egy Boc-Lys(ClZ) módosított MBHA-gyantán állítjuk össze 0,15 mmol/g szubsztitúcióval. A monomerek beépítését a 32. példában közölt protokoll alapján végezzük, azzal a különbséggel, hogy all. lépésben szereplő lezárást és a 12. lépésben szereplő mosást kihagyjuk. Az első, második és negyedik G(Bzl)aeg-monomer beépítése és a védőcsoportok eltávolítása után támadt némi nehézség azzal, hogy a gyanta megfelelően duzzadjon. Tiszta diklórmetánban végzett háromórás rázatás megfelelő mértékű duzzadást okozott. A Taeg-4, G(Bzl)aeg-6 és a Taeg-7-Taeg-10 csoportok beépítésénél a kapcsolás ismétlésére van szükség, hogy közel kvantitatív kapcsolási hatásfokot kapjunk. Taeg4 (2 χ 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben), Gaeg6 (2 χ 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben), Taeg7 (2 χ 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, χ 50%-os NMP/diklór-metán elegyben és 1 χ tiszta diklór-metánban), Taeg8 (lx 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben és 2 χ tiszta diklórmetánban), Taeg9 (2 χ 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben), Taeg10 (2 χ 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben). Mindegyik kvalitatív Kaiser-teszt negatív (szalmasárga szín, a gyöngyök nem színeződnek el). A PNA-oligomereket hasítjuk és standardeljárásokkal tisztítjuk.
86. példa
A nyers (körülbelül 50%-os) H-T4G2TGTG-LysNH2 hibridizációja
I Oligodezoxinukleotid Találmány
5’-A4C2ACAC 38
5’-CACAC2A4 55
87. példa
A H-[Taeg] 4-Lys-NH2, H-jTaegj^Lys-NH;,, H[Taeg]g-Lys-NH2, H-[Taeg]9-Lys-NH2 és a H[Taeg] 1(rLys-NH2 nagy mennyiségben való előállítása szilárdfázisú szintézissel (aj A Boc-[Taeg]]0-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta és a rövidebb fragmensek lépésenkénti előállítása Körülbelül 9 g nedves Boc-[Taeg]3-Lys(ClZ)MBHA gyantát (lásd a 19. példát) 60 ml-es SPPS reakcióedénybe teszünk. A Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA gyantát egyedi kapcsolásokkal állítjuk össze a két csoportból 0,15 mól BocTaeg-OPfp 10 ml tiszta diklórmetános oldatával („8. szintézisprotokoll”). Mindkét kapcsolási reakciót egy éjszakán át hagyjuk lejátszódni. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, amely mindkét csoportra közel kvantitatív beépülést mutat. Az N-terminális Boc-csoport eltávolítása után körülbelül 4,5 g H-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA-t teszünk egy 20 ml-es SPPS reakcióelegybe, majd meghosszabbítjuk Boc-[Taeg]g-Lys(ClZ)-MBHA-vá az összes csoport egyetlen in situ DCC kapcsolásával (közel kvantitatív, kivéve a nyolcas csoportot) éjszakán át 0,2 mól BocTaeg-OH-val és 0,2 mól DCC-vel 7,5 ml tiszta diklór-metánban („9. szintézisprotokoll”). A hetes és nyolcas Taeg-csoportok kapcsolása előtt kis mennyiségű H-[Taeg]6-Lys(ClZ)-MBHA-t és H-[Taeg]7Lys(ClZ)-MBHA-t veszünk ki HF-es hasítás céljából.
A nyolcas Tag-csoportot kétszer kapcsoljuk (éjszakán át), hogy közel kvantitatív beépülést kapjunk. Az N-terminális Boc-csoport eltávolítása után nagy mennyiségű H-[Taeg]8-Lys(ClZ)-t veszünk ki a HF hasításhoz. A Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát kétszeres in situ DCC kapcsolással állítjuk össze 0,16 mól BocTaeg-OH-ból, 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). A végső csoport kapcsolása előtt kis mennyiségű H-[Taeg]9-Lys(ClZ)-MBHA gyantát kiveszünk HF-es hasítás céljára.
(b) A H-[Taeg]g-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]6-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 14 mg nyersanyagot 52,4 mg száraz H[Taeg]6-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-os hasításával. A nyersterméket nem tisztítjuk (körülbelül 99%-os tisztaságú).
(c) A H-[Taeg] rLys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]7-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 5,2 mg nyersanyagot 58,4 mg száraz H[Taeg]7-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
(d) A H-[Taeg]g-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]8-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 114 mg nyersanyagot 604 mg száraz H[Taeg]8-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
HU 221 003 Bl (e) A H-[Taeg] rLys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]9-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 19,3 mg nyersanyagot 81,0 mg száraz H[Taeg]9-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
(f) A H-[Taeg] 10-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 141 mg nyersanyagot 417 mg száraz H[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
(g) 8. szintézisprotokoll (1) Boc védőcsoport eltávolítása TFA/diklór-metán (1:1, térfogat/térfogat) eleggyel, 3x1 perc és 1 χ 30 perc;
(2) mosás diklór-metánnal, 6x1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/diklór-metán (1:19, térfogat/térfogat) eleggyel, 3x2 perc;
(4) mosás diklór-metánnal, 6x1 perc, szárítás 1 percig;
(5) a szintézis bizonyos fázisaiban 2-5 mg PNAgyantamintát kiveszünk és alaposan megszárítunk egy kvantitatív ninhidrinelemzéshez, hogy a szubsztitúció mértékét meghatározzuk;
(6) Boc-védett PNA-monomer hozzáadása (Pfpészter); a kapcsolási reakciót összesen X óráig rázatva hagyjuk lejátszódni;
(7) mosás dimetil-formamiddal, 1x2 perc;
(8) mosás diklór-metánnal, 4x1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/diklór-metánnal, (1:19, térfogat/térfogat) 2x2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 6x1 perc;
(11) a védett PNA-gyantából alkalmanként 2-5 mg-os mintát veszünk, majd alaposan megszárítjuk a kvantitatív ninhidrinelemzéshez, amelynek célja, hogy meghatározzuk a kapcsolás mértékét;
(12) a szintézis bizonyos fázisaiban a reagálatlan aminosavakat acetilezéssel blokkoljuk, 25 ml ecetsavanhidrid/piridin/diklór-metán (1:1:2, térfogat/térfogat/térfogat) elegyet alkalmazva, 2 órán keresztül, majd diklórmetános mosás következik, 6x1 perc, és alkalmanként ninhidrines elemzés.
88. példa
H-[Taeg] 4-Caeg-[Taeg] 5-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg],f-C[Z]aeg-[Taeg]fLys(ClZ)MBHA-gyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 1 g nedves Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát in situ DCC kapcsolásokkal állítjuk össze, mindegyik csoportból, 0,16 mól BocC[Z]aegOH-t alkalmazva 0,16 mól DCC-vel 2,0 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben vagy 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót hagyjuk, hogy 20-24 óra hosszat játszódjon le rázatás közben. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy a C[Z]aeg körülbelül 98%-ban épült be, illetve mindegyik Taeg-csoport közel kvantitatíve épült be.
(b) A H-[Taegj4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 22,5 mg nyersanyagot 128,2 mg H-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-es kezelésével. A nyersterméket tisztítjuk, így kapunk 3,1 mg H-[Taeg]4-Caeg-[Taeg]s-LysNH2-t.
(c) 9. szintézisprotokoll (általános protokoll) (1) Boc védőcsoport eltávolítása TFA/diklórmetán (1:1, térfogat/térfogat) eleggyel, 3x1 perc és 1x30 perc;
(2) mosás diklór-metánnal, 6x1 perc;
(3) semlegesítés DIEA/diklór-metán (1:19, térfogat/térfogat) eleggyel, 3x2 perc;
(4) mosás diklór-metánnal, 6x1 perc, szárítás 1 percig;
(5) a szintézis bizonyos fázisaiban 2-5 mg PNAgyantamintát kiveszünk és alaposan megszárítunk egy kvantitatív ninhidrinelemzéshez, hogy a szubsztitúció mértékét meghatározzuk;
(6) Boc-védett PNA-monomer hozzáadása (szabad sav) X ml dimetil-formamidban, majd DCC hozzáadása X ml diklór-metánban; a kapcsolási reakciót összesen Y óráig rázatva hagyjuk lejátszódni;
(7) mosás dimetil-formamiddal, 1x2 perc;
(8) mosás diklór-metánnal, 4x1 perc;
(9) semlegesítés DIEA/diklór-metánnal, (1:19, térfogat/térfogat) 2x2 perc;
(10) mosás diklór-metánnal, 6x1 perc;
(11) a védett PNA-gyantából alkalmanként 2-5 mgos mintát veszünk, majd alaposan megszárítjuk a kvantitatív ninhidrinelemzéshez, amelynek célja, hogy meghatározzuk a kapcsolás mértékét;
(12) a szintézis bizonyos fázisaiban a reagálatlan aminosavakat acetilezéssel blokkoljuk, ecetsavanhidrid/piridin/diklór-metán (1:1:2, térfogat/térfogat/térfogat) elegyet alkalmazva, 2 órán keresztül, majd diklór-metános mosás következik, 6x1 perc, és alkalmanként ninhidrines elemzés.
89. példa
A H-[Taeg]r(NBaeg)-[Taeg]5-Lys-NH2 (NB=COCHj) szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg] j-CNBaegfifTaeg] 5-Lys(ClZ)MBHA-gyanta lépésenkénti összerakása
Körülbelül 1 g nedves Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5Lys(ClZ)-MBHA-gyantát in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, 0,16 mól Boc(NBaeg)-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml tiszta diklór-metánban, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-ben 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni. Az NBaeg-csoportot háromszor kapcsoljuk, mindegyik Taeg-csoportot csak
HU 221 003 Bl egyszer kapcsoljuk. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az NBaeg >99%-ban épül be (körülbelül 88% az első kapcsolás után, és körülbelül 93% a második kapcsolás után), míg az összes Taeg-csoport közel kvantitatíve beépül.
(b) A H-[Taeg] 4-(NBaeg)-[Taeg] 5-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása A védett Boc-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 33,6 mg nyersanyagot,
108,9 mg száraz H-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-os hasításával. A nyersterméket tisztítjuk, így kapunk 4,6 mg H-[Taeg]4(NBaeg)-[Taeg]5-Lys-NH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2683,12, a mért m/z érték 2683,09.
90. példa
A H-[Taeg] 4-aeg-[Taeg] S-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]4-aeg-[TaegJs-Lys(ClZ)-MBHAgyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 1 g nedves Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, 0,16 mól Bocaeg-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklórmetán elegyben, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-vel 50%-os dimetil-formamid/diklórmetán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépült.
(b) A H-[TaegJ^aeg-jTaeg]S-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 22,2 mg nyersanyagot, 126,0 mg száraz H-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-os hasításával. A nyersterméket tisztítjuk, így kapunk 7,6 mg H-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-LysNH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2641,11, a mért m/z érték 2641,16.
91. példa
A H-[Taeg]4-Gly-[Taeg]s-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]4-Gly-[Taeg]s-Lys(ClZ)-MBHAgyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 1 g nedves Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, 0,16 mól BocGly-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-vel 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni.
A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépült.
(b) A H-[Taeg]4-Gly-[Taeg]S-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 18(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 45,0 mg nyersanyagot,
124,1 mg száraz H-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (40,4 mg) tisztítjuk, így kapunk 8,2 mg H-[Taeg]4Gly-[Taeg]5-Lys-NH2-t.
92. példa
A H-[Taeg] rGly2-[Taeg] 5-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]s-Lys(ClZ)-MBHAgyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 1 g nedves Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-[Taeg]C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg Lys(ClZ)-MBHA-gyantát in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, 0,16 mól BocGly-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-vel 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépült.
(b) A H-[Taeg]^Gly^jTaeg]5-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 32,6 mg nyersanyagot,
156,6 mg száraz H-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (30 mg) tisztítjuk, így kapunk 7,8 mg H-[Taeg]4-Gly2[Taeg]5-Lys-NH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2655,09, a mért m/z érték 2655,37.
93. példa
A H-[Taeg]r[Caegj2-[TaegJ-Caeg-Taeg-CaegLys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-[Taeg]-C[Z]aegTaeg-C[Z]aeg-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 1,5 g nedves Boc-Lys(ClZ)-MBHAgyantát (0,28 mmol Lys/g) teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-TaegC[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, 0,16 mól BocC[Z]-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-vel 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépült.
HU 221 003 Β1 (b) A H-[Taeg]4-[Caeg]2-Taeg-Caeg-Taeg-CaegLys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]4-[C[Z]aeg2-[Taeg]-C[Z]aegTaeg-C[Z]aeg-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül
52,1 mg nyersanyagot, 216,7 mg száraz H-[Taeg]4[C[Z]aeg2-[Taeg]-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (30,6 mg) tisztítjuk, így kapunk 6,2 mg H-[Taeg]4[Caeg]2-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2747,15, a mért m/z érték 2746,78.
94. példa
A H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[CaegJ3-Taeg-CaegTaeg-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg[C[ZJaeg}3-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-Lys(ClZ)-MBHAgyanta lépésenként! összeállítása
Körülbelül 1,5 g nedves Boc-Lys(ClZ)-MBHAgyantát (0,28 mmol Lys/g) teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aegTaeg-C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg]3-Taeg-C[Z]aeg-TaegLys(ClZ)-MBHA-gyantát in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, 0,16 mól BocC[Z]-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-vel 50%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépült.
(b) A H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[CaegJ3-TaegCaeg-Taeg-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg[C[Z]aeg]3-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-Lys(ClZ)-MBHAgyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 56,1 mg nyersanyagot, 255,0 mg száraz H-C [Z] aeg-Taeg-C [Z]aeg-Taeg- [C [Z] aeg] 3 Taeg-C[Z]aeg-Taeg-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (85,8 mg) tisztítjuk, így kapunk 46,2 mg H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[Caeg]3Taeg-Caeg-Taeg-Lys-NH2. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2717,15, a mért m/z érték 2716,93.
95. példa
A H-[TaegJ2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2, a
H-Caeg-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-LysNH2, és a H-Tyr-[Taeg]2-[CaegJ3-fTaeg]2[Caeg] 2-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[TaegJ2-[C(Z)aegJ3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2Lys(ClZ)-MBHA-gyanta, a Boc-Caeg-[Taeg]2[C(Z)aeg] 3-[Taeg]2-[C(Z)aeg] rLys(ClZ)-MBHAgyanta, és a Boc-Tyr(Brz)-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta lépésenként! összeállítása
Körülbelül 3 g nedves Boc-Lys(ClZ)-MBHAgyantát (0,28 mmol Lys/g) egy 20 ml-es SPPS reakcióedénybe teszünk. A Boc-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát in situ, minden egyes csoport egyedi DDC kapcsolásával rakjuk össze, 0,16 mól BocC[Z]-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCC-vel 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépült. Az N-terminális Boc védőcsoport eltávolítása után a PNA-gyanta felét kvantitatíve Tyr(BrZ)-OHhoz kapcsoljuk, majd egy kis részét kvantitatíve még egy vagy több Caeg-csoporthoz kapcsoljuk. Mindkét kapcsolás során az előzőkben leírt szintetikus protokollt használjuk.
(b) A H-[Taeg]2-[CaegJ3-[Taeg]2r[Caeg]2-LysNH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taegj2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 50,9 mg nyersanyagot, 182,5 mg száraz H-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (50,9 mg) tisztítjuk, így kapunk 13,7 mg H-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-LysNH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2466,04; az m/z értékét nem mértük meg.
(c) A H-Tyr-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]r
Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 60,8 mg nyersanyagot, 188,8 mg száraz HTyr(BrZ)-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (60,8 mg) tisztítjuk, így kapunk 20,7 mg HTyr-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2629,11; a mért m/z érték 2629,11.
