CN101978070A

CN101978070A - 检测核酸的***和方法

Info

Publication number: CN101978070A
Application number: CN2007800362797A
Authority: CN
Inventors: 维萨里昂·埃瓦萨韦利; 克瑞斯蒂恩·斯卡博; 尤金·斯拜尔
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2011-02-16
Also published as: JP2010514450A; US20080193940A1; WO2008083259A1; EP2069525A1; AU2007339793A1; CA2674012A1

Abstract

本发明描述了检测样品中靶核酸的方法和试剂盒。待分析的样品可以包括与靶核酸的至少一部分杂交的引物、具有与靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和具有可检测标记的第二区域的探针、延伸杂交的引物的聚合酶以及包含能切割杂交的杂交探针由此产生标记的探针片段的核酸外切酶活性的酶。杂交探针的至少一部分与其另一部分杂交由此形成折叠结构。该方法包括解链样品、降低样品的温度以便使引物和探针与样品中单链靶核酸的至少一部分各自杂交、延长引物以及释放标记的探针片段。可将样品与包含与标记的探针片段杂交的表面结合捕获探针的固相支持体接触。随后检测标记。

Description

检测核酸的***和方法

本申请要求2006年12月29日提交的美国第60/877,611号临时专利申请的权益，通过引用的方式将其整体并入本文。

本文所用的章节标题(section headings)仅是出于组织目的，不应当理解为以任何方式限制本文所述的主题。

发明领域

本申请一般涉及检测生物分子的方法和***，特别是涉及检测样品中核酸的方法和***。

发明背景

核酸的扩增可以与多种测定联合进行。此类测定可以是定性的，例如当用于评估生物样品时。然而，通过检测靶核酸的扩增，可改善多种生物学应用，而无需麻烦的印迹技术或光学方法通常所需的昂贵且易损坏的设备

因此，仍然需要改进检测样品中核酸的方法。

发明概述

根据第一实施方案，提供了检测样品中靶核酸的方法，其包括：

通过将样品加热至第一温度，解链样品，其中样品包含：

与靶核酸的至少一部分杂交的引物；

包含第一和第二区域的杂交探针，其中第一区域与靶核酸的至少一部分杂交，且第二区域不与靶核酸杂交，且其中第二区域包含可检测的标记；和

聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和可检测标记的探针片段；和

其中，第一温度高于引物和存在于样品中的双链核酸的T_m；

随后，通过将温度降至低于第一温度的第二温度，将样品退火，以便使引物和杂交探针与样品中靶核酸的单链部分各自杂交；和

随后，通过使聚合酶在第三温度下延伸与靶核酸杂交的引物，延长引物；

使酶的核酸外切酶活性切割杂交探针，由此释放探针片段；

任选地重复解链、退火和延长至少一次；

将样品与固相支持体的表面接触，其中固相支持体的表面包含一个或多个与探针片段第二区域的至少一部分杂交的捕获探针；

使捕获探针在第四温度下与存在于样品中的探针片段的至少一部分杂交，其中第四温度低于第二和第三温度；以及

检测固相支持体表面上的标记；

其中杂交探针的至少一部分与杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中，所述折叠结构的解链温度(T_m)低于第三温度但高于第四温度。

根据第二实施方案，提供了检测样品中靶核酸的试剂盒，其包含：

杂交探针，其包含与靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和包含可检测标记的第二区域，其中第二区域不与靶核酸杂交，且其中，当与靶核酸杂交时，核酸外切酶能够切割杂交探针，由此产生包含第二区域和可检测标记的探针片段；

固相支持体，其包含位于其表面上的捕获探针，其中所述捕获探针与探针片段的第二区域杂交；

任选地，引物，其与靶核酸的至少一部分杂交；以及

任选地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针方向上延伸杂交的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和可检测标记的探针片段；

其中，所述杂交探针的至少一部分与该杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中折叠结构的解链温度(T_m)低于完整的杂交探针与靶核酸杂交时所形成的双链体的解链温度，且高于探针片段与捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温度。

附图简要说明

本领域技术人员能够理解下文所述的附图仅仅是出于示例的目的。所述附图并非是用来以任何方式限制本文教义的范围。

图1A是设计使用能形成折叠结构的杂交探针的测定的组成和步骤的示意图，其中可将杂交探针可与靶序列杂交，杂交的探针的一部分经切割形成标记的探针片段，且其中可在表面(如利用电极表面)上捕获和检测标记的探针片段。

图1B是显示预测的T_m为61.7℃的杂交探针的预测的折叠结构的图解。

图2是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图1B所示的核苷酸序列的杂交探针在不同的时间和温度下经40个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)循环后产生的。

图3A是显示预测的T_m为43.9℃的杂交探针的预测的折叠结构的图解。

图3B是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的。

图4是显示预测的T_m为34.2℃的杂交探针的预测的折叠结构的图解，其中该杂交探针与图3A所示的探针的差异在于从图3A所示的探针中移除了6个3’核苷酸。

图5A是显示由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图。

图5B是显示由具有图4所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图。

图6A是显示预测的T_m为53.1℃的杂交探针的预测的折叠结构的图解，其中该探针与图3A所示的探针的预测的3’端6个碱基双链区域相比，具有预测的3’端9个碱基的双链区域。

图6B是显示由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图。

图6C是显示由具有图6A所述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图。

图7A是显示由具有下述核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图：

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO.5)

其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的19mer(链节)核苷酸序列。

图7B是显示由具有下述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图：

TC TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT

(SEQ ID NO.6)

其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的15mer核苷酸序列。

图7C是显示由具有下述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图：

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT

(SEQ ID NO.7)

其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的13mer核苷酸序列。

图8A是显示用于禽流感的杂交探针的预测折叠结构的图解，所述探针具有44.0℃的预测的T_m。

图8B是显示由具有图8A所示的核苷酸序列的禽流感DNA杂交探针产生的PCR后电化学信号的柱状图。

图9A是显示用于禽流感的第二杂交探针的预测折叠结构的图解，所述探针具有45.3℃的预测的T_m。

图9B是显示由具有图9A所示的核苷酸序列的第二禽流感DNA杂交探针产生的PCR后电化学信号的柱状图。

图10是显示杂交探针的示意图，其中折叠结构是分子内三链体。

图11A和11B是显示碱基配对结构的图解，所述碱基配对当具有质子化的胞嘧啶(C+)核碱基的三链体形成时(图11A)以及当用假异胞嘧啶核碱基(pseudoisocytosine nucleobase，也称为J或J碱基)取代质子化的胞嘧啶核碱基时(图11B)发生。

图12是密封的电化学室的示意图，其可用于测量温度的升高。

各种实施方案的描述

出于解释本说明书的目的，使用下列定义，且只要适当，以单数使用的术语也包括复数，反之亦然。当下文阐述的任何定义与该词语在任何其他文献包括以参考方式并入本文的任何文献中的用法矛盾时，出于理解本说明书和其相关的权利要求的目的，以下文阐述的定义为准，除非明确规定了相反的含意(例如为了理解最初使用术语的文献)。除非另有说明或者使用“和/或”明显不合适，本文中“或”意指“和/或”。除非另有说明或者使用“一个或多个”明显不合适，本文中“a”意指一个或多个(one or more)。“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”以及“包括(including)”可交换使用，且并非意图限制。此外，如果一个或多个实施方案的描述使用了术语“包含(comprising)”，本领域的技术人员应该理解，在一些特定的情况下，可选择使用术语“基本上由......组成”和/或“由......组成”来描述所述一个实施方案或多个实施方案。