(d) A H-Caeg-[Taeg]r[Caeg]3-[Taeg]r[Caeg]2Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-C(Z)aeg-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 11,7 mg nyersanyagot, 42,0 mg száraz H-C(Z)aeg[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (11,6 mg) tisztítjuk, így kapunk 3,1 mg H-Caeg[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2717,15; az m/z értéket nem mértük.
96. példa
A H-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]rLys-NH2,
H-Taeg-[Caeg] 2-[Taeg] 2-[Caeg] 3-[Taeg] 2-LysNH2, és a H-Tyr-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3[Taeg]2-Lys-NH2 szilárdfázisú szintézise (a) A Boc-[C(Z)aeg]2-[TaegJ2-[C(Z)aeg]3-[Taegj2Lys(ClZ)-MBHA-gyanta, a Boc-Taeg-[C(Z)aeg]245
HU 221 003 Bl [Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHAgyanta, és a Boc-Tyr(Brz)-[C(Z)aeg]2-[TaegJ2[C(Z)aeg] 3-[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta lépésenkénti összeállítása
Körülbelül 3 g Boc-Lys(ClZ)-MBHA (0,28 mmol Lys/g) gyantát teszünk egy 20 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát az összes csoport in situ DCC kapcsolásával állítjuk össze, 0,16 mól BocC[Z]-OH-t használva 0,16 mól DCC-vel 2 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, illetve 0,16 mól BocTaeg-OH-t 0,16 mól DCCvel 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót 20-24 órás rázatással hagyjuk lejátszódni. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az összes csoport közel kvantitatíve beépült. Az N-terminális Boc védőcsoport eltávolítása után a PNA-gyanta felét kvantitatíve Tyr(BrZ)-OH-hoz kapcsoljuk, majd egy kis részét kvantitatíve még egy vagy több Taeg-csoporthoz kapcsoljuk. Mindkét kapcsolás során az előzőkben leírt szintetikus protokollt használjuk.
(b) A H-[C(Z)aeg]2-[Taegjr[C(Z)aeg]3-[Taeg]r
Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 57,6 mg nyersanyagot, 172,7 mg száraz H-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (57,6 mg) tisztítjuk, így kapunk 26,3 mg H-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2Lys-NH2-t. Az (M + Z)+-ra számított m/z érték 2466,04; az m/z értéket nem mértük.
(c) AH-Tyr-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]rLys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-Tyr(BrZ)-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 57,6 mg nyersanyagot, 172,7 mg száraz HTyr(BrZ)-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (47,1 mg) tisztítjuk, így kapunk 13,4 mg HTyr-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2-t. Az (M+Z)+-ra számított m/z érték 2629,11; az m/z értéket nem mértük.
(d) AH-Taeg-[C(Z)aeg]r[Taegj2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2~Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-Taeg-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 53,4 mg nyersanyagot, 42,4 mg száraz H-Taeg-[C(Z)aeg]2[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (11,9 mg) tisztítjuk, így kapunk 4,3 mg H-Taeg-[Caeg]2-[Taeg]2[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2-t. Az (M+Z)+-ra számított m/z érték 2732,15; az m/z értéket nem mértük.
(c) 10. szintézisprotokoll (általános protokoll)
Ugyanaz, mint a „9. szintetikusprotokoll”, azzal az eltéréssel, hogy a DCC-t DIC-cel helyettesítjük.
97. példa
A gerincegység szintézise felnagyítás céljára, reduktív aminálással (a) (Bocamino)-acetaldehid szintézise
80,0 g (0,88 mól) 3-amino-l,2-propán-diolt oldunk 1500 ml vízben, majd az oldatot 4 °C-ra hűtjük, majd egyszerre hozzáadunk 230 g (1,05 mól) Bocanhidridet. Az oldatot óvatosan szobahőmérsékletre hűtjük vízfürdőben. A pH-t 10,5 értéken tartjuk, nátrium-hidroxid cseppenkénti hozzáadásával. A reakció során összesen 70,2 g, 480 ml vízben oldott nátriumhidroxidot adunk a reakcióelegyhez. Egy éjszakán át való kevertetés után 1000 ml etil-acetátot adunk a reakcióelegyhez, majd 0 °C-ra hűtjük, a pH-t 2,5-re állítjuk 4 mol/1 sósav hozzáadásával. Az etil-acetát réteget eltávolítjuk, majd a savas vizes oldatot még extraháljuk 8 χ 500 ml etil-acetáttal. A kombinált etil-acetát-oldat térfogatát 1500 ml-re csökkentjük rotációs bepárlóberendezésen. A kapott oldatot félig telített kálium-hidrogén-szulfáttal (1500 ml), majd telített nátrium-kloriddal mossuk. Az oldatot magnéziumszulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Kitermelés 145,3 g (86%).
144,7 g (0,757 mmol) 3-bocamino-l,2-propán-diolt szuszpendálunk 750 ml vízben, majd 191,5 g (0,833 mól) kálium-peqodátot adunk hozzá. A reakcióelegyet nitrogénatmoszférában kevertetjük 2,5 óra hosszat, majd a kicsapódott kálium-jodátot kiszűrjük, és egyszer mossuk 100 ml vízzel. A vizes fázist 6x400 ml kloroformmal extraháljuk. A kloroformos extraktumokat szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Kitermelés: 102 g olaj (93%). A (bocamino)-acetaldehidet golyóshűtőn végzett desztillációval tisztítjuk 84 °C-on, 40 Pa mellett, két részletben. Kitermelés 79 g (77%) színtelen olaj.
(b) (N’-bocamino-etil)-glicin-metil-észter készítése
2,0 g 10%-os csontszenes palládiumot adunk 10 g (68,9 mmol) (bocamino)-acetaldehid 150 ml metanolban készült oldatához. 11,3 g (138 mmol) nátriumacetát 150 ml metanolban készült oldatát és 8,65 g (68,9 mmol) glicin-metil-észter-hidroklorid 75 ml metanolban készült oldatát adjuk a reakcióelegyhez. Az elegyet atmoszferikus nyomáson hidrogénezzük
2,5 óra hosszat, majd celiten átszűrjük, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Az anyagot újra oldjuk 150 ml vízben, és a pH-t 8,0-ra állítjuk 0,5 mol/1 nátrium-hidroxiddal. A vizes oldatot diklór-metánnal extraháljuk (5 χ 150 ml). Az egyesített kivonatokat nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. így kapunk 14,1 g (88%) (N’bocamino-etil)-glicin-metil-észtert. A nyersanyagot golyós hűtőn végzett desztillációval tisztítjuk 120 °C-on 67 Pa nyomáson, így kapunk 11,3 g (70%) színtelen olajat. A termék a vékonyréteg-kromatográfiás elemzés szerint (10% metanol diklór-metánban) jobb minőségű annál, mint amelyet a 26. példában állítottunk elő.
Egy másik módszer szerint nátrium-ciano-bórhidridet használunk redukálószerként hidrogén helyett (katalizátorként Pd(C)-t alkalmazva), jóllehet a kitermelés (42%) alacsonyabb.
HU 221 003 Bl (c) Az (N’-bocamino-etil)-glicin-etil-észter
A címben szereplő vegyületet a fenti eljárás szerint állítjuk elő, glicin-etil-észter-hidrokloridot használva a glicin-metil-észter-hidroklorid helyett. Emellett a használt oldószer etanol. A kitermelés 78%.
98. példa
A H-Tyr[Taeg]ia-Lys-NH2 szilárdfázisú szintézise (a) A Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]I0-Lys(ClZ)-MBHAgyanta előállítása lépésenként
Körülbelül 0,2 g nedves Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)MBHA-gyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]10-Lys(ClZ)MBHA-gyantát standard in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, 0,32 mól BocCTyr(BrZ)-OH-t használva 0,32 mól DCC-vel 3 ml tiszta diklór-metánban oldva, éjszakán át. A ninhidrinreakció azt mutatja, hogy a BocTyr(BrZ) körülbelül 97%-ban épült be.
(b) A H-Tyr[Taeg]ia-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-Tyr(BrZ)-[TAeg]10-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 5,5 mg nyersanyagot,
20,7 mg száraz H-Tyr(BrZ)-[Taeg]10-Lys(ClZ)MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket tisztítva kapunk 2,5 mg H-Tyr[Taeg]10-Lys-NH2-t.
99. példa
A danzil-JTaeg]jg-Lys-NH2 szilárdfázisú szintézise (a) A danzil-JTaeg] 10-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta előállítása lépésenként
Körülbelül 0,3 g nedves Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)MBHA-gyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A danzil-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHAgyantát 0,5 mól danzil-Cl kapcsolásával készítjük 2 ml tiszta piridinben, egy éjszakán át. A ninhidrinreakció a danzilcsoport körülbelül 95%-os beépülését mutatja.
(b) A danzil-[Taeg]ln-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett danzil-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 12 mg nyersanyagot, 71,3 mg száraz danzil[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket tisztítva kapunk 5,4 mg danzil[Taeg]10-Lys-NH2-t.
100. példa
A Gly-Gly-His-[Taeg] I0-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]ia-Lys(ClZ)MBHA-gyanta összeállítása lépésenként
Körülbelül 0,5 g Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHAgyantát teszünk egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg] 10-Lys(ClZ)-MBHAgyantát standard kettős in situ DCC kapcsolással készítjük el, 0,1 mól Boc-védett aminosav kapcsolásával
2,5 ml 25%-os dimetil-formamid/diklór-metán oldatban, azzal a különbséggel, hogy az első kapcsolásnál BocHis(Tos)-t használunk, egy előre elkészített szimmetrikus anhidriddel (0,1 mól) 25%-os dimetilformamid/diklór-metán elegyben. Mindegyik kapcsolást egy éjszakán át végezzük, ninhidrinreakciókat nem végzünk.
(b) A Gly-Gly-His-[Taeg]I0-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]i0Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 10,3 mg nyersterméket, (körülbelül 40%-os tisztaságú), 34,5 mg száraz Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]i0-Lys(ClZ)-MBHAgyanta HF-es hasításával. A nyerstermék egy kis részét (a liofilezés előtt kivéve) megtisztítjuk, így kapunk 0,1 mg Gly-Gly-His-[Taeg]10-Lys-NH2-t.
101. példa
A H-[Taeg]5-[Caeg]2-NH2 szilárdfázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]5-[C(Z)aeg]rMBHA-gyanta összeállítása lépésenként
Körülbelül 0,2 g MBHA-gyantát egy 3 ml-es SPPS reakcióedénybe teszünk, majd semlegesítünk. A töltés a meghatározás szerint körülbelül 0,64 mmol/g. BocC(Z)aeg-OPfp-t kapcsolunk a gyantára, 0,13 mól koncentrációban, 2,5 ml 25%-os fenol: kloroform elegyben. A ninhidrinelemzés azt mutatja, hogy a kapcsolás hatásfoka körülbelül 40%. A megmaradó szabad aminocsoportokat a szokásos módon acetilezzük. A Boc-[Taeg]5-[C(Z)aeg]2-MBHA-gyantát a következő csoport egyszeri in situ DCC kapcsolásával rakjuk össze, 0,11 mól BocC(Z)aeg-OH-t használva 0,11 mól DCC-vel 2,5 ml 50%-os dimetil-formamid/diklórmetán elegyben, valamint 0,13 mól BocTaeg-OPfp kapcsolásával tiszta diklór-metánban a többi csoport esetében („8. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót egy éjszakán át való rázatással hajtjuk végre. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az egyes csoportok majdnem kvantitatíve beépültek.
(b) A H-[Taeg]/[Caeg]2-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]5-[C(Z)aeg]2-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 21,7 mg nyersanyagot (>80% tisztaságú)
94,8 mg száraz H-[Taeg]5-[C(Z)aeg]2-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (7,4 mg) tisztítjuk, így kapunk 2,0 mg H-[Taeg]5-[Caeg]2-NH2-t (> 99%os tisztaságú).
102. példa
A H-[Taeg] 3-Caeg-[Taeg] 4-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-JTaeg]3-C(Z)aeg-[Taeg]^MBHA-gyanta összeállítása lépésenként
Az előzőkben említett MBHA-gyantából körülbelül 0,2 mg-ot egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe helyezünk, majd semlegesítjük. A Boc-[Taeg]3-C(Z)aeg[Taeg]4-MBHA-gyantát egyszeri DCC kapcsolással készítjük a C(Z)aeg csoport esetében, 0,13 mól BocC[Z]aeg-OH-t használva 0,13 mól DCC-vel
2,5 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, valamint a Taeg-csoport kapcsolásához 0,13 mól
HU 221 003 Bl
BocTaeg-OPfp-t használunk 2,5 ml tiszta diklórmetánban. Mindegyik kapcsolási reakciót egy éjszakán át való rázatással hajtjuk végre. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az egyes csoportok majdnem kvantitatíve beépültek.
(b) A H-[Taeg]3-Caeg-[Taeg]4-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]3-C(Z)aeg-[Taeg]4-MBHAgyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 44,4 mg nyersanyagot 123 mg száraz H-[Taeg]3-Caeg-[Taeg]4-MBHA-gyanta HF-es kezelésével. A nyersterméket (11,0 mg) tisztítva kapunk
3,6 mg H-[Taeg]3-Caeg-[Taeg]4-NH2-t.
103. példa
A H-Taeg-Caeg-[Taeg] g-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(ClZ)-MBHAgyanta lépésenként! összeállítása
Körülbelül 0,3 g nedves Boc-[Taeg]g-Lys(ClZ)MBHA-gyantát egy 3 ml-es SPPS reakcióedénybe teszünk. A Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]8-Lys(ClZ)MBHA-gyantát egyszeri in situ DCC kapcsolással állítjuk össze a C(Z)aeg csoport esetében („9. szintézisprotokoll”), 0,2 mól BocC[Z]aeg-OH-t használva 0,2 mól DCC-vel 2,5 ml 50%-os dimetil-formamid/diklórmetán elegyben (a beépülés hatásfoka körülbelül 80%os a ninhidrinelemzés eredményei alapján; a megmaradt szabad aminocsoportokat acetilezzük), illetve a Taeg-csoport éjszakán át tartó kapcsolásával 0,15 mól BocTAeg-OPfp-t 2,5 ml tiszta diklór-metánban oldva (közel kvantitatív kapcsolás).
(b) A H-Taeg-Caeg-[Taeg]g-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]8-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 22,3 mg nyersterméket körülbelül 76,5 mg száraz H-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]8Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket (6,7 mg) tisztítjuk, így kapunk 2,6 mg HTaeg-Caeg-[Taeg]8-Lys-NH2-t. Az (M+H)+-ra számított m/z érték 2792,15, a mért m/z érték 2792,21.
104. példa
A H-Caeg-[Taeg]S-Lys-NH2 és a H-[Taeg]2-Caeg[Taeg] 5-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]s-Lys(ClZ)MBHA-gyanta lépésenként! összeállítása
Körülbelül 0,5 g nedves Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe teszünk. A Boc-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát egyszeri in situ DCC kapcsolással állítjuk össze mindegyik csoport esetében, 0,12 mól BocC(Z)aeg-OH-t használva 0,12 mól DCC-vel 3 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben, illetve 0,12 mól BocTaeg-OH-t használva 0,12 mól DCCvel 3 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót egy éjszakán át való rázatással hajtjuk végre. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az egyes csoportok majdnem kvantitatíve beépültek. A szintézis során egy kevés HC(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát kiveszünk a reakcióelegyből és HF-es hasítást végzünk vele.
(b) A H-Caeg-[Taeg]S-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHAgyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 3 mg nyersanyagot 37,5 mg száraz HC(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. Körülbelül 0,7 mg nyersterméket megtisztítva kapunk körülbelül 0,5 mg H-Caeg-[Taeg]5-Lys-NH2-t.