如本文所用的，“捕获探针”指表面结合的(surface bound)核碱基多聚体。捕获探针可以是核酸(如DNA或RNA)、核酸类似物(如锁核酸(locked nucleic acid，LNA))、核酸模拟物(如肽核酸(peptide nucleic acid，PAN))或嵌合体。

如本文所用的，“嵌合体”指包含两个或多个连接的亚单位的核碱基多聚体，所述亚单位选自不同类别的亚单位。例如，PNA/DNA嵌合体可包含连接于至少一个2’-脱氧核糖核酸亚单位的至少一个PNA亚单位(对于有关PAN/DNA嵌合体制备的示例性方法和组合物，参阅WO96/40709)。嵌合体示例性的组成亚单位选自PNA亚单位、天然存在的氨基酸亚单位、DNA亚单位、RNA亚单位、LNA亚单位和其他核酸类似物或模拟物的亚单位。

如本文所用的，“翼(flap)”指经设计可测定靶核酸的杂交探针中与该靶核酸不互补的一部分。

如本文所用的，“杂交探针”是核碱基多聚体，其可在该探针与互补链杂交的位点受到酶的核酸外切酶活性的切割，所述杂交探针包含与样品中所关注的靶核酸的至少一部分互补的核碱基序列。只要杂交探针通过核酸外切酶活性是可切割的，它可以是寡核苷酸、寡核苷酸类似物或嵌合体。在某些实施方案中，核碱基多聚体可以是包含除了一个LNA亚单位以外的所有DNA亚单位的嵌合体。在某些实施方案中，核碱基多聚体含有位于距离经设计与靶核酸杂交的杂交探针的那部分的5’端(向3’端)一个亚单位处的单个LNA亚单位。

如本文所用的，“核碱基多聚体”指包含一系列包含亚单位的连接的核碱基。适宜多聚体的非限制性实例包括寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸、肽核酸、核酸类似物、核酸模拟物和嵌合体。

如本文所用的，“肽核酸”或“PAN”指包含两个或多个PAN亚单位的任何聚核碱基链(polynucleobase)或聚碱基链的区段，包括但不限于在下列美国专利中称为肽核酸或作为肽核酸而请求保护的任何聚核碱基链或聚核碱基链的区段：5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、5,766,855、5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053、6,107,470和6,357,163。为了避免任何疑义，PNA是核酸模拟物，而不是核酸或核酸类似物。因为PNA不是由核苷酸形成的，所以它不是核酸。为了避免疑义，PNA寡聚体可以包括包含一个或多个连接于骨架的氨基酸侧链的多聚体。

如本文所用的，“支持体”或“固相支持体”或“固相载体”指任何固相材料。固相支持体包含诸如“树脂”、“合成支持体”、“固相”、“表面”、“膜”和/或“支持体”的术语。固相支持体可由有机多聚体如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺以及它们的共聚物和接枝物(grafts)组成。固相支持体也可以是无机物，如玻璃、硅石、可控孔度玻璃(controlled-pore-glass，CPG)或反相硅石。固相支持体的构型可以是珠、球、微粒、颗粒、凝胶、膜或表面的形式。表面可以为平面、基本上平面或非平面。固相支持体可以是多孔的或非多孔的，以及可以具膨胀或非膨胀特性。固相支持体可以以孔(well)、凹陷(depression)、管(tube)、槽(channel)、圆柱体(cylinder)或其他的容器(container)、器皿(vessel)、特征部件(feature)或区域(location)的形式成形。

如本文所用的，“靶核酸”指所关注的核酸分子。样品可以包含多于一种的核酸分子。

PCR产物电化学检测的测定公开于恰好与本申请同一日提交的美国临时专利申请第60/877,610号(Docket卷号：70043.0036USP1)中。该测定由具有例如15mer 5’翼的杂交探针组成，所述15mer 5’翼与靶核酸不互补但与电极限制的捕获探针互补。这种5’翼包含电化学标记。在PCR过程中，包含该5’翼的探针片段由具有核酸外切酶活性的酶如Taq聚合酶切割。探针片段随后与电极限制的捕获探针杂交，产生信号。发现完整的(即未切割的)杂交探针不像探针片段一样有效地与捕获探针杂交。这种现象可在单容器测定(one pot assay)中监控PCR，而无需从完整的杂交探针中分离探针片段。

在本文所述测定中，完整的或未切割的杂交探针可形成折叠结构，该折叠结构的解链温度(T_m)低于完整的杂交探针与靶核酸杂交时所形成的双链体的解链温度而高于探针片段与捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温度。不期望限于任何理论，认为在探针片段与捕获探针杂交的温度时的完整杂交探针的折叠结构基本上抑制了完整的杂交探针与电极表面上的捕获探针的杂交，由此，改善了测定的信噪比。

1.用包含5’翼的杂交探针进行的PCR测定

图1A是设计测定的组成和步骤的示意图，该测定利用能形成折叠结构的杂交探针，其中可将杂交探针与靶核酸杂交，且其中杂交的探针的一部分经切割形成可以在表面(如电极表面)上被捕获和检测的标记的探针片段。考虑到此测定模式，设计和评估一组具有多种预测的T_m值(如83.5℃、61.7℃、54.3℃或46℃)的杂交探针。具有最高T_m(＝83.5℃)的杂交探针对应于5’翼的15mer区域和探针的余部之间的完美匹配。其他的探针包含导致较低T_m值的错误匹配。利用2006年7月17日提交的美国专利申请第11/488,439号所述的切割的杂交探针和完整的杂交探针的HPLC分离，评估PCR过程中这些探针的切割效率。用7％ACN+93％TEAA平衡来自Waters公司的HPLC柱XTerroMSC 18(2.5mm×50mm)。分三步进行梯度洗脱(0.3ml/min，60C)：步骤1：7％ACN+93％TEAA，7分钟(min)。步骤2：10％ACN+90％TEAA，10分钟。步骤3：35％ACN+65％TEAA，10分钟。(ACN-乙腈；TEAA-0.1M三乙醇胺-乙酸，pH 6.8)。用于折叠结构的具有T_m为61.7℃的杂交探针表现出了30％的切割效率，其被选择用来进行PCR电化学检测。

图1B图解预测的T_m为61.7℃的杂交探针的预测的折叠结构。这种杂交探针依照图1A所示的测定适合检测李斯特氏杆菌(Listeria)单细胞发生hlyA基因。图1B所示的探针具有如下序列：

GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA(SEQ ID NO.1)

其中，粗体所示的核碱基表示5’翼，

符号表示预期核酸外切酶活性切割占优势的位点。

依照图1A所示的测定，利用这种包含5’锇电化学标签的杂交探针，进行李斯特氏杆菌单细胞发生hlyA基因片段(即靶核酸)的PCR。PCR反应在95℃运行10分钟，随后在补充了6mM MgCl₂的PCR缓冲液A(Applied Biosystems，目录号：N808-0228)中进行40个循环(95℃15秒，63℃1分钟)。引物和探针的浓度分别为200nM和400nM。这种杂交探针具有与探针内部局部互补的19-mer的5’翼(参见图1B)。在PCR过程中，在退火-延伸温度(即66℃)时，因为测定温度高于预测的折叠结构的T_m，所以杂交探针应该是基本上未折叠的。这可使杂交探针与靶核酸杂交。一旦杂交，具有核酸外切酶活性的酶切割杂交的杂交探针，由此在PCR反应过程中产生探针片段。PCR完成后，将样品的温度降低至41℃，以使探针片段与捕获探针杂交。在这些条件下，仍然存在于样品中的任何完整的(即未切割的)杂交探针形成了如图1B所示的预测的折叠结构，以致表面结合捕获探针基本上接触不到5’翼。