(c) A H-[TaegJ2-Caeg-[Taeg]S-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 37,7 mg nyersanyagot
118,6 mg száraz H-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]5Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
105. példa
A H-[Caeg]s-Lys-NH2, H-[Caeg]6-Lys-NH2, H[Caeg] g-Lys-NH2, H-[Caeg] 10-Lys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-[C(Z)aeg]lfl-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta és a rövidebb fragmensek lépésenkénti összeállítása Körülbelül 5 g Boc-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát (szubsztitúció=0,3 mmol Lys/g) teszünk egy 30 ml-es SPPS reakcióedénybe. A Boc-[C(Z)aeg]i0-Lys(ClZ)MBHA-gyantát egyedi in situ DCC kapcsolással állítjuk össze, az első három csoport esetében 0,1 mól BocC(Z)aeg-OH-t használva 0,1 mól DCC-vel 10 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („9. szintézisprotokoll”), illetve egyedi DIC kapcsolással a további három csoport esetében, 0,1 mól BocC(Z)aegOH-t 0,1 mól DIC-cel együtt használva 10 ml 50%-os dimetil-formamid/diklór-metán elegyben („10. szintézisprotokoll”). Mindegyik kapcsolási reakciót egy éjszakán át való rázatással hajtjuk végre. A szintézist a ninhidrinreakcióval követjük, ami azt mutatja, hogy az egyes csoportok majdnem kvantitatíve beépültek. A szintézis során a rövidebb ffagmensekből, azaz a H[C(Z)aeg]5-Lys(ClZ)-MBHA-ból, a H-[C(Z)aeg]6Lys(lZ)-MBHA-ból és a H-[C(Z)aeg]g-Lys(ClZ)MBHA-ból részeket veszünk ki, és HF-es hasítást végzünk rajtuk.
(b) A H-[Caeg]S-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[C(Z)aeg]s-Lys(ClZ)-MBHAgyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 10,8 mg nyersterméket 60,1 mg száraz H-[C(Z)aeg]5-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
(c) A H-[CaegJg-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[C(Z)aeg]6-Lys(ClZ)-MBHAgyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 13,4 mg nyersterméket 56,2 mg száraz H-[C(Z)aeg]6-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
HU 221 003 Bl (d) A H-[Caeg]g-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[C(Z)aeg]8-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 16,8 mg nyersterméket 65,6 mg száraz H[C(Z)aeg]g-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
(e) A H-[Caeg]Ia-Lys-NH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[C(Z)aeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 142,4 mg nyersterméket 441 mg száraz H[C(Z)aeg]10-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával.
106. példa
A H-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]rLys-NH2 szilárd fázisú szintézise (a) A Boc-jTaegJ 2-C(Z)aeg-[Taeg] 2-C(Z)aeg[TaegJ4-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta lépésenkénti összeállítása
A Boc-[Taeg]3-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta előző szintéziséből körülbelül 0,3 g nedves H-[Taeg]2-C(Z)aeg[Taeg]4-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát egy 5 ml-es SPPS reakcióedénybe teszünk. A következő csoport ötszöri kapcsolásával összesen 87%-os BocC(Z)aeg kapcsolást lehet elérni. Az öt ismételt kapcsolást 0,18 mól BocC(Z)aeg-OPfp-vel végezzük 2 ml TFE/diklór-metán elegyben (1:2, térfogat/térfogat), 2 ml TFE/diklórmetán elegyben (1:2, térfogat/térfogat), 2 ml TFE/diklór-metán elegyben (1:2, térfogat/térfogat), de két csepp dioxánnal és két csepp DIEA-val kiegészítve (ilyen körülmények csak néhány százalékos kapcsolási hatásfokot eredményeznek), 2 ml TFE/diklór-metán elegyben (1:2, térfogat/térfogat), kiegészítve 0,5 g fenollal, és végül 1 ml diklór-metánban kiegészítve 0,4 g fenollal. A két utolsó Taeg-csoportot közel kvantitatíve építjük be kettős kapcsolással, 0,25 mól BocTaeg-OPfpt használva. Mindegyik kapcsolási lépést egy éjszakán át végezzük.
(b) A H-[Taeg]rCaeg-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]fLysNH2 hasítása, tisztítása és azonosítása
A védett Boc-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]2-C(Z)aeg[Taeg]4-Lys(ClZ)-MBHA-gyantát a 17(c) példában leírtak alapján kezeljük, így kapunk körülbelül 7 mg nyersanyagot 80,7 mg száraz H-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]2C(Z)aeg-[Taeg]4-Lys(ClZ)-MBHA-gyanta HF-es hasításával. A nyersterméket tisztítjuk, így kapunk 1,2 mg H-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2-t (>99,9%-os tisztaságú).
107. példa
PNA-szintézis két egymáshoz kötött antiparalell lánccal
A H-[TaegJ-[Taeg]-[TaegJ-[GaegJ-[TaegJ[Taeg]-[Taeg]-[6-AHAJ-[aeg]-[6-AHAJ-[Taeg][Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg]-[TaegJ-[TaegJ-LysNH2 szintézise (6-AHA = 6-amino-hexánsav (26. ábra)
A védett PNA-t egy védett Boc-Lys(ClZ) módosított MBHA-gyantán végezzük, körülbelül 0,30 mmol/g szubsztitúcióval. A kapcsolatlan aminosavak lezárását csak a BocGaeg-OH-monomer beépítése előtt hajtjuk végre. A szintézist 1,0 g (száraz súly) előre duzzasztott (éjszakán át DCM-ben) és semlegesített Boc-Lys(ClZ)-MBHA-gyantával kezdjük. A monomerek beépítését a 32. és 71. példában leírtak alapján végezzük. A kapcsolási reakciót kvalitatív ninhidrinreakcióval (Kaiser-teszttel) végezzük. Pozitív Kaiser-teszt esetében a kapcsolási reakciót addig ismételjük, ameddig a teszt alapján a gyöngyök nem színeződnek el. A védőcsoportok végső eltávolítását, a hordozóról való lehasítást és a tisztítást standardeljárásokkal végezzük.
108. példa
Alternatív védőcsoport-stratégia PNA-szintézishez (27. ábra) (a) A tesztvegyületek szintézise 2-Amino-6-O-benzil-purin: 2,5 g (0,109 mól) nátrium 100 ml benzil-alkoholban készített oldatához 10,75 g (0,063 mól) 2-amino-6-klór-purint adunk. A keveréket 12 óra hosszat kevertetjük 120 °C-on. Az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, majd ecetsavval semlegesítjük, végül 10 rész 0,2 mol/1 nátrium-hidroxiddal extraháljuk. Az összegyűjtött nátrium-hidroxidos fázisokat 100 ml dietil-éterrel mossuk, majd ecetsavval semlegesítjük, erre megindul a csapadékképződés. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd a sárga csapadékot szűréssel összegyűjtjük. Az etanolból való átkristályosítással
14,2 g 92%-os tisztaságú fehér kristályos anyagot kapunk, a címben szereplő vegyületet.
'H-NMR (250 MHz-DMSO-dfi) Ö ppm: 8-H, 7,92; benzil aromás, 7,60-7,40; 2NH2, 6,36; benzil CH2, 5,57.
(2-Amino-6-O-benzil-purinil)-metil-etanoát: 5 g (0,0207 mól) 2-amino-6-O-benzil-purin, 30 ml dimetil-formamid és 2,9 g (0,021 mól) kálium-karbonát elegyét szobahőmérsékleten kevertetjük. 3,2 g (1,9 ml; 0,0209 mól) metil-bróm-acetátot adunk hozzá cseppenként. Az oldatot 4 óra elteltével megszűrjük, és az oldószert csökkentett nyomáson (530 Pa, 40 °C) eltávolítjuk. A maradékot kétszer kristályosítjuk etil-acetátból, így kapunk 3,7 g (57%) címben szereplő vegyületet. '-NMR (250 MHz, DMSO-dJ δ ppm: 8-H, 7,93;
benzil-aromás 7,4-7,6; 2 NH2, 6,61; benzil CH2, 5,03; CH2, 5,59; OCH3, 3,78.
(2N-p-Toluol-szulfonamido-6-O-benzil-purinil)metil-etanoát: 0,5 g (1,6 mmol) (2-amino-6-Obenzil-purinil)-metil-etanoát 25 ml diklór-metánban készült oldatához 0,53 g (1,62 mmol) p-toluolszulfonsavanhidridet és 0,22 g (1,62 mmol) káliumkarbonátot adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten kevertetjük. Az elegyet megszűrjük és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk (2000 Pa, 40 °C). Az olajos maradékhoz dietil-étert adunk. A keletkező oldatot éjszakán át kevertetjük, erre a címben szereplő vegyület kicsapódik (0,415 mg; 55%), szűréssel kinyerhető.
'H-NMR (260 MHz, DMSO-dJ δ ppm: 8-H, 8,97; aromás 7,2—7,8; benzil CH2, 5,01; CH2, 4,24; OCH3, 3,73; CH3, 2,43.
HU 221 003 Bl (b) A tozilcsoporttal védett báziscsoport stabilitása
TFA-ban és HF-ben
Az anyagot a standard védőcsoport-eltávolítási körülményeknek (TFA-védőcsoport-eltávolítás), és a végső HF-es hasítás körülményeinek tesszük ki. A termékeket ezután HPLC elemzésnek vetjük alá, 4 μ RCM 8x10 Nova pack oszlopot használva, valamint A oldószerként 0,1% TFA vizes oldatát, B oldószerként pedig 0,1% TFA acetonitriles oldatát használva, az alábbi idógradiens szerint, 2 ml/perc áramlási sebességgel.
Idő %A %B
0 100 0
5 100 0
35 0 100
37 0 100
39 100 0
Az alábbi retenciós időket találtuk :
(a) 1. vegyület: 30,77 perc (b) 2. vegyület: 24,22 perc (c) 3. vegyület: 11,75 perc
Az elemzés azt mutatja, hogy a 6-O-benzil-csoportot mind a TFA, mind a HF eltávolítja, viszont a tozilcsoport nem hasad le TFA-ban, de kvantitatíve eltávolítható HF-fel standard hasítási körülmények között.
109. példa
5-Bróm-uracil-N1 -metil-acetát
5,0 g (26,2 mmol) 5-bróm-uracilt és 7,23 g (52,3 mmol) kálium-karbonátot szuszpendálunk 75 ml dimetil-formamidban. 2,48 ml (26,1 mmol) metil-bróm-acetátot adunk a szuszpenzióhoz 5 perc alatt. A szuszpenziót 2 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük, majd megszűrjük. A szilárd maradékot kétszer mossuk dimetil-formamiddal, majd megszűrjük. A szilárd maradékot kétszer mossuk dimetilformamiddal, majd a kombinált szűrleteket csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradék egy olaj, amely a címben szereplő vegyületet, dimetilformamidot és valamennyi azonosítatlan anyagot tartalmaz. Hidrolízis előtt nem szükséges megtisztítani a címben szereplő vegyületet.
•Η-NMR (DMSO-df,, 250 MHz) δ; 8,55 (szennyezés); 8,27 (CBr=C//N); 8,02 (szennyezés);
4,76 (szennyezés); 4,70 (szennyezés); 4,62 (NCH2COOCH3); 3,78 (COOC//3); 2,96 (dimetil-formamid); 2,80 (dimetil-formamid).
13C-NMR (DMSO-d6, 250 MHz) δ;
168,8 (COOCH3); 172,5 (CH = CBrCON);
161.6 (dimetil-formamid); 151,9 (NCON); 145,0 (CO-CBr=CHN); 95,6 (COCBr=CHN);
52.6 (szennyezés); 52,5 (OCH3); 49,7 (szennyezés); 48,8 (NCH2COOMe); 43,0 (szennyezés); 36,0 (dimetil-formamid).
UV (metanol; maxnm); 226; 278.
IR (KBr; cm-i; 3158s ( NH); 1743vs(_C = O, COOMe); 1701vs (_C = O, CONH); 1438vs (szigma-CH, CH3O); 1223vs (_C-O, COOMe); 864m (szigma-CH, Br=C-H).
FAB-MS m/z (hozzárendelés): 265/263 (M+H).
110. példa (5-Bróm-uracil)-ecetsav ml vizet adunk a 109. példából származó olaj formájú nyerstermékhez, majd az elegyet 60 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxid hozzáadásával feloldjuk. 10 percig kevertetjük 0 °C-on, majd 45 ml 4 mol/1 sósavat adunk hozzá (pH=2 lesz), majd a címben szereplő vegyület kicsapódik. 50 perc múlva a szilárd maradékot szűréssel izoláljuk, egyszer mossuk hideg vízzel, majd szárítószeren csökkentett nyomáson szárítjuk. Kitermelés: 2,46 g (38%). Olvadáspont 250-251 °C.
Elemanalízis C6H5BrN2O4 képletre: mért (számított)
C: 28,78 (28,94); H: 2,00 (2,02); Br:
32,18 (32,09); N: 11,29(11,25).
Ή-NMR (DMSO-dg, 250 MHz) δ: 12,55 (IH, s,
CQQH); 11,97 (IH, s, NH); 8,30 (IH, s, C=C-H);
4,49 (2H, s, NCHjCOOH).
«C-NMR (DMSO-dg, 250 MHz) δ; 169,4 (COOH);
159.8 (NHCOCBr=CH); 150,04 (NCON);
145.8 (COCBr=CHN); 94,6 (COCBr=CHN);
48.8 (NCH2COOH).
UV (metanol; max nm); 226; 278.
IR (KBr; cm-»); 3187s (_NH); 1708vs (_C=O,
COOH); 1687vs; 1654VS LC=O, CONH); 1192s (_C=O, COOH); 842 m (szigma-CH,
Br-C=C-H).
FAB-MS m/z (hozzárendelés, relatív intenzitás);
251/249 (M+H,5).
111. példa
N-(Boc-amino-etil)-N-(5-bróm-uracil)-metilénkarbamoil-glicin-etil-észter
1,80 g (7,30 mmol) Boc-amino-etil-glicin-etilésztert oldunk 10 ml dimetil-formamidban. 1,31 g (8,03 mmol) Dhbt-OH-t adunk hozzá, ennek következtében csapadék képződik. 2 χ 10 ml dimetil-formamidot adunk hozzá, addig, ameddig a csapadék feloldódik. A 110. példában készült terméket (2,00 g; 8,03 mmol) lassan adjuk hozzá, hogy elkerüljük a csapadékképződést. 30 ml diklór-metánt adunk hozzá, majd az elegyet 0 °C-ra hűtjük és megszüljük. A csapadékot (DCU) kétszer mossuk diklór-metánnal. Az egyesített szürlethez 100 ml diklór-metánt adunk. Az elegyet félig telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal (100 ml, víz:telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldat 1:1 térfogat/térfogat), majd híg kálium-hidrogén-szulfát-oldattal (2x100 ml, víz: telített kálium-hidrogén-szulfát-oldat 4:1 térfogat/térfogat), majd végezetül telített nátriumklorid-oldattal mossuk (1x100 ml). A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, megszüljük, majd csökkentett nyomáson (körülbelül 2000 Pa, majd 133,3 Pa) szárazra pároljuk. A maradékot 35 ml diklór-metánban szuszpendáljuk, 45 percig szobahőmérsékleten kevertetjük, majd megszűrjük (a csapadék a DCU). Cseppenként 2 térfogat petrolétert adunk a szürlethez 0 °C-on, erre olajos anyag csapódik ki. A felülúszót dekantáljuk, majd a megmaradó olajat 20-50 ml diklór-metánban oldjuk. A kicsapást 2 térfogat petroléterrel végezzük. Ezt az eljárást ötször megismételjük, ameddig a szennyezést eltávolítjuk. A szennyezés vékonyréteg50
HU 221 003 Bl kromatográfiával látható, kifejlesztésre 10%-os metanol/diklór-metán elegyet használunk. A keletkező olajat 25 ml diklór-metánban oldjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, erre a címben szereplő vegyület megszilárdul. Kitermelés: 2,03 g (58%). Olvadáspont 87-90 °C.
Elemanalízis C17H25BrN4O7 képletre: mért (számított) C: 42,33 (42,78); H: 5,15 (5,28); Br: 17,20 (16,74); N: 11,69(11,74).
•H-NMR (DMSO-d6,250 MHz, J értéke Hz-ben megadva) δ: 11,93 & 11,92 (IH, s, C=ONHC=O); 8,09 & 8,07 (IH, s, C=C-H); 7,00 & 6,80 (IH, t, b, BocNAT); 4,80 & 4,62 (2H, s, NCH2CON); 4,35 & 4,24 (2H, s, NC//2COOEt); 4,27-4,15 (2H, m-ek, COOCtf2CH3O); 3,47-3,43 (2H, m-ek, BocNHCH2Ctf2N); 3,28-3,25 & 3,12-3,09 (2H, m-ek, BocNHC7/2CH2N); 1,46 & 1,45 (9H, s, ‘Bu); 1,26 & 1,32 (3H, t, J=7,l, COOCH2C//,).
•3-NMR (DMSO-d6, 250 MHz) δ: 169,3 & 169,0 (‘BuOC=O); 167,4 & 167,1 (COOEt);
159,8 (C=C-CON); 155,9 (NCH2CON);
150,4 (NCON); 145,9 (COCBr-CHN);
94,5 (COCBr=CHN); 78,2 (Me3Q; 61,3 &
60,7 (COCH2CH3); 49,1 & 48,0 (NCH2COOH); 48,0 & 47,0 (NCH2CON); 38,6 (BocNHCH2CH2N);
38,2 (BocNHCH2CH2N); 26,3 (C(CH3)3);
14,1 (COCH2CCH3).
UV (metanol, „, ΝΜ): 226; 280.
IR (KBr, cm-*>: 3200 ms, széles (_NH); 168vs, nagyon széles (_CO, COOH, CONH); 1250s (_C-O, COOEt); 1170s (_C-O, COO‘Bu); 959m (szigmaCH, Br-C=C-H).
FAB-módszer m/z (hozzárendelés, relatív intenzitás): 479/477 (M+H, 5); 423/421 (M+2H-‘Bu, 8); 379/377 (M+2H-Boc, 100); 233/231 (M-gerinc, 20).
112. példa
N-jBoc-amino-etilj-N-jS-bröm-uracil-l'P-metilénkarbonoil)-glicin
A 111. példából származó terméket (1,96 g;
4,11 mmol) 30 ml metanolban oldjuk melegítés közben, majd 0 °C-ra hűtjük. 30 ml 2 mol/1 nátriumhidroxidot adunk hozzá, majd a reakcióelegyet 30 percig kevertetjük. 70 ml 1 mol/1 sósavat adunk hozzá (pH=2,0 lesz). A vizes fázist 3x65 ml+7x40 ml etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített etil-acetátos extraktumokat 500 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk. Az etil-acetátos fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Kitermelés: 1,77 g (96%). Olvadáspont 92-97 °C. Elemanalízis C15H21BrN4O7 képletre: mért (számított)
C: 40,79 (40,10); H: 5,15 (4,71); Br:
14,64 (17,70); N: 11,35(12,47).
•H-NMR (DMSO-dg, 250 MHz, J értéke Hz-ben megadva) δ: 12,83 (IH, s, COOH); 11,93 & 11,91 (IH, s, C=ONA/C=O); 8,10 & 8,07 (IH, s, C=C-H); 7,00 & 6,81 (IH, t, b, BocN//); 4,79 & 4,61 (2H, s, NCH2CON); 4,37 & 4,25 (2H, s, NCH2COOH); 3,46-3,39 (2H, m-ek, BocNHCH2CH2N);
3,26-3,23 & 3,12-3,09 (2H, m-ek,
BocNHCH2CH2N); 1,46 (9H, s, tBu).
••C-NMR (DMSO-d6, 250 MHz) δ:
170.4 (’BuOC=O); 166,9 (COOH);
159,7 (C=C-CON); 155,8 (NC2CON);
150.4 (NCON); 145,9 (COCBr=CHN);
94.4 (COCBr=CHN); 78,1 (Me3C); 49,1 &
48,0 (NCH2COOH); 47,7 & 47,8 (NCH2CON);
38,6 (BocNHC2CH2N); 38,1 (Boc(NCH2CH2N);
28,2 [C(CH3)3],
UV (metanol; nm); 226; 278.
IR (KBr, cm-·)1 3194ms, széles 9_NH); 1686vs, nagyon széles (_C=O COOH, CONH); 1250s (_C-O, COOH); 1170s (_C-O, COOtBu); 863m (szigma-CH, Br-C=C=H).
FAB-MS m/z (hozzárendelés, relatív intenzitás): 449/451 (M+H, 70); 349/351 (M+2H-Boc, 100); 231/233 (M-gerinc, 20).
113. példa
Uracil-N1-metil-acetát
10,0 g (89,2 mmol) uracilt és 24,7 g (178 mmol) kálium-karbonátot szuszpendálunk 250 ml dimetilformamidban. 8,45 ml (89,2 mmol) metil-brómacetátot adunk hozzá 5 perc alatt. A szuszpenziót éjszakán át kevertetjük nitrogénatmoszférában szobahőmérsékleten, majd megszűrjük. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal megállapítható, hogy az uracil konverziója nem teljes. A szilárd maradékot kétszer mossuk dimetil-formamiddal, majd az egyesített szűrleteket csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A csapadékot 60 ml vízben szuszpendáljuk és 2,4 ml 4 mol/1 sósavat adunk hozzá (pH=2). A szuszpenziót 30 percig 0 °Con kevertetjük, majd megszűrjük. A kicsapódott címben szereplő vegyületet vízzel mossuk, majd szárítószeren csökkentett nyomáson szárítjuk.
Kitermelés: 9,91 g (60%). Olvadáspont 182-183 °C. Elemanalízis C6HgN2O4 képletre: mért (számított)
C: 45,38 (45,66); H: 4,29 (4,38); N: 15,00 (15,21) •H-NMR (DMSO-d6, 250 MHz, J értéke Hz-ben) δ:
1,47 (IH, s, NH); 7,68 (IH, d, JH-c=c-h=7,9,
CH=C//N); 5,69 (IH, d, JH-c=c-h=7,9, Ctf=CN);
4,59 (2H, s, NC/fjCOOMe); 3,76 (3H, s,
COOCHj).
••C-NMR (DMSO-dö, 250 MHz) δ; 168,8 (COOMe);
164,0 (C=C-CON); 151,1 (NCON);
146,1 (COCH=CHN); 101,3 (COCH-CHN);
52.5 (COOCH3); 48,7 (NCH2COOMe).
UV (metanol; maxnm): 226; 261.
IR (KBr; cm-·); 3164s (_NH); 1748vs (_C=O),
COOMe); 1733vs (_C=O, CONH); 1450vs (szigma-CH, CH3O); 1243vs (_C-O, COOMe);
701m (szigma-CH, H-C=C=H).
FAB-MS m/z (hozzárendelés); 185 (M+H).
114. példa
Uracil-ecetsav
A 113. példában keletkező termékhez (8,76 g;
47,5 mmol) 90 ml vizet adunk, majd 40 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidot. A reakcióelegyet 40 percig melegít51
HU 221 003 BI jük, ezalatt az összes metil-észter elreagál. 15 percig 0 °C-on kevertetjük, majd 25 ml 4 mol/1 sósavat adunk hozzá (pH=2). A címben szereplő vegyületet kicsapjuk, majd a keveréket 2-3 óra múlva megszűrjük. A csapadékot még egyszer mossuk az anyalúggal, majd kétszer mossuk hideg vízzel, végül csökkentett nyomáson szárítószeren szárítjuk. Kitermelés: 6,66 g (82%). Olvadáspont 288-289 °C.
Elemanalízis C6H6N2O4 képletre: mért (számított):
C: 42,10 (42,36); H: 3,43 (3,55); N: 16,25(16,47).
•H-NMR (DMSO-d^ 250 MHz, J értéke Hz-ben) δ: 13,19 (IH, s, COOH); 11,41 (IH, s, YiH); 7,69 (IH, d, Jh-c=c-h=7,8, Jh-c-c-n-h=2,0, COC7/=CHN); 4,49 (2H, s, NCT/jCOOH).
•3C-NMR (DMSO-dé, 250 MHz) δ: 169,9 /COOH);
163,9 (CH=CHCON); 151,1 (NCON);
146,1 (COCH = CHN); 100,9 (COCH=CHN);
48,7 (NC7/2COOH).
UV (metanol; maxnm): 246; 263.
IR (KBr; cm-·): 3122 (_NH); 1703vs (_C=O, COOH); 1698vs, 1692vs (C=O, CONH); 1205s (_C-O, COOH); 676 (szigma-CH, H-C=C-H).
FAB-MS (hozzárendelés): 171 (M+H).
115. példa
N-fBocamino-etilj-N-juracil-N'-metilénkarbonoil)-glicin-etil-észter
2,0 g (8,12 mmol) (Bocamino-etil)-glicin-etilésztert oldunk 10 ml dimetil-formamidban. 2 χ 10 ml dimetil-formamidot adunk hozzá, ameddig az egész feloldódik. A 114. példában keletkező terméket (1,52 g; 8,93 mmol) lassan hozzáadjuk, a kicsapódás elkerülésére. 30 ml diklór-metánt adunk hozzá, majd a reakcióelegyet 0 °C-ra hűtjük, végül 2,01 g (9,74 mmol) DDC-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 1 óra hosszat 0 °C-on, majd 2 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük, végül megszűrjük. A kicsapódott DCU-t kétszer mossuk diklór-metánnal. Az egyesített szűrlethez 100 ml diklór-metánt adunk, majd az oldatot félig telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal (3x100 ml; víz:telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldat 1:1 térfogat/térfogat), majd híg kálium-hidrogén-szulfát-oldattal (2x100 ml, víz:telített kálium-hidrogén-szulfát-oldat 4:1 térfogat/térfogat), végül pedig telített nátriumklorid-oldattal (1x100 ml) mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, és csökkentett nyomáson (körülbelül 2000 Pa, utána körülbelül 133,3 Pa) szárazra pároljuk. A maradékot 32 ml diklórmetánban szuszpendáljuk, majd 35 percig szobahőmérsékleten, utána 30 percig 0 °C-on kevertetjük, végül megszűrjük. A csapadékot (DCU) diklór-metánnal mossuk. 2 térfogat petrolétert adunk az egyesített szűrlethez cseppenként 0 °C-on, ennek következtében olaj válik ki. A keveréket dekantáljuk, a megmaradt olajat 20 ml diklór-metánban oldjuk, majd ismét kicsapjuk 2 térfogat petroléter hozzáadásával. Ezt az eljárást ötször megismételjük, ameddig sikerül a szennyezést eltávolítani. A szennyezés vékonyréteg-kromatográfiával látható 10% metanol/diklór-metán kifejlesztő oldatot használva. A keletkező olajat 20 ml diklór-metánban oldjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, ennek hatására a címben szereplő vegyület megszilárdul. Kitermelés: 1,71 g (53%). Olvadáspont: 68,5-75 °C.
Elemanalízis C17H26N4O7 képletre: mért (számított):
C: 50,61 (51,25); H: 6,48 (6,58);N: 13,33 (14,06).
•H-NMR (DMSO-de, 250 MHz, J értéke Hz-ben) δ: 11,36 (IH, s, C=ONhC=O); 7,51 & 7,47 (IH, d, Jh-c=c-h=6,1; COCH=X-//), 7,00 & 6,80 (IH, t, b, BocN//); 5,83 & 5,66 (IH, d, JH-c=c-h=5,7, COC7/=CH); 4,78 & 4,60 (2H, s, NC//2CON); 4,37 & 4,12 (2H, s, NCtf2COOEt); 4,30-4,15 (2H, m-ek, COOC7/2CH3); 3,49-3,46 (2H, m-ek, BocNHCH2CH2N); 3,27, 3,23 & 3,11-3,09 (2H, m-ek, BocNHCH2CH2N); 1,46 (9H, s, ‘Bu); 1,39-1,23 (3H, m-ek, COOCH2Ctf,).
•3C-NMR (DMSO-d6, 250 MHz) δ: 169,4 & 169,0 (*BuoC=O); 167,6 & 167,3 /COOEt);
163.8 (CH=CHCON); 155,8 (NCH2CON); 151,0 (NCON); 146,3 (C)CH=CHN);
100.8 (COCH=CHN); 78,1 (Me3C); 61,2 &
60,6 (COOCH2CH3); 49,1 (NCH2COOEt); 47,8 & 47,0 (NCH2CON); 38,6 (BocNHCH2CH2N);
38.1 & 37,7 (BocNHCH2N); 28,2 [C/CH3)3];
14.1 (CO-OCH2CH3).
UV (metanol; maxnm): 226; 264. IR (KBr; cm·): 3053 ( NH); 1685vs, vbroad (_C=O, COOH, CONH); 1253s (_C-O, COOEt); 1172s (_C-O, COO‘Bu); 718w (szigma-CH, C-C-C-H).
FAB-módszer m/z (hozzárendelés, relatív intenzitás): 399 (M+H, 35); 343 (M+2H-'Bu, 100); 299 (M+2H—Boc, 100); 153 (M-gerinc, 30).
116. példa
N-(Bocamino-etil)-N-uracil-metilén-karbonoil)glicin
A 115. példa termékét (1,56 g; 3,91 mmol) oldjuk ml metanolban, majd 0 °C-ra hűtjük. 20 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidot adunk hozzá, majd a reakcióelegyet 0 °C-on 75 percig kevertetjük. 46 ml 1 mol/1 sósavat adunk hozzá (pH=2,0). A vizes fázist etil-acetáttal extraháljuk (3x50 ml+7x30 ml). Az egyesített etilacetát extraktumokat 360 ml telített nátrium-kloridoldattal mossuk. Az etil-acetátos fázist magnéziumszulfáton szárítjuk, szüljük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot metanolban oldjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Kitermelés: 0,55 g (38%). Olvadáspont 164-170 °C. Elemanalízis C15H22N4O7 képletre: mért (számított)
C: 46,48 (48,65); H: 6,03 (5,99);N: 14,61 (15,13).
•H-NMR (DMSO-d*, 250 MHz, J értéke Hz-ben) δ: 12,83 (IH, s, COOH); 11,36 (IH, s, C=ON/ÍC=O); 7,52-7,45 (IH, m-ek, COCH=C7ÍN) 7,00 & 6,82 (IH, t, b, BocN//); 5,67-5,62 (IH, m-ek, COC//=CHN); 4,76 & 4,58 (2H, s, NC2CON); 4,26 & 4,05 (2H, s, NC/ACOOH); 3,46-3,39 (2H, m-ek, BocNHCH2C//2N); 3,25-3,23 &
3,15-3,09 (2H, m-ek, BocNHC//2CH2N); 1,46 (H, s, ®u).
•3C-NMR (DMSO-d6, 250 MHz) δ:
170,5 (‘BuOC=O); 167,2 (COOH);
HU 221 003 Bl
163,9 (C = C-CON); 155,8 (NCH2CON);
151,1 (NCON); 146,4 (C)CH = CHN);
100.8 (COCH-CHN); 78,1 (Me3C); 49,1 &
47.8 (NCH2 COOH); 47,6 & 46,9 (NCH2CON);
38,6 (BocNHCH2CH2N); 38,1 & 37,6 (BocNHCH2CH2N); 28,2 [C/CH3)3],
UV (metanol; maxnm): 226; 264.
IR (KBr; cm-i): 3190 (_NH); 1685vs, vbroad (_C=O,
COOH, CONH); 1253s (_C-O, COOH); 1171s (_C-O, COO‘Bu); 682w (szigma-CH,
H-C=C-H).