这种测定的电化学测量结果显示于图2中。40个PCR循环后，将阳性(pos)反应混合物和无模板对照(ntc)反应混合物置于夹于两个加热板之间的电化学池中。本实验中所用的电化学池显示于图12中。如图12所示，这种池包括直径为2mm的工作电极(working electrode，WE)和计算器电极(counter electrode，CE)。金计算电极(CE)是通过在具有Cr粘附层的硅石晶片上喷镀涂覆2000埃厚度的金层而制成的。参比电极(reference electrode)是0.5mm直径的Ag/AgCl金属丝。如从图2所示的结果中所观察到的，完整杂交探针杂交的效率比切割的探针片段低20-30倍。

2.用包含相互作用的5’和3’翼的杂交探针进行的PCR测定

具有可用于测定禽流感病毒RNA的互补的5’和3’翼的杂交探针具有如下序列：

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTC

(SEQ ID NO：2)

其中以粗体显示的核碱基表示5’和3’翼，

符号表示预期核酸外切酶活性的切割占优势的位点。这种探针的折叠结构的预测T_m为43.9℃。图3A显示了这种杂交探针的预测的折叠结构。

使用这种杂交探针，进行PCR测定。在环境反应混合液(master mix)中进行40个PCR循环(60℃下进行延伸和退火)后，将温度转变为28℃。环境反应混合液包括100mM KCl、100mM Tris(pH 8)、8mM MgCl₂、100μM dntps以及0.3单位/μL金牌酶(gold ampliTaq)。在此温度下，在杂交的杂交探针上通过核酸外切酶活性产生的探针片段，可与表面结合捕获探针(T_m＝32℃)退火。在这些条件下，仍然存在于样品中的任何完整的(即未切割的)杂交探针应该形成图3A所示的预测的折叠结构(T_m＝43.9℃)，以使表面结合捕获探针基本上接触不到5’翼。

图3B是显示在图3A所示的杂交探针PCR后，在各种时间点产生于表面电极上的电化学信号的柱状图。在存在10000拷贝的靶核酸和不存在靶核酸(无靶对照或NTC)的两种情况下进行PCR。如图3B所示，电化学数据表明两种测定的杂交效率有约100倍的区别。

用另一个具有如下核碱基序列的探针重复这种测定：

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO：3)

其中粗体所示的核碱基表示5’翼，

符号表示预期核酸外切酶活性的切割占优势的位点。图4显示这种杂交探针的预测的折叠结构。这种折叠结构的T_m为34.2℃。对5mM MgCl₂介质进行所有的T_m和mFold分析，所述媒介对应于环境反应混和液的离子强度。

如与图4所示的杂交探针所进行的比较，利用图3A所示的杂交探针进行PCR测定，以比较电化学测定的效率。图5A是显示用图3A所示的杂交探针进行的PCR测定的电化学信号的柱状图。图5B是显示用图4所示的杂交探针进行的PCR测定的电化学信号的柱状图。图5A所示的结果显示，与图4所示的杂技探针相比，图3A所示的杂交探针的辨别力高2-3倍。

3.3’翼长度的影响

为了阐明3’翼长度对折叠结构稳定性的影响，进行另外的实验。这些实验所用的杂交探针包括图3所示的探针，所述探针具有长度为6个核碱基的3’翼和相似的探针，所述相似探针具有长度为9个核碱基的延长的3’翼。具有较长的9个核碱基的3’翼的杂交探针的结构具有如下序列：

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT

(SEQ ID NO：4)

这种探针具有图6A所示的预测的折叠结构，且其预测的T_m为53.1℃。上文粗体所示的核碱基表示5’翼和3’翼，

符号表示预期核酸外切酶活性切割占优势的位点。在这种杂交探针中，邻近所示的切割位点的加下划线的C核碱基是LNA亚单位。杂交探针的所有其他亚单位都是DNA。

具有长度为9个核碱基的3’翼的探针具有约为53.1℃的预测的解链温度，而具有较短的6个核碱基的3’翼探针的预测的解链温度约为43.9℃。进行图3A和图6A所示的杂交探针的PCR测定后，电化学检测结果分别显示于图6B和图6C中。在金粉表面于32℃下，进行PCR后杂交反应的电化学分析。由于3’翼长度的增加，具有长度为9个核碱基的3’翼的探针具有预测的更稳定的结构(即更高的折叠T_m)，这显然产生了更好的辨别能力。

4.5’翼长度的影响

为了测定5’翼长度对测定性能的影响，进行另外的实验。对于这些实验而言，评估针对禽流感病毒的具有19mer、15mer、13mer 5’翼的杂交探针。这些探针不包括3’翼。所述探针具有如下核苷酸序列：

19-mer 5’翼

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO：5)

15-mer 5′翼

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT

(SEQ ID NO：6)

13-mer 5′翼

TC

TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT

(SEQ ID NO：7)

在这些序列中，上文粗体所示的核碱基表示5’翼，

符号表示预期核酸外切酶活性切割占优势的位点。在这些杂交探针中，邻近所示的切割位点的加有下划线的C核碱基是LNA亚单位。这些杂交探针的所有其他亚单位都是DNA。

在使用每种具有19mer、15mer和13mer 5’翼的杂交探针进行PCR后，电化学检测的结果分别显示于图7A、7B和7C中。对于19mer、15mer和13mer 5’翼，将PCR后混合物在金电极上分别于41℃、35℃、31℃(即比每种预测的折叠结构的预测的T_m低8℃)下杂交。从这些结果中可以观察到，具有13mer 5’翼的杂交探针比具有更长的15mer和19mer 5’翼的杂交探针表现处更好的测定性能。

5.另外的禽流感PCR测定

进行两个另外的禽流感PCR测定，这两个测定针对禽流感病毒血凝素基因的不同区域。用导致折叠结构的预测T_m为约44-45℃的3’翼，设计两种杂交探针。这两者探针的预测的折叠结构显示于图8A和图9A中。作为这些测定的靶核酸的模板是长度为约100个碱基的合成的DNAs。在比探针片段/捕获探针杂交物的预测的T_m低10-14℃的温度下，利用环境反应混和液，在金电极上，进行PCR后杂交/检测。

这些实验所用的第一杂交探针的核碱基序列为：

C

AGTTACCATATTCCAATTCACTTTTCATAATTGCTG

(SEQ IDNO：8)

对于折叠结构而言，这种杂交探针的预测的解链点(T_m)为44.0℃。这种探针的预测的折叠结构示于图8A中。与这种探针一起使用的捕获探针是具有下文所示结构的15mer寡聚体：

GTGTTGAGTAGCATG (SEQ ID NO：9)

这些实验所用的第二杂交探针的核碱基序列如下：

C TGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATGGTA CAC (SEQ ID NO：10)

对于折叠结构而言，这种杂交探针的预测的解链点(折叠T_m)为45.2℃。这种探针的预测的折叠结构示于图9A中。与这种杂交探针一起使用的捕获探针具有下文所示的结构：

GTAAGGTACACGTGT (SEQ ID NO：11)

对于这两种杂交探针而言，上文以粗体所示的核碱基表示5’和3’翼，符号表示预期核酸外切酶活性的切割占优势的位点。在这些杂交探针中，加下划线的A(第一探针)和加下划线的T(第二探针)核碱基，是LNA亚单位，其邻近所示的切割位点。这些杂交探针的所有其他亚单位都是DNA。