FAB-módszer m/z (hozzárendelés, relatív intenzitás):
371 (M+H, 25); 271 (M+H-Boc, 100).
117. példa
H-U10-LysNH2
A címben szereplő vegyület szintézisét a „10. szintézisprotokoll” alapján végezzük. A szintézist körülbelül 100 mg Lys (ClZ)-MBHA-gyantával kezdjük. A nyerstermék (12 mg) elég tiszta a hibridizációs vizsgálatokhoz. Az 5’-(dA)10 és a H-U10 közötti hibrid Tm értéke
67,5 °C.
118. példa
A HjCacg]I<rLys-NH2 védőcsoportjainak eltávolítása és hasítása trifluor-metán-szulfonsawal (TFMSA). A védőcsoport eltávolítására és hasítására egy másik módszer a hidrogén-fluoridos (HF) kezelés.
(a) Az oldallánc védőcsoportok eltávolítása „alacsony savasságü ” TFMSA-TFA-DMS-eljárással Körülbelül 0,4 g nedves Boc-[Cacg]10-Lys(ClZ)MBHA-gyantát (valamelyik előző példa szerint előállítva) egy 5 ml-es szilárd fázisú reakcióedénybe tesszük. Az N-terminális Boc-csoportot az alábbi eljárással távolítjuk el:
(1) 50% TFA/diklór-metán, 2x1 perc és 1 χ 30 perc;
(2) 100 TFA, 2x1 perc és szárítás.
Abból a célból, hogy a benzilalapú oldallánc védőcsoportot eltávolítsuk, egy úgynevezett „alacsony savasságü” TFMSA-eljárást hajtunk végre az alábbiak szerint: egy A törzsoldatot készítünk, amely 5 ml TFADMS-m-krezolt (2:6:2, térfogat/térfogat/térfogat) tartalmaz, és egy B törzsoldatot készítünk, amely TFATFMSA 8:2 térfogat/térfogat elegy. Ezután a következő lépéseket hajtjuk végre:
(3) Az A törzsoldatból 1 ml-t hozzáadunk a PNAgyantához a reakcióedényben, 2 perces rázatás közben. Szárítás nincs.
(4) A B törzsoldatból (jeges vízfürdőbe hűtve) 1 ml-t adunk a reakcióelegyhez 200 μΐ-es részenként, 10 percenként, összesen 40 percig, majd a rázatást újabb 50 percig folytatjuk;
(5) szárítás és mosás 100%-os TF A-val, 5x1 perc, majd szárítás.
(b) Hasítás a gyantáról a „magas savasságü ”
TFMSA-TFA eljárással
Abból a célból, hogy az előzőkben leírt PNA-t lehasítsuk a gyantáról, egy úgynevezett „magas savasságü” TFMSA-eljárást hajtunk végre, az alábbiak szerint:
Egy C törzsoldatot készítünk, amely m-krezol-TFA 2:8 térfogat/térfogat elegye. Ezután az alábbi lépéseket hajtjuk végre:
(6) 1 ml C törzsoldatot adunk a védőcsoport nélküli
PNA-gyantához az SPPS edényben, 2 perces rázatás közben;
(7) 1 ml B törzsoldatot (jeges vízfürdőbe hűtve) adunk 200 μΐ-es részletekben 30 perc alatt a reakcióelegyhez, majd a rázatást további 150 percig folytatjuk;
(5) a reakcióedényben levő 2 ml oldatot „kirobbantjuk” a szűrőn keresztül 20 ml dietil-éteres oldatba, amelyet szárazjég/izopropanol keverékkel hűtünk. A kicsapási eljárás teljessé tétele érdekében 200 μΐ vízmentes piridint adunk cseppenként a sav-éter elegyhez;
(8) centrifugálás 3000/perc fordulatszámmal 5 percig;
(9) a felülúszót leöntjük, majd a csapadékot háromszor mossuk hideg dietil-éterrel, szárítjuk, vízben oldjuk, majd liofílezzük.
(c) Az N-[Caeg]I0-Lys-NH2 tisztítása és azonosítása
Egy analitikai HPLC kromatogram azt mutatja, hogy a nyerstermék nagyon tiszta, és profilja majdnem azonos azzal, amit a H-[Caeg]10-Lys-NH2 HF-es hasításával kapunk, azzal a különbséggel, hogy természetesen egy további csúcs jelenik meg, amely a piridin TMFSA só korai eluálásából származik a kromatogramban. A tisztítást és azonosítást a szokásos eljárással végezzük.
A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány előnyös megvalósítási módjaihoz képest számos változtatás és módosítás tehető, és ezek a változtatások és módosítások anélkül tehetők, hogy eközben eltérnénk a találmány szellemétől. Tehát szándékunk szerint a mellékelt igénypontok az összes ilyen ekvivalens variációra vonatkoznak, és a találmány igazi szellemébe és oltalmi körébe tartoznak.

Claims (22)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Vegyület, azzal jellemezve, hogy egy, számos különböző ligandumot hordozó poliamidgerincet tartalmaz, amely ligandumok egyenként az említett gerincben található aza-nitrogénekhez kötődnek, és az említett ligandumok közül legalább az egyik egy természetes nukleobázis, egy nem természetes nukleobázis, egy DNS-interkalátor vagy egy nukleobázist kötő csoport.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy az említett aza-nitrogénatomokat az említett gerincen 4-6 közbeeső atom választja el.
  3. 3. (IV) általános képletű vegyület, ahol n értéke legalább 2,
    L'-Ln jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, hidroxil-, 1-4 szénatomos alkanoilcsoport, természetes nukleobázis, nem természetes nukleobázis, aromás csoport, DNS-interkalátor, nukleobáziskötő csoport, heterociklusos csoport vagy riporterligandum, az H-L egységek közül legalább az egyik
    HU 221 003 BI egy természetes nukleobázis, egy nem természetes nukleobázis, egy DNS-interkalátor vagy egy nukleobázist kötő csoport;
    A1-An jelentése egyszeres kötés, metiléncsoport vagy (V) vagy (VI) általános képletű csoport, amelyben X jelentése O, S, Se, NR3, CH2 vagy C(CH3)2 képletű csoport;
    Y jelentése egyszeres kötés, O, S vagy NR4 képletű csoport;
    p és q értéke nulla vagy 1 és 5 közötti egész szám, p és q értékének összege legfeljebb 10;
    r és s értéke nulla, vagy 1 és 5 közötti egész szám, s és r értékének összege legfeljebb 10;
    R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tio-csoporttal lehet helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport, aminocsoport vagy halogénatom, és
    R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tio-csoporttal lehet helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport vagy aminocsoport;
    B'-B jelentése N vagy R3N képletű csoport, ahol R3 jelentése a fentiekben meghatározott;
    Cl -C jelentése CR«R7, CHR«CHR7 vagy CRNUCH,, ahol R6 jelentése hidrogénatom és R7 természetes alfa-aminosavak oldallánca, illetve R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 2-6 szénatomos alkil-, aril-, aralkil-, heteroaril-, hidroxil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-tiovagy N3R4- és SR5 képletű csoport, ahol R3 és R4 jelentése a fentiekben meghatározott, R5 jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tio-csoporttal lehet helyettesítve, illetve R6 és R7 együttesen egy aliciklusos vagy heterociklusos rendszert képeznek;
    Di-D” jelentése CR6R7, CH2CR6R7 vagy CHR6CHR7 képletű csoport, ahol R6 és R7 jelentése a fenti;
    Gi-G-i jelentése -NR3CO-, -NR3CS-, NR3SOvagy -NR3SO2-Y képletű csoport bármelyik orientációban, ahol R3 jelentése a fenti;
    Q jelentése -CO2H, -CONR’R”, -SO3H vagy -SO2NR’R” képletű csoport vagy a -CO2H vagy -SO3H képletű csoportok valamely aktivált származéka; és
    I jelentése -NHR”’R”” vagy -NR”’C(O)R”” képletű csoport, ahol R’, R”, R’” és R”” jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, amino-védőcsoport, riporterligandum, interkalátor, kelátképző, peptid, fehéije, szénhidrát, lipid, szteroid, oligonukleotid vagy oldható vagy oldhatatlan polimer.
  4. 4. (VII) általános képletű vegyület, ahol
    L jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, fenilcsoport, heterociklusos csoport, természetben előforduló nukleobázis vagy a természetben elő nem forduló nukleobázis;
    R7’ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, a természetben előforduló alfa-aminosavak oldallánca;
    n értéke 1 és 60 közötti egész szám;
    k és m értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1,
    1 értéke 1 és 5 közötti egész szám;
    Rh jelentése OH, NH2 vagy -NHLysNH2 képletű csoport és
    R> jelentése hidrogénatom vagy COCH3 képletű csoport.
  5. 5. (XIV) általános képletű vegyület, ahol
    L jelentése egymástól függetlenül timin, adenin, citozin, guanin vagy uracil nukleobázis;
    R7’ jelentése hidrogénatom; és n jelentése 1 és 30 közötti egész szám.
  6. 6. (VIII), (IX) vagy (X) általános képletű vegyület, ahol
    L jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, hidroxil-, 1-4 szénatomos alkanoilcsoport, természetes nukleobázis, nem természetes nukleobázis, aromás egység, DNS-interkalátor, nukleobáziskötó csoport, heterociklusos csoport vagy riporterligandum,
    L* -L csoportok közül legalább az egyik egy természetes nukleobázis, egy nem természetes nukleobázis, egy DNS-interkalátor vagy egy nukleobázist kötő csoport;
    A jelentése egyszeres kötés vagy (V) vagy (VI) általános képletű csoport, amelyben X jelentése O, S, Se, NR3, CH2 vagy C(CH3)2 képletű csoport;
    Y jelentése egyszeres kötés, O, S vagy NR4 képletű csoport;
    p és q értéke nulla vagy 1 és 5 közötti egész szám, p és q értékének összege legfeljebb 10;
    r és s értéke nulla vagy 1 és 5 közötti egész szám, s és r értékének összege legfeljebb 10;
    Rí és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tiocsoporttal lehet helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport, aminocsoport vagy halogénatom, és
    R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tiocsoporttal lehet helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport vagy aminocsoport;
    B jelentése N vagy R3N+ képletű csoport, ahol R3 jelentése a fentiekben meghatározott;
    C jelentése CR6R7, CHR6CHR7 vagy CR6R7CH2 képletű csoport, ahol R6 jelentése hidrogénatom és R7 jelentése természetes alfa-aminosavak oldallánca, illetve R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 2-6 szénatomos alkil-, aril-, aralkil-, heteroaril-, hidroxil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-tio- vagy N3R4- vagy SR5 képletű csoport, ahol R3 és R4 jelentése a fentiekben meghatározott, R5 jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tio-csoporttal lehet he54
    HU 221 003 Bl lyettesítve, illetve R6 és R7 együttesen egy aliciklusos vagy heterociklusos rendszert képeznek;
    D jelentése CR6R7, CH2CR«R7 vagy CHR6CHR7 csoport, amelyekben R6 és R7 jelentése a fenti;
    E jelentése COOH, CSOH, SOOH, SO2OH képletű csoport vagy ezek aktivált vagy védett származéka; és
    F jelentése NHR3 vagy NPgR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése a fenti, Pg jelentése amino-védőcsoport.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti vegyületek körébe tartozó (XV) általános képletű vegyület, ahol
    L jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, fenilcsoport, heterociklusos csoport, egy a természetben előforduló nukleobázis vagy egy a természetben elő nem forduló nukleobázis;
    R7’ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy a természetben előforduló alfa-aminosavak oldallánca; és k, 1 és m értéke egymástól függetlenül nulla, illetve 1 és 5 közötti egész szám.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti vegyületek körébe tartozó (XVI) általános képletű vegyület, ahol
    L jelentése timin, adenin, citozin, guanin, uracil, 5metil-citozin, 6-tio-guanin vagy 5-bróm-uracil vagy ezek származéka;
    R7’ jelentése hidrogénatom;
    E jelentése COOH vagy annak aktivált vagy védett származéka; és
    F jelentése NH2 vagy NHPg képletű csoport, ahol Pg jelentése egy amino-védőcsoport.
  9. 9. A 4. igénypont szerinti olyan (VII) általános képletű vegyület, ahol
    L jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, fenilcsoport, heterociklusos csoport, egy a természetben előforduló nukleobázis vagy egy a természetben elő nem forduló nukleobázis;
    R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy egy a természetben előforduló alfa-aminosavak oldallánca;
    n értéke 1 és 60 közötti egész szám;
    k, 1 és m értéke egymástól függetlenül nulla, illetve 1 és 5 közötti egész szám;
    Rh jelentése OH, NH2 vagy -NHLysNH2 képletű csoport; és
    R' jelentése hidrogénatom vagy COCH3 képletű csoport.
  10. 10. Eljárás az 1. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy (A) egy polimerszubsztrátot készítünk, amely olyan funkciós csoportot tartalmaz, amely képes rögzítőkötést létrehozni egy aminosavval;
    (B) az említett polimert az említett rögzítőkötésen keresztül egy (VIII) általános képletű első aminosavval kapcsoljuk, ahol
    L jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, hidroxil-, 1-4 szénatomos alkanoilcsoport, természetes nukleobázis, nem természetes nukleobázis, aromás egység, DNS-interkalátor, nukleobáziskötő csoport, heterociklusos csoport vagy riporterligandum,
    L1 -Ln csoportok közül legalább az egyik egy természetes nukleobázis, egy nem természetes nukleobázis, egy DNS-interkalátor vagy egy nukleobázist kötő csoport;
    A jelentése egyszeres kötés vagy (V) vagy (VI) általános képletű csoport, amelyben X jelentése O, S, Se, NR3, CH2 vagy C(CH3)2 képletű csoport;
    Y jelentése egyszeres kötés, O, S vagy NR4 képletű csoport;
    p és q értéke nulla vagy 1 és 5 közötti egész szám, p és q értékének összege legfeljebb 10;
    r és s értéke nulla vagy 1 és 5 közötti egész szám, s és r értékének összege legfeljebb 10;
    R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tiocsoporttal lehet helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport, aminocsoport vagy halogénatom, és
    R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tiocsoporttal lehet helyettesítve, hidroxilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport vagy aminocsoport;
    B jelentése N vagy R3N+ képletű csoport, ahol R3 jelentése a fentiekben meghatározott;
    C jelentése CR6R7, CHR6CHR7 vagy CRbR7CH2 képletű csoport, ahol R6 jelentése hidrogénatom és R7 jelentése természetes alfa-aminosavak oldallánca, illetve R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 2—6 szénatomos alkil-, aril-, aralkil-, heteroaril-, hidroxil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-tio- vagy N3R4- vagy SR5 képletű csoport, ahol R3 és R4 jelentése a fentiekben meghatározott, R5 jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben hidroxil-, alkoxi- vagy alkil-tio-csoporttal lehet helyettesítve, illetve R6 és R7 együttesen egy aliciklusos vagy heterociklusos rendszert képeznek;
    D jelentése CR6R7, CH2CR6R7 vagy CHR6CHR7 csoport, amelyekben R6 és R7 jelentése a fenti;
    E jelentése COOH, CSOH, SOOH, SO2OH képletű csoport vagy ezek aktivált vagy védett származéka; és
    F jelentése NHR3 vagy NPgR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése a fenti, Pg jelentése amino-védőcsoport;
    (C) az említett amino-védőcsoportot eltávolítjuk a kapcsolt első aminosavról; és (D) a kapott szabad aminocsoportot egy második (VIII) általános képletű aminosavval reagáltatjuk.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket is tartalmazza még:
    (E) az említett amino védőcsoportot eltávolítjuk az említett második aminosavról, és (F) a kapott szabad aminocsoportot az említett peptidláncon egy további (VIII) általános képletű aminosavval reagáltatjuk a peptidlánc meghosszabbítására.
    HU 221 003 Bl
  12. 12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (E) és (F) lépéseket a kívánt hosszúságú peptidlánc eléréséig ismételjük.
  13. 13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a peptidláncon maradó aminosavegységeken megmaradó védőcsoportok közül legalább egyet eltávolítunk.
  14. 14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rögzítőkötést a peptidlánc lebontása nélkül bontjuk le.
  15. 15. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polisztirolt, poli(akril-amid)-ot, szilikátot, egy kompozit anyagot, gyapotot vagy ezek származékát tartalmazó polimerszubsztrátot alkalmazunk.
  16. 16. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett rögzítőkapcsolat létrehozására képes kémiai csoportként klór-, bróm- vagy jódatommal helyettesített alkil-, aminocsoporttal helyettesített alkil-, amino- és arilcsoporttal helyettesített alkil-, amino- és alkil-aril-csoporttal helyettesített alkil-, hidroxilcsoporttal helyettesített alkilcsoportot vagy ezek olyan származékát alkalmazzuk, amely olyan spacer csoportot tartalmaz, amely az említett polipeptid lebontása nélkül lehasítható.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy klóratommal helyettesített alkilcsoportként klór-metil-csoportot, aminocsoporttal helyettesített alkilcsoportként amino-metil-csoportot, amino- és alkilcsoporttal helyettesített arilcsoport a-aminobenzil-csoportot, amino- és alkil-aril-csoporttal helyettesített alkilcsoportként a-amino-3- vagy a-amino-4metil-benzil-csoportot, hidroxilcsoporttal helyettesített alkilcsoportként hidroxi-metil-csoportot alkalmazunk.
  18. 18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kémiai csoportként egy aminocsoportot tartalmazó csoportot alkalmazunk, amely lehet aminocsoporttal helyettesített alkil-, amino- és arilcsoporttal helyettesített alkilcsoport vagy amino- és alkil-aril-csoporttal helyettesített alkilcsoport; és a kémiai csoport egy spacer csoportot tartalmaz, amely lehet 4-(halogén-alkil)-aril-(rövid szénláncú alkánsav), Boc-amino-acil-4-(oxi-metil)-aril-(rövid szénláncú alkánsav), N-Boc-p-acil-benzhidril-amin, N-Boc-4’-(rövid szénláncú alkil)-p-acil-benzhidril-amin, N-Boc-4’(rövid szénláncú alkoxi)-p-acil-benzhidril-amin, és 4hidroxi-metil-fenoxi-(rövid szénláncú alkánsav).
  19. 19. Eljárás egy kétszálú polinukleotidszekvencia specifikus felismerésére, azzal jellemezve, hogy a polinukleotidszekvenciát egy, az 1. igénypont szerinti vegyülettel hozzuk érintkezésbe.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a 4. igénypont szerinti vegyületet alkalmazunk.
  21. 21. Eljárás sejtek vagy vírusok elpusztítására, azzal jellemezve, hogy az említett sejteket vagy vírust egy, az 1. igénypont szerinti vegyülettel hozzuk érintkezésbe, amely specifikusan kötődik az említett sejtek vagy vírus genomjának egy részéhez.
  22. 22. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti vegyületet tartalmaz, legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozó-, kötőanyag, sűrítő-, hígító-, konzerválószer és/vagy puffer felületaktív anyag mellett.
HU9303023A 1991-05-24 1992-05-22 Peptid-nukleinsavak HU221003B1 (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK98791A DK98791D0 (da) 1991-05-24 1991-05-24 Fremgangsmaade til sekvensspecifik genkendelse af et dobbeltstrenget polynucleotid
DK98691A DK98691D0 (da) 1991-05-24 1991-05-24 Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
DK92510A DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
PCT/EP1992/001219 WO1992020702A1 (en) 1991-05-24 1992-05-22 Peptide nucleic acids

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9303023D0 HU9303023D0 (en) 1994-01-28
HUT66597A HUT66597A (en) 1994-12-28
HU221003B1 true HU221003B1 (hu) 2002-07-29

Family

ID=27220741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303023A HU221003B1 (hu) 1991-05-24 1992-05-22 Peptid-nukleinsavak

Country Status (16)

Country Link
US (11) US6395474B1 (hu)
EP (5) EP1411063B1 (hu)
JP (6) JP2758988B2 (hu)
KR (1) KR0133131B1 (hu)
AT (3) ATE515569T1 (hu)
AU (2) AU666480B2 (hu)
BR (1) BR9206049A (hu)
CA (2) CA2109805A1 (hu)
DE (2) DE69232055T2 (hu)
DK (3) DK51092D0 (hu)
ES (2) ES2107552T3 (hu)
FI (1) FI118424B (hu)
GR (1) GR3025018T3 (hu)
HU (1) HU221003B1 (hu)
NO (2) NO312516B1 (hu)
WO (2) WO1992020702A1 (hu)

Families Citing this family (359)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5852182A (en) * 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Thiol-derivatized oligonucleosides
US5783682A (en) * 1990-07-27 1998-07-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mimics having nitrogen-containing linkages
US6713602B1 (en) 1991-05-24 2004-03-30 Ole Buchardt Synthetic procedures for peptide nucleic acids
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5766855A (en) * 1991-05-24 1998-06-16 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
US6441130B1 (en) 1991-05-24 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linked peptide nucleic acids
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US6451968B1 (en) 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5641625A (en) * 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
US5714331A (en) * 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6414112B1 (en) 1991-05-24 2002-07-02 Ole Buchardt Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
WO1993012135A1 (en) 1991-12-12 1993-06-24 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
MX9207334A (es) * 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
US5700922A (en) * 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
EP1695979B1 (en) * 1991-12-24 2011-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped modified oligonucleotides
US6033884A (en) * 1992-03-20 2000-03-07 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporter systems and methods of use
US6770738B1 (en) 1992-05-22 2004-08-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Higher order structure and binding of peptide nucleic acids
GB9211979D0 (en) * 1992-06-05 1992-07-15 Buchard Ole Uses of nucleic acid analogues
US6350853B1 (en) 1993-04-26 2002-02-26 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
US7825215B1 (en) * 1993-04-26 2010-11-02 Peter E. Nielsen Substituted nucleic acid mimics
GB9311386D0 (en) * 1993-06-02 1993-07-21 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogue assay procedures
AU7206794A (en) * 1993-06-11 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating ras oncogene
WO1995004748A1 (en) * 1993-08-09 1995-02-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating viral processes
US5527675A (en) * 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331012A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
DE4331011A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit C-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
US20020068275A1 (en) * 1993-09-21 2002-06-06 Michael A. Reeve Methods of using a chimeric nucleic acid/nucleic acid analogue molecule
US6710164B1 (en) * 1993-11-22 2004-03-23 Peter E. Nielsen Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
GB2284208A (en) * 1993-11-25 1995-05-31 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogues with a chelating functionality for metal ions
GB2284209A (en) 1993-11-25 1995-05-31 Ole Buchardt Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template
GB2289677A (en) * 1993-12-06 1995-11-29 Pna Diagnostics As Labelling of nucleic acid analogue-peptide chimerae
GB2285445A (en) * 1993-12-06 1995-07-12 Pna Diagnostics As Protecting nucleic acids and methods of analysis
WO1995017403A1 (en) * 1993-12-22 1995-06-29 Perseptive Biosystems, Inc. Guanine synthons for peptide nucleic acid synthesis and method for production
US6133444A (en) * 1993-12-22 2000-10-17 Perseptive Biosystems, Inc. Synthons for the synthesis and deprotection of peptide nucleic acids under mild conditions
DK145493D0 (da) * 1993-12-23 1993-12-23 Dako As Antistof
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
DE4408533A1 (de) 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag PNA-Synthese unter Verwendung einer basenlabilen Amino-Schutzgruppe
DE4408528A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Peptid-Oligonucleotid-Derivate, deren Herstellung und Verwendung
DE4408534A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Substituierte N-Ethyl-Glycinderivate zur Herstellung von PNA und PNA-/DNA-Hybriden
US6919441B2 (en) 1994-03-14 2005-07-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Polyamide-oligonucleotide derivatives, their preparation and use
DE4408531A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag PNA-Synthese unter Verwendung einer gegen schwache Säuren labilen Amino-Schutzgruppe
WO1995029921A1 (en) * 1994-04-29 1995-11-09 Perseptive Biosystems, Inc. Activated esters of 1-phenylpyrazolin-5-one for labelling amine-functionalized molecules
US6169169B1 (en) 1994-05-19 2001-01-02 Dako A/S PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
US5629152A (en) * 1994-08-01 1997-05-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted β-lactams and oligo β-lactamamides
DE4427980A1 (de) * 1994-08-08 1996-02-15 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere für Therapie und Diagnostik
US6558633B1 (en) 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
ES2181799T3 (es) * 1994-10-06 2003-03-01 Isis Pharmaceuticals Inc Conjugados de acidos peptido nucleicos.
US5629178A (en) * 1994-10-28 1997-05-13 Genetics & Ivf Institute Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA)
UA48150C2 (uk) * 1994-11-02 2002-08-15 Ай-Сі-Ен Фармасьютикалз Похідні амінокислот або аміноспиртів, олігонуклеотид
CA2203565A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Ronald N. Zuckermann Synthesis of peptide nucleic acids (pnas) and analogues via submonomer approach
WO1996019587A2 (en) * 1994-12-22 1996-06-27 Abbott Laboratories Methods of immobilizing oligonucleotides to solid support materials and methods of using support bound oligonucleotides
US6475721B2 (en) 1995-03-04 2002-11-05 Boston Probes, Inc. Sequence specific detection of nucleic acids using a solid carrier bound with nucleic acid analog probes
ATE201453T1 (de) * 1995-03-04 2001-06-15 Pna Diagnostics As Modulation von bindungseigenschaften der nukleinsäure bindungspartner
US6465650B1 (en) 1995-03-13 2002-10-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Substituted N-ethylglycine derivatives for preparing PNA and PNA/DNA hybrids
EP0840741B1 (en) 1995-06-07 2004-04-28 Perseptive Biosystems, Inc. Pna-dna chimeras and pna synthons for their preparation
US6251939B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Promega Biosciences, Inc. Carbamate-based cationic lipids
JPH11511642A (ja) * 1995-06-22 1999-10-12 ダコ アクティーゼルスカブ Ｐｎａ／核酸複合体に結合し得る組換え抗体
WO1996014341A1 (en) * 1995-06-22 1996-05-17 Dako A/S Monoclonal antibody capable of binding to pna/nucleic acid complexes
GB9519299D0 (en) * 1995-09-21 1995-11-22 Farrar Gwyneth J Genetic strategy
US20020012902A1 (en) * 1995-10-06 2002-01-31 Martin Fuchs Methods and kit for hybridization analysis using peptide nucleic acid probes
EP1477572A3 (en) * 1995-10-06 2006-02-15 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and kit for hybridization analysis using peptide nucleic acid probes
ATE362546T1 (de) 1995-10-12 2007-06-15 Lansdorp Peter M Verfahren zum nachweis von mehrfachkopien einer wiederholungssequenz in einem nukleinsäuremolekül
US6001966A (en) * 1995-10-19 1999-12-14 Proligo Llc Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
US5874532A (en) 1997-01-08 1999-02-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
WO1997014793A1 (en) * 1995-10-20 1997-04-24 Trustees Of Boston University Nucleic acid clamps
EP0862650B1 (en) * 1995-11-16 2007-08-01 Dako Denmark A/S In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples
US5888733A (en) * 1995-11-16 1999-03-30 Dako A/S In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples
CA2190430A1 (en) * 1995-12-12 1997-06-13 Margret Barbara Basinski Method for measuring genetic messages
US6180767B1 (en) 1996-01-11 2001-01-30 Thomas Jefferson University Peptide nucleic acid conjugates
US20030069195A1 (en) * 1996-03-01 2003-04-10 Farrar Gwenyth Jane Suppression of polymorphic alleles
US6020126A (en) * 1996-03-21 2000-02-01 Hsc, Reasearch And Development Limited Partnership Rapid genetic screening method
EP0932698A1 (en) * 1996-03-26 1999-08-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide treatments and compositions for human melanoma
GB9606961D0 (en) 1996-04-02 1996-06-05 Farrar Gwyneth J Genetic strategy III
US8551970B2 (en) * 1996-04-02 2013-10-08 Optigen Patents Limited Genetic suppression and replacement
US20040234999A1 (en) * 1996-04-02 2004-11-25 Farrar Gwenyth Jane Genetic suppression and replacement
GB9608803D0 (en) * 1996-04-27 1996-07-03 Univ Newcastle Mitochondrial dna defects
SE506700C2 (sv) * 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040171030A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Oligomeric compounds having modified bases for binding to cytosine and uracil or thymine and their use in gene modulation
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050032068A1 (en) * 2002-11-05 2005-02-10 Prakash Thazha P. Sugar and backbone-surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050118605A9 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Baker Brenda F. Oligomeric compounds having modified bases for binding to adenine and guanine and their use in gene modulation
EP0960121B1 (en) * 1996-07-24 2005-11-30 BUCHARDT, Dorte Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5858683A (en) * 1996-08-30 1999-01-12 Matritech, Inc. Methods and compositions for the detection of cervical cancer
DE19637339A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Hoechst Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren
US5919638A (en) * 1996-10-08 1999-07-06 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting prostate tumors
US5908845A (en) * 1996-10-30 1999-06-01 Segev; David Polyether nucleic acids
US20050202499A1 (en) 1996-10-31 2005-09-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6444202B1 (en) 1996-11-25 2002-09-03 Bundesrepublic Deutschland, Vertreten Durch Den Bundesminister Fur Gesundheit Processed polypeptides with IL-16 activity, processes for their production and their use
US6117973A (en) * 1997-02-24 2000-09-12 Georgia Tech Research Corp. PNA monomers with electron donor or acceptor
ATE279534T1 (de) * 1997-02-24 2004-10-15 Georgia Tech Res Inst Verfahren zur bestimmung einer nukleinsäure
US6692912B1 (en) * 1997-03-05 2004-02-17 Matrix Technologies Corporation Nucleic acid-containing polymerizable complex
US5932711A (en) * 1997-03-05 1999-08-03 Mosaic Technologies, Inc. Nucleic acid-containing polymerizable complex
US6015887A (en) * 1997-04-11 2000-01-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chiral peptide nucleic acids and methods for preparing same
SE522077C2 (sv) * 1997-09-05 2004-01-13 Lightup Technologies Ab Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering
US6617422B1 (en) 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
EP1003480A4 (en) * 1997-05-28 2002-04-17 Nielsen Peter Eigil NUCLEIC ACIDS CONJUGED WITH PEPTIDES WITH INCREASED UPDATE IN CELLS
DE69831113T2 (de) * 1997-05-30 2006-05-24 Pna Diagnostics A/S 2- oder 3-dimensionale geometrische struktur aus peptidnukleinsäuren
AU8147798A (en) * 1997-06-16 1999-01-04 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Peptido oligonucleotides (pons) and their combinatorial libraries
US5962665A (en) 1997-06-16 1999-10-05 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2
JPH11332595A (ja) * 1997-07-09 1999-12-07 Masao Karube プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法
DE69827998T2 (de) * 1997-08-22 2005-10-06 Pna Diagnostics Aps kurze PNA Oligonukleotide in Triplexkomplexen
US6300318B1 (en) 1997-09-16 2001-10-09 Peter E. Nielsen Antibacterial and antibiotic methods using peptide nucleic acids and pharmaceutical compositions therefor
DE19741739B4 (de) * 1997-09-22 2006-04-27 Nanogen Recognomics Gmbh Supramolekulares Paarungssystem, dessen Herstellung und Verwendung
US6723560B2 (en) 1998-10-08 2004-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6989270B1 (en) 1997-10-17 2006-01-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6028183A (en) 1997-11-07 2000-02-22 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
US6007992A (en) * 1997-11-10 1999-12-28 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
DE19816550A1 (de) 1997-12-24 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Universell verwendbarer Aufbau eines Analysenelements und dessen Einsatz zur Analytbestimmung
US6030997A (en) * 1998-01-21 2000-02-29 Eilat; Eran Acid labile prodrugs
US6326479B1 (en) * 1998-01-27 2001-12-04 Boston Probes, Inc. Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same
WO1999049293A2 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20040063618A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Muthiah Manoharan Peptide nucleic acids having improved uptake and tissue distribution
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6664045B1 (en) * 1998-06-18 2003-12-16 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of microorganisms
EP1095054B1 (en) 1998-07-09 2006-10-25 Biocept, Inc. Method of using an improved peptide nucleic acid universal library to optimize dna sequence hybridation