在本文所讨论的PCR测定中使用这些杂交探针和捕获探针。使用第一杂交探针的禽流感DNA的PCR后电化学检测显示于图8B中。使用第二杂交探针的禽流感DNA的PCR后电化学检测显示于图9B中。

尽管上文中公开了采用茎环构象的杂交探针，但也可以使用折叠时采用其他构型的杂交探针。此类结构包括发夹(hairpin)、内环(internalloop)、凸起(bulge)、分枝(branched)、苜蓿叶形(cloverlfeaf)和伪节(pesudoknot)结构。可用于实施本文所公开的方法和试剂盒的的其他折叠结构的实例，可见于美国专利第7,118,860B2号中。

6.包含三链体结构的杂交探针

在某些实施方案中，杂交探针可采用分子内三链体构象。可形成分子内三链体结构的杂交探针的实例如下文所示：

AGA

-[探针序列]-AAGGA (SEQ ID NO：12)

在上述序列中，“J”表示假胞嘧啶核碱基，“探针序列”表示经设计使序列与靶核酸特异性地杂交的探针的一部分。

可以预见，这种通用构象的杂交探针可采用与图10所示的折叠结构相同的分子内三链体构象，其中“--”表示Hoogsteen氢键，“·”沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pairs)，“环”包含探针中与靶核酸杂交的一部分(即“探针序列”)。这种类型的三链体结构公开于Petrov et al.，″The Triplex-Hairpin Transition in Cytosine-Rich DNA(富含胞嘧啶的DNA中的三链发夹转换)″，Biophysical Journal，Vol.87，3954-3973(December 2004)中。这些结构涉及T·^*A--T和C·G--C⁺三链体的形成，其中C⁺表示在N3位置质子化的胞嘧啶残基。参考图11和Egholm et al.，″Efficient pH-independent sequence-specific DNA bindng bypseudoisocytosine-containing bis-PNA(通过含假异胞嘧啶的双PNA进行有效的非pH依赖性的序列特异性DNA结合)″，Nucl.Acids Res.，Vol.23，No.2.217-222(1995)，当需要质子化的胞嘧啶核碱基(C⁺)产生三链体时，可用假异胞嘧啶来取代。以此方式，可以以不依赖pH的方式形成三链体结构。

在上文所示的序列和图10所示的结构中，用假异胞嘧啶取代那些要被质子化的胞嘧啶核碱基。因此，在所示的位置用J碱基取代C+允许三链体在生理pH下形成。预期形成分子内三链体的杂交探针形成稳定的折叠结构(即三链体结构)，所述结构基本上抑制它们与表面结合捕获探针的相互作用。

7.标记、探针和引物

任何已知的电化学部分可用作杂交探针切割部分上的标记。可使用的示例性的电化学标记包括双(2，2′-二吡啶基)咪唑基氯化锇(II)[盐]。这种标记具有相对Ag/AgCl的0.165的优良E₀，并具有用于合成和纯化的良好的溶解性。其他示例性的标记包括二茂铁以及于2006年7月17日提交的美国专利申请第11/488,439号公开的标记。此外，电化学标记可以是任何可将电子转运到到电极或从电极转运电子的部分。示例性的电化学标记包括过渡金属配合物。适合的过渡金属配合物包括，例如钌²⁺(2，2′-二吡啶)₃(Ru(bpy)₃ ²⁺)、钌²⁺(4，4′-二甲基-2，2′-二吡啶)₃(Ru(Me²-bpy)₃ ²⁺)、钌²⁺(5，6-二甲基-1，10-邻菲罗啉)₃(Ru(Me₂-phen)₃ ²⁺)、铁²⁺(2，2′-二吡啶)₃(Fe(bpy)₃ ²⁺)、铁²⁺(5-氯邻菲罗啉)₃(Fe(5-Cl-phen)₃ ²⁺)、锇²⁺(5-氯邻菲罗啉)₃(Os(5-Cl-phen)₃ ²⁺)、锇²⁺(2，2′-二吡啶)₂(咪唑基)、二氧化铼¹⁺膦以及二氧化铼¹⁺吡啶(ReO₂(Py)₄ ¹⁺)。一些可用作介质的阴离子复合物是Ru(bpy)((SO₃)2-bpy)₂ ^2-和Ru(bpy)((CO₂)2-bpy)2^2-，一些可用作介质两性离子复合物是Ru(bpy)2((SO₃)2-bpy)和Ru(bpy)2((CO2)2-bpy)，其中(SO₃)2-bpy2-是4，4′-二磺酸-2，2′-二吡啶，(CO2)2-bpy2-是4，4′-二羧基-2，2′-二吡啶。吡啶、二吡啶(bypyridine)和邻菲罗啉基的适宜的取代衍生物与上文所述的任何金属一起也可以用于复合物中。除其他的以外，适宜的取代衍生物包括但不限于4-氨基吡啶、A-二甲基吡啶、4-乙酰吡啶、4-硝基吡啶、4，4′-二氨基-2，2′-二吡啶、5，5′-二氨基-2，2′-二吡啶、6，6′-二氨基-2，2′-二吡啶、4，4′-二乙二胺-2，2′-二吡啶、5，5′-二乙二胺-2，2′-二吡啶、6，6′-二乙二胺-2，2′-二吡啶、4，4′-二羟基-2，2′-二吡啶、5，5′-二羟基-2，2′-二吡啶、6，6′-二羟基-2，2′-二吡啶、4，4′，4″-三氨基-2，2′，2″-四吡啶、4，4′，4″-三乙二胺-2，2′，2″-四吡啶、4，4′，4″-三羟基-2，2′，2′-四吡啶、4，4′，4″-三硝基-2，2′，2″-四吡啶、4，4′，4″-三苯基-2，2′，2″-四吡啶、4，7-二氨基-1，10-邻菲罗啉、3，8-二氨基-1，10-邻菲罗啉、4，7-二乙二胺-1，10-邻菲罗啉、3，8-二乙二胺-1，10-邻菲罗啉、4，7-二羟基-1，10-邻菲罗啉、3，8-二羟基-1，10-邻菲罗啉、4，7-二硝基-1，10-邻菲罗啉、3，8-二硝基-1，10-邻菲罗啉、4，7-二苯基-1，10-邻菲罗啉、3，8-二苯基-1，10-邻菲罗啉、4，7-二波胺-1，10-邻菲罗啉(4，7-disperamine-1，10-phenanthroline)、3，8-二波胺-1，10-邻菲罗啉、二吡啶[3，2-a：2′，2′-c]吩嗪，以及6，6′-二氯-2，2′-二吡啶。

尽管上文对电化学检测进行了举例说明，但公开的方法也适用于通过其他的检测技术如荧光检测进行核酸检测。而且，杂交探针上的可检测标记可以是能被检测和/或定量的任何部分。示例性的标记包括电化学标记、发光(如荧光、发光、化学发光)标记和比色标记。

本文所用的引物可以具有任何类型的长度和构型。例如，引物的长度可以是从18到约30个亚单位或从20到25个亚单位。引物并非限于DNA或RNA寡核苷酸，但它们必须是通过聚合酶可延伸的。也可以使用更长或更短的引物。

杂交探针中与靶核酸结合的区域的长度可以是从8到30个亚单位，而杂交探针中不与靶核酸结合的区域(即5’翼)的长度可以是2-40个亚单位或从8到30个亚单位。也可以使用具有比上文列举的那些区域更长或更短的区域的杂交探针。

PCR引物经设计可结合并产生任何期望长度的扩增的产物，通常长度为至少30或至少50个核苷酸且最多200、300、500、1000或更多个核苷酸。探针和引物可以以任何适宜的浓度提供。例如，提供的正向和反向引物的浓度通常小于或等于500nM，如20nM-500nm，或50-500nM，或100-500nM，或50-200nM。提供的探针的浓度通常小于或等于1000nM，如20nM-500nm，或50-500nM，或100-500nM，或50-200nM。NTPs、酶、引物和探针浓度的示例性条件也可见于美国专利第5,538,848号中，或利用商购(例如可从Applied Biosystems，Foster City，CA获得)的反应组分来实现，所述美国专利整体被通过引用的方式并入本文。

也可以以阵列的形式使用多种互补的捕获探针，所述探针的每种都具有特征序列。例如，可用与不同杂交探针片段杂交的捕获寡核苷酸的阵列定位和捕获许多离散的检测区中的单个标签序列。

本文所述方法可用于实时检测靶核酸。例如，固相支持体可与其中正发生核酸扩增的溶液以及PCR过程中受到监控的过程(即实时检测)接触。可选地，固相支持体可与PCR过程完成后的溶液接触(即终点检测)。在某些实施方案中，可在PCR过程中(实时)以及该过程完成后(终点)监控PCR测定。PCR测定可利用传统PCR模式以及Fast PCR模式、不对称PCR模式和异步PCR模式来进行。

本文所述的方法适用于均相PCR测定，其中检测到杂交探针的探针片段的表面杂交指示样品中存在靶核酸。

尽管前述的说明书讲述了本发明的原理，但通过参考出于说明目的而提供的实施例，本领域技术人员通过阅读本说明书应当理解，在没有偏离本发明的实质范围的情况下，可以在形式和细节上做出各种变化。

序列表

<110>西托吉尼克斯公司(CytoGenix，Inc.)

<120>针对禽流感的新序列和DNA疫苗

<130>17242/015WO1

<150>60/921,581

<151>2007-04-03

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>7009

<212>DNA

<213>CMV-H5，CMV-N1(H5N1串联盒)

<400>1

cggccgcacg cgtgggatcc gagctagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 60

tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 120

accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgtc 180

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 240

agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 300

gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 360

ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 420

tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 480

tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 540

acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctccgcgg ataccgccga gaccgcgtcc gccccgcgag cacagagcct 720

cgcctttgcc gatccgccgc ccgtccacac ccgccgccag ctcacctcga atcccggccg 780

ggaacggtgc attggaacgc ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag 840

agtctatagg cccacaaaaa atgctttctt cttttaatat acttttttgt ttatcttatt 900

tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat gatacaatgt atcatgcctc 960

tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt taaggcaata gcaatatttc 1020

tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta agaggtttca tattgctaat 1080

agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttaag gttgggataa ggctggatta 1140

ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcatgttcat acctcttatc ttcctcccac 1200

agctcctggg caacgtgctg gtctgtgtgc tggcccatca ctttggcaaa gaattgggat 1260

tcgaacatcg attgaattcg gtaccatgga ttggacttgg atcttatttt tagttgctgc 1320

tgctactaga gttcattcta actggatgga aaagatcgtg ctgctgttcg ccatcgtgag 1380

cctggtgaag agcgaccaga tctgcatcgg ctaccacgcc aacaacagca ccgagcaggt 1440

ggacaccatc atggaaaaaa acgtgaccgt gacccacgcc caggacatcc tggaaaagaa 1500

gcacaacggc aagctgtgcg acctggacgg cgtgaagccc ctgatcctgc gggactgcag 1560

cgtggccggc tggctgctgg gcaaccccat gtgcgacgag ttcatcaacg tgcccgagtg 1620

gagctacatc gtggagaagg ccaaccccgt gaacgacctg tgctaccccg gcgacttcaa 1680

cgactacgag gaactgaagc acctgctgtc ccggatcaac cacttcgaga agatccagat 1740

catccccaag agcagctggt ccagccacga ggccagcctg ggcgtgagca gcgcctgccc 1800

ataccagggc aagtccagct tcttccggaa cgtggtgtgg ctgatcaaga agaacagcac 1860

ctaccccacc atcaagcgga gctacaacaa caccaaccag gaagatctgc tggtcctgtg 1920

gggcatccac caccccaacg acgccgccga gcagaccaag ctgtaccaga accccaccac 1980

ctacatcagc gtgggcacca gcaccctgaa ccagcggctg gtgccccgga tcgccacccg 2040

gtccaaggtg aacggccaga gcggccggat ggaattcttc tggaccatcc tgaagcccaa 2100

cgatgccatc aacttcgaga gcaacggcaa cttcatcgcc cccgagtacg cctacaagat 2160

cgtgaagaag ggcgacagca ccatcatgaa gagcgagctg gaatacggca actgcaacac 2220

caagtgccag acccccatgg gcgccatcaa cagcagcatg cccttccaca acatccaccc 2280

cctgaccatc ggcgagtgcc ccaagtacgt gaagagcaac aggctggtgc tggccaccgg 2340

cctgcggaac agcccccagc gggagcggcg gaggaagaag aggggcctgt tcggcgccat 2400

cgccggcttc atcgagggcg gctggcaggg catggtggac gggtggtacg gctaccacca 2460

cagcaatgag cagggcagcg gctacgccgc cgacaaagag agcacccaga aggccatcga 2520

cggcgtcacc aacaaggtga acagcatcat cgacaagatg aacacccagt tcgaggccgt 2580

gggccgggag ttcaacaacc tggaacggcg gatcgagaac ctgaacaaga aaatggaaga 2640

tggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc cgagctgctg gtgctgatgg aaaacgagcg 2700

gaccctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac gacaaagtgc ggctgcagct 2760

gcgggacaac gccaaagagc tgggcaacgg ctgcttcgag ttctaccaca agtgcgacaa 2820

cgagtgcatg gaaagcgtgc ggaacggcac ctacgactac ccccagtaca gcgaggaagc 2880

ccggctgaag cgggaggaaa tcagcggcgt gaaactggaa agcatcggca tctaccagat 2940

cctgagcatc tacagcaccg tggccagcag cctggccctg gccatcatgg tggccggcct 3000

gagcctgtgg atgtgcagca acggcagcct gcagtgccgg atctgcatct gagaaatcga 3060

gttcagattg tagttaacga ttcagaagag gcgccgtata ctctacgcgc ggatctctag 3120

agtcgacctg ctcggggacg gtgaaggtga cagcagtcgg ttggagcgag catctctacg 3180

ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 3240

tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 3300

tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 3360

cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 3420

tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 3480

tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 3540

gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 3600

ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 3660

ttttgtaggt aaccacgatc cgagctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 3720

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 3780

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgt 3840

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 3900

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 3960

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 4020

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 4080

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 4140

gtttgttttg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt 4200

gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt 4260

gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg 4320

ggaccgatcc agcctccgcg gataccgccg agaccgcgtc cgccccgcga gcacagagcc 4380

tcgcctttgc cgatccgccg cccgtccaca cccgccgcca gctcacctcg aatcccggcc 4440

gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata 4500

gagtctatag gcccacaaaa aatgctttct tcttttaata tacttttttg tttatcttat 4560

ttctaatact ttccctaatc tctttctttc agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct 4620

ctttgcacca ttctaaagaa taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat agcaatattt 4680

ctgcatataa atatttctgc atataaattg taactgatgt aagaggtttc atattgctaa 4740

tagcagctac aatccagcta ccattctgct tttattttaa ggttgggata aggctggatt 4800

attctgagtc caagctaggc ccttttgcta atcatgttca tacctcttat cttcctccca 4860

cagctcctgg gcaacgtgct ggtctgtgtg ctggcccatc actttggcaa agaattggga 4920

ttcgaacatc gattgaattc ggtaccatgg attggacttg gatcttattt ttagttgctg 4980

ctgctactag agttcattct aactggatga accccaacca gaagatcatc accatcggca 5040

gcatctgcat ggtgaccggc atcgtgagcc tgatgctgca gatcggcaac atgatcagca 5100

tctgggtgtc ccacagcatc cacaccggca accagcacca gagcgagccc atcagcaaca 5160

ccaactttct gaccgagaag gccgtggcca gcgtgaagct ggccggcaac agcagcctgt 5220

gccccatcaa cggctgggcc gtgtacagca aggacaacag catccggatc ggcagcaagg 5280

gcgatgtgtt cgtgatccgg gagcccttca tcagctgcag ccacctggaa tgccggacct 5340

tcttcctgac ccagggggcc ctgctgaacg acaagcacag caacggcacc gtgaaggaca 5400

gaagccccca ccggaccctg atgagctgcc ccgtgggcga ggcccccagc ccctacaaca 5460

gccggttcga gagcgtggcc tggtccgcca gcgcctgcca cgacggcacc agctggctga 5520

ccatcggcat cagcggccct gacaacggcg ccgtggccgt gctgaagtac aacggcatca 5580

tcaccgacac catcaagagc tggcggaaca acatcctgcg gacccaggaa agcgagtgcg 5640

cctgcgtgaa cggcagctgc ttcaccgtga tgaccgacgg ccccagcaac ggccaggcca 5700

gccacaagat cttcaagatg gaaaagggca aggtggtgaa gagcgtggag ctggacgccc 5760

ccaactacca ctacgaggaa tgcagctgct accccaacgc cggcgagatc acctgcgtgt 5820

gccgggacaa ctggcacggc agcaaccggc cctgggtgtc cttcaaccag aacctggaat 5880

accagatcgg ctacatctgc agcggcgtgt tcggcgacaa ccccaggccc aacgatggca 5940

ccggcagctg cggccctgtg agcagcaacg gcgcctacgg cgtgaagggc ttcagcttca 6000

agtacggcaa cggcgtgtgg atcggccgga ccaagagcac caacagcaga tccggcttcg 6060

agatgatctg ggaccccaac ggctggaccg agaccgacag cagcttctcc gtgaagcagg 6120

acatcgtggc catcaccgac tggtccggct acagcggcag cttcgtgcag caccccgagc 6180

tgaccggcct ggactgcatc cggccctgct tttgggtgga gctgatcaga ggcaggccca 6240

aagagagcac catctggacc agcggcagca gcatcagctt ttgcggcgtg aacagcgaca 6300

ccgtgggctg gtcctggccc gatggcgccg agctgccctt caccatcgac aagtgagagc 6360

taaagttcag attgtagtta acgattcaga agaggcgccg tatactctac gcgcggatct 6420

ctagagtcga cctgctcggg gacggtgaag gtgacagcag tcggttggag cgagcatctc 6480

tacgggtggc atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact 6540

ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg 6600

tccttctata atattatggg gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag 6660

acaacctgta gggcctgcgg ggtctattgg gaaccaagct ggagtgcagt ggcacaatct 6720

tggctcactg caatctccgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag 6780

ttgttgggat tccaggcatg catgaccagg ctcagctaat ttttgttttt ttggtagaga 6840

cggggtttca ccatattggc caggctggtc tccaactcct aatctcaggt gatctaccca 6900

ccttggcctc ccaaattgct gggattacag gcgtgaacca ctgctccctt ccctgtcctt 6960

ctgattttgt aggtaaccac gtgcggaccg agcggccgtg cggaccgag 7009

<210>2

<211>3690

<212>DNA

<213>CMV-H5(H5盒)序列

<400>2

cggccgcacg cgtgggatcc gagctagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 60

tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 120

accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgtc 180

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 240

agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 300

gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 360

ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 420

tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 480

tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 540

acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctccgcgg ataccgccga gaccgcgtcc gccccgcgag cacagagcct 720

cgcctttgcc gatccgccgc ccgtccacac ccgccgccag ctcacctcga atcccggccg 780

ggaacggtgc attggaacgc ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag 840

agtctatagg cccacaaaaa atgctttctt cttttaatat acttttttgt ttatcttatt 900

tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat gatacaatgt atcatgcctc 960

tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt taaggcaata gcaatatttc 1020

tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta agaggtttca tattgctaat 1080

agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttaag gttgggataa ggctggatta 1140

ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcatgttcat acctcttatc ttcctcccac 1200

agctcctggg caacgtgctg gtctgtgtgc tggcccatca ctttggcaaa gaattgggat 1260

tcgaacatcg attgaattcg gtaccatgga ttggacttgg atcttatttt tagttgctgc 1320

tgctactaga gttcattcta actggatgga aaagatcgtg ctgctgttcg ccatcgtgag 1380

cctggtgaag agcgaccaga tctgcatcgg ctaccacgcc aacaacagca ccgagcaggt 1440

ggacaccatc atggaaaaaa acgtgaccgt gacccacgcc caggacatcc tggaaaagaa 1500

gcacaacggc aagctgtgcg acctggacgg cgtgaagccc ctgatcctgc gggactgcag 1560

cgtggccggc tggctgctgg gcaaccccat gtgcgacgag ttcatcaacg tgcccgagtg 1620

gagctacatc gtggagaagg ccaaccccgt gaacgacctg tgctaccccg gcgacttcaa 1680

cgactacgag gaactgaagc acctgctgtc ccggatcaac cacttcgaga agatccagat 1740

catccccaag agcagctggt ccagccacga ggccagcctg ggcgtgagca gcgcctgccc 1800

ataccagggc aagtccagct tcttccggaa cgtggtgtgg ctgatcaaga agaacagcac 1860

ctaccccacc atcaagcgga gctacaacaa caccaaccag gaagatctgc tggtcctgtg 1920

gggcatccac caccccaacg acgccgccga gcagaccaag ctgtaccaga accccaccac 1980

ctacatcagc gtgggcacca gcaccctgaa ccagcggctg gtgccccgga tcgccacccg 2040

gtccaaggtg aacggccaga gcggccggat ggaattcttc tggaccatcc tgaagcccaa 2100

cgatgccatc aacttcgaga gcaacggcaa cttcatcgcc cccgagtacg cctacaagat 2160

cgtgaagaag ggcgacagca ccatcatgaa gagcgagctg gaatacggca actgcaacac 2220

caagtgccag acccccatgg gcgccatcaa cagcagcatg cccttccaca acatccaccc 2280

cctgaccatc ggcgagtgcc ccaagtacgt gaagagcaac aggctggtgc tggccaccgg 2340

cctgcggaac agcccccagc gggagcggcg gaggaagaag aggggcctgt tcggcgccat 2400

cgccggcttc atcgagggcg gctggcaggg catggtggac gggtggtacg gctaccacca 2460

cagcaatgag cagggcagcg gctacgccgc cgacaaagag agcacccaga aggccatcga 2520

cggcgtcacc aacaaggtga acagcatcat cgacaagatg aacacccagt tcgaggccgt 2580

gggccgggag ttcaacaacc tggaacggcg gatcgagaac ctgaacaaga aaatggaaga 2640

tggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc cgagctgctg gtgctgatgg aaaacgagcg 2700

gaccctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac gacaaagtgc ggctgcagct 2760

gcgggacaac gccaaagagc tgggcaacgg ctgcttcgag ttctaccaca agtgcgacaa 2820

cgagtgcatg gaaagcgtgc ggaacggcac ctacgactac ccccagtaca gcgaggaagc 2880

ccggctgaag cgggaggaaa tcagcggcgt gaaactggaa agcatcggca tctaccagat 2940

cctgagcatc tacagcaccg tggccagcag cctggccctg gccatcatgg tggccggcct 3000

gagcctgtgg atgtgcagca acggcagcct gcagtgccgg atctgcatct gagaaatcga 3060

gttcagattg tagttaacga ttcagaagag gcgccgtata ctctacgcgc ggatctctag 3120

agtcgacctg ctcggggacg gtgaaggtga cagcagtcgg ttggagcgag catctctacg 3180

ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 3240

tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 3300

tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 3360

cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 3420

tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 3480

tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 3540

gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 3600

ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 3660

ttttgtaggt aaccacgtgc ggaccgagcg 3690

<210>3

<211>1695

<212>DNA

<213>密码子优化的H5(H5-ORF)

<400>3

tcgtgctgct gttcgccatc gtgagcctgg tgaagagcga ccagatctgc atcggctacc 60

acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga aaaaaacgtg accgtgaccc 120

acgcccagga catcctggaa aagaagcaca acggcaagct gtgcgacctg gacggcgtga 180

agcccctgat cctgcgggac tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac cccatgtgcg 240

acgagttcat caacgtgccc gagtggagct acatcgtgga gaaggccaac cccgtgaacg 300

acctgtgcta ccccggcgac ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg ctgtcccgga 360

tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ccaagagcag ctggtccagc cacgaggcca 420

gcctgggcgt gagcagcgcc tgcccatacc agggcaagtc cagcttcttc cggaacgtgg 480

tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ccaccatcaa gcggagctac aacaacacca 540

accaggaaga tctgctggtc ctgtggggca tccaccaccc caacgacgcc gccgagcaga 600

ccaagctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgtggg caccagcacc ctgaaccagc 660

ggctggtgcc ccggatcgcc acccggtcca aggtgaacgg ccagagcggc cggatggaat 720

tcttctggac catcctgaag cccaacgatg ccatcaactt cgagagcaac ggcaacttca 780

tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc atgaagagcg 840

agctggaata cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catgggcgcc atcaacagca 900

gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag tacgtgaaga 960

gcaacaggct ggtgctggcc accggcctgc ggaacagccc ccagcgggag cggcggagga 1020

agaagagggg cctgttcggc gccatcgccg gcttcatcga gggcggctgg cagggcatgg 1080

tggacgggtg gtacggctac caccacagca atgagcaggg cagcggctac gccgccgaca 1140

aagagagcac ccagaaggcc atcgacggcg tcaccaacaa ggtgaacagc atcatcgaca 1200

agatgaacac ccagttcgag gccgtgggcc gggagttcaa caacctggaa cggcggatcg 1260

agaacctgaa caagaaaatg gaagatggct tcctggacgt gtggacctac aacgccgagc 1320

tgctggtgct gatggaaaac gagcggaccc tggacttcca cgacagcaac gtgaagaacc 1380

tgtacgacaa agtgcggctg cagctgcggg acaacgccaa agagctgggc aacggctgct 1440

tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggaaag cgtgcggaac ggcacctacg 1500

actaccccca gtacagcgag gaagcccggc tgaagcggga ggaaatcagc ggcgtgaaac 1560

tggaaagcat cggcatctac cagatcctga gcatctacag caccgtggcc agcagcctgg 1620

ccctggccat catggtggcc ggcctgagcc tgtggatgtg cagcaacggc agcctgcagt 1680

gccggatctg catct 1695

<210>4

<211>3330

<212>DNA

<213>CMV-N1(N1盒)

<400>4

cggccgcacg cgtgggatcc gagctagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 60

tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 120

accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgtc 180

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 240

agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 300

gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 360

ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 420

tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 480

tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 540

acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctccgcgg ataccgccga gaccgcgtcc gccccgcgag cacagagcct 720

cgcctttgcc gatccgccgc ccgtccacac ccgccgccag ctcacctcga atcccggccg 780

ggaacggtgc attggaacgc ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag 840

agtctatagg cccacaaaaa atgctttctt cttttaatat acttttttgt ttatcttatt 900

tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat gatacaatgt atcatgcctc 960

tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt taaggcaata gcaatatttc 1020

tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta agaggtttca tattgctaat 1080

agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttaag gttgggataa ggctggatta 1140

ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcatgttcat acctcttatc ttcctcccac 1200

agctcctggg caacgtgctg gtctgtgtgc tggcccatca ctttggcaaa gaattgggat 1260

tcgaacatcg attgaattcg gtaccatgga ttggacttgg atcttatttt tagttgctgc 1320

tgctactaga gttcattcta actggatgaa ccccaaccag aagatcatca ccatcggcag 1380

catctgcatg gtgaccggca tcgtgagcct gatgctgcag atcggcaaca tgatcagcat 1440

ctgggtgtcc cacagcatcc acaccggcaa ccagcaccag agcgagccca tcagcaacac 1500

caactttctg accgagaagg ccgtggccag cgtgaagctg gccggcaaca gcagcctgtg 1560

ccccatcaac ggctgggccg tgtacagcaa ggacaacagc atccggatcg gcagcaaggg 1620

cgatgtgttc gtgatccggg agcccttcat cagctgcagc cacctggaat gccggacctt 1680

cttcctgacc cagggggccc tgctgaacga caagcacagc aacggcaccg tgaaggacag 1740

aagcccccac cggaccctga tgagctgccc cgtgggcgag gcccccagcc cctacaacag 1800

ccggttcgag agcgtggcct ggtccgccag cgcctgccac gacggcacca gctggctgac 1860

catcggcatc agcggccctg acaacggcgc cgtggccgtg ctgaagtaca acggcatcat 1920

caccgacacc atcaagagct ggcggaacaa catcctgcgg acccaggaaa gcgagtgcgc 1980

ctgcgtgaac ggcagctgct tcaccgtgat gaccgacggc cccagcaacg gccaggccag 2040

ccacaagatc ttcaagatgg aaaagggcaa ggtggtgaag agcgtggagc tggacgcccc 2100

caactaccac tacgaggaat gcagctgcta ccccaacgcc ggcgagatca cctgcgtgtg 2160

ccgggacaac tggcacggca gcaaccggcc ctgggtgtcc ttcaaccaga acctggaata 2220

ccagatcggc tacatctgca gcggcgtgtt cggcgacaac cccaggccca acgatggcac 2280

cggcagctgc ggccctgtga gcagcaacgg cgcctacggc gtgaagggct tcagcttcaa 2340

gtacggcaac ggcgtgtgga tcggccggac caagagcacc aacagcagat ccggcttcga 2400

gatgatctgg gaccccaacg gctggaccga gaccgacagc agcttctccg tgaagcagga 2460

catcgtggcc atcaccgact ggtccggcta cagcggcagc ttcgtgcagc accccgagct 2520

gaccggcctg gactgcatcc ggccctgctt ttgggtggag ctgatcagag gcaggcccaa 2580

agagagcacc atctggacca gcggcagcag catcagcttt tgcggcgtga acagcgacac 2640

cgtgggctgg tcctggcccg atggcgccga gctgcccttc accatcgaca agtgagagct 2700

aaagttcaga ttgtagttaa cgattcagaa gaggcgccgt atactctacg cgcggatctc 2760

tagagtcgac ctgctcgggg acggtgaagg tgacagcagt cggttggagc gagcatctct 2820

acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 2880

cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 2940

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 3000

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 3060

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 3120

tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 3180

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 3240

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc 3300

tgattttgta ggtaaccacg tgcggaccga 3330

<210>5

<211>1408

<212>DNA

<213>密码子优化的N1(N1-ORF)

<400>5

atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctaactgg 60

atgaacccca accagaagat catcaccatc ggcagcatct gcatggtgac cggcatcgtg 120

agcctgatgc tgcagatcgg caacatgatc agcatctggg tgtcccacag catccacacc 180

ggcaaccagc accagagcga gcccatcagc aacaccaact ttctgaccga gaaggccgtg 240

gccagcgtga agctggccgg caacagcagc ctgtgcccca tcaacggctg ggccgtgtac 300

agcaaggaca acagcatccg gatcggcagc aagggcgatg tgttcgtgat ccgggagccc 360

ttcatcagct gcagccacct ggaatgccgg accttcttcc tgacccaggg ggccctgctg 420

aacgacaagc acagcaacgg caccgtgaag gacagaagcc cccaccggac cctgatgagc 480

tgccccgtgg gcgaggcccc cagcccctac aacagccggt tcgagagcgt ggcctggtcc 540

gccagcgcct gccacgacgg caccagctgg ctgaccatcg gcatcagcgg ccctgacaac 600

ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg acaccatcaa gagctggcgg 660

aacaacatcc tgcggaccca ggaaagcgag tgcgcctgcg tgaacggcag ctgcttcacc 720

gtgatgaccg acggccccag caacggccag gccagccaca agatcttcaa gatggaaaag 780

ggcaaggtgg tgaagagcgt ggagctggac gcccccaact accactacga ggaatgcagc 840

tgctacccca acgccggcga gatcacctgc gtgtgccggg acaactggca cggcagcaac 900

cggccctggg tgtccttcaa ccagaacctg gaataccaga tcggctacat ctgcagcggc 960

gtgttcggcg acaaccccag gcccaacgat ggcaccggca gctgcggccc tgtgagcagc 1020

aacggcgcct acggcgtgaa gggcttcagc ttcaagtacg gcaacggcgt gtggatcggc 1080

cggaccaaga gcaccaacag cagatccggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1140

accgagaccg acagcagctt ctccgtgaag caggacatcg tggccatcac cgactggtcc 1200

ggctacagcg gcagcttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catccggccc 1260

tgcttttggg tggagctgat cagaggcagg cccaaagaga gcaccatctg gaccagcggc 1320

agcagcatca gcttttgcgg cgtgaacagc gacaccgtgg gctggtcctg gcccgatggc 1380

gccgagctgc ccttcaccat cgacaagt 1408

Claims

1.检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括：

通过将所述样品加热至第一温度，使所述样品解链，其中所述样品包含：

与所述靶核酸的至少一部分杂交的引物；

包含第一和第二区域的杂交探针，其中所述第一区域与所述靶核酸的至少一部分杂交，且所述第二区域不与所述靶核酸杂交，且其中所述第二区域包含可检测标记；和

聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中所述聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交的引物，且所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交的探针，由此释放包含所述探针第二区域和所述可检测标记的探针片段；和

其中所述第一温度高于所述引物和存在于所述样品中的双链核酸的T_m；

随后，通过将温度降低至低于所述第一温度的第二温度，使所述样品退火，以便使所述引物和所述杂交探针与所述样品中的靶核酸的单链部分各自杂交；和

随后通过使所述聚合酶在第三温度下延伸与所述靶核酸杂交的引物，延长所述引物；

使所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交探针，由此释放所述探针片段；

任选地重复解链、退火和延长至少一次；

将所述样品与固相支持体的表面接触，其中所述固相支持体的表面包含一个或多个与所述探针片段的第二区域的至少一部分杂交的捕获探针；

使所述捕获探针在第四温度下与存在于所述样品中的所探针片段的至少一部分杂交，其中所述第四温度低于所述第二和第三温度；以及

检测所述固相支持体表面上的标记；

其中所述杂交探针的至少一部分与所述杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中所述折叠结构的解链温度(T_m)低于所述第三温度且高于所述第四温度。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶和所述具有核酸外切酶活性的酶是同一分子。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构的解链温度(T_m)是41℃至66℃。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构的解链温度(T_m)是58℃至63℃。

5.如权利要求1所述的方法，其中在相应折叠结构中，所述捕获探针基本上接触不到所述探针片段中与所述捕获探针杂交的的第二区域。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述第三温度高于或等于所述第二温度且小于所述第一温度。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二温度和所述第三温度相同。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述杂交探针还包含邻近所述第一区域且与所述第二区域相对的第三区域，其中所述第三区域不与所述靶核酸杂交。

9.如权利要求8所述的方法，其中将所述杂交探针的第二区域和第三区域都与所述杂交探针的另一部分杂交以形成所述的折叠结构。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述第三区域的至少一部分与所述第二区域的至少一部分杂交以形成所述的折叠结构。

11.如权利要求5所述的方法，其中将所述杂交探针的第二区域的至少一部分与所述杂交探针的另一部分杂交以形成所述的折叠结构。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是热稳定酶。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述热稳定酶是Taq聚合酶。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述固相支持体的表面包含电极，且其中所述可检测标记是可以将电子转运到所述电极或者从所述电极转运电子的部分。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述可检测标记是二茂铁部分。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述固相支持体的表面包含金。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述固相支持体包含多个形成流体槽的交叉板，其中所述板的至少某些表面包含捕获探针，且其中将所述样品与固相支持体的表面接触包括使所述样品流经所述流体槽。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述板的表面包含电极。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述交叉板的表面包含捕获探针。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构包含分子内三链体结构。

21.如权利要求1所述的方法，其中在连续循环中多次进行解链、退火和延长。

22.如权利要求21所述的方法，其中检测所述固相支持体表面上的标记在最后一次解链、退火和延长循环后发生。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述样品在解链、退火和延长过程中与所述固相支持体的表面接触，且其中检测在所述方法过程中和/或最后一次解链、退火和延长循环后多次发生。

24.检测样品中靶核酸的试剂盒，其包含：

杂交探针，其包含与所述靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和包含可检测标记的第二区域，其中所述第二区域不与所述靶核酸杂交，且其中，当与所述靶核酸杂交时，核酸外切酶可以切割所述杂交探针，由此产生包含所述第二区域和所述可检测标记的探针片段；

固相支持体，其包含位于其表面上的捕获探针，其中所述捕获探针与所述探针片段的第二区域杂交；

任选地，引物，其与所述靶核酸的至少一部分杂交；以及

任选地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中所述聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交的引物，且所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交的探针，由此释放包含所述探针第二区域和所述可检测标记的探针片段；

其中所述杂交探针的至少一部分与所述杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中所述折叠结构的解链温度(T_m)低于所述杂交探针与所述靶核酸杂交时所形成的双链体的解链温度且高于所述探针片段与所述捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温度。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述固相支持体的表面包含电极，且其中所述可检测标记是可以将电子转运到所述电极或从所述电极转运电子的部分。

26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述可检测标记是电活化二茂铁部分。

27.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述固相支持体的表面包含金。

28.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶。

29.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶是同一分子。

30.如权利要求2所述的方法，其中所述聚合酶是热稳定酶。