US6548651B1 (en) 1998-11-11 2003-04-15 Pantheco A/S Modified peptide nucleic acid (PNA) molecules
KR20020007332A (ko) * 1999-03-18 2002-01-26 추후제출 일 단계 샘플 제조 및 복합적인 생물학적 샘플에서 핵산의검출
US20020049173A1 (en) * 1999-03-26 2002-04-25 Bennett C. Frank Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6824866B1 (en) 1999-04-08 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Porous silica substrates for polymer synthesis and assays
DE19927783A1 (de) * 1999-06-18 2000-12-21 Roche Diagnostics Gmbh Element zur Bestimmung eines Analyts in einer Flüssigkeit, entsprechendes Bestimmungsverfahren unter Verwendung des Elementes sowie Kit zur Bestimmugn eines Analyts
AU6629200A (en) * 1999-08-25 2001-03-19 Philip P Garner Alpha-helical peptide nucleic acid alpha-pna
WO2001016149A2 (en) 1999-08-30 2001-03-08 Roche Diagnostics Gmbh 2-azapurine compounds and their use
US6348583B1 (en) * 1999-08-30 2002-02-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Poly(ether-thioether), poly(ether-sulfoxide) and poly(ether-sulfone) nucleic acids
CA2317179A1 (en) 1999-09-01 2001-03-01 Affymetrix, Inc. Macromolecular arrays on polymeric brushes and methods for preparing the same
US6660845B1 (en) * 1999-11-23 2003-12-09 Epoch Biosciences, Inc. Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof
US7125542B2 (en) 2000-02-10 2006-10-24 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for treating conditions of the eye
US6962906B2 (en) 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
WO2001068673A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US20040014644A1 (en) * 2000-03-14 2004-01-22 Vladimir Efimov Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression
ATE456668T1 (de) 2000-04-03 2010-02-15 Cytyc Corp Nachweis und typisierung des papillomavirus mittels pna-sonden
US6936443B2 (en) 2000-04-03 2005-08-30 Cytyc Corporation Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes
US7211381B1 (en) 2000-04-04 2007-05-01 Abbott Laboratories β2 andrenergic polymorphism detection
US6593092B2 (en) 2000-04-04 2003-07-15 Abbott Laboratories Beta 2 adrenergic polymorphism detection
DE10019135A1 (de) 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE10019136A1 (de) 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
US7238795B2 (en) 2000-08-03 2007-07-03 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses
ES2387329T3 (es) 2000-08-08 2012-09-20 Technion Research And Development Foundation Ltd. Composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis
US20030114410A1 (en) 2000-08-08 2003-06-19 Technion Research And Development Foundation Ltd. Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis
US7183394B1 (en) * 2000-08-11 2007-02-27 Garner Philip P Helical nucleopeptides
CA2437942C (en) * 2000-11-09 2013-06-11 Cold Spring Harbor Laboratory Chimeric molecules to modulate gene expression
US7282575B2 (en) 2000-12-26 2007-10-16 Credia Japan Co., Ltd. Functional peptide nucleic acid monomer and process for producing the same
ATE465739T1 (de) 2001-01-29 2010-05-15 Bio Rad Laboratories Nukleinsäurederivative
GB0102388D0 (en) * 2001-01-31 2001-03-14 Secr Defence Polymers
EP1236804A1 (en) 2001-03-02 2002-09-04 Boehringer Mannheim Gmbh A method for determination of a nucleic acid using a control
DE60216468T2 (de) 2001-03-09 2007-09-27 Boston Probes, Inc., Bedford Kombinationsoligomere betreffende verfahren, kits und zusammensetzungen
KR20080081201A (ko) 2001-04-16 2008-09-08 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 폴리펩티드 항원을 암호화하는 신규한 스트렙토코쿠스뉴모니애 개방형 판독 프레임 및 이를 포함하는 조성물
US8026051B2 (en) 2001-05-18 2011-09-27 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of Candida
WO2009003492A1 (en) 2007-07-03 2009-01-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use
US20030207804A1 (en) * 2001-05-25 2003-11-06 Muthiah Manoharan Modified peptide nucleic acids
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
US6921812B1 (en) 2001-07-03 2005-07-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating pharmacokinetics of oligonucleotides
US6852491B2 (en) 2001-09-04 2005-02-08 Abbott Laboratories Amplification and detection reagents for HIV-1
US20030129626A1 (en) 2001-09-24 2003-07-10 Nielsen Kirsten Vang Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
EP1442137A4 (en) 2001-11-07 2005-08-31 Applera Corp UNIVERSAL NUCLEOTIDES FOR NUCLEIC ACID ANALYSIS
CA2466821A1 (en) 2001-11-21 2003-06-05 Applera Corporation Digital assay
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
JP2005516300A (ja) 2002-01-25 2005-06-02 アプレラ コーポレイション 製品およびサービスに対する注文を発注し、受理し、および充足する方法
JP2005520554A (ja) * 2002-03-21 2005-07-14 ボストン プローブス，インコーポレイテッド ＢａｃｉｌｌｕｓＡｎｔｈｒａｃｉｓの検出に関するＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法およびキット
US20030211509A1 (en) * 2002-03-26 2003-11-13 Wiley Steven R. TNF-delta ligand and uses thereof
US7052840B2 (en) 2002-04-03 2006-05-30 Capitol Genomix, Inc. Reversible association of nucleic acid with a carboxylated substrate
US7026120B2 (en) 2002-04-15 2006-04-11 Abbott Laboratories Probes for detecting tumor cells
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7015317B2 (en) 2002-05-02 2006-03-21 Abbott Laboratories Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis B virus nucleic acids
US20040005611A1 (en) * 2002-05-17 2004-01-08 Hyldig-Nielsen Jens J. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the determination of Listeria
US20030220844A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Marnellos Georgios E. Method and system for purchasing genetic data
US20040137469A1 (en) 2002-09-08 2004-07-15 Casale Ralph A Methods, compositions and libraries pertaining PNA dimer and PNA oligomer synthesis
AU2003304278B2 (en) * 2002-10-16 2009-03-12 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
WO2004036188A2 (en) * 2002-10-18 2004-04-29 Cylene Pharmaceuticals, Inc. Processes for identifying quadruplex-targeted antiviral molecules
AU2003291753B2 (en) * 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US9150606B2 (en) * 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
US9150605B2 (en) * 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
CA2505330A1 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
DK1576138T3 (en) 2002-11-15 2017-05-01 Idenix Pharmaceuticals Llc 2'-METHYL NUCLEOSIDES IN COMBINATION WITH INTERFERON AND FLAVIVIRIDAE MUTATION
US20040197802A1 (en) 2002-11-21 2004-10-07 Dahl Gary A. Methods for using primers that encode one strand of a double-stranded promoter
US20040259132A1 (en) * 2002-11-22 2004-12-23 Henrik Stender Peptide nucleic acid probes for analysis of pseudomonas (sensu stricto)
EP2112229A3 (en) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
US7736909B2 (en) 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
EP1588145B1 (en) 2003-01-30 2011-07-06 Life Technologies Corporation Methods, mixtures, kits and compositions pertaining to analyte determination
DK1597366T3 (da) * 2003-02-11 2013-02-25 Antisense Therapeutics Ltd Modulering af ekspression af insulin-lignende vækstfaktor receptor I
AU2003900609A0 (en) * 2003-02-11 2003-02-27 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
EP1595953B1 (en) 2003-02-21 2012-04-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Signal amplification method for detecting mutant gene
JP4633716B2 (ja) * 2003-05-20 2011-02-16 インベスチゲン， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドを検出するためのシステム
WO2005012546A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Andreas Braun Methods for isolating and identifying novel target-specific structuremers for use in the biological sciences
WO2005010181A1 (ja) * 2003-07-25 2005-02-03 Credia Japan Co., Ltd. 核酸検出方法
US20060198800A1 (en) * 2003-08-14 2006-09-07 Natalie Dilallo Skin care compositions including hexapeptide complexes and methods of their manufacture
US20050063932A1 (en) * 2003-08-14 2005-03-24 Natalie Dilallo Skin care compositions including hexapeptide complexes and methods of their manufacture
WO2005074417A2 (en) * 2003-09-03 2005-08-18 Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
US20050148087A1 (en) 2004-01-05 2005-07-07 Applera Corporation Isobarically labeled analytes and fragment ions derived therefrom
CN1910289B (zh) 2004-01-07 2012-05-23 日立化成研究中心公司 用于检测hiv的引物和探针
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US7604937B2 (en) 2004-03-24 2009-10-20 Applied Biosystems, Llc Encoding and decoding reactions for determining target polynucleotides
WO2005106031A1 (ja) 2004-04-28 2005-11-10 Eisai R & D Management Co., Ltd. ハイブリダイゼーション方法
JP2007535966A (ja) * 2004-05-04 2007-12-13 ダコ デンマーク アクティーゼルスカブ 染色体異常を検出するための方法
WO2005121372A2 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
EP1776482A2 (en) 2004-06-30 2007-04-25 Applera Corporation Log-linear amplification
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US7306785B2 (en) * 2004-09-23 2007-12-11 General Electric Company Multifunctional cross-bridged tetraaza macrocyclic compounds and methods of making and using
EP1836317A2 (en) * 2004-12-06 2007-09-26 BioVeris Corporation Methods and compositions for detecting bacillus anthracis
WO2006063355A2 (en) * 2004-12-11 2006-06-15 Cytogenix , Inc. Cell free biosynthesis of high-quality nucleic acid and uses thereof
WO2006074233A2 (en) 2005-01-06 2006-07-13 Applera Corporation Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification
US7229769B2 (en) * 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
US20060257902A1 (en) 2005-03-25 2006-11-16 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant RNA transcripts
WO2006130872A2 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of microorganisms
CA2919210C (en) 2005-06-07 2019-03-05 Luminex Corporation Methods for detection and typing of nucleic acids
ATE501277T1 (de) 2005-07-01 2011-03-15 Dako Denmark As Monomere und polymere linker zur konjugierung von biologischen molekülen und anderen stoffen
US20070059713A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
WO2007056113A2 (en) * 2005-11-02 2007-05-18 Cylene Pharmaceuticals, Inc. Methods for targeting quadruplex sequences
WO2007073149A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange
WO2007100711A2 (en) * 2006-02-24 2007-09-07 Investigen, Inc. Methods and compositions for detecting polynucleotides
EP1997908A4 (en) 2006-03-15 2010-09-29 Eisai R&D Man Co Ltd METHOD FOR FORMING A SIGNAL CONDUCTOR POLYMER
JP2009536525A (ja) 2006-05-10 2009-10-15 ディクステリティー ダイアグノーティクス 化学反応性オリゴヌクレオチドプローブを使用した核酸標的の検出
WO2007137300A2 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
CN101490551A (zh) 2006-06-30 2009-07-22 阿普里拉股份有限公司 分析结合相互作用的方法
WO2008016644A1 (en) 2006-08-01 2008-02-07 Applera Corporation Detection of analytes and nucleic acids
US20080096193A1 (en) * 2006-10-24 2008-04-24 Charles Robert Bupp Methods and compositions for detecting polynucleotides
US20080131880A1 (en) * 2006-11-22 2008-06-05 Bortolin Laura T PNA-DNA oligomers and methods of use thereof
EP2099816A1 (en) 2006-12-04 2009-09-16 Luminex Corporation Oxocarbonamide peptide nucleic acids and methods of using same
EP2857526B1 (en) 2006-12-13 2016-08-17 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of PCR in real time
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
EP2118310B1 (en) * 2006-12-29 2013-03-06 Applied Biosystems, LLC Systems and methods for detecting nucleic acids
AU2007339793A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Applied Biosystems, Llc Systems and methods for detecting nucleic acids
US7803543B2 (en) 2007-01-19 2010-09-28 Chang Gung University Methods and kits for the detection of nucleotide mutations using peptide nucleic acid as both PCR clamp and sensor probe
EP2129388B1 (en) * 2007-02-23 2012-09-12 The Research Foundation Of State University Of New York Rna targeting compounds and methods for making and using same
WO2008103702A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Investigen, Inc. Methods and compositions for rapid light-activated isolation and detection of analytes
US9260476B2 (en) 2007-02-23 2016-02-16 The Research Foundation For The State University Of New York RNA targeting compounds and methods for making and using same
JP5619602B2 (ja) 2007-04-13 2014-11-05 アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド クラミジア・トラコマチスを検出するためのプライマー及びプローブ配列
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
IL184627A0 (en) 2007-07-15 2008-12-29 Technion Res & Dev Foundation Agents for diagnosing and modulating metastasis and fibrosis as well as inflammation in a mammalian tissue
CA2693208A1 (en) 2007-08-02 2009-02-05 Victoria Smith Methods and compositions for treatment and diagnosis of fibrosis, tumor invasion, angiogenesis, and metastasis
SG185315A1 (en) 2007-10-24 2012-11-29 Eisai R&D Man Co Ltd Nucleic acid probe, and method of forming probe -polymer
EP2213751A1 (en) 2007-10-31 2010-08-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Polymer for detection of target substance, and method for detection of target substance
ES2641290T3 (es) 2007-11-20 2017-11-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc Modulación de la expresión de CD40
US8017338B2 (en) 2007-11-20 2011-09-13 Life Technologies Corporation Reversible di-nucleotide terminator sequencing
BRPI0906429B1 (pt) 2008-01-10 2021-08-03 Research Development Foundation Método de identificação de uma infecção por e. chaffeensis em um indivíduo, uso de um ou mais polipeptídeo sintético e kit
EP3360972B1 (en) 2008-01-17 2019-12-11 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes
KR101072899B1 (ko) * 2008-01-21 2011-10-17 주식회사 파나진 아미노산 스페이서가 결합된 펩티드 핵산의 합성 및 그의응용
CA2717320A1 (en) 2008-03-11 2009-09-17 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
KR20090098710A (ko) * 2008-03-14 2009-09-17 주식회사 씨티아이바이오 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체
EP2636757B1 (en) 2008-05-27 2016-11-23 Dako Denmark A/S Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers
US20090312196A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
EP2285958B1 (en) 2008-06-13 2016-03-09 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
WO2010027326A1 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Nanyang Technological University Peptide nucleic acid monomers and oligomers
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
AU2009293658A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 James Cardia Reduced size self-delivering RNAi compounds
EP2568044B1 (en) 2008-09-29 2015-04-08 The Trustees of The University of Pennsylvania Tumor vascular marker-targeted vaccines
EP3085794B1 (en) 2008-10-15 2020-03-18 AXOLABS GmbH Oligonucleotide detection method
WO2010054328A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Research Development Foundation Compositions and methods for the inhibition of cripto/grp78 complex formation and signaling
US8715732B2 (en) * 2009-01-05 2014-05-06 Cornell University Nucleic acid hydrogel via rolling circle amplification
US9107935B2 (en) 2009-01-06 2015-08-18 Gilead Biologics, Inc. Chemotherapeutic methods and compositions
EP2391714B2 (en) 2009-01-30 2019-07-24 Whitehead Institute for Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US7964355B2 (en) 2009-02-17 2011-06-21 Investigen, Inc. Assays based on detection of photobleaching reaction products from dye catalytic complex
WO2010097655A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Dako Denmark A/S Compositions and methods for rna hybridization applications
US8063193B2 (en) 2009-03-27 2011-11-22 Abbott Laboratories Nucleotide and amino acid sequences encoding an exported protein 1 derived from Plasmodium vivax and uses thereof
WO2010114599A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Dx Terity Diagnostics Inc. Chemical ligation dependent probe amplification (clpa)
US20100297127A1 (en) 2009-04-08 2010-11-25 Ghilardi Nico P Use of il-27 antagonists to treat lupus
WO2010141421A1 (en) 2009-06-02 2010-12-09 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases
EP2789689B1 (en) 2009-06-29 2016-04-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
US8614081B2 (en) 2009-07-23 2013-12-24 Codexis, Inc. Nitrilase biocatalysts
NZ598457A (en) * 2009-08-03 2014-06-27 Recombinetics Inc Methods and compositions for targeted gene modification
BR112012008054A2 (pt) 2009-08-21 2017-05-23 Gilead Biologics Inc domínios catalíticos de lisil oxidase e loxl2
US8759259B2 (en) 2009-10-16 2014-06-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for producing cyclic peptoid libraries
ES2601237T3 (es) 2009-12-02 2017-02-14 Dako Denmark A/S Composiciones y métodos para realizar hibridaciones sin desnaturalización
CA2785020C (en) 2009-12-22 2020-08-25 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
WO2011087789A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
EP2550000A4 (en) 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc RNAI COMPOUNDS OF REDUCED SIZE ADMINISTERING
WO2011133931A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease
MX2017015093A (es) 2011-01-11 2023-03-10 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
JP5852222B2 (ja) 2011-03-29 2016-02-03 シージーン アイエヌシー Ｐｔｏ切断及び延長−依存的切断によるターゲット核酸配列の検出
ES2745504T3 (es) 2011-04-08 2020-03-02 Univ Carnegie Mellon Acidos nucleicos peptídicos gamma que contienen miniPEG preorganizados conformacionalmente
US8460872B2 (en) 2011-04-29 2013-06-11 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
MX342067B (es) 2011-05-04 2016-09-09 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo por desdoblamiento e hibridización de oligonucleótido de sonda.
AU2012255121B2 (en) 2011-05-17 2017-03-09 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids
US10662465B2 (en) 2011-09-30 2020-05-26 Agilent Technologies, Inc. Hybridization compositions and methods using formamide
GB201117482D0 (en) 2011-10-11 2011-11-23 Univ Dundee Targetiing of miRNA precursors
US11118226B2 (en) 2011-10-21 2021-09-14 Agilent Technologies, Inc. Hybridization compositions and methods
EP2594942A1 (en) * 2011-11-16 2013-05-22 Koninklijke Philips Electronics N.V. Long rigid spacers to enhance binding kinetics in immunoassays
EP2789688A4 (en) 2011-12-09 2015-07-15 Eisai R&D Man Co Ltd METHOD FOR DETECTING NUCLEOTIDE MUTATION AND DETECTION KIT
ES2930180T3 (es) 2012-03-02 2022-12-07 Sequenom Inc Métodos para enriquecer ácido nucleico canceroso a partir de una muestra biológica
MX354465B (es) 2012-03-05 2018-03-06 Seegene Inc Deteccion de variacion del nucleotido en la secuencia de acido nucleico de objetivo por ensayo de desdoblamiento y extension de pto.
WO2013172305A1 (ja) 2012-05-15 2013-11-21 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 Ｒｎａの検出方法及び検出用キット
CA2873447A1 (en) 2012-05-21 2013-11-28 The Scripps Research Institute Ribosomal polynucleotides and related expression systems
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10077474B2 (en) 2012-05-29 2018-09-18 Abbott Molecular, Inc. Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits
AU2013290102B2 (en) 2012-07-13 2018-11-15 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
WO2014033314A1 (en) 2012-09-03 2014-03-06 Uab Bioseka Antisense oligonucleotide targeting bacterial glucosyltransferases
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
EP2929050A1 (en) 2012-12-10 2015-10-14 AdvanDx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
EP2770065B1 (en) 2013-02-25 2017-12-13 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence
US9289502B2 (en) 2013-03-08 2016-03-22 Emerald Therapeutics, Inc. Preparation of oligo conjugates
EP2971115B1 (en) 2013-03-13 2022-07-27 Seegene, Inc. Quantification of target nucleic acid using melting peak analysis
WO2014168711A1 (en) 2013-03-13 2014-10-16 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
EP2971158B1 (en) 2013-03-15 2018-11-14 Abbott Molecular Inc. Detection of bisulfite converted nucleotide sequences
US9347095B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays for mutation detection
WO2014169206A2 (en) 2013-04-11 2014-10-16 Carnegie Mellon University Divalent nucleobase compounds and uses therefor
US10221216B2 (en) 2013-04-11 2019-03-05 Carnegie Mellon University Template-directed γPNA synthesis process and γPNA targeting compounds
KR101894762B1 (ko) 2013-07-12 2018-09-05 이엠디 밀리포어 코포레이션 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 활성탄을 사용하여 바이러스 제거를 결정하는 방법
EP3022319B1 (en) 2013-07-15 2023-05-17 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization
LT6214B (lt) 2013-10-07 2015-08-25 Uab "Bioseka" Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai
JP2016537965A (ja) 2013-10-11 2016-12-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｓｐ４阻害剤及び使用方法
CA2927358C (en) 2013-10-16 2021-12-21 The University Of British Columbia Device for formulating particles at small volumes
WO2015057008A2 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence on solid phase by pto cleavage and extension using hcto assay
WO2015070050A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Baylor Research Institute Nuclear loclization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
SG10201803094QA (en) 2014-01-28 2018-06-28 Dice Molecules Sv Llc Monoliths with attached recognition compounds, arrays thereof and uses thereof
EP3117011B1 (en) 2014-03-13 2020-05-06 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10851407B2 (en) 2014-05-08 2020-12-01 Carnegie Mellon University Left-handed gamma-peptide nucleic acids, methods of synthesis and uses therefor
JP6695285B2 (ja) 2014-06-10 2020-05-20 ディクステリティー ダイアグノスティクス インコーポレイテッド 生物学的試料を採取して安定化するためのデバイス及び方法
CN106414738A (zh) 2014-06-24 2017-02-15 雅培分子公司 人kras中单核苷酸多态性的检测
ES2864855T3 (es) 2014-07-24 2021-10-14 Abbott Molecular Inc Métodos para la detección y análisis de mycobacterium tuberculosis
EP3633047B1 (en) 2014-08-19 2022-12-28 Pacific Biosciences of California, Inc. Method of sequencing nucleic acids based on an enrichment of nucleic acids
EP3259346A4 (en) 2015-02-20 2018-07-11 Baylor College of Medicine P63 inactivation for the treatment of heart failure
WO2016201389A2 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Alector Llc Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
EP3307771A2 (en) 2015-06-12 2018-04-18 Alector LLC Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
CN108184327A (zh) 2015-07-14 2018-06-19 雅培分子公司 用于鉴定耐药性结核的组合物和方法
CN108137702B (zh) 2015-08-28 2023-01-06 艾利妥 抗siglec-7抗体及其使用方法
CA2998886C (en) 2015-09-16 2023-05-16 PetaOmics, Inc. Methods and compositions for genomic target enrichment and selective dna sequencing
JP7011830B2 (ja) 2015-10-14 2022-01-27 エックス－サーマ インコーポレイテッド 氷晶形成を低減するための組成物および方法
US9744187B2 (en) 2015-10-14 2017-08-29 Bio-Path Holdings, Inc. p-Ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
KR20180084817A (ko) 2015-10-29 2018-07-25 알렉터 엘엘씨 항-siglec-9 항체 및 이의 이용 방법
JP7349788B2 (ja) 2016-01-06 2023-09-25 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 分岐ミキサー並びにその使用及び製造方法
EP3436049B1 (en) 2016-03-31 2022-01-12 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
US10400274B2 (en) 2016-06-18 2019-09-03 Jan Biotech, Inc. Fluorogenic probes and their use in quantitative detection of target RNA sequences
US10300145B2 (en) 2016-07-15 2019-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic nanoparticles for delivery of immunomodulatory compounds
WO2018053232A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Bio-Path Holdings, Inc. Combination therapy with liposomal antisense oligonucleotides
JP2019531726A (ja) 2016-09-26 2019-11-07 カーネギー メロン ユニバーシティ 二価核酸塩基化合物およびそれらの使用
US11147249B2 (en) 2016-12-08 2021-10-19 Alector Llc Siglec transgenic mice and methods of use thereof
US11359014B2 (en) 2017-05-16 2022-06-14 Alector Llc Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
PE20200486A1 (es) 2017-08-03 2020-03-03 Alector Llc Anticuerpos anti-cd33 y metodos para utilizarlos
EP3676400A4 (en) 2017-08-31 2021-06-02 Seegene, Inc. ASSESSING THE PERFORMANCE OF COMPONENTS USING A PAIR OF DIMER FORMING PRIMERS
WO2019066461A2 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Seegene, Inc. DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY CLEAVAGE ANALYSIS AND EXTENSION OF PTO
US11470827B2 (en) 2017-12-12 2022-10-18 Alector Llc Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof
CN111801317A (zh) 2017-12-21 2020-10-20 ***梅隆大学 模板导向的核酸靶向型化合物
JP2021531027A (ja) 2018-07-27 2021-11-18 アレクトル エルエルシー 抗Ｓｉｇｌｅｃ−５抗体及びその使用方法
AU2019342197A1 (en) 2018-09-21 2021-04-15 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching mRNA coding for secreted proteins
EP3997225A1 (en) 2019-07-10 2022-05-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
WO2021099394A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
WO2021243271A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Front Range Biosciences, Inc. Methods and compositions for pathogen detection in plants
WO2022006019A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Front Range Biosciences, Inc. Characterization of cannabis cultivars based on terpene synthase gene profiles
US20240018524A1 (en) 2020-07-10 2024-01-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating epilepsy
CA3218220A1 (en) * 2021-05-11 2022-11-17 Russell Lewis Mccurdy Replaceable floating attractant accessories for fishing line
WO2023043280A1 (ko) 2021-09-17 2023-03-23 주식회사 씨젠 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
CN114409890A (zh) * 2022-02-28 2022-04-29 中国科学院长春应用化学研究所 一种氨基功能化的聚乙二醇衍生物及其制备方法
WO2024017990A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2910130A1 (de) 1979-03-15 1980-09-25 Franz Rossmoeller Verbesserte befestigungsvorrichtung zum aufhaengen von paneelen und moebelelementen
DE2910129C2 (de) 1979-03-15 1986-01-23 Oskar 4354 Datteln Fleck Leiste zum Abdichten des Zwischenraums zwischen der Trauflatte eines Daches und den darüberliegenden traufseitigen Dacheindeckungsplatten
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
JP3022967B2 (ja) * 1985-03-15 2000-03-21 アンチバイラルズ インコーポレイテッド 立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマー
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) * 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
DE3856406T2 (de) 1987-10-28 2000-10-19 Florey Howard Inst Oligonucleotid-polyamid konjugate
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
CA1339987C (en) 1988-09-01 1998-08-04 Robert Bruce Merrifield Peptide synthesis method and solid support for use in the method
JPH02156895A (ja) * 1988-12-08 1990-06-15 Sumitomo Heavy Ind Ltd 好塩菌による５’‐ヌクレオチド類の製造法
JPH0635469B2 (ja) * 1989-09-13 1994-05-11 信 高橋 ジエチレントリアミン三酢酸化合物及びその製造中間体並びにそれらの製造法
US5340716A (en) * 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
US6414112B1 (en) * 1991-05-24 2002-07-02 Ole Buchardt Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
US6451968B1 (en) * 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
MX9207334A (es) 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
US6770738B1 (en) * 1992-05-22 2004-08-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Higher order structure and binding of peptide nucleic acids
WO1993024507A1 (en) * 1992-05-28 1993-12-09 Gilead Sciences, Inc. Conformationally restrained oligomers containing amide or carbamate linkages for sequence-specific binding
US5705333A (en) * 1994-08-05 1998-01-06 The Regents Of The University Of California Peptide-based nucleic acid mimics(PENAMS)
US6472209B1 (en) * 1997-10-17 2002-10-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response

Also Published As

Publication number Publication date
DE69232055T2 (de) 2002-06-06
AU1884392A (en) 1992-12-30
CA2109320C (en) 2003-07-22
EP1074559B1 (en) 2011-07-06
WO1992020702A1 (en) 1992-11-26
DE69220946D1 (de) 1997-08-21
AU1880692A (en) 1992-12-30
US20120115136A1 (en) 2012-05-10
ATE205504T1 (de) 2001-09-15
US5977296A (en) 1999-11-02
DE69232055D1 (de) 2001-10-18
JP2007306926A (ja) 2007-11-29
EP1074559A1 (en) 2001-02-07
US7378485B2 (en) 2008-05-27
EP1162206A3 (en) 2004-04-14
EP1411063A1 (en) 2004-04-21
HU9303023D0 (en) 1994-01-28
FI935208A0 (fi) 1993-11-23
EP1411063B1 (en) 2006-07-19
KR0133131B1 (en) 1998-04-14
NO934122D0 (no) 1993-11-15
US6395474B1 (en) 2002-05-28
FI935208A (fi) 1993-11-23
NO934235L (no) 1994-01-20
US6357163B1 (en) 2002-03-19
DK0586618T3 (da) 1998-02-09
JP2003235590A (ja) 2003-08-26
EP0586474A1 (en) 1994-03-16
JP2009069158A (ja) 2009-04-02
US20060160731A1 (en) 2006-07-20
WO1992020703A1 (en) 1992-11-26
CA2109320A1 (en) 1992-11-25
US20030180734A1 (en) 2003-09-25
ES2107552T3 (es) 1997-12-01
US20020160383A1 (en) 2002-10-31
EP0586618B1 (en) 1997-07-16
US6201103B1 (en) 2001-03-13
JP2008253251A (ja) 2008-10-23
ATE155483T1 (de) 1997-08-15
EP0586618A1 (en) 1994-03-16
US20040059087A1 (en) 2004-03-25
JPH06506945A (ja) 1994-08-04
ES2164052T3 (es) 2002-02-16
NO934235D0 (no) 1993-11-23
AU666480B2 (en) 1996-02-15
US6710163B1 (en) 2004-03-23
CA2109805A1 (en) 1992-11-26
JP3982828B2 (ja) 2007-09-26
DE69220946T2 (de) 1998-01-15
DK0586474T3 (da) 2001-12-31
JP2758988B2 (ja) 1998-05-28
ATE515569T1 (de) 2011-07-15
NO934122L (no) 1994-01-11
EP1162206A2 (en) 2001-12-12
DK51092D0 (da) 1992-04-15
JPH06509063A (ja) 1994-10-13
BR9206049A (pt) 1994-12-27
HUT66597A (en) 1994-12-28
FI118424B (fi) 2007-11-15
NO313201B1 (no) 2002-08-26
NO312516B1 (no) 2002-05-21
GR3025018T3 (en) 1998-01-30
US20060046255A1 (en) 2006-03-02
EP0586474B1 (en) 2001-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221003B1 (hu) Peptid-nukleinsavak
EP0773950B1 (en) Linked peptide nucleic acids
US5539082A (en) Peptide nucleic acids
US6228982B1 (en) Double-stranded peptide nucleic acids
US5786461A (en) Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5736336A (en) Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6441130B1 (en) Linked peptide nucleic acids
US5766855A (en) Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
US6613873B1 (en) Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
DE69734783T2 (de) Peptidnukleinsäuren mit erhöhter bindungsaffinität, sequenzspezifität und löslichkeit
US6713602B1 (en) Synthetic procedures for peptide nucleic acids
US6710164B1 (en) Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US20030105286A1 (en) Linked peptide nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee